ES2380233T3

ES2380233T3 - Variantes de meganucleasa que escinden una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de ratÃ³n y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2380233T3
Application number: ES08807158T
Authority: ES
Inventors: AgnÃ¨s GOUBLE
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2008-06-06
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2028-06-06
Also published as: HK1141049A1; WO2008149176A1; IL202555A0; WO2008152523A1; WO2008152523A9; US20100325745A1; ATE532857T1; EP2167656A1; CA2690027A1; US20130236946A1; IL202555A; CN101821386A; EP2167656B1; AU2008263501A1; US8426177B2; WO2008149176A8; JP2010528648A; BRPI0812779A2; DK2167656T3

Abstract

Una variante de l-Crel, caracterizada porque uno de los dos monomeros de l-Crel tiene al menos dos sustituciones, una en cada uno de los dos subdominios funcionales del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado respectivamente entre las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de l-Crel, siendo dicha variante capaz de escindir una secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y que es obtenible mediante un procedimiento que comprende al menos las etapas de: (a) construir una primera serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en el primer subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel, (b) construir una segunda serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en un segundo subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel, (c) seleccionar y/o cribar las variantes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a + 10 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (d) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (e) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (f) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (g) combinar en una unica variante, la (s) mutacion (es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes de la etapa (c) y la etapa (d), para obtener una novedosa variante de l-Crel homodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico al triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y/o (h) combinar en una unica variante, la (s) mutacion (es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes procedentes de la etapa (e) y etapa (f), para obtener una novedosa variante de l-Crel heterodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (i) combinar las variantes obtenidas en las etapas (g) y/o (h) para formar heterodimeros, y (j) seleccionar y/o cribar los heterodimeros de la etapa (i) que son capaces de escindir dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton.

Description

Variantes de meganucleasa que escinden una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de raton y usos de las mismas

5 La invencion se refiere a una variante de meganucleasa que escinde una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de raton, a un vector que codifica dicha variante, a una celula, un animal o una planta modificada por dicho vector y al uso de dicha variante de meganucleasa y productos derivados para la genomanipulacion del genoma de raton (produccion de proteina recombinante, construccion de ratones transgenicos y lineas recombinantes de celulas

10 de raton). El locus ROSA26 de raton fue descubierto por Friedrich y Soriano en 1991 mediante un experimento de atrapamiento de genes usando embriocitoblastos (ES) infectados con un retrovirus (Friedrich, G. y P. Soriano, Genes & Development, 1991, 5, 1513-1523). La linea ROSA26 de atrapamiento de genes de ratones, en la que se

15 produce la insercion en el intron 1 del locus ROSA26, un sitio no esencial, muestra la expresion ubicua del gen indicador durante el desarrollo embrionico, en crias (Friedrich y Soriano, 1991, citado anteriormente) y en celulas hematopoyeticas (Zambrowicz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 3789-3794). El locus ROSA26, localizado en el cromosoma 6 de raton, produce tres transcritos (Figura 1). Dos transcritos proceden de un promotor comun que comparte extremos 5' identicos (exon 1 y exon de inicio 2), pero ninguno contiene un ORF significativo. Y un

20 tercero procedente de la cadena inversa (Zambrowicz y col., 1997, citado anteriormente). Los transgenes bajo el control del promotor ROSA26 de raton muestran una expresion ubicua en embriones y adultos de raton (Soriano, P., Nature Genetics, 1999, 21, 70-71). El direccionamiento del locus ROSA26 en celulas ES de raton ha sido ampliamente usado para la construccion de modelos de ratones transgenicos (Kisseberth y col., Developmental Biology, 1999, 214, 128-138; Mao X. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5037-5042; Soriano, 1999, citado

25 anteriormente; A watramani y col., Nature Genetics, 2001, 29, 257-259; Mao X. y col., Blood, 2001, 97, 324-326; Possemato y col., Genesis, 2002, 32, 184-186; Mao, J. y col., Nucleic Acids Res., 2005, 33, e155; Yu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 8615-8620; Solicitudes PCT lnternacionales WO 99/53017, WO 02/098217, WO 03/020743, WO 2004/063381 y WO 2005/116070)).

30 Sin embargo, la eficacia de la recombinacion homologa en celulas de raton es muy baja (frecuencia: 10-6 a 10-9). Se puede aumentar esta eficacia mediante una rotura del ADN bicatenario (DSB) en el locus diana. Dichos DBS se pueden crear mediante meganucleasas, que son por definicion endonucleasas especificas de secuencia que reconocen grandes secuencias (Thierry, A. y B. Dujon, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5625-5631). Estas proteinas

35 pueden escindir sitios unicos en celulas vivas, mejorando por tanto el direccionamiento genico en 1000 veces o mas en la proximidad del sitio de escision (Puchta y col., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034-5040; Rouet y col., Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096-8106; Choulika y col., Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968-1973; Puchta y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996, 93, 5055-5060; Sargent y col., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267-277; Cohen-Tannoudji y col., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444-1448; Donoho, y col., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070-4078; Elliott y col., Mol. Cell. Biol., 1998,

40 18, 93-101). Sin embargo, aunque se han identificado algunos cientos de meganucleasas naturales, denominadas tambien como "endonucleasas de asentamiento" (Chevalier, B.S. y B.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774), el repertorio de secuencias escindibles esta demasiado limitado a dirigir la complejidad de los genomas, y no existen

45 normalmente sitios escindibles en un gen seleccionado. Teoricamente, la preparacion de meganucleasas con especificaciones adaptadas esta bajo intensa investigacion. De este modo, se esta investigando profundamente sobre la preparacion de meganucleasas con especificidades a medida Recientemente, la fusion de proteinas de dedo de cinc con el dominio catalitico de Fokl, una endonucleasa de

50 restriccion de tipo llS, se uso para preparar endonucleasas especificas de secuencia funcionales (Smith y col., Nucleic Acids Res., 1999, 27, 674-681; Bibikova y col., Mol. Cell. Biol., 2001, 21, 289-297; Bibikova y col., Genetics, 2002, 161, 1169-1175; Bibikova y col., Science, 2003, 300, 764; Porteus, M.H. y D. Baltimore, Science, 2003, 300, 763-; Alwin y col., Mol. Ther., 2005, 12, 610-617; Urnov y col., Nature, 2005, 435, 646-651; Porteus, M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438-446; Solicitud PCT lnternacional WO 2007/014275). Dichas nucleasas podrian usarse recientemente

55 para la genomanipulacion del gen lLR2G en celulas humanas procedentes de linaje linfoide (Urnov y col., Nature, 2005, 435, 646-651). La especificidad de la union de las proteinas de dedo de cinc de tipo Cys2-His2 (ZFP), es facil de manipular, debido probablemente a que representan un sistema sencillo (especificamente impulsado por esencialmente cuatro restos por dedo), y modular (Pabo y col., Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, 313-340; Jamieson y col., Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2, 361-368. Los estudios de los laboratorios de Pabo (Rebar, E.J. y C.O. Pabo, Science, 1994, 263, 671-673; Kim, J.S. y C.O. Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1998, 95, 2812-2817), Klug (Choo, Y. y A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163-11167 ; lsalan M. y A. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656-660) y Barbas (Choo,

5 Y. y A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163-11167 ; lsalan M. y A. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656-660) dieron como resultado un gran repertorio de ZFP artificiales novedosas, capaz de unirse a la mayor parte de las secuencias G/ANNG/ANNG/ANN.

Sin embargo, las ZFP pueden tener sus limitaciones, especialmente en aplicaciones que requieren un nivel muy alto

10 de especificidad, tal como aplicaciones terapeuticas. Se ha demostrado recientemente que la actividad de la nucleasa Fokl en la fusion actua con un sitio de reconocimiento cualquiera o con dos sitios separados por distancias variables mediante un bucle de ADN que incluye la presencia de algunos mutantes de Fokl defectivos de la union con el ADN (Catto y col., Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1711-1720). De esta manera, la especificidad puede degenerar mucho, tal como se ilustra por la toxicidad en celulas de mamiferos y Drosophila (Bibikova y col.,

15 Genetics, 2002, 161, 1169-1175; Bibikova y col., Science, 2003, 300, 764-).

En la naturaleza, las meganucleasas estan esencialmente representadas por las endonucleasas de asentamiento. Las endonucleasas de asentamiento (HE) son una familia ampliamente distribuida de meganucleasas naturales que incluyen cientos de familias de proteinas (Chevalier, B.S. y B.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774).

20 Estas proteinas estan codificadas por elementos geneticos moviles que se propagan mediante un procedimiento denominado "asentamiento": la endonucleasa escinde un alelo analogo del cual esta exento el elemento movil, estimulando por tanto un episodio de recombinacion homologa que duplica el ADN movil en el locus receptor. Dadas sus excepcionales propiedades de escision en terminos de eficacia y especificidad, podria representar un armazon ideal para derivar novedosas endonucleasas muy especificas.

25 Las HE pertenecen a cuatro familias principales. La familia LAGLlDADG, nombrada de acuerdo con un motivo peptidico conservado implicado en el centro catalitico, es el grupo mas ampliamente distribuido y el mejor caracterizado. En la actualidad se dispone de siete estructuras. Mientras que la mayor parte de las proteinas de esta familia son monomericas y muestran dos motivos LAGLlDADG, unas pocas de estas solo tienen un motivo, pero

30 dimerizan para escindir secuencias diana palindromicas o pseudopalindromicas.

Aunque el peptido LAGLlDADG es la unica region conservada entre los miembros de la familia, estas proteinas comparten una arquitectura muy similar (Figura 2). El nucleo catalitico esta flanqueado por dos dominios de union al ADN con una simetria en dos pliegues perfecta para los homodimeros tales como l-Crel (Chevalier, y col., Nat. 35 Struct. Biol., 2001, 8, 312-316) e l-Msol (Chevalier y col., J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269) y con una simetria para los monomeros tales como l-Seel (Moure y col., J. Mol. Biol., 2003, 334, 685-69, l-Orol (Silva y col., J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123-1136) o l-Anil (Bolduc y col., Genes Dev., 2003, 17, 2875-2888). Ambos monomeros, o ambos dominios (para las proteinas monomericas) contribuyen al nucleo catalitico, organizado alrededor de cationes divalentes. Exactamente por encima del nucleo catalitico, los dos peptidos LAGLlDADG juegan tambien un papel

40 montar tipica, que se asientan en la ranura mayor del ADN. Se pueden encontrar otros dominios en inteinas tales como Pl-Pful (lchiyanagi y col., J. Mol. Biol., 2000, 300, 889-901) y Pl-Scel (Moure y col., Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764-770), cuyo dominio de corte y empalme con la proteina esta tambien implicado en la union del ADN.

45 La preparacion de meganucleasas quimericas funcionales, mediante la fusion del dominio l-Orol N terminal con un monomero I-Crel (Chevalier y col., Mol. Cell., 2002, 10, 895-905; Epinat y col., Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2952-62; Solicitudes PCT lnternacionales WO 03/078619 y WO 2004/031346) ha demostrado la plasticidad de las proteinas LAGLlDADG.

50 Ademas de esto, otros grupos han usado un enfoque racional para alterar localmente la especificidad del l-Crel (Seligman y col., Genetics, 1997, 147, 1653-1664; Sussman y col., J. Mol. Biol., 2004, 342, 31-41; Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784, WO 2006/097853 y WO 2007/049156; Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458; Rosen y col., Nucleic Acids Res., 2006, 34, 4791-4800; Smith y col., Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006), l-Seel (Doyon y col., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477-2484), Pl-Scel (Gimble y col., J. Mol.

55 Biol., 2003, 334, 993-1008) e l-Msol (Ashworth y col., Nature, 2006, 441, 656-659).

Ademas, se genomanipularon cientos de derivados de l-Crel que alteraban localmente la especificidad combinando el enfoque semirracional y el Cribado de Alto Rendimiento:

-: Los restos 044, R68 y R70 o 044, R68, D75 e l77 de I-CreI se sometieron a mutagenesis y se identifico una coleccion de variantes con especificidad alterada hacia los nucleotidos en las posiciones

3 a 5 del ADN diana (ADN 5NNN diana) mediante cribado (Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784 y WO 2006/097853; Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458; Smith y col., Nucleic Acids Res., Epub 27 de

5 noviembre de 2006).

-: Los restos K28, N30 y 038, N30, Y33 y 038 o K28, Y33, 038 y S40 de I-CreI se sometieron a mutagenesis y se identifico una coleccion de variantes con especificidad alterada hacia los nucleotidos en las posiciones

8 a 10 del ADN diana (ADN 10NNN diana) mediante cribado (Smith y col., Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006; Solicitud PCT lnternacional WO 2007/049156).

10 Se demostro que los restos 28 a 40 y 44 a 77 de I-CreI formaban dos subdominios funcionales separables, capaces de unir distintas partes del semisitio de una endonucleasa de asentamiento (Smith y col. Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006; Solicitud PCT lnternacional WO 2007/049095).

15 La combinacion de mutaciones entre los dos subdominios de l-Crel dentro del mismo monomero permitio el diseno de moleculas quimericas (homodimeros) novedosas capaces de escindir una secuencia de ADN diana palindromico combinado que comprende los nucleopeptidos en las posiciones

3 a 5 y

8 a 10 que se unen por cada subdominio (Smith y col., Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006; Solicitud PCT lnternacional WO 2007/049156).

20 Se combinaron dos variantes diferentes y se ensamblaron en una endonucleasa heterodimerica funcional capaz de escindir una diana quimerica resultante de la fusion de una mitad diferente de cada secuencia de ADN diana variante (Arnould y col., citados anteriormente; Solicitud PCT lnternacional WO 2006/097854). De manera interesante, las proteinas novedosas habian mantenido el plegado y la estabilidad apropiados, una elevada actividad, y una estrecha especificidad.

25 La combinacion de las dos etapas anteriores permite un enfoque combinatorio mas grande, que implica cuatro diferentes subdominios. Los diferentes subdominios se pueden modificar por separado y combinarse para obtener una variante de meganucleasa completamente redisenada (heterodimero o molecula monocatenaria) con especificidad seleccionada, tal como se ilustra en la figura 3. En una primera etapa, acoplamientos de novedosas

30 meganucleasas se combinan en nuevas moleculas ("semimeganucleasas") que escinden las dianas palindromicas derivadas de la diana que quiere escindirse. A continuacion, la combinacion de dicha "semimeganucleasa" puede dar como resultado una especie heterodimerica que escinde la diana de interes. Se ha descrito en Smith y col. (Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006) el ensamblaje de cuatro conjuntos de mutaciones en endonucleasas heterodimericas que escinden una secuencia diana modelo o una secuencia procedente del gen

35 RAG1 humano.

Sin embargo, las dianas ensayadas en este informe fueron identicas a la secuencia original del sitio l-Crel palindromico (C1221; figura 5) en las posiciones

2 y

1. lncluso aunque los pares de bases

1 y

2 no muestran

ningun contacto con la proteina, se ha demostrado que estas posiciones no estan desprovistas de la informacion

40 contenida (Chevalier y col., J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269), especialmente para el par de bases

1 y podria ser una fuente de especificidad adicional del sustrato (Argast y col., J. Mol. Biol., 1998, 280, 345-353; Jurica y col., Mol. Cell., 1998, 2, 469-476; Chevalier, B.S. y B.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774). La seleccion in vitro de la diana I-Crel (Argast y col., citados anteriormente) sometida a mutacion aleatoria, desvelo la importancia de estos cuatro pares de bases sobre la union de la proteina y la actividad de escision. Se ha sugerido que la red de

45 moleculas de agua ordenadas en el sitio activo era importante para el posicionamiento del ADN diana (Chevalier y col., Biochemistry, 2004, 43, 14015-14026). Ademas, los extensos cambios conformacionales que aparecen en esta region tras la union de l-Crel sugieren que los cuatro nucleotidos centrales podrian contribuir a la especificidad del sustrato, posiblemente mediante preferencias conformacionales dependientes de la secuencia (Chevalier y eol., 2003, citados anteriormente).

50 De esta manera, no estaba claro si los mutantes identificados en las dianas de ADN 10NNN y 5NNN como homodimeros que escinden una secuencia palindromica siendo los cuatro nucleotidos centrales gtac, podrian permitir el diseno de nuevas endonucleasas que podrian escindir dianas que contuvieran cambios en los cuatro nucleotidos centrales.

55 Los inventores han identificado una serie de dianas de ADN en el locus ROSA26 de raton que podrian escindirse por variantes de l-Crel (Figura 17). Se uso el enfoque combinatorio descrito en la figura 3 para redisenar por completo el dominio de union del ADN de la proteina I-CreI y genomanipular por consiguiente novedosas meganucleasas con especificidad completamente genomanipulada, para escindir un ADN diana del locus ROSA26 de raton (rosal) que difiere del sitio palindromico C1221 de l-CreI de 22 pb en 13 nucleotidos que incluyen uno (posicion + 1) de los cuatro nucleotidos centrales (Figura 5).

lncluso aunque las variantes combinadas se identificaron inicialmente hacia los nucleotidos 10NNN y 5NNN

5 respectivamente, y se observo un fuerte impacto de los cuatro nucleotidos centrales de la diana sobre la actividad de la meganucleasa genomanipulada, se seleccionaron las meganucleasas funcionales con un profundo cambio en la especificidad. Ademas, se puede mejorar significativamente la actividad de la proteina genomanipulada mediante dos ciclos sucesivos de mutagenesis y cribado aleatorios, para comparar con la actividad de la proteina I-CreI.

10 La capacidad de generar una rotura bicatenaria en el locus ROSA26 proporciona un medio para mejorar significativamente la recombinacion homologa en el locus. De esta manera, una meganucleasa que direcciona el locus ROSA 26 permitira inserciones eficaces en las celulas de raton (Figura 4). La capacidad de insertar genes eficazmente (activacion) en este locus tiene la ventaja de permitir niveles de expresion reproducibles asi como lineas temporales predecibles para generar las inserciones. Las aplicaciones potenciales incluyen la produccion de

15 proteinas recombinantes en celulas de raton y la genomanipulacion de ratones transgenicos y de lineas recombinantes de celulas de raton, que se pueden usar, por ejemplo, para la produccion de proteinas, los estudios de funcion genica, el cribado de farmacos, o como modelo de enfermedad.

La invencion se refiere a una variante de l-Crel en la que al menos uno de los dos monomeros de l-Crel tiene al

20 menos dos sustituciones, una en cada uno de los dos subdominios del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado respectivamente entre las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de l-Crel, y es capaz de escindir una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de raton.

Se puede medir la actividad de escision de la variante de acuerdo con la invencion mediante cualquier ensayo de

25 escision in vitro o in vivo bien conocido, tal como los descritos en la Solicitud PCT lnternacional WO 2004/067736; Epinat y col., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962; Chames y col., Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178 y Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458. Se puede medir, por ejemplo, la actividad de escision de la variante de la invencion mediante un ensayo de recombinacion mediante repeticion directa, en celulas de levaduras o de mamiferos, usando un vector indicador. El vector indicador comprende dos copias no funcionales truncadas de un

30 gen indicador (repeticiones directas) y la secuencia diana del ADN genomico en el interior de la secuencia de intervencion, clonada en un vector de expresion de una levadura o de un mamifero. La expresion de la variante da como resultado una endonucleasa funcional que es capaz de escindir la secuencia diana del ADN genomico. Esta escision induce la recombinacion homologa entre las repeticiones directas, dando como resultado un gen indicador funcional, cuya expresion se puede controlar mediante un ensayo apropiado.

Oefinieiones

-: Aminoacido se refiere a un aminoacido natural o sintetico incluyendo los enantiomeros y estereoisomeros de los aminoacidos anteriores.

40 - Los restos de aminoacidos en una secuencia polipeptidica se designan en la presente memoria descriptiva de acuerdo con el codigo de una letra, en el que, por ejemplo, 0 significa Gln o resto de Glutamina, R significa Arg o resto de Arginina y D significa Asp o resto de Acido Aspartico.

-: Aminoacido acido se refiere a acido aspartico (D) y acido glutamico (E).

