ES2381731T3 - Caspasa-8 y cicatrización de heridas - Google Patents

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Eitan Galun
Tehila Ben Moshe
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Abstract

Uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 en la fabricación de un medicamento para facilitar o acelerar la curación de un higado herido o lesionado, en donde la herida o la lesión se desarrolla despues de una resección hepatica.

Description

Caspasa-8 y cicatrizaci6n de heridas
Campo de la invenci6n
La presente invenci6n se refiere a la funci6n reguladora de la caspasa 8 en la cicatrizaci6n de heridas.
Antecedentes de la invenci6n
La familia caspasa de las proteasas de cisteina se conoce principalmente por su papel fundamental en la inducci6n de la apoptosis en las celulas animales (Shi y col., 2002). Algunas de las caspasas, que se caracterizan por una regi6n denominada "prodominio", situada aguas arriba de la fracci6n proteolitica, tienen una funci6n de iniciaci6n en la apoptosis. Se activan tras la uni6n de sus prodominios a los receptores que inducen la muerte o a proteinas adaptadoras asociadas a tales receptores y, una vez activadas, escinden otros miembros de la familia de las caspasas, activandoles de este modo. La caspasa-8 (anteriormente conocida como MACH/FLICE/Mch4) es una caspasa iniciadora activada, dentro de complejos de senalizaci6n de receptores de la familia TNF/NGF, a los que se incorpora mediante la uni6n de su prodominio a una proteina adaptadora, denominada dominio de muerte asociado a Fas (FADD, tambien denominada MORT1) (Boldin y col., 1996, Muzio y col., 1996 y Wallach y col., 1999). La activaci6n de la caspasa-8 constituye un acontecimiento iniciador crucial en el mecanismo de muerte por apoptosis, inducido por estos receptores (lo ruta extrinseca de la muerte celular) (Varfolomeev y col., 1998). La caspasa-8 y FADD tambien contribuyen, por mecanismos aun desconocidos, a diversos procesos celulares no apopt6ticos (por ejemplo, vease Varfolomeev y col., 1998, Zhang y col., 1998, Walsh y col., 1998, Newton y col., 1998, Alam y col., 1999, Kennedy y col., 1999, Chun y col., 2002, Sakamaki y col., 2002, Salmena y col., 2003, Kang y col., 2004, Su y col., 2005 y Beisner y col., 2005).
Aunque el funcionamiento in vivo de la caspasa-8 se ha investigado empleando una serie de modelos de ratones transgenicos (Varfolomeev y col., 1998, Salmena y col., 2003, Kang y col., 2004 y Beisner y col., 2005), todavia se sabe muy poco sobre el significado fisiol6gico o fisiopatol6gico de la enzima.
Sumario de la invenci6n
En un aspecto, la invenci6n se refiere a un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8, en la preparaci6n de un medicamento para prevenir y/o tratar la inflamaci6n de un tejido u 6rgano, tal y como se define en las reivindicaciones.
Es un objeto de la invenci6n proporcionar el uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8, en la preparaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la curaci6n de un tejido o un 6rgano herido o lesionado.
Otro objeto de la invenci6n es proporcionar un metodo para facilitar o acelerar la curaci6n de un tejido o un 6rgano herido o lesionado que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8.
La herida o la lesi6n se desarrollan despues de la resecci6n de un tejido o un 6rgano.
El 6rgano es el higado.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, la herida o la lesi6n se desarrollan despues de un traumatismo fisico que incluye pero no se limita a, una operaci6n quirurgica, una mordedura, un accidente deportivo, un accidente, una resecci6n de un tejido o un 6rgano y una amputaci6n.
Otro objeto de la invenci6n es proporcionar el uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8, en la fabricaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la cicatrizaci6n de un higado lesionado.
Otro objeto adicional de la invenci6n es proporcionar un metodo para facilitar o acelerar la cicatrizaci6n de un higado lesionado que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8.
En ciertas realizaciones de la invenci6n, el inhibidor de la caspasa-8 incluye, pero no esta limitado a los mismos, un ARNm no codificante, un ARN pequeno de interferencia, un anticuerpo especifico de la caspasa-8 y una molecula pequena inhibidora.
En una realizaci6n adicional de la invenci6n, la molecula inhibidora es una molecula pequena que tiene un peso molecular de 100 a 5.000 dalton, tal como Z-IETD-FMK.
Otro objeto adicional de la invenci6n es proporcionar el uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 junto con un inhibidor de la inflamaci6n, en la preparaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la curaci6n de un higado lesionado.
La lesi6n se desarrolla despues de una resecci6n hepatica.
En otra realizaci6n de la invenci6n, se extirpa 1/3 del higado.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, se extirpan 2/3 del higado.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, el inhibidor de la caspasa-8 se selecciona a partir de un ARNm no codificante especifico de la caspasa-8, un ARN pequeno de interferencia especifico de la caspasa-8, un anticuerpo anticaspasa-8 y una molecula pequena inhibidora de la caspasa-8.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, la molecula pequena inhibidora tiene un peso molecular de 100 a 5.000 dalton.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, la molecula pequena inhibidora es Z-IETD-FMK.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, el inhibidor de la inflamaci6n es un agente capaz de inhibir celulas inmunes, tales como macr6fagos, por ejemplo, celulas de Kupffer.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, el inhibidor de la inflamaci6n se administra despues del inhibidor de la caspasa-8.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, el inhibidor de la inflamaci6n se administra los dias 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 despues de la resecci6n hepatica.
En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, el inhibidor de la inflamaci6n comprende cloruro de gadolinio.
Breve descripci6n de las Figuras
Las Figs. 1A-1I muestran el efecto de la falta de caspasa-8 en hepatocitos, sobre la infecci6n con Listeria monocytogenes. En todas las figuras, las barras negras representan ratones GaspSFI+: Alb-Gre (con hepatocitos normales) y las barras vacias representan ratones GaspSFI-: Alb-Gre (con hepatocitos carentes de caspasa-8). (A-C) Organismos viables de Listeria recuperados a partir de bazos e higados de ratones, despues de una infecci6n subletal, 24 horas (A), 6 dias (B) y 14 dias (C) despues de la infecci6n. Cada grupo de ratones F/+ o F/-en cada momento especifico, comprendia por lo menos cinco ratones. (D-I) Analisis histol6gico de secciones hepaticas de ratones GaspSFI-: Alb-Gre y GaspSFI+: Alb-Gre, 6 y 14 dias despues de la infecci6n con Listeria. (D, E) Tinci6n con H&E de los higados, 6 dias despues de la infecci6n, que muestra la acumulaci6n de leucocitos en los higados de ratones GaspSFI-: Alb-Gre (flechas). (F, G) 14 dias despues de la infecci6n, los higados de los ratones GaspSFI-: Alb-Gre (G) presentan grandes lesiones necr6ticas, mientras que los higados testigos parecen normales. (F) Ampliaci6n (200x) de D a G. (H, I) Inmunotinci6n anti-Ki67 de los higados, 14 dias despues de la infecci6n, que muestra un gran numero de hepatocitos proliferantes en higados GaspSFI-: Alb-Gre pero no en higados GaspSF-: Alb-Gre (I; nucleos tenidos de marr6n). Aumento: 100x.
Las Figs. 2A-2E muestran el efecto de la falta de caspasa 8 en hepatocitos, sobre la recuperaci6n a partir de una PHx (hepatectomia parcial): una disminuci6n en la respuesta de crecimiento temprano. (A) Inmunotinci6n anti-Ki67 (nucleos tenidos de marr6n) del higado en etapas tempranas (dia 2) y tardias (dia 14) despues de PHx. Aumento: 100x. (B, C) Proliferaci6n de los hepatocitos en varios momentos especificos despues de 1/3 de PHx (B) y 2/3 de PHx (C), cuantificada por la determinaci6n del numero de hepatocitos tenidos con anticuerpos contra Ki67 (o BrdU; recuadro), tal y como se muestra en A, hecho el recuento con 10 campos de alta resoluci6n. * P <0,05, ** P <0,01. Al menos ocho ratones fueron sometidos a ensayo en cada momento especifico en cuatro experimentos independientes. (D) Cantidades de diversas proteinas asociadas a la transici6n G1/S (ciclina A, ciclina E, proteina de retinoblastoma fosforilada) en el higado en diferentes momentos especificos despues de 1/3 de PHx (panel izquierdo), 2/3 de PHx (panel derecho). Se muestran resultados representativos de pruebas llevadas a cabo en al menos cuatro ratones en cada momento especifico. (E) Panel superior, inmunotinci6n con anti-ciclina D1, 2 dias despues de 1/3 de PHx. Ampliaci6n: 400x. Panel inferior, cuantificaci6n del incremento en ciclina D1, 2 y 4 dias despues de 1/3 de PHx, determinada mediante el recuento de hepatocitos tenidos (tal y como se muestra en el panel superior) con el anticuerpo anti-ciclina D1 con 15 campos de alta resoluci6n.
Las Figs. 3A-3E muestran el efecto de la falta de caspasa-8 en hepatocitos, sobre la recuperaci6n a partir de PHx: efectos diferenciales sobre la recuperaci6n de volumen en el sitio de la lesi6n y en el resto del tejido hepatico, segun se determina mediante resonancia magnetica secuencial MRI y analisis histol6gico. (A, B) Imagenes de higados representativas con eco de espin axiales, con ponderaci6n en T1, adquiridas el dia 4 despues de la PHx. (A) Imagen representativa del higado de un rat6n GaspSFI+: Alb-Gre. La linea punteada delimita el area isquemica. (B) Imagen representativa del higado de un rat6n GaspSFI-: Alb-Gre. Las flechas en los puntos A y B indican el material de sutura. (C) Volumen del area isquemica expresada como un porcentaje del volumen hepatico antes de la PHx en diferentes momentos especificos despues de la PHx, que muestra una disminuci6n mas rapida del tamano del sitio de la lesi6n en los ratones GaspSFI-: Alb-Gre que en los testigos. Al menos se examinaron ocho ratones en cada grupo en cada momento especifico. (D) Volumen hepatico post-PHx expresado como un porcentaje (media ± SD) de la pre-
PHx en ratones GaspSFI+-: Alb-Gre y los ratones GaspSFI-: Alb-Gre (O), segun se determina mediante visualiza
ci6n por resonancia magnetica coronal y axial, lo que demuestra un aumento de tamano mas rapido y un tamano anormalmente grande del higado en los ratones que carecen de caspasa-8. *P <0,05, **P <0,01. Se examinaron al menos ocho ratones por grupo en los momentos especificos tempranos (dias 1-4) y al menos cuatro ratones por grupo en los momentos especificos mas tardios. (E) Muestra el analisis histol6gico del area isquemica de un higado de rat6n 2 dias despues de la PHx. La secci6n del panel superior tenida con H&E del area isquemica del higado de ratones GaspSF+: Alb-Gre, 2 dias despues de la PHx. En el area de la cirugia, hay un foco grande de celulas fantasma y necrosis [N] del parenquima hepatico. El material de sutura [S] se observa en el area necr6tica. El parenquima necr6tico esta rodeado por un reborde de leucocitos infiltrantes [I]. Panel inferior, tinci6n izquierda de tipo TUNEL del area que se muestra en el inserto del panel superior, que muestra la apoptosis masiva encontrada en esta area (tinci6n). Por encima de esta regi6n, hay celulas muertas y fantasma (sin tinci6n), mientras que por debajo hay celulas vivas (nucleos tenidos con DAPI). Panel inferior, inmunotinci6n derecha contra la caspasa-3 activa de hepatocitos localizados en el reborde del parenquima hepatico lesionado. Tanto el citoplasma como los nucleos estan tenidos. Aumentos: panel superior 20x; panel inferior izquierdo 100x, panel inferior derecho 400x.
Las Figs. 4A-4B muestran el efecto de la falta de caspasa-8 en hepatocitos, sobre la recuperaci6n a partir de la PHx: perfusi6n precoz y cambios hemodinamicos. Los cambios hemodinamicos en el higado durante la regeneraci6n se determinaron por resonancia magnetica funcional. La visualizaci6n por resonancia magnetica se obtuvo antes de la PHx y 4 dias despues (n = 4 por grupo en cada momento especifico). (A) Imagenes representativas de resonancia magnetica, mapas de LSo2 y LSco2. Filas superiores, pre-PHx; filas inferiores, 4 dias despues de PHx. Columna izquierda, imagenes con eco de espin, con ponderaci6n en T1 (SE); columna central, mapas de LSo2; columna derecha, mapas de LSco2. Barra = 1 cm. Los valores son tal y como se indican en la barra de color. (B) Media de los valores ± SD de LSo2 y de LSco2 en ratones GaspSFI+: Alb-Gre (barras negras) y en ratones GaspSFI-: Alb-Gre (barras vacias) * P <0,02.
