ES2376035T3 - Unidades de expresión de p-ef-ts en corynebacterium glutamicum. - Google Patents

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Abstract

Método para modificar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre mediante regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor, que contiene A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o B) una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas, en cuyo caso los genes respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor son heterólogos.

Description

Unidades de expresión de P-EF-TS en CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM
La presente invención se refiere a un método para modificar o causar la rata de transcripción de genes y a microorganismos genéticamente modificados con rata de transcripción modificada o causada.
Varios productos biosintéticos, como por ejemplo compuestos de química fina tales como, entre otros, aminoácidos, vitaminas, pero también proteínas, se producen mediante procesos metabólicos naturales en células y se usan en muchas ramas de la industria, incluida la industria de productos alimentos, de forrajes y comida para animales, de cosméticos, de piensos y alimentos para humanos y animales, y la industria farmacéutica. Estas sustancias, que se denominan conjuntamente como productos de química fina / proteínas, comprenden, entre otras, ácidos grasos, aminoácidos tanto proteinogénicos como también no proteinogénicos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, así como proteínas y enzimas. Su producción se efectúa de la manera más conveniente a gran escala mediante el cultivo de bacterias que se desarrollaron con el fin de producir y secretar grandes cantidades de la sustancia respectivamente deseada. Para este propósito los organismos particularmente adecuados son bacterias corineformes, bacterias gram-positivas no patógenas.
Se conoce que los aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes, principalmente Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia, permanentemente se trabaja en el mejoramiento de los procesos de producción. Los mejoramientos de proceso pueden concernir medidas de fermentación industrial como, por ejemplo, agitación y abastecimiento de oxígeno, o la composición de medios nutrientes como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación o el procesamiento para obtener el producto, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico pero también secamiento por pulverización o la propiedades de desempeño intrínsecas del mismo microorganismo.
Desde hace unos años se emplean igualmente métodos de la ingeniería genética de ADN recombinante para el mejoramiento de la cepas que producen productos de química fina / proteínas de la bacteria Corynebacterium, amplificando genes individuales e investigando el efecto sobre la producción de productos de química fina/proteínas.
Otros modos para desarrollar un proceso para la producción de productos de química fina, aminoácidos o proteínas,
o para elevar o para mejorar la productividad de un proceso ya existente para la producción de productos de la química fina, aminoácidos o proteínas son elevar o modificar la expresión de uno o varios genes o influir la traducción de un ARNm mediante secuencias adecuadas de polinucleótidos. La influencia en este contexto puede ser la elevación, la disminución o también otros parámetros de la expresión de genes como patrones temporales de expresión.
El experto en la materia conoce los diferentes componentes de las secuencias bacteriana de regulación. Se distinguen los sitios de enlace de reguladores, llamados también operadores, los sitios de enlace de holoenzimas – polimerasa – ARN, llamados también regiones 35 y 10 y el sitio de enlace de ARN -16S ribosómico, llamado también sitios de enlace ribosómicos o secuencia Shine-Dalgarno.
Como secuencia de sitio de enlace ribosómico, también llamado secuencia de Shine-Dalgarno, en el sentido de esta invención se entienden secuencias de polinucleótidos que se anteponen hasta 20 bases antes del inicio del codón de la traducción.
En la bibliografía (E. coli y S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press) se describe que tanto la composición de la secuencia de polinucleótido de la secuencia Shine-Delgarno, la sucesión de secuencia de las bases, pero también la distancia de una secuencia de polinucleótido contenida en la secuencia Shine-Delgarno tiene una influencia esencial en la rata de iniciación de la traducción.
Las secuencias de ácido nucleico con actividad de promotor pueden influir en la formación de ARNm de diferente manera. Los promotores cuya actividad es independiente de la fase de crecimiento fisiológica del organismo se llaman constitutivos. A su vez, otros promotores reaccionan a estímulos químicos y físicos externos como oxígeno, metabolitos, calor, pH, etc. A su vez otros muestran una fuerte dependencia de su actividad en diferentes fases de desarrollo. A manera de ejemplo, en la bibliografía se describen promotores que durante la fase de crecimiento exponencial de los microorganismos muestran una actividad particularmente pronunciada, pero también exactamente en la fase estacionaria del crecimiento microbiano. Ambas características de los promotores pueden tener una influencia favorable en la productividad para una producción de productos de química fina y proteínas según la vía metabólica.
Por ejemplo, pueden aprovecharse promotores que desconectan la expresión de un gen durante el crecimiento, pero que la conectan después de un crecimiento óptimo con el fin de regular un gen que controla la producción de un metabolito. La cepa modificada tiene luego los mismos parámetros de crecimiento que la cepa de partida, pero produce más producto por célula. Este tipo de modificación puede aumentar tanto el título (g de producto/litro) como también el rendimiento de C (g de producto/g de fuente de C).
En especies de Corynebacterium ya han podido aislarse aquellas secuencias de nucleótido que pueden utilizarse para un aumento o un debilitamiento de la expresión génica. Estos promotores regulados pueden reducir la rata con la que se transcribe un gen dependiendo de las condiciones internas y/o externas de la célula. La presencia de un factor determinado, conocido como inductor, puede estimular en parte la rata de la transcripción del promotor. Los inductores pueden afectar directa o indirectamente la transcripción del promotor. Otra clase de factores, conocidos como supresores, está en capacidad de reducir o de inhibir la transcripción del promotor. Tal como los inductores, también los supresores pueden actuar directa o indirectamente. Sin embargo, también se conocen promotores que se regulan por la temperatura. De esta manera, el nivel de transcripción de tales promotores puede aumentarse, o si no debilitarse, por ejemplo elevando la temperatura de crecimiento o mediante la temperatura de crecimiento normal de las células.
Hasta hoy se ha descrito una pequeña cantidad de promotores de C. glutamicum. El promotor del gen de malato sintasa de C. glutamicum se describió en DE 4440118. Este promotor se antepuso a un gen estructural que codifica para una proteína. Después de la transformación de tal constructo en una bacteria corineforme se regula la expresión del gen estructural insertado después del promotor. La expresión del gen estructural se induce tan pronto al medio se adiciona un inductor correspondiente.
Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999) han descrito una fusión de transcripción entre el promotor pta-ack de
C. glutamicum y un gen reportero (cloranfenicol acetiltransferasa). Las células de C. glutamicum que tienen una tal fusión de transcripción presentaron una expresión elevada del gen reportero durante el crecimiento en medio que contenía acetato. En comparación con esto, las células transformadas que crecieron en glucosa no mostraron una expresión aumentada de este gen reportero.
En Pa’tek et al., Microbiology 142:1297 (1996) se describieron algunas secuencias de ADN de C. glutamicum que pueden fortalecer la expresión de un gen reportero en células de C. glutamicum. Estas secuencias se compararon entre sí para definir secuencias de consenso para promotores de C. glutamicum.
Otras secuencias de ADN de C. glutamicum que pueden utilizarse para la regulación de la expresión de gen se han descrito en la patente WO 02/40679. Estos polinucleótidos aislados representan unidades de expresión de Corynebakterium glutamicum que pueden utilizarse o bien para aumentar o sino para disminuir una expresión de gen. Además, en esta patente se describen plásmidos recombinantes sobre los que se asocian unidades de expresión de Corynebakterium glutamicum con genes heterólogos. El método descrito aquí, la fusión de un promotor de Corynebacterium glutamicum con un gen heterólogo, puede emplearse entre otras para la regulación de los genes de la biosíntesis de aminoácido.
El objetivo fundamental de la invención es proporcionar más procesos para modificar o para ocasionar la rata de transcripción de genes en el microorganismo en comparación con el tipo silvestre.
Por consiguiente, se encontró un método para modificar u ocasionar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre mediante regulación de la transcripción de genes en microorganismos por ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor, los cuales contienen
A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o
B) una secuencia derivada de esta secuencia mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, la cual tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o
C) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas,
en cuyo caso los genes son heterólogos con respecto a los ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor.
De acuerdo con la invención, por "transcripción" se entiende el proceso por el cual a partir de una matriz de ADN se produce una molécula complementaria de ARN. En este proceso intervienen proteínas como la polimerasa de ARN, los llamados factores sigma y las proteínas reguladoras de transcripción. el ARN sintetizado sirve entonces como matriz en el proceso de la traducción que conduce luego a la proteína biosintéticamente activa.
La rata de formación con la que se produce una proteína biosintéticamente activa es un producto de la rata de la transcripción y de la traducción. Ambas ratas pueden afectarse de acuerdo con la invención y con esto afectar la rata de formación de productos en un microorganismo.
Por un "promotor" o un "ácido nucleico con actividad de promotor" de acuerdo con la invención se entiende un ácido nucleico que en conexión funcional con un ácido nucleico a transcribir regula la transcripción de este ácido nucleico.
Por una "conexión funcional" se entiende en este contexto, por ejemplo, la disposición secuencial de uno de los ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1 y de una secuencia de ácido nucleico a transcribir y, opcionalmente, otros elementos regulatorios como, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que garantizan la transcripción de ácidos nucleicos, así como, por ejemplo, un terminador de tal modo que cada uno de los elementos regulatorios pueda cumplir su función en la transcripción de la secuencia del ácido nucleico. Para esto no es obligatoriamente necesaria una conexión directa en el sentido químico. Las secuencias genéticas de control como, por ejemplo, secuencias enhancer (intensificadoras), también pueden ejercer su función desde posiciones más alejadas o incluso desde otras moléculas de ADN sobre la secuencia objetivo. Se prefieren disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico a transcribirse se posiciona detrás (es decir en el extremo 3’) de la secuencia de promotor de la invención de tal modo que ambas secuencias están enlazadas entre sí de modo covalente. En tal caso se prefiere que la distancia entre la secuencia de promotor y la secuencia de ácido nucleico a expresarse de modo transgénico sea menor que 200 pares de bases, particularmente preferible menor que pares de bases, muy particularmente preferible menor que 50 pares de bases.
Por "actividad de promotor" de acuerdo con la invención se entiende la cantidad de ARN formada por el promotor en un tiempo determinado, es decir la rata de transcripción.
Por "actividad de promotor específica" se entiende de acuerdo con la invención la cantidad de ARN por promotor, formada por el promotor en un tiempo determinado.
Por el concepto "tipo silvestre" de acuerdo con la invención se entiende el organismo de partida correspondiente.
Dependiendo del contexto, por el término "microorganismo" puede entenderse el microorganismo de partida (tipo silvestre) o un microorganismo genéticamente modificado, según la invención, o ambos.
Preferentemente y principalmente en los casos en los que el microorganismo o el tipo silvestre no puedan designarse de manera inequívoca, por "tipo silvestre" se entiende respectivamente un organismo de referencia para la modificación o la generación de la actividad de promotor o de la rata de transcripción y para el aumento del contenido de productos biosintéticos.
En una forma preferida de realización este organismo de referencia es Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
En una forma preferida de realización se usan microorganismos de partida que ya están en capacidad de producir los productos deseados de la química fina. Particularmente se prefieren en tal caso, entre los microorganismos particularmente preferidos las bacterias del género y los productos de la química fina particularmente preferidos Llisina, L-metionina y L-treonina, aquellos microorganismos de partida que ya están en capacidad de producir L-lisina, L-metionina y/o L-treonina. Estas son de manera particularmente preferida corinebacterias en las que, por ejemplo, el gen que codifica una aspartoquinasa (gen ask) está desregulado o la inhibición de retroalimentación (feed-back) se anuló o se redujo. Por ejemplo, tales bacterias tienen en el gen ask una mutación que conduce a una reducción o anulación de la inhibición de retroalimentación, como por ejemplo la mutación T311
En el caso de una "actividad de promotor causada" o rata de transcripción respecto de un gen, en comparación con el tipo silvestre se causa de esta manera la formación de una ARN que, en comparación con el tipo silvestre, no estaba presente de este modo en el tipo silvestre.
En el caso de una actividad de promotor modificada o rata de transcripción respecto de un gen en comparación con el tipo silvestre se modifica de este modo la cantidad formada de ARN en comparación con el tipo silvestre en un tiempo determinado.
Por "modificada" se entiende preferiblemente en este contexto aumentada o disminuida.
Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la actividad de promotor o rata de transcripción aumentadas, por ejemplo mediante regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor.
La regulación de la transcripción de genes en el microorganismo se logra preferentemente por ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor según la reivindicación 1 introduciendo uno o varios ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, al genoma del microorganismo, de modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido que tiene actividad de promotor según la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o introduciendo uno o varios gene al genoma del microorganismo de modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos que tienen actividad de promotor según la reivindicación 1, opcionalmente actividad de promotor modificada específica, o uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico que tiene actividad de promotor según la
5 reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y enlazando funcionalmente al microorganismo uno o varios ácidos nucleicos a transcribirse. La secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 1 representa la secuencia de promotor del factor de elongación TS (PEF-TS) de corynebacterium glutamicum. La SEQ. ID.NO. 1 corresponde a la secuencia de promotor del tipo silvestre.
Otros ejemplos naturales de promotores según la reivindicación 1 pueden recuperarse fácilmente, por ejemplo, a
10 partir de diferentes organismos cuya secuencia genómica es conocida, mediante comparaciones de identidad de las secuencias de ácido nucleico de bancos de datos con las secuencias descritas previamente SEQ ID NO: 1.
Las secuencias de promotor sintéticas según la reivindicación 1 pueden recuperarse fácilmente a partir de la secuencia SEQ ID NO: 1 mediante variación y mutación sintética, por ejemplo por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos.
15 Por el término "sustitución" debe entenderse en la descripción el intercambio de uno o varios nucleótidos por uno o varios nucleótidos. "Deleción" es el reemplazo de un nucleótido por un enlace directo. Las inserciones son incorporaciones de nucleótidos a la secuencia de ácido nucleico, en cuyo caso formalmente un enlace directo se reemplaza por uno o varios nucleótidos.
