ES2382821T3 - Polipéptidos capaces de estimular una reacción inmune contra el cáncer - Google Patents

Abstract

Un polipéptido para uso como medicamento para el tratamiento de cáncer mediante la estimulación de una reacción inmune contra el cáncer; en donde el polipéptido: a) comprende una secuencia dada por la SEC ID Nº: 1 ó 2; b) comprende 8 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 1 ó 2, con la condición de que al menos uno de dichos 8 aminoácidos contiguos proceda de la SEC ID Nº: 1; oc) comprende 8 aminoácidos contiguos que tienen solo una, dos o tres sustituciones de aminoácidos respecto a los 8 aminoácidos contiguos descritos en anteriormente en b), con la condición de que al menos uno de los 8 aminoácidos contiguos presentes proceda de la SEC ID Nº: 1; en donde el polipéptido es capaz de inducir una respuesta de células T.

Description

Polipeptidos capaces de estimular una reacci6n inmune contra el cancer

La presente invenci6n se refiere a polipeptidos y acidos nucleicos de ADN que codifican dichos polipeptidos, capaces de estimular una reacci6n inmune contra el cancer, a los metodos para generar linfocitos T capaces de reconocer y destruir celulas tumorales y a composiciones farmaceuticas para el tratamiento, profilaxis o diagnosis de cancer.

El cancer se desarrolla a traves de un proceso multietapa que implica varios episodios mutacionales. Estas mutaciones dan como resultado una expresi6n/funci6n alterada de genes que pertenecen a dos categorfas: oncogenes y genes supresores de tumores. Los oncogenes surgen en la naturaleza de proto-oncogenes a traves de mutaciones puntuales o traslocalizaciones, dando como resultado con ello un estado transformado de la celula que alberga la mutaci6n. Los oncogenes codifican para, y funci6n a traves de, una protefna. Los proto-oncogenes son genes normales de la celula que tienen el potencial de convertirse en oncogenes. En la mayorfa de los casos, se ha demostrado que los proto-oncogenes son componentes de mecanismos de transducci6n de senal. Los oncogenes actuan de un modo dominante. Por otro lado, los genes supresores de tumor actuan de un modo recesivo, es decir a traves de la perdida de funci6n, y contribuyen a la oncogenesis cuando ambos alelos que codifican la protefna funcional han sido alterados para producir productos genicos no funcionales.

En el campo de la inmunologfa de cancer humano, las dos ultimas decadas han contemplado importantes esfuerzos por caracterizar los antfgenos especfficos de cancer genuinos. En particular, el esfuerzo se ha dedicado al analisis de anticuerpos para antfgenos tumorales humanos. La tecnica anterior sugiere que dichos anticuerpos pueden usarse con fines diagn6sticos y terapeuticos, por ejemplo en relaci6n con un agente anti-cancerfgeno. Sin embargo, los anticuerpos s6lo se pueden unir a antfgenos tumorales que estan expuestos sobre la superficie de celulas tumorales. Por esta raz6n, el esfuerzo para producir un tratamiento de cancer basado en el sistema inmune del organismo ha tenido menos exito de lo anticipado.

Una caracterfstica fundamental del sistema inmune es que puede distinguir moleculas propias de no propias y normalmente no reacci6n contra moleculas propias. Se ha demostrado que el rechazo de tejidos u 6rganos injertados procedentes de otros individuos es una respuesta inmune a antfgenos extranos sobre la superficie de las celulas injertadas. La respuesta inmune comprende una respuesta humoral, mediada por anticuerpos, y una respuesta celular. Los anticuerpos son producidos y secretados por linfocitos B, y normalmente reconocen antfgenos libres en conformaci6n nativa. Por tanto, potencialmente pueden reconocer casi cualquier sitio expuesto sobre la superficie del antfgeno. Al contrario que los anticuerpos, las celulas T, que median el brazo celular de la respuesta inmune, reconocen antfgenos solamente en el contexto de moleculas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC, del ingles "major histocompatibility complex"), y s6lo despues de un procesamiento del antfgeno apropiado. Dicho procesamiento de antfgeno normalmente consiste en la fragmentaci6n proteolftica de la protefna, que da como resultado polipeptidos que se ajustan a la cavidad de las moleculas de MHC. Esto permite que las celulas T tambien reconozcan polipeptidos derivados de antfgenos/fragmentos de protefna intracelulares.

Las celulas T pueden reconocer polipeptidos aberrantes derivados de cualquier zona de la celula tumoral, en el contexto de moleculas de MHC sobre la superficie de la celula tumoral. Las celulas T pueden ser activadas posteriormente para eliminar la celula tumoral que alberga el polipeptido aberrante. En los modelos experimentales que implican tumores murinos se ha demostrado que las mutaciones puntuales en las protefnas "propias" intracelulares pueden dar lugar a antfgenos de rechazo del tumor, que consisten en polipeptidos que difieren en un unico aminoacido respecto al polipeptido normal. Las celulas T que reconocen dichos polipeptidos en el contexto de moleculas de MHC sobre la superficie de las celulas tumorales son capaces de matar las celulas tumorales y rechazar asf el tumor del hospedante (Boon y col., 1989, Cell 58: 293-303).

Las moleculas de MHC en humanos normalmente se denominan moleculas HLA (antfgeno de leucocito humano). Existen dos clases principales de moleculas HLA: la clase I y la clase II. Las moleculas HLA de clase I se codifican mediante las sub-localizaciones de HLA A, B y C y activan principalmente celulas T citot6xicas CD8+. Las moleculas HLA de clase II, por otro lado, activan principalmente celulas T CD4+ (citot6xicas o colaboradoras), y se codifican mediante las sub-localizaciones de HLA DR, DP y DO. Cada individuo normalmente tiene seis moleculas HLA de clase I diferentes, normalmente dos alelos de cada uno de los tres subgrupos A, B y C, aunque en algunos casos el numero de moleculas HLA de clase I diferentes se reduce debido a la aparici6n dos veces del mismo alelo de HLA. Para una revisi6n general, vease Roitt, I.M. y col. (1998) Immunology, 5a edici6n, Mosby, Londres.

Los productos genicos de HLA son altamente polim6rficos. Diferentes individuos expresan distintas moleculas HLA que difieren de las que se dan en otros individuos. Esto explica la dificultad para encontrar donantes de 6rganos para trasplantes con igual HLA. La significancia de la variaci6n genetica de las moleculas HLA en inmunobiologfa subyace en su papel como genes de respuesta inmune. A traves de su capacidad de uni6n de polipeptidos, la presencia o la ausencia de determinadas moleculas HLA gobierna la capacidad de un individuo para responder a epftopos de polipeptido especfficos. Como consecuencia, las moleculas HLA influyen en la resistencia o la susceptibilidad a la enfermedad.

Las celulas T pueden inhibir el desarrollo y el crecimiento de cancer mediante una variedad de mecanismos. Las celulas T citot6xicas, tanto las HLA de clase I CD8+ restringidas como las HLA clase II CD4+ restringidas, pueden matar directamente celulas tumorales que presenten los antfgenos tumorales apropiados. Normalmente, las celulas T CD4+ colaboradoras son necesarias para las respuestas de celulas T CD8+ citot6xicas, pero si el polipeptido antfgeno se presenta mediante un APC apropiado, las celulas T CD8+ citot6xicas pueden ser activadas directamente, lo que da como resultado una respuesta mas rapida, mas fuerte y mas eficiente.

En la Solicitud de Patente Internacional PCT/N092/00032 (publicada como W0 92/14756) se describen polipeptidos sinteticos y fragmentos de productos protefnicos de oncogenes que tienen un punto de mutaci6n o traslocalizaciones con respecto a su proto-oncogen o protefna genica supresora de tumor. Estos polipeptidos corresponden, cubren completamente o son fragmentos del fragmento de protefna de oncogen procesado o del fragmento de gen supresor tumoral tal como se presentan por celulas cancerosas u otras celulas presentadoras de antfgenos, y son presentados como un complejo HLA-polipeptido por al menos un alelo en cada individuo. Se demostr6 que los polipeptidos inducen respuestas de celulas T especfficas frente al fragmento de protefna de oncogen real producido por la celula mediante procesamiento y presentado en la molecula HLA. En particular, se describe en el documento W0 92/14756 que los polipeptidos derivados de la protefna p21-ras que presentaban mutaciones puntuales en posiciones concretas de aminoacidos, a saber, posiciones 12, 13 y 61. Se ha demostrado que estos polipeptidos son efectivos a la hora de regular el crecimiento de celulas cancerosas in vitro. Ademas, se demostr6 que los polipeptidos provocan inmunidad de celulas T CD4+ frente a celulas cancerosas albergando la protefna de oncogen p21-ras mutada a traves de la administraci6n de dichos polipeptidos en vacunaci6n o en esquemas de terapia contra el cancer. Posteriormente se ha demostrado que estos polipeptidos tambien provocan inmunidad de celulas T CD8+ contra celulas cancerosas albergando la protefna de oncogen p21 ras mutada a traves de la administraci6n mencionada anteriormente (Gjertsen, M.K. y col., 1997, Int. J. Cancer 72: 784-790).

La Solicitud de Patente Internacional PCT/N099/00143 (publicada como W0 99/58552) describe polipeptidos sinteticos y fragmentos de productos proteicos mutantes que surgen de las mutaciones estructurales que se producen en los genes de celulas cancerosas. Estos polipeptidos corresponden, cubren completamente o son fragmentos del fragmento de protefna mutante de estructura procesada tal como es presentado por celulas cancerosas u otras celulas presentadoras de antfgenos, y son presentados como un complejo HLA-polipeptido por al menos un alelo de cada individuo. En particular, se describen los polipeptidos que son resultado de mutaciones estructurales en los genes BAX y hTGF�-RII. Se demostr6 que dichos polipeptidos son efectivos para estimular celulas T CD4+ y CD8+ de un modo especffico.