Las Figs. 5A-5C muestran el efecto de la falta de caspasa-8en hepatocitos, sobre la recuperaci6n de la PHx: persistencia de la inflamaci6n y crecimiento de los hepatocitos. (A) Inmunotinci6n con F4/80 de los higados, 4 dias y 6 dias despues de la PHx. Ampliaci6n: 400x. (B) Tinci6n con H&E e inmunotinci6n con anticuerpos anti-Ki67 y anti-F4/80, 14 dias despues de la PHx de un higado normal (F/+, arriba), un higado carente de caspasa-8 (F/-, medio, que muestra diferentes regiones en el mismo higado), y un higado carente de caspasa-8 en un rat6n tratado con cloruro de gadolinio (GdCl, parte inferior), tal y como se describe en Materiales y Metodos. Ampliaci6n de la tinci6n con H&E, 400x; de la inmunotinci6n con anticuerpos anti-Ki67, 200x, y de la inmunotinci6n con anticuerpos anti-F4/80, 100x. (C) Panel superior, analisis de tipo transferencia Western de la fosforilaci6n con STAT-3 en el higado, 14 dias despues de la PHx. Panel inferior, inmunotinci6n con p-STAT 3 del higado en los momentos indicados despues de la PHx. Ampliaci6n: en los paneles principales, 200x, y en los recuadros, 400x. Flechas negras, macr6fagos; flechas blancas, hepatocitos.
Las Figs. 6A-6B muestran que el aumento de la proliferaci6n de los hepatocitos carentes de caspasa-8 en una etapa tardia posterior a la PHx, es secundario a la inflamaci6n. (A) Efecto del tratamiento con cloruro de gadolinio sobre el volumen de los higados el dia 14Q despues de la PHx, tal y como se determina mediante visualizaci6n por resonancia magnetica, y (B) sobre la proliferaci6n de hepatocitos en ese momento, tal y como se determina mediante la tinci6n con anticuerpos anti-Ki67 y el recuento de los nucleos tenidos con 10 campos de alta resoluci6n. Se sometieron a ensayo al menos cuatro ratones en cada grupo. *P <0,05; **P <0,01.
Descripci6n detallada de las realizaciones
Se ha encontrado de acuerdo con la presente invenci6n, que la caspasa-8 tiene un papel regulador en la infecci6n del higado con un agente pat6geno intracelular, en la inflamaci6n y en la cicatrizaci6n. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe la regulaci6n del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 para tratar una infecci6n causada por un agente pat6geno intracelular, para tratar la inflamaci6n y para facilitar la cicatrizaci6n.
La invenci6n se basa en los hallazgos obtenidos en esta memoria, al explorar el efecto de la deleci6n de la caspasa-S en hepatocitos, sobre las funciones del higado. Se encontr6 de acuerdo con la invenci6n que: la deleci6n de la caspasa-S en hepatocitos compromete la resistencia de los ratones a la infecci6n con el agente pat6geno intracelular Listeria monocytogenes; que la hepatectomia parcial (PHx) esta acompanada por la aparici6n de un estado inflamatorio cr6nico en ausencia de caspasa-8 en los hepatocitos, y que la ausencia de caspasa-8 en los hepatocitos promueve una cicatrizaci6n rapida de una lesi6n en el higado.
El comportamiento de un higado humano lesionado se podria imitar con un modelo animal experimental correspondiente, consistente en una hepatectomia parcial (PHx) de ratones, mediante la escisi6n del l6bulo medio del higado (30% de PHx) o mediante la escisi6n de los l6bulos superiores medio, izquierdo y derecho (70% de PHx), tal y como se describe en la secci6n de los Ejemplos. Se ha encontrado de acuerdo con la invenci6n, utilizando el modelo de PHx, que la ausencia de caspasa-8 en los hepatocitos afectaba de varias maneras a la regeneraci6n del higado, despues de una lesi6n hepatica. Por ejemplo, la curaci6n de la lesi6n en PHx ocurri6 mas rapidamente en ausencia de caspasa-8. La mejoria en la curaci6n de la lesi6n se observa poco despues de la inducci6n de la lesi6n, aproximadamente dos a cuatro dias despues de la PHx. En vista de estos resultados, un aspecto de la descripci6n se refiere a la inhibici6n de la actividad y/o del nivel de la caspasa-8 para promover o facilitar la curaci6n de una contusi6n, lesi6n o herida en un 6rgano o tejido. En una realizaci6n, la descripci6n se refiere a la mejora de la recuperaci6n de lesiones isquemicas mediante la inhibici6n de la actividad y/o del nivel de la caspasa-8. En particular, la descripci6n se refiere a la utilizaci6n de un inhibidor de la actividad y/o del nivel de la caspasa-8 para facilitar o acelerar la curaci6n de un tejido u 6rgano herido o lesionado. La herida o la lesi6n pueden estar causadas por un traumatismo fisico, que incluye pero no esta limitado a una operaci6n quirurgica, una mordedura, un accidente deportivo, un accidente, una resecci6n de un tejido u 6rgano y una amputaci6n.
El inhibidor de la caspasa-8 se puede utilizar en metodos quirurgicos antes, durante o despues de la resecci6n del 6rgano o del tejido. La inhibici6n post-operatoria del tratamiento con caspasa-8 puede tener un efecto beneficioso sobre la curaci6n de lesiones post-operatorias en el higado.
La invenci6n contempla el uso de un inhibidor de la caspasa-8 antes, durante y/o despues de la resecci6n de un tejido para acelerar y/o facilitar la curaci6n. En una realizaci6n de la invenci6n, la inhibici6n de la caspasa-8 se lleva a cabo antes de la resecci6n del tejido.
De acuerdo con la presente invenci6n, se detect6 temprano un efecto beneficioso de la inhibici6n de la caspasa-8 sobre la cicatrizaci6n de heridas, ya unos pocos dias despues de la lesi6n causada por una hepatectomia parcial, antes de la aparici6n de la inflamaci6n (Fig. 3D). Por lo tanto, un inhibidor de la caspasa-8 se puede administrar ventajosamente durante un corto periodo de tiempo antes, durante o despues de una lesi6n y/o de una resecci6n de un 6rgano. Por ejemplo, un inhibidor de la caspasa-8 puede aplicarse desde varias horas hasta aproximadamente 1, 2, 3 dias y no mas de 4 dias, para facilitar la cicatrizaci6n de heridas. El inhibidor de la caspasa-8 se puede utilizar desde 10 hasta 60 minutos, no menos de 10, 20, 30 o 45 minutos, o durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o hasta 24 horas, para aumentar la cicatrizaci6n de heridas.
Se ha encontrado de acuerdo con la presente invenci6n que la inyecci6n de cloruro de gadolinio (GdCl), que interfiere con la funci6n de las celulas de Kupffer e induce su eliminaci6n, daba como resultado la detenci6n de la proliferaci6n retardada de los hepatocitos y la prevenci6n de hepatomegalia que tiene lugar en ausencia prolongada de caspasa-8 en los hepatocitos. Esta detenci6n de la proliferaci6n retardada de los hepatocitos es particularmente sorprendente en vista de que la proliferaci6n de hepatocitos facilitada de forma temprana despues de la PHx no disminuye, sino que mas bien se mejora mediante el tratamiento con GdCl. Asi, para un tratamiento mas largo de un tejido lesionado con inhibidores de la caspasa-8, puede ser beneficioso utilizar la combinaci6n del inhibidor de la caspasa-8 con un agente antiinflamatorio o un agente capaz de eliminar la acumulaci6n de celulas inflamatorias. Por ejemplo, el inhibidor de la caspasa-8 se puede administrar simultaneamente con un agente antiinflamatorio, tal como el cloruro de gadolinio, hasta 4 dias o mas, por ejemplo, hasta 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 dias y hasta 1 mes, para facilitar la curaci6n de heridas, la recuperaci6n del tejido de la lesi6n, y/o la regeneraci6n del tejido.
Un inhibidor de la caspasa-8 solo o junto con agente antiinflamatorio, o un agente capaz de eliminar la acumulaci6n de celulas inflamatorias, se pueden utilizar para facilitar la curaci6n de un higado lesionado, la recuperaci6n del higado de una lesi6n y/o la regeneraci6n del higado, por ejemplo, en los casos en los que se elimina o se extirpa del higado un tumor maligno, una metastasis o un area cirr6tica.
La donaci6n de un higado entre un donante vivo y un paciente presenta problemas, porque el higado injertado o el remanente son demasiado pequenos para mantener la vida del donante y/o del receptor. Tipicamente, una relaci6n de injerto a peso corporal mayor que 0,8 parece ser segura (Lee y col., 2004). La inhibici6n de la caspasa-8 sola, o junto con un agente antiinflamatorio o un agente capaz de eliminar la acumulaci6n de celulas inflamatorias, puede permitir ampliar aun mas las resecciones hepaticas a una masa hepatica por debajo del margen de seguridad actual en el higado de un donante.
La invenci6n contempla el uso de un inhibidor de la caspasa-8, administrado sistemica y/o localmente, en el sitio de la herida.
La expresi6n "inhibidor de caspasa-8" en el contexto de esta invenci6n, se refiere a cualquier molecula que modula la producci6n y/o la acci6n de la caspasa-8, de tal manera que la producci6n y/o la acci6n de la caspasa-8 se atenua, se reduce, o se evita o se bloquea de manera parcial, sustancial o completa. La expresi6n "inhibidor de la caspasa-8" pretende abarcar los inhibidores de la producci6n de la caspasa-8, asi como los inhibidores de la acci6n de la caspasa-8. El inhibidor de la caspasa-8 se puede dirigir, por ejemplo, a los hepatocitos (vease mas adelante).
Un inhibidor de la producci6n puede ser cualquier molecula que afecte negativamente a la sintesis, al procesamiento
o a la maduraci6n de la caspasa-8. Los inhibidores considerados de acuerdo con la invenci6n pueden ser, por ejemplo, supresores de la expresi6n genica de la caspasa-8, ARNm no codificantes o ARN bicatenarios, tales como ARN pequenos de interferencia (Hunter y col., 1975) para reducir o evitar la transcripci6n del ARNm de la caspasa-8 o que conducen a la degradaci6n del ARNm, proteinas que impiden el plegamiento correcto de la caspasa-8, proteasas que degradan la caspasa-8, una vez que se ha sintetizado, e inhibidores de la escisi6n de la procaspasa-8 a fin de generar caspasa-8 activa.
Un inhibidor de la acci6n de la caspasa-8 puede ser un antagonista de la caspasa-8. Los antagonistas pueden unirse
o secuestrar la molecula misma de caspasa-8 con suficiente afinidad y especificidad para neutralizar parcial o sustancialmente la caspasa-8.
Los inhibidores de la acci6n de la caspasa-8 pueden ser anticuerpos especificos de la caspasa-8, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, o cualquier otro agente o molecula que impida la uni6n de la caspasa-8 a sus dianas, disminuyendo o evitando de este modo la activaci6n de las reacciones mediadas por la caspasa-8.
La expresi6n "inhibidor de una proteina" en el contexto de esta invenci6n, se refiere a cualquier agente, tal como una proteina (por ejemplo, un anticuerpo), un polinucle6tido (por ejemplo, ARNs no codificantes y pequenos de interferencia) y una pequena molecula inhibidora capaz de disminuir la producci6n y/o la acci6n de una proteina de tal manera, que dicha producci6n y/o acci6n proteica este atenuada, reducida o parcial, sustancial o completamente inhibida o bloqueada.