Por identidad entre dos ácidos nucleicos se entiende la identidad de los nucleótidos respectivamente por toda la
20 longitud de ácido nucleico, principalmente la identidad que se calcula mediante comparación con ayuda del programa de ordenador Vector NTI Suite 7.1 Software de la empresa Informax (USA) aplicando el método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) estableciendo los siguientes parámetros:
Multiple alignment parameter (parámetro de alineamiento múltiple):
25 Gap opening penalty (pena de abertura de brecha) 10
Gap extension penalty (pena de extensión de brecha) 10
Gap separation penalty range (rango de pena de separación de brecha) 8
Gap separation penalty (pena de separación de brecha) off (desconectado)
% identity for alignment delay (% de identidad para atraso de alineamiento) 40
30 Residue specific gaps (brechas específicas de residuo) off (desconectado)
Hydrophilic residue gap (brecha de residuo hidrofílico) off (desconectado
Transition weighing (peso de transición) 0
Pairwise alignment parameter (parámetros de alineamiento apareado):
FAST algorithm (algoritmo FAST) on (conectado)
35 K-tuplesize (tamaño de tupla-K) 1
Gap penalty (pena de brecha) 3
Window size (tamaño de ventaja) 5
Number of best diagonals (número de mejores diagonales) 5
Por una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos 90 % con la secuencia SEQ ID NO: 1 se
40 entiende por consiguiente una secuencia de ácido nucleico que al comparar su secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 1, tiene una identidad de al menos 90 % principalmente según el algoritmo de programación de arriba con el conjunto de parámetros de arriba.
Promotores particularmente preferidos tienen una identidad de 91%, más preferible 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, particularmente preferible 99% con la secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 1.
Otros ejemplos naturales de promotores pueden encontrarse fácilmente de una manera conocida per se además a partir de las secuencias de ácido nucleico arriba descritas, principalmente a partir de la secuencia SEQ ID NO: 1 de diferentes organismos cuya secuencia genómica no se conoce, mediante técnicas de hibridación.
Los ácidos nucleicos con actividad de promotor que contienen una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. No. 1 en condiciones estrictas, comprenden al menos 10, más preferible más de 12,15,30,50 o particularmente preferible más de 150 nucleótidos.
La hibridación se efectúa según la invención en condiciones estrictas. Tales condiciones de hibridación se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6:
Por condiciones estrictas de hibridación se entienden principalmente: la incubación durante la noche a 42°C en una solución que se compone de formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl de 750 mM, citrato tri-sódico de 75 mM), fosfato de sodio de 50 mM (pH7,6), solución de 5x Denhardt, sulfato de dextrano de 10% y 20 g/ml ADN de esperma de salmón cizallado, desnaturalizado, seguido de lavado del filtro con 0,1x SSC a 65°C.
La SEQ. ID. NO. 1 se ha descrito sin designación de función en la inscripción del banco de genes AP005283.
Todos los ácidos nucleicos previamente mencionados que tienen actividad de promotor pueden producirse además de una manera conocida per se mediante síntesis química de las unidades estructurales de nucleótido, como por ejemplo mediante condensación de fragmentos de unidades estructurales de ácido nucleico individuales, complementarios, solapantes de la hélice doble. La síntesis química de oligonucleótidos puede efectuarse de manera conocida, por ejemplo, según el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2. Edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de polinucleótidos sintéticos y el relleno de los sitios huecos con ayuda del fragmento de Klenow de la polimerasa de ADN y reacciones de ligamiento y procesos de clonación generales se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Por una unidad de expresión se entiende un acido nucleico con actividad de expresión, es decir un ácido nucleico que en conexión funcional con un ácido nucleico o gen a expresarse regula la expresión, es decir la transcripción y la traducción de este ácido nucleico o de este gen.
Por una "conexión funcional" se entiende en este contexto, por ejemplo, la disposición secuencial de una unidad de expresión y de una secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica y, opcionalmente, de otros elementos regulatorios como, por ejemplo, un terminador de tal manera que cada uno de los elementos regulatorios pude cumplir su función en el caso de la expresión transgénico de la secuencia de ácido nucleico. Para esto no es obligatoriamente necesaria una conexión directa en el sentido químico. Las secuencias genéticas de control, como por ejemplo secuencias de enhancer (intensificador), también puede ejercer su función desde posiciones más alejadas o incluso desde otras moléculas de ADN sobre la secuencia objetivo. Se prefieren disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica se posiciona detrás (es decir en el extremo 3’) de la secuencia de unidad de expresión, de modo que ambas secuencias se enlazan entre sí de manera covalente. En tal caso se prefiere que la distancia entre la secuencia de unidad de expresión y la secuencia de ácido nucleico a expresarse transgénicamente es de menos de 200 pares de bases, particularmente preferible de menos de 100 pares de bases, muy particularmente preferible de menos de 50 pares de bases.
Por "actividad de expresión" se entiende de acuerdo con la invención la cantidad de proteína formada por la unidad de expresión en un tiempo determinado, es decir la rata de expresión.
Por "actividad de expresión específica" se entiende de acuerdo con la invención la cantidad de proteína formada por unidad de expresión en un tiempo determinado.
En el caso de una "actividad de expresión causada" o de la rata de expresión respecto de un gen en comparación con el tipo silvestre se genera de este modo la formación de una proteína que no estaba presente en el tipo silvestre, en comparación con el tipo silvestre.
En el caso de una "actividad de expresión modificada" o de la rata de expresión respecto de un gen en comparación con el tipo silvestre se modifica la cantidad de proteína formada en un tiempo determinado en comparación con el tipo silvestre.
Por "modificada" en este contexto se entiende preferiblemente aumentada o disminuida.
Esto puede efectuarse, por ejemplo, aumentando o disminuyendo la actividad específica de la unidad de expresión endógena, por ejemplo mediante mutación de la unidad de expresión o mediante estimulación o inhibición de la unidad de expresión. Además, la actividad de expresión elevada o la rata de expresión pueden lograrse, por ejemplo, mediante regulación de la expresión de genes en el microorganismo por unidades de expresión o por unidades de expresión que tienen actividad de expresión específica elevada, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de las unidades de expresión.
La regulación de la expresión de genes en el microorganismo se logra preferentemente a través de unidades de expresión o a través de unidades de expresión que tienen actividad de expresión específica elevada, introduciendo al genoma del microorganismo una o varias unidades de expresión de la invención, opcionalmente con actividad de expresión específica modificada, de modo que la expresión de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión introducidas, opcionalmente con actividad de expresión específica, modificada,
o introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la expresión de uno o de varios genes introducidos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión endógenas, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, o introduciendo al microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen una unidad de expresión, opcionalmente con actividad de expresión específica modificada y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a expresar.
Las unidades de expresión contienen un ácido nucleico previamente descrito con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1 y adicionalmente conectan funcionalmente una secuencia de ácido nucleico que garantiza la traducción de ácidos ribonucleicos.
Esta secuencia de ácido nucleico, que garantiza la traducción de ácidos ribonucleicos, contiene preferentemente la secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 42 como sitio de enlace ribosómico.
La unidad de expresión contiene:
E) la secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 2 o
F) una secuencia, derivada de esta secuencia mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, la cual tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ. ID. NO. 2 o
G) una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones estrictas con la secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 2.
La secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 2 representa la secuencia de ácido nucleico de la unidad de expresión del factor de elongación TS (PEF-TS) de Corynebacterium glutamicum. La SEQ. ID.NO. 2 corresponde a la secuencia de la unidad de expresión del tipo silvestre.
Otros ejemplos naturales de unidades de expresión pueden encontrarse fácilmente, por ejemplo, de diferentes organismos cuya secuencia genómica se conoce, mediante comparaciones de identidad de las secuencias de ácido nucleico de bancos de datos con la secuencia SEQ ID NO: 2 previamente descrita.
Las secuencias sintéticas de las unidades de expresión puede encontrarse fácilmente a partir de la secuencia SEQ ID NO: 2 mediante variación o mutación sintéticas, por ejemplo mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos.
Por una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos 90 % con la secuencia SEQ ID NO: 2 se entiende, por consiguiente, una secuencia de ácido nucleico que al comparar su secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 2, principalmente de acuerdo con el algoritmo de programa de arriba con el conjunto de parámetros de arriba, presenta una identidad de al menos 90 %.
Otros ejemplos naturales de unidades de expresión pueden encontrarse además fácilmente de una manera conocida per se mediante técnicas de hibridación, a partir de las secuencias de ácido nucleico previamente descritas, principalmente a partir de la secuencia SEQ ID NO: 2 de diferentes organismos cuya secuencia genómica no se conoce.
Por "hibridar" se entiende la capacidad de un poli-u oligonucleótido en condiciones estrictas de enlazarse a una secuencia casi complementaria mientras que en estas condiciones no tienen lugar enlaces no específicos entre socios no complementarios. Para esto, las secuencias deben ser complementarias preferentemente en 90-100%. La propiedad de las secuencias complementarias de poder enlazarse entre sí se aprovecha, por ejemplo, en la técnica de Norte-o Southem-Blot o en el enlace de cebador en PCR o RT-PCR.
La hibridación se efectúa en condiciones estrictas. Tales condiciones estrictas se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6:
Por condiciones estrictas se entienden principalmente:
La incubación por una noche a 42°C en una solución que se compone de formamida de 50 %, 5 x SSC (NaCl de 750 mM, citrato trisódico de 75 mM), fosfato de sodio de 50 mM (pH7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano de 10% y 20 g/ml de ADN de esperma de salmón cizallado, desnaturalizado, seguido de un lavado de los filtros con 0,1x SSC a 65°C.
Las secuencias de nucleótidos según la reivindicación 1 hacen posible además la generación de sondas y cebadores que pueden usarse para la identificación y/o clonación de secuencias homólogas en otros tipos de células y microorganismos. Tales sondas o cebadores comprenden habitualmente una región de secuencia de nucleótido que hibrida en condiciones estrictas en por lo menos aproximadamente 12, preferentemente al menos aproximadamente 25, como por ejemplo aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos sucesivos de una cadena sense (sentido) de una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 o de una cadena antisense (antisentido) correspondiente.
También están comprendidas tales secuencias de ácido nucleico que comprenden las llamadas mutaciones mudas o se modifican de manera correspondiente con la utilidad de codón de un organismo de procedencia especial o huésped en comparación con una secuencia mencionada en concreto, al igual que variantes que tienen lugar en la naturaleza, como por ejemplo variantes cortadas o alélicas de las mismas.
La secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 2 puede usarse como unidad de expresión, es decir para la expresión de genes.
La unidad de expresión contiene un ácido nucleico con actividad de promotor según la reivindicación 1 funcionalmente enlazado de manera adicional con una secuencia de ácido nucleico que garantiza la traducción de ácidos ribonucleicos. Las unidades de expresión comprenden uno o varios de los siguientes elementos genéticos: una secuencia menos 10 ("-10"); una secuencia menos 35 ("-35"); un inicio de transcripción, una región enhancer (de intensificador); y una región de operador.
Estos elementos genéticos son preferentemente específicos para las especies de corinebacterias, especialmente para Corynbacterium glutamicum.
Todas las unidades de expresión previamente mencionadas pueden producirse además de manera conocida per se, mediante síntesis química a partir de unidades estructurales de nucleótidos, como por ejemplo por condensación de fragmentos de unidades estructurales de ácido nucleico complementarias individuales, que se solapan, de la hélice doble. La síntesis química de oligonucleótidos puede efectuarse de manera conocida, por ejemplo, según el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2. Edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de oligonucleótidos sintéticos y el llenado de sitios vacíos con ayuda de fragmentos Klenow de la polimerasa de ADN y de reacciones de ligamiento, así como métodos generales de clonación, se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Para las invenciones en esta patente se utilizaron métodos y técnicas que son conocidos para el experto en técnicas microbiológicas y recombinantes de ADN. Los métodos y técnicas para el crecimiento de células bacterianas, la infiltración de moléculas de ADN aisladas a la célula huésped y el aislamiento, la clonación y la secuenciación de moléculas aisladas de ácido nucleico son ejemplo de tales técnicas y métodos. Estos métodos se describen en muchas fuentes bibliográficas estándar: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986); J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmann et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); and P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989).
Todas las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se presentan preferiblemente en forma de una molécula aislada de ácido nucleico. Una molécula "aislada" de ácido nucleico se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico y puede estar, además, esencialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, si se produce mediante técnicas recombinantes, o libre de de precursores químicos u otros productos químicos, si se sintetiza de manera química.
La invención comprende además las moléculas de ácido nucleico complementarias a las secuencias de nucleótidos concretamente descritas o un segmento de las mismas.
Los promotores y/o unidades de expresión pueden usarse, por ejemplo, particularmente ventajoso en procesos mejorados para la producción fermentativa de productos biosintéticos, tal como se describe a continuación.
Los promotores y/o unidades de expresión tienen principalmente la ventaja de que se inducen en microorganismos mediante estrés. Mediante control adecuado del proceso de fermentación, esta inducción por estrés puede controlarse de manera dirigida para un incremento de la rata de expresión/transcripción de los genes deseados. Principalmente en la producción de L-lisina se alcanza muy temprano esta fase de estrés, de tal modo que puede lograrse muy temprano aquí una rata de expresión/transcripción de genes deseados.
Los ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1 pueden usarse para modificar, es decir para aumentar o reducir o para causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre.
Las unidades de expresión pueden usarse para modificar, es decir para aumentar o reducir, o para causar la rata de expresión de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre.
Además, los ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1 y las unidades de expresión para la regulación y el fortalecimiento de la formación de diferentes productos biosintéticos como, por ejemplo, productos de química fina, proteínas, principalmente aminoácidos, en microorganismos, principalmente en especies de Corynebacterium.
La modificación o generación de la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre se efectúa regulando la transcripción de genes en el microorganismo mediante ácidos nucleicos con actividad de promotor
A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o
B) una secuencia derivada de esta secuencia mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o
C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas,
en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor.
Esto se logra preferiblemente
b1) introduciendo uno o varios ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor según la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúe bajo el control del ácido nucleico introducido que tiene actividad de promotor, o
b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos que tienen actividad de promotor según la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o
b3) introduciendo al microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor según la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.
De esta manera es posible modificar la rata de transcripción de un gen endógeno del tipo silvestre, es decir aumentarla o reducirla de acuerdo con la forma de realización b1) introduciendo al genoma del microorganismo uno
o varios ácidos nucleicos que tienen actividad de promotor, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúe bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor o
según la forma de realización b2) introduciendo uno o varios genes endógenos al genoma del microorganismo, de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes endógenos introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o
Según la forma de realización b3) introduciendo al microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y enlazando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos endógenos a transcribir.
Además, también es posible causar la rata de transcripción de un gen exógeno en comparación con el tipo silvestre
Según la forma de realización b2) introduciendo uno o varios genes exógenos al genoma del microorganismo, de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes exógenos introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o
Según la forma de realización b3) introduciendo al microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico, que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y enlazando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos exógenos a transcribir.