-: Aminoacido basico se refiere a lisina (K), arginina (R) e histidina (H). 45 -Aminoacido pequeno se refiere a glicina (G) y alanina (A).

-: Aminoacido aromatico se refiere a fenilalanina (F), triptofano (W) y tirosina (Y). Los nucleotidos se designan como sigue: se usa un codigo de una letra para designar la base de un nucleosido: a es adenina, t es timina, c es citosina, y g es guanina. Para los nucleotidos degenerados, r representa g o a (nucleotidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c

50 (nucleotidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

-: por "meganucleasa", se entiende una endonucleasa que tiene una secuencia de ADN diana bicatenario de 12 a 45 pb. Dicha meganucleasa es tanto una enzima dimerica, en la que cada dominio esta en un monomero como una enzima monomerica que comprende los dos dominios de un unico polipeptido.

55 - por "dominio de la meganucleasa" se entiende la region que interactua con una mitad del ADN diana de una meganucleasa que es capaz de asociarse con el otro dominio de la misma meganucleasa que interactua con la otra mitad del ADN diana para formar una meganucleasa funcional capaz de escindir dicho ADN diana.

-: por "variante de la meganucleasa" o "variante" se entiende una meganucleasa obtenida por sustitucion de al menos un resto en la secuencia de aminoacidos de la meganucleasa natural (meganucleasa natural) con un aminoacido

diferente.

-: por "variante funcional" se entiende una variante que es capaz de escindir una secuencia diana del ADN, preferiblemente dicha diana es una nueva diana que no esta escindida por la meganucleasa parental. Por ejemplo, dichas variantes tienen la variacion de los aminoacidos en las posiciones que ponen en contacto la secuencia diana

5 del ADN o interactuan de manera directa o indirecta con dicho ADN diana.

-: por "variante de meganucleasa con especificidad novedosa" se entiende una variante que tiene un modelo de dianas escindidas diferente del de la meganucleasa parental Los terminos "especificidad novedosa", "especificidad modificada", "especificidad de escision novedosa", "especificidad de sustrato novedosa" que son equivalentes y se usan indistintamente, se refieren a la especificidad de la variante hacia los nucleotidos de la secuencia de ADN

10 diana.

-: por "l-Crel" se entiende el I-CreI natural que tiene la secuencia SWlSSPROT P05725, que corresponde a la secuencia SE0 lD NO: 1 en el listado de secuencias o a la secuencia pdb con el codigo de acceso 1g9y que corresponde a la secuencia SE0 lD NO: 33 en el listado de secuencias.

-: por "dominio" o "dominio del nucleo" se entiende "el dominio del nucleo de la endonucleasa de asentamiento 15 1

3 caracteristico de las endonucleasas de asentamiento de la familia LAGLlDADG, que corresponde a aproximadamente cien restos de aminoacido. Dicho dominio comprende cuatro

2

3 4

4) plegadas en una lamina beta antiparalela que interactua con una mitad del ADN diana. Este dominio es capaz de asociarse con otro dominio del nucleo de la endonucleasa de asentamiento LAGLlDADG que interactua con la otra mitad del ADN diana para formar una endonucleasa funcional capaz de escindir dicho ADN

20 diana. Por ejemplo, en el caso de la endonucleasa de asentamiento l-Crel (163 aminoacidos), el dominio del nucleo de la endonucleasa de asentamiento LAGLlDADG corresponde a los restos 6 a 94.

1 2 3

-: por "meganucleasa de cadena simple" se entiende una meganucleasa que comprende dos dominios de la endonucleasa de asentamiento LAGLlDADG o dominios de nucleo unidos mediante un separador especifico. La meganucleasa de cadena simple es capaz de escindir una secuencia de ADN diana quimerico que comprende una

25 mitad diferente de cada secuencia diana de la meganucleasa parental.

-: por "subdominio" se entiende la region de un dominio de nucleo de la endonucleasa de asentamiento LAGLlDADG que interactua con una parte distinta de un semisitio del ADN diana de la endonucleasa de asentamiento. Dos subdominios diferentes se comportan de manera independiente y la mutacion en un subdominio no altera las propiedades de union y escision del otro subdominio. Por tanto, dos subdominios unen partes distintas de un

30 semisitio del ADN diana de una endonucleasa de asentamiento.

-: por "horquilla beta" se entienden dos cadenas beta consecutivas de la lamina beta antiparalela del dominio del

4) que estan conectados por un bucle o un giro.

-: por "sitio l-Crel" se entiende una secuencia de ADN bicatenario de 22 a 24 pb que se escinde por l-Crel. Los sitios

35 l-Crel incluyen el sitio de l-Crel natural (natural) no palindromico y las secuencias palindromicas derivadas tales como la secuencia 5'-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a-1c+2g+3a4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12 denominada tambien C1221 (SE0 lD NO: 2; figura 5).

-: por "ADN diana", "secuencia de ADN diana", "secuencia diana", "sitio diana", "diana", "sitio"; "sitio de interes"; "sitio de reconocimiento", secuencia de reconocimiento", "sitio de reconocimiento de asentamiento", "sitio de 40 asentamiento", "sitio de escision" se entiende una secuencia de polinucleotidos palindromica bicatenaria, parcialmente palindromica (pseudopalindromica) o no palindromica de 20 a 24 pb que se reconoce y escinde por una endonucleasa de asentamiento LAGLlDADG tal como l-Crel, o una variante o una meganucleasa quimerica monocatenaria derivada de l-Crel. Estos terminos se refieren a una localizacion distinta del ADN, preferiblemente una localizacion genomica, en la cual se va a inducir la rotura de la doble cadena por la meganucleasa. El ADN

45 diana se define por la secuencia 5' a 3' de una cadena del polinucleotido bicatenario, tal como se ha indicado anteriormente para C1221. La escision del ADN diana se produce en los nucleotidos en las posiciones +2 y -2, respectivamente, para la cadena de sentido directo y la de sentido contrario. A no ser que se indique otra cosa, la posicion en la cual se produce la escision del ADN diana por una variante de la meganucleasa l-Crel, corresponde al sitio de escision en la cadena de sentido directo del ADN diana.

50 - por "semisitio del ADN diana", "semisitio de escision" o "semisitio" se entiende la porcion del ADN diana que esta unida por cada dominio del nucleo de la endonucleasa de asentamiento LAGLlDADG.

-: por "ADN diana quimerico" o "ADN diana hibrido" se entiende la fusion de una mitad diferente de dos secuencias de la meganucleasa diana parental. Ademas, al menos una mitad de dicha diana puede comprender la combinacion de nucleotidos que se unen mediante al menos dos subdominios separados (ADN diana combinado).

55 - por "locus ROSA26 de raton" se entiende el locus localizado en el cromosoma 6 de raton y que tiene la secuencia que corresponde al numero de acceso C0880114 de la EMBL (SE0 lD NO: 3; 13139 pb). ROSA26 produce tres transcritos (Figura 1): dos transcritos que se originan de un promotor comun comparten extremos 5' identicos (exon 1 e inicio del exon 2) pero ninguno contiene un ORF significativo. Y uno tercero originado de la cadena inversa.

-: por "secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton", "secuencia de ADN genomico diana", "sitio

de escision de ADN genomico" "ADN genomico diana" o "diana genomica" se entiende una secuencia de 20 a 24 pb del locus ROSA26 de raton que se reconoce o escinde por una variante de meganucleasa.

-: por "vector" se entiende una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al cual se ha enlazado.

5 - por "homologa" se entiende una secuencia con suficiente identidad entre si con otra para conducir a una recombinacion homologa entre secuencias, teniendo mas concretamente al menos un 95% de identidad, preferiblemente un 97% de identidad y mas preferiblemente un 99%.

-: "identidad" se refiere a la identidad de secuencias entre dos moleculas de acido nucleico o polipeptidos. Se puede determinar la identidad comparando una posicion en cada secuencia que se puede alinear a objeto de comparacion. 10 Cuando una posicion en la secuencia comparada esta ocupada por la misma base, entonces las moleculas son identicas en esta posicion. Un grado de similitud o identidad entre las secuencias de acido nucleico o aminoacidos es una funcion del numero de nucleotidos identicos o correspondientes en las posiciones compartidas por las secuencias de acido nucleico. Se pueden usar varios algoritmos y/o programas de alineacion para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA, o BLAST que estan disponibles como una parte del paquete de

15 analisis de secuencias GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con, por ejemplo, configuraciones por defecto.

-: "individual" incluye mamiferos, asi como otros vertebrados (por ejemplo, aves, peces y reptiles). Los terminos "mamifero" y "mamiferos", tal como se usan en la presente memoria descriptiva, se refieren a cualquier animal vertebrado, incluyendo monotremas, marsupiales y placentarios, que dan de mamar a las crias y dan a luz crias

20 vivas (mamiferos eutarianos o placentarios) o nacen de huevos (mamiferos metarianos o no placentarios). Los ejemplos de especies de mamiferos incluyen seres humanos y otros primates (por ejemplo, monos, chimpances), roedores (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas) y otros tales como por ejemplo: vacas, cerdos y caballos.

-: por "mutacion" se entiende la sustitucion, delecion, insercion de uno o mas nucleotidos/aminoacidos en un polinucleotido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptidica. Dicha mutacion puede afectar la secuencia de codificacion

25 de un gen o su secuencia reguladora. Esto puede afectar tambien la estructura de la secuencia genomica o la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

La variante de acuerdo con la presente invencion puede ser un homodimero o un heterodimero. Preferiblemente, ambos monomeros del heterodimeros estan mutados en las posiciones 26 a 40 y/o 44 a 77. Mas preferiblemente, 30 ambos monomeros tienen diferentes sustituciones en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de l-Crel.

En una realizacion preferida de dicha variante, dicha(s) sustitucion(es) en el subdominio situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel estan en las posiciones 44, 68, 70, 75 y/o 77.

35 En otra realizacion preferida de dicha variante, dicha(s) sustitucion(es) en el subdominio situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel estan en las posiciones 26, 28, 30, 32, 33, 38 y/o 40.

En otra realizacion preferida de dicha variante, dichas sustituciones se llevan a cabo en los aminoacidos iniciales con aminoacidos seleccionados entre el grupo que consiste en: A, D, E, G, H, K, N, P, 0, R, S, T, Y, C, V, L y W.

40 En otra realizacion preferida de dicha variante, esta comprende una o mas mutaciones en las posiciones de otros restos de aminoacidos que entran en contacto con la secuencia del ADN diana o interactuan con el esqueleto de ADN o con las bases de nucleotidos, directamente o mediante una molecula de agua; estos restos son bien conocidos en la tecnica (Jurica et al., Molecular Cell., 1998, 2, 469-476; Chevalier y col., J. Mol. Biol., 2003, 329,

45 253-269).

En particular, se pueden introducir sustituciones adicionales en las posiciones que entran en contacto con el esqueleto de fosfato, por ejemplo en el bucle C terminal final (posiciones 137 a 143, Prieto y col., Nucleic Acids Res., Epub 22 de abril de 2007). Preferiblemente dichos restos estan implicados en la union y escision de dicho sitio de 50 escision del ADN. Mas preferiblemente, dichos restos estan en las posiciones 138, 139, 142 o 143 de l-Crel. Dos restos pueden estar mutados en una variante con la condicion de que cada mutacion este en una pareja diferente de restos seleccionada entre la pareja de restos en las posiciones 138 y 139 y la pareja de restos en las posiciones 142 y 143. Las mutaciones que se introducen modifican la(s) interaccion(es) de dicho(s) aminoacido(s) del bucle C terminal final con el esqueleto de fosfato del sitio l-Crel. Preferiblemente, el resto en la posicion 138 o 139 esta 55 sustituido por un aminoacido hidrofobo para evitar la formacion de enlaces de hidrogeno con el esqueleto de fosfato del sitio de escision del ADN. Por ejemplo, el resto en la posicion 138 esta sustituido por una alanina o el resto en la posicion 139 esta sustituido por una metionina. El resto en la posicion 142 o 143 esta ventajosamente sustituido por un aminoacido pequeno, por ejemplo una glicina, para disminuir el tamano de las cadenas laterales de estos restos de aminoacidos. Mas preferiblemente, dicha sustitucion en el bucle C terminal final modifica la especificidad de la

variante hacia los nucleotidos en las posiciones

1 a 2,

6 a 7 y/o

11 a 12 del sitio l-Crel. En otra realizacion preferida de dicha variante, esta comprende una o mas mutaciones adicionales que mejoran las propiedades de la union y/o la escision de la variante hacia la secuencia del ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton.

5 Los restos adicionales que estan mutados pueden estar en la secuencia completa de l-Crel, y en particular en la mitad C terminal de l-Crel (posiciones 80 a 163). Por ejemplo, la variante comprende una o mas sustituciones adicionales en las posiciones 19, 24, 79, 105, 107, 151, 153, 158. Dichas sustituciones se seleccionan ventajosamente entre el grupo que consiste en: G19S, l24V, S79G, V105A, K107R, V151A, D153G y K158E.

10 La variante de la invencion se puede derivar del l-Crel natural (SE0 lD NO: 1 o 133) o de una proteina de armazon del l-Crel que tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, mas preferiblemente al menos un 95% de identidad con la SE0 lD NO: 133, tal como el armazon de la SE0 lD NO: 4 (167 aminoacidos) que tiene la insercion de una alanina en la posicion 2, la sustitucion D75N, y la insercion de AAD

15 en el termino C (posiciones 164 a 166) de la secuencia de l-Crel.

Ademas, las variantes de la invencion pueden incluir uno o mas restos insertados en el termino NH2 y/o en el termino COOH de la secuencia. Por ejemplo, se introdujo una etiqueta (epitopo (etiqueta HA (YPYDVPDYA; SE0 lD NO: 135) o etiqueta S (KETAAAKFER0HMDS; SE0 lD NO: 136) o secuencia de polihistidina) en el termino NH2 y/o en el

20 termino COOH; dicha etiqueta es util para la deteccion y/o la purificacion de dicha variante. Cuando se introduce la etiqueta en el termino NH2, la secuencia de la etiqueta puede tanto sustituir los primeros aminoacidos de la variante (al menos la primera metionina y eventualmente el segundo aminoacido de la variante, la etiqueta de inicio con una metionina) como insertarse entre el primer (metionina) y el segundo aminoacidos o el primer y el tercer aminoacidos de la variante (etiqueta sin metionina).

25 La variante puede comprender tambien una senal de localizacion nuclear (NLS); dicha NLS es util para la importacion de dicha variante en el nucleo de la celula. Un ejemplo de NLS es KKKRK (SE0 lD NO: 134). La NLS se puede insertar exactamente despues de la primera metionina de la variante o exactamente despues de una etiqueta N terminal.

30 La variante de acuerdo con la presente invencion puede ser un homodimero que sea capaz de escindir una secuencia de ADN diana palindromico o pseudopalindromico.

Alternativamente, dicha variante es un heterodimero, resultante de la asociacion del primer y el segundo monomero 35 que tienen diferentes sustituciones en las posiciones 26 a 40 y/o 44 a 77 del l-Crel, siendo dicho heterodimero capaz de escindir una secuencia de ADN diana no palindromico procedente del locus ROSA26 de raton.

La secuencia de ADN diana que se escinde por dicha variante puede estar en un exon o en un intron del locus ROSA26 de raton.

40 En otra realizacion preferida de dicha variante, dicho ADN diana se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 5 a 30 (Figura 17) que cubren todos los locus ROSA26 de raton.

Tabla l: secuencias diana del locus ROSA26

SEQ ID N(: : Secuencia diana Po sicion de la diana * Localizacion de la diana

5 cg: cccctgcgcaac gtggcagg 32 20 lntron 1

6 cc: gcacccttctccg gaggggg 34 90 lntron 1

7 tg: gactggcttgac t 17 lntron 1

8 cc: agcctggtctac acatcaag 5584 lntron 1 catggca 47

9 ct: atctaggatagcc aggaata 56 08 lntron 1

10 c: agcctgatttcca gggtgggg 59 06 lntron 1

11 t: aaacctcataaaa tagttatg 59 92 lntron 1

12 t: cagattcttttata ggggaca 64 09 lntron 1

13 t: tgtatatctcaaa taatgctg 73 94 lntron 1

14 t: gagccactgagaa tggtctca 80 70 lntron 1

15 c: aacatgatgttc ataatccca 8304 Exon 2

16 t: taaatgttgctat gcagtttg 8 394 Exon 2

17 t: tccccaaagttc caaattata 8583 Exon 2

18 t: aacaccgtttgt gttataata 8678 Exon 2

19 t: atactgtctttag agagttta 8aaatttaa 9 749 Exon 2

20 t: qtaataqcttag a 010 Exon 2

21 t: ttaatctattggt ttgtctag 9280 lntron 2

22 t: tgtacattgttag gagtgtga 9556 lntron 2

23 t: gcactggtacaca taatttca 102 63 lntron 2

24 tga: gatgatacaaagaatttag 11558 lntron 2 y tr anscrito de sentido contrario

25 cca: tcctataaaagaaggtcaa 12391 Exon 3 o tr anscrito de sentido contrario

26 ttta: atctattgcaaaaggtaa 1 2414 Exon 3 o tra nscrito de sentido contrario

27 tag: tccagtgttatagagttag 1 2535 Exon 3 o tra nscrito de sentido contrario

28 ttct: acctttttccaaatggca 1 2791 Exon 3 o tra nscrito de sentido contrario

29 tttt: ctgtggagacaaaggtaa 12904 Exon 3 o tra nscrito de sentido contrario

30 tga: gatggctcagcaaataatg 12954 Exon 3 o tr anscrito de sentido contrario

* La posicion indicada es la del primer nucleotido de la diana

Mas preferiblemente, los monomeros de la variante tienen al menos las siguientes sustituciones, respectivamente para el primer y el segundo monomero:

5 - N30H, Y33S, 044E, R68C, R70S y D75N (primer monomero), y N30D, Y33R, 038T, 044K, R68E, R70S, e l77R (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 5 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: S32N, Y33G, 044K, R70E y D75N (primer monomero), y S32T, 038W, 044K, R68E, R70S e l77R (segundo

monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 6 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figura 1 y 10 17; Tabla l),

-: Y33R, 038N, S400, 044N, R70S, D75R e l77D (primer monomero), y N30H, Y33S, 044A, R70S, D750 e l77E (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 7 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: K28S, 038R, S40K, 044D, R68Y, R70S, D75S e l77R (primer monomero), e Y33C, 038A, R68A, R70K y D75N

15 (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 8 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: Y33C, 044T, R70S y D75Y (primer monomero), y S32D, 038C, 044D, R68Y, R70S, D75S e l77R (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 9 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

20 - S32T, Y33C, R68T, R70N y D75N (primer monomero), y S32T, 038W, 044K, R70E y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 10 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: R70S, D75R e l77Y ((primer monomero), e Y33R, 038A, S400, 044A, R70S y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 11 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

25 - K28S, 038R, S40K, 044T, R68N, R70N y D75N (primer monomero), e Y33H, 038S, 044K, R68Y, R70S, D750 e l77N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 12 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: K28A, Y33S, 038R, S40K, 044N, R68Y, R70S, D75R, l77V (primer monomero), y S32T, Y33C, 044A, R70S y

D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 13 diana de ROSA26 que se localiza en el primer 30 intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: S32D, Y33H, 044K, R68E, R70S e l77R (primer monomero), y S32D, Y33H, 044D, R68N, R70S y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 14 diana de ROSA26 que se localiza en el primer intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: N30R, S32D, R68S, R70K y D75N (primer monomero), y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 35 lD NO: 16 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo exon (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: K28R, Y33A, 038Y, S400, R68Y, R70S, D75R e l770 (primer monomero), e Y33R, 038A, S400, R70S e l77K (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 17 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo exon (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: K28R, N30D, D75E e l77R (primer monomero), y S32D, 038C, 044A, R70S, D75R e l77Y (segundo monomero);

40 esta variante escinde la SE0 lD NO: 18 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo exon (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: Y33R, 038A; S400, R70S, y D75N (primer monomero), y R70S, D75Y e l77R (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 19 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo exon (Figuras 1 y 17; Tabla l), -Y33R, 038A, S400, 044N, R68Y, R70S, D75R e l77V (primer monomero), y N30R, S32D, 044T, R68H, R70H y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 20 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo exon (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: Y33P, S400, 044K, R68Y, R70S, D750 e l77N (primer monomero), y S32A, Y33C, R68Y, R70S, D75R e l770

(segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 21 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo 5 intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: K28A, Y33S, 038R, S40K, R68N, R70S, D75N e l77R (primer monomero), y S32N, Y33G, 044A, R68A, R70K y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 22 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: N30H, Y33S, 044Y, R70S e l77V (primer monomero), e Y33R, S400, 044A, R70S y D75N (segundo monomero);

10 esta variante escinde la SE0 lD NO: 23 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo intron (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: S32D, Y33H, R68T, R70N y D75N (primer monomero), y N30R, S32D, 044T, R68N, R70N y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 24 diana de ROSA26 que se localiza en el segundo intron y el transcrito de sentido contrario (Figuras 1 y 17; Tabla l),

15 - S32R, Y33D, 044A, R70S y D75N (primer monomero), e Y33S, 038R, S40H, R68H, R70H y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 25 diana de ROSA26 que se localiza en el tercer exon o el transcrito de sentido contrario (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: Y33P, S400, 044K, R68Y, R70S, D750 e l77N (primer monomero), y K28R, Y33A, 038Y, S400, 044T, R68H,

R70H y D75N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 26 diana de ROSA26 que se localiza en el 20 tercer exon o el transcrito de sentido contrario (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: K280, 038R, S40K, 044A, R70S, D75E e l77R (primer monomero), y N30R, S32D, 044K, R68Y, R70S, D750 e l77N (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 27 diana de ROSA26 que se localiza en el tercer exon o el transcrito de sentido contrario (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: Y33T, 038A, R68H, R70H y D75N (primer monomero), y N30H, Y33S, R70S e l77K (segundo monomero); esta

25 variante escinde la SE0 lD NO: 28 diana de ROSA26 que se localiza en el tercer exon o el transcrito de sentido contrario (Figuras 1 y 17; Tabla l),

-: Y33T, S40T, R68A, R70K y D75N (primer monomero), y K28R, Y33A, 038Y, S400, R70S e l77K (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 29 diana de ROSA26 que se localiza en el tercer exon o el transcrito de sentido contrario (Figuras 1 y 17; Tabla l), y

30 - S32D, Y33H, 044N, R70S, D75R e l77D (primer monomero), y S32D, 038C, R70S e l77K (segundo monomero); esta variante escinde la SE0 lD NO: 30 diana de ROSA26 que se localiza en el tercer exon o el transcrito de sentido contrario (Figuras 1 y 17; Tabla l).