Una molecula inhibidora pequena puede ser un compuesto organico (que contiene carbono) o inorganico con un peso molecular de aproximadamente 100 a 5.000; 200 a 5.000, 200 a 2000; o 200 a 1.000 dalton. Las moleculas pequenas incluyen, pero no se limitan a, metabolitos, analogos metab6licos, peptidos, peptidomimeticos, aminoacidos, analogos de aminoacidos, polinucle6tidos, analogos de polinucle6tidos, nucle6tidos, analogos de nucle6tidos, compuestos heteroorganicos y organometalicos. Por ejemplo, moleculas pequenas inhibidoras de la caspasa-8 pueden estar constituidas por peptidos que compiten con exito por la uni6n a la caspasa. Los peptidos WEHD, VDVAD y DEVD son ejemplos de peptidos que se unen a caspasas. Es posible generar inhibidores reversibles o irreversibles de la activaci6n de la caspasa, mediante el acoplamiento de peptidos especificos de la caspasa a ciertos compuestos de aldehido, nitrito o cetona. Los peptidos derivatizados de la fluorometilcetona (FMK), tales como Z-IETD-FMK, actuan como inhibidores irreversibles eficaces. Los inhibidores sintetizados con un grupo benciloxicarbonilo (tambien conocido como BOC o Z) en el extremo N-terminal y las cadenas laterales O-metilo, muestran una permeabilidad celular mejorada, facilitando asi su uso in vivo.
Ejemplos de inhibidores de la caspasa-8 incluyen, pero no se limitan a, (i) cFLIP corta (CASH beta) (ii) cFLIP larga (CASH alfa). (iii) Las proteinas RING asociadas a las caspasas-8 y 10 (CARPs, McDonald ER 3Q, El-Deiry WS, Proc Natl Acad Sci USA, 20 de abril de 2004; 101(16):6170-5), y un agente quimico inhibidor de la caspasa-8, tal y como IETD-FMK (R&D Systems nQ de cat. FMK007).
El termino "anticuerpo" se entiende que incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (AcMs), anticuerpos quimericos, anticuerpos anti-idiotipicos (anti-ID) de anticuerpos que se pueden marcar en forma soluble o ligada, y anticuerpos humanizados, asi como fragmentos de los mismos proporcionados por cualquier tecnica conocida, tal como, pero no limitada a, la escisi6n enzimatica, la sintesis peptidica o tecnicas recombinantes.
Un anticuerpo monoclonal contiene una poblaci6n sustancialmente homogenea de anticuerpos especificos de antigenos, cuyas poblaciones contienen sitios de uni6n al epitopo sustancialmente similares. Los AcMs se pueden obtener por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495497 (1975); documento de Patente de EE.UU. nQ 4.376.110; Ausubel y col., compiladores, Harlow y Lane ANTIBO-DIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan y col., compiladores, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience N.Y. (1992-1996), los contenidos de cuyas referencias se incorporan totalmente en esta memoria como referencia. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produce un AcM de la presente invenci6n, se puede cultivar in vitro, in situ o in vivo. La producci6n de titulos elevados de AcMs in vivo o in situ, es el metodo actualmente preferido de producci6n.
Los anticuerpos quimericos son moleculas cuyas diferentes porciones se obtienen a partir de diferentes especies animales, tales como las que tienen la regi6n variable derivada de un AcM de murido y una regi6n constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quimericos se utilizan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicaci6n y para aumentar el rendimiento en la producci6n, por ejemplo, cuando los AcMs de murido tienen rendimientos superiores a partir de hibridomas, pero una inmunogenicidad mayor en los seres humanos, de tal manera que se utilizan AcMs quimericos humano/murido. Los anticuerpos quimericos y los metodos para su producci6n son conocidos en la tecnica (Cabilly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne y col., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly y col., documento de Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada el 14 de noviembre, 1984); Neuberger y col., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi y col., documento de Solicitud de Patente Europea 171496 (publicado el 19 de febrero, 1985); Morrison y col., documento de Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo, 1986); Neuberger y col., documento de Solicitud PCT WO 8601533, (publicada el 13 de marzo, 1986); Kudo y col., documento de Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de junio, 1986); Sahagan y col., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson y col., documento de Solicitud de Patente Internacional nQ WO8702671 (publicada el 7 de mayo, 1987); Liu y col., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better y col., Science 240:1041-1043 (1988); Riechmann y col., Nature 332:323-327 y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, supra. Estas referencias se incorporan totalmente en esta memoria como referencia.
"Anticuerpos totalmente humanizados" son moleculas que contienen tanto la regi6n variable como la constante de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos totalmente humanizados se pueden utilizar potencialmente para uso terapeutico, cuando se requieren tratamientos repetidos para enfermedades cr6nicas y recurrentes, tales como las enfermedades autoinmunes. Un metodo para la preparaci6n de anticuerpos totalmente humanos consiste en la "humanizaci6n" del sistema inmune humoral del rat6n, es decir, la producci6n de cepas de ratones capaces de producir Ig humana (Xeno-ratones), mediante la introducci6n de loci de la inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que se han inactivado los genes end6genos de Ig. Los loci de Ig son excesivamente complejos en terminos de su estructura fisica y del reordenamiento genico, y de los procesos de expresi6n requeridos para producir finalmente una respuesta inmune amplia. La diversidad de los anticuerpos se genera principalmente mediante una reorganizaci6n combinatoria entre diferentes genes V, D y J presentes en los loci de Ig. Estos loci tambien contienen los elementos reguladores intercalados, que controlan la expresi6n del anticuerpo, la exclusi6n alelica, el cambio de clase y la maduraci6n de la afinidad. La introducci6n de transgenes de Ig humana no reordenados en ratones, ha demostrado que la maquinaria de recombinaci6n del rat6n es compatible con los genes humanos. Ademas, los hibridomas que secretan hu-AcMs especificos del antigeno, en varios isotipos, se pueden obtener mediante la inmunizaci6n de los xenoratones con antigeno.
Anticuerpos totalmente humanizados y los metodos para su producci6n son conocidos en la tecnica (Mendez y col., Nature Genetics 15:146-156 (1997); Buggemann y col., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991); Tomizuka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 (2000) documento de Patente WO 98/24893.
Un anticuerpo monoclonal se dice que es "capaz de unirse" a una molecula, si es capaz de reaccionar especificamente con la molecula para unir de esta forma la molecula con el anticuerpo. El termino "epitopo" se entiende que se refiere a esa porci6n de cualquier molecula la cual puede ser fijada por un anticuerpo, la cual tambien puede ser reconocida por ese anticuerpo. Los epitopos o "determinantes antigenicos" consisten generalmente en agrupaciones de superficies quimicamente activas de moleculas, tales como aminoacidos o cadenas laterales de azucares y tienen caracteristicas estructurales tridimensionales especificas, asi como caracteristicas de carga especificas.
Se ha encontrado de acuerdo con la presente invenci6n, que la hepatectomia con hepatocitos que carecen de caspasa-8, desencadena eventualmente la inflamaci6n y, por tanto, que la funci6n de la caspasa-8 esta asociada a la inhibici6n de la inflamaci6n. Esta nueva funci6n de la caspasa-8 en la inflamaci6n no se podia predecir a partir de la literatura publicada, ya que de la caspasa-12 (Saleh y col., 2006) se habia descrito que inhibia mediadores inflamatorios, y de otras caspasas de mamiferos tales como las caspasas 1, 4, 5, 11 (Martinon y col., 2004) se habia descrito que catalizaban la generaci6n de mediadores de la inflamaci6n IL-1 e IL-18. Aunque se observ6 menos proliferaci6n celular en ratones carentes de caspasa-8, en comparaci6n con los miembros de la misma camada testigos que no carecen de caspasa-8, pocos dias despues de la resecci6n hepatica, mas tarde, el efecto de la carencia de caspasa-8 se invirti6, y los hepatocitos carentes de caspasa-8 mantuvieron la proliferaci6n. La proliferaci6n excesiva daba como resultado un higado anormalmente grande. Nuestros resultados indicaron que la proliferaci6n sostenida de los hepatocitos era una consecuencia de la inflamaci6n. En vista de estos hallazgos, la descripci6n tambien se refiere a la inducci6n o la mejora de la actividad/el nivel de la caspasa-8 para evitar o reducir la inflamaci6n en un tejido u 6rgano. El uso de la caspasa-8 como agente antiinflamatorio es ventajoso, pero no esta limitado a un tejido o un 6rgano que tenga celulas en las que el nivel o la actividad de la caspasa-8 esten disminuidos. Asi, al menos un agente seleccionado a partir de: (i) una caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal de la misma; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad la caspasa-8, se puede utilizar para tratar una enfermedad, un trastorno o un estado inflamatorio. Ejemplos de enfermedad, trastorno o estado inflamatorio incluyen, pero no se limitan a, la hepatitis, las enfermedades inflamatorias intestinales, la vasculitis, la inflamaci6n de las articulaciones, la sinusitis, la escleritis, la periodontitis, la cervicitis, la uveitis, la conjuntivitis, la vulvovaginitis, la alveolitis, la esofagitis, la glomerulonefritis aguda, la nefritis, la bronquitis aguda, la colecistitis aguda, la pancreatitis y la infecci6n del oido.
La contribuci6n de la funci6n de la caspasa-8 a la respuesta inmune en los hepatocitos, se determin6 mediante la comparaci6n de la recuperaci6n de la infecci6n en diferentes momentos especificos, despues de la inoculaci6n intravenosa de una dosis subletal de L. monocytogenes en ratones con hepatocitos carentes de caspasa-8 (GaspSFI-: Alb-Gre) con la de las miembros de la misma camada testigos (GaspSFI+: Alb-Gre). Se ha encontrado de acuerdo con la presente invenci6n, que la falta de caspasa-8 en hepatocitos atenuaba la resistencia de los ratones frente al agente pat6geno intracelular, Listeria monocytogenes.
El higado es el sitio principal para el aclaramiento de Listeria desde la circulaci6n y es tambien un sitio importante de persistencia de la infecci6n por Listeria. La detenci6n de la infecci6n depende en gran medida de la capacidad de las celulas del sistema inmune para destruir los hepatocitos infectados. Mientras que en las primeras etapas despues de la infecci6n, la ausencia de caspasa-8 en los hepatocitos parecia no tener efecto sobre el rendimiento de Listeria, en etapas posteriores de la infecci6n, los ratones con hepatocitos carentes de caspasa-8 muestran una infecci6n incrementada y persistente del higado. Sin estar relacionados con ninguna teoria sobre el mecanismo operativo o el modo de acci6n de la caspasa-8, nuestros hallazgos indican que la caspasa-8 puede ayudar a combatir la infecci6n, potenciando la destrucci6n de las celulas infectadas. Sin embargo, una contribuci6n de la caspasa-8 a otros mecanismos de defensa, no se puede excluir. Los resultados mostrados en esta memoria, junto con un informe reciente que muestra que la deleci6n de la caspasa-8 en hepatocitos, dota a estas celulas con una resistencia frente al efecto citot6xico del receptor Fas (Kang y col., 2004), plantean la posibilidad de que una infecci6n incrementada y persistente con el agente pat6geno intracelular en los hepatocitos carentes de caspasa-8, es debida a un fallo de los linfocitos T para eliminar los hepatocitos infectados a traves de Fas.
En general, utilizando un sistema de modelo animal ampliamente empleado para la exploraci6n de la defensa inmune contra agentes pat6genos intracelulares, se encontr6 de acuerdo con la invenci6n, que el nivel y/o la actividad de la caspasa-8 esta implicado en la defensa contra agentes pat6genos intracelulares en el higado y que un nivel y/o una actividad la caspasa creciente de la caspasa-8, se puede explotar para erradicar agentes pat6genos intracelulares. En una realizaci6n, un nivel y/o una actividad creciente de la caspasa-8, se puede utilizar para erradicar agentes pat6genos intracelulares de los hepatocitos en humanos.
Por tanto, otro aspecto de la descripci6n se refiere a la mejora o la inducci6n de la actividad y/o del nivel de la caspasa-8 en un mamifero, con el fin de reducir la infecci6n causada por un agente pat6geno intracelular. Algunos ejemplos de agentes pat6genos intracelulares incluyen, pero no se limitan a, Mycobacterium, Listeria, Leishmania, Legionella, Salmonella y virus (Steinert y col., 2002, y Gruenheid y Gros, 2002). Ejemplos de infecci6n con micobacterias incluyen, pero no se limitan a, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium y Mycobacterium lepraemurium.
El aumento o la inducci6n de la actividad y/o del nivel de la caspasa-8 se puede afectar empleando un agente seleccionado a partir de: (i) una caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal de la misma; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o la actividad de la caspasa-8 se puede utilizar para tratar una enfermedad, un trastorno o un estado inflamatorio.
La caspasa-8, muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente, se pueden administrar utilizando un vector de expresi6n que codifica y que es capaz de expresar la caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente.
La expresi6n "agente capaz de aumentar la expresi6n de una proteina" o "activador de una proteina" en el contexto de esta invenci6n, se refiere a cualquier agente o activador, tal como una proteina, nucle6tido, polinucle6tido y molecula pequena, capaz de aumentar dicho nivel y/o acci6n de la proteina.