La inserción de genes según la forma de realización b2) puede efectuarse en tal caso de tal manera que el gen se integra en regiones codificantes o en regiones no codificantes. La inserción se efectúa preferentemente en regiones no codificantes.
La inserción de constructos de ácido nucleico según la forma de realización b3) puede efectuarse en tal caso de modo cromosómico o extracromosómico. La inserción se efectúa de los constructos de ácido nucleico se efectúa preferentemente de modo cromosómico. Una integración "cromosomática" es la inserción de un fragmento de ADN exógeno al cromosoma de una célula huésped. Este término también se utiliza para la recombinación homóloga entre un fragmento de ADN exógeno y la región correspondiente en el cromosoma de la célula huésped.
Por "endógeno" se entienden informaciones genéticas como, por ejemplo, genes que ya están contenidos en el genoma de tipo silvestre.
Por "exógeno" se entienden informaciones genéticas como, por ejemplo, genes que no están contenidos en el genoma de tipo silvestre.
Por el término "genes" respecto de la regulación de la transcripción mediante los ácidos nucleicos con actividad de promotor se entienden preferentemente ácidos nucleicos que contienen una región a transcribir, es decir por ejemplo una región que regula la traducción, una región codificante y opcionalmente otros elementos de regulación como, por ejemplo, un terminador.
Por el término "genes" respecto de la regulación, descrita a continuación, de la expresión mediante las unidades de expresión se entienden preferentemente ácidos nucleicos que contienen una región codificante así como opcionalmente otros elementos de regulación, como por ejemplo un terminador.
Por una "región codificante" se entiende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína.
Por "heterólogo" respecto de ácidos nucleicos con actividad de promotor y genes se entiende que los genes usados en el tipo silvestre no se transcriben bajo regulación de los ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1 sino que se genera una nueva conexión funcional que no existe en el tipo silvestre y la combinación funcional de ácido nucleico con actividad de promotor y el gen específico no tiene lugar en el tipo silvestre.
Por "heterólogo" con respecto de las unidades de expresión y los genes se entiende que los genes usados en el tipo silvestre no se expresan bajo regulación de las unidades de expresión previamente mencionadas sino que se genera una nueva conexión funcional que no tiene lugar en el tipo silvestre y la combinación funcional de la unidad de expresión y el gen específico no tiene lugar en el tipo silvestre.
La invención se refiere en una forma preferida de realización además a un proceso para elevar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre regulando la transcripción de genes en el microorganismo mediante ácidos nucleicos con actividad de promotor
A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.lD.NO. 1 o B) una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o
C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.
La modificación o la generación de la rata de expresión de un gen en microorganismos puede efectuarse en comparación con el tipo silvestre mediante regulación de la expresión de genes en el microorganismo mediante las unidades de expresión previamente mencionadas, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de las unidades de expresión.
La modificación o la generación de la rata de expresión de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre pueden efectuarse regulando la expresión de genes en el microorganismo mediante unidades de expresión. En cuyo caso los genes son heterólogos respecto de las unidades de expresión.
Esto se logra preferiblemente
d1) introduciendo al genoma una o varias unidades de expresión, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, de modo que la expresión de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión introducidas o
d2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de modo que la expresión de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión endógenas, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, o
d3) introduciendo al microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen una unidad de expresión, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a expresar.
De esta manera es posible modificar la rata de expresión de un gen endógeno del tipo silvestre, es decir aumentarla
o disminuirla,
según la forma de realización d1), introduciendo una o varias unidades de expresión, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, al genoma del microorganismo de modo que la expresión de uno o varios genes endógenos se efectúe bajo el control de las unidades de expresión introducidas o
según la forma de realización d2), introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que a expresión de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión endógenas, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, o
según la forma de realización d3) introduciendo al microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen una unidad de expresión, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a expresar.
De esta manera también es posible causar la rata de la expresión de un gen exógeno en comparación con el tipo silvestre
según la forma de realización d2) introduciendo uno o varios genes exógenos al genoma del microorganismo de tal modo que la expresión de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión endógenas, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, o
según la forma de realización d3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen una unidad de expresión, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos exógenos a expresar.
La inserción de genes según la forma de realización d2) puede efectuarse en tal caso de tal manera que el gen se integra a las regiones codificantes o a las regiones no codificantes. La inserción se efectúa preferentemente a las regiones no codificantes.
La inserción de constructos de ácido nucleico según la forma de realización d3) puede efectuarse en tal caso de modo cromosómico o extracromosómico. La inserción de los constructos de ácido nucleico se efectúa preferentemente de modo cromosómico.
Los constructos de ácido nucleico también se denominan en lo sucesivo casetes de expresión.
La elevación o la causa de la rata de expresión de un gen en microorganismos en comparación con el tipo silvestre pueden efectuarse
ch) elevando la actividad de expresión específica en el microorganismo de unidades de expresión endógenas que regulan la expresión de los genes endógenos en comparación con el tipo silvestre o
dh) regulando la expresión de genes en el microorganismo mediante las unidades de expresión de la invención, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de las unidades de expresión.
La regulación de la expresión de genes en el microorganismo se logra preferentemente mediante unidades de expresión
dh1) introduciendo al genoma del microorganismo una o varias unidades de expresión, opcionalmente con actividad de expresión elevada específica A, de tal modo que la expresión de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión introducidas, opcionalmente con actividad de expresión elevada específica, o
dh2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo, de tal modo que la expresión de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión endógenas, opcionalmente con actividad de expresión elevada específica, o
dh3) introduciendo al microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen una unidad de expresión, opcionalmente con actividad de expresión elevada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a expresar.
En una forma preferida de realización del proceso de la invención previamente descrito para modificar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos, los genes se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de productos de la química fina, en cuyo caso los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.
En una forma particularmente preferida del proceso de la invención previamente descrita para la modificación o la causa de la rata de transcripción de genes en microorganismos los genes se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo caso los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.
En una forma particularmente preferida las proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se seleccionan del grupo de aspartatoquinasa, aspartato-semialdehído-dehidrogenasa, diaminopimelato-dehidrogenasa, diaminopimelato-decarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinaldehído-3-fosfatdehidrogenasa, 3-fosfoglicerato-quinasa, piruvato-carboxilasa, triosefosfato-isomerasa, regulador de transcripción LuxR, regulador de transcripción LysR1, regulador de transcripción LysR2, malato-quinona-oxidoreductasa, glucosa6-fosfato-dehidrogenasa, 6-fosfogluconato-dehidrognasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserin-Oacetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistationina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, Oacetilhomoserina-sulfhidrilasa, metileno-tetrahidrofolato-reductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserinafosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserina-dehidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, soporte exportador de treonina, treonina-dehidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa l, cisteína-sintasa II, metionina-sintasa dependiente de coenzima B12, actividad de metionina-sintasa dependiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxinasulfitreductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato dehidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginil-ARN-t-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinahidroximetiltransferasa, fructosa-1,6-bisfosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6fosfofructoquinasa.
Proteínas preferidas y ácidos nucleicos que codifican estas proteínas de las proteínas descritas previamente de la vía de biosíntesis de aminoácidos son secuencias de proteína o secuencias de ácido nucleico de origen microbiano, preferentemente de bacterias del género Corynebacterium o Brevibacterium, preferiblemente de bacterias corineformes, particularmente preferible de Corynebacterium glutamicum.
Ejemplos de secuencias de proteína particularmente preferidas y las secuencias de ácido nucleico correspondientes que codifican estas proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos, cuyo documento de referencia y su denominación en el documento de referencia se listan en la tabla 1:
Tabla 1
Proteína
�?cido nucleico que codifica proteína Documento de referencia SEQ. ID. NO. en el documento de referencia
Aspartato-quinasa
ask o lysC EP1108790 DNA: 281 Proteína: 3781
Aspartato-semialdehídodehidrogenasa
asd EP1108790 DNA: 331 Proteína: 3831
Dihidrodipicolinatosintetasa
dapA WO 0100843 DNA: 55 Proteína: 56
Dihidrodipicolinatoreductasa
dapB WO 0100843 DNA: 35 Proteína: 36
Meso-diaminopimelatoD-dehidrogenasa
ddh EP1108790 DNA : 3494 Proteína : 6944
Diaminopicolinatodecarboxilasa
lysA EP1108790 DNA: 3451 Prot.:6951
Exportador de lisina
lysE EP1108790 DNA: 3455 Prot.: 6955
Arginil-ARN-t sintetasa
argS EP1108790 DNA: 3450 Prot.: 6950
Glucosa-6-fosfatodehidrogenasa
zwf WO 0100844 DNA: 243 Prot.: 244
Glicerinaldehído-3fosfato-Dehidrogenasa
gap WO 0100844 DNA: 187 Prot.: 188
3-Fosfoglicerato-quinasa
pgk WO 0100844 DNA: 69 Prot.: 70
Piruvato-carboxilasa
pycA EP1108790 DNA 765 Prot.: 4265
Triosa-fosfato-isomerasa
tpi WO 0100844 DNA: 61 Prot.: 62
Biotina-ligasa
birA EP1108790 DNA: 786 Prot.: 4286
PEP-carboxilasa
pck EP1108790 DNA: 3470 Prot.: 6970
Homoserina quinasa
thrB WO 0100843 DNA: 173 Prot.: 174
Treonina sintasa
thrC WO 0100843 DNA: 175 Prot.: 176
Exportador soporte de treonina
thrE WO 0251231 DNA: 41 Prot.: 42
Proteína de eflujo de treonina
RXA2390 WO 0100843 DNA: 7 Prot.: 8
Treonina dehidratasa
ilvA EP 1108790 DNA: 2328 Prot.: 5828
Homoserina-Oacetiltransferasa
metA EP 1108790 DNA:727 Prot: 4227
Cistationina-gammasintasa
metB EP 1108790 DNA:3491 Prot: 6991
Cistationina-beta-liasa
metC EP 1108790 DNA:2535 Prot: 6035
Metionina-sintasa dependiente de coenzima B12
metH EP 1108790 DNA:1663 Prot: 5163
O-Acetilhomoserinasulfhidrilasa
metY EP 1108790 DNA:726 Prot: 4226
Proteína
�?cido nucleico que codifica proteína Documento de referencia SEQ. ID. NO. en el documento de referencia
Metilentetrahidrofolatoreductasa
metF EP 1108790 DNA:2379 Prot: 5879
D-3-Fosfogliceratodehidrogenasa
serA EP 1108790 DNA:1415 Prot: 4915
Fosfoserina-fosfatasa 1
serB WO 0100843 DNA: 153 Prot.:154
Fosfoserina-fosfatasa 2
serB EP 1108790 DNA: 467 Prot: 3967
Fosfoserina-fosfatasa 3
serB EP 1108790 DNA: 334 Prot.: 3834
Fosfoserinaaminotransferasa
serC WO 0100843 DNA: 151 Prot.: 152
Serina acetil-transferasa
cysE WO 0100843 DNA: 243 Prot.: 244
Cisteína-sintasa I
cysK EP 1108790 DNA: 2817 Prot.: 6317
Cisteína sintasa II
CysM EP 1108790 DNA: 2338 Prot.: 5838
Homoserinadehidrogenasa
hom EP 1108790 DNA: 3452 Prot.: 6952
Metionina-sintasa independiente de coenzima B12
metE WO 0100843 DNA:755 Prot.: 756
Serina-Hidroximetiltransferasa
gliA WO 0100843 DNA: 143 Prot.: 144
Proteína en reducción de sulfato
RXA247 EP 1108790 DNA: 3089 Prot.: 6589
Proteína en reducción de sulfato
RXA248 EP 1108790 DNA: 3090 Prot.: 6590
Sulfatadeniltransferasa Subunidad 1
CysN EP 1108790 DNA: 3092 Prot.: 6592
Sulfatadeniltransferasa Subunidad 2
CysD EP 1108790 DNA: 3093 Prot.: 6593
Fosfoadenosina fosfosulfato reductasa Ferredoxina-sulfitoreductasa
CysH RXA073 WO 02729029 WO 0100842 DNA: 7 Prot.: 8 DNA: 329 Prot.: 330
Ferredoxina NADP reductasa
RXA076 WO 0100843 DNA: 79 Prot.: 80
Regulador de transcripción LuxR
luxR WO 0100842 DNA: 297 Proteína: 298
Regulador de transcripción LysR1
lysR1 EP 1108790 DNA: 676 Proteína: 4176
Regulador de transcripción LysR2
lysR2 EP 1108790 DNA: 3228 Proteína: 6728
Regulador de transcripción LysR3
lysR3 EP 1108790 DNA: 2200 Proteína: 5700
Malato-quinonaoxodoreductasa
mqo WO 0100844 DNA: 569 Proteína: 570
Transcetolasa
RXA2739 EP 1108790 DNA: 1740 Prot: 5240
Transaldolasa
RXA2738 WO 0100844 DNA: 245 Prot: 246
OPCA
opcA WO 0100804 DNA: 79 Prot: 80
1-Fosfofructoquinasa 1
pfk1 WO0100844 DNA: 55 Proteína: 56
1-Fosfofructoquinasa 2
pfk2 WO0100844 DNA: 57 Proteína: 58
6-Fosfofructoquinasa 1
6-pfk1 EP 1108790 DNA: 1383
Proteína
�?cido nucleico que codifica proteína Documento de referencia SEQ. ID. NO. en el documento de referencia
Proteína: 4883
6-Fosfofructoquinasa 2
6-pfk2 DE 10112992 DNA: 1 Proteína: 2
Fructosa-1,6-bisfosfatasa 1
fbr1 EP1108790 DNA:1136 Proteína: 4636
Piruvato oxidasa
poxB WO 0100844 DNA : 85 Proteína: 86
Regulador RXA00655
RXA655 US2003162267 .2 DNA: 1 Prot.: 2
Regulador RXN02910
RXN2910 US2003162267 .2 DNA: 5 Prot.: 6
6-fosfogluconolactonasa
RXA2735 WO 0100844 DNA: 1 Prot.: 2
Otro ejemplo de una secuencia de proteína particularmente preferida y la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica esta proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos, es la secuencia de la fructosa1,6-bisfosfatasa 2, o llamada también fbr2, (SEQ. ID. NO.20) y la secuencia de ácido nucleico correspondiente que
5 codifica una fructosa-1,6-bisfosfatasa 2 (SEQ. ID. NO.19).
