ES2381917T3

ES2381917T3 - Plantas de algodón tolerantes al estrés

Info

Publication number: ES2381917T3
Application number: ES05798484T
Authority: ES
Inventors: Michel Van Thournout; Arlette Reynaerts; John Jacobs
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2004-10-29
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2012-06-01
Anticipated expiration: 2025-10-27
Also published as: US8053636B2; WO2006045633A1; EP1807519A1; CN101090971A; MX2007005166A; ATE543907T1; AU2005298784A1; ZA200704247B; BRPI0518249A2; US20090013431A1; EP1807519B1; AU2005298784B2; CN101090971B

Abstract

Un método para producir una planta de algodón que es apta para resistir una sequía sin penalización sobre el rendimiento, que comprende las operaciones de a) introducir un gen quimérico en una célula de algodón, para generar una célula de algodón transgénico, comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos 5 de ADN engarzados operativamente: i) un promotor expresable en plantas: ii) una región de ADN transcribible que comprende (1) una primera región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de un gen parp2 o de un ADNc de parp2 procedente de una especie de algodón en la que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20; (2) una segunda región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre dicha primera región de ADN; en donde dicha primera región de ADN y dicha segunda región de ADN están en una orientación de repetición invertida una con respecto a la otra y en donde una molécula de ARN transcrito a partir de dicha reacción transcribible es capaz de formar una región de ARN de doble hebra entre una región de ARN transcrita a partir de dicha primera región de ADN y una región de ARN transcrita a partir de dicha segunda región de ADN; y iii) una región de ADN que comprende una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación, que es funcional en plantas;: b) regenerar dicha célula de algodón transgénico para obtener una planta de algodón transgénico; y c) identificar una planta de algodón transgénico que tiene una aptitud aumentada para resistir a condiciones de estrés por sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento en comparación con una planta de algodón no transformada.

Description

Plantas de algodón tolerantes al estrés.

El siguiente invento se refiere a unas plantas de algodón modificadas que tienen una mayor aptitud que las plantas de algodón no modificadas de contrapartida para resistir una sequía sin condiciones que afecten al rendimiento particularmente condiciones de estrés abiótico, tales como, pero sin limitarse a, temperaturas bajas o altas, sequía, altas intensidades de luz, contaminación química, inundación, alta salinidad, altas intensidades de luz o alta irradiación con rayos UV (ultravioleta). Tales plantas de algodón se pueden obtener disminuyendo la expresión del (de los) gen(es) parp2 de algodón endógenos, particularmente en condiciones de estrés por sequía.

Descripción de la técnica relacionada

Una poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), también conocida como poli(ADP-ribosa) transferasa (ADPRT) (EC 2.4.2.30), es una enzima nuclear que se halla en la mayor parte de los eucariotas, incluyendo a vertebrados, artrópodos, moluscos, mohos mucilaginosos, dinoflagelados, hongos y otros eucariotas de orden bajo con la excepción de las levaduras. La actividad enzimática ha sido demostrada también en un cierto número de plantas (Payne y colaboradores, 1976; Willmitzer y Wagner, 1982; Chen y colaboradores, 1994; O’Farrell, 1995).

Una PARP cataliza la transferencia de un residuo de ADP-ribosa que se deriva de NAD+, principalmente al grupo carboxilo de un residuo de ácido glutámico en la proteína diana, y una subsiguiente polimerización de la ADP-ribosa. La principal proteína diana es una PARP propiamente dicha, pero también se ha mostrado que están sujetas a esta modificación las histonas, las proteínas cromosómicas con un grupo de alta movilidad, una topoisomerasa, endonucleasas y polimerasas de ADN.

La proteína PARP procedente de animales es una proteína nuclear de 113-120 kDa, abundante en la mayor parte de los tipos de células, que consiste en tres grupos funcionales principales: un dominio de fijación de ADN terminal de amino que contiene dos dominios de dedos de Zn, un dominio catalítico terminal de carboxi y un dominio interno que está auto-modificado (de Murcia y Ménissier de Murcia, 1994; Kameshita y colaboradores, 1984; Lindahl y colaboradores, 1995). La actividad enzimática in vitro es aumentada en gran manera después de una fijación a roturas de una sola hebra en un ADN. La actividad in vivo es inducida por unas condiciones que dan como resultado eventualmente roturas de ADN (Álvarez-González y Althaus, 1989; Ikejima y colaboradores 1990). La automodificación del dominio central sirve aparentemente como una regulación de la retroalimentación negativa de una PARP.

La actividad de una PARP en células de plantas se demostró por primera vez examinando la incorporación de 3H procedente de NAD+ marcado dentro de los núcleos de células de puntas de raíz (Payne y colaboradores, 1976; Willmitzer y Wagner, 1982). La actividad enzimática fue también purificada parcialmente a partir de plántulas de maíz y se encontró que está asociada con una proteína con una masa molecular aparente de 113 kDa, sugiriendo que la PARP de plantas puede ser similar a la enzima procedente de animales (Chen y colaboradores, 1994; O’Farrell, 1995).

Chen y colaboradores, (1994) han informado sobre una actividad de una PARP en núcleos de maíz y han asociado a esta actividad enzimática con la presencia de una proteína de aproximadamente 114 kDa presente en un extracto de núcleos de maíz.

O’ Farrel (1995) informó que una amplificación por RT-PCR (= reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) en un ARN aislado a partir de maíz (usando unos cebadores degenerados basados en las secuencias conservadas de manera sumamente alta) daba como resultado un fragmento de 300 pb (pares de bases), mostrando una identidad de un 60 % al nivel de los aminoácidos con la proteína PARP humana.

Lepiniec y colaboradores (1995) han aislado y clonado un ADNc de plena longitud a partir de Arabidopsis thaliana que codifica una proteína de 72 kDa con una alta similaridad con el dominio catalítico de una PARP de vertebrado. El dominio terminal de N de la proteína no revela ninguna similaridad de secuencias con el correspondiente dominio de una PARP procedente de vertebrados, pero se compone de cuatro tramos de aminoácidos (denominados A1, A2, B y C) que muestran una similaridad con el terminal de N de un cierto número de proteínas nucleares y de fijación de ADN. La estructura secundaria predicha de A1 y A2 era una estructura de hélice-bucle-hélice.

Mahajan y Zuo (1998) describieron la purificación y la clonación del ADNc (cromosomal) de una polimerasa de poli(ADP)-ribosa de maíz. La enzima es un único polipéptido de aproximadamente 115 kD (980 aminoácidos), codificado por un cuadro de lectura abierto de 2.943 pb. La secuencia deducida de aminoácidos muestra una identidad de un 40 a 42 % y una similaridad de aproximadamente un 50 % con las conocidas secuencias de las PARP de vertebrados. Las características de la estructura modular de la molécula de una PARP, tales como dos dedos de zinc, una señal de localización nuclear putativa, el dominio de auto-modificación, y el dominio de fijación de NAD+, se conservan en la enzima de maíz.

Babiychuk y colaboradores (1998) describieron que dos homólogos de una poli(ADP-ribosa) polimerasa se encontraron en plantas, la clásica polimerasa que contiene dedos de Zn y las proteínas PARP no clásicas estructuralmente, que carecen del característico dominio de dedo de Zn en el terminal de N.

La nomenclatura actual se refiere a las clásicas polimerasas que contienen dedos de Zn tales como las proteínas PARP1 (y los correspondientes genes parp1) mientras que las proteínas PARP no clásicas estructuralmente se mencionan a actualmente como PARP2 (y los correspondientes genes parp2).

Se podrían identificar las siguientes entradas en bases de datos que identifican secuencias demostradas y putativas de proteínas de poli(ADP-ribosa) polimerasa, partes de las mismas o secuencias homólogas: BAD53855 (Oryza sativa); BAD52929 (Oryza sativa); XP_477671 (Oryza sativa); BAC84104 (Oryza sativa); AAT25850 (Zea mays); AAT25849 (Zea mays); NP_197639 (Arabidopsis thaliana); NP_850165 (Arabidopsis thaliana); NP_188107 (Arabidopsis thaliana); NP_850586 (Arabidopsis thaliana); BAB09119 (Arabidopsis thaliana); AAD20677 (Arabidopsis thaliana); Q11207 (Arabidopsis thaliana); C84719 (Arabidopsis thaliana); T51353 (Arabidopsis thaliana); T01311 (Arabidopsis thaliana); AAN12901 (Arabidopsis thaliana); AAM13882 (Arabidopsis thaliana); CAB80732 (Arabidopsis thaliana); CAA10482 (Arabidopsis thaliana); AAC79704 (Zea mays): AAC19283 (Arabidopsis thaliana); CAA10888 (Zea mays); CAA10889 (Zea mays); y CAA88288 (Arabidopsis thaliana).

Amor y colaboradores, (1998) describieron la implicación de una PARP en la respuesta a un estrés oxidativo en plantas. Los autores mostraron que en células de soja cultivada, una PARP está implicada en respuestas a estreses abióticos suaves y severos, mediando en la reparación de los ADN y en procesos de muerte celular programada, respectivamente.

El documento de solicitud de patente internacional WO99/37789 describe composiciones y métodos para influir el estado metabólico de células de plantas. Las composiciones comprenden genes de poli(ADP-ribosa) polimerasas y porciones de los mismos, particularmente el gen de una poli(ADP-ribosa) polimerasa de maíz así como secuencias de nucleótidos antisentido para genes de poli(ADP-ribosa) polimerasas. Las secuencias de nucleótidos encuentran uso en la transformación de células de plantas con el fin de alterar el estado metabólico de las plantas y las células de plantas transformadas.

El documento WO 00/04173 describe medios y métodos para modular una muerte celular programada (PCD = acrónimo de programmed cell death) en células y organismos eucarióticos, particularmente en células de plantas y plantas, por introducción de genes quiméricos que modulan una PCD, influyendo sobre la expresión y/o la actividad aparente de genes de una poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) endógena. La muerte celular programada puede ser inhibida o provocada. El invento se refiere particularmente al uso de secuencias de nucleótidos que codifican proteínas con la actividad de una PARP para modular una PCD, para intensificar la velocidad o tasa de crecimiento

o para producir células y organismos tolerantes al estrés.

La técnica anterior, por lo tanto, sigue siendo deficiente en la provisión de genes de PARP de algodón específicos, que sean útiles en la modificación de genes de PARP endógenos de algodón para obtener plantas de algodón que sean capaces de resistir una sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento.