Ejemplos de activadores de la caspasa-8 incluyen, pero no se limitan a, FADD, caspasas que pueden escindir la caspasa-8, tales como la caspasa-6 y la caspasa-3 e, indirectamente, varios receptores de muerte de la familia de TNF/NGF. Dependiendo de la configuraci6n celular exacta, cFLIP larga puede servir tambien como activador de la caspasa-8.
Tal y como se usa en esta memoria, el termino "muteinas" se refiere a analogos de una caspasa-8, en los que uno o varios de los residuos de aminoacidos de los componentes presentes en la naturaleza de la caspasa-8, se sustituyen por diferentes residuos de aminoacidos, o se eliminan, o uno o varios residuos de aminoacidos se anaden a la secuencia original de una caspasa-8, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes, en comparaci6n con la caspasa-8 original. Estas muteinas se preparan mediante tecnicas de sintesis conocidas y/o por tecnicas de mutagenesis dirigida al sitio, o por cualquier otra tecnica conocida adecuada para ello.
Las muteinas usadas de acuerdo con la presente invenci6n incluyen proteinas codificadas por un acido nucleico, tal como ADN o ARN, que se hibrida con ADN o ARN, que codifica una caspasa-8, de acuerdo con la presente invenci6n, bajo condiciones rigurosas. La expresi6n "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones de la hibridaci6n y de los lavados posteriores, a las que los expertos en la tecnica se refieren convencionalmente como "rigurosa". Vease Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, supra. Interscience, N.Y., parrafos 6.3 y 6.4 (1987, 1992), y Sambrook y col. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Sin limitaci6n alguna, los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen las condiciones de lavado de 12-20°C por debajo de la Tm calculada del hibrido en estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y SDS al 0,5% durante 5 minutos, 2 x SSC y SDS al 0,1% durante 15 minutos; 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 37°C durante 30-60 minutos y a continuaci6n, 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 68°C durante 30-60 minutos. Los expertos en esta tecnica entienden que las condiciones rigurosas tambien dependeran de la longitud de las secuencias de ADN, de las sondas de oligonucle6tidos (tales como 10-40 bases) o las sondas de oligonucle6tidos mixtas. Si se utilizan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametil-amonio (TMAC) en lugar de SSC. Vease Ausubel, supra.
Cualquier muteina tal tiene preferiblemente una secuencia de aminoacidos que repite suficientemente la de una caspasa-8, de modo que tiene una actividad sustancialmente similar, o incluso mejor, que la de la caspasa-8.
Una actividad caracteristica de la caspasa-8 es su actividad proteolitica en los sitios de sustratos especificos. Por lo tanto, se puede determinar si cualquier muteina dada tiene, al menos sustancialmente, la misma actividad que la caspasa-8, por medio de experimentaci6n de rutina. Siempre que el mutante tenga actividad proteolitica, se puede considerar que tiene una actividad sustancialmente similar a la de la caspasa-8.
Por lo tanto, se puede determinar si cualquier mutante dado tiene al menos sustancialmente la misma actividad que la caspasa-8, por medio de experimentaci6n de rutina que comprende someter a dicho mutante, p. ej., a un sustrato tal y como se describe en el ejemplo 3 del documento de Patente de EE.UU. 6.399.327.
En una realizaci6n preferida, cualquier muteina tal tiene al menos 40% de identidad u homologia con la secuencia de la caspasa-8. Mas preferiblemente, tiene al menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80% o, mas preferiblemente, al menos 90% de identidad o de homologia con la misma.
La identidad refleja una relaci6n entre dos o mas secuencias de polipeptidos, o dos o mas secuencias de polinucle6tidos, determinada comparando las secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucle6tido a nucle6tido o de aminoacido a aminoacido, de las dos secuencias de polinucle6tidos o de polipeptidos, respectivamente, a lo largo de las secuencias que se van a comparar.
Para secuencias en las que no hay una correspondencia exacta, se puede determinar un "% de identidad". En general, las dos secuencias que se van a comparar estan alineadas para proporcionar una correlaci6n maxima entre las secuencias. Esto puede incluir la inserci6n de "huecos" en una o en ambas secuencias, para mejorar el grado de alineaci6n. Un % de identidad se puede determinar a lo largo de toda la longitud de cada una de las secuencias que se comparan (denominada alineaci6n global), que es particularmente adecuada para secuencias de la misma longitud o muy similares, o mas cortas, longitudes definidas (denominada alineaci6n local), que es mas adecuada para secuencias de longitud desigual.
Los metodos para comparar la identidad y la homologia de dos o mas secuencias son bien conocidos en la tecnica. Asi, por ejemplo, programas disponibles en el "Wisconsin Sequence Analysis Package", versi6n 9.1 (Devereux, J. y col., 1984), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, se pueden utilizar para determinar el % de identidad entre dos polinucle6tidos y el % de identidad y el % de homologia entre dos secuencias de polipeptidos. BESTFIT utiliza el algoritmo de "homologia local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la regi6n aislada con mayor similitud entre dos secuencias. Otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias tambien son conocidos en la tecnica, por ejemplo, la familia BLAST de programas (Altschul SF y col., 1990, Altschul SF y col., 1997, accesible a traves de la pagina principal del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson WR, 1990; Pearson 1988).
Las muteinas de la caspasa-8, que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invenci6n, o el acido nucleico que las codifica, incluyen un conjunto finito de secuencias que se corresponden sustancialmente, como peptidoso polinucle6tidos de sustituci6n que pueden ser obtenidos habitualmente por un experto normal en la tecnica, sin una experimentaci6n indebida, basandose en las ensenanzas y las orientaciones presentadas en esta memoria.
Los cambios preferidos para las muteinas de acuerdo con la presente invenci6n, son lo que se conocen como sustituciones "conservadoras". Las sustituciones conservadoras de aminoacidos de la caspasa-8 pueden incluir aminoacidos sin6nimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisico-quimicas suficientemente similares que la sustituci6n entre los miembros del grupo conservaran la funci6n biol6gica de la molecula (Grantham, 1974). Es evidente que las inserciones y las deleciones de aminoacidos tambien se pueden hacer en las secuencias definidas anteriormente, sin alterar su funci6n, particularmente si las inserciones o las deleciones implican s6lo unos pocos aminoacidos, por ejemplo, menos de treinta y preferiblemente menos de diez, y no eliminan o desplazan aminoacidos que son esenciales para una conformaci6n funcional, por ejemplo, residuos de cisteina. Las proteinas y las muteinas producidas por esas deleciones y/o inserciones entran dentro del ambito de la presente invenci6n.
Preferiblemente, los grupos de aminoacidos sin6nimos son los definidos en la Tabla A. Mas preferiblemente, los grupos de aminoacidos sin6nimos son los definidos en la Tabla B; y lo mas preferible, los grupos de aminoacidos sin6nimos son los definidos en la Tabla C.
TABLA A TABLA B
Grupos preferidos de aminoacidos sin6nimos
Aminoacido
Grupo de sin6nimos
Ser
Ser, Thr, Gly, Asn
Arg
Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu
Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro
Gly, Ala, Thr, Pro
Thr
Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala
Gly, Thr, Pro, Ala
Val
Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly
Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile
Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe
Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr
Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys
Ser, Thr, Cys
His
Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln
Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn
Gln, Asp, Ser, Asn
Lys
Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp
Glu, Asn, Asp
Glu
Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met
Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp
Trp
Grupos mas preferidos de aminoacidos sin6nimos
Aminoacido
Grupo de sin6nimos
Ser
Ser
Arg
His, Lys, Arg
Leu
Leu, Ile, Phe, Met
Pro
Ala, Pro
Thr
Thr
Ala
Pro, Ala
Val
Val, Met, Ile
Gly
Gly
Ile
Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe
Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr
Phe, Tyr
Cys
Cys, Ser
His
His, Gln, Arg
Gln
Glu, Gln, His
Asn
Asp, Asn
Lys
Lys, Arg
Asp
Asp, Asn
Glu
Glu, Gln
Met
Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp
Trp
TABLA C
Grupos los mas preferidos de aminoacidos sin6nimos
Aminoacido
Grupo de sin6nimos
Ser
Ser
Arg
Arg
Leu
Leu, Ile, Met
Pro
Pro
Thr
Thr
Ala
Ala
Val
Val
Gly
Gly
Ile
Ile, Met, Leu
Phe
Phe
Tyr
Tyr
Cys
Cys, Ser
His
His
Gln
Gln
Asn
Asn
Lys
Lys
Asp
Asp
Glu
Glu
Met
Met, Ile, Leu
Trp
Met
Los ejemplos de producci6n de sustituciones de aminoacidos en proteinas que se pueden utilizar para la obtenci6n de muteinas de polipeptidos de caspasa-8, para uso en la presente invenci6n, incluyen cualquier etapa de metodos conocidos, tal y como se presentan en los documentos de patentes de EE.UU. nQ 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462 de Mark y col; 5.116,943 de Koths y col., 4.965.195 de Namen y col; 4.879.111 de Chong y col; y 5.017.691 de Lee y
10 col., y las proteinas sustituidas con lisina presentadas en el documento de patente de EE.UU. n° 4.904.584 (Shaw y col.).
La expresi6n "proteina fusionada" se refiere a un polipeptido que comprende una caspasa-8, o una muteina o un fragmento de la misma, fusionada con otra proteina, que tiene, por ejemplo, un tiempo de residencia prolongado en los fluidos corporales. Una caspasa-8 puede estar fusionada por lo tanto, por ejemplo, con una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.
"Derivados funcionales" tal y como se emplean en esta memoria, abarca los derivados de la caspasa-8, y sus muteinas y proteinas fusionadas, que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales que se encuentran como cadenas laterales sobre los residuos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la tecnica, y se incluyen en la invenci6n, siempre que permanezcan farmaceuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la proteina que es sustancialmente similar a la actividad de la caspasa-8, y que no confieran propiedades t6xicas a las composiciones que los contienen.
Estos derivados, por ejemplo, pueden incluir cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigenicos y extender la residencia de una caspasa-8 en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifaticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante reacci6n con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoacidos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroil-carbociclicos) o derivados O-acilicos de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de residuos de serilo o treonilo) formados con restos acilo.
Una "fracci6n activa" de acuerdo con la presente invenci6n, puede ser, por ejemplo, un fragmento de caspasa-8. El termino fragmento se refiere a cualquier subconjunto de la molecula, es decir, un peptido mas corto que conserva la actividad biol6gica deseada. Los fragmentos se pueden preparar facilmente eliminando aminoacidos de cada extremo de la molecula de caspasa-8 y sometiendo a ensayo el fragmento resultante para estudiar la actividad proteolitica. Las proteasas para eliminar un aminoacido a la vez, ya sea del extremo N-terminal o C-terminal de un polipeptido, se conocen y asi la determinaci6n de fragmentos que conservan la actividad biol6gica deseada, implica s6lo una experimentaci6n de rutina.
Como fracciones activas de una caspasa-8, muteinas y proteinas fusionadas de la misma, la presente invenci6n abarca ademas cualquier fragmento o precursores de la cadena polipeptidica de la molecula de proteina, aislado o junto con moleculas asociadas o residuos ligados al mismo, por ejemplo, residuos de azucar o fosfato, o agregados de la molecula de proteina o de los residuos de azucar por si mismos, siempre que dicha fracci6n tenga una actividad sustancialmente similar a la de la caspasa-8, p. ej., actividad proteolitica.
El termino "sales" en esta memoria se refiere a sales de grupos carboxilo y a sales por adici6n de acido de grupos amino de la molecula de caspasa-8 o de sus analogos. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la tecnica e incluyen sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, sales ferricas
o de cinc y similares, y sales con bases organicas, tales como las formadas, por ejemplo, con aminas, como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaina y similares. Las sales por adici6n de acido incluyen, por ejemplo, sales con acidos minerales, tales como, por ejemplo, acido clorhidrico o acido sulfurico, y sales con acidos organicos, tales como, por ejemplo, acido acetico o acido oxalico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales debe conservar la actividad biol6gica de la caspasa-8, por ejemplo, la actividad proteolitica.
Las "isoformas" de la caspasa-8 son proteinas capaces de tener actividad proteolitica o un fragmento de las mismas, que se puede producir por corte y empalme alternativo o por un sitio alternativo de inicio de la traducci6n.