Otro ejemplo de una secuencia de proteína particularmente preferida y la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica esta proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos, es la secuencia de la proteína en reducción de sulfato o llamada también RXA077, (SEQ. ID. NO. 3) y la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica una proteína en la reducción de sulfato (SEQ. ID. NO. 4)
10 Otras secuencias de proteína particularmente preferidas de la vía de biosíntesis de aminoácidos tienen respectivamente la secuencia de aminoácidos indicada en la Tabla 1 para esta proteína, en cuyo caso la proteína respectiva en al menos una de las posiciones de aminoácido indicadas en la Tabla 2/ columna 2 para esta secuencia de aminoácido tiene respectivamente un aminoácido proteinogénico diferente del respectivo aminoácido indicado en la Tabla 2/columna 3 en el mismo renglón. En otra forma preferida de realización, las proteínas tienen en al menos
15 una de las posiciones de aminoácido indicadas en la Tabla 2/columna 2 para la secuencia de aminoácido el aminoácido indicado en la Tabla 2/columna 4 en el mismo renglón. Las proteínas indicadas en la Tabla 2 son proteínas mutadas de la vía de biosíntesis de aminoácidos que tienen propiedades particularmente ventajosas y por esto son principalmente adecuadas para la expresión de los ácidos nucleicos correspondientes mediante el promotor de la invención y para la preparación de aminoácidos. Por ejemplo, la mutación T3111 conduce a una eliminación de
20 la retroalimentación (feedback) de ask.
Los ácidos nucleicos correspondientes que codifican una proteína mutada previamente descrita de la tabla 2 pueden producirse mediante procesos usuales.
Como punto de partida para la preparación de las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína mutada es adecuado, por ejemplo, el genoma de una cepa de Corynebacterium glutamicum que puede obtenerse de la 25 American Type Culture Collection bajo la denominación ATCC 13032 o las secuencias de ácido nucleico referidas en la Tabla 1. Para la retro-traducción de la secuencia de aminoácido de las proteínas mutadas a las secuencias de ácido nucleico que codifican estas proteínas es ventajoso usar el codon usage del organismo al cual debe introducirse la secuencia de ácido nucleico o en el cual se encuentra presente la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, es ventajoso para Corynebacterium glutamicum usar el codon usage (utilización de codón) de
30 Corynebacterium glutamicum. La utilización de codón (codon usage) del respectivo microorganismo puede averiguarse de manera conocida de los bancos de datos o de las solicitudes de patente que describen al menos una proteína y un gen, que codifica esta proteína, del organismo deseado.
Los datos de la Tabla 2 han de ser entendidos de la siguiente manera:
En la columna 1 "Identificación" representa una denominación unívoca para cada secuencia respecto de la Tabla 1.
35 En la columna 2 "AS-POS" se refiere al número respectivo en la posición de aminoácido de la correspondiente secuencia de polipéptido de la Tabla 1. Un "26" en la columna "AS-POS" significa por lo tanto la posición de aminoácido 26 de la secuencia de polipéptido indicada de manera correspondiente. La numeración de la posición inicia en +1 la terminación N.
En la columna 3 "AS -tipo silvestre" la letra respectiva designa el aminoácido – representado en el código de una letra – en la posición indicada en la columna 2 en la cepa de tipo silvestre correspondiente de la secuencia de la Tabla 1.
En la columna 4 "AS-mutante" la letra respectiva designa el aminoácido – representado en el código de una letra en la posición indicada en la columna 2 en la cepa mutante correspondiente.
En la columna 5 "Función" representa la función fisiológica de la secuencia de polipéptido correspondiente.
Para una proteína mutada con una función determinada (columna 5) y una determinada secuencia de aminoácido de partida (Tabla 1) en las columnas 2, 3 y 4 se describe al menos una mutación, en algunas secuencias también se describen varias mutaciones. Estas varias mutaciones se refieren siempre a la secuencia de aminoácido de partida más próxima, que se encuentra arriba respectivamente (Tabla 1). Por el concepto "al menos una de las posiciones de aminoácido" de una determinada secuencia de aminoácidos se entiende preferentemente al menos una de las mutaciones descritas para esta secuencia de aminoácidos en la columna 2, 3 y 4.
Código de una letra de los aminoácidos proteinogénicos:
A
Alanina
C
Cisteína
D
Aspartato
E
Glutamato
F
Fenilalanina
G
Glicina
H
Histidina
I
Isoleucina
K
Lisina
L
Leucina
M
Metionina
N
Asparagina
P
Prolina
Q
Glutamina
R
Arginina
S
Serina
T
Treonina
V
Valina
W
Triptofano
Y
Tirosina
Tabla 2
Columna 1
Columna 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5
Identificación
AS Posición AS Tipo silvestre AS Mutante Función
ask
317 S A Aspartato-quinasa
311
T I
279
A T
asd
66 D G Aspartato-semialdehídodehidrogenasa
234
R H
272
D E
285
K E
20
L F
dapA
2 S A Dihidrodipicolinato sintetasa
84
K N
85
L V
dapB
91 D A Dihidrodipicolinatoreductasa
83
D N
ddh
174 D E Meso-diaminopimelato-Ddehidrogenasa
235
F L
237
S A
IysA
265 A D Diaminopicolinatodecarboxilasa
320
D N
332
I V
argS
355 G D Arginil-ARN-t-sintetasa
156
A S
513
V A
540
H R
zwf
8 S T Glucosa-6-fosfatodehidrogenasa
150
T A
321 1
G S
gap
264 G S Glicerinaldehído-3-fosfatodehidrogenasa
pycA
7 S L Piruvato-carboxilasa
153
E D
182
A S
206
A S
227
H R
455
A G
458
P S
639
S T
1008
R H
1059
S P
1120
D E
pck
162 H Y PEP-Carboxilasa
241
G D
829
T R
thrB
103 S A Homoserina quinasa
190
T A
133
A V
138
P S
thrC
69 G R Treonina sintasa
Columna 1
Columna 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5
478
T I
RXA330
85 I M Proteína de eflujo de treonina
161
F I
195
G D
hom
104 V I Homoserina-Dehidrogenasa
116
T I
148
G A
59
V A
270
T S
345
R P
268
K N
61
D H
72
E Q
lysR1
80 R H regulador de transcripción LysR1
lysR3
142 R W regulador de transcripción LysR3
179
A T
RXA2739
75 N D Transquetolasa
329
A T
332
A T
556
V I
RXA2738
242 K M Transaldolasa
opcA
107 Y H OpcA
219
K N
233
P S
261
Y H
312
S F
65
G R Aspartato-1-Decarboxilasa
33
G S 6-Fosfogluconolactonasa
En el método de la invención descrito previamente para modificar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos, así como en los métodos descritos a continuación para producir microorganismos modificados genéticamente, en los microorganismos modificados genéticamente descritos a continuación y en los métodos
5 descritos a continuación para la producción de productos biosintéticos, la introducción de los ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1, de las unidades de expresión, de los genes descritos previamente y de los constructos de ácido nucleico o casetes de expresión descritos previamente al microorganismo, principalmente en bacterias corinefomes, se efectúa preferentemente mediante el método SacB.
El método SacB es conocido por el experto en la materia y se describe, por ejemplo, en Schäfer A, Tauch A, Jäger
10 W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A.; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22; 145(1):69-73 y Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun;5(6):1447-57.
15 En una forma preferida de realización del método de la invención descrito previamente, la modificación o la causa de la rata de transcripción de genes en microorganismos ocurre introduciendo ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1 o unidades de expresión en el microorganismo.
En otra forma preferida de realización del método de la invención previamente descrito la modificación o la causa de la rata de transcripción de genes en microorganismos se efectúa introduciendo los constructos de ácido nucleico o
20 casetes de expresión previamente descritos en el microorganismo.
Los vectores son bien conocidos para el experto en la materia y pueden inferirse, por ejemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., editores, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Por vectores, además de plásmidos también han de entenderse todos los otros vectores conocidos para el experto en la materia, como por ejemplo fagos, transposons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, y ADN lineal o circular. Esos vectores pueden replicarse
25 de manera autónoma den el organismo huésped o replicarse de manera cromosómica.
Como plásmidos son adecuados de manera particularmente preferida aquellos que se replican en bacterias corineformes. Numerosos vectores de plásmido conocidos como, por ejemplo, pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores de plásmido como, por ejemplo, pCLiK5MCS, o aquellos que se basan en pCG4 (US-A 4,489,160) o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66,119-124 (1990)) o pAG1 (US-A 5,158,891), pueden usarse de igual manera.
Además, también son adecuados aquellos vectores de plásmido con ayuda de los cuales puede aplicarse el proceso de la amplificación de gen por integración al cromosoma, tal como fue descrito por Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)) para la duplicación o amplificación del operon hom-thrB. En este método se clona el gen a un vector de plásmido que puede replicar en un huésped (de manera típica E. coli), pero no en C. glutamicum. Como vectores vienen al caso, por ejemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1,784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schäfer et al., Gene 145,69-73 (1994)), Bernard et al., Journal of Molecular Biology,
234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) o pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342). El vector de plásmido que contiene el gen a amplificar se transfiere a continuación a la cepa deseada de C. Glutamicum mediante transformación. Se describen métodos para la transformación, por ejemplo, en Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994)).
La invención también se refiere a un microorganismo genéticamente modificado, en cuyo caso la modificación genética conduce a la modificación o causa de la rata de transcripción de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre y depende de
La regulación de la transcripción de genes en el microorganismo mediante ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 7, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.
Tal como se ha descrito previamente en el caso de los métodos, la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo se logra mediante ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 7
b1) introduciendo uno o varios ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, al genoma del microorganismo, de modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor según la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o
b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor según la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o
b3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor según la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.
La invención se refiere además a un microorganismo genéticamente modificado con rata de transcripción aumentada o causada de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre, en cuyo caso la transcripción de genes en el microorganismo se regula mediante ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 7, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.
Tal como se describió previamente en el caso de los métodos, la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo se logra mediante ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 7
bh1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúe bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, o
bh2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o de varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor según la reivindicación 7, opcionalmente con elevada específica actividad de promotor, o
bh3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor según la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.
Microorganismos genéticamente modificados también pueden contener modificaciones genéticas que conducen a una modificación o causa de la rata de expresión de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre y dependen de la regulación de la expresión de genes en el microorganismo mediante unidades de expresión ), en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de las unidades de expresión.
Tal como se describió previamente en el caso de los métodos, la regulación de la expresión de genes en el microorganismo se logra mediante unidades de expresión
d1) introduciendo al genoma del microorganismo una o varias unidades de expresión opcionalmente con actividad de expresión modificada específica de tal modo que la expresión de uno o varios genes endógenos se efectúe bajo el control de las unidades de expresión introducidas, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, o
d2) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios genes de tal modo que la expresión de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de las unidades de expresión endógenas, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica o
d3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen una unidad de expresión, opcionalmente con actividad de expresión modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a expresar.
De manera particularmente preferida, la presente invención se refiere a microorganismos genéticamente modificados, principalmente a bacterias corineformes que contienen un vector, principalmente un vector de péndulo
o vector de plásmido el cual tiene al menos un constructo recombinante de ácido nucleico según la definición de la invención.
En una forma preferida de realización de los microorganismos genéticamente modificados, los genes descritos previamente son al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de la vía de biosíntesis de productos de la química fina.
En una forma particularmente preferida de los microorganismos genéticamente modificados, los genes descritos previamente se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos nucleicos proteinogénicos y no proteinogénicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo caso los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.
Las proteínas preferidas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se seleccionan del grupo de aspartato-quinasa, aspartato-semialdehído-dehidrogenasa, diaminopimelato-dehidrogenasa, diaminopimelato-decarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinoaldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, 3fosfoglicerato-quinasa, piruvato-carboxilasa, triosa-fosfato-isomerasa, regulador de transcripción LuxR, regulador de transcripción LisR1, regulador de transcripción LisR2, malato-quinona-oxidoreductasa, glucosa-6-fosfatodehidrogenasa, 6-fosfogluconato-dehidrogenasa, transquetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metilen-tetrahidrofolato-reductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserina-dehidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, soporte exportador de treonina, treoninadehidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa l, cisteína-sintasa II, metionina – sintasa dependiente de coenzima B12, actividad de metionina – sintasa dependiente de coenzima B12, sulfatoadenil-transferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato dehidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginil-ARN-t sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinhidroximetiltransferasa, fructosa-1,6bisfosfatasa, proteína de la sulfato-reducción RXA077, proteína de la sulfato-reducción RXA248, proteína de la sulfato-reducción RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6-fosfofructoquinasa.
Ejemplos particularmente preferidos de las proteínas y genes de la vía de biosíntesis de aminoácidos se describen previamente en la Tabla 1 y Tabla 2.
Microorganismos preferidos o microorganismos genéticamente modificados son bacterias, algas, hongoso levaduras.
Microorganismos particularmente preferidos son principalmente bacterias corineformes.
Bacterias corineformes preferidas son bacterias del género Corynebacterium, principalmente de las variedades Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola y Corynebacterium efficiens o del género 5 Brevibacterium, principalmente de las variedades Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum y Brevibacterium divaricatum.
Bacterias particularmente preferidas de los géneros Corynebacterium y Brevibacterium se seleccionan del grupo Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium
10 melassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium efficiens DSM 44548. Corynebacterium efficiens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 y Corynebacterium glutamicum ATCC21608.
La abreviatura KFCC significa Korean Federation of Culture Collection, la abreviatura ATCC significa la American
15 type strain culture collection, la abreviatura DSM significa die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (la Colección Alemana de Microorganismos).
