ES2382464T3 - Mutantes de factor del crecimiento de actividad elevada - Google Patents

Abstract

Proteína relacionada con GDF-5 recombinante con actividad biológica mejorada en la que a) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 453 (M453) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina, valina o isoleucina, y/o b) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 456 (M456) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina, valina o isoleucina, y en la que la misma comprende una secuencia que coincide con una o más de las fórmulas de aminoácidos genéricas siguientes: a) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSHLEPTNHAX15 IQTLZTNSMX16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX27X28NNVVY X29X30YEX31MVVEX32CGCR o b) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15 IQTLMNSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX28NNVVYX29X30YEX31MVVEX32CGCR o c) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15 IQTLZ1NSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LPISILX25X26DX27X28NNVV YX29X30YEX31MVVEX32CGCR en las que X1 indica asparagina (N) o serina (S) X2 indica arginina (R) o lisina (K) X3 indica alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) o serina (S) X4 indica asparagina (N) o ácido aspártico (D) X5 indica arginina (R) o lisina (K) X6 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X7 indica leucina (L) o metionina (M) X8 indica isoleucina (I) o valina (V) X9 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X10 indica histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina (Y) X11 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X12 indica leucina (L), metionina (M) o valina (V) X13 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X14 indica isoleucina (I) o leucina (L) X15 indica isoleucina (I) o valina (V) X16 indica alanina (A), asparagina (N) o ácido aspártico (D) X17 indica arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) o serina (S) X18 indica alanina (A), asparagina (N), serina (S) o treonina (T) X19 indica alanina (A), metionina (M) o treonina (T) X20 indica alanina (A) o prolina (P) X21 indica serina (S) o treonina (T) X22 indica alanina (A), serina (S) o treonina (T) X23 indica arginina (R) o lisina (K) X24 indica serina (S) o treonina (T) X25 indica fenilalanina (F) o tirosina (Y) X26 indica isoleucina (I) o treonina (T) X27 indica alanina (A) o serina (S) X28 indica alanina (A) o glicina (G) X29 indica asparagina (N) o lisina (K) X30 indica ácido glutámico (E) o glutamina (Q) X31 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E), X32 indica alanina (A), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T) Z1 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V), Z2 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V), o una secuencia correspondiente en la que la cisteína que es responsable de la formación de dímero se sustituye por un aminoácido diferente o se suprime.

Description

Mutantes de factor del crecimiento de actividad elevada

La invención se refiere a mutantes de factor del crecimiento biosintéticos recombinantes novedosos que muestran actividad biológica mejorada. Dicha actividad de proteína mejorada se consigue mediante la sustitución de aminoácidos específicos de las proteínas del factor de crecimiento originales que son proteínas de origen natural de la superfamilia de factor del crecimiento transformante beta de moléculas de señalización. Las proteínas recombinantes proporcionadas en el presente documento son particularmente adecuadas para inducir regeneración, estimulación del crecimiento y diferenciación de diferentes células, tejidos y órganos. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos mutantes de proteínas recombinantes, vectores de expresión y células hospedadoras que contienen las moléculas de ácido nucleico, anticuerpos dirigidos frente a dichos mutantes de proteína, composiciones farmacéuticas y métodos para producir los mutantes del factor de crecimiento.

La superfamilia de proteínas de factor del crecimiento transformante beta (TGF-beta) comprende más de 35 miembros incluyendo TGF-betas, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), activinas, inhibinas y factores de crecimiento/diferenciación (GDF). Las proteínas de la superfamilia de TGF-beta promueven la proliferación y diferenciación celular así como la formación de tejido y son relevantes para una amplia diversidad de métodos y aplicaciones de tratamiento médico. Estas moléculas diméricas actúan a través de complejos de receptor específicos que están compuestos de serina/treonina quinasas receptoras de tipo I y tipo II. Las quinasas receptoras posteriormente activan proteínas Smad, que después propagan las señales en el núcleo para regular la expresión génica diana. Las rutas de señalización independientes de Smad también se inician por estos receptores y dan como resultado de la inducción de la ruta de MAP Quinasa. Las Smad son una familia única de moléculas de transducción de señal que pueden transmitir señales directamente desde los receptores de la superficie celular al núcleo, donde las mismas regulan la transcripción interaccionando con compañeros de unión a ADN así como coactivadores y coexpresores transcripcionales.

Los miembros de esta familia de proteínas se sintetizan inicialmente como proteínas precursoras grandes que posteriormente experimentan escisión proteolítica en un grupo de restos básicos de aproximadamente 110-140 aminoácidos desde el extremo C, liberando de este modo la parte de proteína madura del extremo C del prodominio N-terminal. Todos los polipéptidos maduros están relacionados estructuralmente y contienen un dominio bioactivo conservado que comprende seis o siete restos de cisteína canónicos que son responsables del motivo tridimensional característico de “nudo de cistina” de estas proteínas

Los diversos miembros de superfamilia se pueden clasificar adicionalmente en subfamilias y grupos diferentes, en base al alcance de la homología/identidad de su motivo de nudo de cistina. Las familias solapantes de proteínas morfogenéticas óseas y factores del crecimiento/diferenciación (GDF) se conoce que juegan un conjunto diverso de papeles en el sistema esquelético y otros tejidos (véase, es decir Ducy y Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214 para una revisión). Especialmente GDF-5 (la proteína se conoce también como MP52, CDMP-1 o algunas veces como BMP-14), GDF-6 (CDMP-2, BMP13) y GDF-7 (CDMP-3, BMP-12) humanas se han agrupado en conjunto por varios autores debido a sus propiedades biológicas comparables y el grado extraordinariamente elevado de identidad de secuencia de aminoácidos (véase, es decir Mikic 2004, Annals of Biomedical Engineering 32, 466-476; Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330).

Además de las funciones prominentes del subgrupo de GDF-5/-6/-7 en la formación de novo de hueso y cartílago (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85-A, 1544-1552; Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130), se ha demostrado de forma repetida que los miembros de este subgrupo también son inductores y reguladores importantes de tendones y ligamentos (Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330), tejidos nerviosos (Farkas et al. 1997, Neurosci Lett. 236,120-122; Watakabe et al. 2001, J. Neurochem. 76, 1455-1464), ligamento periodontal y dientes (Sena et al. 2003, J. Dent. Res. 82, 166-171; Morotome et al. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 85-90) y otros tejidos.

Las estructuras de genes y proteínas de diversos BMP/GDF de origen natural incluyendo GDF-5, GDF-6 y GDF-7 se han dilucidado previamente. Se podrían identificar varios mutantes de pérdida de función de GDF-5 los cuales, es decir, conducen al acortamiento de dedos de las manos y de los pies (braquidactília de tipo C) y otras anormalidades esqueléticas tales como braquipodismo en animales (Storm et al. 1994, Nature 368, 639-643) y displasias acromesomélicas en el hombre (Thomas et al. 1996, Nature Gen. 12, 315-317). Con respecto a estos mutantes se ha observado que las sustituciones de aminoácidos específicas en las posiciones 173, 204, 400, 438, 441 y 498 de GDF-5 humana reducen o abolen completamente la función de la proteína (Schwabe et al. 2004, Amer. J. Med Genet. 124A, 356-363). Por el contrario, se conocen hasta la fecha únicamente algunos pocos mutantes de GDF con actividad biológica potenciada. Un ejemplo raro se divulga en el documento WO01/11041 y se refiere a GDF-5 monomérico activo que carece del resto de cisteína normalmente responsable de la dimerización.