Sin embargo, los polipeptidos descritos anteriormente seran utiles solo en cierto numero de canceres que implican oncogenes con mutaciones puntuales, mutaciones estructurales o traslocalizaci6n en un proto-oncogen o gen supresor tumoral. Existe una enorme necesidad de un tratamiento o vacuna anti-cancer que sea efectiva contra un rango generico de canceres.

La acci6n concertada de una combinaci6n de oncogenes y genes supresores tumorales alterados da como resultado una transformaci6n celular y el desarrollo de un fenotipo de malignidad. Sin embargo, dichas celulas son propensas a la senescencia y tienen una longevidad limitada. En la mayorfa de los canceres, la inmortalizaci6n de las celulas tumorales requiere la activaci6n de un complejo enzimatico denominado telomerasa. En las celulas somaticas normalmente la subunidad catalftica de la holoenzima telomerasa, hTERT (transcriptasa inversa de telomerasa humana, del ingles "human telomerase reverse transcriptase"), no es expresada. 0tros eventos adicionales, tales como la acci6n de protefnas codificadas por un virus tumoral o una desmetilaci6n de sitios promotores silenciados (metilados), pueden dar como resultado la expresi6n de los genes que codifican los componentes del complejo de telomerasa funcional en celulas tumorales.

Debido a la presencia de telomerasa en la mayorfa de los tipos de celulas cancerosas, la enzima ha sido descrita como un candidato general de vacuna contra el cancer (Solicitud de Patente Internacional N° PCT/N099/00220, publicada como W0 00/02581. El documento W0 00/02581 describe un metodo para prevenir o tratar el cancer mediante la generaci6n de respuesta de celulas T contra celulas que expresan telomerasa en un mamffero que padece (o que tiene probabilidad de padecer) un cancer. En W0 00/02581 se demuestra que se pueden estimular tanto celulas T CD4+ como celulas T CD8+ mediante la administraci6n de polipeptidos que tengan secuencias derivadas de dicha protefna de telomerasa.

En bibliograffa se han publicado variantes de divisi6n alternativas de pre-ARNm de telomerasa (Kilian, A. y col., 1997, Hum. Mol. Genet. 6: 2011-2019). Kilian y col. (1997, ver anterior) indicaron que cabfa destacar que varias variantes de divisi6n estaban localizadas dentro del dominio crftico RT (transcriptasa inversa) de hTERT. Sin embargo, concluyeron que no se habfa obtenido un entendimiento completo de la significancia de las variantes de divisi6n de hTERT y que se requerfa mas caracterizaci6n funcional adicional.

El analisis de la secuencia gen6mica completa del gen hTERT ha verificado que las diferentes variantes de divisi6n de ARNm surgen del uso de sitios de divisi6n alternativos en el pre-ARNm de hTERT (Wick, M. y col., 1999, Gene

232: 97-106). En comparaci6n con el ARNm de hTERT de longitud completa, se han detectado al menos cinco variantes de divisi6n adicionales. En la Figura 1 se muestra un dibujo esquematico de dichas variantes, y la Figura 2

muestra un alineamiento de las protefnas codificadas. Dos de las variantes de divisi6n, denominadas a-del (o DEL1) y �-del (o DEL2), representan eliminaciones de secuencias codificadoras especfficas. La variante a-del ha borrado los primeros 36 nucle6tidos del ex6n 6 y codifica una protefna que carece de una tira de 12 aminoacidos internos. En la variante -del faltan 182 nucle6tidos que representan los exones 7 y 8 completos, lo que conduce a un cambio en el marco de lectura abierto y una protefna truncada con un extremo carboxilo de 44 aminoacidos de longitud no presente en la protefna hTERT de longitud completa. El resto de variantes de divisi6n son el resultado del uso de sitios de divisi6n alternativos localizados dentro de regiones de intr6n, lo que produce la inserci6n de secuencias de intr6n dentro del marco de lectura abierto y una terminaci6n prematura de la traducci6n. La variante injerto-a (o INS1) procede de una inserci6n de los primeros 38 nucle6tidos del intr6n 4. El injerto-a no contiene un cod6n de detenci6n, sino que en su lugar el marco de lectura de abierto se extiendo 22 nucle6tidos en la secuencia normal usando un marco de lectura alternativo. La variante injerto-y (o INS3) esta provocada por la inserci6n de los ultimos 159 nucle6tidos del intr6n 14. La Ins-4 contiene los primeros 600 nucle6tidos del intr6n 14 y al mismo tiempo tiene eliminado el ex6n 15 y la mayor parte del ex6n 16. Las protefnas truncadas que proceden de la traducci6n de estas variantes de divisi6n se muestran en la Figura 2.

Varios estudios recientes han determinado la regulaci6n de la actividad de telomerasa, y se han publicado varias correlaciones entre la transcripci6n de ARNm de hTERT y la actividad de telomerasa para varias lfneas celulares y tejidos (Nakamura, T.M. y col., 1997, Science 277: 955-959; Meyerson, M. y col., 1997, Int. J. Cancer 85: 330-335; Nakayama, J. y col., 1998, Nature Genet. 18: 65-68; Liu, K. y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 5147-5152). 0tros estudios han demostrado que la actividad de telomerasa se ve regulada al alza a traves de la fosforilaci6n de la protefna hTERT mediante la protefna quinasa Ca, e inversamente, regulada a la baja por la presencia de inhibidores de protefna quinasa C y fosfatasa 2A (Li, H. y col., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16729-16732; Li, H. y col., 1998, J. Biol. Chem. 273: 33436-33442; Bodnar, A.G. y col., 1996, Exp. Cell Res. 228: 58-64; Ku, W.C. y col., 1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 241: 730-736). La divisi6n alternativa del pre-ARNm de hTERT representa un mecanismo adicional para regular la actividad de telomerasa, y se ha demostrado que media en la regulaci6n a la baja durante el desarrollo renal fetal y en tejidos adultos de ovario y utero (Ulaner, G.A. y col., 1998, Cancer Res. 58: 4168-4172; Ulaner, G.A. y col., 2000, Int. J. Cancer 85: 330-335). Los estudios anteriores se han centrado en las variantes de divisi6n a y �, presumiblemente porque eliminan secuencias que se cree que codifican estructuras de transcriptasa inversa crfticas (Lingner, J. y col., 1997, Science 276: 561-567).

La presente invenci6n proporciona peptidos y acidos nucleicos que codifican dichos peptidos basados en las variantes de divisi6n TERT y y a, y el uso novedoso de dichos peptidos y acidos nucleicos en medicina.

Por tanto, de acuerdo con la presente invenci6n se proporciona un polipeptido para su uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer; en donde el polipeptido: a) comprende una secuencia dada en la SEC ID N°: 1 6 2; b) comprende 8 aminoacidos contiguos de la SEC ID N°: 1 6 2, siempre que al menos uno de dichos 8 aminoacidos contiguos sea de la SEC ID N°: 1; o c) comprende 8 aminoacidos contiguos que solo tienen una, dos o tres sustituciones de aminoacidos respecto a los 8 aminoacidos contiguos descritos antes en b), siempre que al menos uno de los 8 aminoacidos contiguos presentes sea de la SEC ID N° 1;

en donde el polipeptido es capaz de inducir una respuesta de celulas T.

El termino "comprende" usado en la presente memoria incluye "consta". El polipeptido (o acido nucleico) de la presente invenci6n puede estar flanqueado por uno o mas residuos de aminoacido (o acido nucleico) a menos que se especifique lo contrario. Por ejemplo, el polipeptido puede ser parte de una protefna de fusi6n que tenga uno o mas dominios flanqueantes en el extremo N o C para permitir la purificaci6n de la protefna de fusi6n.

Los cambios o modificaciones (sustituciones) de aminoacidos en el polipeptido pueden realizarse en particular en los residuos ancla que se ajustan a las moleculas de HLA o MHC para la presentaci6n a las celulas T. De este modo se puede lograr propiedades de uni6n e inmunogenicas mejoradas del polipeptido con moleculas de HLA o MHC (vease Bristol, J.A. y col., 1998, J. Immunol. 160(5): 2433-2441; Clay, T.M. y col., 1999, J. Immunol. 162(3): 17491755).

El polipeptido descrito anteriormente opcionalmente puede:

a) tener al menos un 55% de identidad de secuencia con una molecula que comprende la secuencia de la SEC ID N°: 1, determinada mediante una busqueda NCBI BLASTP Versi6n 2.1.2 con parametros por defecto; o

b) tener al menos un 55% de identidad de secuencia con una molecula que comprende la secuencia de la SEC ID N°: 2, determinada mediante una busqueda NCBI BLASTP Versi6n 2.1.2 con parametros por defecto.

El programa NCBI BLASTP puede encontrarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, y los parametros por defecto se pueden cambiar usando la busqueda avanzada. Pueden requerirse valores superiores a las "Expect" por defecto cuando se busca con secuencias pista pequenas para presentar coincidencias. La expresi6n "identidad de secuencia" usado en la presente memoria se refiere a residuos de aminoacido en secuencias alineadas 6ptimamente que coinciden exactamente en las posiciones relativas correspondientes. Por ejemplo, el programa

NCBI BLASTP proporciona un valor de porcentaje de identidad entre la secuencia pista (del ingles "query") y la secuencia sujeto ("hit").

El polipeptido descrito anteriormente puede comprender una secuencia como la proporcionada en la SEC ID N°: 1 6 2, o puede ser un fragmento de una secuencia como la mostrada en la SEC ID N°: 1 6 2.