Otras bacterias particularmente preferidas de los géneros Corynebacterium y Brevibacterium se listan en la
Tabla 3:
Bacteria
Número de depósito
Género
Especie ATCC FER NRRL CEC T NCIMB CBS NCTC DSMZ
Brevibacterium
ammoniagenes 21054
Brevibacterium
ammoniagenes 19350
Brevibacterium
ammoniagenes 19351
Brevibacterium
ammoniagenes 19352
Brevibacterium
ammoniagenes 19353
Brevibacterium
ammoniagenes 19354
Brevibacterium
ammoniagenes 19355
Brevibacterium
ammoniagenes 19356
Brevibacterium
ammoniagenes 21055
Brevibacterium
ammoniagenes 21077
Brevibacterium
ammoniagenes 21553
Brevibacterium
ammoniagenes 21580
Brevibacterium
ammoniagenes 39101
Brevibacterium
butanicum 21196
Brevibacterium
divaricatum 21792 P928
Brevibacterium
flavum 21474
Brevibacterium
flavum 21129
Brevibacterium
flavum 21518
Brevibacterium
flavum B11474
Brevibacterium
flavum B11472
Brevibacterium
flavum 21127
Brevibacterium
flavum 21128
Brevibacterium
flavum 21427
Brevibacterium
flavum 21475
Brevibacterium
flavum 21517
Brevibacterium
flavum 21528
Brevibacterium
flavum 21529
Brevibacterium
flavum B11477
Brevibacterium
flavum B11478
Brevibacterium
flavum 21127
Brevibacterium
flavum B11474
Brevibacterium
healii 15527
Brevibacterium
ketoglutamicum 21004
Brevibacterium
ketoglutamicum 21089
Bacteria
Número de depósito
Género
Especie ATCC FER NRRL CEC T NCIMB CBS NCTC DSMZ
Brevibacterium
ketosoreductum 21914
Brevibacterium
lactofermentum 70
Brevibacterium
lactofermentum 74
Brevibacterium
lactofermentum 77
Brevibacterium
lactofermentum 21798
Brevibacterium
lactofermentum 21799
Brevibacterium
lactofermentum 21800
Brevibacterium
lactofermentum 21801
Brevibacterium
lactofermentum B11470
Brevibacterium
lactofermentum B11471
Brevibacterium
lactofermentum 21086
Brevibacterium
lactofermentum 21420
Brevibacterium
lactofermentum 21086
Brevibacterium
lactofermentum 31269
Brevibacterium
linens 9174
Brevibacterium
linens 19391
Brevibacterium
linens 8377
Brevibacterium
paraffinolyticum 11160
Brevibacterium
spec. 717.7 3
Brevibacterium
spec. 717.7 3
Brevibacterium
spec. 14604
Brevibacterium
spec. 21860
Brevibacterium
spec. 21864
Brevibacterium
spec. 21865
Brevibacterium
spec. 21866
Brevibacterium
spec. 19240
Corynebacterium
acetoacidophilum 21476
Corynebacterium
acetoacidophilum 13870
Corynebacterium
acetoglutamicum B11473
Corynebacterium
acetoglutamicum B11475
Corynebacterium
acetoglutamicum 15806
Corynebacterium
acetoglutamicum 21491
Corynebacterium
acetoglutamicu 31270
Corynebacterium
acetophilum B3671
Corynebacterium
ammoniagenes 6872 2399
Corynebacterium
ammoniagenes 15511
Corynebacterium
fujiokense 21496
Corynebacterium
glutamicum 14067
Corynebacterium
glutamicum 39137
Corynebacterium
glutamicum 21254
Corynebacterium
glutamicum 21255
Corynebacterium
glutamicum 31830
Corynebacterium
glutamicum 13032
Corynebacterium
glutamicum 14305
Corynebacterium
glutamicum 15455
Corynebacterium
glutamicum 13058
Corynebacterium
glutamicum 13059
Corynebacterium
glutamicum 13060
Corynebacterium
glutamicum 21492
Corynebacterium
glutamicum 21513
Corynebacterium
glutamicum 21526
Corynebacterium
glutamicum 21543
Bacteria
Número de depósito
Género
Especie ATCC FER NRRL CEC T NCIMB CBS NCTC DSMZ
Corynebacterium
glutamicum 13287
Corynebacterium
glutamicum 21851
Corynebacterium
glutamicum 21253
Corynebacterium
glutamicum 21514
Corynebacterium
glutamicum 21516
Corynebacterium
glutamicum 21299
Corynebacterium
glutamicum 21300
Corynebacterium
glutamicum 39684
Corynebacterium
glutamicum 21488
Corynebacterium
glutamicum 21649
Corynebacterium
glutamicum 21650
Corynebacterium
glutamicum 19223
Corynebacterium
glutamicum 13869
Corynebacterium
glutamicum 21157
Corynebacterium
glutamicum 21158
Corynebacterium
glutamicum 21159
Corynebacterium
glutamicum 21355
Corynebacterium
glutamicum 31808
Corynebacterium
glutamicum 21674
Corynebacterium
glutamicum 21562
Corynebacterium
glutamicum 21563
Corynebacterium
glutamicum 21564
Corynebacterium
glutamicum 21565
Corynebacterium
glutamicum 21566
Corynebacterium
glutamicum 21567
Corynebacterium
glutamicum 21568
Corynebacterium
glutamicum 21569
Corynebacterium
glutamicum 21570
Corynebacterium
glutamicum 21571
Corynebacterium
glutamicum 21572
Corynebacterium
glutamicum 21573
Corynebacterium
glutamicum 21579
Corynebacterium
glutamicum 19049
Corynebacterium
glutamicum 19050
Corynebacterium
glutamicum 19051
Corynebacterium
glutamicum 19052
Corynebacterium
glutamicum 19053
Corynebacterium
glutamicum 19054
Corynebacterium
glutamicum 19055
Corynebacterium
glutamicum 19056
Corynebacterium
glutamicum 19057
Corynebacterium
glutamicum 19058
Corynebacterium
glutamicum 19059
Corynebacterium
glutamicum 19060
Corynebacterium
glutamicum 19185
Corynebacterium
glutamicum 13286
Bacteria
Número de depósito
Género
Especie ATCC FER NRRL CEC T NCIMB CBS NCTC DSMZ
Corynebacterium
glutamicum 21515
Corynebacterium
glutamicum 21527
Corynebacterium
glutamicum 21544
Corynebacterium
glutamicum 21492
Corynebacterium
glutamicum B8183
Corynebacterium
glutamicum B8182
Corynebacterium
glutamicum B12416
Corynebacterium
glutamicum B12417
Corynebacterium
glutamicum 812418
Corynebacterium
glutamicum B11476
Corynebacterium
glutamicum 21608
Corynebacterium
lilium P973
Corynebacterium
nitrilophilus 21419 11594
Corynebacterium
spec. P4445
Corynebacterium
spec. P4446
Corynebacterium
spec. 31088
Corynebacterium
spec. 31089
Corynebacterium
spec. 31090
Corynebacterium
spec. 31090
Corynebacterium
spec. 31090
Corynebacterium
spec. 15954 20145
Corynebacterium
spec. 21857
Corynebacterium
spec. 21862
Corynebacterium
spec. 21863
Las abreviaturas tienen el siguiente significado: ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japón
5 NRRL: ARS Culture Collection, Northem Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA CECT: Colección Española de Cultivos Tipo, Valencia, España NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL NCTC: National Collection of Type Cultures, Londres, UK
10 DSMZ: Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y
Cultivos celulares), Brunswick, Alemania Mediante los ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1 es posible con ayuda de los métodos previamente descritos regular en los microorganismos genéticamente modificados descritos previamente las vías metabólicas hacia productos biosintéticos específicos.
15 Para esto se refuerzan, por ejemplo, las vías metabólicas que conducen hacia un producto biosintético específico causando o elevando la rata de transcripción o la rata de expresión de genes de esta vía biosintética en la que la cantidad aumentada de proteína conduce a una actividad total elevada se estas proteínas de la vía de biosíntesis deseada y con esto a un flujo metabólico reforzado hacia un producto biosintético deseado.
Además, las vías metabólicas que divergen de un producto biosintético específico pueden disminuirse reduciendo la rata de transcripción o rata de expresión de genes de esta vía biosintética divergente en la cual una cantidad reducida de proteína conduce a una actividad total reducida de estas proteínas de la vía biosintética indeseada y, con esto, adicionalmente a un flujo metabólico indeseado en la dirección de un producto biosintético deseado.
Los microorganismos genéticamente modificados de la invención son capaces de producir productos biosintéticos a partir de, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidón, celulosa o glicerina y etanol.
De acuerdo con el producto biosintético deseado la rata de transcripción de diferentes genes puede elevarse o reducirse. Por lo regular es ventajoso modificar la rata de transcripción de varios genes, es decir elevar la rata de transcripción de una combinación de genes y/o reducir la rata de transcripción de de una combinación de genes.
En los microorganismos genéticamente modificados de la invención, al menos una rata de transcripción modificada, es decir elevada o reducida, de un gen es atribuible a un ácido nucleico con actividad de promotor según la reivindicación 1.
Otras ratas de transcripción adicionales modificadas, es decir adicionalmente elevadas o adicionalmente reducidas, de otros genes en el microorganismo modificado genéticamente pueden, pero no tienen que atribuirse a los ácidos nucleicos con actividad de promotor según la reivindicación 1.
Los microorganismos genéticamente modificados de la invención pueden utilizarse en un método para la producción de productos biosintéticos.
Productos biosintéticos preferidos son productos de la química fina.
La expresión "productos de la química fina" es conocida en el campo especializado y comprende compuestos que son producidos por un organismo y encuentran aplicaciones en diferentes ramas de la industria como, por ejemplo, aunque no se restringe a, la industria farmacéutica, la agricultura, la industria de cosméticos, de alimentos para humanos y de comida para animales. Estos compuestos comprenden ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido tartárico, ácido itacónico y ácido diaminopimélico, aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, bases purina y bases pirimidina, nucleósidos y nucleótidos (tal como se describe en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, páginas 561-612, en Biotechnology volumen 6, Rehm et al., Editores VCH: Weinheim y las referencias citadas allí), lípidos, ácidos grasos saturados e insaturados (por ejemplo, ácidos araquidónico), dioles (por ejemplo, propandiol y butandiol), carbohidratos (por ejemplo, ácido hialurónico y trehalosa), compuestos aromáticos (por ejemplo, aminas aromáticas, vanilina e índigo), vitaminas y cofactores (tal como se describe en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, volumen A27, "Vitamins", páginas 443-613 (1996) VCH: Weinheim y las referencias citadas allí; y Ong, A.S., Niki, E. y Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research -Asia, celebrado el 1 -3 de septiembre de 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press (1995)), Enzimas y todos los otros compuestos químicos descritos por Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las citas bibliográficas allí indicadas. El metabolismo i los usos de determinados productos de la química fina se explican más adelante.
I. Metabolismo y usos de aminoácido
Los aminoácidos comprenden las unidades estructurales fundamentales de todas las proteínas y de esta manera son esenciales para las funciones celulares normales. El término "aminoácido" es conocido en el campo técnico especializado. Los aminoácidos proteinogénicos, de los cuales existen 20 tipos, sirven como unidades estructurales para proteínas, en las que se conectan entres sí a través de enlaces peptídicos, mientras que los aminoácidos no proteinogénicos (de los cuales se conocen cientos) usualmente no tienen lugar en proteínas (véase Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, volumen A2, páginas 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Los aminoácidos pueden presentarse en la configuración D o L a pesar de que los L-aminoácidos son habitualmente el único tipo que se encuentra en las proteínas de procedencia natural. Las vías de biosíntesis y de degradación de cada una de los 20 aminoácidos proteinogénicos están bien caracterizados tanto en células procariotas como también eucariotas (véase por ejemplo Stryer, L. Biochemistry, 3. Edición, páginas 578-590 (1988)). Los aminoácidos "esenciales" (histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano y valina), así denominados porque tienen que ser ingeridos con la alimentación debido a la complejidad de su biosíntesis, se convierten mediante vías de biosíntesis sencillas en los demás 11 aminoácidos "no esenciales" (alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamato, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina). Los animales superiores poseen la capacidad de sintetizar algunos de estos aminoácidos, aunque los aminoácidos esenciales tienen que ingerirse con la alimentación para que tenga lugar una síntesis normal de proteínas.
Aparte de su función en la biosíntesis de proteína, estos aminoácidos son compuestos químicos interesantes per se y se ha descubierto que muchos se emplean en aplicaciones diferentes en la industria de productos alimenticios, de comida para animales, de la química, los cosméticos, la agricultura y farmacéutica. La lisina es un aminoácido importante no solo para la nutrición humana sino también para animales monogástricos como las aves domésticas y los cerdos. El glutamato se usa la mayoría de las veces como aditivo de sabor (glutamato monosódico, MSG) así como además en la industria de alimentos, como también aspartato, fenilalanina, glicina y cisteína. Glicina, Lmetionina y triptofano se usan todos en la industria farmacéutica. Glutamina, valina, leucina, isoleucina, histidina, arginina, prolina, serina y alanina se usan en la industria farmacéutica y en la industria de cosméticos. Treonina, Triptofano y D-/L-metionina son aditivos ampliamente usados en comida para animales (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids -technical production and use, páginas 466-502 en Rehm et al., (editores) Biotechnology volumen 6, capítulo 14a, VCH: Weinheim). Se ha descubierto que estos aminoácidos son adecuados además como precursores para la síntesis de aminoácidos y proteínas sintéticos, como N-acetil-cisteína, S-carboximetil-L-cisteína, (S)-5hidroxitriptofano y otras sustancias descritas en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, volumen A2, páginas 57-97, VCH, Weinheim, 1985.
La biosíntesis de estos aminoácidos naturales en organismos que los pueden producir, por ejemplo bacterias, ha sido bien caracterizada (para una revisión general de la biosíntesis bacteriana de aminoácidos y su regulación, véase Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533 -606). El glutamato se sintetiza mediante aminación reductiva de -ceto-glutarato, un producto intermedio en el ciclo de ácido cítrico. Glutamina, prolina y arginina se generan cada una sucesivamente a partir de glutamato. La biosíntesis de serina se efectúa en un proceso de tres pasos e inicia con 3-fosfoglicerato (un producto intermedio en la glicólisis) y después de los pasos de oxidación, trasnominación e hidrólisis da lugar a estos aminoácidos. Cisteína y glicina se producen respectivamente de serina; la primera por condensación de homo-cisteína con serina, y la última por transferencia del átomo de carbono de la cadena lateral al tetrahidrofolato, en una reacción catalizada por serina transhidroximetilasa. Fenilalanina y tirosina se sintetizan a partir de los precursores de la vía de glicólisis y pentosa-fosfato, eritrosa-4-fosfato y fosfoenolpiruvato en una vía de biosíntesis de 9 pasos que solo en los dos últimos pasos se diferencia después de la síntesis de prefenato. El triptofano también se produce a partir de estas dos moléculas de partida, aunque su síntesis se efectúa en una vía de 11 pasos-La tirosina también puede producirse de fenilalanina en una reacción catalizada por fenilalaninhidroxilasa. Alanina, valina y leucina son respectivamente productos de biosíntesis de piruvato, el producto final de la glicólisis. El aspartato se forma a partir de oxalacetato, un producto intermedio del ciclo de citrato. Asparagina, metionina, treonina y lisina se producen respectivamente mediante conversión de aspartato. La isoleucina se forma a partir de treonina. En una vía compleja de 9 pasos la formación de histidina se efectúa a partir de 5-fosforibosil-1-pirofosfato, un azúcar activado.