La búsqueda de las moléculas responsables de la actividad inductora de hueso, cartílago y otros tejidos ha conducido al descubrimiento de un conjunto de moléculas denominadas factores de crecimiento/diferenciación. Debido a sus actividades inductoras de tejido únicas estas proteínas se han aplicado satisfactoriamente en investigación terapéutica y cirugía regenerativa en las cuales las mismas promueven y ayudan al proceso de curación natural de tejidos dañados, bien sea solas o en combinación con materiales de vehículo y o de matriz específicos. Sin embargo existe una necesidad enorme de desarrollar formas mejoradas y más eficaces de estas proteínas para tales propósitos.

Este objeto se resuelve de acuerdo con la invención proporcionando proteínas recombinantes novedosas obtenidas a partir de proteínas relacionadas con GDF-5 que muestran actividad biológica mejorada como se describe en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas.

Con el fin de evitar malos entendidos y ambigüedades, algunos términos usados frecuentemente en el presente documento se definen y se ilustran de la manera siguiente:

El término “domino de nudo de cistina” como se usa en el presente documento significa la región de aminoácidos con alto contenido en cisteína bien conocida y conservada que está presente en las partes maduras de las proteínas de la superfamilia de TGF-beta tales como GDF-5 humana y que forman una estructura de proteína tridimensional conocida como nudo de cisteína. En este dominio, el emplazamiento respectivo de los restos de cisteína con respecto los unos a los otros es importante y se permite que varíe únicamente ligeramente con el fin de no perder la actividad biológica. Las secuencias de consenso para dominios de nudo de cistina se conocen en el estado de la técnica. De acuerdo con la definición definida en el presente documento el dominio de nudo de cistina de una proteína comienza con el primer resto de cisteína que participa en el nudo de cistina de la proteína respectiva y finaliza con el resto que sigue a la última cisteína que participa en el nudo de cistina de la proteína respectiva. Por ejemplo, el dominio de nudo de cistina de la proteína precursora GDF-5 humana (SEC ID Nº 1) comprende los aminoácidos 400-501 (véase también la Figura 1).

El término “proteína relacionada con GDF-5” como se usa en el presente documento significa cualquier proteína de origen natural o creada artificialmente que comprende un dominio de nudo de cistina con una identidad de aminoácidos de al menos el 60% con el dominio de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humana (aminoácidos 400501 de Figura 1/SEC ID Nº 1) y que porta un resto de metionina en una posición equivalente al resto de metionina 453 (M453) de GDF-5 humana y un resto de metionina o leucina en una posición equivalente a metionina 456 (M456) de GDF-5 humana. Se incluyen las proteínas que pertenecen al grupo de las proteínas GDF-5, GDF-6 y GDF-7 de especies de vertebrados o mamíferos así como también variantes recombinantes de las mismas siempre y cuando estas proteínas cumplan con los requerimientos mencionados anteriormente.

Los ejemplos no limitantes de proteínas no limitantes relacionadas con GDF-5 de acuerdo con la definición anterior son GDF-5 humana (divulgada como MP52 en el documento WO95/04819 y en Hötten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), GDF-5/MP52 humana recombinante (documento WO96/33215), GDF-5 de ratón (documento US 5.801.014), CDMP-1 (documento WO96/14335), MP52 humana de HMW (documento WO97/04095), GDF-5 de conejo (Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), GDF-6/BMP-13 humana (documento US 5.658.882), GDF-6 bovina (NCBI P55106), GDF-6 de ratón (Nº de acceso de NCBI NP_038554), GDF-6/CDMP-2 (documento WO96/14335), GDF-7/BMP-12 humana (documento US 5.658.882), GDF-7 de ratón (Nº de acceso de NCBI AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (documento WO96/143335), GDF-5 de pollo (Nº de acceso de NCBI NP_989669), GDF-5 de Xenopus laevis (Nº de acceso de NCBI AAT99303), GDF-5, -6 y -7 monomérica (documentos WO 01/11041 y WO99/61611), como se muestra en las Figuras 3 y 4.

El término “mutante ML” como se usa en el presente documento significa una proteína recombinante obtenida a partir de una proteína relacionada con GDF-5 en la que, después del alineamiento con GDF-5 humana como se ha descrito en la presente solicitud, el aminoácido equivalente a la metionina 453 (M453) de GDF-5 humana no es metionina y/o el aminoácido equivalente a metionina 456 (M456) de GDF-5 humana (SEC ID Nº 1) no es metionina

(N) o leucina (L).

La expresión “actividad biológica mejorada” como se usa en el presente documento se refiere a una actividad biológica de un mutante de ML que asciende a al menos el 120% de la actividad de la proteína no mutada respectiva.

La expresión “actividad biológica” indica la actividad de una proteína relacionada con GDF-5 medida mediante uno o más de los siguientes ensayos:

a) un ensayo de fosfatasa alcalina in vitro (ALP), por ejemplo, como se describe en Takuwa et al. (1989), Am.J. Physiol. 257, E797-E803); b) medición de supervivencia aumentada de neuronas dopaminérgicas según se describe por ejemplo por Krieglstein et al. 1995 (J. Neuroscience Res. 42, 724-732) o Sullivan et al. 1997 (Neuroscience Letters 233, 7376); c) la extensión de fibras nerviosas desde la retina embrionaria medida por ejemplo, como se describe es decir en el documento WO97/03188; d) el potencial angiogénico de estas proteínas verificado por ejemplo en un modelo de microbolsa corneal in vivo como se describe en Yamashita et al. 1997 (Exp. Cell Research 235, 218-226);

e) efectos de proteínas relacionadas con GDF-5 sobre la diferenciación terminal de mioblastos determinada según se describe, por ejemplo, por Inada et al 1996 (Biochem Biophys Res Commun. 222, 317-322); f) ensayos in vivo que miden el potencial inductor de tales proteínas con referencia a tendón y ligamento, por ejemplo, como se divulga en Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330; g) medición de la cascada de transducción de señal a través de la activación de Smad usando un ensayo de gen informador en base a los elementos de unión a Smad que preceden al gen de luciferasa de luciérnaga, por ejemplo, como se ha descrito previamente (Nohe et al., 2002. J Biol Chem. 277, 5330-5338.)

El término “variante” significa cualquiera de los siguientes polipéptidos:

a) fragmentos biológicamente activos de una proteína b) construcciones de proteína que contienen secuencias adicionales en exceso a la secuencia original de la proteína c) cualquier combinación de a) y b)

El grupo de GDF-5/-6/-7 de la superfamilia de proteínas TGF-beta, que comprende GDF-5 como su miembro mejor caracterizado, está altamente conservado entre especies de vertebrados/mamíferos (Ducy y Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214). Se ha observado actualmente de forma sorprendente por medio de estudios mutacionales y otros experimentos que los restos de aminoácidos que corresponden a la metionina 453 (M453) y metionina 456 (M456) de GDF-5 humana se pueden sustituir con algunos aminoácidos especificados sin efectos negativos sobre la función de la proteína. Además, estas sustituciones incluso aumentan la actividad biológica de las proteínas de forma significativa.

Esta realización de la invención se ilustra adicionalmente mediante las Figuras 1, 2 y 3. La Figura 1 muestra la proteína precursora GDF-5 humana (Hötten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652) que consiste en un predominio de 381 aa (aa 1-381 incluyendo péptido señal (aa 1-27), letras en negritas) y una parte madura de 120 aa (aa 382-501). La parte madura o especialmente el dominio de nudo de cistina (aa 400-501, subrayado) son suficientes para la función biológica de la proteína. Los restos M453 y M456 (recuadros grises) están localizados dentro de este dominio de nudo de cistina. Los restos correspondientes en los dominios de nudo de cistina y otras proteínas relacionadas con GDF-5 se muestran en la Figura 2 y Figura 3 (marcados por flechas). Los restos correspondientes en proteínas no mostrados en estas figuras se pueden determinar fácilmente mediante un alineamiento de secuencia con GDF-5 humana.