Aunque los polipeptidos que son presentados por moleculas HLA de clase II son de longitud variable (12-25 aminoacidos), los polipeptidos presentados por moleculas HLA de clase I normalmente deben tener una longitud de nueve aminoacidos a fin de ajustarse al punto de uni6n de HLA de clase I. Un polipeptido de mayor longitud no se unira si no puede ser procesado internamente por un APC o una celula diana, tal como una celula cancerosa, antes de presentarse en la zona de uni6n restringida de HLA de clase I. S6lo se ha publicado un numero limitado de desviaciones de este requisito de nueve aminoacidos, y en dichos casos la longitud del polipeptido presentado ha sido de ocho o de diez aminoacidos. Para una revisi6n de la uni6n de polipeptidos a moleculas de MHC vease Rammensee, H.-G. y col. (1995) Immunogenetics 41: 178-228 y Barinaga (1992), Science 257: 880-881. Male, D.K. y col. (1996, Advanced Immunology, Mosby, Londres) proporciona informaci6n de antecedentes en el campo de la inmunologfa.

La respuesta de celulas T generada por el polipeptido descrito anteriormente puede ser generada despues de una ruptura intracelular del polipeptido para proporcionar un fragmento que se ajuste en un punto de uni6n de MHC o HLA. Alternativamente, el polipeptido descrito anteriormente puede no necesitar una ruptura intracelular para ajustarse a un punto de uni6n de MHC o HLA de clase I. En este caso, el polipeptido puede tener una longitud de entre 8 y 10 aminoacidos. Tambien se proporciona un polipeptido descrito anteriormente que no necesita una ruptura intracelular para ajustarse a un sitio de uni6n de MHC o de HLA de clase II. En este caso, el polipeptido puede tener una longitud de entre 12 y 25 aminoacidos.

La respuesta de celulas T de acuerdo con la presente invenci6n puede aumentar el numero y/o la actividad de celulas T colaboradoras y/o celulas T citot6xicas.

Tambien se proporciona un polipeptido que no estimula una respuesta de celulas T citot6xicas sustancial en un paciente contra uno o mas de los siguientes elementos: celulas madre de medula 6sea, celulas epiteliales de criptas col6nicas o linfocitos.

Ademas se proporciona de acuerdo con la presente invenci6n una molecula de acido nucleico para su uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune frente al cancer; en donde la molecula de acido nucleico:

a) tiene una cadena que codifica un polipeptido descrito anteriormente, tal como se ha descrito anteriormente; b) tiene una cadena que es complementaria a una cadena como se ha descrito antes en a); o c) tiene una cadena que se hibrida con una molecula como se ha descrito antes en a) o b) en condiciones severas.

Las condiciones de hibridaci6n severas se discuten en detalle en las paginas 1.101-1.110 y 11.45-11.61 de Sambrook, J. y col. (1989, Molecular Cloning, 2a edici6n, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Un ejemplo de condiciones de hibridaci6n que pueden usarse implica el uso de una disoluci6n de pre-lavado de 5 X SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) e intentar la hibridaci6n durante una noche a 55°C usando 5 X SSC. La hibridaci6n de secuencias de acido nucleico dentro del alcance de la presente invenci6n incluye sondas, cebadores

o fragmentos de ADN. El termino cebador incluye un oligonucle6tido de cadena sencilla que actua como punto de inicio de la sfntesis de ADN dirigida con plantilla en las condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de cuatro trifosfatos de nucle6sido diferentes y un agente para la polimerizaci6n, tal como ADN o ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tamp6n apropiado y a una temperatura adecuada.

Tambien se proporciona un vector o celula para su uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con la presente invenci6n.

Ademas se describe un agente de uni6n para su uso en medicina; en donde el agente de uni6n se une a un polipeptido descrito anteriormente como se ha descrito anteriormente. Dicho agente de uni6n puede ser especffico para un polipeptido como el descrito anteriormente. Dicho agente de uni6n puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo. Dicho agente de uni6n puede ser lectina.

El termino anticuerpo en sus diversas formas gramaticales se usa en la presente memoria para referirse a moleculas de inmunoglobulina y a porciones inmunol6gicamente activas de moleculas de inmunoglobulinas, es decir, moleculas que contienen un sitio de combinaci6n de anticuerpo o paratopo. Dichas moleculas tambien se denominan "fragmentos de uni6n de antfgeno" de moleculas de inmunoglobulina. Las moleculas de anticuerpos ilustrativas son moleculas de inmunoglobulina intactas, moleculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas porciones de una molecula de inmunoglobulina que contengan el paratopo, incluyendo aquellas porciones que se conocen en la tecnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v). Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. El termino anticuerpo tambien pretende abarcar anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos

quimericos, humanizados o primatizados (anclados a CDR) y otros similares, asf como anticuerpos quimericos o de cadena sencilla anclados a CDR, que comprenden porciones de dos especies diferentes. Para la preparaci6n de anticuerpos vease Harlow, E. y Lane, D. (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Se pueden usar adyuvantes inmunol6gicos para vacunas que comprenden lecitina para estimular la producci6n de anticuerpos (vease por ejemplo la patente de EE.UU. N° 4.803.070).

Adicionalmente, de acuerdo con la presente invenci6n se proporciona un linfocito T para su uso como medicamento; en donde el linfocito T es capaz de matar una celula que expresa un polipeptido descrito anteriormente de acuerdo con la presente invenci6n o de ayuda para matar dicha celula. Dicho linfocito T puede ser una celula T citot6xica o una celula T colaboradora.

Tambien se proporciona una lfnea celular clonal para su uso como medicamento que comprende una pluralidad de linfocitos T como se ha descrito anteriormente. Tambien se proporciona una mezcla de linfocitos T para uso como medicamento que comprende una celula T colaboradora o una lfnea celular clonal de dichas celulas y una celula T citot6xica o una lfnea celular clonal de dichas celulas.

Tambien se describe un metodo para generar linfocitos T capaces de reconocer y destruir celulas tumorales en un mamffero, que comprende tomar una muestra de linfocitos T de un mamffero y cultivar la muestra de linfocitos T en presencia de al menos un polipeptido descrito anteriormente en una cantidad suficiente para generar linfocitos T especfficos de protefna de injerto y de hTERT y/o linfocitos T especfficos de protefna de injerto a de hTERT.

Tambien se proporciona un linfocito B que puede ser util para generar anticuerpos de acuerdo con la presente invenci6n. Tambien se incluye los hibridomas que son capaces de generar anticuerpos de acuerdo con la presente invenci6n (vease por ejemplo Koehler y col., 1975, Nature 256: 495-497; Kosbor y col., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote y col., 1983, PNAS USA 80: 2026-2030; Cole y col., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., Nueva York, paginas 77-96).

De acuerdo con la presente invenci6n, se proporciona ademas el uso de un polipeptido como el descrito anteriormente, de un acido nucleico como el descrito anteriormente, de un vector o celula como los descritos anteriormente, de un linfocito T como el descrito anteriormente, de una lfnea celular como la descrita anteriormente,

o de una mezcla de linfocitos T como la descrita anteriormente, en la preparaci6n de un medicamento para tratar el cancer. El cancer puede ser un cancer de mamffero. En particular, el cancer puede ser un cancer humano. Por ejemplo, el cancer puede ser cancer de mama, cancer de pr6stata, cancer pancreatico, cancer colorrectal, cancer de pulm6n, melanoma maligno, leucemia, linfoma, cancer de ovario, cancer cervical o un carcinoma del tracto biliar.

Dicho medicamento puede ser una vacuna.

Los polipeptidos descritos en la presente memoria son particularmente adecuados para su uso en una vacuna capaz de estimular de forma segura una inmunidad de celulas T CD4+ 6 CD8+. Como los polipeptidos se pueden producir sinteticamente, los medicamentos que incluyen los polipeptidos no incluyen genes cancerfgenos transformantes u otros sitios o materiales que pudieran producir efectos perniciosos. Los polipeptidos pueden estar dirigidos para la respuesta de un tipo particular de celulas T sin los efectos secundarios de otras respuestas no deseadas.

Se describe ademas una composici6n farmaceutica que comprende un polipeptido como el descrito anteriormente, un acido nucleico como el descrito anteriormente, un vector o celula como los descritos anteriormente, un agente de uni6n como el descrito anteriormente, un linfocito T como el descrito anteriormente, una lfnea celular como la descrita anteriormente, o una mezcla de linfocitos T como la descrita anteriormente.

Dicha composici6n farmaceutica puede comprender un polipeptido capaz de inducir una respuesta de celulas T dirigida contra un polipeptido producido por un oncogen o contra una protefna supresora tumoral mutante, o un acido nucleico que codifique dicho polipeptido, o un agente de uni6n que se una a dicho polipeptido, o una celula T que sea capaz de matar a una celula que expresa dicho polipeptido o de ayudar en la muerte de dicha celula. Los ejemplos de dichos oncogenes o protefnas supresoras tumorales mutantes incluyen p21-ras, Rb, p53, abl, gip, gsp, ret 6 rtk. El objetivo del oncogen pueden ser los polipeptidos p21-ras descritos en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/N092/00032 (con N° de Publicaci6n W0 92/14756).

Tambien se describe una preparaci6n combinada que comprende un componente de las composiciones farmaceuticas descritas anteriormente para un uso simultaneo, separado o secuencial en una terapia contra el cancer.

Tambien se describe una composici6n farmaceutica o una preparaci6n combinada como la descrita anteriormente que ademas comprende un vehfculo, diluyente, aditivo, estabilizante y/o adyuvante farmaceuticamente aceptables; incluyendo ademas dicha composici6n o preparaci6n combinada de forma opcional uno o mas de: una citocina o factor de crecimiento (por ejemplo IL-2, IL-12 y/o GM-CSF) y otro polipeptido que surja de una mutaci6n de estructura (por ejemplo, una mutaci6n de estructura en el gen BAX o hTGF -RII).