Los ejemplos de dichas variantes que escinden los ADN diana de ROSA26 de la Tabla l (las secuencias de

35 nucleotidos SE0 lD NO: 5 a 14 y 16 a 30) incluyen las variantes que tienen un primer monomero de cualquiera de las secuencias de aminoacidos SE0 lD NO: 82 a 106 y un segundo monomero de cualquiera de las secuencias de aminoacidos SE0 lD NO: 107 a 116, 4, 117 a 130, respectivamente (Figura 17).

Adicionalmente, las siguientes variantes son capaces de escindir el ADN diana de ROSA26, denominado rosa1, que 40 se localiza en el segundo exon (Figuras 1 y 17; Tabla l):

-: las cuarenta variantes que tienen un primer monomero seleccionado entre el grupo que consiste en: l24V, 044Y, R70S y D75N; l24V, 044Y, R68Y, R70S, D75Y e l77R ; l24V, 044Y, R70S, D75N e l77V ; l24V, 044Y, R68N, R70S y D75R; l24V, 044Y, R68S, R70S y D75R; l24V, 044Y, R70S y D750 ; l24V, 044Y, R68Y, R70S, D75R e l77V ; 45 l24V, 044Y, R70S, D75Y e l77T, y un segundo monomero seleccionado en el grupo que consiste en: K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R68H, R700 y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R70N y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R68H, R700 y D75N ; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044V, R70A y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R70G y D75N; en la Tabla V se presentan ejemplos de estas variantes (primer monomero: m2, m6, m8, m12, m13, m14, m16 o m17 (SE0 lD NO: 39, 43, 45, 49, 50, 51, 53 y 54); segundo monomero cualquiera de la SE0 lD

50 NO : 60, 61, 63, 65 y 66)

-: la variante que tiene un primer monomero que comprende l24V, 044Y, R70S, D75Y e l77T y K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R68S, R700 y D75N (segundo monomero); en la Tabla V se presenta un ejemplo de esta variante (primer monomero m17 (SE0 lD NO: 54) y segundo monomero SE0 lD NO: 62).

-: las diez variantes que tienen un primer monomero seleccionado entre el grupo que consiste en l24V, 044Y, R68N,

55 R70S y D75R; l24V, 044Y, R68S, R70S y D75R; l24V, 044Y, R70S y D750; l24V, 044Y, R68Y, R70S, D75R e l77V; l24V, 044Y, R70S, D75Y e l77T, y un segundo monomero seleccionado en el grupo que consiste en: K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R70S y D75N y K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R68T, R70N y D75N; en la Tabla V se presentan ejemplos de estas variantes (primer monomero: m12, m13, m14, m16 o m17 (SE0 lD NO: 49, 50, 51, 53 y 54); segundo monomero cualquiera de la SE0 lD NO: 64 y 67.

-: las variantes que tienen un primer monomero que consiste en la secuencia SE0 lD NO: 72 (MO 1; Tablas Vl y Vll)

o SE0 lD NO: 73 (MO 2; Tablas Vl y Vll) y un segundo monomero que consiste en cualquiera de las secuencias SE0 lD NO: 74 a 77 (mO 1 a mO 4; Tabla Vll); estas ocho variantes tienen sustituciones adicionales que aumentan la actividad de escision de las variantes de la diana rosal.

5 La invencion abarca las variantes de l-Crel que tienen al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, mas preferiblemente al menos un 95% (96%, 97%, 98%, 99%) de identidad con las secuencias, tal como se ha definido anteriormente, siendo dicha variante capaz de escindir un ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton.

10 Por ejemplo, la invencion abarca las variantes de l-Crel derivadas de MO 1 y mO 2 mediante la insercion de una NLS, una etiqueta o ambas, que se seleccionan entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 140 a

145.

15 La variante heterodimerica es ventajosamente una variante heterodimerica obligada que tiene al menos un par de mutaciones interesantes que corresponden a restos del primer y el segundo monomeros que realizan una interaccion molecular entre los dos monomeros l-Crel, en el que la primera mutacion de dicho(s) par(es) esta en el primer monomero y la segunda mutacion de dicho(s) par(es) esta en el segundo monomero y dicho(s) par(es) de mutaciones evitan la formacion de homodimeros funcionales entre cada monomero y permiten la formacion de un

20 heterodimero funcional, capaz de escindir el ADN genomico diana procedente del locus ROSA26 de raton

Para formar un heterodimero obligado, los monomeros tienen ventajosamente al menos uno de los siguientes pares de mutaciones, respectivamente para el primer y el segundo monomero.

25 a) la sustitucion del acido glutamico en la posicion 8 con un aminoacido basico, preferiblemente una arginina (primer monomero) y la sustitucion de la lisina en la posicion 7 con un aminoacido acido, preferiblemente un acido glutamico (segundo monomero); el primer monomero puede comprender ademas la sustitucion de al menos uno de los restos de lisina en las posiciones 7 y 96, por una arginina. b) la sustitucion del acido glutamico en la posicion 61 con un aminoacido basico, preferiblemente una arginina

30 (primer monomero) y la sustitucion de la lisina en la posicion 96 con un aminoacido, preferiblemente un acido glutamico (segundo monomero); el primer monomero puede comprender ademas la sustitucion de al menos uno de los restos de lisina en las posiciones 7 y 96, por una arginina. c) la sustitucion de la leucina en la posicion 97 con un aminoacido aromatico, preferiblemente una fenilalanina (primer monomero) y la sustitucion de la fenilalanina en la posicion 54 con un aminoacido pequeno,

35 preferiblemente una glicina (segundo monomero); el primer monomero puede comprender ademas la sustitucion de la fenilalanina en la posicion 54 por un triptofano y el segundo monomero puede comprender ademas la sustitucion de la leucina en la posicion 58 o la lisina en la posicion 57, por una metionina, y d) la sustitucion del acido aspartico en la posicion 137 con un aminoacido basico, preferiblemente una arginina (primer monomero) y la sustitucion de la arginina en la posicion 51 con un aminoacido acido, preferiblemente

40 un acido glutamico (segundo monomero).

Por ejemplo, el primer monomero puede tener la mutacion D137R y el segundo monomero, la mutacion R51D. La meganucleasa del heterodimero obligado comprende ventajosamente, al menos dos pares de mutaciones tal como se define en a), b), c) o d), anteriormente; uno de los pares de mutaciones es ventajosamente tal como se define en 45 c) o d). Preferiblemente, un monomero comprende la sustitucion de restos de lisina en las posiciones 7 y 96 por un aminoacido acido (acido aspartico (D) o acido glutamico (E)), preferiblemente un acido aspartico (K7E y K96E) y el otro monomero comprende la sustitucion de restos de acido glutamico en las posiciones 8 y 61 por un aminoacido basico (arginina (R) o lisina (K); por ejemplo, E8K y E61R). Mas preferiblemente, la meganucleasa del heterodimero obligado, comprende tres pares de mutaciones tal como se define en a), b) y c), anteriormente. La meganucleasa del 50 heterodimero obligado consiste ventajosamente en (i) E8R, E8K o E8H, E61R, E61K o E61H y L97F, L97W o L97Y;

(ii) K7R, E8R, E61 R, K96R y L97F, o (iii) K7R, E8R, F54W, E61R, K96R y L97F y un segundo monomero (B) que tiene al menos las mutaciones (iv) K7E o K7D, F54G o F54A y K96D o K96E; (v) K7E, F54G, L58M y K96E, o (vi) K7E, F54G, K57M y K96E. Por ejemplo, el primer monomero puede tener las mutaciones K7R, E8R o E8K, E61R, K96R y L97F o K7R, E8R o E8K, F54W, E61R, K96R y L97F y el segundo monomero, las mutaciones K7E, F54G,

55 L58M y K96E o K7E, F54G, K57M y K96E. Un ejemplo de heterodimero es la SE0 lD NO: 147 y la SE0 lD NO: 148. El heterodimero obligado puede comprender al menos una NLS y/o una etiqueta tal como se ha definido anteriormente; dicha NLS y/o la etiqueta puede estar en el primer y/o el segundo monomero.

La materia sujeto de la presente invencion es tambien una meganucleasa quimerica monocatenaria (proteina de fusion) derivada de una variante de I-Crel tal como se ha definido anteriormente. La meganucleasa monocatenaria puede comprender dos monomeros de I-Crel, dos dominios del nucleo de l-Crel (posiciones 6 a 94 de l-Crel) o una combinacion de ambos. Preferiblemente, los dos monomeros / dominios del nucleo o la combinacion de ambos, estan conectados por un enlazante peptidico. Un ejemplo de enlazante peptidico es la SE0 lD NO: 149. Un ejemplo

5 de meganucleasa quimerica monocatenaria es la SE0 lD NO: 146. La meganucleasa quimerica monocatenaria puede comprender ademas al menos una NLS y/o una etiqueta tal como se ha definido anteriormente; dicha NLS y/o la etiqueta puede estar en el primer y/o el segundo monomero.

La materia sujeto de la presente invencion es tambien un fragmento de polinucleotido que codifica una variante o

10 una meganucleasa quimerica monocatenaria tal como se ha definido anteriormente; dicho polinucleotido puede codificar un monomero de una variante homodimerica o heterodimerica, o dos dominios/monomeros de una meganucleasa quimerica monocatenaria.

La materia sujeto de la presente invencion es tambien un vector recombinante para la expresion de una variante o

15 de una meganucleasa monocatenaria de acuerdo con la invencion. El vector recombinante comprende al menos un fragmento de polinucleotido que codifica una variante o una meganucleasa monocatenaria, tal como se ha definido anteriormente. En una realizacion preferida, dicho vector comprende dos fragmentos de polinucleotidos diferentes, codificando cada uno, uno de los monomeros de una variante heterodimerica.

20 Un vector que se puede usar en la presente invencion incluye, pero no se limita a, un vector virico, un plasmido, un vector de ARN o una molecula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en unos acidos nucleicos cromosomicos, no cromosomicos, semisinteticos o sinteticos. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicacion autonoma (vector episomico) y/o la expresion de los acidos nucleicos a los que se unen (vectores de expresion). Los expertos en la materia conocen grandes cantidades de vectores adecuados y estan comercialmente

25 disponibles.

Los vectores viricos incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena levogira tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rhabdovirus (por ejemplo, virus de la hidrofobia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampion y Sendai), virus de ARN 30 de cadena dextrogira tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario que incluyen adenovirus, virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus), y virus de la viruela (por ejemplo, vaccinia, virus de la viruela aviar, y virus de la viruela del canario). Otros virus incluyen el virus de Norwalk, los togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus, y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucossisarcoma aviar, virus de tipo C de mamiferos, virus de tipo B, virus de tipo D,

35 grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, ln Fundamental Virology, tercera Edicion, B. N. Fields, y col., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

Los vectores preferidos incluyen vectores lentiviricos, y particularmente vectores lentiviricos autoinactivantes.

40 Los vectores pueden comprender marcadores seleccionables, por ejemplo: neomicin fosfotransferasa, histidinol, deshidrogenasa, glutamina sintetasa, e hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa para el cultivo de celulas eucariotas; TRP1 para S. eerevisiae; tetraciclina, resistencia a la rifampicina o ampicilina en E. eoli.

Preferiblemente, dichos vectores son vectores de expresion, en los que la(s) secuencia(s) que codifica(n) la

45 meganucleasa variante/monocatenaria de la invencion se coloca(n) bajo el control de elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados para permitir la produccion o la sintesis de dicha variante. Por tanto, dicho polinucleotido esta comprendido por un casete de expresion. Mas concretamente, el vector comprende un origen de la replicacion, un promotor unido operativamente con dicho polinucleotido codificante, un sitio de union al ribosoma, un sitio de corte y empalme del ARN (cuando se usa ADN genomico), un sitio de poliadenilacion y un sitio

50 de terminacion de la transcripcion. Puede comprender tambien un potenciador. La seleccion del promotor dependera de la celula en la que el polipeptido se expresa. Preferiblemente, cuando dicha variante es un heterodimero, los dos polinucleotidos que codifican cada uno de los monomeros se incluyen e un vector que es capaz de impulsar la expresion de ambos polinucleotidos, simultaneamente. Los promotores incluyen promotores especificos de tejido y/o inducibles. Los ejemplos de promotores inducibles son: el promotor eucariotico de la metalotionina que esta inducido

55 D-tiogalacto-piranosido (lPTG) y el promotor eucariota del choque termico que esta inducido por la temperatura creciente. Los ejemplos de promotores especificos de tejido son la creatina cinasa del musculo esqueletico, el De acuerdo con otra realizacion ventajosa de dicho vector, este incluye una construccion directora que comprende secuencias que comparten homologias con la region que rodea el sitio de escision del ADN genomico tal como se ha definido anteriormente.

5 Alternativamente el vector que codifica una meganucleasa l-Crel variante/monocatenaria y el vector que comprende la construccion directora son vectores diferentes.

Mas preferiblemente, la construccion directora del ADN comprende:

10 a) Secuencias que comparten homologias con la region que rodea el sitio de escision del ADN genomico tal como se ha definido anteriormente, y b) Una secuencia que se va a introducir flanqueada por secuencias como en a)

Para la activacion genica en el locus ROSA26 de raton, la secuencia que se va a introducir comprende un casete 15 exogeno de expresion genica o parte del mismo y eventualmente un marcador de seleccion, tal como un gen HPRT.

Alternativamente, la secuencia que se va a introducir puede ser cualquier otra secuencia usada para alterar el locus ROSA26 de raton de alguna manera especifica incluyendo una secuencia usada para modificar una secuencia especifica en el locus ROSA26 de raton, para atenuar o activar el locus ROSA26 de raton o parte del mismo, para

20 introducir una mutacion en un sitio de interes del locus ROSA26 de raton, o para inactivar o eliminar el locus ROSA26 de raton o una parte del mismo.

Preferiblemente, se usan secuencias homologas de al menos 50 pb, preferiblemente de mas de 100 pb y mas preferiblemente de mas de 200 pb para reparar el sitio de escision. De este modo, se localizan homologias 25 compartidas de ADN en regiones flanqueantes en la direccion 5' y en la direccion 3' del sitio de la rotura y la secuencia de ADN que se va a introducir debe localizarse entre los dos brazos.

Por tanto, la construccion directora es preferiblemente de 200 pb a 6000 pb, mas preferiblemente de 1000 pb a 2000 pb.

30 Para la insercion de una secuencia, las homologias del ADN se localizan generalmente en regiones situadas directamente en la direccion 5' y en la direccion 3' del sitio de la rotura (secuencias inmediatamente adyacentes a la rotura; matriz de minima reparacion). Sin embargo, cuando la insercion se asocia con una delecion de secuencias que flanquean el sitio de escision, las homologias compartidas del ADN se localizan en las regiones situadas en la

35 direccion 5' y en la direccion 3' de la region de la delecion.

Por ejemplo, se indican en la figura 17 los ADN dianas de ROSA26 de raton que se escinden por las variantes tal como se ha definido anteriormente y la matriz minima para reparar cada una de las escisiones generadas por cada variante.

40 La materia sujeto de la presente invencion es tambien una composicion caracterizada porque comprende al menos una meganucleasa tal como se ha definido anteriormente (meganucleasa variante o quimerica derivada monocatenaria) y/o al menos un vector de expresion que codifica dicha meganucleasa, tal como se ha definido anteriormente.

45 En una realizacion preferida de dicha composicion, esta comprende una construccion directora del ADN tal como se ha definido anteriormente.

Preferiblemente, dicha construccion directora del ADN, esta incluida tanto en un vector recombinante como esta 50 incluida en un vector de expresion que comprende el(los) polinucleotidos que codifican la meganucleasa de acuerdo con la invencion.

La materia sujeto de la presente invencion es ademas el uso de una meganucleasa tal como se ha definido anteriormente, uno o dos polinucleotido(s), incluidos preferentemente en el(los) vector(es) de expresion, para la 55 genomanipulacion del genoma en el locus ROSA26 de raton, para objetivos no terapeuticos.

De acuerdo con una realizacion ventajosa de dicho uso, es para inducir una rotura en la doble cadena en un sitio de interes del locus ROSA26 de raton que comprende una secuencia genomica del ADN diana, induciendo por consiguiente un episodio de recombinacion del ADN, una perdida de ADN o la muerte celular.

De acuerdo con la invencion, dicha rotura de la doble cadena es para: modificar una secuencia especifica en el locus de ROSA26, atenuar o activar el locus ROSA26 endogeno, introducir una mutacion en un sitio de interes del locus ROSA26, introducir un gen exogeno o una parte del mismo, inactivar o eliminar el locus ROSA26 endogeno o una parte del mismo, translocar un brazo cromosomicos, o dejar el ADN sin reparar y degradado.

5 De acuerdo con otra realizacion ventajosa de dicho uso, dicha variante, polinucleotido(s), vector, se asocian con una construccion directora del ADN tal como se ha definido anteriormente.

En una realizacion preferida del uso de la meganucleasa de acuerdo con la presente invencion, esta comprende al

10 menos las siguientes etapas: 1) introducir una rotura en la doble cadena en un sitio de interes del locus ROSA26 de raton que comprenda al menos un sitio de reconocimiento y escision de dicha meganucleasa, poniendo en contacto dicho sitio de escision con dicha meganucleasa; 2) proporcionar una construccion directora del ADN que comprenda la secuencia que se va a introducir flanqueada por secuencias que comparten homologias con el locus dirigido Se puede proporcionar dicha meganucleasa directamente a la celula o a traves de un vector de expresion que

15 comprenda la secuencia del polinucleotido que codifica dicha meganucleasa y adecuada para su expresion en la celula usada. Se usa la estrategia para introducir una secuencia de ADN en el sitio diana, por ejemplo, para generar la activacion en ratones transgenicos o en lineas recombinantes de celulas de raton que se pueden usar para la produccion de proteinas, estudios de la funcion genica, desarrollo de farmacos (cribado de farmacos) o como modelo de la enfermedad.