Sumario del invento

En un aspecto del invento, se describe un método para producir una planta de algodón que es apta para resistir una sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento, que comprende las etapas de introducir un gen quimérico en una célula de algodón, para generar una célula de algodón transgénico, comprendiendo el gen quimérico, engarzado operativamente, un promotor expresable en plantas; una región de ADN transcribible que comprende una primera región de ADN que a su vez comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados a partir de la secuencia de nucleótidos un gen parp2 o de un ADNc de parp2 procedente de una especie de algodón o de una especie relacionada con una especie progenitora de algodón; una segunda región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 ó 50 ó 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la primera región de ADN; con lo que la primera región de ADN y la segunda región de ADN están en orientación de repetición invertida una con respecto a la otra, y en la que una molécula de ARN transcrita a partir de la región transcribible es capaz de formar una región de ARN de doble hebra situada entre una región de ARN transcrita a partir de la primera región de ADN y una región de ARN transcrita a partir de la segunda región de ADN; y una región de ADN que comprende una señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación que es funcional en plantas; regenerar la célula de algodón transgénico para obtener una planta de algodón transgénico, e identificar una planta de algodón transgénico que tiene una aptitud aumentada para resistir una sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento. La secuencia de nucleótidos del gen parp2 o del ADNc del parp2 puede comprender la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.:18, SEQ ID No.19 o SEQ ID No. 20 o una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.:21 o SEQ ID No.:22.

Con los objetos, ventajas y características precedentes y otros/as del invento, que resultarán evidentes en el presente texto a continuación, la naturaleza del invento se puede entender con mayor claridad haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de diferentes formas de realización del invento, y de las reivindicaciones y las Figuras adjuntas.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 es una representación esquemática del pTMT01, un vector de ADN T que comprende un gen quimérico, que después de una transcripción proporciona una molécula de ARN de doble hebra capaz de reducir la expresión de genes de PARP2 de algodón. Se usan las siguientes abreviaturas: LB: borde izquierdo del ADN T; 3’nos: señal de terminación de la transcripción y de poliadenilación procedente del gen de la nopalina sintasa del ADN T de A. tumefaciens; 2mepsps: proteína de 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa doble mutante procedente de maíz; TPotpC: péptido de tránsito; PcsvmvX, Y, Z: las partes primera, segunda y tercera del promotor del virus del mosaico de venas de Cassava; P35S2: promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor; parp2Gh: parte de la secuencia de nucleótidos de un parp2 de algodón; Pdk-intron: intrón 2 procedente del intrón pdk de Flaveria trinervia; OCS-terminator: señal de la terminación de la transcripción y de poliadenilación procedente del gen de la octopina sintasa del ADN T de A. tumefaciens: RB: borde derecho del ADN T; fragmento de NPTI: porción del gen de resistencia a antibióticos nptI; ORI ColE1: origen de replicación del plásmido ColE1; ORI pVS1: origen de replicación del replicón de pVS1.

La Figura 2: Representación gráfica del ensayo de germinación en frío. Para cada suceso transgénico (identificado por el número en el eje de las X y por el modelo patrón) se indica el porcentaje de plántulas que germinan a 16ºC para las poblaciones segregadas homocigóticas (H) y acigóticas (h).

La Figura 3: representación gráfica de la conductividad del medio después de una incubación en la presencia de diferentes concentraciones de paraquat para plantas de algodón testigos (+) o para linajes de algodon transgenico que comprenden una construcción artificial silenciosa de un parp2 (.).

La Figura 4 es una alineación de las diversas secuencias de aminoácidos obtenidas para un parp2 procedente de algodón. GV1: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) codificada por la variante uno de ADN genómico (SEQ ID NO: 19); cADN: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) codificada por un ADNc; GV2: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) codificada por la variante dos de ADN genómico (SEQ ID NO: 20).

Descripción detallada de diferentes formas de realización del invento

El presente invento está basado en el hallazgo de que los genes parp2 de algodón o los ADNc de parp2 de algodón son excelentes secuencias de nucleótidos de fuentes para obtener plantas de algodón que son aptas para resistir una sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento por modificación de la actividad de gen(es) parp2 de algodón endógeno(s).

En una forma de realización, el invento se refiere a un método para obtener una planta de algodón que es apta para resistir una sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento por reducción de la expresión del gen parp2 endógeno en células de una planta de algodón, por producción de una planta transgénica que comprende un gen quimérico capaz de producir un ARN de doble hebra (”dsRNA” = acrónimo de double stranded RNA) en el que las hebras de ARN complementarias de dicha molécula de dsRNA constituyen una parte de la secuencia de nucleótidos de un gen parp2 o de un ADNc de parp2 obtenido a partir de una especie de algodón o de una especie relacionada con una especie progenitora de algodón o de una parte de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína PARP2 procedente de una especie de algodón o de una especie relacionada con una especie progenitora de algodón.

El concepto de “algodón”, tal como se usa en el presente contexto, incluye la especie alotetraploide Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense (alopolidiploides del genoma AD) y las especies diploides Gossypium arboreum y Gossypium herbaceum (diploides del genoma A). Las especies de Gossypium relacionadas con especies progenitoras de algodón son Gossypium raimondii, Gossypium trilobum y Gossypium gossypioides (diploides del genoma D).

Un gen parp2 o un ADNc de parp2 obtenido a partir de una especie de algodón o a partir de una especie relacionada con una especie progenitora de algodón, se refiere al gen parp2 que se presenta de modo natural en esa especie o al ADNc correspondiente al ARNm (mensajero) del gen parp2 que aparece de modo natural en esa especie. Similarmente, una proteína PARP2 obtenida a partir de una especie de algodón o a partir de una especie relacionada con una progenitora de algodón se refiere a la proteína tal como aparece de modo natural en esa especie.

Ejemplos de secuencias de nucleótidos de algodón o relacionadas con especies progenitoras de algodón de parp2 incluyen aquellas que comprenden la secuencia de nucleótidos que se expone en una cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20. Otros ejemplos de dichas secuencias de algodón de parp2 incluyen las secuencias de nucleótidos que codifican un gen de PARP2 de algodón que comprende p.ej. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 13 o de SEQ ID No.: 21 o de SEQ ID No.:22.

Sin embargo, resultará inmediatamente evidente para una persona experta en la especialidad que las secuencias de nucleótidos dadas como ejemplos, o partes de las mismas, se pueden usar para identificar adicionales genes parp2

o ADNc’s de parp2 en otras plantas de algodón, en variedades de algodón distintas de la Cooker312 o en plantas relacionadas con especies progenitoras de algodón, y que dichas secuencias de nucleótidos o dichas partes de las mismas se pueden usar también p.ej. para aumentar la tolerancia al estrés en plantas de algodón. Las secuencias de nucleótidos dadas como ejemplos se podrían usar para seleccionar:

i) un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 13 para su uso como una sonda;

ii) un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20 para su uso como una sonda;

iii) un fragmento de ADN o un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que consiste en entre 20 y 1.382 nucleótidos consecutivos seleccionados entre una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 13 para su uso como una sonda;

iv) un fragmento de ADN o un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que consiste en entre 20 y 2.000 nucleótidos consecutivos seleccionados entre una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nos: 21 o 22 para su uso como una sonda;

v) un fragmento de ADN o un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que consiste en entre 20 y 2.000 nucleótidos consecutivos seleccionados entre una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20 para su uso como una sonda;

vi) una secuencia de oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende entre 20 y 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 13, para su uso como un cebador en una reacción PCR.

vii) una secuencia de oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende entre 20 y 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nos: 21 o 22 para su uso como un cebador en una reacción PCR;

viii) una secuencia de oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende entre 20 y 200 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20 para su uso como un cebador en una reacción PCR; o

ix) una secuencia de oligonucleótidos que tiene la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3 , SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 16 o SEQ ID No.: 17 para su uso como un cebador en una reacción PCR.

x) un fragmento que puede ser amplificado a partir del ADN genómico o ADNc de algodón usando como cebadores un oligonucleótido como se describe en los apartados vi, vii, viii o ix, tal como un fragmento que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No.: 18 para su uso como una sonda.

Por realización de una PCR usando un ADN genómico o ADNc procedente de especies y variedades de algodón o plantas relacionadas con una especie progenitora de algodón y los mencionados oligonucleótidos como cebadores o realizando una hibridación, preferiblemente en condiciones rigurosas entre un ADN genómico o un ADNc procedente de especies y variedades de algodón o plantas relacionadas con una especie progenitora de algodón y las mencionadas sondas, se pueden identificar y/o aislar dichos otros genes parp2 o ADNc de parp2 o fragmentos de los mismos. Resultará evidente que para las finalidades de obtener unas plantas de algodón que sean aptas para resistir una sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento, puede no requerirse identificar la secuencia de nucleótidos real del fragmento de ADN aislado. Sin embargo, opcionalmente, la secuencia de nucleótidos de los fragmentos identificados y/o aislados o la secuencia de aminoácidos de los marcos de codificación potenciales, puede ser alineada frente a las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos disponibles. Se puede verificar también la presencia de la denominada signatura de PARP (TGYMFGKG) o de una secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de ADN en la secuencia así obtenida. La actividad enzimática (de poliadenilribosilación) se puede ensayar tal como se describe p.ej. en el documento WO 00/04173.

El concepto de “condiciones de hibridación rigurosas” tal como se usa en el presente contexto significa que se realizará generalmente una hibridación si hay una identidad de secuencias de por lo menos un 95 % y de manera preferible un 97 % entre la sonda y la secuencia diana. Ejemplos de condiciones de hibridación rigurosas son una incubación durante una noche en una solución que comprende 50 % de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de trisodio), 50 mM de fosfato de sodio (de pH 7,6), 5x de una solución de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano, y 20 μg/ml de un ADN vehículo cortado y desnaturalizado, tal como un ADN de esperma de salmón, seguida por un lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 ºC, p.ej. durante aproximadamente 10 min (dos veces). Otras condiciones de hibridación y de lavado son bien conocidas y se ilustran en la obra de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [clonación molecular: un manual de laboratorio], Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente en el capítulo 11.

Usando las secuencias de nucleótidos de parp2 o las secuencias de aminoácidos de PARP2 dadas como ejemplos, se pueden producir también unas secuencias variantes por inserción, supresión o sustitución de nucleótidos o aminoácidos. Unas proteínas de algodón PARP2 variantes se pueden describir como aquellas proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos basada en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID Nos.: 13, 21 ó 22 en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o más de los aminoácidos en posiciones variantes son reemplazados por secuencias de aminoácidos funcionalmente similares. Se pueden distinguir los siguientes conjuntos de aminoácidos intercambiables:

-: aminoácidos alifáticos (glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L) e isoleucina (I))

-: aminoácidos aromáticos (fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W))

-: aminoácidos alifáticos que contienen hidroxilo (serina (S), treonina (T))

-: aminoácidos de carácter básico (lisina (K), arginina (R), histidina (H)) -aminoácidos de carácter ácido (ácido aspártico (D), ácido glutámico (E))

-: aminoácidos que contienen amido (asparagina (N), glutamina (Q)).

