ES2383990T3

ES2383990T3 - Endonucleasas FEN

Info

Publication number: ES2383990T3
Application number: ES04019258T
Authority: ES
Inventors: Victor Lyamichev; Natasha Lyamichev; W. Michael Kaiser
Original assignee: Third Wave Technologies Inc
Current assignee: Third Wave Technologies Inc
Priority date: 2000-11-15
Filing date: 2001-11-15
Publication date: 2012-06-28
Anticipated expiration: 2021-11-15
Also published as: ATE541943T1

Abstract

Una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

Description

Endonucleasas Fen

Campo de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona nuevos agentes de escisión y polimerasas para la escisión y modificación de ácido nucleico. Los agentes de escisión y las polimerasas encuentran utilidad para, por ejemplo, la detección y caracterización de secuencias de ácido nucleico y variaciones en las secuencias de

ácido nucleico. En algunas realizaciones, la actividad 5’ nucleasa de varias enzimas se usa para escindir una

estructura de escisión dependiente de diana, de modo que indica la presencia de secuencias específicas de ácido nucleico o variaciones específicas de las mismas.

Antecedentes de la invención

La detección y caracterización de secuencias específicas de ácido nucleico y variaciones de las secuencias se han utilizado para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico víricas o bacterianas indicativas de una infección, para detectar la presencia de variantes o alelos de genes de asociados con enfermedad y cánceres. Estos procedimientos también encuentran aplicación en la identificación de fuentes de ácidos nucleicos, como para análisis forenses o para determinaciones de paternidad.

En la técnica se conocen diversos procedimientos que se pueden usar para detectar y caracterizar secuencias específicas de ácido nucleico y variantes de secuencia. Sin embargo, con la finalización de la secuenciación de ácido nucleico del genoma humano, así como de los genomas de numerosos organismos patógenos, la demanda de ensayos rápidos, fiables, económicos y cómodos para el usuario para la detección de secuencias específicas de ácido nucleico continúa creciendo. Lo que es aún más importante, estos ensayos tienen que ser capaces de crear una señal detectable a partir de muestras que contengan muy pocas copias de la secuencia de interés. La siguiente discusión examina dos niveles de ensayos de detección de ácido nucleico que se usan actualmente: I. Tecnología de Amplificación de Señal para detección de secuencias raras; y II. Tecnología de Detección Directa para la detección cuantitativa de secuencias.

I. Procedimientos de Tecnología de Amplificación de Señal para Amplificación

La “Reacción en Cadena de la Polimerasa” (PCR) comprende la primera generación de procedimientos para la

amplificación de ácido nucleico. Sin embargo, se han desarrollado varios procedimientos diferentes que emplean la misma base de especificidad, pero que crean señal mediante diferentes mecanismos de amplificación. Estos procedimientos incluyen la “Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR)”, “Reacción Sintética Auto-Mantenida” (3SR/NASBA) y “Replicasa Q ” (Q ).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describe en las Patentes de EE.UU. Nº 4.683.195.

4.683.202. y 4.965.188 de Mullis y Mullis y col. describe un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Esta tecnología proporciona una enfoque para los problemas de una baja concentración de secuencia diana. Se puede usar la PCR para aumentar directamente la concentración de la diana hasta un nivel fácilmente detectable. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana implica introducir un exceso molar de los dos cebadores oligonucleotídicos que son complementarios con sus cadenas respectivas de la secuencia diana de doble hélice a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada. La mezcla se desnaturaliza y después se deja hibridar. Después de la hibridación, los cebadores se extienden con polimerasa para formar cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión por polimerasa se pueden repetir tan a menudo como sea necesario, para obtener concentraciones relativamente altas de un segmento de la secuencia diana deseada.

La longitud del segmento de la secuencia diana deseada se determina mediante las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Debido a que los segmentos deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias dominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se

dice que se “amplifican por PCR”.

Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR o LAR)

La reacción en cadena de la ligasa (LCR; denominada en ocasiones “Reacción de Amplificación de la Ligasa” (LAR) descrita por Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 189 (1991); Barany, PCR Methods and Applic., 1: 5 (1991); y Wu y Wallace, Genomics 4: 560 (1989) se ha desarrollado hasta un procedimiento alternativo bien reconocido para amplificar ácidos nucleicos. En la LCR se mezclan cuatro oligonucleótidos, dos oligonucleótidos adyacentes que hibridan de forma única con una hebra de ADN diana y un conjunto complementario de oligonucleótidos adyacentes, que hibridan con la hebra opuesta y se añade ADN ligasa a la mezcla. Con la condición de que haya una complementariedad completa en la unión, la ligasa ligará covalentemente cada conjunto de moléculas hibridadas. Lo

que es aún más importante, en la LCR se ligan dos sondas entre sí solamente cuando tienen emparejamiento de bases con secuencias en la muestra diana, sin huecos o apareamientos erróneos. Ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y ligación amplifican un segmento corto de ADN. La LCR también se ha usado en combinación con PCR para conseguir una detección potenciada de los cambios de una única base. Segev, PCT Public. Nº W09001069 A1 (1990). Sin embargo, debido a que los cuatro oligonucleótidos usados en este ensayo se pueden emparejar para formar dos fragmentos cortos que se pueden ligar, existe el potencial de la generación de señal de fondo independiente de diana. El uso de LCR para selección de mutantes está limitado al análisis de posiciones de ácido nucleico específicas.

Reacción Sintética Auto-Mantenida (3SR/NASBA)

La reacción de replicación de secuencia auto-mantenida (3SR) (Guatelli y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 1874-1878, [1990], con una errata en Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 7797 [1990]) es un sistema de amplificación in vitro basado en transcripción (Kwok y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 1173-11177 [1989]) que puede amplificar exponencialmente secuencias de ARN a una temperatura uniforme. Después, el ARN amplificado se puede utilizar para detección de mutaciones (Fahy y col. PCR Meth. Appl., 1:25-33 [1991]). En este procedimiento se usa un cebador

oligonucleotídico para añadir un promotor de ARN polimerasa de fago al extremo 5’ de la secuencia de interés. En

una combinación de enzimas y sustratos que incluye un segundo cebador, transcriptasa inversa, RNAsa H, ARN polimerasa y ribo- y desoxirribonucleósidos trifosfato, la secuencia diana experimenta rondas repetidas de transcripción, síntesis de ADNc síntesis de segunda hebra para amplificar el área de interés. El uso de 3SR para detectar mutaciones está limitado cinéticamente a la exploración de pequeños segmentos de ADN (por ejemplo, 200-300 pares de bases).

Replicasa Q-Beta (QQ )

En este procedimiento, una sonda que reconoce la secuencia de interés se une al molde de ARN replicable para replicasa Q . Un problema principal que se ha identificado previamente con falsos positivos que se producen por la replicación de sondas no hibridadas se ha abordado mediante el uso de una etapa de ligación específica de secuencia. Sin embargo, las ADN ligasas termoestables disponibles no son eficaces sobre este sustrato de ARN, de tal forma que se tiene que realizar la ligación mediante ADN ligasa de T4 a temperaturas bajas (37 ºC). Esto evita el uso de temperatura alta como un medio para conseguir especificidad como en la LCR, el acontecimiento de ligación se puede usar para detectar una mutación en el sitio de unión, pero no en otro lugar.

La siguiente tabla 1 enumera algunas de las características deseables para sistemas útiles en diagnósticos de ácido nucleico sensibles y resume las capacidades de cada uno de los principales procedimientos de amplificación (véase también Landgren, Trends in Genetics 9: 199 [1993]).

Un procedimiento de diagnóstico exitoso tiene que ser muy específico. Un procedimiento sencillo para controlar la especificidad de hibridación de ácido nucleico es mediante el control de la temperatura de la reacción. Aunque la 3SR/NASBA y los sistemas Qß son todos capaces de generar una gran cantidad de señal, una o más de las enzimas implicadas en cada uno no se pueden usar a temperatura alta (es decir, >55 ºC). Por lo tanto, las temperaturas de reacción no se pueden aumentar para evitar hibridación no específica de las sondas. Si las sondas se acortan para hacer que se fundan de forma más sencilla a temperaturas bajas, aumenta la probabilidad de tener más de un apareamiento perfecto en un genoma complejo. Por estos motivos, la PCR y LCR dominan actualmente el campo de investigación en tecnologías de detección.

TABLA 1

Característica: Procedimiento

PCR: LCR PCR y LCR 3SR NASBA QQ

Amplifica la diana: + + + +

Reconocimiento se secuencias independientes requerido: + + + + +

Realizado a temperatura alta: + +

Funciona a temperatura fija: + +

Amplificación exponencial: + + + + +

Generación de señal genérica: +

Característica: Procedimiento

PCR: LCR PCR y LCR 3SR NASBA QQ

Fácilmente automatizable

La base del procedimiento de amplificación en la PCR y LCR es el hecho de que los productos de un ciclo se convierten en moldes que se pueden usar en todos los ciclos posteriores, duplicando en consecuencia la población con cada ciclo. El rendimiento final de cualquiera de tales sistemas de duplicación se puede expresar como: (1+X)n = y, donde “X” es la eficacia media (porcentaje copiado en cada ciclo), “n” es el número de ciclos e “y” es la eficacia global o el rendimiento de la reacción (Mullis, PCR Methods Applic., 1: 1 [1991]). Si cada copia de un ADN diana se utiliza como un molde en cada ciclo de una reacción en cadena de la polimerasa, la eficacia media es del 100%. Si se realizan 20 ciclos de PCR, entonces el rendimiento será 220 ó 1.048.576 copias del material de partida. Si las condiciones de reacción reducen la eficacia media al 85%, entonces el rendimiento en esos 20 ciclos será solamente 1,8520 o 220.513 copias del material de partida. En otras palabras, una PCR que se procesa al 85% de eficacia producirá únicamente hasta el 21% de producto final en comparación con una reacción que se procesa al 100% de eficacia. Una reacción que se reduce al 50% de eficacia media producirá menos del 1% del posible producto.

En la práctica, las reacciones en cadena de la polimerasa rutinarias consiguen en pocas ocasiones el rendimiento máximo teórico y las PCR se han procesado habitualmente durante más de 20 ciclos para compensar el menor rendimiento. Al 50% de eficacia media, se necesitarían 34 ciclos para conseguir la amplificación de un millón de veces teóricamente posible en 20 y, a eficacias menores, el número de ciclos requeridos se convierte en prohibitivo. Además, cualquier producto de fondo que se amplifique con una mejor eficacia media que la diana pretendida se convertirá en los productos dominantes.

Además, muchas variables pueden influir en la eficacia media de la PCR, incluyendo la longitud y estructura secundaria del ADN diana, la longitud y el diseño del cebador, las concentraciones de cebador y dNTP y la composición del tampón, por nombrar algunas. La contaminación de la reacción con ADN exógeno (por ejemplo, ADN vertido sobre superficies de laboratorio) o contaminación cruzada también es una consideración principal. Las condiciones reacción se tienen que optimizar cuidadosamente para cada par de cebador diferente y secuencia diana y el procedimiento puede requerir días, incluso para un investigador experimentado. La laboriosidad de este procedimiento, incluyendo numerosas consideraciones técnicas y otros factores, presenta una desventaja significativa para usar PCR en el entorno clínico. De hecho, la PCR todavía tiene que penetrar en el mercado clínico de un modo significativo. Los mismos aspectos se presentan con LCR, ya que la LCR también se tiene que optimizar para usar diferentes secuencias oligonucleotídicas para cada secuencia diana. Además, ambos procedimientos requieren equipamiento costoso, capaz de ciclado a temperatura precisa.

Muchas aplicaciones de tecnologías de detección de ácido nucleico, tales como en estudios de variación alélicas, no implican solamente la detección de una secuencia específica en un fondo complejo, sino también la discriminación entre secuencias con pocas, o únicas, diferencias de nucleótidos. Un procedimiento para la detección de variantes específicas de alelo mediante PCR se basa en el hecho de que es difícil que la polimerasa de Taq sintetice una hebra de ADN cuando hay un apareamiento erróneo entre la cadena molde y el extremo 3’ del cebador. Se puede detectar una variante específica de alelo mediante el uso de un cebador que esté perfectamente apareado con solamente uno de los posibles alelos; el apareamiento erróneo con el otro alelo actúa evitando la extensión del cebador, evitando de este modo la amplificación de esa secuencia. Este procedimiento tiene una limitación sustancial porque la composición de bases del apareamiento erróneo influye en la capacidad de evitar extensión a lo largo del apareamiento erróneo y determinados apareamientos erróneos no evitan la extensión o tienen solamente un efecto mínimo (Kwok y col., Nucl. Acids Res., 18:999 [1990]).)

Se usa una estrategia de apareamiento erróneo 3’ similar con mayor efecto para evitar la ligación en la LCR (Barany, PCR Meth. Applic., 1:5 [1991]). Cualquier apareamiento erróneo bloquea de forma eficaz la acción de la ligasa termoestable, pero la LCR todavía tiene la desventaja de que productos de ligación de fondo independientes de diana inician la amplificación. Además, la combinación de PCR con LCR posterior para identificar los nucleótidos en posiciones individuales también es una proposición claramente incómoda para el laboratorio clínico.

II. Tecnología de Detección Directa

Cuando está disponible una cantidad suficiente de un ácido nucleico que se tiene que detectar, hay ventajas en la detección de esa secuencia directamente, en vez de preparar más copias de esa diana (por ejemplo, como en PCR y LCR). Más en particular, un procedimiento que no amplifica la señal exponencialmente es más susceptible de análisis cuantitativo. Incluso si la señal se mejora uniendo múltiples colorantes a un único oligonucleótido, la correlación entre la intensidad de señal final y la cantidad de diana es directa. Un sistema de este tipo tiene una ventaja adicional de que productos de la reacción no favorecerán por sí mismos reacción posterior, de tal forma que la contaminación de superficies de laboratorio por los productos no es tanto un problema. Los procedimientos tradicionales de detección directa, incluidos transferencia de tipo Northern y Southern y ensayos de protección de RNasa, normalmente requieren el uso de radioactividad y no son susceptibles de automatización. Con las técnicas concebidas recientemente se ha pretendido eliminar el uso de radiactividad y/o mejorar la sensibilidad en formatos

automatizables. dos ejemplos la “Reacción de Sonda de Ciclado” (CPR) y “ADN Ramificado” (ADNr).

La reacción de sonda de ciclado (CPR) (Duck y col., Biotech., 9: 142 [1990]) usa un oligonucleótido quimérico largo en el que una parte central está hecha de ARN mientras que los dos extremos están hechos de ADN. La hibridación de la sonda con un ADN diana y exposición a ENASA H termoestable provoca que se digiera la parte de ARN. Esto desestabiliza las partes de ADN remanentes del dúplex, liberando el resto de la sonda del ADN diana y permitiendo que otra molécula sonda repita el procedimiento. La señal, en forma de moléculas de sonda escindidas, se acumula a una velocidad lineal. Aunque el procedimiento repetitivo aumenta la señal, la parte de ARN del oligonucleótido es vulnerable a RNasas que se pueden transportar por la preparación de muestra.

El ADN ramificado (ADNr), descrito por Urdea y col., Gene 61: 253-264 (1987), implica oligonucleótidos con estructuras ramificadas que permiten que cada oligonucleótido individual lleve de 35 a 40 marcadores (por ejemplo enzimas fosfatasa alcalina). Aunque esto mejora la señal de un acontecimiento de hibridación, la señal de unión no específica aumenta de forma similar.

Aunque estos dos procedimientos tienen las ventajas de detección directa que se han discutido anteriormente, ni los procedimientos de CPR ni de ADNr pueden hacer uso de la especificidad permitida por el requerimiento de reconocimiento independiente por dos o más secuencias de sonda (oligonucleotídicas), como es común en los procedimientos de amplificación de señal que se han descrito anteriormente en la sección I. El requerimiento de que dos oligonucleótidos tengan que hibridar con un ácido nucleico diana para que se genere una señal detectable confiere una medida adicional de rigurosidad a cualquier ensayo de detección. El requerimiento de que dos oligonucleótidos se unan a un ácido nucleico diana disminuye la probabilidad de que se produzcan resultados de

falsos “positivos” debido a la unión no específica de una sonda a la diana. El requerimiento adicional de que los dos

oligonucleótidos se tengan que unir en una orientación específica en relación a la diana, como se requiere en la PCR, donde los oligonucleótidos se tienen que orientar de forma opuesta pero de forma apropiada de tal forma que la ADN polimerasa pueda superar el hueco entre los dos oligonucleótidos en ambas direcciones, mejora adicionalmente la especificidad de la reacción de detección. Sin embargo, los expertos en la técnica conocen bien

que incluso aunque la PCR utiliza dos sondas oligonucleotídicas (denominadas cebadores), la amplificación “no específica” (es decir, amplificación de secuencias no dirigida por los dos cebadores usados) es una artefacto habitual. Esto es en parte debido a que la ADN polimerasa usada en PCR se puede acomodar a distancias muy grandes, medidas en nucleótidos, entre los oligonucleótidos y, por tanto, hay una gran ventana en la que la unión no específica de un oligonucleótido puede conducir a amplificación exponencial de producto inapropiado. Por el contrario, la PCR no puede avanzar a menos que los oligonucleótidos usados se unan a la diana de forma adyacente entre sí y de tal forma se realiza el beneficio completo de la hibridación de oligonucleótido doble.

Un procedimiento de detección directa ideal combinaría las ventajas de los ensayos de detección directa (por ejemplo, cuantificación sencilla y riesgo mínimo de contaminación por traspaso) con la especificidad proporcionada por un ensayo de hibridación de oligonucleótido doble.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona nuevos agentes de escisión y polimerasas para la escisión y modificación de ácido nucleico. El agente de escisión y las polimerasas encuentran utilidad para, por ejemplo, la detección y caracterización de secuencias de ácido nucleico y variaciones en las secuencias de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la actividad 5’ nucleasa de varias enzimas se usa para escindir una estructura de escisión dependiente de diana, de modo que indica la presencia de secuencias específicas de ácido nucleico o variaciones específicas de las mismas. La presente invención contempla el uso de nuevos procedimientos de detección para diversos usos, incluyendo, pero sin limitación, propósitos de diagnóstico clínico.

La invención proporciona una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

La invención proporciona además una composición que comprende un ácido nucleico aislado, en el que dicho ácido nucleico codifica la endonucleasa de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico aislado comprende la SEC ID Nº 369.

La invención proporciona además un procedimiento para detectar una secuencia diana, que comprende:

a) proporcionar:

i) una estructura de escisión que comprende una secuencia Diana y oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de dicha secuencia diana; y

ii) una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370; y

b) exponer dicha estructura de escisión a dicha endonucleasa FEN-1; y

c) detectar la escisión de dicha estructura de escisión.

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar una secuencia diana (p. ej., una mutación, polimorfismo etc.), que comprende una muestra que se sospecha que contiene la secuencia diana; oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de la secuencia diana; y un agente para detectar la presencia de una estructura de escisión invasiva; y exponer la muestra a los oligonucleótidos y al agente. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de detectar un complejo que comprende el agente y la estructura de escisión invasiva (directa o indirectamente). En algunas realizaciones, el agente comprende un agente de escisión. En algunas realizaciones preferidas, la exposición de muestra a los oligonucleótidos y al agente comprende exponer la muestra a los oligonucleótidos y al agente en condiciones en las que se forma una estructura de escisión invasiva entre la secuencia diana y los oligonucleótidos si la secuencia diana está presente en la muestra, en la que la estructura de escisión invasiva es escindida por el agente de escisión para formar un producto de escisión. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de detectar el producto de escisión. En algunas realizaciones, la secuencia diana comprende una primera región y una segunda región, la segunda región cadena abajo y contigua a la primera región, y en la que los oligonucleótidos comprende los oligonucleótidos primero y segundo, en la que al menos una porción del primer oligonucleótido es completamente complementaria a la primera porción de la secuencia diana y en la que el segundo

oligonucleótido comprende una porción en 3’ y una porción en 5’, en la que la porción en 5’ es completamente

complementaria a la segunda porción de dicho ácido nucleico diana.

La presente invención también proporciona un kit para detectar dichas secuencias diana, comprendiendo dicho kit oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de la secuencia diana, como se define en las reivindicaciones.

En concreto, la invención proporciona un kit de tratamiento de ácido nucleico, que comprende:

a) una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370; y

b) oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de un ácido nucleico diana.

La presente invención también proporciona procedimientos para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana detectando productos de escisión no diana, que comprende proporcionar: Un agente de escisión, una fuente de ácido nucleico diana, comprendiendo el ácido nucleico diana una primera región y una segunda región, la segunda región cadena abajo y contigua a la primera región; un primer oligonucleótido, en el que al menos una porción del primer oligonucleótido es completamente complementaria a la primera porción del ácido nucleico diana; y

un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3’ y una porción 5’, en la que la porción 5’ es

completamente complementaria a la segunda porción del ácido nucleico diana; mezclar el agente de escisión, el ácido nucleico diana, el primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tal que al menos la porción del primer oligonucleótido se hibrida con la primera región de

dicho ácido nucleico diana y en el que al menos la porción 5’ del segundo oligonucleótido hibrida con la segunda

región del ácido nucleico diana para crear una estructura de escisión, y en la que la escisión de la estructura de escisión se produce para generar un producto de escisión no diana; y detectar la escisión de la estructura de escisión.

La detección de la escisión de la estructura de escisión se puede llevar a cabo de cualquier manera. En algunas realizaciones, la detección de la escisión de la estructura de escisión comprende detectar el producto de escisión no diana. En otras realizaciones más, la detección de la escisión de la estructura de escisión comprende la detección de fluorescencia, masa o transferencia de energía de fluorescencia. Otros procedimientos de detección incluyen, entre otros, detección de radioactividad, luminiscencia, fosforescencia, polarización de fluorescencia y carga. En algunas realizaciones, la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento que comprende proporcionar el producto de escisión no diana; una composición que comprende dos ácidos nucleicos monocatenarios hibridados de modo que definen una porción monocatenaria de una región de unión a proteína; y una proteína; y exponer el producto de escisión no diana a la porción monocatenaria de la región de unión a proteína en condiciones tales que la proteína se une a la región de unión a proteína. En algunas realizaciones, la proteína comprende una proteína productora de ácido nucleico, en la que proteína productora de ácido nucleico se une a la región de unión a proteína y produce ácido nucleico. En algunas realizaciones, la región de unión a proteína es una región de unión a la ARN polimerasa dependiente del molde (p. ej., la región de unión de la ARN polimerasa de T7). En otras realizaciones, la detección se lleva a cabo mediante un procedimiento que compren de proporcionar el producto de escisión no diana, una hebra contigua sencilla de ácido nucleico que comprende una secuencia que define una sola hebra de una región de unión a ARN polimerasa; una ADN polimerasa dependiente del molde; y una ARN polimerasa dependiente del molde; exponer el producto de escisión no diana a la región de unión a ARN polimerasa en condiciones tales que el producto de escisión no diana se une a una porción de la hebra sencilla de la región de unión a ARN polimerasa para producir un producto de escisión no diana unido; exponer el producto de escisión no diana unido a la ADN polimerasa dependiente de molde en condiciones tales que se produce una región de unión a ARN polimerasa bicatenaria; y exponer la región de unión bicatenaria a ARN polimerasa a la ARN polimerasa dependiente de molde en condiciones tales que se produce tránscritos de ARN. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de detectar tránscritos de ARN. En algunas realizaciones, la ARN polimerasa dependiente de molde es ARN polimerasa de T7.

La presente invención no está limitada por la porción 3’ del segundo oligonucleótido. En algunas realizaciones preferidas, la porción 3’ de este segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en 3’ terminal no complementario al ácido nucleico diana. En algunas realizaciones preferidas, la porción 3’ de este segundo oligonucleótido consiste en un único nucleótido no complementario al ácido nucleico diana.

Cualquiera de los componentes del procedimiento puede estar fijado a un soporte sólido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el primer oligonucleótido está fijado a un soporte sólido. En otras realizaciones, el segundo oligonucleótido está fijado a un soporte sólido.

El agente de escisión puede ser un agente que es capaz de escindir las estructuras de escisión invasivas como redefine en las reivindicaciones. En algunas realizaciones preferidas, el agente de escisión comprende una nucleasa específica de estructura. En realizaciones particularmente preferidas, la nucleasa específica de estructura comprende una nucleasa específica de estructura termoestable (p. ej., una nucleasa 5’ termoestable). Las nucleasas específicas de estructura termoestables incluyen, entre otras, las que tienen una secuencia de aminoácidos homóloga a una porción de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable derivada de un organismo termofílico (p. ej., Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus).

El procedimiento no está limitado por la naturaleza del ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es ADN o ARN monocatenario o bicatenario. En algunas realizaciones, el ácido nucleico bicatenario se convierte en monocatenario (p. ej., mediante calor) antes de la formación de la estructura de escisión. En alguna realización, la fuente del ácido nucleico diana comprende una muestra que contiene ADN genómico. Las muestras incluyen, entre otras, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, fluido pleural, leche, linfa, esputo y semen.

En algunas realizaciones, las condiciones de reacción para el procedimiento comprenden proporcionar una fuente de cationes divalentes. En algunas realizaciones preferidas, el catión divalente se selecciona del grupo que comprende iones Mn2+ y Mg2+. En algunas realizaciones, las condiciones de reacción para el procedimiento comprenden proporcionar el primero y el segundo oligonucleótidos en un exceso de concentración en comparación con el ácido nucleico diana.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además proporcionar un tercer oligonucleótido complementario a una tercera porción de dicho ácido nucleico diana cadena arriba de la primera porción del ácido nucleico diana, en el que el tercer oligonucleótido se mezcla con la mezcla de reacción.

La invención proporciona un procedimiento para detectar una secuencia diana, que comprende:

a) proporcionar:

b) exponer dicha estructura de escisión a dicha endonucleasa FEN-1; y

c) detectar la escisión de dicha estructura de escisión.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana detectando productos de escisión no diana, que comprende proporcionar: Un agente de escisión, una fuente de ácido nucleico diana, comprendiendo el ácido nucleico diana una primera región y una segunda región, la segunda región cadena abajo y contigua a la primera región; una pluralidad de primeros oligonucleótidos, en el que al menos una porción del primer oligonucleótido es completamente complementaria a la primera porción del ácido

nucleico diana; y un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3’ y una porción 5’, en la que dicha porción 5’ es completamente complementaria a la segunda porción del ácido nucleico diana; la pluralidad de los primeros oligonucleótidos y el segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tal que al menos la porción del primer oligonucleótido se hibrida con la primera región del ácido nucleico diana y en el que al

menos la porción 5’ del segundo oligonucleótido hibrida con la segunda región del ácido nucleico diana para crear

una estructura de escisión, y en la que la escisión de la estructura de escisión se produce para generar un producto de escisión no diana; en el que las condiciones permiten múltiples estructuras de escisión para formar y escindirse del ácido nucleico diana y detectar la escisión de dichas estructuras de escisión. En algunas realizaciones, las condiciones comprenden condiciones isotérmicas que permiten que la pluralidad de dichos primeros oligonucleótidos se disocien del ácido nucleico diana. Aunque la presente invención está limitada por el número de estructuras de escisión formadas en un ácido nucleico diana concreto, en algunas realizaciones preferidas, dos o más (3, 4, 5,...,10,...,10000,...) de la pluralidad de los primeros oligonucleótidos forman estructuras de escisión con un ácido nucleico Diana, en el que las estructuras de escisión se escinden para producir los productos de escisión no diana.

La presente invención también se refiere a procedimientos en los que un producto de escisión de los procedimientos anteriores se usa en otra región de escisión invasiva. Por ejemplo, la presente invención proporciona un procedimiento que comprende proporcionar un agente de escisión; un primer ácido nucleico diana, en el que el primer ácido nucleico comprende una primera región y una segunda región, la segunda región cadena abajo y contigua a la primera región; un primer oligonucleótido, en el que al menos una porción del primer oligonucleótido es completamente complementaria a la primera porción del primer ácido nucleico diana; un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3’ y una porción 5’, en el que la porción 5’ es completamente complementaria a la segunda porción del primer ácido nucleico diana; un segundo ácido nucleico diana, en el que dicho segundo ácido nucleico diana comprende una primera región y una segunda región, la segunda región cadena abajo y contigua a la primera región; y un tercer oligonucleótido, en el que al menos una porción del tercer oligonucleótido es completamente complementaria a la primera porción del segundo ácido nucleico diana; generar una primera estructura de escisión en la que al menos dicha porción del primer oligonucleótido se hibrida con la primera región

del primer ácido nucleico diana y en el que al menos la porción 5’ del segundo oligonucleótido se hibrida a la

segunda región del primer ácido nucleico diana y en el que la escisión de la primera estructura de escisión se produce mediante el agente de escisión, escindiendo de este modo el primer oligonucleótido para generar un cuarto oligonucleótido, en el que dicho cuarto oligonucleótido comprende una porción 3’ y una porción 5’, en el que la porción 5’ es completamente complementaria a la segunda porción del segundo ácido nucleico diana; generando

una segunda estructura de escisión en condiciones en las que al menos dicha porción del tercer oligonucleótido se hibrida con la primera región del segundo ácido nucleico diana y en las que al menos la porción 5’ del cuarto oligonucleótido se hibrida con la segunda región del segundo ácido nucleico diana y en las que la escisión de la segunda estructura de escisión se produce para generar un fragmento de escisión; y detectar la escisión de la

segunda estructura de escisión. En algunas realizaciones preferidas, la porción 3’ del cuarto oligonucleótido comprende un nucleótido en 3’ terminal no complementario al segundo ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la porción 3’ del tercer oligonucleótido está unido covalentemente al segundo ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, el segundo ácido nucleico diana comprende además una región 5’, en el que la región 5’ del

segundo ácido nucleico diana es el tercer oligonucleótido. La presente invención también proporciona kits que

comprenden: Un agente de escisión; un primer oligonucleótido que comprende una porción 5’ complementaria con una primera región de un ácido nucleico diana; y un segundo oligonucleótido que comprende una porción 3’ y una porción 5’, dicha porción 5’ complementaria a una segunda región del ácido nucleico diana cadena abajo y contigua a la primera porción. En algunas realizaciones, la porción 3’ del segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en 3’ terminal no complementario al ácido nucleico diana. En algunas realizaciones preferidas, la porción 3’ del

segundo oligonucleótido consiste en un único nucleótido no complementario al ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, el kit comprende además un soporte sólido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el primero y/o segundo oligonucleótido está fijado a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el kit comprende además una solución tampón. En algunas realizaciones preferidas, la solución tampón comprende una fuente de cationes divalentes (p. ej., Mn2+ y/o Mg2+). En algunas realizaciones específicas, el kit comprende además un tercer oligonucleótido complementario a una tercera porción de dicho ácido nucleico diana cadena arriba de la primera porción del primer ácido nucleico diana. En otras realizaciones más, el kit comprende además un ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, el kit comprende un segundo ácido nucleico diana. En otras realizaciones más, el kit comprende además un tercer oligonucleótido que comprende una porción 5’ complementaria a una primera región del segundo ácido nucleico diana. En algunas realizaciones específicas, la porción 3’ del tercer

oligonucleótido está unida covalentemente al segundo ácido nucleico diana. En otra realización específica, el

segundo ácido nucleico diana comprende además una porción 5’, en el que la porción 5’ del segundo ácido nucleico

diana es el tercer oligonucleótido. En otras realizaciones más, el kit comprende además una molécula ARRESTOR

(p. ej., un oligonucleótido ARRESTOR).

La presente invención se refiere además a una composición que comprende una estructura de escisión, en la que la estructura de escisión comprende: a) un ácido nucleico diana, en el que el ácido nucleico Diana tiene una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región, en el que la primera región se localiza adyacente y cadena abajo de la segunda región, la segunda región está localizada adyacente y cadena abajo de la tercera región y la tercera región está localizada adyacente y cadena abajo a la cuarta región; b) un primer oligonucleótido complementario a la cuarta región del ácido nucleico diana; c) un segundo oligonucleótido que tiene

una porción 5’ y una porción 3’ en el que la porción 5’ del Segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico Diana y en el que la porción 3’ del Segundo oligonucleótido

contiene una secuencia complementaria a la tercera región del ácido nucleico Diana; y (d) un tercer oligonucleótido

que tiene una porción 5’ y una porción 3’ en el que la porción 5’ del tercer oligonucleótido contiene una secuencia

complementaria a la primera región del ácido nucleico diana y en el que la porción 3’ del tercer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana.

La presente invención no está limitada por la longitud de las cuatro regiones del ácido nucleico diana. En una realización, la primera región del ácido nucleico diana puede tener una longitud de 11 a 50 nucleótidos. En otra realización, la segunda región del ácido nucleico diana tiene una longitud de uno a tres nucleótidos. En otra realización, la tercera región del ácido nucleico diana puede tener una longitud de de seis a nueve nucleótidos. En otra realización más, la cuarta región del ácido nucleico diana puede tener una longitud de 6 a 50 nucleótidos.

La invención no está limitada por la naturaleza o composición del primer, segundo, tercer y cuarto oligonucleótido; estos oligonucleótidos pueden comprender ADN, ARN, ANP y combinaciones de los mismos así como comprender nucleótidos modificados, bases universales, aductos, etc. Además, uno o más del primero, segundo, tercero y el cuarto oligonucleótido pueden contener un didesoxinucleótido en el extremo 3’.

En una realización preferida, el ácido nucleico diana no es completamente complementario con al menos uno del primer, el segundo, el tercer y el cuarto oligonucleótido. En una realización particularmente preferida, el ácido nucleico diana no es completamente complementario con el segundo oligonucleótido.

Como se ha señalado anteriormente, la presente invención contempla el uso de nucleasas con especificidad de estructura en procedimientos de detección. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana detectando productos de escisión no diana, que comprende: a) proporcionar: i) un medio de escisión, ii) una fuente de ácido nucleico diana, en el que el ácido nucleico diana tiene una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región, en el que la primera región se localiza adyacente y cadena abajo de la segunda región, la segunda región se localiza adyacente y cadena abajo de la tercera región y la tercera región se localiza adyacente y cadena abajo a la cuarta región; iii) un primer oligonucleótido complementario a la cuarta región del ácido nucleico diana; iv) un segundo oligonucleótido

que tiene una porción 5’ y una porción 3’ en el que la porción 5’ del segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana y en el que la porción 3’ del segundo oligonucleótido

contiene una secuencia complementaria a la tercera región del ácido nucleico diana; iv) un tercer oligonucleótido que

tiene una porción 5’ y una porción 3’ en el que la porción 5’ del tercer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la primera región del ácido nucleico diana y en el que la porción 3’ del tercer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana; b) mezclar el medio de escisión, el ácido nucleico diana, el primer oligonucleótido, el segundo oligonucleótido y el tercer oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción de tal forma que el primer oligonucleótido hibride con la cuarta región del ácido nucleico diana y en el que al menos la parte 3’ del segundo oligonucleótido hibride con el ácido nucleico diana y en el que al menos la parte 5’ del tercer oligonucleótido hibride con el ácido nucleico diana

para crear una estructura de escisión y en el que la escisión de la estructura de escisión tiene lugar para generar productos de escisión no diana, teniendo cada producto de escisión no diana un grupo hidroxilo 3’; y c) detectar los productos de escisión no diana.

La invención no está limitada por la naturaleza del ácido nucleico diana. En una realización, el ácido nucleico diana comprende un ADN monocatenario. En otra realización, el ácido nucleico diana comprende ADN de doble hélice y antes de la etapa c), la mezcla de reacción se trata de tal forma que el ADN de doble hélice se convierte sustancialmente en de hélice única. En otra realización, el ácido nucleico diana comprende un ARN y el primer y el segundo oligonucleótido comprenden ADN.

El medio de escisión de la invención es una endonucleasa FEN-1, como se define en las reivindicaciones. El medio de escisión de la invención puede ser también una endonucleasa FEN-1 que comprende la endonucleasa de las reivindicaciones.

En una realización alternativa preferida, la detección de los productos de escisión no diana comprende separación electroforética de los productos de la reacción seguido de visualización de los productos de escisión no diana separados.

En otra realización preferida, uno o más del primer, segundo y tercer oligonucleótido contienen un didesoxinucleótido en el extremo 3’. Cuando se emplean oligonucleótidos que contienen didesoxinucleótidos, la detección de los productos de escisión no diana comprende preferiblemente: a) incubar los productos de escisión no diana con una polimerasa independiente de molde y al menos un nucleósido trifosfato marcado en condiciones tales que al menos

un nucleótido marcado se añada al grupo hidroxilo 3’ de los productos de escisión no diana para generar productos

de escisión no diana marcados; y b) detectar la presencia de los productos de escisión no diana marcados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de molde empleada; en una realización, la polimerasa independiente de molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y polimerasa poli A. Cuando se emplean TdT o polimerasa poli A en la etapa de detección, el segundo

oligonucleótido puede contener un marcador de extremo 5’, siendo el marcador de extremo 5’ un marcador diferente

al marcador presente en el nucleósido trifosfato marcado. La invención no está limitada por la naturaleza del

marcador de extremo 5’; en la técnica se conoce una amplia diversidad de marcadores de extremo 5’ adecuados e

incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, amidita Cy3, amidita Cy5 y digoxigenina.

En otra realización relacionada, la detección de los productos de escisión no diana comprende: a) incubar los productos de escisión no diana con una polimerasa independiente de molde y al menos un nucleósido trifosfato en condiciones tales que al menos un nucleótido marcado se añada al grupo hidroxilo 3’ de los productos de escisión no diana para generar productos de escisión no diana con cola; y b) detectar la presencia de los productos de escisión no diana con cola. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de molde empleada; en una realización, la polimerasa independiente de molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y polimerasa poli A. Cuando se emplea TdT o polimerasa poli A en la

etapa de detección, el segundo oligonucleótido puede contener un marcador de extremo 5’. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador de extremo 5’; en la técnica se conoce una amplia diversidad de marcadores de extremo 5’ adecuados e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, amidita Cy3, amidita Cy5 y digoxigenina.

En una realización preferida, las condiciones de reacción comprenden proporcionar una fuente de cationes divalentes; son cationes divalentes particularmente preferidos los iones Mn2+ y Mg2+.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana detectando productos de escisión no diana, que comprende: a) proporcionar: i) un medio de escisión, ii) una fuente de ácido nucleico diana, teniendo el ácido nucleico diana una primera región, una segunda región y una tercera región, en el que la primera región se localiza adyacente a y cadena abajo de la segunda región y en el que la segunda región se localiza adyacente a y cadena abajo de la tercera región, iii) un primer oligonucleótido que

tiene una parte 5’ y una 3’, en el que la parte 5’ del primer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana y en el que la parte 3’ del primer oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la tercera región del ácido nucleico diana; iv) un segundo oligonucleótido que tiene una longitud entre once y quince nucleótidos y que tiene además una parte 5’ y una 3’, en el que la parte 5’ del segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la primera región del ácido nucleico diana y en el que la parte 3’ del segundo oligonucleótido contiene una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana; b) mezclar el medio de escisión, el ácido nucleico diana, el primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción de tal forma que al menos la parte 3’ del primer oligonucleótido hibride con el ácido nucleico diana y en el que al menos la parte 5’ del segundo

oligonucleótido hibride con el ácido nucleico diana para crear una estructura de escisión y en el que la escisión de la estructura de escisión tiene lugar para generar productos de escisión no diana, teniendo cada producto de escisión

no diana un grupo hidroxilo 3’; y c) detectar los productos de escisión no diana. En una realización preferida, medio

de escisión puede ser una nucleasa con especificidad de estructura, preferentemente una nucleasa con especificidad de estructura termoestable.

La invención no está limitada por la longitud de las diversas regiones del ácido nucleico diana. En una realización preferida, la segunda región del ácido nucleico diana tiene una longitud de uno a cinco nucleótidos. En otra realización preferida, uno o más del primer y el segundo oligonucleótido contienen un didesoxinucleótido en el extremo 3’. Cuando se emplean oligonucleótidos que contienen didesoxinucleótidos, la detección de los productos de escisión no diana comprende preferiblemente: a) incubar los productos de escisión no diana con una polimerasa independiente de molde y al menos un nucleósido trifosfato marcado en condiciones tales que al menos un

nucleótido marcado se añada al grupo hidroxilo 3’ de los productos de escisión no diana para generar productos de

escisión no diana marcados; y b) detectar la presencia de los productos de escisión no diana marcados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de molde empleada; en una realización, la polimerasa independiente de molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y polimerasa poli A. Cuando se emplean TdT o polimerasa poli A en la etapa de detección, el segundo

En otra realización, la detección de los productos de escisión no diana comprende: a) incubar los productos de escisión no diana con una polimerasa independiente de molde y al menos un nucleósido trifosfato en condiciones tales que al menos un nucleótido marcado se añada al grupo hidroxilo 3’ de los productos de escisión no diana para generar productos de escisión no diana con cola; y b) detectar la presencia de los productos de escisión no diana con cola. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente de molde empleada; en una realización, la polimerasa independiente de molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y polimerasa poli A. Cuando se emplea TdT o polimerasa poli A en la etapa de detección,

el segundo oligonucleótido puede contener un marcador de extremo 5’. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador de extremo 5’; en la técnica se conoce una amplia diversidad de marcadores de extremo 5’

adecuados e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, amidita Cy3, amidita Cy5 y digoxigenina.

