ES2376725T3 - Anticuerpos IgM humanos con la capacidad de inducir remielinización y usos diagnósticos y terapéuticos de los mismos, particularmente en el sistema nervioso central - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano, o una mezcla, monómero o fragmento activo del mismo, caracterizado por su capacidad para unirse a oligodendrocitos, o un anticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad para unirse a los oligodendrocitos, con las características siguientes: (a) capaz de inducir remielinización; (b) capaz de estimular la proliferación celular de células gliales; y (c ) capaz de estimular la señalización de Ca++ en los oligodendrocitos; y que tiene: un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo A o de tipo B como se establece en la Figura 17 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo I o de tipo II como se indica en la Figura 18; un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como establece en la Figura 19 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como se establece en la Figura 20; un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HigM CB2bG8 como se establece en la Figura 27 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HIgM CB2bG8 como se establece en la Figura 28

Description

Anticuerpos IgM humanos con la capacidad de inducir remielinización y usos diagnósticos y terapéuticos de los mismos, particularmente en el sistema nervioso central

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de la neurobiología, y, más particularmente, a la identificación de autoanticuerpos que desempeñan un papel en la función y terapia del sistema nervioso central. La invención también se refiere a materiales y procedimientos diagnósticos y terapéuticos, incluidos, a modo de ejemplo, composiciones farmacéuticas, autoanticuerpos para usar en procedimientos de tratamientos de enfermedades asociadas con la alteración neurológica, autoanticuerpos para usar en procedimientos de regeneración y restauración de la función neural, ensayos de detección selectiva y vacunas.

Antecedentes de la invención

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) crónica, con frecuencia progresiva, que se caracteriza patológicamente por desmielinización primaria, normalmente sin lesión axonal inicial. La etiología y patogenia de la EM se desconocen. Varias características inmunológicas de la EM y su moderada asociación con ciertos alelos del complejo mayor de histocompatibilidad ha urgido la especulación de que la EM es una enfermedad mediada por el sistema inmunitario.

Una hipótesis de autoinmunidad está avalada por el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAR), en el que la inyección de ciertos componentes de mielina en animales genéticamente susceptibles conduce a la desmielinización del SNC mediada por linfocitos T. No obstante, en el SNC de los pacientes de EM no se han identificado definitivamente los autoantígenos específicos y linfocitos T reactivos a mielina patogénica ni la EM se asocia con otras enfermedades autoinmunitarias. Una hipótesis alternativa, en base a los datos epidemiológicos, es que un factor ambiental, quizá un virus no identificado, desencadena una respuesta inflamatoria en el SNC, que conduce a la destrucción directa o indirecta (“espectador”) de mielina, potencialmente con un componente autoinmunitario inducido. Esta hipótesis viene avalada por las pruebas de que varias infecciones víricas naturales, tanto en seres humanos como en animales, pueden producir desmielinización. Un modelo de virus experimental de uso habitual se induce con el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) (Dal Canto, M.C., y Lipton, H.L., Am. J. Path., 88:497-500 (1977)).

En Kirschning y col. (J. Neuroimmunology 99:122-130) se demostró que varios anticuerpos monoclonales (AcMo) murinos de tipo IgM que estimulan la remielinización en ratones que eran autoanticuerpos naturales codificados por genes de la línea germinal que reaccionan con los oligondendrocitos y los antígenos intracelulares. El AcMo de tipo IgM DS1F8 reactivo con oligodendrocitos humanos derivado de un paciente con esclerosis múltiple, que es similar a los AcMo murinos, está dirigido a estructuras de tipo microtúbulo. Estas similitudes del AcMo DS1F8 con los AcMo murinos que estimulan la remielinización sugieren que este AcMo humano es un autoanticuerpo natural.

Asakura y col. (Neurology 54:Suppl 3 PP A126-127) enseña que los autoanticuerpos naturales que reaccionan con los antígenos del SNC pueden estimular la remielinización.

Bansal y col. (J. Neuro Res 21:260-267) divulga un procedimiento de simulación de la diferenciación de oligondendrocitos usando el AcMo 04.

La limitada eficacia de los tratamientos actuales para la EM y otras enfermedades desmielinizantes ha estimulado el interés en nuevas terapias para aliviar estas enfermedades. No obstante, debido a la aparentemente compleja etiopatogenia de estas enfermedades que implican potencialmente a factores ambientales y autoinmunitarios, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento eficaz de estos trastornos desmielinizantes.

Se sabe que un grupo de autoanticuerpos exhiben actividad en el sistema nervioso central y que estaba particularmente asociado con la estimulación de la remielinización. Uno de los objetivos de los solicitantes ha sido investigar el amplio abanico de actividades de los anticuerpos y, de forma concomitante, identificar otros miembros de la clase que demuestran dichas actividades. En consecuencia, la presente invención está dirigida a la satisfacción de estos y otros objetivos.

La mención de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como admisión de que dicha referencia está disponible como “Técnica anterior” a la presente solicitud.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona (reivindicación 1), en el presente documento se han identificado y analizado anticuerpos concretos, y la invención se extiende, en consecuencia, a autoanticuerpos humanos, de modo que son ejemplos de autoanticuerpos humanos sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10 y CB2bG8. La invención también proporciona, en otro aspecto, un ensayo para la detección selectiva de otros anticuerpos y parejas de unión relacionadas, incluidos haptenos y análogos peptídicos, que pueden exhibir una actividad terapéutica similar. Dichas actividades incluirían el tratamiento o prevención de lesiones o disfunciones neurológicas, tal como esclerosis múltiple, ELA, ictus, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer.

La presente invención se refiere, en otro aspecto, a la promoción o estimulación de la regeneración o remielinización de los axones del sistema nervioso central en un mamífero. Específicamente, la presente invención se refiere a autoanticuerpos para usar en procedimientos de estimulación de la remielinización de los axones sistema nervioso central (SNC), incluidos anticuerpos del subtipo IgM y monómeros de la misma, y, en particular, a autoanticuerpos humanos, o mezclas y/o fragmentos activos de los mismos, que se caracterizan por su capacidad para unirse a estructuras y células dentro del sistema nervioso central. La presente invención también se extiende a la preparación y uso de autoanticuerpos humanos, en el que son ejemplos de los autoanticuerpos humanos sHIgM22 (LYM 22), sHIgM46, ebvHIgM, MSI19D10 y CB2bG8. Las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de ejemplo se exponen en las Figuras del siguiente modo: LYM 22 se expone en las Figuras 17 y 18 (SEC ID Nº 1, 5, 49 y 50); MSI19D10 se expone en las Figuras 19 y 20 (SEC ID Nº 9 y 11); CB2bG8 se expone en las Figuras 27 y 28 (SEC ID Nº 13 y 15);

La invención se extiende a anticuerpos y a las correspondientes proteínas de anticuerpos y a moléculas pequeñas, tales como haptenos, que tienen, o corresponden al menos en parte a, las secuencias expuestas en las Figuras indicadas.

La presente invención usa un análisis de las secuencias de ADNc de la región variable de la Ig y la capacidad de unirse a estructuras y células en el sistema nervioso central, incluidos, entre otros, oligondendrocitos, de estos AcMo para determinar su utilidad en los procedimientos descritos en el presente documento. Además, este trabajo proporciona confirmación de la utilidad genérica de este grupo de autoanticuerpos como eficaces en la producción de la remielinización del sistema nervioso central

De acuerdo con una realización adicional de la invención, y como se ha indicado anteriormente, se ha definido una clase más amplia de anticuerpos y se divulga en el presente documento. Específicamente, de acuerdo con el presente documento también se divulgan y preparan autoanticuerpos monoclonales y policlonales humanos que proporcionan mayor afinidad por tejido neural y capacidad tanto diagnóstica como terapéutica. La invención se extiende más allá en cuanto a que los anticuerpos recién identificados se pueden usar para varios fines, tales como la estimulación de la remielinización, regeneración de células nerviosas dañadas, protección neuronal, sobrecrecimiento neuronal y similares.

Una característica y ventaja significativa de la presente invención reside en la fuente de anticuerpos, ya que pueden obtenerse directamente del huésped o paciente y usarse después para estimular autoterapias más seguras. Más ampliamente, el desarrollo de anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantes, péptidos, moléculas pequeñas y similares, en base a estos materiales endógenos reduce, si no elimina, posibles enfermedades o disfunciones, tales como reacciones autoinmunitarias, que pueden ser el resultado de la introducción in vivo y uso de materiales exógenos. Asimismo, el origen endógeno de los anticuerpos ofrece una ventaja adicional en cuanto a que es posible estudiar el proceso de reparación en el paciente o huésped e identificar, potencialmente, un mecanismo de acción subyacente en el tratamiento de la afección, que en sí misma puede proporcionar puntos de vista y estrategias terapéuticas adicionales.

Además, se contempla que la identificación de la relación entre agentes que estimulan la señalización del calcio, como mediante la inducción de picos de Ca++, en los oligodendrocitos, y el inicio y/o estimulación de las actividades terapéuticas indicadas, proporciona un procedimiento de identificar agentes terapéuticos mediante la demostración de la señalización del calcio en, por ejemplo, oligodendrocitos. En consecuencia, la invención también se extiende a este uso y actividad.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para seleccionar bibliotecas peptídicas o haptenos, de modo que los péptidos reactivos o los haptenos se pueden aislar y analizar su capacidad para remielinizar, inducir proliferación celular, diferenciación, sobrecrecimiento neural, brotes de neuritas y/o señalización de Ca++. Una vez aislados y purificados, dichos péptidos pueden usarse después para seleccionar otros anticuerpos policlonales o monoclonales, otras moléculas que pueden inducir remielinización, proliferación o diferenciación celular, sobrecrecimiento neuronal, brotes de neuritas y/o señalización de Ca++, el último mencionado, se cita en el presente documento que es relevante a la proliferación y a la correspondiente actividad de las células gliales. Particularmente, los péptidos, haptenos y otras moléculas que corresponden a los anticuerpos de la invención se pueden identificar por su capacidad para unirse a los oligodendrocitos y, de este modo, inducir rehabilitación neural, tal como remielinización, regeneración y neuroprotección. Asimismo, en el presente documento se describen péptidos que se unen a los autoanticuerpos descritos en el presente documento, de modo que estos péptidos, en virtud de su secuencia, estructura tridimensional o cambios conformacionales que surgen de la unión del anticuerpo, pueden usarse en y o por sí mismos como vacunas peptídicas.

Estos péptidos pueden tener propiedades neuromoduladoras y/o inmunomoduladoras, y pueden proporcionar un procedimiento de inducción de una respuesta proliferativa de células neurales y/o un papel neuroprotector, neuroregenerativo y/o remielinizante en mamíferos que necesiten dicha terapia.

Asimismo, en el presente documento se describen haptenos que se pueden unir a los péptidos, los anticuerpos y/u otros sustratos relevantes que pueden poseer inmunogenicidad, de modo que también pueden funcionar como componentes activos en formulaciones terapéuticas, que incluyen también vacunas. Como se describe en el presente documento, se pueden combinar uno o más haptenos con otros péptidos de la presente invención, en una formulación de vacuna.

Estos péptidos se pueden formular como composiciones farmacéuticas con estabilizantes para evitar la degradación proteolítica, de modo que se amplia su semivida para su administración por vía oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intratecal o como preparaciones de liposomas a mamíferos que necesiten dicha terapia.

La presente invención también se refiere a autoanticuerpos para usar en procedimientos de tratamiento de enfermedades desmielinizantes en mamíferos, tales como esclerosis múltiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domésticos, tales como encefalomielitis postinfecciosa, o inhibir profilácticamente la iniciación o progresión de la desmielinización en estos estados patológicos, usando los anticuerpos monoclonales, o fragmentos activos de los mismos, de la presente invención. La presente invención se refiere además a procedimientos in vitro de producción y estimulación de la proliferación de células gliales, tales como oligondendrocitos, y al uso de estas células gliales para tratar enfermedades desmielinizantes.

En un aspecto adicional, la invención se extiende a un grupo de moléculas que se denominarán en el presente documento agentes neuromoduladores y que son notables en su actividad terapéutica en el SNC. En consecuencia, la invención se refiere a agentes neuromoduladores con eficacia concreta en el SNC, en el que los agentes comprenden un material seleccionado del grupo consistente en un anticuerpo de la presente invención, incluidos anticuerpos del subtipo IgM, monómeros de los mismos, un análogo peptídico, un hapteno, fragmentos activos de los mismos, agonistas de los mismos, miméticos de los mismos y combinaciones de los mismos. Los agentes neuromoduladores tienen las características siguientes: inducen remielinización y/o proliferación celular de células gliales; y/o evocan la señalización de Ca++ con oligodendrocitos.

Más particularmente, los anticuerpos comprendidos dentro del alcance de los agentes neuromoduladores de la invención se pueden seleccionar del grupo consistente en AcMo sHIgM22 (LYM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, CB2bG8 mezclas de los mismos, monómeros de los mismos, fragmentos activos de los mismos y autoanticuerpos naturales o sintéticos que tienen las características de los AcMo sHIgM22 (LYM 22), sHIgM46, y ebvHIgM MSI19D10, CB2bG8, particularmente anticuerpos humanos. Los presentes agentes neuromoduladores pueden derivar de células de mamífero y, específicamente, pueden derivar de células humanas. Además, los agentes neuromoduladores pueden comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la FIGURA 17 (SEC ID Nº 1 y 49), FIGURA 18 (SEC ID Nº 5 y 50), FIGURA 19 (SEC ID Nº 9, FIGURA 20 (SEC ID Nº 11), FIGURA 27 (SEC ID Nº 13), FIGURA 28 (SEC ID Nº 15), o fragmentos activos de los mismos. La presente invención también se refiere a una molécula de ADN recombinante o gen clonado, o a una variante degenerada del mismo, que codifica una clase de moléculas que, en el presente documento, también se denominarán agentes neuromoduladores y que incluyen y se pueden seleccionar de los anticuerpos de la invención, y, particularmente, de los anticuerpos que tienen secuencias correspondientes, al menos en parte, a las secuencias presentadas en las FIGURAS 17-20, 27, 28 y 37-43, y péptidos que pueden corresponder al menos en parte a los anticuerpos de la presente invención, que también se denominarán en el presente documento péptidos de anticuerpo y, por ejemplo, péptidos que tienen una o más secuencias correspondientes, al menos en parte, a las FIGURAS 1720, 27, 28 y 37-43, y moléculas pequeñas, tales como haptenos; incluidas moléculas de ADN recombinante o genes clonados que tienen las mismas secuencias o secuencias complementarias.

Más particularmente, la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de ADN o variante degenerada de la misma, que codifica un anticuerpo, un análogo peptídico del mismo, un hapteno correspondiente o un fragmento activo del mismo y que se puede seleccionar del grupo que consiste en:

(A)

la secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porción de la FIGURA 17 (SEC ID Nº 1, 49);

(B la secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porción de la FIGURA 18 (SEC ID Nº 5, 50);

(C)

La secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porción de la FIGURA 19 (SEC ID Nº 9);

(D)

la secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia correspondiente a al menos una

porción de la FIGURA 20 (SEC ID Nº 11);

(E)

la secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porción de la FIGURA 27 (SEC ID Nº 13);

(F)

la secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia correspondiente a al menos una porción de la FIGURA 28 (SEC ID Nº 15);

(N)

secuencias de ADN que hibridan con cualquiera de las secuencias de ADN anteriores en condiciones de hibridación estándar; y

(O)

secuencias de ADN que codifican la expresión de una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ADN anteriores.

La presente invención también incluye proteínas derivadas de, o correspondientes a, dichos anticuerpos, o fragmentos o derivados de los mismos, que tienen las actividades indicadas en el presente documento y que muestra las secuencias de aminoácidos indicadas y descritas con anterioridad y seleccionadas de las FIGURAS 1720, 27 y 28. Asimismo, la presente invención se extiende a haptenos que demuestran las mismas actividades que las proteínas o péptidos de anticuerpo, y que se pueden administrar para fines terapéuticos de un modo similar, como mediante formulación en una composición terapéutica o vacuna. En una realización, se puede preparar una composición terapéutica o vacuna que incluye tanto péptidos como haptenos.

En una realización adicional de la invención, la secuencia completa de ADN de la molécula de ADN recombinante o gen clonado determinado de este modo puede estar unido operativamente a una secuencia de control de la expresión que se puede introducir en un huésped adecuado. De acuerdo con esto, la invención se extiende a huéspedes unicelulares transformados con el gen clonado o molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica los presentes péptidos de anticuerpo,

En una realización concreta, la secuencia de ADN de la región variable de un anticuerpo de la presente invención se puede usar para generar anticuerpo(s) sintético(s). En particular, la secuencia de la región variable se puede combinar con su secuencia de la región constante proporcionada genéticamente, para proporcionar un anticuerpo sintético. La presente invención proporciona vectores para generar anticuerpos sintéticos derivados de, y que comprende, las secuencias de ADN, en particular secuencias de la región variable, de los anticuerpos de la presente invención.

De acuerdo con otras características preferidas de ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, se proporciona un sistema de expresión recombinante para producir péptidos de anticuerpo biológicamente activos animales o, particularmente, humanos.

La presente invención incluye varios modos para la preparación de clones de los autoanticuerpos, péptidos, haptenos correspondientes u otros análogos de molécula pequeña de los mismos, incluidos, como se ilustra en el presente documento, técnicas recombinantes conocidas, y la invención, en consecuencia, pretende abarcar dichas preparaciones sintéticas en su alcance. El aislamiento del ADNc y las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento facilitan la reproducción de los presentes anticuerpos o sus análogos mediante dichas técnicas recombinantes y, de acuerdo con esto, la invención se extiende a los vectores de expresión preparados a partir de las secuencias de ADN divulgadas para la expresión en sistemas del huésped mediante técnicas de ADN recombinante y a los huéspedes transformados resultantes.

La invención incluye un sistema de ensayo para detección selectiva de potenciales fármacos eficaces para modular la actividad neurológica de las células neurales de mamífero diana potenciando la actividad de los presentes autoanticuerpos o sus análogos. En un caso, el fármaco de ensayo se pudo administrar a una muestra celular con el ligando que suprime o inhibe la actividad de los autoanticuerpos, o un extracto que contiene los anticuerpos suprimidos, para determinar su efecto sobre la actividad de unión de los autoanticuerpos a cualquier muestra química (incluido ADN), o al fármaco de ensayo, mediante comparación con un control.

El sistema de ensayo podría adaptarse para identificar fármacos u otras entidades capaces de unirse a los autoanticuerpos y/o sus dianas, incluidos péptidos, haptenos, otros factores o proteínas, se encuentren en el citoplasma, el núcleo o en cualquier otro lugar, de modo que potencian la actividad de anticuerpo, incluido, por ejemplo, la respuesta inmunitaria, el crecimiento neural, la neuroprotección y la remielinización, y las correspondientes actividades terapéuticas indicadas en el presente documento. Dicho ensayo sería útil en la identificación de candidatos a fármaco de entre bibliotecas peptídicas y otras de moléculas pequeñas, sueros y otros fluidos corporales relevantes, y en el desarrollo de fármacos que serían específicos bien en la estimulación o bien en la inhibición de una actividad celular concreta, o que potenciarían dicha actividad, en tiempo o en nivel de actividad. Por ejemplo, dichos fármacos podrían usarse para estimular la remielinización o para tratar otras enfermedades o lesiones, como, por ejemplo, al hacer las neuronas del SNC capaces o con mejor capacidad para adaptarse en el recrecimiento o regeneración.

Asimismo, la presente invención se extiende al desarrollo de anticuerpos correspondientes a los agentes neuromoduladores de la invención, incluidos los anticuerpos naturales y preparados de forma recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos podrían usarse para la detección selectiva en bibliotecas de expresión para obtener el gen o genes que codifican los péptidos que pueden funcionar como agentes neuromoduladores y que podrían funcionar en, por ejemplo, una vacuna. Dichos anticuerpos podrían incluir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales preparados mediante técnicas genéticas conocidas, así como anticuerpos biespecíficos (quiméricos) y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que las hacen adecuadas para uso diagnóstico adicional junto con su capacidad para emular o modular la actividad de los autoanticuerpos humanos que son parte de los agentes neuromoduladores de la presente invención.

Por tanto, los agentes neuromoduladores, sus análogos y/o análogos, y cualquier antagonista o anticuerpo que se puede producir frente a ellos, se pueden usar en relación con varias técnicas diagnósticas, incluidos inmunoensayos, tales como radioinmunoensayo, usando, por ejemplo, un anticuerpo frente a los agentes neuromoduladores que se ha marcado con adición radioactiva o radioyodinación.

En un inmunoensayo se puede preparar una cantidad control de los antagonistas o anticuerpos de los mismos, o similares, y marcar con una enzima, una pareja de unión específica y/o un elemento radioactivo, y después se puede introducir en una muestra celular. Después de que el material marcado, o su(s) pareja(s) de unión ha tenido la oportunidad de reaccionar con sitios dentro de la muestra, la masa resultante se puede analizar mediante técnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza del marcador unido.

En el caso en el que se use un marcador radioactivo, como los isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I y 186Re, se pueden usar procedimientos de recuento conocidos disponibles en la actualidad. En el caso en el que el marcador es una enzima, la detección se puede conseguir mediante cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas usadas en la actualidad conocidas en la materia.

La presente invención incluye un sistema de ensayo que se puede preparar en forma de un kit de ensayo para el análisis cuantitativo de la extensión de la presencia de los agentes neuromoduladores o para identificar fármacos u otros agentes que pueden imitar o bloquear su actividad. El sistema o kit de ensayo puede comprende un componente marcado preparado mediante una de las técnicas radioactivas y/o enzimáticas tratadas en el presente documento, acoplar un marcador a los agentes neuromoduladores, sus agonistas y/o antagonistas y uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales, al menos uno de los cuales es un ligando libre o inmovilizado, capaces de unirse al componente marcado, a su pareja de unión, a uno de los componentes que se va a determinar o a su(s) pareja(s) de unión.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a autoanticuerpos para usar en ciertos procedimientos terapéuticos que se basarían en la actividad de los agentes neuromoduladores, sus subunidades, o fragmentos activos de los mismos, equivalentes peptídicos de los mismos, análogos de los mismos, o en agentes u otros fármacos que se haya determinado que poseen la misma actividad. Un primer procedimientos terapéutico se asocia con la prevención de las manifestaciones de afecciones relacionadas causalmente o después de la actividad de unión de los anticuerpos o sus subunidades, y comprende administrar un agente capaz de estimular la producción y/o actividad de los agentes neuromoduladores, los correspondientes autoanticuerpos, péptidos de anticuerpos, fragmentos activos o subunidades de los mismos, bien individualmente o mezclados entre sí en una cantidad eficaz para prevenir o tratar el desarrollo de dichas afecciones en el huésped. Por ejemplo, se pueden administrar fármacos u otras parejas de unión a los anticuerpos o sus fragmentos, o similares, para potenciar la actividad neuroregeneradora y/o neuroprotectora, o para estimular la remielinización como en el tratamiento de la esclerosis múltiple.

Más específicamente, el procedimiento terapéutico al que en general se hace referencia en el presente documento podría incluir el procedimiento para el tratamiento de varias enfermedades u otras disfunciones y desorganizaciones celulares, mediante la administración de composiciones farmacéuticas que pueden comprender inhibidores o potenciadores eficaces de la activación de los agentes neuromoduladores u otros fármacos igualmente eficaces, por ejemplo, mediante un ensayo de detección selectiva de fármacos preparado y usado de acuerdo con un aspecto de la presente invención tratado anteriormente. Por ejemplo, fármacos u otras parejas de unión a los agentes neuromoduladores o proteínas similares, que tienen secuencias correspondientes, al menos en parte, a las secuencias representadas por la FIGURA 17 (SEC ID Nº 1, 49), FIGURA 18 (SEC ID Nº 5, 50), FIGURA 19 (SEC ID Nº 9), FIGURA 20 (SEC ID Nº 11), FIGURA 27 (SEC ID Nº 13), FIGURA 28 (SEC ID Nº 15) se pueden administrar para inhibir o potenciar la neuroregeneración, neuroprotección o remielinización, como en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o esclerosis múltiple. En particular, la proteína de sHIgM46, (LYM 22), cuyas secuencias se presentan en las FIGURAS 17 y 18, y/o las de MSI19D10 presentadas en las FIGURAS 19 y 20, y/o las de CB2bG8 presentadas en las FIGURAS 27 y 28, sus anticuerpos, agonistas, antagonistas o fragmentos activos de los mismos, se podrían preparar en formulaciones farmacéuticas, incluidas vacunas, para administrar en los casos en los que la terapia neuroregeneradora y/o neuroprotectora o desmielinización es adecuada, tal como para tratar la enfermedad de Alzheimer, ELA, EM, enfermedad de Parkinson o lesiones en la médula espinal. La presente invención incluye combinaciones o mezclas de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, en el que más de uno de los anticuerpos, particularmente anticuerpos humanos, más particularmente seleccionados del grupo de sHIgM22, sHIgM46, MSI19E10 y CB2bG8, se pueden preparar en composiciones o formulaciones farmacéuticas y terapéuticas. Además, la invención proporciona combinaciones adicionales del(los) anticuerpo(s) como compuestos terapéuticos, fármacos o agentes útiles en dicha terapia neuroregeneradora y/o neuroprotectora o de remielinización. Por ejemplo, la formulación o composición de anticuerpo de la presente invención se puede combinar con compuestos terapéuticos para el tratamiento de la esclerosis múltiple, incluidos, entre otros, formulaciones con interferón beta ((Betaseron, etc.) y copolímero 1 (Copaxone).

De acuerdo con esto, es un objeto principal de la presente invención proporcionar agentes neuromoduladores, incluidos autoanticuerpos humanos y los correspondientes péptidos de anticuerpo, haptenos, análogos y fragmentos activos de los mismos en forma purificada, que exhibe ciertas características y actividades asociadas con la estimulación de la actividad neuroregeneradora y/o neuroprotectora.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para detectar la presencia, la cantidad y la actividad de los autoanticuerpos en mamíferos en los que se sospecha que ha estados patológicos invasivos, espontáneos o idiopáticos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento y un sistema de ensayo asociado para la detección selectiva de sustancias, tales como fármacos, agentes y similares, potencialmente eficaces en la simulación de la actividad o para combatir cualquier efecto adverso de los autoanticuerpos y/o sus fragmentos, subunidades o similares, en mamíferos.

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar procedimientos para tratar enfermedades desmielinizantes en mamíferos, tales como esclerosis múltiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domésticos, tales como encefalomielitis postinfecciosa, o inhibir profilácticamente la iniciación o progresión de la desmielinización en estos estados patológicos, usando los autoanticuerpos monoclonales descritos, fragmentos activos de los mismos, u otros autoanticuerpos naturales o sintéticos que tienen las característicos de los anticuerpos humanos de ejemplo mediante sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10 y CB2bG8. Además, se proporcionan dichos procedimientos que usan los autoanticuerpos, fragmentos activos de los mismos, u otros autoanticuerpos naturales o sintéticos que tienen las característicos de los anticuerpos humanos de ejemplo mediante AKJR4, CB2iE12, CB2iE7 yMSI19E5.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar procedimientos in vitro de producción y estimulación de la proliferación de células gliales, tales como oligondendrocitos, y al uso de estas células gliales para tratar enfermedades desmielinizantes.

Es todavía un objeto adicional de la presente invención proporcionar los presentes agentes neuromoduladores, y composiciones farmacéuticas, que incluyen vacunas que comprenden las mismas, para uso en procedimientos terapéuticos que comprenden, o se basan en, los presentes agentes neuromoduladores, y, particularmente, los autoanticuerpos humanos, fragmentos, incluidos fragmentos peptídicos, haptenos, subunidades, agonistas, pareja(s) de unión, o en agentes o fármacos que controlan la producción o que imitan o antagonizan las actividades de los agentes neuromoduladores.

Es todavía un objeto adicional de la presente invención proporcionar procedimientos de ensayo que incluyen ensayos de selección, para la identificación de fármacos y otras moléculas que imitan o antagonizan los agentes neuromoduladores de la invención y que, en consecuencia, se pueden considerar para uso como agentes terapéuticos.

Otros objetos y ventajas serán evidentes para los expertos en la técnica desde una revisión de la descripción siguiente, que procede en referencia a las siguientes figuras ilustrativas.

Descripción de las figuras

La FIGURA 1 comprende fotografías que muestran que los anticuerpos policlonales humanos y los anticuerpos IgM monoclonales humanos derivados de suero (sHIgMs) se unen con una especificidad alta a los antígenos de superficie sobre las células en láminas de cerebelo. Marcaje inmunofluorescencia indirecta de láminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los sHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lámina de cerebro sin fijar. Esta propiedad se usó como uno de los criterios para seleccionar anticuerpos candidatos para analizar in vivo la capacidad para estimular la remielinización (véase la Tabla 1 y la Figura 12). La IgG policlonal humana se une muy débilmente a muchas estructuras dentro del cerebelo, incluida la sustancia blanca y las células de Purkinje (A), mientras que la IgM humana policlonal se une fuertemente a la mielina y los oligodendrocitos dentro de la sustancia blanca central de las hojas, los cuerpos de las células de Purkinje y muchas células pequeñas dentro de la capa granular y molecular (B). sHIgM 22 (C) se une bien al citoesqueleto de los astrocitos dañados sobre la sustancia blanca central de las hojas, células de Purkinje y sus arborizaciones dendríticas y a células redondas pequeñas en la capa molecular. sHIgM 22 marca débilmente, pero uniformemente, marca la superficie de las células granulares. sHIgM 14 (D) se une bien a las células de la capa granular y las células de Purkinje localizadas en la superficie de la lámina, mientras que la sustancia blanca central de las hojas está considerablemente desprovista de marcador. sHIgM 1 (E) marca el citoesqueleto de los astrocitos sobre la sustancia blanca central de las hojas. Las demás estructuras se identifican justo por encima de los niveles de fondo. SHIgM2

(F) se une a las células de la capa granular y a las fibras que atraviesan la sustancia blanca central de las hojas. Aumento x.

La FIGURA 2 comprende fotografías que muestran que sHIgMs adicionales se unen con una especificidad elevada a las células en las láminas del cerebelo. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de láminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los sHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lámina de cerebro sin fijar. sHIgM 12 (A) se une y da un aspecto esponjoso a la sustancia blanca central de las hojas y un marcaje uniforme sobre la capa molecular, reminiscente de una molécula de la matriz extracelular. Los astrocitos que se encuentran encima también están bien definidos. sHIgM 29 (B) se une muy débilmente a muchas estructuras dentro del cerebelo, con una intensidad justo por encima de la de fondo, a excepción de una población pequeña de neuronas en las capas granular y molecular. Las extensiones axónicas sobre 100 (m de longitud están claramente delineadas. sHIgM 31 (C) y sHIgM 50 (F), cada uno, se unen predominantemente a la capa granular, con poca unión a la sustancia blanca, células de Purkinje o astrocitos. El patrón de unión de sHIgM 50 es también reminiscente de una molécula de matriz extracelular. sHIgM 42 (D) se une en un patrón fibroso a toda la hoja, las capas molecular y granular y a la sustancia blanca. sHIgM 46 (E) se une en un patrón fibroso a la capa granular y a la sustancia blanca. Los cuerpos de las células de Purkinje están bien definidos.

La FIGURA 3 comprende fotografías que muestran que sHIgM se unen con una especificidad elevada a las láminas sin fijar de sustancia blanca cortical humana de adulto. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de láminas sin fijar de sustancia blanca cortical humana de adulto. La sustancia blanca cortical humana se obtuvo en autopsia de un individuo sin infección ni traumatismo del SNC, La causa de la muerte fue otra no relacionada con el SNC. El tejido se mantuvo eh hielo y se mantuvo frío durante todo el procedimiento de marcaje con anticuerpo. sHIgM 2 (A) se une sólo a unas pocas células dentro del campo de visión. En contraste, otras sHIgM se unen a la sustancia blanca humana bastante bien y con un grado alto de especificada. sHIgM 32 se une a las células de aspecto de astrocito de tipo 2 (C), mientras que sHIgM 31 se une a muchos cuerpos celulares redondos no identificados (B). sHIgM 26 se une a células de aspecto de oligodendrocitos y a sustancia blanca fibrosa (E). sHIgM 22 se une a la sustancia blanca cortical humana de un modo que sugiere una molécula unida a matriz extracelular (D). Aumento x.

La FIGURA 4 comprende fotografías que muestran que los anticuerpos IgM monoclonales derivados del clon de células B humanas inmortalizadas con EBV (ebvHIgM) se unen con una especificidad alta a los antígenos de superficie sobre las células en el cerebelo. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de láminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los ebvHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lámina de cerebro de rata sin fijar. ebvHIgM MSI19E15 (A) se une a estructuras fibrosas dentro de la sustancia blanca y a las capas granular y molecular en un patrón de casi confluencia. ebvHIgM AKJJR4 (B) se une casi exclusivamente a la capa granular. Las células pequeñas dentro de la capa molecular también se identifican. ebvHIgMs MSI17A2 (C) y MSI20H10 (E) se unen a la sustancia blanca central las capas granular y molecular y las células de Purkinje con varios grados de intensidad. ebvHIgM MSI16E6 (D) demuestra una afinidad muy fuerte por las células de Purkinje y sus árboles dendríticos, mientras que la capa granular está marcada mucho menos claramente. ebvHIgM MSI7E11 (F) se une de un modo puntual a sólo unas pocas células de aspecto glial en la superficie de la lámina cerebral. Aumento x.