Se ha observado en proteínas relacionadas con GDF-5 que cuando el resto de metionina en una posición correspondiente a metionina 453 (M453) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) se reemplaza con un aminoácido elegido entre alanina (A), valina (V) o isoleucina (L), la proteína recombinante resultante tiene actividad biológica aumentada.

Una realización preferida, el aminoácido elegido es valina (V) para la posición M453.

También se ha observado que cuando el resto de metionina en la posición correspondiente a la metionina 456 (M456) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) se reemplaza con un aminoácido elegido entre alanina (A), valina (V) o isoleucina (L), de forma independiente o en combinación con un reemplazo de M453, la proteína recombinante resultante tiene actividad biológica aumentada.

En una realización preferida, el aminoácido elegido es valina (V) para la posición M456.

Estos mutantes ML de proteínas relacionadas con GDF-5 en los que los equivalentes de M453 y/o M456 se sustituyen con los aminoácidos especificados anteriormente muestran una actividad biológica que aventaja enormemente la actividad de las proteínas no mutadas respectivas.

Como un ejemplo, la Figura 5 muestra la capacidad potenciada del mutante de ML de hGDF-5 M453V/M456V de inducir fosfatasa alcalina in vitro. La proteína mutante muestra una actividad biológica del 585,5% (a 133 ng/ml), el 356,3% (a 400 ng/ml) y el 236,3% (a 1.200 ng/ml) de la actividad de la proteína de tipo silvestre (rh-GDF-5) en este ensayo (promedio de múltiples experimentos). Por tanto, la actividad promedio es 585,5 + 356,3 + 236,3 : 3 = 392,7% de la actividad de la proteína de tipo silvestre (rh-GDF-5). La actividad mínima medida para el mutante a una concentración de proteína única y en un experimento único fue el 150% de la actividad de la proteína de tipo silvestre.

Por tanto, los mutantes ML que muestran una actividad biológica mejorada que asciende a al menos el 120% de la actividad de la proteína no mutada respectiva están incluidos en la invención. Son especialmente preferidos los mutantes ML relacionados con GDF-5 con actividades biológicas mejoradas de al menos el 150%, preferentemente el 160%, más preferentemente al menos el 170%, más preferentemente al menos el 180% y lo más preferente es que sea al menos el 200% de la actividad biológica de la proteína no mutada respectiva.

Las actividades biológicas de proteínas relacionadas con GDF-5 y mutantes ML de las mismas, es decir, en el campo de inducción de hueso, cartílago y tejido conectivo tal como, es decir, ligamento periodontal se puede determinar fácilmente con la ayuda de sistemas de ensayo preestablecidos. El más útil y preferido es un ensayo in vitro común conocido como ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) (Takuwa et al. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803), que también se demuestra en el ejemplo 2 / Figura 5. Se ha demostrado que las proteínas relacionadas con GDF-5 aumentan la actividad de fosfatasa alcalina, es decir, en células osteoprogenitoras ROB-C26 (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) como se describe en el documento W095/04819, en células ATDC5 embrionarias (Riken Gene Bank, ROB 0565), en células MCHT-1/26 estromales de ratón y en células de ligamento periodontal (HPDL) como se muestra en Nakamura et al. 2003, J. Periodontal Res. 38,597-605.

Las proteínas relacionadas con GDF-5 como se define en el presente documento comprenden un dominio de nudo de cistina con una identidad de aminoácidos de al menos el 60%, preferentemente al menos el 75%, más preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90% y lo más preferente es que sea al menos el 95%, con el dominio de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humana. Un valor limitante del 60% es bien adecuado para separar los miembros del grupo GDF-5/-6/-7 de proteínas así como variantes del mismo de proteínas adicionales tales como otros GDF-5 y BMP. Una comparación de los dominios de nudo de cistina de 102 aa de GDF-5 humana, GDF-6 humana y GDF-7 humana (Figura 2) muestra el alto grado de identidad de aminoácidos entre estas proteínas. GDF-6 humana comparte 87 (el 85%) y GDF-7 humana 83 (el 81%) restos idénticos con el dominio de nudo de cistina de GDF-5 humana. Los dominios respectivos de moléculas de GDF-5/-6/-7 a partir de otras especies de vertebrados y mamíferos que se han identificado hasta ahora también muestran porcentajes de identidad muy elevados de al menos el 75% (entre el 79% y el 99%), cuando se comparan con GDF-5 humana (Figura 4). Por el contrario, los GDF y BMP que no pertenecen al subgrupo de GDF-5/-6/-7 presentan valores de identidad mucho más bajos por debajo del 60%.

La determinación de posiciones de aminoácido en secuencias de aminoácidos relacionadas así como el cálculo o porcentaje de identidad entre los mismos se puede realizar con la ayuda de algoritmos de alineamiento bien conocidos y opcionalmente programas informáticos que usan estos algoritmos. Las identidades de aminoácido en esta solicitud de patente se han calculado mediante el alineamiento de secuencias con el programa gratuito ClustaIX (Versión 1.81) con parámetros por defecto y recuento posterior de restos idénticos manualmente. Los ajustes por defecto para alineamiento por pares (baja precisión) son: parámetro de apertura de hueco: 10,00; parámetro de extensión de hueco 0,10; matriz de peso de Proteína: Gonnet 250. El programa ClustaIX se describe con detalle en:

Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. y Higgins, D.G. (1997) The ClustaIX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876-4882

ClustaIX es una interfaz de Windows para el programa de alineamiento múltiple de secuencias ClustaIW y está, es decir, disponible a partir de diversas fuentes, es decir mediante ftp anónimo de ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.emblheidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk o a través de la descarga a partir de la siguiente página web: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/. El programa ClustaIW y el algoritmo también se describen en detalle en:

Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680.

Los mutantes ML de acuerdo con la invención que se obtienen a partir de proteínas relacionadas con GDF-5 generalmente son aplicables en cualquier indicación en la cual proteínas relacionadas con GDF-5 tales como GDF5, GDF-6 y GDF-7 también son útiles. Se ha demostrado que proteínas relacionadas con GDF-5 son inductoras y reguladoras/diferenciadoras importantes de, es decir, hueso y cartílago (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85-A, 1544-1552; Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130), tejido conectivo tal como tendón y ligamento (Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330), tejido nervioso (Farkas et al. 1997, Neurosci Lett. 236,120-122; Watakabe et al. 2001 , J. Neurochem. 76, 1455-1464), células madre (Shimaoka et al. 2003, J. Biomed. Materials Res. Part A 68A, 168-176; Bal et al. 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 453-460) y ligamento periodontal y dientes (Sena et al 2003, J. Dent. Res. 82, 166-171; Morotome et al, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 85-90).