Los procedimientos de detección novedosos de la invención se pueden emplear para la detección de ADN y ARN diana incluyendo, pero sin limitación, ADN y ARN diana que comprenden alelos de genes de tipo silvestre y mutantes, incluyendo genes de seres humanos u otros animales que están o pueden estar asociados a enfermedad

o cáncer. Además, los procedimientos de la invención se pueden usar para la detección de y/o identificación de cepas de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, protozoos, ciliados y virus (y, en particular, para la detección e identificación de virus ARN, tales como VHC).

La presente invención proporciona una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

La invención proporciona además una composición que comprende un ácido nucleico aislado que codifica la endonucleasa FEN-1 que comprende la SEC ID Nº 370, en la que el ácido nucleico aislado comprende la SEC ID Nº

369.

La invención proporciona además una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 quimérica, en la que dicha endonucleasa FEN-1 quimérica comprende la endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

La invención también proporciona vectores de ADN recombinantes que comprenden ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica endonucleasas FEN-1, como se define en las reivindicaciones. En una realización preferida, la célula huésped es una célula Escherichia coli.

Por tanto, la presente invención proporciona múltiples endonucleasas FEN-1 purificadas, tanto formas nativas purificadas de las endonucleasas como endonucleasas recombinantes. En realizaciones preferidas, las endonucleasas FEN-1 purificadas se obtienen de organismos arqueobacterianos. Las endonucleasas FEN-1 se obtienen de Archaeaglobus veneficus. En una realización preferida, las endonucleasas FEN-1 purificadas tienen pesos moleculares de aproximadamente 39 kd (el peso molecular se puede estimar de forma conveniente usando SDS-PAGE como se describe en el Ej. 28).

En una realización preferida, las endonucleasas quiméricas comprenden porciones de aminoácidos derivados de las endonucleasas FEN-1 seleccionadas del grupo de Pyrococcus furiosus, Methanococcus jannaschi, Pyrococcus woesei, Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococ-cus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix. En una realización más preferida, las endonucleasas FEN-1 quiméricas tienen pesos moleculares de aproximadamente 39 kd (el peso molecular se puede estimar de forma conveniente usando SDS-PAGE como se describe en el Ej. 28). En otra realización, las endonucleasas FEN quiméricas tienen secuencias de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID Nº 418, 426, 432, 436, 440, 444, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482 y

484.

La presente invención proporciona además oligonucleótidos aislados que codifican endonucleasas quiméricas. En una realización, los oligonucleótidos que codifican las endonucleasas quiméricas comprenden secuencias de ácidos nucleicos derivados de los genes seleccionados del grupo de homólogos de FEN-1, XPG y RAD. En una realización preferida, los oligonucleótidos que codifican las endonucleasas quiméricas comprenden secuencias de ácido nucleico derivados de los genes que codifican las endonucleasas FEN-1 seleccionadas del grupo de derivados de

Pyrococcus furiosus, Methanococcus jannaschi, Pyrococcus woesei, Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococ-cus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix. En otra realización, los oligonucleótidos que codifican las endonucleasas quiméricas comprenden una secuencia de de ácido nucleico seleccionada del grupo de SEC ID Nº 417, 425, 431, 435, 439, 443, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479,481, y 483. En una realización particularmente preferida, los genes de las endonucleasas quiméricas están unidos operablemente a promotores heterólogos. La presente invención no está limitada por la naturaleza del promotor heterólogo empleado. Se considera que el promotor seleccionado dependerá de la célula huésped seleccionada para la expresión como se conoce en la técnica. En realizaciones preferidas, el promotor heterólogo es un promotor inducible. La invención no está limitada por la naturaleza del promotor inducible empleado. Los promotores inducibles preferidos incluyen el promotor de -PL, el promotor tac, el promotor trp y el promotor trc.

En otra realización preferida, la invención proporciona vectores de ADN recombinantes que comprenden oligonucleótidos aislados que codifican las endonucleasas quiméricas descritas anteriormente y como se define en las reivindicaciones.

En una realización, los vectores de ADN recombinantes comprenden oligonucleótidos aislados que codifican secuencias de ácido nucleico obtenidas de los genes seleccionados del grupo de homólogos de FEN-1, XPG y RAD.

En una realización preferida, los vectores de ADN recombinantes oligonucleótidos aislados que codifican las endonucleasas quiméricas que comprenden secuencias de ácido nucleico derivadas de los genes que codifican las endonucleasas FEN-1 seleccionadas del grupo de derivados de Pyrococcus furiosus, Methanococcus jannaschi, Pyrococcus woesei, Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococ-cus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix. En otra realización, los vectores de ADN recombinantes comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEC ID Nº 417, 425, 431, 435, 439, 443, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 481 y 483. Estos vectores pueden comprender además un promotor heterólogo ligado operablemente a los polinucleótidos que codifican la nucleasa quimérica.

También se proporcionan las células huésped transformadas con estos vectores recombinantes. La invención no está limitada por la naturaleza de la célula huésped empleada. la técnica se conocen bien vectores de expresión adecuados para la expresión de polinucleótidos que codifican FEN-1 que se pueden expresar en una diversidad de células huésped procariotas y eucariotas. En una realización preferida, la célula huésped es una célula Escherichia coli.

La invención proporciona una mezcla que comprende: i) una primera nucleasa con especificidad de estructura que comprende una endonucleasa FEN-1 de Archaeaglobus veneficus; y ii) una segunda nucleasa con especificidad de estructura, en la que dicha nucleasa con especificidad de estructura comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.

En realizaciones preferidas, segunda nucleasa con especificidad de estructura de la mezcla se selecciona del grupo que comprende endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei, endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus; endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii, endonucleasa FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum, FEN-1 de Archaeoglobus fulgidus, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix y endonucleasas FEN-1 quiméricas. En realizaciones alternativas, la endonucleasa FEN-1 purificada de la mezcla se selecciona del grupo constituido por endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei, endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus; endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii, endonucleasa FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum, FEN-1 de Archaeoglobus fulgidus, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix y endonucleasas FEN-1 quiméricas. En otras realizaciones preferidas más de la mezcla, la

segunda nucleasa es una nucleasa 5’ obtenida de una ADN polimerasa termoestable alterada en la secuencia de

aminoácidos de tal forma que muestra actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la ADN polimerasa de tipo silvestre pero conserva sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ de la ADN polimerasa de tipo silvestre. En algunas realizaciones preferidas de la mezcla, la segunda nucleasa se selecciona del grupo constituido por la enzima Cleavase® BN, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, ADN polimerasa de Thermus thermophilus, Exo III de Escherichia coli, complejo Rad1/Rad10 de Saccharomyces cerevisiae.

a) proporcionar:

b) exponer dicha estructura de escisión a dicha endonucleasa FEN-1; y

c) detectar la escisión de dicha estructura de escisión.

La invención se refiere además a un procedimiento para tratar ácido nucleico, que comprende: a) proporcionar una endonucleasa FEN-1 purificada; y un sustrato de ácido nucleico; b) tratar el sustrato de ácido nucleico en condiciones tales que el sustrato forme una o más estructuras de escisión; y c) hacer reaccionar la endonucleasa con las estructuras de escisión de tal forma que se produzcan uno o más productos de escisión. En algunas realizaciones, la endonucleasa FEN-1 purificada se selecciona del grupo constituido por endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei, endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus, endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii, endonucleasa FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum, FEN-1 de Archaeoglobus fulgidus, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Ar-chaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mo-bilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix y endonucleasas FEN-1 quiméricas. En otras realizaciones, el procedimiento comprende además proporcionar una nucleasa con especificidad de estructura obtenida de una ADN polimerasa termoestable alterada en la secuencia de aminoácidos de tal forma que muestra actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la ADN polimerasa de tipo silvestre pero conserva sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ de la ADN polimerasa de tipo silvestre.

En realizaciones relacionadas de los procedimientos, una parte de la secuencia de aminoácidos de la segunda nucleasa es homóloga a una parte de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable obtenida de un termófilo eubacteriano del género Thermus. En otras realizaciones relacionadas más, el termófilo se selecciona del grupo constituido por Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus. En otras realizaciones relacionadas, la nucleasa con especificidad de se selecciona del grupo constituido por la enzima Cleavase® BN, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, ADN polimerasa de Thermus thermophilus, Exo III de Escherichia coli, complejo Rad1/Rad10 de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones relacionadas, la nucleasa con especificidad de estructura es la nucleasa Cleavase® BN. En otras realizaciones más, el ácido nucleico de la etapa (a) es sustancialmente monocatenario. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ARN y ADN. En realizaciones adicionales más, el ácido nucleico de la etapa

(a) es bicatenario.

En otras realizaciones relacionadas de los procedimientos, el tratamiento de la etapa (b) comprende:

convertir el ácido nucleico de doble hélice sustancialmente en de hélice única; y exponer el ácido nucleico de hélice única a condiciones tales que el ácido nucleico de hélice única tenga una estructura secundaria. En algunas realizaciones preferidas, el ácido nucleico bicatenario se convierte en sustancialmente monocatenario mediante el uso de temperatura aumentada. En realizaciones preferidas alternativas, el procedimiento comprende además la etapa de detectar el uno o más productos de escisión.

La presente invención se refiere también a procedimientos para tratar ácido nucleico, que comprenden: a) proporcionar: una primera nucleasa con especificidad de estructura constituida por una endonucleasa FEN-1 purificada en una solución que contiene manganeso y un sustrato de ácido nucleico; b) tratar el sustrato de ácido nucleico con temperatura aumentada de tal forma que el sustrato sea sustancialmente monocatenario; c) reducir la temperatura en condiciones tales que el sustrato monocatenario forme una o más estructuras de escisión; d) hacer reaccionar el medio de escisión con las estructuras de escisión de tal forma que se produzcan uno o más productos de escisión; y e) detectar el uno o más productos de escisión. En algunas realizaciones de los procedimientos, la endonucleasa FEN-1 purificada se selecciona del grupo constituido por endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei, endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus, endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii, endonucleasa FEN-1 de Methanobacterium thermoautotrophicum, FEN-1 de Archaeoglobus fulgidus, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Ar-chaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mo-bilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix y endonucleasas FEN-1 quiméricas. En realizaciones alternativas, los procedimientos comprenden además proporcionar una segunda nucleasa con especificidad de estructura. En algunas realizaciones preferidas, la segunda nucleasa se selecciona del grupo constituido por la enzima Cleavase® BN, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, ADN polimerasa de Thermus thermophilus, Exo III de Escherichia coli, complejo Rad1/Rad10 de Saccharomyces cerevisiae. En otras realizaciones preferidas más, la segunda nucleasa es una nucleasa 5’ obtenida de una ADN polimerasa termoestable alterada en la secuencia de aminoácidos de tal forma que muestra actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la ADN polimerasa de tipo silvestre pero conserva

sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ de la ADN polimerasa de tipo silvestre. En otras realizaciones más,

el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ARN y ADN. En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de la etapa (a) es bicatenario.

La invención proporciona también un kit de tratamiento de ácido nucleico, que comprende:

La presente invención también proporciona los kit de tratamiento de ácido nucleico, como se definen en las reivindicaciones, que además comprenden una solución que contiene manganeso. En otras realizaciones, los kit comprenden además al menos una segunda nucleasa con especificidad de estructura. En algunas realizaciones

preferidas, la segunda nucleasa es una nucleasa 5’ obtenida de una ADN polimerasa termoestable alterada en la

secuencia de aminoácidos de tal forma que muestra actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la

ADN polimerasa de tipo silvestre pero conserva sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ de la ADN

polimerasa de tipo silvestre. En otras realizaciones más de los kit, la parte de la secuencia de aminoácidos de la segunda nucleasa es homóloga a una parte de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable obtenida de un termófilo eubacteriano del género Thermus. En realizaciones adicionales, el termófilo se selecciona del grupo constituido por Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus. En otras realizaciones más, los kit comprenden además reactivos para detectar los productos de escisión.

La presente invención proporciona además cualquiera de las composiciones, mezclas, procedimientos y kits descritos en el presente documento usados junto con endonucleasas que comprenden endonucleasas de Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococ-cus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix. Estas incluyen composiciones que comprenden endonucleasas FEN-1 purificadas de los organismos (incluidas las endonucleasas específicas descritas por las secuencias proporcionadas en el presente documento, así como variantes y homólogos), kits que comprenden estas composiciones, composición que comprende endonucleasas quiméricas que comprenden al menos una parte de las endonucleasas de estos organismos, kits que comprenden dichas composiciones, composiciones que comprenden ácidos nucleicos que codifican las endonucleasas de estos organismos (incluidos vectores y células huésped), kits que comprenden dichas composiciones, anticuerpos generados frente a las endonucleasas, mezclas que comprenden endonucleasas de estos organismos, procedimientos de uso de la endonucleasa en ensayos de escisión (p. ej., ensayos de escisión invasiva, CFLP etc.) y kits que contienen componentes útiles para dichos procedimientos. En los Ejemplos 62-67 se proporcionan ejemplos que describen la generación, estructura, uso y caracterización de estas endonucleasas.

La presente invención está relacionada con nucleasas específicas de estructura de varias fuentes, incluidas, entre otras, organismos mesófilas, psicrófilos, termófilos e hipertermófilos. Las nucleasas específicas de estructura preferidas son termoestables. Las nucleasas específicas de estructura termoestables se consideran particularmente útiles en cuanto a que permiten realizar el ensayo CON INVASOR (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5,846,717, 5,985,557, 5,994,069, and 6,001,567 y las publicaciones PCT WO 97/27214 y WO 98/42873) cerca de la temperatura de fusión (Tf) de la sonda oligonucleotídica cadena abajo, de forma que las sondas escindidas y sin escindir puede ciclar y no ciclar la diana durante el curso de la reacción. En una realización, las enzimas específicas de estructura termoestables son nucleadas 5’ termoestables que se seleccionan del grupo que comprende polimerasas alteradas derivadas de las polimerasas nativas de especies de Thermus, incluidos, entre otros, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus thermophilus, Thermus filiformus, y Thermus scotoductus. No

obstante, la invención no está limitada al uso de nucleadas 5’ termoestables. Por ejemplo, ciertas realizaciones de la

presente invención usan sondas oligonucleotídicas cortas que pueden ciclar y no ciclar la diana a temperaturas bajas, lo que permite el uso de enzimas no termoestables.

En algunas realizaciones preferidas, la presente invención proporciona una composición que comprende una enzima, en la que la enzima comprende un dominio funcional heterólogo, en el que el dominio funcional heterólogo proporciona una funcionalidad alterada (p. ej., mejorada) en un ensayo de escisión de ácido nucleico. La presente invención no está limitada por la naturaleza del ensayo de escisión de ácido nucleico. Por ejemplo, los ensayos de escisión de ácido nucleico incluyen un ensayo en el que se escinde un ácido nucleico, directa o indirectamente, en presencia de la enzima. En ciertas realizaciones preferidas, el ensayo de escisión de ácido nucleico es un ensayo de escisión invasivo. En realizaciones particularmente preferidas, el ensayo de escisión usa una estructura de escisión que tiene al menos un componente de ARN. En otra realización particularmente preferida, el ensayo de escisión usa una estructura de escisión que tiene al menos un componente de ARN, en el que se escinde un miembro de ADN de la estructura de escisión.

La presente invención no está limitada por la naturaleza de la funcionalidad alterada proporcionada por el dominio funcional heterólogo. Ejemplos ilustrativos de alteraciones incluyen, entre otros, enzimas en las que el dominio funcional heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos (p. ej., uno o más aminoácidos) que proporciona una actividad nucleasa mejorada, una actividad de unión al sustrato mejorada y/o especificada de fondo mejorara en un ensayo de escisión de ácido nucleico.

La presente invención no está limitada por la naturaleza del dominio funcional heterólogo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dominio funcional heterólogo comprende dos o más aminoácidos de un dominio polimerasa de una polimerasa (p. ej., introducido en la enzima mediante inserción de un dominio funcional quimérico o creado por mutación). En cierta realización preferida, al menos uno de los dos o más aminoácidos es de una región de la palma

o pulgar del dominio de polimerasa. La presente invención no está limitada por la identidad de la polimerasa de la que se seleccionan los dos o más aminoácidos. En ciertas realizaciones preferidas, la polimerasa comprende polimerasa de Thermus thermophilus. En realizaciones particularmente preferidas, los dos o más aminoácidos proceden de los aminoácidos 300-650 de la SEC ID Nº 267.

Las nuevas enzimas de la invención se pueden emplear para la detección de ADN y ARN diana incluyendo, pero sin limitación, ADN y ARN diana que comprenden alelos de genes de tipo silvestre y mutantes, incluyendo, entre otros, genes de seres humanos, otros animales o plantas que están o pueden estar asociados a enfermedad u otras alteraciones. Además, las enzimas de la invención se pueden usar para la detección de y/o identificación de cepas de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, protozoos, ciliados y virus (y, en particular, para la detección e identificación de virus que tienen genomas de ARN, tales como los virus de la hepatitis C y de la inmunodeficiencia humana). Por ejemplo, la presente invención proporciona procedimientos para escindir ácidos nucleicos que comprenden proporcionar: una enzima de la presente invención y un ácido nucleico sustrato; y exponer el ácido nucleico sustrato a la enzima (p. ej., para producir un producto de escisión que se pueda detectar).

DEFINICIONES

Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se definen una serie de términos y frases:

Como se usa en el presente documento, los términos “complementario” o “complementariedad” se usan en

referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos tal como un oligonucleótido o un ácido nucleico diana) de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia 5'-A-G-T-3'" es complementaria a la secuencia "3'-T-C-A-5'." La complementariedad puede ser “parcial”, en la que sólo algunas de las bases nucleotídicas están apareadas de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. O puede

haber complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre

las hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre hebras de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos. Cualquier término se puede usar en referencia a nucleótidos individuales, especialmente dentro del contexto de polinucleótidos. Por ejemplo, un nucleótido concreto dentro de un oligonucleótido puede observarse por su complementariedad, o ausencia de la misma, con un nucleótido dentro de otra hebra de ácido nucleico, en contraste o comparación con la complementariedad entre el resto del oligonucleótido y la hebra de ácido nucleico.

El término “homología” y “homólogo” se refiere a un grado de identidad. Puede haber homología parcial u homología completa. Una secuencia parcialmente idéntica es una que tiene menos del 100% de identidad con otra secuencia.

Como se usa en el presente documento, el término “hibridación” se usa con referencia al emparejamiento de ácidos

nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) están influidas por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos), la rigurosidad de las condiciones implicadas y la Tf del híbrido formado. Los procedimientos de “hibridación” implican la hibridación de un ácido nucleico con otro, ácido nucleico complementario, es decir un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica complementaria. La capacidad de dos polímeros de ácido nucleico que contiene secuencias complementarias para encontrarse e hibridar mediante interacción de apareamiento de bases es un fenómeno bien

reconocido. Tras las observaciones iniciales del procedimiento de “hibridación” de Marmur y Lane, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 46:453 (1960) and Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:461 (1960) se ha producido el perfeccionamiento de este proceso en una herramienta esencial de la biología moderna.

Con respecto a la complementariedad, para algunas aplicaciones diagnósticas es importante determinar si la hibridación representa una complementariedad completa o parcial. Por ejemplo, cuando se desea detectar simplemente la presencia o ausencia de ADN patógeno (tal como de un virus, bacteria, hongo, micoplasma, protozoo), solo es importante que el procedimiento de hibridación garantice la hibridación con la secuencia relevante presente; se pueden seleccionar condiciones de modo que hibriden sondas parcialmente complementarias y completamente complementarias. No obstante, otras aplicaciones diagnósticas pueden requerir que el procedimiento de hibridación distinga entre complementariedad parcial y completa. Puede ser de interés detectar polimorfismos genéticos. Por ejemplo, la hemoglobina humana está compuesta, en parte, por cuatro cadenas polipeptídicas. Dos de estas cadenas son cadenas idénticas de 141 aminoácidos (cadenas alfa) y dos de estas cadenas son cadenas idénticas de 146 aminoácidos (cadenas beta). Se sabe que el gen que codifica la cadena beta que exhibe polimorfismo. El alelo normal codifica una cadena beta que tiene ácido glutámico en la sexta posición. El alelo mutante codifica una cadena beta que tiene valina en la sexta posición. Esta diferencia en los aminoácidos tiene un profundo impacto fisiológico (más profundo cuando el individuo es homocigoto para el alelo mutante) conocido clínicamente como anemia drepanocítica. Es bien conocido que la base genética del cambio de aminoácido implica una diferencia en una sola base entre la secuencia de ADN del alelo normal y la secuencia de ADN del alelo mutante.

El complemento de una secuencia de ácido nucleico como se usa en el presente documento se refiere a un

oligonucleótido que, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico de modo que el extremo 5’ de una secuencia esté emparejado con el extremo 3’ de la otra, está en “asociación antiparalela". Ciertas bases que no se encuentran habitualmente en los ácidos nucleicos naturales se pueden incluir en los ácidos nucleicos de la presente invención e incluyen, por ejemplo, inopina y 7-deazaguanina. La complementariedad no tiene que ser perfecta, dúplex estables pueden contener pares de bases apareadas incorrectamente o bases sin aparear. Los expertos en la técnica de la tecnología de los ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad del dúplex empíricamente considerando una serie de variables incluidas, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición en bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases apareadas incorrectamente.

Como se usa en el presente documento, el término “Tf” se usa con referencia a la “temperatura de fusión”. La

temperatura de fusión es la temperatura a la que la población de moléculas de ácido nucleico bicatenario se disocia a la mitad en hélices únicas. En la técnica se conocen bien varias ecuaciones para calcular la Tf de ácidos nucleicos. Como se indica por referencias convencionales, una estimación simple del valor Tf se puede calcular con la ecuación: Tf = 81,5 + 0,41 (% G + C), cuando un ácido nucleico está en solución acuosa a NaCl 1 M (véase, por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985). Otras referencias

(p. ej., Allawi, H.T. & SantaLucia, J., Jr. Thermodynamics and NMR of internal G.T mismatches in DNA. Biochemistry 36, 10581-94 (1997) incluyen cálculos más sofisticados que tienen en cuenta características estructurales y ambientales, así como características de secuencia para el cálculo de Tf.

Como se usa en el presente documento, el término “rigurosidad” se usa con referencia a las condiciones de

temperatura, fuerza iónica y presencia de otros compuestos, en las que se realizan las hibridaciones de ácidos nucleicos. En condiciones de “alta rigurosidad”, el emparejamiento de bases de ácidos nucleicos tendrá lugar solamente entre fragmentos de ácido nucleico que tienen una alta frecuencia de secuencias de bases

complementarias. Por tanto, a menudo se requieren condiciones de rigurosidad “débil” o “baja” cuando se desea que

los ácidos nucleicos que no sean completamente complementarios entre sí se hibriden o asocien entre sí.

"Condiciones de rigurosidad alta”, cuando se usan en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos, comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH 2PO4 H2O y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,5% de SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100

g/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón seguido de lavado en una solución que comprende 0,1X SSPE, 1,0% SDS a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

“Condiciones de rigurosidad media”, cuando se usan en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos, comprenden

condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH 2PO4 H2O y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,5% SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100

g/ml de AND de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una solución que comprende 1,0X SSPE, 1,0% SDS a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

“Condiciones de rigurosidad baja” comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una

solución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH2PO4 H2O y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,1% SDS, 5X reactivo de Denhardt [50X reactivo de Denhardt contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll (Tipo400, Pharmacia), 5 g de BSA (Fracción V; Sigma) y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una solución que comprende 5X SSPE, 0,1% SDS a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

El término “gen” se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la producción de un ARN que tiene una función que no es de codificación (p. ej., un ARN ribosómico o de transferencia), un polipéptido o un precursor. El ARN o polipéptido se puede codificar por una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia de codificación siempre se conserve la actividad enzimática deseada.

La expresión “de tipo silvestre” se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente de origen natural. Un gen de tipo silvestre es el que se observa más

frecuentemente en una población y, por lo tanto, se denomina arbitrariamente la forma “normal” o “de tipo silvestre” del gen. Por el contrario, el término “modificado”, “mutante” o “polimórfico” se refiere a un gen o producto génico que muestra modificaciones en secuencia y/o propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o producto génico de tipo silvestre. Cabe destacar que se pueden aislar mutantes de origen natural; los mismos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas cuando se compararon con el gen o producto génico de tipo silvestre.

La expresión “vector de ADN recombinante” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de ADN

que contienen una secuencia heteróloga deseada. Por ejemplo, aunque el término no está limitado al uso de secuencias expresadas o secuencias que codifican un producto de expresión, en algunas realizaciones la secuencia heteróloga es una secuencia de codificación y secuencias de ADN adecuadas necesarias para la replicación de la secuencia de codificación en un organismo huésped o la expresión de la secuencia de codificación operablemente unida en un organismo huésped concreto. Las secuencias de ADN necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, un sitio de unión a ribosoma y posiblemente otras secuencias. Se conoce que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El término “LTR” como se usa en este documento se refiere a la repetición terminal larga observada en cada

extremo de un provirus (es decir, la forma integrada de un retrovirus). La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control de la transcripción, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación e integración del genoma vírico. La LTR vírica se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5.

La región U3 contiene los elementos de potenciador y promotor. La región U5 contiene las señales de poliadenilación. La región R (repetición) separa las regiones U3 y U5 y secuencias transcritas de la región R se presentan tanto en los extremos 5’ como 3’ del ARN vírico.

El término “oligonucleótido” como se usa en este documento se define como una molécula que comprende dos o

más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente al menos 5 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-15 nucleótidos y más preferiblemente al menos aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos. El tamaño exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función última y uso del oligonucleótido. El oligonucleótido se puede generar de cualquier modo. incluyendo síntesis química, replicación de ADN, transcripción inversa o una combinación de los mismos.

Ya que los mononucleótidos se hacen reaccionar para preparar oligonucleótidos de un modo tal que el fosfato 5’ de un anillo de pentosa de mononucleótido se une al oxígeno 3’ de su vecino en una dirección mediante un enlace fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido se denomina el “extremo 5’” si su fosfato 5’ no se enlaza al oxígeno 3’ de un anillo pentosa de mononucleótido y el “extremo 3’” si su oxígeno 3’ no se enlaza a un fosfato 5’ de un anillo de pentosa de mononucleótido posterior. Como se usa en el presente documento, se puede decir que una secuencia de ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleótido mayor, también tiene extremos 5’ y 3’. Una primera región a lo largo de una cadena de ácido nucleico se dice que está cadena arriba de otra región si el extremo 3’ de la primera región está delante del extremo 5’ de la segunda región cuando se mueve a lo largo de una cadena de ácido nucleico en una dirección de 5’ a 3’.

Cuando dos oligonucleótidos diferentes, no solapantes hibridan con regiones diferentes de la misma secuencia de

ácido nucleico complementaria lineal y el extremo 3’ de un oligonucleótido se dirige hacia el extremo 5’ del otro, el primero se puede denominar el oligonucleótido “cadena arriba” y el último, el oligonucleótido “cadena abajo”. De

forma similar, cuando dos oligonucleótidos solapantes hibridan con la misma secuencia de ácido nucleico complementario lineal, con el primer oligonucleótido colocado de un modo tal que su extremo 5' esté cadena arriba del extremo 5' del segundo oligonucleótido y el extremo 3' del primer oligonucleótido esté cadena arriba del extremo 3' del segundo oligonucleótido, el primer oligonucleótido se puede denominar el oligonucleótido "cadena arriba" y el

segundo oligonucleótido se puede denominar el oligonucleótido "cadena abajo”.

El término “cebador” se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se pone en condiciones en las que se inicia la extensión por cebador. Un “cebador” oligonucleotídico puede

aparecer de forma natural, como en un producto de digestión por restricción purificado o se puede producir sintéticamente.

Un cebador se selecciona de modo que sea “sustancialmente” complementario a una hebra de una secuencia

específica del molde. Un cebador tiene que ser suficientemente complementario para hibridar con una cadena molde para que se produzca la elongación del cebador. Una secuencia del cebador no tiene que reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede estar unido al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador sustancialmente complementaria a la hebra. Las bases no complementarias o secuencias más largas pueden estar entrelazadas en el cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia del molde para hibridar con ella y, de este modo, formar el complejo molde-cebador para la síntesis del producto de extensión del cebador.

El término “marcador” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier átomo o molécula que se puede

usar para proporcionar una señal detectable (preferiblemente cuantificable) y que se puede unir a un ácido nucleico

o a una proteína. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción de rayos X o absorción, magnetismo, actividad enzimática y similares. Un marcador puede ser un resto cargado (carga positiva o negativa) o, alternativamente, puede tener carga neutra. Los marcadores pueden incluir o consistir en una secuencia de ácido nucleico o proteína, siempre que la secuencia que comprende el marcador sea detectable.

La expresión “estructura de escisión” como se usa en el presente documento se refiere a una estructura que está

formada por la interacción de un oligonucleótido sonda y un ácido nucleico diana para formar un dúplex, siendo la estructura resultante escindible por un medio de escisión, incluyendo, pero sin limitación, una enzima. La estructura de escisión es un sustrato para escisión específica por los medios de escisión en comparación con una molécula de ácido nucleico que es un sustrato para escisión no específica por agentes tales como fosfodiesterasas que escinden moléculas de ácido nucleico sin tener en cuenta la estructura secundaria (es decir, no se requiere formación de una estructura en dúplex).

La expresión “estructura de escisión plegada” como se usa en el presente documento se refiere a una región de un sustrato de ácido nucleico de hélice única que contiene una estructura secundaria, siendo la región escindible por un medio de escisión enzimática. La estructura de escisión es un sustrato para escisión específica por los medios de escisión en comparación con una molécula de ácido nucleico que es un sustrato para escisión no específica por agentes tales como fosfodiesterasas que escinden moléculas de ácido nucleico sin tener en cuenta la estructura secundaria (es decir, no se requiere plegamiento del sustrato).

Como se usa en el presente documento, la expresión “diana plegada” se refiere a una cadena de ácido nucleico que

contiene al menos una región de estructura secundaria (es decir, al menos una región de doble hélice y al menos una región de hélice única dentro de una única cadena del ácido nucleico). Una diana plegada puede comprender regiones de estructura terciaria además de regiones de estructura secundaria.

La expresión “medios de escisión” o “agente de escisión”, como se usa en el presente documento, se refiere a

cualquier medio que sea capaz de escindir una estructura de escisión, incluyendo, entre otros, enzimas. Los medios de escisión pueden incluir DNAP nativas que tienen actividad nucleasa 5’ (por ejemplo, ADN polimerasa de Taq, ADN polimerasa I de E. coli) y, más específicamente, DNAP modificadas que tienen nucleasa 5’ pero que carecen de actividad sintética. Las “nucleasas con especificidad de estructura” o “enzimas con especificidad de estructura”

son enzimas que reconocen estructuras secundarias específicas en una molécula de ácido nucleico y escinden estas estructuras. El medio de escisión de la invención escinde una molécula de ácido nucleico en respuesta a la formación de estructuras de escisión; no es necesario que el medio de escisión escinda la estructura de escisión en ninguna ubicación particular dentro de la estructura de escisión.

El medio de escisión no está limitado a enzimas que tienen solamente actividad nucleasa 5’. Los medios de escisión pueden incluir actividad nucleasa proporcionada por una diversidad de fuentes incluyendo las enzimas Cleavase®, las endonucleasas FEN-1 (incluyendo las proteínas RAD2 y XPG), ADN polimerasa Taq y ADN polimerasa I de E. coli.

El término “termoestable” cuando se usa en referencia a una enzima, tal como una nucleasa 5’, indica que la enzima

es funcional o activa (es decir, puede realizar catálisis) a una temperatura elevada, es decir, a aproximadamente 55ºC o más.

La expresión “productos de escisión” como se usa en el presente documento se refiere a productos generados por la

reacción de un medio de escisión con una estructura de escisión (es decir, el tratamiento de una estructura de escisión con un medio de escisión).

La expresión “ácido nucleico diana” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia que

tiene al menos complementariedad parcial con al menos un oligonucleótido sonda y también puede tener al menos complementariedad parcial con un oligonucleótido INVASOR. El ácido nucleico diana puede comprender ADN o ARN monocatenario o bicatenario.

La expresión “oligonucleótido sonda” se refiere a un oligonucleótido que interacciona con un ácido nucleico diana

para formar una estructura de escisión en presencia o ausencia de un oligonucleótido INVASOR. Cuando se hibrida con el ácido nucleico diana, el oligonucleótido sonda y la diana forman una estructura de escisión y la escisión tiene lugar dentro del oligonucleótido sonda.

La expresión “producto de escisión no diana” se refiere a un producto de una reacción de escisión que no se obtiene

del ácido nucleico diana. Como se ha discutido anteriormente, en los procedimientos de la presente invención, la escisión de la estructura de escisión tiene lugar dentro del oligonucleótido sonda. Los fragmentos del oligonucleótido

sonda generados por esta escisión dependiente de ácido nucleico diana son “productos de escisión no diana”.

La expresión “oligonucleótido invasor” se refiere a un oligonucleótido que hibrida con un ácido nucleico diana en un lugar cerca de la región de hibridación entre una sonda y el ácido nucleico diana, en el que el oligonucleótido INVASOR comprende una porción (p. ej., un resto químico o nucleótido, complementario o no de la diana) que solapa con la región de hibridación entre la sonda y la diana. En algunas realizaciones, el oligonucleótido INVASOR contiene secuencias en su extremo 3’ que son sustancialmente iguales que las secuencias localizadas en el extremo 5’ de un oligonucleótido sonda.

La expresión “sustancialmente monocatenario” cuando se usa con referencia a un sustrato de ácido nucleico

significa que la molécula de sustrato existe principalmente como una hélice única de ácido nucleico en comparación con un sustrato bicatenario que existe como dos cadenas de ácido nucleico cuando se mantienen juntas por interacciones de emparejamiento de bases intercatenarias.

La expresión “variación de secuencia” como se usa en este documento se refiere a diferencias en la secuencia de ácido nucleico entre dos ácidos nucleicos. Por ejemplo, un gen estructural de tipo silvestre y una forma mutante de este gen estructural de tipo silvestre pueden variar en la secuencia por la presencia de sustituciones de una única base y/o deleciones o inserciones de uno o más nucleótidos. dice que estas dos formas del gen estructural varían en secuencia entre sí. Puede existir una segunda forma mutante del gen estructural. Se dice que esta segunda forma mutante varía en secuencia tanto del gen de tipo silvestre como de la primera forma mutante del gen.

El término “liberar” como se usa en este documento se refiere a la puesta en libertad de un fragmento de ácido nucleico de un fragmento de ácido nucleico mayor, tal como un oligonucleótido, por la acción de una nucleasa 5’ de tal forma que el fragmento puesto en libertad ya no está unido covalentemente al resto del oligonucleótido.

El término “Km” como se usa en este documento se refiere a la constante de Michaelis-Menten para una enzima se

define como la concentración del sustrato específico a la que una enzima dada produce la mitad de su velocidad máxima en una reacción catalizada por enzima.

La expresión “análogo de nucleótido” como se usa en este documento se refiere a nucleótidos modificados o no naturales tales como 7-desaza purinas (es decir, 7-desaza-dATP y 7-desaza-dGTP). Los análogos de nucleótidos incluyen análogos de base y comprenden formas modificadas de desoxirribonucleótidos así como ribonucleótidos.

La expresión “locus polimórfico” es un locus presente en una población que muestra variación entre miembros de la población (es decir, el alelo más común tiene una frecuencia inferior a 0,95). Por el contrario, un “locus monomórfico”

es un locus genético con pocas o sin variaciones observadas entre miembros de la población (generalmente se asume que es un locus en el que el alelo más común supera una frecuencia de 0,95 en el grupo de genes de la población).

El término “microorganismo” como se usa en este documento se refiere a un organismo demasiado pequeño para ser observado a simple vista e incluye, pero sin limitación, bacterias, virus, protozoos, hongos y ciliados.

La expresión “secuencias génicas microbianas” se refiere a secuencias génicas obtenidas de un microorganismo.

El término “bacteria” se refiere a cualquier especie bacteriana incluyendo especies eubacterianas y de

arqueobacterias.

El término “virus” se refiere a parásitos intracelulares obligados, ultramicroscópicos, incapaces de replicación

autónoma (es decir, la replicación requiere el uso de la maquinaria de la célula huésped).

La expresión “multirresistente a fármacos” o “con resistencia múltiple a fármacos” se refiere a un microorganismo

que es resistente a más de uno de los antibióticos o agentes antimicrobianos usados en el tratamiento de dicho microorganismo.

El término “muestra” en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones se usa en su sentido más amplio. Por

un lado, se quiere decir que incluye un espécimen o cultivo (por ejemplo, cultivos microbiológicos). Por otro lado, se quiere decir que incluye muestras tanto biológicas como ambientales. Una muestra puede incluir un espécimen de origen sintético.

Las muestras biológicas pueden ser animales, incluyendo humanas, fluido, sólido (por ejemplo, heces) o tejido, así como alimentos líquidos y sólidos y productos alimenticios e ingredientes tales como artículos lácteos, vegetales, carne y subproductos de carne y desechos. Se pueden obtener muestras biológicas de todas las diversas familias de animales domésticos, así como de animales salvajes o silvestres, incluyendo, entre otros, animales tales como ungulados, oso, peces, lagomorfos, roedores, etc.

Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como material de superficie, tierra, agua y muestras industriales así como muestras obtenidas de instrumentos de procesamiento de alimentos y lácteos, aparatos, equipamiento, utensilios, artículos desechables y no desechables. Estos ejemplos no se tienen que considerar como limitantes de los tipos de muestra aplicables a la presente invención.

La expresión “fuente de ácido nucleico diana” se refiere a cualquier muestra que contenga ácidos nucleicos (ARN o

ADN). Son fuentes particularmente preferidas de ácidos nucleicos diana las muestras biológicas incluidos, entre otros, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo y semen.

Se dice que un oligonucleótido está presente en “exceso” con respecto a otro oligonucleótido (o secuencia de ácido

nucleico diana) si ese oligonucleótido está presente en una mayor concentración molar que el otro oligonucleótido (o secuencia de ácido nucleico diana). Cuando un oligonucleótido tal como un oligonucleótido sonda está presente en una reacción de escisión en un exceso con respecto a la concentración de la secuencia de ácido nucleico diana complementaria, la reacción se puede usar para indicar la cantidad del ácido nucleico diana presente. Típicamente, cuando está presente en exceso, el oligonucleótido sonda estará presente en un exceso molar de al menos 100 veces; típicamente se usaría al menos 1 pmol de cada oligonucleótido sonda cuando la secuencia de ácido nucleico diana estaba presente con aproximadamente 10 fmol o menos.

Una muestra de la que “se sospecha que contiene” un primer y un segundo ácido nucleico diana puede contener

cualquiera, ambas o ninguna molécula de ácido nucleico diana.

La expresión oligonucleótido “equilibrado en carga” se refiere a un oligonucleótido (el oligonucleótido de entrada en

una reacción) que se ha modificado de tal forma que el oligonucleótido modificado lleva una carga, de tal forma que cuando el oligonucleótido modificado se escinde (es decir, se acorta) o prolonga, un producto resultante lleva una carga diferente que el oligonucleótido de entrada (el oligonucleótido “no equilibrado en carga”), permitiendo de este modo la separación de los oligonucleótidos de entrada y los que han reaccionado basándose en la carga. La expresión “equilibrado en carga” no implica que el oligonucleótido modificado o equilibrado tenga una carga neta neutra (aunque puede ser el caso). El equilibrado de carga se refiere al diseño y la modificación de un oligonucleótido de tal forma que un producto de reacción específico generado por este oligonucleótido de entrada se pueda separar basándose en la carga del oligonucleótido de entrada.

Por ejemplo, en un ensayo de escisión dirigida por INVASOR en el que el oligonucleótido sonda lleva la secuencia: 5’ TTCTTTTCACCAGCGAGACGGG 3’ (es decir, la SEC ID Nº 61 sin las bases modificadas) y la escisión de la sonda tiene lugar entre el segundo y el tercer resto, una posible versión equilibrada en carga de este oligonucleótido sería: 5’ Cy3-AminoT-Amino-TCTTTTCACCAGCGAGAC GGG 3’. Este oligonucleótido modificado lleva una carga neta negativa. Después de la escisión se generan los siguientes oligonucleótidos: 5’ Cy3-AminoT-Amino-T 3’y 5’ CTTTTCAC-CAGCGAGACGGG 3’ (residuos 3-22 de SEC ID Nº 61). El 5’ Cy3-AminoT-Amino-T 3’ lleva un resto detectable (el colorante Cy3 cargado positivamente) y dos bases amino-modificadas. Las bases amino-modificadas y el colorante Cy3 contribuyen con cargas positivas superiores a las cargas negativas contribuidas por los grupos fosfato y, por lo tanto, el oligonucleótido 5’-Cy3-AminoT-Amino-T-3’ tiene una carga neta positiva. El otro fragmento de escisión más largo, como la sonda de entrada, lleva una carga neta negativa. Debido a que el fragmento 5’-Cy3AminoT-Amino-T-3’ se puede separar basándose en la carga de la sonda de entrada (el oligonucleótido equilibrado en carga), se denomina oligonucleótido no equilibrado en carga. El producto de escisión más largo no se puede separar basándose en la carga del oligonucleótido de entrada ya que ambos oligonucleótidos llevan una carga neta negativa; por tanto, el producto de escisión más largo no es un oligonucleótido no equilibrado en carga.