La FIGURA 5 muestra que ebvHIgM adicionales que se unen con una especificidad elevada a los antígenos de superficie sobre las células en las láminas del cerebelo. Marcaje inmunofluorescencia indirecta de láminas sin fijar de cerebelo de rata posnatal. Los ebvHIgM muestran una variedad de especificidades por poblaciones y estructuras celulares dentro de una lámina de cerebro sin fijar. Cada panel muestra el extremo terminal de una única hoja cerebelar, incluida la sustancia blanca central, y las capas granular, de Purkinje y molecular. Los sobrenadantes que contienen ebvHIgM se incubaron a 1:1 con medio tamponado sobre láminas de cerebro. Muchos ebvHIgM se unen a la sustancia blanca, los cuerpos de las células de Purkinje y a células pequeñas dentro de la capa molecular, pero con afinidades variables. ebvHIgM MSI19D10 (A) se une fuertemente a las células de la capa granular y a las células de Purkinje y a sus árboles dendríticos, además de identificar débilmente la sustancia blanca y los astrocitos. ebvHIgM MSI19D10 se analizó según su capacidad para estimular la remielinización in vivo (véase la Tabla 1 y la Fig. 13). Se han aislado otros ebvHIgMs, CB2bG8 (B), CB2eC2 (C), CB2iE12 (D), y MSI10E10 (F) de unión en el cerebro y se requieren estudios adicionales, pero no se han analizado in vivo. CB2eC2 (E) es la intensidad típica de un sobrenadante no reactivo. Aumento x.

La FIGURA 6 muestra que la IgM humana policlonal se une a los oligodendrocitos en cultivo. Mediante inmunohistoquímica, la IgM humana policlonal tiñe la superficie de una subpoblación de oligodendrocitos. No se observó reactividad a los antígenos de superficie de los oligodendrocitos con IgG humana policlonal u sueros de sHIgM 1 o SHIgM 2. Inmunocitoquímica con IgM o IgG humana combinada en células fijadas y permeabilizadas mostró una tinción mínima de las estructuras intracelulares.

La FIGURA 7 muestra que sHIgM se unen con una especificidad elevada a los antígenos de superficie sobre las células gliales en cultivo. Marcaje de inmunofluorescencia indirecta de cultivos de células gliales mixtas primarias de ratas vivas a los nueves días del sembrado. sHIgM demuestran varias especificidades respecto a os tipos celulares unidos, así como la etapa de diferenciación celular identificada en los cultivos de células gliales. sHIgM 12 se une a grupos de posibles progenitores de oligodendrocitos (A, marcador verde) en la niebla de los oligodendrocitos OD4 + más maduros (A, marcador rojo). sHIgM 22 se une a los oligodendrocitos en las etapas maduras (B) adherentes a la superficie del cultivo glial. sHIgM 46 se une fuertemente a las etapas maduras de los oligodendrocitos (C, centro de la figura) y a las etapas inmaduras de los oligodendrocitos con un marcador punteado más débil (C, izquierda de la figura). sHIgM 42 (D) y sHIgM 51 (F) se unen ambas a las etapas maduras de los oligodendrocitos y débilmente, a los astrocitos subyacentes. sHIgM 30 se une a los cuerpos celulares de la mayoría de las células en cultivo, mientras que no se delinean extensiones del proceso (E).Aumento x.La FIGURA 8 muestra que las sHIgM se unen a las células del linaje de los oligodendrocitos en láminas de cerebelo y cultivos de células gliales primarias mixtas. Las células identificadas por los sHIgM se marcan de forma conjunta con marcadores para el linaje de los oligodendrocitos. Las células que se unen a sHIgM 22 en una lámina sin fijar de cerebelo de rata neonata co-marcan el anticuerpo Rip, un marcador citoplasmático para etapas maduras de los oligodendrocitos. Las imágenes confocales de doble marcador demuestran que las células positivas para sHIgM 22 (A) también son positivas para Rip (C). Las imágenes (A) y (C) se fusionan en (E). Las células que se unen a sHIgM 51 en cultivos de células gliales de rata primarias mixtas (B) también son positivos 04 (D). 04, una anti-sulfatida, es un marcador bien establecido para el linaje de oligodendrocitos que aparece antes del cese de la proliferación y se mantiene en la vaina de mielina adulta. Las imágenes (B) y (D) se fusionan en (F). Aumento x.

La FIGURA 9 muestra que las sHIgM se unen a las células del linaje de los oligodendrocitos en láminas de cerebelo y cultivos de células gliales primarias mixtas. Las células identificadas por ebvHIgM MSI19E5 en una lámina sin fijar de cerebelo de rata neonata co-marcan el anticuerpo 04, una una anti-sulfatida y marcador de superficie celular para oligondendrocitos. Las imágenes confocales de doble marcador de células dentro de la sustancia blanca de las hojas demuestran que las células positivas demuestran células positivas para ebvHIgM MSI19E5 (A) que también son positivas para 04 (B), Las imágenes (A) y (B se fusionan en (C).

La FIGURA 10 presenta los resultados de la detección selectiva de sHIgM según la unión a los antígenos del SNC encontrados en el homogeneizado de médula espinal. Los sHIgMs se sometieron a detección selectiva por su unión al homogeneizado de médula espinal unido a placas de poliestireno. La mayoría de los antígenos que se unen a la placa son lípidos y proteínas de la sustancia blanca de la médula espinal. Por tanto, la unión fuerte al homogeneizado de SCH se puede interpretar como unión a los componentes de la sustancia blanca. Sólo 1 sHIgM se une al SCH con una DO superior a 1, sHIgM 22. Este anticuerpo también se une bien a láminas cerebrales, los oligodendrocitos en cultivo, y se ha analizado la capacidad de estimular la remielinización in vivo (véase la Tabla 1). Se ha demostrado que este sencillo ensayo es una potente herramienta en la predicción de la capacidad de un anticuerpo para estimular la remielinización in vivo. Otros SHIgM que se unen bien a SCH (tal como 38 y 49) se están estudiando.

La FIGURA 11 muestra los resultados de la detección selectiva de ebvHIgM según la unión a los antígenos del SNC encontrados en el homogeneizado de médula espinal. Los ebvHIgM se sometieron a detección selectiva por su unión al homogeneizado de médula espinal unido a placas de poliestireno. Cuatro ebvHIgM se unieron al homogeneizado de SCH con una DO superior a 1. Uno de estos, MSI19D10 se ha analizado según su capacidad para estimular la remielinización in vivo. (véase la Tabla 1). También se ha analizado in vivo un anticuerpo de unión baja, AKJR4 (véase la Tabla 1). Otro anticuerpo de unión fuerte, AKJR8, se está estudiando. Los clones CB2iH1 y CB1bD2, producen muy poco anticuerpo en cultivo. De nuevo, se ha demostrado que este sencillo ensayo es una potente herramienta para la detección selectiva de anticuerpos y en la predicción de la capacidad de un anticuerpo para estimular la remielinización in vivo.

La FIGURA 12 demuestra que los anticuerpos policlonales humanos y un sHIgM estimulan la remielinización en ratones infectados con TMEV. Fotomicrografías ópticas de regiones de patología de la mielina en médulas espinales de ratones SJL/J infectados crónicamente con TMEV. Se observa extensa remielinización del SNC, caracterizada por vainas de mielina finas en relación con el diámetro del axon, en ratones tras el tratamiento con IgG (A) policlonal humana, IgM (B) policlonal humana y sHIgM 22 (C). Se observó desmielinización sin remielinización significativa en ratones tratados con sHIgM 14 (D), sHIgM 1(E) y sHIgM 2. Secciones embebidas en radita se tiñeron con 1 % de pfenilendiamina. Aumento x. Se ha demostrado que la IgM policlonal humana es superior en la capacidad de estimular la remielinización in vivo a la IgG policlonal humana (Tabla 1). Parece que la especificidad fuerte del SNC es uno de los requisitos para que un anticuerpo estimule la remielinización in vivo, pero sola no es suficiente para predecir la capacidad del anticuerpo para estimular la remielinización.

La FIGURA 13 muestra que un ebvHIgM puede estimular la remielinización en ratones infectados con TMEV. Fotomicrografías ópticas de regiones de patología de la mielina en médulas espinales de ratones SJL/J infectados crónicamente con TMEV. Se observa extensa remielinización del SNC, caracterizada por vainas de mielina finas en relación con el diámetro del axon, en ratones tras el tratamiento con ebvHIgM MSI19D10 (A). Se observó desmielinización sin remielinización significativa en ratones tratados con ebvHIgM AKJR4 (B). Secciones embebidas en radita se tiñeron con 1 % de p-fenilendiamina. De nuevo, parece que la especificidad fuerte del SINC es uno de los requisitos para que un anticuerpo estimule la remielinización in vivo, pero sola no es suficiente para predecir la capacidad del anticuerpo para estimular la remielinización.

La FIGURA 14 presenta la cuantificación de axones mielinados en lesiones de lisolecitina tratadas con IgM policlonal humana. Los axones remielinizados/mm2 en lesiones de lisolecitina tratadas frente a sin tratar. Hay un número significativamente mayor de axones mielinados en lesiones de lisolecitina tratadas con IgM policlonal humana que los animales tratados con IgG policlonal humana (p<0,05). Un animal del grupo control con PBS remielinizó de forma espontánea y, por tanto, la diferencia entre los grupos tratados con anticuerpo humano y el grupo control no es estadísticamente significativa (p> 0,05).

La FIGURA 15 demuestra que los anticuerpos humanos son polirreactivos a los haptenos químicos mediante ELISA. Las especificidades de unión a antígeno de las inmunoglobulinas se evaluaron mediante ELISA directo. Reactividades químicas de hapteno de IgM policlonal humana, IgG policlonal humana. Abreviaturas usadas en estas figuras: NP, (4-hidroxi-3-nitrofenil)acetilo; PhoX, feniloxazolona; TMA, azofeniltrimetilamonio; FITC, fluoresceína; PC, azofenilfosforil-colina; ARS, azofenilarsonato; TNP, trinitrofenil acetilo.

La FIGURA 16 muestra que los anticuerpos humanos son polirreactivos a la autoproteína mediante ELISA. Las especificidades de unión a antígeno proteico de las inmunoglobulinas se evaluaron mediante ELISA directo. Abreviaturas usadas en estas figuras: MBP, proteína básica de la mielina; KLH, hemocianina de lapa californiana; HEL, lisozima de huevo de gallina; BSA, seroalbúmina bovina; Rbt, conejo; Bo, bovino; Mo Hb, hemoglobina de ratón.

La FIGURA 17 presenta las secuencias de la región variable de la cadena pesada de sHIgM 22. La secuencia está alineada de acuerdo con el sistema de numeración de las secuencias VH humanas en la publicación: Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol I, Quina Edición (1991), Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H.M. Gottesman, K.S. y Foeller, C., NIH Publication. La VH de sHIgM 22 es un miembro del subgrupo III de VH. Los aminoácidos subrayados se han confirmado mediante secuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de nucleótidos de sHIgM 22. Las secuencias de tipo A y B de VH de SHIgM 22 se representan sólo con nucleótidos que difieren de las secuencias de la línea germinal de IGHV3-30/3-30-05*01, IGHJ4*02 y IGHD2-21*02. Dos sustituciones de aminoácidos en la secuencia proteica de la VH de sHIgM 22 de tipo B están impresas en negrita. Las secuencias de la VH de sHIgM 22 de tipo A y de tipo B coincidieron más estrechamente con la secuencia de la línea germinal de IGHV3-30/3-30-5*01 (homología del 96 %). Referencias para las secuencias de la línea germinal: IMGT, base de datos internacional ImMunoGeneTics [http://imgt.cnusc.fr:8104]. (Iniciador y coordinador: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia)

La FIGURA 18 presenta las secuencias de la región variable de la cadena ligera de sHIgM 22. La secuencia está alineada de acuerdo con el sistema de numeración de las secuencias VH humanas en la publicación: Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol I, Quina Edición (1991), Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H.M. Gottesman, K.S. y Foeller, C., NIH Publication. Vλ de sHIgM 22 es un miembro del subgrupo lambda I. Los aminoácidos subrayados se han confirmado mediante secuenciación proteica. La secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de nucleótidos de sHIgM 22. Las secuencias de tipo I y II de Vλ de SHIgM 22 se representan sólo con nucleótidos que difieren de las secuencias de la línea germinal de IGLV1-51*01 y IGLJ3*01 . Dos sustituciones de aminoácidos en la secuencia proteica de la Vλ de sHIgM 22 de tipo II están impresas en negrita. Las secuencias de de sHIgM 22 coincidían más estrechamente con la secuencia de la línea germinal IGLV-51*01 (homología del 97 %). Los dos genes difieren de su ancestro común en un solo cambio de nucleótido. Referencias para las secuencias de la línea germinal: IMGT, base de datos internacional ImMunoGeneTics [http://imgt.cnusc.fr:8104]. (Iniciador y coordinador: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia)

La FIGURA 19 presenta las secuencias de la región variable de la cadena pesada de ebvHIgM MSI19D10.

La FIGURA 20 presenta las secuencias de la región variable de la cadena ligera de ebvHIgM MSI19D10.

La FIGURA 21 demuestra que los anticuerpos monoclonales que estimulan la remielinización producen un flujo de Ca2+ en las células gliales en cultivo. Los tres paneles demuestran las respuestas de Ca2+ de las células gliales a cuatro anticuerpos diferentes. Dos que estimulan la remielinización in vivo, sHIgM 22 (A) y SCH94.03 (B), y dos que no estimulan la remielinización, sHIgM 14 (panel C) y CH12 (C). Las células que respondieron exhibían uno de dos tipos diferentes de contaminantes de calcio, un pico rápido inmediatamente tras la adición del anticuerpo (A y B, trazas rojas) o un pico más ancho que aparece con un retraso corto tras la adición del anticuerpo (A y B, trazas negras). Los triángulos pequeños coloreados en el eje del tiempo representan el momento en el que se añadió el anticuerpo (o ionóforo). Loas anticuerpos sHIgM 22 and SCH94.03 provocaron ambos tipos de respuestas, pero de diferentes subpoblaciones ce células gliales (paneles A y B). Loas anticuerpos sHIgM14 y CH12, que no estimulan la remielinización in vivo, no se observó que causaran el flujo de calcio en cultivos de glía (panel C). Al final de cada experimento, el ionóforo de calcio Br-A23187 se añadió a cada cultivo como control de la integridad celular. La adición del ionóforo a células viables produce una gran entrada de Ca2+ que es evidente en cada uno de los experimentos que se representan.

La FIGURA 22 demuestra que sHIgMs y ebvHIgMs se unen a neuronas primarias en cultivo. El marcaje con inmunofluorescencia indirecta de células granulares de rata primarias vivas a los seis días en cultivo, sHIgM 12 se une a casi todos los axones y extensiones dendríticas de células granulares cerebelares en cultivo (A). El patrón de unión es similar al observado con los anticuerpos anti-gangliósidos, tal como el anticuerpo A2B5 de ratón. Se ha demostrado que A2B5 estimula la remielinización in vivo (Asakara y col., 1998). ebvHIgM CB2iE12 solo se une a cuerpos celulares granulares y a sus extensiones axonales proximales (B). El antígeno reconocido por CB2iE12 está regulado en el desarrollo, ya que células granulares en cultivo son negativas para la tinción con CB2iE12 hasta 4-5 días después de la siembra en la placa. Aumento x.

La FIGURA 23 demuestra que el anticuerpo monoclonal de ratón SCH94.03 se une a la superficie de las células granulares en cultivo. Marcaje con inmunofluorescencia indirecta y la imagen confocal en serie demuestra que el anticuerpo monoclonal de ratón SCH94.03 se une a la superficie de las neuronas granulares en cultivo. La serie de imágenes se tomo separadas por 1 um y claramente muestran los anillos circulares concéntricos previstos de un cuerpo celular esférico marcado externamente con extensiones del proceso.

La FIGURA 24 representa la metodología usada para cuantificar la sustancia blanca, la patología de la sustancia blanca y la remielinización en las médulas espinales de ratones infectados con TMEV. Fotomicrogafías ópticas de una sección de médula espinal a nivel torácico de un ratón SJL/J infectado crónicamente con TMEV y tratado con IgM policlonal humana (A). La sustancia blanca en la periferia se tiñe de forma más oscura que la sustancia gris central más clara. El área de sustancia blanca total está trazada (indicada por las líneas rojas) con un aumento de 40x. Después, las áreas de patología de la sustancia blanca están trazadas (indicada por las líneas verdes) con un aumento de 100x. En este ejemplo, las áreas de patología de la sustancia blanca aparecen como áreas más ligeras en la periferia de la sección. Por último, a un aumento de 250x, las áreas de remielinización de OL (indicadas por las líneas azules) y de remielinización de SC (indicadas por la línea amarilla) están trazadas. La remielinización de OL se caracteriza por vainas finas de mielina en relación con el diámetro del axon. El porcentaje de área de patología de la sustancia blanca se calcula dividiendo el área de color verde por el área de color rojo x 100. El porcentaje de área de remielinización de OL se calcula dividiendo el área de color azul por el área de color verde x 100. Se trazan diez secciones transversales de médula espinal para cada animal considerado y las áreas se combinan para calcular una puntuación para dicho animal. En general, en cada grupo experimental se tratan 7-8 animales para contar con las muertes y con los animales que no contienen al menos un 5 % de patología de sustancia blanca. Normalmente, 4-5 animales tratados cumplen los criterios de inclusión en el conjunto de datos final. Un campo de aumento alto de la sustancia blanca de la columna dorsal (B, del área indicada con el asterisco en A) demuestra una remielinización de OL significativa (flecha). Las barras a escala son 250 m en A y 20 m en B.

La FIGURA 25 tras tratamiento con Ac humanos, ratones infectados crónicamente con TMEV demuestra remielinización significativa de OL. Microfotografías ópticas de áreas representativas de patología de sustancia blanca de la médula espinal de diferentes grupos de tratamiento. El tratamiento con IVIg tuvo como resultado una significativa remielinización de OL (A). Se observó una remielinización casi completa, caracterizada por vainas de mielina finas densamente empaquetadas en relación con el diámetro del axon (B, punta de la flecha), en secciones de médula espinal de ratones tras el tratamiento con IgM policlonal humana (B) y AcMo humanos sHIgM 22 (F) y sHIgM46 (G). En contraste, tras el tratamiento con AcMo sHIgM1 (C), sHIgM2 (D), sHIgM14 (E) o PBS (H), los ratones mostraron patología de la sustancia blanca sin una remielinización significativa de OL. También fueron evidentes las células inflamatorias infiltrantes y los macrófagos que ingieren los restos de mielina (A, punta de flecha), signos de destrucción activa de mielina. Secciones transversales de médula espinal en cuatro de ocho animales tratados con sHIgM22 y cinco de cinco animales tratados con sHIgM46 contenían al menos un área de remielinización de OL casi confluente, un acontecimiento raro que indica significativa reparación tisular. En contraste, las 10 secciones transversales de médula espinal de cada ratón tratado con sHIgM1, sHIgM2, sHIgM14 o PBS no contenían ninguna. La barra de escala es de 20 mm.

FIGURA 26 Los AcMo humanos aislados por su capacidad para unirse a OL de rata también se unen a la superficie de OL humanos en cultivo. sHIgM14 (A), que no estimularon la remielinización y sHIgM22 (B) y sHIgM46 (C), que estimularon la remielinización, se unieron al pericarion y elaboraron el proceso y las extensiones de membrana de los OL humanos positivos para sulfatida mantenidos en cultivo durante 3 semanas. sHIgM2 (D, canal verde) es un ejemplo de AcMo humano que no se unió a los OL humanos positivos para sulfatida (D, canal rojo). Los núcleos se marcan con color azul. IVIg, IgM policlonal humana y los AcMo humanos sHIgM1 y sHIgM2 no se unieron a la superficie de los OL humanos en ningún punto de tiempo analizado. La barra de escala es de 25 mm.

La FIGURA 27 presenta la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo CB2b-G8 transformante con EBV.

La FIGURA 28 presenta la secuencia de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo CB2b-G8 transformante con EBV.

La FIGURA 29 Amplificación del ARN de la cadena ligera y expresión de proteínas en células de hibridoma transfeccionadas mediante amplificación con metotrexato de un plásmido de expresión que contiene dHfR. El plásmido de expresión que contiene la secuencia de codificación para la cadena ligera kappa 94,03 humanizada bajo el control del promotor del MCV junto con un gen de dHfR unido bajo el control del promotor de SV40 se introdujo mediante electroporación en la línea celular de hibridoma humano/de ratón F3B6 negativa para inmunoglobulina. Las células bajo selección con metotrexato mínimo (0,5 g/ml) y las que habían sufrido una selección más rigurosa (52,1 g/ml) se cultivaron para recoger el sobrenadante para evaluar la secreción de la cadena ligera y ARN para evaluar la expresión del gen de la cadena ligera. El análisis de transferencia de tipo northern indica una amplificación sustancial de la expresión de ARN en un clon (nº 5). La expresión proteica aumentó tras la selección con metotrexato en el clon 4, pero no en el clon 5. Estos hallazgos indican que la amplificación con metotrexato en ocasiones tiene como resultado la amplificación del ARNm y de la expresión proteica mediante genes estrechamente unidos, pero, en otros casos, no se observa amplificación de la transcripción ni de la síntesis proteicas.

La FIGURE 30 Los vectores amplificables que codifican 94.03 humanizado y sHIgM 22. El panel superior es el vector prototipo que contiene la secuencia de codificación de la cadena ligera 94.03 () y una construcción genómica híbrida que codifica la cadena pesada () 94.03. El panel inferior es una construcción similar que contiene las secuencias de codificación derivadas de la secuencia de sHIgM 22.

La FIGURA 31 Cerebelo de rata posnatal teñido con 94.03 murino y humanizado. Secciones de cerebelo se tiñeron con 94.03 de ratón y humanizado. El anticuerpo unido se localizó usando reactivo de anticuerpo secundario fluorescente específico de IgM de ratón o humano, respectivamente. Ambos anticuerpos mostraron similares patrones de tinción a los de la sustancia blanca y los astrocitos del cerebelo.

FIGURA 32 Aislamiento de una variante de IgG de 94.03. Una variante de desplazamiento natural de 94.03 se aisló del cultivo clasificando según las células que expresan IgG en su superficie. Se muestran los perfiles de antes y después de la clasificación de los cultivos celulares. Las células IgG se aislaron de la población posclasificación mediante clonación por dilución límite. El anticuerpo producido se identificó como IgG1 usando anticuerpos específicos de isotipo de IgG.

La FIGURA 33 Demostración de que las células productoras de IgG1 eran, de hecho, una variante de 94.03. El ARN se aisló de las células que expresan IgG1. El ADNc se generó usando RT-PCR con cebadores específicos de la región variable de 94.03 y la región constante del isotipo 1. El ADN resultante se secuenció para demostrar la unión de corte y empalme precisa prevista para una variante de desplazamiento espontáneo.

La FIGURA 34 presenta la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 de ratón.

La FIGURA 35 presenta la secuencia de la región variable de la cadena ligera kappa 1 de la secuencia de la región variable de 09 de ratón del anticuerpo 09 de ratón.

La FIGURA 36 presenta la secuencia de la región variable de la cadena ligera kappa 2 del anticuerpo 09 de ratón.

La FIGURA 37 de referencia presenta las secuencias de la región variable de la cadena pesada de AKJR4.

La FIGURA 38 de referencia presenta las secuencias de la región variable de la cadena ligera kappa de AKJR4.

La FIGURA 39 de referencia presenta las secuencias de la región variable de la cadena pesada de CB2iE12.

La FIGURA 40 de referencia presenta las secuencias de la región variable de la cadena ligera kappa de CB2iE12.

La FIGURA 41 de referencia presenta las secuencias de la región variable de la cadena pesada de CB2iE7.

La FIGURA 42 de referencia presenta las secuencias de la región variable de la cadena ligera kappa de CB2iE7.

La FIGURA 43 de referencia presenta las secuencias de la región variable de la cadena ligera kappa de MSI 19E5.

La FIGURA 44 presenta la cadena ligera kappa 2 del anticuerpo 04 de ratón.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a la estimulación, regeneración, protección y/o remielinización de los axones del sistema nervioso central en un mamífero. Específicamente, la presente invención se refiere a autoanticuerpos para usar en procedimientos de estimulación de la remielinización de los axones sistema nervioso central (SNC) usando un anticuerpo, particularmente un autoanticuerpo humano, incluidos anticuerpos del subtipo IgM y monómeros de la misma o un fragmento activos de los mismos, que se caracterizan por la capacidad para unirse a estructuras y células dentro del sistema nervioso central o un análogo sintético o natural de los mismos. En una realización concreta, los anticuerpos proporcionados en el presente documento y usados en los procedimientos de la presente invención se caracterizan por su capacidad para unirse a oligodendrocitos y, además, en particular, son capaces de estimular la proliferación de células gliales.

De acuerdo con la presente invención se pueden emplear técnicas convencionales de biología molécula, microbiología y de ADN recombinante, dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volúmenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Por tanto, si aparecen en el presente documento, los términos siguientes tendrán las definiciones que se indican a continuación.

Con la expresión “agente(s) neuromodulador(es)”, como se usan en el presente documento de forma singular a lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, se quiere hacer referencia a una amplia clase de materiales que funcionan estimulando el sobrecrecimeinto de neuritas, la regeneración y la remielinización con beneficios y efectos concretos sobre el SNC y, por tanto, incluye los anticuerpos de la presente invención, incluyendo los anticuerpos del subtipo de IgM y monómeros de los mismos, y, particularmente, los autoanticuerpos humanos proporcionados en el presente documento, incluidos en las Tablas 2 y 3 en el presente documento, y, más particularmente, en el presente documento se refiere a sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, y CB2bG8, análogos peptídicos, haptenos, monómeros, fragmentos activos de los mismos, agonistas, miméticos y similares, incluyendo dichos materiales ya que pueden tener una similitud al menos parcial con las secuencias peptídicas indicadas en las FIGURAS 17-20, 27 y 28. Agente(s) neuromodulador(es) también incluye y abarca combinaciones o mezclas de más de uno de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, incluidos monómeros o fragmentos activos de los mismos.

Asimismo, las expresiones “agente neuromodulador”, “autoanticuerpo”, “péptido de anticuerpo”, “péptido”, “hapteno” y cualquier variante no indicada específicamente, se pueden usar en el presente documento de forma intercambiable, en la medida en que pueden todos ellos hacer referencia e incluir material proteináceo, incluidas proteínas sencillas o múltiples, y se extiende a las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento y presentadas en las FIGURAS 17-20, 27, 28 y 37-43 (SEC ID Nº 1, 49, 5, 50, 9, 11, 13, 15, 23, 25, 27, 29, 31, 33 y 35), y el perfil de actividades indicadas en el presente documento y en las reivindicaciones. De acuerdo con eso, asimismo se contemplan las proteínas (particularmente anticuerpos, anticuerpos sintéticos, monómeros de los mismos y fragmentos activos de los mismos) que muestran una actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, como las modificaciones obtenidas mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como las obtenidas mediante mutaciones en huéspedes que producen el complejo o sus subunidades citadas. Asimismo, las expresiones "agente neuromodulador”, “autoanticuerpo”, “péptido de anticuerpo”, “péptido”, “hapteno” están destinadas, cuando se adecuado, a incluir dentro de su alcance las proteínas específicamente citadas en el presente documento, así como todos los análogos sustancialmente homólogos y variaciones alélicas.

Los residuos de aminoácidos descritos en el presente documento se prefiere que estén en la forma isomérica “L”. No obstante, los residuos en la forma isomérica “D” pueden estar sustituidos por cualquier residuo de L-aminoácido, siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada de unión a inmunoglobulina. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente

en el extremo carboxi de un polipéptido. Manteniendo la nomenclatura estándar de polipéptidos, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia:

TABLA DE CORRESPONDENCIA

S�?MBOLO

AMINO�?CIDO

1 letra

3 letras

Y

Tyr tirosina

G

Gly glicina

F

Phe fenilalanina

M

Met metionina

A

Ala alanina

S

Ser serina

I

Ile isoleucina

L

Leu leucina

T

Thr treonina

V

Val valina

P

Pro Prolina

K

Lys lisina

H

His histidina

Q

Gln glutamina

E

Gln ácido glutámico

W

Trp triptófano

R

Arg arginina

D

Asp ácido aspártico

N

Asn aspargina

C

Cys cisteína

Cabe citar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan en la presente documento por formulas cuya orientación a la izquierda o a la derecha está en la dirección convencional del extremo amino al

5 extremo carboxi. Además, cabe destacar que una barra inclinada al principio o final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico a una secuencia posterior de uno o más residuos de aminoácidos. La tabla anterior se presenta para correlacionar las notaciones de tres letras y de una letra que pueden aparecer alternativamente en el presente documento.

Un “replicón” es cualquier elemento genético (p. ej., plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad 10 autónoma de replicación de ADN un vivo, es decir capaz de replicarse bajo su propio control.

Un “vector” es un replicón, como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de ADN de forma que se realiza la replicación del segmento unido.

Una “molécula de ADN” se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleotidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma monocatenaria o una hélice bicatenaria. Este término sólo se refiere a la estructura primaria y 15 secundaria de la molécula, y no se limita a una forma terciaria concreta. Por tanto, este término incluye ADN bicatenario que se encuentra, entre otros, en moléculas de ADN lineal (p. ej., fragmentos de restricción), virus,

plásmidos y cromosomas. Al tratar la estructura de las moléculas de ADN bicatenario concreto, las secuencias se pueden describir en el presente documento de acuerdo con la convención normal de proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5’ a 3’ a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra tiene una secuencia homóloga al ARNm).

Un “origen de replicación” se refiere a las secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.

Una “secuencia codificadora” de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vivo cuando se introduce bajo el control de las secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de finalización de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificadora puede incluir, entre otras, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (p. ej., de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintéticas.

Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción normalmente se localizarán en 3’ de la secuencia de codificación.

Las secuencias de control de la transcripción y de la traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificadora en una célula huésped.

Una “secuencia promotora” es una región reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora (dirección 3’) posterior. Para los fines de definir la presente invención, la secuencia promotora se une a su extremo 3’ mediante el sitio de inicio de la transcripción y se extiende hacia arriba (en dirección 5’) para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del normal. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido mediante mapeo con la nucleasa S1), así como los dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, aunque no siempre, contienen cajas “TATA” y cajas “CAT”. Los promotores eucariotas contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso de -10 y -35.

Una “secuencia de control de la expresión” es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y la traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora está “bajo el control” de las secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que a su vez se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificadora.

Se puede incluir una “secuencia señal” antes de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica un péptido señal, N-terminal del polipéptido, que comunica a la célula huésped a dirigir el polipéptido a la superficie de la célula o a los orgánulos en el interior de la célula o a secretar el polipéptido en el medio y este péptido señal normalmente es escindido de la célula huésped antes de que la proteína salga de la célula.

Las secuencias señal se pueden encontrar asociadas con una diversidad de proteínas nativas de procariotas y eucariotas.

El término “oligonucleótido”, como se usa en el presente documento en referencia a las sondas de la presente invención, se define como una molécula compuesta por dos o más ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Si tamaño exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función última y uso del oligonucleótido.

El término “cebador”, como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido, natural como en un digesto de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se introduce en las condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión del cebador, que es complementario a una hebra de ácido nucleico, se induce, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser monocatenario o bicatenario y debe ser lo bastante largo como para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluidos la temperatura, la fuente del cebador y el uso del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones diagnósticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico normalmente contiene 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Los cebadores del presente documento se seleccionan de modo que sean “sustancialmente” complementarios a diferentes hebras de una secuencia de ADN diana concreta. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus respectivas hebras.

Por tanto, la secuencia del cebador no tiene que reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede estar unido al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria a la hebra. Como alternativa, las bases no complementarias o secuencias más largas pueden estar entrelazadas en el cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la hebra para hibridar con ella y, de este modo, formar el molde para la síntesis del producto de extensión.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “endonucleasas de restricción” y “enzimas de restricción” se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN bicatenario en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica.

Una célula se ha “transformado” con ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN se ha introducido en el interior de la célula. El ADN transformante puede o no integrarse (unido de forma covalente) en el ADN cromosómico que compone el genoma de la célula. En procariotas, células de levadura o de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante se puede mantener en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de forma estable es una en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que es heredada por las células hija a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones compuestos por una población de células hija que contienen el ADN transformante. Un “clon” es una población de células derivadas de una única célula o ancestro común mediante mitosis. Una “línea celular” es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro para muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son “sustancialmente homólogas” cuando al menos aproximadamente el 75 % (preferentemente al menos aproximadamente el 80% y más preferentemente al menos aproximadamente 90 o 95 %) de los nucleótidos coinciden con una longitud definida de las secuencias de ADN.

Las secuencias que son sustancialmente homólogas se pueden identificar comparando las secuencias usando un software estándar disponible en los bancos de datos de secuencia o en un experimento de hibridación de tipo southern en, por ejemplo, condiciones estrictas tal y como se define para ese sistema concreto. La definición de las condiciones de hibridación adecuadas está dentro de la experiencia en la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis y col., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. En concreto, las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de la presente invención son sustancialmente homólogas a una secuencia génica de línea germinal correspondiente, que tiene una homología de al menos aproximadamente un 90 % con una secuencia génica de línea germinal correspondiente.