No pueden almacenarse aminoácidos cuya cantidad exceda la demanda de biosíntesis de proteína de la célula, y en lugar de esto se degradan, de tal modo que los productos intermedios se proporcionan para las vías metabólicas principales de la célula (para una revisión general véase Strier, L., Biochemistry, 3. Edición, capítulo 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cicle"; páginas 495-516 (1988)). Si bien la célula es capaz de convertir aminoácidos indeseados en productos intermediarios útiles, no obstante la producción de aminoácido es costosa en términos de la energía, de las moléculas precursoras y de las enzimas necesarias para su síntesis. Por lo tanto no sorprende que la biosíntesis de aminoácido se regule mediante la inhibición de retroalimentación (feedback), en cuyo caso la presencia de un aminoácido determinado torna más lenta su propia producción o la finaliza enteramente (para una revisión general sobre el mecanismo de retroalimentación en vías de biosíntesis de aminoácido véase Strier, L., Biochemistry, 3. Edición, capitulo 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", páginas 575-600. (1988)). El rendimiento de un aminoácido determinado se restringe por lo tanto por la cantidad de este aminoácido en la célula.
II. Metabolismo y usos de vitaminas, cofactores y nutracéuticos
Vitaminas, cofactores y nutracéuticos comprenden otro grupo de moléculas. Los animales superiores han perdido la capacidad de sintetizar éstos y tienen que ingerirlos a pesar de que otros organismos como las bacterias las sintetizan fácilmente. Estas moléculas son, o bien moléculas biológicamente activas per se, o bien precursores de sustancias biológicamente activas que sirven como portadores de electrones o productos intermedios en una serie de vías metabólicas. Estos compuestos también tienen, además de su valor nutritivo, un valor industrial significativo como colorantes, antioxidantes y catalizadores u otros auxiliares de procesamiento. (Para una revisión general sobre la estructura, actividad y las aplicaciones industriales de estos compuestos véase por ejemplo Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", volumen A27, páginas 443-613, VCH: Weinheim, 1996). El término "vitamina" es conocido en el campo especializado y comprende nutrientes que un organismo requiere para una función normal aunque este mismo organismo no puede sintetizarlas. El grupo de las vitaminas puede comprender cofactores y compuestos nutracéuticos. El término "cofactor" comprende compuestos no proteinogénicos que son necesarios para la ocurrencia de actividad enzimática normal. Estos compuestos pueden ser orgánicos o inorgánicos; las moléculas co-factores de la invención son preferentemente orgánicas. El término "nutracéutico" comprende aditivos nutritivos que promueven la salud en plantas y animales, principalmente en las personas. Ejemplos de tales moléculas son vitaminas, antioxidantes e igualmente determinados lípidos (por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados).
La biosíntesis de estas moléculas en organismos que son capaces de su producción, tales como las bacterias, se ha caracterizado de manera completa (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", volumen A27, páginas 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons: Ong, A.S., Niki, E. y Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research -Asia, celebrado el 1 – 3 de septiembre de 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).
La tiamina (vitamina B1) se forma mediante acoplamiento químico de unidades de pirimidina y de tiazol. Riboflavina (vitamina B2) se sintetiza a partir de guanosina-5’-trifosfato (GTP) y ribosa-5’-fosfato. La riboflavina se emplea a su vez para la síntesis de flavinmononucleótido (FMN) y flavinadenindinucleótido (FAD). La familia de compuestos que se denominan conjuntamente como "vitamina B6" (por ejemplo piridoxina, piridoxamina, piridoxal-5’-fosfato y el hidrocloruro de piridoxina usado comercialmente), son todos los derivados de la unidad estructural común 5-hidroxi6-metilpiridina. Pantotenato (ácido pantoténico, R-(+)-N-(2,4-dihidroxi-3,3-dimetil-1-oxobutil)--alanina) puede producirse o bien mediante síntesis química o bien mediante fermentación. Los últimos pasos en la biosíntesis de pantotenato consisten en la condensación de -alanina y ácido pantóico accionada por ATP. Las enzimas responsables por los pasos de biosíntesis para la conversión en ácido pantóico, en –alanina y para la condensación en ácido pantoténico son conocidas. La forma metabólicamente activa de pantotenato es la coenzima A cuya biosíntesis transcurre por 5 pasos enzimáticos. El pantotenato, piridoxal-5’-fosfato, cisteína y ATP son los precursores de la coenzima A. Estas enzimas catalizan no solo la formación de pantotenato sino también la producción de ácido (R)-pantóico, (R)-pantolactona, (R)-pantenol (provitamina B5), panteteina (y sus derivados) y coenzima A.
La biosíntesis de biotina a partir de la molécula precursora pimeloil-CoA en microorganismos se ha investigado de manera detallada, y se han identificado varios de los genes que intervienen. Se ha comprobado que muchas de las proteínas correspondientes intervienen en la síntesis de agrupamiento de Fe y pertenecen a la clase de las nifSproteínas. El ácido lipóico se deriva del ácido octanoico y sirve como coenzima en el metabolismo de energía, donde se vuelve componente del complejo piruvato-dehidrogenasa y del complejo –cetoglutarato-dehidrogenasa. Los folatos son un grupo de sustancias que se derivan todas del ácido fólico el cual se deriva a su vez de ácido Lglutámico, ácido p-aminobenzoico y 6-metil-pterina. La biosíntesis del ácido fólico y de sus derivados a partir de los productos metabólicos intermedios guanosina-5’-trifosfato (GTP), ácido L-glutámico y ácido p-aminobenzoico se ha investigado en detalle en determinados microorganismos.
Corrinoides (como las cobalaminas y principalmente la vitamina B12) y las porfirinas pertenecen a un grupo de compuestos químicos que se distinguen por un sistema anular tetrapirrol. La biosíntesis de la vitamina B12 es tan compleja que aún no ha sido completamente caracterizada aunque entretanto la mayoría de las enzimas y sustratos que intervienen son conocidos. El ácido nicotínico (nicotinato) y la nicotinamida son derivados de piridina que también se denominan "niacina". La niacina es la precursora de las coenzimas más importantes NAD (nicotinamidadenin-dinucleótido) y NADP (nicotinamid-adenin-dinucleótido-fosfato) y sus formas reducidas.
La producción de estos compuestos a escala industrial se basa en su mayor parte en síntesis químicas libres de células aunque algunos de estos compuestos químicos se han producido igualmente mediante cultivo a gran escala de microorganismos, tal como la riboflavina, la vitamina B6, pantotenato y biotina. Solo la vitamina B12 se produce por fermentación debido a la complejidad de su síntesis. Los métodos in-vitro requieren un gasto considerable en materiales y tiempo y con frecuencia altos costes.
III. Metabolismo y usos de purina, pirimidina, nucleósido y nucleótido
Los genes para el metabolismo de purina y pirimidina y sus proteínas correspondientes son objetivos importantes para la terapia de patologías tumorales e infecciones virales. El término "purina" o "pirimidina" comprende bases nitrogenadas que son un componente de los ácidos nucleicos, coenzimas y nucleótidos. El término "nucleótido" comprende las unidades estructurales fundamentales de moléculas de ácido nucleico que comprenden una base nitrogenada, un azúcar de pentosa (en el caso de ARN es el azúcar ribosa, en el caso de ADN es el azúcar Ddesoxiribosa) y ácido fosfórico. El término "nucleósido" comprende moléculas que sirven como precursores de nucleótidos pero que no tienen unidad de ácido fosfórico por contraste con los nucleótidos. Inhibiendo la biosíntesis de estas moléculas o su inmovilización para la formación de moléculas de ácido nucleico es posible inhibir la síntesis de ARN y de ADN; si esta actividad se inhibe en las células cancerígenas de manera dirigida al objetivo, puede inhibirse la capacidad de dividirse y replicarse que tienen las células tumorales.
Existen, además, nucleótidos que no forman una molécula de ácido nucleico aunque sirven como almacenadores de energía (es decir, AMP) o como coenzimas (es decir, FAD y NAD).
Muchas publicaciones han descrito el uso de estos productos químicos para indicaciones medicinales, en cuyo caso el metabolismo de purina y/o de pirimidina se ve afectado (por ejemplo, Christopherson, R.I. y Lions, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine byosinthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res. Reviews
10: 505-548). Las investigaciones de enzimas que intervienen en el metabolismo de purina y pirimidina se han concentrado en el desarrollo de nuevos medicamentos que pueden usarse, por ejemplo, como agentes de inmunosupresión o antiproliferantes (Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). Las bases de purina y pirimidina, nucleósidos y nucleótidos no obstante también tienen otras posibilidades de empleo: como productos intermedios en la biosíntesis de diferentes productos de la química fina (por ejemplo, tiamina, S-adenosil-metionina, folatos o riboflavina), como portadores de energía para la célula (por ejemplo ATP o GTP) y para los mismos compuestos químicos, usualmente se usan como reforzadores de sabor (por ejemplo IMP o GMP) o para muchas aplicaciones medicinales (véase, por ejemplo, Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology volumen 6, Rehm et al., editores VCH: Weinheim, páginas 561-612). Enzimas que intervienen en el metabolismo de purina, pirimidina, nucleósido o nucleótido, también sirven cada vez con más fuerza como objetivos para desarrollar compuestos químicos para protección vegetal, incluidos fungicidas, herbicidas e insecticidas.
El metabolismo de estos compuestos en bacterias se ha caracterizado (para revisiones generales véanse, por ejemplo, Zalkin, H. y Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" en Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, volumen 42, Academic Press, páginas 259-287; y Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides"; capítulo 8 en : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). El metabolismo de purina, el objeto de investigación más intensa, es esencial para el funcionamiento normal de las células. Un metabolismo perturbado de purina en animales superiores puede causar patologías severas, por ejemplo gota. Los nucleótidos de purina se sintetiza por una serie de pasos mediante el compuesto intermedio inosin-5’-fosfato (IMP) de ribosa-5-fosfato, lo cual conduce a la producción de guanosina-5’-monofosfato (GMP) o adenosina-5’-monofosfato (AMP), a partir de los cuales pueden producirse fácilmente las formas trifosfato usadas como nucleótidos. Estos compuestos también se usan como almacenadores de energía de tal modo que su degradación suministra energía para muchos procesos bioquímicos diferentes en la célula. La biosíntesis de pirimidina se efectúa a través de la formación de uridina-5’-monofosfato (UMP) a partir de ribosa-5-fosfato. UMP se convierte a su vez en citidina-5’-trifosfato (CTP). Las desoxiformas de todos los nucleótidos se producen en una reacción de reducción de un paso a partir de la forma difosfato-ribosa del nucleótido en dirección de la forma difosfato-desoxiribosa del nucleótido. Después de la fosforilación estas moléculas pueden participar en la síntesis de ADN.
IV. Metabolismo y usos de trealosa
La trealosa se compone de dos moléculas de glucosa que están enlazadas entre sí a través de un enlace a,a-1,1. Habitualmente se usa en la industria de alimentos como edulcorante, como aditivo para alimentos secos o congelados o en bebidas. Sin embargo también se aplica en la industria farmacéutica, en la industria de cosméticos y en la industria de la biotecnología (véase, por ejemplo, Nishimoto et al., (1998) patente estadounidense No. 5 759 610; Singer, M.A. y Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. y Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; y Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102). La trealosa se produce mediante enzimas de muchos microorganismos y se libera al medio circundante del cual puede obtenerse mediante métodos conocidos en el campo especializado.
Productos biosintéticos particularmente preferidos se seleccionan del grupo de los ácidos orgánicos, proteínas, nucleótidos y nucleósidos, así como aminoácidos proteinogénicos como también aminoácidos no proteinogénicos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, enzimas y proteínas.
�?cidos orgánicos preferidos son ácido tartárico, ácido itacónico y ácido diaminopimélico
Nucleósidos y nucleótidos preferidos se describen, por ejemplo, en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, páginas 561-612, en Biotechnology volumen 6, Rehm et al., editores VCH: Weinheim y las referencias allí citadas.
Productos biosintéticos preferidos son, además, lípidos, ácidos grasos saturados e insaturados como, por ejemplo, ácido araquidónico, dioles como, por ejemplo, propandiol y butandiol, carbohidratos como, por ejemplo, ácido hialurónico y trealosa, compuestos aromáticos como, por ejemplo, aminas aromáticas, vanilina e índigo, vitaminas y cofactores, tal como se describe por ejemplo en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, volumen A27, "Vitamins", páginas 443-613 (1996) VCH: Weinheim y las referencias citadas allí; y Ong, A.S., Niki, E. y Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research -Asia, celebrada el 1 – 3 de septiembre de 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press (1995)), enzimas, policétidos (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68), y todos los otros compuestos químicos descritos por Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las citas bibliográficas indicadas allí.
Productos biosintéticos particularmente preferidos son aminoácidos, particularmente preferidos son aminoácidos esenciales, particularmente L-glicina, L-alanina, L-leucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-triptofano, L-lisina, Lglutamina, ácido L-glutámico, L-serina, L-prolina, L-valina, L-isoleucina, L-cisteína, L-tirosina, L-histidina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico y L-treonina, L-homoserina, principalmente L-lisina, L-metionina y L-treonina. En lo sucesivo, por un aminoácido como, por ejemplo, lisina, metionina y treonina, se entiende tanto la forma L y la forma D del aminoácido, preferentemente la forma L; es decir, por ejemplo, L-lisina, L-metionina y L-treonina.
En el proceso para preparar productos biosintéticos, al paso de cultivo de los microorganismos genéticamente modificados preferentemente se asocia un aislamiento de productos biosintéticos de los microorganismos y/o del caldo de fermentación. Estos pasos pueden tener lugar simultáneamente y/o preferentemente después del paso de cultivo.
Los microorganismos genéticamente modificados de la invención pueden cultivarse continuamente o discontinuamente en el proceso por lotes (batch) (cultivo por lotes) o en fed batch (proceso de lote alimentado) o proceso de repeated fed batch (proceso de alimentación repetitiva de lote) para la producción de productos biosintéticos, principalmente L-lisina, L-metionina y L-treonina. Una composición mediante métodos de cultivo conocidos puede encontrarse en el libro texto de Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Ingeniería de bioprocesos 1. Introducción a la ingeniería de bioprocesos) (Gustav Fischer Verlag (editorial), Stuttgart, 1991)) o en libro texto de Storhas (Bioreaktoren y periphere Einrichtungen (Bioreactores y dispositivos periféricos) (Vieweg Verlag (Editorial), Brunswick/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a usarse tiene que satisfacer de manera adecuada las demandas de la cepa respectiva. Descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidas en el libro "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society für Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981).