La expresión “carga neutra neta” cuando se usa con referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos

modificados, indica que la suma de las cargas presentes (es decir, grupos R-NH3+ en timidinas, el nitrógeno N3 de citosina, presencia o ausencia de grupos fosfato, etc.) en las condiciones de reacción deseadas esencialmente es cero. Un oligonucleótido que tiene una carga neutra neta no migraría en un campo eléctrico.

La expresión “carga positiva neta” cuando se usa con referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (es decir, grupos R-NH3+ en timidinas, el nitrógeno N3 de citosina, presencia o ausencia de grupos fosfato, etc.) en las condiciones de reacción deseadas esencialmente es +1

: o mayor. Un oligonucleótido que tiene una carga neutra positiva migraría hacia el electrodo negativo en un campo eléctrico.

La expresión “carga negativa neta” cuando se usa con referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (es decir, grupos R-NH3+ en timidinas, el nitrógeno N3 de citosina, presencia o ausencia de grupos fosfato, etc.) en las condiciones de reacción deseadas esencialmente es -1

: o mayor. Un oligonucleótido que tiene una carga neutra negativa migraría hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico.

La expresión “medios de polimerización” o “agente de polimerización” se refiere a cualquier agente capaz de facilitar la adición de nucleósidos trifosfato a un oligonucleótido. Los medios de polimerización preferidos comprenden ADN y ARN polimerasas.

La expresión “medio de ligación” o “agente de ligación” se refiere a cualquier agente capaz de facilitar la ligación (es decir, la formación de un enlace fosfodiéster entre un OH 3’ y un P 5’ localizados en los extremos de dos cadenas de

ácido nucleico). Los medios de ligación preferidos comprenden ADN ligasas y ARN ligasas.

El término “reactante” se usa en el presente documento en su sentido más amplio. El reactante puede comprender, por ejemplo, un reactante enzimático, un reactante químico o luz ultravioleta (se conoce que la luz ultravioleta, particularmente la luz ultravioleta de longitud de onda corta rompe cadenas de oligonucleótidos). En el término

“reactante” está incluido cualquier agente capaz de reaccionar con un oligonucleótido para acortar (es decir,

escindir) o prolongar el oligonucleótido.

El término “aducto” se usa en este documento en su sentido más amplio para indicar cualquier compuesto o elemento que se pueda añadir a un oligonucleótido. Un aducto puede estar cargado (positivamente o negativamente) o puede tener carga neutra. Se puede añadir un aducto al oligonucleótido mediante enlaces covalentes o no covalentes. Los ejemplos de aductos incluyen, pero sin limitación, amiditas con colorante indodicarbocianina, nucleótidos amino-sustituidos, bromuro de etidio, homodímero de etidio (1,3propanodiamino)propidio, (dietilenotriamino)propidio, naranja de triazol, naranja de (N-N’-tetrametil-1,3propanodiamino) propil triazol, naranja de (N-N’-tetrametil-1,2-etanodiaminio) propil triazol, homodímero de naranja de triazol-naranja de triazol (TOTO), heterodímero de naranja de tiazol-azul de tiazol (TOTAB), heterodímero 1 de naranja de triazol-etidio (TOED1), heterodímero 2 de naranja de tiazol-etidio (TOED2) y heterodímero de fluoresceína-etidio (FED), psoralenos, biotina, estreptavidina, avidina, etc.

Cuando un primer oligonucleótido es complementario a una región de un ácido nucleico diana y un segundo

oligonucleótido tiene complementariedad con la misma región (o una parte de esta región), existe una “región de solapamiento” a lo largo del ácido nucleico diana. El grado de solapamiento variará dependiendo de la naturaleza de la complementariedad (véase, por ejemplo, región “X” en las Figuras 29 y 67 y las discusiones adjuntas).

Como se usa en este documento, el término “purificado” o “para purificar” se refiere a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, las nucleasas recombinantes Cleavase® se expresan en células huésped bacterianas y las nucleasas se purifican mediante la eliminación de proteínas de célula huésped; de este modo se incrementa el porcentaje de estas nucleasas en la muestra.

La expresión “molécula de ADN recombinante” como se usa en este documento se refiere a una molécula de ADN

que comprende segmentos de ADN unidos entre sí mediante técnicas de biología molecular.

La expresión “proteína recombinante” o “polipéptido recombinante” como se usa en este documento se refiere a una

molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante.

Como se usa en este documento, el termino “parte” cuando se hace referencia a una proteína (como en “una parte de una proteína dada”) se refiere a fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde cuatro restos aminoacídicos a toda la secuencia de aminoácidos menos un aminoácido (p. ej., 4, 5, 6, …, n-1).

La expresión “secuencia de ácido nucleico” como se usa en este documento se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido y fragmentos o partes de los mismos y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que pueden ser mono o bicatenarios y representa la cadena con sentido o antisentido. De forma similar, “secuencia de aminoácidos” como se usa en este documento se refiere a secuencia de péptido o proteína.

La expresión “ácido nucleico peptídico” (“PNA”) como se usa en este documento se refiere a una molécula que comprende bases o análogos de bases tales como los que se encontrarían en el ácido nucleico natural pero unidos a un armazón peptídico en lugar de al armazón de azúcar-fosfato típica de los ácido nucleicos. La unión de las bases al péptido es tal que permita que las bases se emparejen con bases complementarias de ácido nucleico de un modo similar al de un oligonucleótido. Estas pequeñas moléculas, también denominadas agentes antigénicos, detienen la prolongación del transcrito uniéndose a su cadena complementaria de ácido nucleico [Nielsen y col. Anticancer Drug Des. 8:53 63 [1993]).

Como se usa en este documento, las expresiones “purificado” o “sustancialmente purificado” se refieren a moléculas

bien secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, que se eliminan de su entorno natural, se aíslan o separan y están al menos el 60% libres, preferiblemente el 75% libres y mucho más preferiblemente el 90% libres de otros

componentes con los que se asocian de forma natural. Por lo tanto, un “polinucleótido aislado” u “oligonucleótido aislado” es un polinucleótido sustancialmente purificado.

Un oligonucleótido (o polinucleótido) aislado que codifica una endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei (Pwo) que tiene una región capaz de hibridar con la SEC ID Nº: 116 es un oligonucleótido que contiene secuencias que codifican al menos la parte amino-terminal de la endonucleasa FEN-1 de Pwo. Un oligonucleótido (o polinucleótido) aislado que codifica una endonucleasa FEN-1 Pwo que tiene una región capaz de hibridar con la SEC ID Nº: 117 es un oligonucleótido que contiene secuencias que codifican al menos la parte carboxi-terminal de la endonucleasa FEN-1 de Pwo. Un oligonucleótido (o polinucleótido) aislado que codifica una endonucleasa FEN-1 Pwo que tiene una región capaz de hibridar con las SEC ID Nº: 118 y 119 es un oligonucleótido que contiene secuencias que codifican al menos las partes de la proteína endonucleasa FEN-1 Pwo localizadas internas del extremo amino o carboxi de a proteína endonucleasa FEN-1 Pwo.

Como se usa en este documento, la expresión “proteína de fusión” se refiere a una proteína quimérica que contiene la proteína de interés (es decir, nucleasa Cleavase® BN/trombina y partes o fragmentos de la misma) unida a un fragmento proteína exógena (el compañero de fusión constituido por una proteína nucleasa no Cleavase® BN/trombina). El compañero de fusión puede mejorar la solubilidad de la proteína quimérica recombinante (por ejemplo, la nucleasa Cleavase® BN/trombina) cuando se expresa en una célula huésped, puede proporcionar un marcador de afinidad (por ejemplo, un marcador his) para permitir la purificación de la proteína de fusión recombinante de la célula huésped o el sobrenadante del cultivo o de ambos. Si se desea, la proteína de fusión se puede eliminar de la proteína de interés (por ejemplo, nucleasa Cleavase® BN/trombina o fragmentos de la misma) mediante una diversidad de medios enzimáticos o químicos conocidos en la técnica.

Como se usa en este documento, las expresiones “proteína quimérica” y “proteína de tipo quimérico” se refieren a

una única molécula de proteína que comprende partes de secuencias de aminoácidos obtenidas de dos o más proteínas precursoras. Estas moléculas precursoras pueden ser de proteínas similares de orígenes genéticamente distintos, proteínas diferentes de un único organismo o proteínas diferentes de organismos diferentes. A modo de ejemplo pero no a modo de limitación, la nucleasa con especificidad de estructura quimérica de la presente invención puede contener una mezcla de secuencias de aminoácidos que se han obtenido de genes de FEN-1 de dos o más de los organismos que tienen tales genes, combinados para formar una nucleasa de origen no natural. El término “quimérico”, como se usa en este documento no tiene por objeto transmitir ninguna proporción particular de contribución de los genes de origen natural ni limitar el modo en el que se combinan las partes. Cualquier construcción de nucleasa con especificidad de estructura quimérica que tiene actividad de escisión como se determina por los procedimientos de ensayo descritos en este documento es un agente de escisión mejorado que entra dentro del alcance de la presente invención.

La expresión “hebra continua de ácido nucleico”, como se usa en el presente documento, quiere decir una hebra de ácido nucleico que tiene una estructura armazón continua unida covalentemente, sin muescas ni roturas. La disposición de la parte de bases de cada nucleótido, emparejados, monocatenaria o con emparejamientos erróneos, no es un elemento en la definición de una hebra continua. El armazón de la hebra continua no se limita a las composiciones de ribosa-fosfato o desoxirribosa-fosfato que se encuentran en la naturaleza, ácidos nucleicos no modificados. Un ácido nucleico de la presente invención puede comprender modificaciones de la estructura del

armazón, incluidos, entre otros, residuos de fosforotioato, residuos de fosfonato, residuos de ribosa 2’sustituida (p. ej., 2-O’-metil-ribosa) y residuos que contienen azúcar alternativo (p. ej., arabinosa).

La expresión “dúplex continuo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una región de ácido nucleico

bicatenario en el que no hay rotura en la progresión de los pares de bases en el dúplex (es decir, los pares de bases a lo largo del dúplex no están distorsionados para acomodar un hueco, protuberancia o emparejamiento erróneo en los confines de la región del dúplex continuo). Como se usa en el presente documento, el término solo se refiere a la disposición de los pares de bases dentro del dúplex, sin implicación de la continuidad en la porción armazón de la hebra de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos dúplex con emparejamiento de bases sin interrumpir, pero con muescas en una o ambas hebras están dentro de la definición de un dúplex continuo.

El término “dúplex” se refiere al estado de los ácidos nucleicos en los que las partes de bases de los nucleótidos en

una hebra están unidas a través de puentes de hidrógeno que unen sus bases complementarias dispuestas en una segunda hebra. La condición de estar en una forma dúplex se refleja en el estado de las bases de un ácido nucleico. En virtud del emparejamiento de bases, las hebras de ácido nucleico también asumen generalmente la estructura terciaria de una doble hélice que tiene una ranura mayor y una menor. La asunción de la forma helical está implícita en la acción de formar un dúplex.

La expresión “unión de proteína dependiente de dúplex” se refiere a la unión de las proteínas al ácido nucleico

dependiente de que el ácido nucleico esté en un dúplex o forma helicoidal.

La expresión “sitios o regiones de unión a proteína dependiente de dúplex”, como se usa en el presente documento,

se refiere a regiones o secuencias pequeñas dentro de un ácido nucleico que están unidas con una afinidad concreta mediante proteínas específicas de unión a ácido nucleico dependiente de dúplex. Esto contrasta con la unión generalizada dependiente de dúplex de proteínas que no son específicas de sitio, tales como las proteínas histonas que se unen a la cromatina con poca referencia a secuencias o sitios específicos.

La expresión “región de unión a proteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a una región de ácido

nucleico identificada por la unión de una secuencia o estructura a una proteína o clase de proteínas concretas. Entra dentro del alcance de esta definición incluir las regiones que contienen suficiente información genética para permitir identificaciones de la región por comparación con secuencias conocidas, pero que podrían no tener la estructura requerida para la unión real (p. ej., una sola hebra de un sitio de proteína de unión a ácido nucleico dependiente de

dúplex). Como se usa en el presente documento, “”región de unión a proteína” excluye las regiones de unión a

endonucleasas de restricción.

La expresión “región de unión a proteína bicatenaria completa”, como se usa en el presente documento, se refiere a

la región mínima de dúplex continuo requerida para permitir la unión u otra actividad de una proteína dependiente de dúplex. Con esta definición se pretende abarcar la observación de que algunas proteínas de unión a ácido nucleico dependientes de dúplex pueden interaccionar con actividad completa con las regiones del dúplex que pueden ser más cortas que una región de unión a proteína canónica como se observa en una u otra de las dos hebras sencillas. En otras palabras, se puede dejar que uno o más nucleótidos en la región permanezcan sin aparear sin suprimir la

unión. Como se usa en el presente documento, la expresión “región de unión bicatenaria completa” se refiere a la

secuencia mínima que alojará la función de unión. Dado que algunas de estas regiones pueden tolerar secuencias no dúplex en múltiples lugares, aunque no necesariamente simultáneamente, una única región de unión a proteína podría tener varias subregiones más cortas que, cuando están en dúplex, serán completamente competentes para la unión a proteínas.

El término “molde” se refiere a una hebra de ácido nucleico sobre la cual se fabrica una copia complementaria con

nucleósidos trifosfato mediante la actividad de una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde. Dentro de un

dúplex, la hebra molde se representa y describe, por consenso, como la hebra “inferior”. De forma similar, la hebra que no es molde a menudo se representa y describe como la hebra “superior”.

La expresión “ARN polimerasa dependiente de molde” se refiere a un ácido nucleico polimerasa que crea nuevas

hebras de ARN mediante la copia de una hebra molde como se ha descrito anteriormente y que no sintetiza ARN en ausencia de un molde. Esto contrasta con la actividad de las ácido nucleico polimerasas independientes del molde que sintetizan o extiendan los ácidos nucleicos sin referencia a un molde, tal como la desoxinucleotidiltransferasa terminal o PoliA polimerasa.

El término “molécula de DETENCIÓN” se refiere a un agente añadido o incluido en una reacción de escisión invasiva

con el fin de detener la participación de uno o más componentes de la reacción en una acción o reacción posterior. Esto se puede realizar secuestrando o inactivando algún componente de la reacción (p. ej., mediante la unión o emparejamiento de bases de un componente de ácido nucleico o mediante la unión a un componente proteico). Laexpresión “oligonucleótido de DETENCIÓN” se refiere a un oligonucleótido incluido en una reacción de escisión invasiva con el fin de detener o parar uno o más aspectos de cualquier reacción (p. ej., la primera reacción y/ocualquier reacción o acción posterior; no se pretende que el oligonucleótido de DETENCIÓN esté limitado a ninguna reacción o etapa de reacción concretas). Esto se puede realizar secuestrando algún componente de la reacción (p. ej., mediante el emparejamiento de bases con otro ácido nucleico o mediante la unión a un componente proteico). No obstante, no se pretende limitar la expresión únicamente a situaciones en las que se secuestre el componente de la reacción.

Como se usa en el presente documento, el término “kit” se refiere a cualquier sistema de liberación para liberar

materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, dichos sistemas de liberación incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o liberación de reactivos de reacción (p. ej., oligonucleótidos, enzimas etc. en los contenedores adecuados) y/o materiales de soporte (p. ej., tampones, instrucciones escritas para realizar el ensayo etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kit incluyen uno o más envases (p. ej., cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte relevantes. Como se usa en el presente documento, la expresión “kit fragmentado” se refiere a sistemas de liberación que comprenden dos o más contenedores separados, cada uno de

los cuales contiene una subporción de todos los componentes del kit. Los contenedores se pueden liberar en el recipiente previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer contenedor puede contener una enzima para usar

en un ensayo, mientras que un segundo contenedor contiene oligonucleótidos. Con la expresión “kit fragmentado” se

pretende abarcar kits que contienen reactivos específicos para analitos (REA) regulados en la sección 520(e) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, pero no se limitan a ellos. De hecho, cualquier sistema de liberación que comprende dos o más contenedores separados, cada uno de los cuales contiene una subporción de

todos los componentes del kit, está incluido en la expresión “kit fragmentado”. En contraste con esto, un “kit combinado” se refiere a un sistema de liberación que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un único contenedor (p. ej., en una sola caja cada uno de los componentes deseados). El término “kit” incluye los

kits tanto fragmentados como combinados.

Como se usa en el presente documento, la expresión “dominio funcional” se refiere a una región, o una parte de una región, de una proteína (p. ej., una enzima), que proporciona una o más características funcionales de la proteína. Por ejemplo, un dominio funcional de una enzima puede proporcionar, directa o indirectamente, una o más actividades de la enzima, incluidas, entre otras, la capacidad de unión al sustrato y la actividad catalítica. Un dominio funcional se puede caracterizar mediante la mutación de uno o más aminoácidos dentro del dominio funcional, en el que la mutación del(los) aminoácido(s) altera la funcionalidad asociada (medida empíricamente en un ensayo), de modo que indica la presencia de un dominio funcional.

Como se usa en el presente documento, la expresión “dominio funcional heterólogo” se refiere a un dominio funcional que no está en su ambiente natural. Por ejemplo, un dominio funcional heterólogo incluye un dominio funcional de una enzima introducida en otra enzima. Un dominio funcional heterólogo también incluye un dominio funcional nativo de una proteína que se ha alterado de algún modo (p. ej., mutado, añadido en múltiples copias, etc.). Un dominio funcional heterólogo puede comprender una pluralidad de aminoácidos contiguos o puede incluir dos o más aminoácidos distales fragmentos de aminoácidos (p. ej., dos o más aminoácidos o fragmentos con secuencia interpuesta no heteróloga). Los dominios funcionales heterólogos se distinguen de los dominios funcionales endógenos en que el(los) aminoácido(s) heterólogo(s) están unidos a secuencias de aminoácidos que no se encuentran asociadas de forma natural con la secuencia de aminoácidos de la naturaleza o que están asociadas con una porción de una proteína que no está en la naturaleza.

Como se usa en el presente documento, la expresión “funcionalidad alterada en un ensayo de escisión de aminoácido” se refiere a una característica de una enzima que se ha alterado de algún modo para diferir de su

estado natural (p. ej., diferir de como se encuentra en la naturaleza). Las alteraciones incluyen, entre otras, adición de un dominio funcional heterólogo (p. ej., mediante mutación o mediante la creación de proteínas quiméricas). En algunas realizaciones, la característica alterada de la enzima puede ser una que mejore el rendimiento de una enzima en un ensayo de escisión de ácido nucleico. Tipos de mejoras incluyen, entre otros, mejora de la actividad nucleasa (p. ej., mejora del índice de reacción), mejora de la unión al sustrato (p. ej., incremento o disminución de la unión de ciertas especies de ácido nucleico [p. ej., ARN o ADN] que produce un resultado deseado [p. ej., mayor especificidad, mejora del recambio del sustrato etc.]) y mejora de la especificidad de fondo (p. ej., se produce menos producto no deseado). La presente invención no está limitada por el ensayo de escisión de ácido nucleico para analizar la mejora de la funcionalidad. No obstante, en algunas realizaciones preferidas de la presente invención se usa un ensayo de escisión invasivo como el ensayo de escisión de ácido nucleico. En ciertas realizaciones particularmente preferidas, como ensayo de escisión de ácido nucleico se usa un ensayo de escisión invasivo usando un ARN diana.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “N-terminal” y “C-terminal” en referencia a secuencias polipeptídicas se refieren a regiones de polipéptidos que incluyen porciones de las regiones -terminal y C-terminal del polipéptido, respectivamente. Una secuencia que incluye una porción de la región N-terminal del polipéptido incluye aminoácidos predominantemente de la mitad N-terminal de la cadena polipeptídica, pero no está limitada a dichas secuencias. Por ejemplo, una secuencia N-terminal puede incluir una porción interior de la secuencia polipeptídica que incluye bases tanto de la mitad N-terminal como C-terminal del polipéptido. Lo mismo se aplica a las regiones en C-terminal. Las regiones N-terminal y C-terminal pueden incluir, aunque no necesariamente, el aminoácidos que define los últimos extremos en N-terminal y C-terminal del polipéptido, respectivamente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “panel de detección” se refiere a un sustrato o dispositivo que contiene al menos dos ensayos de detección candidatos únicos configurados para detección de dianas.

Descripción de los dibujos

La invención se define en las reivindicaciones. La Fig. 1 es una comparación de la estructura nucleotídica de los genes DNAP aislados de Thermus aquaticus (SEC

ID Nº 1), Thermus flavus (SEC ID Nº 2) y Thermus thermophilus (SEC ID Nº 3); la secuencia consenso (SEC ID Nº 7) se muestra en la parte superior de cada fila. La Fig. 2 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de DNAP aislados de Thermus aquaticus (SEC ID Nº

4), Thermus flavus (SEC ID Nº 5) y Thermus thermophilus (SEC ID Nº 6); la secuencia consenso (SEC ID Nº 8) se muestra en la parte superior de cada fila. Las Figuras 3A-G son un conjunto de diagramas de genes DNAPTaq de tipo silvestre y con síntesis deficiente. La Fig.4A representa el gen de la polimerasa de Thermus flavus de tipo silvestre.

La Fig.4B representa el gen de la polimerasa de Thermus flavus con síntesis deficiente. La Figura 5 ilustra una estructura que no se puede amplificar usando DNAP Taq; esta figura muestra la SEC ID Nº 17 (cebador) y la SEC ID Nº 15 (horquilla).

La Figura 6es un gel teñido con bromuro de etidio que demuestra intentos de amplificar un dúplex bifurcado usando

bien DNAPTaq o DNAPStf (es decir, el fragmento Stoffel de DNAPTaq). La Figura 7 es un autorradiograma de un gel que analiza la escisión de un dúplex bifurcado por DNAPTaq y ausencia de escisión por DNAPStf

Las Figuras 8A-B son un conjunto de autorradiogramas de geles que analizan la escisión o ausencia de escisión después de adición de diferentes componentes de reacción y cambio de temperatura de incubación durante intentos de escindir un dúplex bifurcado con DNAPTaq.

Las Figuras 9A-B son un autorradiograma que muestra reacciones de escisión sincronizadas con y sin cebador.

Las Figuras 10 A-B son un conjunto de autorradiogramas de geles que demuestran intentos de escindir un dúplex bifurcado (con y sin cebador) con diversos DNAP. La Figura 11A muestra los sustratos y oligonucleótidos (19-12 [SEC ID Nº 18] y 30-12 [SEC ID Nº 19]) usados para

ensayar la escisión específica de ADN sustrato dirigida por oligonucleótidos piloto.

La Figura 11B muestra un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de reacciones de escisión usando los sustratos y oligonucleótidos mostrados en la Figura 12A. La Figura 12A muestra los sustratos y oligonucleótidos (30-0 [SEC ID Nº 20] usados para ensayar la escisión

específica de ARN sustrato dirigida por un oligonucleótido piloto.

La Figura 12B muestra un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de de una reacción de escisión usando el sustrato y oligonucleótido mostrados en la Figura 13A. La Figura 13 es un diagrama del vector pTTQ18. La Figura 14 es un diagrama del vector pET-3c. Las Figuras 15A-E ilustran un conjunto de moléculas que son sustratos adecuados para escisión por la actividad

nucleasa 5’ de DNAP (las SEC ID Nº 15 y 17 se representan en la Figura 15E).

La Figura 16 es un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de una reacción de escisión realizada con DNAP deficientes en síntesis. La Figura 17 es un autorradiograma de un cromatograma de PEI que separa los productos de un ensayo para

actividad sintética en clones de DNAPTaq deficientes en síntesis. La Figura 18A ilustra la molécula de sustrato (SEC ID Nº 15 y 17) usada para ensayar la capacidad de DNAP

deficientes en síntesis para escindir estructuras de horquilla cortas.

La Figura 18B muestra una autorradiograma de un gel que separa los productos de una reacción de escisión realizada usando el sustrato mostrado en la Figura 19A.

La Figura 19 proporciona la secuencia de dúplex de oligómeros de 206 unidades completa (SEC ID Nº 27) empleada

como un sustrato para las nucleasas 5’ de la presente invención.

Las Figuras 20A y B muestran la escisión de sustratos de ácido nucleico lineal (basándose en los oligómeros de 206 unidades de la Figura 21) por DNAP de tipo silvestre y nucleasas 5’ aisladas de Thermus aquaticus y Thermus flavus.

La Figura 21A muestra el fenómeno de “recorte” detectado con las DNAP de la presente invención.

La Figura 21B muestra que el “recorte” de la Figura 21A es escisión nucleolítica 5’ y no escisión por fosfatasa.

La Figura 22 demuestra que el fenómeno de “recorte” depende de dúplex.

La Figura 23 es un esquema que muestra cómo se puede emplear el “recorte” en un ensayo de detección.

Las Figura 24A y B demuestran que el “recorte” se puede dirigir por diana.

La Figura 25 proporciona un dibujo esquemático de un ácido nucleico diana con un oligonucleótido INVASOR y un oligonucleótido sonda hibridados con la diana.

La Figura 26 proporciona un esquema que muestra el oligonucleótido de horquilla S-60 (SEC ID Nº 29) con el oligonucleótido P-15 hibridado (SEC ID Nº 30).

La Figura 27 es un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de una reacción de escisión realizada usando la horquilla S-60 en presencia o ausencia del oligonucleótido P-15.

La Figura 28 proporciona un esquema que muestra tres disposiciones diferentes de oligonucleótidos específicos de diana y su hibridación con un ácido nucleico diana que también tiene hibridado con el mismo un oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 31-35).

La Figura 29 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra que la presencia de un oligonucleótido INVASOR provoca un desplazamiento en el sitio de escisión en un dúplex de sonda/diana.

La Figura 30 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por invasor realizados usando los tres oligonucleótidos específicos de diana esquematizados en la Figura 28.

La Figura 31 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados en presencia o ausencia de moléculas de ácido nucleico no diana.

La Figura 32 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados en presencia de cantidades decrecientes de ácido nucleico diana.

La Figura 33 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados en presencia o ausencia de extracto de saliva usando diversas nucleasas 5’ termoestables o ADN polimerasas.

La Figura 34 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los

productos de ensayos de escisión dirigida por invasor realizados usando diversas nucleasas 5’.

La Figura 35 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido invasor realizados usando dos ácidos nucleicos diana que difieren en único par de bases a dos temperaturas de reacción diferentes.

La Figura 36A proporciona un esquema que muestra el efecto de temperatura elevada sobre la hibridación y escisión de un oligonucleótido sonda a lo largo de un ácido nucleico diana en el que la sonda contiene una región de no complementariedad con la diana.

La Figura 36B proporciona un esquema que muestra el efecto de la adición de un oligonucleótido cadena arriba después de la hibridación y escisión de un oligonucleótido sonda a lo largo de un ácido nucleico diana en el que la sonda contiene una región de no complementariedad con la diana.

La Figura 37 proporciona un esquema que muestra una disposición de un oligonucleótido INVASOR específico de diana (SEC ID Nº 39) y un oligonucleótido sonda específico de diana (SEC ID Nº: 38) que lleva un marcador Cy3 5’ a lo largo de un ácido nucleico diana (SEC ID Nº: 31).

La Figura 38 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados en presencia de concentraciones crecientes de KCl.

La Figura 39 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados en presencia de concentraciones crecientes de MnCl2 o MgCl2.

La Figura 40 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados en presencia de de cantidades crecientes de ADN genómico o ARNt.

La Figura 41 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por invasor realizados usando una diana de ARN de VHC.

La Figura 42 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados usando una diana de ARN de VHC y demuestra la estabilidad de dianas de ARN en condiciones de ensayo de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR.

La Figura 43 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra la sensibilidad de detección y la estabilidad de ARN en ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados usando una diana de ARN de VHC.

La Figura 44 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra la degradación térmica de oligonucleótidos que contienen o que carecen de un grupo fosfato 3’.

La Figura 45 ilustra la estructura de oligonucleótidos amino-modificados 70 y 74.

La Figura 46 ilustra la estructura de oligonucleótidos amino-modificados 75.

La Figura 47 ilustra la estructura de oligonucleótidos amino-modificados 76.

La Figura 48 es la imagen generada por una exploración de aparato para la formación de imágenes fluorescentes de un gel de IEF que muestra la migración de sustratos 70, 70dp, 74, 74dp, 75, 75dp, 76 y 76dp.

La Figura 49A proporciona un esquema que muestra una disposición de un oligonucleótido INVASOR específico de

diana (SEC ID Nº 50) y un oligonucleótido sonda específico de diana (SEC ID Nº: 51) que lleva un marcador Cy3 5’ a

lo largo de un ácido nucleico diana (SEC ID Nº: 52).

La Figura 49B es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra la detección de productos de escisión específicos generados en un ensayo de escisión invasiva usando inversión de carga (es decir, separación basada en carga de productos de escisión).

La Figura 50 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra la sensibilidad de detección de productos de escisión específica generados en un ensayo de escisión invasiva usando inversión de carga.

La Figura 51 ilustra una primera realización de un dispositivo para la separación basada en carga de oligonucleótidos.

La Figura 52 ilustra una segunda realización de un dispositivo para la separación basada en carga de oligonucleótidos.

La Figura 53 muestra un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de reacciones de escisión realizadas en presencia o ausencia de un oligonucleótido cebador; se muestra una escala de secuenciación como un marcador del tamaño.

Las Figuras 54A-D ilustran cuatro pares de oligonucleótidos; en cada par mostrado, la disposición superior de una sonda hibridada con un ácido nucleico diana carece de un oligonucleótido cadena arriba y la disposición inferior contiene un oligonucleótido cadena arriba (las SEC ID Nº 32 y 54-58 se muestran en las Figuras 54A-D).

La Figura 55 muestra la estructura química de varios colorantes de unión a ADN heterodimérico cargados positivamente.

La Figura 56 es un esquema que muestra procedimientos alternativos para la prolongación y detección de productos de escisión específica en el contexto del ensayo de escisión dirigida por INVASOR.

La Figura 57 proporciona un dibujo esquemático de un ácido nucleico diana con un oligonucleótido INVASOR, una minisonda y un oligonucleótido apilador hibridados con la diana.

La Figura 58 proporciona un modelo de relleno de espacio de la estructura 3-dimensional de la exonucleasa 5’ T5.

La Figura 59 proporciona un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de varias nucleasas FEN-1 incluyendo la proteína FEN-1 de Methanococcus jannaschii (MJAFEN1.PRO), la proteína FEN-1 de Pyrococcus furiosus (PFUFEN1.PRO), la proteína FEN-1 humana (HUMFEN1.PRO), la proteína FEN-1 de ratón (MUSFEN1.PRO), la proteína YKL510 de Saccharomyces cerevisiae (YST510.PRO), la proteína RAD2 de Saccharomyces cerevisiae (YSTRAD2.PRO), la proteína RAD13 de Shizosaccharomyces pombe (SPORAD13.PRO), la proteína XPG humana (HUMXPG.PRO), la proteína XPG de ratón (MUSXPG.PRO), la proteína XPG de Xenopus laevis (XENXPG.PRO) y la proteína RAD2 de C. elegans (CELRAD2.PRO); partes de la secuencia de aminoácidos de algunas de estas proteínas no se mostraron para maximizar el alineamiento entre proteínas (específicamente los aminoácidos 122 a 765 de la secuencia YSTRAD2 se delecionaron; los aminoácidos 122 a 746 de la secuencia SPORAD13 se delecionaron; los aminoácidos 122 a 757 de la secuencia HUMXPG se delecionaron, los aminoácidos 122 a 770 de la secuencia MUSXPG se delecionaron; y los aminoácidos 122 a 790 de la secuencia XENXPG se delecionaron). Los números a la izquierda de cada línea de secuencia se refieren al número de resto aminoacídico; las líneas discontinuas representan huecos introducidos para maximizar el alineamiento.

La Figura 60 es un esquema que muestra los oligonucleótidos S-33 (SEC ID Nº 84) y 11-8-0 (SEC ID Nº 85) en una configuración plegada, el sitio de escisión se indica por la punta de flecha.

La Figura 61 muestra un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie que muestra la digestión con trombina de Cleavase® BN/trombina.

La Figura 62 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la escisión de la horquilla S-60 usando Cleavase® BN/trombina (antes y después de la digestión con trombina).

La Figura 63 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la escisión de de ADN de M13 circular usando Cleavase® BN/trombina.

La Figura 64 es un gel de SDS-PAGE que muestra la migración de nucleasa Cleavase® BN purificada, FEN-1 de Pfu, FEN-1 de Pwo y FEN-1 de Mja.

La Figura 65 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la escisión de de los oligonucleótidos S-33 y 11-8-0 por Cleavase® BN y las nucleasas FEN-1 de Mja.

La Figura 66 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la incubación de un oligonucleótido que tiene o carece de un grupo 3’-OH con TdT.

La Figura 67 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la incubación de productos de escisión con TdT.

La Figura 68 es una fotografía de una tarjeta Universal GeneCombTM que muestra la captura y detección de productos de escisión sobre un soporte de nitrocelulosa.

La Figura 69 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos usando las nucleasas Cleavase® A/G y FEN-1 de Pfu y una sonda marcada con fluoresceína.

La Figura 70 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos usando las nucleasas Cleavase® A/G y FEN-1 de Pfu y una sonda marcada con Cy3.

La Figura 71 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos usando las nucleasas Cleavase® A/G y FEN-1 de Pfu y una sonda marcada con TET.

Las Figuras 72A y 72B son imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestran los productos producidos usando las nucleasas Cleavase® A/G y las FEN-1 de Pfu y sondas que tienen o que carecen de una carga positiva 5’; el gel mostrado en la Figura 83A se procesó en la dirección convencional y el gel mostrado en la Figura 84B que se procesó en la dirección inversa.

La Figura 73 muestra la estructura de 3-nitropirrol y 5-nitroindol.

La Figura 74 muestra la secuencia de oligonucleótidos 109, 61 y 67 (SEC ID Nº 97, 50 y 51) hibridados en una estructura de escisión así como la secuencia del oligonucleótido 67 (SEC ID Nº 51) y un compuesto de las SEC ID Nº 98, 99, 101 y 102.

Las Figuras 75A-C muestran imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestran los productos producidos en un ensayo de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizado a diversas temperaturas usando una minisonda que es completamente complementaria a la diana o contiene un único apareamiento erróneo con la diana.

La Figura 76 muestra la secuencia de oligonucleótidos 166 (SEC ID Nº 103), 165 (SEC ID Nº 104), 161 (SEC ID Nº 106), 162 (SEC ID Nº 105) y 164 (SEC ID Nº 107) así como una estructura de escisión.

La Figura 77 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos de ensayos de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR realizados usando secuencias de gen ras como la diana.

Las Figuras 78A-C muestran la secuencia de la horquilla S-60 (SEC ID Nº 29) (A) y el oligonucleótido P-15 (SEC ID Nº 30) (mostrado hibridado con la horquilla S-60 en B) y la imagen generada por un aparato para la formación imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la escisión de la horquilla S-60 en presencia de diversos oligonucleótidos INVASOR.

La Figura 79 muestra la estructura de diversos sustituyentes de extremo 3’.

La Figura 80 es un gráfico compuesto que muestra el efecto de concentración de sonda, temperatura y un oligonucleótido apilador sobre la escisión de minisondas.

La Figura 81 muestra la secuencia del oligonucleótido IT-2 (SEC ID Nº 115; mostrada en una configuración plegada) así como la secuencia de los oligonucleótidos IT-1 (SEC ID Nº 116) e IT-A (SEC ID Nº: 117).

La Figura 82 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por de los oligonucleótidos mostrados en la Figura 92 por nucleasa Cleavase® A/G.

La Figura 83 es la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que proporciona una comparación de las velocidades de escisión por las nucleasas FEN-1 de Pfu y FEN-1 de Mja.

La Figura 84 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que ilustra la detección de dianas de ARN usando una minisonda y oligonucleótidos apiladores.

Las Figuras 85A-C proporcionan esquemas que muestran realizaciones concretas de la presente invención, en las que una región promotora de T7 y la copia del molde hibridaron con sin oligonucleótido (A), un oligonucleótido

promotor completo (B) o un oligonucleótido promotor completo con una cola en 3’ (C); una hebra de la región

promotora de T7 se indica con la línea rayada.

Las Figuras 86A-D proporcionan esquemas que muestran realizaciones concretas de la presente invención, en las que una región promotora de T7 y la copia del molde hibridaron con una sonda de corte (A), un oligonucleótido promotor parcial (B), un oligonucleótido sin cortar (C) o una sonda sin cortar y un oligonucleótido promotor parcial (D).

La Figura 87 proporciona un esquema que ilustra una realización de la presente invención en la que se usa una ADN polimerasa dependiente de molde para extender una sonda cortada para completar una región promotora de T7 y de este modo permitir la transcripción.

La Figura 88 proporciona un esquema que ilustra que una sonda sin cortar combinada con un oligonucleótido promotor parcial no permite la transcripción, mientras que una sonda cortada combinada con un oligonucleótido promotor parcial genera un promotor completo (pero con muescas) que soporta la transcripción.

La Figura 89 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra que la extensión del cebador se puede usar para completar un promotor parcial formado por una sonda cortada (calles 1-5) y que hibridar una sonda cortada generada en un ensayo de escisión invasivo puede completar un promotor de T7 parcial para permitir la transcripción (calles 6-9).

Las Figuras 90A-C proporcionan esquemas que muestran realizaciones concretas de la presente invención que

ilustran que el uso de un oligonucleótido promotor parcial con una cola emparejada e 5’ se puede usar para bloquear

la transcripción de un promotor compuesto formado mediante la hibridación de una sonda sin cortar.

La Figura 91 la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra que la transcripción desde un promotor compuesto de T7 ramificado “con fugas” se puede apagar mediante el uso de un oligonucleótido promotor parcial cadena abajo que tenga una cola emparejada en 5’-

La Figura 92 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra que la localización del sitio de la muesca en un promotor de T7 compuesto con muescas puede efectuar la transcripción con eficiencia.

La Figura 93 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra que la presencia de una cola sin emparejar en 2’ sobre un oligonucleótido promotor de longitud completa disminuye, pero no anula la transcripción. Debajo de la imagen se presentan esquemas que muestran los ácidos nucleicos analizados en las reacciones 1-4; estos esquemas muestran las SEC ID Nº 123-125.

La Figura 94 es un esquema que ilustra una realización de la presente invención en la que se crea una región promotora de T7 compuesta mediante la unión del oligonucleótido de sonda cortada cadena abajo del oligonucleótido promotor parcial.

Las Figuras 95A-D proporcionan esquemas que muestran realizaciones concretas de la presente invención que muestran varios modos mediante los que se puede formar un promotor compuesto en el que el corte se localice en la hebra molde (o inferior).

La Figura 96 es un esquema que ilustra una realización de la presente invención en el que la sonda cortada a partir de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 97 es un esquema que ilustra una realización de la presente invención en el que la sonda cortada a partir de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como un complejo INVASOR-diana integrado en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 98 muestra la secuencia de nucleótidos de la sonda PR1 (SEC ID Nº 119), el oligonucleótido INVASOR-Diana TT3 (SEC ID Nº 118), los oligonucleótidos IT3-8, IT3-6, TT3-4, IT3-3 y IT3-0 (SEC ID Nº 147-151, respectivamente).

La Figura 99 representa estructuras que se pueden emplear para determinar la capacidad de una enzima para escindir una sonda en presencia y ausencia de un oligonucleótido cadena arriba. La Figura 99 muestra la secuencia del oligonucleótido 89-15-1 (SEC ID Nº 152), el oligonucleótido 81-69-5 (SEC ID Nº 156), el oligonucleótido 81-69-4 (SEC ID Nº 155), el oligonucleótido 81-69-3 (SEC ID Nº 154), el oligonucleótido 81-69-2 (SEC ID Nº 153) y una parte de M13mp18 (SEC ID Nº 163)..

La Figura 100 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra la dependencia de FEN-1 de Pfu de la presencia de un oligonucleótido solapante cadena arriba para la escisión específica de la sonda.

La Figura 101a muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara la cantidad de producto generada en una reacción estándar (es decir, una reacción de escisión invasiva no secuencial) y una reacción de escisión invasiva secuencial.

La Figura 101b es un gráfico que compara la cantidad de producto generada en una reacción estándar o básica (es decir, una reacción de escisión invasiva no secuencial) y una reacción de escisión invasiva secuencial (" INVASOR sqrd") (eje y= unidades de fluorescencia; eje x= atomoles de la diana).

La Figura 102 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra que los productos de una reacción de escisión invasiva secuencial completada no puede producir contaminación cruzada en una reacción posterior similar.

La Figura 103 muestra la secuencia del oligonucleótido empleado en una reacción de escisión invasiva para la detección de AND viral del HCMV; La Figura 103 muestra la secuencia de los oligonucleótidos 89-76 (SEC ID Nº 161), los oligonucleótidos 89-44 (SEC ID Nº 160) y los nucleótidos 3057-3110 del genoma del HCMV (SEC ID Nº 162).