Debe apreciarse que dentro del alcance de la presente invención también se encuentran las secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la invención o un análogo peptídico, hapteno, o fragmento activo del mismo, que codifican un péptido que define en al menos una porción del mismo o tiene la misma secuencia de aminoácidos que se indica en las FIGURAS 17-20, 27 y 28 (SEC ID Nº 1, 49, 5, 50, 9, 11, 13, 15, ), pero que son degeneradas para las mismas SEC ID NOº Por “degenerado con” se quiere decir que se usa un codón diferente de tres letras para especificar un aminoácido concreto. Es bien sabido en la técnica que se pueden usar los codones siguientes de forma intercambiable para codificar cada aminoácido específico:

Fenilalanina (Phe o F)

UUU o UUC

Leucina (Leu o L)

UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG

Isoleucina (Ile o 1)

AUU o AUC o AUA

Metionina (Met o M)

AUG

Valina (Val o V)

GUU o GUC o GUA o GUG

Serina (Ser o S)

UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC

Prolina (Pro o P)

CCU o CCC o CCA o CCG

Treonina (Thr o T)

ACU o ACC o ACA o ACG

Alanina (Ala o A)

GCU o GCG o GCA o GCG

Tirosina (Tyr o Y)

UAU o UAC

Histidina (His o H)

CAU o CAC

Glutamina (Gln o Q)

CAA o CAG

Asparagina (Asn o N) AAU o AAC Lisina (Lys o K) AAA o AAG �?cido aspártico (Asp o D) GAU o GAC �?cido glutámico (Glu o E) GAA o GAG 5 Cisteína (Cys o C) UGU o UGC

Arginina (Arg o R) CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG Glicina (Gly o G) GGU o GGC o GGA o GGG Triptófano (Trp o W) UGG

10 Codón de terminación UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (ópalo)

Debe entenderse que los codones especificados anteriormente son para secuencias de ARN. Los codones correspondientes para ADN tiene T en lugar de U. Se pueden realizar mutaciones en una secuencia o molécula de ADN concreta de modo que dicho codón concreto

15 se cambia a un codón que codifica un aminoácido diferente. En general, dicha mutación se realiza haciendo los menos cambios nucleotídicos posibles. Una mutación de sustitución de este tipo se puede realizar para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de un modo no conservador (es decir, cambiando el codón de un aminoácido perteneciente a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica concretos de un aminoácido perteneciente a otro grupo) o de un modo conservador (es decir, cambiando el codón de un aminoácido

20 perteneciente a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica concretos un aminoácido perteneciente al mismo grupo). En general, dicho cambio conservador conduce a menos cambio en la estructura y la función de la proteína resultante. Un cambio no conservador es más probable que altere la estructura, actividad y función de la proteína resultante. Debe considerarse que la presente invención incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente la actividad o las características de unión de la proteína

25 resultante. A continuación se presenta un ejemplo de varios grupos de aminoácidos: Aminoácidos con grupos R no polares Alanina Valina

30 Leucina Isoleucina Prolina Fenilalanina Triptófano

35 Metionina Aminoácidos con grupos R polares sin carga Glicina Serina Treonina

40 Cisteína Tirosina Asparagina

Glutamina Aminoácidos con grupos R polares cargados (con carga negativa a pH 6,0)

�?cido aspártico

�?cido glutámico Aminoácidos básicos (con carga positiva a pH 6,0)

Lisina

Arginina

Histidina (a pH 6,0)

Otro grupo puede ser los aminoácidos con grupos fenilo:

Fenilalanina

Triptófano

Tirosina Otro grupo puede ser según el peso molecular (es decir, el tamaño de los grupos R):

Glicina 75

Alanina 89

Serina 105

Prolina 115

Valina 117

Treonina 119

Cisteína 121

Leucina 131

Isoleucina 131

Asparagina 132

�?cido aspártico 133

Glutamina 146

Lisina 146

�?cido glutámico 147

Metionina 149

Histidina (a pH 6,0) 155

Fenilalanina 165

Arginina 174

Tirosina 181

Triptófano 204

Sustituciones particularmente preferidas son:

-

Lys por Arg y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga positiva;

-

Glu por Asp y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga negativa;

-

Ser por Thr de modo que se pueda mantener un -OH libre; y

-

Gln por Asn de modo que se pueda mantener un –NH2 libre.

Las sustituciones de aminoácidos también se pueden introducir para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir una Cys con un posible sitio para puentes disulfuro con otra Cys. Se puede introducir una His como un sitio particularmente “catalítico” (es decir, la His puede actuar como ácido o base y es el aminoácido más frecuente en la catálisis bioquímica). Se puede introducir Pro porque su estructura particularmente planar, que induce giros ß en la estructura de la proteína.

Dos secuencias de aminoácidos son “sustancialmente homólogas” cuando al menos aproximadamente el 70% de los residuos de aminoácidos (preferentemente al menos aproximadamente el 80% y más preferentemente al menos aproximadamente 90 o 95%) son idénticas o representan sustituciones conservadoras. En concreto, las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de la presente invención son sustancialmente homólogas a una secuencia de aminoácidos de línea germinal correspondiente, que tiene una homología de al menos aproximadamente un 90%, y preferentemente de al menos aproximadamente 95 %, con una secuencia de aminoácidos de línea germinal correspondiente.

Una región “heteróloga” de la construcción de ADN es un segmento identificable de ADN en una molécula de ADN más grande que no se encuentra asociada con la molécula más grande en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen normalmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia de codificación heteróloga es una construcción en la que la propia secuencia de codificación no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADN c en el que la secuencia de codificación genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen nativo). Las variaciones alélicas o acontecimientos mutacionales naturales no producen una región heteróloga de ADN como se define en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" es una inmunoglobulina, que incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se une a un epítopo específico. Con el término se pretende abarcar anticuerpos policlonales, monoclonales y quiméricos, este último mencionado se describe con mayor detalle en las patentes de EE.UU. nº 4.816.397 y 4.816.567. Dichos anticuerpos podrían incluir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales preparados mediante técnicas genéticas conocidas, así como anticuerpos biespecíficos (quiméricos) y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que las hacen adecuadas para uso diagnóstico adicional junto con su capacidad para modular la actividad , por ejemplo que estimula la remielinización y/o la regeneración de los axones del SNC o que proporciona neuroprotección. Un “sitio de combinación de anticuerpo” es la porción estructural de una molécula de anticuerpo compuesta por regiones variables e hipervariables de las cadenas pesada y ligera que se une específicamente al antígeno. La expresión “molécula de anticuerpo” en sus diversas formas gramaticales, como se usa en el presente documento, contempla molécula de inmunoglobulina intacta y una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina- Ejemplos de moléculas de anticuerpo son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y las porciones de una molécula de inmunoglobulina que contiene el paratope, incluidas las porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab’, F(ab’)2 y F(v).

Las porciones Fab y F(ab’)2 de moléculas de anticuerpo se pueden preparar mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, sobre de moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas mediante procedimientos bien conocidos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.342.566 concedida a Theofilopolous y col.). Las porciones Fab’ de moléculas de anticuerpo también son bien conocidas y se puede producir a partir de porciones F(ab’)2, seguido de la reducción de los puentes disulfuro que unen las dos porciones de cadenas pesadas, como con mercaptoetanol, y seguido de alquilación de la proteína resultante mercaptán con un reactivo tal como yodoacetamida.

La expresión “anticuerpo monoclonal” en sus varias formas gramaticales hace referencia a un anticuerpo que solo tiene una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antígeno concreto. Por tanto, un anticuerpo monoclonal normalmente muestra una afinidad de unión sencilla por cualquier antígeno con el que inmunorreaccione. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un antígeno diferente, por ejemplo un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).

La metodología general para fabricar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. Las líneas celulares productotas de anticuerpos inmortales también se pueden crear mediante técnicas distintas a la fusión, tal como transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico o transfección con el virus de Epstein-Barr. Véase, por ejemplo, M. Schreier y col., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies And Tcell Hybridomas" (1981); Kennettetal., "Monoclonal Antibodies" (1980); véase también las patentes de EE.UU. nº 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 4,493,890.

Paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra péptidos agentes neuromoduladores o péptidos de autoanticuerpos se pueden someter a detección selectiva para varias propiedades, es decir isotipo, epítopo, afinidad etc. De interés concreto son los anticuerpos monoclonales capaces de unirse a estructuras y células en el sistema nervioso central y que exhiben la misma actividad que los agentes neuromoduladores y, en particular, los presentes autoanticuerpos. Dichos anticuerpos se pueden someter fácilmente a detección selectiva y caracterizarse en ensayos, incluidos procedimientos de unión, tinción e inmunohistoquímica presentados e ilustrados en el presente documento. Dichos monoclonales se pueden identificar con facilidad en ensayos de actividad, tal como los modelos del virus de Theilers, EAE e lisolecitina presentados e ilustrados en el presente documento. Los anticuerpos de alta afinidad también son útiles cuando es posible la purificación de inmunoafinidad de los autoanticuerpos nativos o recombinantes.

Preferentemente, el anticuerpo anti-péptido usado en los procedimientos terapéuticos y diagnósticos de la presente invención es un anticuerpo monoclonal (AcMo), más preferentemente un anticuerpo humano o humanizado. Preferentemente, el anticuerpo es también un anticuerpo sintetico. Además, es preferible que las moléculas de anticuerpo anti-péptido usadas estén en forma de las porciones Fab, Fab’, F(ab’)2 or F(v) de las moléculas de anticuerpo enteras.

Como se ha sugerido antes, el procedimiento diagnóstico de la presente invención comprende analizar una muestra

o medio celular por medio de un ensayo que incluye una cantidad eficaz de un antagonista frente a un péptido de anticuerpo/proteína, tal como un anticuerpo anti-péptido, preferentemente un anticuerpo policlonal purificado opr afinidad y, más preferentemente, un AcMo. Además, es preferible que las moléculas de anticuerpo anti-péptido usadas estén en forma de las porciones Fab, Fab’, F(ab’)2 or F(v) de las moléculas de anticuerpo enteras. Como se ha tratado anteriormente, los pacientes capaces de beneficiarse de este procedimiento incluyen los que sufren una afección neurológica, tal como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, una infección vírica u ota desorganización neuropatológica, incluidos los daños resultantes de traumatismos físicos. Procedimientos para aislar los péptidos e inducir anticuerpos anti-péptidos y para determinar y optimizar la capacidad de los anticuerpos anti-péptidos para ayudar en el análisis de las células diana son bien conocidos en la técnica.

Los procedimientos para producir anticuerpos anti-polipeptídicos policlonales son bien conocidos en la técnica. Véase la patente de EE.UU. nº de 4.493.795 a Nestor y col. Un anticuerpo monoclonal, que normalmente contiene las porciones Fab y/o F(ab’)2 de moléculas de anticuerpo útiles, se puede preparar usando la tecnología de hibridomas descrita en Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), que se incorpora en el presente documento por referencia. Brevemente, para formar el hibridoma a partir del cual se produce la composición de anticuerpo monoclonal, se fusiona un mieloma u otra línea celular de autoperpetuación con linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con una porción de unión del péptido de anticuerpo del mismo, o el péptido o fragmento de anticuerpo, o una porción de unión a ADN específico de origen del msimo.

Normalmente los esplenocitos se fusionan con células de mieloma usando polietilenglicol (PEG) 6000. Los híbridos fusionados se seleccionan según su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útil en la práctica de la presente invención se identifican por su capacidad para inmunorreaccionar del mismo modo que los presentes autoanticuerpos y su capacidad para estimular o inhibir la actividad especificada en las células y tejidos diana.

Un anticuerpo monoclonal útil en la práctica de la presente invención se puede producir iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio de nutrientes que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo de la especificidad de antígeno adecuada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un periodo de tiempo suficientes para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo al medio.

El medio que contiene anticuerpo se recoge. Las moléculas de anticuerpo pueden aislarse después mediante técnicas bien conocidas.

Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones endogámicos y similares. Un ejemplo de medio sintético es medio mínimo esencial de Dulbecco (DMEM; Dulbecco y col., Virol. 8:396 (1959) suplementado con 4,5 gm/l de glucosa, glutamina 20 mm y 20 % de suero bovino fetal. Un ejemplo de cepa de ratón endogámico Balb/c.

Los procedimientos para producir anticuerpos antipéptido monoclonales son bien conocidos en la técnica, Véase Niman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983). Normalmente, los péptidos de anticuerpo presentes,

o un análogo o fragmento peptídico, se usan solos o conjugados con un vehículo inmunogénico, como inmunógeno, en el procedimiento descrito anteriormente para producir anticuerpos antipéptido monoclonales. Los hibridomas se someten a detección selectiva de la capacidad de producir un anticuerpo que inmunorreacciona como en análogo de péptido de anticuerpo y, de este modo, reacciona de un modo similar con los anticuerpos de la presente invención.

La presente invención también se refiere a anticuerpos humanos sHIgM22, sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, CB2bG8, monómeros de los mismos, análogos de los mismos, incluidos haptenos, fragmentos activos de los mismos, o autoanticuerpos aislados o sintéticos que tienen las caracterísicas de los mismos para usar en procedimientos de tratar enfermedades desmielinizantes en mamíferos, tales como esclerosis múltiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domésticos, tales como encefalomielitis postinfecciosa.

La presente invención también abarca procedimientos de tratamiento profiláctico usando estos AcMo, monómeros de los mismos, fragmentos activos de los mismos u otros autoanticuerpos aislados o sintéticos que tienen las mismas características, incluidos para inhibir la iniciación o la progresión de enfermedades desmielinizantes.

Los oligodendrocitos (OL), las células formadoras de mielina del sistema nervioso central (SNC), se originan como células neuroectodérmicas de las zonas subventricular y, después, migran y maduran para producir mielina. El desarrollo secuencial de los OL se identifica mediante marcadores específicos de la etapa de diferenciación bien caracterizada. Los precursores bipolares proliferativos y migratorios, designados progenitores de oligodendrocito/astrosito de tipo 3 (O-2A) se identifican mediante anticuerpos monoclonales anti-GD3 y A2B5 [Eisenbarth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (1979), 4913-4917]. La siguiente etapa de desarrollo, caracterizada por células multipolares, proliferativas y posmigratorias es reconocida por el AcMo 04 [Gard y col., Neuron, 5 (1990), 615-625; Sommer y col., Dev. Biol., 83, (1981), 311-327). El desarrollo adicional se define por la expresión en la superficie celular de galatocerebrósido, reconocido por el AcMo 01 [Schachner, J. Neurochem., 39 (1982), 1-8; Sommer et al., supra], y mediante la expresión del 2’,3’-cílcico nucleótido 3’-fosfohidrolasa. La mayoría de las células maduras expresan marcadores de diferenciación terminal, tal como la proteína básica de la mielina y la proteína proteolipídica.

Los AcMo (A2B5, O1, y 04) usados para caracterizar las etapas de desarrollo de los OL se prepararon inmunizando ratoines BALB/c con células de retina de embrión de pollo u homogeneizado del cuerpo calloso bovino [Eisenbarth y col., supra; Sommer y col., supra]. A2B5 no solo reconoce los progenitores O-2ª, sino que también las neuronas y reacciona con el gangliósido de superficie celular GQ1c [Kasai y col., Brain Res. , 277 (1983), 155-158] y otros gangliósidos [Predman y col., Arch. Biochem. Biophys., 233 (1984), 661-666]. 04 reacciona con sulfatada, seminolípido y colesterol [Bansal y col., J. Neurosci. Res., 24 (1989), 548-557], mientras que O1 reacciona con galactocerebrósido, monogalactosil-diglicérido yi psicosina [Bansal y col., supra]. Estos AcMo pertenecen a la subclase de inmunoglobulina (Ig) IgM y reconoce estructuras citoplasmáticas, así como los antígenos de superficie de los OL [Eisenbarth et al., supra; Sommer et al., supra]. El AcMo de ratón HNK-1 (anti-Leu-7), preparado inmunizado ratones BALB/c con la suspensión de la membrana de células linfoblastoides HSB-2 T, se dio a conocer primero como un marcador para células asesinas naturales [Abo et al., J. Immunol., 127 (1981), 1024-1029]. Más tarde, se demostró que HNK-1 compartía determinantes antigénicos con el sistema nervioso [Schuller-Petrovic et al., Nature, 306 (1983), 179-181]. El epítopo del carbohidrato sobre la glicoproteína asociada con la mielina, encontado en las vainas de mielina centrales y periféricas se demostró que era un antígeno principal del tejido nervioso que reaccionó con HNK-1 [McGarry et al., Nature, 306 (1983), 376-378]. No obstante, otras glicoproteínas del tejido nervioso reaccionan con este AcMo, algunas d elas cuales son importantes en la embriogénesis, diferenciación y mielinación [Keilhauer et al., Nature, 316 (1985), 728-730; Kruse et al., Nature, 311 (1984), 153-155; Kruse et al., Nature, 316 (1985), 146-148; McGarry et al., J. Neuroimmunol., 10 (1985), 101-114]. De interés, HNK-1 también reacciona con estructuras citoplasmáticas y pertenece a la subclase de Ig IgM.

Un anticuerpo monoclonal, divulgado y reivindicado en la patente de EE.UU. número 5,591,629, presentada el 7 de enero de 1997, y designado SCH94.03, se encontró que estimula la remielinización del SNC en ratones infectados crónicamente por el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) [Miller et al., J. Neurosci., 14 (1994), 62306238]. SCH94.03 pertenece a la subclase de Ig IgM(x) Ig y reconce un antígeno de superficie desconocida sobre los OL, pero antígenos citoplasmáticos en todas las células (Asakura et al., Molecular Brain Research, in press). La polirreactividad de SCH94.03 mediante ELISA y las secuencias de la línea germinal de la región variable de la Ig no mutada indicaron que SCH94.03 es un autoanticuerpo natural [Miller et al., J. Neurosci., 14 (1994), 6230-6238].

Un estudio cerrado de SCH94.03, y su comparación con AcMo reactivos de OL bien conocidos A2B5, O1, 04, y HNK-1 produjeron la posibildad de que estos eran autoanticuerpos naturales. Un análisis posterior de las secuencias de ADNc de la región variable de la Ig y la polirreactividad de estos AcMo mediante ELISA confirmaron que este es un grupo genérico de autoanticuerpos naturales que tienen utilidades similares.

La reactividad antigénica del anticuerpo monoclonal, el anticuerpo monoclonal IgM SCH 94.03 (también denominado SCH94.32) ySCH 79.08 (ambos preparados de un mamífero inmunizado con homogeneizado de médula espinal de un mamífero normal (es decir, no infectado con ninguna enfermedad desmielinizante)) se han caracterizado y descrito en la patente de EE.UU. mencionado anteriormente número 5,591,629, presentada el 7 de enero de 1997, usando varios ensayos bioquímicos y moleculares, inlcuidos inmunohostoquímica, inmunocitoquímica, transferencia Western, ensayos de inmunosocrción ligado a enzima en fase sólida (ELISA) y secuenciación de la región variable de la Ig.

Autoanticuerpos naturales o fisiológicos normalmente están presentes en el suero y se caracterizan porque son reactivos o capaces de unirse a autoestructuras, antígenos o células. A menudo sn polirreactivos, con frecuencia son del subtipo IgM, y están codificados por genes de línea germinal sin mutar o son sustancialmente homólogos a los genes de línea germinal con pocas diferencias de secuencia. Mediante secuenciación de los ADNc de inmunoglobulina (Ig) de los anticuerpos monoclonales reactivos con los oligodendrocitos O1, 04, A2B5, and HNK-1 IgM x y comparándolos con secuencias de línea germinal publicadas, se determinó que estos eran autoanticuerpos naturales. La VH de 01 fue idéntica al tránscrito A1 y A4 del segmento VH, la VH de 04 tenían tres y la VH de de HNK1 tenía seis diferencias de nucleótidos de VH de 01 de la línea germinal en la región de codificación de VH. El segmento D de 01 derivó de la familia de genes Sp2 de línea germinal, JH4, mientras que JH de O1 estaba codificada por la línea germinal JH1 con un cambio de nucleótido silente. Las cadenas ligeras de O1 y O4 eran idénticas al MOPC21 del mieloma a excepción de un cambio de nucleótido silente. HNK-1 Vx fue idéntica a la línea germinal Vx41 a excepción de dos cambios de nucleótidos silentes. O1Jx, O4Jx y HNK Jx estaban codificados por la línea germinal Jx2 sinmutar. En contraste la VH de A2B5 mostró siete diferencias de nucleótidos de la línea germinal V1, mientras qe no se identificó ninguna secuencia de línea germinal que codifica A2B5 Vx. O1 y O4, pero no A2B5, eran polirreactivos contra múltiples antígenos mediante ELISA directo. Por tanto, las Ig O1, O4, y HNK-1 están codificadas por los genes de la línea germinal y tienen el genotipo y el fenotipo de los autoanticuerpos naturales.

La identificación y caracterización de una familia entera de autoanticuerpos, denominados autoanticuerpos “naturales” o “fisiolóicos”, ha influido sobre la visión tradicional de la autoinmunidad y la autorreactividad. Los autoanticuerpos que se han estudiado ampliamente son, normalmente, IgM, aunque se han identificado otros isotipos, son reactivos frente a un amplio abanico de autoestructuras o antígenos, incluidas proteínas citoesqueléticas, proteínas de superficie, ácidos nucleicos, fosfolípidos, antígenos bacterianos tales como lipopolisacáridos, y varios haptenos químicos (revisado por Avrameas y Ternynck, Mol. Immunol., 30:1133-1142 (1993)). Los autoanticuerpos naturales comparen una extensa reactividad cruzada idiotípica o “conectividad”, que incluye la expresión de idiotipos similares, algunos de los cuales son expresados por autoanticuerpos patogénicos, así como la reactividad frente a los idiotipos comunes expresados sobre otros anticuerpos. El análisis molecular ha demostrado que los autoanticuerpos naturales normalmente están codificados por los genes de inmunoglobulina (Ig) de la línea germinal sin mutar, o sustancialmente homólogos a los mismos, con pocas mutaciones somáticas, y, por tanto, representan una fracción sustancial del repertorio de Ig, especialmente en animales neonatos que no han estado expuestos de forma extensa a antígenos exógenos.

La función de los autoanticuerpos naturales sigue siendo un enigma. Se han propuesto varias hipótesis en base a sus características bioquímicas y moleculares. Estas incluyen: (1) eliminación del tejido senescente o dañado, (2) proporcionar una primera línea de defensa inmunológica en el periodo entre la exposició al patógenoy una respuesta inmunitaria específica del Ag, (3) enmascarar los autoantígenos de una respuesta autoinmunitaria potencialmente patogénica, (4) inmunomodulación, incluida la conformación del repertorio inmunológico neonato mediante una red idiotípica y (5) particoipación en la selecció positiva de células B en la médula ósea, similar al procedimiento propuesto para las células T en el timo.

Que determinados autoanticuerpos, ampliamente caracterizados como anticuerpos que reconocen antígenos propios y que incluyen autoanticuerpos naturales, son capaces de estimular la remielinización en el sistema nervioso central sugiere una importante función fisiológica de los autoanticuerpos. Los autoanticuerpos que se producen durante la fisiología normal o en respuesta a daños tisulares y la posterior liberación de antígenos previamente secuestrados podrían participar activamente en la estimulación de la reparación del tejido dañado. En línea con las funciones propuestas anteriormente de los autoanticuerpos, esta participación activa podría ser para facilitar la eliminación de tejido dañado, enmascarar los autoantígenos de modo que se evita una respuesta autoinmunitaria patogénica enérgica, modular la respuesta inmunitaria que realmente diera lugar a la destrucción de tejido, de modo que se permite que se produzca la reparación del tejido endógeno, o estimular directamente las células implicadas en el proceso de reparación.

Los resultados y Ejempos que se proporcionan en el presente documento demuestran el aislamiento de los autoanticuerpos humanos, generados y seleccionados por su capacidad para unirse a los autoantígenos, particularmente capaces de unirse a estructuras y células en el sistema nervioso central. La capacidad de estos anticuerpos para estimular la remielinización del SNC también se demuestra. Los ratones infectados crónicamente con TMEV y tratados con AcMo IgM de hibridomas humanos, como ejemplos concretos sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, CB2bG8, tenían una reparación del SNC significativamente mayor que los animales control, medido mediante una evauación morfológica cuantitativa detallada de la remielinización del SNC.

Tratamiento de enfermedades desmielinizantes

Los resultados de los experimentos descritos en la presente memoria tienen aplicaciones prácticas en la esclerosis múltiple (EM), ELA y otros trastornos desmielinizantes del sistema nervioso central relacionados. Se encuentran raros ejemplos de remielinización del SNC de tipo espontáneo (“placas sombreadas”) en EM, y se encuentra remielinización de tipo ocasional en el sistema nervioso periférico (SNP) en placas de médula espinal desmielinizadas cerca de la zona de entrada de raíz. Los oligodendrocitos son infrecuentes en el centro de las placas crónicas en EM, pero parecen proliferar en la periferia de las placas, donde se asocian a remielinización abortiva. El proceso de remielinización puede correlacionarse con la remisión espontánea y las mejoras observadas clínicamente en la EM. Estas observaciones clínicas indican que es posible la formación de mielina nueva en EM. La remielinización que se ha estimulado en ratones con desmielinización inducida por TEMV utilizando un mAb puede ser prometedora para aplicación terapéutica en esclerosis múltiple.

Es de importancia clínica la pregunta de si la regeneración morfológica de vainas de mielina finas contribuye a la recuperación funcional. Las simulaciones informáticas indican que la formación de mielina nueva incluso mediante vainas inapropiadamente finas mejora la conducción de impulsos. Puesto que la membrana del axón de fibras mielinizadas normalmente está altamente diferenciada, es necesario que estén presentes canales de sodio con alta densidad en el nodo de Ranvier para propagar la conducción saltatoria.

Las evidencias experimentales sugieren que los nodos recién formados desarrollan la alta densidad de canal de sodio necesaria como se demuestra por la unión de saxitoxina. Los datos hasta la fecha sugieren que la remielinización incluso mediante mielina inapropiadamente fina mejora la conducción en un axón previamente desmielinizado. Por lo tanto, cualquier estrategia para promover este fenómeno morfológico tiene el potencial de producir una recuperación funcional.

El aislamiento y análisis de los autoanticuerpos humanos como se indica en el presente documento proporciona anticuerpos humanos particularmente adecuados y deseables para usar en seres humanos. Es importante el hecho de que el uso de anticuerpos humanos evita el potencial de una respuesta inmunitaria humana contra el anticuerpo terapéutico. Se ha demostrado que los anticuerpos terapéuticos derivados de animales no humanos generan una respuesta inmunitaria que puede ser significativa y perjudicial para el individuo. La IgM policlonal humana y la IgG policlonal humana se han analizado en dos modelos de desmielinización de médula espinal in vivo, un modelo de infección viral crónica y un modelo de toxicidad aguda. En ambos modelos, los animales tratados con IgM policlonal humana tenían una densidad significativamente mayor de axones recién mielinizados que los animales tratados con IgG policlonal humana. También se ha identificado un panel de anticuerpos IgM monoclonales humanos en base a su reactividad con antígenos de superficie específicos del sistema nervioso central. Estos anticuerpos humanos estimulan significativamente más remielinización del sistema nervioso central que la IgG policlonal humana cuando se administra a mamíferos con una enfermedad desmielinizante. Los anticuerpos monoclonales humanos son antogénicamente polirreactivos y reconocen determinantes sobre la superficie de los oligodendrocitos y poblaciones específicas de neuronas. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo humano que estimula la remielinización se ha secuenciado parcialmente. Este anticuerpo puede inducir entradas de calcio en los oligodendrocitos en cultivo, lo que sugiere la unión directa y señalización mediante las células glia. Estos anticuerpos humanos se unen a la sustancia blanca humana y pueden ser eficaces en la estimulación de la remielinización en seres humanos. Los beneficios de un anticuerpo monoclonal para usar como agente terapéutico son 1) el anticuerpo puede crecer libre de posibles infecciones en el huésped y 2) el anticuerpo se puede alterar genéticamente vitro para cambiar su eficacia.

Por tanto, como resultado de los experimentos descritos en la presente memoria, los autoanticuerpos de la presente invención pueden usarse en procedimientos para tratar mamíferos, incluyendo seres humanos y animales domésticos, aquejados por trastornos desmielinizantes, y para estimular la remielinización de axones del SNC, así como para ofrecer neuroprotección. Como se describe en el presente documento, puede administrarse una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento peptídico, hapteno o equivalente mediante vías de administración convencionales y, en particular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). Como se describe en el presente documento, se contemplan composiciones terapéuticas y vacunas, y se pueden preparar y administrar. Una cantidad eficaz de anticuerpo puede variar dependiendo del tamaño del mamífero que se esté tratando, de la gravedad de la enfermedad, de la vía de administración, y del curso de tratamiento. Por ejemplo, cada dosis de AcMo administrada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg, con el intervalo preferido de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg. Es importante observar que una dosis del orden de 10 μg (0,5 mg/kg) era eficaz para promover la remielinización de axones del SNC en ratones. La dosis de AcMo dependerá también de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis i.v. administrada a ratones era de 0,5 mg/kg, y la dosis i.p. era de 5,0 mg/kg. El curso de tratamiento incluye la frecuencia de administración del AcMo (por ejemplo diariamente, semanalmente, o bisemanalmente) y la duración del tratamiento (por ejemplo de cuatro semanas a cuatro meses). Por tanto, por ejemplo, puede administrarse una cantidad mayor de AcMo diariamente durante cuatro a cinco semanas, en contraposición con una cantidad menor de AcMo administrada durante cuatro meses.

La eficacia de la cantidad de anticuerpo monoclonal que se está administrando puede evaluarse utilizando cualquier serie de criterios clínicos, por ejemplo como se describe en el presente documento, incluyendo la apariencia global del mamífero, la actividad del mamífero y la extensión de la parálisis del mamífero. La eficacia de la cantidad de anticuerpo monoclonal necesaria para inducir la remielinización en seres humanos puede evaluarse también en un ensayo controlado de doble ciego. Pueden tratarse pacientes con déficit neurológicos fijos por enfermedad desmielinizante con anticuerpo monoclonal o controles. La mejora de la fuerza muscular isométrica detectada mediante ensayos musculares biomecánicos cuantitativos podría utilizarse como criterio de valoración terapéutico primario.

Los procedimientos ex vivo de estimular remielinización en axones del SNC están también entran dentro la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede utilizarse in vitro para estimular la proliferación y/o diferenciación de células gliales, tales como oligodendrocitos. Estas células gliales exógenas pueden introducirse después en el SNC de mamíferos utilizando técnicas conocidas. La remielinización de axones del SNC aumentaría al aumentar el número de células gliales endógenas presentes (las células gliales tales como oligodendrocitos desempeñan un papel crítico en la producción de mielina).

Los procedimientos in vitro de producción de células gliales o de estimulación de la proliferación de células gliales de cultivo mixto (por ejemplo célula de nervio óptico de rata o cultivos de célula cerebral de rata) están también dentro de la presente invención. Por ejemplo, se cultivan células obtenidas de nervio óptico de rata o cerebro de rata que contienen células gliales en forma de un cultivo mixto en condiciones suficientes para promover el crecimiento de las células. Se añade después una cantidad eficaz de mAb capaz de promover la remielinización de axones del SNC, tal como as sHIgM22 (LIM 22), sHIgM46, ebvHIgM MSI19D10, y CB2bG8, al cultivo mixto de células y se mantiene en condiciones suficientes para el crecimiento y la proliferación de células. Además, se puede añadir una cantidad eficaz de AcMo, tales como AKJR4, CB2iE12, CB2iE7, o MSI19E5. En concreto, las mezclas o combinación de más de uno de los anticuerpos proporcionados en el presente documento se contemplan y proporcionan para usar en los procedimientos. El mAb estimula la proliferación de células gliales cultivadas en presencia del AcMo aumenta, respecto a la proliferación de células gliales crecidas en ausencia del mAb.

Como se ha indicado, los anticuerpos monoclonales humanos para usar en los procedimientos de la presente invención pueden administrarse, y preferentemente se hace así, como medicamentos, es decir composiciones farmacéuticas. Una cantidad eficaz de anticuerpo monoclonal puede combinarse, o diluirse, con un vehículo apropiado farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón fisiológico, o solución salina. En particular, combinaciones o mezclas de más de uno de los anticuerpos monoclonales en el presente documento pueden combinarse diluirse, con un vehículo apropiado farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón fisiológico, o solución salina. En el caso en el que se vaya a preparar una vacuna, el anticuerpo monoclonal o sustancia activa equivalente de la invención se puede preparar con un vehículo o adyuvante apropiado farmacéuticamente aceptable y el protocolo para la administración puede proceder de acuerdo con procedimientos estándar para inmunización conocidos para el experto en la práctica.

Las composiciones farmacéuticas usadas en los procedimientos de la presente invención para administrar a animales y seres humanos comprenden los anticuerpos monoclonales en combinación con un vehículo o excipiente farmacéutico. En una realización preferida, la composición farmacéutica puede contener más de uno, preferentemente dos, autoanticuerpos monoclonales de la presente invención. Dichas composiciones son ventajosas en cuanto a que la presencia de más de un autoanticuerpo monoclonal potenciará la actividad de otros en la misma composición terapéutica o procedimiento. El medicamento puede estar en forma de comprimidos (incluidas pastillas y gránulos), grageas, cápsulas, píldoras, ampollas o supositorios que comprenden el compuesto de la invención.

De forma ventajosa, las composiciones se formulan en unidades de dosificación, estando cada unidad adaptada para suministrar una dosis fija de ingredientes activos. Comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, ampollas y supositorios son ejemplos de formas de dosificación preferidas de acuerdo con la invención. Sólo es necesario que el ingrediente activo constituta una cantidad eficaz, es decir de modo que una dosis eficaz adecuada será consistente con la forma de dosificación empleada en una o múltiples dosis. Las dosis individuales exactas, así como las dosis diarias, se determinarán de acuerdo con los principios médicos estándar bajo la dirección de un médico o veterinario.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden administrar como suspensiones, soluciones y emulsiones del compuesto activo en diluyentes acuosos o no acuosos, jarabes, granulados o polvos.

Los diluyentes que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas (p. ej., granulados) que contienen el compuesto activo adaptado para formar comprimidos, grageas, cápsulas y píldoras incluyen los siguientes: (a) cargas y expansores, por ejemplo almidón, azúcares, manitol y ácido silícico; (b) agentes de unión,, por ejemplo carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; (c) agentes hidratantes, por ejemplo glicerol; (d) agentes disgregantes, por ejemplo agar agar, carbonato cálcico y bicarbonato sódico; (e) agentes para retrasar la disolución, por ejemplo parafina; (f) aceleradores de la resorción, por ejemplo compuestos de amonio cuaternario; (g) agentes de superfciei activa, por ejemplo alcohol cetílico, monoestearato de glicerol; (g) vehículos de adosrción, por ejemplo caolín y bentonita; (i) lubriicantes, por ejemplo talco, estearato cálcico y de magnesio y glicoles de polietileno sólido.

Los comprimidos, grageas, cápsulas y píldoras que comprenden el compuesto activo pueden tener los recubrimientos, cubiertas y matrices protectoras habituales, que pueden contener opacificantes. Pueden estar constituidos de modo que liberen el principio activo solo o, preferentemente, en una parte concreta del tracto intestinal, posiblemente en un periodo de tiempo. Los brimientos, cubiertas y matrices protectoras pueden estar hechos de, por ejemplo, sustancias poliméricas o ceras.

