ES2380107T3 - Combinación de inmunogenoterapia y quimioterapia para el tratamiento del cáncer y enfermedades hiperproliferativas - Google Patents

Combinación de inmunogenoterapia y quimioterapia para el tratamiento del cáncer y enfermedades hiperproliferativas Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de cáncer o trastornos hiperproliferativos, que comprende:(a) un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en DNA plasmódico, siRNA, RNA sentido, RNA antisentido y ribozima, y un polí­mero de administración de genes; y (b) un agente farmacéutico antineoplásico, caracterizado porque (i) el polí­mero de administración de genes es un lipopolí­mero que comprende una cadena principal de polietilenimina covalentemente unida a un polietilenglicol y a un colesterol; y (ii) el agente farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en fármacos quimioterapéuticos, fármacos antiangiogénicos, péptidos antineoplásicos, anticuerpos monoclonales y sus mezclas.

Description

Combinaci6n de inmunogenoterapia y quimioterapia para el tratamiento del cancer y enfermedades hiperproliferativas �
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invenci6n se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden un acido nucleico, un polimero de administraci6n de genes y por lo menos un farmaco quimioterapeutico complementario para el tratamiento de cancer o trastornos hiperproliferativos en mamiferos. La presente invenci6n tambien se refiere a metodos para tratar cancer o trastornos hiperproliferativos en mamiferos, donde dicho metodo comprende poner en contacto celulas cancerosas o cualquier otra celula hiperproliferativa con dichas composiciones por inyecci6n intratumoral, intraperitoneal o sistemica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El cancer es la causa mas frecuente de muerte en muchas partes del mundo, y cada ano se diagnostican mas de 2,5 millones de casos a nivel global. Los ultimos avances en la comprensi6n de la biologia molecular del cancer han demostrado que el cancer es una enfermedad genetica que produce la proliferaci6n anormal de la celula afectada. Por lo tanto, los terapeutas de cancer se centran ahora en estrategias terapeuticas que implican macromoleculas que portan informaci6n genetica, en lugar de una proteina terapeutica propiamente dicha, lo que permite que los genes suministrados de manera ex6gena se expresen en el entorno tumoral. Se cree que la genoterapia ofrece beneficios terapeuticos a los pacientes enfermos de cancer en una diversidad de formas que no son posibles con los planteamientos convencionales. Los farmacos de moleculas pequenas tradicionales usualmente funcionan por interacci6n no especifica con las dianas celulares, producen efectos colaterales indeseables y no tratan la raiz de la enfermedad. Los farmacos de proteinas que se han introducido en los ultimos anos tienen sus propias limitaciones debido a su rapida degradaci6n y a las altas dosis requeridas que con frecuencia provocan efectos colaterales no deseados. El tratamiento genico utiliza el mecanismo celular del propio organismo para producir niveles terapeuticos sostenidos de proteinas en tejidos y celulas especificos despues de una unica inyecci6n, proporcionando asi un metodo de tratamiento seguro y eficaz con mejor cumplimiento por parte del paciente.
Las estrategias de genoterapia para el cancer frecuentemente aplicadas incluyen inmunoterapia, ablaci6n celular y anti-angiogenesis que se logra con inyecci6n 1) local, 2) loco-regional, o 3) sistemica. La inmunoterapia para el cancer es un planteamiento potente para combatir el cancer estimulando el sistema inmunitario contra las celulas cancerosas. Las inmunocitocinas desempenan una funci6n importante en el desarrollo de respuestas inmunitarias hospedantes por activaci6n, maduraci6n y diferenciaci6n de las celulas inmunitarias. Se han ensayado varias citocinas contra una diversidad de tipos de cancer en modelos humanos y animales de cancer. Veanse Hum Gene Ther., 1998, vol. 9, 2223; Gene Ther. 1999, vol. 6, 833; Cancer Gene Ther. 2000, vol. 7, 1156; J. Control Rel. 2003, vol. 87,177; y Cancer Res., 2002, vol. 62, 4023. La interleucina 12 (IL-12) es una citocina inmunoestimuladora que parece ser prometedora en el tratamiento de cancer humano. Vease The Oncologist, 1996, vol. 1, 88.
La IL-12 es un heterodimero de 70-kD que consiste ene dos cadenas covalentemente unidas, p35 y p40. Los efectos biol6gicos de IL-12 incluyen la inducci6n de la producci6n de IFN-y tanto por celulas T CD4+ en reposo como activadas, celulas T CD8+ y linfocitos citoliticos naturales (NK). La IL-12 tambien potencia la proliferaci6n de celulas T activadas y celulas NK, aumenta la actividad litica de NKilinfocitos citot6xicos activados por linfocinas, y facilita las respuestas de los linfocitos T citot6xicos (CTL) especificas.
En modelos animales, se ha demostrado que la IL-12 recombinante induce profundos efectos antitumorales mediados por las celulas T que causan regresi6n de tumores consolidados, seguida de memoria inmunitaria sistemica. Vease The Oncologist, 1996, vol. 1, 88. No obstante, la administraci6n sistemica de IL-12 recombinante ha provocado toxicidad limitante de la dosis en varios ensayos experimentales y en un ensayo humano inicial. Veanse Lab Invest., 1994, vol. 71, 862; Science, 1995, vol. 270, 908; J. Interferon Cytokine Res., 1995, vol. 14, 335. La toxicidad limitante de la dosis tambien se observ6 con la administraci6n intraperitoneal de IL-12 recombinante en un ensayo clinico humano reciente. Clin. Cancer Res., 2002, vol. 8, 3686. Un planteamiento de administraci6n de genes que pudiese proveer niveles terapeuticos de IL-12 localmente en el sitio del tumor tendria la ventaja de generar una respuesta anticancerosa sin causar toxicidad sistemica.
Ambos sistemas de administraci6n de genes viricos y no viricos se han utilizado para la administraci6n de genes de IL-12 en modelos animales de cancer. El planteamiento virico tiene serias limitaciones practicas debido a las preocupaciones de toxicidad, principalmente a causa de un aumento en la incidencia del cancer y una fuerte reacci6n inmunitaria a los antigenos viricos por el sistema hospedante. Existe un considerable interes en el desarrollo de sistemas de administraci6n de genes no viricos debido a su toxicidad inferior. Se ha demostrado el uso de polivinilpirrolidona (PVP), un sistema de administraci6n de genes no virico, para la administraci6n de IL-12 para tratar carcinoma renal (Renca) y carcinoma de celulas de colon (CT26). Vease Gene Ther., 1999, vol. 6, 833. Cuando los tumores se sometieron a esta genoterapia, exhibieron todas las caracteristicas de la terapia de proteinas de IL-12, p. ej., un aumento en la infiltraci6n de NK, celulas T CD4 y CD8, unido a un aumento en la expresi6n de moleculas de clase I del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). La administraci6n de genes de IL-12 se toler6 bien y fue
altamente eficaz en animales que portaban tanto tumores Renca como CT26. Los ratones que rechazaron el tumor tambien estuvieron protegidos contra una re-exposici6n subsiguiente, lo que indica la presencia de una inmunidad sistemica a largo plazo. Se ha ensayado un lipopolimero soluble en agua (OSLO) funcionalizado y menos t6xico para administraci6n del gen de IL-12 a tumores de carcinoma de colon CT26. Vease Mahato et al, Mol. Ther., 2001, vol. 4,
130. El tratamiento con el plasmido de IL-12 (pIL-12) y el WSLP (pIL-12iWSLP) produjo niveles superiores de expresi6n de genes intratumorales que el DNA desnudo.
Asimismo, los efectos secundarios de la producci6n de citocinas IL-12, a saber niveles de IFN-y y 6xido nitrico (NO) tambien fueron superiores en tumores tratados con WSLP en comparaci6n con DNA desnudo. Una sola inyecci6n de complejos pIL-12iWSLP produjo efectos sub6ptimos en el crecimiento del tumor y en la supervivencia animal, mientras que la administraci6n repetida produjo mejor eficacia, lo que indica la administraci6n suficiente por el sistema. J. Control Release 2003, vol. 87, 177. De modo similar, la inyecci6n intratumoral del plasmido de IL-12 en otro vehiculo polimerico, PAGA, produjo solamente inhibici6n parcial de tumores CT26. Vease Gene Ther., 2002, vol. 9, 1075. Estos resultados garantizan la necesidad de sistemas de administraci6n mas eficientes. A pesar de sus insuficiencias en ensayos preclinicos anteriores, la excelente flexibilidad molecular de los vehiculos de genes polimericos permite la modificaci6n compleja y la nueva funcionalizaci6n imperativa para el desarrollo de sistemas de administraci6n de genes mas eficientes.
Se reconoce ampliamente que empleando una estrategia de tratamiento individual contra el cancer por lo general resulta ineficaz debido a la naturaleza multifactorial de esta enfermedad. La combinaci6n de mas de un farmaco para maximizar la respuesta anticancer se utiliza cada vez mas. Vease Gene Ther., 2000, vol. 11, 1852. Se ha demostrado que existe una relaci6n sinergica entre la terapia de genes de IL-12 y la terapia de genes IFN-a. El co-tratamiento de tumores Renca con estos dos genes condujo a un rechazo del tumor de 100%, que fue mayor que aquel logrado con tratamientos o bien con IL-12 (58%) o IFN-a (25%) solos. De modo similar, los tumores CT26 demostraron un indice de rechazo de 50% con la genoterapia combinada, que fue mayor que el indice de rechazo de 17% y 0% logrado a partir de tratamientos individuales de IL-12 e IFN-a, respectivamente. Los tumores tratados con la terapia combinada demostraron una mayor infiltraci6n del tumor en celulas NK y celulas T CD8 en comparaci6n con tumores tratados por una monoterapia genica. La transferencia genica de metilguanina-DNA-metiltransferasa (MGMT) en celulas madre, junto con quimioterapia, protegieron las celulas normales de la quimioterapia y redujeron la toxicidad sistemica de la quimioterapia. Nature Reviews Cancer 2004, vol. 4, 296.