Los mutantes ML de la presente invención comprenden una secuencia que coincide con una de las siguientes secuencias de aminoácidos genéricas

a)

CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSHLEPTNHAX15

IQTLZTNSMX16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX27X28NNVVY

X29X30YEX31MVVEX32CGCR o

b) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15

IQTLMNSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX28NNVVYX29X30YEX31MVVEX32CGCR o

c) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15 IQTLZ1NSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LPISILX25X26DX27X28NNVV YX29X30YEX31MVVEX32CGCR

y en la que cada X indica cualquier aminoácido, Z1 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V),

Z2 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V). y en la que X1 indica asparagina (N) o serina (S) X2 indica arginina (R) o lisina (K) X3 indica alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) o serina (S) X4 indica asparagina (N) o ácido aspártico (D) X5 indica arginina (R) o lisina (K) X6 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X7 indica leucina (L) o metionina (M) X8 indica isoleucina (I) o valina (V) X9 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X10 indica histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina (Y) X11 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X12 indica leucina (L), metionina (M) o valina (V) X13 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X14 indica isoleucina (I) o leucina (L) X15 indica isoleucina (I) o valina (V) X16 indica alanina (A), asparagina (N) o ácido aspártico (D) X17 indica arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) o serina (S) X18 indica alanina (A), asparagina (N), serina (S) o treonina (T) X19 indica alanina (A), metionina (M) o treonina (T) X20 indica alanina (A) o prolina (P) X21 indica serina (S) o treonina (T) X22 indica alanina (A), serina (S) o treonina (T) X23 indica arginina (R) o lisina (K) X24 indica serina (S) o treonina (T) X25 indica fenilalanina (F) o tirosina (Y) X26 indica isoleucina (I) o treonina (T) X27 indica alanina (A) o serina (S)

X28 indica alanina (A) o glicina (G) X29 indica asparagina (N) o lisina (K)

X30 indica ácido glutámico (E) o glutamina (Q)

X31 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E),

X32 indica alanina (A), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T)

Z1 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V),

Z2 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V),

o una secuencia correspondiente en la que la cisteína responsable de la formación de dímeros se sustituye por un aminoácido diferente o se suprime.

Estas secuencias genéricas se han compilado a partir de una comparación de los dominios de nudo de cistina de secuencias de GDF-5, GDF-6 y GDF-7 de vertebrado de acuerdo con la Fig. 3. Las posiciones que no están conservadas en las proteínas alineadas se indican con una X en las secuencias genéricas. Las posiciones que están mutadas de acuerdo con la presente invención se indican con una Z.

En otra realización preferida, la proteína mutante de ML de acuerdo con la invención es un mutante de ML de una proteína GDF-5 de vertebrado o recombinante o una variante de la misma. Más preferidos son los mutantes ML de una proteína GDF-5 de mamífero o variantes de la misma. Los ejemplos de proteínas GDF-5 de vertebrados y mamíferos son: GDF-5 humana (divulgada como MP52 en el documento WO95/04819 y como GDF-5 humana en Hotten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646 652), GDF-5/MP52 humana recombinante (documento WO96/33215), MP52 humanas de HMW (documento WO97/04095), CDMP-1 (documento WO96/14335), GDF-5 de ratón (Mus musculus) (documento US. 5.801.014), GDF-5 de conejo (Oryctolagus cuniculus) (Sanyal et al 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), GDF-5 de pollo (Gallus gallus) (Nº de acceso de NCBI NP_989669), GDF-5 de rana africana de uñas (Xenopus laevis) (Nº de acceso de NCBI AAT99303).

Otra realización preferida de la invención incluye proteínas mutantes ML de proteínas relacionadas con GDF-5 monoméricas. En estas proteínas monoméricas, la cisteína que es responsable de la formación de dímero se sustituye por otro aminoácido o se suprime. Tales proteínas se describen, por ejemplo, en los documentos WO 01/11041 y WO 99/61611, que se incorporan en el presente documento por referencia. Una proteína monomérica especialmente preferida es GDF - 5 monomérica recombinante como se divulga en dicha referencia.

En estas realizaciones se incluyen también mutantes ML de versiones alélicas de los genes/proteínas mencionados anteriormente así como mutantes ML de las proteínas de vertebrado, de mamífero y recombinantes o variantes de las mismas que tienen mutaciones adicionales tales como sustituciones, adiciones y supresiones, siempre y cuando estas mutaciones adicionales no tengan un efecto básico sobre la actividad de la proteína y cumplan los requisitos de las reivindicaciones.

En general, el mutante de ML de la proteína GDF-5 de vertebrado o de mamífero o recombinante o variantes de la misma se espera que muestre todas las actividades descritas previamente de GDF-5 y se puede aplicar donde quiera que se usen de forma satisfactoria las formas de GDF-5 de tipo silvestre y recombinante mencionadas anteriormente. Por ejemplo, se considera que GDF-5 es un promotor muy eficaz de formación de hueso y de cartílago así como también de formación de tejido conectivo (véase por ejemplo el documento WO 95/04819, Hötten et al. 1996, Growth Factors 13, 65-74; Storm et al. 1994, Nature 368, 639 643; Chang et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 28227-28234) y la formación de unión de tejido conectivo (documento EP 0 831 884). En este contexto, GDF-5 es útil para aplicaciones que se refieren a articulaciones entre elementos esqueléticos (véase por ejemplo Storm & Kingsley 1996, Development 122, 3969-3979). Un ejemplo para tejido conectivo es tendón y ligamento (Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330; Aspenberg & Forslund 1999, Acta Orthop Scand 70, 51-54; documento WO 95/16035). La proteína es útil para reparación de menisco y de disco espinal/intervertebral (Walsh et al. 2004, Spine 29, 156-63) y aplicaciones de fusión espinal (Spiro et al 2000, Biochem Soc trans. 28, 362-368). GDF-5 se puede aplicar de forma beneficiosa en aplicaciones dentales (dental y periodontal) (véanse por ejemplo, los documentos WO 95/04819; WO 93/16099; Morotome et al. 1998, Biochem Biophys Res Comm 244, 85-90) tal como la regeneración de dentina o ligamento periodontal.

GDF-5 también es útil en la reparación de heridas de cualquier tipo. También es beneficioso para promover crecimiento de tejido en el sistema neuronal y en la supervivencia de, por ejemplo, neuronas dopaminérgicas. En este contexto, GDF-5 se puede usar para tratar trastornos neurodegenerativos como, por ejemplo, enfermedad de Parkinson y posiblemente también enfermedad de Alzheimer o tejidos de Corea Huntington (véase por ejemplo, el documento WO 97/03188; Krieglstein et al., (1995) J. Neurosci Res 42, 724-732; Sullivan et al., (1997) Neurosci Lett 233, 73-76; Sullivan et al (1998), Eur. J Neurosci 10, 3681-3688). GDF-5 permite mantener la función nerviosa o conservar la función nerviosa en tejidos ya dañados. Por lo tanto GDF-5 se considera que es un factor neurotrófico aplicable de forma general.

También es útil para enfermedades del ojo, en particular retina, córnea y nervio óptico (véase por ejemplo el documento WO 97/03188; You et al (1999), Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296-311), para el crecimiento del pelo y el tratamiento y diagnóstico de trastornos relacionados con la piel (documento WO 02/076494; Battaglia et al 2002, Trans. Orthop. Res Soc. 27, 584) y para inducción de angiogénesis (Yamashita et al. 1997, Exp. Cell, Res 235, 21826).

Por otra parte, existe la prevención o la terapia de enfermedades asociadas con daño óseo y/o de cartílago o que influyen sobre enfermedad ósea y/o de cartílago o situaciones en general en las cuales se desea la formación de cartílago y/o de hueso o para fusión espinal y por otra parte, existe la prevención o terapia de tejido dañado o enfermo asociado con tejido conectivo incluyendo tendón y/o ligamento, tejido periodontal o dental incluyendo implantes dentales, tejido neuronal incluyendo tejido del SNC y situaciones neuropatológicas, tejido del sistema sensorial, hígado, páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, renal, uterino y tejido tiroideo, piel, membranas mucosas, endotelio, epitelio, para promoción o inducción de crecimiento nervioso, regeneración tisular, angiogénesis, curación de heridas incluyendo úlceras, quemaduras, lesiones o injertos de piel, inducción o proliferación de células progenitoras o células de médula ósea, para el mantenimiento de un estado de proliferación o diferenciación para el tratamiento o conservación de tejidos o células para trasplante de órgano o tejido, para la integridad del revestimiento gastrointestinal, para tratamiento de alteraciones en la fertilidad, anticoncepción o embarazo.