20 La materia sujeto de la presente invencion es tambien un procedimiento para preparar un raton transgenico que exprese un producto de interes, que comprende al menos la etapa de:

(a) lntroducir e una celula precursora pluripotente de raton o en un embrion de raton, una meganucleasa, tal

25 como se ha definido anteriormente con el fin de inducir en ella una escision en la doble cadena e un sitio de interes del locus ROSA26 que comprende un sitio de reconocimiento y escision de dicha meganucleasa; simultanea o consecutivamente,

(b) lntroducir en la celula precursora o el embrion de raton de la etapa (a) un ADN director, que comprende al menos una secuencia que codifica un producto de interes flanqueado por secuencias que comparten

30 homologias con la region que rodea el sitio de escision, con el fin de generar una celula o embrion precursores de raton genomicamente modificado que tenga insertada la secuencia de interes mediante recombinacion homologa entre el ADN director y el ADN cromosomico,

(c) Desarrollar la celula o embrion precursores de raton genomicamente modificado de la etapa (b) en un

raton quimerico, y 35 (d) Derivar un raton transgenico del raton quimerico de la etapa (c).

Preferiblemente, la etapa (c) comprende la introduccion de una celula precursora genomicamente modificada en la etapa (b) en el interior de blastocistos con el fin de generar ratones quimericos.

40 De acuerdo con una realizacion preferida de dicho procedimiento, este comprende una etapa adicional (e) de recuperacion del producto de interes procedente del raton transgenico, por cualquier medio.

La materia sujeto de la presente invencion es tambien un procedimiento para preparar una celula recombinante de raton que expresa un producto de interes, que comprende al menos la etapa de:

(a): lntroducir en una celula de raton, una meganucleasa, tal como se ha definido anteriormente, con el fin de inducir una rotura de la doble cadena en un sitio de interes del locus ROSA26 que comprende un reconocimiento del ADN y un sitio de escision para dicha meganucleasa, simultanea o consecutivamente.

(b): lntroducir en la celula de la etapa (a), un ADN director, en el que dicho ADN director que comprende al

50 menos una secuencia que codifica un producto de interes flanqueada por secuencias que comparten homologias con la region que rodea el sitio de escision, con el fin de generar una celula recombinante de raton que tiene insertada la secuencia de interes mediante recombinacion homologa entre el ADN director y el ADN cromosomico,

(c) aislar la celula recombinante de raton de la etapa (b), mediante cualquier medio apropiado.

55 De acuerdo con una realizacion preferida de dicho procedimiento, este comprende una etapa adicional (d) de recuperacion del producto de interes de la celula recombinante de raton, mediante cualquier medio.

El ADN director se introduce en la celula en las condiciones apropiadas para la introduccion del ADN director en el sitio de interes.

En una realizacion preferida, dicha construccion directora del ADN se inserta en un vector.

5 La celula que se modifica puede ser cualquier celula de interes. Para preparar ratones transgenicos, las celulas son celulas precursoras pluripotentes tales como citoblastos derivados de embriones (ES), que son bien conocidos en la tecnica. Para preparar lineas recombinantes de celulas de raton, las celulas pueden ser ventajosamente celulas NSO, SP2/0 (BALB/c de mieloma; ECACC nO 85110503 y nO 85072401), o L (ATCC nO CRL-2648). Dicha meganucleasa se puede proporcionar directamente a la celula o a traves de un vector de expresion que comprenda

10 la secuencia del polinucleotido que codifica dicha meganucleasa y adecuada para su expresion en la celula usada.

Para preparar animales/lineas de celulas recombinantes que expresan un producto de interes, el ADN director comprende una secuencia que codifica el producto de interes (proteina o ARN), y eventualmente, un gen marcador seleccionable, flanqueado por secuencias en la direccion 5' y en la direccion 3' del sitio de la meganucleasa en el

15 locus ROSA26 de raton, tal como se ha definido anteriormente, con el fin de generar celulas genomicamente modificadas (celula o embrion precursor animal/celula animal o humana) que tienen integrada la secuencia exogena de interes en el sitio de la meganucleasa en el locus ROSA26, mediante recombinacion homologa.

La secuencia de interes puede ser cualquier gen que codifique alguna proteina/peptido de interes, incluyendo, pero

20 sin limitarse a: genes indicadores, receptores, moleculas de senalizacion, factores de transcripcion, proteinas y peptidos farmaceuticamente activos, productos y toxinas genicas que producen enfermedad. La secuencia puede codificar tambien una molecula de ARN de interes incluyendo por ejemplo un ARNip.

Se puede impulsar la expresion de la secuencia exogena, tanto mediante el promotor ROSA26 endogeno como

25 mediante un promotor heterologo, preferiblemente un promotor ubicuo o especifico de tejido, tanto constitutivo como inducible, tal como se ha definido anteriormente. Ademas, la expresion de la secuencia de interes puede ser condicional; se puede inducir la expresion mediante una recombinasa especifica del sitio (Cre, FLP.).

De esta manera, la secuencia de interes se inserta en un casete apropiado que puede comprender un promotor

30 heterologo operativamente enlazado con dicho gen de interes y una o mas secuencias funcionales incluyendo, pero sin limitarse a (genes marcadores (seleccionables), sitios de reconocimiento de la recombinasa, senales de poliadenilacion, secuencias aceptoras de corte y empalme, intrones, etiquetas para la deteccion de proteinas y potenciadores.

35 Alternativamente, el casete apropiado puede comprender un sitio lnterno de Entrada al Ribosoma (lRES) operativamente enlazado con dicho gen de interes y una o mas secuencias funcionales incluyendo solamente n eventos lRES-Hygro (pCLS1675), que no se limitan a genes marcadores (seleccionables), sitios de reconocimiento de la recombinasa, senales de poliadenilacion, secuencias aceptoras de corte y empalme, intrones, etiquetas para la deteccion de proteinas y potenciadores.

40 La meganucleasa se puede usar bien como un polipeptido o bien como una construccion de polinucleotidos que codifica dicho polipeptido. Se introduce en celulas de raton, mediante cualquier medio conveniente bien conocido de los expertos en la tecnica, que sea apropiado para el tipo de celula concreta, sola o en asociacion ya sea con al menos un vehiculo o portador apropiado y/o con el ADN director.

45 De acuerdo con una realizacion ventajosa de los usos de acuerdo con la invencion, la meganucleasa (polipeptido) esta asociada con:

-: liposomas, polietileneneimina (PEl); en tal caso, dicha asociacion se administra y se introduce por tanto en 50 celulas diana somaticas

-: peptidos de translocacion de membrana (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Ford y col., Gene Ther., 2001, 8, 1-4; Wadia y Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52-56); en tal caso, la secuencia de la meganucleasa variante/monocatenaria se fusiona con la secuencia de un peptido de translocacion de membrana (proteina de fusion)

55 De acuerdo con otra realizacion ventajosa de los usos de acuerdo con la invencion, la meganucleasa (el polinucleotido que codifica dicha meganucleasa) y/o el ADN director se insertan en un vector. Se pueden introducir vectores que comprenden el ADN director y/o el acido nucleico que codifica una meganucleasa en una celula mediante una variedad de procedimientos (por ejemplo, inyeccion, captacion directa, bombardeo de proyectiles, liposomas, electroporacion). Las meganucleasas se pueden expresar de manera estable o transitoria en celulas que usan vectores de expresion. Los expertos en la materia conocen bien las tecnicas de expresion en celulas eucariotas. (Vease Current Protocols in Human Genetics: Capitulo 12 "Vectors For Gene Therapy" y Capitulo 13 "Delivery Systems for Gene Therapy"). Opcionalmente, puede ser preferible incorporar una senal de localizacion

5 nuclear en la proteina recombinante para asegurarse que se expresa en el interior del nucleo.

Una vez en la celula, y si esta presente la meganucleasa, el vector que comprende el ADN director y/o el acido nucleico que codifica una meganucleasa se importa o transloca por la celula desde el citoplasma al sitio de accion en el nucleo.

10 En una realizacion de los usos de acuerdo con la presente invencion, la meganucleasa es sustancialmente no inmunogena, es decir, engendra poca o ninguna respuesta inmunologica adversa. Se pueden usar una variedad de procedimientos para mejorar o eliminar las reacciones inmunologicas perjudiciales de este tipo, de acuerdo con la invencion. En una realizacion preferida, la meganucleasa esta sustancialmente exenta de N-formil metionina. Otra

15 manera de evitar reacciones inmunologicas no deseadas es conjugar las meganucleasas con polietilenglicol ("PEG")

o prolipropilenglicol ("PPG") (preferiblemente de 500 a 20.000 daltons de peso molecular promedio (PM). La conjugacion con PEG o PPG, tal como se describe por Davis y col. (documento US 4.179.337) por ejemplo, puede proporcionar conjugados de endonucleasas solubles en agua, no inmunogenos, fisiologicamente activos. Procedimientos similares usando tambien un copolimero de polietileno-polipropilenglicol, se describen en Saifer y

20 col. (documento US 5.006.333).

La invencion se refiere tambien a una celula hospedadora procariota o eucariota que esta modificada por un polinucleotido o un vector tal como se ha definido anteriormente, preferiblemente un vector de expresion.

25 La invencion se refiere tambien a un animal transgenico no humano o a una planta transgenica, caracterizados porque todas o parte de sus celulas estan modificadas por un polinucleotido o un vector tal como se ha definido anteriormente.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, una celula se refiere a una celula procariota, tal como una 30 celula bacteriana, o una celula eucariota, tal como una celula animal, planta o levadura.

La materia sujeto de la presente invencion es tambien el uso de al menos una variante de meganucleasa, tal como se ha definido anteriormente, como un armazon para preparar otras meganucleasas. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, un tercer ciclo de mutagenesis y seleccion/cribado en dichas variantes, con el objetivo de preparar

35 novedosas meganucleasas de tercera generacion.

Los diferentes usos de la meganucleasa y los procedimientos de utilizacion de dicha meganucleasa de acuerdo con la presente invencion incluyen el uso de la variante de l-Crel, la meganucleasa quimerica monocatenaria derivada de dicha variante, el(los) polinucleotido(s), el vector, la celula, la planta transgenica o el mamifero transgenico no

40 humano que codifica dicha variante o meganucleasa quimerica monocatenaria, tal como se ha definido anteriormente.

La variante de l-Crel de acuerdo con la invencion se puede obtener mediante un procedimiento para genomanipular variantes de l-Crel capaces de escindir una secuencia diana de ADN genomico procedente del locus ROSA26 de

45 raton, que comprende al menos las etapas de:

(a) construir una primera serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en un primer subdominio funcional del dominio del nucleo LAGLlDADG situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel,

(b) construir una segunda serie de variantes de l-Crel que tenga al menos una sustitucion en un segundo 50 subdominio funcional del dominio del nucleo LAGLlDADG situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel,

(c) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha diana genomica y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 se ha sustituido con la

55 secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha diana genomica,

(d): seleccionar y/o cribar las variantes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha diana

genomica y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha diana genomica,

(e): seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de

5 escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha diana genomica y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha diana genomica,

10 (f) seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha diana genomica y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5

15 de dicha diana genomica,

(g) combinar en una unica variante, la(s) mutacion(es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de dos variantes procedentes de la etapa (c) y la etapa (d), para obtener una variante homodimerica novedosa de l-Crel que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha diana genomica, (ii) el triplete

20 de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha diana genomica, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha diana genomica y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las

25 posiciones -5 a -3 de dicha diana genomica, y/o

(h) combinar en una unica variante, la(s) mutacion(es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de dos variantes procedentes de la etapa (e) y la etapa (f), para obtener una novedosa variante homodimerica de l-Crel que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha diana genomica, (ii) el triplete

30 de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha diana genomica, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha diana genomica y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos en las

35 posiciones +8 a +10 de dicha diana genomica,

(i): combinar las variantes obtenidas en las etapas (g) y (h) para formar heterodimeros, y

(j): seleccionar y/o cribar los heterodimeros procedentes de la etapa (i) que son capaces de escindir dicho ADN genomico diana del locus ROSA26 de raton.

40 Se puede omitir una de las etapa(s) (c), (d), (e) o (f). Por ejemplo, si se omite la etapa (c), la etapa (d) se lleva a cabo con un sitio l-Crel mutante en el que ambos tripletes de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 y -5 a -3 se han sustituido con los tripletes de nucleotidos que estan presente en las posiciones -10 a -8 y -5 a -3, respectivamente de dicha diana genomica, y los tripletes de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 y +8 a +10 se han sustituido con la secuencia complementaria inversa de los tripletes de nucleotidos que estan presentes en las posiciones -5 a -3 y -10

45 a -8, respectivamente de dicha diana genomica.

Las etapas (a), (b), (g), (h) e (i) pueden comprender ademas la introduccion de mutaciones adicionales en otras posiciones que entran en contacto con la secuencia de ADN diana o interactuan directa o indirectamente con dicha secuencia diana, en las posiciones que mejoran las propiedades de union y/o escision de los mutantes, o en las

50 posiciones que evitan la formacion de homodimeros funcionales, tal como se ha definido anteriormente. Esto se puede llevar a cabo generando una biblioteca combinatoria tal como se describe en la Solicitud PCT lnternacional WO 2004/067736.

El procedimiento para genomanipular variantes de l-Crel de la invencion comprende ventajosamente la introduccion

55 de mutaciones aleatorias en la variante completa o en una parte de la variante, en particular, la mitad C terminal de la variante (posiciones 80 a 163) para mejorar las propiedades de union y/o escision de los mutantes hacia el ADN diana procedente del gen de interes. Se puede llevar a cabo la mutagenesis generando bibliotecas de mutagenesis aleatorias en un combinado de variantes, de acuerdo con los procedimientos normalizados de la mutagenesis que son bien conocidos en la tecnica y estan comercialmente disponibles. Preferiblemente, la mutagenesis se lleva a cabo en la secuencia completa de un monomero del heterodimero formado en la etapa (i) u obtenido en la etapa (j), ventajosamente en un combinado de monomeros, preferiblemente en ambos monomeros del heterodimero de la etapa (i) o (j).

5 Preferiblemente, se llevan a cabo dos ciclos de seleccion/cribado de acuerdo con el proceso ilustrado por la figura 4 de Arnould y col., J. Mol. Biol., Epub 10 de mayo de 2007. En el primer ciclo, uno de los monomeros del heterodimero se somete a mutagenesis (monomero Y en la figura 4), se expresa simultaneamente con el otro monomero (monomero X en la figura 4) para formar heterodimeros, y los monomeros Y+ mejorados se seleccionan frente a la diana procedente del gen de interes. En el segundo ciclo, el otro monomero (monomero X) se somete a

10 mutagenesis, se expresa simultaneamente con los monomeros Y4 mejorados para formar heterodimeros, y se selecciona frente a la diana procedente del gen de interes para obtener meganucleasas (X+ Y+) con actividad mejorada.

La combinacion (intramolecular) de mutaciones en las etapas (g) y (h) se puede llevar a cabo amplificando los

15 fragmento solapantes que comprenden cada uno de los dos subdominios, de acuerdo con las tecnicas de solapamiento de la PCR bien conocidas.

La combinacion (intermolecular) de las variantes en la etapa (i) se lleva a cabo expresando simultaneamente una variante procedente de la etapa (g) con una variante procedente de la etapa (h), con el fin de permitir la formacion de

20 heterodimeros. Por ejemplo, las celulas hospedadoras se pueden modificar mediante uno o dos vector(es) de expresion recombinantes que codifica(n) dicha(s) variante(s). A continuacion se cultivan las celulas en condiciones que permitan la expresion de la(s) variante(s), de tal manera que se formen heterodimeros en las celulas hospedadoras, tal como se ha descrito anteriormente en la Solicitud PCT lnternacional WO 2006/097854 y Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458.

25 Se puede llevar a cabo la seleccion y/o el cribado en las etapas (c), (d), (e), (f) y/o (j) usando un ensayo de escision in vitro o in vivo, tal como se describe en la Solicitud PCT lnternacional WO 2004/067736, Arnould et al., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458, Epinat y col., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962 y Chames y col., Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178.

30 De acuerdo con otra realizacion ventajosa de dicho procedimiento, las etapas (c), (d), (e), (f) y/o (j) se llevan a cabo in vivo, en condiciones en las que la rotura de la doble cadena en la secuencia mutada del ADN diana que se genera por dicha variante conduce a la activacion de un marcador de seleccion positivo o un gen indicador, o la inactivacion de un marcador d seleccion negativo o un gen indicador, mediante reparacion medida por recombinacion de dicha

35 rotura del ADN bicatenario.

La materia sujeto de la presente invencion es tambien una variante de l-Crel que tiene mutaciones en la posiciones 26 a 40 y/o 44 a 77 del l-Crel que es util para genomanipular las variantes capaces de escindir un ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, de acuerdo con la presente invencion. En particular, la invencion abarca las

40 variantes de l-Crel tal como se define en la etapa (c) a (f) del procedimiento para genomanipular variantes de l-Crel, tal como se ha definido anteriormente, incluyendo las variantes m1 a m18 (Tabla ll, SE0 lD NO: 38 a 55), la variante que comprende 044V, R70A y D75N (SE0 lD NO: 131; Tabla lll) y la variante que comprende K28E, Y33R, 038R, S40R y D75N (SE0 lD NO: 132; Tabla lll). La invencion abarca tambien las variantes de l-Crel tal como se definen en la etapa (g) y (h) del procedimiento para genomanipular las variantes de l-Crel, tal como se ha definido

45 anteriormente, incluyendo las variantes de la secuencia SE0 lD NO: 60 a 67 (variantes combinadas de la Tabla lll).

Las meganucleasas quimericas monocatenarias capaces de escindir un ADN diana procedente del gen de interes se derivan de las variantes de acuerdo con la invencion mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica (Epinat y col., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-62; Chevalier y col., Mol. Cell., 2002, 10, 895-905; Steuer y col.,

50 Chembiochem., 2004, 5, 206-13; Solicitudes PCT lnternacionales WO 03/078619 y WO 2004/031346). Cualquiera de dichos procedimientos, se puede aplicar para la construccion de meganucleasas quimericas monocatenarias derivadas de las variantes tal como se define en la presente invencion.

La(s) secuencia(s) del (de los) polinucleotido(s) que codifica(n) la variante tal como se define en la presente

55 invencion se puede preparar mediante cualquier procedimiento conocido por la persona experta en la materia. Por ejemplo, se amplifican a partir de un molde de ADNc, mediante reaccion en cadena de la polimerasa con cebadores especificos. Preferiblemente, los codones de dicho ADNc se seleccionan para favorecer la expresion de dicha proteina en el sistema de expresion deseado.

El vector recombinante que comprende dichos polinucleotidos se puede obtener e introducirse en una celula hospedadora mediante tecnicas de ADN recombinante e ingenieria genetica bien conocidas.

La variante de l-Crel o el derivado monocatenario tal como se define en la presente invencion se producen

5 expresando el(los) polipeptido(s) tal como se ha definido anteriormente; preferiblemente, dicho(s) polipeptido(s) se expresa(n) o expresan simultaneamente (en el caso de la variante sola) en una celula hospedadora o un animal/planta transgenicos modificados para la expresion o expresion simultanea del(de los) polipeptido(s), y la variante o derivado monocatenario se recupera del cultivo de la celula hospedadora o del animal/planta transgenicos.

10 La practica de la presente invencion empleara, a no ser que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologia celular, cultivo celular, biologia molecular, biologia transgenica, microbiologia, ADN recombinante, e inmunologia, que estan comprendidas en los conocimientos del experto en la materia. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliografia. Veanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M.