Asimismo, la genoterapia combinada aument6 el numero de moleculas CD40 en celulas que presenta antigenos (APC) en los tumores hasta niveles superiores que los logrados con tratamientos individuales. El incremento de CD40 en las APC se asocia con un estado de activaci6n superior para la presentaci6n de antigenos. Veanse Nature, 1998, vol. 393, 480; Nature, 1998, vol. 393, 474; y Nature, 1998, vol. 393, 478. Se observ6 un incremento similar en los niveles de mRNA para las quimiocinas IP-10 y TCA-3. La genoterapia combinada potenci6, por ende, sinergicamente la inmunidad antitumoral, y se hall6 que este efecto es duradero en estudios de re-exposici6n al tumor. Estudios de genoterapias combinadas similares han sido notificados por otros grupos. Vease Laryngoscope 2001, vol. 111, 815. Los tumores consolidados se trataron con pIFN-aiPVP, pIL-2ilipido o pIL-12iPVP solo, o sus combinaciones. La combinaci6n de pIFN-aiPVP, comparada con otras dos terapias, increment6 significativamente los efectos antitumorales frente a los tratamientos individuales. En otro estudio que utiliz6 el mismo modelo de tumor, se demostr6 que el tratamiento combinado con pIL-12iPVP y pIL-2ilipido proporciona efectos antitumorales significativamente superiores en comparaci6n con los tratamientos individuales. Vease Arch. Otolaryngol Head Neck Surg, 2001, vol. 127,1319.
En otro estudio, la inyecci6n intratumoral de poliplejos de polietilenimina lineal (PEI) con un anti-oncogen y un receptor de somatostatina de subtipo 2 (sst2), produjo una inhibici6n importante del desarrollo de tumores pancreaticos y metastasis en el higado. Curr Opin Biotechnol, 2002, vol.13, 128. La administraci6n de sst2 mediada por PEI en tumores condujo a un aumento de la apoptosis y activaci6n de las vias de caspasa-3 y poli(ADP-ribosa). La administraci6n sostenida de poliplejos DNAiPEI a tumores s6lidos produjo una mayor expresi6n que aquella obtenida por inyecci6n en embolada. Gene Ther., 1999, vol. 10, 1659. Se utilizaron dendrimeros para la inhibici6n de carcinoma pancreatico y carcinoma hepatocelular por transferencia genica intratumoral de Fas-L y HSV-1 timidina cinasa, respectivamente. Veanse Gene Ther., 2003, vol. 10, 434; y Gene Ther., 2000, vol. 7, 53.
La quimioinmunoterapia que emplea farmacos citot6xicos y citocinas ofrece un nuevo planteamiento para mejorar el tratamiento de enfermedades neoplasicas. La eficacia terapeutica de las combinaciones de proteinas IL-12 con ciclofosfamida, paclitaxel, cisplatino o doxorrubicina se ha investigado en el modelo de leucemia L1210 murino. Vease Int. J. Cancer, 1998, vol. 77, 720. El tratamiento de leucemia L1210 con IL-12 o uno de los agentes quimioterapeuticos anteriormente mencionados administrado solo produjo efectos antileucemicos moderados. La combinaci6n de IL-12 con ciclofosfamida o paclitaxel no produjo aumento de los efectos antileucemicos en comparaci6n con estos agentes administrados solos. No obstante, la combinaci6n de IL-12 con doxorrubicina aument6 el efecto antileucemico, mientras que la combinaci6n con cisplatino tuvo un efecto mejorador moderado.
Sin embargo, en el modelo de melanoma murino MmB16, la combinaci6n de IL-12 + paclitaxel fue mas eficaz que las terapias individuales. Cancer Lett., 1999, vol. 147, 67. Tambien se examin6 la eficacia antitumoral de la proteina IL-12 en combinaci6n con adriamicina, ciclofosfamida o 5-FU en carcinoma de vejiga MB-49 y en melanoma B16. Vease,
Clin. Cancer Res., 1997, vol. 3, 1661. En combinaci6n con quimioterapia, la administraci6n de IL-12 aument6 la actividad antitumoral sin causar toxicidad adicional. En sarcoma de rat6n MCA207 resistente al tratamiento con IL-12
o ciclofosfamida, la combinaci6n de IL-12 recombinante y ciclofosfamida produjo una mejor respuesta antitumoral que los tratamientos individuales. J. Immunol., 1998, vol. 160, 1369. En tumores mamarios de ratones, la terapia combinada que comprendia quimioterapia de paclitaxel intravenoso y genoterapia de IL-12 antitumoral (IL-12iWSLP) fue mas eficaz que las terapias individuales. Vease, Molecular Therapy, 2004, vol. 9, 829. El beneficio de esta terapia combinada dependi6 del vehiculo de administraci6n utilizado para el paclitaxel. Se observ6 la interacci6n sinergica entre paclitaxel y la genoterapia de IL-12 cuando el paclitaxel se formul6 en una formulaci6n polimerica. En comparaci6n, la combinaci6n con Cremophor EL (Taxol®), una formulaci6n de paclitaxel muy utilizada para la terapia del cancer, no fue sinergica, indicando que los beneficios observados eran especificos de la formulaci6n.
Para lograr un resultado deseable a partir de un planteamiento de combinaci6n que implica genoterapia, es importante la selecci6n de un sistema de administraci6n de genes apropiado. El sistema de administraci6n de genes utilizado en los experimentos de combinaci6n anteriormente mencionados (Molecular Therapy, 2004, vol. 9, 829) es un lipopolimero soluble en agua, PEI-Colesterol (WSLP). En la presente invenci6n, se describe el uso de una nueva clase de vehiculos polimericos (PEG-PEI-Colesterol) estructuralmente distinta de WSLP en el sentido que contiene un polimero hidr6filo disenado para mejorar la farmacocinetica, seguridad y potencia del sistema de administraci6n de genes y los ligandos de la membrana que interactuan (p. ej., colesterol) que se orientan en numerosas configuraciones geometricas para promover la actividad de transfecci6n de los genes antineoplasicos o bien solos o en combinaci6n con un agente quimioterapeutico. La ventaja de la actividad de transfecci6n de PPC en comparaci6n con WSLP en tejidos de tumores se ilustra en la FIG. l y en la FIG. 2.
La combinaci6n de dos agentes quimioterapeuticos o de un agente quimioterapeutico y una citosina se ha examinado clinicamente. Si bien estas combinaciones han producido mayor regresi6n tumoral, los beneficios de supervivencia a largo plazo son marginales, y la citotoxicidad ha representado un problema. Esto se debe a la toxicidad sistemica inherente con la quimioterapia y la terapia de proteinas recombinantes. Se deben disenar planteamientos de combinaciones nuevas y mas eficaces para mejorar la terapia del cancer futura. En la presente invenci6n, se describe un nuevo planteamiento de combinaci6n para el tratamiento del cancer, que comprende un agente terapeutico basado en acido nucleico administrado con un vehiculo polimerico y por lo menos un agente quimioterapeutico.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invenci6n provee composiciones farmaceuticas para el tratamiento de cancer o trastornos hiperproliferativos, como se expone en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
Ademas, la invenci6n provee composiciones segun lo definido en las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la inhibici6n del crecimiento y metastasis de celulas tumorales y para mejorar la supervivencia en mamiferos, mediante administraci6n in vivo.
El acido nucleico comprendido en las composiciones de la invenci6n se puede seleccionar del grupo que consiste en DNA plasmidico, siRNA, RNA sentido, RNA antisentido y ribozimas. El DNA plasmidico puede ser un sistema de expresi6n de genes que contiene una secuencia de DNA que codifica una proteina antineoplasica o antiproliferativa seleccionada del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina-12, interleucina-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, genes supresores de tumores, timidina cinasa, eNOS, iNOS; p53, p16, TNF-a, ligando Fas, oncogenes mutados, antigenos tumorales, antigenos viricos o antigenos bacterianos. El DNA plasmidico tambien puede codificar una molecula de shRNA disenada para inhibir proteina(s) implicadas en el desarrollo o el mantenimiento de celulas tumorales u otras celulas hiperproliferativas. Un DNA plasmidico puede codificar simultaneamente una proteina terapeutica y uno o mas shRNA. Asimismo, el acido nucleico de dicha composici6n puede ser una mezcla de DNA plasmidico y RNA sintetico, incluyendo RNA sentido, RNA antisentido o ribozimas.
El polimero de administraci6n de genes es un lipopolimero que comprende polietilenimina (PED), una cadena principal covalentemente unida a un polietilenglicol y a un colesterol. La polietilenimina puede ademas comprender un resto diana que incluye anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, receptores celulares, receptores del factor de crecimiento, receptores de citocinas, folato, transferrina, factor de crecimiento epidermico (EGF), insulina, asialoorosomucoide, manosa-6-fosfato (monocitos), manosa (macr6fago, algunas celulas B), Lewisx y sialilo Lewisx (celulas endoteliales), N-acetil-lactosamina (celulas T), galactosa (celulas de carcinoma de colon) y trombomodulina (celulas endoteliales de pulm6n de rat6n), agentes fusogenicos tales como polimixina B y hemaglutinina HA2, agentes lisosomotr6ficos, senales de localizaci6n de nucleo (NLS) tales como antigeno T y similares.
En una realizaci6n preferida de la composicl6n anterior, el agente farmaceutico es un farmaco quimioterapeutico seleccionado del grupo que consiste en taxanos, platinos, adriamicinas, ciclofosfamida, topotecan, carmustina (BCNU)
o sus combinaciones. Se prefieren particularmente paclitaxel, carboplatino, topotecan, gemcitabina y cualquiera de sus combinaciones.
En otra realizaci6n preferida de las composiciones anteriores, el agente farmaceutico es un anticuerpo antineoplasico seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo CD20, anticuerpo HER2ineu, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidermico y sus conjugados radioisot6picos.
Se describe un metodo para el tratamiento de cancer en mamiferos por administraci6n
intratumoral, intraperitoneal, intratraqueal, intracraneal o sistemica de composiciones farmaceuticas que comprenden un acido nucleico, un polimero de administraci6n de acido nucleico y por lo menos un farmaco quimioterapeutico complementario. Las composiciones de la invenci6n se pueden usar para tratar cancer mamifero seleccionado de un grupo que consiste en tumores primarios o metastaticos de ovario, mama, cerebro, cabeza y cuello, higado, pulm6n, pr6stata, rin6n, colon, pancreas, tiroides, vejiga urinaria, cavidad abdominal, cavidad toracica y piel. El acido nucleico y el polimero de administraci6n de genes se pueden administrar por administraci6n intratumoral, intraperitoneal, intratraqueal u oral o sistemica, antes o despues de la administraci6n de los agentes farmaceuticos. Por ejemplo, en algunos casos se prefiere administrar el acido nucleico (p. ej., pIL-12 DNAipolimero) antes del agente farmaceutico (p. ej., quimioterapia), ya que esto potenciaria potencialmente la sensibilidad del tumor al agente farmaceutico y dispararia una respuesta anti-cancer. En otro caso, se prefiere administrar el agente farmaceutico (p. ej., quimioterapia) antes de la administraci6n del gen (p. ej., pIL-12iPPC) para permitir que el agente farmaceutico cause la destrucci6n del tumor y la liberaci6n posterior de antigenos del tumor para ser utilizados por el gen terapeutico (p. ej., pIL-12ipolimero) a fin de producir una respuesta terapeutica altamente especifica y robusta (p. ej., respuesta inmunitaria) contra el cancer diana.