Los diluyentes que se van a usar en las composiciones farmacéuticas adaptadas para convertirse en supositorios pueden, por ejemplo, ser los diluyentes hidrosolubles habituales, tales como polietilenglicoles y grasas (p. ej., aceite de cacao y ésteres altos, [p. ej., alcohol C14 con ácido graso C16] o mezclas de estos diluyentes.

Las composiciones farmacéuticas que son soluciones y emulsiones pueden contener, por ejemplo, los diluyentes habituales (con, por supuesto, la exclusión mencionada anteriormente de disolventes que tienen un peso molecular inferior a 200, a excepción de la presencia de un agente de superficie activa), tales como disolventes, agentes de disolución y emulsionantes. Ejemplos específicos no limitantes de dichos diluyentes son agua, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3butilenglicol, dimetilformamida, aceites (por ejemplo, aceite de nuez molida, glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácido grasos de sorbitol o mezclas de los mismos.

Para dministración parenteral, las soluciones y suspensiones estériles, por ejemplo agua o aceite de cacahuete, contenidas en ampollas y, en caso adecuado, son isotónicas con la sangre.

Las composiciones farmacéuticas que son suspensiones pueden contener los diluyentes habituales, tales como diluyentes líquidos, por ejemplo agua, agua, alcohol etílico, propilenglicol, agentes de superficie activa (p. ej., alcoholes de isoestearilo etoxilado, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y goma de tragacanto, y mezclas de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas pueden también contener agentes colorantes y conservantes, así como perfumes y adiciones de aromas (p. ej., aroma de aceite de menta y de aceite de eucaliptos) y agentes edulcorantes (p. ej., sacarina y aspartamo).

Las composiciones farmacéuticas, generalmente, contendrán de 0,5 a 90 % del ingrediente activo en peso de la composición total.

Además de los anticuerpos monoclonales, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos también pueden contener otros compuestos farmacéuticamente activos, por ejemplo esteroides, agentes antiinflamatorios o similares.

Cualquier diluyente en los medicamentos de la presente invención puede ser cualquiera de los mencionados anteriormente en relación con las composiciones farmacéuticas. Dichos medicamentos pueden incluir disolventes de peso molecular inferior a 200 como el único diluyente.

Se ha previsto que los anticuerpos monoclonales se administren por vía peroral, parenteral (por ejemplo, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica o intravenosa), rectal o localmente, preferentemente oral o parenteral, especialmente perilingual o intravenosa.

La tasa de la dosis administrada será una función de la naturaleza y el peso corporal del sujeto humano o animal que se va a tratar, la reacción individual de este sujeto al tratamiento, tipo de formulación en el que el ingrediente activo se administra, el modo en el que la administración se lleva a cabo y el punto en el progreso de la enfermedad o intervalo en e que se va a administrar. Por tanto, puede, en algunos casos, ser suficiente para usar menos que una tasa de dosificación mínima, mientras que en otros casos se debe superar el límite superior para alcanzar los resultados deseados. Cuando se administran cantidades grandes, puede ser aconsejable dividirlas en varias administraciones individuales durante el curso del día.

Los agentes neuromoduladores de la invención también se pueden preparar para administrar en forma de vacunas que pueden comprender, como ingrediente activo, los autoantiucuerpos citados en el presente documento, análogos peptídicos o haptenos, o, posiblemente, combinaciones de los mismos. Por tanto, la preparación de vacunas puede proceder de acuerdo con procedimientos conocidos y se contemplan vacunas monovalentes, así como polivalentes. Asimismo, se pueden preparar subunidades de vacunas de ADN, en base a las moléculas de ADN de la invención. Todas las vacunas se pueden administrar de acuerdo con prácticas estándar del médico o clínico, y dichos parámetros se consideran dentro del alcance de la presente invención.

Además, en el presente documento también se describe el tratamiento mediante terapia génica, en la que el agente neuromodulador adecuado se introduce en las células diana para tratamiento, causar o incrementar la expresión del agente correspondiente Por tanto, en una realización, el ADN o un gen que codifica el agente neuromodulador, autoanticuerpo, péptido de anticuerpo etc., o una proteína o dominio polipeptídico se introduce in vivo, ex vivo o in vitro usando un vector viral o mediante la introducción directa de ADN. La expresión en tejidos diana se puede efectuar mediante dirección del vector transgénico a células específicas, tal como con un vector viral o un ligando de receptor, o usando un promotor específico de tejido, o ambos.

Los vectores virales que normalmente se usa para los procedimientos dirigidos y de terapia in vivo o ex vivo son vectores basados en ADN y vectores retrovirales. Los procedimientos para construir y usar vectores virales se conocen en la técnica [véase, por ejemplo, Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)].

Los vectores virales de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o defectuosos, tal como, entre otros, virus del herpes simple (HSV), papilomavirus, virus de , Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adenoasociados (AAV) y similares. Se prefieren virus defectuosos, que carecen completamente e o casi completamente, de genes virales. Los virus defectivos no son infecciosos tras su introducción en una célula. El uso de vectores virales defectivos permite la administración a las células en un área localizada específica, sin tener que preocuparse de que el vector pueda infectar a otras células. Por tanto, el tejido adiposo puede ser una diana específca. Ejemplos de vectores concretos incluyen, entre otros, vector del virus del herpes 2 defectivo (HSV1) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], vector del virus del herpes defectivo que carece del ge de la glicoproteína L [publicación de patente RD 371005 A], u otros vectores del virus del herpes defectivo [publicación de patente internacional nº WO 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; shed publicación de patente internacional n º WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994]; un vector adenovirus atenuado, yal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y col. [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); véase también La Salle et al., Science 259:988-990 (1993)]; y un vecor de virus adenoasociado defectivo [Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)].

Preferentemente, para la administración in vivo, se empela un tratamiento inmunosupresor adeciado junto con le vector viral, por ejemplo vector adnovirus, para evitar la inmunodesactivación del vector viral y las células transfeccionadas. Por ejemplo, se pueden administrar citoquinas inmunosupresoras, como la interleuquina 12 (IL12), interferón  (IFN-), o anticuerpo anti-CD4, se pueden administrar para bloquear las respuestas humorales o celulares a los vectores virales [véase, p. ej,., Wilson, Nature Medicine (1995)]. Además, es ventajoso emplear un vector viral que se ha sometido a ingeniería para expresar un número mínimo de antígenos. En otra realización, el ADN o gen se puede introducir en un vector retroviral, por ejemplo como se describe en Anderson et al., Patente de EE.UU. nº 5,399,346; Mann y col., 1983, Cell 33:153; Temin y col., Patente de EE.UU. nº 4,650,764; Temin y col., Patente de EE.UU. nº 4,980,289; Markowitz y col., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin y col., Patente de EE.UU. nº 5,124,263; publicación de patente internacional nº WO 95/07358, publicado el 16 de marzo de 1995, de Dougherty y col.; y Kuo y col., 1993, Blood 82: 845. Los vectores retrovirales se pueden construir para que funcionen como partículas infecciosas o sufran un único ciclo de transfección.

En el primer caso, el virus se modifica para que conserve todos sus genes, a excepción de los responsables de las propiedades de transformación oncogénica y que exprese el gen heterólogo. Los vectores virales no infecciosos se preparan para destruir la señal de empaquetamiento viral, pero conservan los genes estructurales requeridos para empaquetar el virus introducido sometido a ingeniería para que contengan el gen heterólogo y las señales de empaquetamiento. Por tanto, las partículas virales que se producen no son capaces de producir virus adicionales.

La liberación génica dirigida se describe en la publicación de patente internacional WO 95/28494 publicada en octubre de 1995.

Como alternativa, el vector se puede introducir in vivo mediante lipofección. Durante la última década se ha producir un uso creciente de liposomas para encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Los lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y peligros encontados con la transfección mediada por liposomas se pueden usar para preparar liposomas para la transfección in vivo o un gen que codifica un marcador Felgner, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); véase Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al., Science 259:1745-1748 (1993)]. El uso de lípidos catiónicos puede estimular la encapsulación de ácidos nucleicos con carga negativa y también promueve la fusión con membranas celulares cargadas negativamente [Felgner and Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. El uso de lipofección para introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. Dirigir los liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Está claro que dirigir la transfección a tipos celulares concretos sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como páncreas, hígado, riñón y cerebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el fin de dirigir el tratamiento [véase Mackey, et. al., supra]. Los péptidos dirigidos, por ejemplo hormonas o neurotransmisores, y proteínas, como anticuerpos o moléculas no peptídicas, podrían acoplarse a los liposomas químicamente.

También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudo para terapia génica se pueden introducir en las células huésped deseadas mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación en fosfato cálcico, uso de una pistola génica o uso de un transportador de vector de ADN [veáse, p. ej., Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., solicitud de patente canadiense Nº 2,012,311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]. La liberación de ADN mediada por receptores también se pueden usar [Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)].

En una realización preferida de la presente invención, un vector de terapia génica como se ha descrito anteriormente emplea una secuencia de control de la transcripción que comprende la secuencia consenso de ADN reconocida por, por ejemplo, un autoanticuerpo de la invención, es decir, un sitio de unión a anticuerpo, asociado operablemente con un gen heterólogo terapéutico insertado en el vector. Es decir, un vector de expresión específico de la invención se puede usar en terapia génica.

La presente invención se entenderá mejor a partir de la consideración de los ejemplos no limitantes siguientes, que describe la preparación de materiales, compuestos y composiciones y el desarrollo y práctica de procedimientos ilustrativos de la presente invención, Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar muchas modificaciones, tanto de materiales como de procedimientos, sin desviarse del fin y la intención de la presente divulgación. Los ejemplos siguientes se presentan con el fin de ilustrar más completamente las realizaciones preferidas de la invención y también sirven para finalizar la tarea de los solicitantes para presentar el mejor modo conocido para la práctca de la invención y, de ningún modo, se interpretará como limitante del amplio alcance de la presente invención.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes presentan la preparación y análisis de anticuerpos monoclonales y policlonales humanos.

En particular, los anticuerpos IgM policlonale shumanos se prepararon y analizaron, en los que su capacidad para unirse con afinidad alta a estructuras y células dentro del SNC, por ejemplo, e incluye oligodendrocitos, con una especificidada alta por tejido neural, y se demostró la capacidad concocmitante par apotenciar la remielinización. Como se presenta en el presente documento a continuación, la remielinización se verificó en un modelo de desmielinización inducida por el virus de Thelier e inducida por lisolecitina.

Introducción

La potenciación de la remielinización es un importante objetivo terapéutico en los trastoirnos desmielinizantes inflamatorios del SNC, tal como esclerosis múltiple (EM). La identificación de lesiones del SNC extensamente remielinizadas en alginos pacientes que mueren de EM aguda y en los datos recientes de los solicitantes de biopsias cerebrales sugiere que puede ser posible la reparación completa en las primeras etapas de la enfermedad (Prineas and Connell 1979; Prineas, et al 1993; Rodriguez and Scheithauer 1994). No obstante, a medida que la enfermedad progresa, la remielinización se limita y se produce principalmente en la periferia de la lesión. Se han propuesto una serie de razones para que no se consiga alcanzar la remielinización compelta en las lesiones de EM (Ludwin 1981). Dos importantes consideraciones incluyen la depleción de células capaces de remielinizar y la depleción de factores, que sostienen su crecimiento y diferenciación. Por tanto, la intervención precoz para estimular las células de reparación o para eliminar los factores inhibidores que impiden la reparación de la mielina puede ser clave para una estrategia terapéutica.

Se han analizado una serie de enfoques como estrategias terapéuticas para estimular la remielinización en animales experimentales. El transplante d eoligondendrocitos o células gliales progenitoras en lesiones previamente desmielinziadas puede dar como resultado la remielinización de azones del SNC y, en menor medida, la migración de células precursoras de la mielinización. Se ha demostrado que la remielinización central restablece la conducción. Una estrategia alternativa propuesta por los solicitantes e spotenciar la remielinización endógena (Miller, D.J. et al. 1995b). Este abordaje implica que las células capaces de remielinizar y los factores que sostienen su crecimiento o diferenciación están presentes en las lesiones desmielinizadas, pero que hay mecanismos que inhiben esta respuesta y, por tanto, previenen la remielinización completa.

Una de las primeras descripciones de la potenciación de la remielinización endógena del SNC procedió del modelo de endefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). Usando coadyuvante incompleto de Freund (IFA) como vehículo y los componentes de la mielina como antígeno, la inmunización tras la inducción de la enfermedad estimuló la recuperación estructural y funcional en cobayas con EAE (Trautgott y col., 1982). En base a la estimulación de la remielinización endógena en EAE se realizaron experimentos similares en ratones infectados crónicamente con el virus de la encefalomielitis murina de Thelier (TMEV) (Lang, W. et al., 1984).

La infección por TMEV de celas susceptibles de ratones da lugar a la desmielinización inflamatoria crónica en el contexto de persistencia del virus, que sirve como un excdelente modelo de EM. Los ratones infectados crónicmamente tratados con homogeneizado de médula espinal (SCH) EN ifa mostró una remielinización sustancial del SNC en comparación con los animales control a los que solo se administró adyuvante. A esta observación le siguió experimentos que demostraron que la transferencia pasiva de antisuero o Ig purificada de animales singeneicos no infectados inmunizados con SCH/IFA estimula la remielinización en ratones infectados crónicamente con TMEV. (Rodriguez et al., 1987a; Rodriguez and Lennon 1990; Rodriguez 1991). Estos experimentos eran nuevos y contrastaban con la visión clásica de que la respuesta inmunitaria humoral desempeña un papel patogénico en enfermedades desmielinizantes del SNC. Estos experimentos fueron los primeros en demostrar qu las IG, en particular los autoanticuerpos, podrían desempeñar un papel beneficioso en la estimulación de la remielinización del SNC.

En base a estas observaciones comenzó la generación de AcMo que estimularon la remielinización del SNC en el modelo de desmielinización de Thelier. Se utilizaron bazos de ratones SJL en los que que se había inyectado sch/IFA como fuente de células B para fusión y producción de hibridoma. Previamente se había demostrado que el suero de estos ratones estimulaba la remielinización en ratones crónicamente desmielinizados. Se generaron hibridomas y se seleccionaron mediante ELISA usando SCH como antígen. Tras la fusión inicial, dos de los 95 hibridomas viables secretaron anticuerpos que s eunieron significativamente a SCH. Las células de hibridoma de estos pocillos (denominados SCH79 y SCH94)) se subclonaron y seleccionaron según la inmunorreactividad de SCH. En la serie SCH79, 14 de 49 clones fueron positivos y lara la serie SCH94 17 de 32 fueron positivos. Los anticuerpos monoclonales producidos por estos hibridomas se analizaron después in vivo por su capacidad para estimular la remielinización en el sistema del modelo de Theiler. Ratones SJL/J de seis a ocho meses de edad infectados crónicamente recibioern inyección intraperitoneal o intravenosa de AcMo dos veces a la semana durante 4-5 semanas con una dosis de mAb total de 0,5 mg a 5,0 mg. Dos AcMo SCH94.03 and SCH94.32, mostraron la mayor potenciación de la remilinización del NSC (Miller et al., 1994). La secuencia de las cadenas ligeSCH94.03 probó que estos dos anticuerpos eran idénticos, por lo que más tarde se denominaron SCH94.03 (Miller and Rodriguez 1995c).

El tratamiento con SH94.03 de ratnes SLJ con desmielinización crónica inducida por TMEV en general tiene como resultado 20-30 % de remielinización del area desmielinizada total, en comparación con menos del 5% en animals control tratados con PBS. Esto representa un incremento de 4-6 veces de la remielinización frente a los controles y, a partir de los recuentos axonales, se ha estimado que esto representa una media de 100.000 axones remielinizados en animales tratados con SCH94.03. El análisis por microscopia electrónica de las lesiones completamente remielinizadas revela ningúna azó no remielinizado, lo que sugiere que la remielinización de los axones disponibles en estas lesiones es cercana al 100 %. SCH94.03 pertenece a la subclase de IgM y es altamente polirreactivo contra antígenos proteicos conocidos y desconocidos, incluidas las proteínas del citoesqueleto. De interés es que está codificado or los genes de la límea germinal de Ig no mutada, lo que confirma que SCH94.03 es un anticuerpo natural. De importancia es que SCH94.03 reconoce un antígeno de superficie sin identificar sobre los oligodendrocitos, lo que proporciona una potencial diana para los mecanismos de acción de este anticuerpo.

Central para sta hipótesis son las diferencias en la biología entre SCH94.03 y CH12. En el momento de la identififcación de la secuencia génica de Ig de SCH94.03 se descubrió que había otro anticuerpo IgMk de ratón con una secuencia de la línea germinal idéntica y una combinación génica. Este anticuerpo IgM, designado CH12, es de un linfoma de células B cd5+ y tiene una especificidad aparente fosfatidil clina. SCH94.03 y CH12 tienen una identidad de aminiácidos del 99,1 % en la región VL y tienen secuencias de VH idénticas. Las únicas diferencias entre SCH94.03 and CH12 se encuentra en la región CDR3, debido a las inserciones en la región N. CH12 no marca la superfciei de los oligodendrocitos y no estimula la remielinización en el sistema del modelo de Theiler, por lo que establecer que la única diferencia molecular que justifique el mecanismo de estimulación de la remielinización reside dentro de la región CDR3. Esta conclusión avala la hiótess de que la unión de estos AcMo a antígenos específicos, probablemente dentro de la lesión desmielinizada, es importante para la inducción de la remielinización.

Hasta la fecha se han identificado seis anticuerpos monoclonales diferentes de ratón, que estimulan la remielinización en el modelo de TMEV para enfermedades desmielinizantes (Asakura et al., 1998). Los seis anticuerpos son del isotipo de IgM y conservan las secuencias de la ínea germinal que son reminiscentes de los autoanticuerpos (Miller and Rodriguez 1995; Asakura et al. , 1996). Cada une muestra una especificidad de unión a antígeno amplia, pero, lo más importante, cada uno se une a los antígenos expresados en las superficies de los oligodendrocitos. Los estudios realizados hasta ahora con anticuerpos IgM que no se unieron a los oligodendrocitos no estimularon la remielinización. El miembro prototípico de este grupo, AcMo SCH94.03, se ha demostrado que estimula la remielinización en varios modelos de ratón para enfermedades desmmielinizantes. En ratones con desmielinización crónica inducida por virus (TMEV), el tratamiento con SCH94.03 tiene como resultado un incremento de 4-6 veces de la remielinización. El tratamiento con SCH94.03 también se ha mostrado que incrementa significativamente la tasa de remielinización espontánea que se produce tras la desmielinización químicamente inducida tras la inyección de lisolecitina.

Dado el éxito del aislamiento y caracterización de los anticuerpos de ratón que estimulan la remielinización, la identificación de homólogos humanos de los monoclonales de ratón comenzó usando una estreategia independiente de antígeno. La justificación era identificar anticuerpos humanos que reaccionan con el homogeneizado de médula espinal de ratón mediante ensayo ELISA y que se unen con una afinidad alta a las estructuras y células dentro del SNC. Estos anticuerpos se analizaron después en los modelos de desmielinización de ratón por su capacidad para estimula la reparación de la mielina. Los sueros combinados de IgG e IgM humanas de pacientes de la clínica Mayo Hematology y los anticuerpos monoclonales de células B humanas inmortalizadas con EBV (de varias fuentes, como se describe en los resultados) se caracterizaron y analizaron en los modelos de ratón. Los resultados de estos experimentos se muestran a continuación.

Resultados

IgM policlonal humana, per no IgG, se une a láminas cerebrales de rata y a oligodendrocitos en cultivo

Mediante inmunohistoquímica, la IgM humana policlonal tiñe la superficie de una subpoblación de ilogodendrocitos (Figura 6) y es altamante reactiva para las estructuras y células en una lámina de cerebro de rata (Figura 1B). Con la IgG pliclonal humana no se observó reactividad frente a los antígenos de superficie de los oligodendrocitos (Figura 6) o a las láminas de cerebro de rata (Figura 1A). La inmunohistoquímica usando IgM o IgG policlonal humana sobre células glials fijadas y permeabilizadas mostró una tinción mínima de las estructuras intracelulares (datos no mostrados).

La especificidad de la IgM policlonal humana por las estructuras y células del SNC, y la unión a los oligodendrocitos pueden dirigir el pronunicado potencial remielinizante. En contraste con ello, la IgG policlonal humana, aunque estimula la remielinización sobre los niveles control (véase la Tabla 1), no se une al SNC y puede funcionar a través de un mecanismo diferente al de la IgM policlonal humana.

IgG e IgM policlonales humanas estimulan la remielinización del SNC en ratones infectados por TMEV

Aunque la cause de la EM se desconoce, en estudios epidemiológicos se ha sugerido que la enfermedad puede estar desencadenada por un agente infeccioso (Franklin y col. , 1991), aunque esta teoría no se ha probado con ninguna prueba concluyente. Más recientemente, el virus del herpes de tipo 6 ha recibido atención como posible agente etiológico en una subpoblación de pacientes (Groves y col., 1993). De los múltiples factores epidemiológicos estudiados que correlacionan con las exacerbaciones, solo se ha efectuado una asociación consistente con una infección vírica reciente (Smith y col., 1981). Además, el principal tratamiento establecido para la EM, IFN-ß, es una citoquina crucial para el control de la replicación del virus (14).

Un importante modelo murino para el estudio de la EM es el virus de la encefalomielitis murino de Thelier (TMEV). Este picornavirus de cadena positiva tiene una serie de ventajas. (1) El virus es un patógeno natural de los ratones, una especie de la que se sabe mucho sobre inmunología y genética; (2) la desmielinización primaria (destrucció de las vainas de mielina) es la manifestación física principal de la infección crónica (Trautgott y coll., 1982); (3) la genética del huésped desempeña un papel crucial en la determinación de la susceptibilidad o resistencia a la persistencia crónica del virus, desmielinizaci´n y enfermedad neurológica (Lang y coll., 1996; Rodriguez y col., 1987a, 1987b); (4) como en la EM, la patología está mediada por el sistema inmunitario (Rodriguez y Lennon, 1990; Rodriguez 1991; Miller y col., 1994; Miller y Rodriguez 1995c);(5) existe información completa sobre la virología molecular, incluidos detalles de la replicación del virus y del ensamblaje del virus; (6) la mayoría de los ratones susceptibles que alojan la infeccón por TMEV crónica desarrollan enfermedad neurológica similar a la EM: debilidad de las extremidaes, espasticidad, incontinencia, dismnución de la actividad espontánea y, en última instancia, parálisis (Asakura y col. , 1996a; Askura y col. , 1998).

De un modo similar a la EM, los ratones infectados por TMEV mostraron un amplio espectro de fenotipos de enfermedades (definidos como desmielinización y déficit neurológicos) (Ludwin, 1997). En un extremo están los animales en los que el virus se replica rápidamente en las neuronas del SNC, no es eliminado por el sistema inmunológico y tiene como resultado encefalitis grave y muerte (Asakura y col., 1996).

Este patrón de patología se observa en ratones neonatos o ratones con inmunodeficiencia grave. Esta enfermedad fuliminante contrasta con los ratones que montan una respuesta inmunitaria protectora, mediada principalmente por los linfocitos T de restricción de clase I, que eliminan el virus del SNC. Estos animales desarrollan encefalitis aguda, tras lo cual el virus se elimina del SNC sin la consiguiente desmielinización (Blakemore y col., 1997; Jeffrey y Blakemore 1995). Entre estos dos extremos se encuentran los animales que desarrollan enfermedad aguda que se resuelve, pero entran en una fase crónica que se caracteriza por desmielinización progresiva y persistencia del virus en oligodendrocitos, astrocitos y microglía (Rivera-Quinones y col., 1998; Miller y col., 1995a). Aunque estos ratones montan una respuesta inmunitaria que impide la muerte y la encefalitis devastadora, la incapacidad para eliminar el virus de la sustancia blanca tiene como resultado una inflamación persistente crónica y desmielinización mediada por el sistema inmunitario. Para evitar las respuestas inmunitarias anti-humano, se trató a los ratones crónicamente infectados (de 5 a 6 meses después de la infección por TMEV) con una única inyección en bolo de 1 mg de Ig por vía intraperitoneal. La dosis total de Ig fue de aproximadamente 0,05 g/kg de peso corporal, que corresponde a un octavo de la dosis total usada para el tratamiento con IVIg humana. No s eprodujeron diferencias significativas en las áreas de patología de la mielina entre los grupos de tratamiento (Tabla 1). No obstante, los ratones tratados con IgM policlonal humana mostraron una remielinización importante. Aproximadamente un cuarto del área total de la patología de mielona se reparó en ratones tratados con IgM policlonal humana. La extensión de la remielinización fue significativamente mayor que la remielinización espontánea observada en los grupos control tratados con PBS (p < 0,01), pero también fue superior a la obervada en los ratones tratados con IgG policlonal humana (p= 0,05). Los ratones tratados con IgG policlonal humana mostraron más remielinización que los ratones tratados con PBS. Las lesiones individuales que se remielinizaron mostraron una reparación casi completa con pocas células inflamatorias o macrófagos (Figura 12A, B). Con frecuencia, en cada lesión de este tipo se observaron de 500 a 1000 axones remielinizados. En contraste, la mayoría de las lesiones en ratones tratados con PBS tenían menos exones remielinizados y las lesiones contenían muchas células inflamatorias y macrófagos, signos de destrucción activa de la mielina.

La IgM policlonal humana potencia la remielinización en la desmielinización inducida por lisolecitina

La inyección de lisolecitina en la médula espinal es un procedimiento bien establecido para la lesión y desmielinización de la médula espinal químicamente inducidas. La inyección tiene como resultado lesiones desmielinizadas reproducibles que sufren remielinización espontánea a las 5-6 semanas. Trabajos previos realizados por los presentes solicitantes han mostrado que el tratamiento con anticuerpos que estimulan la remielinización incrementa la tasa de remielinización endógena de modo que las lesiones están sustancialmente reparadas a las 3 semanas. La naturaleza monofásica de las lesiones por lisolecitina, su rápida reparación espontánea y la ausencia de déficit clínicos en los animales lesionados contrastan con la desmielinización crónica inducida por TMEV y puede modelar aspectos de la lesión en la médula espinal mejor que la EM.

Los animales con lesiones en la médula espinal inducidas con lisolecitina fueron tratados con IgM e IgG policlonal humana. Las microfotografías de las áreas de lesión mostraron que los animales que recibieron IgM policlonal humana contenían muchos axones remeilinizados, mientras que los animales tratados con IgG policlonal humana o PBS contenían pocos axones remeilinizados (datos no mostrados).

En un esfuerzo para cuantificar el número de axones remielinizados por área de lesión, con un aumento alto se contaron los axones remielinizados de las lesiones de los 3 grupos de tratamiento. Había un número significativamente mayor de axones mielinados en lesiones de lisolecitina tratadas con IgM policlonal humana que los animales tratados con IgG policlonal humana (p<0,05).

Las inmunoglobulinas policlonales humanas reaccionan con múltiples autoantígenos y haptenos químicos

Las especificidades por antígeno de las Ig usadas en este estudio se analizaron mediante ELISA. En estudios previos se ha indicado que los anticuerpos que estimulan la remielinización muestran una reactividad amplia a múltiples antígenos proteicos y de haptenos (Miller y col., 1995c). Tanto la IgG como la IgM policlonal humana se unieron a múltples antígenos proteicos y haptenos químicos (Figuras 15 y 16).

La IgG y la IgM policlonales humanas no reaccionan con antígenos de TMEV.

Para exlucir la posibilidad de que la remielinización potenciada por IgM humana combinada era el resultado de la especificidad por antígenos de TMEV se realizó transferencia de tipo Western usando TMEV purificado. Ninguno de los AcMo usados en este estudio reacciónó con ninguna de las proteínas de la cápsice del TMEV conocidas (datos no mostrados). En contraste con ello, los anticuerpos policlonales de conjeo producidos contra TMEV mostraron una fuerte reactividad frente a los antígenos de la cápside VP1, VP2, VP3 del virus.

Los anticuerpos monoclonales reactivos en el SNC se pueden identificar en suero humano.

Dado que los autoanticuerpos naturales existen en la población humana normal, debería ser posible identificar autoanticuerpos monoclonales naturales humanos mediante detección selectiva de un gran número de clones de IgM monoclonal humana. Se diseñó una detección selectiva inicial de polirreactividad de anticuerpos monoclonales humanos derivados de suero usando un sistema de ensayo de unín a láminas de cerebro sin fijar. Los clones positivos son las muestras que se unieron a estructuras específicas del ceebro o a capas anatómicas o a poblaciones celulares significativamente por encima del nivel de fondo de un anticuerpo secundario conjugado con un marcador fluorescente solo.

En cincuenta y dos muestras de IgM humana, purificada de los sueros de los pacientes btenidos del departamento de hematología de la clínica Mayo, bajo la dirección del Dr. Robert A Kyle, se analizó la especificidad del SNC en un ensayo de unión a láminas de cerebro. Se determinó que treinta y dos anticuerpos se unían por encima del nivel de fondo. En las Figuras 1 y 2 se presentan varias d elas reactividades. También se analizaron cincuenta IgG derivadas de suero humano según su especificidad del SNC en un ensayo de unión a láminas de cerebro y se se identificaron patrones de unión distintos por encima del nivel de fondo (datos no mostrados). Por tanto, inmediatamente se identificó una diferencia grande entre las IgM y las IgG monoclonales humanas.

Los 32 anticuerpos positivos se analizaron después en función de la unión a través de un sistema de ELISA con homogeneizado de médula espinal (Figura 10) y de la unión a cultivos de células gliales primarias mixtos de rata tanto fijadas como vivas (Figure 7). Una tabulación de las reactividades de dichos anticuerpos (anticuerpos sHIgm #) se muestra en la Tabla 2. Los criterios para analizar un anticuerpo para actividad biológica in vivo fueron la especificidad del SNC, la unión a oligodendrocitos no fijados en cultivo y una reactividad significativa frente al SCH mediante ELISA. Por tanto, se identificó a sHIgM 22 y a sHIgM46 como estimuladores de la remielinización. Otros varios candidatos a sHIgM quedan por estudior cuidadosamente. La capacidad de los anticuerpos sHIgM analizados para unirse a los oligodendrocitos se muesra en la Tabla 3.

Los anticuerpos monoclonales reactivos al SNC se identificaron a partir del sobrenadante de los clones de células B humanas inmortalizadas con EBV.

Los sobrenadantes de clones celulares que tenían una concentración total de IgM superior a 3 ug/ml se analizaron en un sistema de ensayo de láminas de cerebro para determinar su capacidad para unirse a las estructuras del SNC. Se analizaron ciento cuarenta sobrenadantes de clones según la unión a las láminas de cerebro. Se determinó que quincesanticuerpos se unían por encima del nivel de fondo. En la Tabla 2 se muestra una tabulación de las reactividades de estos anticuerpos (MSI Nº). En las Figuras 4 y 5 se presenta una representación de las reactividades de ebvHIgM. Se analizó la capacidad de estos anticuerpos para unirse a los oligodendrocitos. Estos resultados se muestran en la tabla 3.

sHIgMs se unen a la sustancia blanca cortical humana.

Para confirmar que los sHIgM se unen al SNC humano, la sustancia blanca cortical humana se inmunomarcó en un sistema análogo al ensayo con láminas de cerebro de rata. La Figura 3 presenta varias de las especificidades del SNC de los sHIgM. Cuatro anticuerpos se unen bien al SNC humano (Figura 3B,C,D,E), mientras que la Figura 3A muestra un SHIgM que se une ligeramente por encima del nivel de fondo.

Los anticuerpos monoclonales humanos se unen a los antígenos de superficie sobre las células en cultivos mixtos de células gliales primarias.

Varios de los sHIgM se unen a las células en cultivos mixtos de células gliales primarias de rata. sHIgM 12 se une a los supuestos grupos de progenitories de oligodendrocitos (Figura 7A) en un campo de oligodendrocitos positivos para 04. Otros cuatro sHIgM (Figuras 7B,C,D,F) se unen a los oligodendrocitos morfológicamente maduros. sHIgM 30 s eune a la mayoría de las células (oligodendrocitos, astrocitos, microglía) en el cultivo (Figura 7E).

sHIgM y ebvHlgM estimulan la remielinización del SNC en ratones infectadas por TMEV.

Para evitar las respuestas inmunitarias anti-humano, se trató a los ratones crónicamente infectados (de 5 a 6 meses después de la infección por TMEV) con una única inyección en bolo de 0,5 mg del anticuerpo monoclonal humano por vía intraperitoneal. De los anticuerpos monoclonales humanos analizados in vivo hasta la fecha, sHIgM 22, sHIgM46 and ebvHIgM MSI19D10 estimulares significativamente la remielinización sobre otras IgM monoclonales humanas analizadas (sHIgM 1,2 y 14). No se produjeron diferencias en las áreas de patología de la mielina entre los grupos de tratamiento (Tabla 1). Los ratones tratados con sHIgM 22 y sHIgM46 mostraron una remielinización importante. Aproximadamente un quinto del área total de la patología de mielona se reparó en ratones tratados con sHIgM 22 (Tabla 1). La extensión de la remielinización fue significativamente superior que la remielinización espontánea observada en los grupos control tratados con PBS (p<0,05, Tabla 1). Las lesiones individuales remielinizadas mostraron una reparación casi completa con pocas células inflamatorias o macrófagos (Figura 12). Con frecuencia, en cada lesión de este tipo se observaron de 500 a 1000 axones remielinizados. En contraste, la mayoría de las lesiones en ratones tratados con PBS tenían menos exones remielinizados y las lesiones contenían muchas células inflamatorias y macrófagos, signos de destrucción activa de la mielina. Consistente con los trabajos previos que demostraban que los anticuerpos mononclonales de ratón reactivos con los oligodendrocitos pueden estimular la remielinización in vivo (Asukara y col., 1998), los anticuerpos humanos reactivos con los oligodendrocitos con reactividades similares a las de sus homólogos de ratón pueden estimular la remielinización in vivo también.