Se considera que son residuos de aminoácidos conservados los siguientes: los aminoácidos en las posiciones 372380, 15, 35, 63, 82, 113, 115, 117, 123, 163, 167, 168, 172, 173, 183, 189, 226, 234, 242, 251, 266, 271, 275, 285, 289, 344, 367, 368, 371, 386, 394, 408, 415, 429, 443 y 445 de la SEQ ID No.: 15. Todas las otras posiciones de aminoácidos pueden ser consideradas como posiciones variantes. Así, las proteínas PARP2 variantes pueden incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 15.

Otras proteínas variantes son las que contienen por lo menos los siguientes aminoácidos procedentes de la SEQ ID No.:13, que son los aminoácidos conservados entre la proteína codificada por un parp2 procedente de un ratón, maíz, arroz, Arabidopsis y algodón: los aminoácidos de las posiciones 9, 11, 14, 22, 31-32, 35-36, 40-43, 47-50, 55, 57, 58, 60, 67, 70-75, 78-79, 82, 91, 96, 99, 100, 103, 104, 106, 108, 111, 114, 121, 124, 126, 127, 128, 154, 157, 165, 166, 167, 171, 175, 177, 180, 186, 187, -189, 195, 198, 199, 202, 203, 205, 209, 217, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 242, 244, 248, 251, 256, 257, 258, 259, 261, 262, 264, 266, 267, 278, 279, 281, 286, 292, 299, 306, 310, 311, 314, 315, 318, 319, 326, 333, 337, 345-352, 353-355, 357, 358, 360, 361-363, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372-374, 376-383, 385-389, 391-397, 406, 408-410, 412-416, 420-422, 431, 434-435, 439, 440, 442, 446, 457 y 460. Estas proteínas variantes pueden o bien tener en las otras posiciones aminoácidos seleccionados entre las alternativas proporcionadas en la SEQ ID No.: 15 o pueden tener incluso otros aminoácidos en esas posiciones variantes.

La parte de la secuencia de nucleótidos del gen parp2 o del ADNc de un parp2 que está comprendida entre una hebra de la molécula de ARN de doble hebra debería tener una longitud de por lo menos 19 nucleótidos, pero que puede variar entre aproximadamente 19 nucleótidos (nt) hasta llegar a una longitud que se iguala con la longitud (en nucleótidos) del gen parp2 o su ADNc. La longitud total de la secuencia de nucleótidos de sentido o antisentido puede ser por lo tanto de por lo menos 25 nt (= nucleótidos), o de por lo menos aproximadamente 50 nt, o de por lo menos aproximadamente 100 nt, o de por lo menos aproximadamente 150 nt, o de por lo menos aproximadamente 200 nt, o de por lo menos aproximadamente 500 nt. Se espera que no haya ningún limite superior para la longitud total de las secuencias de nucleótidos de sentido o antisentido. Sin embargo, por una razón práctica (tal como p.ej. la estabilidad de los genes quiméricos) se espera que la longitud de la secuencia de nucleótidos de sentido o antisentido no debería superar los 5.000 nt; particularmente, no debería superar los 2.500 nt y podría ser limitada a aproximadamente 1.000 nt.

Se apreciará que cuanto más larga sea la longitud total de la parte del parp2 o del ADNc de parp2 (región de sentido

o antisentido) menos rigurosos serán los requisitos para la identidad de secuencias entre estas regiones y la correspondiente secuencia en el gen parp2 endógeno o su complemento. Preferiblemente, el ácido nucleico que interesa debería tener una identidad de secuencias de por lo menos alrededor de un 75 % con la correspondiente secuencia diana, particularmente de por lo menos alrededor de un 80 %, más particularmente de por lo menos alrededor de un 85 %, muy particularmente de alrededor de un 90 %, especialmente de alrededor de un 95 %, más especialmente de alrededor de un 100 %, y muy especialmente deberá ser idéntico a la parte correspondiente de la secuencia diana o su complemento. Sin embargo, se prefiere que el ácido nucleico que interesa siempre incluya una secuencia de aproximadamente 19 nucleótidos consecutivos, particularmente alrededor de 25 nt, más particularmente alrededor de 50 nt, especialmente alrededor de 100 nt, muy especialmente, alrededor de 150 nt con una identidad de secuencias de un 100% con la correspondiente parte del ácido nucleico diana. Preferiblemente, para calcular la identidad de secuencias y diseñar la correspondiente secuencia de sentido o antisentido, se debería reducir al mínimo el número de intersticios, particularmente para las secuencias de sentido más cortas.

Para la finalidad de este invento, la “identidad de secuencias” de dos secuencias relacionadas de nucleótidos o aminoácidos, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x100) dividido por el número de posiciones comparadas. Un intersticio, es decir una posición en una alineación en donde un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra, es considerado como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se realiza por medio del algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970). La anterior alineación de secuencias, asistida por ordenador, se puede realizar de una manera conveniente usando un programa lógico (software) clásico tal como el GAP que es una parte de la Versión de Paquete Wisconsin 10.1 (del Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, EE.UU.) usando la matriz de calificación por defecto con una penalidad por creación de un intersticio de 50 y con una penalidad por prolongación de un intersticio de 3.

Resultará evidente que cuando unas secuencias de nucleótidos de moléculas de ARN son definidas haciendo referencia a una secuencia de nucleótidos de correspondientes moléculas de ADN, la timina (T) en la secuencia de nucleótidos debería ser reemplazada por uracilo (U). El hecho de si se hace referencia a moléculas de ARN o de ADN resultará claro a partir del contexto de la solicitud.

Se ha demostrado que el requisito mínimo para silenciar a un gen diana particular es la presencia en la secuencia de nucleótidos de un gen quimérico silenciador de una secuencia de nucleótidos con una longitud de aproximadamente 20-21 nucleótidos consecutivos, que corresponde a la secuencia de un gen diana, en la que por lo menos 19 de los 20-21 nucleótidos consecutivos son idénticos a los de la correspondiente secuencia del gen diana. El concepto de “19 entre 20 nucleótidos consecutivos” tal como se usa en el presente contexto, se refiere a una secuencia de nucleótidos de 20 nucleótidos consecutivos seleccionados a partir del gen diana, que tiene un nucleótido discordante.

Como se usa en el presente contexto, “una planta de algodón tolerante al estrés” o “una planta de algodón tolerante a condiciones de estrés o a condiciones adversas de crecimiento” es una planta (particularmente una planta de algodón obtenida de acuerdo con los métodos del invento) que, cuando es sometida a condiciones desfavorables de crecimiento durante un cierto período de tiempo, tal como, pero sin limitarse a, sequía, altas temperaturas, suministro limitado de nutrientes (particularmente de nitrógeno), altas intensidades de luz, crece mejor que una planta testigo no tratada de acuerdo con los métodos del invento. Usualmente, esto será evidente a partir del aspecto general de las plantas y se puede medir, p.ej. por medio de una producción aumentada de biomasa, un crecimiento vegetativo continuado en condiciones desfavorables o un rendimiento más alto de semillas. Las plantas tolerantes al estrés tienen un espectro más amplio de crecimiento, es decir, que ellas son aptas para resistir una gama más amplia de cambios climatológicos y abióticos de otros tipos, sin ninguna penalización sobre el rendimiento. Desde un punto de vista bioquímico, una tolerancia al estrés puede ser evidente como el más alto contenido de NAD+-NADH / ATP y como una más baja producción de especies oxigenadas reactivas de plantas tolerantes al estrés, comparado/a con el/la de plantas testigos en condiciones de estrés. Una tolerancia al estrés puede también ser evidente como el más alto contenido de clorofila, la más alta fotosíntesis y la más baja fluorescencia de la clorofila en condiciones de estrés en plantas tolerantes al estrés, comparado/as con el de o las de plantas testigos en las mismas condiciones. Unas plantas de algodón tolerantes al estrés pueden también ser reconocidas analizando el impacto de las condiciones de estrés sobre la iniciación y/o la elongación de las fibras en condiciones de estrés, incluyendo una temperatura aumentada, en cultivos de tejidos para fibras.

Resultará manifiesto que tampoco se requiere que la planta sea hecha crecer continuamente en las condiciones desfavorables para que resulte evidente la tolerancia al estrés. Usualmente, la diferencia en cuanto a la tolerancia al estrés entre una planta o una célula de planta de acuerdo con el invento y una planta o una célula de planta testigo resultará evidente incluso cuando solamente se presente un período de tiempo relativamente corto de condiciones desfavorables durante el crecimiento.

Los genes quiméricos que reducen la expresión de un parp2 de algodón que codifica un dsRNA de acuerdo con el invento pueden comprenden un intrón, tal como un intrón heterólogo, situado p.ej. en la secuencia espaciadora entre las regiones de ARN de sentido y antisentido de acuerdo con la divulgación del documento WO 99/53050 (incorporado a la presente por su referencia).

Recientemente ha resultado evidente que unas moléculas de ARN de doble hebra, tales como las que más arriba se han descrito, son disociadas en células de plantas para dar pequeños fragmentos de ARN con aproximadamente 2021 nucleótidos, que sirven como una secuencia de guía en la degeneración del correspondiente ARNm (recopilado por Baulcombe, 2004). Por lo tanto, también se describe un método para producir una planta de algodón tolerante al estrés, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una o más moléculas de ARN de doble hebra a células de las plantas de algodón, en donde

las moléculas de ARN de doble hebra comprenden dos hebras de ARN, consistiendo una hebra de ARN

esencialmente en una secuencia de nucleótidos de ARN de 20 a 21 nucleótidos consecutivos

seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de un gen parp2 o de un ADNc de parp2 procedente de

una especie de algodón o procedente de una especie relacionada con una especie progenitora de algodón;

y

b) identificar una planta de algodón que comprenda esta(s) molécula o moléculas de ARN de doble hebra, que

es más resistente a condiciones de estrés abiótico que una misma planta de algodón que no comprende la

molécula o las moléculas de ARN de doble hebra.