La expresi6n "derivados permutados circularmente" tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a una molecula lineal en la que los extremos se han unido entre si, ya sea directamente o a traves de un enlazador, para producir una molecula circular, y a continuaci6n la molecula circular se abre en otro lugar para producir una nueva molecula lineal con extremos diferentes de los extremos de la molecula original. Las permutaciones circulares incluyen aquellas moleculas cuya estructura es equivalente a una molecula que se ha circularizado y despues abierto. De este modo, una molecula permutada circularmente se puede sintetizar de nuevo como una molecula lineal y no tener que realizar nunca una etapa de circularizaci6n y apertura. La preparaci6n de derivados permutados circularmente se describe en el documento WO95/27732.
Algunas sustancias de acuerdo con la invenci6n, tales como peptidos, proteinas y oligonucle6tidos, requieren su introducci6n en las celulas de un organismo vivo. Para este fin, se desea mejorar la permeabilidad de la membrana de los peptidos, las proteinas y los oligonucle6tidos. La derivatizaci6n con estructuras lip6filas se puede utilizar en la creaci6n de peptidos y proteinas con una mayor permeabilidad de la membrana. Por ejemplo, la secuencia de un peptido membranotr6fico conocido, tal y como se senal6 anteriormente, se puede anadir a la secuencia del peptido o de la proteina. Ademas, el peptido o la proteina se pueden derivatizar mediante estructuras parcialmente lip6filas, tales como las cadenas de hidrocarburos mencionadas anteriormente, que estan sustituidas con al menos un grupo polar o cargado. Por ejemplo, los derivados lauroilo de peptidos, han sido descritos por Muranishi y col., 1991. Otras modificaciones de los peptidos y las proteinas comprenden la oxidaci6n de residuos de metionina para crear de este modo grupos sulf6xido, tal y como describen Zacharia y col., 1991. Zacharia y sus colaboradores tambien describen peptidos o derivados en los que el enlace peptidico relativamente hidr6fobo se sustituye por su cetometilen isoester (COCH2). Estas y otras modificaciones conocidas por una persona experta en la tecnica quimica de proteinas y de peptidos, mejoran la permeabilidad de la membrana.
Otra forma de mejorar la permeabilidad de la membrana es el uso de receptores, tales como receptores viricos, en las superficies celulares con el fin de inducir la captaci6n celular del peptido o la proteina. Este mecanismo lo utilizan frecuentemente los virus, que se unen especificamente a ciertas moleculas de la superficie celular. Despues de la uni6n, la celula lleva el virus a su interior. La molecula de la superficie celular se denomina un receptor virico. Por ejemplo, las moleculas de integrina CAR y AdV han sido descritas como receptores viricos para adenovirus, ver Hemmi y col., 1998, y las referencias en la misma. Las moleculas CD4, GPR1, GPR15 y STRL33 han sido identificados como receptores/correceptores para el VIH, vease Edinger y col., 1998 y las referencias en la misma.
Asi, el conjugar peptidos, proteinas u oligonucle6tidos con moleculas de las que es conocido que se unen a receptores de la superficie celular, aumentara la permeabilidad de la membrana de dichos peptidos, proteinas u oligonucle6tidos. Ejemplos de grupos adecuados para formar conjugados son azucares, vitaminas, hormonas, citocinas, transferrina, asialoglicoproteina y moleculas similares. Low y col., en el documento de Patente de EE.UU. n° 5.108.921, describen el uso de estas moleculas con el fin de mejorar la permeabilidad de la membrana de peptidos, proteinas y oligonucle6tidos, y la preparaci6n de dichos conjugados. Low y colaboradores muestran ademas que moleculas tales como folato o biotina, se pueden utilizar para dirigir el conjugado hacia una multitud de celulas diana en un organismo, debido a la expresi6n prolifica e inespecifica de los receptores para estas moleculas.
El uso anterior de proteinas de la superficie celular para mejorar la permeabilidad de la membrana de un peptido, proteina u oligonucle6tido de la invenci6n, tambien se puede ser emplear para dirigir dicho peptido, proteina u oligonucle6tido de la invenci6n hacia ciertos tipos de celulas o tejidos diana. Wang y col., 1998, describen el uso de folato para dirigir a la diana de celulas cancerosas, y Zhang y col., 1998, describen la abundancia relativa de cada uno de los otros antigenos indicados anteriormente en diversos tipos de cancer y en celulas normales.
Las proteinas, peptidos y secuencias no codificantes de la invenci6n se pueden introducir en celulas mediante el uso de un vector virico. El uso del vector de vaccinia para este prop6sito se detalla en el capitulo 16 de "Current Protocols in Molecular Biology". El uso de vectores de adenovirus ha sido descrito, por ejemplo, por Teoh y col., 1998, Narumi y col., 1998, Pedersen y col., 1998, Guang-Lin y col., 1998, y sus referencias, Nishida y col., 1998, Schwarzenberger y col 1998 y Cao y col., 1998. La transferencia retrovirica de secuencias no codificantes ha sido descrita por Daniel y col., 1998.
Cuando los virus se utilizan como vectores, las proteinas viricas de superficie se utilizan generalmente para dirigir el virus. Como muchos virus, tales como el adenovirus anterior, son bastante inespecificos en su tropismo celular, puede ser deseable impartir una mayor especificidad, empleando un tipo celular o un promotor especifico de tejido. Griscelli y col., 1998 describe el uso del promotor de la cadena 2 ligera de miosina cardiaca, especifico de ventriculo, para dirigir de forma especifica del coraz6n hacia un gen diana cuya transferencia esta mediada por adenovirus.
Alternativamente, el vector virico se puede disenar con ingenieria genetica para expresar una proteina adicional sobre su superficie, o la proteina de superficie del vector virico se puede modificar para incorporar una secuencia peptidica deseada. El vector virico se puede disenar con ingenieria genetica, por lo tanto, para expresar uno o varios epitopos adicionales, que se pueden utilizar para dirigir dicho vector virico hacia una diana. Por ejemplo, epitopos de citocinas, peptidos que se unen a la clase II del MHC, o epitopos obtenidos a partir de moleculas de reclutamiento, se pueden utilizar para dirigir el vector virico hacia una diana, de acuerdo con las ensenanzas de la invenci6n.
Es una ventaja dirigir las sustancias activas de acuerdo con la invenci6n hacia los hepatocitos diana. Dirigir sustancias activas hacia los hepatocitos diana se puede realizar asociando las sustancias activas a compuestos o ligandos que se unen a los hepatocitos y son internalizados por los mismos, por ejemplo, ligandos que reaccionan con el receptor de asialoproteinas (ASGPr) [Groman y col., 1994; Rogers y Kornfeld 1971; Fiume y col., 1997], [Wu y col.,
2002, Wu y col., 2004] y el ligando T7 (documento de Patente de EE.UU nQ 7.071.163).
Los resultados de acuerdo con la presente descripci6n preparan el camino para disenar composiciones farmaceuticas que comprenden una sustancia activa capaz de regular el nivel y/o la actividad de la caspasa-8, en combinaci6n con al menos un vehiculo aceptable para facilitar la cicatrizaci6n de heridas, el tratamiento de una inflamaci6n y el tratamiento de una infecci6n causada por un agente pat6geno intracelular.
La presente invenci6n proporciona composiciones farmaceuticas que incluyen sustancias activas de acuerdo con la invenci6n y un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas pueden comprender en el caso de inflamaci6n o de infecci6n, por lo menos uno de los siguientes agentes o sustancias de la invenci6n: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal de la misma, (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8 y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de las actividades de la caspasa-8. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas pueden comprender, en el caso de cicatrizaci6n de heridas, los siguientes agentes o sustancias de la invenci6n: un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invenci6n tambien son adecuadas en el tratamiento de insuficiencia hepatica, consecutiva a una hepatectomia. Asi, la composici6n farmaceutica de acuerdo con la invenci6n se puede administrar al donante de un trasplante de higado o a los pacientes, despues de una hepatectomia, con el fin
de impedir el establecimiento o el progreso de una insuficiencia hepatica, facilitando y acelerando la curaci6n de la lesi6n. La composici6n farmaceutica de acuerdo con la invenci6n, puede comprender un inhibidor de la caspasa-8 y un agente antiinflamatorio, por ejemplo, para el tratamiento de una lesi6n hepatica. Sujetos especificos que se van a tratar con la composici6n de la invenci6n incluyen, pero no se limitan a, pacientes en los que se ha resecado parcialmente una porci6n del higado lesionado, debido a enfermedades hepaticas, tales como la hepatitis, la cirrosis hepatica alcoh6lica, enfermedades viricas, farmacos o de causa desconocida, o cancer hepatico y donantes sanos en los que se ha realizado una resecci6n parcial del higado para trasplante.
La composici6n farmaceutica de acuerdo con la presente invenci6n, incluye una cantidad suficiente de sustancia(s) de acuerdo con la invenci6n para conseguir el fin deseado. Ademas, las composiciones farmaceuticas pueden contener vehiculos adecuados farmaceuticamente aceptables, que comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente y que pueden estabilizar tales preparaciones para su administraci6n al paciente que lo requiera, que tambien son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
Las sustancias de acuerdo con la invenci6n se pueden administrar a un paciente que las requiera, en una variedad de maneras. Las vias de administraci6n incluyen la via intrahepatica, intradermica, transdermica (por ejemplo, en formulaciones de liberaci6n lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, oral, epidural, t6pica e intranasal. Ademas, la sustancia se puede administrar junto con otros componentes de agentes biol6gicamente activos, tales como agentes tensioactivos, excipientes, soportes, diluyentes y vehiculos farmaceuticamente aceptables.
La dosificaci6n administrada a un individuo, en forma de dosis unica o multiple, variara dependiendo de una variedad de factores, que incluyen las propiedades farmacocineticas de la sustancia, la via de administraci6n, el estado y las caracteristicas del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamano), la extensi6n de los sintomas, los tratamientos simultaneos, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulaci6n de los intervalos de dosificaci6n establecidos estan al alcance de la capacidad de los expertos.
La definici6n de "farmaceuticamente aceptable" abarca cualquier soporte que no interfiere con la eficacia de la actividad biol6gica del ingrediente activo y que no es t6xico para el hospedador al que se administra. Por ejemplo, para la administraci6n por via parenteral, la sustancia de acuerdo con la invenci6n se puede formular en una forma de dosificaci6n unitaria para inyecci6n en vehiculos tales como soluci6n salina, soluci6n de dextrosa, seroalbumina y soluci6n de Ringer.
Una "cantidad terapeuticamente efectiva" es una que cuando se administra, dichas sustancias de la invenci6n inducen un efecto beneficioso sobre la inflamaci6n, la infecci6n con agentes pat6genos intracelulares y la cicatrizaci6n de heridas. La dosificaci6n administrada, como dosis unica o multiple, a un individuo puede variar dependiendo de una variedad de factores, que incluyen la via de administraci6n, el estado y las caracteristicas del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamano), la extensi6n de los sintomas, los tratamientos simultaneos, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulaci6n de los intervalos de dosificaci6n establecidos estan al alcance de los expertos en la tecnica.
Los compuestos a los que se refiere la invenci6n, se pueden preparar para su administraci6n a traves de cualquier via coherente con sus propiedades farmacocineticas.
La sustancia o el ingrediente activo tambien se pueden administrar parenteralmente en un medio esteril. Dependiendo del vehiculo y de la concentraci6n utilizada, el farmaco puede estar suspendido o disuelto en el vehiculo.
El termino "dosificaci6n" se refiere a la determinaci6n y la regulaci6n de la frecuencia y del numero de dosis.
El hacer referencia a etapas de metodos conocidos, etapas de metodos convencionales, metodos conocidos o metodos convencionales, no es en ningun modo una admisi6n de que cualquier aspecto, descripci6n o realizaci6n de la presente invenci6n este descrito, ilustrado o se haya sugerido en la tecnica pertinente.
Habiendo descrito ahora la invenci6n, se comprendera mas facilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustraci6n y no pretenden limitar la presente invenci6n.
Algunos de los ejemplos se han incluido solo a modo de referencia.