La Figura 104 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra la detección sensible del ADN viral de HCMV en muestras que contienen ADN genómico humano usando una reacción de escisión invasiva.

La Figura 105 es un esquema que ilustra una realización de la presente invención en el que la sonda cortada a partir de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva y en la que un oligonucleótido de DETENCIÓN evita la participación de la primera sonda sin cortar restante en la escisión de la segunda sonda.

La Figura 106 es un esquema que ilustra una realización de la presente invención en el que la sonda cortada a partir de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como complejo INVASOR-diana integrado en una segundareacción de escisión invasiva y en la que un oligonucleótido de DETENCIÓN evita la participación de la primera sonda sin cortar restante en la escisión de la segunda sonda.

La Figura 107 muestra tres imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra que las dos longitudes diferentes de 2’-O-metil, oligonucleótido de DETENCIÓN aminomodificado en el extremo 3’ reducen la escisión de base inespecífica de la sonda secundaria cuando se incluye en la segunda etapa

de una reacción en la que la sonda cortada de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como un complejo INVASOR-diana integrado en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 108A muestra dos imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de concentraciones crecientes de la sonda primaria en la primera etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 108B muestra dos imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de concentraciones crecientes de la sonda primaria en la primera etapa de una reacción y la inclusión de un 2’-O-metil oligonucleótido de DETENCIÓN aminomodificado en el extremo 3’ en la que la segunda etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una

reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 108C muestra un gráfico generado usando el software de hoja desplegable Microsoft Excel que compara los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de concentraciones crecientes de la sonda primaria en la primera etapa de una reacción en presencia o ausencia de un 2’-O-metil oligonucleótido de DETENCIÓN aminomodificado en el extremo 3’ en la que la segunda etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una

La Figura 109A muestra dos imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de la inclusión de un oligonucleótido deDETENCIÓN aminomodificado en la segunda etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 109B muestra dos imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que muestra los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de la inclusión de un oligonucleótido deDETENCIÓN aminomodificado en el extremo 3’, un 2’-O-metil oligonucleótido de DETENCIÓN aminomodificado en el extremo 3’ o un 2’-O-metil oligonucleótido de DETENCIÓN completamente aminomodificado en el extremo 3’ en la segunda etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 110A muestra dos imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de la inclusión de un oligonucleótido deDETENCIÓN de diferentes longitudes en la segunda etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva.

La Figura 110B muestra dos imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de la inclusión de un oligonucleótido deDETENCIÓN de diferentes longitudes en la segunda etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva y en la que se analiza una variante más larga de la sonda secundaria usada en las reacciones de la Figura 110A.

La Figura 110C muestra un diagrama esquemático de una sonda primaria alineada con varios oligonucleótidos deDETENCIÓN de longitudes diferentes. La región de la sonda primaria que es complementaria a la secuencia diana del VHB está subrayada. Los oligonucleótidos de DETENCIÓN están alineados con la sonda mediante complementariedad.

La Figura 111 muestra dos imágenes generadas por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los efectos sobre la señal de escisión inespecífica y específica de la inclusión de un oligonucleótido deDETENCIÓN de diferentes longitudes en la segunda etapa de una reacción en la que la sonda cortada de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva usando sondas secundarias de dos longitudes diferentes.

La Figura 112A proporciona un diagrama esquemático que ilustra una realización de la presente invención en la que la sonda cortada a partir de una reacción de escisión invasiva inicial se emplea como el oligonucleótido INVASOR en una segunda reacción de escisión invasiva usando un casete FRET. La región indicada como “N" es la superposición requerida para la escisión en esta realización. La Figura 112B es un diagrama de cómo un

apareamiento erróneo entre la sonda y la hebra diana en la posición “N” rompe la superposición y, de este modo,

suprime la escisión de la sonda.

La Figura 113A muestra un diagrama esquemático de un proporciona un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 195), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 197) y un casete FRET (SEC ID Nº 201) para la detección del alelo Apo E 112 arg.

La Figura 113B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 195), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 198) y un casete FRET (SEC ID Nº 201) para la detección del alelo Apo E 112 cys.

La Figura 113C muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 196), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 199) y un casete FRET (SEC ID Nº 201) para la detección del alelo Apo E 158 arg.

La Figura 113D muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 196), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 200) y un casete FRET (SEC ID Nº 201) para la detección del alelo Apo E 158 cys.

La Figura 114A proporciona un gráfico de barras que muestra la detección de los alelos de arg y cys en el locus Apo E 112 en 2 controles sintéticos y 5 muestras de ADN genómico humano.

La Figura 114B proporciona un gráfico de barras que muestra la detección de los alelos de arg y cys en el locus Apo E 158 en 2 controles sintéticos y 5 muestras de ADN genómico humano.

La Figura 115A muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 202), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 208) y el casete FRET (SEC ID Nº 201) para la detección del alelo C282 de tipo silvestre del gen HFE humano.

La Figura 115B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 202), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 209) y el casete FRET (SEC ID Nº 210) para la detección del alelo mutante C282Y del gen HFE humano.

La Figura 115C muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 203), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 211) y el casete FRET (SEC ID Nº 206) para la detección del alelo H63 mutante del gen HFE humano.

La Figura 115D muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 203), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 212) y el casete FRET (SEC ID Nº 213) para la detección del alelo mutante H63D del gen HFE humano.

La Figura 116 proporciona un gráfico de barras que muestra el análisis de las mutaciones C282Y (primer conjunto de ocho ensayos, de izquierda a derecha) y H63D (segundo conjunto de ocho ensayos, de izquierda a derecha) en el gen HFE humano, cada uno analizado en 2 controles sintéticos y 5 muestras de ADN genómico humano.

La Figura 117A muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 216), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 217) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo de tipo silvestre en la posición 677 del gen MTHFR humano.

La Figura 117B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 216), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 218) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo mutante en la posición 677 del gen MTHFR humano.

La Figura 118 proporciona un gráfico de barras que muestra el análisis de la mutación C677T en el gen MTHFR humano en 3 muestras control sintéticos y 3 muestras de ADN genómico humano.

La Figura 119A muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 222), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 223) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo de tipo silvestre en la posición 20210 del gen de la protrombina humana.

La Figura 119B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 222), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 224) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo mutante en la posición 20210 del gen de la protrombina humana.

La Figura 120 proporciona un gráfico de barras que muestra el análisis de la mutación A20210G en el gen de la protrombina humana en 2 muestras control sintéticas y 3 muestras de ADN genómico humano.

La Figura 121A muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 228), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 229) y el casete FRET (SEC ID Nº 230) para la detección del alelo mutante R-2 del gen del factor V humano.

La Figura 121B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 231), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 232) y el casete FRET (SEC ID Nº 230) para la detección del gen de la -actina humana. La Figura 122 proporciona un gráfico de barras que muestra la detección del mutante R-2 (HR-2) del gen del factor V humano en comparación con la detección del control interno (CI), el gen de la -actina, 3 muestras control sintéticas y 2 muestras de ADN genómico humano.

La Figura 123A muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 235), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 236) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo de tipo silvestre en la posición -308 en el promotor del gen del TNF-humano. La Figura 123B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 235), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 237) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo mutante en la posición -308 en el promotor del gen del TNF- humano.

La Figura 124 proporciona un gráfico de barras que muestra el análisis de la mutación -308 en el promotor del gen del TNF- humano en 3 muestras control sintéticos y 3 muestras de ADN genómico humano. La Figura 125A muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 240), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 241) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo de tipo silvestre en la posición del codón 506 del gen del factor V humano.

La Figura 125B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 240), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 242) y el casete FRET (SEC ID Nº 225) para la detección del alelo mutante A506G del gen del factor V humano.

La Figura 126 proporciona un gráfico de barras que muestra el análisis de la mutación A506G en el gen del factor V humano en 3 muestras control sintéticos y 6 muestras de ADN genómico humano.

La Figura 127A muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 243), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 244) y el casete FRET (SEC ID Nº 245) para la detección del gen mecA asociado con la resistencia a la meticilina en S. aureus.

La Figura 127B muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 246), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 247) y el casete FRET (SEC ID Nº 245) para la detección del gen nuc, un gen específico de especie que distingue S. aureus de S. haemolyticus.

La Figura 128 proporciona un gráfico de barras que muestra la detección del gen mecA en comparación con la detección del gen nuc específico de S. aureus en ADN de S. aureus sensible a meticilina (MSSA), S. aureus resistente a meticilina (MRSA), S. haemolyticus y dianas control amplificadas para las secuencias mecA y nuc diana.

La Figura 129A muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los productos producidos mediante escisión de una mezcla de los oligonucleótidos mostrados en la Figura 60 por FEN-1 de Pfu (1) o FEN-1 de Mja (2).

La Figura 129B muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los productos producidos mediante escisión de los oligonucleótidos mostrados en la Figura 26 por FEN-1 de Pfu (1) o FEN-1 de Mja (2).

La Figura 130 muestra un diagrama esquemático de las partes de las proteínas FEN-1 de Pfu y FEN-1 de Mja combinadas para crear nucleadas quiméricas.

La Figura 131A muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los productos producidos mediante escisión de una mezcla de los oligonucleótidos mostrados en la Figura 60 por FEN-1 de Pfu (1) o FEN-1 de Mja (2) o las nucleadas quiméricas mostradas en los diagramas de la Figura

130.

La Figura 131B muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los productos producidos mediante escisión de los oligonucleótidos mostrados en la Figura 26 por FEN-1 de Pfu (1) o FEN-1 de Mja (2) o las nucleadas quiméricas mostradas en los diagramas de la Figura 130.

La Figura 132 muestra la imagen generada por un aparato para la formación de imágenes fluorescentes que compara los productos producidos mediante escisión de las estructuras de escisión plegadas por FEN-1 de Pfu (1) o FEN-1 de Mja (2) o las nucleadas quiméricas mostradas en los diagramas de la Figura 130.

Las Figuras 133A-J muestran los resultados de varios ensayos usados para determinar la actividad de Cleavase BN en varias condiciones.

Las Figuras 134A-B, D-F y H-J muestran los resultados de varios ensayos usados para determinar la actividad de TaqDN en varias condiciones.

Las Figuras 135A-B, D-F, H-J muestran los resultados de varios ensayos usados para determinar la actividad de TthDN en varias condiciones.

Las Figuras 136A-B, D-F y H-J muestran los resultados de varios ensayos usados para determinar la actividad de FEN-1 de Pfu en varias condiciones.

Las Figuras 137A-J muestran los resultados de varios ensayos usados para determinar la actividad de FEN-1 de Mja en varias condiciones.

Las Figuras 138A-B, D-F y H-J muestran los resultados de varios ensayos usados para determinar la actividad de FEN-1 de Afu en varias condiciones.

Las Figuras 139A-E y G-I muestran los resultados de varios ensayos usados para determinar la actividad de FEN-1 de Mth en varias condiciones.

La Figura 140 muestra los dos sustratos. El panel A muestra la estructura y la secuencia del sustrato de horquilla (25-65-1) (SEC ID Nº 293), mientras que el Panel B muestra la estructura y la secuencia del sustrato INVASOR (IT) (25-184-5) (SEC ID Nº 294).

La Figura 141A muestra la estructura y la secuencia de oligonucleótidos que forman una estructura de escisión invasiva (203-91-01, SEC ID Nº 403, y el oligonucleótido diana-INVASOR 203-91-04 (SEC ID Nº 404).

La Figura 141B muestra la estructura y la secuencia de oligonucleótidos que forman un sustrato de estructura en X (203-81-02, SEC ID Nº -405 y 594-09-01, SEC ID Nº 406).

La Figura 142 muestra las actividades de las proteínas FEN indicadas en la estructura de escisión invasiva del diagrama de la Figura 141A.

La Figura 143 muestra las actividades de las proteínas FEN indicadas en la estructura en X del diagrama de la Figura 141B.

La Figura 144 muestra un diagrama esquemático de un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 407), oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 408) y el casete FRET (SEC ID Nº 409) para la detección del gen de la polimerasa del citomegalovirus humano.

La Figura 145 proporciona un gráfico de barras que muestra la detección de diferentes números de copias del ADN genómico del citomegalovirus humano.

Las Figuras 146A-J muestran las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para ciertas endonucleasas FEN-1 de la presente invención.

La Figura 147 muestra un diagrama esquemático de una realización de un sistema de detección enzimático de alto rendimiento.

La Figura 148 muestras gráficos que comparan las tasas de escisión observadas usando enzimas modificadas y

oligonucleótidos INVASOR que tiene diferentes extremos 3’.

Descripción de la invención

Introducción

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a procedimientos y composiciones para tratar ácido nucleico y, en particular, a procedimientos y composiciones para la detección y caracterización de secuencias de ácido nucleico y cambios de secuencia.

En realizaciones preferidas, la presente invención se refiere a medios para escindir una estructura de escisión de ácido nucleico de un modo específico de sitio. Aunque la presente invención proporciona diversos agentes de escisión, en algunas realizaciones la presente invención se refiere a una enzima de escisión que tiene actividad nucleasa 5’ sin capacidad sintética de ácido nucleico de interferencia. En otras realizaciones, la presente invención proporciona nuevas polimerasas (p. ej., polimerasas termoestables) que poseen actividades de polimerasa y/o nucleasa alteradas.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona nucleasas 5’ obtenidas de ADN polimerasas termoestables que muestran actividad sintética de ADN alterada con respecto a la de ADN polimerasas termoestables nativas. La actividad nucleasa 5’ de la polimerasa se conserva mientras que la actividad sintética está disminuida o ausente. Tales nucleasas 5’ son capaces de catalizar la escisión con especificidad de estructura de ácidos nucleicos en ausencia de actividad sintética de interferencia. La ausencia de actividad sintética durante una reacción de escisión da como resultado productos de escisión de ácido nucleico de tamaño uniforme.

Las propiedades novedosas de las nucleasas de la invención forman la base de un procedimiento para detectar secuencias de ácido nucleico específicas. Este procedimiento depende de la amplificación de la molécula de detección más que de la amplificación de la propia secuencia diana como lo hacen los procedimientos existentes para detectar secuencias diana específicas.

Las ADN polimerasas (DNAP), tales como las aislados de E. coli o de bacterias termófilas del género Thermus, son enzimas que sintetizan nuevas cadenas de ADN. Varias de las DNAP conocidas contienen actividades nucleasas asociadas además de la actividad sintética de la enzima.

Se conoce que algunas DNAP eliminan nucleótidos de los extremos 5’ y 3’ de cadenas de ADN (Kornberg, ADN

Replication, W. H. Freeman y Co., San Francisco, págs. 127-139 [1980]). Estas actividades nucleasas se denominan habitualmente actividades exonucleasa 5’ y exonucleasa 3’, respectivamente. Por ejemplo, la actividad exonucleasa 5’ localizada en el dominio N-terminal de varias DNAP participa en la eliminación de cebadores de ARN durante la síntesis de cadena rezagada durante la replicación del ADN y la eliminación de nucleótidos dañados durante la reparación. Algunas DNAP, tales como la ADN polimerasa de E. coli (DNAPEcl), también tienen actividad exonucleasa 3’ responsable de la corrección de lectura durante la síntesis de ADN (Kornberg, anteriormente).

Una DNAP aislada de Thermus aquaticus, denominada ADN polimerasa de Taq (DNAPTaq), tiene una actividad

exonucleasa 5’, pero carece de un dominio exonucleolítico 3’ funcional (Tindall y Kunkell, Biochem., 27: 6008

[1988]). Los derivados de DNAPEc1 y DNAPTaq, denominados respectivamente los fragmentos Klenow y Stoffel,

carecen de dominios exonucleasa 5’ como resultado de manipulaciones enzimáticas o genéticas (Brutlag y col.,

Biochem. Biophys. Res. Commun., 37:982 [1969]; Erlich y col., Science 252: 1643 [1991]; Setlow y Kornberg, J. Biol. Chem., 247: 232 [1972]).

La actividad exonucleasa 5’ de DNAPTaq se describió que requería síntesis concurrente (Gelfand, PCR Technology

-: Principles and Applications for ADN Amplification, H. A. Erlich, [Ed.], Stockton Press, New York, p.19 [1989]).

Aunque los mononucleótidos predominan entre los productos de digestión de las exonucleasas 5’ de DNAPTaq y

DNAPEc1, también se pueden observar oligonucleótidos cortos ( 12 nucleótidos) que implican que estas

denominadas exonucleasas 5’ pueden funcionar endonucleolíticamente (Setlow, anteriormente; Holland y col., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276 [1991]).

En el documento WO 92/06200, Gelfand y col. muestran que el sustrato preferido de la actividad exonucleasa 5’ de las ADN polimerasas termoestables es ADN de una sola hebra desplazada. La hidrólisis del enlace fosfodiéster tiene lugar entre el ADN de una sola hebra desplazado y el ADN de doble hélice siendo el sitio de escisión de exonucleasa preferido un enlace fosfodiéster en la región de doble hélice. Por tanto, la actividad exonucleasa 5’ asociada habitualmente a DNAP es una endonucleasa de hélice única dependiente de estructura y se denomina más apropiadamente una nucleasa 5’. Las exonucleasas son enzimas que escinden moléculas de nucleótidos de los extremos de la molécula de ácido nucleico. Por otro lado, las endonucleasas son enzimas que escinden la molécula de ácido nucleico en un sitio interno en vez de en sitios terminales. La actividad nucleasa asociada a algunas ADN

polimerasas termoestables escinde endonucleolíticamente pero esta escisión requiere contacto con el extremo 5’ de la molécula que se está escindiendo. Por lo tanto, estas nucleasas se denominan nucleasas 5’.

Cuando una actividad nucleasa 5’ está asociada a una ADN polimerasa de Tipo A eubacteriana, se observa en el tercio de la región N-terminal de la proteína como un dominio funcional independiente. Los dos tercios C-terminales de la molécula constituyen el dominio de polimerización que es responsable de la síntesis de ADN. Algunas ADN polimerasas de Tipo A también tienen una actividad exonucleasa 3’ asociada la región de dos tercios C-terminales de la molécula.

La actividad exonucleasa 5’ y la actividad de polimerización de DNAP se han separado por escisión proteolítica o manipulación genética de la molécula de polimerasa. El fragmento Klenow o de escisión proteolítica grande de DNAPEc1 contiene la actividad polimerasa y exonucleasa 3’, pero carece de la actividad nucleasa 5’. El fragmento Stoffel de DNAPTaq (DNAPStf) carece de la actividad nucleasa 5’ debido a una manipulación genética que

delecionó los 289 aminoácidos N-terminales de la molécula de polimerasa (Erlich y col., Science 252: 1643 [1991]). El documento WO 92/06200 describe una DNAP termoestable con un nivel alterado de exonucleasa de 5’ a 3’. La Patente de Estados Unidos Nº 5.108.892 describe una DNAP de Thermus aquaticus sin una exonucleasa 5’ a 3’.

Existen ADN polimerasas termoestables con menor cantidad de actividad sintética ((Third Wave Technologies, Madison, WI) y se describen en las patentes de EE.UU. nº 5.541.311. 5.614.402. 5.795.763.5.691.142. and 5.837.450). La presente invención se refiere a nucleasas 5’ obtenidas de ADN polimerasas de Tipo A termoestables que conservan actividad nucleasa 5’ pero tienen actividad sintética reducida o ausente. La capacidad de desacoplar la actividad sintética de la enzima de la actividad nucleasa 5’ prueba que la actividad nucleasa 5’ no requiere síntesis

de ADN concurrente como se describió previamente (Gelfand, PCR Technology, anteriormente).

Además de los dominios de exonucleasa 5’ de las proteínas de ADN polimerasa I de eubacterias descritas anteriormente se han encontrado nucleadas 5’ asociadas con bacteriófagos, eucariotas y arqueobacterias. En general, todas las enzimas de esta familia muestran especificidades de sustrato muy similares, a pesar de su nivel limitado de similitud de secuencia. En consecuencias, se pueden aislar enzimas adecuadas para usar en los procedimientos de la presente invención o se pueden obtener de una amplia gama de fuentes.

Hace casi 30 años se aisló una enzima de mamífero con una simiitud funcional al dominio de la 5’-exonucleasa de la Pol I de E. coli (Lindahl, y col., Proc Natl Acad Sci U S A 62(2): 597-603 [1969]). Más tarde, se demostró que miembros adicionales de este grupo de enzimas denominadas endonucleasas de ala (FEN1) de Eukarya and Archaea poseían una actividad específica de estructura casi identical (Harrington y Lieber. Embo J 13(5), 1235-46 [1994]; Murante y col., J Biol Chem 269(2), 1191-6 [1994]; Robins, y col., J Biol Chem 269(46), 28535-8 [1994]; Hosfield, y col., J Biol Chem 273(42), 27154-61 [1998]), a pesar de la limitada siimilitud de secuencia. Se han estudiado las especificidades de sustrato de las enzimas FEN1 y las enzimas eubacterianas y de bacteriófagos relacionadas y se ha encontrado que son similares para todas las enzimas (Lyamichev, y col., Science 260(5109), 778-83 [1993], Harrington y Lieber, anteriormente, Murante, y col., anteriormente, Hosfield, et al, anteriormente, Rao, y col., J Bacteriol 180(20), 5406-12 [1998], Bhagwat, y col., J. Biol Chem 272(45), 28523-30 [1997], Garforth y Sayers, Nucleic Acids Res 25(19), 3801-7 [1997]).

Usando sustratos preformados, muchos de los estudios citados anteriormente determinaron que estas nucleadas dejan un hueco tras la escisión, lo que conduce a los autores a especular que la ADN polimerasa debe actuar para llenar dicho hueco y generar un corte ligable. Se ha demostrado que una serie de otras 5’-nucleasas dejan un hueco

o superposición tras la escisión de los mismos sustratos de ala o similares. Desde entondes se ha determinado que todas las 5’ exonucleasas específicas de estructura dejan un corte tras la escisión si el sustrato tiene una superposición entre los dúplex cadena arriba y cadena abajo (Kaiser y col., J. Biol Chem. 274(30):21387-21394 [1999]). Aunque los dúplex que tienen varias bases de secuencia solapante pueden asumir varias conformaciones diferentes mediante migración de rama, se determinó que la escisión se produce en la conformación en la que el

último nucleótido en el extremo 3’ de la hebra cadena arriba está desemparejado, siendo la tasa de escisión

esencialmente la misma sea el extremo del cebador cadena arriba A, C, G o T. Se determinó un solapamiento

posicional entre el extremo 3’ del cebador cadena arriba y el dúplex cadena abajo, en lugar del solapamiento de la

secuencia, requerido para una escisión óptimca. Además de permitir que estas enzimas dejen un corte tras la escisión, la única base del solapamiento hace que las enzimas escindan varias órdenes de magnitud más rápido que cuando un sustrato carece de solapamiento (Kaiser y col., anteriormente).

Cualquiera de las nucleadas 5’ descritas anteriormente puede encontrar aplicación en una o más realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento. Las nucleadas FEN1 de utilidad concreta en los procedimientos de la presente invención incluyen, entre otras, las de Methanococcus jannaschii y Methanobacterium thermoautotrophicum; enzimas FEN1 particularmente preferidas son de Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Archaeoglobus veneficus, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix.

La invención se define en las reivindicaciones.

La descripción detallada de la invención se presenta en las secciones siguientes:

I. Detección de Secuencias de Ácido Nucleico Específicas Usando Nucleasas 5’ en un ensayo de escisión dirigida por INVASOR;

II. Efecto de oligonucleótidos de DETENCIÓN sobre la señal y el fondo en reacciones de escisión invasiva secuencial.

III. Mejora de Señal por incorporación de los productos de una reacción de escisión invasiva en una posterior reacción de escisión invasiva;

IV.: Fraccionamiento de ácidos nucleicos específicos por inversión de carga selectiva;

V.: Mejora de Señal por Prolongación de Productos de Reacción En El Ensayo de Escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR;

VI Mejora de señal por finalización de un sitio de union a proteína activado

VII. Generación de Nucleasas 5’ Obtenidas de ADN Polimerasas Termoestables;

VIII. Enzimas mejoradas para uso en reacciones de escisión dirigidas por oligonucleótido INVASOR;

IX.: Ensayo INVASOR pada detección directa y medición de analitos específicos.

X.: Kits

I. Detección de Secuencias de Ácido Nucleico Específicas Usando Nucleasas 5’ en un ensayo de escisión dirigida por INVASOR

1. Diseño De la reacción de ensayo INVASOR

La presente invención proporciona medios para formar una estructura de escisión de ácido nucleico que depende de la presencia de un ácido nucleico diana y la escisión de la estructura de escisión de ácido nucleico para liberar diferentes productos de escisión. La actividad nucleasa 5’ se usa para escindir la estructura de escisión dependiente de diana y los productos de escisión resultantes son indicativos de la presencia de secuencias de ácido nucleico diana en la muestra. Cuando deshebras de ácido nucleico, u oligonucleótidos, hibridan con una hebra de ácido nucleico diana de un modo tal que forman una estructura de escisión invasiva solapanta, como redescribe más adelante, se puede producir una escisión invasiva. A través de la interacción de un agente de escisión (p. ej., una

nucleasa 5’) y el oligonucleótidos cadena arriba, se puede hacer que el agente de escisión escinda el

oligonucleótidos cadena abajo en un sitio interno de un modo tal que se produce un fragmento distintivo. Dichas realizaciones se han denominado ensayo INVASOR (Third Wave Technologies) y se describen en las solicitudes de patente nº 5.846.717. 5.985.557. 5.994.069. 6.001.567 y 6.090.543 y las publicaciones PCT WO 97/27214 y WO 98/42873.

La presente invención proporciona además ensayos en los que el ácido nucleico diana se reutiliza o recicla durante múltiples rondas de hibridación con sondas oligonucleotídicas y escisión sin necesidad de usar ciclado de temperatura (es decir, para desnaturalización periódica de cadenas de ácido nucleico diana) o síntesis de ácido nucleico (es decir, para el desplazamiento basado en polimerización de las hebras de ácido nucleico sonda). Cuando una reacción de escisión se realiza en condiciones en las que las sondas se sustituyen continuamente en la hebra diana (p. ej., mediante desplazamiento sonda-sonda o mediante un equilibrio entre asociación sonda/diana y disociación o mediante una combinación que comprende estos mecanismos [The kinetics of oligonucleotide replacement. Luis P. Reynaldo, Alexander V. Vologodskii, Bruce P. Neri and Victor I. Lyamichev. J. Mol. Biol. 97: 511-520 (2000)], múltiples sondas pueden hibridar con la misma diana, lo que permite multiples escisiones, y la generación de múltiples productos de escisión.

Por extensión de su complementariedad con una hebra de ácido nucleico diana, se puede decir que un oligonucleótidos define una región específica de dicha diana. En una estructura de escisión invasiva, los dos oligonucleótidos definen e hibridan con dos regiones de la diana que están adyacentes entre sí (es decir, regiones sin ninguna región adicional de la diana entre ellos). Cualquiera o ambos oligonucleótidos pueden comprender partes adicionales que no son complementarias con la hebra diana. Además de hibridar de forma adyacente, con el fin de formar una estructura de escisión invasiva, el extremo 3’ del oligonucleótidos cadena arriba debe comprender un resto adicional. Cuando ambos oligonucleótidos hibridan con una hebra diana para formar una estructura y dicho retso en 3’ está presente en el oligonucleótidos cadena arriba dentro de la estructura, se puede decir que los oligonucleótidos solapan y la estructura puede describirse como una estructura solapante o de escisión invasiva.

En una realización, el resto en 3’ de la estructura de escisión invasiva es un único nucleótido. En esta realización, el resto en 3’ puede ser cualquier nucleótido (es decir, puede ser, pero no tiene que ser complementario a la hebra diana). En una realización preferida, el resto en 3’ es un único nucleótido que no es complementario con la hebra diana. En otra realización, el resto en 3’ es un compuesto similar a nucleótido (es decir, un resto que tiene características químicas similares a un nucleótido, tal como un análogo nucleotídico o un compuesto de anillo orgánico; véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.985.557). En otra realización más, el resto en 3’ es uno o más nucleótidos que suplican en secuencia uno o más nucleótidos presentes en el extremo 5’ de la región hibridada del oligonucleótidos cadena abajo. En una realización adicional, a la secuencia duplicada de nucleótidos del resto 3’ le sigue un único nucleótido que no es más duplicado de la secuencia oligonucleotídica cadena abajo y que puede ser cualquier otro nucleótido. En otra realización más, a la secuencia duplicada de nucleótidos del resto en 3’ le sigue un compuesto similar a nucleótido, como se ha descrito anteriormente.

El oligonucleótido cadena abajo puede tener, pero no es necesario, restos adicionales unidos a cualquier extremo de la región que hibrida con la hebra de ácido nucleico diana. En una realización preferida, el oligonucleótido cadena abajo comprende un resto en su extremo 5’ (es decir, un resto en 5’). En una realización particularmente preferida, dicho resto en 5’ es un ala o brazo en 5’ que comprende una secuencia de nucleótidos que no es complementaria de

la hebra de ácido nucleico diana.

Cuando se forma una estructura de escisión solapante, puede ser reconocida y escindida por una nucleasa que es específica de esta estructura (es decir, una nucleasa que escindirá uno o más de los ácidos nucleicos en la estructura solapante basada en el reconocimiento de esta estructura, en lugar de en el reconocimiento de una secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos que forman la estructura). Dicha nucleasa se puede denominar “nucleasa específica de estructura”. En algunas realizaciones, la nucleasa específica de estructura es una nucleasa en 5’. En una realización preferida, la nucleasa específica de estructura es la nucleasa en 5’ de una ADN polimerasa. En otra realización preferida, la ADN polimerasa que tiene la nucleasa 5’ tiene una síntesis deficiente. En otra realización preferida, la nucleasa 5’ es una endonucleasa FEN-1. En una realización particularmente preferida, la nucleasa 5’ es termoestable.

En algunas realizaciones, dicha nucleasa con especificidad de estructura escinde, preferentemente, el oligonucleótido cadena abajo. En una realización preferida, el oligonucleótido cadena abajo es escindido un nucleótido en el extremo 5’ de la región que hibrida con la diana dentro de la estructura solapante. La escisión de la estructura solapante en cualquier localización por una nucleasa con especificidad de estructura produce una o más partes o fragmentos liberados de ácido nucleico, denominados “productos de escisión”.

En algunas realizaciones, la escisión de una estructura solapante se realiza en condiciones en las que uno o más de los ácidos nucleicos de la estructura se puedan disociar (es decir, se deshibridan o funden) de la estructura. En una realización, la disociación completa o parcial de una primera estructura de escisión permite que el ácido nucleico diana participe en la formación de una o más estructuras de escisión solapantes adicionales. En una realización preferida, la primera estructura de escisión está parcialmente disociada. En una realización particularmente preferida, solo el oligonucleótidos que se escinde se disocia de la primera estructura de escisión de modo que pueda ser sustituida por otra copia del mismo oligonucleótidos. En algunas realizaciones, dicha disociación se induce mediante un incremento de la temperatura, de modo que uno o más oligonucleótidos ya no pueden hibridar con la hebra diana. En otras realizaciones, dicha disociación se produce porque la escisión de un oligonucleótidos produce solo productos de escisión que no se pueden unir a la hebra diana en las condiciones de la reacción. En una realización preferida, se seleccionan condiciones en las que un oligonucleótido se puede asociar con (es decir hibridar) y disociar de una hebra diana con independencia de la escisión y en las que el oligonucleótido puede escindirse cuando se hibrida con la diana como parte de una estructura de escisión solapante. En una realización particularmente preferida, se seleccionan condiciones en las que el número de copias del oligonucleótido que se puede escindir cuando parte de una estructura solapante supera el número de copias de la hebra de ácido nucleico diana en una cantidad suficiente que cuando la primera estructura de escisión se disocia, la probabilidad de que la hebra diana se asocie con una copia intacta del oligonucleótido es mayor que la probabilidad de que se asocie con una copia escindida del oligonucleótido.

En algunas realizaciones, la escisión se realiza mediante una nucleasa específica de estructura que puede reconocer y escindir estructuras que tienen un solapamiento. En una realización preferida, la escisión se realiza mediante una nucleasa específica de estructura que tenga una tasa de escisión de estructuras de ácido nucleico que no comprenden un solapamiento menor que la tasa de escisión de estructuras que comprenden un solapamiento. En una realización particularmente preferida, la escisión se realiza mediante una nucleasa específica de estructura que tenga una tasa de escisión de estructuras de ácido nucleico que no comprenden un solapamiento menor del 1 % de la tasa de escisión de estructuras que comprenden un solapamiento.

En algunas realizaciones, es deseable detectar la escisión de la estructura de escisión solapante. La detección se puede realizar mediante análisis de los productos de escisión o mediante análisis de uno o más ácidos nucleicos restantes no escindidos. Por comodidad, la discusión siguiente se referirá al análisis de productos de escisión, pero los expertos en la técnica apreciarán que estos procedimientos se pueden aplicar tan fácilmente al análisis de los ácidos nucleicos sin escindir en una reacción de escisión invasiva. Cualquier procedimiento conocido en la técnica para el análisis de ácidos nucleicos, fragmentos de ácido nucleico u oligonucleótidos se puede aplicar a la detección de productos de escisión.

En una realización, los productos de escisión se pueden identificar por el contenido químico, por ejemplo las cantidades relativas de cada átomo, cada tipo concreto de grupo reactivo o cada base nucleotídica (Chargaff y col.,

J. Biol. Chem. 177: 405 [1949]) que contienen. De este modo, un producto de escisión se puede distinguir de un ácido nucleico más largo del que se liberó mediante escisión o de otros ácidos nucleicos.

En otra realización, los productos de escisión se pueden distinguir por una característica física concreta, incluidas, entre otras, la longitud, la masa, la carga o la proporción carga-masa. En otra realización más, el producto escisión se puede distinguir por un comportamiento que está relacionado con una característica física, incluidos, entre otros, la velocidad de rotación en solución, la velocidad de migración durante la electroforesis, el coeficiente de sedimentación en centrifugación, el tiempo de vuelo en la espectrometría de masas MALDI-TOFF, la velocidad de migración u otro comportamiento en la cromatografía, la temperatura de fusión de un ácido nucleico complementario

o la capacidad de precipitar en solución.

La detección de los productos de escisión se puede realizar mediante la liberación de un marcador. Dichos marcadores pueden incluir, entre otros, uno o más de cualquier pigmento, radiomarcadors tales como 32P o 35S, restos de unión tales como biotina, marcas de masa, tales como iones metálicos o grupos químicos, marcas de carga, tales como poliaminas o pigmentos cargados, haptenos tales como digoxgenina, restos luminogénicos, fosforescentes o fluorogénicos, y pigmentos fluorescentes, bien solos o en combinación con restos que pueden suprimir o desplazar el espectro de emisión, tal como resonancia de fluorescencia por transferencia de energía (FRET) o fluorescencia por colisión con transferencia de energía.

En algunas realizaciones, el análisis de los productos de escisión puede incluir resolución o separación física, por ejemplo mediante electroforesis, hibridación o unión selectiva a un soporte, o mediante procedimientos de espectrometría de masas tales como MALDI-TOFF. En tras realizaciones, el análisis se puede realizar sin ninguna resolución o separación física, tal como mediante detección de cambios inducidos por escisión en fluorescencia, como en análisis basado en FRET o mediante cambios inducidos por escisión en la velocidad de rotación de un ácido nucleico en solución como en el análisis de polarización de fluorescencia.

Los productos de escisión s epueden usar después en cualquier reacción o procedimiento de lectura que pueda usar oligonucleótidos. Dichas reacciones incluyen, entre otras, reacciones de modificación, tales como ligación, prolongación con una ácido nucleico polimerasa independiente de molde y extensión de cebador con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde. La modificación de los productos de escisión se puede realizar con los fines de, incluidos, entre otros, adición de uno o más marcadores o restos de unión, alteración d ela masa, adición de secuencias específicas o para cualquier otro fin que facilitaría el análisis de los productos de escisión o el análisis de cualquier otro subproducto, resultado o consecuencia de la reacción de escisión.

El análisis de los productos de escisión puede implicar etapas o reacciones posteriores que no modifican los propios productos de escisión. Por ejemplo, los productos de escisión se pueden usar para completar una estructura funcional, tal como un promotor competente para la transcripción in Vitro u otro sitio de unión a proteínas, El análisis puede incluir la etapa de usar la estructura completada por o para realizar su función. También se pueden usar uno

o más productos de escisión para completar una estructura de escisión solapante, de modo que permite una reacción de escisión posterior cuyos productos se pueden detectar o usar por cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, incluida la participación en reacciones de escisión posteriores.

Ciertas realizaciones preferidas de las reacciones de escisión invasivas se proporcionan en las descripciones siguientes. Como se ilustra en el diagrama de la Figura 29, los procedimientos de la presente invención emplean al menos un par de oligonucleótidos que interaccionan con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión para una nucleasa específica de estructura. En algunas realizaciones, la estructura de escisión comprende i) un ácido nucleico diana que puede ser monocatenario o bicatenario (cuando se emplea un ácido nucleico diana bicatenario, se puede convertir en monocatenario, por ejemplo, mediante calentamiento); ii) un primer

oligonucleótido, denominado la “sonda”, que define una primera región de la secuencia de ácido nucleico diana

siendo el complemento de esa región (regiones X y Z de la diana como se muestra en la Fig. 29); iii) un segundo oligonucleótido, denominado el “INVASOR”, cuya parte 5’ define una segunda región de la misma secuencia de ácido nucleico diana (regiones Y y X en la Fig. 29), adyacente a y cadena abajo de la primera región diana (regiones X y Z) y cuya segunda parte se solapa en la región definida por el primer oligonucleótido (la región X representa la región de solapamiento). La estructura resultante se representa en la Fig. 29.

Aunque no limita la invención o la presente discusión a ningún mecanismo de acción particular, el diagrama en la Fig. 29 representa el efecto del sitio de escisión provocado por este tipo de disposición de un par de oligonucleótidos. El diseño de un par de oligonucleótidos de este tipo se describe con más detalle más adelante. En la Fig. 29, los extremos 3’ de los ácidos nucleicos (es decir, la diana y los oligonucleótidos) se indican mediante el uso de las puntas de flecha en los extremos de las líneas que representan las cadenas de los ácidos nucleicos (y, donde lo permite el espacio, estos extremos también se marcan con “3’”). Se entiende fácilmente que los dos oligonucleótidos (el INVASOR y la sonda) se disponen en una orientación paralela relativa entre sí, mientras que la cadena de ácido nucleico diana se dispone en una orientación antiparalela con respecto a los dos oligonucleótidos. Además, es evidente que el oligonucleótido INVASOR se localiza cadena arriba del oligonucleótido sonda y que, con respecto a la cadena de ácido nucleico diana, la región Z está cadena arriba de la región X y la región X está cadena arriba de la Y (es decir, la región Y está cadena abajo de la región X y la región X está cadena abajo de la región Z). Las regiones de complementariedad entre las cadena opuestas se indican por las líneas verticales cortas. Aunque no se pretende indicar la ubicación precisa del sitio o los sitios de escisión, el área al que se desplaza el sitio de escisión dentro del oligonucleótido sonda por la presencia del oligonucleótido invasor se indica por la punta de flecha vertical rellena. Una representación alternativa de la estructura de escisión de diana/INVASOR/sonda se muestra en la Fig. 32C. Ningún diagrama (es decir, la Fig. 29 o la Fig. 32C) pretende representar el mecanismo de acción real o disposición física de la estructura de escisión y, además, no se pretende que el procedimiento de la presente invención se limite a ningún mecanismo de acción particular.

Se puede considerar que la unión de estos oligonucleótidos en esta realización divide el ácido nucleico diana en tres regiones distintas: una región que tiene complementariedad solamente con la sonda (mostrada como “Z”); una región que tiene complementariedad solamente con el INVASOR (mostrado como “Y”); y una región que tiene complementariedad con ambos nucleótidos (mostrado como “X”). Como se ha tratado anteriormente, en algunas realizaciones preferidas de la presente invención, el solapamiento puede comprender restos distintos de las bases complementarias solapantes. Por tanto, en algunas realizaciones, la región mostrada como “X” puede representar una región en la que hay un solapamiento físico, pero no una secuencia, entre los oligonucleótidos INVASOR y sonda, es decir, en estas últimas realizaciones no hay una región del ácido nucleico diana entre las regiones "Z" e “Y” que tenga complementariedad con ambos nucleótidos.

a) Diseño del oligonucleótido

El diseño de estos oligonucleótidos (es decir, el INVASOR y la sonda) se consigue usando prácticas que son convencionales en la técnica. Por ejemplo, generalmente se evitan las secuencias que tienen auto complementariedad, de tal forma que los oligonucleótidos resultantes se plegarían sobre sí mismos o hibridarían entre sí a costa de unirse al ácido nucleico diana.