El efecto estimulador sobre las celulas T CD4+ y CD8+ de un modo especffico por acci6n de los polipeptidos

resultado de mutaciones de estructura en los genes BAX y hTGF� -RII se describe en el documento W0 99/58552 (ver mas arriba).

La composici6n farmaceutica o la preparaci6n combinada descrita anteriormente puede ser una vacuna.

La composici6n farmaceutica o la preparaci6n combinada descritas anteriormente pueden comprender o pueden ser capaces de producir moleculas antisentido.

Tambien se describe un metodo para la preparaci6n de una composici6n farmaceutica como la descrita anteriormente, que comprende las etapas de combinar los componentes descritos anteriormente con un vehfculo, diluyente, aditivo, estabilizante y/o adyuvante farmaceuticamente aceptables.

Una composici6n farmaceutica puede comprender cualquiera de las siguientes mezclas:

a) una mezcla de al menos un polipeptido descrito anteriormente junto con otro polipeptido que tenga una

secuencia diferente; b) una mezcla de al menos un polipeptido descrito anteriormente junto con otro polipeptido que tenga una

secuencia solapada, de tal modo que los polipeptidos sean adecuados para ajustarse a diferentes alelos de MHC

o HLA; c) una mezcla de ambas mezclas a) y b); d) una mezcla de varias mezclas a); e) una mezcla de varias mezclas b); o f) una mezcla de varias mezclas a) y varias mezclas b).

Los polipeptidos de la mezcla pueden estar unidos covalentemente unos con otros para formar polipeptidos de mayor tamano o incluso polipeptidos cfclicos. Los propios polipeptidos pueden estar en forma lineal o cfclica.

Tambien se describe un composici6n de diagn6stico que comprende un polipeptido como el descrito anteriormente, un acido nucleico como el descrito anteriormente, un vector o celula como los descritos anteriormente, un agente de uni6n como el descrito anteriormente, un linfocito T como el descrito anteriormente, una lfnea celular como la descrita anteriormente, o una mezcla de linfocitos T como la descrita anteriormente.

Tambien se describe un kit diagn6stico como el descrito anteriormente.

Tambien se facilita un metodo para el tratamiento o la profilaxis de un cancer de un organismo humano o animal que comprende administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de la composici6n farmaceutica descrita anteriormente a un paciente o animal que lo necesite. La invenci6n incluye un metodo para el tratamiento o la profilaxis de un paciente o animal que padece un cancer, comprendiendo el metodo la administraci6n a dicho paciente o animal de una composici6n farmaceutica descrita anteriormente en una cantidad suficiente para estimular una respuesta de celulas T contra dicho cancer. El metodo de tratamiento tambien puede incluir la estimulaci6n in vivo o ex vivo con una composici6n farmaceutica descrita anteriormente. La terapia ex vivo puede incluir el aislamiento de celulas dendrfticas u otras celulas presentadoras de antfgeno adecuadas procedentes de un paciente

o un animal, cargar dichas celulas con al menos un polipeptido o acido nucleico descritos anteriormente, e infundir dichas celulas cargadas de vuelta al paciente o al animal. Los polipeptidos o acidos nucleicos descritos anteriormente tambien pueden usarse en un metodo de vacunaci6n de un paciente con el objetivo de obtener resistencia frente al cancer. A veces los oncogenes estan asociados a virus. La presente invenci6n tambien es adecuada para el tratamiento de determinados trastornos vfricos.

Los polipeptidos de acuerdo con la presente invenci6n pueden administrarse en una cantidad en el intervalo de 1 microgramo (1 Ig) a 1 gramo (1 g) a un paciente humano o individuo promedio que vaya a ser vacunado. Se prefiere usar una dosis menor, en el intervalo de 1 microgramo (1 Ig) a 1 miligramo (1 mg) para cada administraci6n.

Las dosis exactas, es decir las dosis farmaceuticamente aceptables, y el regimen de administraci6n de las composiciones farmaceuticas y los medicamentos de la presente invenci6n pueden ser facilmente determinadas por el especialista en la tecnica, por ejemplo usando ensayos de dosis-respuesta.

La administraci6n puede tener lugar una vez o varias veces segun sea adecuado para establecer y/o mantener la inmunidad de celulas T deseada. Los polipeptidos de acuerdo con la presente invenci6n pueden administrarse, simultaneamente o por separado, junto a compuestos tales como citocinas y/o factores de crecimiento, es decir, interleucina-2 (IL-2), interleucina-12 (IL-12), factor estimulador de colonia de macr6fagos de granulocito (GM-CSF) u otros similares con el objetivo de fortalecer la respuesta inmune como es sabido en la tecnica. Los polipeptidos pueden usarse en una vacuna o en una composici6n terapeutica tanto solos como en combinaci6n con otros materiales. Por ejemplo, el polipeptido o polipeptidos pueden suministrarse en la forma de un conjugado de polipeptido el cual se sepa que induce una respuesta de celulas T citot6xicas de alta afinidad (Deres, K. y col., 1989, Nature 342: 561-564).

Los polipeptidos de acuerdo con la presente invenci6n pueden administrarse a un individuo o animal en la forma de vacunas de ADN. El ADN que codifica el(los) polipeptido(s) puede estar en la forma de ADN plasmido clonado u

oligonucle6tido sintetico. El ADN se puede administrar junto con citocinas, tales como la IL-2, y/u otras moleculas coestimuladoras. Las citocinas y/o las moleculas co-estimuladoras pueden administrarse en la forma de plasmido o de ADN de oligonucle6tido.

Se ha demostrado que la respuesta a una vacuna de ADN se incrementa en presencia de secuencias de ADN inmunoestimuladoras (ISS). Estas pueden adoptar la forma de estructuras hexamericas que contienen CpG metilado, segun la f6rmula: 5'-purina-purina-CG-pirimidina-pirimidina-3'. Por tanto, las vacunas de ADN de acuerdo con la presente invenci6n pueden incorporar estas u otras ISS, en el ADN que codifica la protefna de injerto y de hTERT y/o la protefna de injerto a de hTERT, en el ADN que codifica la citocina u otras moleculas co-estimuladoras,

o en ambos. En Tighe y col. (1998, Immunology Today, 19(2): 89-97) se proporciona una revisi6n de las ventajas de la vacunaci6n de ADN.

La secuencia de polipeptido mostrada en la Figura 4 representa la descripci6n de la Figura 5C de Kilian y col. (1997, ver mas arriba) de 46 residuos de aminoacido del extremo C-terminal de la variante de divisi6n de injerto y de hTERT de aproximadamente 1100 residuos de aminoacidos, que incluye 44 aminoacidos de la SEC ID N°: 1. La secuencia proporcionada por Kilian y col. (1997, ver mas arriba) muestra el "extremo C alternativo" de la protefna variante de divisi6n de injerto y de hTERT. (Kilian y col., 1997, ver mas arriba, indican que la correspondiente secuencia de ADN se proporciona con el numero de acceso del GenBank AF015950). Kilian y col. (1997, ver mas arriba) no describe como una entidad separada al polipeptido de acuerdo con las SEC ID N°: 1, 2 6 5 en el extremo C-terminal de la protefna variante de divisi6n de injerto y de hTERT, y no describen o sugieren un uso medicinal del polipeptido de acuerdo con la SEC ID N°: 1, 2 6 5.

Los polipeptidos descritos en la presente memoria pueden ser producidos mediante procesos convencionales, por ejemplo, mediante los diversos metodos de sfntesis de polipeptidos conocidos en la tecnica. De forma alternativa, pueden ser fragmentos de una protefna de injerto y de hTERT y/o una protefna de injerto a de hTERT producida mediante ruptura, por ejemplo, usando bromuro de cian6geno, y posterior purificaci6n. Tambien se puede usar la ruptura enzimatica. La protefna de injerto y de hTERT y la protefna de injerto a de hTERT, o los peptidos, tambien pueden encontrarse en la forma de protefnas o polipeptidos expresados recombinantes.

La secuencia de acido nucleico del extremo 3' de la variante de divisi6n de injerto y de hTERT de aproximadamente 3100 pb, parte de la cual codifica el extremo C-terminal de la correspondiente protefna que incluye la SEC ID N°: 1, se proporciona en la Figura 4 de Kilian y col. (1997, ver mas arriba). La secuencia de acido nucleico en las fronteras ex6n-intr6n de las variantes de divisi6n de hTERT INS1 (equivalente a la variante de divisi6n de injerto a) e INS3 (equivalente a la variante de divisi6n de injerto y), tal como se describen en la Figura 2B de Wick y col. (1999, ver mas arriba), se muestran en la Figura 5. Los acidos nucleicos mostrados en la Figura 5, tal como se describen en la Figura 2B de Wick y col. (1999, ver mas arriba), incluyen nucle6tidos que codifican residuos de aminoacido presentes en la SEC ID N°: 1-6 y 11. Wick y col. (1999, ver mas arriba) no hacen una referencia especffica a la existencia de los acidos nucleicos mostrados como entidades distintas o a su uso medico. Wick y col., 1999, ver mas arriba, proporcionan una referencia a la secuencia de nucle6tidos completa de su gen de hTERT en los numeros de acceso del GenBank AF128893 y AF128894.