15 AUSUBEL, 2000, Wiley and son lnc, Biblioteca del Congreso, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis y col. Patente de los Estados Unidos NO 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. l. Freshney, Alan R. Liss, lnc., 1987); lmmobilized Cells And

20 Enzymes (lRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods ln ENZYMOLOGY (J. Abelson y M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, lnc., Nueva York), especificamente, Vols.154 y 155 (Wu y col. eds.) y Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); lmmunochemical Methods ln Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental

25 lmmunology, Volumes l-lV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Adicionalmente a las caracteristicas anteriores, la invencion comprende ademas otras caracteristicas que surgiran de la descripcion que sigue, que se refiere a los ejemplos que ilustran las variantes l-Crel de la meganucleasa y sus

30 usos de acuerdo con la invencion, asi como los dibujos adjuntos en los que:

-: la figura 1 representa el locus ROSA26 de raton (numero de acceso EMBL C0880114; SE0 lD NO: 3). Los exones se secuencian (Exon 1. Posiciones 2490 a 2599, el Exon 2 a partir del transcrito 1: posiciones 8228 a 9248; el Exon 3 a partir del transcrito 2 comienza en la posicion 11845, y solapamientos en gran parte con el transcrito de sentido contrario, que finaliza en la posicion 11505. Se indican los tres transcritos

35 identificados hasta el momento asi como la secuencia y la posicion de la diana rosa1 (SE0 lD NO: 15).

-: la figura 2 representa la estructura tridimensional de la endonucleasa de asentamiento l-Crel unida a su ADN diana. El nucleo catalitico esta rodeado por interaccion con forma de silla de montar por encima de la ranura mayor del ADN.

-: la figura 3 ilustra una solucion en dos etapas para genomanipular la especificidad de l-Crel y otras

40 endonucleasas de asentamiento LAGLlDADG. Se genero una gran coleccion de derivados de l-Crel mediante mutagenesis semirracional de un armazon inicial y cribado de variantes funcionales con especificidad localmente alterada. A continuacion, se uso una solucion combinatoria para ensamblar estos mutantes en meganucleasas con especificidad completamente redisenada. Se crearon proteinas homodimericas ("semimeganucleasas" mediante combinaciones de dos conjuntos de mutaciones dentro de

45 como resultado especies heterodimericas ("meganucleasa hecha a medida" que escinden la diana de interes.

-: la figura 4 representa una estrategia para el uso de una meganucleasa que escinde el locus ROSA26 de raton. La insercion genica usando la recombinacion homologa inducida por meganucleasa activara un gen

50 de interes en el locus ROSA26 de raton. Se pueden usar secuencias de intrones y exones como regiones homologas.

-: la figura 5 representa la secuencia de rosa1 diana y los derivados. 10GGG P, 5GAT P y 5TAT P son derivados que se encuentran cerca que se van a escindir mediante mutantes l-Crel obtenidos anteriormente. Difieren de C1221 (secuencia palindromica escindida por la proteina de armazon de l-Crel)

55 en los motivos secuenciados. Se describieron en primer lugar C1221, 10GGG P, 5GAT P and 5TAT P como secuencias de 24 pb, pero los datos estructurales sugieren que solo los 22 pb son relevantes para la interaccion de la proteina/ADN. Sin embargo, se indican las posiciones

12 entre parentesis. rosa 1 es la secuencia de ADN localizada en el locus ROSA26 de raton en la posicion 8304. En la diana rosa1.2, la secuencia GTTC en la parte media de la diana esta sustituida con GTAC, las bases se encuentran en C1221. rosa 1.3 es la secuencia palindromica derivada de la parte izquierda de rosa 1.2 y rosa 1.4 es la secuencia palindromica derivada de la parte derecha de rosa 1.2. tal como se muestra en la figura, los motivos secuenciados procedentes de 10GGG P, 5GAT P and 5TAT P se encuentran en la serie rosa1 de dianas.

5 - la figura 6 representa la cartografia del vector pCLS1055.

-: la figura 7 representa la cartografia del vector pCLS0542.

-: la figura 8 ilustra la escision del ADN diana rosa 1.3 por mutantes de l-Crel. Los 63 positivos encontrados en el cribado primario se volvieron a disponer en una placa de 96 pocillos y se validaron mediante un cribado secundario (en un formato cuadruplicado). Los 22 mutantes seleccionados en el ejemplo 2 estan

10 rodeados por un circulo.

-: la figura 9 ilustra la escision de la diana rosa1.4 por mutantes combinatorias de l-Crel. Los 69 positivos encontrado en el cribado primario se volvieron a disponer en una placa de 96 pocillos y se validaron mediante un cribado secundario (en un formato cuadruplicado). Los 15 mutantes seleccionados en el ejemplo 3 estan rodeados por un circulo.

15 - la figura 10 representa la cartografia del vector pCLS 1107

-: la figura 11 ilustra la escision de las dianas rosa1.2 y rosa1 por mutantes combinatorios de l-Crel heterodimericos. A. Ejemplo de cribado de combinaciones de mutantes de l-Crel con la diana rosa1.2. B. Cribado de las mismas combinaciones de mutantes de l-Crel con la diana rosa1. B5, B6, D5, D6, F5, F6, H5 y H6: cepas de levaduras que expresan rosa1.3 que cortan mutantes de l-Crel transformados con ADN

20 plasmido de PCLS1107 vacio.

-: la figura 12 ilustra la escision de la diana rosa1. Una serie de mutantes de l-Crel que cortaban rosa 1.4 se sometieron a mutagenesis aleatoria y se expresaron simultaneamente con un mutante que cortaba rosa

1.3. Se ensayo la escision con la diana rosa1. En cada cuatro grupos de manchas, las dos manchas en el lado derecho corresponden a uno de los heterodimeros originales que escinden rosa1 por duplicado

25 mientras que las dos manchas en el lado izquierdo corresponden al mismo escisor rosa1.4 mutado expresado simultaneamente con un escisor rosa1.3 no mutado (mutante m13, descrito en las Tablas lV y V). Los dos mutantes optimizados que muestran escision mejorada de rosa1 y estan rodeados por un circulo, y corresponden a la expresion simultanea de mutantes m13 y MO 1 (C10) o de m13 y MO 2 (E2). MO 1 y MO 2 se describen adicionalmente en la Tabla Vl.

30 - la figura 13 ilustra la escision de la diana rosa1. Una serie de mutantes de l-Crel que cortaban rosa1.3 se sometieron a mutagenesis aleatoria y se expresaron simultaneamente con un mutante refinado que cortaba rosa 1.4. Se ensayo la escision con la diana rosa1. Los mutantes que muestran una escision eficaz de rosa1 estan rodeados por un circulo. En el filtro:

-: B11 corresponde al heterodimero S 19, V24, Y44, R68, S70, N75, V77 + E28, R33, R38, K40, A44, H68, 35 070, A105, R107, A151, G153, E158;

-: C9 corresponde al heterodimero S19, V24, Y44, R68, S70, 075, 77 + E28, R33, R38, K40, A44, H68, 070, A105, R107, A151, G153, E158;

-: C11 y E8 corresponden al heterodimero V24, Y44, S68, S70, R75, 177, A105 + E28, R33, R38, K40, A44, H68, 070, A105, R107, A151, G153, E58; y

40 - E6 corresponde al heterodimero V24, Y44, S68, S70, R75, 177, G79 + E28, R33, R38, K40, A44, H68, 070, A105, R107, A151, G153, E158.

-: H10 es un control negativo, H11 y H12 son controles positivos de diferente intensidad. Para comparar la actividad de los heterodimeros frente a la diana rosa1 antes y despues de la mejora de los mutantes que cortan la diana rosa1.3: en cada grupo, los dos puntos a la derecha son uno de los

45 heterodimeros descritos en el ejemplo 5 y los dos puntos a la izquierda son heterodimeros con mutantes descritos en el ejemplo 6.

-: la figura 14 representa la cartografia del vector pCLS 1.058.

-: la figura 15 representa la cartografia del vector pCLS1069.

-: la figura 16 ilustra la escision de la diana rosa1 por los mutantes de l-Crel refinados. En un modelo

50 extracromosomico en celulas CHO. Se muestran valores que proceden de dos experimentos de transfeccion. La escision de las dianas l-Crel e l-Seel por l-Crel N75 e l-Seel en los mismos experimentos se muestran como controles positivos.

-: la figura 17 representa las secuencias de la meganucleasa diana que se encuentran en el ROSA26 de raton y la variante de l-Crel correspondiente que es capaz de escindir cada una de dichas dianas de ADN.

55 La secuencia del ADN diana se presenta (columna 1), con su posicion (columna 2). La matriz minima de reparacion para reparar la escision en el sitio diana se indica por su primer nucleotido (inicio, columna 5) y el ultimo nucleotido (final, columna 6). La secuencia de cada variante se define por los restos en las posiciones indicadas. Por ejemplo, la primera variante heterodimerica de la figura 17 consiste en un primer monomero que tiene K, H, S, S, 0, S, E, C, S, N e l en las posiciones 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 y 77, respectivamente y un segundo monomero que tiene K, D, S, R, T, S, K, E, S, D, R en las posiciones 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 y 77, respectivamente. Las posiciones se indican por referencia a la secuencia SWlSSPROT P05725 (SE0 lD NO: 1); de l-Crel; l-Crel tiene K, N, S, Y, 0, S, 0, R, R, D e l, en las posiciones 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 y 77 respectivamente.

5 - la figura 18 representa la cartografia del vector pCLS1675.

-: la figura 19 representa la cartografia del vector pCLS1761.

-: la figura 20 representa la cartografia del vector pCLS1762.

-: la figura 21 ilustra el analisis de la PCR de los eventos de activacion (Kl) con la matriz lRES-Hygro (pCLS1675). Eventos con la matriz lRES-Hygro (pCLS1675): los clones naturales para el locus ROSA26 y

10 los clones que tienen una insercion aleatoria de la higromicina CDS son negativos en la PCR. Los clones que tienen un evento Kl en el locus ROSA26 son positivos en la PCR. Los clones que tienen un evento Kl y la insercion aleatoria son tambien positivos en la PCR.

Ejemplo 1: Estrategia para genomanipular meganucleasas novedosas que escinden el locus R(SA26 de 15 raton

La solucion combinatoria descrita en Smith y col., Nucleic Acids Res., 2006 e ilustrada en la figura 3, se uso para genomanipular el dominio de union al ADN de l-Crel, y escindir una secuencia de 22 pb (no palindromica) denominada rosa1 (Figura 5) y localizada en la posicion 8304, en el exon 2 del locus ROSA26 de raton (numero de

20 acceso C0880114; SE0 lD NO: 3). Las meganucleasa que escinden la secuencia rosa1 podrian usarse para activar los genes en el locus ROSA26 de raton (Figura 4). Las aplicaciones son en los siguientes campos: produccion de proteinas recombinantes en celulas de raton, genomanipulacion de lineas de celulas recombinantes, por ejemplo, a objeto de cribado de farmacos, y genomanipulacion de ratones transgenicos, por ejemplo, para uso como modelos animales.

25 La secuencia de rosa1 es parcialmente un mosaico de las dianas 10GGG P, 5GAT P y 5TAT P (Figura 5) que se escinden por las meganucleasas anteriormente identificadas, obtenidas tal como se describe en las Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784, WO 2006/097853 y WO 2007/049156; Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458 y Smith y col., Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006. De esta manera, rosa1 podria escindirse

30 por meganucleasas que combinan las mutaciones que se encuentran en los derivados de l-Crel que escinden estas tres dianas.

Las secuencias 10GGG P, 5GAT P y 5TAT P son derivados de 24 pb de C1221, una secuencia palindromica escindida por l-Crel (Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784, WO 2006/097853 y WO 2007/049156; 35 Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458 y Smith y col., Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006). Sin embargo, la estructura de l-Crel unida a su ADN diana sugiere que dos pares de bases externas de estas dianas (posiciones -12 y 12) no tienen impacto sobre la union y la escision (Chevalier y col., Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312316; Chevalier B.S. y Stoddard B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3754; Chevalier y col., J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269), y en este estudio, solo se consideraron las posiciones -11 a 11. Consecuentemente, se definio la

40 serie rosa1 de dianas como secuencias de 22 pb en vez de 24 pb.

Rosa 1 difiere de C1221 en un par de bases de la region central de 4 pb. De acuerdo con la estructura de la proteina l-Crel unida a su diana, no existe contacto entre los 4 pares de bases centrales (posiciones -2 a 2) y la proteina l-Crel (Chevalier y col., Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312-316; Chevalier B.S. y Stoddard B.L., Nucleic Acids Res., 2001,

45 29, 3757-3754; Chevalier y col., J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269). De esta manera, las bases en estas posiciones no se supone que afectan la eficacia de union. Sin embargo, podrian afectar la escision, que es el resultado de dos muescas en el borde de esta region. De esta manera, la secuencia GTTC en -2 a 2 se sustituyo en primer lugar con la secuencia GTAC de C1221, dando como resultado una rosa1.2 diana (Figura 5).

50 A continuacion, dos dianas palindromicas, rosa1.3 y rosa1.4, se derivaron de rosa1.2 (Figura 5). Ya que rosa1.3 y rosa 1.4 son palindromicas, deben escindirse mediante proteinas homodimericas.

De esta manera, se disenaron en primer lugar las proteinas capaces de escindir las secuencias rosa1.3 y rosa1.4, como homodimeros (ejemplos 2 y 3), y a continuacion se expresaron simultaneamente para obtener los 55 heterodimeros que escindian rosa1 (ejemplo 4). Se podrian identificar los heterodimeros que escindian las dianas rosa1.2 y rosa1. Con el fin de mejorar la actividad de escision de la diana rosa1, los inventores han seleccionado una serie de mutantes escogidos que escindian rosa1.3 y rosa1.4 y a continuacion los refinaron; los mutantes seleccionados se sometieron a mutagenesis aleatoria para formar novedosos heterodimeros que se cribaron frente a la diana rosa1 (ejemplos 5 y 6). Finalmente, se podrian identificar los heterodimeros que escindian la diana rosa1,

que muestra una elevada actividad de escision en celulas de levaduras y CHO.

Ejemplo 2: Preparacion de las meganucleasas que escinden rosa1.3

5 Este ejemplo muestra que los mutantes l-Crel puede cortar la secuencia de ADN diana de rosa1.3 derivada de la parte izquierda de la diana rosa1 en una forma palindromica (figura 5).

Las secuencias diana descritas en este ejemplo son secuencias palindromicas de 22 pb. Por tanto, se describiran solo mediante los primeros 11 nucleotidos, seguidos por el sufijo P. Por ejemplo, rosa1.3 diana se senalara tambien 10 caacatgatgt P; SE0 lD NO: 35)).

La diana rosa1.3 es similar a 5GAT P en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 y 11, difiriendo las dos secuencias solo en las posiciones 6 y 8. Se teorizo que las posiciones 6 tendrian poco efecto sobre la actividad de union y escision. Se obtuvieron previamente mutantes capaces de escindir 5GAT P (caaaacgatgt P; SE0 lD NO:

15 32) mediante mutagenesis en l-Crel N75 en las posiciones 24, 44, 68, 70, 75 y 77, tal como se describe en Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458 y en las Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784 y WO 2006/097853. En este ejemplo, se comprobo si los mutantes que escindian la diana 5GAT P podrian escindir tambien la diana rosa1.3.

20 1) Material y procedimientos

El procedimiento para producir variantes de meganucleasas y los ensayos basados en la recombinacion inducida por la escision en celulas de mamifero o levaduras, que se usaron para cribar variantes con la especificidad alterada se describen en la Solicitud PCT lnternacional WO 2004/067736; Epinat y col., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952

25 2962; Chames y col., Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178, y Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458. Estos ensayos dieron como Resultado un gen indicador LacZ funcional que se controlo mediante procedimientos normalizados.

a) Construccion del vector diana

30 La diana se clono como sigue: el oligonucleotido que correspondia a la secuencia diana flanqueada por la secuencia de clonacion Gateway se ordeno a partir de PROLlGO: 5' 5' tggcatacaagtttcaacatgatgtacatcatgttgacaatcgtctgtca 3' (SE0 lD NO: 37). El ADN diana bicatenario, generado mediante la amplificacion de la PCR del oligonucleotido monocatenario, se clono usando el protocolo del sistema Gateway (lNVlTROGEN) en el vector indicador de levadura

35 (pCLS1055, Figura 6). El vector indicador de levadura se transformo en la cepa FYBL2-7B de S. eerevisiae (MAT a, ).

b) Mutantes de l-Crel

40 Se identificaron los mutantes de l-Crel que escindian 5GAT P en una biblioteca en la que se mutaron las posiciones 24, 44, 68, 70, 75 y 77 de l-Crel, tal como se ha descrito anteriormente en Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458 y Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784 y WO 2006/097853. Se clonaron en el vector de ADN (pCLS0542, Figura 7) y se expresaron en la cepa FYC2-6A de la levadura Saeeharoryees eerevisiae (

). 45 c) Correspondencia de los clones que expresan la meganucleasa y cribado en levaduras:

Se llevo a cabo el cribado tal como se ha descrito anteriormente (Amould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458). Se llevo a cabo la correspondencia usando una placa de colonias (0pixll, Genetix). Se plaquearon los mutantes en 50 filtros de nylon que cubrian las placas YPD, usando una densidad de placa baja (aproximadamente 4 puntos/cm2). Se llevo a cabo un segundo procedimiento de plaqueado sobre los mismos filtros para puntear una segunda capa que consistian en diferentes cepas de levadura que contenian indicadores de cada diana. Se colocaron las membranas en medio rico en agar YPD, y se incubaron a 30OC durante una noche, para permitir la correspondencia. A continuacion, se transfirieron los filtros a un medio sintetico, que carecia de leucina y triptofano, con galactosa 55 (2%) como fuente de carbono, y se incubaron durante cinco dias a 37OC, para seleccionar los diploides que transportaban la expresion y los vectores diana. Despues de 5 dia, se colocaron los filtros en medio solido de agarosa con 0,02% de X-gal en tampon fosfato de sodio 0,5 M, pH 7,0, SDS al 0,1%, dimetil formamida al 6%

se incubo a 37OC, para controlar la Se analizaron los resultados mediante barrido y se llevo a cabo la cuantificacion usando el software apropiado.

d) Secuenciacion de los mutantes

Para recuperar los plasmidos que expresan los mutantes, se extrajo el ADN de levadura usando protocolos normalizados y se uso para transformar E. coli. A continuacion se llevo a cabo la secuencia del ORF mutante en los

5 plasmidos mediante MlLLEGEN SA. Alternativamente se amplificaron los ORF del ADN de levadura mediante la PCR (Akada y col., Biotechniques, 2000, 28, 668-670), y se llevo a cabo la secuencia directamente en el producto de la PCR mediante MlLLEGEN SA.

2) Resultados

10 Los mutantes l-Crel que escindian la diana 5GAT P, previamente identificada en una biblioteca en la que se mutaron las posiciones 24, 44, 68, 70, 75 y 77 de l-Crel, se cribaron para la escision frente al ADN diana de rosa1.3 (caacatgatgt P; SE0 lD NO: 35). Se encontraron un total de 63 clones positivos, se volvieron a disponer en una placa de 96 pocillos y se validaron mediante cribado secundario (Figura 8). Entre aquellos clones positivos, se

15 seleccionaron 22 (rodeados por un circulo en la Figura 8). Aquellos 22 clones positivos se secuenciaron. Resultaron corresponder con 18 novedosas endonucleasas diferentes que escindian la diana rosa1.3 (denominada ml a m18: SE0 lD NO: 38 a 55; Tabla ll).