Una consideración para la selección de una longitud para estos oligonucleótidos es la complejidad de la muestra que contiene el ácido nucleico diana. Por ejemplo, el genoma humano tiene aproximadamente 3 x 109 pares de bases de longitud. Cualquier secuencia de 10 nucleótidos se presentará con una frecuencia de 1:410 o 1:1048.576 en una serie aleatoria de nucleótidos, que estarían aproximadamente 2.861 veces en 3 mil millones de pares de bases. Claramente, un oligonucleótido de esta longitud tendría una peor posibilidad de unirse de forma única a una región de 10 nucleótidos dentro de una diana que tiene una secuencia con el tamaño del genoma humano. Si la secuencia diana estuviera dentro un plásmido de 3 kb, sin embargo, un oligonucleótido de este tipo podría tener una probabilidad muy razonable de unirse de forma única. Mediante este mismo cálculo se puede observar que un oligonucleótido de 16 nucleótidos (es decir, un oligómero de 16 unidades) es la longitud mínima de una secuencia que probablemente aparecerá matemáticamente una vez en 3 x 109 pares de bases. Asimismo, se puede proporcionar este nivel de especificidad mediante dos o más oligonucleótidos más cortos si están configurados para unirse de un modo cooperativo (es decir, de un modo tal que puedan producir únicamente el complejo previsto si ambos o todos están unidos a sus secuencias diana previstas), en el que la combinación de los oligonucleótidos cortos proporciona la especificidad deseada. En una de estas realizaciones, la cooperatividad entre los oligonucleótidos más cortos es mediante efecto de apilamiento coaxial que se puede producir cuando los oligonucleótidos hibridan en sitios adyacentes sobre un ácido nucleico diana. En otra realización, los oligonucleótidos más cortos están conectados entre sí, bien directamente o bien mediante una o más regiones espaciadoras. Los oligonucleótidos más cortos conectados de este modo se pueden unir a regiones distales de la diana y se pueden usar para atravesar las regiones de la estructura secundaria en una diana. Ejemplos de dichos oligonucleótidos puente se describen en la publicación PCR WO 98/50403, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad.

Una segunda consideración para la selección de la longitud de oligonucleótido es el intervalo de temperaturas en el que se espera que funcionen los oligonucleótidos. Un oligómero de 16 unidades con un contenido de bases promedio (50% de pares de bases G-C) tendrá una Tf calculada (la temperatura a la que se disocia el 50% de la secuencia) de aproximadamente 41ºC, dependiendo de, entre otras cosas, la concentración del oligonucleótido y su diana, el contenido en sales de la reacción y el orden preciso de los nucleótidos. Como un aspecto práctico, se seleccionan habitualmente oligonucleótidos más largos para mejorar la especificidad de hibridación. Los oligonucleótidos de 20 a 25 nucleótidos de longitud se usan a menudo ya que tienen una alta probabilidad de ser específicos si se usan en reacciones realizadas a temperaturas que están próximas a sus Tf (dentro de aproximadamente 5º de la Tf). Además, con Tf calculadas en el intervalo de 50º a 70ºC, tales oligonucleótidos (es decir, oligómeros de 20 a 25 unidades) se usan de forma apropiada en reacciones catalizadas por enzimas termoestables, que muestran a menudo actividad óptima cerca de este intervalo de temperaturas.

La longitud máxima del oligonucleótido seleccionado también se basa en la especificidad deseada.. Se tiene que evitar seleccionar secuencias que sean tan largas que presenten un alto riesgo de unirse de forma estable a complementos parciales o que no se puedan desalojar de forma sencilla cuando se desee (por ejemplo, fallo en la disociación de la diana una vez que ha tenido lugar la escisión o fallo en la disociación a una temperatura de reacción adecuada para las enzimas y otros materiales en la reacción).

La primera etapa de diseño y selección de los oligonucleótidos para la escisión dirigida por INVASOR está de acuerdo con estos principios generales de muestra. Considerados como sondas específicas de secuencia de forma individual, cada oligonucleótido puede seleccionarse de acuerdo con las directrices que se han indicado anteriormente. Es decir, cada oligonucleótido generalmente será lo suficientemente largo para esperar de forma razonable que hibridará solamente con la secuencia diana pretendida dentro de una muestra compleja, habitualmente en el intervalo de 20 a 40 nucleótidos. Como alternativa, ya que el ensayo de escisión dirigida por INVASOR depende de la acción concertada de estos oligonucleótidos, la longitud compuesta de los 2 oligonucleótidos abarcará/se unirá a las regiones X, Y, Z se puede seleccionar para que entre dentro de este intervalo, estando cada uno de los oligonucleótidos individuales en aproximadamente el intervalo de 13 a 17 nucleótidos. Se puede emplear un diseño de este tipo si se emplearon medios de escisión no termoestables en la reacción, requiriendo que las reacciones se realicen a una temperatura inferior a la usada cuando se emplean medios de escisión termoestables. En algunos casos, puede ser deseable tener estos oligonucleótidos unidos múltiples veces dentro de un ácido nucleico diana (por ejemplo, que se unen a múltiples variantes o múltiples secuencias similares dentro de una diana). No se pretende que el procedimiento de la presente invención esté limitado a ningún tamaño particular de la sonda u oligonucleótido INVASOR.

La segunda etapa para diseñar un par de oligonucleótidos para este ensayo es seleccionar el grado al que la

secuencia de oligonucleótido “INVASOR” cadena arriba se solapará en la secuencia de oligonucleótido “sonda”

cadena abajo y, en consecuencia, los tamaños hasta los que se escindirá la sonda. Una característica clave de este

ensayo es que el oligonucleótido sonda se puede preparar para “renovarse”, es decir, la sonda escindida se puede

preparar para apartarse para permitir la unión y escisión de otras copias de la molécula sonda, sin los requerimientos de desnaturalización térmica o desplazamiento por polimerización. Aunque en una realización de este ensayo se puede facilitar la renovación de la sonda mediante una digestión exonucleolítica por el agente de escisión, es básico para la presente invención que la renovación no requiera esta actividad exonucleolítica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se seleccionan una temperatura de reacción y las condiciones de reacción para crear un equilibrio en el que la sonda hibride y se disocie de la diana. En otras realizaciones, la temperatura de reacción y las condiciones de reacción se seleccionan de forma que la sonda sin unir pueda iniciar la unión a la hebra diana y desplazar físicamente la sonda unida. En otras realizaciones más, la temperatura y las condiciones de reacción se seleccionan de forma que cualquiera o ambos mecanismos de la sustitución de la sonda se pueden producir en cualquier proporción. El procedimiento de la presente invención no está limitado a cualquier mecanismo concreto de sustitución de la sonda. Por cualquier mecanismo, cuando la sonda está unida a la diana para formar una estructura de escisión, se puede producir la escisión. El ciclado continuo de la sonda de forma intermitente de la diana permite que múltiples sondas se unan y se escindan para cada copia de un ácido nucleico diana.

i) Selección de la cantidad de solapamiento de secuencia

Un modo de conseguir una renovación de este tipo, en el que el oligonucleótido INVASOR y el oligonucleótido sonda comparten una región de complementariedad, se puede prever considerando el diagrama en la Fig. 29. Se puede observar que la Tf de cada oligonucleótido será una función de la longitud completa de ese oligonucleótido: es decir, la Tf del INVASOR = Tf(Y + X) y la Tf de la sonda = Tf (X+Y) para la sonda. Cuando la sonda se escinde, la región X se libera, dejando la sección Z. Si la Tf de Z es menor que la temperatura de reacción y la temperatura de reacción es menor que Tf (X+Z), entonces la escisión de la sonda conducirá al alejamiento de Z, permitiendo de este modo que hibride un nuevo (X + Z). Se puede observar a partir de este ejemplo que la región X tiene que ser lo suficientemente larga para que la liberación de X haga caer la Tf de la sección de sonda remanente por debajo de la temperatura de reacción: una sección X rica en G-C puede ser mucho más corta que una sección X rica en A-T y todavía consigue este cambio de estabilidad.

En otras realizaciones descritas en el presente documento, la renovación de la sonda no está relacionada con un cambio en la Tf producida por la escisión de la sonda, sino que está relacionado con el comportamiento de asociación y disociación de la sonda en las condiciones seleccionadas, con independencia de la escisión. Por tanto, no se pretende que la presente invención se limite al uso de sondas que, tras la escisión, den productos que tengan Tf inferiores a la temperatura de reacción, como se ha descrito anteriormente.

ii) Solapamientos que no son de secuencias

Se ha determinado que la relación entre el extremo 3’ del oligonucleótido cadena arriba y el sitio de escisión

deseado en la sonda se tienen que diseñar de forma cuidadosa. Se conoce que el sitio de escisión preferido para los tipos de endonucleasas con especificidad de estructura empleadas en este documento es un par de bases en un dúplex (Lyamichev y col., anteriormente). Anteriormente se creía que la presencia de un oligonucleótido cadena arriba o cebador permitía que el sitio de escisión se desplazara de este sitio preferido, a la región monocatenaria del brazo 5’ (Lyamichev y col., anteriormente y la Patente de Estados Unidos Nº 5.422.253). En contraste con este mecanismo propuesto previamente y aunque no limita la presente invención a ningún mecanismo particular, se cree

que el nucleótido inmediatamente 5’ o cadena arriba del sitio de escisión en la sonda (incluyendo minisonda y

sondas de longitud intermedia) tiene que ser capaz de tener apareamiento de bases con la diana para que tenga lugar la escisión eficaz. En el caso de la presente invención, esto sería el nucleótido en la secuencia de sonda inmediatamente cadena arriba del sitio de escisión pretendido. Además, como se describe en el presente documento, se ha observado que para dirigir la escisión al mismo sitio en la sonda, el oligonucleótido cadena arriba

tiene que tener su base 3’ (es decir, nucleótido) inmediatamente cadena arriba del sitio de escisión pretendido de la

sonda. En las realizaciones en las que los oligonucleótidos INVASOR y sonda comparten un solapamiento de

secuencia, esto coloca el nucleótido 3’ terminal del oligonucleótido cadena arriba y la base del oligonucleótido sonda 5’ del sitio de escisión compitiendo por emparejamiento con el correspondiente nucleótido de la cadena diana.

Para examinar el resultado de esta competencia (es decir, qué base se empareja durante un acontecimiento de escisión exitoso) se realizaron sustituciones en los oligonucleótidos sonda e INVASOR de tal forma que bien el oligonucleótido sonda o el INVASOR se aparearon erróneamente con la secuencia diana en esta posición. Se examinaron los efectos de ambas disposiciones sobre las velocidades de escisión. Cuando el oligonucleótido INVASOR está desemparejado en el extremo 3’, la velocidad de escisión no se redujo. Sin embargo, si se retiraba esta base, el sitio de escisión se desplazaba cadena arriba del sitio pretendido. Por el contrario, si el oligonucleótido sonda no tenía emparejamiento de bases con la diana justo cadena arriba del sitio al que el oligonucleótido INVASOR estaba dirigiendo la escisión, la velocidad de escisión disminuyó espectacularmente, sugiriendo que cuando existe una competencia, el oligonucleótido sonda era la molécula a tener emparejamiento de bases en esa posición.

Parece que el extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR cadena arriba está desemparejado durante la escisión y todavía se requiere para la colocación precisa de la escisión. Para examinar qué parte o partes del nucleótido 3’ terminal se requieren para la colocación de la escisión se diseñaron oligonucleótidos INVASOR que terminaban en este extremo con nucleótidos que estaban alterados de una diversidad de modos. Los azúcares examinados incluyeron 2’ desoxirribosa con un grupo fosfato 3’, una didesoxirribosa, 3’ desoxirribosa, 2’ O-metilribosa, arabinosa y arabinosa con un fosfato 3’. Se ensayaron ribosa abásica, con y sin fosfato 3’. Se ensayaron bases “universales”

sintéticas tales como 3-nitropirrol y 5-3-nitroindol en azúcares de ribosa. Finalmente, se ensayó una estructura de anillo aromático similar a base, acridina, unida al extremo 3’ del anterior nucleótido sin un grupo de azúcar. Los resultados obtenidos reforzaron la conclusión de que el anillo aromático de la base (en el extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR) es el resto requerido para conseguir la dirección de la escisión al sitio deseado dentro de la sonda cadena abajo. El resto en el extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR no tiene que ser una base complementaria al ácido nucleico diana.

iii) Minisondas y Sondas De Longitud Intermedia;

Como se ha discutido anteriormente, el ensayo de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR se puede realizar usando oligonucleótidos INVASOR y sonda que tienen una longitud de aproximadamente 13-25 nucleótidos (típicamente 20-25 nucleótidos). También se considera que los oligonucleótidos pueden estar compuestos por sí mismos por secuencias oligonucleotídicas más cortas que se alinean a lo largo de una cadena diana pero que no están covalentemente unidas. Esto quiere decir que hay un corte en la estructura principal de fosfato-azúcar del oligonucleótido compuesto, pero que no hay alteración en el progreso de nucleótidos con bases emparejadas en el dúplex resultante. Cuando cadenas cortas de ácido nucleico se alinean de forma contigua a lo largo de una cadena más larga, la hibridación de cada una se estabiliza mediante la hibridación de los fragmentos adyacentes debido a que los pares de bases se pueden apilar a lo largo de la hélice ya que, de hecho, la estructura principal no estaba interrumpida. Esta cooperatividad de unión puede dar a cada segmento una estabilidad de interacción superior a lo que se esperaría para el segmento que hibrida con el ácido nucleico más largo solo. Una aplicación de esta observación ha sido ensamblar cebadores para secuenciación de ADN, típicamente de aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, de conjuntos de oligonucleótidos de tres hexámeros que se diseñan para hibridar de este modo (Kotler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4241 [1993]). El cebador resultante con doble corte se puede extender enzimáticamente en reacciones realizadas a temperaturas que se puede esperar que alteren la hibridación de hexámeros, pero no de oligómeros de 18 unidades.

El uso de oligonucleótidos compuestos o discontinuos se aplica con éxito en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR. Por ejemplo, el oligonucleótido sonda se puede dividir en dos oligonucleótidos que hibridan de un modo contiguo y adyacente a lo largo de un oligonucleótido diana como se ilustra en la Fig. 57. En esta figura, el oligonucleótido cadena abajo (análogo a la sonda de la Fig. 25) está compuesto por dos piezas más pequeñas: un segmento corto de 6-10 nucleótidos (denominado la “minisonda”), que se tiene que escindir a lo largo de la reacción de detección y un oligonucleótido que hibrida inmediatamente cadena debajo de la minisonda (denominado el “apilador”), que sirve para estabilizar la hibridación de la sonda. Para formar la estructura de escisión se proporciona un oligonucleótido cadena arriba (el oligonucleótido INVASOR) para dirigir la actividad de escisión a la región deseada de la minisonda. El ensamblaje de la sonda por piezas no ligadas de ácido nucleico (es decir, la minisonda y el apilador) permite que regiones de secuencias cambien sin requerir la re-síntesis de toda la secuencia sondada, mejorando de este modo el coste y la flexibilidad del sistema de detección. Además, el uso de oligonucleótidos compuestos no unidos hace que el sistema sea más riguroso en su requerimiento de hibridación perfectamente coincidente para conseguir generación de señal, permitiendo que esto se use como un medio sensible para detectar mutaciones o cambios en las secuencias de ácido nucleico diana.

Como se ilustra en la Figura 57, en una realización, los procedimientos de la presente invención emplean al menos un par de oligonucleótidos que interaccionan con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión para una nucleasa específica de estructura. Más específicamente, la estructura de escisión comprende i) un ácido nucleico diana que puede ser monocatenario o bicatenario (cuando se emplea un ácido nucleico diana bicatenario, se puede convertir en monocatenario, por ejemplo, mediante calentamiento); ii) un primer oligonucleótido,

denominado el “apilador”, que define una primera región de la secuencia de ácido nucleico diana siendo el

complemento de esa región (región W de la diana como se muestra en la Fig. 57); iii) un segundo oligonucleótido,

denominado la “minisonda”, que define una segunda región de la secuencia de ácido nucleico diana siendo el

complemento de dicha región (regiones X y Z de la diana como se muestra en la Fig. 57); iv) un tercer

oligonucleótido, denominado el “INVASOR”, cuya parte 5’ define una tercera región de la misma secuencia de ácido

nucleico diana (regiones Y y X en la Fig. 57) adyacente a y cadena debajo de la segunda región diana (regiones X y Z) y la segunda cuya parte 3’ se solapa en la región definida por el segundo oligonucleótido (la región X representa la región de solapamiento). La estructura resultante se ilustra en la Fig. 57. Como se ha descrito anteriormente para las realizaciones que no emplean un aplicador, la región mostrada como “X” puede representar una región en la que hay un solapamiento físico, pero no de secuencia, entre los oligonucleotidos INVASOR y sonda.

Aunque no limita la invención o la presente discusión a ningún mecanismo de acción particular, el diagrama en la Fig. 57 representa el efecto del sitio de escisión provocado por este tipo de disposición de tres oligonucleótidos. El diseño de estos tres oligonucleótidos se describe con más detalle más adelante. En la Fig. 57, los extremos 3’ de los ácidos nucleicos (es decir, la diana y los oligonucleótidos) se indican mediante el uso de las puntas de flecha en los extremos de las líneas que representan las cadenas de los ácidos nucleicos (y, donde lo permite el espacio, estos extremos también se marcan con “3’”). Se entiende fácilmente que los tres oligonucleótidos (el INVASOR, la minisonda y el apilador) se disponen en una orientación paralela relativa entre sí, mientras que la cadena de ácido nucleico diana se dispone en una orientación antiparalela con respecto a los tres oligonucleótidos. Además, es evidente que el oligonucleótido INVASOR se localiza cadena arriba del oligonucleótido minisonda y que el oligonucleótido minisonda se localiza cadena arriba del oligonucleótido apilador y que, con respecto a la cadena de ácido nucleico diana, la región W está cadena arriba de la región Z, la región Z está cadena arriba de la región X y la región X está cadena arriba de la región Y (es decir, la región Y está cadena abajo de la región X, la región X está cadena abajo de la región Z y la región Z está cadena debajo de la región W). Las regiones de complementariedad entre las cadena opuestas se indican por las líneas verticales cortas. Aunque no pretende indicar la ubicación precisa del sitio o los sitios de escisión, el área al que se desplaza el sitio de escisión dentro del oligonucleótido minisonda por la presencia del oligonucleótido INVASOR se indica por la punta de flecha vertical rellena. La Fig. 57 no pretende representar el mecanismo de acción real o la disposición física de la estructura de escisión y, además, no pretende que el procedimiento de la presente invención se limite a ningún mecanismo de acción particular.

Se puede considerar que la unión de estos oligonucleótidos divide el ácido nucleico diana en cuatro regiones distintas: una región que tiene complementariedad solamente con el apilador (mostrada como “W”); una región que tiene complementariedad solamente con la minisonda (mostrado como “Z”); una región que tiene complementariedad solo con el oligonucleótido INVASOR (mostrado como “Y”) y una región que tiene complementariedad con ambos oligonucleótidos, el INVASOR y la minisonda, (mostrado como “X”). Como se ha tratado anteriormente, el oligonucleótido INVASOR también se puede emplear de un modo tal que se proporcione un solapamiento físico en lugar de un solapamiento de secuencia con la sonda.

Además de los beneficios que se han citado anteriormente, el uso de un diseño compuesto para los oligonucleótidos que forman la estructura de escisión permite una mayor libertad en el diseño de las condiciones de reacción para realizar el ensayo de escisión dirigida por INVASOR. Cuando se usa una sonda más larga (por ejemplo, 16-25 nucleótidos), como se ha descrito anteriormente para la detección en reacciones que se realizan a temperaturas por debajo de la Tf de esa sonda, la escisión de la sonda puede desempeñar un papel significativo en la desestabilización del dúplex del cual es una parte, permitiendo de este modo la renovación y la reutilización del sitio de reconocimiento en el ácido nucleico diana. Por el contrario, las temperaturas de reacción que están en o por encima de la Tf de la sonda se refieren a que las moléculas sonda hibridan y se liberan de la diana bastante rápidamente incluso sin escisión de la sonda. Cuando se proporcionan un oligonucleótido INVASOR cadena arriba y un medio de escisión, la sonda se escindirá específicamente, pero la escisión no será necesaria para la renovación de la sonda. Si se usa una sonda larga (por ejemplo, 16-25 nucleótidos) de este modo, las temperaturas requeridas para conseguir este estado serían bastante altas, aproximadamente de 65 a 70ºC para un oligómero de 25 unidades de composición de bases promedio. La necesidad del uso de tales temperaturas elevadas limita la selección de agentes de escisión a los que son muy termoestables y puede contribuir a fondo en las reacciones, dependiendo de los medios de detección, mediante degradación térmica de los oligonucleótidos sonda. Con las minisondas, este último mecanismo de sustitución de sonda se puede conseguir a una temperatura menor. Por tanto, son preferibles las sondas cortas para realizaciones que usan temperaturas de reacción menores.

La minisonda de la presente invención puede variar en tamaño dependiendo de la aplicación deseada. En una realización, la sonda puede ser relativamente corta en comparación con una sonda convencional (por ejemplo, 16-25 nucleótidos), en el intervalo de 6 a 10 nucleótidos. Cuando se usa una sonda corta de este tipo, se pueden eleccionar ondiciones de reacción que evitan la hibridación de la minisonda en ausencia del oligonucleótido apilador. De este modo se puede preparar una sonda corta para asumir la especificidad y selectividad estadística de una secuencia más larga. En el acontecimiento de una perturbación en la unión cooperativa de la minisonda y los ácidos nucleicos de apilamiento, como se puede provocar por un apareamiento erróneo dentro de la secuencia corta (es decir, región “Z” que es la región de la minisonda que no se solapa con el invasor) o en la unión entre los dúplex contiguos, esta cooperatividad se puede perder, disminuyendo espectacularmente la estabilidad del oligonucleótido más corto (es decir, la minisonda) y disminuyendo de este modo el nivel de producto escindido en el ensayo de la presente invención.

También se contempla que se pueden usar sondas de tamaño intermedio. Tales sondas, en el intervalo de 1 a 15 nucleótidos, pueden combinar algunas de las características asociadas a las sondas más largas como se han descrito originalmente, incluyendo estas características la capacidad de hibridar y escindirse en ausencia de ayuda de un oligonucleótido apilador. A las temperaturas por debajo de la Tf esperada de tales sondas, los mecanismos de renovación pueden ser como se han discutido anteriormente para sondas en el intervalo de 20 nucleótidos y pueden

depender de la eliminación de la secuencia en la región “X” para desestabilización y ciclado.

Las sondas de longitud intermedia también se pueden usar a temperaturas elevadas, a o por encima de su Tf esperada, para permitir la fusión en vez de escisión para promover la renovación de la sonda. Al contrario que las sondas más largas que se han descrito anteriormente, sin embargo, las temperaturas requeridas para permitir el uso de una renovación dirigida térmicamente de este tipo son mucho menores (de aproximadamente 40 a 60ºC), protegiendo de este modo tanto los medios de escisión como los ácidos nucleicos en la reacción contra degradación térmica. De este modo, las sondas de longitud intermedia pueden funcionar en algunos casos como las minisondas que se han descrito anteriormente. En una similitud adicional con las minisondas, la acumulación de señal de escisión de una sonda de longitud intermedia se puede ayudar en algunas condiciones de reacción por la presencia de un apilador.

Para resumir, una sonda de longitud convencional habitualmente no se beneficia de la presencia de un oligonucleótido apilador cadena abajo (siendo la excepción los casos en los que un oligonucleótido de este tipo también puede alterar estructuras en el ácido nucleico diana que interfieren con la unión de sonda) y se usa habitualmente en condiciones que requieren que se eliminen varios nucleótidos para permitir que el oligonucleótido se libere de la diana de forma eficaz. Si la temperatura de la reacción se usa para dirigir el intercambio de las sondas, las sondas estándar pueden requerir el uso de una temperatura a la que los ácidos nucleicos y las enzimas tengan un riesgo mayor de sufrir degradación térmica.

La minisonda es muy corta y funciona de forma óptima en presencia de un oligonucleótido apilador cadena abajo. Las minisondas son muy adecuadas para condiciones de reacción que usan la temperatura de la reacción para dirigir un intercambio rápido de las sondas en la diana independientemente de cuántas bases se hayan escindido. En reacciones con cantidad suficiente de los medios de escisión, las sondas que se unen se escindirán rápidamente antes de que se fundan.

La sonda de longitud intermedia o midisonda combina características de estas sondas y se puede usar en

reacciones como las denominadas sondas largas, con regiones más largas de solapamiento (regiones “X”) para

dirigir la renovación de sonda a temperatura menor. En una realización preferida, las sondas de longitud intermedia se usan a temperaturas suficientemente altas de tal forma que las sondas hibridan con la diana y se liberan rápidamente con independencia de la escisión. La sonda de longitud intermedia puede tener rendimiento mejorado en presencia de un apilador en algunas circunstancias.

No se considera que las distinciones entre minisondas, midisondas (es decir de longitud intermedio) y largas sean inflexibles y solo se basan en la longitud. El funcionamiento de cualquier sonda dada puede variar con su secuencia específica, la selección de condiciones de solución, la selección de temperatura y los medios de escisión seleccionados.

En el Ejemplo 17 se muestra que el ensamblaje de oligonucleótidos que comprenden la estructura de escisión de la presente invención es sensible a apareamientos erróneos entre la sonda y la diana. El sitio del apareamiento erróneo usado en el Ejemplo 17 proporciona un ejemplo y no tiene por objeto ser una limitación en la ubicación de un apareamiento erróneo que afecta a la escisión. También se considera que un apareamiento erróneo entre el oligonucleótido INVASOR y la diana se puede usar para distinguir secuencias diana relacionadas. En el sistema de 3 oligonucleótidos, que comprende un oligonucleótido invasor, una sonda y un apilador, se considera que los apareamientos erróneos se pueden localizar dentro de cualquiera de las regiones de dúplex formados entre estos oligonucleótidos y la secuencia diana. En una realización preferida, un apareamiento erróneo a detectar se localiza en la sonda. En una realización particularmente preferida, el apareamiento erróneo está en la sonda, en el par de

bases inmediatamente cadena arriba (es decir, 5’) del sitio que se escinde cuando la sonda no se aparea

erróneamente con la diana.

En otra realización preferida, un apareamiento erróneo a detectar se localiza dentro de la región “Z” definida por la hibridación de una minisonda. En una realización particularmente preferida, el apareamiento erróneo está en la minisonda, en el par de bases inmediatamente cadena arriba (es decir, 5’) del sitio que se escinde cuando la minisonda no se aparea erróneamente con la diana.

b) Diseño de las condiciones de reacción

Los ácidos nucleicos diana que se pueden analizar usando los procedimientos de la presente invención que emplean una nucleasa 5’ como el medio de escisión incluyen muchos tipos tanto de ARN como de ADN. Tales ácidos nucleicos se pueden obtener usando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, se pueden aislar ácidos nucleicos (ARN o ADN) de una muestra tisular (por ejemplo, una muestra de biopsia), células de cultivo tisular, muestras que contienen bacterias y/o virus (incluyendo cultivos de bacterias y/o virus), etc. El ácido nucleico diana también se puede transcribir in vitro a partir de un molde de ADN o se puede sintetizar químicamente o amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Además, los ácidos nucleicos se pueden aislar de un organismo, como material genómico o como un plásmido o ADN extracromosómico similar o pueden ser un fragmento de tal material generado por tratamiento con una endonucleasa de restricción u otros agentes de escisión,

o fuerza de cizalladura, o pueden ser sintéticos.

El ensamblaje de los ácidos nucleicos diana, sonda y el oligonucleótido INVASOR en la reacción de escisión de la presente invención usa principios usados habitualmente en el diseño de ensayos enzimáticos basados en oligonucleótidos, tales como secuenciación de didesoxinucleótidos y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se realiza en estos ensayos, los oligonucleótidos se proporcionan en un exceso suficiente para que la velocidad de hibridación con el ácido nucleico diana sea muy rápida. Estos ensayos habitualmente se realizan con de 50 fmol a 2 pmol de cada oligonucleótido por μl de mezcla de reacción, aunque no necesariamente están limitados a este intervalo. En los Ejemplos descritos en el presente documento se usaron cantidades de oligonucleótidos que variaban de 250 fmol a 5 pmol por μl de volumen de reacción. Estos valores se seleccionaron con el propósito de facilitar la demostración y no tienen por objeto limitar la realización de la presente invención a estas concentraciones. También se consideran otras concentraciones de oligonucleótidos (por ejemplo, menores) usadas habitualmente en otras reacciones de biología molecular.

Es deseable que un oligonucleótido invasor esté inmediatamente disponible para dirigir la escisión de cada oligonucleótido sonda que hibrida con un ácido nucleico diana. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el oligonucleótido INVASOR se proporciona en exceso con respecto al oligonucleótido sonda. Aunque este es un medio eficaz de fabricar el oligonucleótido INVASOR inmediatamente disponible en dichas realizaciones, no se pretende que la práctiva de la presente invención esté limitada a condiciones en las que el oligonucleótido INVASOR esté en exceso con respecto a la sonda o a cualquier proporción concreta del INVASOR y la sonda (p. ej., en algunas realizaciones preferidas descritas en el presente documento, la sonda se proporciona en exceso con respecto al oligonucleótido INVASOR). Otro medio de asegurar la presencia de un oligonucleótido INVASOR siempre que una sonda se una a un ácido nucleico diana es diseñar el oligonucleótido INVASOR para que hibride de un modo más estable con la diana, es decir para que tenga una Tf superior a la de la sonda. Esto se puede conseguir por cualquier medio de incrementar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico tratada en el presente documento (p. ej., aumentando la cantidad de complementariedad con el ácido nucleico diana).

Se tienen que seleccionar condiciones de tampón que serán compatibles tanto con la hibridación de oligonucleótidos/diana y con la actividad del agente de escisión. Las condiciones de tampón óptimas para enzimas de modificación de ácido nucleico y, particularmente, enzimas de modificación de ADN, incluyen generalmente suficientes sales mono- y divalentes para permitir la asociación de cadenas de ácido nucleico por emparejamiento de bases. Si el procedimiento de la presente invención se realiza usando un agente de escisión enzimática diferente a los descritos específicamente en este documento, las reacciones se pueden realizar generalmente en cualquier tampón de este tipo que se haya descrito que es óptimo para la función nucleasa del agente de escisión. En general, para ensayar la utilidad de cualquier agente de escisión en este procedimiento, se realizan reacciones de ensayo en las que el agente de escisión de interés se ensaya en el tampón MOPS/MnCl2/KCl o tampones que contienen Mg que se describen en el presente documento y en cualquier tampón que se haya descrito que es adecuado para el uso con ese agente, en una hoja de datos de fabricante, un artículo de revista o en una comunicación personal.

Los productos de la reacción de escisión dirigida por invasor son fragmentos generados por escisión con especificidad de estructura de los oligonucleótidos de entrada. Los oligonucleótidos resultantes escindidos y/o no escindidos se pueden analizar y separar mediante varios procedimientos incluyendo, entre otros, electroforesis (sobre una diversidad de soportes incluyendo geles de acrilamida o agarosa, papel, etc.), cromatografía, polarización de fluorescencia, espectrometría de masas e hibridación en chip. En algunos ejemplos, la invención se ilustra usando separación electroforética para el análisis de los productos de las reacciones de escisión. Sin embargo, se señala que la separación de los productos de escisión no se limita a la electroforesis. La electroforesis se selecciona para ilustrar el procedimiento de la invención debido a que la electroforesis se practica ampliamente en la técnica y está fácilmente accesible para el practicante promedio. En otros ejemplos, la invención se ilustra sin electroforesis o cualquier otra resolución de los productos de escisión.

Los oligonucleótidos sonda e INVASOR pueden contener un marcador para ayudar a su detección después de la reacción de escisión. El marcador puede ser un radioisótopo (por ejemplo, un nucleótido marcado con 32P o 35S)

colocado en el extremo 5’ o 3’ del oligonucleótido o, alternativamente, el marcador se puede distribuir a lo largo del

oligonucleótido (es decir, un oligonucleótido marcado de forma uniforme). El marcador puede ser un resto detectable no isotópico, tal como un fluoróforo, que se puede detectar directamente o un grupo reactivo que permite reconocimiento específico por un agente secundario. Por ejemplo, oligonucleótidos biotinilados se pueden detectar sondando con una molécula de estreptavidina que está acoplada a un indicador (por ejemplo, fosfatasa alcalina o un fluoróforo) o un hapteno tal como dioxigenina que se puede detectar usando un anticuerpo específico acoplado a un indicador similar. El grupo reactivo también puede ser una configuración específica o secuencia de nucleótidos que se puede unir o, de otro modo, interaccionar con un agente secundario, tal como otro ácido nucleico, una enzima o un anticuerpo.

c) Optimización de las condiciones de reacción

La reacción de escisión dirigida por INVASOR es útil para detectar la presencia de ácidos nucleicos específicos Además de las consideraciones que se han indicado anteriormente para la selección y el diseño de los oligonucleótidos INVASOR y sonda, las condiciones en las que se tiene que realizar la reacción se pueden optimizar para detección de una secuencia diana específica.

Un objetivo para optimizar el ensayo de escisión dirigida por INVASOR es permitir la detección específica del menor número de copias de un ácido nucleico diana. Para conseguir este extremo, es deseable que los elementos combinados de la reacción interaccionen con la máxima eficacia, de tal forma que la velocidad de reacción (por ejemplo, el número de acontecimientos de escisión por minuto) se maximice. Los elementos que contribuyen a la eficacia global de la reacción incluyen la velocidad de hibridación, la velocidad de escisión y la eficacia de la liberación de la sonda escindida.

La velocidad de escisión será una función del medio de escisión seleccionado y se puede hacer óptima de acuerdo con las instrucciones del fabricante cuando se usan preparaciones comerciales de enzimas o como se describe en este documento en los ejemplos en el presente documento. Los demás elementos (velocidad de hibridación, eficacia de liberación) dependen de la ejecución de la reacción y la optimización de estos elementos se discute más adelante.

Tres elementos de la reacción de escisión que afectan de forma significativa a la velocidad de hibridación de ácido nucleico son la concentración de los ácidos nucleicos, la temperatura a la que se realiza la reacción de escisión y la concentración de sales y/u otros iones de protección de carga en la solución de reacción.

Las concentraciones a las que se usan sondas oligonucleotídicas en ensayos de este tipo se conocen bien en la técnica y se han discutido anteriormente. Un ejemplo de una estrategia común para optimizar una concentración de oligonucleótido es seleccionar una cantidad de partida de oligonucleótido para ensayos piloto; de 0,01 a 2 μM es un intervalo de concentraciones usado en muchos ensayos basados en oligonucleótidos. Cuando se realizan reacciones de escisión inicial, se pueden plantear las siguientes cuestiones acerca de los datos: ¿Se realiza la reacción en ausencia del ácido nucleico diana sustancialmente libre de producto de escisión?; ¿Está desplazado específicamente el sitio de escisión de acuerdo con el diseño del oligonucleótido INVASOR?; ¿Se detecta el producto de escisión específico de forma sencilla en presencia de la sonda no escindida (o la cantidad de material no cortado supera el procedimiento de visualización seleccionado)?

Una respuesta negativa a cualquiera de estas cuestiones sugeriría que la concentración de la sonda es demasiado alta y que se debería realizar un conjunto de reacciones usando diluciones seriadas de la sonda hasta que se identificara la cantidad apropiada. Una vez identificada para un ácido nucleico diana dado en un tipo de muestra dada (por ejemplo, ADN genómico purificado, extracto de líquido corporal, extracto bacteriano lisado), no se debe necesitar la re-optimización. El tipo de muestra es importante debido a que la complejidad del material presente puede influir en el óptimo de la sonda.

Por el contrario, si la concentración de sonda inicial seleccionada es demasiado baja, la reacción puede ser lenta, debido a hibridación ineficaz. Los ensayos con cantidades crecientes de la sonda identificarán el punto en el que la concentración supera el óptimo (p. ej., en el cual se producie un efecto indeseable, tal como escisión de fondo no dependiente de la secuencia diana o nterferencia con la detección de los productos escindidos). Ya que la hibridación se facilitará por el exceso de sonda, es deseable, pero no se requiere, que la reacción se realice usando concentraciones de sonda justo por debajo de este punto.

La concentración de oligonucleótido INVASOR se puede seleccionar basándose en las consideraciones de diseño que se han discutido anteriormente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido INVASOR está en exceso con respecto al oligonucleótido sonda. En una realización preferida, el oligonucleótido sonda está en exceso con respecto al oligonucleótido INVASOR.

La temperatura también es un factor importante en la hibridación de oligonucleótidos. El intervalo de temperatura analizado dependerá en gran parte del diseño de los oligonucleótidos, como se ha discutido anteriormente. Cuando se desea ejecutar una reacción a una temperatura concreta (p. ej., por un requisito enzimático, por comodidad, por compatibilidad con ensayo o aparatos de detcción etc.), los oligonucleótidos que funcionan en la reacción se pueden diseñar para funcionar óptimamente a la temperatura de reacción deseada. Cada reacción del INVASOR incluye al menos dos oligonucleótidos específicos de la secuencia diana para la reacción primaria: un oligonucleótido INVASOR cadena arriba y un oligonucleótido sonda cadena abajo. En algunas realizaciones preferidas, el oligonucleótido INVASOR está diseñado para unirse de forma estable a la temperatura de reacción, mientras que la sonda está diseñada para asociarse y disociarse libremente con la hebra diana, produciéndose la escisión únicamente cuando una sonda sin cortar hibrida adyacente a un oligonucleótido INVASOR solapante. En realizaciones preferidas, la sonda incluye una aleta en 5' que no es complementaria a la diana y esta aleta se libera de la sonda cuando se produce la escisión. La aleta liberada se puede detectar directa o indirectamente. En algunas realizaciones preferidas, como se trata con detalle más adelante, la aleta liberada participa con oligonucleótido INVASOR en una reacción secundaria.

En general, las condiciones óptimas para el ensayo INVASOR son las que permiten la detección específica de la menor cantidad de un ácido nucleico diana. Dichas condiciones s epueden caracterizar como las que dan la señal dependiente de diana más alta en un marco temporal dado o para una cantidad dada de ácido nucleico diana, o que permiten la velocidad de escisión d ela sonda más alta (es decir, sondas escindidas por minuto). Para seleccionar una secuencia de sonda que funcione óptimamente a una temperatura de reacción preseleccionada, la temperatura de fusión (Tf) de su región específica del analito (ASR, la región que es complementaria al ácido nucelico diana) se calcula usando el modelo de vecino más cercano y los parámetros publicados para la formación de dúplex de ADN (SantaLucia, J., Proc Natl Acad Sci U S A 95, 1460-5 (1998), Allawi, H.T. & SantaLucia, J., Jr. Biochemistry 36, 10581-94 (1997). No obstante, existen varias diferencias entre las condiciones bajo las cuales se midieron los parámetros publicados y las condiciones en las que se midieron los parámetros publicados y las condiciones en las que se ejecuta el ensayo INVASOR en realizaciones preferidas. Las concentraciones de sales a menudo son diferentes de las condiciones de la solución en las que se obtuvieron los parámetros vecinos más cercanos (NaCl 1M y sin metales divalentes). Se puede compensar este factor modificando el valor proporcionado para la concentración de sales dentro de los cálculos de la temperatura de fusión. Además de la concentración de sales, la presencia y la concentración d ela enzima influye sobre la temperatura de reacción óptima y se deberá realizar un ajuste adicional en la Tf calculada para determinar la temperatura óptima a la que realizar una reacción. Observando la temperatura óptima para una serie de reacciones del INVASOR (es decir, la temperatura a la cual la velocidad de acumulación de la señal es más alta), ha sido posible alterar adicionalmente el valor de la concentración de sales dentro de estos cálculos para permitir que se modifique el algoritomo para el cálculo de la Tf en lugar de proporcionar una temperatura de la reacción de escisión óptima para una secuencia sonda dada. Este ajuste

adicional se denomina una “corrección de sales”. Como se usa en el presente documento, la expresión “corrección de sales” se refiere a una variación realizada en el valor proporcionado para una concentración de sales con el fin de reflejar el efecto sobre un cálculo de la Tf para un dúplex de ácido nucleico de un parámetro o condición sin sales que afecte a dicho dúplex. La variación de los valores proporcionados para las concentraciones de la hebra también afectará al resultado de estos cálculos. Usando un valor de NaCl 0,5M [SantaLucia, J., Proc Natl Acad Sci U S A 95, 1460-5 (1998)] concentraciones de la hebra de aproximadamente 1 M de la sonda y 1fM de la diana, el algoritmo usado para calcular la temperatura de fusión de la sonda-diana se ha adaptado para usar en la predicción de la temperatura de reacción óptima del ensayo INVASOR. Para un conjunto de aproximadamente 30 sondas, la desviación media entre las temperaturas de ensayo óptimas calculadas por este procedimiento y las determinadas experimentalmente fue de aproximadamente 1,5 ºC.

Como se ha indicado anteriormente, la concentración del agente de escisión puede afectar a la temperatura óptima real para una reacción de escisión. Adicionalmente, diferentes agentes de escisión, aunque se usen a concentraciones idénticas, pueden afectar a la temperatura de reacción óptima d eun modo diferente (p. ej., la diferencia entre la Tf calculada de la sonda y la temperatura óptima de la reacción observada puede ser mayor para una enzima que para otra). La determinación de las concentraciones de sales adecuadas para reacciones que usan diferentes enzimas o concentraciones de enzimas, o para cualquier otra variación realizada en las condiciones de la reacción, implica un procedimiento de dos etapas de a) medir la temperatura óptima de la reacción en las nuevas condiciones de reacción y variando la concentración de sales dentro del algoritomo de la Tf para producir una temperatura calculada que coincida o se aproxime considerablemente a la óptima observada. La medición de una temperatura de reacción ópitma generalmente implica realizar reacciones a un intervalo de temperaturas seleccionadas de forma tal que el iintervalo permita la observación de un incremento del rendimiento a medida que se aproxima a una temperatura óptima (aumentando o disminuyendo las temperaturas) y una disminución de rendimiento cuando se ha superado una temperatura óptima, de modo que se permite la identificación de la temperatura óptima o el intervalo de temperaturas [véase, por ejemplo, V.I. Lyamichev, y col., Biochemistry 39, No.