El tratamiento de tumores con dicha composici6n farmaceutica (acido nucleico mas polimero de administraci6n de genes y uno o mas agentes quimioterapeuticos) produce el encogimiento del tumor y la prolongaci6n de la vida. La combinaci6n de genoterapia (acido nucleico y polimeros de administraci6n de genes) con quimioterapia (agentes quimioterapeuticos) de acuerdo con el metodo de la presente invenci6n produce eficacia aditiva yio sinergica. La eficacia del metodo de la presente invenci6n se define como, aunque sin limitarse a ello, encogimiento del tamano del tumor o reducci6n de la densidad del tumor, un incremento en el recuento de linfocitos o un incremento en el recuento de neutr6filos, o una mejoria en la supervivencia, o todo lo antedicho. A su vez, la combinaci6n de genoterapia (acido nucleico y polimeros de administraci6n de genes) con quimioterapia (agentes quimioterapeuticos) de acuerdo con el metodo de la presente invenci6n reduce la toxicidad del agente quimioterapeutico y revierte la resistencia del tumor a la quimioterapia. La toxicidad se define en la presente memoria como cualquier efecto adverso relacionado con el tratamiento en la observaci6n clinica, incluyendo sin limitaci6n, hematologia o quimica en suero anormal, o toxicidad organica. Ademas, la combinaci6n de genoterapia (acido nucleico y polimeros de administraci6n de genes) con una dosis sub6ptima de quimioterapia (agentes quimioterapeuticos) de acuerdo con la presente invenci6n potencia el efecto anticancer hasta un nivel equivalente o superior a aquel logrado con la dosis 6ptima del agente quimioterapeutico pero con menor toxicidad.
En dicha terapia combinada, el acido nucleico puede ser un miembro seleccionado del grupo que consiste en DNA plasmidico, siRNA, RNA sentido, RNA antisentido y ribozimas. El acido nucleico puede ser un sistema de expresi6n de genes basado en plasmidos que contiene una secuencia de DNA que codifica una proteina antineoplasica o antiproliferativa seleccionada del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina-12, interleucina-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, genes supresores de tumores, timidina cinasa, eNOS, iNOS, p53, p16, TNF-a, ligando Fas, oncogenes mutados, antigenos tumorales, antigenos viricos o antigenos bacterianos. El DNA plasmidico puede tambien codificar una molecula de shRNA disenada para inhibir proteina(s) implicada en el crecimiento o mantenimiento de celulas tumorales u otras celulas hiperproliferativas. Un DNA plasmidico puede codificar simultaneamente una proteina terapeutica y una o mas moleculas de shRNA. Asimismo, el acido nucleico de dicha composici6n puede ademas ser una mezcla de DNA plasmidico y RNA sintetico. El polimero de administraci6n de genes es un polimero cati6nico o un polimero no condensante. El polimero cati6nico se selecciona del grupo que comprende polilisina, polietilenimina, derivados funcionalizados de polietilenimina, polipropilenimina, aminogluc6sidopoliamina, didesoxi-diamino-b-ciclodextrina, espermina y espermidina. Un ejemplo de un polimero de administraci6n de genes adecuado para la presente invenci6n es un lipopolimero que comprende una cadena principal de polietilenimina (PEI), un colesterol y un espaciador de polietilenglicol, donde el colesterol esta directamente unido a la cadena principal de polietilenimina o covalentemente unido al espaciador de polietilenglicol, que a su vez esta unido, mediante un enlace biocompatible, a la PEI. El polimero de administraci6n de genes de la presente invenci6n puede ademas comprender un resto diana que incluye anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, receptores celulares, receptores de los factores de crecimiento, receptores del factor de crecimiento epidermico, receptores de citocinas, folato, transferrina, factor de crecimiento epidermico (EOF), insulina, asialoorosomucoide, manosa-6-fosfato (monocitos), manosa (macr6fago, algunas celulas B), Lewisx y sialilo Lewisx (celulas endoteliales), N-acetillactosamina (celulas T), galactosa (celulas de carcinoma de colon) y trombomodulina (celulas endoteliales de pulm6n de rat6n), agentes fusogenicos tales como polimixina B y hemaglutinina HA2, agentes lisosomotr6picos, senales de localizaci6n de nucleo (NLS) tales como antigeno T y similares.
El farmaco quimioterapeutico puede ser un miembro seleccionado del grupo que consiste en texanos, platinos, adriamicinas, ciclofosfamida, topotecan, carmustina (BCNU) o una combinaci6n de estos. Se prefieren particularmente paclitaxel, carboplatino, topotecan, gemcitabina y cualquiera de sus combinaciones.
En otra realizaci6n, el agente farmaceutico puede ser un anticuerpo antineoplasico seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo CD20, anticuerpo HER2ineu, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidermico y sus conjugados radioisot6picos.
Se describe en la presente memoria un metodo para el tratamiento de cancer o trastornos hiperproliferativos en mamiferos por administraci6n intratumoral, intraperitoneal, intratraqueeal, intracraneal o sistemica de composiciones farmaceuticas que comprenden un sistema de expresi6n de genes basado en plasmido y un polimero de administraci6n de genes, sin un farmaco quimioterapeutico. Las composiciones de la invenci6n se pueden utilizar para tratar cancer mamifero seleccionado del grupo que consiste en tumores primarios o metastaticos de ovario, mama, cerebro, cabeza y cuello, tiroides, higado, pulm6n, pancreas, intestino, bazo, pr6stata, rin6n, vejiga urinaria, colon y melanoma. Preferiblemente, el acido nucleico es un sistema de expresi6n de genes basado en plasmido que contiene una secuencia de DNA que codifica una proteina antineoplasica o antiproliferativa seleccionada del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7interleucina-12interleucina-15, interfer6n-a, interfer6n-, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de granulocitos y macr6fagos, factor antiangiogenico, genes supresores de tumores, timidina cinasa, eNOS, iNOS, p53, p16, TNF-a, ligando Fas, oncogenes mutados, antigenos tumorales, antigenos viricos o antigenos bacterianos. El DNA plasmidico puede tambien codificar una molecula de shRNA disenada para inhibir proteina(s) implicadas en el crecimiento o el mantenimiento de celulas tumorales u otras celulas hiperproliferativas. Un DNA plasmidico puede codificar simultaneamente una proteina terapeutica y una o mas moleculas shRNA. A su vez, el acido nucleico de la composici6n mencionada puede ser tambien una mezcla de DNA plasmidico y RNA sintetico. El tratamiento de tumores con la composici6n farmaceutica (acido nucleico mas polimero de administraci6n de genes y uno o mas agentes terapeuticos) produce el achicamiento del tumor y la prolongaci6n de la vida.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 ilustra la diferencia en la eficacia de la transferencia de genes entre los polimeros de administraci6n de genes PEG-PEI-Colesterol (PPC) y un lipopolimero soluble en agua, PEI-Col (WSLP). Los polimeros de prueba formaron complejo con un plasmido de luciferasa y se administraron por via intratumoral a tumores de mama 4T1. La expresi6n de luciferasa se cuantific6 en los tejidos tumorales 24 horas despues.
La FIG. 2 ilustra el efecto de aumentar la relaci6n PEG:PEI en PEG-PEI-CoI sobre la eficiencia de la transferencia de genes a tumores 4T1 s6lidos por administraci6n intratumoral de complejos de plasmidoiPPC. El polimero PPC, sintetizado en diferentes relaciones PEG:PEI, form6 complejo con un plasmido de luciferasa y se administr6 por via intratumoral a tumores de mama 4T1. La expresi6n de luciferasa se cuantific6 en los tejidos tumorales 24 horas despues.
La FIG. 3 ilustra la transferencia del gen de IL-12 a tumores de mama s6lidos por administraci6n intratumoral (A) y a tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal (tumores ID8) por inyecci6n intraperitoneal (B) de complejos de pmIL-12iPPC. PPC form6 complejo con un plasmido de expresi6n del gen IL-12 (pmIL-12), y se administr6 por via intratumoral a tumores de mama 4T1 y por via intraperitoneal a ratones que portaban el tumor peritoneal ID8. Se cuantificaron los niveles de IL-12 despues de 24 horas en los tumores 4T1 y despues de 1, 2, 3 y 7 dias en la ascitis peritoneal en los animales que portaban el tumor ID8.
La FIG.4 ilustra el transcurso de tiempo de la producci6n de IFN-y que le sigue a la administraci6n intraperitoneal de pmIL-12iPPC. PPC form6 complejo con un plasmido de expresi6n del gen IL-12 de rat6n (pmIL-12), y se administr6 por via intraperitoneal a ratones que portaban el tumor peritoneal ED8. Se cuantificaron los niveles de IFN-y en ascitis peritoneal despues de 1, 2, 3 y 7 dias.
La FIG. 5 ilustra la inhibici6n dependiente de la dosis de tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal por administraci6n intraperitoneal de complejos pmIL-12iPPC. Los complejos pmIL-12iPPC, preparados en distintas dosis de DNA, se administraron por via intraperitoneal a ratones que portaban el tumor ED8 diseminado en la cavidad peritoneal. Los animales fueron pesados peri6dicamente para evaluar los efectos del tratamiento sobre la carga del tumor, y se registraron los datos de supervivencia.
La FIG. 6 ilustra el avance en la supervivencia de ratones que portan tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal por administraci6n intraperitoneal de complejos pmIL-12iPPC.
La FIG. 7 ilustra el avance en la supervivencia de los ratones que portaban tumores colorrectales diseminados en la cavidad peritoneal por administraci6n intraperitoneal de los complejos pmIL-12iPPC. Los complejos pmIL-12iPPC se administraron por via intraperitoneal a ratones que portaban los tumores. Se vigil6 la supervivencia de los animales de ensayo y control.
La FIG. 8 ilustra el avance en la supervivencia de ratones que portaban glioma GL-261. por administraci6n intratumoral de complejos pmIL-12iPPC. Los complejos pmIL-12iPPC se administraron a la cavidad craneal al momento de la implantaci6n del tumor. Se vigil6 la supervivencia de los animales de ensayo y control.
La FIG. 9 ilustra la inhibici6n de carcinoma de celulas escamosas subcutaneo por administraci6n intratumoral de complejos pmIL-12iPPC. Los complejos pmIL-12iPPC se administraron por via intratumoral a tumores SCCVII subcutaneos 6-7 dias despues de la implantaci6n del tumor, y el tratamiento se repiti6 una vez por semana por un total de 4 semanas. Para evaluar la eficacia del tratamiento, se midi6 peri6dicamente el tamano del tumor.