Tabla II: mutantes de I-CreI capaces de escindir el ADN diana de rosa1.3

Posicion en la figura 8: Nombre S ecuencia SEQ ID N(: Aminoacidos en las posiciones 24, 44, 68, 70, 75 y 77 (ex: VYRSYI significa V24, Y44, R68, S70, Y75 e I77)

A 1 y F: 3 m 1 3 8 V Y R S Y l

A 3 m 2: 3 9 V Y R S N l

A 5 y B: 1 m 3 4 0 V Y D S R R

A 9 m 4: 4 1 l T Y S Y R

A 1 1 m: 5 4 2 V Y R S Y 0

B 3 , D 5: y E 6 m 6 4 3 V Y Y S Y R

B 8 m 7: 4 4 V Y Y S R A

B 9 m 8: 4 5 V Y R S N V

B 1 0 m: 9 4 6 V N Y S Y R

B 1 1 m 1 0: 4 7 V N Y S Y R + 8 2 T *

C 3 m 1: 1 4 8 V Y S S R V

C 8 m 1: 2 4 9 V Y N S R l

C 1 1 m: 1 3 5 0 V Y S S R l

D 6 m 1: 4 5 1 V Y R S 0 l

D 9 m 1: 5 5 2 l Y R S N l

D 1 2 m: 1 6 5 3 V Y Y S R V

E 1 m 1: 7 5 4 V Y R S Y T

E 1 1 m: 1 8 5 5 V N S S R V

* 82T en m 10 es una mutacion inesperada que puede ser debida a un error introducido por la reaccion de la PCR antes de la secuenciacion del ADN de levadura

Ejemplo 3: Preparacion de meganucleasas que escinden rosa1.4

Este ejemplo muestra que los mutantes de l-Crel pueden cortar la secuencia del ADN diana de rosa1.4 derivada de la parte derecha de la diana de rosa1 en una forma palindromica (Figura 5) todas las secuencias dianas descritas en

25 este ejemplo son secuencias palindromicas de 22 pb. Por tanto se describiran solo por los primeros 11 nucleotidos, seguidos por el sufijo P. por ejemplo, rosa1.4 se denominara tgggattatgt P (SE0 lD NO: 36).

La diana rosa1.4 es similar a las posiciones 1, 2,

3, 4, 5 y 7 de 5TAT Pat y a 10GGG P en las posiciones 1,

2,

7, 8, 9 y 10. Se teorizo que las posiciones 6 y 11 tendrian poco efecto sobre la actividad de union y

30 escision. Se obtuvieron previamente mutantes capaces de escindir 5TAT P mediante mutagenesis en l-Crel N75 en las posiciones 44, 68, 70, tal como se describe en Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458 y en las Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784 y WO 2006/097853. Se obtuvieron mutantes capaces de escindir la diana 10GGG P mediante mutagenesis en l-Crel N75 en las posiciones 28, 30, 33, 38, 40 y 70, tal como se describe en Smith y col., Nucleic Acids Res., Epub 27 de noviembre de 2006 y la Solicitud PCT lnternacional WO

35 2007/049156.

Ambos conjuntos de proteinas se mutaron en la posicion 70. Sin embargo, se teorizo que existian dos subdominios funcionales separables. Esto implica que esta posicion tiene un pequeno impacto sobre la especificidad hacia las bases

8 a 10 de la diana

5 Por lo tanto, para comprobar si mutantes combinados podrian escindir la diana rosa1.4, se combinaron mutaciones en las posiciones 44, 68 y 70 de las proteinas que escindian 5TAT P (caaaactatgt P; SE0 lD NO: 33) con mutaciones en las posiciones 28, 30, 33, 38 y 40 de las proteinas que escindian 10GGG P (cgggacgtcgt P; SE0 lD NO: 31).

10 1) Material y procedimientos

Los procedimientos experimentales son como se describe en el ejemplo 2 y como sigue:

Construeei6n de rutantes eorbinatorios

15 Se identificaron mutantes de l-Crel que escindian 10GGG P o 5TAT P en Smith y col, Nucleic Acids Res. Epub 27 de noviembre de 2006; Solicitud PCT lnternacional WO 2007/049156, y Arnould y col., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443458; Solicitudes PCT lnternacionales WO 2006/097784 y WO 2006/097853, respectivamente para las dianas 10GGG P o 5TAT P. con el fin de generar la secuencia de codificacion derivada de l-Crel que contiene mutaciones

20 de ambas series, se llevaron a cabo reacciones de la PCR mediante solapamiento separado que amplifican el extremo 5' (posiciones de aa 1-43) o el extremo 3' (posiciones 39-167) de la secuencia de codificacion de l-Crel. Para ambos extremos, 5' y 3', se llevo a cabo la reaccion de amplificacion usando los cebadores Gal10F 5'gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (SE0 lD NO: 56) o Ga110R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(SE0 lD NO: 57), especificos del vector (pCLS0542, Figura 7) y los cebadores assF 5'-ctannnttgaccttt-3' (SE0 lD NO: 58) o assR 5'

25 aaaggtcaannntag-3' (SE0 lD NO: 59) en el que el codigo nnn es para el resto 40, especifico de la secuencia de codificacion de l-Crel para los aminoacido 39-43. Se combinaron los fragmentos de la PCR resultantes de la reaccion de amplificacion realizada con los mismos cebadores y con la misma secuencia de codificacion para el resto 40. A continuacion, cada combinado de fragmentos de la PCR resultante de la reaccion con los cebadores Gal10F y assR o assF y Gal10R se mezclo en una relacion equimolar. Finalmente, aproximadamente 25 ng de cada

30 combinado final de los dos fragmentos de la PCR solapantes y 75 ng de ADN de vector (pCLS0542) se linealizaron mediante digestion con Neol y se uso Eagl para transformar la cepa FYC2-6A de la levadura Saeeharoryees eerevisiae protocolo de transformacion LiAc de alta eficacia (Gietz y Woods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87-96). Se genero una secuencia de codificacion intacta que contenia ambos grupos de mutaciones mediante recombinacion homologa in vivo en levadura.

2) Resultados

Se construyeron mutantes combinatorios de l-Crel asociando mutaciones en las posiciones 44, 68 y 70 con las mutaciones en 28, 30, 33, 38 y 40 en el armazon de l-Crel N75, dando como resultado una biblioteca de complejidad 40 2208. En la Tabla 3 se muestran ejemplos de mutantes combinatorios. Esta biblioteca se transformo en levadura y se cribaron 3456 clones (1,5 veces la diversidad) para la escision frente al ADN diana de rosa1.4 (tgggattatgt P; SE0 lD NO: 36). Se encontraron un total de 69 clones positivos y se volvieron a disponer en una placa de 96 pocillos y se validaron mediante cribado secundario (Figura 9). Entre aquellos positivos, se seleccionaron 15 clones (rodeados por un circulo en la Figura 9). Tras la secuenciacion, estos 15 clones resultaron corresponder a 8

45 diferentes endonucleasas novedosas que escindian el ADN diana de rosa1.4 (SE0 lD NO: 60 a 67, Tabla lll).

Tabla III: Escision de la diana rosa1.4 por las variantes combinatorias

Aminoacidos en las posiciones 28, 30, 33,38 y 40 (ex: ENRRR significa para E28, N30, R33, R38 y R40)

ENRRR: ENRRK KNHAS KNHSS KNH0S KNRAT RNRDR

: A H 0 + +

A: R N +

A: R S +

V: R A +

A: R G +

A: S 0 +

A: T N +

R: A G

A: N N

A: 0 H

A: R H

A: R L

A: R T

N: R
N

Solo se muestran 105 de las 2208 combinaciones

+ indica que se encontro un mutante combinatorio funcional entre los positivos secuenciados

Ejemplo 4: Preparacion de meganucleasas que escinden rosa1

5 Se identificaron los mutantes de l-Crel capaces de escindir cada una de las dianas palindromicas derivadas de rosa1 (rosa1.3 y rosa1.4) en los ejemplos 2 y 3. Parejas de dichos mutantes (una que cortaba rosa1.3 y una que cortaba rosa1.4) se expresaron simultaneamente en levaduras. Tras la expresion simultanea, deben existir tres especies moleculares activas, dos homodimeros, y un heterodimero. Se ensayo si los heterodimeros que debian formarse

10 cortaban los ADN dianas no palindromicos de rosa1 y rosal.2

1) Material y procedimientos

a) Clonacion de mutantes en un vector resistente a la kanamicina

15 Para expresar simultaneamente dos mutantes de l-Crel en levaduras, se subclonaron los mutantes que cortaban la secuencia de rosa1.4 en un vector de expresion en levadura marcado con un gen de resistencia a la kanamicina (pCLS1107, Figura 10). Se amplificaron los mutantes mediante la reaccion de la PCR usando cebadores comunes para pCLS0542 y pCLS1107: Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (SE0 lD NO: 56) y Gal10R 5'

20 acaaccttgattggagacttgacc-3' (SE0 lD NO: 57). Aproximadamente 25 ng de un fragmento de la PCR y 25 ng de un ADN de vector (pCLS1107) linealizados mediante digestion con OraIII y NgoMI� se usaron para transformar la cepa FYC2-6A de la levadura Saeeharoryees eerevisiae ( ) usando un protocolo de transformacion LiAc de alta eficacia. Se genero una secuencia de codificacion intacta para el mutante de l-Crel mediante recombinacion homologa in vivo en levadura. Cada cepa de levadura que contenia un mutante que

25 cortaba la diana rosa1.4 se subclono en el vector pCLS1107 que se correspondio con la levadura que expresaba la diana rosa1.4 para validar esta. Para recuperar el mutante que expresaba los plasmidos, se extrajo el AD de levadura usando protocolos normalizados y se uso para transformar E. eoli y preparar el ADN de E. eoli.

b) Expresion simultanea de mutantes

30 La cepa de levadura que expresaba un mutante que cortaba la diana rosa1.3 en el vector de expresion pCLS0542 se transformo con ADN que codificaba un mutante que cortaba la diana rosa1.4 en el vector de expresion pCLS 1107. Se seleccionaron los transformantes en medio �L Glu + G418.

35 c) Correspondencia de meganucleasas que expresan simultaneamente clones y cribado en levaduras

Se llevo a cabo la correspondencia usando una placa de colonias (0pixll, Genetix). Se plaquearon los mutantes en filtros de nylon que cubrian placas de YPD, usando una densidad de plaqueo baja (aproximadamente 4 puntos/cm2).

Se llevo a cabo un segundo procedimiento de plaqueo sobre los mismos filtros para puntear una segunda capa que consistia en diferentes cepas de levaduras que contenian el indicador para cada diana. Se colocaron las membranas sobre medio rico en agar solido YPD, y se incubaron a 30OC durante una noche, para permitir la correspondencia. A continuacion, se transfirieron los filtros a medio sintetico, que carecia de leucina y triptofano, anadiendo G418, con 5 galactosa (1%) como fuente de carbono, y se incubaron durante cinco dias a 37OC, para seleccionar los diploides que transportaban la expresion y los vectores diana. Despues de 5 dias, se colocaron los filtros sobre medio solido de agarosa con 0,02% de X-Gal en tampon fosfato de sodio 0,5 M, pH 7,0, SDS al 0,1%, dimetil formamida al 6%

galactosidasa. Se analizaron los resultados mediante cribado y se llevo a cabo la cuantificacion usando el software 10 apropiado.

Resultados

La expresion simultanea de los mutantes que escindian la diana rosa1.3 (ml a m18 descrita en la Tabla ll) y de los

15 ocho mutantes que escindian la diana rosa 1.4 (descrita en la Tabla lll) dio como resultado una expresion eficaz de la diana rosa1.2 en todos los casos (se muestran los ejemplos de criba en la Figura 11A). En la Tabla lV se resumen todas las combinaciones. La mayor parte de esta combinaciones son tambien capaces de cortar la diana rosa1 natural que difiere de la de la secuencia rosa1.2 exactamente en 1 pb en la posicion +1 (Figura 5). Tal como se muestra en la Figura 11b, la senal observada en la diana rosa1 natural es debil en comparacion con la observada en

20 la diana rosa1.2. En la Tabla V se presentan las combinaciones que escinden el ADN diana de rosa1.

Tabla IV: Combinaciones que dan como resultado una escision de la diana rosa 1.2

Mutantes que cortan los aminoacidos de rosa1.4 en las posiciones 28, 30, 33, 38, 40 / 44, 68 y 70 (ex: ENRRR / AH0 significa para E28, N30, R33, R38, R40 / A44, H68 y 070)

ENRRR / AH0: ENRRR / ARN ENRRR / AS0 ENRRK / AH0 ENRRK / ARS ENRRK / VRA ENRRK / ARG ENRRK / ATN

: m 1 V Y R S Y l + + + + + + + +

m 2: V Y R S N l + + + + + + + +

m 3: V Y D S R R + + + + + + + +

m 4: i T Y S Y R + + + + + + + +

m 5: V Y R S Y 0 + + + + + + + +

m 6: V Y Y S Y R + + + + + + + +

m 7: V Y Y S R A + + + + + + + +

m 8: V Y R S N V + + + + + + + +

m 9: V N Y S Y R + + + + + + + +

m10: VNYSYR + 82T + + + + + + + +

m 1: 1 V Y S R VS + + + + + + + +

m 1: 2 V Y N S R l + + + + + + + +

m 1: 3 V Y S S R l + + + + + + + +

m 1: 4 V Y R S 0 l + + + + + + + +

m 1: 5 l Y R S N l + + + + + + + +

m 1: 6 V Y Y R VS + + + + + + + +

m 1: 7 V Y R S Y T + + + + + + + +

m 1: 8 V N S S R V + + + + + + + +

+ indica que el mutante heterodimerico escinde la diana rosa1.2

Tabla V: Combinaciones que dan como resultado la escision de la diana rosa1

: m 1 V Y R S Y l

m: 2 V Y R S N l + + + + +

m: 3 V Y D S R R

m: 4 i T Y S Y R

m: 5 V Y R S Y 0

m: 6 V Y Y S Y R + + + + +

m: 7 V Y Y S R A

m: 8 V Y R S N V + + + + +

m: 9 V N Y S Y R

m10: VNYSYR + 82T

m 1: 1 V Y S S R V + + + + + + +

m 1: 2 V Y N S R l + + + + + + +

m 1: 3 V Y S S R l + + + + + + +

m 1: 4 V Y R S 0 l + + + + + + +

m: 1 5 l Y R S N l

m 1: 6 V Y Y S R V + + + + + + +

m 1: 7 V Y R S Y T + + + + + + + +

m: 1 8 V N S S R V

+ indica que el mutante heterodimerico escinde la diana rosa1.2

5 Ejemplo 5: Refinamiento de las meganucleasas que escinden rosa1 mediante mutagenesis aleatoria de las proteinas que escinden rosa1.4 y un ensamblaje con las proteinas que escinden rosa1.3

Se identificaron mutantes de l-Crel capaces de escindir las dianas rosa1.2 y rosa1 no palindromicas mediante el ensamblaje de mutantes que escindian las dianas rosa1.3 y rosa1.4 palindromicas Sin embargo, las combinaciones

10 fueron capaces de escindir eficazmente rosa1.2 pero de escindir debilmente rosa1, que difiere de rosa1.2 solo en 1 pb en la posicion 1. La senal observada en rosa1 no es suficiente.

Por tanto, se sometieron a mutagenesis las combinaciones de proteinas que escindian rosa1, y se cribaron los mutantes que escindian eficazmente rosa1. De acuerdo con la estructura de la proteina l-Crel unida a su diana, no 15 existe contacto entre los 4 pares de bases centrales (posiciones -2 a 2) y la proteina l-Crel (Chevalier y col., Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312-316; Chevalier B.S. y Stoddard B.L., Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3754; Chevalier y col., J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269). De esta manera, es dificil seleccionar racionalmente un conjunto de posiciones para someter a mutagenesis, y se llevo a cabo la mutagenesis en la parte C terminal de la proteina (83 ultimos aminoacidos) o en la proteina completa. La mutagenesis aleatoria da como resultado bibliotecas de elevada

20 complejidad, y la complejidad de las bibliotecas variante que se van a ensayar se limitaron sometiendo a mutagenesis solo uno de los dos componentes de los heterodimeros que escindian rosa1.

De esta manera, se sometieron a mutagenesis las proteinas que escindian rosa1.4, y se ensayo si estas podrian escindir eficazmente rosa1 cuando se expresaban simultaneamente con proteinas que escindian rosa1.3.

25 1) Material y procedimientos

a) Mutagenesis aleatoria:

30 Se crearon bibliotecas por mutagenesis aleatoria sobre combinados de mutantes seleccionados, mediante la PCR usando Mn2+ o derivados de dNTP como 8-oxo-dGTP y dPTP en un procedimiento de PCR en dos etapas tal como se describe en el protocolo de JENA BlOSClENCE GmbH en el kit de mutagenesis de dNTP de JBS. Para la mutagenesis aleatoria sobre la proteina completa, se usaron los cebadores: preATGCreFor (5'gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3'; SE0 lD NO: 68) e lCrelpostRev (5'ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc -3'; SE0 lD NO: 69). Para la mutagenesis aleatoria sobre la parte C terminal de la proteina, se usaron los cebadores: AA78a83For (5'-ttaagcgaaatcaagccg-3'; SE0 lD NO: 70) e lCrelpostRev con derivados de dNTP; el resto de la proteina se amplifico con una polimerasa taq de alta fidelidad y sin derivados de dNTP usando los cebadores preATGCreFor y AA78a83Rev (5'-cggcttgatttcgcttaa-3'; SE0 lD NO:

5 71).

Se amplificaron combinados de mutantes mediante la reaccion de la PCR usando estos cebadores comunes para pCLS0542 (Figura 7) y pCLS1107 (Figura 10). Aproximadamente 75 ng de un fragmento de la PCR y 75 ng de ADN de vector (pCLS1107) linealizados mediante digestion con OraIII y NgoMI� se usaron para transformar la cepa

10 FYC2-6A de Saeeharoryees eerevisiae 0) usando un protocolo de transformacion LiAc de alta eficacia. Se genero una biblioteca de secuencias de codificacion intactas para el mutante l-Crel mediante recombinacion homologa in vivo en levadura. Se verificaron los clones positivos resultantes mediante secuenciacion tal como se ha descrito en el ejemplo 2.

15 b) Clonacion de mutantes en vector de expresion de leucina en la cepa de levadura que contiene la diana rosa1:

La cepa FYBL2-7B de levadura (MAT a, ur que contenia la diana rosa1 en el vector indicador de levadura (pCLS1055, Figura 6) se transformo con mutantes que cortaban la diana rosa1.3, en el vector pCLS0542, marcado con el gen �E��, usando un protocolo de transformacion LiAc de alta eficacia. Las

20 cepas de levadura resultantes se usaron como dianas para los ensayos de correspondencia tal como se describe en el ejemplo 4.

2) Resultados

25 Cuatro mutantes que escindian rosa1.4 (ERRR / AH0, ERRR / ARN, ERRK / AH0 and ERRK / VRA de acuerdo con la Tabla V) se combinaron, se sometieron a mutagenesis aleatoria sobre todas las proteinas o sobre la parte C terminal de las proteinas y se transformaros en levaduras. A continuacion se hicieron corresponder 4464 clones transformados con una cepa de levadura que (i) contiene la diana rosa1 en un plasmido indicador (ii) expresa una variante que escinde la diana rosa1.3, seleccionada entre las descritas en el ejemplo 2. Se usaron tres de dichas

30 cepas, que expresaban el mutante V24 Y44 S68 S70 R75 177 de l-Crel (o VYSSRl), el mutante V24 Y44 R68 S70 075 177 de l-Crel (o VYRS0l) o el mutante V24 Y44 R68 S70 Y75 T77 de l-Crel (o VYRSYT) (vease la Tabla ll). Se encontro que dos clones estimulaban una mejor escision de la diana rosa1 cuando se hacian corresponder con dicha cepa de levadura en comparacion con los mutantes antes de la mutagenesis con la misma cepa de levadura. En conclusion, se identificaron dos proteinas capaces de escindir eficazmente rosa1 cuando formaban

35 heterodimeros con VYSSRl, VYRS0l o VYRSYT (Tabla Vl) (Figura 12).