Ejemplos
Material y metodos
(i) Cepas de rat6n. Las cepas de ratones portadoras de un alelo de la caspasa-8 desactivado (CASP8-/+) (Varfolomeev y col., 1998), o un alelo condicional de la caspasa-8 (CASP8F/-) (Kang y col., 2004.), asi como Cre que se expresa en ratones bajo el control del promotor de la albumina especifico del higado (Alb-Cre) (Kellendonk y col., 2000) y su uso para la deleci6n del gen de la caspasa-8 especificamente en hepatocitos (Kang y col., 2004), se han descrito anteriormente. Los experimentos relacionados con la infecci6n con Listeria se llevaron a cabo con ratones de origen C57B1/6 puro, obtenidos mediante 11 retrocruzamientos con ratones de esa cepa. Los experimentos pre
sentados en relaci6n a la regeneraci6n del higado despues de la PHx, se realizaron con ratones de origen genetico mixto original y origen C57B1/6 puro, tal y como se ha indicado. Todos los ratones se mantuvieron en una instalaci6n especifica, exenta de agentes pat6genos. Los ratones se manejaron segun los criterios establecidos en la "Guia para el Cuidado y el Uso de Animales de Laboratorio", preparada por la Academia Nacional de Ciencias y publicada por los Institutos Nacionales de Salud. Todos los experimentos fueron aprobados por el comite etico institucional para el cuidado de animales.
(ii) Infecci6n con Listeria monocytogenes y cuantificaci6n. A los ratones se les inyect6 por via intravenosa 2 x 103 unidades formadoras de placas de Listeria monocytogenes (cepa 10403S) y se sacrificaron despues en diferentes momentos especificos. Sus higados y bazos se extirparon y se pesaron. Las porciones de los higados y los bazos se pesaron y se homogeneizaron por separado en 1% de Triton X-100 en soluci6n salina tamponada con fosfato (PBS). Se extendieron en placas diluciones x10 en serie, del material homogeneizado de los 6rganos, sobre agar para infusi6n de cerebro coraz6n. El numero de unidades formadoras de colonias por 6rgano se determin6 despues de la incubaci6n de las placas de agar a 37°C durante 24 horas. Las partes restantes de los bazos e higados se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra, durante 24 a 48 horas. A continuaci6n, los tejidos se cortaron, se procesaron de manera rutinaria en parafina y se tineron con hematoxilina y eosina (H&E) o con anticuerpos anti-Ki67 (DakoCytonation, Glostrup, Dinamarca).
(iii) Hepatectomia parcial y administraci6n de cloruro de gadolinio. Ratones GASPSFI-: Alb-Gre de la misma edad y ratones GASPSFI+: Alb-Gre fueron ligeramente anestesiados con 10 mg/g de peso corporal de xilazina administrada por via intraperitoneal (i.p.) (Chanelle Pharmaceuticals Manufacturing, Loughrea, Galway, Irlanda) y 450 mg/g de peso corporal de ketamina (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Se realiz6 "un tercio" (30%) de PHx mediante escisi6n del l6bulo medio del higado, y "dos tercios" (70%) de PHx por escisi6n de los l6bulos medio, izquierdo y derecho superiores, tal y como se ha descrito (Higgins y col., 1931 y Greene y col., 2003). Se tomaron imagenes de los ratones antes y despues de la PHx, los dias 0-56 (cada dos dias durante la primera semana y semanalmente a partir de entonces). Los dias 10 y 12 despues de la PHx, a los ratones se les inyect6 i.p. cloruro de gadolinio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en soluci6n salina con una dosificaci6n de 10 mg/kg.
(iv) Tecnica de anmlisis por resonancia magnetica. Los experimentos de formaci6n de imagenes por resonancia magnetica (IRM), se realizaron con un espectr6metro horizontal de Biospec 4.7T (Bruker Medical, Ettlingen, Alemania) con una bobina de jaula de 4,2 cm. Los ratones fueron anestesiados (con pentobarbital 30 mg/kg, i.p.) y en posici6n supina con el higado situado en el centro de la bobina. El volumen hepatico se determin6 mediante imagenes multicorte, coronales y axiales con eco de espin, con ponderaci6n en T1 (tiempo de repetici6n = 400 ms; tiempo de eco = 18 ms; grosor del corte = 1 mm). En resumen, el borde del higado visualizado en cada sector se traz6 empleando un programa de procesamiento de imagenes (NIH Image). Para convertir el numero de pixeles del higado en un area, multiplicamos por el factor [(campo de visi6n)2/(matriz)2]. El volumen total del higado se calcul6 como el area sumada de todos los cortes, multiplicado por el grosor del corte. Para cada rat6n, el volumen del higado se expres6 como un porcentaje del volumen del higado preoperatorio.
La perfusi6n hepatica y la hemodinamica se evaluaron a partir de imagenes de eco en gradiente con ponderaci6n en T2* (tiempo de repetici6n = 100 ms; tiempo de eco = 10 ms; campo de visi6n = 3,4 cm; grosor del corte = 1,2 mm) adquiridas mientras que el rat6n estaba respirando aire, aire y CO2 (95% de aire, 5% de CO2) y carb6geno (95% de O2, 5% de CO2), tal y como se ha descrito previamente (Abramovitch y col., 1998 y 1999). Para cada mezcla de gases, se obtuvieron cinco repeticiones.
Los datos hemodinamicos de la resonancia magnetica fueron analizados en un ordenador PC empleando el programa IDL (Research Systems, Boulder, CO). Los mapas de los valores de intensidad de la senal media
obtenidos para cada pixel durante la inhalaci6n de los diferentes gases (Saire, Sco2 y So2) se calcularon a partir del promedio de cuatro valores para cada gas (valores obtenidos cuando se desecharon cambios de gas). El porcentaje de cambio en la intensidad de la senal de la resonancia magnetica inducida por hipercapnia (LSco2) y por hiperoxia (LSo2), se calcul6 de acuerdo con las siguientes ecuaciones:
Los resultados se expresan como media ± SD. Los valores promedio se calcularon a partir de las regiones de interes en n ratones, tal y como se ha indicado, y a partir de tres cortes por rat6n.
(v)Cmlculo del volumen de la zona isquemica. Rodeando el area diseccionada, una zona anormal que manifestaba una intensidad de la senal superior a la del tejido hepatico sano, era detectable por resonancia magnetica. Esta area se denomin6 "zona isquemica" y se determinaron sus limites y su volumen. El volumen en cada rat6n se calcul6 como la suma de las areas con intensidad de senal elevada en todos los cortes, multiplicada por el espesor del corte. El volumen de la zona isquemica se calcul6 como un porcentaje del volumen del higado pre-PHx, los dias 2 y 4 post-PHx.
(vi) Anmlisis Estadistico. Las diferencias entre los grupos se identificaron por la prueba T de Student independiente. Un valor de P <0,05 fue considerado estadisticamente significativo.
(vii) Histologia e inmunotinci6n. Los higados se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones de 4 Im y se tineron con H&E. Para detectar las celulas que expresaban la caspasa-3 procesada, las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron con anticuerpo de conejo anticaspasa-3 escindida de rat6n (Asp 175) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuaci6n se tineron las secciones con anticuerpo anti-rat6n con peroxidasa biotinilada (Dako EnVision + System, Glostrup, Dinamarca).
Para detectar las celulas que expresaban Ki67, las secciones del higado en parafina se desparafinaron, se rehidrataron y se desnaturalizaron durante 10 minutos con acido citrico 10 mM hirviendo (pH 6,0). Se permiti6 que se enfriaran a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego se lavaron tres veces en PBS. Despues de un tratamiento durante 5 minutos en 3% de H2O2, los portaobjetos se incubaron durante una noche a 4°C con anticuerpos de rata anti-Ki67 de rat6n, diluidos 1:100 en CAS-Block (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). A continuaci6n, se lavaron tres veces con PBS, se incubaron durante 1 hora con polimero de inmunoperoxidasa anti-rata (Nichirei Biosciences, Tokio, Jap6n), y se revelaron con 3,3'-diaminobencidina (Sigma-Aldrich) durante 10 minutos.
Las celulas que expresaban F4/80 se detectaron de manera similar, utilizando anticuerpo de rata anti-F4/80 de rat6n (Serotec Oxford, Reino Unido), excepto que para la recuperaci6n de los antigenos, las secciones de parafina se trataron durante 3 minutos a temperatura ambiente con una soluci6n que contenia Tris 20 mM (pH 7,5), 0,1% de tripsina y 0,1% de cloruro de calcio. El contenido en macr6fagos de los higados se determin6 mediante la cuantificaci6n de las areas positivas para F4/80 en los portaobjetos, empleando el programa de ImageJ 1.37r.
La bromodesoxiuridina (BrdU) se inyect6 i.p. 3 horas antes de que se sacrificaran los ratones, y se detect6 con la ayuda de un equipo de reactivos de Amersham para la proliferaci6n celular (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para la detecci6n inmunohistoquimica del transductor de la fosfosenal y del activador de la transcripci6n de la proteina 3 (p-STAT 3, una proteina de senalizaci6n activada durante la inflamaci6n), las secciones de parafina se desparafinaron, se rehidrataron, se incubaron durante 10 minutos en per6xido de hidr6geno al 3% para mitigar la peroxidasa end6gena, y despues se sometieron a una recuperaci6n del antigeno mediante ebullici6n durante 15 minutos en EDTA 1 mM (pH 8,0). Despues, los portaobjetos se lavaron tres veces con TBS + 0,5% de Tween 20 (TBST) y se incubaron durante una noche a 4°C con anticuerpo de conejo anti-p-STAT 3 de rat6n (Tyr705) (Cell Signaling Technology, 1:500). Despues de una serie de lavados en TBST, se incubaron en anticuerpo secundario biotinilado de cabra anti-conejo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). El anticuerpo unido se detect6 empleando el sistema TSA Biotina (Perkin Elmer, Boston, MA). La inmunorreactividad se visualiz6 despues de incubar durante 5-10 minutos con sustrato crom6geno de sensibilidad elevada de 3-amino-9-etilcarbazol (Dako).
(viii) Anmlisis de tipo Western. En distintos momentos especificos despues de la PHx, el tejido hepatico se separ6, se congel6 inmediatamente en nitr6geno liquido y se almacen6 a -80°C hasta su uso. Muestras de 0,3 mg de tejido congelado se pesaron y se homogeneizaron en tamp6n de homogeneizaci6n [�-glicerofosfato 50 mM, pH 7,3, EGTA 1,5 mM, EDTA 1 mM y ditiotreitol 1 mM que contenia una mezcla completa de inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania)], se fraccionaron sobre geles al 10% de dodecilsulfato s6dico y poliacrilamida, se transfirieron a nitrocelulosa y se incubaron durante una noche a 4°C con anticuerpo de conejo anti-ciclina A de rat6n, anticuerpo de conejo anti-fosfo STAT-3 de rat6n (ambos de Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo de conejo anticiclina E de rat6n (Upstate, Chicago, IL), anticuerpo de conejo anti-fosfo-Rb de rat6n (Cell Signaling Technology), anticuerpo monoclonal de rata anti-caspasa-8 de rat6n (1G12, donado amablemente por los Drs. A. Strasser y L.A. O'Reilly, WEHI, Melbourne, Australia), o anticuerpo monoclonal anti-�-actina (Sigma). Esto fue seguido por una incubaci6n con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), diluido 1:5000. Las bandas especificas se visualizaron por quimioluminiscencia.
Ejemplo 1. Deleci6n de la caspasa-B en hepatocitos compromete la resistencia a la infecci6n con Listeria.
El higado es un sitio principal para la replicaci6n de L. monocytogenes, una bacteria Gram positiva que invade el citoplasma de las celulas eucariotas y se multiplica en el mismo. La erradicaci6n de este agente pat6geno del higado despues de una infecci6n experimental de ratones, se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar los mecanismos de defensa inmune contra agentes pat6genos intracelulares (Wing y col., 2002). Para examinar la contribuci6n de la funci6n de la caspasa 8 a la respuesta inmune en los hepatocitos, se compar6 la recuperaci6n de la infecci6n en diferentes momentos especificos, despues de la inoculaci6n intravenosa de una dosis subletal de L. monocytogenes, en ratones con hepatocitos carentes de caspasa-8 (GASPSFI-: Alb-Gre) con los miembros de la misma camada testigos (GASPSFI+: Alb-Gre).