La FIG. 10 ilustra la inhibici6n de los tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal por terapia combinada que comprendia pmIL-12iPPC intraperitoneal y paclitaxel intravenoso. Los complejos pmlL-12iPPC se administraron por inyecci6n intraperitoneal 21 dias despues de la implantaci6n de celulas tumorales. El tratamiento pmIL-12iPPC se repiti6 7 dias despues. El paclitaxel se administr6 por via intravenosa solamente una vez, el dia antes de la primera inyecci6n del gen. Se vigil6 la supervivencia de los animales de ensayo y control.
La FIG. 11 ilustra la inhibici6n de tumores ovaricos ID8 diseminados en la cavidad peritoneal por terapia combinada que comprendia pmIL-12iPPC intraperitoneal y quimioterapia de gemcitabina. Los ratones que portaban el tumor se trataron con gemcitabina intraperitoneal 14 dias despues de la implantaci6n del tumor, y el tratamiento se repiti6 una vez por semana por un total de 4 tratamientos. El primer tratamiento de pmlL-12iPPC se administr6 17 dias despues de la implantaci6n del tumor por inyecci6n intraperitoneal y se repiti6 una vez por semana por un total de 4 tratamientos. Se vigil6 la supervivencia de los animales de ensayo y control.
La FIG. 12 ilustra la inhibici6n de tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal por terapia combinada que comprendia pmIL-12iPPC intraperitoneal y quimioterapia de carboplatinoipaclitaxel. El tratamiento de quimioterapia comenz6 15 dias despues de la implantaci6n del tumor, se administr6 carboplatino una vez por semana durante 4 semanas y Taxol una vez cada dos semanas por un total de dos tratamientos. El primer tratamiento de pmIL-12iPPC se administr6 18 dias despues de la implantaci6n del tumor por inyecci6n intraperitoneal y se repiti6 una vez por semana por un total de 4 tratamientos. Se vigil6 la supervivencia de los animales de ensayo y control.
La FIG. 13 ilustra la inhibici6n de tumores SCCVH por administraci6n intratumoral de complejos pmlL-12iPPC y quimioterapia de ciclofosfamida. Los complejos pmIL-12iPPC se administraron por via intratumoral a tumores SCCVH subcutaneos 6-7 dias despues de la implantaci6n del tumor, y el tratamiento se repiti6 una vez por semana durante un total de 4 semanas. Se administr6 Cytoxan por via intravenosa un dia antes de la inyecci6n de los genes y se repiti6 despues de 14 dias. Para evaluar la eficacia del tratamiento, se midi6 peri6dicamente el tamano del tumor.
La FIG. 14 ilustra la inhibici6n del glioma GL261 por administraci6n intratumoral de complejos pmlL-12iPPC y quimioterapia de BCNU. Los complejos pmIL-12iPPC se administraron a la cavidad craneal al momento de la implantaci6n del tumor. Se administr6 BCNU como una oblea de Gliadel 5 dias despues de la implantaci6n del tumor. Se vigil6 la supervivencia de los animales de ensayo y control.
La FIG. 15 ilustra que la adici6n de la genoterapia de IL-12iPPC a la quimioterapia de bajas dosis de carboplatinoipaclitaxel no incrementa la toxicidad. En comparaci6n, el tratamiento con quimioterapia de altas dosis de carboplatinoipaclitaxel condujo a un indice de 30% de muertes asociadas al tratamiento. El tratamiento de quimioterapia comenz6 15 dias despues de la implantaci6n del tumor, se administr6 carboplatino una vez por semana durante 4 semanas, y Taxol una vez cada dos semanas por un total de dos tratamientos. El primer tratamiento de pmIL-12iPPC tuvo lugar 18 dias despues de la implantaci6n del tumor por inyecci6n intraperitoneal y se repiti6 una vez por semana por un total de 4 tratamientos. Todo el ciclo de tratamiento se repiti6 tres veces. Se vigil6 la supervivencia de los animales de ensayo y control.
DESCRIPCION DETALLADA
Antes de describir la presente composici6n y el presente metodo para administraci6n de un agente bioactivo, se ha de entender que las configuraciones particulares, etapas de procesos y materiales descritos en la presente memoria describen realizaciones particulares solamente y no tienen como fin ser limitativos, ya que el alcance de la presente invenci6n solamente estara limitado por las reivindicaciones anejas.
Se ha de observar que, tal como se emplean en esta memoria y en las reivindicaciones anejas, las formas singulares "un," "una" y "el", "la" incluyen las referencias al plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a un polimero que contiene "un enlace disulfuro" incluye la referencia a dos o mas de dichos enlaces disulfuro, la referencia a "un ligando" incluye la referencia a uno o mas de dichos ligandos, y la referencia a "un farmaco" incluye la referencia a dos o mas de dichos farmacos.
En la descripci6n y reivindicaci6n de la presente invenci6n, se empleara la siguiente terminologia de acuerdo con las definiciones expuestas a continuaci6n.
"Transfectar" o "transfecci6n" significa transportar acidos nucleicos desde el entorno externo a una celula hasta el entorno celular interno, con referencia particular al citoplasma yio al nucleo celular. Sin desear influencias de ninguna
teoria particular, se ha de entender que los acidos nucleicos pueden ser suministrados a las celulas o bien despues de ser encapsulados dentro o adheridos a uno o mas complejos de polimero cati6nicoiacido nucleico o atrapados alli. Los ejemplos particulares de transfecci6n suministran un acido nucleico a un nucleo celular. Los acidos nucleicos incluyen DNA y RNA como tambien sus congeneres sinteticos. Dichos acidos nucleicos incluyen de sentido alterado, antisentido, finalizador, como tambien nucle6tidos que producen proteinas, nucle6tidos reguladores de iniciaci6n y detenci6n, y de velocidad, que controlan la producci6n de proteinas, peptidos y acidos nucleicos. En particular, aunque sin limitarse a ello, pueden ser DNA gen6mico, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, secuencias de hibridos o secuencias sinteticas o semisinteticas, y de origen natural o artificial. Ademas, el acido nucleico puede ser de tamano variable, oscilando entre oligonucle6tidos y cromosomas. Estos acidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, virico o sintetico. Pueden obtenerse por cualquier tecnica conocida por el experto en la materia.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresi6n "agente farmaceutico" o "farmaco" o cualquier otro termino
o expresi6n similar significa cualquier material o compuesto quimico o biol6gico adecuado para administraci6n por lo metodos previamente conocidos en la tecnica yio por los metodos descritos en la presente invenci6n, que inducen un efecto biol6gico o farmacol6gico deseado, que puede incluir, aunque sin limitarse a ello (1) un efecto profilactico sobre el organismo, y la prevenci6n de un efecto biol6gico no deseado tal como la prevenci6n de una infecci6n , (2) alivio de una afecci6n causada por una enfermedad, por ejemplo, alivio de dolor o inflamaci6n causados como consecuencia de una enfermedad, yio (3) o bien alivio, reducci6n o eliminaci6n completa de una enfermedad del organismo. El efecto puede ser local, tal como proporcionando un efecto anestesico local, o puede ser sistemico.
La presente invenci6n no se refiere a nuevos farmacos o a nuevas clases de agentes bioactivos per se. En cambio, se refiere a composiciones de copolimeros cati6nicos biocompatibles y metodos para usar dichas composiciones para la administraci6n de genes u otros agentes bioactivos que existen en el estado de la tecnica o que pueden consolidarse luego como agentes activos y que son adecuados para administraci6n por la presente invenci6n. Dichas sustancias incluyen clases amplias de compuestos normalmente administrados al organismo. En general, esto incluye, aunque sin limitarse a ello, acidos nucleicos, tales como DNA, RNA y oligonucle6tidos, anti-infectivos tales como antibi6ticos y agentes antiviricos; analgesicos y combinaciones analgesicas; anorexicos; antihelminticos; antiartriticos; antihistaminicos; anticonvulsionantes; antidepresivos; antidiabeticos; antidiarreicos; antihistaminicos; antinflamatorios; preparaciones antimigrana; antivomitivos; antineoplasicos; farmacos antiparkinsonianos; antipruriticos; antipsic6ticos; antipireticos; antiespasm6dicos; anticolinergicos, simpatomimeticos; derivados de xantina; preparaciones cardiovasculares incluyendo bloqueantes del canal de potasio, calcio, beta-bloqueantes, alfa-bloqueantes y antiarritmicos; antihipertensivos; diureticos y antidiureticos; vasodilatadores incluyendo estimulantes coronarios, perifericos y cerebrales; del sistema nervioso central; vasoconstrictores; preparaciones para la tos y el resfriado, incluyendo descongestivos; hormonas tales como estradiol y otros esteroides incluyendo corticosteroides; hipn6ticos; inmunosupresores; relajantes musculares, parasimpaticoliticos; psico-estimulantes; sedantes y tranqulizantes. Por el metodo de la presente invenci6n, se pueden administrar los farmacos en todas las formas, p. ej., ionizados, no ionizados, de base libre, sales de adici6n de acidos y similares, como tambien los farmacos de bajo o alto peso molecular. La unica limitaci6n al genero o especie de agente bioactivo que se ha de administrar es aquella de la funcionalidad que puede determinarse facilmente por experimentaci6n de rutina.
Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "biocompatible" o "biodegradaci6n" se define como la conversi6n de materiales en intermedios menos complejos o productos terminados por hidr6lisis de solubilizaci6n, o por la acci6n de entidades biol6gicamente formadas que pueden ser enzimas y otros productos del organismo.
Tal como se emplea en la presente memoria, "cantidad eficaz" significa la cantidad de acido nucleico o de un agente bioactivo que es suficiente para proveer el efecto local o sistemico deseado y el desempeno deseado con una relaci6n razonable de riesgoibeneficio, que se esperaria de cualquier tratamiento medico.
Tal como se emplea en la presente memoria, "peptido" significa peptidos de cualquier longitud, e incluye proteinas. Los terminos "polipeptido" y "oligopeptido" se emplean en la presente memoria sin ninguna limitaci6n particular de tamano, a menos que se establezca especificamente un tamano particular. Los ejemplos tipicos de peptidos que se pueden utilizar se seleccionan del grupo que consiste en oxitocina, vasopresina, hormona adrenocorticotr6pica, factor de crecimiento epidermico, prolactina, luliberina u hormona liberadora de la hormona luteinizante, hormona del crecimiento, factor liberador de la hormona del crecimiento, insulina, somatostatina, glucag6n, interfer6n, gastrina, tetragastrina, pentagastrina, urogastroina, secretina, calcitonina, encefalinas, endorfinas, angiotensinas, renina, bradiquinina, bacitracinas, polimixinas, colistinas, tirocidina, gramicidinas y analogos sinteticos, sus modificaciones y fragmentos farmacol6gicamente activos, anticuerpos monoclonales y vacunas solubles. La unica limitaci6n al farmaco de proteina o peptido que se puede utilizar es una de funcionalidad.