Tabla VI: Combinaciones de mutantes funcionales que muestran una fuerte actividad de escision para el ADN diana de rosa1

Mutante de rosa1.4 optimizado* (SE0 lD NO: 72, 73)

: VYSSRl (m13) MO 1: E28 R33 R38 R40 A44 H68 070 N75 A105 R107 MO 2: E28 R33 R38 K40 A44 H68 070 N75 A105 R107 A151 �153 E158

VYRS0l (m14): MO 1: E28 R33 R38 R40 A44 H68 070 N75 A105 R107 MO 2: E28 R33 R38 K40 A44 H68 070 N75 A105 R107 A151 �153 E158

VYRSYT (m17): MO 1: E28 R33 R38 R40 A44 H68 070 N75 A105 R107 MO 2: E28 R33 R38 K40 A44 H68 070 N75 A105 R107 A151 �153 E158

* Las mutaciones resultantes de la mutagenesis aleatoria estan en negrita 40

Ejemplo 6: Refinamiento de las meganucleasas que escinden rosa1 mediante mutag�nesis aleatoria de las prote�nas que escinden rosa1.3 y ensamblaje con las prote�nas refinadas que escinden rosa1.4

Se identificaron los mutantes de l-Crel capaces de escindir la diana rosa1 mediante ensamblaje de los mutantes que

45 escindia rosa1.3 y de los mutantes refinados que escindian rosa1.4. Para aumentar la actividad de las meganucleasas, se sometio a mutagenesis el segundo componente de los heterodimeros que escindian rosa1. En este ejemplo, los mutantes que escindian rosa1.3 se sometieron a mutagenesis, seguido por el cribado de las variantes mas eficaces que escindian rosa1 en combinacion con los mutantes refinados que escindian rosa1.4 identificados en el ejemplo 5.

5 1) Material y procedimientos

a) Mutagenesis aleatoria:

Se crearon bibliotecas por mutagenesis aleatoria sobre combinados de mutantes seleccionados, mediante la PCR

10 usando Mn2+ o derivados de dNTP como 8-oxo-dGTP y dPTP en un procedimiento de PCR en dos etapas tal como se describe en el protocolo de JENA BlOSClENCE GmbH en el kit de mutagenesis de dNTP de JBS. Para la mutagenesis aleatoria sobre la proteina completa, se usaron los cebadores: preATGCreFor (5'gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3'; SE0 lD NO: 68) e lCrelpostRev (5'ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc -3'; SE0 lD NO: 69). Para la mutagenesis aleatoria sobre la

15 parte C terminal de la proteina, se usaron los cebadores: AA78a83For (5'-ttaagcgaaatcaagccg-3'; SE0 lD NO: 70) e lCrelpostRev con derivados de dNTP; el resto de la proteina se amplifico con una polimerasa taq de alta fidelidad y sin derivados de dNTP usando los cebadores preATGCreFor y AA78a83Rev (5'-cggcttgatttcgcttaa-3'; SE0 lD NO: 71).

20 Se amplificaron combinados de mutantes mediante la reaccion de la PCR usando estos cebadores comunes para pCLS0542 (Figura 7) y pCLS1107 (Figura 10). Aproximadamente 75 ng de un fragmento de la PCR y 75 ng de ADN de vector (pCLS0542) linealizados mediante digestion con NeoI y EagI se usaron para transformar la cepa FYC2-6A de Saeeharoryees eerevisiae

) usando un protocolo de transformacion LiAc de alta eficacia. Se genero una biblioteca de secuencias de codificacion intactas para el mutante l-Crel mediante 25 recombinacion homologa in vivo en levadura. Se verificaron los clones positivos resultantes mediante secuenciacion

tal como se ha descrito en el ejemplo 2.

b) Clonacion de mutantes en vector de expresion de kanamicina en la cepa de levadura que contiene la diana rosa1

30 La cepa de levadura FYBL2-7B (MAT a, que contiene la diana rosa1 en el vector indicador de levadura (pCLS1055, Figura 6) se transformo con los mutantes refinados MO 1 y MO 2, que cortaban la diana rosa1.4, en el vector pCLS1107, usando un protocolo de transformacion LiAc de alta eficacia. Se usaron levaduras dirigidas por mutantes como dianas para los ensayos de correspondencia tal como se describe en el ejemplo 4.

2) Resultados

Dos combinados de cuatro mutantes que escindian rosa1.3 (combinado 1: VYRSNl, VYYSYR, VYRSNV y VYNSRl y combinado 2: VYYSYR, VYSSRl, VYRS0l y VYRSYT de acuerdo con la Tabla V) se sometieron a mutagenesis 40 aleatoria sobre todas las proteinas en la parte C terminal de las proteinas y se transformaron en levaduras. A continuacion se hicieron corresponder 8928 clones transformados con una cepa de levadura que (i) contiene la diana rosa1 en un plasmido indicador (ii) expresa una variante que escinde la diana rosa1.4. Dos de dichas cepas se usaron para expresar tanto el mutante E28 R33 R38 R40 A44 H68 070 N75 A105 R107 de l-Crel (o MO 1), como el mutante E28 R33 R38 K40 A44 H68 070 N75 A105 R107 A151 G153 E158 de l-Crel (o MO 2). Se encontro que

45 cinco clones estimulaban una mejor escision de la diana rosa1 cuando se hacian corresponder con dicha cepa de levadura en comparacion con los mutantes antes de la mutagenesis con la misma cepa de levadura (Figura 13). Tras la secuenciacion, resultan corresponder con cuatro proteinas. En conclusion, se identificaron cuatro proteinas capaces de escindir eficazmente rosa1 cuando forman heterodimeros con MO 1 o MO 2, (Tabla Vll)

Tabla VII: Combinaciones de mutantes funcionales que muestran una fuerte actividad de escision para el ADN diana de rosa 1.

Mutante rosa1.3 optimizado (SE0 lD NO: 74 a 77)

: MO 1 E28 R33 R38 R40 A44 H68 070 N75 A105 R107 mO 1: S19 V24 Y44 R68 S70 N75 V77 mO 2: S19 V24 Y44 R68 S70 075 l77 mO 3. V24 Y44 S68 S70 R75 l77 A105 mO 4: V24 Y44 S68 S70 R75 l77 G79

MO 2 E28 R33 R38 K40 A44 H68 070 N75 A105 R107 A151 G153 E158: mO 1: S19 V24 Y44 R68 S70 N75 V77 mO 2: S19 V24 Y44 R68 S70 075 l77 mO 3. V24 Y44 S68 S70 R75 l77 A105 mO 4: V24 Y44 S68 S70 R75 l77 G79

* las mutaciones resultantes de la mutagenesis aleatoria estan en negrita 5

Ejemplo 7: Validacion de la escision de la diana rosa1 en el modelo extracromosomico en c�lulas C�(

En el ejemplo 6, se identificaron los mutantes refinados de l-Crel capaces de escindir eficazmente la diana rosa1 en levaduras. En este ejemplo, la capacidad de dos combinaciones de mutantes de cortar la diana rosa1 en celulas 10 CHO se ensayo usando un ensayo extracromosomico en celulas de mamiferos.

1) Materiales y procedimientos

a) Clonacion de la diana rosa1 en un vector para la criba de CHO

15 La diana se clono como sigue: el oligonucleotido que correspondia a la secuencia diana flanqueada por la secuencia de clonacion Gateway se ordeno a partir de Proligo: 5' tggcatacaagtttcaacatgatgtacatcatgttgacaatcgtctgtca 3' (SE0 lD NO: 37). El ADN diana bicatenario, generado mediante la amplificacion de la PCR del oligonucleotido monocatenario, se clono usando el protocolo del sistema Gateway (lNVlTROGEN) en el vector indicador de CHO

20 (pCLS1058, Figura 14).

b) Reclonacion de las meganucleasas

Se amplificaron los ORF de los mutantes l-Crel N75, l-Scel y l-Crel identificado en el ejemplo 6 mediante la PCR y

25 se secuenciaron (MlLLEGEN). A continuacion, se volvieron a clonar los ORF usando el protocolo del sistema Gateway (lNVlTROGEN). Se amplificaron los ORF mediante la PCR del ADN de levadura usando los cebadores B1F: 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc 3' (SE0 lD NO: 78) and B2R: 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc 3' (SE0 lD NO: 79) de Proligo. Los productos de la PCR se clonaron en el vector de expresion pcDNA6.2 gateway de CHO de lnvitrogen (pCLS1069,

30 Figura 15). Se verificaron los clones resultantes mediante la secuenciacion tal como se describe en el ejemplo 2.

c) Ensayo extracromosomico en celulas de mamiferos

Se transfectaron celulas CHO con reactivo de transfeccion Polyfect de acuerdo con el protocolo del suministrados 35 (0lAGEN). 72 horas despues de la transfeccion, se retiro el medio de cultivo y se anadieron 150 �l de tampon de

tampon de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X100 al 0,1 %, 0,1 mg/ml de BSA, inhibidores de la proteasa), 10 ml de tampon Mg 100X (MgCl2 mg/ml de ONPG y 780 ml de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,5) Tras la incubacion a 37OC, se midio la densidad optica a

40 420 nm. El proceso completo se llevo a cabo en una plataforma BioCel� automatizada (VELOClTY11).

2) Resultados

Los resultados de los dos experimentos presentados en la figura 16, muestran que las dos combinaciones de 45 mutantes de l-Crel (mO 2 / MO 1 y mO 2 / MO 2) son capaces de cortar la diana rosa1 en celulas CHO con una actividad similar a la actividad de l-Crel N75 frente al l-Crel diana (tcaaaacgtcgtgagacagtttgg, SE0 lD NO: 80) o el l

Seel frente al l-Seel diana (tagggataacagggtaat, SE0 lD NO: 81).

Ejemplo 8: �enomanipulacion del genoma en el locus R(SA26 en c�lulas de raton

5 Se han identificado mutantes refinados de l-Crel capaces de escindir eficazmente la diana rosa1 en levadura y en un ensayo extracromosomico en celulas de mamiferos (celulas CHO K1) en los ejemplo 6 y 7. Se ensayo en este ejemplo la capacidad de una combinacion de dos mutantes refinados de l-Crel para inducir la recombinacion homologa en el locus ROSA26 en celulas L de raton.

10 1) Materiales y procedimientos

a) Matrices activadas (Kl)

Se construyeron dos matrices activadas que comprendian la secuencia d codificacion del gen de resistencia a la

15 higromicina (CDS) clonadas entre dos brazos de homologia de ROSA26 de raton, HG ROSA26 de 6283 a 8317 y HD ROSA26 de 8313 a 10319 en la secuencia C0880114 (que corresponde a la SE0 lD NO: 3 en el listado de secuencias) Los plasmidos resultantes son pCLS1679 y pCLS1675 (cartografia del plasmido en la figura 18). En pCLS1679, la secuencia de codificacion del gen de resistencia a la higromicina (hygro CDS) operativamente enlazada con SV40 polyA se clono en el vector pBR322 (PROMEGA) entre HG ROSA26 y HD ROSA26. pCLS 1675

20 difiere de pCLS1679 por la insercion de un sitio lnterno de Entrada al Ribosoma (lRES; SE0 lD NO: 139) exactamente en la direccion 5' del hygro CDS.

b) Clonacion de meganucleasas

25 Los ORF de los mutantes refinados de l-Crel mO 2 y MO 1 se describen en el ejemplo 6 (Tabla Vll). Se llevo a cabo la expresion de los mutantes en dos vectores de expresion con el control del promotor del factor 1 alfa de

Se clonaron los mutantes en pCLS1069 con el control del promotor CMV tal como se describe en el ejemplo 7. Se verificaron los plasmidos resultantes mediante secuenciacion (MlLLEGEN). En pCLS1761 (figura 19) y pCLS1762

30 (figura 20), los mutantes mO 2 y MO 1 de l-Cre

c) Experimento de activacion en celulas L de raton

Se cultivaron celulas L de raton (ATCC nO CRL-2648) en medio DMEM completo (DMEM Glutamax, GlBCO)

35 suplementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina, estreptomicina y fungizona. Se transfectaron las celulas usando reactivo de lipofectamina (lNVlTROGEN) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. Dos dias despues de la transfeccion, se llevo a cabo la seleccion usando higromicina a 0,6 mg/ml en medio completo. Tras dos semanas de seleccion, se repicaron los clones resistentes usando un robot ClonePix (GENETlX). Se amplificaron los clones una semana en placas de 96 pocillo en medio completo suplementado con higromicina a

40 0,6 mg/ml. Se extrajo el ADN genomico de los clones resistentes cultivados en placas de 96 pocillo usando el kit ZR96 (ZYMO RESEARCH).

c) Analisis mediante la PCR de eventos activados

45 Se detectaron eventos activados mediante el analisis de la PCR en ADN genomico usando el par de cebadores Kl GHG S5 (5' tagtatacagaaactgttgcatcgc 3'; SE0 lD NO: 137) y HygSeqRev (5'cgtctgctgctccatacaag 3'; SE0 lD NO: 138), localizados respectivamente en la secuencia de ROSA26 de raton en la direccion 5' del brazo de homologia HG ROSA26 y en la higromicina CDS, para obtener una amplificacion mediante la PCR especifica de Kl (Figura 21).

2) Resultados

Las meganucleasas de ROSA26 usadas en este ejemplo son mO 2 y MO 1 descritas en el ejemplo 6 (Tabla Vll) y se clonaron en dos vectores de expresion, bajo el control del promotor del factor 1 alfa de alargamiento humano

55 o inmediato del citomegalovirus (CMV) (pCLS1069, figura 15). Se transfectaron simultaneamente las celulas L de raton con tres vectores: dos plasmidos que expresaban las meganucleasas mO 2 and MO 1 de ROSA26 y la matriz Kl. Se clonaron las meganucleasas en pCLS1761 and y la matriz Kl fue pCLS1675.

Se transfectaron simultaneamente un total de 2600000 celulas L de raton con 2 �g del vector de matriz Kl y 5 �g o 10 �g de cada vector de expresion de la meganucleasa. Como control de la frecuencia Kl espontanea, se transfecto el mismo numero de celulas con 2 �g del vector de matriz Kl solo se determino la eficacia de la transfeccion (40%) mediante el analisis FACS usando un marcador fluorescente que expresaba el plasmido. Se determino la frecuencia

5 de los clones resistentes contando el numero total de clones resistentes a higromicina y se corrigio mediante la eficacia de la transfeccion. Se obtuvieron 2605, 1197 y 1902 clones resistentes a la higromicina, respectivamente (Tabla Vlll). Se repicaron 92 0 184 clones por condicion y se analizaron mediante la PCR tal como se describe en materiales y procedimientos. En la Tabla Vlll se presentan los resultados.

10 Tabla VIII: Resultado de la PCR y frecuencia de los eventos Kl en el locus ROSA26 en celulas L de raton

Vectores transfectados: Numero total de clones HygroR Frecuencia corregida de HygroR Numero de clones positivos / HygroR repicados mediante la PCR Frecuencia de eventos Kl

2 �g de pCLS1675 5 �g de pCLS1761 5 �g de pCLS1762: 2605 2 ,5 x 10-3 18/92 4,9 x 10-4

2 �g de pCLS1675 10 �g de pCLS1761 10 �g de pCLS1762: 1197 1.1 x 10-3 28/92 3.5 x 10-4

2 �g de pCLS1675: 1902 1,8 x 10-3 0 / 1 8 4 0

Transfeccion simultanea de meganucleasas de ROSA26 y la recombinacion homologa inducida por la matriz Kl en el locus ROSA26 de raton en celulas L a una frecuencia maxima de 4,9 x 10-4. No se observo recombinacion homologa espontanea con la transfeccion de la matriz Kl solo. Este ejemplo ilustra la capacidad de las meganucleasas de

15 ROSA26 de inducir la recombinacion homologa en el locus ROSA26 de raton en celulas L de raton.

Ejemplo �: Meganucleasas derivadas de m(�2 y M(�1

Se genomanipularon construcciones de meganucleasas a partir de mO 2 (SE0 lD NO: 75) y MO 1 (SE0 lD NO: 72)

20 usando tecnicas convencionales de biologia molecular y ADN recombinante, que se explican completamente en Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son lnc, Biblioteca del Congreso, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, (Sambrook y col, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

25 Se inserto una NLS (KKKRK; SE0 lD NO: 134) entre el primer (M1) y el segundo aminoacidos de MO 1 y mO 2; las variantes resultantes son SE0 lD NO: 140 y 141, respectivamente.

Se inserto una etiqueta (TagHA; YPYDVPDYA; SE0 lD NO: 135) entre el primer (M1) y el tercer aminoacido (N3) de mO 2; la variante resultante es SE0 lD NO: 142.

30 Se insertaron una etiqueta (STag; KETAAAKFER0HMDS; SE0 lD NO: 136) entre el primer (M1) y el segundo (A2) aminoacidos de MO 1; la variante resultante es SE0 lD NO: 143

Se insertaron una etiqueta (TagHA; YPYDVPDYA; SE0 lD NO: 135) y una NLS (KKKRK; SE0 lD NO: 134) entre el 35 primer (M1) y el segundo aminoacido (A2) de mO 2; la variante resultante es SE0 lD NO: 144.

Se insertaron una etiqueta (STag; KETAAAKFER0HMDS; SE0 lD NO: 136) y una NLS (KKKRK; SE0 lD NO: 134) entre el primer (M1) y el segundo (A2) aminoacidos de MO 1; la variante resultante es SE0 lD NO: 145.

40 Se construyo una meganucleasa monocatenaria que comprendia un monomero MO 1 (posiciones 1 a 166 de la SE0 lD NO: 72) separado de un monomero mO 2 (posiciones 3 a 164 de SE0 lD NO: 75) por un enlazante (GGSDKYN0ALSKYN0ALSKYN0ALSGGGGS; SE0 lD NO: 149): la meganucleasa monocatenaria resultante es SE0 lD NO: 146.

45 Se genomanipulo un heterodimero obligado derivado de mO 2/MO 1 introduciendo las mutaciones E8K y E61 R en un monomero mO 2 y las mutaciones K7E y K96E en un monomero MO 1; el heterodimero resultante consiste en la SE0 lD NO: 147 y la SE0 lD NO: 148.