Los acidos nucleicos que codifican los polipeptidos de la presente invenci6n pueden prepararse mediante sfntesis de oligonucle6tidos. Esto puede realizarse mediante cualquiera de los diversos metodos disponibles en la tecnica. Una protefna de telomerasa que codifica acido nucleico puede clonarse a partir de una biblioteca gen6mica o de ADNc, usando un escrutinio de biblioteca convencional. La sonda puede corresponder a una porci6n de cualquier secuencia de un gen de injerto y de hTERT o de injerto a de hTERT conocido. Alternativamente, el acido nucleico puede obtenerse usando Reacci6n en Cadena de Polimerasa (PCR). El acido nucleico es preferiblemente ADN, y puede clonarse de forma adecuada en un vector. Se pueden generar sub-clones usando enzimas de restricci6n adecuadas. El ADN clonado o sub-clonado puede propagarse en un hospedante adecuado, por ejemplo un hospedante bacteriano. Alternativamente, el hospedante puede ser un organismo ecuari6tico, tal como una levadura

o un baculovirus. Las protefnas o polipeptidos de injerto y de hTERT o de injerto a de hTERT pueden producirse mediante la expresi6n en un hospedante adecuado. En este caso, el ADN se clona en un vector de expresi6n. Se dispone de una variedad de kits de expresi6n comerciales. Para estos prop6sitos se pueden usar los metodos descritos en Sambrook, J. y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

Tambien se describe le vector o celula como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en forma aislada.

Ademas se describe el agente de uni6n como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en forma aislada.

Adicionalmente se describe el linfocito T como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en forma aislada.

Tambien se describe la lfnea celular clonal como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en forma aislada.

Ademas se describe la mezcla de linfocitos T como se ha descrito anteriormente.

Tambien se describe un dispositivo para lectura de datos mecanica (por ejemplo un disco) que comprende la secuencia de un polipeptido o de un acido nucleico como se ha descrito anteriormente.

Adicionalmente se describe un metodo que comprende el uso de un polipeptido o de una molecula de acido nucleico como los descritos en la presente memoria para llevar a cabo estudios de identidad de secuencia, estudios de homologfa de secuencia o estudios de hibridaci6n. Dicho metodo puede incluir el uso de dicha secuencia para predecir la estructura y/o la funci6n (por ejemplo, para predecir la actividad anticancerfgena).

Tambien se proporciona el uso de este metodo en un procedimiento de desarrollo o de escrutinio de farmacos. Ademas se proporciona un farmaco identificado o seleccionado mediante este procedimiento.

Tambien se describe un ordenador o una base de datos que presente o almacene una secuencia de un polipeptido o molecula de acido nucleico como los descritos en la presente memoria, o que este preparado para llevar a cabo un metodo como el descrito anteriormente.

Los terminos "residuo de aminoacido" y "aminoacido" se definen de forma general para incluir aminoacidos modificados e inusuales, segun se define en WIP0 Standard ST.25, y se incorpora aquf a modo de referencia.

El termino tratamiento o terapia usado en la presente memoria incluye tratamiento o terapia profilacticos cuando sea aplicable.

La invenci6n sera mas evidente a partir de la siguiente descripci6n, con referencia a las figuras acompanantes que muestran, solo a modo de ejemplo, varios polipeptidos y su uso de acuerdo con la presente invenci6n.

De las figuras:

La Figura 1 es un dibujo esquematico del ARNm de hTERT de longitud completa, y de variantes de divisi6n, encontrado en lfneas de celulas cancerosas;

La Figura 2 muestra un alineamiento de protefna entre una porci6n de la protefna de hTERT y las protefnas resultantes de la traducci6n de variantes de divisi6n;

La Figura 3 muestra los extremos carboxilo de las protefnas variantes de divisi6n de injerto y e injerto a de hTERT;

La Figura 4 muestra secuencias de la tecnica anterior relacionadas con la variante de divisi6n de injerto y de hTERT descrita en la Figura 5C de Kilian y col. (1997, ver mas arriba);

La Figura 5 muestra secuencias de la tecnica anterior relacionadas con las variantes de divisi6n de injerto y y de injerto a de hTERT descritas en la Figura 2B de Wick y col. (1999, ver mas arriba);

La Figura 6 muestra los resultados del analisis de RT-PCR de las regiones que comprenden las variantes de divisi6n de injerto y (A) y de injerto a (B) de hTERT;

La Figura 7 muestra las respuestas de celulas T inducidas en muestras de sangre humana por un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 11;

La Figura 8 muestra la proliferaci6n de clones de celulas T inducida por un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 11; y

La Figura 9 muestra la proliferaci6n de otros clones de celulas T inducida por un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 11.

En la Figura 1, la posici6n de los intrones presentes en el pre-ARNm de hTERT se indica mediante la letra "i" seguida de un numero apropiado. Las variantes de inserci6n y de eliminaci6n se muestran como cajas cuadradas; el relleno sombreado representa secuencias que codifican secuencia de protefna que no esta presente en la protefna de hTERT de longitud completa. La posici6n y la orientaci6n de los cebadores de oligonucle6tidos usados para analizar las diferentes variantes de divisi6n se indican con flechas.

En la Figura 2, se muestra la numeraci6n de aminoacidos encima de la secuencia. Los aminoacidos se representan mediante su abreviatura de una letra estandar conocida en la tecnica.

En la Figura 3, la SEC ID N°: 1 refleja la cola truncada de la protefna de injerto y de hTERT y la SEC ID N°: 2 refleja el mismo polipeptido con una extensi6n en el extremo amino con los nueve aminoacidos que se encuentran normalmente en dichas posiciones en el producto de expresi6n de injerto y de hTERT natural (subrayado). La SEC ID N°: 3 refleja la cola truncada de la protefna de injerto a de hTERT. La SEC ID N°: 4 refleja la SEC ID N°: 3 con una extensi6n en el extremo amino con los nueve aminoacidos que normalmente se dan en dichas posiciones en el producto de expresi6n de injerto a de hTERT natural (subrayado).

En la Figura 4, las uniones ex6n/intr6n de la variante de divisi6n de injerto 3 (equivalente a la variante de divisi6n de injerto y de hTERT) se muestra tal como se proporciona en la Figura 5C de Kilian y col. (1997, ver mas arriba). Kilian

y col. (1997, ver mas arriba) proporcionan la siguiente informaci6n: la secuencia de acido nucleico se muestra por encima de una secuencia de traducci6n de protefna, con el intr6n no dividido putativo mostrado en negrita; las uniones ex6n/intr6n putativas estan marcadas con I; la correspondencia de la numeraci6n de secuencia de acido nucleico es como se indica a continuaci6n: el nucle6tido 1 corresponde al nucle6tido 139 de la secuencia del numero de acceso AF015950 del GenBank; y los aminoacidos correspondientes al sitio de uni6n c-Abl/SH3 putativo estan subrayados. La secuencia de aminoacidos mostrada por Kilian y col. (1997; ver mas arriba) representa el extremo Cterminal de una protefna variante de divisi6n de injerto y de hTERT de aproximadamente 1100 residuos de aminoacido.

En la Figura 5, se representan los nucle6tidos de las fronteras ex6n-intr6n de las variantes de divisi6n de hTERT INS1 (equivalente a la variante de divisi6n de injerto a) e INS3 (equivalente a la variante de divisi6n de injerto y) como se describen en la Figura 2B de Wick y col. (1999, ver mas arriba). Las secuencias intr6nicas y ex6nicas se muestran en letras minusculas y mayusculas, respectivamente. Wick y col. (1999, ver mas arriba) indican que la secuencia de nucle6tidos de su gen hTERT ha sido depositada en el GenBank con los numeros de acceso AF128893 y AF128894.

Se ha establecido que las variantes de divisi6n de injerto y y de injerto a de hTERT son expresadas en lfneas de celulas cancerosas y en tumores, pero son indetectables o presentan unos niveles muy bajos en celulas normales. Por lo tanto, la presente solicitud describe candidatos de vacuna contra el cancer generales con una especificidad mejorada con respecto a las vacunas basadas en la variante funcional de la protefna telomerasa (hTERT). Los injertos y y a dan como resultado la formaci6n de un cod6n de detenci6n temprana y la expresi6n de una protefna que esta truncada en el extremo carboxilo. Las protefnas de injerto y y a de hTERT truncadas no tienen actividad de telomerasa por sf mismas. En el caso de un injerto y, la cola truncada de la protefna es una secuencia de 44 aminoacidos (SEC ID N°: 1). Un injerto a da como resultado una protefna en la que la cola truncada es una secuencia de 20 aminoacidos (SEC ID N°: 3). Se expresan predominantemente en lfneas de celulas cancerosas pero son indetectables, o presentan niveles muy bajos, en celulas normales, y por tanto son dianas para una inmunoterapia especffica. Segun la presente invenci6n, los polipeptidos correspondientes al extremo carboxilo (cola truncada) de protefnas expresadas por variantes de divisi6n de injerto y y/o de injerto a de hTERT son utiles como agentes o vacunas anticancerfgenos con la funci6n de activar el brazo celular del sistema inmune (celulas T) en humanos contra celulas cancerosas. En una realizaci6n preferida de la invenci6n, el polipeptido comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N°: 5. En otra realizaci6n preferida de la invenci6n, el polipeptido comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N°: 6.

La SEC ID N°: 11, a la cual se hace referencia en la presente memoria, se incluye meramente con fines de ejemplo y como tal no forma parte de la presente invenci6n.

Procedimiento experimental

Los experimentos descritos en la presente memoria describen la caracterizaci6n de variantes de divisi6n de hTERT en varias lfneas de celulas cancerosas en comparaci6n con celulas normales. Se detalla la sfntesis de polipeptidos de acuerdo con la presente invenci6n, y los experimentos para evaluar la eficacia de los polipeptidos para uso en terapia contra el cancer. Se describe un experimento que muestra la inducci6n y proliferaci6n de celulas T humanas por parte del peptido que tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEC ID N°: 11.