Las mencionadas secuencias de dsRNA con una longitud de 20-21 nt son generadas también en el curso de un silenciamiento mediado por un ARN de antisentido convencional o un silenciamiento mediado por un ARN de sentido. Por lo tanto, otro método para producir plantas de algodón tolerantes al estrés, que comprende la etapa de proporcionar a células de la planta de algodón un gen quimérico que comprende, engarzados operativamente, los siguientes fragmentos de ADN

a) un promotor expresable en plantas;

b) una región de ADN que comprende por lo menos 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la

secuencia de nucleótidos de un gen parp2 o un ADNc de parp2 procedente de una especie de algodón o

procedente de una especie relacionada con una especie progenitora de algodón en orientación en

antisentido o en sentido;

c) una región de ADN que comprende una señal de terminación de la transcripción o de poliadenilación, que

es funcional en plantas.

Las mencionadas regiones de nucleótidos de antisentido o sentido pueden tener una longitud de desde aproximadamente 21 nt hasta aproximadamente 5.000 nt, tal como una longitud de 21nt, 40 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 300 nt, 500 nt, 1000 nt, o incluso aproximadamente de 2.000 nt o más larga. Además, no se requiere para la finalidad del invento que la secuencia de nucleótidos de la molécula del gen parp2 inhibidor usado o la región codificadora del gen quimérico sea completamente idéntica a, o complementaria con, la del gen parp2 de algodón endógeno, cuya expresión es dirigida hacia la diana de ser reducida en la célula de la planta de algodón. Cuanto más larga sea la secuencia, menos riguroso será el requisito de la identidad global de secuencias. Por lo tanto, las regiones de sentido o antisentido pueden tener una identidad global de secuencias de aproximadamente un 40 % o 50 % o 60 % o 70 % o 80 % o 90 % o 100 % con la secuencia de nucleótidos del gen parp2 endógeno o del complemento del mismo. Sin embargo, tal como se ha mencionado, las regiones de antisentido o sentido deberán comprender preferiblemente una secuencia de nucleótidos de 19-20 nucleótidos consecutivos que tienen una identidad de secuencias de aproximadamente un 100 % con la secuencia de nucleótidos del gen parp2. Preferiblemente, la longitud del tramo con una identidad de secuencias de aproximadamente un 100 % debería ser de aproximadamente 50, 75 o 100 nt.

La eficiencia de los genes quiméricos antes mencionados para el silenciamiento mediado por un ARN de antisentido

o por un ARN de sentido puede ser aumentada adicionalmente por inclusión de unos elementos de ADN que dan como resultado la expresión de moléculas de ARN inhibidor de parp2, no poliadeniladas, aberrantes. Uno de dichos elementos de ADN, que es apropiado para esta finalidad, es una región de ADN que codifica una ribozima autoempalmable tal como se describe en el documento WO 00/01133. La eficiencia puede también ser intensificada proporcionando a las moléculas de ARN generadas unas señales de localización nuclear o de retención tal como se describen en el documento WO 03/076619.

Las secuencias de nucleótidos de ADNc de parp2 de algodón, dadas como ejemplos, se pueden usar también para identificar unos alelos parp2 de algodón en una población de plantas de algodón o de plantas progenitoras de algodón que están correlacionadas con una tolerancia aumentada al estrés. La población de plantas de algodón puede ser una población que ha sido previamente mutagenizada. Los alelos parp2 de algodón identificados pueden luego ser introducidos en un linaje de plantas selectas de algodón, usando técnicas de crianza convencionales.

Unos métodos para transformar plantas de algodón son asimismo bien conocidos en la especialidad. La transformación mediada por Agrobacterium ha sido descrita p.ej. en la patente de los EE.UU. 5.004.863 o en la patente de los EE.UU. 6.483.013, y la transformación de algodón por bombardeo con partículas se informa p.ej. en el documento WO 92/15675.

Los métodos y medios descritos se pueden usar en plantas de algodón, tales como las Coker 312, Coker 310, Coker 5Acala SJ-5, GSC25110, variedades de FIBERMAX tales como FIBERMAX 819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991, Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, no Acala “picker” Siokra, “stripper” variedad FC2017, Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61, DP90, DP77, DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1, CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1, CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1, CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 y ORO BLANCO PIMA y plantas con genotipos derivados de ellas.

La planta de algodón transformada, obtenida de acuerdo con el invento, se puede usar en un esquema de crianza convencional para producir más plantas con las mismas características o para introducir el gen quimérico de acuerdo con el invento en otras variedades de la misma especie o de una especie relacionada de plantas, o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas contienen los genes quiméricos del invento como un inserto genómico estable y también están abarcadas por el invento.

Resultará además evidente para una persona experta en la especialidad que un ADNc de parp2 o un ADN genómico de parp2, o una parte del mismo, tal como aquí se describe, se puede usar también para aumentar la velocidad o tasa de crecimiento de cualquier planta o para aumentar la tolerancia al estrés en células de cualquier planta de acuerdo con la enseñanza del documento WO 00/04173.

Además, es conocido que la introducción de un ARN de antisentido, de sentido o de doble hebra o los genes quiméricos que lo codifican puede conducir a una distribución de fenotipos, que fluctúa entre casi ninguna o muy poca supresión de la expresión del gen diana hasta una supresión muy fuerte e incluso de un 100 % de la expresión del gen diana. No obstante, una persona experta en la especialidad será capaz de seleccionar los células de plantas, las plantas, los sucesos o los linajes de plantas que conduzcan al grado deseado de silenciamiento y al fenotipo deseado.

Resultará también evidente para una persona experta en la especialidad que los genes o ADNc’s de parp2 aislados a partir de diferentes variedades o partes de las mismas, pueden diferir en la secuencia de nucleótidos o en los aminoácidos del polipéptido codificado, y todavía ser significativamente similares o incluso idénticos en regiones particulares. En otras palabras, las diferentes variantes de genes parp2 pueden compartir tramos similares o idénticos de unas secuencias de 20-200 nucleótidos contiguos. Por lo tanto, cuando la memoria descriptiva o las reivindicaciones se refiere(n) a una región de ADN que comprende por lo menos x nucleótidos consecutivos tomados de una secuencia particular de nucleótidos, o tomados de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia particular de aminoácidos, resultará evidente que los que se mencionan son los por lo menos x nucleótidos consecutivos como tales, sin tener que hacer referencia al origen de la secuencia de nucleótidos.

Tal como se usa aquí, el concepto de “comprende” ha de ser interpretado como que especifica la presencia de las características, los números enteros, las etapas o los componentes señalados/as a los/las que se ha hecho referencia, pero no excluye la presencia o la adición de una o más otras/os características, números enteros. etapas

o componentes, o conjuntos de los mismos. Por consiguiente, p.ej. un ácido nucleico o una proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los realmente citados, puede estar embebido/a en un ácido nucleico o en una proteína de mayor tamaño. Un gen quimérico que comprende una región de ADN, que ha sido definida de una manera funcional o estructural, puede comprender adicionales regiones de ADN, etc.

Los siguientes Ejemplos no limitativos describen unos genes quiméricos para la alteración de las características de tolerancia al estrés en algodón y unos usos de los mismos. A menos que se señale otra cosa distinta en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinantes se llevan a cabo de acuerdo con unos protocolos clásicos, tal como se describen en la obra de Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y en los volúmenes 1 y 2 de la obra de Ausubel y colaboradores (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols [Protocolos actuales en biología molecular, protocolos actuales], EE.UU. Unos materiales y métodos clásicos para el trabajo molecular en plantas se describen en la obra Plant Molecular Biology Labfax (1993), coordinada en edición por R.D.D. Croy, publicada conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (UK = Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, UK.

A lo largo de la descripción y de los Ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias que están representadas en la lista de secuencias: SEQ ID No 1: secuencia de nucleótidos del oligonucleótido P1a apropiado para amplificar una parte de un gen parp2

de algodón o de su ADNc. SEQ ID No 2: secuencia de nucleótidos del oligonucleótido P1b apropiado para amplificar una parte de un gen parp2

de algodón o de su ADNc. SEQ ID No 3: secuencia de nucleótidos del oligonucleótido P1c apropiado para amplificar una parte de un gen parp2

de algodón o de su ADNc. SEQ ID No 4: secuencia de nucleótidos del oligonucleótido P1x apropiado para amplificar una parte de un gen parp2

de algodón o de su ADNc. SEQ ID No 5: secuencia parcial del ADNc de un gen parp2 de algodón (que contiene la signatura PARP) variante 1. SEQ ID No 6: secuencia parcial del ADNc de un gen parp2 de algodón (que contiene la signatura PARP) variante 2. SEQ ID No 7: secuencia parcial del ADNc de un gen parp2 de algodón (que contiene la signatura PARP) variante 3. SEQ ID No 8: secuencia parcial del ADNc de un gen parp2 de algodón (parte 2) variante 1.

SEQ ID No 9: secuencia parcial del ADNc de un gen parp2 de algodón (parte 2) variante 2. SEQ ID No 10: secuencia parcial del ADNc de un gen parp2 de algodón (parte 2) variante 3. SEQ ID No 11: secuencia parcial del ADNc de un gen parp2 de algodón (parte 2) variante 4. SEQ ID No 12: secuencia parcial de nucleótidos del ADNc de un geh parp2 de algodón (fusionado)

5 SEQ ID No 13: secuencia parcial de aminoácidos de una proteína PARP2 de algodón. SEQ ID No 14: secuencia de nucleótidos de una región de ADN T del vector pTMT01. SEQ ID No 15: variantes de la secuencia parcial de aminoácidos de una proteína PARP2 de algodón. SEQ ID No 16: cebador de oligonucleótidos 1 usado para la preparación de una sonda específica para un gen parp2

de algodón 10 SEQ ID No 17: cebador de oligonucleótidos 2 usado para la preparación de una sonda específica para un gen parp2

de algodón. SEQ ID No 18: secuencia de nucleótidos de una sonda específica para un gen parp2 de algodón. SEQ ID No 19: secuencia de nucleótidos de un ADN genómico que comprende un gen parp2 de algodón variante 1. SEQ ID No 20: secuencia de nucleótidos de un ADN genómico que comprende un gen parp2 de algodón variante 2.

15 SEQ ID No 21: secuencia de aminoácidos de la estructura de proteína que puede ser codificada por la SEQ ID No

19. SEQ ID No 22: secuencia de aminoácidos de la estructura de proteína que puede ser codificada por la SEQ ID No

20.

SEQ ID No 23: copia de ADNc del ARNm de un gen parp2 de algodón variante 1. 20 SEQ ID No 24: copia de ADNc del ARNm de un gen parp2 de algodón variante 2.

Ejemplos

Ejemplo 1: Aislamiento de secuencias de ADNc para parp2 de algodón.