Las enfermedades relacionadas con órganos sensoriales como el ojo también se deben incluir en la indicación preferida de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Como enfermedades neuronales, nuevamente se pueden mencionar como ejemplos las enfermedades de Parkinson y Alzheimer.

El Ejemplo 3 y la FIG. 6 describen los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina con GDF-5 humana recombinante (documento WO96/33215) y el mutante de ML M453V/M456V de GDF-5 humana recombinante (rhGDF-5). GDF-5 humana recombinante se usó como patrón/control con actividad biológica del 100%. La proteína mutante muestra una actividad biológica del 585,5% (a 133 ng/ml), el 356,3% (a 400 ng/ml) y el 236,3% (a 1200 ng/ml) de la actividad de la proteína de tipo silvestre (rh-GDF-5) en este ensayo (promedio de múltiples experimentos). Por tanto, la actividad promedio es 585,5 + 356,3 + 236,3: 3 = 392,7% de la actividad de la proteína de tipo silvestre (rh-GDF-5). La actividad mínima medida para el mutante a una concentración de proteína única y en un experimento único fue el 150% de la actividad de la proteína de tipo silvestre.

Los mutantes ML de acuerdo con la invención se pueden producir fácilmente en diversos sistemas de expresión procariotas y eucariotas, en particular mediante expresión en procariotas y posterior renaturalización/replegamiento de acuerdo con métodos conocidos (véase, por ejemplo el documento WO96/33215).

Una materia objeto adicional de la presente invención es un ácido nucleico que codifica un mutante de ML de acuerdo con la invención. El ácido nucleico tiene una secuencia de forma que se consiga una sustitución de uno o ambos restos equivalentes a M453 y M456 de GDF-5 humana con uno de los aminoácidos especificados de la presente solicitud. Los tripletes de bases que codifican estos aminoácidos y la degeneración del código genético se conocen de forma general. El ácido nucleico puede ser una secuencia de ADN y/o una secuencia de ARN, siempre y cuando la proteína de acuerdo con la invención se pueda obtener a partir de este ácido nucleico tras la expresión en un sistema adecuado.

Los vectores de expresión son una materia objeto adicional de la presente invención, en los que el ácido nucleico se inserta en un sistema de vector adecuado, seleccionándose el sistema de vector de acuerdo con la expresión deseada de la proteína. El sistema de vector puede ser un sistema de vector eucariota, pero se prefiere un sistema de vector procariota, con lo cual las proteínas se pueden producir de una manera particularmente fácil y pura. Un vector de expresión adecuado se muestra, por ejemplo, en el documento WO96/33215. El vector de expresión también puede ser un vector viral que se puede usar, es decir, en enfoques de terapia génica.

Las células hospedadoras también son una materia objeto de la presente invención. Las células hospedadoras se caracterizan porque las mismas contienen un ácido nucleico o un vector de expresión de acuerdo con la invención y las mismas son capaces de usar la información presente en los ácidos nucleicos y en el vector de expresión, respectivamente, para la expresión de mutantes ML de acuerdo con la invención. Las células hospedadoras adecuadas son preferentemente células procariotas, en particular la mayoría de las cepas de E. coli. Las cepas hospedadoras particularmente útiles son descendientes de E. coli W3110 como se muestra, por ejemplo, en el documento WO96/33215. En una realización preferida, las células hospedadoras, preferentemente de origen humano, también pueden ser útiles para trasplante a pacientes que las necesitan.

Otra materia objeto de la presente invención son anticuerpos frente a mutantes ML. Estos anticuerpos de acuerdo con la presente invención son específicos para el mutante de ML recombinante reivindicado. Los mismos son específicos para las regiones de nudo de cistina de proteínas relacionadas con GDF-5 que contienen uno o más de los reemplazos de aminoácidos descritos en el presente documento. Los anticuerpos son específicos para una región de una proteína recombinante obtenida a partir de una proteína relacionada con GDF de acuerdo con la invención que abarca los aminoácidos 453-456. Estos anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden generar usando aquellos fragmentos de la proteína de la invención como se ha descrito anteriormente como inmunógenos para generar anticuerpos mediante métodos conocidos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y los mismos pueden ser de cualquier isotipo. También están comprendidos fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab o fragmentos Fab2. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos etc.

Materias objeto adicionales de la presente solicitud son composiciones farmacéuticas y/o de diagnóstico que comprenden al menos un mutante de ML de una proteína relacionada con GDF-5 o un ácido nucleico o un vector o una célula hospedadora de acuerdo con la invención. En general son adecuadas todas las composiciones farmacéuticas que se han publicado en el contexto de proteínas relacionadas con GDF-5. Un vector de expresión o una célula hospedadora se puede considerar que es provechosa como sustancias activas en una composición farmacéutica y/o de diagnóstico. También las combinaciones de una proteína de acuerdo con la invención con otras proteínas se pueden usar en composiciones farmacéuticas preferidas. Especialmente preferidas para aplicaciones neuronales son las combinaciones con otras proteínas de la superfamilia de TGF-beta tales como, por ejemplo GDNF (véase el documento WO 97/03188). Para aplicaciones que se refieren a cartílago y/o hueso la combinación con BMP en general o con una proteína inductora del mantenimiento de cartílago tal como BMP-9 (véase por ejemplo, el documento WO 96/39170) es útil. Las combinaciones con otras proteínas tales como, por ejemplo, NGF, BDNF, EGF, PDGF, NT-3, -4, -5, cordina y/o proteínas hedgehog también son posibles (véase por ejemplo, el documento WO97/03188). Por supuesto la presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que contienen sustancias adicionales como, por ejemplo, sustancias auxiliares y de vehículo farmacológicamente aceptables. La formulación puede incluir antioxidantes, conservantes, agentes colorantes, saporíferos y emulsificantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes de volumen, tampones, vehículos de administración, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Por ejemplo, un medio de soporte o vehículo adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o una solución salina mezclada con una proteína transportadora adecuada tal como albúmina sérica. Un antioxidante preferido para la preparación de la composición de la presente invención es ácido ascórbico.

Las composiciones cosméticas conocidas en la técnica, preferentemente hipoalergénicas y de pH controlado son especialmente preferidas e incluyen aguas de tocador, empaques, lociones, leches para la piel o lociones lechosas. Dichas preparaciones contienen, además del compuesto activo, componentes usados habitualmente en tales preparaciones. Los ejemplos de tales componentes son aceites, grasas, ceras, tensioactivos, humectantes, agentes espesantes, antioxidantes, estabilizantes de viscosidad, agentes quelantes, tampones, conservantes, perfumes, colorantes, alcanoles inferiores y similares. Si se desea, se pueden incorporar ingredientes adicionales en las composiciones, por ejemplo, agentes antiinflamatorios, antibacterianos, antifúngicos, desinfectantes, vitaminas, protectores solares, antibióticos u otros agentes antiacné.