Un dia despues de la infecci6n, la carga bacteriana en los 6rganos de los ratones GASPSFI-: Alb-Gre, era similar a la de las crias normales testigo. Sin embargo, el 6Q dia, los titulos de bacterias, tanto en el higado como en el bazo de los ratones GASPSFI-: Alb-Gre, eran 10 a 100 veces superiores que en los testigos (Fig. 1A, B). Para el 14Q dia, el agente pat6geno habia sido totalmente eliminado del higado y del bazo de los ratones testigos, mientras que los titu
los en los higados de los ratones GASPSFI-: Alb-Gre, seguian siendo elevados (Fig. 1C). La infecci6n prolongada dio lugar a una inflamaci6n (Fig. 1D, E) y al desarrollo de lesiones necr6ticas en el higado (Fig.1F, G), asi como un aumento de la proliferaci6n de los hepatocitos (Fig. 1H, I). El 6Q dia despues de la infecci6n, habian muerto aproximadamente el 15% de los ratones GASPSFI-: Alb-Gre pero ninguno de los ratones testigos.
Ejemplo 2. Efectos de la falta de caspasa-B en hepatocitos sobre la recuperaci6n de una PHx: atenuaci6n de la respuesta temprana de crecimiento. Para evaluar la contribuci6n de la caspasa-8 a la recuperaci6n tisular de una lesi6n, se determin6 el efecto de la deleci6n de la caspasa-8 en hepatocitos, sobre la regeneraci6n hepatica despues de una PHx. En consonancia con informes anteriores, se encontr6 que la PHx provoca una explosi6n de la proliferaci6n de hepatocitos (revisado en Fausto y col., 2006). Sin embargo, en los higados de ratones GASPSFI-: Alb-Gre, la proliferaci6n y tambien la inducci6n de varios cambios moleculares asociados con la transici6n G1/S (incremento de la expresi6n de ciclina A, D y E, y la fosforilaci6n de la proteina del retinoblastoma) se produjeron en un grado significativamente menor que en las crias naturales testigos (Fig. 2). Esta disminuci6n se observ6 despues de 1/3 de PHx, asi como despues de 2/3 de PHx, lo que conduce a una sintesis de ADN mas intensa y mejor sincronizada y a una progresi6n mas eficaz a traves del ciclo celular (Mitchell y col., 2005 19). Debido a que la mortalidad durante las primeras horas despues de la resecci6n, era significativamente mas elevada despues de 2/3 de PHx, todos los analisis posteriores de los efectos de la falta de caspasa-8, se limitaron a la recuperaci6n de los ratones de 1/3 de PHx.
Ejemplo 3. Efectos de la falta de caspasa-B en hepatocitos sobre la recuperaci6n de PHx: Recuperaci6n mejorada del sitio de la lesi6n isquemica. El control estricto del crecimiento celular in vivo se manifiesta de forma impresionante por la capacidad del higado para mantener su tamano normal y la recuperaci6n precisa de su tamano original, despues de la disecci6n (Diehl 2000, y Michalopoulos y DeFrances, 1997). Sin embargo, en diversos estados patol6gicos, este control falla, dando como resultado un agrandamiento anormal (hepatomegalia) (Adachi y col., 1995, Anders y col., 2005 y Zimmer y col., 2003). A fin de determinar el efecto de la falta de caspasa-8 sobre la recuperaci6n del higado despues de la PHx, se vigilaron los cambios en el volumen hepatico mediante el uso de resonancia magnetica. Antes de la hepatectomia, el volumen promedio del higado en los ratones GASPSFI-: Alb-Gre era identico al de los ratones GASPSFI+: Alb-Gre (datos no presentados). Sin embargo, despues de la PHx, los dos grupos diferian significativamente en sus cineticas de crecimiento hepatico (Fig. 3C). En la resonancia magnetica con eco de espin, con ponderaci6n en T1, dos regiones se distinguian en los higados hepatectomizados: el sitio de la lesi6n isquemica que se habia generado como consecuencia de la disecci6n, y que con analisis histol6gico se encontr6 que contenia tejido necrosado, asi como celulas apopt6ticas (Fig. 3E), cuyo tamano disminuia gradualmente durante la regeneraci6n; y el resto del higado, que aument6 de tamano para compensar la perdida del tejido diseccionado. La disminuci6n del tamano en el sitio de la lesi6n isquemica en los ratones GASPSFI-: Alb-Gre, era significativamente mas rapida que en los ratones testigos (Fig. 3A-C), lo que sugiere que la ausencia de caspasa-8 en los hepatocitos promueve la curaci6n rapida o la adsorci6n del tejido en ese sitio.
Ejemplo 4. Efectos de la carencia de caspasa-B en hepatocitos sobre la recuperaci6n de PHx: proliferaci6n tardia persistente de los hepatocitos. Sorprendentemente, aunque la respuesta proliferativa inicial de los hepatocitos carentes de caspasa-8 era mas suave que la de los hepatocitos normales, el aumento de tamano en el resto del higado en los ratones GASPSFI-: Alb-Gre, no era mas lento que en las miembros de la misma camada testigos, pero significativamente mas rapido. Ademas, mientras que el higado de los ratones testigos dej6 de crecer una vez que alcanz6 su tamano original, el tamano eventual del higado en los ratones GASPSFI-: Alb-Gre era significativamente mayor que el normal (Fig. 3D), alcanzando un 120% del tamano que tenia antes de la PHx.
Al determinar la proliferaci6n de los hepatocitos en una etapa posterior despues de la hepatectomia, se encontr6 que mientras que la proliferaci6n celular de ratones testigos en el higado habia desaparecido despues de la explosi6n inicial, la proliferaci6n de hepatocitos en los ratones GASPSFI-: Alb-Gre persistia durante varias semanas despues de la disecci6n; por lo que eventualmente, a pesar de su supresi6n inicial, excedia significativamente a la de los ratones normales (Fig. 2A paneles inferiores y 2B). Un incremento similar tardio y persistente posterior a la PHx, se observ6 en los niveles de ciclina A y E (Fig. 2D) en los hepatocitos.
Ejemplo 5. Efectos de la falta de caspasa-B en hepatocitos sobre la recuperaci6n de PHx: una respuesta inflamatoria cr6nica. La presente observaci6n de que los hepatocitos GASPSFI-: Alb-Gre continuaron proliferando mucho tiempo despues de la PHx, parece ser compatible con el tamano en continuo aumento del higado en estos ratones, en una etapa tardia despues de la hepatectomia. Sin embargo, el hecho de que este incremento mas rapido del volumen ya era perceptible pocos dias despues de la hepatectomia (Fig. 3D), cuando la tasa de proliferaci6n de los hepatocitos que carecian de caspasa-8 era todavia inferior a la normal, sugiri6 que otros factores adicionales contribuyen tambien a esta diferencia.
Un protocolo de resonancia magnetica funcional combinado con hipercapnia e hiperoxia, proporciona una medida sensible de las alteraciones de la perfusi6n y hemodinamicas que son el resultado de una variedad de cambios patol6gicos (Barash y col., 2006). En este estudio, en los ratones testigos, a la PHx sigui6 una disminuci6n tanto en LSco2 como en LSo2, lo que refleja una disminuci6n de la vascularizaci6n hepatica y del contenido en sangre. Por otro lado, en los higados de ratones GASPSFI-: Alb-Gre, 4 dias despues de la PHx, ambos parametros se incrementaron (Fig. 4), como resultado de un aumento del volumen sanguineo y del flujo. Tal incremento se encontr6 que tenia lugar asociado con un estado inflamatorio (Barash H, datos no publicados). El analisis histol6gico revel6 de hecho una acumulaci6n masiva de leucocitos en los higados de los ratones GASPSFI-: Alb-Gre hepatectomizados, que es indicativa de inflamaci6n. La tinci6n con el anticuerpo anti-F4/80 indic6 que los leucocitos que se acumulan son macr6fagos (Fig. 5A, B). El analisis de transferencia tipo Western revel6 un aumento significativo de STAT-3 fosforilada, una proteina de senalizaci6n activada durante la inflamaci6n, en los higados de los ratones GASPSFI-: Alb-Gre (Fig. 5C).
Tal y como se ha mencionado anteriormente, la inflamaci6n y la proliferaci6n incrementada de hepatocitos en los ratones GASPSFI-: Alb-Gre, tambien se observ6 despues de su infecci6n con L. monocytogenes (Fig. 1D, E, H, I). Nuestros ratones se mantuvieron en una instalaci6n especifica exenta de agentes pat6genos, sin embargo, en vista de este efecto de la infecci6n con Listeria, se trat6 de excluir aun mas la posibilidad de que la inflamaci6n y el crecimiento incrementado del higado observados despues de la PHx, pudieran reflejar el efecto de algun agente pat6geno que hubiera pasado desapercibido. En consecuencia, los experimentos se repitieron con ratones que se rederivaron mediante secci6n por cesarea, se colocaron en madres adoptivas gnotobi6ticas, y despues se mantuvieron en un aislador exento de germenes. Se encontr6 que la hepatectomia parcial de estos ratones rederivatizados iniciaba el mismo estado inflamatorio cr6nico que el observado antes de rederivatizar (datos no presentados).
Ejemplo �. Efectos de la falta de caspasa-B en hepatocitos sobre la recuperaci6n de una hepatectomia parcial: la proliferaci6n persistente tardia de los hepatocitos se produce como consecuencia de la respuesta inflamatoria cr6nica. El analisis histol6gico comparativo de diferentes secciones de los higados de ratones GASPSFI-: Alb-Gre hepatectomizados, durante el periodo de proliferaci6n persistente de los hepatocitos, describia esa variaci6n entre secciones en la medida de la correlaci6n del crecimiento celular con el numero de macr6fagos que se acumulaban en las regiones correspondientes (Fig. 5B), lo que sugiere que la proliferaci6n de hepatocitos y el estado inflamatorio del higado estan relacionados causalmente. Para examinar mas a fondo esta relaci6n, a los ratones se les inyect6 cloruro de gadolinio, un agente que induce una disminuci6n transitoria de las celulas de Kupffer (Canbay y col., 2003), los dias 10 y 12 despues de la PHx, el momento en el que la inflamaci6n alcanza su punto maximo. Tal y como se muestra en la Fig. 5B (panel inferior) y la Fig. 6, ademas de disminuir sustancialmente las celulas inflamatorias que se habian acumulado en el higado GASPSFI-: Alb-Gre, este tratamiento tambien eliminaba practicamente el aumento de la proliferaci6n de hepatocitos en estos ratones. Ademas, el aumento excesivo del tamano de sus higados (probablemente debido en parte a un aumento relacionado con la inflamaci6n, en el volumen y flujo sanguineos y en la cantidad de celulas de Kupffer, y debido en parte a un aumento del numero de hepatocitos que se produce principalmente en ese momento) era reducido. Estos resultados indican que el crecimiento constitutivo de los hepatocitos en ratones GASPSFI-: Alb-Gre en una etapa tardia despues de la hepatectomia, es una consecuencia de la persistencia de la inflamaci6n que se produce en sus higados.
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Ademas, la presente descripci6n se refiere a los siguientes puntos:
1.
Uso de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8, en la fabricaci6n de un medicamento para evitar y/o tratar la inflamaci6n de un tejido u 6rgano, excepto la piel.
2.
El uso de acuerdo con el punto 1, en donde el nivel y/o la actividad de la caspasa-8 se reduce en las celulas del tejido u 6rgano.
3.
El uso de acuerdo con el punto 1 o 2, en donde la inflamaci6n se desarrolla despues de la lesi6n del tejido u 6rgano.
4.
El uso de acuerdo con el punto 3, en el que una lesi6n se produce por la resecci6n de un tejido u 6rgano.
5.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que el 6rgano es el higado y el nivel y/o la actividad de la caspasa-8 se reducen en los hepatocitos.
6.
El uso de acuerdo con el punto 1, para el tratamiento y/o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o estado inflamatorio seleccionado entre hepatitis, enfermedades inflamatorias intestinales, vasculitis, inflamaci6n de las articulaciones, sinusitis, escleritis, periodontitis, cervicitis, uveitis, conjuntivitis, vulvovaginitis, alveolitis, esofagitis, glomerulonefritis aguda, nefritis, bronquitis aguda, colecistitis aguda, pancreatitis e infecci6n del oido.
7.
Uso de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8, en la fabricaci6n de un medicamento para evitar y/o tratar la inflamaci6n de un tejido u 6rgano, excepto la piel, en donde la inflamaci6n se manifiesta en un tejido u 6rgano que comprende celulas comprendidas en las que se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8, y en donde la inflamaci6n se desarrolla despues de una lesi6n de dicho 6rgano o tejido.
8.
Uso de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8, en la fabricaci6n de un medicamento para tratar una infecci6n causada por un agente pat6geno intracelular.
9.
El uso de acuerdo con el punto 8, en el que el agente pat6geno intracelular se selecciona entre Micobacteria, Listeria, Leishmania, Legionella, Salmonella y virus.