Unas secuencias de oligonucleótidos, que se habían de usar como cebadores degenerados en una amplificación por PCR de una parte de un gen parp2 de algodón, fueron diseñadas por comparación de las secuencias de nucleótidos

25 disponibles para genes parp2 procedentes de Arabidopsis thaliana, Zea mays y Oryza sativa. Los cebadores fueron diseñados usando las regiones con la más alta homología en exones. De esta manera se generaron los siguientes cebadores degenerados:

Un ARN fue extraído a partir de callos de algodón (Coker 312) basándose en el protocolo descrito por Jones y

30 colaboradores (1985), y usado para la síntesis de un ADNc usando el sistema de síntesis de primera hebra SuperScript® para una RT-PCR (de Invitrogen Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Usando el ADNc como molde y un par de cebadores P1a/P1b se realizó una amplificación por PCR en las siguientes condiciones:

5 min a 95ºC

Reanillamiento 35 s a 52ºC

Alargamiento 35 s a 72ºC

Desnaturalización 1 min a 92ºC

durante 50 ciclos seguidos por 40 s a 52ºC y 10 min a 72 ºC .

35 Un fragmento de ADN de aproximadamente 580 pb fue amplificado y clonado, y se secuenciaron varios clones (que comprenden las secuencias de SEQ ID 5, 6 y 7). Todas las secuencias de aminoácidos predichas codificadas por las secuencias variantes, contenían la denominada signatura PARP (TGYMFGKG) que se conserva en todas las proteínas PARP.

Sobre la base de las secuencias amplificadas, se diseñó un nuevo cebador (no degenerado) que podría permitir una 40 amplificación de la parte situada corriente arriba del ADNc de un parp2:

Usando el ADNc y las condiciones de PCR que antes se han descrito, con la excepción que solamente se realizaron 35 ciclos y se usaron los oligonucleótidos P1x y P1c como cebadores, se amplificó un fragmento de ADN con aproximadamente 600 pb, que se solapaba con la parte previamente amplificada del ADNc de un parp2, y constituía la parte del ADNc de un parp2 que estaba situada corriente arriba del fragmento previamente amplificado. De nuevo se identificaron unas secuencias variantes (SEQ ID Nos 8-11).

La SEQ ID No. 11 representa la secuencia de nucleótidos de las partes fusionadas de un gen parp2. La SEQ ID No.: 13 incluye la secuencia de aminoácidos de la proteína PARP2 codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID No.: 12.

Se realizaron unas hibridaciones de Southern con un ADN genómico de plantas de algodón diploides del genoma A y plantas tetraploides AD. Se podrían observar dos bandas, de las cuales solamente una estaba presente en los diploides del genoma de A usando varias digestiones con enzimas de restricción.

Ejemplo 2: Construcción de un vector de ADN T que contiene un gen silenciador de PARP2.

Un fragmento de ADN amplificado que comprendía la signatura PARP que se ha descrito en el Ejemplo 1, se usó para construir un gen quimérico que después de una transcripción proporciona una molécula de ARN que comprende una secuencia de ADN de sentido y antisentido a partir del fragmento de ADN amplificado, y que podría emparejar bases para formar una molécula de ARN de doble hebra. Dicho gen quimérico se puede usar para reducir la expresión de un parp2 en algodón. Con esta finalidad, los siguientes fragmentos de ADN fueron engarzados operativamente usando técnicas clásicas de ADN recombinantes:

un fragmento que incluye la región de promotor del transcrito 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Odell y colaboradores, 1985) (SEQ ID No.:14 desde el nucleótido 2.686 al nucleótido 3.191)

un fragmento que incluye una parte terminal de C que a su vez incluye la signatura PARP de la secuencia codificadora del ADNc de parp2 de la poli(ADP-ribosa) polimerasa de tipo no clásico de Gossypium hirsutum (algodón) clonado en una orientación de sentido (SEQ ID No.: 14 desde el nucleótido 3.192 al nucleótido 3.617).

un fragmento que contiene el segundo intrón del gen de la piruvato ortofosfato dicinasa procedente de Flaveria trinervia como ha sido descrito por Rosche y Westhoff (1995) (SEQ ID No.:14 desde el nucleótido

3.649 al nucleótido 4.423).

un fragmento que incluye una parte terminal de C, que a su vez incluye la signatura PARP de la secuencia codificadora del ADNc de parp2 de la poli(ADP-ribosa) polimerasa de tipo no clásico de Gossypium hirsutum (algodón) clonado en una orientación de antisentido (SEQ ID No.: 14 desde el nucleótido 4.424 al nucleótido 4.851).

un fragmento que incluye la región no traducida en 3’ del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens como ha sido descrita por De Greve y colaboradores (1982) (SEQ ID No.:14 desde el nucleótido 4.852 al nucleótido 5.591).

Este gen quimérico fue introducido entre los bordes de ADN T de un vector de ADN T conjuntamente con un gen quimérico que codifica un marcador seleccionable para proporcionar el pTMT1 (véase la Fig 1; la secuencia del ADN T de pTMT1 está representada en la SEQ ID No.: 14). El vector pTMT1 se deriva del pGSC1700 (Cornelissen y Vandewiele, 1.989). El esqueleto del vector contiene los siguientes elementos genéticos:

el núcleo de plásmido que comprende el origen de replicación procedente del plásmido pBR322 (Bolivar y colaboradores, 1977) para su replicación en Escherichia coli (ORI ColE1) y un fragmento de restricción que comprende el origen de replicación procedente del plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh y colaboradores, 1984) para su replicación en Agrobacterium tumefaciens (ORI pVS 1).

un gen marcador seleccionable que confiere tolerancia a estreptomicina y a espectinomicina (aadA) para la propagación y la selección del plásmido en Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens. una región de ADN que consiste en un fragmento de la secuencia que codifica la neomicina fosfotransferasa del gen nptl procedente del transposón Tn903 (Oka y colaboradores, 1981).

El vector de ADN T fue introducido en Agrobacterium tumefaciens que comprendía un plásmido Ti cooperante (helper). Unas plantas de algodón fueron transformadas usando la cepa de A. tumefaciens obtenida, de acuerdo con el protocolo que se ha descrito en la patente de los EE.UU. 6.483.013.

Ejemplo 3: Análisis de plantas de algodón transgénico que albergan un gen silenciador de PARP2.

Se obtuvieron diferentes linajes de algodón transgénico, que comprendían el gen quimérico que se ha descrito en el Ejemplo 1. Los linajes de plantas transgénicas fueron analizados al nivel molecular usando un análisis por transferencia de borrón Southern. Similarmente, los linajes de plantas son analizados en cuanto a la expresión del ARN de un parp2 usando la transferencia de borrón y en cuanto a la presencia de una proteína PARP2 usando p.ej. un ELISA o una transferencia de borrón Western. Una indicación de la actividad de una PARP se puede obtener usando el ensayo de TUNEL que visualiza roturas de ADN de una única hebra.

Unos linajes de plantas transgénicas de la generación T0 fueron retrocruzados con plantas Coker 312, para reducir la variación somaclonal potencial en los resultantes linajes de plantas transformadas.

Las poblaciones que se segregan de linajes de algodón transgénico autopolinizado fueron analizadas en cuanto a la presencia del transgén en una forma homocigótica, o heterocigótica, o en cuanto a la ausencia del transgén usando una PCR en tiempo real.

Los diferentes linajes de plantas son sometidos a diversas formas de estreses. Ya sea se comparan unas poblaciones homólogas de plantas transgénicas con plantas de referencia no transformadas, o se usan poblaciones que se segregan, seguido por una determinación de los linajes de plantas homocigóticas, heterocigóticas y acigóticas usando técnicas clásicas.

Un primer ensayo es el “ensayo de germinación en frío” en el que unas semillas son germinadas sobre una tierra arenosa a una temperatura de 5ºC. Se puede usar también un ensayo similar al que ha sido descrito por Schulze y colaboradores, 1996, Schulze y colaboradores, 1996, Duesterhaus y colaboradores, 1999 o Duesterhaus y colaboradores 2000.

Un ensayo similar consiste en someter a las plantas en crecimiento a diversos períodos de sequía o de temperatura aumentada (o una combinación de ellos) seguidos por un período de crecimiento en condiciones clásicas de invernadero para algodón, antes de efectuar la calificación visual de las plantas.

También es conocido que una iniciación y/o una elongación de fibras de algodón están sujetas a diversas condiciones de estrés, incluyendo p.ej. el frío; se desarrolla un ensayo con el que se analiza la influencia de una temperatura disminuida o de una temperatura aumentada sobre cultivos de tejidos para fibras, iniciados a partir de los diferentes linajes de plantas transgénicas. Con esta finalidad, unos cultivos de tejidos para fibras son iniciados, esencialmente tal como ha sido descrito por Beasly y Ting, 1974. Los cultivos son sometidos luego a un periodo de temperatura modificada (p.ej. durante 2 h-4 h a 45-50ºC) y se registra el efecto sobre la iniciación de fibras.

Un ensayo adicional es el ensayo de aptitud y adaptación (fitness) esencialmente tal como se ha descrito en el documento WO02/066972), en el que las condiciones de estrés impuestas sobre el material de explantes tal como aquí se describen, pueden ser reemplazadas o suplementadas por unas condiciones adicionales de estrés tales como una cultivación bajo una temperatura disminuida o aumentada.

Los linajes de plantas transgénicas son analizados también para determinar el nivel de especies oxigenadas reactivas en plantas o explantes, en condiciones de estrés, en comparación con el nivel de especies oxigenadas reactivas en un similar material de plantas en condiciones normales, tal como se describe en la solicitud de patente europea EP04077624.7. Similarmente, los linajes de plantas transgénicas son analizados también para determinar el nivel de ATP y/o NAD(H) en plantas o explantes, en condiciones de estrés, en comparación con el nivel de ATP y/o NAD(H) en un similar material de plantas en condiciones normales, esencialmente tal como se ha descrito en el documento EP04077624.7.

Los diferentes linajes de plantas transgénicas se usan también en pruebas en el campo, en las que unas parcelas regadas son comparadas con unas parcelas no regadas. Las plantas son calificadas visualmente en cuanto a aptitud, adaptación y daño agronómica/o, en comparación con plantas acigóticas así como con plantas de algodón de referencia.

Se observan varios linajes de plantas transgénicas que contienen una tolerancia aumentada a condiciones desfavorables de crecimiento o a las condiciones de estrés impuestas en uno o más de los ensayos arriba descritos.

Ejemplo 4: Pruebas en el campo con linajes de algodón transgénico.