El disolvente o diluyente de la composición farmacéutica puede ser acuoso o no acuoso y puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables que son capaces de modificar y/o mantener un pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, escala, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución u olor de la formulación. De forma similar otros componentes se pueden incluir en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención con el fin de modificar y/o mantener la velocidad de liberación de la sustancia farmacéuticamente eficaz. Tales componentes modificadores son sustancias usadas habitualmente en la técnica con el fin de formular dosis para administración parenteral en forma unitaria o multidosis. La composición farmacéutica y/o de diagnóstico formulada finalmente preparada de acuerdo con la presente invención se puede almacenar en viales estériles en forma de una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar en una forma lista para su uso o en una forma, por ejemplo, en el caso de un polvo liofilizado, que requiere la reconstitución antes de la administración. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas anteriores y adicionales se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Gus Remington Pharmaceutical Sciences (18ª Ed., Mack Publishing Co., Eastern, Pa., 1990, 1435-1712). Tales formulaciones pueden influir sobre el estado fisiológico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo del componente farmacéuticamente eficaz. Otras formas de administración eficaces comprenden formulaciones parenterales de liberación lenta, es decir, retardada, formulaciones, brumas para inhalación o formulaciones activas por vía oral. Por ejemplo, una formulación de liberación lenta puede comprender proteínas unidas o incluidas en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc.) o liposomas. La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también se puede formular para administración parenteral, por ejemplo, mediante infusión o inyección y también puede incluir formulaciones de liberación lenta o de circulación sostenida. Tales composiciones terapéuticas administradas por vía parenteral típicamente están en forma de soluciones acuosas sin pirógenos parenteralmente aceptables que comprenden el componente o los componentes farmacéuticamente eficaces en un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede comprender un material de matriz, es decir, en casos en los que la regeneración de hueso o cartílago se pretende. Es provechoso para la proteína, el ácido nucleico, el vector de expresión o la célula hospedadora cuando los mismos se aplican en y/o sobre un material de matriz biocompatible. El material de matriz usado en el presente documento significa un vehículo o matriz que actúa como un armazón para el reclutamiento, la fijación, la proliferación y diferenciación celular y/o como un dispositivo de administración potencial y almacenamiento para mutantes ML de proteínas relacionadas con GDF-5. Por el contrario a las matrices sólidas, los vehículos consisten en materiales amorfos que no tienen superficies definidas y que carecen de una forma específica, es decir, alquilcelulosa, plurónicos, gelatinas, polietilen glicoles, dextrinas, aceites vegetales, azúcares y otras sustancias líquidas y viscosas.

Los usos de las proteínas relacionadas con GDF-5 o morfógenos similares tales como BMP en combinación con

5 materiales de matriz se han publicado y descrito de forma exhaustiva, tal como por ejemplo en el documento WO98/21972. Estos materiales de matriz son igualmente adecuados para mutantes ML de acuerdo con la invención. El material de matriz se puede trasplantar al paciente, por ejemplo, quirúrgicamente, donde la proteína o el ADN que codifica la proteína se puede liberar lentamente a partir del material de matriz y después ser eficaz durante un período de tiempo prolongado. Todos los tipos de materiales de matriz son útiles de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando los mismos sean biocompatibles y se seleccionen para el área o indicación de uso pretendidos. El material de matriz puede ser un material natural, un material natural modificado, así como un material sintético. Todas las matrices conocidas para proteínas morfogenéticas están incluidas. Los ejemplos de materiales naturales son, por ejemplo, materiales óseos autólogos, heterólogos o xenólogos, colágeno, por ejemplo, colágeno de tipo I y III o metales como titanio. También se pueden usar otros componentes de la matriz extracelular.

15 La matriz extracelular comprende por ejemplo los diversos colágenos, tales como por ejemplo los tipos I, II, V, IX, X, XI y XIII, proteoglicanos y glicosaminoglicanos adicionales, como por ejemplo condroitinsulfato, biglicano, decorina y/o ácido hialurónico o proteínas no colágenas tales como por ejemplo osteonectina, laminina, fibronectina, vitronectina, trombospondina, proteína de matriz de cartílago y fosfoproteína de dentina. Todos los materiales naturales mencionados también se pueden usar en formas modificadas artificialmente. Los ejemplos de materiales naturales modificados son hueso desmineralizado, mineral óseo incinerado, hueso sinterizado o ácido hialurónico químicamente reticulado (hidrogel) o aleaciones metálicas. Los ejemplos de materiales sintéticos son polímeros como ácido poliglicólico, poliláctido y derivados de poliláctido tales como, por ejemplo, ácido poliláctico, poli(láctidoco-glicólido), ácido poliláctido-polietilenglicol o copolímeros de glicólido L-láctido, polifosfatos adicionales, polietilenglicol, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno o materiales que contienen fosfatos de calcio tales

25 como fosfato beta tricálcico (Ca3(PO4)2), fosfato alfa-tricálcico y apatita de hidroxilo. Los ejemplos adicionales de otros materiales de matriz útiles que pertenecen a uno de los grupos mencionados anteriormente son Ca(OH)2, coral, mineral óseo natural, chitina, partículas óseas no desmineralizadas, partículas óseas cerámicas, dentina cerámica, trozos de hueso esponjoso irradiado, yeso de París, vidrio bioactivo, vitrocerámica que contiene apatitawollastonita. También una combinación de los vehículos y/o matrices mencionados anteriormente puede formar el material de matriz como por ejemplo la combinación de hidroxiapatita y colágeno (por ejemplo, Healos, disponible previamente en Orquest, Inc., CA, USA, [ahora DePuy Acromed, MA, USA]), una combinación de ácido poliglicólico y ácido poliláctico o derivados de poliláctido o compuestos de coral-colágeno. Para una lista no limitante de vehículos y matrices útiles véase adicionalmente, por ejemplo, Kirker-Head 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92.

35 Los siguientes ejemplos no limitantes junto con las figuras y protocolos de secuencia tienen por objeto ilustrar adicionalmente la invención.

Las SEC ID Nº 1 y 2 muestran la secuencia de ADN y proteínas del precursor de GDF-5 humana. En los mutantes de proteína GDF-5 humana preferidos con actividad biológica mejorada, el resto de metionina en la posición 453 y/o el resto de metionina en la posición 456 se sustituyen con otros aminoácidos.

La FIG. 1 muestra características adicionales de la proteína precursora de GDF-5 humana de acuerdo con SEC ID Nº 1:

aa 001-381 pre-prodominio (letras en negritas) aa 382-501 parte de la proteína madura aa 400 501 dominio de nudo de cistina (subrayado) aa 453 Resto de metionina 453 (recuadro gris) aa 456 Resto de metionina 456 (recuadro gris)

45 La FIG. 2 muestra una comparación de los dominios de nudo cistina de 102 aa de GDF-5 humana (SEC ID Nº 1), GDF-6 humana (secuencia 2 de la patente de los Estados Unidos 5.658.882) y GDF-7 humana (secuencia 26 de la patente de Estados Unidos 5.658.882). Los restos de aminoácido que son idénticos en las tres moléculas se resaltan en negro. Los restos M453 y M456 de GDF-5 humana y los restos equivalentes de GDF-6 y GDF-7 humana se marcan mediante flechas.

La FIG. 3 muestra una comparación de los dominios de nudo de cistina de 102 aa de secuencias de GDF-5, -6 y -7 de vertebrado del género Homo, además Cercopithecus, Macaca, Bos, Mus, Gallus Danio y Xenopus, que están disponibles en la base de datos de proteínas de NCBI de “Entrez” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) con los

55 números de acceso mostrados en la figura. Los restos de M453 y M456 de GDF-5 humana y restos equivalentes de otras proteínas están marcados mediante flechas.

La FIG. 4 muestra una tabla con las identidades de secuencia de los dominios de nudo de cistina de BMP y GDF conocidos para el dominio de nudo de cistina de GDF-5 humana.