Tal como se emplea en la presente memoria, un "derivado" de carbohidrato incluye, por ejemplo, una forma de acido de un azucar, p. ej., acido glucur6nico; una amina de un azucar, p. ej., galactosamina; un fosfato de un azucar, p. ej., manosa-6-fosfato y similares.
Tal como se emplea en la presente memoria, "administrar" y terminos similares significa proporcionar la composici6n al individuo que se esta tratando, de manera tal que la composici6n sea capaz de circular en forma sistemica, donde
la composici6n se une a una celula diana y es absorbida por endocitosis. Por lo tanto, la composici6n se administra preferiblemente al individuo, tipicamente por las rutas subcutanea, intramuscular, transdermica, intravenosa o intraperitoneal. Los inyectables para tal uso pueden prepararse en formas convencionales, o bien como una disoluci6n
o suspensi6n liquida, o en una forma s6lida que sea adecuada para preparaci6n como disoluci6n o suspensi6n en un liquido antes de la inyecci6n, o como una emulsi6n. Los excipientes adecuados que se pueden utilizar para administraci6n incluyen, por ejemplo, agua, disoluci6n salina, dextrosa, glicerol, etanol y similares, y si se desea, cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, y similares.
Tal como se emplea en la presente memoria, "eficacia" y terminos similares significan la desaparici6n del tumor o el encogimiento del tumor en tamano, o reducci6n de la densidad del tumor, o aumento en el recuento de linfocitos o aumento en el recuento de neutr6filos o avance en la supervivencia, o todo lo antedicho.
Tal como se emplea en la presente memoria, "toxicidad" se define como cualquier efecto adverso asociado al tratamiento en la observaci6n clinica, incluyendo sin limitaci6n, hematologia o resultados de quimica en suero anormales, o toxicidad organica.
Las nuevas estrategias de tratamiento del cancer se centran en la administraci6n de macromoleculas que portan informaci6n genetica, en lugar de una proteina terapeutica propiamente dicha, permitiendo que los genes administrados en forma ex6gena se expresen en el entorno tumoral. Los metodos que utilizan sistemas de administraci6n de genes no viricos se consideran seguros comparados con los sistemas de administraci6n viricos, pero la aplicaci6n practica de los sistemas polimericos actuales no ha sido satisfactoria debido a la deficiente eficiencia. Se ha descrito recientemente una estrategia mediante la cual la eficiencia de la transfecci6n genica de un PEI de bajo peso molecular se potenci6 por uni6n covalente de colesterol formando un lipopolimero soluble en agua (WSLP). Vease, Mol. Ther., 2001, 4, 130. La transferencia del gen de IL-12 a tumores s6lidos con WSLP fue significativamente mejor que con el PEI no modificado y condujo a una inhibici6n del tumor mas significativa.
La presente invenci6n provee un nuevo sistema polimerico, PEG-PEI-Colesterol (PPC), que difiere de WSLP (PEI-Colesterol) en el sentido que contiene restos PEG y produce una eficiencia de transfecci6n significativamente superior en los tumores (FIG. 1). La adici6n de PEG esta disenada para potenciar la estabilidad de los complejos de acido nucleicoipolimero en el medio biol6gico a fin de manejar esta deficiencia de la tecnica anterior (WSLP). Asimismo, la adici6n de cadenas de PEG permite la incorporaci6n de ligandos en la cadena de PPC para mejorar la selectividad de tejido de la administraci6n. Por ejemplo, el resto de colesterol que esta directamente unido a la cadena principal PEI en la tecnica anterior (WSLP) puede extenderse mas a partir de la cadena principal PEI para crear una geometria mas flexible para la interacci6n del receptor celular. El control del numero de moleculas PEG por unidad de la cadena principal PEI es importante para lograr la potenciaci6n 6ptima en la actividad de transfecci6n. Como se ilustra en la FIG. 2, la magnitud de la transferencia genica al tumor depende de la relaci6n entre los diferentes componentes de PPC, el PEG, PEI y colesterol. Un intervalo preferido de la composici6n fue una relaci6n molar PEG:PEI de 2-4 a un contenido de colesterol fijo. La relaci6n 6ptima entre PEI y colesterol fue 1:0.5 a 1:1. La capacidad de PPC de promover la transferencia genica a tumores se examin6 con un gen terapeutico. El plasmido de expresi6n que contenia los genes IL-12 (pmIL-12) de rat6n form6 complejo con PPC en una relaci6n de nitr6geno (N) a fosfato (P) (relaci6n N:P) de 11:1 y se administr6 por via intratumoral a ratones con tumores 4T1 s6lidos, o por via intraperitoneal a ratones con tumores ovaricos diseminados a la cavidad peritoneal.
En ambos modelos de tumores, la transferencia del gen IL-12 se manifest6 por un incremento en los niveles de IL-12 (FIG. 3). En los ratones que portaban el tumor peritoneal, se alcanzaron los niveles de IL-12 post-tratamiento al cabo de 24 horas y declinaron hasta el nivel inicial aproximadamente a los 7 dias. La cinetica de la acci6n de IL-12 se relacion6 estrictamente con una elevaci6n de IFN-y, un mediador en direcci6n 3� de las acciones de IL-12 (FIG. 4). La elevaci6n en los niveles de IFN-y estuvo algo demorada tal como se esperaba, y permaneci6 elevada encima del valor inicial despues de 7 dias. Estos datos demuestran que las composiciones que comprenden plasmidos de expresi6n de IL-12 y PPC son capaces de manifestar la transferencia del gen de IL-12 en diferentes tipos de tumores y por diferentes rutas de administraci6n. La transferencia del gen de IL-12 mediada por pmIL-12iPPC es terapeuticamente significativa, ya que conduce a una inhibici6n significativa del crecimiento del tumor.
En ratones con tumores de ovario diseminados a la cavidad peritoneal, la administraci6n intraperitoneal de complejos pmIL-12iPPC (relaci6n N:P 11:1) en una dosis de DNA de 10-250 �g redujo significativamente la carga del tumor (FIG. 5) y mejor6 la supervivencia (FIG. 6) en un modo dependiente de la dosis. El efecto terapeutico de pmIL-12iPPC (relaci6n N:P 11:1) tambien se observ6 en cancer colorrectal. La administraci6n intraperitoneal de 25 ug de complejos pmIL-12iPPC en ratones con cancer colorrectal diseminado a la cavidad peritoneal prolong6 significativamente su supervivencia, en comparaci6n con animales no tratados (FIG. 7). La eficacia anticancer de la transferencia del gen de IL-12 por pmIL-12iPPC tambien se observ6 en tumores s6lidos despues de la administraci6n intratumoral. La FIG. 8 ilustra los efectos de la inyecci6n intratumoral de pmIL-12iPPC sobre el desarrollo de tumores cerebrales GL261. El tratamiento de implantes intracraneales de glioma GL261 de rat6n por administraci6n local de complejos pIL-12iPPC (relaci6n N:P 11:1) mejor6 significativamente la supervivencia. En ratones con carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello implantado subcutaneamente, la administraci6n intratumoral de complejos pmIL-12iPPC una vez por semana durante cuatro semanas produjo una inhibici6n significativa del indice de crecimiento del tumor (Fig. 9). El efecto antineoplasico de los complejos pmIL-12iPPC tambien se observ6 en tumores ovaricos y mamarios.
La composici6n utilizada en la presente invenci6n (acido nucleico y polimero de administraci6n de genes) no ejerce efectos colaterales adversos cuando se administra in vivo. Por ejemplo, ninguna muerte o signos clinicos de toxicidad relacionados con el compuesto se asociaron con la administraci6n de pmIL-12iPPC; pmIL-12iPPC intraperitoneal o subcutaneo fue bien tolerado tanto en ratones macho como hembra en dosis de 10, 50 y 250 ug por animal. El examen histopatol6gico de los animales en ambos grupos de dosis IP y SC no demostr6 signos de toxicidad sistemica debida a pmIL-12iPPC, se observ6 inflamaci6n leve en los 6rganos ubicados en o adyacentes al sitio de inyecci6n, pero esta cedi6 durante un periodo de recuperaci6n de un mes. Estos resultados demuestran que las composiciones de acido nucleicoipolimero para el tratamiento del cancer son eficaces contra una diversidad de tipos de cancer cuando se administran por diferentes modos de administraci6n, y que la administraci6n repetida in vivo no causa toxicidad grave.
Se reconoce ampliamente que una estrategia de tratamiento individual contra el cancer en general es ineficaz debido a la naturaleza multifactorial de esta enfermedad. El beneficio de la combinaci6n de mas de un farmaco para maximizar la respuesta anticancer es cada vez mas reconocido. A pesar de los datos preclinicos alentadores, el exito clinico de las combinaciones quimio-quimio o de las combinaciones quimio-citocina examinado hasta la fecha no ha sido satisfactorio debido a la toxicidad inherente de los farmacos quimioterapeuticos y de las proteinas citocinas recombinantes. Esto garantiza la necesidad de un planteamiento de quimioinmunoterapia mas seguro para reducir la toxicidad de las proteinas y mejorar la eficacia. En la presente descripci6n, se ha combinado un agente quimioterapeutico con administraci6n de un gen antineoplasico administrado localmente al sitio del tumor para mejorar la seguridad y eficacia del tratamiento. Al combinar la administraci6n local segura y eficiente de un gen antineoplasico con un agente quimioterapeutico estandar se potenciara la respuesta anticancer y la supervivencia del paciente sin aumentar la toxicidad. Esta terapia combinada reducira la dosis de quimioterapia y aumentara la sensibilidad del tumor a la quimioterapia. Esta demostrado que las composiciones farmaceuticas que comprenden un gen antineoplasico que forma complejo con un polimero de administraci6n de genes cati6nico, y por lo menos un farmaco quimioterapeutico complementario, es mas eficaz que la genoterapia o la quimioterapia administradas solas. Ademas, la terapia combinada es eficaz contra una gran variedad de tumores cuando se administra por diferentes rutas de administraci6n, y no aumenta la toxicidad comparada con las terapias individuales.