Analisis RT-PCR de las variantes de divisi6n de injerto y y de injerto a de hTERT

Analisis de ARN:

Se aisl6 ARNm poly(A)+ procedente de celulas lisadas completamente directamente a partir de los lisatos sin purificar usando partfculas magneticas oligo(dT) (Dynal AS; Jakobsen, K.S. y col., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 3669). Las fracciones de ARNm citos6lico se prepararon incubando celulas en IGEPAL al 1% (Sigma) a 0°C durante un minuto, seguido de centrifugaci6n [10.000 g; 1 min; 4°C] para eliminar los nucleos. A continuaci6n se aisl6 el ARNm Poly(A)+ a partir del sobrenadante usando particular oligo(dT) como se ha descrito anteriormente.

Sintesis de ADNc y PCR:

La sfntesis de ADNc de primera cadena se llev6 a cabo empleando procedimientos estandares usando transcriptasa inversa M-MLV RNasaH+ (Promega Corp.), y las reacciones PCR se llevaron a cabo usando ADN polimerasa HotStar Taq (Oiagen) y se ejecutaron para 35 ciclos sobre un ciclador termico PTC-200 (MJ Research). Para obtener productos detectables a partir de celulas PBM y CD34+, el 10% de la reacci6n se us6 como plantilla en una segunda reacci6n PCR y se amplific6 mediante otros 15 ciclos adicionales.

Para el analisis de la variante de divisi6n de injerto y la variante de cebador de cadena-mas se us6 el cebador de cadena-mas hTERT-p3195 (5-GCC TCC CTC TGC TAC TCC ATC CT -SEC ID N°: 7) y el cebador de cadenamenos hTERT-m3652 (5-CGT CTA GAG CCG GAC ACT CAG CCT TCA - SEC ID N°: 8). Aplicados al ADNc de hTERT de longitud completa y a la variante de injerto y, estos cebadores producen fragmentos de 465 y 624 nucle6tidos, respectivamente. El analisis de la variante de injerto a se llev6 a cabo usando los cebadores hTERT-P6

(5-GCC AAG TTC CTG CAC TGG CTG A -SEC ID N°: 9) hTERT-m2044 (5-GCT CTA GAA CAG TGC CTT CAC CCT CG - SEC ID N°: 10). El producto de amplificaci6n resultante del uso de dichos cebadores con ADNc de hTERT de longitud completa y con la variante de injerto a comprende 369 y 407 nucle6tidos, respectivamente. Para verificar que estos productos de PCR representan variantes de divisi6n genuinas, los fragmentos fueron aislados del gel y analizados mediante secuenciamiento directo usando un secuenciador automatico AB1 prism 310 (PE Corp.).

Resultados:

La actividad de telomerasa esta sujeta a una regulaci6n compleja a nivel post-transcripcional, y los metodos usados para detectar la presencia o la ausencia de protefnas de telomerasa deberfan incluir mediciones directas de la propia protefna, o alternativamente de las variantes de ARNm. Ademas, la abundancia de las diferentes variantes de divisi6n de hTERT que se dan en las celulas no se correlaciona necesariamente con los niveles observados en la fracci6n citos6lica de las mismas celulas (vease la Figura 6). Dichas desviaciones pueden explicarse a traves de las diferencias en la eficacia con la que las variantes de ARNm son transportadas desde el nucleo hasta el compartimento citos6lico, y/o mediante la estabilidad diferencial de las variantes de divisi6n especfficas del citosol. Es bien conocido en la tecnica que dichos mecanismos son parte del concepto de la regulaci6n genica. Sin embargo, los estudios llevados a cabo para explicar la regulaci6n de hTERT, que incluyen los citados anteriormente, han usado ARN o ARNm total aislado de celulas lisadas completamente para su analisis. Los kits y reactivos requeridos para realizar este tipo de aislamiento de ARN se encuentran ampliamente disponibles a nivel comercial. Para obtener una imagen correcta de la expresi6n genica, los estudios sobre la abundancia de ARNm deberfan incluir el analisis de ARNm especffico al compartimento citos6lico.

La Figura 6 muestra los resultados del analisis de RT-PCR de las regiones que comprenden las variantes de injerto y (A) y de injerto a (B) de hTERT. HL60, K562 y Jurkat denotan las lfneas de celulas cancerosas analizadas. HL60 es una lfnea de celulas de leucemia promielocftica (Sololoski, J.A. y col., 1993, Blood 82: 625-632), K562 una lfnea de celulas de leucemia eritroidea (Lozzio, C.B. y col., 1975, Blood 45: 321-324), mientras que Jurkat deriva de celulas de leucemia de linfocito T (Gillis, S. y col., 1980, J. Exp. Med. 152: 1709-1719). Las lfneas de celulas cancerosas HK60, K562 y Jurkat se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, en ATCC, 0slo). PBM1, PBM2, PBM3 y PBM4 representan poblaciones de celulas sangufneas mononucleares perifericas (PBM) aisladas de cuatro donantes sanos diferentes. CD34 denota celulas madre positivas CD34 aisladas de un donante sano, y CC1/CC2 denota biopsias de cancer de colon procedentes de dos pacientes con cancer del Norwegian Radium Hospital, 0slo, siendo CC2a y CC2b dos muestras de tejido diseccionadas del mismo tumor. Las reacciones RT-PCR llevadas a cabo con ARNm aislado mediante lisis completa de celulas y con ARNm aislado a partir de fracciones citos6licas estan marcadas con las letras "T" y "C", respectivamente. "M" indica una banda con marcador de peso molecular. La posici6n de los fragmentos de PCR que representan las variantes de divisi6n de injerto y y a y los respectivos productos (+) de hTERT de longitud completa se indica en el lado derecho de los paneles.

El analisis de RT-PCR mostr6 que ambas variantes de divisi6n de injerto y y a eran facilmente detectables en todas las lfneas de celulas cancerosas y en una de las muestras de tumor analizadas (CC2b), y apareciendo la variante de injerto a como la mas abundante en las fracciones citos6licas. Por el contrario, no fuimos capaces de detectar dichas variantes en poblaciones de ARNm citos6lico aislado a partir de celulas PBM a pesar de la intensiva amplificaci6n de PCR realizada sobre estas muestras. La identidad del fragmento debil de 395 pb producido con los cebadores de injerto a sobre celulas PBM y positivas CD34 de momento es desconocida.

Sfntesis y analisis de polipeptidos para aplicaciones relativas al cancer

Sintesis de polip�ptidos:

Los polipeptidos fueron sintetizados usando sfntesis de peptidos en fase s6lido con flujo continuo. Se usaron N-aFmoc-aminoacidos con la protecci6n de cadena lateral apropiada. Los Fmoc-aminoacidos fueron activados para el acoplamiento como esteres de pentafluorofenilo o usando TBTU o activaci6n de carbodiimida de diisopropilo antes del acoplamiento. Se us6 piperidina al 20% en DMF para la eliminaci6n selectiva de Fmoc despues de cada acoplamiento. La separaci6n de la resina y la eliminaci6n final de la protecci6n de cadena lateral se llev6 a cabo mediante TFA al 95% que contenfa los agotadores apropiados. Los polipeptidos fueron purificados y analizados mediante HPLC de fase inversa. La identidad de los polipeptidos se confirm6 usando espectroscopfa de masas de electro-pulverizaci6n.

Evaluaci�n de polip�ptidos y terapia contra el cancer:

Para que una vacuna contra el cancer de acuerdo con la presente invenci6n, y los metodos para una terapia contra un cancer especffico basados en inmunidad de celulas T, sean efectivos, se deben cumplir dos condiciones:

(a)

el polipeptido tenga al menos 8 aminoacidos de longitud y sea un fragmento de la protefna de injerto y de hTERT

o de la protefna de injerto a de hTERT, y

(b)

el polipeptido sea capaz de inducir, bien en su longitud completa o tras el procesamiento de una celula presentadora de antfgeno, respuestas de celulas T.

Se pueden usar los siguientes metodos experimentales para determinar si estas dos condiciones se cumplen para un polipeptido particular. En primer lugar, deberfa determinarse si el polipeptido particular da lugar a la estimulaci6n de respuestas inmunes de celulas T in vitro. Tambien sera necesario establecer si los polipeptidos sinteticos corresponden, o son capaces tras un procesamiento de dar lugar, a fragmentos de polipeptido correspondientes a los fragmentos de polipeptido que se dan en las celulas cancerosas que albergan la protefna de injerto y de hTERT y/o la protefna de injerto a de hTERT, o celulas presentadoras de antfgeno que han procesado la protefna de injerto y de hTERT y/o la protefna de injerto a de hTERT naturales. Tambien se puede determinar la especificidad de celulas T inducidas in vivo mediante la vacunaci6n con polipeptido de injerto y de hTERT y/o de injerto a de hTERT.

Analisis de respuesta de c�lulas T in vitro:

Es necesario determinar si las lfneas de celulas tumorales que expresan injerto y de hTERT y/o injerto a de hTERT pueden ser matadas por clones de celulas T obtenidos a partir de sangre periferica procedente de pacientes de carcinoma despues de una vacunaci6n con polipeptido de injerto y de hTERT y/o injerto a de hTERT. Los clones de celulas T se obtienen despues de clonar blastos de celulas T presentes en celulas mononucleares sangufneas perifericas (PBMC) procedentes de un paciente de carcinoma despues de una vacunaci6n con polipeptido injerto y de hTERT y/o injerto a de hTERT. El protocolo de vacunaci6n con polipeptido incluye varias inyecciones in vivo de polipeptidos intracutaneamente con GM-CSF u otro adyuvante usado habitualmente. La clonaci6n de celulas T se lleva a cabo llevando a placa blastos de celulas T respondientes a una concentraci6n de 5 blastos por pocillo sobre placas Terasaki. Cada pocillo contiene 2 x 104 PBMC aut6logas irradiadas (30 Gy) como celulas de sustrato. Las celulas se propagan con el polipeptido de injerto y de hTERT y/o injerto a de hTERT candidato a una concentraci6n de 25 IM y 5 U/mL de interleucina-2 recombinante (rIL-2) (Amersham, Aylesbury, R.U.) en un volumen total de 20 mL. Tras 9 dfas los clones de celulas T son transferidos a placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar, Cambridge, MA) con 1 mg/mL de fitohemaglutinina (PHA, Wellcome, Dartford, R.U.), 5 U/mL de rIL-2 y PBMC alogenicas irradiadas (30 Gy) (2 x 105) por pocillo como celulas sustrato. Los clones en crecimiento son expandidos adicionalmente en placas de 24 pocillos con PHA/rIL-2 y 1 x 106 PBMC alogenicas irradiadas como celulas sustrato, y son escrutados en funci6n de la especificidad de polipeptido despues de 4 a 7 dfas.