LlSTADO DE SECUENClAS

�110� CELLECTlS GOUBLE, Agn�s

5 �120� Variantes de meganucleasa que escinden una secuencia de ADN diana del locus ROSA26 de raton y usos de las mismas �130� 1546PCT17 �160� 149 �170� Patentln version 3.3

10 �210� 1 �211� 163 �212� PRT �213� Chlamydomonas reinhardtii �400� 1

�210� 1 �211� 24 20 �212� ADN �213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de C1221

�400� 2

tcaaaacgtc gtacgacgtt ttga 24

�210� 3

�211� 13139

�212� ADN

�213� Mus musculus 10 �400� 3

�210� 4 �211� 167

5 �212� PTR �213� secuencia artificial �220� �223� proteina de armazon n75 de l-Crel �400�

�210� 5 5

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26 10

�400� 5

cgcccctgcg caacgtggca gg: 22

�210� 6

�211� 22 15

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 6 20

ccgcaccctt ctccggaggg gg: 22

�210� 7

�211� 22

�212� ADN 25

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA 26

�400� 7

tggactggct tgactcatgg ca 30: 22

�210� 8

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26 5

�400� 8

ccagcctggt ctacacatca ag: 22

�210� 9

�211� 22 10

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 9 15

ctatctagga tagccaggaa ta: 22

�210� 10

�211� 22

�212� ADN 20

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 10

cagcctgatt tccagggtgg gg 25: 22

�210� 11

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial 30

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 11

taaacctcat aaaatagtta tg: 22

35

�210� 12

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220� 40

�223� ADN diana de ROSA26 DNA

�400� 12

tcagattctt ttatagggga ca: 22

�210� 13 45

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26 50

�400� 13

ttgtatatct caaataatgc tg: 22

�210� 14

�211� 22 55

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA

�400� 14

tgagccactg agaatggtct ca: 22

�210� 15

�211� 22 5

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 15 10

caacatgatg ttcataatcc ca: 22

�210� 16

�211� 22

�212� ADN 15

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 16

ttaaatgttg ctatgcagtt tg 20: 22

�210� 17

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220� 25

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 17

ttccccaaag ttccaaatta ta: 22

�210� 18 30

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26 DNA 35

�400� 18

taacaccgtt tgtgttataa ta: 22

�210� 19

�211� 22 40

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 19 45

tatactgtct ttagagagtt ta: 22

�210� 20

�211� 22

�212� ADN 50

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA

�400� 20

tgtaatagct tagaaaattt aa 55: 22

�210� 21

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 21

tttaatctat tggtttgtct ag 5: 22

�210� 22

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial 10

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 22

ttgtacattg ttaggagtgt ga: 22

15

�210� 23

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220� 20

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 23

tgcactggta cacataattt ca: 22

�210� 24 25

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26 30

�400� 24

tgagatgata caaagaattt ag: 22

�210� 25

�211� 22 35

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26 DNA

�400� 25 40

ccatcctata aaagaaggtc aa: 22

�210� 26

�211� 22

�212� ADN 45

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 26

tttaatctat tgcaaaaggt aa 50: 22

�210� 27

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial 55

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 27

tagtccagtg ttatagagtt ag: 22

�210� 28

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial 5

�220�

�223� ADN diana de ROSA26

�400� 28

tagtccagtg ttatagagtt ag: 22

10

�210� 29

�211� 22

�212� DNA

�213� artificial sequence

�220� 15

�223� ROSA26 DNA target

�400� 29

ttttctgtgg agacaaaggt aa: 22

�210� 30 20

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de ROSA26 25

�400� 30

tgagatggct cagcaaataa tg: 22

�210� 31

�211� 24 30

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de 10GGG P

�400� 31 35

tcgggacgtc gtacgacgtc ccga: 24

�210� 32

�211� 24

�212� ADN 40

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de 5GAT P

�400� 32

tcaaaacgat gtacatcgtt ttga 45: 24

�210� 33

�211� 24

�212� ADN

�213� secuencia artificial 50

�220�

�223� ADN diana de 5TAT P

�400� 33

tcaaaactat gtacatagtt ttga: 24

55

�210� 34

�211� 22

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220� �223� ADN diana de rosa1.2 DNA �400� 34 caacatgatg tacataatcc ca 22

5 �210� 35 �211� 22 �212� ADN �213� secuencia artificial

10 �220� �223� ADN diana de rosa1.3 �400� 35 caacatgatg tacatcatgt tg 22

15 �210� 36 �211� 22 �212� ADN �213� secuencia artificial �220�

20 �223� ADN diana de rosa1.4 �400� 36 tgggattatg tacataatcc ca 22

�210� 37

25 �211� 50 �212� ADN �213� secuencia artificial �220� �223� oligonucleotide diana

30 �400� 37 tggcatacaa gtttcaacat gatgtacatc atgttgacaa tcgtctgtca 50

�210� 38 �211� 167

35 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m1 �400� 38

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m2 �400� 39

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m3 �400� 40

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m4 �400� 41

10 �210� 42

5 �211� 167 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m5

10 �400� 42

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m6 �400� 43

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m7 �400� 44

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m8 �400� 45

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m9 �400� 46

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m10 �400� 47

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m11 �400� 48

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m12 �400� 49

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m13 �400� 50

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m14 �400� 51

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m15 �400� 52

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m16 �400� 53

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m17 �400� 54

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante m18 �400� 55

5 �212� ADN �213� secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 56

10 gcaactttag tgctgacaca tacagg 26

�210� 57 �211� 24 �212� ADN

15 �213� secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 57 acaaccttga ttggagactt gacc 24

20 �210� 58 �211� 15 �212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� cebador

�220�

�221� misc feature

�222� (4)..(6)

�223� n es a, c, g, o t

�400� 58

ctannnttga ccttt: 15

�210� 59

�211� 15

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� cebador

�220�

�221� misc feature

�222� (10)..(12)

�223� n es a, c, g, o t

�400� 59

aaaggtcaan nntag: 15

�210� 60

�211� 167

�212� PRT

�213� secuencia artificial

�220�

�223� variante de l-Crel

�400� 60

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 61

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 62

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 63

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 64

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 65

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 66

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 67

�210� 68

�211� 59

�212� ADN 5

�213� secuencia artificial

�220�

�223� cebador

�400� 68

gcataaatta ctatacttct atagacacgc aaacacaaat acacagcggc cttgccacc 10: 59

�210� 69

�211� 48

�212� ADN

�213� secuencia artificial 15

�220�

�223� cebador

�400� 69

ggctcgagga gctcgtctag aggatcgctc gagttatcag tcggccgc: 48

20

�210� 70

�211� 18

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� cebador

�400� 70

ttaagcgaaa tcaagccg: 18

�210� 71

�211� 18

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� cebador

�400� 71

ttaagcgaaa tcaagccg: 18

�210� 72

�211� 167

�212� PRT

�213� secuencia artificial

�220�

�223�variante de l-Crel

�400� 72

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 73

10 �210� 74

5 �211� 167 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel

10 �400� 74

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 75

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 76

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 77

5 �212� ADN �213� secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 78

�210� 79 �211� 64 15 �212� ADN

�213� secuencia artificial �220� �223� cebador �400� 79

�210� 80

�211� 24

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de l-Crel DNA

�400� 80

tcaaaacgtc gtgagacagt ttgg: 24

�210� 81

�211� 18

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� ADN diana de l-SCe

�400� 81

tagggataac agggtaat: 18

�210� 82

�211� 167

�212� PRT

�213� secuencia artificial

�220�

�223� variante de l-Crel

�400� 82

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223�variante de l-Crel �400� 83

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 84

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 85

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 86

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 87

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 88

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 89

10 �210� 90

10 �400� 90

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 91

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 92

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 93

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 94

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 95

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 96

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 97

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 98

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 99

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 100

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 101

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 102

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 103

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 104

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 105

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 106

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 107

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 108

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 109

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 110

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 111

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 112

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 113

10 �210� 114

10 �400� 114

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 115

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 116

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 117

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 118

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 119

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 120

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 121

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 122

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 123

10 �210� 124

10 �400� 124

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 125

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 126

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 127

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 128

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 129

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 130

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 131

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� variante de l-Crel �400� 132

5 �212� PRT �213� Chlamydomonas reinhardtii �400� 133 �210� 134

5 �211� 5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� NLS

10 �400� 134

�210� 135

15 �211� 9 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� HA-tag

20 �400� 135 �210� 136 �211� 15 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� s-tag �400� 136

�210� 137

�211� 25

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� cebador

�400� 137

tagtatacag aaactgttgc atcgc: 25

�210� 138

�211� 20

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� cebador

�400� 138

cgtctgctgc tccatacaag: 20

�210� 139

�211� 585

�212� ADN

�213� secuencia artificial

�220�

�223� lRES

�400� 139

5 000 �210� 141 �211� 172 �212� PRT �213� secuencia artificial

10 �220� �223� MO 1 NLS �400� 141

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� mO 2 TagHA �400� 142

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� MO 1 STag �400� 143

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� mO 2 NLS+TagHA �400� 144

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� MO 1NLS+STag �400� 145

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� MO 1/mO 2 monocatenario �400� 146

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� mO 2 E8K+E61R �400� 147

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� MO 1 K7E+K96E �400� 148

5 �212� PRT �213� secuencia artificial �220� �223� enlazante de meganucleasa monocatenaria �400� 149

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante de l-Crel, caracterizada porque uno de los dos monomeros de l-Crel tiene al menos dos sustituciones, una en cada uno de los dos subdominios funcionales del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado respectivamente entre las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de l-Crel, siendo dicha variante capaz de escindir una secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y que es obtenible mediante un procedimiento que comprende al menos las etapas de:

(a)

construir una primera serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en el primer subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel,

(b)

construir una segunda serie de variantes de l-Crel que tengan al menos una sustitucion en un segundo subdominio funcional del dominio del nucleo de LAGLlDADG situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel,

(c)

seleccionar y/o cribar las variantes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a + 10 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(d)

seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(e)

seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la primera serie de la etapa (a) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(f)

seleccionar y/o cribar las variantes procedentes de la segunda serie de la etapa (b) que son capaces de escindir un sitio l-Crel mutante en el que al menos (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 se ha sustituido con la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en la posicion +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(g)

combinar en una unica variante, la(s) mutacion(es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes de la etapa (c) y la etapa (d), para obtener una novedosa variante de l-Crel homodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -10 a -8 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico al triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones -5 a -3 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, y/o

(h)

combinar en una unica variante, la(s) mutacion(es) en las posiciones 26 a 40 y 44 a 77 de las dos variantes procedentes de la etapa (e) y etapa (f), para obtener una novedosa variante de l-Crel heterodimerico que escinda una secuencia en la que (i) el triplete de nucleotidos en las posiciones +3 a +5 es identico al triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (ii) el triplete de nucleotidos en las posiciones -5 a -3 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotido que esta presente en las posiciones +3 a +5 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, (iii) el triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 del sitio l-Crel se ha sustituido con el triplete de nucleotidos que esta presente en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton y (iv) el triplete de nucleotidos en las posiciones -10 a -8 es identico a la secuencia complementaria inversa del triplete de nucleotidos en las posiciones +8 a +10 de dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton,

(i)

combinar las variantes obtenidas en las etapas (g) y/o (h) para formar heterodimeros, y

(j)

seleccionar y/o cribar los heterodimeros de la etapa (i) que son capaces de escindir dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton.
2.

La variante de la reivindicacion 1, en la que dicha(s) sustitucion(es) en el subdominio situado entre las posiciones 44 a 77 de l-Crel son en las posiciones 44, 68, 70, 75 y/o 77 y en la que dicha(s) sustitucion(es) en el subdominio situado entre las posiciones 26 a 40 de l-Crel son en las posiciones 26,28, 30, 32, 33, 38 y/o 40.
3.

La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende una o mas sustituciones en las posiciones 137 a 143 del l-Crel que modifica la especificidad de la variante hacia el nucleotido en las posiciones

1 a 2,

6 a 7 y/o

11 a 12 del sitio l-Crel.
4.

La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una o mas sustituciones de la secuencia completa de l-Crel que mejora las propiedades de union y/o escision de la variante hacia dicha secuencia de ADN diana procedente del locus ROSA26 de raton, seleccionandose preferiblemente dichas sustituciones entre el grupo que consiste en G19S, l24V, S79G, V105A, K107R, V151A, D153G y K158E.
5.

La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dichas sustituciones son sustituciones de los aminoacidos iniciales con aminoacidos seleccionados en el grupo que consiste en A, D, E, G, H, K, N, P, 0, R, S, T, Y, C, W, L y V.
6.

La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un heterodimero, resultante de la asociacion de un primer y un segundo monomero que tienen diferentes mutaciones en las posiciones 26 a 40 y/o 44 a 77 de l-Crel, siendo dicho heterodimero capaz de escindir una secuencia de ADN diana no palindromico procedente del locus ROSA26 de raton.
7.

La variante de la reivindicacion 6, en la que dicho ADN diana se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO; 5 a 14 y 16 a 30, dicho primer y segundo monomeros, respectivamente, comprendiendo preferiblemente al menos las siguientes sustituciones:

-

N30H, Y33S, 044E, R68C, R70S, D75N and N30D, Y33R, 038T, 044K, R68E, R70S, l77R,

-

S32N, Y33G, 044K, R70E, D75N and S32T, 038W, 044K, R68E, R70S, l77R,

-

Y33R, 038N, S400, 044N, R70S, D75R, l77D and N30H, Y33S, 044A, R70S, D750, l77E,

-

K28S, 038R, S40K, 044D, R68Y, R70S, D75S, l77R and Y33C, 038A, R68A, R70K, D75N,

-

Y33C, 044T, R70S, D75Y and S32D, 038C, 044D, R68Y, R70S, D75S, l77R,

-

S32T, Y33C, R68T, R70N, D75N and S32T, 038W, 044K, R70E, D75N,

-

R70S, D75R, l77Y and Y33R, 038A, S400, 044A, R70S, D75N,

-

K28S, 038R, S40K, 044T, R68N, R70N, D75N and Y33H, 038S, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N,

-

K28A, Y33S, 038R, S40K, 044N, R68Y, R70S, D75R, l77V and S32T, Y33C, 044A, R70S, D75N,

-

S32D, Y33H, 044K, R68E, R70S, l77R and S32D, Y33H, 044D, R68N, R70S, D75N,

-

N30R, S32D, R68S, R70K, D75N and D75N,

-

K28R, Y33A, 038Y, S400, R68Y, R70S, D75R, l770 and Y33R, 038A, S400, R70S, l77K,

-

K28R, N30D, D75E, l77R and S32D, 038C, 044A, R70S, D75R, l77Y,

-

Y33R, 038A, S400, R70S, D75N and R70S, D75Y, l77R,

-

Y33R, 038A, S400, 044N, R68Y, R70S, D75R, l77V and N30R, S32D, 044T, R68H, R70H, D75N,

-

Y33P, S400, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N and S32A, Y33C, R68Y, R70S, D75R, l770,

-

K28A, Y33S, 038R, S40K, R68N, R70S, D75N, l77R and S32N, Y33G, 044A, R68A, R70K, D75N,

-

N30H, Y33S, 044Y, R70S, l77V and Y33R, S400, 044A, R70S, D75N,

-

S32D, Y33H, R68T, R70N, D75N and N30R, S32D, 044T, R68N, R70N, D75N,

-

S32R, Y33D, 044A, R70S, D75N and Y33S, 038R, S40H, R68H, R70H, D75N,

-

Y33P, S400, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N and K28R, Y33A, 038Y, S400, 044T, R68H, R70H, D75N,

-

K280, 038R, S40K, 044A, R70S, D75E, l77R and N30R, S32D, 044K, R68Y, R70S, D750, l77N,

-

Y33T, 038A, R68H, R70H, D75N and N30H, Y33S, R70S, l77K,

-

Y33T, S40T, R68A, R70K, D75N and K28R, Y33A, 038Y, S400, R70S, and

-

S32D, Y33H, 044N, R70S, D75R, l77D and S32D, 038C, R70S, l77K.
8.

La variante de la reivindicacion 7, en la que el primer monomero es de cualquiera de las secuencias SE0 lD NO: 82 a 106 y el segundo monomero es de cualquiera de las secuencias SE0 lD NO: 107 a 116, 4, 117 a 130, respectivamente.
9.

La variante de la reivindicacion 6, en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en: l24V, 044Y, R70S y D75N ; l24V, 044Y, R68Y, R70S, D75Y e l77R ; l24V, 044Y, R70S, D75N e l77V ; 124V, 044Y, R68N, R70S y D75R; l24V, 044Y, R68S, R70S y D75R; l24V, 044Y, R70S y D750 ; l24V, 044Y, R68Y, R70S, D75R e l77V ; l24V, 044Y, R70S, D75Y e l77T, y el segundo monomero se selecciona en el grupo que consiste en K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R68H, R700 y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R70N y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R68H, R700 y D75N ; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044V, R70A y D75N; K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R70G y D75N, preferiblemente el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO : 39, 43, 45, 49, 50, 51, 53 y 54, y el segundo monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 60, 61, 63, 65 y 66.
10.

La variante de la reivindicacion 6 en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en el que el primer y el segundo monomero, respectivamente, comprende al menos las siguientes sustituciones: l24V, 044Y, R70S, D75Y, l77T y K28E, Y33R, 038R, S40R, 044A, R68S, R700, D75N, preferiblemente en la que el primer y el segundo monomeros son la SE0 lD NO: 54 y la SE0 lD NO: 62, respectivamente.
11.

La variante de la reivindicacion 6 en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en l24V, 044Y, R68N, R70S y D75R; l24V, 044Y, R68S, R70S y D75R; l24V, 044Y, R70S y D750; 124V, 044Y, R68Y, R70S, D75R e l77V; l24V, 044Y, R70S, D75Y e l77T, y el segundo monomero s selecciona en el grupo que consiste en: K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R70S, D75N y K28E, Y33R, 038R, S40K, 044A, R68T, R70N, D75N, preferiblemente en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 49, 50, 51, 53 y 54, y el segundo monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 64 y 67.
12.

La variante de la reivindicacion 6 en la que dicho ADN diana es la SE0 lD NO: 15 y en la que el primer monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 72 y 73 y el segundo monomero se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias SE0 lD NO: 74 a 77.
13.

La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende una senal de localizacion nuclear y/o una etiqueta.
14.

La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que tiene al menos un 95% de identidad de la secuencia con las secuencias 82-106, 107-116, 4, 117-130; 39, 43, 45, 49, 50, 51, 53 y 54; 60, 61, 63, 65 y 66; 54, 62; 64, 67; 72-73; 74-77.
15.

La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, que es un heterodimero obligado, en la que el primer monomero comprende la mutacion D137R y el segundo monomero comprende ademas la mutacion R51D o en la que el primer monomero comprende ademas las mutaciones E8R o E8K y E61 R y el segundo monomero comprende ademas las mutaciones K7E y K96E.
16.

Una meganucleasa quimerica monocatenaria que comprende dos monomeros o dominios de nucleo de una variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o una combinacion de ambas, que comprende preferiblemente el primer y el segundo monomero tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 y 9 a 15, junto con un enlazante peptidico.
17.

Un fragmento de polinucleotido que codifica la variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16.
18.

Un vector de expresion que comprende al menos un fragmento de polinucleotido que codifica al menos una variante monomerica de l-Crel de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16, preferiblemente, dicho vector de expresion comprende dos fragmentos diferentes de polinucleotidos, codificando cada uno, uno de los monomeros de una variante heterodimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15.
19.

Un vector, que incluye una construccion directora que comprende una secuencia que se va a introducir en el locus ROSA26 de raton, flanqueada por secuencias que comparten homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 y 9 y en el que preferiblemente dicha secuencia que comparte homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton es un

fragmento del locus ROSA26 de raton que comprende la secuencia seleccionada entre las posiciones 3131 a 3330, 3401 a 3600, 4628 a 4827, 5495 a 5694, 5519 a 5718, 5817 a 6016, 5903 a 6102, 6320 a 6519, 7305 a 7504, 7981 a 8180, 8215 a 8414, 8305 a 8504, 8494 a 8693, 8589 a 8788, 8660 a 8859, 8921 a 9120, 9191 a 9390, 9467 a 9666, 10174 a 10373, 11469 a 11668, 12302 a 12501, 12325 a 12524, 12446 a 12465, 12702 a 12901, 12815 a 13014 y 12865 a 13064 de la SE0 lD NO: 3 o dicha secuencia que comparte homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton es un fragmento del locus ROSA26 de raton que comprende secuencias en la direccion 5' y en la direccion 3' del sitio de escision, con el fin de permitir la delecion de las secuencias de codificacion que flanquean inmediatamente el sitio de escision.
20.

Una composicion que comprende al menos una variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16, y/o al menos un vector de expresion de las reivindicaciones 18 o 19, preferiblemente dicha composicion comprende una construccion de ADN director que comprende una secuencia que se va a introducir en el locus ROSA26 de raton, flanqueada por secuencias que comparten homologias con la region que rodea el sitio de escision del ADN genomico de dicha variante, tal como se define en la reivindicacion 19.
21.

Una celula hospedadora que esta modificada por un polinucleotido de la reivindicacion 17 o un vector de las reivindicaciones 18 o 19.
22.

Un animal transgenico no humano que comprende uno o dos fragmentos de polinucleotidos tal como se define en la reivindicacion 17 o en la reivindicacion 18.
23.

Una planta transgenica que comprende uno o dos fragmentos de polinucleotidos tal como se define en la reivindicacion 17 o en la reivindicacion 18.
24.

Uso de al menos una variante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una meganucleasa quimerica monocatenaria de la reivindicacion 16, un vector de acuerdo con las reivindicaciones 18 o 19, para genomanipular el genoma de raton, para objetivos no terapeuticos, en el que preferiblemente dicha variante, meganucleasa quimerica monocatenaria, o vector esta asociada con una construccion de ADN director tal como se define en la reivindicacion 19 y mas preferiblemente, dicha construccion de ADN director comprende un casete que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de interes, y eventualmente un gen marcador, flanqueado por secuencias que comparten homologias con las regiones que rodean el sitio de escision del ADN genomico presente en el locus ROSA26 de raton, tal como se define en la reivindicacion 19.