La respuesta anticancer a la terapia combinada esta demostrada en tumores ovaricos implantados en la cavidad peritoneal. La administraci6n intravenosa de paclitaxel (Taxor®) (8 mgikg) o la administraci6n intraperitoneal de plasmido mIL-12 (25 -100 ug)icomplejos PPC (relaci6n N:P 11:1) produjo reducci6n del tumor y mejora de la supervivencia en los ratones que portaban los tumores. El tratamiento de pmlL-12iPPC fue mas eficaz que el tratamiento de paclitaxel. La combinaci6n del gen de IL-12 y terapia de paclitaxel produjo mayor respuesta del tratamiento que los tratamientos individuales (FIG. 10). Se observ6 un efecto similar de la terapia combinada en cancer de ovario cuando se combin6 genoterapia de IL-12 con otro agente quimioterapeutico, gemcitabina (Gemzar®) (FIG.ll). La actividad antineoplasica de la gemcitabina se potenci6 significativamente cuando se us6 junto con el tratamiento de pmIL-12iPPC. Se investig6 la combinaci6n de genoterapia de IL-12 con una mezcla de dos agentes quimioterapeuticos. Como se indica en la FIG. 12, la combinaci6n de genoterapia de IL-12 con un c6ctel de carboplatino (Paraplatin®)ipaclitaxel produjo una mayor supervivencia que la terapia de IL-12 o la quimioterapia solas. La adici6n de genoterapia de IL-12 a una dosis sub6ptima de carboplatinoipaclitaxel potenci6 la eficacia terapeutica similar a aquella lograda con una alta dosis de quimioterapia (FIG. 12) sin aumentar la toxicidad.
El avance en la respuesta anticancer por la terapia combinada se observ6 tambien en tumores s6lidos. Por ejemplo, en carcinoma de celulas escamosas subcutaneo de la cabeza y el cuello, la administraci6n intravenosa del agente quimioterapeutico ciclofosfamida (150 mgikg) redujo significativamente el crecimiento del tumor, pero no lo inhibi6 por completo (FIG. 13). La inyecci6n intratumoral de pmIL-12iPPC solo caus6 aproximadamente 30% de inhibici6n del crecimiento del tumor. En contraste con los tratamientos individuales, el tratamiento combinado de ciclofosfamida mas pmIL-12iPPC caus6 una inhibici6n completa del crecimiento del tumor. El rechazo total aument6 drasticamente de solamente 10% con ciclofosfamida a 55% con ciclofosfamida mas los complejos pmIL-12iPPC. Una sola inyecci6n intratumoral de una dosis sub6ptima (1,5 ug) de complejos pmlL-12iPPC en tumores cerebrales GL261 no potenci6 de manera significativa el indice de supervivencia de los animales. No obstante, la combinaci6n de esta dosis sub6ptima de pmIL-12iPPC con el agente quimioterapeutico BCNU (oblea Gliadel®) produjo una mejoria significativa del indice de supervivencia (FIG. 14).
El tratamiento del cancer con quimioterapia de altas dosis se asocia con toxicidad grave. Para examinar si la adici6n de IL-12iPPC a quimioterapia de baja dosis aumenta la toxicidad relacionada con el tratamiento, se trataron ratones que portaban tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal con tres ciclos de tratamiento (en comparaci6n con un solo ciclo de tratamiento) de IL-12iPPC y quimioterapia de baja dosis, y se vigilaron los signos de toxicidad. Se realiz6 una comparaci6n directa con los animales tratados con tres ciclos de tratamiento de quimioterapia de alta dosis. Como se muestra en la FIG. 15, 50% del grupo de quimioterapia de alta dosis muri6 debido a toxicidad relacionada con el tratamiento (es decir, antes de alcanzar los 40 gramos), mientras que ninguno del grupo de IL12iPPC + quimioterapia de baja dosis muri6 por toxicidad del tratamiento. Estos resultados demuestran que la toxicidad de la quimioterapia convencional (alta dosis) para el cancer puede reducirse significativamente disminuyendo la dosis de la quimioterapia y anadiendo genoterapia de IL-12 mas segura y eficaz.
Estos datos demuestran la eficacia antineoplasica de dichas composiciones que comprenden plasmidos de IL-12 y un nuevo polimero de administraci6n de genes, y su aumento con un solo agente o una mezcla de agentes quimioterapeuticos. El planteamiento de combinaci6n provee un metodo mediante el cual la eficacia de una dosis sub6ptima de un regimen de quimioterapia se potencia sin aumentar la toxicidad.
Los siguientes ejemplos permitiran al experto en la tecnica entender mas claramente c6mo practicar la presente invenci6n. Se ha de entender que, si bien la invenci6n se ha descrito junto con sus realizaciones especificas preferidas, lo siguiente tiene como fin ilustrar y no limitar el alcance de la invenci6n.
EJEMPLO 1
Transferencia del gen IL-12 a tumores diseminados a la cavidad peritoneal o subcutaneos por administraci6n local de complejos pIL-12iPPC
Se examin6 la capacidad de la administraci6n local de complejos pIL-12iPPC para producir niveles de IL-12 en ratones que portaban tumores subcutaneos y diseminados en la cavidad peritoneal. Para estudios de tumores subcutaneos, se inyectaron subcutaneamente (sc) a los flancos derechos e izquierdos de ratones BALBic (7 semanas, 14-18 gramos) 1x106 celulas 4T1. Despues de que los tumores habian alcanzado un tamano de aproximadamente 60 mm3, se les inyectaron complejos pmIL-12iPPC que contenian 6 ug de DNA. Los ratones fueron sacrificados 24 horas despues, y se extirparon los tumores para analisis de mIL12 por ELISA. Los niveles de mIL-12 en los tumores 24 horas despues de la inyecci6n se muestran en la Fig. 3A.
Para los estudios de tumores peritoneales, ratones C57iBL6 hembra recibieron inyecciones intraperitoneales (ip) de 5 x 106 celulas ID8 en un volumen de 500 �l. Los tratamientos comenzaron cuando la carga del tumor (peso del rat6n) alcanz6 aproximadamente 20 gramos (�21 dias despues de la inyecci6n de las celulas). Los ratones recibieron una inyecci6n intraperitoneal de una sola dosis de pmIL-12iPPC en una relaci6n 11:1 nitr6geno (N) a fosfato (P) (relaci6n N:P) en un volumen de 500 ul. Se extrajo fluido de ascitis de los animales que portaban el tumor 1, 2, 3 y 7 dias despues de que los ratones habian sido tratados con pmIL-12iPPC. Se determinaron los niveles de mIL-12 e IFN-y por ELISA y se normalizaron hasta liquido ascitico total. Los resultados indican que se observan niveles significativos de mIL-12 en liquido ascitico con niveles maximos logrados 1 dia despues del tratamiento, con niveles que caen hasta cerca de la linea inicial alrededor de 7 dias despues del tratamiento (FIG. 3B). Se observa un aumento similar de los niveles de IFN-y, pero los niveles maximos se demoran temporalmente (pico en el dia 3) con respecto a los niveles de IL-12 y alrededor de 7 dias despues del tratamiento habian caido pero estaban todavia significativamente por encima de los niveles iniciales (FIG. 4).
EJEMPLO 2
Tratamiento de tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal por administraci6n intraperitoneal de complejos pIL-12iPPC
Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 5 x 106 celulas ID8 a un volumen de 500 ul. Los tratamientos comenzaron cuando la carga del tumor (peso del rat6n) alcanz6 aproximadamente 20 gramos (�21 dias despues de la inyecci6n de las celulas). Los ratones recibieron tres inyecciones semanales intraperitoneales de 10-250 �g de pIL12 formando complejo con PPC en una relaci6n N:P de 11:1 en un volumen de 500 �l. Los ratones fueron pesados peri6dicamente durante el curso del estudio. El aumento de peso es causado predominantemente por la acumulaci6n de ascitis, lo cual provee una evaluaci6n indirecta del avance de la enfermedad y de la carga del tumor. El tratamiento de pmIL-12iPPC produjo una inhibici6n de la carga del tumor dependiente de la dosis (FIG. 5) y la prolongaci6n de la supervivencia del animal (FIG., 6).
EJEMPLO 3
Tratamiento de tumores colorrectales diseminados en la cavidad peritoneal por administraci6n intraperitoneal de complejos pIL-12iPPC
Los ratones recibieron inyecciones de 0,1 x 106 celulas CT26 en un volumen de 500 �l. Los tratamientos comenzaron 1 dias despues de la implantaci6n del tumor. Los ratones recibieron cinco inyecciones semanales intraperitoneales de 50 �g de pmIL-12 en formando complejo con PPC, o 25 �g de pIL-12 formando complejo con LPPC6 en una relaci6n
N:P de 11:1 en un volumen de 500 �l. LPPC6 es una polietilenimina lineal de 15 kD a la que se unen independientemente una molecula de mPEG y 6 moleculas de colesterol. Como se ilustra en la Fig. 7, el tratamiento de pmIL-12iPPC y pmIL-12iLPPC6 produjo una mejoria significativa en la supervivencia en comparaci6n con los controles no tratados en este modelo de tumor altamente agresivo.
EJEMPLO 4
Tratamiento de cancer cerebral por administraci6n intratumoral de complejos pIL-12iPPC.
El efecto de la administraci6n local de complejos pmIL-12iPPC se examin6 en un modelo de glioma de rat6n. Los tumores se implantaron en la corteza cerebral de ratones por inyecci6n intracraneal de 1 x 105 celulas de glioma GL261 junto con la co-inyecci6n de complejos pmIL-12iPPC. Se vigilaron signos de neurotoxicidad en los animales, y se les practicaron autopsias, cuando fue posible, para confirmar que la muerte se debi6 al tumor intracraneal. La supervivencia se registr6 usando una curva de analisis de supervivencia Kaplan-Meier. Una inyecci6n intracraneal individual de complejos pmIL-12iPPC administrada en un intervalo de dosis de 2,5 -30 �g de plasmido fue bien tolerada, ya que no se observaron efectos adversos importantes. Una inyecci6n individual de complejos pmIL-12iPPC en una dosis de 15 �g de plasmido produjo un avance significativo en la supervivencia de los animales (Fig. 8).
EJEMPLO 5
Tratamiento de cancer de cabeza y cuello por administraci6n intratumoral de complejos pIL-12iPPC
Se examin6 el efecto de la administraci6n local de complejos pIL-12iPPC sobre el crecimiento de carcinoma de celulas escamosas implantado subcutaneamente (SCCVH). Se implantaron sc 4 x 10s celulas de carcinoma escamosas en 100 �l en el flanco derecho de ratones CH3 hembra (6-9 semanas, 17-22 gramos) El plasmido mIL-12 form6 complejo con PPC en una relaci6n N:P de 11:1 y se administr6 localmente a los tumores en una dosis de DNA de 25 �g en un volumen de inyecci6n de 50 �l una vez por semana durante cuatro semanas, comenzando �11 dias despues de la implantaci6n del tumor. Se utilizaron grupos de tratamiento de 12 ratones y se vigil6 el crecimiento del tumor dos veces por semana, usando una medici6n con calibre. Como se indica en la FIG. 9, la administraci6n intratumoral de complejos pmlL-12iPPC produjo una inhibici6n parcial pero significativa del crecimiento del tumor.