31: 9523-9532 (2000)].

La longitud de la región específica de analito (ASR) de la sonda cadena abajo se define con la temperatura seleccionada para ejecutar la reacción, por ejemplo a 63 ºC, en los expertimentos descritos en los ejemplos 54 a 60. Para seleccionar una secuencia de sonda basada en una temperatura de reacción deseada, la secuencia de la sonda se selecciona del siguiente modo (como se ilustra para el diseño de una sonda para la detección de una diferencia en la secuencia en una ubicación deseada). Comenzando desde la posición del nucleótido variante sobre el ADN diana (posición N, Figura 112); la base diana que se empareja con el nucleótido sonda en 5’ del sitio de escisión previsto), se usa un procedimiento reiterativo mediante el cual se incrementa la longitud de la ASR en un par de bases hasta alcanzar una temperatura óptima de reacción calculada (Tf más corrección de sales para compensar la enzima y cualquier otro efecto de las condiciones de la reacción) que coincide con la temperatura de reacción deseada. Preferentemente, el brazo no complementario de la sonda se selecciona (mediante un procedimiento retiterativo similar) para permitir que la reacción secundaria se cicle a la misma temperatura de

reacción y el diseño de toda la sonda (ASR y la rama no complementaria en 5’) se selecciona usando programas

tales como mfold [Zuker, M. Science 244, 48-52 (1989)] or Oligo 5.0 [Rychlik, W. & Rhoads, R.E. Nucleic Acids Res 17, 8543-51 (1989)] para la possible formación de complejos diméricos o estructuras secundarias que pudieran interferir en la reacción. Los mismos principios también se siguen para el diseño del oligonucleótido INVASOR. A

continuación se describe un diseño de una realización de ensayo INVASOR en el que el extremo 3’ del

oligonucleótido INVASOR, en la posición N en el ADN diana, está diseñado para tener un nucleótido no complementario para cualquier alelo que se sospeche que esté contenid en la muestra que se va a analizar. La falta de apareamiento no afecta adversamente a la escisión [Lyamichev, V. y col. Nature Biotechnology 17, 292-296 (1999)], y puede poternciar el ciclado de la sonda, probablemente minimizando los efectos de la estabilización coaxial entre las dos sondas. Brevemente, comenzando en la posición N, residuos adicionales complementarios al ADN diana comenzando desde el residuo N-1 se añaden después en dirección cadena arriba hasta que la estabilidad del híbrido INVASOR-diana supera la de la sonda (y, por tanto, la temperatura de la reacción de ensayo programada). En realizaciones preferidas, la estabilidad del híbrido INVASOR-diana supera la de la sonda en 15-20 ºC.

En algunas realizaciones, cuando el fragmento de escisión liberado de una reacción primaria se va a usar en una reacción secundaria, también se deberá considerar las condiciones de reacción de la reacción secundaria a la hora de diseñar los oligonucleótidos para la reacción primaria (p. ej., la secuencia de la aleta en 5' no complementaria liberada de la sonda en la reacción primaria se puede diseñar para funcionar óptimamente en una reacción secundaria). Por ejemplo, como se describe con detalle más adelante, en algunas realizaciones se usa una reacción secundaria cuando el fragmento de escisión liberado de una reacción primaria hibrida con un casete sintético para formar una reacción de escisión secundaria. En algunas realizaciones preferidas, el casete comprende un resto fluorescente y un resto de inactivación, en el que la escisión de la estructura de escisión secundarua separa el resto fluorescente del resto de inactivación, lo que tiene como resultado una señal detectable (p. ej., detección FRET). La reacción secundaria se puede configurar de varios modos diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el casete sintético comprende dos oligonucleótidos: Un oligonucleótido que contiene los retsos FRET y un oligonucleótido FRET/INVASOR en puente con un oligonucleótido que permite que el oligonucleótido INVASOR (es decir, la aletaliberada de la reacción primaria) y el oligonucleótido FRET para hibridar, de modo que se forma una estructura de escisión. En algunas realizaciones, el casete sintético se proporciona como un oligonucleótido único, que comprende una estructura en horquilla (es decir, el oligonucleótido FRET está conectado en su extremo 3' con el oligonucleótido en puente por un bucle). El bucle puede ser ácido nucleico (p. ej., una cadena de nucleótidos, tales como los cuatro residuos T representados en varias Figuras, incluida la 113A) o un espaciador o ligador que no es de ácido nucleico. Las moléculas ligadas pueden describirse juntas como un casete FRET. En la reacción secundaria usando un casete FRET, la aleta liberada de la reacción primaria, que actúa como un oligonucleótido INVASOR, debería ser capaz de asociarse y desasociarse con el casete FRET libremente, de modo que una aleta liberada puede dirigir la escisión de múltiples casetes FRET. Es un aspecto del diseño del ensayo que todas las secuencias de la sonda se pueden seleccionar para permitir que se produzcan las reacciones primarias y secundarias a la misma temperatura óptima, de modo que las etapas de reacción se pueden ejecutar de forma simultánea. En una realización alternativa, las sondas se pueden diseñar para funcionar a diferentes temperaturas óptimas, de modo que las etapas de reacción no son simultáneas a su temperatura óptima. Como se ha indicado anteriormente, el mismo proceso reiterativo usado para seleccionar la ASR de la sonda se puede usar en el diseño de la parte de la sonda primaria qye participa en una reacción secundaria.

Otro determinante de la eficacia de hibridación es la concentración salina de la reacción. En gran parte, la selección de las condiciones de solución dependerá de los requisitos del agente de escisión y, para reactivos disponibles en el mercado, las instrucciones del fabricante son un recurso para esta información. Cuando se desarrolla un ensayo que utiliza cualquier agente de escisión particular, las optimizaciones de oligonucleótido y temperatura que se han descrito anteriormente se deben realizar en las condiciones de tampón más adecuadas a ese agente de escisión.

Un control “sin enzima” permite la evaluación de la estabilidad de los oligonucleótidos marcados en condiciones de reacción concretas o en presencia de la muestra que se va a someter a ensayo (es decir, evaluando la muestra para nucleadas contaminantes). De este modo, el sustrato y los oligonucleótidos se introducen en un tubo que contiene todos los componentes de reacción, excepto la enzima y se tratan igual que las reacciones que contienen enzima. También se pueden incluir otros controles. Por ejemplo, una reacción con todos los componentes excepto el ácido nucleico diana servirá para confirmar la dependencia de la escisión de la presencia de la secuencia diana.

d) Selección de un agente de escisión

Como se ha demostrado en una serie de los Ejemplos, algunas nucleadas 5’ no requieren un oligonucleótido cadena

arriba que esté activo en una reacción de escisión. Aunque la escisión puede ser más lenta sin el oligonucleótido cadena arriba, se puede producir (Lyamichev y col., Science 260:778 [1993], Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274:21387 [1999]). Cuando una hebra de ADN es el molde o la hebra diana con la que hibridan los oligonucleótidos sonda, las

nucleadas 5’ deriuvadas de las ADN polimerasas y algunas endonucleasas FLAP (FEN), tales como las procedentes

de Methanococcus jannaschii, pueden escindirse bastante bien sin un oligonucleótido cadena arriba que proporciona un solapamiento (Lyamichev y col., Science 260:778 [1993], Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274:21387 [1999], y la patente de EE.UU. nº 5.843.669). Estas mucleasas se pueden seleccionar para usar en algunas realizaciones del ensayo INVASOR, por ejemplo en realizaciones en las que la escisión de la sonda en ausencia de un oligonucleótido INVASOR da un producto de escisión diferente que no interfiere en el análisis previsto, o en el que ambos tipos de escisión, dirigida por oligonucleótido INVASOR e independiente de oligonucleótido INVASOR, se van a producir.

En otras realizaciones se prefiere que la escisión de la sonda dependa de la presencia de un oligonucleótido INVASOR cadena arriba y que se use una enzima que tiene este requisito. Otras FEN, como las procedentes de Archeaoglobus fulgidus (Afu) y Pyrococcus furiosus (Pfu), escinden una estructura solapada sobre un ADN diana a una velodidad tan superior que con una estructura no solapante (es decir, después de perder el oligonucleótido cadena arriba o de tener un oligonucleótido cadena arriba no solapante) que se puede ver como que tienen un requisito esencialmente absoluto para el solapamiento (Lyamichev y col., Nat. Biotechnol., 17:292 [1999], Kaiser y col., J. Biol. Chem., 274:21387 [1999]). Cuando un ARN diana hibrida con sondas oligonucleotídicas de ADN para formar una estructura de escisión, muchasFEN escinden la sonda de ADN cadena abajo mal, con independencia de la presencia de un solapamiento. En estas estructuras que contienen ARN, las nucleadas 5’ derivadas de las ADN polimerasas tienen un fuerte requisito del solapamiento y son esencialmente inactivas en su ausencia.

e) Sondeo Para Múltiples Alelos

La reacción de escisión dirigida por INVASOR también es útil en la detección y cuantificación de variantes individuales o alelos en una población de muestra mixta. A modo de ejemplo, una necesidad de este tipo existe en el análisis de material de tumor para mutaciones en genes asociados a cánceres. El material de biopsia de un tumor puede tener un complemento significativo de células normales, de tal forma que es deseable detectar mutaciones incluso cuando están presentes en menos del 5% de las copias del ácido nucleico diana en una muestra. En este caso, también es deseable medir qué fracción de la población lleva la mutación. También se pueden realizar análisis similares para examinar variación alélica en otros sistemas de genes y no se pretende que el procedimiento de la presente invención se limite a los análisis de tumores.

Como se demuestra más adelante, las reacciones se pueden realizar en condiciones que evitan la escisión de sondas que llevan incluso un apareamiento erróneo de diferencia de un único nucleótido dentro de la región del ácido nucleico diana denominada “Z” en la Fig. 29, pero que permiten la escisión de una sonda similar que es completamente complementaria a la diana en esta región. En una realización preferida, el apareamiento erróneo está en la sonda que está en 5' del sitio en el que se produce la escisió en ausencia del apareamiento erróneo.

En otras realizaciones, el ensayo INVASOR se puede realizar en condiciones de un requisito importante de un solapamiento (p. ej., usando la FEN de Afu para la detección del ADN diana o la nucleasa 5’ de la ADN polimerasa para la detección del ARN diana, como se ha descrito anteriormente), que proporciona un medio alternativo de detección de un únic nucleótido u otras variaciones de la secuencia. En una realización, la sonda se selecciona de

modo que la base diana que se sospecha que varía está colocada en el extremo 5’ de la región complementaria a la

diana de esta sonda. El oligonucleótido INVASOR cadena arriba está colocado para proporconar una única base de solapamiento. Si la diana y el oligonucleótido sonda son complementarios en la base en cuestión, se forma el solapamiento y se puede producir la escisión. Esta realización se ilustra en la Figura 112. No obstante, si la diana no es complementaria de la sonda en esta posición, dicha base en la sonda pasa a ser parte de una rama no

complemnentaria en 5’, no existe solapamiento entre el oligonucleótido INVASOR y el oligonucleótido sonda y se

suprime la escisión.

También se contempla que se pueden detectar diferentes secuencias en una única reacción. Las sondas específicas para las diferentes secuencias se pueden marcar de forma diferente. Por ejemplo, las sondas pueden tener colorantes diferentes u otros restos detectables, longitudes diferentes o pueden tener diferencias en cargas netas de los productos después de la escisión. Cuando se marcan de forma diferente de uno de estos modos, la contribución de cada secuencia diana específica al producto final se puede ajustar. Esto tiene la aplicación en la detección de las cantidades de diferentes versiones de un gen dentro de una mezcla. Diferentes genes en una mezcla a detectar y cuantificar pueden ser genes de tipo silvestre y mutantes, por ejemplo, (como se puede observar en una muestra de tumor, tal como una biopsia). En esta realización, se pueden diseñar las sondas para unirse al mismo sitio de forma precisa, pero una para coincidir con la secuencia de tipo silvestre y una para coincidir con el mutante. La detección cuantitativa de los productos de escisión de una reacción realizada durante una cantidad de tiempo ajustada mostrará la proporción de los dos genes en la mezcla. Tal análisis también se puede realizar en genes no relacionados en una mezcla. Este tipo de análisis no pretende limitarse a dos genes. Se pueden medir de forma similar muchas variantes dentro de una mezcla.

Como alternativa se pueden controlar y cuantificar diferentes sitios en un único gen para verificar la medición de ese gen. En esta realización, se esperaría que la señal de cada sonda fuera igual.

También se considera el uso de múltiples sondas que no están marcadas de forma diferente, de forma que se mide la señal agregada. Esto puede ser deseable cuando se usan muchas sondas diseñadas para detectar un único gen para reforzar la señal de ese gen. Esta configuración también se puede usar para detectar secuencias no relacionadas dentro de una mezcla. Por ejemplo, en bancos de sangre es deseable conocer si uno cualquiera de un huésped de agentes infecciosos está presente en una muestra de sangre. Debido a que la sangre se desecha independientemente de qué agente está presente, no se requerirían diferentes señales de las sondas en una aplicación de este tipo de la presente invención y, de hecho, pueden ser indeseables por razones de confidencialidad.

Como se acaba de describir para el sistema de dos oligonucleótidos, anteriormente, la especificidad de la reacción Como se acaba de describir para el sistema de dos oligonucleótidos, anteriormente, la especificidad de la hibridación del conjunto completo de los oligonucleótidos de detección. Por ejemplo, puede haber aplicaciones en las que sea deseable detectar una única región dentro de un genoma complejo. En un caso de este tipo, el conjunto de oligonucleótidos se puede elegir para requerir reconocimiento preciso mediante hibridación de un segmento más largo de un ácido nucleico diana, a menudo en el intervalo de 20 a 40 nucleótidos. En otros casos puede ser deseable tener el conjunto de oligonucleótidos interaccionando con múltiples sitios dentro de una muestra diana. En estos casos, una estrategia sería usar un conjunto de oligonucleótidos que reconozcan un segmento menor y, por tanto, estadísticamente más común de una secuencia de ácido nucleico diana.

En una realización preferida, los oligonucleótidos INVASOR y apilador se pueden diseñar para ser máximamente estables, de tal forma que permanecerán unidos a la secuencia diana durante periodos prolongados durante la reacción. Esto se puede conseguir mediante una cualquiera de varias medidas bien conocidas por los especialistas en la técnica, tal como adición de secuencias de hibridación adicionales a la longitud del nucleótido (hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud total) o usando restos con carga negativa disminuida, tales como restos fosforotioatos o ácido nucleico peptídico, de tal forma que las cadenas complementarias no se repelan entre sí hasta el grado que lo hacen las cadenas naturales. Tales modificaciones también pueden servir para hacer que estos oligonucleótidos flanqueantes sean resistentes a nucleadas contaminantes, garantizando de este modo además su presencia continuada sobre la cadena diana durante el curso de la reacción. Además, los oligonucleótidos INVASOR y apilador se pueden unir covalentemente a la diana (por ejemplo, mediante el uso de entrecruzamiento con psoraleno).

II. Efecto de moléculas de DETENCIÓN sobre la señal y el fondo en reacciones de escisión invasiva secuencial

Como se ha descrito anteriormente, y demostrado en el ejemplo 36, la concentración de la sonda que se escinde se puede usar para incrementar la acumulación de señal, dando las concentraciones más altas d ela sonda la señal final más alta. No obstamte, la presencia de cantidades grandes de sonda sin escindir residual puede plantear problemas para el uso posterior de los productos escindidos para la detección o para amplificación adicional. Si la siguiente etapa es una detección simple (p. ej., mediante resolución en gel), el exceso de material sin cortar puede producir fondo por diseminación o dispersión de la señal, o superando un detector (p. ej., sobreexponiendo una película en el caso de radioactividad o superando los límites de detección cuantitativa de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes). Esto se puede superar repartiendo el producto de la sonda sin cortar (p. ej., usando el procedimiento de inversión de carga descrito en el Ejemplo 22 y tratado con detalle más adelante). En procedimientos de detección más complejos, puede pretenderse que el producto escindido interaccione con otra entidad para indicar escisión. Como s eha indicado antes, el producto escindido se puede usar en cualquier reacción que use oligonucleótidos, tal como hibridación, extensión del cebador, ligación o la dirección de la escisión invasiva. En cada uno de estos casos, el destino de la sonda sin cortar residual se deberá considerar en el diseño de la reacción. En una reacción de prolongación del cebador, la sonda sin cortar puede hibridar con un molde para la prolongación. Si se requiere que la escisión revele el correcto extremo 3’ para prolongación, la sonda sin cortar hibridada no se prolongará. No obstante, puede competir con el producto escindido para el molde. Si el molde está en exceso de la combinación d ela sonda escindida y sin escindir, los dos últimos deberán encontrar una copia del molde para unirse. No obstante, si el molde es limitante, cualquier competición puede reducir la parte de la sonda escindida que puede unirse con éxito al molde disponible. Si se usó un gran exceso de sonda para dirigir la reacción inicial, el resto puede también estar en gran exceso sobre el producto de la escisión y, por tanto, puede proporcionar un competidor muy eficaz, de modo que se reduce la cantidad del producto de reacción final (p. ej., prolongiación) para su detección última.

La participación del material sonda sin cortar en una reacción secundaria puede también contribuir al fondo en estas reacciones. Aunque la presentación de una sonda escindida para una reacción posterior puede representar un sustrato ideal para la enzima que se va a usar en la etapa siguiente, algunas enzimas pueden también actuar, aunque de forma ineficiente, también sobre la sonda sin cortar. En el ejemplo 43, se demostró que la transcripción se puede estimular a partir de un promotor con corte incluso cuando un lado del corte tiene nucleótidos sin emparejar adicionales (denominado “promotor ramificado” en dicho Ejemplo). De un modo similar, cuando la reacción posterior va a ser una escisión invasiva, la sonda sin escindir puede unirse a los elementos destinados a formar la segunda estructura de escisión con la sonda escindida. Dos de las posibles configuraciones se muestran esquemáticamente en las Figuras 105 y 106. La estructura de la derecha en la segunda etapa en cada Figura muestra una posible configuración formada por los elementos de la reacción secundaria (p. ej., dianas y/o sondas secundarias) y la sonda primaria sin escindir. En cada uno de estos casos se encontró que algunas d elas 5’ nucleadas descritas en el presente documento pueden catalizar alguna medida de escisión de estas estructuras defectuosas. Incluso a un nivel bajo, esta escisión aberrante se puede interpretar erróneamente como señal de escisión positiva específica de la diana.

Con estos efectos negativos del exceso de sonda sin cortar considerada, existe claramente una necesidad de algún procedimiento para prevenir estas interacciones. Como se ha indicado anteriormente, es posible repartir el producto escindido de la snda sin cortar tras la reacción primaria mediante procedimientos tradicionales. No obstante, estos procedimientos a menudo requieren tiempo, pueden ser caros (p. ej., columnas, geles desechables etc.) y pueden incrementar el riesgo de manipulación incorrecta o contaminación de la muestra. Es muy preferible configurar las reacciones secuenciales de modo que la muestra original no se tenga que retirar a un vaso nuevo para la reacción posterior.

La presente invención proporciona un procedimiento para reducir interacciones entre la sonda primaria y otros reactantes. Este procedimiento proporciona un medio de desviar específicamente las sondas sin escindir de la participación en las reacciones posteriores. Ladesviación se consigue mediante la inclusión en la siguiente etapa de reacción un agente diseñado para interaccionar específicamente con la sonda primaria sin escindir. Aunque la sonda primaria en una reacción de escisión invasiva se trata por las razones de comodidad, se contempla que se puedenusar las moléculas de DETENCIÓN en cualquier etapa de reacción dentro de una cadena de etapas de escisión invasiva, según se neceiste o desee para el diseño de un ensayo. No se pretende que las moléculas de DETENCIÓN de la presente invención estén limitadas a ninguna etapa concreta.

El procedimiento de desviar las sondas sin cortar residuales de una reacción primaria usa los agentes que se pueden diseñar o seleccionar específicamente para unirse a las moléculas sonda sin escindir con mayor afinidad que las sondas escindidas, de modo que permite que la especie de sonda escindida compite con eficacia por los elementos de la reacción posterior, incluso cuando la sonda sin cortar está presente en un gran exceso. Estos

agentes se han denominado “moléculas de DETENCIÓN” debido a su función de detención o ceso de la sonda

primaria de la participación en la última reacción. En diversos Ejemplos que figuran más adelante se proporciona unoligonucleótido como un oligonucleótido de DETENCIÓN en un ensayo de escisión invasivo. Se puede apreciar que cualquier molécula o sustancia química que pueda discriminar entre la sonda sin cortar de longitud completa y la sonda escindida, y que se puede unir o, de otro modo, inactivar la sonda sin escindir se puede configurar,preferentemente, para actuar como moléculas de DETENCIÓN dentro del significado de la presente invención. Por

ejemplo, se pueden obtener anticuerpos con dicha especificidad, como los “aptámeros” que se pueden seleccionar

mediante múltiples etapas de amplificación in Vitro (p. ej., SELEX," patentes de EE.UU. nº 5.270.163 y 5.567.588) y rondas específicas de captura u otros medios de selección.

En una realización, la molécula de DETENCIÓN es un oligonucleótido. En otra realización, el oligonucleótido deDETENCIÓN es un oligonucleótido compuesto, que comprende dos o más oligonucleótidos cortos que no están unidos covalentemente pero que se unen de forma cooperativa y se estabilizan mediante apilamiento coaxial. En una realización preferida, el oligonucleótido se modifica para reducir las interacciones con los agentes de escisión dela presente invención. Cuando un oligonucleótido se usa como un oligonucleótido de DETENCIÓN, se pretende que no participe en la posterior etapa de reacción. Considerando los diagramas esquemáticos en las Figuras 105 y 106, particularmente la Figura más a la derecha de la etapa 2b de cada Figura, mostrará que la unión del oligonucleótidode DETENCIIÓN a la sonda primaria puede, con la participación de la diana secundaria o sin dicha participación, crear una estructura bifurcada que es un sustrato de la escisión por las 5’ nucleasas usadas en algunas realizaciones de los procedimientos de la presente invención. La formación de dichas estructuras conduciría a algún nivel de escisión no pretendida que podría contribuir al fonodi, reducir la señal específica o competir por la enzima.Es preferible proporcionar oligonucleótidos de DETENCIÓN que no creen dichas estructuras de escisión. Un procedimiento para hacer esto es añadir a los oligonucleótidos de DETENCIÓN dichas modificaciones, ya que se ha descubierto que reducen la actividad de los olugonucleóridos INVASOR, ya que los olugonucleóridos INVASOR

ocupan una posición similar dentro de una estructura de escisión (es decir, el extremo 3’ del oligonucleótido ONVASOR coloca el sitio de escisión de un brazo en 5’ no apareado). La modificación del extremo 3’ de los oligonucleótidos INVASOR se analizó para determinar los efectos sobre la escisión en el Ejemplo 35, se encontró que una serie de modificaciones eran significativamente debilitantespara la función del oligonucleótido INVASOR. Otras modificaciones no descritas en el presente documento se pueden caracterizar fácilmente realizando dicho ensayo usando la enzima de escisión que se va a usar en la reacción para la que está destinado el oligonucleótidode DETENCIÓN.

En una realización preferida se modifica la estructura de un oligonucleótido de DETENCIÓN. Esto se puede realizar para incrementar la resistencia a la degradación mediante nucleadas o la temperatura, o para proporcionar una estructura dúplex que es un sustrato menos favorable para la enzima que se va a usar (p. ej., dúplex de forma A frente a dúplex de forma B). En una realización particularmente preferida, el oligonucleótido de estructura modificda comprende además una modificación en el extremo 3’. En una realización preferida, las modificaciones comprenden una sustitución en 2’-0-metilo de la estructura del ácido nucleico, mientras que en una realización particularmente preferida, el oligonucleótido 2’-O-metil modificado comprende además un grupo amina en el extremo 3’.

La finalidad del oligonucleótido de DETENCIÓN es permitir que la población minoritaria de sonda escindida compita de un modo eficaz con la sonda escindida por la unión de cualquier elemento que se vaya a usar en la etapa siguiente. Aunque un oligonucleótido de DETENCIÓN que puede discriminar entre las dos especies sonda absolutamente (es decir, uniéndose solo a la sonda sin cortar y nuna a la cortada) puede dar los mayores beneficios en algunas realizaciones, se ha previsto que en muchas aplicaciones, incluidos los ensayos INVASOR secuencialesdescritos en el presente documento, el oligonucleótido de DETENCIÓN de la presente invención puede realizar la función prevista únicamente con discriminación parcial. Cuando el oligonucleótido de DETENCIÓN tiene alguna interacción con la sonda escindida, puede evitar la detección de alguna parte de estos productos de escisión, de modo que se reduce el nivel absoluto de señal generada a partir de una cantidad dada de material diana. Si estemismo oligonucleótido de DETENCIÓN tiene el efecto simultáneo de reducir el fondo de la reacción (es decir, a partir d ela escisión específica no diana) por un factor que es mayor que el factor de reducción en la señal específica, el significado de la señal (es decir, la proporción señal:fondo) aumenta, incluso con la cantidad menor de señal absoluta. Cualquier potencial diseño de molécula de DETENCIÓN se puede analizar de un modo sencill comparando los niveles de las señales de fondo y específica de las reacciones que carecen de moléculas de DETENCIÓN con los niveles de las señales de fondo y específica de reacciones similares que incluyen oligonucleótidos de DETENCIÓN. Cada una de las reacciones descritas en los Ejemplos 49-53 demuestran el uso de dichas comparaciones y los expertos en la técnica pueden adaptarlas con facilidad a otras moléculas deDETENCIÓN y realizaciones diana. Lo que constituye un nivel aceptable de intercambio de la señal absoluta para esoecificidad variará para diferentes aplicaciones (p. ej., niveles diana, sensibilidad d ela lextura etc.) y cualquier usuario individual puede determinarlo usando los procedimientos de la presente invención.

III. Mejora de señal por incorporación de los productos de una reacción de escisión invasiva en una posterior reacción de escisión invasiva

Como se ha indicado anteriormente, el producto oligonucleótido liberado por la escisión invasiva se puede usar después en cualquier reacción o procedimiento de lectura que use que use oligonucleótidos en el intervalo de tamaños de un producto de escisión. Además de las reacciones que implican prolongación del cebador y transcripción, descritas en el presente documento, otra reacción enzimática que usa oligonucleótidos es la reacción de escisión invasiva. La presente invención proporciona medios de usar el oligonucleótido liberado en una reacción de escisión invasiva primaria como componente para completar una estructura de escisión para permitir una reacción de escisión invasiva secundaria. Una posible configuración de una reacción de escisión invasiva que suministra un componente para una estructura de escisión secundaria se representa en la Figura 96. No se pretende que el uso secuencial del producto de la escisión invasiva se limite a una única etapa adicional. Se contempla que muchas reacciones de escisión invasiva distintas se puedan realizar en secuencia.

La reacción en cadena de la polimerasa usa un procedimiento de replicación de ADN para crear copias de un segmento dirigido de ácido nucleico a una velocidad de acumulación logarítmica. Esto se hace posible por el hecho de que cuando se separan las hebras de ADN, cada hebra individual contiene suficiente información para permitir el ensamblaje de una nueva hebra complementaria. Cuando se sintetizan hebras nuevas, el número de moléculas idénticas se ha duplicado. En 20 repeticiones de este procedimiento, el original se puede copiar 1 millón de veces, haciendo fácilmente detectables las secuencias muy raras. La potencia matemática de una reacción de duplicación se ha incorporado en una serie de ensayos de amplificación, varios de los cuales se citan en la Tabla 1.

Realizando múltiples reacciones de escisión invasiva secuenciales, el procedimiento de la presente invención captura una ventaja matemática exponencial sin producir copias adicionales del analito diana. En una reacción de escisión invasiva simple, el rendimiento, Y, es simplemente la velocidad de renovación, K, multiplicada por el tiempo de la reacción, t (es decir, Y = (K)(t)). Si Y se usa para representar el rendimiento de una simple reacción, el rendimiento de un compuesto (es decir, una reacción múltiple secuencial), suponiendo que cada una de las etapas de escisión invasiva individual tiene la misma velocidad de renovación, purde representarse simplemente como Yn, en la que n es el número de reacciones de escisión invasiva que se han realizado en la serie. Si los rendimientos de cada etapa difieren, el rendimiento último se puede representar como el producto de la multiplicación de los rendimientos de cada reacción individual en la serie. Por ejemplo, su una reacción de escisión invasiva primaria puede producir mil productos en 30 minutos y cada uno de estos productos puede participar a su vez en 1000 reacciones adicionales, habrá 10002 copias (1000 x 1000) del producto último en una segunda reacción. Si a la serie se añade una tercera reacción, el rendimiento teórico será 10003 (1000 x 1000 x 1000). En los procedimientos de la presente invención, el exponente procede del número de reacciones de escisión invasiva en la cascada. Esto se puede contrastar con los procedimientos de amplificación descritos anteriormente (p. ej., PCR) en los que Y está limitado a 2 por el número de hebras en el ADN dúplex y el exponente n es el número de ciclos realizacos, de modo que son necesarias muchas repeticiones para acumular cantidades grandes de producto.

Para distinguir las amplificaciones exponenciales descritas anteriormente de ls de la presente invención, las primeras se pueden considerar reacciones de reciprocidad porque los porductos de reacción se vuelven a introducir en la misma reacción (p. ej., el acontecimiento uno conduce a algún número de acontecimientos 2 y cada acontecimiento 2 condude de nuevo a algún número de acontecimientos 1). En contraste con ello, los acontecimentos de la presente invención son secuenciales (p. ej., el acontecimiento 1 conduce algún número de acontecimientos 2; cada acontecimiento 2 doncude de nuevo a algún número de acontecimientos 3 etc., y ningún acontecimiento puede contribuir a un acontecimiento anterior en la cadena).

La sensibilidad de los procedimientos de reciprocidad es también una de las mayores debilidades cuando estos ensayos se usan para determinar si una secuencia de ácido nucleico diana está presente o ausente en una muestra. Dado que el producto de estas reacciones es una copia detectable del material de partida, la contaminación de una reacción con los productos de una reacción anterior puede conducir a resultados falsos positivos (es decir, la reacción evidente del ácido nucleico diana en las muestras que no contienen realmente ninguno de dichos analitos diana). Además, dado que la concentración del producto en cada reacción positiva es tan alta, cantidades de ADN suficientes para crear una fuerte señal falso positivo se pueden comunicar a reacciones nuevas muy fácilmente, bien por contacto con instrumentos contaminados o por aerosol. En contraste con los procedimientos de reciprocidad, el producto más concentrado de la reacción secuencial (es decir, el producto liberado en el último acontecimiento de escisión invsiva) no es capaz de iniciar una reacción o ascada similar si se realiza con una muestra de ensato fresca. Esta es una marcada ventaja sobre los procedimientos de amplificación exponencial descritos anteriormente porque las reacciones de la presente invención s epueden realizar sin las costosas disposiciones de contención (p. ej., mediante instrumentos especializados o mediante un espacio de laboratorio aparte) requeridas por cualquier reacción de reciprocidad. Aunque los productos de un acontecimiento penúltimo puedan transferirse de forma inadvertida para producir un fondo del producto último en ausencia de un analito diana, la contaminación tendría que ser de un volumen mucho mayor para dar un riesgo equivalente de un resultado falso positivo.

Cuando se usa el término secuencial, no se pretende que limite la invención a condifugraciones en las que una reacción de escisión invasiva o ensayo se deban completar antes del inicio de una reacción posterior para la escisión invasiva de una sonda diferente. En su lugar, el término se refiere al orden de los acontecimientos tal como se producirían si en un ensayo se usaran solo copias únicas de cada una de las especies oligonucleotídicas. La reacción de escisión invasiva primaria se refiere a la que se produce primero, en respuesta a la formación de la estructura de escisión sobre el ácido nucleico diana. Las reacciones posteriores se pueden denominar reacciones secundarias, terciarias etc., y pueden implicar hebras "diana" artificiales que solo sirven como soporte del

ensamblaje de una estructura de escisión y que no están relacionadas con”el analito ácido nucleico de interés.

Aunque el ensayo completo puede configurarse, si se desea, con cada etapa de escisión invasiva separada en el espacio (p. ej., en diferentes vasos de reacción) o en el tiempo (p. ej., usando un desplazamiento en las condiciones de reacción, tales como temperatura, identidad de la enzima o condiciones de la solución, para permitir los últimos acontecimientos de escisión), también se contempla que todos los componentes de la reacción se pueden mezclar de modo que las reacciones secundarias se puedan iniciar en cuanto el producto de una escisión primaria esté disponible. En dicho formato, los acontecimientos de escisión primarios, secundarios y posteriores implican diferentes copias de las estructuras de escisión pueden tener lugar simultáneamente.

Se pueden concebir varios niveles de este tipo de amplificación lineal, en la que cada ronda sucesiva de la escisión produce un oligonucleótido que puede participar en la escisión de una sonda diferente en rondas posteriores. La reacción primaria sería específica para el analito de interés, usándose las reacciones secundarias (y terciarias etc.) para generar señal mientras siguen siendo dependientes de la reacción primaria para su inicio.

El producto liberado puede funcionar en varias capacidades en las reacciones posteriores. Una de las posibles variaciones se muestra en la Figura 96, en la que el producto de una reacción de escisión invasiva se convierte en el oligonucleótido INVASOR para dirigir la escisión específica de otra sonda en una segunda reacción. En la Figura 96,

la primera estructura de escisión invasiva se forma mediante la asociación del oligonucleótido INVASOR (“Invasor”) y el oligonucleótido sonda (“Sonda 1”) con el pirmer ácido nucleico diana (“Diana 1"). El ácido nucleico diana se divide en tres regiones en base a qué partes de los oligonucleótidos INVASOR y sonda son capaces de hibridar con la diana (como se ha tratado anteriormente y como se muesra en la Figura 25). La Región 1 (región Y en la Figura 25) de la diana tiene complementariedad con únicamente el oligonucleótido INVASOR; la región 3 (Región Z en la Figura 25) de la diana tiene complementariedad con únicamente el oligonucleótido; y la región 2 (región X en la Figura 25) de la diana tiene complementariedad con ambos oligonucleótidos INVASOR y sonda. Se observa que la reacción de escisión invasiva secuencial se representa en la Figura 96 emplea un oligonucleótido INVASOR y uno sonda; la reacción de escisión secuencial no está limitada al uso de tal primera estructura de escosión. La primera estructura de escisión en la reacción secuencial también puede emplear un oligonucleótido INVASOR, una minisonda y un oligonucleótido apliador como se ha tratado anteriormente. Además, como se ha tratado anteriormente, el solapamiento en cualquiera o todas las estructuras de escisión en las reacciones secuenciales pueden comprender restos distintos a las bases complementarias solapantes, de modo que la región mostrada como

“X” representa una región en la que hay un solapamiento físico en lugar de de secuencia entre los oligonucleótidos

INVASOR y sonda.

En la Figura 96, la escisión de la Sonda 1 libera la “Sonda cortada 1” (indicada por la línea rayada en la Sonda 1

tanto escindida como sin escindir en la Figura 96). Después, la Sonda 1 liberada se usa como el oligonucleótido INVASOR en la segunda escisión. La segunda estructura de escisión se forma mediante la asociación de la Sonda

Cortada 1, una segunda sonda oligonucleotídica (“Sonda 2”) y un segundo ácido nucleico diana (“Diana 2”). En

algunas realizaciones, la Sonda 2 y el segundo ácido nucleico diana están unidos covalentemente, preferentemente en sus extremos 3' y 5',respectivamente, formando de este modo un pie y un bucle en horquilla que en el presente documento se denomina un “casete”. El bucle puede ser ácido nucleico (p. ej., una cadena de nucleótidos, tales como los cuatro residuos T representados en varias Figuras, incluida la 113A) o un espaciador o ligador que no es de ácido nucleico. La inclusión de un exceso de la molécula casete permite que cada Sonda 1 Cortada sirva como INVASOR para dirigir la escisión de múltiples copias del casete.

La Sonda 2 puede estar marcada (p. ej., como indica la estrella en la Figura 96) y la detección de la escisión de la segunda estructura de escisión s epuede conseguir detectando la Sonda 2 Cortada marcada; el marcador puede ser un radioisótopo (p. ej., 32P o 35S), un fluoróforo (fluoresceína), un grupo reactivo capaz de detectar un agente secundario (p. ej., biotina/estreptavidina), un aducto cargado positivamente que permite la detección mediante inversión selectiva de carga (como se ha tratado en la Sección IV anterior) etc. Como alternativa, la Sonda 2 Cortada se puede usar en una reacción de prolongación o para completar o activar un sitio de unión a proteína o puede detectarse i usarse mediante cualquiera de los medios para detectar o usar un oligonucleótido descrito en el presente documento.

Otra posible configuración para realizar una reacción de escisión invasiva secuencial se representa en la Figura 97. En esta realizacón, los oligonucleótidos sonda que se escinden en la reacción primaria se pueden diseñar de modo que se plieguen sobre sí mismos (es decir, contienen una región de autocomplementariedad) para crear una molécula que pueda servir como oligonucleótido INVASOR y diana (en el presente documento denominado complejo “IT”). El complejo IT permite después la escisión de una sonda diferente presente en la reacción secundaria. La inclusión de un exceso de la molécula sonda secundaria (“Sonda 2”) permite que cada molécula IT sirva como

plataforma para la generación de múltiples copias de la sonda secundaria escindida. En la Figura 97, las regiones de

autocomplementariedad contenidas dentro de la parte 5’ del oligonucleótido INVASOR están indicadas por los

óvalos rayados, la flehca entre estos dos óvalos indica que estas dos regiones pueden autoaparearse (como se muestra en la “Sonda Cortada 1”). El ácido nucleico diana se divide en tres regiones en base a qué partes de los oligonucleótidos INVASOR y sonda son capaces de hibridar con la diana (como se ha tratado anteriormente y se observa que la diana puede dividirse en cuatro regiones si se emplea un oligonucleótido apilador). La seguna

estructura de escisión se forma mediante la asociación de la segunda sonda (“Sonda 2”) con el fragmento de la Sonda 1 (“Sonda 1 Cortada”) que se liberó mediante la escisión de la primera estructura de escisión. La Sonda 1 Cortada forma una horquilla o estructura de pie/bucle cerca de su extremo 3’ en virtud de la asociación de las

regiones de autocomplementariedad contenidas dentro de la Sonda 1 Cortada (esta Sonda 1 Cortada autoasociada forma el complejo IT). El complejo IT (Sonda 1 Cortada) se divide en tres regiones. La Región 1 del complejo IT tiene

complementariedad con la parte 3’ de la Sonda 2; la región 2 tiene complementariedad con el extremo 3’ de la Sonda Cortada 1 y con la parte 5’ de la Sonda 2 (análoga a la región del solapamiento “X” mostrada en la Figura 25); y la región 3 contiene la región de autocomplementariedad (Es decir, la región 3 es complementaria a la parte 3’ de

la Sonda 1 Cortada). Obsérvese que, con respecto al complejo IT (es decir, la Sonda Cortada 1), la región 2 se localiza cadena arriba de la región 2 y la región 2 se localiza cadena arriba de la región 3. Como para otras realizaciones de escisión invasiva, la región mostrada como "2" puede representar una región en la que hay un solapamiento físico, pero no de secuencia, entre la parte INVASOR de la Sonda 1 Cortada y el oligonucleótido Sonda 2.

Los productos de escisión de la reacción de escisión invasiva secundaria (es decir, la Sonda 2 Cortada) puede detectarse o puede, a su vez, diseñarse para constituir otro complejo INVASOR-diana integrado más para usar con una tercera molécua sonda, de nuevo sin relacionar c y las dianas precedentes.

La presente invención no está limitada a las configuraciones representadas en las Figuras 96 y 97. Se ha concebido que el producto oligonucleotídico de una reacción de escisión primaria puede desempeñar el papel de cualquiera de los oligonucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., puede servir como una hebra diana sin una secuencia similar al oligonucleótido INVASOR o puede servir como oligonucleótido apilador, como se ha descrito anteriormente), para potenciar la velocidad de renovación en la reacción secundaria estabilizando la hibridación de la sonda a través de apilamiento coaxial.

Las reacciones de escisión secundarias en algunas realizaciones preferidas de la presente invención incluyen el uso de casetes FRET tales como los descritos en los Ejemplos 54 a 62. Dichas moléculas proporcionan una diana secundaria y una secuencia escindible marcada FRET, lo que permite la reacción homogénea (es decir sin separación del producto u otra manipulación tras la reacción) de la reacción de escisión invasiva secuencial. Otras realizaciones preferidas usan un sistema de reacción secundaria en la que la sonda FRET y la diana sintética se proporcionan como oligonucleótidos separados.