Diferentes linajes de algodón transgénicos homocigóticos así como las correspondientes linajes de cero, identificados tal como se ha descrito en el Ejemplo 3, se usaron en pruebas en el campo comparando unas parcelas que recibieron un riego durante todo el tiempo, con unas parcelas que fueron regadas solamente al comienzo de la estación de crecimiento, sometiendo con ello a las plantas de algodón a un importante estrés por calor. Una tormenta de granizo destruyó a una parte del campo, haciendo difícil una interpretación de los resultados. No obstante, se puso de manifiesto que unos pocos linajes transgénicos tenían un aspecto más sano y tenían más crecimiento vegetativo, es decir aparecieron como más vigorosos.

Ejemplo 5: Análisis de linajes de algodón transgénico usando un ensayo de germinación en frío.

que eran acigóticas. 50 semillas procedentes o bien de plantas homocigóticas o de plantas acigóticas para cada suceso se sembraron en arena. Las cubetas fueron incubadas a una temperatura constante de 16ºC durante 21 días, en cuyo momento se contaron las plántulas germinadas. La germinación de semillas de algodón es sensible a unas temperaturas más bajas que 18ºC. Al mismo tiempo, 50 semillas procedentes de los mismos lotes de semillas que más arriba se han mencionado se hicieron crecer sobre arena pero se incubaron a 26ºC durante el día y a 21ºC durante la noche a lo largo de 12 días. El número de plántulas que emergieron se contó y se usó para corregir los datos para el ensayo de germinación en frío en cuanto a cualquier efecto sobre la calidad del lote de semillas.

La Figura 4 representa datos para 11 diferentes sucesos que comparan los linajes homocigóticos con linajes acigóticos. Particularmente, los linajes transgénicos homocigóticos indicados como linajes 7, 9 y 11 se comportaron muy bien puesto que no se podría observar casi ninguna pérdida de germinación durante el estrés,

Ejemplo 6: Análisis de linajes de algodón transgénico en cuanto a tolerancia de un tratamiento con paraquat

Unas hojas procedentes de los tres linajes de algodón transgénico, que se identificaron en el Ejemplo 5 como que se comportaban bien en el ensayo de germinación en frío, fueron sometidas a un ensayo de tolerancia al paraquat en comparación con unas hojas procedentes de Coker312 no transgénico. Con esta finalidad, unos discos de hojas de aproximadamente 1 cm cuadrado fueron incubados en diferentes cápsulas de Petri que contenían una solución de paraquat en diferentes concentraciones (6 repeticiones por cada concentración). Las cápsulas de Petri fueron incubadas en la oscuridad durante 4 horas, seguido por una incubación durante 2 horas bajo una alta intensidad de luz. Después de esto, las placas fueron incubadas en la oscuridad durante una noche. El daño causado por el paraquat a las membranas celulares fue estimado al día siguiente midiendo la conductividad del medio de incubación. Los resultados de estas mediciones son recopilados en la Fig. 3. Tal como se puede observar a partir de la Figura 3B, por lo menos un linaje transgénico mostró más tolerancia a un tratamiento con paraquat que el linaje testigo.

Ejemplo 7: Aislamiento de clones genómicos que codifican un parp2 de algodón

Unos clones genómicos de parp2 de algodón fueron aislados usando técnicas recombinantes clásicas a partir de una biblioteca de BAC de Gossypium hirsutum. Dicho brevemente, una biblioteca BAC comercialmente disponible de Gossypium hirsutum cultivar Maxxa, fue explorada usando una sonda obtenida por amplificación por PCR usando un ADNc de algodón como molde y unos oligonucleótidos, que tenían las secuencias de las SEQ ID No.: 16 y SEQ ID No.: 17, como cebadores. La secuencia de los oligonucleótidos se derivaba de la secuencia de ADNc de la SEQ ID No.: 12. La secuencia del fragmento de ADN amplificado es proporcionada como la SEQ ID No.: 18. 12 clones de BAC fueron identificados como candidatos positivos putativos. El análisis del modelo de fragmentos de restricción de estos clones reveló dos tipos de clones. La variante genómica 1 era el representante más abundante en la biblioteca. Un representante de cada clon fue sometido a una determinación de la secuencia de nucleótidos por paseo con cebadores. La secuencia de nucleótidos para la parte relevante de ambos clones es proporcionada como las SEQ ID No.: 19 y SEQ ID No.: 20 respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos que pueden ser codificados por estas secuencias de nucleótidos, son proporcionadas como las SEQ ID No.: 21 y SEQ ID No.: 22 respectivamente. La secuencia de nucleótidos de los ARNm después de una transcripción y un empalme se proporciona como las SEQ ID No.: 23 y SEQ ID No.: 24. Los polipéptidos que pueden ser codificados por las dos variantes de las clases genómicas (procedentes del cv (cultivar) Maxxa; SEQ ID Nos.: 20 y 21) fueron alineados y comparados con el polipéptido por el clon de ADNc (procedente de Coker312; SEQ ID No.: 13) tal como se ilustra en la Figura 4.

Tal como se espera, los tres polipéptidos comparten una importante identidad de secuencias u homología de secuencias.

La diferencia principal entre los polipéptidos codificados por los clones genómicos y el polipéptido (incompleto) codificado por el clon de ADNc, es la presencia de un tramo adicional de 26 aminoácidos en los polipéptidos codificados por los clones genómicos (ambas variantes) (la SEQ ID No.: 21 desde el AA 444 hasta el AA 469). (AA = abreviatura de aminoácido(s)).

El polipéptido GV1 tiene además una prolongación terminal de N (la SEQ ID No 21 desde el AA 1 hasta el AA 65) mientras que carece de un tramo de 48 aminoácidos presente en el GV2 (la SEQ ID No 22 desde el AA 174 hasta el AA 221). Un tramo similar de aminoácidos (excepto los 4 AA: VLQK) está también ausente desde el polipéptido codificado por el clon de ADNc. Además, el polipéptido GV1 tiene un inserción de aproximadamente 11 aminoácidos en su parte terminal de C (SEQ ID No 21 desde el AA 644 hasta el AA 664).

Unas regiones dianas preferidas que se han de incluir en las construcciones artificiales silenciadoras de acuerdo con el invento pueden ser, por lo tanto, las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 13 desde el 7 al 26; de la SEQ ID No.: 13 desde el 31 al 238; de la SEQ ID No.: 13 desde el 239 al 412; de la SEQ ID No.: 13 desde el 413 al 423; y de la SEQ ID No.: 13 desde el 425 al 460.

Referencias:

Álvarez-González y Althaus (1989) Mut. Res. 218, 67-74

Amor y colaboradores (1998) FEBS Letters 440, 1-7

Babiychuk y colaboradores (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12722-12727

Baulcombe (2004) Nature 431, 356-363

Bolivar, F y colaboradores (1977). Gene 2, 95-113

Chen y colaboradores (1994) Eur. J. Biochem 224, 135-142

Cornelissen, M., Vandewiele, M. (1989). Nucleic Acids Research, 17, 19-25.

De Greve y colaboradores (1982). J. Mol. Appl. Genetics, 1 (6), 499-511.

de Murcia y Menissier de Murcia (1994) Trends Biochem. Sci. 19, 172-176.

Duesterhaus y colaboradores (1999) Proceedings of the Beltwide Cotton Conference 1: 621-623

Duesterhaus y colaboradores (2000) Proceedings of the Beltwide Cotton Conference 1: 596-599

Ikajima y colaboradores (1990) J. Biol. Chem. 265, 21907-21913

Itoh y colaboradores (1984). Plasmid, 11, 206

Jones y colaboradores (1985) EMBO J. 4, 2411-2418

Kameshita y colaboradores (1984) J. Biol. Chem. 259, 4770-4776

Lebrun y colaboradores (1996). Patente de los EE.UU, US5510471

Lebrun y colaboradores (2003) Patente de los EE.UU, US6566587Bl

Lepiniec y colaboradores (1995) FEBS Letters 364,103-108

Lindahl y colaboradores (1995) Trends Biochem. Sci. 20, 405-411

Mahajan y Zuo (1998) Plant Physiology 118, 895-905

Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453

0' Farrel (1995) Biochimie 77, 486-491

Odell y colaboradores (1985) Nature 313, 810

Oka y colaboradores (1981). Journal of Molecular Biology, 147, 217-226

Payne y colaboradores (1976) Exp. Cell Res. 99, 428-432

Rosche, E., Westhoff, P. (1995). Plant Molecular Biology, 29 (4), 663-678

Schulze y colaboradores (1996) Proceedings of the Beltwide Cotton Conference 2: 1240-1243

Schulze y colaboradores (1997) Proceedings of the Beltwide Cotton Conference 1: 1383-1385

Verdaguer y colaboradores (1998). Plant Mol Biol, 37, 1055-1067

Willmitzer y Wagner (1982) en ADP-Ribosylation Reactions (Hayashi, O. y Ueda, K., coordinadores de edición). Nueva York: Academic Press, páginas 241-252

Zambryski (1988). Ann. Rev. Genet. 22: 1-30

LISTADO DE LAS SECUENCIAS

<110>: Bayer BioScience N.V. Van Thournout, Michel Reynaerts, Arlette Jacobs, John

<120>: Plantas de algodón tolerantes al estrés

<130>: BCS 04-2006

<150> <151>: EP04077984.5 2004-10-29

<150> <151>: US60/628,597 2004-11-17

<160> <170>: 24 PatentIn version 3.0

<210> <211> <212> <213>: 1 25 ADN Artificial

<220>

<223> oligonucleótido P1a <400> 1 ggtygccaag kggaacaaca acacc: 25

<210> <211> <212> <213>: 2 29 ADN Artificial

<220>

<223> oligonucleótido P1b <400> 2 ggatgatccd ttrtatkmtc rmtaemagc: 29

<210> <211> <212> <213>: 3 29 ADN Artificial

<220>

<223> oligonucleótido P1c <400> 3 gagaaratbg twachgcsac rargaargg: 29

<210> <211> <212> <213>: 4 26 ADN Artificial

<220>

<223> oligonucleótido P1x <400> 4 caagaggaaa cagttcacag tgaagc: 26

5: <210> <211> <212> <213> <220> 5 426 ADN Artificial

<223> <400>: ADNc de un parp2 de algodón 1_1 5

15: <210> <211> <212> <213> 6 573 ADN Artificial

<220>

20: <223> <400> ADNc de un parp2 de algodón parte 1 variante 2 6

25: <210> <211> <212> <213> 7 566 ADN Artificial

<220>

30: <223> <400> ADNc de un parp2 de algodón parte 1 variante 3 7

35: <210> <211> <212> <213> 8 881 ADN Artificial

40: <220>

<223> ADNc de un parp2 de algodón parte 2 variante 1

<400>: 8

<400>: 10

<400>: 12

5: <210> <211> <212> <213> 9 882 ADN Artificial

10: <220>

<223> <400>: ADNc de un parp2 parte 2 variante 2 9

20: <210> <211> <212> <213> 10 869 ADN Artificial

<220>

25: <223> ADNc de un parp2 parte 2 variante 3

5: <210> <211> <212> <213> 11 880 ADN Artificial

10: <220> <223> <400> ADNc de un parp2 parte 2 variante 4 11

15 20: <210><211> <212> <213> <220> 12 1384 ADN Artificial

25: <223> <220> <221> ADNc de un parp2 (fusionado) CDS

<222>: (3) .. (1382)