Los clones de celulas T se seleccionan para una caracterizaci6n adicional. Se determina el fenotipo de superficie celular del clon de celula T para establecer si el clon de celula T es CD4+ o CD8+. El clon de celula T se incuba con dianas aut6logas de celulas tumorales a diferentes relaciones efector diana para determinar si se produce lisis de las celulas tumorales. La lisis indica que la celula T tiene una reactividad dirigida contra un antfgeno derivado de tumor, por ejemplo, protefnas de injerto y de hTERT y/o protefnas de injerto a de hTERT.

Correlaci�n entre polip�ptidos y �ragmentos de injerto de hTERT in vivo:

A fin de verificar que el antfgeno reconocido esta asociado a protefna de injerto y de hTERT o a protefna de injerto a de hTERT, y para identificar la molecula HLA de clase I o de clase II que presenta el polipeptido putativo de injerto y de hTERT o de injerto a de hTERT al clon de celula T, se usan como celulas diana en los ensayos de citotoxicidad diferentes lfneas de celulas tumorales que expresan injerto y de hTERT o injerto a de hTERT que tienen una o mas moleculas HLA de clase I o de clase II en comun con las del paciente. Las celulas diana son marcadas durante una noche con 51Cr o 3H-timidina (9,25 x 104 Bq/mL), se lavan una vez y se llevan a placa con una concentraci6n de 5000 celulas por pocillo en placas de 96 pocillos. Se anaden las celulas T a diferentes relaciones efector diana y las placas son incubadas durante 4 horas a 37°C y a continuaci6n recolectadas antes de ser contabilizadas en un contador de centelleo de lfquidos (Packard Topcount). Por ejemplo, como celulas diana se puede usar la lfnea de celulas de carcinoma de vejiga T24 (12Val+, HLA-A1+, B35+), la lfnea de celulas de melanoma FMEX (12Val+, HLA-A2+, B35+) y la lfnea de celulas de carcinoma de colon SW 480 (12Val+, HLA-A2+, B8+) o cualquier otra lfnea de celulas tumorales positivas en telomerasa. Se puede usar como control una lfnea celular adecuada que no expresa protefnas de injerto y de hTERT y/o de injerto a de hTERT, que no deberfa ser lisada. La lisis de una lfnea celular particular indica que el clon de celulas T que esta siendo evaluado reconoce un epftopo de injerto y de hTERT y/o de injerto a de hTERT procesado end6genamente en el contexto de HLA de clase I o del subtipo de clase II expresado por dicha lfnea celular.

Caracteri�aci�n de clones de c�lulas T:

La restricci6n de HLA de clase I o de clase II de un clon de celula T puede determinarse mediante experimentos de bloqueo. Se pueden usar los anticuerpos monoclonales contra antfgenos de HLA de clase I, por ejemplo el anticuerpo monoclonal de HLA de clase I panreactivo W6/32, o contra antfgenos de clase II, por ejemplo, monoclonales dirigidos contra antfgenos de HLA de clase II DR, DO y DP (B8/11, SPV-L3 y B7/21). La actividad del clon de celula T contra la lfnea de celulas tumorales aut6logas se evalua usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra moleculas HLA de clase I y de clase II a una concentraci6n final de 10 Ig/mL. Los ensayos se preparan como se ha descrito anteriormente por triplicado en placas de 96 pocillos y las celulas diana son preincubadas durante 30 minutos a 37°C antes de la adici6n de las celulas T.

La fina especificidad de un clon de celula T puede determinarse usando experimentos de pulsos de polipeptido. Para identificar el polipeptido de injerto y de hTERT y/o de injerto a de hTERT que esta siendo reconocido realmente por un clon de celula T, se ensaya un panel de polipeptidos nonamericos. Se llevan a placa fibroblastos aut6logos,

elufdos en condiciones acidas suaves y marcados con 51Cr o 3H-timidina, a una concentraci6n de 2500 celulas por pocillo en placas de 96 pocillos y se someten a pulsos con los polipeptidos a una concentraci6n de 1 IM junto con b2-microglobulina (2,5 Ig/mL) en una incubadora con un 5% de C02 a 37°C antes de la adici6n de las celulas T. Los ensayos se preparan por triplicado en placas de 96 pocillos y se incuban durante 4 horas con una relaci6n de efector a diana de 5 a 1. Los controles pueden incluir clon de celula T cultivado solo, con APC en ausencia de polipeptidos o con un polipeptido MART-1/Melan-A asociado a melanoma irrelevante.

Tambien se puede usar un protocolo alternativo para determinar la especificidad fina de un clon de celula T. En este protocolo alternativo, se usa la lfnea de celulas T2 deficiente en TAP como celulas presentadoras de antfgeno. Esta lfnea celular expresa solo cantidades pequenas de antfgeno HLA-A2, pero se pueden inducir niveles incrementados de antfgenos de HLA de clase I mediante la adici6n de b2-microglobulina. Las celulas diana marcadas con 3H son incubadas con diferentes polipeptidos de ensayo y polipeptidos de control a una concentraci6n de 1 IM junto con b2microglobulina (2,5 Ig/mL) durante una hora a 37°C. Tras el pulso de polipeptido, las celulas diana son lavadas intensivamente, se contabilizan y se llevan a placa con una concentraci6n de 2500 celulas por pocillo en placas de 96 pocillos antes de la adici6n de las celulas T. Las placas son incubadas durante 4 horas a 37°C en C02 al 5% antes de ser recolectadas. Los controles incluyen el clon de celula T cultivado solo o con celulas diana en ausencia de polipeptidos. Los ensayos fueron realizados por triplicado en placas de 96 pocillos con una relaci6n efector a diana de 20 a 1.

La sensibilidad de un clon de celula T respecto a un polipeptido particular identificado anteriormente tambien puede determinarse usando un experimento de dosis-respuesta. Se pueden usar fibroblastos sensibilizados a polipeptido como celulas diana. Las celulas diana son sometidas a pulsos con el peptido particular como se ha descrito anteriormente para la determinaci6n de la especificidad fina, salvo porque los peptidos se anaden a concentraciones diferentes antes de la adici6n de las celulas T. Los controles incluyen celulas diana solas y celulas diana pulsadas con el peptido asociado a melanoma irrelevante Melan-A/Mart-1.

Inducci6n y proliferaci6n de la respuesta de celulas T humanas al peptido de injerto a de hTERT

En este experimento, se aislaron celulas mononucleares sangufneas perifericas (PBMC) procedentes de cuatro humanos sanos (donantes "14328", "14313", "23244" y "23255") y se imprimaron durante siete dfas con celulas dendrfticas pulsadas con el peptido de SEC ID N°: 11 derivado del polipeptido de injerto a de hTERT, seguido de dos ciclos que consistieron en siete dfas de re-estimulaci6n con PBMC aut6logas pulsadas con peptido. Las celulas dendrfticas derivaron de monocitos procedentes de sangre periferica. Las celulas T procedentes del cultivo en masa resultante fueron evaluadas por triplicado con o sin celulas presentadoras de antfgeno (APC) pulsadas con peptido antes de ser recolectadas a los 3 dfas. Para medir la capacidad proliferativa de los cultivos, se anadi6 3H-timidina (3,7 x 104 Bq/pocillo) al cultivo durante una noche antes de la recolecci6n. Los cultivos con APC no pulsadas o sin APC sirvieron como controles. Los resultados que muestran la capacidad proliferativa de los cultivos se presentan en la Figura 7. A continuaci6n se describen otros detalles adicionales del protocolo usado.

Los clones de celulas T se obtuvieron de los cultivos en masa resultantes procedentes de los donantes 14313 y 23255 no vacunados. Los clones fueron obtenidos a partir de blastos de celulas T presentes en PBMCs, tal como se ha descrito anteriormente en la secci6n "Analisis de respuesta de celulas T in vitro". Los resultados de la proliferaci6n de los clones de celulas T con celulas presentadoras de antfgeno pulsadas con peptido y no pulsadas con peptido se muestran en la Figura 8 (donante 14313) y en la Figura 9 (donante 23255).

Los resultados de las Figuras 7, 8 y 9 se dan como conteos medios por minuto (cpm) de medidas por triplicado. Los datos demuestran que la sangre de humano contiene celulas T en circulaci6n especfficas para un peptido (SEC ID N°: 11) derivado del peptido derivado del polipeptido de injerto a de hTERT, y ademas que dichas celulas T pueden expandirse in vitro con una estimulaci6n con el peptido relevante.

Por tanto, los experimentos de las Figuras 7, 8 y 9 demuestran que el polipeptido de injerto a de hTERT es inmunogenico en el hombre. La estimulaci6n in vitro (o in vivo) puede dar lugar a un aumento de las respuestas de celulas T especfficas de protefna de injerto a de hTERT con el potencial de reconocer el mismo antfgeno cuando este sobreexpresado por un tumor que crece en un paciente con cancer. Este experimento en particular demuestra que en principio el peptido de la SEC ID N°: 11 podrfa desarrollarse como una vacuna contra el cancer en humanos.