Tabla 1. Remielinización del SNC por anticuerpos humanos

Tratamiento

�?rea de �?rea de �?rea de �?rea de

Nº de

ratones

sustancia patología de la remielinización de remielinización de

blanca (mm2)

mielina (mm2) tipo SNC (mm2) tipo SNC (%)

policlonal IgG humana

10 8,6 ± 0,52 0,86 ± 0,10 0,13 ± 0,02 14,15 ± 2,38*

policlonal IgM humana

13 9,70 ± 0,43 1,21 ± 0,21 0,24 ± 0,04 23,2 ± 3,26**

sHIgM 1

4 9,34 ± 1,93 0,68 ± 0,07 0,03 ± 0,01 8,35 ± 3,73

sHIgM 2

4 8,78 ± 0,70 0,87 ± 0,12 0,09 ± 0,01 11,37 ± 1,30

sHIgM 14

7 10,68 ± 0,24 0,98 ± 0,09 0,08 ± 0,03 8,57 ± 2,51

sHIgM 22

8 10,55 ± 0,41 1,16 ± 0,22 0,19 ± 0,05 17,06 ± 3,42*

sHIgM 46

5 9,44 ± 0,36 0,66 ± 0,06 0,18 ± 0,04 27,12 ± 4,01***

ebvHIgM

3 8,24 ± 0,40 0,90 ± 0,14 0,26 ± 0,07 26,47 ± 3,71***

MSI19D10

ebvHIgM AKJR4

4 8,70 ± 0,84 1,10 ± 0,15 0,05 ± 0,03 4,15 ± 1,98

PBS

7 9,78 ± 0,60 1,20 ± 0,22 0,06 ± 0,02 6,74 ± 1,80

Los valores representan la media ± SEM. Se usaron ANOVA de una vía y una prueba t para comparar el porcentaje de área de remielinización de tipo SNC en ratones tratados con anticuerpos humanos con los ratones tratados con PBS. Dicho análisis reveló valores *p<0,05; †p<0,01, ‡p<0,001. La comparación d elos ratones tratados con IgG policlonal humana con otros tratamientos reveló: IgM policlonal humana p= 0,05, , sHIgM 46 P<0,05. Ninguna de las demás comparaciones fue estadísticamente significativa. No se observaron diferencias en la remielinización de tipo SNC entre IgM policlonal humana, sHIgM 22 y sHIgM 46. El área de remielinización de células de Schwann de tipo PNS varió de ) a 0,08 mm2. Esto correspondió a un porcentaje de área de 0,0 a 6,92 de remielinización de células de Schwann de tipo PNS como una función de la patología de la mielina. No se observaron diferencias significativas en el área de la patología de la mielina en los diversos grupos de tratamiento

o en comparación con el PBS o en la remielinización de células de Schwann de tipo PNS entre grupos.

TABLA 2

NOMBRE DEL CLON*

DESCRIPCIÓN DE LA TINCIÓN INMUNOFLUORESCENTE DE CEREBELO DE RATA NEONATA

CB2b-G8

Identifica cuerpos celulares neuronales grandes en la capa granular, cuerpos celulares redondos pequeños en la capa molecular, astrocitos fibrosos en la sustancia blanca central.

CB2e-C2

Marcaje débil de cuerpos de células de Purkinje; células pequeñas procesadas de morfología de oligodendrocitos y microglías, y astrocitos en la sustancia blanca central y la capa granular.

CB2i-E7

Marcaje de las células de Purkinje, células en la capa granular, sustancia blanca central en las hojas; citoesqueleto de oligodendrocitos y células gliales. .

CB2i-E12

Fuerte marcaje de los cuerpos de las células de Purkinje, árboles dendríticos y células redondas pequeñas en la capa molecular, marcaje casi confluente de la capa granular, astroicitos fibrosos en la sustancia blanca central.

(continuación) (continuación)

NOMBRE DEL CLON*

DESCRIPCIÓN DE LA TINCIÓN INMUNOFLUORESCENTE DE CEREBELO DE RATA NEONATA

CB2i-G2

Fuerte marcaje de los astrocitos fibrosos en los tractos de la sustancia blanca central; indentifica cuerpos de las células de Purkinje; marcaje puntuado sobre la capa granular, cuerpos de células pequeñas en la capa molecular.

CB2L-H1

Fuerte marcaje de los cuerpos de las células gliales en la sustancia blanca central y los cuerpos de células de Purkinje; marcaje más débil de los árboles dendríticos; cuerpos de células pequeñas muy pronunciados en la capa molecular.

MSI 10-E10

Fuerte marcaje de los tractos de la sustancia blanca central fibrosos, similar al observado usando anticuerpos antiglicolípicos y anticuerpos anti-microglía.

MSI 16-E6

Marcaje fuerte de cuerpos de células de Purkinje, más débil de los árboles dendríticos; marcaje casi confluente de las células pequeñas én la capa granular; sustancia blanca central casi sin marcar.

MSI 17-A2

Marcaje fuerte de células redondas pequeñas en la capa molecular y de cuerpos de células de Purkinje; marcaje difuso de la capa granular, sustancia blanca central sin marcar.

MSI 19-C11

Aspecto fibrosos de la sustancia blanca central, con muchas células de la morfología de los oligodendrocitos, marcaje puntuado en la superficie sobre la mayoría del tejido, pero concentrado sobre los presuntos cuerpos celulares.

MSI 19-ES

Marcaje de la capa molecular similar a la matriz extracelular, fuerte marcaje fibroso de la sustancia blanca central, que identifica muchas células gliales individuales.

AKJR4

Identifica todos los cuerpos celulares neuronales en la capa granular, cuerpos celulares redondos pequeños en la sustancia blanca central y en la capa molecular.

MSI 19D10

Se une fuertemente a las células de la capa granular y a las células de Purkinje y a sus árboles dendríticos, además de identificar débilmente la sustancia blanca y los astrocitos.

MSI 20H10

Se une a la sustancia blanca central, a las capa granular y molecular, y a las células de Purkinje, con varios grados de intensidad.

MSI 17E11

Se une de un modo puntuado a sólo unas pocas células de aspecto glial en la superficie de la lámina de cerebro.

sHIgM1

Se une al citoesqueleto de los astrocitos sobre la sustancia blanca central de las hojas.

sHIgM2

Se une a las células de la capa granular y a las fibras que atraviesan la sustancia blanca central de las hojas.

sHIgM12

Se une para dar un aspecto esponjoso a la sustancia blanca central de las hojas y un marcaje uniforme sobre a capa molecular, reminiscente de una molécula de la matriz extracelular.

sHIgM14

Se une bien a las células de la capa granular y a las células de Purkinje localizadas en la superficie de la lámina, mientras que la sustancia blanca central de las hojas está en gran medida desprovista de marcaje.

sHIgM22

Se une bien al citoesqueleto de los astrocitos dañados sobre la sustancia blanca central de las hojas, a las células de Purkinje y a sus arborizaciones dendríticas, y a las células redondas pequeñas en la capa molecular; marca débilmente la superficie de las células granulares.

sHIgM26

Se une a las células de aspecto de oligodendrocito y a la sustancia blanca fibrosa.

NOMBRE DEL CLON*

DESCRIPCIÓN DE LA TINCIÓN INMUNOFLUORESCENTE DE CEREBELO DE RATA NEONATA

sHIgM29

Se une débilmente a muchas estructuras dentro del cerebelo, con una intensidad justo por encima de la de fondo, a excepción de una población pequeña de neuronas en las capas granular y molecular. Las extensiones axónicas superiores a 100 µm están claramente delimitadas.

sHIgM30

No se une al cerebelo sin fijar.

sHIgM31

Se une predominantemente a la capa granular, con poca unión a la sustancia blanca, las células de Purkinje o los astrocitos.

sHIgM32

Se une a las células de aspecto de astrocito de tipo 2.

sHIgM42

Se une en un patrón fibroso a toda la hija, las capas molecular y granular y a la sustancia blanca.

sHIgM46

Se une en un patrón fibroso a toda la hija, la capa granular y a la sustancia blanca. Las células de Purkinje están bien definidas.

sHIgM50

Se une predominantemente a la capa granular, con poca unión a la sustancia blanca, las células de Purkinje o los astrocitos.

sHIgM51

Se une a células pequeñas similares a la microglía en las capas molecular y granular.

De los 96 clones de células B humanas de EBV generados, 60 produjeron anticuerpo IgM a una concentración de 2 µg/ml o mayor. De estos, se descubrió que 11 se unían fuertemente al cerebelo murino de forma consistente. Otros 10 se unieron al cerebelo murino débilmente o de forma inconsistente, mientras que 39 no se unieron. Se incluyen las imágenes de la tinción inmunofluorescente de los anticuerpos de tinción fuerte de forma consistente indicados anteriormente, así como cuatro clones negativos representativos (CB2g-E10, CB2g-F11, CB2IF10, MSI24-D6). *CB: Clones generados a partir de sangre de cordón umbilical humano; MSI: clones generados a partir de sangre periférica de pacientes de esclerosis múltiple; AKJR: clones generados a partir de sangre periférica de pacientes de artritis reumatoide.

TABLA 3

Unión a oligodendrocitos

Anticuerpo

Unión a oligodendrocitos

MSI 17 A.2

Negativa

MSI 19C11

Negativa

MSI 19E5

Mara oligodendrocitos de morfología madura

AKJR 4

Negativa

MSI 19010

Marca algunos oligodendrocitos de morfología madura

MSI 20H10

No analizado

MSI 17E11

No analizado

SH1gm 1

Sin reactividad contra los antígenos de superficie

SH1gm 2

Sin reactividad contra los antígenos de superficie

SH1gm 12

Presuntos progenitores de oligodendrocitos antes de la expresión de sulfórtido

SH1gm 14

Marca oligodendrocitos maduros multiprocesados

SH1gm 22

Marca estadios maduros de los oligodendrocitos y extensiones del proceso

SH1gm 26

Sin reactividad contra los antígenos de superficie

(continuación)

Unión a oligodendrocitos

Anticuerpo

Unión a oligodendrocitos

SH1gm 29

Sin reactividad contra los antígenos de superficie

SH1gm 30

Sin reactividad contra los antígenos de superficie

poly hIgG

Negativo en la superficie

poly hIgm

Subpoblación de oligodendrocitos maduros

CB2b G8

Marca oligodendrocitos (humanos) de morfología madura

CB2e C2

Negativa

CB2iE7

Marca oligodendrocitos de morfología madura

CB2i E12

Negativa

CB2i G2

Negativa

CB2L H1

Negativa

MSI 10E10

Negativa

MSI 16E6

Negativa

sHIgM31

No hay unión a oligodendrocitos

sHIgM32

No hay unión a oligodendrocitos

sHIgM42

Se une a los estadios maduros de los oligodendrocitos y débilmente a los astrocitos subyacentes

sHIgM46

Se une fuertemente a los estadios maduros e inmaduros de los oligodendrocitos con marcaje puntuado.

sHIgM50

Débil marcaje puntuado de la subpoblación de estadios maduros de los oligodendrocitos

sHIgM51

Se une a los estadios maduros de los oligodendrocitos y débilmente a los astrocitos subyacentes.

Anticuerpos monoclonales que estimulan la remienilización producen un flujo de Ca2+ en las células gliales en cultivo.

La respuesta de las células gliales cultivadas a las concentraciones fisiológicas de los anticuerpos que estimulan la remielinización sugiere que estoas anticuerpos pueden tener efectos directos sobre la bioquímica de las células 5 gliales a través de la regulación del flujo de calcio celular. Este efecto puede representar un aspecto importante del mecanismo molecular de la remielinización inducida por anticuerpos. La Figura 21 demuestra las respuestas de Ca2+ de las células gliales a cuatro anticuerpos diferentes. Dos de estos anticuerpos, sHIgM 22 ySCH94.03, estimulan la remielinización in vivo y dos sHIgM 14 y CH12 no estimulan la remielinización. Las células que respondieron al anticuerpos exhibieron uno de dos tipos diferentes de picos de calcio. Algunas células respondieron con un pico de

10 inicio rápido de corta duración (respuesta rápida), como muestran los trazados rojos en los paneles A y B. Una subpoblación distinta de células respondió con un pico de inicio más lento de duración más larga (respuesta lenta) como demuestra la ausencia de trazados negros en los paneles A y B. Los anticuerpos sHIgM 22 y SCH94.03 provocaron cada uno ambos tipos de respuestas, pero siempre de diferentes células gliales individuales.

Estas respuestas cualitativamente diferentes sugieren claramente dos modos de acción moleculares distintos sobre

15 diferentes subpoblaciones de células. Una respuesta de anticuerpo (la respuesta rápida o la lenta) se observó en 30 de 251 células tras el tratamiento con sHMab22 y en 36 de 251 células tratadas con SCH 94.03. Los anticuerpos que no estimulan la remielinización in vivo (sHIgM14 y CH12) no se observó que causaran el flujo de calcio en cultivos de glía (panel C). Para cada uno de estos anticuerpos se analizó un total de 203 células.

Los anticuerpos monoclonales humanos se unen a las neuronas primarias.

20 Muchos de los sHIgMs y ebvHIgMs se unen a poblaciones neuronales en láminas de cerebro. No obstante muchas de las aneuronas unidas están en la superficie de la lámina, lo que plantea la posibilidad de que los anticuerpos se puedan unir a epítopos internos dentro de las neuronas dañadas. Las Higo de unión positivas se analizaron para determinar la unión a células granulares de rata viva en cultivo. La Figura 22 demuestra la unión de dos sHIgMs a neuronas vivas. sHIgM 12 se une a las extensiones axonales y dendríticas de las neuronas (Fig. 22A), mientras que ebvHIgm CB2iE12 se une exclusivamente al exterior de la membrana de las células granulares y las extensiones axónicas proximales (Figura 22B). Estas reactividades se verificaron mediante inmunohistoquímica de marcaje doble mediante marcaje c de neuronas ositivas a anticuerpos humanos con anticuerpos de proteína 2 asociados antineurofilamento y anti-microtúbulos (datos no mostrados).

De interés particular para nuestro laboratorio es la posibilidad de que la desmielinización predisponga a los axones a lesiones inmunomediadas y a los correspondientes déficit neurológicos. En nuestro análisis reciente de ratones deficientes en microglobulina p2 (ß2m -/-), los inventores demostraron que, en ausencia de MHC de clase I, los ratones infectados con TMEV desarrollan lesiones de desmielinización grandes pero no desarrollan déficits clínicos. Los ratone smostarron una conservación relativa de axones con mayores densidades de los canales de calcio y remielinización de la sustancia blanca de la médula espinal. La conservación de los exones parece ser esencial para el mantenimiento de la función neurológica. La observación de que los anticuerpos humanos s epueden unir específicamente a las neuronas presenta otra posible vía para la participación de los anticuerpos en la reparación del SNC. Ciertos anticuerpos pueden ser capaces de potenciar la remielinización a través de su acción sobre las neuronas. La reparación de las lesiones en el SNC se pueden potenciar con anticuerpos monoclonales a través de muchas situaciones posibles. 1) incrementar las uniones adhesivas entre neuronas y oligodendrocitos. 2) estimulación celular directa de las neuronas ara regular por incremento los factores tróficos y atraer a los progenitores de los oligodendrocitos al área de los axones desnudos. 3) neuroprotección de los axones mediante bloqueo de los canales iónicos con pérdidas sobre los axones desnudos. 4) protección de los axones desnudos del reconocimiento por las células inmunitarias activadas y destructoras.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

A. Producción de anticuerpos monoclonales, caracterización, detección selectiva y purificación:

Fuentes de Ac y purificación de Ac.

IgM humana normal se purificó de plasma combinado de más de 2.500 donantes sanos mediante el procedimiento de fraccionamiento en etanol de Deutsch-Kistler-Nitschmann, seguido de precipitación en ácido octanoico y dos etapas sucesivas de cromatografía de intercambio iónico como previamente se ha descrito (Hurez y col., 1997). La pureza de la IgM fue superior al 90 %, confirmado mediante ELISA y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE). La IgG humana combinada de donantes sanos usada clínicamente como IVIg se adquirió en Miles Inc. (Elkhart, IN). Las muestras se obtuvieron de la clínica de disproteinasa bajo la dirección del Dr. Robert A. Kyle, Clínica Mayo. Las muestras de suero procedieron de pacientes con una amplia variedad de afecciones caracterizadas por picos de IgG o IgM monoclonales en suero, incluidas macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiple, linfoma, gammapatía monoclonal benigna.

Generación de líneas de células B inmortalizadas con el virus de Epstein-Barr (EBV)

La línea celular de tití B95-8 de la ATCC (Nº CRL 1612) para el crecimiento y aislamiento del EBV. Las células se siembran a 1 x 106 células/ml en medio completo RPMI-10, seguido de 3 días de incubación en un incubador humidificado, a 37 ºC, 5% de CO2. Las células se recogen y el sobrenadante se elimina mediante centrifugación durante 10 minutos a 300 x g y a 4 ºC. El sobrenadante que contiene el EBV se pasa a través d eun filtro de 0,45 m y el flujo pasante se recoge y almacena a -130 ºC (nitrógeno líquido). Este sobrenadante con EBV contiene, en general, 102-103 unidades transformantes/ml.

Las células B periféricas para inmortalización se recogieron de la sangre de adultos normales (NA), adultos con artritis reumatoide (AKJR), adultos con esclerosis múltiple (EM) y de sangre de cordón umbilical (CB). La sangre heparinizada (15 ml) se diluye a 1:2 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 12 ml de esta dilución se introducen por debajo de la capa con 12 ml de Ficoll-Hypaque en un tubo de centrífuga de 50 ml. El tubo se centrifuga durante 8 minutos a 1500 x g, a temperatura ambiente, y la intefaz leucocitaria se elimina y s etransfiere a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Las células se lavan mediante centrifugación (15 minutos, 300 x g, temperatura ambiente), una vez en PBS y, después, dos veces en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Después, las células se resuspenden en 2-5 ml de medio completo RPMI-10 y se contaron.

Las células se diluyen a 4x106 células/ml en medio completo RPMI-10 , 2,5 ml (1x107 células) se transfieren a un tubo de centrífuga de 50 ml y se añaden 2,5 ml de sobrenadante con EBV. El tubo se incuba durante dos horas en un baño de agua a 37 ºC, seguido de la adición de 5 ml de medio completo RPMI-10 que contiene 1 g/ml de ciclosporina A. Los 10 ml de suspensión celular se transfieren después a un matraz de cultivo tisular de 25 cm2 y se cultivan durante 3 semanas en un incubador humidificado, a 37 ºC, 5% de CO2. Tras 3 semanas, un alícuota del cultivo se crioconserva y el resto se expande y se aíslan las líneas de células clonales mediante dilución límite.

Purificación de anticuerpos IgM

Se escogieron muestras de suero humano para estudiar únicamente por la presencia de un pico alto de IgM en el cromatograma de Ig. Las muestras se obtuvieron de la clínica de disproteinasa bajo la dirección del Dr. Robert A. Kyle, Clínica Mayo. Las muestras de suero procedieron de pacientes con una amplia variedad de afecciones caracterizadas por picos de IgG o IgM monoclonales en suero, incluidas macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiple, linfoma, gammapatía monoclonal benigna. Los sueros de los pacientes se dializaron contra agua desionizada durante tres días. Los precipitados euglobulínicos se recogieron mediante centrifugación (1400 rpm/30 minutos) y se disolvieron en PBS. Las soluciones se eliminaron mediante centrifugación (1400 rpm/30 minutos) y se sometieron a cromatografía en una columna de Superosa 6 (Pharmacia, Upsalla) equilibrada con PBS. Las fracciones correspondientes a IgM se combinaron y analizaron mediante SDS-PAGE reductora (12 % de gel). Las concentraciones de IgM se determinaron mediante tinción de los geles de SDS con Cypro Orange (Molecular Probes, Eugene) y el posterior barrido en Storm 840 (Molecular Dynamics). Las IgM monoclonales (Sigma, St Louis) se usó como patrón para la medición de la concentración. Las soluciones de IgM se esterilizaron mediante filtración a través de filtros de 0,22 m.

Caracterización de la especificidad de unión a antígeno

Como ensayo para la detección selectiva preliminar de anticuerpos antes del análisis in vivo de la capacidad para producir remilelinización se usó ELISA contra homogeneizado de médula espinal (SCH) de ratón. Para caracterizar adicionalmente la polirreactividad y la especificidad antigénica de anticuerpos seleccionados, se usó un ELISA contra el panel estándar de proteínas y antígenos químicos, así como análisis de los patrones de tinción del anticuerpo en tejidos neurales seccionados y sobre oligodendrocitos cultivados.

Ensayo ELISA

Se realizó detección selectiva de los anticuerpos según su reactividad al homogeneizado de médula espinal (SCH) de ratón. SCH a una concentración de 0,01 mg/ml se introdujo en placas de microtitulación de poliestireno en tampón carbonato 0,1M, a pH 9,5, durante 18 horas a 4 ºC y después se lavaron 3 veces con PBS. Las placas revestidas se bloquearon con solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo diluido a 10 g/ml en tampón de bloqueo durante 2-24 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con PBS/0,05% de Tween 20 y el anticuerpo añadido se detectó con anti-IgM o IgG de cabra biotinilada, seguida de fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina, con p-nitrofenilfosfato como sustrato cromogénico. La absorbancia de la reacción se mide a 405 nm.

También se analiza la reactividad de los anticuerpos frente a un panel de antígenos proteicos (espectrina eritrocitaria humana, cadena pesada de miosina bovina, hemoglobina de ratón, transferrina bovina, vimentina bovina, lisozima de huevo de pollo, actina de conejo, proteína básica de la mielina de conejo, hemocianina de lapa californiana) y haptenos químicos acoplados a seroalbúmina bovina (BSA) (4-hidrozi-3-nitrofenilacetilo (NP), feniloxazolona (PhoX), axofeniltrimetilamonio (TMA), fluoresceína (FL), azofenilfosforil-colina (PC), azofenilarsonato (Ars), trinitrofenil acetilo (TNP)). Las proteínas s eusan a 5 g/ml y haptenos acoplados a BSA se usan a una concentración de hapteno 2 M. Los antígenos se introducen en las placas de microtitulación de poliestireno, reaccionaron con anticuerpo y los anticuerpos unidos se detectan como se ha descrito para ELISA con SCH.

Tinción de sección tisular

Como fuente de tejido neural se usa cerebelo de rata neonata para la comparación de patrones de tinción de anticuerpos. Tejido fresco sin fijar se incluye en agarosa al 2% de bajo punto de fusión y se corta en secciones sagitales de 300 m en un triturador de tejido McIlwain Tissue Chopper. Las secciones no se fijan y se conservan a 4 ºC o en hielo a lo largo del resto del procedimiento. Las láminas se transfieren a placas de cultivo tisular de 48 pocillos en sales equilibradas de Earles tamponadas con HEPES ((E/H) y se bloquearon durante 30 minutos en E/H con 5% de BSA. Las secciones se tiñen con anticuerpo primario a 10 g/ml en E/H con 1% de BSA durante 2-12 horas a 4 ºC. Las seciones se lavan 3 veces en E/H y se incuban con un anticuerpo secundario fluorescente adecuado en E/H con 1 % de BSA durante 2 horas. Las secciones se lavan 3 veces en E/H, 1 vez en PBS y después sefijan con 4% de paraformaldehído durante 30 minutos. Las secciones se lavan 3 veces con PBS y se montan en 90 % de glicerina con 2,5 % de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano para prevenir el fotoblanqueo.

Tinción de oligodendrocitos cultivados

Se diseccionan los hemisferios cerebrales de ratas Sprague-Dawley P0-P3 y se retiran las meninges y vasos sanguíneos. El tejido se tritura y se transfiere a una solución de tripsina al 0,25% en sales equilibradas de Earles tamponadas con HEPES (E/H) sin calcio ni magnesio, hasta un volumen final de 10 ml por cerebro. El tejido se agita a rpm baja a 37 ºC durante 30 minutos y, después, se añade suero bovino fetal inactivado con calor hasta una concentración final del 10 % para inactivar la tripsina. Se añaden MgSO4 y ADNasa (hasta 0,1 % y 20 g/ml, respectivamente) y el tejido se agita durante 5 minutos adicionales. Las células se lavan mediante centrifugación y se resuspenden en E/H con ADNasa I y se disocian mediante trituración a través de una pipeta de vidrio. Los residuos grandes se dejan sedimentar y el sobrenadante celular superior se lava mediante centrifugación a través de una almohada de 4% de BSA en E/H. El sedimento celular se resuspende en medio de cultivo y las células se siembran a 2,5 x 105 células por cm2 en placas de cultivo de poli-D-lisina. Las placas se agitan para aislar los progenitores de oligodendrocitos el día 9-12. En este momento hay una diseminación fenotípica completa de oligodendrocitos en el cultivo con progenitores presentes en la capa superior en grupos de células recientemente divididas. Los progenotires de oligodendrocitos se aíslan mediante agitación suave los cultivos, se vuelven a sembaren placas sobre cubiertas revestidas con polilisina y se estimularon para diferenciar mediante la eliminación d elos factores de crecimiento del medio de cultivo.

La tinción de la superficie viva se realiz a 4 ºC durante 15 mintuos sobre células no fijadas después de bloquear con PBS y 5% de BSA. La tinción intracelular se realiza tras fijación con 4% de paraformaldehído y permeabilización con 0,1 % de Triton-X-100. Los anticuerpos primarios se detectan con anticuerpos secundarios conjugados con fluoresceína. Los cubreobjetos se montan en 90 % de glicerina con 2,5 % de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano para prevenir el fotoblanqueo y se ven en un microscopio de epifluorescencia.

Transferencia de tipo western

El TMEV purificado (Njenga y col., 1996) se separó mediante SDS-PAGE sobre geles de acrilamida al 15 %. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante electrotransferencia. La membrana se bloqueó con solución salina tamponada con Tris que contiene 5% de leche seca desgrasada y 0,05 % de Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se incubó con IgM humana combinada, IgG humana combinada, IgM de dos apcientes con macroglobulinemia de Waldenstrom y Ac anti-TMEV policlonal de conejo (1:2000) (Njenga y col., 1996) durante 4 horas a temperatura ambiente. Todas las Ig humanas se usaron a la misma concentración (10 ug/ml). Las Ig unidas se detectaron con anticuerpos anti-humanos de cabra biotinilados o anticuerpos anti-conejo de cabra biotinilados (ambos de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y azul de nitro-tetrazolio (BCIP/NBT).

B. Estimulación de la remielinización usando anticuerpos monoclonales humanos:

Desmielinización inducida por TMEV

Para la porducción de la desmielinización inducida por TMEV se realiza inyección de virus intracerebral en animales de 4-6 semanas de edad ligeramente anestesiados con metofano. El virus se inyecta usando una aguja de 37 gauge con una jeringuilla de Hamilton que libera un volumen de 10 l que contiene 2 x 105 UFP de la cepa de Daniel de TMEV. La inyección intracerebral tiene como resultado una incidencia superior al 98 % de infección viral crónica con desmielinización. Los animales crónicamente infectados para los experimentos de remielinización son, en general, de 6-8 meses tras la infección.

Protocolo del tratamiento con anticuerpos

Los animales con desmielinización crónica reciben inyecciones intraperitoneales (IP) de anticuerpos purificados en solución salina tamponada con fosfato. Para los animales infectados por TMEV, el programa d einyección consiste en inyecciones dos veces a la semana de 50 g en 100 ml. La duración del tratamiento con anticuerpos es de cinco semanas (500 g de dosis total). Después, se sacrificó a los animales y el tejido de médula espinal se procesa para su evaluación morfológica tal como se describe más adelante. Para cada tratamiento con un anticuerpo diferente, en nueve ratones SJL/J hembra crónicamente infectados se inyecta el anticuerpo. Al final del periodo de tratamiento, seis de los animales se perfunden y procesan para la cuantificación morfométrica de desmielinización/remielinización y se sacrificó a tres para obtener tejido congelado que se usa para la evaluación de la integridad del axon. Para cualquier anticuerpo dado se requieren tres ensayos de tratamiento por separado, con resultados reproducibles y consistentes, antes de que los datos se consideren significativos. Como controles negativos se incluyen grupos control con PBS y con isotipo, para cada nuevo experimento de tratamiento con anticuerpo.

Evaluación morfológica de la remielinización/remielinización

Al final de cada experimento, la médula espinal de cada animal se evaluará histológicamente. Se anestesió a los ratones con pentobarbital y se perfundieron mediante administración intracardíaca de agente de fijación (formaldehído al 4% tamponado con fosfato con glutaraldehído al 1 %, pH 7,4). Se retiran las médulas espinales y se seccionan coronalmente en bloques de 1mm, se fijan después con osmio y se incluyen en araldita. De cada bloque se cortan secciones transversales de un micrómetro de espesor y se tiñen con parafenilendiamina al 4 %. Esta técnica es reproducible y permite la visualización constante de las vainas de mielina en la sustancia blanca de la médula espinal.

La desmielinización y remielinización se cuantifican usando un sistema de análisis digital interactivo Zeiss (ZIDAS) y una cámara lúcida. Para cada ratón se analizan diez secciones transversales de médula esponal que atraviesan toda la médula, desde las regiones de la columna cervical a la espinal porximal coccígea. El área total de la sustancia blanca, el área de desmielinización y el área de remielinización se determinan para cada sección y las áreas de las diez secciones analizadas para un ratón específico se añaden para proporcionar las áreas totales para cada ratón. Las áreas de desmielinización se caracterizan por cantidades grandes de residuos de meilina, residuos que tragan los macrófagos, infiltración celular y axones desnudos. La remielinización de los oligodendrocitos se caracteriza por áreas de axones con vainas de mielina anormalmente finas y ausencia de células de Schwann. La comparación estadística de la extensión de la desmielinización y de la remielinización se realiza usando la prueba t de Student.

Desmielinización inducida por lisolecitina

Para estos experimentos, se anestesió a ratones SJL/J de 12 semanas de edad con pentobarbitol sódico y se realiza una laminectomía dorsal en la región torácia superior de la médula espinal. Se usa una aguja de 34 gauge unida a una jeringuilla Hamilton para inectar 1 l de una solución al 1 % de lisolecitina directamente en el lado dorsolateral de la médula. Se sacrifica a los animales a los 21 días de la inyección y la región de la médula espinal en la que se realizó la inyección se elimina y procesa para su evaluación morfológica.

Como segundo modelo de desmielinización se usó la inyección intraespinal de lisolecitina. Ratones SJL/J de 12 semanas de edad fuero anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (0,08 mg/g). Se realizaron laminectomías dorsales sobre la regón torácica superior de la médula espinal y se inyectó lisolecitina (L-alisofosfatidilcolina) (Sigma, St. Louis, MO) como se ha descrito previamente (Pavelko y col., 1998). Brevemente, se usó una aguja de 34 gauge unida a una jeringuilla de Hamilton montada sobre un micromanpulador estereotáctivo para inyectar una solución al 1 % de lisolecitina en PBS estéril (pH 7,4) con azul de evan añadido como marcador. La aguja se insertó en la parte dorsolateral de la médula espinal, se inyectó 1 ul de lisolecitina y, después, se retiró lentamente la aguja. La herida se suturó en dos capas y los ratones se recuperaron. El día de la inyección d elisolecitina se denominó día 0.

Siete días después de la inyección de lisolecitina, se trató a los ratones con una inyección en bolo intraperitoneal de IgM humana o IgG humana (1 mg/cada inyección). Se trató a los ratones control con una inyección en bolo intraperitoneal de PBS. Trees semanas y cinco semanas después de la inyección de lisolecitina, se sacrificó a los ratones y se prepararon secciones de un m de espesor como se ha descrito en la sección anterior. El bloque de araldita que mostraba la lesión de desmielinizaicón inducida con lisolecitina más grande se usó para el análisis cuantitativo. El área total de la lesión se cuantificó usando un sistema de análisis digital Zeiss. El número total de las fibras remielinizadas se cuantificó usando un sistema de análisis informático/microscopio Nikon. Los datos se expresaron en forma del número de azones remielinizados/mm2 de la lesión.

Los ratones tratados con lisolecitina recibieron inyecciones IP de 50 g del anticuerpo los días 0, 3, 7, 10, 14, y 17 tras la inyección de lisolecitina. Se sacrifica a los animales el día 21 después de la inyección de lisolecitina. Los inventores encontraron de forma rutinaria efectos del tratamiento estadísticamente significativos con grupos de tratamiento experimental de diez animales. Los grupos control con PBS y de isotipo sirvieron como controles negativos.

C. Mecanismo de acción de los anticuerpos monoclonales humanos que estimulan la remielinización:

Análisis fluorescentes ratiométricos de Ca2+

Los cultivos mixtos de glías primarias, desde el día 2-4 tras el nacimiento de los cachorros de rata,, se siembran sobre subreobjetos revestidos con poli-D-lisina y se cultivan durante 5-7 días antes del análisis. Fura-2-AM y Pluronic F-127 se mezclan a 1:1 y se añaden a DMEM (sin suero) para dar Fura-2 4 mM en solución (medio de carga Fura-2).

Los cubreobjetos con células se lavan una vez con DMEM y después se incuban en medio de carga Fura-2 durante 60 minutos a 37 ºC. Después, las células se lavan 4 veces en DMEM. El cubreobjetos se monta en una cámara de registro en un microscopio de fluorescencia nvertido conectado a un sistema de adquisición de datos controlado por ordenador, que captura imágenes digitales de emisión de fluorescencia a 510 nm, a dos longitudes de onda de excitación diferentes: 340 nm y 380 nm. Para cada registro, las imágenes digitales se capturan de una célula individual, a ntervalos de 10 segundos durante 600-800 segundos. La concentración relativa interna de Ca2+ se calcula como la proporción de 340 nm/380 nm de fluorescencia. Todos los registros se realizan a 37 ºC en 1 ml DMEM.

El anticuerpo de ensayo se introduce añadiendo 50 ml de la solución madre de anticuerpo concentrado (60 mg/ml en PBS) a la cámara de registro para dar una concentración final de 3 mg/ml. Después de registrar los efectos de la adición de los anticuerpos de ensayo, se añaden 50 ml de una reserva de ionóforo de calcio (Br-A23187 20 mM en PBS), para dar una concentración final de 10 mM.