Estos medios aplicables comprenden habitualmente una o varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o microelementos.
Las fuentes de carbono preferidas son azúcares como los mono-, di-o polisacáridos. Fuentes de carbono muy buenas son, por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. A los medios pueden adicionarse azúcares a través de compuestos complejos como melasas u otros productos secundarios de la refinación de azúcar. También puede ser ventajoso adicionar mezclas de diferentes fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, o ácido linoléico; alcoholes como, por ejemplo, glicerina, metanol o etanol y ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético o ácido láctico.
Las fuentes de nitrógeno son habitualmente compuestos orgánicos o inorgánicos de nitrógeno o materiales que contienen estos compuestos. Las fuentes de nitrógeno ejemplares comprenden gas de amoniaco o sales de amonio, como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes complejas de nitrógeno como agua de maíz macerado, harina de soja, proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse individualmente o como mezcla.
Los compuestos de sal inorgánica que pueden estar contenidos en los medios comprenden las sales de cloruro, fósforo o sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, cinc, cobre y hierro.
Como fuente de azufre para la producción de productos de química fina, principalmente de metionina, pueden usarse compuestos inorgánicos como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitos, tetraionitos, tiosulfatos, sulfuros pero también compuestos orgánicos de azufre como mercaptanos y tioles.
Como fuente de fósforo pueden usarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las sales correspondientes que contienen sodio.
Al medio pueden adicionarse formadores de quelato a fin de mantener iones metálicos en solución. Formadores de quelato particularmente adecuados comprenden dihidroxifenoles como la catequina o protocatecuato, o ácidos orgánicos como ácido cítrico.
Los medios de fermentación empleados también contienen usualmente otros factores de crecimiento como vitaminas o promotores de crecimiento a los cuales pertenecen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Muchas veces los factores de crecimiento y las sales provienen de componentes complejos de los medios como extracto de levadura, melasas, agua de maíz macerado y similares. Además, al medio de cultivo pueden adicionarse precursores adecuados. La composición exacta de los compuestos de los medios depende fuertemente del respectivo experimento y se decide individualmente para cada caso específico. Puede obtenerse información sobre optimización de medios del libro de texto "Applied Microbiol. Phisiology, A Practical Approach" (editores P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) páginas 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Los medios de crecimiento también pueden obtenerse de proveedores comerciales como Standard 1 (Merck) o BHI (Brain heart infusion, DIFCO) y similares.
Todos los componentes de medios de esterilizan ya sea calentando (20 min a 1,5 bar y 121°C) o mediante filtración de esterilización. Los componentes pueden esterilizarse juntos o, en caso de necesidad, por separado. Todos los componentes de medios pueden estar presentes al inicio del cultivo o adicionarse opcionalmente de manera continua o por cargas.
La temperatura del cultivo se encuentra normalmente entre 15°C y 45°C, preferentemente a 25°C a 40°C y puede mantenerse constante o modificarse durante el experimento. El valor de pH del medio debe encontrarse en el rango de 5 a 8,5, preferentemente alrededor de 7,0. El valor de pH para el cultivo puede controlarse durante el cultivo adicionando compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar el desarrollo de espuma pueden emplearse productos anti-espumantes como, por ejemplo, ésteres de poliglicol y ácido graso. Para mantener la estabilidad de plásmidos pueden adicionarse a l medio sustancias adecuadas con efecto selectivo como, por ejemplo, antibióticos. Con el fin de mantener condiciones aeróbicas al cultivo se introduce oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, como por ejemplo aire del ambiente. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente en 20°C a 45°C. El cultivo continúa hasta que se forme un máximo del producto deseado. Este objetivo normalmente se logra en el transcurso de 10 horas hasta 160 horas.
Los caldos de fermentación obtenidos de esta manera tienen habitualmente una masa seca de 7,5 a 25 % en peso.
Además, también es ventajoso si la fermentación opera, al menos al final, aunque principalmente durante al menos 30% de la duración de la fermentación, con limitación de azúcar. Esto significa que durante este tiempo la concentración de azúcar utilizable en el medio de fermentación se mantiene en, o se reduce a 0 a 3 g/l. El aislamiento de productos biosintéticos del caldo de fermentación y/o de los microorganismos se efectúa de una manera conocida per se en correspondencia con las propiedades físico-químicas del producto biosintético valioso y de los productos biosintéticos secundarios.
El caldo de fermentación puede seguir procesándose a continuación, por ejemplo. Dependiendo del requerimiento la biomasa puede retirarse total o parcialmente del caldo de fermentación mediante métodos de separación como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos o dejarse completamente en el mismo.
A continuación el caldo de fermentación puede condensarse o concentrarse por medio de métodos conocidos como, por ejemplo, con ayuda de un evaporador de rotación, evaporador de capa delgada, evaporador de película caída, mediante ósmosis inversa o mediante nanofiltración. Este caldo de fermentación concentrado puede procesarse a continuación mediante secamiento por congelamiento, secamiento por aspersión, granulación por aspersión o mediante otros métodos.
Pero también es posible purificar adicionalmente los productos biosintéticos, principalmente L-lisina, L-metionina y Ltreonina. Para este propósito, después de separarse de la biomasa el caldo que contiene producto se somete a una cromatografía con una resina adecuada, en cuyo caso el producto deseado o las impurezas quedan retenidas total o parcialmente sobre la resina de cromatografía. Estos pasos de cromatografía pueden repetirse en caso de necesitarse, en cuyo caso se usan las mismas resinas de cromatografía o diferentes. El experto en la materia tiene experiencia en la elección de las resinas adecuadas de cromatografía y en su aplicación más efectiva. El producto purificado puede concentrarse mediante filtración o ultrafiltración y almacenarse a una temperatura en la que sea máxima la estabilidad del producto.
Los productos biosintéticos pueden producirse en formas diferentes, por ejemplo en forma de sus sales o ésteres.
La identidad y pureza del (los) compuesto(s) aislado(s) puede determinarse mediante técnicas del estado de la técnica. Estas abarcan cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, procesos de coloración, cromatografía de capa delgada, NIRS, ensayos enzimáticos o ensayos microbiológicos. Estos métodos de análisis se recopilan en: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; y Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) volumen A27, VCH: Weinheim, páginas 89-90, páginas 521-540, páginas 540-547, páginas 559-566, 575-581 y páginas 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, volumen 17.
Ahora la invención se describe más detalladamente mediante los siguientes ejemplos no limitantes:
Ejemplo 1
Preparación del vector pCLiK5MCS Primero se amplificó la resistencia a ampicilina y el origen de replicación del vector pBR322 usando cebadores de oligonucleótidos de SEQ ID NO 5: y SEQ ID NO 6: con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR).
SEQ ID NO 5:
5’-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACA G-3’
SEQ ID NO 6:
5’-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTC G-3’
Además de las secuencias complementarias a pBR322, el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO 5: contiene en la dirección 5’-3’ los sitios de corte para las endonucleasas de restricción SmaI, BamHI, NheI y AscI y el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO 6: contiene en dirección 5’-3’ los sitios de corte para las endonucleasas de restricción XbaI, XhoI, NotI y Dral. La reacción de PCR se realizó según métodos estándar como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) con polimerasa PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, USA). El fragmento de ADN obtenido con un tamaño de aproximadamente 2,1 kb se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. Los extremos romos del fragmento de ADN se ligaron entre sí con el Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA) según métodos estándar como los descritos en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)). Se seleccionaron células que tienen plásmido mediante el plaquetamiento sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) que contiene ampicilina (50 !g/ml).
El ADN de plásmido de un clon individual se aisló usando el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según indicaciones del fabricante y se verificó por digestores de restricción. El plásmido obtenido de esta manera obtiene el nombre de pCLiK1.
A partir del plásmido pWLT1 (Liebl et a1.,1992) como plantilla para una reacción de PCR se amplificó un casete de resistencia a canamicina usando los oligonucleótidos cebadores de SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.
SEQ ID NO:7:
5’-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3’
SEQ 10 NO:8
5’-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’
Junto a las secuencias complementarias pWLT1, el cebador de oligonucleótido de SEQ ID NO: 7 contiene en dirección 5’-3’ los sitios de corte para las endonucleasas de restricción XbaI, SmaI, BamHI, NheI y el cebador de oligonucleótido SEQ ID NO:8 contiene en dirección 5’-3’ los sitios de corte para las endonucleasas de restricción AscI y NheI. La reacción de PCR se realizó según métodos estándar como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) con polimerasa PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, USA). El fragmento de ADN obtenido con un tamaño de aproximadamente 1,3 kb se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. El fragmento de ADN se cortó con las nucleasas de restricción XbaI y AscI (New England Biolabs, Beverly, USA) y a continuación se purificó nuevamente con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. El vector pCLiK1 fue cortado igualmente con las endonucleasas de restricción XbaI y AscI y se desfoforiló con fosfatasa alcalina (1 (Roche Diagnostics, Mannheim)) según las indicaciones del fabricante. Después de la electroforesis, en un gel de agarosa al 0,8% se aisló el vector linealizado (aproximadamente 2,1 kb) con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según las indicaciones del fabricante con el fragmento de PCR cortado y la mezcla de ligazón se transformó en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA) según métodos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Una selección en células que tenían plásmido se logró mediante preparación de cultivos en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) que contiene ampicilina (50 !g/ml) y canamicina (20 !g/ml).
El ADN de plásmido de un clon individual se aisló usando Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según las indicaciones del fabricante y se verificó por digestores de restricción. El plásmido obtenido de esta manera obtiene el nombre de pCLiK2.
El vector pCLiK2 se cortó con la endonucleasa de restricción Dral (New England Biolabs, Beverli, USA). Después de la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% se aisló un fragmento de vector de aproximadamente 2,3 kb de tamaño usando GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se reguló con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según las indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA) según métodos estándar tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Se logró una selección en células que tenían plásmido mediante preparación de cultivos en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) que contiene canamicina (20 !g/ml).
El ADN de plásmido de un clon individual se aisló usando el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según las indicaciones del fabricante y se verificó por digestores de restricción. El plásmido obtenido de esta manera obtiene el nombre de pCLiK3.
A partir del plásmido pWLQ2 (Liebl et al., 1992) como plantilla para una reacción de PCR se amplificó el origen de replicación pHM1519 con los cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:9:
5’-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’
SEQ ID NO:10:
5’-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’
Además de las secuencias complementarias a pWLQ2, los cebadores de oligonucleótido SEQ ID NO:9 y SEI ID NO:10 contienen sitios de corte para la endonucleasa de restricción NotI. La reacción PCR se realizó usando polimerasa PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, USA) según métodos estándar como Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to methods and Applications, Academic Press (1990)). El fragmento de ADN obtenido con un tamaño de aproximadamente 2,7 kb se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. El fragmento de ADN se cortó con la endonucleasa de restricción NotI (New England Biolabs, Beverly, USA) y a continuación de esto se purificó nuevamente con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. El vector pCLiK3 igualmente fue cortado con la endonucleasa de restricción NotI y se defosforiló con fosfatasa alcalina (1 (Roche Diagnostics, Mannheim)) según las indicaciones del fabricante. Después de la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% se aisló el vector linealizado (cerca de 2,3kb) con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector se ligó con el fragmento PCR cortado con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según las indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA) de acuerdo con métodos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Una selección en células que tenían plásmido se logró mediante la preparación de cultivos en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) que contiene canamicina (20 !g/ml).
El ADN de plásmido de un clon individual se aisló usando el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según las indicaciones del fabricante y se verificó por digestores de restricción. El plásmido obtenido de esta manera recibe el nombre pCLiK5.
Para la ampliación de pCLiK5 en un "multiple cloning site" (MCS) (sitio de clonación múltiple) se unieron en la mayor medida posible ambos oligonucleótidos complementarios SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, que contienen los sitios de corte para las endonucleasas de restricción Swal, XhoI, AatI, Apal, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI y SmaI, calentando conjuntamente a 95°C y enfriando lentamente para producir un fragmento de ADN bicatenario.
SEQ ID NO:11:
SEQ ID NO:12:
El vector pCLiK5 fue cortado con las endonucleasas de restricción XhoI y BamHI (New England Biolabs, Beverly, USA) y se defosforiló con fosfatasa alcalina (1 (Roche Diagnostics, Mannheim)) según las indicaciones del fabricante. Después de la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% se aisló el vector linealizado (cerca de 5,0 kb) 5 usando el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante. Este fragmento de vector fue ligado con el fragmento de ADN bicatenario con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según las indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó en E.coli XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA) competente según métodos estándar tal como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Una selección
10 en células que tenían plásmido se logró mediante la preparación de cultivos en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) que contenía canamicina (20 !g/ml).
El ADN de plásmido de un clon individual se aisló usando el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) según las indicaciones del fabricante y se verificó por digestores de restricción. El plásmido obtenido de esta manera recibe el nombre pCLiK5MCS.
15 Las reacciones de secuenciación se realizaron según Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciación se fraccionaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).
El plásmido generado pCLiK5MCS es listado como SEQ ID NO:13.
Ejemplo 2
20 Preparación del plásmido P EF-TS metA
Se preparó ADN cromosómico a partir de C. glutamicum ATCC 13032 de acuerdo con Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 o Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828. El gen metA que codifica para la homoserina-Oacetiltransferasa fue amplificado con los cebadores de oligonucleótido BK 1849 SEQ ID NO 14 y BK 1862 SEQ ID NO 15 33, el ADN cromosómico como plantilla y usando polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), con ayuda de
25 la reacción en cadena – polimerasa (PCR) de acuerdo con métodos estándar, tal como se describen en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to methods and Applications, Academic Press.
BK 1849 SEC ID NO 14
5’-gtgtgtcgacttagatgtagaactcgatgtag -3’
y
30 BK 1862 SEC ID NO 15
5’-atgcccaccctcgcgcc -3’
El fragmento de ADN obtenido, de un tamaño de aproximadamente 1134 bp, se purificó con el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante.
Con los cebadores de oligonucleótido Haf 26 SEQ ID NO 16 y Haf 27 SEQ ID NO 17, el ADN cromosómico como
35 plantilla y usando polimerasa Pfu Turbo (empresa Stratagene), se amplificó la unidad de expresión del gen (SEQ ID 2) que codifica para el factor de elongación TS con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) según métodos estándar, tal como se describe en Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to methods and Applications, Academic Press.