<210> 13

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 13

<210> 14

<211> 5616

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> vector de ADN T pTMT01

<220>

<221> característica variada

<222> (1) .. (25)

<223> LB: repetición en el borde izquierdo del ADN T de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988)

<220>

<221> característica variada

<222> (25) .. (439)

<223> 3'nos: secuencia que incluye la región no traducida en 3' del gen de nopalina sintasa procedente del ADN T de pTiT37 como se ha descrito por Depieker y colaboradores, 1982. (en dirección contraria a la de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada

<222> (440) .. (1777)

<223> 2mepsps(Eagl): la secuencia codificadora (no PvuII) del gen de 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa de Zea mays (maíz) (Lebrun y colaboradores 2003). (en dirección contraria a la de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada

<222> (1778) .. (2150)

<223> TPotp C: el péptido de tránsito optimizado como se ha descrito por Lebrun y colaboradores (1996). (en dirección contraria a la de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada

<222> (2151) .. (2685)

<223> Pcsvmv XYZ: secuencia que incluye la región del promotor del Virus del Mosaico de Venas de Cassava (Verdaguer y colaboradores, 1996). (en dirección contraria a la de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada <222> (2686) .. (3191)

<223> P35s2: secuencia que incluye la región del promotor del Virus de Mosaico de la Coliflor transcrito 35S (Odell y colaboradores, 1985). (en la dirección de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada

<222> (3192) .. (3617)

<223> parp2Gh(terminal de C): secuencia que incluye una parte de la secuencia codificadora de la poli(ADP-ribosa) polimerasa de tipo no clásico de Gossypium hirsutum (algodón). (en la dirección de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada

<222> (3649) .. (4423)

<223> intron pdk: segundo intrón del gen de la piruvato ortofosfato dicinasa procedente de Flaveria trinervia como se ha descrito por Rosche y Westhoff (1995). (en la dirección de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada

<222> (4424) .. (4851)

<223> parp2Gh(terminal de C): secuencia que incluye una parte de la secuencia codificadora de la poli(ADP-ribosa) polimerasa de tipo no clásico de Gossypium hirsutum (algodón). (en la dirección contraria a la de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada

<222> (4852) .. (5591)

<223> 3'ocs: secuencia que incluye la región no traducida en 3' del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens como se ha descrito por De Greve y colaboradores (1982). (en la dirección de las agujas de un reloj

<220>

<221> característica variada '

<222> (5592) .. (5616)

<223> RB: repetición en el borde derecho procedente del AND T de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988)

<210> 15

<211> 457

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> fragmentos de un parp2 de algodón variante

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2) .. (2)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1) .. (1)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3) .. (3)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4) .. (4)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5) .. (5)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6) .. (6)

<223> A O V O L O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> A O G O L O I <220>

<221> VARIANTE

<222> (8) .. (8)

<223> V O G O L O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (9) .. (9)

<223> A O G O L O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10) .. (10)

<223> A O G O V O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11) .. (11)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12) .. (12)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13) .. (13)

<223> A O V O L O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (14) .. (14)

<223> A O V O L O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (16) .. (16)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (17) .. (17)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (18) .. (18)

<223> A O V O G O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19) .. (19)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (20) .. (20)

<223> V O L O I O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (21) .. (21)

<223> R O K <220>

<221> VARIANTE

<222> (22) .. (22)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (23) .. (23)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (24) .. (24)

<223> A O I O L O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (25) .. (25)

<223> A O I O V O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (26) .. (26)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (27) .. (27)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (28) .. (28)

<223> V O L O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (29) .. (29)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (30) .. (30)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (31) .. (31)

<223> L O G O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (32) .. (32)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (33) .. (33)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (34) .. (34)

<223> G O V O L O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (36) .. (36)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (37) .. (37)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (38) .. (38)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (39) .. (39)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (40) .. (40)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (41) .. (41)

<223> A O G O I O L

<220>.

<221> VARIANTE

<222> (42) .. (42)

<223> V O A O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (43) .. (43)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (44) .. (44)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (45) .. (45)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (46) .. (46)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (47) .. (47)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (48) .. (48)

<223> Y O W <220>

<221> VARIANTE

<222> (49) .. (49)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (50) .. (50)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (51) .. (51)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (52) .. (52)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (53) .. (53)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (54) .. (54)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (55) .. (55)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (56) .. (56)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (57) .. (57)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (58) .. (58)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (59) .. (59)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (60) .. (60)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (61) .. (61)

<223> S <220>

<221> VARIANTE

<222> (62) .. (62)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (64) .. (64)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (65) .. (65)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (66) .. (66)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (67) .. (67)

<223> H O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (68) .. (68)

<223> F O Y

<220>

<221> VARIANTE

<222> (69) . . (69)

<223> A O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (70) .. (70)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (71) .. (71)

<223> G O A O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (72) .. (72)

<223> V O A O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (73) .. (73)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (74) .. (74)

<223> V O A O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (75) .. (75)

<223> N <220>

<221> VARIANTE

<222> (76) .. (76)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (77) .. (77)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (78) .. (78)

<223> G O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (79) .. (79)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (80) .. (80)

<223> I O A O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (83) .. (83)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (84) .. (84)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (85) .. (85)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (86) .. (86)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (87) .. (87)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (88) .. (88)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (89) .. (89)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (90) .. (90)

<223> G O A O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (91) .. (91)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (92) .. (92)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (93) .. (93)

<223> y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (94) .. (94)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (95) .. (95)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (96) .. (96)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (97) . . (97)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (98) . . (98)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (99) . . (99)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (100) .. (100)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (101) .. (101)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (102) .. (102)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (103) .. (103)

<223> Q <220>

<221> VARIANTE

<222> (104) .. (104)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (105) .. (105)

<223> F O Y

<220>

<221> VARIANTE

<222> (106) .. (106)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (107) ...(107)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (108) .. (108)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (109) .. (109)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (110) .. (110)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (111) .. (111)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (112) .. (112)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (114) .. (114)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (116) .. (116)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (118) .. (118)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (119) .. (119)

<223> S <220>

<221> VARIANTE

<222> (120) .. (120)

<223> G O A O V O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (121) .. (121)

<223> G O A O V O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (122) .. (122)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (124) .. (124)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (125) .. (125)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (126) .. (126)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (127) .. (127)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (128) .. (128)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (129) .. (129)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (130) .. (130)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (131) .. (131)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (132) .. (132)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (133) .. (133)

<223> E <220>

<221> VARIANTE

<222> (134) .. (134)

<223> G O A O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (135) .. (135)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (136) .. (136)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (137) .. (137)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (138) .. (138)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (139) .. (139)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (140) .. (140)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (141) .. (141)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (142) .. (142)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (143) .. (143)

<223> I O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (144) .. (144)

<223> I O V O L O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (145) .. (145)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (146) .. (146)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (147) .. (147)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (148) .. (148)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (149) .. (149)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (150) .. (150)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (151) .. (151)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (152) .. (152)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (153) .. (153)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (154) .. (154)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (155) .. (155)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (156) .. (156)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (157) .. (157)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (158) .. (158)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (159) .. (159)

<223> G O A O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (160) .. (160)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (161) .. (161)

<223> G O A O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (162) .. (162)

<223> G O A O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (164) .. (164)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (165) .. (165)

<223> G O A O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (166) .. (166)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (169) .. (169)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (170) .. (170)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (171) .. (171)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (174) .. (174)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (175) .. (175)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (176) .. (176)

<223> I O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (177) .. (177)

<223> F O W <220>

<221> VARIANTE

<222> (178) .. (178)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (179) .. (179)

<223> G O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (180) .. (180)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (181) .. (181)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (182) .. (182)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (184) .. (184)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (185) .. (185)

<223> L O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (186) .. (186)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (187) .. (187)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (188) .. (188)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (189) .. (189)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (190) .. (190)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (191) .. (191)

<223> S <220>

<221> VARIANTE

<222> (192) .. (192)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (193) .. (193)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (194) .. (194)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (195) .. (195)

<223> I O L O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (196) .. (196)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (197) .. (197)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (198) .. (198)

<223> I O A O L O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (199) .. (199)

<223> I O A O V O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (200) .. (200)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (201) .. (201)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (202) .. (202)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (203) .. (203)

<223> G O V O L O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (204) .. (204)

<223> E <220>

<221> VARIANTE

<222> (205) .. (205)

<223> G O L O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (206) .. (206)

<223> G O L O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (207) .. (207)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (208) .. (208)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (209) .. (209)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (210) .. (210)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (211) .. (211)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (212) .. (212)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (213) .. (213)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (214) .. (214)

<223> G O V O A O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (215) .. (215)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (216) .. (216)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (217) .. (217)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (218) .. (218)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (219) .. (219)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (220) .. (220)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (221) .. (221)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (222) .. (222)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (223) .. (223)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (224) .. (224)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (225) .. (225)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (227) .. (227)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (228) .. (228)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (229) .. (229)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (230) .. (230)

<223> I O L O A O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (231) .. (231)

<223> Y O W <220>

<221> VARIANTE

<222> (232) .. (232)

<223> H O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (233) .. (233)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (235) .. (235)

<223> H O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (236) .. (236)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (237) .. (237)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (238) .. (238)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (239) .. (239)

<223> G O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (240) .. (240)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (241) .. (241)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (243) .. (243)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (244) .. (244)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (245) .. (245)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (246) .. (246)

<223> R O H <220>

<221> VARIANTE

<222> (247) .. (247)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (248) .. (248)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (249) .. (249)

<223> G O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (250) .. (250)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (252) .. (252)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (253) .. (253)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (254) .. (254)

<223> G O I O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (255) .. (255)

<223> G O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (256) .. (256)

<223> L O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (257) .. (257)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (258) .. (258)

<223> G O L O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (259) .. (259)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (260) .. (260)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (261) .. (261)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (262) .. (262)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (263) .. (263)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (264) .. (264)

<223> G O A O I O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (265) .. (265)