DISCUSIÓN

Se ha demostrado que la inmunoglobulina (Ig) humana nornal, especialmente la IgG, administrada por vía intravenosa (IVIg) es eficaz en el tratamiento de varias enfermedades neurológicas autoinmunitarias, incluido el síndrome de Guillain-Barré (van der Mech y col., 1992), neuropatías desmielinizantes idiomáticas crónicas (van Doom y col., 1991), neuropatía motora multifocal (Chaudhry y col., 1993), polimiositis (Cherin y col., 1991), y miasthenia gravis (Edan y Landgraf, 1994). Los mecanismos mediante los que actúa la Ig no están claros. Algunos investigadores también han sugerido que esta terapia puede ser eficaz en las enfermedades del SNC autoinmunitarias mediadas por linfocitos T, tal como esclerosis múltiple (EM) (van Engelen y col., 1992; Achiron y col., 1992; Fazekas y col. , 1997; Achiron y col., 1998; Sorensen y col. , 1998).

Los inventores han usado la desmielinización inducida por el virus de la encefalomielitis murina de Thelier (TMEV) como modelo para desarrollar nuevos tratamientos para la EM. Cuando este picornavirus se inocula por vía intracerebral en cepas susceptibles de ratones, el TMEV induce desmielinización del SNC progresiva mediada por el sistema inmunitario que es clínica y patológicamente similar a la EM. Los inventores han probado que múltiples IgM de ratón (anticuerpos monoclonales (AcMo) dirigidos contra antígenos del SNC normal estimulan la remielinización del SNC tras desmielinización inducida por TMEV (Miller y col., 1994; Asakura y col., 1998). También se demostró que el anticuerpo prototípico, denominado SCH94.03, potenciaba la tasa de remielinización espontánea del SNC tras desmielinización inducida con lisolecitina (Pavelko, y col., 1998) y disminución de la gravedad y la frecuencia de las recaídas en un modelo de recaída de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). Las características frecuentes de estos AcMo IgM que estimulan la remielinización son que reaccionan a antígenos de superficie sobre los oligodendrocitos y tienen características fenotípicas y genotípicas de los autoanticuerpos naturales (Miller y Rodriguez, 1995; Asakura y col., 1998). Los autoanticuerpos naturals tienen un amplio espectro de reactividades con antígenos propios y no propios. Estos anticuerpos representan una fracción principal del repertorio de IgM circulantes normales. Aunqe su function fisiológica se desconoce, los efectos beneficiosos de los autoanticuerpos naturals se han comunicado en varios modelos de enfermedades autoinmunitarias, incluidas miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico y diabetes no obesa (Sundblad y col., 1989; Hentati y col., 1994; Andersson y col., 1991, 1994).

La IVIg se purifica a partir de grupos de plasma humano de 3.000 a 10.000 donantes sanos y contiene más del 95 % de IgG y cantidades insignificantes de IgM (Dalakas, 1997). En base a las observaciones previas de los inventores, éstos postularon la hipótesis de que la IgM humana de donantes sanos, que está enriquecida en autoanticuerpos naturales, serúa un tratamiento más eficaz para la enfermedad desmielinizante que la IVIg convencional. Para analizar esta hipótesis,, los inventores tratarin crónicamente a los ratones infectados por TMEV con IgM humnana combinada obtenida de más de 2.500 donantes sanos y se analizó la remielinización del SNC.

En este studio, los inventores demostraron que el tratamiento con IgM humnana combinada de donantes sanos tuvo como resultado una remielinización significativamente potenciada por los oligodendrocitos en ratones infectados por TMEV en comparación con el tratamiento con IgG humana combinada o PBS. Los inventors confirmaron mediante ELISA e inmunohistoquímica que la IgM humnana combinada contiene una población de autoanticuerpos naturales polirreactivos a proteínas y haptenos. Esta es la primera demostración de que la IgM policlonal humana estimula la remielinización del SNC en modelos de enfermedad desmielinizante, lo que plantea la posibilidad de que la IgM de donantes sanos puede ser más eficaz para tratar enfermedades desmielinizantes inflamatorias humanas que la IgG humana combinada convencional.

Que se sepa, la IgM humana combinada nunca se ha analizado en la EM, aunque se ha demostrado que es segura y eficaz en las infecciones graves e inmunodeiciencia.

Los autoanticuerpos naturales son una fracción principal del repertorio de IgM. En autoanticuerpos naturales de ratones son, exclusivamente IgM, mientras que en autoanticuerpos naturales de seres humanos son también de los isotipos de IgG aunque con mucho menos frecuencia. Hasta la fecha, los únicos AcMo que se ha demostrado que potencian la remielinización han sido IgM reactiva frente a oligodendrocitos (AcMo), que tienen características genotípicas y fenotípicas de autoanticuerpos naturales (Asakura y col. 1998).

En conclusión, los inventores han demostrado que una técnica de detección selectiva lógica se puede usar para identificar anticuerpos monoclonales humanos que tienen el potencial de estimular la remielinización en sistemas modelos de desmielinización. Las propiedades del anticuerpo, tal como la especificidad del SNC, la capacidad de reconocer los antígenos presentes en los oligodendrocitos y una fuerte unión al homogeneizado de médula espinal, combinados, se puede predecir qué anticuerpos son los mejores candidatos para analizar la remielinización in vivo. Muchos de estos anticuerpos monoclonales se unen bien al SNC humana, lo que proporciona un motivo para esperar que algunos pueden ser útiles como terapia para tratar con éxito la enfermedad humana.

A continuación se presenta una lista alfabética de las referencias citadas en este Ejemplo.

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73.

Ejemplo 2

DETECCIÓN SELECTIVA DE PÉPTIDOS MIMÉTICOS DE EP�?TOPO CON UN AUTOANTICUERPO

En este ejemplo se describe la identificación y preparación de péptidos que imitan los antígenos reconocidos, o porciones de los mismos, correspondientes a los autoanticuerpos de la invención. Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, dichos péptidos pudieron servir como vacunas para producir una respuesta inmunitaria potenciada a las afecciones indicadas que responde de forma favorable a mayores niveles circulantes de anticuerpos.

Un ejemplo de estrategia para la identificación de miméticos peptídicos sería buscar péptidos que se unen específicamente a, por ejemplo, el anticuerpo HNK-1, un autoanticuerpo de ratón demostró que podía inducir demielinización. El antígeno del epítopo de HNK-1 es un hidrato de carbono. El epítopo de HNK-1 se expresa principalmente en los glicolípidos y las glicoproteínas del tejido nervioso (McGarry y col., (1983) Nature 306:376-378; Ilyas y col., (1984) Biochem. Biophys. Res. Comm. 122:1206-1211; Kruse y col., (1984) Nature 311:153-155; Yuen y col., (1997) J. Biol. Chem. 272:8924-8931). La estructura que reacciona con el anticuerpo HNK-1 fue descrita por primera vez por Chou y Jungalwala para el glicolípiod antigénico mayoritario presente en los nervos periféricos humanos. La composición, enlace del azúcar, confuiguración y posición del grupo sulfato se caracterizaron como sulfato-3 GlcAß (1-3) Galß (1-4) GlcNAcß (1-3) GalNAcß (1-3) Galß (1-4) Glcß(1-1)-ceramida para SGGL-1 y como sulfato-3 GlcAß (1-3) Galß (1-4) GlcNAcß (1-3) Galß (1-4) GlcNAcß (1-3) Galß (1-4) Glcß (1-1)-ceramida para SGGL-2. (Chou y col., 1986).

La detección selectiva en bibliotecas de péptidos aleatorios expresados en fagos ofrece una fuente rica de diversida molecular y representa un potente medio de identificar ligandos peptídicos que se unen a una molécula receptora de interés. Los fagos que expresan péptidos de unión se seleccionan mediante purificación por afinidad con la diana de interés. Este sistema permite un gran número de fagos que se van a someter a detección selectiva a la vez. Dado que cada fago infeccioso codifica una secuencia aleatoria expresada sobre su superficie, un fago concreto, cuando se recupera de una matriz de afinidad, se puede amplificar mediante otro ciclo de infección. Por tanto, las moléculas selectoras inmovilizadas sobre un soporte sólido se pueden usar para seleccionar los péptidos que se unen a ellas. Este procedimeinto revela un número de péptidos que se unen al selector y que a menudo muestran una secuencia de aminoácidos consenso habitual. La amplificación biológica de miembros seleccionados de la biblioteca y la secuenciación permite la determinación de la estructura primaria del(los) péptido(s).

El ligadno peptídico identificado mediante expression en fagos con frecuencia interaccionan con sitio(s) de unión natural sobre la molécula diana y a menudo se asemejan al (los) ligando(s) natural(es) de la diana. Aunque este sistema a menudo se ha usado para identificar epítopos peptídicos reconocidos por los anticuerpos, también se ha usado con éxito para encontrar imitadores peptídicos de las moléculas de hidrato de carbono. El trabajo dirigido hacia el uso de imitadores peptídicos en lugar de antígenos de hidratos de carbono ha sido revisado por Kieber-Emmons et al, 1998). La capacidad demostrada de un péptido para imitar un determinante de hidrato de c arbono indica que, aumque la imitación se consigue usando aminoácidos en lugar de azúcares, se puede reproducir el patrón de especificidad.

Se realizó una primera detección selectiva con la biblioteca de partida amplificada de péptidos de 15 unidades. Se encontraron varios clones positivos en la unión al anticuerpo HNK-1. En la detección selective inicial con HNK-1, los fagos unidos se eluyeron mediante desplazamiento de pH, de modo que no hubo diferenciación entre el fago unido específicamente y no específicamente. Por tanto, se realizó una detección selectiva en la que el anticuerpo HBK-1 se biotinila con un agente de acoplamiento que incorpora un puente disulfuro. El anticuerpo biotinilado se reacciona previamente con el tubo revestido con estreptavidina, se elimina el anticuerpo no unido mediante lavado y el inmunotubo se usa para la detección selectiva. Como alternative, los fagos reaccionan con el anticuerpo biotinilado en solución y, después, el complejo biotinilado se deja reaccionar con un inmunotubo revestido con estreptavidina. En cualquier caso, después de eliminar el fago no unido mediante lavado, el fago unido se eluye mediante la adición de diiotreitol, que libera el anticuerpo y el fago unido (Griffiths y col, 1994). Además, estas detecciones selectivas se realizaron en presencia de suero de ratón (12,5 %). Esto proporciona un gran exceso de IgM de ratón sobre el anticuerpo HNK-1, de modo quese debería suprimir la unión no específica al anticuerpo HNK-1.

En algunos casos, cuando el fago en solución se dejó reaccionar con anticuerpo “pre-inmovilizado” se obtuvo un incremento del número de fagos unidos tras la tercera o la cuarta ronda de selección. Los clones analizados se unieron también a la IgM de ratón total. En un experimento final, varios procedimientos se compararon en paralelo. Se dejó que los fagos se unieran al inmunotubo revestido con HNK-1 o a HNK-1 biotinilado en solución y en presencia o ausencia de suero de ratón. Se observó un enriquecimiento usando el anticuerpo pre-revesitod, pero los clones seleccionados s eunieron, de nuevo, a IgM de ratón total, aunque también se unieron a HNK-1. Es interesenta destacar que el fago seleccionado también fue reactivo al anticuerpo L2-412, que reconoce el mismo hidrato de carbono que HNK-1, aunque HNK-1, requiere un grupo sulfato terminal, mientras que el anticuerpo L2-412 reconoce el hidrato de carbono con o sin un grupo sulfato.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Materiales

Se puede usar una biblioteca de péptidos de 15 unidades y células E.coli K91 Kan. La biblioteca de 15 unidades se construyó en el vector fUSE5, un derivado del fago filamentoso fd-tet (Scott y col., 1990). Este vector porta un gen de resistencia a tetraciclina para permitir la selección. Los fagos filamentosos no matan a sus huéspedes; por tanto, las células infectadas se convierten en resistentes a tetraciclina, siguen creciedo y secretan partículas progenie. La cepa

K91Kan de E.coli es un derivado de lambfa de K38 (Lyons et al, 1972), tiene un genotipo cromosómico thi y porta un gen de resistencia a kanamicina (mkh) (Smith y col., 1993; Yu y col., 1996). Los péptidos y el péptido (10 mg) acoplado a BSA activada con SPDP (60 mg) mediante una cisteína en C-terminal se puede obtener de, por ejemplo, ANAWA AG, 8602 Wangen, Suiza. La tetraciclina y la kanamicina se pueden adquirir en Sigma. B. Becker purificó en el laboratorio de los inventores los glicolípidos L2/HNK-1 de la cola de caballo de vaca. Los azúcares sulfatados, SO3-Glc-AGal-alilo, fueron proporcionados amablemente por el N. Nifant’ev, Zelinsky Institutre of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscú.

Anticuerpos

La caracterización y purificación del anticuerpo monoclonal (AcMo L2-412) producido en ratas y que reconoce el hidrato de carbono HNK-1 han sido descritos por Noronha, A. y col., Brain Res. 385, 237-244 (1986)). El anticuerpo L2-412 se ha depositado en el DSMZ - Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, según los términos del Tratado de Budapest, y se le ha dado el nombre de anticuerpo HNK-1 y está disponible como TIB200 en la American Type Culture Collection (ATCC). La IgG policlonal de rata y HRP-estreptavidina se obtuvieron en Sigma (EE.UU.). El anticuerpo policlonal anti-M13/HRP se adquirió en Pharmacia Biotech. El anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP dirigido contra IgG de rata se obtuvo de Jackson Immunoresearch.

Amplificación de la biblioteca de partida

La biblioteca primaria que codifica los péptidos de 15 unidades se amplificó en base al procedimiento de Smith (Smith y col, 1992) del siguiente modo:

La noche antes de necesitar las células, se inocularon 2 ml de medio LB (L Bacto-Triptona, 5 g/l de NACl, 5 g/l de extracto de levadura), que contiene 100 g/ml de kanamicina, con células K91Kan y se agitaron durante la noche a 37 ºC. Se preparó un matraz de 1 l que contiene 100 ml de caldo Terrific (12 g de Bacto-Triptona, 24 g de extracto de levadura, 5,04 g de glicerol (4 ml) se añadieron a 900 ml de agua y se sometieron a autoclave en porciones de 90 ml; a cada porción de 90 ml se añadieron antes de usar 10 ml de tampón de fosfato potásico (KH2PO4 0,17M, KH2PO4 0,72M, no se requiere ajuste de pH).

En 100 ml de caldo Terrific se inoculó 1 ml del cultivo durante la noche de células K91kan y se agitó enérgicamente hasta que la DO600 de una dilución a 1:10 alcanzó 0,2. Después, la agitación se ralenticó durante 10 minutos para permitie la regeneración F-pili y al matraz se añadieron 10 l de la biblioteca de partida; la agitación lenta continuó para permitir la adsorción. Después, el cultivo se transfirió a 1 l de LB que contiene 0,22 g/ml de tetraciclina y se dejó agitar enérgicamente durante 35 minutos a 37 ºC. La concentración de tetraciclina se ahistó a 20 g/ml y se tomó un alícuota para determinar el título. Los fagos se titularon (título recuperado) sembrando las células infectadas sobre el medio de tetraciclina y contando el número de colonias resistentes a tetraciclina. Una unidad infecciosa definida de este modo se denomina unidad transformante (UT) y la infectividad es la proporción del número de UT a un número de partículas físicas. Normalmente se eliminó un alícuota de 50 l del cultivo y se diluyó con LB que contiene 0,2 g/ml de tetraciclina (intervalo de dilución fue 103-105). Una alícuota de 200 l de ada dilución se extendió sobre una palca de agar que contenía 40 g/ml de tetraciclina y 100 g/ml de kanamicina, se incubó durante la noche a 37 ºC. Las colonias se contaron al día siguiente. En esta etapa, el título de colonias resistentes a tetraciclina deberá ser de aproximadamente 107/ml. El resto del cultivo se agitó enérgicamente durante la noche.

A la siguiente mañana, el sobrenadante diblemente aclarado obtenido tras 2 etapas de centrifugación (4.000 x g, 10 min, 4 ºC y 10.500 x g, GSA, 10 min, 4 ºC) se precipitó durante la noche a 4 ºC añadiendo 0,15 volúmenes de solución de PEG/NaCl (polietilenglicol al 16,7 % en solución de NaCl 3,3M). Los fagos precipitados recogidos tras la centrifugación (10,500 x g, GSA, 40 min, 4 ºC) se disolvieron en 10 ml de TBS (Tris-HCl 50 mM, pH7,5, NaCl 150 mM) y se realizó una segunda precipitación añadiendo ,15 volúmenes de solución de PEG/NaCl a la suspensión de fagos e incubando durante 1 hora en hielo. En esta etapa debería se revidente un precipitado pesado.

El sedimento obtenido tras la centrifugación (14.500 x g, SA600, 10 min, 4 ºC) se volvió a disolver en 10 ml de TBS y se transfirió a un vaso Tadeo con 4,83 g de CsCl. El vaso se volvió a tarar y se añadió TBS a un peso neto de 10,75

g. Esto debería dar 12 ml de una solución al 31 % w/v de CsCl (densidad 1,30 g/ml); la solución se centrifugó 48 horas a 150.000 x g a 5 ºC en un rotor SW41 (Beckman). Con la ayuda de una fuente de luz visible fuerte se pudo ver una banda no floculenta de color azulado claro (que contiene los fagos amplificados) sobre una banda estrecha blanca opaca floculenta (que probablemente deriva de PEG). La banda del fago se recogió aspirando primero lentamente el fluido sobre la banda del fago y, después, usando una pipeta, la banda del fago se retiró evitando lo más posible la banda floculenta debajo. Después, la banda del fago se liberó a un frasco de centrífiuga de policarbonato, que se cargó hasta el cuello con TBS y se centrifugó en un rotor Ti70 (279’000 x g, 4h, 5°C) y se resuspendió en 2 ml de TBS por 1 l de cultivo. Los fagos se pueden almacenar de forma estable en esta forma en un refrigerador.

Después, la biblioteca amplificada se tituló (título final) del siguiente modo: Se prepararon varias diluciones del fago en TBS/gelatina (0,1 g de gelatina en 100 ml de TBS) que cubren el intervalo de dilución de 107 a 1010. A continuación, se usaron 10 l de cada una de estas diluciones para infectar 10 l de células K91kan preparadas como se ha descrito al principio de esta sección y cada mezcla de dilución se incubó 15 minutos a temperatura ambiente (TA) para dejar que el fago infecte las células concentradas. Se añadió un ml de LB que contiene 0,2 g/ml de tetraciclona y se incubó durante 30 minutos a 37 ºC en un agitador-incubador. Después, las células infectadas se extendieron (200 l) sobre una placa de agar que contiene 40 g/ml de tetraciclina y 100 g/ml de kanamicina como se ha descrito anteriormente (título recuperado).

Procedimiento de detección selectiva

A. Unión directa

La biblioteca de fagos se barrió usando inmunotubos ((Nunc., Maxisorb) revestidos con mAbL2-412. Los tubos se revistieron incubando durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo L2-412 A 10 g/ml de proteína en PBS (1 ml de volumen total) para la primera ronda y 1 g/ml para la segunda y tercera ronda de detección selectiva. Después de bloquear 2 horas con Blotto (5 % de leche seca sin grasa, 0,05 % (v/v) Tween 20 en PBS) A 4 ºc. 1011 unidades transformantes (en un volumen de 250 l) de la bilioteca de fagos por inmunotubo se jaron unir 1 hora a 37 ºC en una cámara rotatoria. Para las rondas segunda y tercera, los facgos se preincubaron 1 hora con 100 g/ml de IgG de rata antes de añadirlos al inmunotubo, con el fin de disminuir el número de aglutinantes no específicos. Después de la recuperación de los fagos no unidos (de los que se eligió el fago control negativo), los tubos se lavaron 10 veces con PBS-0,05% (v/v) Tween 20 y eluyeron con glicina 0,1M a pH 2,2 (0,5-1 ml de volumen total), 1º in a 4 ºC. Los fagos eluidos se neutralizaron con Tris 1,5M a pH 9 y después se usaron para infectar 0,5-1 ml de células E. coli K91 Kan en fase log 15 minutos a temperatura ambiente. Las bacterias infectadas se transfirieron a 20 ml de LB que contiene 0,2 g/ml de tetraciclina y, después de extraer un alícuota para la determinación del título (título recuperado), se dejaron crecer durante la noche como se ha descrito en la sección anterior. Después, el eluado amplificado se centrifugó dos veces (10 min, 3660 x g, 10 min, 14.500 x g, SA600) y el sobrenadante final se precipitó con 0,15 volúmenes de PEG/NaCl durante la noche a 4 ºC. El fago se sedimentó (15 min, 14,500 x g, SA600) y se disolvió en 1 ml de PBS pipeteando y agitando en vórtex, se microcentrifugó 1 minuto para sedimentar la materia insolubel y se precipitó en PEG de nuevo durante al menos 1 hora a 4 ºC. En esta etapa se debería ver un precipitado pesado. El sedimento obtenido tras 10 minutos, la microcentrifugación se disolvió por último en 200 l de PBS que contienen 0,02 % de azida. Este eluato amplificado se puede almacenar y guardar a 4 ºC. La biblioteca se sometió a tres rondas de amplificación y selección.

El mismo procedimiento se usó para la detección selectiva de HNK-1 con el anticuerpo HNK-1, a excepción de que se incluyó un exceso de 100 veces de la IgM de ratón para disminuir la unión inespecífica.

Los fagos se titularon (título final) como se ha descrito. Las colonias se contaron al día siguiente y el rendimiento de la detección selectiva se calculó dividiendo el título recuperado por el título (entrante) de la ronda anterior.

B. Detección selective con anticuerpo biotinilado

Para realizar esta detección selectiva se usaron dos procedimientos, ambos siguiendo los protocolos de G. Smith (protocolos no publicados). El anticuerpo HNK-1 se biotiniló como se describe más adelante usando NHS-SS-biotina. NHS-SS-biotina une la biotina a la proteína a través de un puente disulfuro, con el fin de dejar que el grupo de biotina se elimine después mediante incubación con ditiotreitol (DTT). El anticuerpo L2-412 se biotiniló de forma similar como se describe más adelante. En el procedimiento A, primero se deja que el anticuerpo biotinilado se una al inmunotubo revestido con estreptavidina, que después se usa para barrer el fago entrante. En el procedimiento B, el anticuerpo biotinilado se preincubac on el fago en solución y la mezcla de reacción se deja unir (unos pocos minutos) al inmunotubo revestido con estreptavidina.

En el procedimiento A, los inmunotubos se revistieron con 10 g/ml de estreptavidina en PBS, 1 ml de volumen total (se humidificó la totalidad de la superficie del tubo), durante la noche a 4 ºC en un rotador. Se descartó la estreptavidina y el tubo se cargó con solución de bloqueo, PBS que contiene 0,5 % de BSA (p/v), durante 2 horas a 4 ºC. Después de lavar 6 veces con PBS-0,05 % (v/v) de Tween 20 (PBST), se añadió el anticuerpo biotinilado. Normalmente, se añadieron 3 g del HNK-1 biotinilado o 5 g del anticuerpo L2-412 biotinilado en 400 l de la solución de bloqueo. Se dejó que el anticuerpo se uniera durante al menos 2 horas (o durante la noche) a 4 ºC en el rotador. Después de lavar 6 veces con PBS-T, 1010 fagos de la biblioteca de partida de 15 unidades, en 400 l de solución de bloqueo se dejaron unir al correspondiente inmunotubo revestido con anticuerpo durante 4 horas a 4 ºC en el rotador. En el procedimiento B, durante el revestimiento de los inmunotubos, 1010 fagos se preincubaron durante la noche con 3 o 5 g de HNK1 o L2-412 biotinilado, respectivamente. Después, se dejó que el anticuerpo biotinilado se uniera al inmunotubo revestido durante 10 minutos a 4 ºC en el rotador. En ambos procedimientos los tubos se lavaron 10 veces, después se eluyeron los complejos fago-anticuerpo con DTT 20 Mm (0,5 ml de volumen) en PBS 1-5 minutos, a temperatura ambiente. La amplificación y la titulación se realizaron como se ha descrito en lo que antecede. La biblioteca se sometió a cuatro rondas de amplificación y selección.

Detección selectiva con ELISA

A. Unión directa para la detección de clones positivos

Colonias individuales resistentes a tetraciclina y kanamicina se cultivaron en LB con 20 g/ml de tetraciclina en placas de 96 pocillos (Nunc) durante la noche a 37 ºC (300 l/pocillo), después se centrifugaron 10 minutos a 3000 rpm en centrífuga de Jouan y el sobrenadante (100 l) se incubó durante 2 horas en otra placa de 96 pocillos previamente revestida con mAbL2-412 (100 l, g/ml durante la noiche a 4 ºC) y se bloqueó mediante incubación durante 2 horas con PBS-0,5 % (p/v) de BSA. Después de lavar 5 veces, la unión de los fagos se detectó mediante incubación con anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP ((Pharmacia, Biotech.) durante 1 hora a una dilución de 1:2000. La reación de la peroxidasa se inició mediante la adición de 100 l de desarrollador que contiene 0,01 % de peróxido de hidrógeno y 0,1 % (p/v) de ácido zino-bis(3-etilbentiazolin-6-sulfónico)-sal diamonio (ABTS, Boehringer Mannheim) en tampón HRP (acetato sódico 0,1m, NaH2PO4, 0,05M, Ph ajustado a 4,2 con ácido acético). La absorbancia del producto de reacción coloreado se determinó a 405 nm en un Multiscan TitertekPlus (Flow, Suiza). En paralelo, cada clon se analizó también en placas de 96 pocillos revestidas con IgG de rata (100 l, 1 g/ml en PBS y se bloquearon de forma idéntica durante 2 horas). Las bacterias productotas de los clones d eunión seleccionados (es decir, los fagos positivos), que eran ligantes positivos para el mAbL2-412 pero que no s eunían a la IgG de rata se sembraron en placas con agar que contenían medio LB con 40 g/ml de tetraciclina y 100 g/ml de kanamicina. Se escogieron dos colonias individuales y se volvióa analizar la positividad hacia el mAb L2-412. Las colonias positivas únicas se almacenaron en 40 % de glicerol a -80 ºC.

B. Unión competitiva

Las placas de microtitulación (Nunc) se revistieron con los glicolípidos L2/HNK-1 (50 l, 1 g/ml, disueltos en EtOH) y se dejaron secar durante la noche. Bloquenado los pocillos durante 2 horas con 0,5 % (p/v) de BSA sin ácdos grasos en PBS, una concentración limitante de L2-412, previamente determinada, se preincubó con diluciones por 2 sucesivas del inhibidor, comenzando a una concentración de 2,2 mM para el péptido libre, 5 mM para el azúcar SO3 y 1012 fagos positivos y negativos (los fagos negativos se clonaron a partir de la fracción no unida de la primera ronda de detección selectiva). Después, la mezcla preincubada se añadió al pocillo en 100 l y s eincubó durante 1 hora a TA. Después d elavar 5 veces con PBS-0,05 % (V/V) de Tween 20, la unión del AcMo L2-412 se detectó mediante incubación con IgG anti-rata de cabra conjugada con HRP durante 1 hora, seguido de la reacción de color descrita anteriormente. El porcentaje de inhibición de la unión del AcMo L2-412 al sustrato en presencia del inhiubidor se calculó con referencia al valor control obtenido en ausencia de inhibidor (0 % de inhibición).

C. Inhibición de la unión

Las placas de microtitulación se revistieron durante la noche a 4 ºC con laminina (Gibco/BRL), (10 g/ml, 100 l), o mAbL2-412 (1 g/ml, 100 l) en PBS. Todas las etapas de reacción posteriores se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Dspués de bloquear con PBS + 0,5 % (P/V) de BSA, se añadieron 50 l de diluciones por 2 sucesivas del péptido acoplado a BSA ((ANAWA Ag, Suiza) comenzanco a una concentración de 30 M durante 1-2 horas a TA. Después se añadió un número limitante de fagos portadores del péptido de interés, previamente determinado, y se incubó durnate otra hora. Los fagos unidos se detectaron con el anticuerpo antiM13/HRP como se ha descrito en la sección de detección selectiva con ELISA. El experimento análogo se realizó con L2-412 inmovilizada en lugar de laminina, el péptido acoplado a BSA que compite con la unión de los fagos positivos al anticuerpo L2-412.

D. Unión dircta a laminina

Las placas de microtitulación se con 100 l del AcMo L2-412 o con laminita, como se ha descrito anteriormente, y se añadieron 100 l del péptido biotinilado acoplado a BSA comenzando a una concentración de 30 M, se incubaron 2 horas a temperatura ambiente y se detectaron con HRP-estreptavidina.

Secuenciación de ADN

Los clones positivos, escogidos de las reservas congeladas en glicerol, se cultivaron durante la noche a 37 ºC en medio LB que contiene 20 g/ml de tetraciclina. El ADN monocatenario se purificó como describe G. Smith (1992) usando el procedimiento de doble giro, se secuenció con el kit de secuenciación de ciclos Thermo Sequenase (Amersham y se cargó sobre un secuenciador automático (B10 Genetic Analyzer, Applied Biosystems Inc.).

Biotinilación

La biotinilación del anticuerpo HNK-1, BSA y el péptido acoplado a BSA se realizó usando Sulfo-NHS-biotina (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una proporción molar de 10 a 1 para el anticuerpo y de 5 a 1 para BSA o los péptidos acoplados a BSA. El producto biotinilado se dializó durante la noche contra PBS a 4 ºC.

Experimentos de sobrecrecimiento de neuritas y cultivo

Preparación de neuronas motoras

Los cubreobjetos se esterilizaron cociéndolos durante la noche a 160 ºC y se revistieron mediante una incubación durante la noche con poliornitina (Sigma, 1,5 g/ml en aguua) a 4°C. Después, los cubreobjetos se lavaron 3 veces con agua y después se revistieron con sustancias de ensayo del siguiente modo: 1) los conjugados BSA-péptido se disolvieron a 100 g/ml en PBS, se sonicaron 1 minuto con un sonicador de sobremesa y se centrifugaron en una microfuga durante 20 minutos a velocidad máxima. La concentración proteica del sobrenadante se determinó cada vez con el método de Bradford (Bradford y col., 1976). Después, 120 l del complejo se mezclaron con 280 l de solución de colágeno (20 g/ml de colágeno en PBS) y se aplicaron 100 l sobre cada cubreobjetos durante la noche a 4 ºC; 2). Como control negativo, el BSA sin tratar se usó en lugar del complejo péptido-BSA; 3) los glicolípidos portadores del hidrato de carbono L2/HNK-1 se disolvieron en etanol a una concentración de 10 g/ml y a 1 ml de la solución de colágeno descrita anteriormente se añadieron 80 l. Para el revestimiento se usó un volumen de 100 l. Los cubreobjetos se colocaron por cuadruplicado en una placa de 24 pocillos (NUNC) y, por último, se lavaron 3 veces antes de sembrar las células en placas (los cubreobjetos nunca se dejaron secar).

Las células neuronales motoras se prepararon como describen Arakawa (1990) a partir de médula espinal de embriones de pollo de 6 días de edad disociados en 1 ml de solución helada que contiene 0,05 % de ADNasa 1 (Sigma), 0,1 % de BSA en medio L-15 (Life Technologies). Las células se colocaron en capas sobre 2 ml de metrizamida 6,8 % (Fluka) en L-15 y se centrifugaron 15 minutos a 500 x g, 4 ºC. Las células recogidas de la interfaz metrizamida/medio se diluyeron en 5 ml de L-15 y se cargaron sobre una almohada de 4 ml de BSA (4 % de BSA en IL-15) y se centrifugaron 10 minutos a 300 x g a 4 ºC. El sedimento se resuspendió en 0,5-1 ml de medio completo (NaHCO3 22 mM, glucosa 22 mM, 1 % de penicilina y estreptomicina (Gibco) en L-15 suplementado con suplemento de 1 % de N2 (Gibco) y 15 g/ml de extracto muscular de pollo (3,5 mg/ml). 30.000 células se sembraron en placas sobre cubreobjetos revestidas con poliornitina/colágeno en presencia o ausencia del péptido acoplado a BSA y se incubaron en una cámara humidificada a 37 ºC y 5 % de CO2. La longitud y el número de neuritas se midieron y se contaron las neuronas aisladas que no estaban en contacto con otras células y con al menos un proceso tan largo como el diámetro del cuerpo celular tras 24 horas de cultivo.

Preparación y cultivo de neuronas ganglionares de la raíz dorsal

Los cubreobjetos se prepararon de forma idéntica que para los experimentos con neuronas motoras. Las neuronas ganglionares de la raíz dorsal se aislaron de huevos de pollo de 11 días embrionario. Los ganglios se transfirieron en 1 ml de solución de digestión (0,05 % de tripsina, 0,01 % de ADNasa 1 en medio HBSS) y se incubaron 15 minutos a 37 ºC con resuspensión cada 2-5 minutos. Los ganglios se disociaron después en 1 ml de solución de disociación helada (0,05 % de ADNasa 1, 0,1 % de BSA en medio L15), se cargaron en 3 ml de una almohada de 4 % de BSA en un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugaron a 4 ºC, 600 x g durante 20 minutos. Las células se resuspendieron en 0,5 ml del medio completo descrito en la sección anterior. 20.000 células se añadieron a los pocillos que contienen un cubreobjetos y se dejaron crecer durante 18 horas en una cámara humidificada a 37 ºC y 5 % de CO2, la fijación y el análisis del sobrecrecimiento de neuritas se realizó como se ha descrito en la sección precedente.