La FIG. 5 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con GDF-5 humana recombinante (rh

GDF-5) y mutante de ML de hGDF-5 M453V/M456V (como se describe en el ejemplo 2).

La FIG. 6 muestra cortes histológicos (tinción de Rojo de Alizarina-S de calcio formado recientemente) y tomografías computarizadas !CT de estructuras tratadas con factor del crecimiento 4 semanas después del implante en ratones 5 SCID de acuerdo con el ejemplo 3.

La FIG. 7 muestra una estimación de la formación ósea nueva de las estructuras de acuerdo con el ejemplo 3. En cada grupo, se examinaron tres animales (n = 3) y se determinó un valor acumulado. Se usó la siguiente escala:

sin hueso 0 1-10% de hueso 1 10-50 % de hueso 2 50-100 % de hueso 3

Ejemplo 1: Creación, expresión y purificación de mutantes ML

Los ADN que codifican las partes maduras de proteínas GDF-5 humana, GDF-6 humana y GDF-7 humana se han aislado a partir de células osteoprogenitoras ROB-C26 humanas (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221225) a través de técnica de RT-PCR y posteriormente se han ligado en vectores plasmídicos procariotas. Con el fin

15 de identificar restos de aminoácido funcionalmente importantes en las partes maduras de GDF-5, 6 y 7, se han introducido diversas mutaciones únicas en estas secuencias a través de mutagénesis dirigida. Todas las mutaciones individuales se crearon usando el kit de mutagénesis dirigida QuickChange™ con la ADN polimerasa PfuTurbo™ y la endonucleasa DPN I de Stratagene de acuerdo con el manual de instrucción del fabricante.

Usando la cepa bacteriana W3110BP transformada con los plásmidos e inducida con IPTG, las proteínas se expresaron en cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se aislaron usando un tampón de homogeneización (Tris HCl 25 mM pH 7,3, EDTA NaOH 10 mM, pH 8, urea 8 M) y tampón de lavado (urea 1 M, Tris HCl 20 mM, pH 8,3, EDTA NaOH 10 mM, pH 8,0) de acuerdo con procedimientos convencionales. La purificación adicional se llevó a cabo en una columna de fase inversa Aquapore octilo (Applied Biosys, (VC = 7,8 ml) 100 x 10, 20 !, Nº 186470)

25 con un gradiente del 100% de eluyente A (TFA al 0,1%, HPLC H2O) al 100% de eluyente B (TFA al 0,1%, CH3N al 90%, HPLC H2O) en 104 minutos (caudal: 3 ml/min). Después de un control con transferencia de western, las fracciones que contenían la proteína mutante se combinaron y se liofilizaron.

Las proteínas mutantes se disolvieron en tampón de disolución (guanidina HCl 6 M, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 3 mM, pH = 8,0), la concentración de proteína se ajustó exactamente a 2,6 mg/ml y el pH se ajustó entre 8 y 9. Después de incubación de 2 h a temperatura ambiente, se añadió tampón de plegado (NaCl 1 M, Tris 50 mM, EDTA 5 mM, GSSG 1 mM, GSH 2 mM, Chaps 33 mM, pH = 9,5) con agitación suave para alcanzar una concentración final de 0,16 mg/ml.

35 La solución se incubó posteriormente durante 48 h a 22°C y el plegado se detuvo cambiando el pH a 3-4 mediante la adición de HCl al 18%. Después de centrifugación, el monómero no plegado se separó de la forma de dímero llevando a cabo una segunda RP-HPLC en las mismas condiciones. Las fracciones que contenían la proteína dimerizada se combinaron, liofilizaron y almacenaron a -70°C.

Ejemplo 2: Medición de la actividad biológica de mutantes ML in vitro mediante ensayo de ALP

1 x 104 células de la línea de células osteo/condroprogenitoras ATDC-5 se incubaron durante una noche en placas de 96 pocillos en medio de cultivo celular (alfa-MEM, penicilina/estreptomicina, L-glutamina 2 mM, FCS al 10%) a 37°C, CO2 al 5%, saturado con agua. Al día siguiente, las células se estimularon con las proteínas relacionadas con

45 GDF-5 y los mutantes de la misma durante 72 h con concentraciones de ligando indicadas. Las células se lavaron posteriormente con PBS (solución salina tamponada con fosfato). La lisis celular se realizó en 100 !l de tampón de lisis alcalina 1 (glicina 0,1 M, pH 9,6, NP-40 al 1%, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM) durante 1 h a temperatura ambiente. Después se añadieron 100 !l de tampón de lisis alcalina 2 (glicina 0,1 M, pH 9,6, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM + 2 mg/ml de PNPP). Las placas se incubaron a 37°C, CO2 al 5%, saturado con agua. La reacción de ALP se detuvo después con 100 !l de 30 g/l de NaOH y finalmente la densidad óptica se midió con un lector de microplaca automático a 405 nm bajo la consideración de resta del valor de blanco.

Como un ejemplo, los resultados (valores promedio de 2 experimentos independientes) con respecto a mutante de hGDF-5 M453V/M456V se muestran en la FIG. 5. La proteína mutante muestra una actividad biológica del 585,5%

55 (a 133 ng/ml), 356,3% (a 400 ng/ml) y 236,3% (a 1200 ng/ml) de la actividad de la proteína de tipo silvestre (rh-GDF5) en este ensayo (promedio de múltiples experimentos). La actividad mínima se midió para el mutante a una concentración de proteína única y en un experimento único fue el 150% de la actividad de la proteína de tipo silvestre.

Ejemplo 3:

Formación ósea ectópica in vivo: un modelo de ratón SCID para rhGDF 5, rhGDF-5 M453V/M456V y BMP-2

Las capacidades de inducción ósea mejorada de los mutantes ML de proteínas relacionadas con GDF-5 también se verificaron in vivo. Se usaron cerámicas de fosfato beta-tricálcico (chronOS®, Synthes/RMS Foundation) como biomateriales biodegradables con un tamaño de 3x3x3,5 mm. Se disolvieron factores del crecimiento en acetato de sodio pH 4 de la forma siguiente: rhGDF-5 en una concentración de 10 !g en 7 !l; rhGDF-5 M453V/M456V en una concentración de 10 !g en 9 !l y BMP-2 (Induct OS Wyeth® Lot-Nº, 20603) se disolvió en primer lugar en agua estéril en una concentración de 3 mg/ml y después se disolvió en acetato de sodio en una concentración de 10 !g en 7 !l. Los controles se saturaron con 7 !l de acetato de sodio. Después de recubiertas las estructuras se secaron posteriormente durante 10 minutos y se almacenaron a -20° celsius. Antes del implante, los armazones se cargaron con 10 !l de fibronectina. En este estudio, se usaron ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID), (30 +/2 g). Bajo anestesia general i.p., se creó una bolsa subcutánea de forma roma a través de una incisión de un centímetro en la espalda. Una estructura cargada se insertó en la bolsa. La herida se cerró con suturas interrumpidas únicas. Los animales se sacrificaron después de cuatro semanas y las estructuras se recogieron. Se realizó histología y tomografías computarizadas !CT (!CT 80 SCANCO MEDICAL). Para histología, las estructuras se incrustaron en cera de parafina y cortes de 5 !m de espesor se tiñeron con rojo de alizarina-S (al 0,5%) y verde rápido (al 0,04%) para demostrar el calcio nuevo construido dentro de las estructuras.