<223> G O A O I O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (267) .. (267)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (268) .. (268),

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (269) .. (269)

<223> G O L O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (270) .. (270)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (272) ., (272)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (273) ., (273)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (274) .. (274)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (276) .. (276)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> ( 27.7) . . (2 7 7 )

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (278) .. (278)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (279) .. (279)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (280) .. (280)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (281) .. (281)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (282) ., (282)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (283) .. (283)

<223> G O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (284) .. (284)

<223> K O R

<220>

<221> VARIANTE

<222> (286) .. (286)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (287) .. (287)

<223> G O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (288) .. (288)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (290) .. (290)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (291) .. (291)

<223> E <220>

<221> VARIANTE

<222> (292) .. (292)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (293) .. (293)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (294) .. (294)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (295) .. (295)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (296) .. (296)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (297) .. (297)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (298) .. (298)

<223> G O I O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (299) .. (299)

<223> G O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (300) .. (300)

<223> G O L O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (301) .. (301)

<223> G O L O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (302) .. (302)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (303) .. (303)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (304) .. (304)

<223> G O L O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (305) .. (305)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (306) .. (306)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (307) .. (307)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (308) .. (308)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (309) .. (309)

<223> G O I O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (310) .. (310)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (311) .. (311)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (312) .. (312)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (313) .. (313)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (314) .. (314)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (315) .. (315)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (316) .. (316)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (317) .. (317)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (318) .. (318)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (319) .. (319)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (320) .. (320)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (321) .. (321)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (322) .. (322)

<223> G O L O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (323) .. (323)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (324) .. (324)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (325) .. (325)

<223> G O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (326) .. (326)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (327) .. (327)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (328) .. (328)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (329) .. (329)

<223> A O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (330) .. (330)

<223> D <220>

<221> VARIANTE

<222> (331) .. (331)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (332) .. (332)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (333) .. (333)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (334) .. (334)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (335) .. (335)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (336) .. (336)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (337) .. (337)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (338) .. (338)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (339) .. (339)

<223> V O I O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (340) .. (340)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (341) .. (341)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (342) .. (342)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (343) .. (343)

<223> K O H <220>

<221> VARIANTE

<222> (345) .. (345)

<223> I O G O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (346) .. (346)

<223> I O G O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (347) .. (347)

<223> F O Y

<220>

<221> VARIANTE

<222> (348) .. (348)

<223> R O K

<220>

<221> VARIANTE

<222> (349) .. (349)

<223> I O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (350) .. (350)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (351) .. (351)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (352) .. (352)

<223> G O I O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (353) .. (353)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (354) .. (354)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (355) .. (355)

<223> F O Y

<220>

<221> VARIANTE

<222> (356) .. (356)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (357) .. (357)

<223> I O A O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (358) .. (358)

<223> G O A O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (359) .. (359)

<223> G O A O I O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (360) .. (360)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (361) .. (361)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (362) .. (362)

<223> I O V O L O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (363) .. (363)

<223> I O V O G O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (364) .. (364)

<223> K O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (365) .. (365)

<223> L O G O V O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (366) .. (366)

<223> L O G O V O I

<220>

<221> VARIANTE

<222> (369) .. (369)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (370) .. (370)

<223> G O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (372) .. (372)

<223> G O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (381) .. (381)

<223> G O A O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (382) .. (382)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (383) .. (383)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (384) .. (384)

<223> G O I O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (385) .. (385)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (387) .. (387)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (388) .. (388)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (389) .. (389)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (390) .. (390)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (391) .. (391)

<223> G O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (392) ., (392)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (393) .. (393)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (395) .. (395)

<223> F O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (396) .. (396)

<223> S <220>

<221> VARIANTE

<222> (397) .. (397)

<223> Q

<220>

<221> VARIANTE

<222> (398) .. (398)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (399) .. (399)

<223> G O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (400) .. (400)

<223> Y O W

<220>

<221> VARIANTE

<222> (401) .. (401)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (402) .. (402)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (403) .. (403)

<223> A O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (404) .. (404)

<223> A O I O L O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (405) .. (405)

<223> A O I O V O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (406) .. (406)

<223> A O I O V O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (407) .. (407)

<223> A O I O V O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (409) .. (409)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (410) .. (410)

<223> A O G O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (411) .. (411)

<223> V O G O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (412) .. (412)

<223> V O G O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (413) .. (413)

<223> V O L O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (414) .. (414)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (416) .. (416)

<223> G O V O I O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (417) .. (417)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (418) .. (418)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (419) .. (419)

<223> G O V O I O A

<220>

<221> VARIANTE

<222> (420) .. (420)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (421) .. (421)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (422) .. (422)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (423) .. (423)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (424) .. (424)

<223> E <220>

<221> VARIANTE

<222> (425) .. (425)

<223> G O I O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (426) .. (426)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (427) .. (427)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (428) .. (428)

<223> G O A O I O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (430) .. (430)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (431) ...(431 )

<223> V O I O A O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (432) .. (432)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (433) .. (433)

<223> G O I O A O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (434) .. (434)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (435) .. (435)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (436) .. (436)

<223> R O H

<220>

<221> VARIANTE

<222> (437) .. (437)

<223> A O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (438) .. (438)

<223> A O I O L O G

<220>

<221> VARIANTE

<222> (439) .. (439)

<223> A O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (440) .. (440)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (441) .. (441)

<223> S

<220>

<221> VARIANTE

<222> (442) .. (442)

<223> G O I O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (444) .. (444)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (446) .. (446)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (447) .. (447)

<223> D

<220>

<221> VARIANTE

<222> (448) .. (448)

<223> G O I O V O L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (449) .. (449)

<223> N

<220>

<221> VARIANTE

<222> (450) .. (450)

<223> T

<220>

<221> VARIANTE

<222> (451) .. (451)

<223> G O I O L O V

<220>

<221> VARIANTE

<222> (452) .. (452)

<223> E

<220>

<221> VARIANTE

<222> (453) .. (453)

<223> E <220>

<221> VARIANTE

<222> (454) .. (454)

<223>: A·OR I O L O V 5

<220>

<221> VARIANTE

<222> (455) .. (455)

<223>: A O I O L O G 10

<220>

<221> VARIANTE

<222> (456) .. (456)

<223>: A O I O L O G 15

<220>

<221> VARIANTE

<222> (457) .. (457)

<223>: A O I O L O G 20

<400> 15 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

5

<220>

<223> Oligonucleótido 1 para sonda de ADNc

<400> 16

aagccctggg agaaatagag: 20

10

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

15

<220>

<223> Oligonucleótido 2 para sonda de ADNc

<400> 17

cagttagtaa gccgagaacc: 20

20

<210> 18

<211> 307

<212> ADN

<213> Artificial

25

<220>

<223> Sonda de ADNc

<400> 18

<210> 19

<211> 8837

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum 35

<220>

<221> característica variada

<222> (1380) .. (1383)

<223> exón 40

<220>

<221> característica variada

<222> (1470) .. (1563)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (1606) .. (1786)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (1868) .. (2150)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (2243) .. (2385)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (2531) .. (2612)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (2799) .. (3034)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (3226) .. (3352)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (3519) .. (3574)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (4044) .. (4117)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (4258) .. (4432)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (4598) .. (4660)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (5244) .. (5324)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (5517) .. (5627)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (5726) .. (5801)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (6027) ., (6202)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (6547) .. (6620)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (6848) .. (6950)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (7048) .. (7140)

<223> exón

<220>

<221> sitio poliA

<222> (353) ..(7353)

<400> 19

<210> 20

<211> 8124 5 <212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<220>

<221> característica variada 10 <222> (1384) .. (1384)

<223> sitio de comienzo de la transcripción

<220>

<221>característica variada 15 <222> (1458) .. (1541)

<223> exón <220>

<221> característica variada

<222> (1625) .. (1907)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (2000) .. (2377)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (2560) .. (2795)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (3027) .. (3153)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (3321) .. (3376)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (3840) .. (3913)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (4053) .. (4227)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (4392) .. (4454)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (5044) .. (5124)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (5317) .. (5427)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (5526) .. (5601)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (5812) .. (5954)

<223> exón

<220>

<221> característica variada

<222> (6332) .. (6405)

<223> exón

<220> <221>característica variada

<222> (6633) .. (6735)

<223>: exón 5

<220>

<221> característica variada

<222> (6833) .. (6925)

<223>: exón 10

<220>

<221> sitio poliA

<222> (7138) .. (7138)

<210> 21

<211> 743

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 21

<210> 22

<211> 718

<212> PRT

<213> Gossypiumn hirsutum

<400> 22

<211> 2232

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<400> 23

<210> 24

<211> 2157

<212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<400> 24

Claims

REIVINDICACIONES

1) Un método para producir una planta de algodón que es apta para resistir una sequía sin penalización sobre el rendimiento, que comprende las operaciones de a) introducir un gen quimérico en una célula de algodón, para generar una célula de algodón transgénico,

comprendiendo dicho gen quimérico los siguientes fragmentos de ADN engarzados operativamente: i) un promotor expresable en plantas: ii) una región de ADN transcribible que comprende

(1)

una primera región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre la secuencia de nucleótidos de un gen parp2 o de un ADNc de parp2 procedente de una especie de algodón en la que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No.: 20;

(2)

una segunda región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 entre 20 nucleótidos consecutivos seleccionados entre dicha primera región de ADN; en donde dicha primera región de ADN y dicha segunda región de ADN están en una orientación de repetición invertida una con respecto a la otra y en donde una molécula de ARN transcrito a partir de dicha reacción transcribible es capaz de formar una región de ARN de doble hebra entre una región de ARN transcrita a partir de dicha primera región de ADN y una región de ARN transcrita a partir de dicha segunda región de ADN; y

iii) una región de ADN que comprende una señal de terminación de la transcripción y de

poliadenilación, que es funcional en plantas;: b) regenerar dicha célula de algodón transgénico para obtener una planta de algodón transgénico; y c) identificar una planta de algodón transgénico que tiene una aptitud aumentada para resistir a condiciones

de estrés por sequía sin ninguna penalización sobre el rendimiento en comparación con una planta de algodón no transformada.

2) El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótidos de dicho gen parp2 o dicho ADNc de parp2 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que a su vez comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 13 o SEQ ID No.: 21 o SEQ ID No.: 22.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos de dicho gen parp2 o dicho ADNc de parp2 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 15.

4) El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, en el que dicha primera y dicha segunda regiones de ADN comprenden por lo menos 50 nucleótidos consecutivos.

5) El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, en el que dicha primera y dicha segunda regiones de ADN comprenden por lo menos 200 nucleótidos consecutivos.