Protocolo para la inducci6n de respuesta de celulas T restringida a MHC de clase II

Dfa 0:

Se separaron las PBMCs de 50 mL de sangre (procedente de la capa leucocitaria). Las celulas fueron contabilizadas y re-suspendidas en RPMI-1640 completo/suero de conjunto 15%.

Los cultivos en masa fueron procesados en 1-2 pocillos sobre una placa de 24 pocillos de PBMCs a 2 x 106 celulas/mL en 1-1,5 mL. Se anadi6 25 IM de peptido de SEC ID N°: 11 derivado del polipeptido de injerto a de hTERT.

Dfa 9-10:

Los cultivos en masa fueron recolectados y estimulados con PBMCs irradiadas y con peptido. Si se producfa una elevada mortandad celular, los cultivos eran separados con lymphoprep, si no eran contabilizados y re-suspendidos en RPMI/suero de conjunto 15%. (Se lleva a cabo una centrifugaci6n Lymphoprep de los cultivos en masa en tubos 5 Falcon de 15 mL mediante 1; adici6n de 8 mL de suspensi6n celular, y 2; refuerzo con 2 mL de limphoprep. Se gira a 1500 rpm durante 30 minutos, y se lava dos veces con agua salada). Se descongel6 un vial de PBMCs aut6logas, se lav6, se contabiliz6 y re-suspendi6 en RPMI/FCS 15%. Las PBMCs fueron irradiadas (25 GY, 5 minutos 58 segundos). Las celulas fueron llevadas a placa en placas de 24 pocillos. Se estimularon 0,5-2,0 x 106 celulas T de los cultivos en masa con 1 x 106 celulas sustrato irradiadas (PBMCs) y peptido de SEC ID N°: 11 25 IM. El volumen

10 final fue 1 mL.

Dfa 12:

Se anadi6 IL-2 (10 U/mL). Tambien se anadi6 medio si era necesario reemplazando la mitad del volumen. Los cultivos se dividieron si era necesario.

Dfa 17:

15 Las celulas T en el cultivo en masa fueron re-estimuladas como en el dfa 10, con PBMCs aut6logas irradiadas y el peptido de SEC ID N°: 11.

Dfa 19:

Se anadi6 IL-2 (10 U/mL) a los cultivos en masa re-estimulados el dfa 17.

Dfa 24:

20 Se realiz6 un ensayo de proliferaci6n para evaluar las celulas T en cuanto a especificidad de peptido en placas de 96 pocillos, cada condici6n por triplicado:

Triplicados

1-3 4-6 7-9 10-12

Controles

PBMC1 T c2 PBMC1 + Tc2 PBMC1 + Tc2 + IL-23

Muestras de ensayo

PBMC1 + Tc2 + Pep4 PBMC1+Tc2+Pep4+IL-23

1 50.000 PBMCs irradiadas, 2 50.000 celulas T de cultivo en masa, 31U/mL, 4 25 Ig/mL de peptido de SEC ID N°: 11.

En el dfa 2-3 del ensayo de proliferaci6n, se anadi6 3H-timidina (20 IL) y se incub6 a 37°C durante una noche antes de la recolecci6n.

25 En una variante del protocolo (tal como se usa en el ejemplo anterior) las PBMCs fueron imprimadas, en el dfa 0, con celulas dendrfticas pulsadas con SEC ID N°: 11.

LISTAD0 DE SECUENCIAS

�110� Norsk Hydro ASA

�120� Polipeptidos

5

�130� MW J1586/07

�160� 10

�170� PatentIn versi6n 3.0

�210� 1

10

�220� 44

�212� PRT

�213� Homo sapiens

�400� 1

15 �210� 2

�220� 53

�212� PRT

�213� Homo sapiens

�400� 2

�210� 3 �220� 20 �212� PRT �213� Homo sapiens

25 �400� 3

�210� 4 �220� 29 30 �212� PRT �213� Homo sapiens

�400� 4 �210� 5 �220� 9 �212� PRT �213� Homo sapiens

�400� 5

�210� 6 �220� 18 10 �212� PRT �213� Homo sapiens

�400� 6

�210� 7 15 �220� 23

�212� ADN

�213� Homo sapiens

�400� 7

20 �210� 8

�220� 27

�212� ADN

�213� Homo sapiens

�400� 8

�210� 9 �220� 22 �212� ADN �213� Homo sapiens

30 �400� 9

�210� 10 �220� 26 �212� ADN

35 �213� Homo sapiens

�400� 10

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer; en donde el polipeptido: a) comprende una secuencia dada por la SEC ID N°: 1 6 2; b) comprende 8 aminoacidos contiguos de la SEC ID N°: 1 6 2, con la condici6n de que al menos uno de dichos 8 aminoacidos contiguos proceda de la SEC ID N°: 1; o c) comprende 8 aminoacidos contiguos que tienen solo una, dos o tres sustituciones de aminoacidos respecto a los 8 aminoacidos contiguos descritos en anteriormente en b), con la condici6n de que al menos uno de los 8 aminoacidos contiguos presentes proceda de la SEC ID N°: 1; en donde el polipeptido es capaz de inducir una respuesta de celulas T.
2. 2.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con la reivindicaci6n 1; en donde el polipeptido:

   a) tiene al menos un 55% de identidad de secuencia con una molecula que comprende la secuencia de SEC ID N°: 1, determinada mediante una busqueda con NCBI BLASTP Versi6n 2.1.2 con los parametros por defecto; o

   b) tiene al menos un 55% de identidad de secuencia con una molecula que comprende la secuencia de SEC ID N°: 2, determinada mediante una busqueda con NCBI BLASTP Versi6n 2.1.2 con los parametros por defecto.
3. 3.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con la reivindicaci6n 1; en donde el polipeptido comprende una secuencia dada en la SEC ID N°: 1 6 2 o es un fragmento de una secuencia como la mostrada en la SEC ID N°: 1.
4. 4.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente; en donde la respuesta de celulas T se genera despues de la separaci6n intracelular del polipeptido para proporcionar un fragmento que se ajusta a un sitio de uni6n de MHC o HLA.
5. 5.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; en donde el polipeptido no necesita una separaci6n intracelular para ajustarse al sitio de uni6n de MHC o HLA de clase I.
6. 6.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con la reivindicaci6n 5; en donde el polipeptido tiene una longitud de entre 8 y 10 aminoacidos.
7. 7.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con las reivindicaci6n 1 a 4; en donde el polipeptido no necesita una separaci6n intracelular para ajustarse al sitio de uni6n de MHC o HLA de clase II.
8. 8.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con la reivindicaci6n 7; en donde el polipeptido tiene una longitud de entre 12 y 25 aminoacidos.
9. 9.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente; en donde la respuesta de celulas T aumenta el numero y/o la actividad de celulas T colaboradoras y/o de celulas T citot6xicas.
10. 10.-Un polipeptido para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente; en donde el polipeptido no estimula una respuesta de celulas T citot6xicas sustancial en un paciente contra uno o mas de los siguientes: celulas madre de medula 6sea, celulas epiteliales de las criptas col6nicas o linfocitos.
11. 11.-Una molecula de acido nucleico para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer; en donde la molecula de acido nucleico: a) tiene una cadena que codifica un polipeptido como el descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; b) tiene una cadena que es complementaria con una cadena como la descrita en a) anteriormente; o c) tiene una cadena que se hibrida con una molecula como la descrita en a) o b) anteriormente en condiciones severas.
12. 12.-Un vector o celula para uso como medicamento para el tratamiento de cancer mediante la estimulaci6n de una reacci6n inmune contra el cancer que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 11 en forma recombinante.
13. 13.-Un linfocito T para uso como medicamento; en donde el linfocito T es capaz de matar a una celula que expresa un polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o de ayudar a matar dicha celula.
14. 14.-El linfocito para uso como medicamento de acuerdo con la reivindicaci6n 13; en done el linfocito T es una celula T citot6xica o una celula T colaboradora.
15. 15.-Una lfnea celular clonal para uso como medicamento que comprende una pluralidad de linfocitos T de acuerdo con la reivindicaci6n 13 o la reivindicaci6n 14.
16. 16.-Una mezcla de linfocitos T para uso como medicamento que comprende una celula T colaboradora de acuerdo

    5 con la reivindicaci6n 14 o una lfnea celular clonal de dichas celulas de acuerdo con la reivindicaci6n 15 y una celula T citot6xica de acuerdo con la reivindicaci6n 14 o una lfnea celular clonal de dichas celulas de acuerdo con la reivindicaci6n 15.
17. 17.-El polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 11, el vector o celula de acuerdo con la reivindicaci6n 12, el linfocito T de acuerdo con la reivindicaci6n

    10 13 6 14, una lfnea celular de acuerdo con la reivindicaci6n 15, o una mezcla de linfocitos T de acuerdo con la reivindicaci6n 16, en donde el cancer es un cancer de mamffero.
18. 18.-El polipeptido, acido nucleico, vector o celula, linfocito T, lfnea celular o mezcla de linfocitos T de acuerdo con la reivindicaci6n 17; en donde el cancer es un cancer humano.
19. 19.-El polipeptido, acido nucleico, vector o celula, linfocito T, lfnea celular o mezcla de linfocitos T de acuerdo con la

    15 reivindicaci6n 18; en donde el cancer es cancer de mama, cancer de pr6stata, cancer pancreatico, cancer colorrectal, cancer de pulm6n, melanoma maligno, leucemia, linfoma, cancer de ovario, cancer cervical o un carcinoma del tractor biliar.