Inmunohistología e inmunocitología

Inmunohistología

Se usaron criosecciones de nervio femoral de un ratón de 4 meses para buscar la unión del complejo péptido-BSA. Las secciones se trataron durante 1 h con 1% de H2O2, 0,5 % de seroalbúmina bovina (BSA) y 10 % de suero de cabra en PBS con el fin de reducir la actividad de peroxidasa endógena. Después, las secciones se incubaron durante la noche a 4 ºC con complejo péptido-BSA o BSA (1 mg/ml en PBS, 150 l/cubreobjetos) y después se lavaron 4 veces con PBS-0,01 % de Tween 20. Para la detección, se añadió anticuerpo anti-BSA (Sigma, dilución 1:16, 150 l/cubreobjetos) y se incubó durante la noche a 4 ºC. S añadió suero anti-conejo de cabra acoplado a HRP (1:2000) durante 1 hora en un volumen de 150 l por cubreobjetos. La reacción de color se desarrolló usando una dilución al 5 % de una solución madre de 4 mg/ml de 9-amino-3-etilcarbazol (AEC, Fluka) en N,N’-dimetilformamida en tampón acetato sódico 0,1M, pH 4,8, que contiene 0,1 % de H2O2. Para el control positivo se usó el anticuerpo L2-412 y el anticuerpo anti-rata de cabra acoplado a HRP. Se realizó un experimento similar usando el conjugado BSA-péptido biotinilado. Se usó una concentración de 50 g/ml para la incubación durante la noche y se añadió estreptavidina acoplada a HRP (1:2000) durante 1 hora. La reacción de color se desarrolló como se ha descrito en lo que antecede.

Inmunocitología

Los cubreobjetos se revistieron con poliornitina (1,5 g/ml), después con colágeno (20 g/ml) y 40.000 células se dejaron cultivar durante 40 horas a 37 ºC en CO2 al 5 % como se ha descrito anteriormente. Los cubreobjetos fijos se bloquearon después en 5 % de polvo de leche seca sin grasa en PBS durante 2 horas. Después de un extenso lavado con PBS-0,05 % de Tween-20, se añadió el conjugado BSA-péptido biotinilado a una concentración de 50 g/ml durante 4 horas. Después de otras seis etapas de lavado, la detección se realizó usando estreptavidina acoplada a HRP, 1:500, durante 1 hora. La detección del color fue como se ha descrito anteriormente para la inmunohistología. Las neuronas fijadas se fotografiaron a un aumento de 40 X. Las imágenes presentadas se procesaron para la rendición potenciada del color usando Adobe Photoshop.

A continuación se presenta una lista alfabética de las referencias citadas en este Ejemplo.

Chou, D., y Jungalwala, F. J. Biol. Chem. 268, 21727-21733 (1993).

Chou, D.K., y col., J. Biol. Chem. 261, 11717-25 (1986).

Griffiths, A. y col. (1994) EMBO J. 13:3245-3260.

Kieber-Emmons, T. Immunologic Research 17, 95-108 (1998).

Lyons, L. y Zinder, N. (1972) Virology 49:45-60.

Scott, J.K. y Smith, G.P. (1990) Science 249:386-390.

Smith G.P. y Smith, J.K. (1993) Methods Enzymol. 217:228-257.

Yu, J. and Smith, G. (1996) Methods Enzymol. 267:3-27.

Ejemplo 3 ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS REACTIVOS A OLIGODENDROCITOS ESTIMULAN LA

REMIELINIZACIÓN EN UN MODELO DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

La estimulación de la remielinización, un objetivo principal de un tratamiento eficaz para las enfermedades desmielinizantes, tiene el potencial de proteger los axones vulnerables, incrementar la velocidad de conducción y mejorar los déficit neurológicos. Las estrategias para estimular la remielinización se han centrado en el transplante de oligodendrocitos (OL) o reclutar células mielinizantes endógenas con factores tróficos. Las terapias basadas en inmunoglobulina (Ig) usadas de forma rutinaria para tratar diversas enfermedades neurológicas y autoinmunitarias, subraya nuestro enfoque para potenciar la remielinización. Los inventores han aislado dos anticuerpos monoclonales (AcMo) dirigidos contra antígenos de superficie de OL que estimularon una remielinización significativa en un modelo mediado por virus de esclerosis múltiple (EM). Cuatro AcMo humanos adicionales de unión a OL no estimularon la remielinización. Los AcMo humanos fueron tan eficaces como la inmunoglobulina intravenosa humana (IVIC), un tratamiento que se ha demostrado que tiene eficacia en la EM, y se unieron a la superficie de los OL humanos, lo que sugiere un efecto directo de los AcMo sobre las células responsables de la mielinización. Como alternativa, dirigir los AcMo humanos a áreas de patología del sistema nervioso central (SNC) puede facilitar la opsonización de los residuos de mielina que permite que progrese la reparación. Los AcMo humanos se aislaron de los sueros de individuos con una forma de gammapatía monoclonal. Estos individuos portan un nivel elevado de proteína monoclonal en sangre sin detrimento, que proporciona soporte a la creencia de que la administración de estos AcMo como terapia es segura. Los resultados de los inventores son 1) consistentes con la hipótesis de que los AcMo reactivos al SNC, parte del repertorio de Ig normal en seres humanos, pueden ayudar a reparar y proteger al SNC de lesiones inmunitarias patogénicas y 2) retar más allá la premisa de que los AC se unen a los OL son necesariamente patogénicos.

INTRODUCCIÓN

La potenciación de la remielinización y la protección de la lesión axonal son importantes objetivos terapéuticos en el tratamiento de trastornos inflamatorios desmielinizantes del SNC, tal como la EM. Se puede producir remielinización en las placas de EM, pero es limitada (1,2) incluso cuando haya progenitores de OL presentes en el adulto (3,4). Se han analizado una serie de estrategias terapéuticas para estimular la remielinización en animales experimentales. El transplante de OL (5) o sus progenitores (6) en tejido desmielinizado produce mielina nueva. Los progenitores de OL transplantados también pueden remielinizar las lesiones desmielinizadas en el SNC adulto (7) y migran hacia un área de daño cuando se colocan en las proximidades de la lesión (8). Sigue habiendo problemas sin resolver concernientes a la supervivencia de los progenitores de OL transplantados en el SNC intacto de adulto y su capacidad para dirigirlos a áreas de patología de la mielina (9). No obstante, si las lesiones del SNC se pueden abordar quirúrgicamente y los axones siguen intactos, el transplante de células gliales puede ser una terapia viable para mejorar el rendimiento funcional (10).

La administración in vitro de factores de crecimiento o tróficos induce la expansión de los progenitores de OL (11, 12)

o estimula los OL maduros para desdiferenciar y, posteriormente, reiniciar un programa de mielinización (13, 14). La administración in vivo de factores tróficos mediante fibroblastos sometidos a ingeniería genética al SNC dañado estimula la formación de brotes axonales y la proliferación de OL (15). Sigue habiendo obstáculos para la terapia con factor trófico in vivo, específicamente en la determinación de la concentración del factor local biológicamente relevante y el potencial de los papeles pleiotrópicos de la mayoría de los factores tróficos administrados a concentraciones altas.

Como alternativa, el laboratorio de los inventores propone reparar la patología del SNC y potenciar la remielinización endógena usando Ig de unión a SNC (16), generando una respuesta reparadora natural que ya puede regularse por incremento tras la desmielinización. La terapia con Ig puede adaptarse rápidamente y analizarse como tratamiento para la enfermedad desmielinizante humana (17,18). La premisa de nuestro enfoque es que las células capaces de remielinización y los factores necesarios para sostener su crecimiento y diferenciación están presentes en el SNC desmielinizado, pero su capacidad para producir la mielina es limitada. La heterogeneidad emergente de la patología y la diseminación de los OL en la población de EM (19) sugiere que, en la práctica, el tratamiento de la enfermedad desmielinizante humana puede requerir combinaciones de varios abordajes terapéuticos basados en requisitos individuales.

Los inventores han usado un modelo mediado por virus de desmielinización para desarrollar una terapia basada en Ig. Cuando el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) se inocula intracerebralmente en cepas susceptibles de ratones, el TMEV induce la desmielinización del SNC progresiva inmunomediada clínica y patológicamente similar a la EM (20). La eficacia de las terapias en la EM humana es similar a la observada en el modelo de TMEV (21), lo que la convierte en una plataforma importante para el diseño de ensayos clínicos. Un AcMo de ratón contra el homogeneizado de la médula espinal, denominado SCH94.03, potencia la remielinización en el modelo de TMEV (22). SCH94.03 es un AcMo de IgMk de ratón polirreactivo que se une a la superficie de los OL (23). SCH94.03 también potencia la tasa de remielinización espontánea del SNC tras la desmielinización inducida por lisolecitina (24) y disminuye la recaída en la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) (25). Los AcMo de IgMk de ratón adicionales de unión a OL, varios de los cuales son marcadores de rutina para el linaje de OL, también estimulan la remielinización del SNC (26).

Dado que los AcMo IgM de ratón estimulan la remielinización, los inventores han postulado la hipótesis de que la IgM policlonal humana sería un tratamiento más eficaz de enfermedad desmielinizante que la IVIg una terapia establecida para los trastornos mediados por el sistema inmunitario (27). El tratamiento de los ratones infectados crónicamente con TMEV con IgM policlonal humana dio como resultado la potenciación de la remielinización en comparación con la IVIg También se identificaron dos AcMo IgM humanos, usando una estrategia independiente del antígeno, que estimulan la remielinización hasta un grado equivalente o superior que la IgM policlonal humana. Los inventores sugieren que los AcMo que estimulan la remielinización pueden ser una terapia eficaz de aplicación sencilla para enfermedades desmielinizantes humanas. Los AcMo humanos se pueden aplicar fácilmente a ensayos clínicos, se pueden producir sin agentes infecciosos y pueden aliviar la escasez nacional y los elevados costes de la IVIg. Un AcMo humano eficaz que estimula la remielinización también puede simplificar la investigación del mecanismo de acción de las terapias inmunomoduladoras.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Anticuerpos humanos y su aislamiento

La IgM humana normal purificada del plasma combinado de más de 2500 donantes sanos se obtuvo de S. V. Kaveri (28). La pureza de IgM fue superior al 90 % confirmado mediante SDS-PAGE. La IgG humana combinada de donantes sanos denominada clínicamente IVIg se adquirió en Miles Inc. (Elkhart, IN).

Las muestras de suero humano se obtuvieron de la clínica de disproteinemia bajo la dirección del Dr. Robert A. Kyle, Mayo Clinic, y se escogieron únicamente por la presencia de un pico clonal de Ig superior a 20 mg/ml. Los sueros procedieron de 102 pacientes con una amplia variedad de afecciones caracterizadas por picos de IgG o IgM monoclonales en suero, incluidas macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiple, linfoma, gammapatía monoclonal de significado no determinado. Los sueros se dializaron frente a agua, los precipitados recogidos mediante centrifugación (14.000 rpm/30 minutos) y se disolvieron en PBS. Las soluciones se centrifugaron y se sometieron a cromatografía en columna de Superosa-6 (Pharmacia, Upsalla, Suecia). Las fracciones de IgM se combinaron y analizaron mediante SDS-PAGE. Las concentraciones se determinaron mediante tinción en gel con densitometría Sypro Orange (Molecular Probes, Eugene, OR). Las soluciones de IgM se esterilizaron mediante filtración a la crioconservaron.

Cultivo de células OL e inmunocitoquímica

Se prepararon hemisferios cerebrales de ratas Sprague-Dawley Holtzman P0-P2 para cultivos mixtos de células gliales primarias como se ha descrito (29) y se cultivaron durante 9 días in vitro. Los progenitores de OL de rata se aislaron como se ha descrito (30). Los OL humanos adultos se prepararon a partir de biopsias del lóbulo temporal obtenidas de pacientes sometidos a resección terapéutica por epilepsia intratable. El tejido no contenía el foco epiléptico y tenía una citoarquitectura normal cuando se analizó por el Departamento de Patología Quirúrgica. Las células gliales adultas aisladas como se ha descrito (31) y se sembraron en cubreobjetos de múltiples pocillos de plástico (Becton Dickenson) revestido con poliornitina (Sigma) y laminina (Life Technologies) o de vidrio (Fisher Scientific) en un medio definido de DMEM/F12 suplementado con biotina (0,01 mg/ml), triyodotironina (15 nM), BAS al 0,5 % (todos de Sigma), N2, 1 % de pen/estrept. (ambos de Life Technologies) de PDGF AA humano recombinante (R & D Systems, Minneapolis, MN). La tinción de la superficie celular se realizó a 4 ºC durante 12 minutos sobre células no fijadas después de bloquear con EBSS tamponado con HEPES (E/H) con 5% de BSA. Todos los Ac humanos se usaron a 10 mg/ml. La tinción intracelular para la proteína básica de la mielina usando antisueros policlonales de ratón (Boehringer Mannheim) se realizó a temperatura ambiente tras la fijación con 4 % de paraformaldehído y permeabilización durante 5 minutos con 0,05 % de saponina. Los Ac primarios se detectaron usando Ac secundarios conjugados de forma fluorescente (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Las monocapas celulares se montaron en glicerina al 90 %/PBS con 2,5 % de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano para prevenir la desaparición y 0,1 g/ml de bisbenzimida (ambos de Sigma) y se vieron con un microscopio epifluorescente Olympus Provis equipado con una cámara digital SPOT (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, MI).

Virus y Animales

La cepa Daniel de TMEV se usó para estos experimentos y se preparó como se ha descrito (32). Ratones SJL/J hembra de los Jackson Laboratories se usaron después de aclimatación de 1 semana. Se inyectó a los ratones de 4 a 6 semanas de edad por vía intracerebral 2 x 105 unidades formadoras de placas de TMEV en un volumen de 10 ml tiene como resultado una incidencia superior al 98 % de infección viral crónica. Los animales usados en este estudio se emplearon de 5 a 8 meses después de la infección y recibieron una única inyección intraperitoneal de Ig o PBS. Las dosis fueron 1,0 mg de IVIC o IgM policlonal humana o 0,5 mg de los AcMo humanos. Se sacrificó a los animales a las 5 semanas después del tratamiento con Ac para la evaluación morfológica; escogidos porque los estudios en modelos tóxicos de desmielinización indican que la remielinización del SNC está casi completa en este momento (33). Se cortaron secciones de médula espinal incluidas en plástico mediante una instalación de microscopia centralizada y se retornaron al laboratorio marcado con un código numérico. De este modo, las láminas se graduan para la remielinización de una forma enmascarada.

Transferencia de tipo western

El TMEV purificado (34) se separó mediante SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa. Después de bloquear con solución salina tamponada con Tris que contiene 5% de leche seca desgrasada y 0,05% de Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente, la membrana se incubó con Ig humana (10 g/ml) o Ac anti-TMEV policlonal de conejo (1:2000) durante 4 horas. Las Ig unidas se detectaron con AcMo anti-humanos de cabra biotinilados o anticuerpos anti-conejo de cabra biotinilados (ambos de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y azul de nitro-tetrazolio (BCIP/NBT, KPL, Gaithersburg, MD).

Cuantificación de la desmielinización/remielinización de médula espinal

Los inventores han desarrollado procedimientos para cuantificar la cantidad de desmielinización de médula espinal, remielinización y atrofia en ratones susceptibles usando secciones transversales incluidas en plástico teñidas con 4 % de parafenilendiamina (PPD) para visualizar la mielina (3 5, Figura 24A). Para obtener una muestra representativa de toda la médula espinal se cortaron secciones transversales de 1 mm de espesor de cada tercer bloque en serie de 1 mm, generando de 10 a 12 secciones transversales que representan la médula espinal entera. De cada sección transversal, el área de la sustancia blanca, la patología de la sustancia blanca, la remielinización de OL y la remielinización de las células Schwann (SC) se calcularon usando el sistema de análisis digital interactivo Zeiss (ZIDAS) y una cámara lúcida unida a un fotomicroscopio de Zeiss (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY). La sustancia blanca se trazó a un aumento de 40x. Las áreas de la patología de la sustancia blanca, definida como regiones de sustancia blanca con desmielinización o remielinización, se trazaron después a un aumento de 100x. Las regiones de la patología de la sustancia blanca a menudo contenían infiltración de macrófagos, inflamación y poca o ninguna tinción PPD (Figura 25 C, D, H). La suma de las áreas de la patología que contenía desmielinización primaria con o sin remielinización se determinó como medida de desmielinización total.

Las áreas de remielinización, bien OL o SC, se trazaron a un aumento de 250x. Los OL pueden remielinizar múltiples fibras axónicas y, por tanto, la remielinización de OL en vainas de mielina densamente empaquetadas, aunque finas, en comparación con los axones mielinados normalmente. Los SC pueden remielinizar sólo una única fibra axónica, lo que tiene como resultado vainas de mielina más espesar y un incremento del espacio entre las fibras axónicas en comparación con la remielinización de los OL. Los cuerpos y los núcleos de las SC se pueden observar adyacentes a los axones que han remielinizado. Las áreas totales se calcularon para cada ratón sumando todas las áreas trazadas desde cada uno de 10 a 12 secciones de la médula espinal por ratón.

El porcentaje de área de patología de la sustancia blanca de la médula espinal por ratón se obtuvo dividiendo el área total de la patología de la sustancia blanca por el área total de la muestra de sustancia blanca. El porcentaje de área de remielinización por ratón se obtuvo dividiendo el área de la remielinización de OL o SC por el área total de la patología de la sustancia blanca. Las medidas repetidas de la patología de la sustancia blanca y la reparación extensa de la mielina revelaron valores comparables que sólo difieren en un 1,5 %. Para determinar la validez del uso de 10 secciones transversales como representación de la remielinización a través de la médula espinal, se realizó una comparación usando 10 secciones transversales frente a las 32 secciones transversales de un único ratón infectado crónicamente. El análisis de 10 secciones transversales tuvo como resultado un valor de remielinización del área en porcentaje de 47,7 %, mientras que los datos de las 32 secciones transversales tuvieron como resultado un valor del 40,0 %. Cualquier valor habría indicado una remielinización significativa en nuestro ensayo.

RESULTADOS

IVIg humana y la IgM policlonal humana estimulan la remielinización del SNC en ratones infectados por TMEV

Los estudios clínicos en EM indican que IVIg puede ser parcialmente eficaz en la estabilización del curso de la enfermedad (18,36,37). Para determinar si la IVIC humana podría estimular la remielinización en el modelo de TMEV de EM, los ratones crónicamente infectados se trataron con una única inyección intraperitoneal de 1 mg de IVIg. Se administró una única dosis para evitar provocar una respuesta inmunitaria a la Ig extraña. La dosis total de Ig humana fue de aproximadamente 0,05 g/kg de peso corporal, un cuatro de la dosis total usada para el tratamiento con IVIg humana (18). Ratones adicionales se trataron con un único bolo de 1 mg de IgM policlonal humano. Tras el análisis de las médulas espinales, el porcentaje de área de remielinización de OL en ratones tratados con IVIg o IgM policlonal humana (Tabla 4, 14,15 % y 23,19 %, respectivamente) fue significativamente mayor que la remielinización OL espontánea observada en el grupo tratado con PBS (6,74%, p<0,05 para IgG, p<0,01 para IgM). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en las áreas de sustancia blanca o las áreas de patología de la sustancia blanca entre cualquier grupo de tratamiento o el grupo control con PBS. Los datos describe dos experimentos independientes de tratamiento de los grupos de 7 y 9 ratones con IVIg y los grupos de 7 y 10 ratones tratados con IgM policlonal humana. Los valores finales de la Tabla 4 incluyen sólo los animales que contenían al menos un 5 % de patología de la sustancia blanca.

Tabla 4. Remielinización del SNC en ratones tras tratamiento con Ac humanos

Tratamiento

Nº de ratones �?rea de sustancia blanca, mm2 �?rea de patología de la mielina, mm2 �?rea de remielinización de tipo SNC, mm2 �?rea de remielinización de tipo SNC, %

IVIg

10 8,60 ± 0,52 0,8 ± 0,10 0,13 ± 0,02 14,15 ± 2,38*

IgM humana

14 9,70 ± 0,43 1,21 ± 0,21 0,24 ± 0,04 23,19 ± 3,26†

sHIgM 1

4 9,34 ± 1,93 0,68 ± 0,07 0,03 ± 0,01 8,35 ± 3,73

sHIgM2

4 8,78 ± 0,70 0,87 ± 0,12 0,10 ± 0,01 11,37 ± 1,30

sHIgM 14

7 11,01 ± 0,60 1,13 ± 0,18 0,08 ± 0,03 8,41 ± 2,59

sHIgM 22

8 10,55 ± 0,41 1,16 ± 0,22 0,19 ± 0,05 17,06 ± 3,42*

sHIgM46

5 9,44 ± 0,36 0,66 ± 0,06 0,18 ± 0,04 27,12 ± 4,01 ‡

PBS

7 9,78 ± 0,60 1,20 ± 0,22 0,06 ± 0,02 6,74 ± 1,80

Los valores representan la media ± SEM. Se usaron ANOVA de una vía y una prueba t para comparar el porcentaje de área de remielinización de tipo SNC en ratones tratados con anticuerpos humanos con los ratones tratados con PBS. Dichos análisis revelaron *P < 0,05; †P < 0,01, ‡P < 0,001. La comparación de los ratones tratados con otros tratamientos reveló IgM policlonal humana P= 0,05; sHIgm 46 P < 0,05. Ninguna de las demás comparaciones fue 15 estadísticamente significativa. No se observaron diferencias en la remielinización de tipo SNC entre IgM policlonal humana, sHIgM 22 y sHIgM 46. El área de remielinización de SC de tipo de sistema nervioso periférico varió de 0 a 0,08 mm2. Esto correspondió a un porcentaje de área de 0,0 a 6,92 de remielinización de SC de tipo sistema nervioso periférico como una función de la patología de la mielina. No se observaron diferencias significativas en el área de la patología de la mielina en los diversos grupos de tratamiento o en comparación con el PBS o en la

20 remielinización de SC de tipo sistema nervioso periférico entre grupos.

El tratamiento con IgM humano policlonal tuvo como resultado más remielinización de OL que la observada en ratones tratados con IVIg (p= 0,05, Figura 25 A, B). Aproximadamente un cuarto del área total de la patología de mieloma se remielinizó en ratones tratados con IgM policlonal humana, que representa miles de axones envainados. De media, 1 mm2 dentro de las áreas de patología remielinizadas en confluencia (Figura 25B) correspondía a 46.000

25 a 125.000 axones remielinizados. Por tanto, la remielinización del SNC tras el tratamiento con Ig humana fue extensa. Había pocas células inflamatorias o macrófagos. En contraste, en ratones tratados con PBS, las áreas de patología de la mielina contenían pocos axones remielinizados (Figura 25H). Había signos de destrucción activa de mielina, como remolinos de mielina, células inflamatorias y macrófagos.

Como procedimiento adicional más rápido para juzgar la eficacia de un tratamiento para estimular la remielinización,

30 las 10 secciones de médula espinal representativas de un animal se analizaron para detectar la presencia de áreas de patología de la sustancia blanca que mostraron una reparación casi completa. Los inventores han definido la reparación completa como un área de patología de la sustancia blanca con axones remielinizados casi confluentes y sin células inflamatorias ni macrófagos (como en la Figura 25 B, F, G), un acontecimiento muy raro en la remielinización espontánea. Se observó a menos un área de reparación completa en cuatro animales tratados a

35 menudo con IVIg y en diez de catorce animales tratados con IgM policlonal humana. Los inventores han concluido que tanto la IVIg como la IgM policlonal humana estimulan la remielinización en comparación con el tratamiento con PBS y que la IgM policlonal humana es superior a la IVIg en cuanto a su capacidad para estimular la remielinización del SNC.

Los Ac humanos que se unen a los OL estimulan la remielinización del SNC en ratones infectados por TMEV. Todos 40 los AcMo de ratón previamente identificados que estimulan la remielinización del SNC se unen a los OL (23, 26). Para detectar AcMo humanos para analizar en el modelo de TMEV, en los AcMo humanos se analizó la capacidad

de unirse a la superficie de los OL de rata en cultivos mixtos de células glía primarias sin fijar. Los cultivos primarios establecidos a partir de cerebro de rata neonata contienen OL en varios estadios de diferenciación a los 9 días n vitro (38). Las fuentes de los inventores de los AcMo eran IgM monoclonales humanas derivadas de suero (sHIgMs) e IgG monoclonales humanas derivadas de suero (sHIgGs). Ninguno de 50 sHIgG se unió a OL de rata sin fijar, pero seis de 52 sHIgM se unieron a la superficie de los OL de rata marcados de forma conjunta con el AcMo anti-sulfatida 04 (39).

Los seis sHIgM de unión a OL se usaron para tratar los ratones infectados por TMEV. Los grupos de cinco animales recibieron, cada uno, una única inyección de 0,5 mg de AcMo humano. El porcentaje de área medio de remielinización de OL tras el tratamiento con sHIgM22 y sHIgM46 (Figura 25 F, G) estuvo, en ambos, significativamente por encima de los niveles de fondo atribuibles a remielinización espontánea. Los otros cuatro sHIgM de unión a OL estimularon la remielinización a niveles comparables o por debajo del nivel observado tras el tratamiento con PBS. Un segundo grupo de animales fue tratado con sHIgM22, sHIgM46 o PBS para confirmar las observaciones iniciales. SHIgM14 también se repitió como ejemplo de un AcMo humano que se unió a los OL, pero no estimuló la remielinización. Los datos combinados se presentan en la Tabla 1. Solo los animales que contenían al menos un 5 % de patología de la sustancia blanca total se incluyeron en el análisis estadístico.

El porcentaje del área más elevado de remielinización de OL se observó en los animales tratados con sHIgM46 (27,%), seguido de los animales tratados con sHIgM22 (17,%). El porcentaje del área de remielinización tras el tratamiento con sHIgM14 (8,41%) fue similar al observado tras tratamiento con PBS (6,74 %). Para analizar si cualquier sHIgM, con independencia de la especificidad antigénica, podría estimular la remielinización, los inventores estudiaron dos AcMo in vivo, que demostró ausencia de inmunorreactividad a los OL en cultivos primarios mixtos, sHIgM1 y sHIgM2 (Figura 25 C, D). El porcentaje del área de remielinización tras el tratamiento con sHIgM1 (8,3%), sHIgM2 (11,4%) no fue significativamente diferente de los grupos de tratamiento sHIgM14 o PBS (11,4%). En todos los grupos, las áreas de sustancia blanca y las áreas de patología de la sustancia blanca no fueron estadísticamente diferentes. En comparación con la remielinización observada en el grupo tratado con PBS, el porcentaje de área de remielinización tras el tratamiento con sHIgM46 o sHIgM22 tuvo como resultado valores p <0,001 y <0,05, respectivamente. El área de remielinización de SC de tipo del sistema nervioso periférico varió en los grupos de tratamiento de 0 a 0,08 mm2. Esto correspondió a valores de porcentaje de área de 0,0 a 6,92 de remielinización de SC como una función de la patología de la mielina. No se produjeron diferencias estadísticas en el porcentaje de área de remielinización de SC entre cualquier grupo de tratamiento.

Comparando el porcentaje del área de remielinización de OL observada tras el tratamiento con cualquier preparación policlonal o monoclonal humana reveló que sHIgM46 era estadísticamente superior a IVIg (p< 0,05), pero no a IgM policlonal humana. El porcentaje del área de remielinización de OL observada tras el tratamiento con sHIgM22 no fue diferente del observado tras tratamiento con IVIg, IgM policlonal humana o sHIgM46.

Cuando se analizaron las áreas de patología de la sustancia blanca con reparación completa, se observó al menos un área en cuatro de ocho animales tratados con sHIgM22 y en cinco de cinco animales tratados con sHIgM46. En contraste con esto, ninguno de los animales tratados con sHIgM1, sHIgM2, sHIgM14 o PBS contenía una única área de reparación completa.

Los AcMo humanos, pero no las Ig policlonales humanas, se unen a los OL humanos de rata.

Si los AcMo humanos van a ser una potencial terapia para estimula la remielinización en seres humanos, una reactividad frente a los antígenos de superficie sobre los OL humanos puede ser importante para apuntar a áreas de patología del SNC humano. Por tanto, los inventores han determinado si los AcMo de estimulación de la remielinización humana podrían unirse a los OL obtenidos del cerebro humano adulto. Los cultivos de células gliales humanas se establecieron a partir de biopsias del lóbulo temporal adulto y se inmunomarcaron con los AcMo humanos en varios puntos de tiempo en el cultivo.

Tres de los seis sHIgM que se unieron a la superficie de los OL en nuestra detección selectiva inicial también se unieron a OL humanos. Tras una semana en cultivo, los OL humanos positivos para sulfatada inmaduros morfológicamente se marcaron con sHIgM14 y sHIgM46, pero no con sHIgM22. A las 3 semanas en cultivo, los OL humanos positivos para sulfatida inmaduros morfológicamente se marcaron con sHIgM14, sHIgM22 y sHIgM46 (Figura 26 A, B, C). Tras 4 semanas en cultivo, casi todos los OL humanos positivos para MBP también se unieron a sHIgM22 y sHIgM46, pero la unión de sHIgM14 se redujo considerablemente (datos no mostrados).

Ni la IVIg ni la IgM policlonal humana se unió a la superficie de OL humanos en cultivo a ninguno de los tiempos analizados. No obstante, la IgM policlonal humana se unió con fuerza a los tractos de la sustancia blanca y varias de las poblaciones neuronales cuando se incubaron con láminas sin fijar frescas de SNC de roedores. La IVIg era completamente negativa en este ensayo de unión (datos no mostrados). SHIgM22 y sHIgM46, ambos estimularon la remielinización, y sHIgM14, que no estimuló la remielinización, también se unieron a la superficie de OL de rata positivos para la proteína básica de la mielina purificada (datos no mostrados).

Los inventores concluyeron que puede ser necesaria una afinidad por antígenos de OL, pero no es suficiente para que un AcMo humano estimule la remielinización. El hecho de que ambos AcMo humanos que estimulan una remielinización significativa se unen a OL humanos maduros diferenciados destaca el posible requisito de que los AcMo sean dirigidos c los OL adultos supervivientes para la función in vivo.

Para excluir la posibilidad de que las Ig o los AcMo humanos estimulen la remielinización neutralizando virus, en cada preparación se analizó la reactividad frente a antígenos de TMEV purificados mediante transferencia Western (34). Ninguna de las preparaciones de Ac humanos reaccionaron con las proteínas de TMEV; no obstante, la Ig policlonal de conejo producida contra el TMEV reaccionó fuertemente a cuatro proteínas de cápside viral (datos no mostrados).

Las células B periféricas se obtuvieron del individuo en el que se identificó sHIgM22. Se determinaron las secuencias de los dominios variables, cadena ligera y pesada, de sHIgM22. La región variable de la cadena ligera de sHIgM22 (número de registro en GenBank AF212992) pertenece al subgrupo I de las regiones variables de la cadena ligera humana. La región variable de la cadena pesada de sHIgM22 (número de registro en GenBank AF212993) pertenece al subgrupo III de las regiones variables de la cadena pesada humana. Se observaron diferencias significativas entre los dominios variables de sHIgM22 y la secuencia del dominio variable de la línea germinal humana más conocida (40).

DISCUSIÓN

En esta serie de experimentos, los inventores han demostrado que los Ac humanos pueden estimular la remielinización del SNC. Se observó una remielinización más extensa en las médulas espinales de ratones infectados por TMEV tras tratamiento con IgM policlonal humana que el tratamiento con IVIg humana. Además, los inventores han identificado dos IgM monoclonales humanas que potenciaron de forma consistente la remielinización. Ambos AcMo se aislaron de los sueros de pacientes con macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), una clase de linfoma caracterizado por la expansión clonal maligna de una única célula B en el último estadio de maduración que inunda el suero con IgM monoclonal (41). El nivel alto de estos AcMo no parece ser perjudicial. En pacientes con WM, la IgM dominante reconoce normalmente los antígenos que son reconocidos por el repertorio de IgM presentes en individuos sanos (42). La capacidad de los inventores para identificar fácilmente y aislar AcMo de unión a antígeno de OL que estimulan la remielinización de la población humana proporciona soporte al concepto de que estos Ac son comunes entre el repertorio de células B y pueden funcionar como modificadores en respuesta a la lesión del SNC.

Los AcMo estimuladores de la remielinización se pueden producir en los sueros de individuos cuando se confrontan con daños en el SNC.

Aunque tanto la IVIg como la IgM policlonal humana estimulaban la remielinización, ninguna se unió a los OL de rata

o humanos en cultivo. En contraste con ello, ambos AcMo humanos que estimulaban la remielinización se unieron a los antígenos de superficie de OL de rata y de seres humanos. La mayor eficacia de los AcMo humanos para estimular la remielinización puede deberse a la orientación eficaz hacia los OL adultos en el área dañada. Stangel notificó que IVIg no tenía ningún efecto sobre la diferenciación, migración o proliferación de los progenitores de OL en cultivo, no obstante, la unión de IVIg a los progenitores de OL no se evaluó (43). La ausencia de afinidad de IVIg por los OL es probable que explique la falta de cualquier afección discernible en los progenitores de OOL. No obstante, el hecho de que IVIC no se une a los OL implica que el mecanismo de acción en la estimulación de la remielinización puede ser distinto del de los AcMo humanos.

La misma preparación de IgM policlonal humana usada en este estudio se ha demostrado que neutraliza los autoanticuerpos (28) y altera la expresión de citocinas en EAE (44) y que es beneficiosa en un modelo de ratón de miastenia gravis (45). La IgM policlonal humana, pero no la IVIg, se une a los tractos mielinizados en láminas no fijadas de cerebro de roedor. Ninguna preparación policlonal se unió a la sustancia blanca humana fresca. La IgM policlonal humana puede estimular una remielinización significativa en el ratón mediante una combinación de inmunorregulación general, unión a anticuerpos patogénicas y opsonización de residuos de mielina.

El mecanismo por el cual las Ig estimulan la remielinización todavía no se ha aclarado. Dado que muchos de los AcMo que estimulan la remielinización se unen a los OL y/o la mielina, es razonable postular la hipótesis de un efecto directo sobre las células reconocidas. Existen ejemplos de AcMo que se unen y alteran la biología de los OL en cultivo (46-48). No obstante, dado que los AcMo que estimulan la remielinización tienen varias especificidades (23, 26), es improbable que cada AcMo funcione directamente a través de un antígeno o receptor frecuente. Una molécula polivalente como una IgM podría acercar las moléculas de señalización normalmente alejadas a las proximidades de la membrana plasmática con la posterior activación (49). Dado que la mayoría de los AcMo que estimulan la remielinización parecen unirse a lípidos (26), la unión de estas IgM a la superficie celular podría reorganizar la membrana plasmática y facilitar una vía de señalización. Cuando se añade SCH94.03 a cultivos mixtos de células gliales primarias se observa un incremento de 2-23 veces en la captación de timidina tritiada Rodriguez, observaciones no publicadas).