Los resultados se presentan en las Figs. 6 y 7. Los controles no tenían signos de formación ósea ectópica nueva. Las estructuras que se cargaron con rhGDF-5 mostraron una cantidad media de hueso construido recientemente con alguna formación ósea en la estructura. RhGDF-5 M453V/M456V tenía el valor más alto de formación ósea nueva. Las estructuras cargadas con rhGDF-5 453V/M456V mostraron hueso prominente en la estructura. Las estructuras tratadas con BMP-2 mostraron hueso prominente en las estructuras pero sin ser homogéneas como en las estructuras cargadas con rhGDF-5 453V/M456V. En resumen, los resultados confirmaron que rhgdf-5 453V/M456V conduce a formación ósea potenciada de forma marcada en este modelo de ratón SCID.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH 5 <120> Mutantes de Factor del Crecimiento de Actividad Elevada

<130> 36878PEP

<160> 2 10

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2703 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 20 <222> (640)..(2142)

<400> 1

<210> 2

<211> 501

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Proteína relacionada con GDF-5 recombinante con actividad biológica mejorada

   en la que

   a) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 453 (M453) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina, valina o isoleucina, y/o b) el aminoácido en la posición correspondiente a metionina 456 (M456) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) es alanina, valina o isoleucina, y en la que la misma comprende una secuencia que coincide con una o más de las fórmulas de aminoácidos genéricas siguientes:

   a)

   CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSHLEPTNHAX15

   IQTLZTNSMX16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX27X28NNVVY

   X29X30YEX31MVVEX32CGCR o

   b) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15

   IQTLMNSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LX24PISILX25X26DX28NNVVYX29X30YEX31MVVEX32CGCR o

   c) CX1X2KX3LHVX4FX5X6X7GWDDWX8IAPLX9YEAX10HCX11GX12CX13FPX14RSH LEPTNHAX15

   IQTLZ1NSZ2X16PX17X18X19PX201X21CCVPX22X23LPISILX25X26DX27X28NNVV

   YX29X30YEX31MVVEX32CGCR

   en las que

   X1 indica asparagina (N) o serina (S) X2 indica arginina (R) o lisina (K) X3 indica alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) o serina (S) X4 indica asparagina (N) o ácido aspártico (D) X5 indica arginina (R) o lisina (K) X6 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X7 indica leucina (L) o metionina (M) X8 indica isoleucina (I) o valina (V) X9 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X10 indica histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina (Y) X11 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X12 indica leucina (L), metionina (M) o valina (V) X13 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) X14 indica isoleucina (I) o leucina (L) X15 indica isoleucina (I) o valina (V) X16 indica alanina (A), asparagina (N) o ácido aspártico (D) X17 indica arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) o serina (S) X18 indica alanina (A), asparagina (N), serina (S) o treonina (T) X19 indica alanina (A), metionina (M) o treonina (T) X20 indica alanina (A) o prolina (P) X21 indica serina (S) o treonina (T) X22 indica alanina (A), serina (S) o treonina (T) X23 indica arginina (R) o lisina (K) X24 indica serina (S) o treonina (T) X25 indica fenilalanina (F) o tirosina (Y) X26 indica isoleucina (I) o treonina (T) X27 indica alanina (A) o serina (S) X28 indica alanina (A) o glicina (G) X29 indica asparagina (N) o lisina (K) X30 indica ácido glutámico (E) o glutamina (Q) X31 indica ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E), X32 indica alanina (A), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T) Z1 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V), Z2 indica alanina (A), isoleucina (I) o valina (V),

   o una secuencia correspondiente en la que la cisteína que es responsable de la formación de dímero se sustituye por un aminoácido diferente o se suprime.

2. 2.

   Proteína de acuerdo con la reivindicación 1,

   en la que la proteína relacionada con GDF-5 es una proteína de GDF-5 de vertebrado o un fragmento biológicamente activo o una versión alélica de la misma.

3. 3.

   Proteína de acuerdo con la reivindicación 2,

   en la que la proteína relacionada con GDF-5 es GDF-5 humana (SEC ID Nº 1) o un fragmento biológicamente activo de la misma.

4. 4.

   Ácido nucleico, que codifica una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a

5. 3.

6. 5.

   Vector de expresión, que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4.

7. 6.

   Célula hospedadora, que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.

8. 7.

   Composición farmacéutica, que comprende una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 y/o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6.

9. 8.

   Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende adicionalmente sustancias auxiliares y/o de vehículo farmacológicamente aceptables.

10. 9.

    Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en la que la proteína y/o ácido nucleico y/o vector y/o célula hospedadora están contenidos en o sobre un material de matriz biocompatible.

11. 10.

    Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para su uso en el diagnóstico, prevención y/o terapia de lesiones o enfermedades asociadas con hueso o cartílago dañado.

12. 11.

    Composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, para uso para promover crecimiento de cartílago y/o de hueso y/o fusión espinal, para el diagnóstico, prevención y/o terapia de tejidos de vasos sanguíneos dañados o enfermos y para la inducción de angiogénesis.

13. 12.

    Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha enfermedad asociada con daño de hueso y/o cartílago es osteoporosis.

14. 13.

    Un método para la producción de una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende preparar de forma recombinante una proteína obtenida a partir de una proteína relacionada con GDF-5 mediante

    a) el reemplazo del aminoácido en la posición correspondiente a metionina 453 (M453) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) con alanina, valina o isoleucina; y/o b) el reemplazo del aminoácido en la posición correspondiente a metionina 456 (M456) de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEC ID Nº 1) con alanina, valina o isoleucina.

15. 14.

    Un anticuerpo que es específico para una proteína relacionada con GDF recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es específico para una región que abarca los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 453-456 de GDF-5 de tipo silvestre humana (SEQ ID Nº 1).

16. 15.

    Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico, prevención y/o terapia de enfermedades asociadas con daño óseo y/o de cartílago o que influye a una enfermedad ósea y/o de cartílago.

17. 16.

    Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para promover formación de cartílago y/o hueso y/o fusión espinal.

18. 17.

    Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para el diagnóstico, prevención y/o terapia de tejido de vasos sanguíneos dañado o enfermo.

19. 18.

    Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición terapéutica y/o de diagnóstico para la inducción de angiogénesis.

    FIG. 4

    % de identidad de secuencia con dominio de nudo de cistina de GDF-5 humana

    Secuencia

    % de identidad Restos idénticos

    GDF-5 Homo

    100 102/102

    GDF-5 Mus

    99 101/102

    GDF-5 Gallus

    99 101/102

    GDF-5 Xenopus

    94 96/102

    GDF-5 Danio (Contad)

    88 90/102

    GDF-7 Danio

    88 90/102

    GDF-6 Mus

    86 88/102

    GDF-7 Gallus

    86 88/102

    GDF-6 Danio (Radar)

    86 88/102

    GDF-6 Homo

    85 87/102

    GDF-6 Xenopus

    84 86/102

    GDF-6 Bos

    83 85/102

    GDF-7 Homo

    81 83/102

    GDF-7 Cercopithecus

    80 82/102

    GDF-7 Macaca

    80 82/102

    GDF-7 Mus

    80 82/102

    GDF-6 Danio (Dynamo)

    79 81/102

    BMP-2A

    57 58/102

    BMP-2B

    57 58/102

    Vg-1

    52 53/102

    DPP

    52 53/102

    BMP-5

    52 53/102

    BMP-9

    51 52/102

    BMP-10

    51 52/102

    BMP-8A

    51 51/102

    BMP-6

    51 52/102

    BMP-7

    51 52/102

    GDF-3

    49 50/102

    60A

    48 49/102

    BMP-8B

    48 49/102

    BMP-3A

    47 48/103

    GDF-9B

    45 46/102

    BMP-3B

    43 44/103

    GDF-8

    37 38/102

    GDF-12

    37 38/104

    GDF-11

    36 37/102

    GDF-9

    32 33/102