10.
El uso de acuerdo con el punto 8, en el que la infecci6n se desarrolla en un 6rgano o tejido que comprende celulas en las que se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8.
11.
El uso de acuerdo con el punto 10, en el que el 6rgano es el higado.
12.
El uso de acuerdo con el punto 10 o 11, en donde las celulas son hepatocitos.
13.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8 a 12, en donde la infecci6n esta causada por Listeria.
14.
El uso de acuerdo con el punto 13, en el que la Listeria es Listeria monocytogenes.
15.
El uso de acuerdo con el punto 9, en donde el agente pat6geno intracelular es un virus.
16.
El uso de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8, en la fabricaci6n de un medicamento para tratar una infecci6n causada por un agente pat6geno intracelular, en donde se desarrolla una infecci6n en un 6rgano o tejido que comprende celulas en las que se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8.
17.
Uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 en la fabricaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la curaci6n de un tejido o un 6rgano herido o lesionado.
18.
El uso de acuerdo con el punto 17, en donde la herida o la lesi6n se desarrollan despues de una resecci6n de un tejido o un 6rgano.
19.
El uso de acuerdo con el punto 18, en el que el 6rgano es el higado.
20.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 17 a 19, en el que la herida o la lesi6n se desarrollan despues de un traumatismo fisico seleccionado entre una operaci6n quirurgica, una mordedura, un accidente deportivo, un accidente, una resecci6n de un tejido o un 6rgano y una amputaci6n.
21.
El uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 en la fabricaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la cicatrizaci6n de heridas en un higado lesionado.
22.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 17 a 21, en el que el inhibidor de la caspasa-8 se selecciona a partir de un ARNm no codificante, un ARN pequeno de interferencia, un anticuerpo especifico de la caspasa-8 y una molecula pequena inhibidora.
23.
El uso de acuerdo con el punto 22, en donde la molecula pequena inhibidora tiene un peso molecular de 100 a
5.000 dalton.
24.
El uso de acuerdo con el punto 23, en el que la molecula pequena inhibidora es Z-IETD-FMK.
25.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 17 a 24, en el que el inhibidor de la caspasa-8 se utiliza desde varias horas hasta aproximadamente 1, 2, 3 dias y no mas de 4 dias.
26.
Uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 en combinaci6n con un inhibidor de la inflamaci6n, en la fabricaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la curaci6n de un higado lesionado.
27.
El uso de acuerdo con el punto 25, en donde se desarrolla una lesi6n despues de una resecci6n hepatica.
28.
El uso de acuerdo con el punto 26 o 27, en donde se hace una resecci6n de 1/3 del higado.
29.
El uso de acuerdo con el punto 26 o 27, en el que se hace una resecci6n de 2/3 del higado.
30.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 26 a 29, en el que el inhibidor de la caspasa-8 se selecciona a partir de un ARNm no codificante especifico de la caspasa-8, un ARN pequeno de interferencia especifico de la caspasa-8, un anticuerpo anti-caspasa-8 y una molecula pequena inhibidora de la caspasa-8.
31.
El uso de acuerdo con el punto 30, en donde la molecula pequena inhibidora tiene un peso molecular de 100 a
5.000 dalton.
32.
El uso de acuerdo con el punto 31, en donde la molecula pequena inhibidora es Z-IETD-FMK.
33.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 26 a 32, en el que el inhibidor de la inflamaci6n es un agente capaz de inhibir las celulas inmunes.
34.
El uso de acuerdo con el punto 33, en el que las celulas inmunes son macr6fagos.
35.
El uso de acuerdo con el punto 34, en el que los macr6fagos son celulas de Kupffer.
36.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 26 a 35, en el que el inhibidor de la inflamaci6n se administra despues del inhibidor de la caspasa-8.
37.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 26 a 35, en el que el inhibidor de la inflamaci6n se administra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y/o 12 dias despues de la resecci6n del higado.
38.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 26 a 37, en donde la caspasa-8 se administra durante un
periodo no inferior a 4 dias, hasta 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 dias, y hasta 1 mes despues de la resecci6n del higado.
39.
El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 26 a 38, en el que el inhibidor de la inflamaci6n comprende cloruro de gadolinio.
40.
Un metodo para evitar y/o tratar la inflamaci6n de un tejido u 6rgano, excepto la piel, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o la actividad de la caspasa-8.
41.
El metodo de acuerdo con el punto 40, en el que se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8 en las celulas del tejido u 6rgano.
42.
El metodo de acuerdo con el punto 40 o 41, en donde se desarrolla una inflamaci6n despues de una lesi6n del tejido u 6rgano.
43.
El metodo de acuerdo con el punto 42, en el que se causa una lesi6n por la resecci6n de un tejido u 6rgano.
44.
El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 40 a 42, en el que el 6rgano es el higado y se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8 en los hepatocitos.
45.
El metodo de acuerdo con el punto 44, para el tratamiento y/o la prevenci6n de una enfermedad, trastorno o estado inflamatorio, seleccionado entre hepatitis, enfermedades inflamatorias intestinales, vasculitis, inflamaci6n de las articulaciones, sinusitis, escleritis, periodontitis, cervicitis, uveitis, conjuntivitis, vulvovaginitis, alveolitis, esofagitis, glomerulonefritis aguda, nefritis, bronquitis aguda, colecistitis aguda, pancreatitis e infecci6n del oido.
46.
Un metodo para evitar y/o tratar la inflamaci6n de un tejido u 6rgano, excepto la piel, en donde la inflamaci6n se manifiesta en un tejido u 6rgano que tiene celulas en las que se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8, y en donde la inflamaci6n se desarrolla despues de la lesi6n de dicho tejido u 6rgano, que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8.
47.
Un metodo para tratar una infecci6n causada por un agente pat6geno intracelular que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8.
48.
El metodo de acuerdo con el punto 47, en el que el agente pat6geno intracelular se selecciona entre Micobacteria, Listeria, Leishmania, Legionella, Salmonella y virus.
49.
El metodo de acuerdo con el punto 46, en donde se desarrolla una infecci6n en un 6rgano o tejido que comprende celulas en las que se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8.
50.
El metodo de acuerdo con el punto 47, en el que el 6rgano es el higado.
51.
El metodo de acuerdo con el punto 47 o 48, en donde las celulas son hepatocitos.
52.
El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 46 a 49, en donde la infecci6n esta causada por Listeria.
53.
El metodo de acuerdo con el punto 52, en el que la Listeria es Listeria monocytogenes.
54.
El metodo de acuerdo con el punto 47 o 48, en el que el agente pat6geno intracelular es un virus.
55.
Un metodo para tratar una infecci6n causada por un agente pat6geno intracelular, en donde la infecci6n se desarrolla en un 6rgano o un tejido que tiene celulas en las que se disminuye el nivel y/o la actividad de la caspasa-8, que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, derivado permutado circularmente o una sal del mismo; (ii) un agente capaz de aumentar el nivel y/o la actividad de la caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8.
56.
Un metodo para facilitar o acelerar la curaci6n de un tejido o un 6rgano herido o lesionado que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8.
57.
El metodo de acuerdo con el punto 56, en el que la herida o la lesi6n se desarrolla despues de un traumatismo fisico, seleccionado entre una operaci6n quirurgica, una mordedura, un accidente deportivo, un accidente, una resecci6n de un tejido o un 6rgano y una amputaci6n.
58. El metodo de acuerdo con el punto 57, en el que la herida o la lesi6n se desarrolla despues de la resecci6n de 5 un tejido o un 6rgano.
59.
El metodo de acuerdo con el punto 58, en el que el 6rgano es el higado.
60.
Un metodo para facilitar o acelerar la cicatrizaci6n en un higado lesionado que comprende administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8.
10 61. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 56 a 60, en el que el inhibidor de la caspasa-8 se selecciona a partir de un ARNm no codificante especifico de la caspasa-8, un ARN pequeno de interferencia especifico de la caspasa-8, un anticuerpo especifico de la caspasa-8 y una molecula pequena inhibidora de la caspasa-8.
62. El metodo de acuerdo con el punto 61, en donde la molecula pequena inhibidora de la caspasa-8 tiene un peso molecular de 100 a 5.000 dalton.
15 63. El metodo de acuerdo con el punto 61, en el que la molecula pequena inhibidora de la caspasa-8 es Z-IETD-FMK.
64. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 56 a 63, en el que el inhibidor de la caspasa-8 se administra durante varias horas hasta aproximadamente 1, 2, 3 dias y no mas de 4 dias.

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 en la fabricaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la curaci6n de un higado herido o lesionado, en donde la herida o la lesi6n se desarrolla despues de una resecci6n hepatica.
  2. 2.
    Un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 para uso con el fin de facilitar o acelerar la curaci6n de un higado herido o lesionado, en donde la herida o la lesi6n se desarrollan despues de una resecci6n hepatica, opcionalmente junto con un inhibidor de la inflamaci6n, preferentemente para la administraci6n de este ultimo despues de la administraci6n del inhibidor de la caspasa-8.
  3. 3.
    El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o el inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en donde la herida o la lesi6n se desarrolla despues de un traumatismo fisico seleccionado entre una operaci6n quirurgica, una mordedura, un accidente deportivo, un accidente, una resecci6n de un tejido o un 6rgano y una amputaci6n.
  4. 4.
    El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o 3 o el inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 2 o 3, en donde el inhibidor de la caspasa-8 se selecciona a partir de un ARNm no codificante, un ARN pequeno de interferencia, un anticuerpo especifico de la caspasa-8 y una molecula pequena inhibidora.
  5. 5.
    El uso o el inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en donde la molecula pequena inhibidora tiene un peso molecular de 100 a 5.000 dalton.
  6. 6.
    El uso o el inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 5, en donde la molecula pequena inhibidora es Z-IETD-FMK.
  7. 7.
    El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 6 o el inhibidor para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el inhibidor de la caspasa-8 se utiliza durante varias horas hasta aproximadamente 1, 2, 3 dias y no mas de 4 dias.
  8. 8.
    Uso de un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 en combinaci6n con un inhibidor de la inflamaci6n en la fabricaci6n de un medicamento para facilitar o acelerar la curaci6n de un higado lesionado, en donde la herida o la lesi6n se desarrollan despues de la resecci6n del higado, opcionalmente administrando el inhibidor de la inflamaci6n despues de la administraci6n del inhibidor de la caspasa-8.
  9. 9.
    Composici6n que comprende un inhibidor del nivel y/o de la actividad de la caspasa-8 y un inhibidor de la inflamaci6n para uso con el fin de facilitar o acelerar la curaci6n de un higado lesionado, en donde la herida o la lesi6n se desarrolla despues de la resecci6n del higado, opcionalmente administrando el inhibidor de la inflamaci6n despues de la administraci6n del inhibidor de la caspasa-8.
  10. 10.
    El uso de acuerdo con la reivindicaci6n 8 o la composici6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en donde se realiza una resecci6n de 1/3 o 2/3 del higado.
  11. 11.
    El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 10 o la composici6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en donde el inhibidor de la caspasa-8 se selecciona a partir de un ARNm no codificante especifico de la caspasa-8, un ARN pequeno de interferencia especifico de la caspasa-8, un anticuerpo anti-caspasa-8 y una molecula pequena inhibidora de la caspasa-8.
  12. 12.
    El uso o la composici6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 11, en donde la molecula pequena inhibidora tiene un peso molecular de 100 a 5.000 dalton.
  13. 13.
    El uso o la composici6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 12, en donde la molecula pequena inhibidora es Z-IETD-FMK.
  14. 14.
    El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o la composici6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde el inhibidor de la inflamaci6n es un agente capaz de inhibir celulas inmunes.
  15. 15.
    El uso o la composici6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 14, en donde las celulas inmunes son macr6fagos.
  16. 16.
    El uso o la composici6n para uso de acuerdo con la reivindicaci6n 15, en donde los macr6fagos son celulas de Kupffer.
  17. 17.
    El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 10 a 16, o la composici6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, en donde el inhibidor de la inflamaci6n se administra los dias 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y/o 12 dias despues de la resecci6n del higado.
  18. 18.
    El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, el uso de acuerdo con
    una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 10 a 17 o la composici6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en donde el inhibidor de la caspasa-8 se administra durante no menos de 4 dias, hasta 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 dias, y hasta 1 mes despues de la resecci6n del higado.
  19. 19.
    El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 10 a 18 o la composici6n para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en donde el inhibidor de la inflamaci6n comprende cloruro de gadolinio.
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