Otro posible mecanismo por el cual los AcMo que estimulan la remielinización pueden funcionar es dirigiendo a los residuos de mielina o a los OL dañados. La unión a los OL o a la mielina puede potenciar la eliminación de residuos celulares de las áreas dañadas, lo que permite que progrese el proceso normal de reparación del SNC espontáneo. Quizá el mecanismo de acción de las Ig policlonales humanas es, principalmente, a través de inmunomodulación mediante una inhibición de la diferenciación de células B o una alteración de la expresión de citoquinas y la red antiidiotípica (27, 50), mientras que la acción de los AcMo humanos se produce mediante la orientación directa a los antígenos de OL y/o mielina. Ninguna característica fue completamente predictiva de la capacidad de un Ac para estimula la remielinización. De hecho, un AcMo humano analizado en ratones infectados por TMEV crónicamente para suprimir la remielinización por debajo del nivel de remielinización espontánea, lo que sugiere que ciertos AcMo humanos de unión a OL pueden inhibir la remielinización in vivo o pueden exacerbar la desmielinización. Esto es consistente con la observación de que AcMo específicos reactivos frente a los antígenos de OL (es decir, glicoproteína de oligodendrocitos de la mielina, 51) potencian la desmielinización en EAE (52). En última instancia, la prueba de un potencial de remielinización de Ac y la ausencia de patogenicidad requiere pruebas in vitro.

En varios ensayos doble ciego u controlados con placebo con IVIg humana se ha demostrado alguna eficacia en la EM (18,36,37). La IgM policlonal humana, sHIgM22 y sHIgM46 potenciaron todos ellos la remielinización del SNC en el modelo de TMEV, así como la IVIg, lo que sugiere que estos Ac pueden ser tan eficaces en la EM. Los AcMo humanos que se unen a los OL pueden tener el beneficio adicional de la estimulación directa de los OL. Los AcMo se pueden producir libres de posible infección por patógenos y se pueden alterar estructuralmente para aumentar su eficacia e inmunogenicidad. En contraste con los AcMo de ratón, o AcMo de ratón “humanizados”, los AcMo humanos deberán tener como resultado una respuesta inmunitaria mínima y son aplicables fácilmente a ensayos humanos. Dado que los AcMo humanos estimulaban la remielinización en animales paralizados crónicamente, ello proporciona esperanza que se pueden desarrollar terapias satisfactorias para pacientes con c largo.

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Ejemplo 4

5 Como se ha descrito en los Ejemplos anteriores, los inventores han usado dos enfoques para identificar anticuerpos monoclonales humanos que inducen un patrón similar de remielinización en el modelo de virus de Thelier de enfermedad desmielinizante. El primer abordaje fue transformar las células B humanas con el virus de Epstein Barr (EBV) para generar clones de células B secretores de inmunoglobulina. Las líneas celulares resultantes se sometieron a detección selectiva para identificar cultivos que expresaban niveles altos de anticuerpos y la estabilidad

10 de los anticuerpos producidos para unirse a antígenos del SNC, con énfasis concreto sobre aquéllos que se unían a oligodendrocitos. El segundo abordaje fue realizar una detección selectiva similar de la unión al SNC de suero de pacientes diagnosticados con una gammapatía monoclonal, tal como MUGUS, linfoma o síndrome de Waldenstrom. En el caso de las células transformada por EBV, las propias células podrían proporcionar una fuente de anticuerpo para generar cantidades suficientes de anticuerpos de calidad GMP para ensayos clínicos. Además, los anticuerpos

15 identificados de cualquier fuente podrían producirse más óptimamente en un sistema productor de anticuerpos artificiales usando genes del anticuerpo sintéticos que codifican los anticuerpos de interés. Los inventores prevén que las líneas celulares de hibridoma transfeccionadas con un casete de expresión de anticuerpo que codifican el anticuerpo de interés proporcionarán suficiente anticuerpo de interés para el análisis in vivo y en ensayos clínicos.

En el curso de los estudios de detección selectiva, los inventores han identificado un grupo de anticuerpos IgM

20 monoclonales humanos que inducen remielinización estadísticamente significativa en su modelo de virus de Thelier in vivo de enfermedad desmielinizante (TABLA 5). Cada uno de estos anticuerpos imitaron la respuesta de remielinización descrita originalmente con el anticuerpo monoclonal murino prototipo SCH 94.03. Entre estos anticuerpos humanos son dos derivadas de líneas de células B transformadas con EBV, denominados MSI 19D10 y CB2bG8, y dos anticuerpos, denominados sHIgM 22 y sHIgM 46, identificados entre un pan de anticuerpos de más

25 de 50 pacientes que expresan niveles altos de IgM monoclonal en su suero.

TABLA 5. Remielinización inducida por anticuerpos monoclonales humanos en ratones SJL/J infectados crónicamente con el virus de Theiler.

Tratamiento % Remielinización

Evaluación estadística

Comparación 1

PBS (n=7) 6,74 (+/-1,80)

sHIgM 22 (n=8) 17,6 (+/-3,42)

P<0,05

sHIgM 46 (n=5) 27,12 (+/-4,01)

P<0,001

Comparación 2

PBS (n=12) 8,25 (+/-1,44)

MSI 19-D10 (n+13) 24,38 (+/-2,91)

P<0,001

CB2b-G8 (n=12) 23,51 (+/-3,13)

P<0,001

Los animales se infectaron crónicamente con la cepa DA del virus de Theiler durante más de 9 meses antes del tratamiento con una única inyección ip de 0,5 mg de anticuerpo IgM aislado del suero del paciente (sHIgM22 y sHIgM 46) o líneas celulares transformadas con EBV (MSI 19-D10 o CB2b-G8). Cinco semanas después, los ratones fueron perfundidos con agente de fijación y médulas espinales para análisis histológico. Las áreas de desmielinización y remielinización se evaluaron directamente mediante microscopia. El porcentaje de área de remielinización se determinó mediante la fórmula área remielinizada/área desmielinizada X 100. Los efectos del tratamiento se evaluaron mediante comparación estadística con los grupos de animales que recibieron inyecciones de PBS en lugar de anticuerpo,

Las estructuras de las cadenas ligera y pesada de la IgM para ambos anticuerpos derivaron de los transformantes

30 con EBV se han determinado mediante análisis de ADNc generado a partir del ARNm de inmunoglobulina aislado de las células. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de MSI 19D10 y sHIgM 22 se proporcionan en las Figuras 19 y 20 (SEC ID Nº 9 y 11) y las Figuras 17 y 18 (SEC ID Nº 1, 49, 5 y50), respectivamente. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de CB2bG8 se proporcionan en las Figuras 27 y 28 (SEC ID Nº 13 y 15). Las propias secuencias no son destacables en otro sentido aparte de que difieren algo con respecto a las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal conocida. Por tanto, pueden ser los productos de la diversificación somática durante el curso de las respuestas inmunitarias contra antígenos no identificados. El valor de las secuencias es que proporcionan una impresión azul para la construcción de vectores de expresión para la producción de la inmunoglobulina en conducciones controladas.

De forma similar, las estructuras de las cadenas pesada y ligera del suero de uno de los pacientes productores de IgM se determinaron mediante análisis de la secuencia de proteínas, seguido de clonación y análisis de la secuencia de ADNc de células mononucleares de sangre periférica aisladas del paciente. En el suero del paciente se identificaron dos cadenas pesada y ligera estrechamente relacionadas, denominadas sHIgM22 (Figuras 17 y 18). Las dos cadenas ligera y pesada estaban presentes en las poblaciones de ADNc aislado en una proporción de

60:40. Ambos anticuerpos comparten una reorganización P-VDJ común y una reorganización –VJ, lo que indica que derivan de un precursor de células B común. Después, han divergido como resultado de la acumulación de mutaciones que han alterado las estructuras de sus regiones variables. Los inventores han concluido que los anticuerpos se expresan en el suero del paciente porque los péptidos de los anticuerpos se caracterizaron a partir de la proteína aislada de suero. No obstante, las dos combinaciones distintas de cadenas variable y ligera no se observaron directamente, dejando abierta la posibilidad de que otras combinaciones de las cadenas alfa pueden estar realmente presentes. En base a las posiciones de las sustituciones de aminoácidos observadas, los inventores sospechan que los anticuerpos tienen patrones de reactividad muy similares.

Ejemplo 5

DESARROLLO DE UN SISTEMA DE TRANSFECCIÓN PARA LA EXPRESIÓN DE GENES DE ANTICUERPOS EN CULTIVO CELULAR

Con el fin de generar un suministro renovable de títulos elevados de anticuerpos de los anticuerpos humanos, los inventores han desarrollado un sistema de expresión basado en la transfección. Las células de hibridoma que se han seleccionado por la pérdida de producción de ARNm de inmunoglobulina endógena se pueden transfeccionar con genes de anticuerpos recombinantes para generar células que expresan los anticuerpos de interés.

Los inventores han explorado el uso de una serie de sistemas vectores basados en genoma y ADNc para expresar los genes de anticuerpo clonados en cultivo celular. Los inventores han expresado con éxito la proteína de cadena ligera usando genes genómicos o basados en ADNc. Los inventores han conseguido la expresión de la cadena pesada usando un vector de la cadena pesada basado en el genoma PAG 4026 (amablemente proporcionado por la Dra. Sherie Morison de la UCLA). No obstante, el rendimiento de anticuerpo con este sistema de vector es demasiado bajo para su uso práctico in vivo. El objetivo de los inventores ha sido desarrollar un vector nuevo que dará de forma rutinaria clones de hibridoma transfeccionados que producen un título alto de anticuerpos. La estrategia actual de los inventores es ensamblar el vector a partir de componentes e individualmente se ha demostrado que funcionan bien en sus manos.

Los inventores han mostrado que un vector que expresa dHfR y el ADN de la cadena ligera de inmunoglobulina bajo el control del promotor de CMV expresa la cadena ligera y que esta expresión se puede amplificar cultivando las células productoras de inmunoglobulina transfeccionadas en concentraciones crecientes de metotrexato (Figura 29). A continuación, los inventores clonan esta unidad funcional, que expresa la cadena ligera de inmunoglobulina y dHfr, en el vector que expresa el gen de la cadena pesada genómica que codifica la cadena complementaria. El primer vector que han creado los inventores en este sentido, codifica 94.03 quimérico de ratón/humano 94.03 y se muestra en el panel superior de la Figura 30. El vector se ha introducido en células de hibridoma negativas a anticuerpo y clones que expresan cantidades pequeñas de anticuerpo funcional. El anticuerpo tiñe el tenido del SNC de un modo idéntico al que usa el anticuerpo 94.03 nativo de ratón (Figura 3.1)- Estos clones productores de anticuerpos sufren selección con cantidades crecientes de metotrexato para expandir la cantidad de anticuerpo que se está produciendo. Dado que los inventores han identificado dos cadenas pesada y dos ligeras en el suero humano de SHIGM 22, las cuatro permutaciones de la cadena pesada y ligera se tienen que evaluar. Los vectores que expresan tres de las cuatro posibles combinaciones de sl-ngm 22 identificados en nuestro estudio de secuencia y actualmente se introdujeron en las células de hibridoma negativos para inmunoglobulina. El vector prototipo se muestra en el panel inferior de la figura 30.

PROCEDIMIENTOS

Construcción de los vectores de expresión para expresar 94.03 (M1) quimérico de ratón/de rata y el anticuerpo smgof-22

Ensamblaje del sistema de expresión para 94.03 quimérico de ratón/de rata

El vector ensamblado consta de dos unidades. El primero codifica la cadena pesada de la inmunoglobulina que está codificada por un gen de inmunoglobulina derivado de ADN genómico. El vector es, en parte, un derivado de un vector armazón (PAG 4026) obtenido del laboratorio de la Dra. Sherrie Morrison de UCLA. El vector PAG 4026 codificado por una cadena pesada de IgM que expresa una región variable irrelevante. No se disponía de sitios de clonación cómodos para la sustitución de regiones variables de interés. Por tanto, los inventores obtuvieron la ingeniería mediante deleción de las secuencias de cadena pesada irrelevantes y reconstitución de las regiones que flanquean la región variable con sitios de restricción únicos (Rsr II en el extremo 5’ y Pac I en el extremo 3’. Dado que la secuencia del vector PAG no se conocía, los inventores han determinado qué encimas de restricción serían únicas por el método de prueba y error, cuando enzimas que reconecen secuencias con porca frecuencia presentes en el ADN de mamífero.

La región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal IgM de ratón 94.03 se aisló a partir de ADNc mediante PCR usando el cebador RsrII

ACTCCCAAGTCGGCTCGCTTTCTCTTCAGTGACAAACACAGACATAGAACA TCACCATGGGATGGAGCTGTATCACT (SEC ID Nº: 39) para introducir el sitio RsrII antes en la cadena de la secuencia líder y el cebador PAcl ACTGACTCTCTTAATTAAGACTCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT (SEC ID Nº 40) para introducir el sitio Pacl manteniendo la correcta unión de corte y empalme en el extremo 3’ del bloque de codificación de la región variable.

La segunda parte del vector de expresión deriva de múltiples plásmidos. La construcción terminada contiene sitios EagI en ambos extremos, la secuencia de codificación DHFR (dihidrofolato reductasa) bajo el control regulador del promotor de SV40 y un bloque de codificación de ADNc de cadena ligera kappa humana/quimérico de ratón bajo el control regulador del promotor sdl CMV. Esta porción del vector se ensambló de un modo por etapas, comenzando con tres plásmidos (pCIneo (Promega Corporation), pUC18 (New England Biolabs), and pFR400 (Simonsen and Levinson, Proc Natl Acad Sci USA 80:2495: 1983)) que proporcionó sitios de clonación adecuados, regiones promotoras, señales de poliadenilación y/o el bloque de codificación DHFR, Después de una serie de modificaciones que incluyó la introducción de regiones de unión sintéticas y, por tanto, los sitios de endonucleasa de restricción no deseables, el casete de expresión de metotrexato mediante un casete de luz., se ensambló. EL casete incluye sitios para endonucleasa de restricción únicas (Nhe I y Xho I) que flanquea el bloque de ADN c del gen de la cadena ligera.

El gen de la cadena ligera quimérica se ensambló a partir de dos secuencias de ADN usando el corte y empalme de PCR mediante la técnica de extensión de solapamiento (Horton y col.) Gene 77:61:1989). Los cebadores que flanquean las regiones fusionadas del ADNc quimérico (que contenían las secuencias de reconocimiento enzimático para las endonucleasas Xho I y Nhe I. El cebador en 5’ usado para amplificar el producto del gen fusionado fue TTGGCGCGCCAAAGACTCAGCCTGGACATGATGTCCTCTGCTCAGTTC (SEC ID Nº 41); el cebador en 3 ’ fue ATAGTTTAGCGGCCGCATTCTTATCTAACACTCTCCCCTGTTG (SEC ID Nº 42). El bloque de codificación de ADNc se insertó en el vector del casete de la cadena ligera usando estos sitios.

Una vez ensamblado, el casete se escindió usando la endonucleasa Eag I y se insertó en el sitio Eag I único en el vector que contiene el gen de la cadena pesada. La construcción resultante contiene las secuencias de codificación para los componentes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo quimérico de ratón/humano para 94.03 “humanizado”. La cadena pesada se expresa mediante el promotor de IgH humano y la cadena ligera se expresa mediante el promotor del CMV. El gen de dHFR proporciona un marcador de amplificación y se expresa mediante el promotor del SV40. Cada uno de estos genes contiene señales de poliadenilación en los extremos 3’. Otras características importantes del vector incluyen un origen bacteriano de replicación y un gen expresado en bacterias que codifica resistencia a ampicilina. Los bloques de codificación de ADN de la región variable de las cadenas ligera y pesada están flanqueados por sitios únicos de endonucleasas de restricción que se pueden usar para sustituir nuevas secuencias de inmunoglobulina aisladas de ARNm de cualquier célula productora de anticuerpo o genes de inmunogloblulina sintéticos.

Inserción de las secuencias de sl-HgM.22 en el sistema del vector de expresión

El ADNc del ARNm que codifica las cadenas pesada y ligera de sHIgM.22 se preparó mediante amplificación por PCR del ARN de sangre periférica usando cebadores en 5’ deducidos de la información sobre la secuencia de aminoácidos y secuencias en las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera respectivamente. El bloque de codificación de la región variable de la cadena pesada, la secuencia líder y la unión de corte y empalme del donante, junto con los sitios flanqueantes de RsrII y Pac I se ensamblaron usando PCR para añadir la región 5'

GACTCGGTCCGCCCAGCCACTGGAAGTCGCCGGTGTTTCCATTCGGTGATC ATCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTC CTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT GG (SEC ID Nº 43) y las secuencias en 3’

CCTTAATTAAGACCTGGAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACCAG GGTTC (SEC ID Nº 44). La molécula de ADN resultante se digirió con Rsr II y Pac I, y después se clonó en el vector de expresión, sustituyendo la secuencia de la región variable deseada para la secuencia irrelevante en el vector.

La secuencia de la cadena ligera se ensambló en dos etapas. La región constante lambda se aisló del ARNm mediante PCR-RT usando el cebador en 5’ CTAGCTAGCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCC (SEC ID Nº 45)y el cebador en 3 ’ ATAGTTTAGCGGCCGCACCTATGAACATTCTGTAGG (SEC ID Nº 46). Este fragmento se clonó usando un único sitio AvrII y un sitio en 3’ Not I en el vector pClneo.

La región variable de sHIgM.22 se generó mediante PCR-RT usando el cebador en 5’

CTAGCTAGCCCGAATTTCGGGACAATCTTCATCATGACCTGCTCCCCTCTC CTCCTCACCCTTCTCATTCACTGCACAGGGTCCTGGGCCCAGTCTGTGTTG ACGCAGCCG (SEC ID Nº 47) con el fin de introducir la necesidad del sitio Nhe I y la secuencia líder sobre el ADN. El cebador en 3’

GGGCAGCCTTGGGCTGAGCTAGGACGGTCAGC (SEC ID Nº 48) se usó para introducir un sitio AvrII de modo que este fragmento podría unirse con la pieza de la región constante. El bloque de codificación resultante que contiene una señal líder funcional estaba flanqueado por los sitios NheI y Xho I necesarios para clonar en el casete de la cadena dHFRnigh, que después se ensambló con el plásmido de la cadena pesada para generar el producto final que contiene las secuencias de codificación tanto de la cadena pesada como de la ligera y los promotores necesarios para la expresión en células de mamífero.

Ejemplo 6

ANTICUERPO 94.03 DE ISOTIPO IgG

Una estrategia para determinar la importancia del isotipo en la capacidad del anticuerpo de ratón 94.03 para inducir remielinización es generar un anticuerpo recombinante que expresa la región variable de 94.03 con un isotipo IgG. Como estrategia alternativa, los inventores han buscado identificar una variante de desplazamiento del isotipo natural dentro de la población de las células productoras de 94.03 en cultivo. Se sabe que las variantes de desplazamiento espontáneo aparecen en los cultivos de este tipo. Tras clasificaciones sucesivas en FACS de las células teñidas para la IgG de superficie celular, los inventores capaces de aislar una línea de células clonales que secretan 94.03 portadoras del isotipo IgG1 (Figura 32). La estructura del anticuerpo producida por estas células se confirmó mediante ELISA, caracterización de las proteínas producidas en geles de SDS y mediante clonación del ADNc. El análisis directo de la secuencia como se indica en la Figura 33 produjo datos definitivos que indicaban que los inventores han descubierto una variante de IgG del anticuerpo 94,03.

Ejemplo 7

ANTICUERPO 09 DE RATÓN ANTI-OLIGODENDROCITOS DE ISOTIPO IGG3.

El anticuerpo 09 de ratón se aisló como anticuerpo anti-oligodendrocito y es del subtipo IgG3 (Kuhlmann-Krieg, S., Sammer, 1. y Shachner M. (1988) Devel Brain Res 39:269-280). El anticuerpo 09 se une fuertemente y específicamente a la sustancia blanda en el SNC. Los inventores han analizado y demostrado la capacidad del anticuerpo 09 para estimular la remielinización en el modelo de TMEV (datos no mostrados). La secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 se proporciona en la Figura 34 (SEC ID Nº 17). La secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 se proporciona en la Figura 35 (SEC ID Nº 19). La secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 09 se proporciona en la Figura 36 (SEC ID Nº 21).

Ejemplo 8

LOS MONÓMEROS DE IgM INDUCEN REMIELINIZACIÓN

Otro abordaje para descifrar la importancia de las características estructurales de los anticuerpos IgM para la inducción de remielinización es fraccionar el anticuerpo bioquímicamente y evaluar la capacidad de los fragmentos de anticuerpo para inducir la remielinización in vivo. Una posibilidad es que los anticuerpos identificados tengan una afinidad baja por las estructuras del SNC, y, por tanto, la decavalencia de la IgM puede ser crucial para remielinizar la atividda porque los múltiples sitios de unión proporcionan suficiente avidez por los anticuerpos de modo que interaccionan con las estructuras diana en el SNC, Para abordar esta cuestión, los inventores han generado monómeros de IgM mediante reducción de los puentes disulfuro que sujetan las moléculas de inmunoglobulina pentamérica. Los monómeros resultantes son divalentes. Los monómeros no se unen al os oligodendrocitos n vitro y no tiñen secciones cerebrales en el patrón observado con el anticuerpo nativo intacto. No obstante, los anticuerpos monoméricos conservan la capacidad para inducir la remielinización (Tabla 6). Este fue un resultado sorprendente a la luz de la ausencia de tinción observada en nuestros ensayos in vitro. Una posibilidad es que los ensayos in vitro que controlan la unión no son tan sensibles como el bioensayo de remielinización . Dado que hay una correlación tan fuerte entre la unión y la inducción de remielinización, los inventores creen que la especificidad de estos anticuerpos por las estructuras del SNC es importante a pesar de nuestra incapacidad para seguir la unión con los monómeros.

Tabla 6. Remielinización inducida por fragmentos monomér5icos de AcMo de IgM 94.023.

Tratamiento

% Remielinización Evaluación estadística

PBS (n=7)

6,74 (+/-1,80)

94,03 monomérico (n= 8)

17,32 (+/-2,67) P<0,01

94,03 pentamérico (N= 5)

18,1 (+/-5,76) P<0,01

Los anticuerpos IgM se redujeron en condiciones suaves y se alquilaron. Este tratamiento rompió la estructura pentamérica de los anticuerpos y permitió aislar los monómeros divalentes mediante cromatografía en columna. Ratones SJL/J crónicamente infectados recibieron un total de 0,5 mg de anticuerpo administrado ip dos veces a la semana durante el periodo de tratamiento de cinco semanas. Cinco semanas después, los animales fueron perfundidos con agente de fijación y las médulas espinales se extrajeron para análisis histológico. El porcentaje de área de remielinización se determinó microscópicamente mediante comparación de las lesiones remielinizadas y el área desmielinizado total como se indica en la Tabla 5. Los grupos de tratamiento individual se compararon con los animales que recibieron inyecciones de PBS en lugar de anticuerpo.

Además, el anticuerpo se fraccionó generando (Fab’)2 Fab, y fragmentos de Fv del anticuerpo. Ratones SJL infectados crónicamente con el virus de Theiler con estos fragmentos de anticuerpo para determinar si los 5 fragmentos divalentes ausentes en la porción de Fc o fragmentos de anticuerpo monovalentes o de anticuerpos.

Un análisis paralelo del anticuerpo monoclonal humano sHIgM 22 se realiza para determinar si los fragmentos de anticuerpo de esta IgM humana se comportan de forma similar. Se puede determinar que un solo dominio de unión pequeño puede inducir remielinización, esta información puede ser importante para determinar el mecanismo de reparación, así como para proporcionar una vía para el desarrollo de un análogo farmacológico.

10 Ejemplo 9

EL ANTICUERPO sHIgM 46 INDUCE REPARACIÓN DE LA MIELINA

Nuestros estudios iniciales sugieren que la inducción de la reparación de la mielina por sHIgM 46 puede ser cualitativamente superior a la reparación observada con sHIgM 22. Tras el análisis histológico de las secciones de ratones SJL crónicamente infectados por TMEV, se observaron áreas más pequeñas de desmielinización tras el 15 tratamiento con sHIgM 46 que con otros anticuerpos monoclonales (Tabla 7). Esta observación fue altamente estadísticamente significativa. Este resultado es notable por el tratamiento con el anticuerpos no comienza hasta que las lesiones desmielinizadas están bien establecidas y han alcanzado un tamaño máximo en animales infectados crónicamente. La interpretación de los inventores de este resultado es que la reparación de la mielina es tan completa en algunas áreas de la médula espinal que no se están distinguiendo de áreas normales de la médula

20 durante nuestro análisis histológico estándar. Las lesiones en ratones tratados con sHIgM 46 se analizan mediante microscopia electrónica para confirmar si las lesiones reparadas contienen números de envueltas de mielina más altos que en otros grupos de tratamiento

Tabla 7. Diferencias cualitativas en la reparación de la mielina por el anticuerpo humano sHIgM 46

Tratamiento

% de sustancia blanca desmielinizada Evaluación estadística

sHIgM46 (n=15)

4,07 (+/-2,52)

Los demás anticuerpos (n= 70)

10,41 (+/-6,26) P<0,001

Los ratones SJL/J crónicamente infectados con el virus de Theiler durante más de 9 meses se dividieron en grupos y cada grupo individual recibió una única inyección ip de 0,,5 mg de una de una batería de anticuerpos monoclonales. Cinco semanas después, los animales fueron perfundidos con agente de fijación y las médulas espinales se aislaron para su análisis histológico. El área de desmielinización se determinó midiendo el área total de la médula ocupada por sustancia blanca y el área de desmielinización visualizada mediante microscopia óptica usando una óptica de 25 X. Los datos están compuestos por los de los ratones de tres experimentos independientes. Los anticuerpos usados para tratar a los animales en el grupo de tratamiento combinado (“todos los demás anticuerpos”) fueron IgM sHIgM 12,’14, 22, 47, 50, AKJR8, MSI 10E10, 2B2GE7, NA8FE4 monoclonales humanos, y los anticuerpos 06, 09, RIP, y MOG de ratón. El conjunto de datos pasó las pruebas de normalidad y se analizaron mediante ANOVA.

Ejemplo 10

Se determinaron las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanos AKJR44, CB2iE12 y CB2iE7, y la región variable de la cadena ligera de MSI19E5. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de AKJR4 se muestran en las Figuras 37 y 38, respectivamente (SEC ID Nº 23 y 25). Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de CB2iE12 se muestran en las Figuras 39 y 40, respectivamente (SEC ID Nº 27 y 29). Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de CB2iE7 se muestran en las Figuras 41 y 42, respectivamente (SEC ID Nº 31 y 33. La secuencia de la región variable de la cadena ligera de MSII9E5 se muestra en la Figura 43, respectivamente (SEC ID Nº 35).

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal humano, o una mezcla, monómero o fragmento activo del mismo, caracterizado por su capacidad para unirse a oligodendrocitos, o un anticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad para unirse a los oligodendrocitos, con las características siguientes:

   (a)

   capaz de inducir remielinización;

   (b)

   capaz de estimular la proliferación celular de células gliales; y

   (c ) capaz de estimular la señalización de Ca++ en los oligodendrocitos;

   y que tiene:

   un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo A o de tipo B como se establece en la Figura 17 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de sHIgM22 de tipo I o de tipo II como se indica en la Figura 18;

   un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como establece en la Figura 19 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebvHIgM MSI19D10 como se establece en la Figura 20;

   un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HigM CB2bG8 como se establece en la Figura 27 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de ebv HIgM CB2bG8 como se establece en la Figura 28;

2. 2.

   El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, que es del subtipo IgM.

3. 3.

   El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que deriva de células humanas.

4. 4.

   El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para usar en:

   (a)

   estimulación de la remielinización de los axones del sistema nervioso central en un mamífero que necesite dicha terapia; o

   (b)

   tratar una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central en un mamífero que necesite dicha terapia.

5. 5.

   El anticuerpo monoclonal para uso de la reivindicación 4, para usar en la prevención y/o tratamiento de debilitaciones celulares, desorganizaciones y/o disfunciones y/u otros estados de enfermedad en mamíferos, incluidos seres humanos, e incluidas las afecciones del SNC como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA, enfermedad desmielinizante viral, una enfermedad del sistema nervioso central y otras afecciones del sistema nervioso central en las que los nervios se han dañado por un traumatismo, una enfermedad desmielinizante viral o una enfermedad posnatal del sistema nervioso central en un ser humano o animal doméstico, tal como un ratón infectado con la cepa DA del virus de la encefalomielitis murina de Theiler.

6. 6.

   Un procedimiento in vitro de estimular la proliferación de células gliales de cultivos mixtos, que comprende:

   (a)

   cultivar un cultivo celular mixto que contiene células gliales en condiciones suficientes para proliferación celular;

   (b)

   introducir en el cultivo mixto una cantidad eficaz de un autoanticuerpo monoclonal humano, un fragmento humano del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad de unirse a oligodendrocitos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de modo que se produce un cultivo mixto tratado con anticuerpo monoclonal;

   (c)

   mantener el cultivo de la etapa (b) en condiciones suficientes para proliferación de células tratadas con el anticuerpo monoclonal, de modo que tiene como resultado la proliferación de las células gliales en el cultivo mixto; y

   (d)

   recoger las células gliales del cultivo mixto.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el cultivo mixto se obtiene del nervio óptico de rata o de cerebro de rata.

8. 8.

   Una composición farmacéutica que comprende, como agente activo, un autoanticuerpo monoclonal humano, un fragmento activo del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad de unirse a oligodendrocitos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. 9.

   La composición de la reivindicación 8, que se adapta para administración intravenosa o intraperitoneal.

10. 10.

    La composición de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la que la cantidad de anticuerpo monoclonal que se va a administrar es de 0,5 mg/kg a 400 mg/kg.

11. 11.

    El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, marcado con un marcador detectable.

12. 12.

    El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que el marcador es una enzima, un producto químico que es fluorescente o un elemento radioactivo.

13. 13.

    Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica al menos un dominio variable de un autoanticuerpo monoclonal humano, un fragmento activo del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo y que tiene la capacidad de unirse a oligodendrocitos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. 14.

    El ácido nucleico aislado de la reivindicación 13, en el que el ácido nucleico es ADN, tal como ADNc o ADN genómico o es ARN.

15. 15.

    El ácido nucleico aislado de la reivindicación 13 o de la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor de la transcripción del ARN.

16. 16.

    El ácido nucleico aislado de la reivindicación 15, en el que el promotor comprende un promotor de bacteria, levadura, insecto, viral o de mamífero.

17. 17.

    El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha secuencia de ADN está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión.

18. 18.

    El ácido nucleico aislado de la reivindicación 17, en el que dicha secuencia de ADN está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión es el promotor temprano o tardío de SV40 o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, un operador principal y la región promotora del fago A, una región de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa, un promotor de la fosfatasa ácida

    o un promotor de un factor de apareamiento de levaduras.

19. 19.

    Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.

20. 20.

    El vector de la reivindicación 19 que es una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN como se define en la reivindicación 14.

21. 21.

    El vector de la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que el vector es un plásmido, un cósmido, cromosoma artificial de levadura (YAC), bacteriófago o ADN viral eucariótico.

22. 22.

    Una sonda de ácido nucleico capaz de seleccionar un autoanticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento activo del mismo, o un monómero, o un autoanticuerpo sintético derivado del mismo, en especies alternativas preparadas de la secuencia de ADN del dominio variable de la reivindicación 14, en el que dicha sonda hibrida con una secuencia de codificación del dominio variable de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones de hibridación estrictas.

23. 23.

    Un sistema vector del huésped para la producción de un polipéptido que comprende el vector de la reivindicación 19 o la reivindicación 20 en una célula huésped adecuada.

24. 24.El sistema vector del huésped de la reivindicación 23, en el que la célula huésped adecuada comprende una célula procariota o eucariota.
25. 25. El sistema vector del huésped de la reivindicación 23, en el que la célula huésped es E. coli, una Pseudomonas, un Bacillus, un Streptomyces, una levadura, una célula CHO, RI, 1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, o BMT10, una célula vegetal, una célula de insecto o una célula humana en cultivo tisular..
26. 26.Un virus recombinante transformado con el ácido nucleico asilado de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a
27. 17.
28. 27. Un procedimiento de obtención de un polipéptido en forma purificada, que comprende:

    (a)

    cultivar un sistema de vector del huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, para producir el polipéptido;

    (b)

    recuperar el polipéptido producido en la etapa (a); y

    (c ) purificar el polipéptido recuperado de este modo en la etapa (b).
29. 28. Un procedimiento para detectar la presencia de una cantidad de una anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho procedimiento comprende:

    (a) colocar una muestra que contiene una forma marcada de dicho anticuerpo monoclonal en contacto con una muestra biológica de un mamífero en el que se sospechan los sitios de unión para dicho anticuerpo monoclonal; y

    5 (b) examinar en dicha muestra biológica en estudios de unión la presencia de dicho anticuerpo monoclonal marcado; en el que la presencia o cantidad de dicho anticuerpo monoclonal marcado se indica o detecta.
30. 29. Un procedimiento para analizar la capacidad de un fármaco u otra entidad para modular la actividad de un anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

    (a) cultivar una colonia de células de ensayo que tiene un receptor para el anticuerpo monoclonal en un medio de 10 crecimiento que contiene el anticuerpo monoclonal;

    (b) añadir un fármaco que se va a analizar; y

    (c ) medir la reactividad de dicho anticuerpo monoclonal con el receptor en dicha colonia de células de ensayo.
31. 30. Un kit de ensayo para demostrar la presencia de un anticuerpo monoclonal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una muestra celular eucariota, que comprende:

    15 (a) una cantidad predeterminada de dicho anticuerpo monoclonal;

    (b)

    una cantidad predeterminada de una pareja de unión específica de dicho anticuerpo monoclonal seleccionado de células gliales y oligodendrocitos cultivados;

    (c)

    otros reactivos; y

    (d) instrucciones de uso de dicho kit; en el que dicho anticuerpo monoclonal o dicha pareja de unión específica se 20 marcan de forma detectable.