EJEMPLO 6
Terapia combinada de pIL-12iPPC mas paclitaxel para el tratamiento de tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal
Se combin6 genoterapia de IL-12 intraperitoneal con quimioterapia de paclitaxel para potenciar la respuesta terapeutica a tumores ovaricos diseminados en ratones. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 5 x 106 celulas ED8 en un volumen de 500 �l. Los tratamientos comenzaron cuando la carga del tumor (peso del rat6n) alcanz6 aproximadamente 20 gramos (�21 dias despues de la inyecci6n de las celulas). Los ratones recibieron inyecci6n intraperitoneal de 25 �g de pmIL-12 formando complejo con PPC en una relaci6n N:P de 11:1 en un volumen de 500 �l. El tratamiento con el gen se repiti6 despues de 7 dias, constituyendo un total de dos inyecciones (Dia 1, 8) conforme al estudio. Se administr6 paclitaxel (Taxol®) solamente una vez (Dia 0) por inyecci6n intravenosa en una dosis de 8 mgikg en un volumen de inyecci6n de 250 �L. Para la terapia de combinaci6n, ambos tratamientos de genoterapia y quimioterapia se administraron como se describi6 precedentemente. Los animales fueron pesados peri6dicamente para evaluar el efecto del tratamiento con el gen sobre la carga del tumor. La inyecci6n intraperitoneal de complejos pmIL-12iPPC solos produjo una reducci6n significativa de la carga del tumor peritoneal. La inhibici6n de la carga del tumor por los complejos pmIL-12iPPC fue ligeramente superior que con paclitaxel. La adici6n de genoterapia de IL-12 al paclitaxel produjo una mejoria en la acci6n del paclitaxel sobre la carga del tumor y la supervivencia (FIG. 10).
EJEMPLO 7
Terapia combinada de pIL-12iPPC mas gemcitabina para el tratamiento de cancer de ovario diseminado en la cavidad peritoneal
Se evalu6 la eficacia de combinar la genoterapia de IL-12 con Gemcitabina (Gemzar®). La gemcitabina pertenece a un grupo general de farmacos de quimioterapia conocidos como antimetabolitos. Se utiliza para tratar cancer de pancreas, cancer de mama (junto con paclitaxel) y cancer de pulm6n (junto con cisplatino), y actualmente esta siendo evaluado clinicamente para uso contra cancer de ovario. Para este estudio, los ratones (C57BLi6) recibieron una inyecci6n intraperitoneal de 2,5 x 106 celulas ED8 en un volumen de 500 �l para inducir la formaci6n de tumores diseminados. A los 14 dias de la implantaci6n del tumor, se administr6 gemcitabina por via intraperitoneal en una dosis de 150 mgikg en un volumen de 250 �l. El tratamiento se repiti6 semanalmente por un total de 4 tratamientos. Comenzando 17 dias despues de la implantaci6n del tumor, los grupos seleccionados de ratones se trataron por via intraperitoneal con 25 �g de plasmidos de IL-12 formando complejo con PPC en una relaci6n N:P 11:1 en un volumen de 500 �l. La administraci6n del plasmido se repiti6 semanalmente por un total de cuatro tratamientos. El tratamiento combinado de genoterapia IL-12 y quimioterapia de gemcitabina mejor6 significativamente la supervivencia en comparaci6n con cualquiera de las monoterapias solas (FIG. 11).
EJEMPLO 8
Terapia combinada de PIL-12iPPC mas carboplatinoipaclitaxel para el tratamiento de cancer de ovario diseminado en la cavidad peritoneal
La quimioterapia de primera linea para cancer de ovario sigue siendo un agente de platino (carboplatino, cisplatino) y paclitaxel. Por lo tanto, nos interesaba evaluar el uso de genoterapia de IL-12 en combinaci6n con un regimen de
quimioterapia de carboplatinoipaclitaxel. Los ratones (C57BLi6) recibieron inyecciones intraperitoneales de 2,5 x 106 celulas ID8 en un volumen de 500 �I. El tratamiento de quimioterapia comenz6 15 dias despues de la implantaci6n del tumor. La administraci6n de carboplatino (Paraplatin®) fue o bien de 40 mgikg ip en 250 ml (dosis alta) o de 15 mgikg en 250 �l (dosis baja), y la administraci6n de paclitaxel (Taxol®) fue o bien de 8 mgikg ip en 250 mgikg (dosis alta) o 3 mgikg intraperitoneal en 250 ml (dosis baja). El carboplatino se administr6 una vez por semana por un total de 4 tratamientos. y el paclitaxel se administr6 q2w por un total de dos tratamientos. Cuando el carboplatino y el paclitaxel se administraron el mismo dia, el paclitaxel se administr6 primero y luego el carboplatino dos horas mas tarde. Comenzando 18 dias despues de la implantaci6n del tumor, los ratones en los grupos seleccionados se trataron por via intraperitoneal con 25 �g de plasmido IL-12 formando complejo con PPC en una relaci6n N:P de 11:1 en un volumen de 500 �l. La administraci6n del plasmido se repiti6 semanalmente por un total de cuatro tratamientos. Despues del final del regimen de tratamiento, se vigil6 la supervivencia de los animales. Los resultados indican que tanto la genoterapia de IL-12 como la quimioterapia de carboplatinoipaclitaxel de baja dosis produjeron resultados de supervivencia similares (FIG. 12). En contraste, cuando se combin6 quimioterapia de baja dosis con genoterapia de IL-12, la eficacia mejor6 hasta un nivel casi identico a aquel del regimen de tratamiento de quimioterapia de alta dosis. Seria ventajoso poder usar la genoterapia de IL-12 en combinaci6n con quimioterapia de baja dosis con el fin de mantener la eficacia terapeutica y a la vez usar dosis de quimioterapia inferiores con el fin de minimizar las toxicidades. Esto probablemente permitiria que los pacientes permanezcan en los regimenes de tratamiento de quimioterapia por periodos de tiempo prolongados, ofreciendo la posibilidad de una repuesta terapeutica potenciada en gran medida.
EJEMPLO 9
Terapia combinada de pIL-12iPPC mas ciclofosfamida para el tratamiento de cancer de cabeza y cuello
Se combin6 genoterapia de IL-12 intratumoral con quimioterapia de ciclofosfamida (Cytoxan®) para potenciar la respuesta terapeutica en cancer de cabeza y cuello. Se implantaron sc 4 x 10s celulas de carcinoma escamosas (SCCVII) en 100 �l en el flanco derecho de ratones CH3 hembra (6-9 semanas, 17-22 gramos). Cinco dias antes del tratamiento con ciclofosfamida (aproximadamente 11 dias despues de la implantaci6n del tumor), los plasmidos de mIL-12 formaron complejo con PPC en una relaci6n N:P de 11:1 y se administraron localmente a los tumores en una dosis de DNA de 25 �g en un volumen de inyecci6n de 50 �l una vez por semana durante cuatro semanas. Se administr6 terapia de ciclofosfamida por via intravenosa en una dosis de 200 mgikg en un volumen de inyecci6n de 125 �l solo o en combinaci6n con genoterapia de pIL-12. El tratamiento de ciclofosfamida se repiti6 despues de 14 dias, constituyendo un total de dos inyecciones por estudio. Para la terapia combinada, tanto la genoterapia como la quimioterapia se administraron como se describi6 previamente. Se emplearon grupos de tratamiento de 12 ratones, y se vigil6 el crecimiento del tumor dos veces por semana, usando medici6n con calibre. Como se muestra en la FIG. 13, la administraci6n intratumoral de complejos pmIL-12iPPC, o la inyecci6n intravenosa de ciclofosfamida sola produjeron una inhibici6n parcial del crecimiento del tumor, mientras que su combinaci6n produjo la inhibici6n completa. Hubo un porcentaje mayor de animales tratados con la terapia de combinaci6n que rechazaron completamente el tumor (55%) en oposici6n a los animales tratados con quimioterapia sola (10%).
EJEMPLO 10
Tratamiento de cancer cerebral por terapia combinada de pIL-12iPPC intratumoral y BCNU.
Se examin6 el efecto de la administraci6n local de complejos pmIL-12iPPC solos o combinados con BCNU (Gliadel®) en un modelo de glioma de rat6n. La oblea Gliadel® es una formulaci6n polimerica de carmustina o BCNU, un agente quimioterapeutico de la familia de nitrosourea. Los tumores se implantaron en la corteza cerebral de los ratones por inyecci6n intracraneal de 1 x 105 celulas de glioma GL261 junto con la co-inyecci6n de complejos pmIL-12iPPC. Cinco dias despues de la implantaci6n del tumor, se implant6 Gliadel® que contenia 10% BCNU debajo de la tabla inferior del hueso parietal. Se vigil6 a los animales para detectar cualquier signo de neurotoxicidad, y se realizaron las autopsias, cuando fue posible, para confirmar que la muerte fue consecuencia del tumor intracraneal. Se registr6 la supervivencia usando una curva de analisis de supervivencia Kaplan-Meier. Una sola inyecci6n intracraneal de complejos pmIL-12iPPC administrada en un intervalo de dosis de 2,5 -30 �g de plasmido fue bien tolerada, ya que no se observaron efectos adversos importantes. Una sola inyecci6n de complejos pmIL-12iPPC administrados en una dosis de plasmido de 1,5 �g no aument6 el indice de supervivencia. No obstante, la combinaci6n de esta dosis sub6ptima de pmIL-12iPPC con BCNU potenci6 en forma significativa la supervivencia (FIG. 14). El avance en la supervivencia a partir de la terapia combinada fue mayor que aquel obtenido hist6ricamente con BCNU solo en este modelo (no se muestran los datos).