En una realización preferida, cada reacción posterior es facilitada (es decir, depende de) por el producto de la escisión previa, de modo que la presencia del producto último puede servir como indicador de la presencia del analito diana. No obstante, la escisión en la segunda reacción no tiene que depender de la presencia del producto de la reacción de escisión primaria; el producto de la reacción de escisión primaria puede simplemente potenciar de forma medible la velocidad de la segunda reacción de escisión.

En resumen, la cascada del ensayo INVASOR (es decir, las reacciones de escisión invasiva secuencial) de la presente invención es una combinación de dos o más ensayos lineales que permite la acumulación del producto último a una velocidad exponencial, pero sin un riesgo significativo de contaminación por trasferencia. Es importante destacar que el findo que no surge por la escisión secuencial, tal como ritura térmica de la sonda secundaria, en general aumenta linealmente con el tiempo. En contraste con esslo, la generación de la señal de una reacción secuencial de dos etapas sigue una cinética cuadrática. Por tanto, la recolección de datos como curso del tiempo, bien tomando puntos temporales o mediante el uso de un instrumento que permita la detección en tiempo real durante las incubaciones de la reacción en el ensayo INVASOR, proporciona la atractva capacidad de discriminar entre la señal verdadera y cualquier fondo únicamente sobre la base de incrementos cuadráticos frente lineales en la señal con el tiempo. Por ejemplo, cuando se ve gráficamente, la señal real aparecerá como una cruva cuadrática, mientras que cualquier fondo acumulado será lineal y, por tanto, fácil de distinguir, incluso si el nivel absoluto de la señal de fondo (p. ej., fluorescencia en un formato de detección FRET) es sustancial.

La amplificación de la escisión invasiva secuencial de la presente invención s epuede usar como refuerzo inetrmedio de cualquiera de los procedimientos de detección (p. ej., análisis basado en gel convencional o mediante inversión de carga), prolongación con polimerasa e incorporación den una región d eunión a la proteína, descrito en el presente documento. Cuando se usa en dichas combinaciones, la mayor producción de un producto de escisión específico en el ensayo de escisión invasiva reduce las cargas de la sensibilidad y la especificidad en los sistemas de lectura, facilitando de este modo su uso.

Además de permitir varias plataformas de detección, la estrategia de la cascada es adecuada para análisis multiplez de analitos individuales (es decir, ácidos nucleicos diana individuales) en una única reacción. El formato multiplez se puede clasificar en dos tipos. En un caso, es deseable conocer la identidad (y la cantidad) de cada uno de los analitos que pueden estar en una muestra clínica o la identidad de cada uno de los analitos así como control interno. Para identificar la presencia de múltiples analitos individuales en una única muestra se pueden incluir varios sistemas de amplificación secundaria. Cada sonda escindida en respuesta a la presencia de una secuencia diana concreta (o control interno) se puede deseñar para desencadenar una cascada diferente acoplada a diferentes restos detectables, tal como diferentes secuencias que se van a prolongar mediante ADN polimerasa o pigmentos diferentes en un formato FRET. La contribución de cada secuencia diana específica al producto final puede, de este modo, prolomgarse, permitiendo la detección cuantitativa de diferentes genes o alelos en una muestra que contiene una mezcla de genes o alelos.

En la segunda configuración, es deseable determinar si alguno de los diversos analitos están presentes en una muestra, pero la identidad exacta de cada uno no tiene porqué conocerse. Por ejemplo, en bancos de sangre es deseable conocer si uno cualquiera de un huésped de agentes infecciosos está presente en una muestra de sangre. Debido a que la sangre se desecha independientemente de qué agente está presente, no se requerirían diferentes señales de las sondas en una aplicación de este tipo de la presente invención y, de hecho, pueden ser indeseables por razones de confidencialidad. En este caso, los brazos en 5’ (es decir, la parte 5’ que se liberará tras la escisión) de las diferentes sondas específicas de analito serían idénticos y, por tanto, desencadenarían la misma cascada de señal secundaria. Una configuración similar permitiría múltiples sondas complementarias de un único gen que se va a usar para reforzar la señal de dicho gen o para garantizar la incuslividad cuando hay numerosos aletos de un gen a detectar.

En la reacción INVASOR primaria hay dos posibles fuentes de fondo. La primera procede de la escisión de la sonda independiente del INVASOR asociada con la diana, consigo misma o con uno de los otros oligonucleótidos presentes en la reacción. Se puede ver considerando las Figuras 96 y 97 de que las sondas de las reacciones de escisión primaria representadas están diseñadas para tener regioes de complementariedad con los otros oligonucleótidos implicados en las reacciones posteriores y, como se representa en la Figura 97, con otras regiones de la misma molécula. Por este motivo se prefiere el uso de una enzima que no puede escindir con eficacia una estructura que carece de un cebador (p. ej., que no puede escindir las estructuras representadas en las Figuras 16A

o 16 D). Como se muestra en las figuras 99 y 100, la enzima FEN-1 de Pfu no da escisión detectable en ausencia del oligonucleótido cadena arriba o incluso en presencia de un oligonucleótido cadena arriba que no invade el complejo sonda-diana. Esto indica que la endonucleasa FEN-1 de Pfu es una enzima adecuada para usar en los procedimientos de la presente invención.

Otras nucleadas específicas de estructura pueden ser adecuadas también. Como se ha comentado en el primer

ejemplo, algunas nucleadas 5’ se pueden usar en condiciones que reduzcan significativamente esta escisión independiente del cebador. Por ejemplo, se ha demostrado que cuando la nucleasa 5’ de DNAPTaq se usa para escindir las horquillas, la escisión idependiente de cebador se reduce marcadamente mediante la inclusión de una sal monovalente en la reacción (Lyamichev, et al., [1993], anteriormente).

Ensayo para escisión independiente de oligonucleótido INVASOR

Se puede realizar un sencillo ensayo para cualquier enzima en combinación con cualquier tampón de reacción para calcular la cantidad de escisión independiente de oligonucleótido INVASOR que cabe esperar a partir de dicha combinación. Una pequeña molécula de ensayo similar a una horquilla que se puede usar con o sin un cebador hibridado a un brazo en 3’, la molécula S-60, se representa en la Figura 30. La S-60 y el oligonucleotido P15 son un conjunto conveniente de moléculas para analizar la idoneidad de una enzima para aplicar en la presente invención y las condiciones de uso de estas moléculas se describen en el Ejemplo 11. Se pueden usar otras horquillas similares. Una estructura de escisión se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos distintos como se represente en las Figuras 99a-e. Las reacciones que usan estas estructuras para analizar la actividad de la enzma FEN-1 de Pfu en presencia o ausencia de un oligonucleótido solapante cadena arriba se describen en el Ejemplo 45 y los resultados se muestra en la Figura 100. Para analizar cualquier combinación concreta de enzima y condiciones de escisión se pueden montar reacciones similares. Fuera de las variables de las condiciones de reacción que se van a analizar para cualquier enzima concreta (p. ej., requisitos de sensibilidades de sales, cationes divalentes), las reacciones de ensayo se deberán adaptar a cuaquier limitación conocida de esta enzima de ensayo. Por ejemplo, las reacciones de ensayo se realizarán a una temperatura que está dentro del intervalo de temperaturas de funcionamiento de la enzima candidata, si se conoce.

No es necesario que se demuestren múltiples longitudes de solapamiento para cada enzima candidata, pero se deberá evaluar la actividad de la enzima en ausencia de un oligonucleótido cadena arriba (solapamiento de secuencia o físico) (como se muestra en la Figura 99ª y en presencia de un oligonucleótido que no solapa (Fig. 99b) Es preferible que las estructuras que carezcan de oligonucleótido cadena arriba se escindan a menos de la mitad de la velocidad observada en presencia de un oligonucleótido solapante cadena arriba. Es más preferible que estas estructuras se escindan a menos de aproximadamente un décimo de la velocidad de la estructura de escisión invasiva. Es lo más preferible la escisión de estas estructuras se produzca a menos de un porcentaje de la velocidad de la estructura de escisión invasiva.

Si el producto escindido es para servir como oligonucleótido cadena arriba en una posterior reacción de escisión, como se representa en la Figura 96, la reacción más rápida se conseguirá si los demás componentes de la segunda estructura de escisión (es decir, Diana 2 y Sonda 2 en la Figura 96) se proporcionan en exceso con respecto a la cantidad del primer producto de escisión, de modo que la escisión pueda proceder inmediatamente después de que esté disponible el oligonucleótido cadena arriba (es decir, la Sonda 1 Cortada en la Figura 96). Para proporcionar una abundancia de la segunda hebra o casete diana (Diana 2 en la Figura 96), se puede usar un ácido nucleico natural aislado, tal como ADN del bacteriófgo M13, o se puede usar un oligonucleótido sintético. Si se escoge un oligonucleótido sintético como la segunda secuencia diana, la secuencia empleada se analizará para las regiones de autocomplementariedad no pretendida (consideraciones similares se aplicarán a ácidos nucleicos naturales aislados tales como fragmentos de enzimas de restricción o productos de PCR; las dianas de ácido nucleico natural cuyos extremos 3’ se localizan 100 nucleótidos cadena abadjo del sitio de unión a la sonda sobre la hebra diana son, en general, lo bastante largos para obviar las consideraciones sobre diseño que se tratan más adelante).

Específicamente, se deberá determinar que el extremo 3’ del oligonucleótido sintético puede no hibridar con la hebra

diana (es decir, hibridación intracatenaria) cadena arriba de la sonda, lo que desencadena una escisión imprevista. El análisis simple de la secuencia del oligonucleótido sintético deberá revelar si el extremo 3’ tiene suficiente complementariedad con la región de la diana cadena arriba del sitio d eunión a la soda para suponer un problema (es decir, revelaría si el oligonucleótido sintético puede formar una horquilla en su extremo 3’ que podría actuar como un oligonucleótido invasor para producir la escisión de la segunda sonda en ausencia de la hibridación del oligonucleótido INVASOR previsto (es decir, el producto de escisión de la primera reacción de escisión invasiva)). Si

3 o más de los últimos 4 a 7 nucleótidos (la región 3’ terminal) de la diana sintética se pueden aparear las bases

cadena arriba de la sonda de modo que exista un solapamiento con el dúplex sonda-diana o demodo que los dúplex

formados por la hebra diana sintética con su propia región 3’ terminal y con la sonda pero sin un hueco y la región 3’ terminal tiene 1 o 2 nucleótidos adicionales sin aparear en el extremo 3’ de la diana sintética, la secuencia del

oligonucleótido diana sintético deberá modificarse. La secuencia se puede modificar para romper la intertacción de

la región 3’ terminal o para aumentar la distancia entre el sitio de unión a la sonda y las regiones a las que se une el extreno 3’. Como alternativa, el extremo 3’ se puede modificar para reducir su capacidad para dirigir la escisión (p. ej., añadiendo un fosfato en 3’ durante la síntesis) (véase el Ejemplo 35, Tabla 3) o añadiendo varios nucleótidos adicionales cuyas bases no se aparearán de un modo autocomplenentario (es decir, no participarán en la formación de una estructura en horquilla).

Cuando el producto de una primera reacción de escisión invasiva se diseña para formar una diana que se pueda plegar sobre sí misma para dirigir la escisión de una segunda sonda, el complejo IT como se representa en la Figura 97, se considerará el diseño de la secuencia usada para formar el piebucle del complejo IT. Factores a introducir en el diseño de dicha sonda son 1) la longitud de la región de autocomplementariedad, 2) el tipo de solapamiento (es

decir qué resto en 3’) y, si se selecciona un solapamiento en la secuencia, la longitud de la región del solapamieno

(región "X" en la Figura 25) y 3) la estabilidad de la horquilla o estrcutura pie/bucle como predice el apareamiento de bases de Watson-Crick y la presenca o ausencia de una secuencia bucle particularmente estable (p. ej., un tetrabucle [Tinoco y col., anteriormente], o un tribucle [Hirao y col., anteriormente]). Es deseable que esta secuencia tenga nucleótidos cuyas bases se pueden aparear (intracatenarias) de modo que se pueda producir la segunda ronda de escisión invasiva, pero que la estructura no sea tan fuerte que su presencia impida la escisión de la sonda en la reacción primaria (es decir, Sonda 1 en la Figura 96). Como se muesra en el presente documento, la presencia

de una estructura secundaria en el brazo 5’ de una estructura de escisión escindida por una nucleasa específica de

estructura puede inhibir la escisión por alguna nucleasa específica de estructura (Ej. 1).

La longitud de la región de autocomplementariedad dentro de la Sonda 1 determina la longitud de la región del dúplex cadena arriba de la Sonda 2 en la segunda estructura de escisión (véase la Fig. 97). Diferentes enzimas tienen diferentes demandas de longitud para este dúplex para efectuar la escisión invasiva de un modo eficaz. Por ejemplo, las enzimas FEN-1 de Pfu y FEN-2 de Mja se han analizado para determinar el efecto de esta longitud de dúplex usando el conjunto de moléculas oligonucleotídicas diana/INVASOR representadas en la Figura 98 (es decir, las SEC ID Nº 118, 119, 147-151). Las reacciones de escisión invasiva se realizaron como se ha descrito en el ejemplo 38, usando IT3 1 pM (SEC IN Nº 118), sonda PR1 2 M (SEC ID Nº 119) durante 5 minutos y las velocidades de escisión se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Longitud del dúplex: Renovación de FEN-1 de Pfu por minuto Renovación de FEN-1 de Mja por minuto

0
0
0

3: 1 29

4: 10 57

6: 44 51

8: 45 46

Los datos mostrados en la tabla 2 demyestran que la enzima FEN-2 de Pfu se puede usar con pies de 3 o 4 bases, pero que la velocidad de la escisión se maximiza cuando el pie tiene una longitud mayor de 4 pares de bases. La Tabla 2 muestra que la enzima FEN-1 de Mja se puede escindir con eficacia usando pies más cortos; no obstante, dado que esta enzima también puede escindir una sonda en ausencia de un oligonucleótido cadena arriba, no se prefiere el uso de FEN-1 de Mja en los procedimientos de escisión invsiva secuencial de la presente invención.

Un ensayo similar se puede realizar usando cualquier enzima candidata para determinar cuanta autocomplementariedad se puede diseñar en la Sonda 1. El uso de un pie más corto significa que la sonda global puede ser más corta. Esto es beneficioso porque las sondas más cortas son menos costosas de sintetizar y porque las sondas más cortas tendrán menos secuencias que podrían formar estructuras intracatenarias imprevistas. Al evaluar la actividad de una enzima candidata en las estructuras tales como las mostradas en la Figura 98, no se requiere que la longitud del pie escogido permita que se produzca la velocidad máxima de la escisión. Por ejemplo, al considerar el caso de la FEN-1 de Pfu, las ventajas de usar un pie de 4 pares de bases (p. ej., limitaciones de costes o secuencia) con una velocidad de escisión de 10 escisiones por minuto pueden superar la ventaja de la velocidad de usar un pie más largo de 6 pares de bases (44 escisiones/minuto) en el contexto de un experimento concreto. Entra dentro del alcance de la presente invención que algunos elementos escogidos para usar en el ensayo sean subóptimos para el rendimiento de dicho elemento concreto, si el uso del diseño subóptimo es beneficioso para los objetivos de dicho experimento concreto como un todo.

Al diseñar los oligonucleótidos que se van a emplear como sonda que, una vez escindida, forma una estructura de pie-bucle como se representa en la Figura 97 (es decir, la Sonda 1 en la Figura 97), se ha descubierto que la estabilidad del bucleo no es un factor en la eficiencia de la escisión de la Sonda 1 o la Sonda 2. Los bucles analizados han incluido tribucles estables, bucleo sde 3 y de 4 nucleótidos que no había predicho que fueran particularmentes estables (es decir, la estabilidad se determina con la secuencia del dúplex y no mediante interacciones estabilizantes adicionales dentro del bucle) y bucles grandes de hasta aproximadamente 25 nucleótidos.

IV. Fraccionamiento de ácidos nucleicos específicos por inversión de carga selectiva

Algunos ensayos de detección basados en ácido nucleico implican la prolongación y/o acortamiento de sondas oligonucleotídicas. Por ejemplo, como se describe en este documento, los ensayos de escisión dirigida por cebador, independiente de cebador y dirigida por INVASOR, así como el ensayo de “recorte” implican todos la escisión (es decir, acortamiento) de oligonucleótidos como un medio para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana. Los ejemplos de otros ensayos de detección que implican el acortamiento de una sonda

oligonucleotídica incluyen el ensayo “TaqMan” o de traslado del corte de PCR descritos en la Patente de Estados

Unidos Nº 5.210.015 de Gelfand y col., los ensayos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.775.619 y

5.118.605 de Urdea, el ensayo de amplificación por hibridación catalítica descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.403.711 de Walder y Walder y el ensayo de sonda cíclica descrito en las Patentes de Estados Unidos Nº

4.876.187 y 5.011.769) de Duck y col. Los ejemplos de ensayos de detección que implican la prolongación de una sonda oligonucleotídica (o cebador) incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y 4.683.202 de Mullis y Mullis y col. y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) descrita en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.427.930 y 5.494.810 de Birkenmeyer y col. y Barany y col. . Los anteriores ejemplos tienen por objeto ser ilustrativos de ensayos de detección basados en ácido nucleico que implica la prolongación y/o el acortamiento de sondas oligonucleotídicas y no proporcionan ninguna lista exhaustiva.

Típicamente, los ensayos de detección basados en ácido nucleico implican la prolongación y/o acortamiento de sondas oligonucleotídicas requieren análisis post-reacción para detectar los productos de la reacción. Es habitual que el producto o los productos de reacción específicos se tengan que separar de los demás componentes de reacción, incluyendo la sonda oligonucleotídica de entrada o sin reaccionar. Una técnica de detección implica la separación electroforética de la sonda oligonucleotídica reaccionada y no reaccionada. Cuando el ensayo implica la escisión o el acortamiento de la sonda, el producto no reaccionado será más largo que el producto reaccionado o escindido. Cuando el ensayo implica la prolongación de la sonda (o cebador), los productos de reacción serán de mayor longitud que la entrada. . La electroforesis basada en gel de una muestra que contiene moléculas de ácido nucleico de diferentes longitudes separa estos fragmentos principalmente basándose en el tamaño. Esto se debe al hecho de que en soluciones que tienen un pH neutro o alcalino, los ácidos nucleicos que tienen tamaños ampliamente diferentes (es decir, pesos moleculares) poseen proporciones de carga a masa muy similares y no se separan (Andrews, Elctrophoresis, 2ª Edición, Oxford University Press [1986], págs. 153-154]. La matriz de gel actúa como un tamiz molecular y permite que los ácidos nucleicos se separen basándose en el tamaño y la forma (por ejemplo, lineal, círculos circulares relajados o superenrollados cerrados covalentemente).

Los ácidos nucleicos no modificados tienen una carga neta negativa debido a la presencia de grupos fosfato cargados negativamente contenidos dentro de la estructura principal de fosfato de azúcar del ácido nucleico. Típicamente, la muestra se aplica al gel cerca del polo negativo y los fragmentos de ácido nucleico migran dentro del gel hacia el polo positivo moviéndose los fragmentos menores más rápidamente a través del gel.

La presente invención proporciona un medio novedoso para fraccionar fragmentos de ácido nucleico basándose en la carga. Esta técnica de separación novedosa está relacionada con la observación de que aductos cargados positivamente pueden afectar al comportamiento electroforético de pequeños oligonucleótidos debido a que la carga del aducto es significativamente relativa con respecto a la carga de todo el complejo. Además del uso de aductos cargados positivamente (por ejemplo, colorantes fluorescentes de amidita Cy3 y Cy5, los colorantes de unión a ADN heterodimérico cargados positivamente mostrados en la Fig. 66, etc.), el oligonucleótido puede contener aminoácidos (son aminoácidos particularmente útiles los aminoácidos cargados: lisina, arginina, aspartato, glutamato), bases modificadas, tales como bases amino-modificadas y/o una estructura principal de fosfonato (en todas o un subconjunto de las posiciones). En otras realizaciones, como se discute con más detalle más adelante, se puede emplear un colorante neutro o resto de detección (por ejemplo, biotina, estreptavidina, etc.) en lugar de un aducto cargado positivamente junto con el uso de bases amino-modificadas y/o una estructura principal de fosfonato completa o parcial.

Este efecto observado es de particular utilidad en ensayos basados en la escisión de moléculas de ADN. Usando los ensayos descritos en el presente documento como un ejemplo, cuando un oligonucleótido se acorta mediante la acción de una enzima CLEAVASE® u otro agente de escisión, la carga positiva se puede preparar para no

solamente disminuir significativamente la carga neta negativa, sino para de hecho anularla, “invirtiendo” de forma

eficaz la carga neta de la entidad marcada. Esta inversión de carga permite que los productos de escisión específica de diana se dividan de la sonda no escindida mediante medios extremadamente simples. Por ejemplo, los productos de escisión se pueden preparar para que migren hacia un electrodo negativo colocado en cualquier punto en un recipiente de reacción, para detección focalizada sin electrofóresis basada en gel; el Ejemplo 24 proporciona ejemplos de dispositivos adecuados para detección focalizada sin electrofóresis basada en gel. Cuando se usa un gel en placa, los pocillos de muestra se pueden colocar en el centro del gel, de tal forma que se puede observar que las sondas escindidas y no escindidas migran en direcciones opuestas. Como alternativa se puede usar un gel vertical tradicional, pero con los electrodos invertidos con respecto a los geles de ADN habituales (es decir, el electrodo positivo en la parte superior y el electrodo negativo en la parte inferior) de tal forma que las moléculas escindidas entran en el gel, mientras que las no escindidas se dispersan al depósito superior de tampón de electroforesis.

Un beneficio importante de este tipo de lectura es la naturaleza absoluta de la división de productos de sustratos (es decir, la separación es prácticamente del 100%.) Esto significa que se puede suministrar una abundancia de sonda no escindida para dirigir la etapa de hibridación del ensayo basado en sonda, aunque la sonda no consumida (es decir, no reaccionada) se puede restar, en esencia del resultado para disminuir el fondo por el hecho de que la sonda no reaccionada no migrará al mismo polo que el producto de reacción específico.

Mediante el uso de múltiples aductos cargados positivamente se pueden construir moléculas sintéticas con suficiente modificación para que la cadena cargada normalmente de forma negativa se haga prácticamente neutra. Cuando se construye de este modo, la presencia o ausencia de un único grupo fosfato puede significar la diferencia entre una carga neta negativa o una positiva neta. Esta observación tiene utilidad particular cuando un objetivo es

diferenciar entre fragmentos de ADN generados enzimáticamente, que carecen de un fosfato 3’ y los productos de degradación térmica, que generalmente conservan un fosfato 3’ (y, por lo tanto, dos cargas negativas adicionales). Los Ejemplos 22 y 23 demuestran la capacidad de separar productos de reacción cargados positivamente de un oligonucleótido sustrato cargado netamente de forma negativa. Como se discute en estos ejemplos, los oligonucleótidos se pueden transformar desde compuestos cargados negativos netos a netamente positivos. En el

Ej. 23, el colorante cargado positivamente Cy3 se incorporó en el extremo 5’ de un oligómero de 22 unidades (SEC ID Nº: 50) que también contenía dos restos aminosustituidos en el extremo 5’ del oligonucleótido; esta sonda oligonucleotídica lleva una carga neta negativa. Después de la escisión, que tuvo lugar 2 nucleótidos dentro de la sonda, se liberó el siguiente oligonucleótido marcado: 5’-Cy3-AminoT-AminoT-3’ (además de los fragmentos sin marcar que comprenden los 20 nucleótidos remanentes de la SEC ID Nº 50). Este fragmento corto lleva una carga neta positiva mientras que el resto del oligonucleótido escindido y el oligonucleótido no reaccionado o de entrada llevan cargas netas negativas.

La presente invención considera realizaciones en las que el producto de reacción específico producido por cualquier escisión de cualquier oligonucleótido se puede diseñar para llevar una carga neta positiva mientras que la sonda no reaccionada es de carga neutra o lleva una carga neta negativa. La presente invención también considera realizaciones en las que el producto liberado se puede diseñar para llevar una carga neta negativa mientras que el ácido nucleico de entrada lleva una carga neta positiva. Dependiendo de la longitud del producto liberado a detectar, se pueden incorporar colorantes cargados positivamente en un extremo de la sonda y se pueden colocar bases modificadas a lo largo del oligonucleótido de tal forma que después de la escisión, el fragmento liberado que contiene el colorante cargado positivamente lleva una carga neta positiva. Se pueden usar bases aminomodificadas para equilibrar la carga del fragmento liberado en los casos en los que la presencia del aducto cargado positivamente (por ejemplo, colorante) solo no es suficiente para impartir una carga neta positiva al fragmento liberado. Además, la estructura principal de fosfato se puede sustituir con una estructura principal de fosfonato a un nivel suficiente para impartir una carga neta positiva (esto es particularmente útil cuando la secuencia del oligonucleótido no es susceptible al uso de bases aminosustituidas). Las Figuras 45 y 46 muestran la estructura de oligonucleótidos cortos que contienen un grupo fosfonato en el segundo residuo T). Un oligonucleótido que contiene una estructura principal completamente sustituida por fosfonato tendría una carga neutra (sin presencia de restos cargados modificados que llevan una carga o presencia de un aducto cargado) debido a la ausencia de los grupos fosfato cargados negativamente. Los nucleótidos que contienen fosfonato (por ejemplo, nucleótidos que contienen metilfosfonato están fácilmente disponibles y se pueden incorporar en cualquier posición de un oligonucleótido durante la síntesis usando técnicas que se conocen bien en la técnica.

En esencia, la invención contempla el uso de separación basada en carga para permitir la separación de productos de reacción específicos de los oligonucleótidos de entrada en ensayos de detección basados en ácido nucleico. El fundamento de esta técnica de separación novedosa es el diseño y el uso de sondas oligonucleotídicas

(denominadas típicamente “cebadores” en el caso de PCR) que están “equilibradas en carga” de tal forma que después de cada escisión o prolongación de la sonda, se convierte en “no equilibrada en carga” y los productos de reacción específicos se pueden separar de los reactantes de entrada basándose en la carga neta.

En el contexto de ensayos que implican la prolongación de una sonda oligonucleotídica (es decir, un cebador), tal como es el caso en PCR, los cebadores de entrada están diseñados para llevar una carga neta positiva. La prolongación del cebador oligonucleotídico corto durante la polimerización generará productos de PCR que llevan ahora una carga neta negativa. Los productos de reacción específicos se pueden separar entonces de forma sencilla y eliminar por concentración de los cebadores de entrada usando la técnica de separación basada en carga que se describe en este documento (los electrodos se invertirán con respecto a la descripción en el Ej. 23, ya que el producto a separar y concentrar después de una PCR llevará una carga negativa).

V. Mejora de la señal mediante prolongación de los productos de reacción en el ensayo de escisión dirigida por oligonucleótido INVASOR

Se ha determinado que cuando se usan sondas oligonucleotídicas en ensayos de detección de escisión a temperatura elevada, cierta fracción de las sondas truncadas se habrá acortado por degradación térmica no específica y que tales productos de descomposición pueden hacer que el análisis de los datos de escisión específica de diana sea más difícil. La degradación térmica que crea una escalera de bandas de fondo cuando las sondas de la presente invención se tratan a una temperatura elevada durante más de unos minutos se produce como un proceso de dos etapas. En la primera etapa se rompe el enlace N-glicosílico, dejando un sitio abásico en la hebra de ADN. En el sitio abásico, la cadena de ADN se debilita y sufre escisión espontánea mediante un proceso de eliminación beta. Se ha determinado que las bases de purina son aproximadamente 20 veces más susceptibles a la rotura que las bases de pirimidina (Lindahl, Nature 362:709 [1993]). Esto sugiere que un modo de reducor el fondo en procedimientos usando oligonucleótidos a temperaturas elevadas es seleccionar secuencias diana que permitan el uso de sondas ricas en pirimidina. Es preferible, cuando sea posible, usar oligonucleótidos completamente compuestos por residuos de pirimidina. Si se usa solo una o algunas pocas purinas, la rotura de fondo aparecerá principalmente en los sitios correspondientes y estas bandas (debido a la degradación térmica) se pueden confundir con los productos de escisión prevista si no se toman precauciones en el análisis de datos (es decir, se deben ejecutar los controles adecuados).

La escisión de fondo debido a la degradación térmica de los oligonucleótidos sonda puede, cuando no se han resuelto a partir de productos de escisión específicos, reducir la precisión de la cuantificación d elos ácidos nucleicos diana basados en la cantidad de producto acumulado en un marco de tiempo fijado. Un medio para distinguir los productos específicos de los no específicos se ha descrito anteriormente y se basa en la división de los productos de estas reacciones mediante diferencias en las cargas netas llevadas por las diferentes especies moleculares en la reacción. Como se señaló en esa discusión, los productos de descomposición térmica conservan habitualmente fosfatos 3’ después de la descomposición, mientras que los productos escindidos por enzima, no. Las dos cargas negativas en el fosfato facilitan la división basada en carga de los productos.

La ausencia de un fosfato 3’ en el subconjunto deseado de los fragmentos de sonda se puede usar de forma provechosa también en ensayos enzimáticos. Las polimerasas de ácido nucleico, tanto sin molde (por ejemplo, desoxinucleotidil transferasa terminal, polimerasa poli A) como dependientes de molde (por ejemplo, ADN polimerasas de tipo Pol 1) requieren un hidroxilo 3’ disponible al que unir nucleótidos adicionales. Esta selección enzimática de estructura terminal 3’ se puede usar como un medio eficaz para la división específica de productos no

específicos.

Además de los beneficios de la división que se ha descrito anteriormente, la adición de nucleótidos al extremo del producto específico de una escisión específica de invasor ofrece una oportunidad de añadir marcador a los productos, de añadir colas capturables para facilitar sistemas de lectura basadas en soporte sólido o para realizar estas dos cosas al mismo tiempo. Algunas posibles realizaciones de este concepto se ilustran en la Fig. 56.

En la Fig. 56, se muestra una estructura de escisión por INVASOR que comprende un oligonucleótido INVASOR que

contiene un extremo 3’ bloqueado o no extensible (por ejemplo, un didesoxi nucleótido 3’) y un oligonucleótido sonda que contiene un extremo 3’ bloqueado o no extensible (el círculo abierto en el extremo 3’ de los oligonucleótidos representa un nucleótido no extensible) y un ácido nucleico diana; el oligonucleótido sonda puede contener un

marcador de extremo 5’ tal como un marcador de biotina o de fluoresceína (indicado por las estrellas) (estructuras de escisión que emplean una sonda marcada con biotina 5’ o una sonda marcada con fluoresceína 5’ se muestran debajo del diagrama grande de la estructura de escisión a la izquierda y la derecha, respectivamente). Después de la escisión de la sonda (el sitio de escisión se indica por la punta de flecha grande), la sonda marcada con biotina escindida se extiende usando una polimerasa independiente de molde (por ejemplo, TdT) y nucleótidos trifosfato fluoresceínados. La molécula de sonda escindida prolongada con fluoresceína se captura después mediante unión por su marcador de biotina 5’ a estreptavidina y después se mide la fluorescencia. Como alternativa, después de la escisión de una sonda marcada con fluoresceína en 5’, la sonda escindida se extiende usando una polimerasa

independiente de molde (por ejemplo, TdT) y d ATP. La molécula de sonda escindida poliadenilada (prolongada con A) se captura después mediante la unión por la cola poli A al oligonucleótido dT unido a un soporte sólido.

Los ejemplos descritos en la Fig. 56 se basan en el uso de TdT para prolongar los productos específicos de escisión dirigida por INVASOR. La descripción del uso de esta enzima concreta se presenta a modo de ejemplo y no pretende ser una limitación (de hecho, cuando se emplean oligonucleótidos sonda que comprenden ARN, las sondas de ARN escindidas se pueden extender usando polimerasa poli A). Se considera que un ensayo de este tipo se podría configurar para usar una polimerasa dependiente de molde, como se ha descrito anteriormente. Aunque esto requeriría la presencia de un molde copia adecuado distinto del ácido nucleico diana, sobre el que el oligonucleótido truncado podría cebar la síntesis, se puede prever que una sonda que antes de la escisión sería no extensible, debido a cualquier apareamiento erróneo o modificación del extremo 3’, se podría activar como un cebador cuando se escinde por una escisión dirigida por INVASOR. Una reacción de prolongación dirigida por molde también tiene la ventaja de permitir una mayor selección y control de los nucleótidos incorporados.

El uso de prolongación sin molde no requiere la presencia de ningún ácido nucleico adicional en la reacción de detección, evitando una etapa de desarrollo de ensayo y resolución de problemas. Además, el uso de síntesis sin molde eliminó la etapa de hibridación, acelerando potencialmente el ensayo. Además, la enzima TdT es rápida, capaz de añadir al menos > 700 nucleótidos a oligonucleótidos sustrato en una reacción de 15 minutos.

Como se ha mencionado anteriormente, las colas añadidas se pueden usar de varias maneras. Se pueden usar como un modo directo de restos marcados al producto de escisión para aumentar la señal de cada acontecimiento de escisión. Una reacción de este tipo se ilustra en el lado izquierdo de la Fig. 66. Los restos marcados pueden ser cualquier cosa que, cuando se añada a un nucleótido, se añada por la enzima de prolongación, tales como moléculas de colorante, haptenos tales como digoxigenina u otros grupos de unión tales como biotina.

En una realización preferida, el ensayo incluye un medio para capturar o dividir específicamente los productos de escisión dirigida por INVASOR en la mezcla. Se puede observar que ácidos nucleicos diana en la mezcla se pueden prolongar durante la reacción. Si se añade un marcador, es deseable dividir los productos de escisión dirigida por INVSOR prolongados de estas otras moléculas marcadas para evitar fondos en estos resultados. Esto se realiza de forma sencilla si solamente el producto de escisión es capaz de ser capturado. Por ejemplo, hay que considerar un

ensayo de escisión de la presente invención en el que la sonda usada tiene una biotina en el extremo 5’ y se bloquea contra la extensión en el extremo 3’ y en el que se añade un colorante durante la prolongación. Hay que considerar además que los productos se tienen que capturar sobre un soporte mediante el resto de biotina y el colorante capturado se mide para evaluar la presencia del ácido nucleico diana. Cuando se añade el marcador por prolongación, solamente se marcarán las sondas escindidas específicamente. Las sondas no cortadas residuales todavía se pueden unir en la etapa de captura final, pero no contribuirán a la señal. n la misma reacción, las mellas y cortes en el ácido nucleico diana se pueden prolongar por la enzima y, por tanto, marcarse con colorante. En la captura final, estas dianas marcadas no se unirán al soporte y, por tanto, aunque marcadas, no contribuirán a la señal. Si se considera que el producto específico final está constituido por dos partes, la parte obtenida de sonda y la parte de cola, se puede observar a partir de esta discusión que se prefiere particularmente que cuando se usa la parte obtenida de sonda para la captura específica, por hibridación, biotina/estreptavidina u otro procedimiento, que el marcador se asocia a la parte de cola. Por el contrario, si se une un marcador a la parte obtenida de sonda, entonces la parte de cola se puede adecuar para la captura, como se ilustra en el lado derecho de la Fig. 66. Las colas se pueden capturar de varios modos, incluyendo hibridación, incorporación de biotina con captura de estreptavidina o mediante el hecho de que las moléculas más largas se unen de forma más predecible y de manera más eficaz a varias matrices de unión de ácido nucleico, tales como nitrocelulosa, nylon o vidrio, en membrana, papel, resina u otra forma. Aunque no se requiere para este ensayo, esta separación de funciones permite la exclusión eficaz de señal tanto de sonda no reaccionada como de ácido nucleico diana prolongado.

Además de los soportes que se han descrito anteriormente, los productos prolongados se pueden capturar sobre cualquier soporte sólido que contenga un resto de captura adecuado. Por ejemplo, los productos biotinilados se capturan generalmente con superficies tratadas con avidina. Estas superficies de avidina pueden estar en pocillos de placa de microtitulación, sobre perlas, sobre varillas, por nombrar solamente una pocas de las posibilidades. Tales superficies también se pueden modificar para contener oligonucleótidos específicos, permitiendo la captura de producto mediante hibridación. Generalmente, los expertos en la técnica conocen las superficies de captura como se describen en el presente documento e incluyen varillas de nitrocelulosa (por ejemplo, GENECOMB, BioRad, Hercules, CA).

VI. Mejora de señal por finalización de un sitio de unión a proteína activado

Además de la reacción de prolongación con ADN polimerasa descrita anteriormente, la presente invención también contempla el uso de los productos de la reacción de escisión invasiva para formar sitios de unión a proteína activados, tales como dúplex de promotor de la ARN polimerasa, de modo que se permite la interacción del sitio completado para usar como indicador de la presencia del ácido nucleico que es la diana de la reacción de escisión invasiva. A modo de ejemplo, cuando un dúplex de promotor de ARN polimerasa se activa haciéndose que se complete (es decir, que sea bicatentario sobre dicha parte de la región promotora requerida para la unión de la polimersas) a través de la hibridación del porducto oligonucleotídico de la reacción de escisión invasiva, se puede usr la síntesis de ARN como tal indicador.

No se pretende que la reacción de transcripción de la presente invención esté limitada al uso de una ARN polimerasa concreta o región promotora de ARN polimerasa. Las secuencias promotoras están bien caracterizadas para varios bacteriófagos, incluidos los bacteriófagos SP6, T7 y T3. Adem´S, las secuencias promotoras se han caracterizado bien para una serie de ARN polimerasas tanto eucariotas como procariotas. En una realización preferida, el promotor usadopermite la transcripción a partir de una de las ARN polimerasas del bacteriófago. En una realización particularmente preferida, el promotor usado permite la transcripción mediante la ARN polimerasa de T7. En la técnica se conocen medios para realizar la transcripción in vitro y se dispone de kit comerciales para realizar la transcripción con ARN polimerasas eucariotas, procariotas o de bacteriófagos (p. ej., de Promega Corp., Madison, WI).

Las regiones de unión a proteína d ela presente invención no están limitadas a los promotores de la ARN polimerasas de bacteriófago descritas anteriormente. Otras secuencias promotoras que se contemplan son las de procariotas y eucariotas. Por ejemplo, se usan muchas cepas de bacterias y hongos para la expresión de proteínas heterólogas. Los promotores mínimos requeridos para la transcripción mediante las ARN polimerasas de organismos talescomo levaduras y otros hongos, eubacterias, nematodos y células de mamífero cultivadas están bien descritos en la literatura y en los catálogos de suministradores comerciales de vectores de ADN para la expresión de proteínas extrañas en estos organismos.

Los sitios de unión para otros tipos de protrínas de unión a ácido nucleico (p. ej., ADN) se contemplan para usar en la presente invención. Por ejemplo, las proteínas implicads en la regulación de los genes ejercen sus efectos uniéndose al ADN en las proximidades del promotor a partir del cual se transcribe el ARN de dicho gen. El operador lac de E. coli es un ejemplo de un sistema de regulación génica particularmente bien caracterizado y de uso habitual en el que la proteína represora lac se une a secuencias específicas que solapan, y por tanto bloquean, el promotor para los genes bajo el control del represor (Jacob and y Monod, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biol. XXVI:193-211 [1961]). Se han descrito muchos sistemas similares en bacterias, incluidos los sistemas reguladores trp y AraC. Dada la gran cantidad de información disponible sobre los promotores bacterianos, las etapas descritas más adelante para el diseño de promotores parciales adecuados para las ARN polimerasas de bacteriófago se pueden adaptar fácilmente al diseño de los sistemas de detección basados en estos otros promotores.

Como se ha indicado anteriormente, muchos de los promotores bacterianos están bajo el control de un represor u otra proteína reguladora. Se considera dentro del alcance de la presente invención incluir la creación de sitios de unión compuestos para estras proteínas reguladoras a través de la provisión de un fragmento de ácido nucleico (p. ej., un producto de escisión no diana generado en una reacción de escisión invasiva). La unión de la proteína reguladora a la región de unión a proteína completada (p. ej., la región de unión compuesta) se puede evaluar mediante uno de numerosos medios, incluida la migración electroforéticoa retardada de la proteína o el fragmento de ADN o mediante un cambio conformacional en la proteína o el ADN tras la unión. Además, la transcripción de un promotor cadena abajo se puede monitorizar para determinar la regulación por aumento o por disminución como resultado de la unión de la proteína reguladora a la región de unión a proteína completada.

Además de los sistemas bacterianos descritos anteriormente, también se ha descuierto que muchos genes en sistemas eucariotas están bajo el control de proteínas específicas que se unen a regiones específicas del ADN dúplex. Ejemplos incluyen, entre otros, las proteínas OCT-1, OCT-2 y AP-4 en mamíferos y las proteínas GAL4 y GCN4 en levaduras. Dichas proteínas reguladoras normalmente tienen un motivo estructural asociado con la unión de ácido nucleico dúplex, tal como hélice-giro-hélice, un dedo de cinc o una cremallera de leucina [para una revisión, véase, Molecular and Cellular Biology, Wolfe (Ed.), Wadsworth Publishing Co., Belmont, CA, pág. 694-715 [1993]).