Haf 26 SEQ ID NO 16
40 5’-gagaggatcccccccacgacaatggaac-3’
y Haf 27 SEO ID NO 17
5’-cctgaaggcgcgagggtgggcattacggggcgatcctccttatg -3’
El fragmento de ADN obtenido, de un tamaño de aproximadamente 195 bp, se purificó usando el GFX™PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) según las indicaciones del fabricante.
Los cebadores Haf 27 y BK 1862 contienen una secuencia solapante y son homólogos entre sí en sus extremos 5’.
Los productos de PCR arriba obtenidos se emplearon como planilla para otra PCR en la que se utilizaron los cebadores BK 1849 (SEQ. ID. NO. 14) y Haf 26 (SEQ. ID. NO. 16).
Con esta mezcla pudo amplificarse un fragmento de ADN que correspondían al tamaño esperado de 1329 bp. Esta fusión de P EF-TS/metA se clonó luego en el vector pClik 5a MCS (SEQ. ID. NO. 13) mediante los sitios de restricción BamH1 y Sall.
El fragmento de vector se ligó junto con el fragmento de PCR con ayuda del Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) según las indicaciones del fabricante y la mezcla de ligazón se transformó en E.coli XL-1 Blue competente (Stratagene, La Jolla, USA) según métodos estándar como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)). Una selección en células que contenían plásmido se logró mediante preparación de cultivos en placas sobre agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) que contenía canamicina (20 !g/ml).
La preparación del ADN de plásmido se realizó según métodos y con materiales de la empresa Quiagen. Reacciones de secuenciación se realizaron de acuerdo con Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467. Las reacciones de secuenciación se fraccionaron y se evaluaron mediante ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).
El plásmido resultante se denominó pClik 5a MCS P EF-TS metA (SEQ. ID. NO. 18).
Ejemplo 3
Actividades MetA
La cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se transformó respectivamente con los plásmidos pClikS MCS, pClik MCS EF-TS metA de acuerdo con el método descrito (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299303). La mezcla de transformación se cultivó en placas CM que contenían adicionalmente 20mg/l de canamicina a fin de lograr una selección de células que contenían plásmido. Los clones resistentes a canamicina obtenidos se seleccionaron y se aislaron.
Las cepas de C. glutamicum que contenían uno de estos constructos de plásmido se cultivaron en medio MMA ((40 g/l de sacarosa, 20 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 1 g/l de K2HPO4, 0,25g/l de MgSO4 x 7H2O, 54 g de Aces, 1 ml de CaCl2 (10 g/l), 1 ml de protocatecoato (300 mg/10 ml), 1 ml de solución de microelementos (10 g/l de FeSO4 x /H2O,10 g/l de MnSO4 x H2O, 2 g/l de ZnSO4 x7 H2O, 0,2 g/l de CuSO4, 0,02 g/l de NiCl2 x 6 de H2O), 100 !g/l de vitamina B12, 0,3 mg/l de tiamina, 1mM de leucina, 1 mg/l de piridoxal HCI, 1 ml de biotina (100 mg/l), pH7,0) por una noche a 30°C. Las células se centrifugaron a 4°C y se lavaron dos veces con búfer frío de tris-HCI (0,1 %, pH 8,0). Después de una nueva centrifugación las células se llevan a un búfer frío de tris-HCI (0,1%, pH 8,0) y se ajusta una OD600 de 160. Para la ruptura celular se transfirió 1 ml de esta suspensión celular a tubos Ribolyser de 2 ml de la empresa Hibaid y se lisó tres veces, respectivamente por 30 segundos, en un Ryboliser de la empresa Hibaid a un ajuste de rotación de 6,0. El lisado fue clarificado por centrifugación a 15 000 rpm durante 30 minutos a 4°C en una centrífuga de Eppendorf y el sobrenadante se transfiere a una nueva copa Eppendororf. El contenido de proteína se determinó de acuerdo con Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254.
La medición de la actividad enzimática de MetA se realizó tal como sigue. Las mezclas de reacción de 1 ml contenían búfer de fosfato de potasio (pH 7,5) de 100 mM, MgCl2 de 5mM, acetilo-CoA de 100 !M, L-homoserina de 5mM, DTNB de 500 !M (reactivo de Ellmans) y extracto celular. El ensayo se inició adicionando el lisado de proteína respectivo y se incubó a temperatura ambiente. Entonces se registró una cinética a 412 nm por 10 minutos.
Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Cepa
Actividad específica [nMol/mg/min]
ATCC 13032 pClik5MCS
12,6
ATCC 13032 pClik5MCS P EF-TS metA
2339,1
La actividad de MetA incrementarse considerablemente usando la unidad de expresión heteróloga PEF-TS. LISTADO DE SECUENCIAS
5 <110> BASF Aktiengesellschaft
<120> PEF-TS-Unidades de expresión
<130> 20040509
<160> 20
<170> PatentIn version 3.1 10 <210> 1
<211> 178
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220> 15 <221> Promotor
<222> (1)..(178)
<223>
<400> 1
20 <210> 2
<211> 195
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220> 25 <221> misc_feature
<222> (1)..(195)
<223> Unidad de expresión
<400> 2
<210> 3 5 <211> 1365
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1365)
<223>
<400> 3
<210> 4
<211> 454 <212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
<210> 5
<211> 52
<212> DNA 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(52)
<223> Primer
10 <400> 5 cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(53)
<223> Primer
<400> 6 tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg 53
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(47)
<223> Primer
<400> 7 gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga 47
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(38)
<223> Primer
<400> 8 gagaggcgcg ccgctagcgt gggcgaagaa ctccagca 38
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer 5 <222> (1)..(34)
<223> Primer
<400> 9 gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa 34
<210> 10 10 <211> 34
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer 15 <222> (1)..(34)
<223> Primer
<400> 10 gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc 34
<210> 11 20 <211> 140
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer 25 <222> (1)..(140)
<223> Primer
<400> 11
<210> 12 <211> 140
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(140)
<223> Primer
<400> 12
10 <210> 13
<211> 5091
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <221> misc_feature
<222> (15091)..()
<223> Plasmid
<400> 13
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(32)
<223> Primer
<400> 14 gtgtgtcgac ttagatgtag aactcgatgt ag 32
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(17)
<223> Primer
<400> 15 atgcccaccc tcgcgcc 17
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(28)
<223> Primer
<400> 16 gagaggatcc cccccacgac aatggaac 28
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(44)
<223> Primer
<400> 17 cctgaaggcg cgagggtggg cattacgggg cgatcctcct tatg 44
<210> 18
<211> 6389
<212> DNA 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6389)
<223> Plasmid 10 <400> 18
<210> 19
<211> 1005
<212> DNA 5 <213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1005)
<223> 10 <400> 19
<210> 20
<211> 335
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 20
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> BASF Aktiengesellschaft
<120> PEF-TS-Unidades de expresión
<130> 20040509
<160> 20
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 178
<212> DNA 5 <213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> Promotor
<222> (1)..(178)
<223> 10 <400> 1
<210> 2
<211> 195
<212> DNA 15 <213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(195)
<223> Unidad de expresión 20 <400> 2
<210> 3
<211> 1365 25 <212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1365)
<223>
<400> 3
<210> 4
<211> 454
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
<210> 5
<211> 52
<212> DNA 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(52)
<223> Primer
10 <400> 5 cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(53)
<223> Primer
<400> 6 tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg 53
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(47)
<223> Primer
<400> 7 gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga 47
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(38)
<223> Primer
<400> 8 gagaggcgcg ccgctagcgt gggcgaagaa ctccagca 38
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer 5 <222> (1)..(34)
<223> Primer
<400> 9 gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa 34
<210> 10 10 <211> 34
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer 15 <222> (1)..(34)
<223> Primer
<400> 10 gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc 34
<210> 11 20 <211> 140
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer 25 <222> (1)..(140)
<223> Primer
<400> 11
<210> 12 <211> 140
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(140)
<223> Primer
<400> 12
10 <210> 13
<211> 5091
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <221> misc_feature
<222> (15091)..()
<223> Plasmid
<400> 13
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(32)
<223> Primer
<400> 14 gtgtgtcgac ttagatgtag aactcgatgt ag 32
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(17)
<223> Primer
<400> 15 atgcccaccc tcgcgcc 17
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(28)
<223> Primer
<400> 16 gagaggatcc cccccacgac aatggaac 28
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer
<222> (1)..(44)
<223> Primer
<400> 17 cctgaaggcg cgagggtggg cattacgggg cgatcctcct tatg 44
<210> 18 5 <211> 6389
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> misc_feature 10 <222> (1)..(6389)
<223> Plasmid
<400> 18
<210> 19
<211> 1005 5 <212> DNA
<213> corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1005) 10 <223>
<400> 19
<210> 20
<211> 335
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 20

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para modificar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre mediante regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor, que contiene
    A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o
    B) una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o
    C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas,
    en cuyo caso los genes respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor son heterólogos.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por los ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra
    b1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor o
    b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o
    b3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios de los ácidos nucleicos a transcribir.
  3. 3.
    Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque para aumentar o causar la rata de transcripción de genes en microorganismos en comparación con el tipo silvestre se regula la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.
  4. 4.
    Método según la reivindicación 3, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra
    bh1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor incrementada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor o
    bh2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica o
    bh3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contiene un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.
  5. 5.
    Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los genes se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo caso los genes pueden obtener opcionalmente otros elementos de regulación.
  6. 6.
    Método según la reivindicación 5, caracterizado porque las proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se seleccionan del grupo de aspartato-quinasa, aspartato-semialdehído-dehidrogenasa, diaminopimelatodehidrogenasa, diaminopimelato-decarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinaaldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, 3-fosfoglicerato-quinasa, piruvato-carboxilasa, triosa-fosfato isomerasa, regulador de transcripción LuxR, regulador de transcripción LisR1, regulador de transcripción LisR2, malato-quinonaoxireductasa, glucosa-6-Ffosfato-dehidrogenasa, 6-fosfogluconato-dehidrogenasa, transcetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahionina-gamma-sintasa, cistahionina-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metileno-tetrahidrofolato-reductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserinafosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserina-dehidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, exportador – soporte de treonina, treonina-dehidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa I, cisteína-sintasa II, metionina-sintasa dependiente de coenzima B12, metionina-sintasa independiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato dehidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginiloARN-t-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinhidroximetiltransferasa, fructosa1,6-bifosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6-fosfofructoquinasa.
  7. 7.
    Microorganismo genéticamente modificado en el cual la modificación genética conduce a modificar o a causar la rata de transcripción de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre y depende de la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor que contienen
    A) la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 o
    B) una secuencia derivada de esta secuencia por sustitución, inserción o deleción de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90 % a nivel de ácido nucleico con la secuencia SEQ.ID.NO. 1 o
    C) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.NO. 1 en condiciones estrictas,
    en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.
  8. 8. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 7, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra
    b1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor o
    b2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, o
    b3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico, que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor modificada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.
  9. 9.
    Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 7 u 8 con rata de transcripción elevada o causada de al menos un gen en comparación con el tipo silvestre, caracterizado porque la transcripción de genes en el microorganismo se regula por ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, en cuyo caso los genes son heterólogos respecto de los ácidos nucleicos con actividad de promotor.
  10. 10.
    Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 9, caracterizado porque la regulación de la transcripción de genes en el microorganismo por los ácidos nucleicos con actividad de promotor se logra
    bh1) introduciendo al genoma del microorganismo uno o varios de los ácidos nucleicos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor aumentada específica, de tal modo que la transcripción de uno o varios genes endógenos se efectúa bajo el control del ácido nucleico introducido con actividad de promotor, o
    bh2) introduciendo uno o varios genes al genoma del microorganismo de tal modo que la transcripción de uno o varios de los genes introducidos se efectúa bajo el control de los ácidos nucleicos endógenos con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, o
    bh3) introduciendo en el microorganismo uno o varios constructos de ácido nucleico que contienen un ácido nucleico con actividad de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, opcionalmente con actividad de promotor elevada específica, y conectando funcionalmente uno o varios ácidos nucleicos a transcribir.
  11. 11.
    Microorganismo genéticamente modificado según una de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque los genes se seleccionan del grupo de los ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de nucleótidos y nucleósidos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de ácidos orgánicos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de lípidos y ácidos grasos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de dioles, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de carbohidratos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de compuestos aromáticos, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de vitaminas, ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de cofactores y ácidos nucleicos que codifican una proteína de la vía de biosíntesis de enzimas, en cuyo cado los genes pueden contener opcionalmente otros elementos de regulación.
  12. 12.
    Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 11, caracterizado porque las proteínas de la vía de biosíntesis de aminoácidos se seleccionan del grupo de aspartatoquinasa, aspartato-semialdehídodehidrogenasa, diaminopimelato-dehidrogenasa, diaminopimelato-decarboxilasa, dihidrodipicolinato-sintetasa, dihidrodipicolinato-reductasa, glicerinaldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, 3-fosfoglicerato-quinasa, piruvatocarboxilasa, triosafosfato-isomerasa, regulador de transcripción LuxR, regulador de transcripción LisR1, regulador de transcripción LisR2, malato-quinona-oxireductasa, glucosa-6-fosfato-dehidrogenasa, 6-fosfogluconatodehidrogenasa, transquetolasa, transaldolasa, homoserina-O-acetiltransferasa, cistahioningamma-sintasa, cistahionin-beta-liasa, serina-hidroximetiltransferasa, O-acetilhomoserina-sulfhidrilasa, metilen-tetrahidrofolatoreductasa, fosfoserina-aminotransferasa, fosfoserina-fosfatasa, serina-acetil-transferasa, homoserinadehidrogenasa, homoserina-quinasa, treonina-sintasa, exportador – soporte de treonina, treonina-dehidratasa, piruvato-oxidasa, exportador de lisina, biotina-ligasa, cisteína-sintasa I, cisteína-sintasa II, metionin-sintasa dependiente de coenzima B12, metionina-sintasa independiente de coenzima B12, sulfatadeniltransferasa subunidad 1 y 2, fosfoadenosina fosfosulfato reductasa, ferredoxina-sulfito-reductasa, ferredoxina NADP reductasa, 3-fosfoglicerato dehidrogenasa, regulador RXA00655, regulador RXN2910, arginilo-ARN-t-sintetasa, fosfoenolpiruvato-carboxilasa, proteína de eflujo de treonina, serinhidroximetiltransferasa, fructosa-1,6-bifosfatasa, proteína de la reducción de sulfato RXA077, proteína de la reducción de sulfato RXA248, proteína de la reducción de sulfato RXA247, proteína OpcA, 1-fosfofructoquinasa y 6-fosfofructoquinasa.
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