EJEMPLO 11
Comparaci6n de toxicidad de terapia combinada de IL-12iPPC mas carboplatinoipaclitaxel de baja dosis y terapia combinada de carboplatinoipaclitaxel de alta dosis
Los solicitantes han demostrado previamente que combinar IL-12iPPC con carboplatino en bajas dosis (15 mgikg) y terapia de paclitaxel (3 mgikg) produce una eficacia anticancer similar a la quimioterapia de carboplatino (40 mgikg) y
paclitaxel (8 mgikg) en altas dosis (Ejemplo 8, Fig. 12). En este ejemplo, se examina si IL-12iPPC mas la quimioterapia combinada en baja dosis es menos t6xica que la quimioterapia en alta dosis. Los ratones que portaban tumores ovaricos diseminados en la cavidad peritoneal recibieron tres ciclos de tratamiento de IL-12iPPC + quimioterapia de baja dosis o quimioterapia de alta dosis en comparaci6n solamente con un ciclo de tratamiento 5 utilizado en los ejemplos previos. La mortalidad animal que ocurria antes de alcanzar el valor de corte de peso de 40 gramos (criterio para sacrificar a los animales debido al avance de la enfermedad) y que no demostraba carga del tumor significativa en la autopsia se consider6 relacionada con el tratamiento. Los ratones (C57BLi6) recibieron inyecciones intraperitoneales de 2,5 x 106 celulas ID8 en un volumen de 500 �l. El tratamiento de quimioterapia comenz6 15 dias despues de la implantaci6n del tumor. La administraci6n de carboplatino (Paraplatin®) fue o bien de 10 40 mgikg ip en 250 ml (dosis alta) o de 15 mgikg en 250 �l (dosis baja), y la administraci6n de paclitaxel (Taxol®) se realiz6 o bien de 8 mgikg ip en 250 �l (dosis alta) o en 3 mgikg por via intraperitoneal en 250 ml (dosis baja). Se administr6 carboplatino solamente una vez por semana por un total de 4 tratamientos, y paclitaxel se administr6 q2w por un total de dos tratamientos. En los dias del tratamiento, el paclitaxel se administr6 primero y el carboplatino se administr6 dos horas despues. Comenzando 18 dias despues de la implantaci6n del tumor, los ratones en los grupos 15 seleccionados se trataron por via intraperitoneal con 100 �g de plasmido IL-12 formando complejo con PPC en una relaci6n N.P de 11:1 en un volumen de 500 �l. La administraci6n del plasmido se repiti6 semanalmente por un total de cuatro tratamientos. Todo el ciclo de tratamiento se repiti6 tres veces (12 semanas en total), y se vigil6 la supervivencia de los animales. Como se indica en la FIG. 15, 30% del grupo de quimioterapia de alta dosis murieron debido a toxicidad relacionada con el tratamiento (es decir, antes de alcanzar 40 gramos) en comparaci6n con 0% de
20 muerte relacionada con el tratamiento en el grupo de IL-12iPPC + quimioterapia de baja dosis, en el grupo de quimioterapia de baja dosis o en el grupo de tratamiento con IL-12iPPC solamente. Estos resultados demuestran que en comparaci6n con un regimen de quimioterapia de alta dosis, la combinaci6n de IL-12iPPC con quimioterapia de baja dosis produce relativamente menos muertes relacionadas con el tratamiento, pero eficacia anticancer similar (FIG. 12).

Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composici6n farmaceutica para uso en el tratamiento de cancer o trastornos hiperproliferativos, que comprende:
    (a)
    un acido nucleico seleccionado del grupo que consiste en DNA plasmidico, siRNA, RNA sentido, RNA antisentido y ribozima, y un polimero de administraci6n de genes; y
    (b)
    un agente farmaceutico antineoplasico, caracterizado porque
    (i)
    el polimero de administraci6n de genes es un lipopolimero que comprende una cadena principal de polietilenimina (PEI) covalentemente unida a un polietilenglicol y a un colesterol; y
    (ii)
    el agente farmaceutico se selecciona del grupo que consiste en farmacos quimioterapeuticos, farmacos antiangiogenicos, peptidos antineoplasicos, anticuerpos monoclonales y sus mezclas.
  2. 2.
    Una composici6n farmaceutica para uso medico segun la reivindicaci6n 1, en la que el colesterol esta directamente unido a la cadena principal PEI o en la que el colesterol esta covalentemente unido al espaciador de polietilenglicol, que a su vez esta unido a la cadena principal PEI.
  3. 3.
    Una composici6n farmaceutica para uso medico segun la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en la que el acido nucleico codifica un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina-12, IL-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, TNF-a, eNOS, iNOS, IP10, p16, antigenos bacterianos, antigenos viricos, antigenos tumorales y cualquiera de sus combinaciones.
  4. 4.
    Una composici6n farmaceutica para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el agente farmaceutico es un agente quimioterapeutico o un agente antineoplasico seleccionado del grupo que consiste en adriamicina, bleomicina, cisplatino, carboplatino, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, paclitaxel, topotecan, carmustina, gemcitabina o cualquier agente quimioterapeutico relacionado de la misma clase y cualquiera de sus combinaciones.
  5. 5.
    Una composici6n farmaceutica para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el agente farmaceutico es un anticuerpo.
  6. 6.
    Una composici6n farmaceutica para uso medico segun la reivindicaci6n 5, en la que el agente farmaceutico es un anticuerpo antineoplasico seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo CD20, anticuerpo HER2ineu, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidermico y sus conjugados radioisot6picos.
  7. 7.
    Una composici6n farmaceutica para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el agente farmaceutico es un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina-12, IL-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, IP10, p16, eNOS, iNOS, TNF-a, antigenos bacterianos, antigenos viricos, antigenos tumorales y cualquiera de sus combinaciones.
  8. 8.
    Una composici6n segun se define en la reivindicaci6n 1 para uso en la inhibici6n in vivo del crecimiento y metastasis de celulas tumorales, y en la mejoria de la supervivencia de mamiferos con cancer, donde los componentes (a) y (b) de la composici6n se administran juntos o separados.
  9. 9.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 8, en la que el acido nucleico es un plasmido de DNA que codifica una proteina seleccionada del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina12, interleucina-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, timidina cinasa, p53, IP10, p16, TNF-a, ligando Fas, antigenos tumorales, antigenos viricos, antigenos bacterianos o cualquiera de sus combinaciones.
  10. 10.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 8, en la que el acido nucleico es un plasmido de DNA que codifica interleucina-12.
  11. 11.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 8, en la que el acido nucleico es un plasmido de DNA sencillo que codifica mas de una proteina seleccionada en cualquier combinaci6n del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina-12, interleucina-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, timidina cinasa, p53, IP10, p16, TNF-a, ligando Fas, antigenos tumorales, antigenos viricos y antigenos bacterianos.
  12. 12.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 8, en la que el acido nucleico es un plasmido de DNA que codifica un RNA de horquilla corta disenado para inhibir la expresi6n de una proteina requerida para el crecimiento y la metastasis de tumores.
  13. 13.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 8, en la que el acido nucleico es un RNA seleccionado del grupo que consiste en siRNA, RNA sentido, RNA antisentido, una ribozima y cualquiera de sus combinaciones, disenada para inhibir la expresi6n de una proteina requerida para el crecimiento y la metastasis de tumores.
  14. 14.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 8, en la que el acido nucleico es un plasmido de DNA sencillo que codifica un RNA de horquilla corta y una proteina seleccionada del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina-12, interleucina-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, timidina cinasa, p53, IP10, p16, TNF-a, eNOS, iNOS, ligando Fas, antigenos tumorales, antigenos viricos, antigenos bacterianos o cualquiera de sus combinaciones.
  15. 15.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 8, en la que el acido nucleico es un RNA seleccionado del grupo que consiste en un siRNA, RNA sentido, RNA antisentido o una ribozima y un DNA plasmidico que codifica una proteina seleccionada del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-4, interleucina-7, interleucina-12, interleucina-15, interfer6n-a, interfer6n-�, interfer6n-y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de colonias de granulocitos y macr6fagos, agentes antiangiogenicos, timidina cinasa, p53, IP10, p16, TNF-a, eNOS, iNOS, ligando Fas, antigenos tumorales, antigenos viricos, antigenos bacterianos o cualquiera de sus combinaciones.
  16. 16.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en la que la polietilenimina tiene una configuraci6n lineal o ramificada con un peso molecular de 100-500.000 Daitons.
  17. 17.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en la que el polietilenglicol tiene un peso molecular comprendido entre 50 y 20.000 Daitons.
  18. 18.
    La composici6n farmaceutica para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17, en la que la relaci6n molar de polietilenglicol a PEI esta dentro de un intervalo de 0,1:1 a 500:1.
  19. 19.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17, en la que la relaci6n molar del colesterol a PEI esta dentro de un intervalo de 0,1:1 a 500:1.
  20. 20.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 19, en la que la polietilenimina comprende ademas un resto diana, donde el resto diana esta directamente unido a la cadena principal de polietilenimina o esta unido a traves del enlazador de polietilenglicol.
  21. 21.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 20, en la que el resto diana se selecciona del grupo que consiste en transferrina, asialoglucoproteina, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, lipoproteinas de baja densidad lipoproteinas, interleucinas, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, factores de celulas madre, eritropoyetina, factor de crecimiento epidermico (EGF), insulina, asialoorosomucoide, manosa-6-fosfato, manosa, Lewisx y sialilo Lewis�, N-acetillactosamina, folato, galactosa, lactosa y trombomodulina, agentes fusogenicos tales como polimixina B y hemaglutinina HA2, agentes lisosomotr6picos, senales de localizaci6n de nucleo (NLS) y cualquiera de sus combinaciones.
  22. 22.
    La composici6n para uso medico segun la reivindicaci6n 20 o la reivindicaci6n 21, en la que la relaci6n molar del lipopolimero y el resto diana esta dentro del intervalo de 1:0,1 a 1:100.
  23. 23.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 22, en la que el acido nucleico forma complejo con el lipopolimero en moles de nitr6geno en el lipopolimero a moles de fosfato en el DNA en una relaci6n molar de 0,1:100 a 100:1.
  24. 24.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 23, en la que el agente farmaceutico se administra por administraci6n intravenosa, intratumoral, oral o intraperitoneal.
  25. 25.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 24, en la que el acido nucleico y el polimero de administraci6n de genes se administran antes de la administraci6n del agente farmaceutico.
  26. 26.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 24, en la que dichos acido nucleico y polimero se administran despues de la administraci6n del agente farmaceutico.
  27. 27.
    La composici6n para uso medico segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 26, en la que el agente farmaceutico se selecciona del grupo que consiste en farmacos quimioterapeuticos, agentes antiangiogenicos, peptidos antineoplasicos, anticuerpos monoclonales y sus mezclas para el tratamiento de cancer o trastornos hiperproliferativos; preferiblemente un agente quimioterapeutico o un agente antineoplasico seleccionado del grupo que consiste en adriamicina, bleomicina, cisplatino, carboplatino, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, paclitaxel, topotecan, carmustina, gemcitabina o cualquier agente quimioterapeutico relacionado de la misma clase y cualquiera de sus combinaciones.
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