Para simplificar la reacción de ensayo descrita en el presente documento se hará referencia a la ARN polimerasa de T7, y a su promotor. No se pretende que esto limite la invención al uso de esta ARN polimerasa y los expertos en la técnica de biología molecular serán capaces de adaptar con facilidad el ensayo descrito al análisis de cualquiera de las proteínas de unión a ADN, ARN polimerasas y su unión o los sitios promotores comentados anteriormente.

En la técnic se conoce que se pueden formar promotores de T7 activos mediante la hibridación de dos oligonucleótidos, comprendiendo cadauno la hebra superior o inferior de la secuencia promotora, de modo que se forma un promotor del dúplex sin mella y completo (Milligan y col., Nucl. Acids Res., 15:21, 8783-8798 (1987)]. La presente invención muestra que un modo de hacer que el inicio de la transcripción dependa de los productos de una reacción de escisión invasiva es diseñar la sonda para la reacción de escisión de un modo tal que una parte de un promotor de la ARN polimerasa se libere como producto. La parte o partes de ADN restantes que tienen que ensamblar un dúplex promotor pueden proporcionarse como elementos en la mezcla de reacción o se pueden producir mediante otros acontecimientos de escisión invasiva. Si las piezas oligonucleotídicas están diseñadas para comprender regiones adecuadas de complementariedad, se pueden aparear las bases para formar un dúplex promotor completo compuesto por tres o más fragmentos de ácido nucleico, como se representa en la Figura 88B. Un promotor ensamblado de este modo tendrá mellas en la estrcutura de una o ambas hebras. En una realización, estas mellas pueden cerrarse covalentemente mediante el uso de una enzima ADN ligasa. En una realización preferida, las mellas están colocadas de un modo tal que la transcripción puede porgresar sin necesidad de ligación. Al seleccionar el sitio de una mella creada mediante el ensamblaje del fragmento parcial del promotor, al menos una mella deberá estar dentro de la región promotora reconocida para usar la ARN polimerasa. Cuando se usa un promotor de bacteriófago, una mella deberá estar entre los nucleótidos -17 y -1, medida desde el sitio del inicio de la transcripción a +1. En una realización preferida, una mella estará entre los nucleótidos -13 y -8. En una realización particularmente preferida, una mella estará entre los nucleótidos -12 y -10 sobre la hebra no molde del promotor del bacteriófago.

Cuando las mellas no se van a reparar (Es decir, no se van a cerrar covalentemente con una ADN ligasa), es importante evaluar el efecto de la localización de la mella sobre el nivel de la transcripción a partir del promotor ensamblado. Un simple ensayo es combinar los oligonucleótidos que comprenden las partes distintas del promotor con un oligonucleótido que comprende una hebra entera del promotor que se va a ensamblar, de modo que se forma un promotor dúplex con una mella en una hebra. Si la mella está en la hebra superior o no molde del promotor, se hace que el oligonucleótido que comprende el promotor completo incluya secuencias no promotoras adicionales en su extremo 5’ para servir como molde a copiar en la transcripción. Estas disposición se representa en la Figura 88B. Como alternativa, si la mella va a estar en la hebra inferior o molde del promotor, el oligonucleótido del promotor parcial qe cubre la posición +1, el sitio de inicio de la transcripción, incluirá la secuencia molde adicional. Esta disposición se representa en las Figuras 95A-D (en esta Figura se muestran varias realizaciones diferentes en las que se usa una sonda cortada o producto de escisión no diana para formar un promotor compuesto que contienen una o más mellas en la hebra molde). En cualquier caso, los oligonucleótidos separados se combinan para formar el promotor completo y el ensamblaje se usa en una reacción de transcripción para crear ARN.

Para medir el efecto de la mella se crea un fragmento de promotor sustancialmente idéntico mediante hibridación de dos oligonucleótidos cada uno de ellos compuesto por una hebra del promotor de longitud completa, para crear una versión sin mellas del mismo promotor. Estos dos ensamblajes moleculares se analizan en reacciones de transcripción paralelas y la cantidadde ARN previsto que se produce en cada reacción se mide tanto para el tamaño como para el rendimiento. Un procedimiento preferido de evaluar el tamaño del ARN es mediante electroforesis con visualización posterior. Si en la transcripción se usa un nucleótido marcado (p. ej., 32P-GTP o fluoresceína-UTP), el ARN se puede detector y cuantificar mediante autorradiografía, formación de imágenes fluorescents o mediante transferencia a la membrane de soporte con la posterior detección (p. ej., mediante anticuerpos o hibridación con sonda). Como alternativa, si se produce ARN sin marcar, las cantidades se pueden determinar mediante otros procedimientos conocidos en la técnica, tal como mediante espectrofotometría o mediante electroforesis con posterior tinción y comparación con patrones conocidos.

Si el tamaño del ARN es como se ha prevsito con la secuencia molde o si coincide con el producido a partir del promotor control, s epuede suponer que la transcripción se ha inicidado en el mismo sitio del complejo y que se ha producido esencialmente el mismo producto de ARN. Si el producto es mucho más corto, la transcripción se ha iniciado en un sitio interno o ha terminado de forma prematura (Schenborn and Mierendorf, Nucl. Acids Res., 13:17, 6223 [1985]; y Milligan y col., anteriormente). Aunque esto no indica que el ensamblaje analizado sea completamente inadecuado para el ensayo, los tránscritos parciales reducirán la cantidad bruta de ARN creado, quizá comprometiendo la señal del ensayo, y dichos productos requerirían caracterización posterior (p. ej., impresión de huella o secuenciación) para identificar el contenido en nucleótidos del producto. Se prefiere que el tamaño del ARN producido coincida con el ARN producido en la reacción control.

El rendimiento de la reacción también se analiza. No es necesario que el nivel de transcripción coincida con el de la reacción control. En algunos casos (véase el Ejemplo 41 más adelante), el promotor con mella puede tener mayor velocidad de transcripción, mientras que en otras disposiciones la transcripción se puede reducir (con respecto a la velocidad del ensamblaje del promotor sin mellar). Solo se requiere que la cantidad de producto esté dentro de los límites de detección del procedimiento que se va a usar con el promotor de ensayo.

Se indica que la transcripción a partir de un promotor de bacteriófago puede producir de 200 a 1000 copias de cada molde de transcripción (molde más promotor activo) en una reacción. Estos niveles de transcripción no son necesarios en la presente invención. Las reacciones en las que se produce un ARN para cada molde también se contemplan.

El ensayo descrito anteriormente permitirá evaluar la utilidad en este ensayo de un promotor con una mella en cualquier posición. Es un objetivo dela invención proporcionar uno o más de los oligonucleótidos que comprenden una región promotora parcial a través de acontecimiento(s) de escisión invasiva. En esta realización, las secuencias promotoras parciales están unidas al oligonucleótido sonda en el ensayo de escisión invasiva y se liberan mediante escisión en un sitio específico, dirigido por el oligonucleótido INVASOR. También se pretende que la transcripción sera muy poca o inexistente en ausencia de la sonda correctamente escindida. Para evaluar el éxito de cualquier diseño de oligonucleótido en lo que respecta al cumplimiento de estos objetivos, se pueden realizar varios ensayos de la reacción de transcripción.

Para un ensamblaje de promotor que tenga una mella en la hebra no molde, en las figuras 86A-D se muestran varios ensamblajes parciales que deberán analizarse. A modo de ejemplo, pero sin limitaciones, esta Figura representa los

ensayos para un promotor con ella en el que la parte cadena arriba o 5’ de la hebra no molde se ha de proporcionar

por el ensayo de escisión invasiva. Este fragmento se ve en la Figura 86A marcado como "sonda cortada". Las reacciones de transcripción incubadas en presencia del dúplex mostradas en la Fig. 86A analizarán la capacidad del promotor parcial cadena arriba para permitir el inicio de la transcripción cuando hibrida con una hebra inferior, denominada un “molde copia”. De forma similar, una reacción realizada en presencia del dúplex representado en la Fig. 86B se analizará para determinar la capacidad del fragmento promotor parcial más cercano al sitio de iniciación (el stio +1, como se indica en la Figura 85B) para soportar la transcripción del molde copia. Es una característica importante de la presente invención que ninguno de estos dúplex del promotor parcial puede soportar la transcripción al mismo nivel que se vería en la transcripción a partir de un promotor intacto como se representa en la Figura 85B. Se prefiere que ninguno de estos promotores parciales sera suficiente para iniciar la transcripción detectable en el mismo curso de tiempo de una reacción de transcripción media (es decir, en aproximadmente una hora de incubación).

Las figuras 86C y 86D representan otras dos disposiciones de duplex diseñadas para analizar el efecto de la sonda sin cortar dentro de la reacción de transcripción. La Figura 86C representa el duplex formado entre ´únicamente la sonda sin cortar y el molde copia, mientras que la Figura 86D incluye la otra parte del promotor. La región 3’ de la sonda no es complementaria a la secuencia promotora y, por tanto, produce una rama sin aparear en el medio del promotor. Es una característica importante de la presente invención que ninguno de estos dúplex del promotor ramificados puede soportar la transcripción al mismo nivel que se vería en la transcripción a partir de un promotor intacto como se representa en la Figura 85B. Se prefiere que ninguno de estos promotores ramificados sera suficiente para iniciar la transcripción detectable en el mismo curso de tiempo de una reacción de transcripción media (es decir, en aproximadmente una hora de incubación).

En una realización del sistema de transcripción de la presente invención, el inicio de la transcripción a partir del molde copia en ausencia de un promotor completo o en presencia de un promotor ramificado se evita mediante la colocación juiciosa de la mella o mellas en el promtor compuesto. Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos siguientes, la colocación de una mella entre los nucleótidos -12 y -11 de la hebra no molde del promotor del bacteriófago T7, permite que la transcripción solo se produzca cuando la sonda ha sido cortada con éxito, como en una reacción de escisión invasiva. No obstante, en algunos casos en las que la reacción de escisión invasiva es proporcionar la parte cadena arriba de la hebra no molde del promotor (p. ej., como se representa en la Figura 88B), puede ser necesario o deseabl colocar la mella en dicha hebra en una posición concreta por motivos distintos a proporcionar un promotor compuesto óptimo (es decir, uno que esté inactivo en ausencia de una cualquiera de laspartes promotoras). Puede ser necesario o deseable colocar la mella de tal modo que la creación de un promotor completo ramificado (Fig. 86D) tenga un nivel de transcripción indeseable, reduciendo la dependencia de la producción del ARN del éxito de la etapa de escisión invasiva. En los ejemplos siguientesse muestra que la transcripción a partir de dicho promotor ramificado se puede suprimir mediante una modificación de la parte promotora no moldecadena abajo, mostrado como el “Oligonucleótido promotor parcial” en las Figuras 86, 88, 90 y 95D. Como se representa en la Figura 90, el oligonucleótido promotor parcial se puede proporcionar con una “cola” de nucleótidos en 5’ que no son complementarios a la hebra molde del promotor pero que sí son complementarios a la parte 3’ del oligonucleótido sonda que se eliminaría en la reacción de escisión invasiva. Cuando la sonda sin cortar hibrida con el molde copia con el oligonucleótido promotor parcial con la cola en 5', la cola en 5' se puede aparear con la región en 3' de la sonda, formando una unión de tres vías como se representa en la Figura 90A. Esto puede apagar la transcripción con eficacia, como se muestra a continuación. Cuando una sonda cortada hibrida, como se muestra en la Figura 90B, se forma un promotor con un brazo pequeño y, en el presente documento, se muestra que dicho promotor ramificado puede iniciar la transcripción. Además, si se tiene cuidado a la hora de seleccionar la secuencia de la cola en 5' (es decir, si la primera base sin aparear es el mismo nucleótido en el nucleótido 3' de la sonda cortada, de modo que compite’ por hibridar con la misma base de la hebra molde), la estructura ramificada resultante también se puede escindir mediante las nucleadas específicas de estructura de la presente invención, de modo que se crea el promotor sin ramificar de la Figura 90C, en algunos casos potenciando la transcripción sobre la observada con el promotor de la Figura 90B.

El dúplex promotor que es pretende crear en esta realización mediante la ejecución con éxito del ensayo de escisión dirigida por INVASOR incluirá la “sonda cortada” y el oligonucleótido promotor parcial representados en las Figuras 86A y B, alineados sobre un ácido nucleico molde copia sencillo. El análisis de la eficiencia de la transcripción de dicho segmento promotor con mella en comparación con el promotor intacto se describe anteriormente. Todos los oligonucleótidos descritos para estas moléculas de ensayo se pueden crear usando químicas de síntesis convencional.

El conjunto de las moléculas de ensayo representadas en la Figura 86 está diseñado para evaluar las capacidades

de transcripción de las diversas estructuras que pueden estar presentes en las reacciones en las que la parte 5’ de

la hebra no molde del promotor son suministradas por la esicisón dirigida por INVASOR. También se ha concebido que la reacción de escisión invasiva puede suministrar una parte diferente del promotor parcial (p. ej., el segmento cadena abjo de la hebra no molde del promotor), como se muestra en la Figura 94. Las porciones de la hebra molde del promotor también puede suministrarlas la sonda cortada, como se muestra en las Figuras 95A-D. Se puede crear

un conjunto nálogo de moléculas de ensayo, incluidas las versions “cortada” y sin cortar de la sonda que se va a

usar en el ensayo de escisión invasivo para analizar cualuiqe diseño alternative, se localice la mella en la hebra molde o en la hebra no molde del promotor.

Los procedimientos de visualización basados en la transcripción de la presente invención s epueden usar de un modo multiplex. Las reacciones se pueden construir de un modo tal que la presencia de una diana concreta conduzca a la transcripción a partir de un tipo de promotor, mientras que la presencia de una secuencia diana diferente (p. ej., un mutante o variante) u otra diana que se sospecha que está presente, puede conducir a la transcripción a partir de un tipo de promotor diferente (es decir, un segundo). En dicha realización, la identidad del promotor a partir del cual se inició la transcripción podría deducirse a partir del tipo o tamaño del ARN producido.

A modo de ejemplo, sin limitaciones, los promotores de bacteriófago se pueden comparar con dicha aplicación a la vista. Los promotores para los fagos T7, T3 y SP6 son bastante similares, teniendo cada uno de ellos una longitud de aproximadamente 15 a 20 pares de bases y compartiendo una identidad de aproximadamente el 45 % entre los nucleótidos -17 y -1, respecto al inicio de la transcripción. A pesar de estas similitudes, las ARN polimerasas de estos fagos son altamente específicas para sus promotores conocidos, de modo que los demás promotores pueden estar presentes en una reacción pero no se transcribirán (Chamberlin y Ryan, Enzymes XV:87-108 [1982]). Dado que estos promotores son tienen un tamaño y un modo de ser reconocidos por sus polimerasas similares (Li y col., Biochem. 35:3722 *[1996]), se pueden diseñar versions melladas de los promotores similares para usar en los procedimientos de la presente invención por analogía con los ejemplos descritos en el presente documento que emplean el promotor T7. Dado el elevado grado de especificidad de las ARN polimerasas, estos promotores mellados se pueden usar juntos para detectar múltiples dianas en una única reacción. Hay muchos casos en los que sería muy deseable detectar múltiples doanas de ácido nucleico en una única muestra, incluidos los casos en los que pueden estar presentes múltiples infecciosos o en los que las variantes de un único tipo de diana pueden tener que identificarse. Como alternativa, a menudo es deseable usar una combinación de sondas para detectar una secuencia diana y una secuencia de control interno para calcular los efectos de los contaminantes de la muestra sobre el resultado del ensayo. El uso de múltiples promotores permite evaluar la reacción según la eficacia de la escisión invasiva y la solidez de la transcripción.

Como se ha indicado anteriormente, los promotores de fagos se describieron con detalla como ejemplo de regiones de unión a proteína adecuadas (p. ej., que se pueden usar para generar un promotor compuesto) para usar en los procedimientos de la presente invención. La invención no está limitada al uso de regiones promotoras de la ARN polimerasa de fago, en concreto, y regiones promotoras de ARN polimerasa en general. También se han encontrado promotores bien caracterizados adecuadamente específicos en sistemas tanto procariotas como eucariotas.

El ARN que se produce de un modo dependiente del éxito de la detección del ácido nucleico diana en la reacción de escisión invasiva se puede detectar de varios modos. Si un nucleótido marcado se incorpora en el ARN durante la transcripción, el ARN se puede detectar directamente después del fraccionamiento (p. ej., mediante electroforesis o cromatografía). El ARN marcdo también se puede capturar sobre un soporte sólido, tal como una placa de microtitulación, una perla o una tira reactiva (p. ej., mediante hibridación, captura de anticuerpos o a través de una interacción de afinidad tal como la que se produce entre biotina y avidina. La captura puede facilitar la medición del marcador incorporado o puede ser una etapa intermedia antes de la hibridación de la sonda o un medio de detección similar. Si se desea incorporar en cada tránscrito la cantidad máxima de marcador, se prefiere que el molde copia sea muy largo, de aproximadamente 3 a 10 kilobases, de modo que cada molécula de ARN sea portadora de muchos marcadores. Como alternativa, se puede desear marcar específicamente un único sitio o un número limitado de sitios dentro del tránscrito. En este caso, puede ser deseable tener un molde copia corto con solo uno o unos pocos residuos que permitirían la incorporación del nucleótido marcado.

El molde copia puede también seleccionarse para producir ARN que realicen funciones específicas. En un caso sencillo, si se va a usar un fluoróforo intercalante dependiente de dúplex para detectar el producto de ARN, puede ser deseable transcribir un ARN que se sabe que forma estructuras secundarias en dúplex, tal como un ARN ribosómico o un ARNt. En otra realización, el ARN se puede diseñar para interaccionar específicamente, o con una afinidad concreta, con una sustancia diferente. Se ha demostrado que se puede usar un procedimiento de etapas de selección alternantes (p. ej., mediante unión a una sustancia diana) y amplificación in Vitro (p. ej., mediante PCR) para identificar ligandos de ácido nucleico con propiedades nuevas y útiles (Tuerk y Gold, Science 249:505 [1990]). Este sistema se ha usado para identificar ARN, denominados ligandos o aptámetos, que se unen estechamente y específicamente a las proteínas y a otros tipos de moléculas, tales como antibióticos (Wang y col., Biochem. 35:12338 [1996]) y hormonas. Los ARN se pueden seleccionar incluso para unirse a otros ARN a través de interacciones que no sean de Watson-Crick (Schmidt y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 782:526 [1996]). Un ARN ligando se puede usar para inactivar o potenciar la actividad de una molécula a la que se une. Cualquier segmento de ARN identificado a través de dicho procedimiento también s epuede producir mediante los procedimientos de la presente invención de modo que la observación de la actividad del ligando de ARN se puede usar como signo específico de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva. La unión del ligando a su compañero específico también se puede usar como otro modo de capturar una señal de lectura en un soporte sólido.

El ARN producto también podría diseñarse de modo que tenga una función catalítica (p. ej., actuar como ribozima), lo que permite que la escisión de otra molécula sea indicativa del éxito de la reacción de esicisón invasiva primaria (Uhlenbeck, Nature

328:596 [1987]). En otra realización, se puede fabricar el ARN para que codifique una secuencia peptídica. Cuando se acopla a un sistema de traducción in vitro (p. ej., el sistema S-30 obtenido de E. coli [Lesley, Methods Mol. Biol.,

37:265 (1985)], o un sistema de lisado de reticulocitos de conejo [Dasso y Jackson, Nucleic Acids Res. 17:3129 (1989)], disponible en Promega), se puede detector la producción de la proteína adecuada. En una realización preferida, las proteínas producidas incluyen las que permiten la detección colorimétrica o luminiscente, tal como beta-galactosidasa (lac-Z) o luciferasa.

La discusión anterior se centró en el uso de los presentes procedimientos de visualización de la transcripción en el contexto del ensayo de escisión dirigida por INVASOR (es decir, lso productos de escisión no diana producidos en el ensayo INVASOR se usaron para completar y activar la región de unión a proteína, tal como una región promotora). No obstante, los procedimientos de visualización de la transcripción no están limitados a este contexto. Un ensayo que produce un producto oligonucleotídico que tiene extremos relativamente pequeños se puede usar junto con los presentes procedimientos de visualización de la transcripción. Por ejemplo, el ensayo homogéneo descrito en la patente de EE.UU. nº . 5,210,015, particularmente cuando se realize en condiciones en las que no se puede producir polimerización, produce fragmentos oligonucleotídicos cortos como resultado de la escisión de una sonda. Si este ensayo se realiza en condiciones en las que se produce polimerización, el sitio de escisión de la sonda se pueden cengtrar mediante el uso de análogos nucleotídicos que tienen enlaces no escindibles en posiciones concretas dentro de la sonda. Estos oligonucleótidos cortos se pueden emplear de un modo análogo a la sonda cortada o productos de escisión no diana producidos en las reacciones de escisión invasiva de la presente invención. En la técnica se conocen ensayos adicionales que general productos oligonucleotídicos adecuados. Por ejemplo, serían adecuados los productos escisión no diana producidos en ensayos tales como la “Reacción de ciclado de la sonda" (Duck y col., BioTech., 9:142 [1990] y las patentes de EE.UU. Nº 4,876,187 and 5,011,769), en los que se liberan oligonucleótidos más cortos a partir de oligonucleótidos más largos tras la hibridación con una secuencia diana, como lo serían los fragmentos de restricción cortos liberados en ensatos en los que se diseña una sonda para su escisión cuando se hibridan con éxito con una secuencia de reconocimiento de restricción adecuada (patente de EE.UU. nº 4.683.194).

Los ensayos que generan oligonucleótidos cortos que tienen extremos en 3’ “Indentado” (es decir, no discontinuos) también se pueden emplear con éxito en las reacciones de transcripción d ela presente invención cuando el oligonucleótido proporcionado por esta reacción de no transcripción se usa para proporcionar una parte de la región promotora localizada cadena abajo del(los) otro(s) oligonucleótido(s) que se requieren para completar la región promotora (es decir, una cola en 3' o extensión sin aparear se puede tolerar cuando el oligonucleótido se usa como la "Sonda cortada" está en las Figuras 94 y 95A).

VII. Generación de Nucleasas 5’ Obtenidas de ADN Polimerasas Termoestables

Las nucleadas 5’ de la invención forman la base de un nuevo ensayo de detección para la identificación de

secuencias de ácido nucleico específicas. La Figura 1A proporciona un esquema de un una realización del procedimiento de detección de la presente invención. La secuencia diana es reconocida por dos oligonucleótidos distintos en la reacción de desencadenamiento o desencadenante. En una realización preferida uno de estos oligonucleótidos se proporciona sobre un soporte sólido. El otro se puede proporcionar libre en solución. En la Figura

1A, el oligonucleótido libre se indica como un “cebador” y el otro oligonucleótido se muestra unido a una perla denominada de tipo 1. El ácido nucleico diana alinea los dos oligonucleótidos para escisión específica del brazo 5’ (del oligonucleótido en la perla 1) por las nucleadas 5’ de la presente invención (no mostrado en la Fig. 1A). El sitio de escisión (indicado por una gran punta de flecha rellena) está controlado por la posición del extremo 3’ del “cebador” respecto a la bifurcación cadena abajo del oligonucleótido en la perla 1.

La escisión con éxito libera una única copia de lo que se denomina el oligonucleótido señal alfa. Este oligonucleótido puede contener un resto detectable (por ejemplo, fluoresceína). Por otro lado, puede estar no marcado.

En una realización del procedimiento de detección se proporcionan dos o más oligonucleótidos sobre soportes sólidos. El oligonucleótido mostrados en la Fig. 1A en la perla 2 tienen una región que es complementaria al oligonucleótido señal (indicado como alfa prima), lo que permite la hibridación. Esta estructura puede ser escindida por las nucelasas 5’ de la presente invención para liberar el oligonucleótido señal beta. El oligonucleótido señal beta puede hibridar después con perlas de tipo 3 que tienen un oligonucleótido con una región complementaria (indicada como beta prima). De nuevo, esta estructura puede ser escindida por las nucelasas 5’ de la presente invención para liberar un nuevo oligonucleótido alfa.

En este punto, la amplificación ha sido lineal. Para aumentar el poder del procedimiento, se desea que el oligonucleótido señal alfa hibride con la perla de tipo 2 a liberar después de la liberación del oligonucleótido beta de tal forma que pueda continuar hibridando con otros oligonucleótidos sobre perlas de tipo 2. De forma similar, después de la liberación de un oligonucleótido alfa de perlas de tipo 3, se desea que se libere el oligonucleótido beta.

Con la liberación de oligonucleótidos señal mediante tales técnicas, cada escisión da como resultado una duplicación del número de oligonucleótidos señal. De este modo, se puede conseguir rápidamente una señal detectable.

La Fig. 1B proporciona un esquema de una segunda realización del procedimiento de detección de la presente invención. De nuevo, la secuencia diana es reconocida por dos oligonucleótidos distintos en la reacción de desencadenamiento o desencadenante y el ácido nucleico diana alinea los dos oligonucleótidos para escisión específica del brazo 5’ por las DNAP de la presente invención (no mostrado en la Fig. 1B). En este ejemplo específico, el primer oligonucleótido es completamente complementario a una parte de la secuencia diana. El

segundo oligonucleótido es parcialmente complementario a la secuencia diana; el extremo 3’ del segundo oligonucleótido es completamente complementario a la secuencia diana mientras que el extremo 5’ no es

complementario y forma un brazo monocatenario. El extremo no complementario del segundo oligonucleótido puede ser una secuencia genérica que se puede usar con un conjunto de estructuras de horquilla convencionales (descritas más adelante). La detección de diferentes secuencias diana requeriría partes únicas de dos oligonucleótidos: todo el primer oligonucleótido y el extremo 3’ del segundo oligonucleótido. El brazo 5’ del segundo oligonucleótido puede ser de secuencia invariable o genérica.

La segunda parte del procedimiento de detección permite la hibridación del fragmento del segundo oligonucleótido liberado por la escisión de la primera estructura de escisión formada en la reacción de desencadenamiento (denominado el tercer oligonucleótido o desencadenante) con una primera estructura de horquilla. La primera estructura de horquilla tiene un brazo 5’ monocatenario y un brazo 3’ monocatenrio. El tercer oligonucleótido desencadena la escisión de esta primera estructura de horquilla hibridando con el brazo 3’ de la horquilla formando de este modo un sustrato para escisión por la nucleasa 5’ de la presente invención. La escisión de esta primera estructura de horquilla genera dos productos de reacción: 1) el brazo 5’ escindido de la horquilla denominado el cuarto oligonucleótido y 2) la estructura de horquilla escindida que ahora carece del brazo 5’ y es de tamaño menor que la horquilla no escindida. Esta primera horquilla escindida se puede usar como una molécula de detección para indicar que ha tenido lugar la escisión dirigida por el oligonucleótido desencadenante o tercer oligonucleótido. Por tanto, esto indica que los dos primeros oligonucleótidos encontraron e hibridaron con la secuencia diana, indicando de este modo la presencia de la secuencia diana en la muestra.

Los productos de detección se amplifican teniendo que hibridar el cuarto oligonucleótido con una segunda estructura de horquilla. Esta estructura de horquilla tiene un brazo 5’ monocatenario y un brazo 3’ monocatenrio. El cuarto oligonucleótido generado por escisión de la primera estructura de horquilla hibrida con el brazo 3’ de la segunda estructura de horquilla creando de este modo una tercera estructura de escisión reconocida por la nucleasa 5’. La escisión de esta segunda estructura de horquilla también genera dos productos de reacción: 1) el brazo 5’ escindido de la horquilla denominado el quinto oligonucleótido y 2) la segunda estructura de horquilla escindida que ahora carece del brazo 5’ y es de tamaño menor que la horquilla no escindida. En una realización, el quinto oligonucleótido tiene una secuencia similaro idéntica a la del tercer nucleótido. Esta segunda horquilla escindida puede ser como una molécula de detección y amplifica la señal generada por la escisión de la primera estructura de horquilla. De forma simultánea a la hibridación del cuarto oligonucleótido, el tercer oligonucleótido se disocia de la primera molécula de horquilla escindida de modo que quede libre para hibridar con una copia nueva de la primera estructura de horquilla. La disociación de los oligonucleótidos de las estructuras de horquilla se puede conseguir mediante calentamiento u otros medios adecuados para romper las interacciones de emparejamiento de bases. Como se ha descrito anteriormente se pueden seleccionar condiciones que permitan la asociación y disociación de oligonucleótidos hibridados son ciclado a temperaturas.

Si el quinto oligonucleótido tiene una secuencia similar o idéntica a la del tercer nucleótido se consigue una amplificación adicional de la señal de detección hibridando el quinto oligonucleótido con otra molécula de la primera estructura de horquilla. Después se realiza la escisión y el oligonucleótido que se libera hibrida después con otra molécula de la segunda estructura de horquilla. Se realizan rondas sucesivas de hibridación y escisión de la primera y la segunda estructura de horquilla, proporcionadas en exceso, para generar una cantidad suficiente de productos de horquilla escindidos para detectar.

Como se ha tratado anteriormente para otras realizaciones de deetcción usando escisión con nucleasa específica de estructura, cualquier procedimiento conocido en la técnica para el análisis de ácidos nucleicos, fragmentos de ácido nucleico u oligonucleótidos se puede aplicar a la detección de productos de escisión.

Las estructuras de horquilla se pueden unir a un soporte sólido, tal como una agarosa, estireno o perla magnética,

mediante el extremo 3’ de la horquilla. Se puede colocar una molécula espaciadora entre el extremo 3’ de la

horquilla y la perla, si se desea. La ventaja de unir las estructuras de tipo horquilla a un soporte sólido que evita la hibridación de las dos estructras de tipo horquilla entre sí sobre regiones que son complementarias. Asi las estructuras de tipo horqilla se hibridan ente sí, se reducirá la cantidad de horquillas disponibles para hibridar con los cebadores liberados durante las reacciones de escisión. Si las estructuras de horquilla se unen a un soporte sólido, entonces se pueden emplear procedimientos de detección adicionales de los productos de la reacción de escisión.

Estos procedimientos incluyen, entre otros, la medición del brazo 5’ monocatenario liberado cuando el brazo 5’ contiene un marcador en el extremo 5’. Este marcador puede ser radiactivo, fluorescente, biotinilado, etc. Si la estructura de horquilla no se ha escindido, el marcador 5’ permanecerá unido al soporte sólido. Si tiene lugar la escisión, el marcador 5’ se liberará del soporte sólido.

El extremo 3’ de la molécula de horquilla se puede bloquear mediante el uso de didesoxinucleótidos. Un extremo 3’ que contiene un didesoxinucleótido no está disponible para participar en reacciones con determinadas enzimas que modifican ADN, tales como transferasa terminal. La escisión de la horquilla que tiene un didesoxinucleótido terminal

3’ genera un nuevo extremo 3’ no bloqueado en el sitio de escisión. Este nuevo extremo 3’ tiene un grupo hidroxilo

libre que puede interaccionar con transferasa terminal proporcionando de este modo otros medios para la detección de los productos de escisión.

Las estructuras de horquilla están diseñadas de tal forma que sus regiones auto-complementarias son muy cortas (generalmente en el intervalo de 3-8 pares de bases). Por tanto, las estructuras de horquilla no son estables a las temperaturas altas a las que se realiza esta reacción (generalmente en el intervalo de 50-75ºC) a menos que la horquilla se estabilice por la presencia del oligonucleótido hibridado en el brazo 3’ de la horquilla. Esta inestabilidad evita que la polimerasa escinda la estructura de horquilla en ausencia de un cebador asociado evitando de este modo resultados de falsos positivos debido a escisión no dirigida por oligonucleótido.

VIII. Enzimas mejoradas para uso en reacciones de escisión dirigidas por oligonucleótido INVASOR

En el presentte documento se define una estructura de escisión una estructura que está formada por la interacción de un oligonucleótido sonda y un ácido nucleico diana para formar un dúplex, siendo la estructura resultante escindible por un agente de escisión, incluyendo, pero sin limitaciones, una enzima. La estructura de escisión se define adicionalmente como un sustrato para escisión específica mediante el medio de escisión al contrario que una molécula de ácido nucleico que es un sustrato para escisión no específica mediante agentes tales como fosfodiesterasas. En la Figura 15 se muestran ejemplos de algunas estructuras de escisión posibles. Considerando mejoras de agentes de escisión enzimática, se puede considerar la acción de dichas enzimas sobre cualquiera de estas estructuras y no sobre cualquier otra estructura que entre dentro de la definición de una estructura de escisión. Los sitios de escisión indicados en las estructuras en la Figura 15 se presentan a modo de ejemplo. Se considera la escisión específica en cualquier sitio dentro de una estructura de este tipo.

Las mejoras en una enzima pueden ser una velocidad de escisión aumentada o disminuida de uno o más tipos de estructuras. Las mejoras también pueden dar como resultado más o menos sitios de escisión en una o más de dichas estructuras de escisión. Durante el desarrollo de una biblioteca de nuevas nucleadas con especificidad de estructura para el uso en ensayos de escisión de ácido nucleico, las mejoras pueden tener muchas realizaciones diferentes, relacionada cada una con la estructura específica de sustrato usada en un ensayo concreto.

Como un ejemplo se puede considerar una realización del ensayo de escisión dirigida por INVASOR de la presente invención. En el ensayo de escisión dirigida por INVASOR, la acumulación de material escindido está influida por varias características del comportamiento de la enzima. De forma no sorprendente, la velocidad de renovación o el número de estructuras que se pueden escindir por una única molécula de enzima en una cantidad de tiempo fijada, es muy importante para determinar la cantidad de material procesado durante el curso de una reacción de ensayo.

Si una enzima necesita un tiempo prolongado para reconocer un sustrato (por ejemplo, si se presenta con una estructura menos que óptima) o necesita un tiempo prolongado para realizar la escisión, la velocidad de acumulación de producto es inferior que si estas etapas avanzaran rápidamente. Si estas etapas son rápidas, la enzima aún se “sujeta” a la estructura escindida y no avanza inmediatamente a otra estructura no cortada, la velocidad se verá afectada negativamente.

La renovación de enzima no es el único modo en el que el comportamiento de la enzima puede afectar negativamente a la velocidad de acumulación de producto. Cuando el medio usado para visualizar o medir producto es específico para un producto definido de forma precisa, los productos que se desvían de esa definición pueden escapar a la detección y, por tanto, la velocidad de acumulación de producto puede parecer ser menor de lo que es. Por ejemplo, si se tiene un detector sensible para trinucleótidos que no podría ver di- o tetranucleótidos o cualquier oligonucleótido dimensionado diferente de 3 restos, en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR de la presente invención, cualquier escisión errante reduciría la señal detectable de forma proporcional. e puede observar a partir de los datos de escisión presentados en el presente documento que, aunque habitualmente hay un sitio dentro de una sonda favorable a la escisión, a menudo hay productos que surgen de la escisión uno o más nucleótidos alejada del sitio de escisión primario. Estos son productos que son dependientes de diana y, por tanto, no fondo no específico. Sin embargo, si un sistema de visualización posterior puede detectar solamente el producto primario, esto representa una pérdida de señal. Un ejemplo de un sistema de visualización selectivo de este tipo es la lectura de inversión de carga presentada en el presente documento, en la que el equilibrio de cargas positivas y negativas determina el comportamiento de los productos. En un sistema de este tipo, la presencia de un nucleótido adicional o la ausencia de un nucleótido esperado puede excluir un producto de escisión válido de detección final dejando ese producto con el equilibrio de carga incorrecto. Se puede observar de forma sencilla que cualquier ensayo que pueda distinguir de forma sensible el contenido de nucleótidos de un oligonucleótido, tal como hibridación de rigurosidad convencional, padece con respecto a sensibilidad cuando alguna fracción del producto válido no es deseable para detección exitosa por ese ensayo.

Estas discusiones sugieren dos rasgos altamente deseables en cualquier enzima a usar en el procedimiento de la presente invención. En primer lugar, cuanto más rápidamente ejecute la enzima una reacción de escisión completa, incluyendo reconocimiento, escisión y liberación, más señal se podrá crear potencialmente en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR. En segundo lugar, cuanto más éxito tenga una enzima en su focalización en un único sitio de escisión dentro de una estructura, de forma más eficaz se podrá detectar con éxito el producto de escisión en una lectura selectiva.

Los fundamentos que se han citado anteriormente para realizar mejoras en enzimas a usar en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR se refieren a que sirven como un ejemplo de una dirección en la que se pueden buscar mejoras, pero no como un límite ni de la naturaleza ni de las aplicaciones de actividades de enzima mejoradas.

Como otra dirección de cambio de actividad que se consideraría de forma apropiada mejora, las nucleasas 5’ asociadas a DNAP se podrían usar como un ejemplo. Durante la creación de algunas de las nucleasas 5’ deficientes en polimerasa descritas en este documento, se observó que las que se crearon por deleción de partes sustanciales del dominio de polimerasa, como se ilustra en la Fig. 4, asumieron actividades que eran débiles o estaban ausentes en las proteínas precursoras. Esas actividades incluían la capacidad de escindir la estructura no bifurcada mostrada en la Fig. 15D, una capacidad en gran medida mejorada para eliminar exonucleolíticamente nucleótidos de los extremos 5’ de cadenas en dúplex y una capacidad naciente para escindir moléculas circulares sin aprovechar un extremo 5’ libre.

Además de las nucleadas 5’ derivadas de ADN polimerasas, la presente invención también contempla el uso de nucleasas específicas de estructura que no proceden de ADN polimerasas. Por ejemplo, se ha identificado una clase

de endonucleasas eucariotas y de arqueobacterias que tienen especificidad de sustrato similar a nucleasas 5’ de

ADN polimerasas de tipo Pol 1. Estos son las proteínas FEN-1 (Flap EndoNucleasa), RAD2 y XPG (grupo de complementación G de Xeroderma Pigmentosa). Estas proteínas están implicadas en la reparación del ADN y se ha

demostrado que favorecen la escisión de estructuras que se parecen a un brazo 5’ que se ha desplazado por un

cebador de extensión durante la polimerización, de forma similar al modelo ilustrado en la Fig. 15B. Se han aislado enzimas de reparación de ADN similares de células únicas y eucariotas superiores y de arqueobacterias y existen proteínas de reparación de ADN relacionadas en eubacterias. Endonucleasas 5’ similares también se han asociado a bacteriófago tal como T5 y T7.

Recientemente, se determinaron las estructuras 3-dimensionales de DNAPTaq y exonucleasa 5’ de fago T5 (Fig. 58) mediante difracción por rayos X (Kim y col., Nature 376: 612 [1995] y Ceska y col., Nature 382: 90 [1995]). Las dos enzimas tienen estructuras 3-dimensionales muy similares a pesar de la similitud de secuencia de aminoácidos limitada. La característica más sorprendente de la estructura de exonucleasa 5’ de T5 es la existencia de un orificio triangular formado por el sitio activo de la proteína y dos hélices alfa (Fig.58). Esta misma región de DNAPTaq está desordenada en la estructura de cristal, indicando que está región es flexible y, por lo tanto, no se muestra en la estructura 3-dimensional publicada. Sin embargo, el dominio nucleasa 5’ de DNAPTaq probablemente tiene la misma estructura, basándose en su similitud 3-dimensional global con la exonucleasa 5’ de T5 y a que los aminoácidos en la región desordenada de la proteína de DNAPTaq son los asociados a la formación de hélice alfa.

La existencia de un orificio o surco de este tipo en el dominio nucleasa 5’ de DNAPTaq se predijo basándose en su

especificidad de sustrato (Lyamichev y col., anteriormente).

Se ha sugerido que el brazo 5’ de una estructura de escisión tiene que enhebrarse a través del arco helicoidal que se ha descrito anteriormente para colocar dicha estructura correctamente para la escisión (Ceska y col., anteriormente). Una de las modificaciones de nucleasas 5’ descritas en el presente documento abrieron por la parte superior la parte de arco helicoidal de la proteína para permitir escisión mejorada de estructuras que cortan mal o que no cortan (por ejemplo, estructuras en dianas de ADN circular que evitarían tal enhebrado de un brazo 5’). La construcción génica que se seleccionó como un modelo para ensayar esta estrategia era la denominada CLEAVASE BN, que se obtuvo de DNAPTaq pero que no contiene el dominio polimerasa (Ej. 2). Comprende todo el dominio 5’ de DNAPTaq, y, por tanto, debe ser muy próximo en estructura a la exonucleasa 5’ de T5. Esta nucleasa 5’ se seleccionó para demostrar el principio de una modificación física de este tipo en proteínas de este tipo. La modificación de abertura de arco de la presente invención no pretende limitarse a los dominios nucleasa 5’ de ADN polimerasas y se considera para el uso en cualquier nucleasa con especificidad de estructura que incluya una abertura de este tipo como una limitación de actividad de escisión. La presente invención considera la inserción de un sitio de escisión de trombina en el arco helicoidal de DNAP obtenidas del género Thermus así como nucleasas 5’ obtenidas de DNAP obtenidas del género Thermus. El ejemplo específico mostrado en el presente documento que usa la nucleasa CLEAVASE® BN/trombina meramente ilustra el concepto de abrir el arco helicoidal ubicado dentro de un dominio de nucleasa. Ya que la secuencia de aminoácidos de DNAP obtenidas del género Thermus está altamente conservada, las descripciones de la presente invención permiten la inserción de un sitio de trombina en el

arco helicoidal presente en estas DNAP y nucleasas 5’ obtenidas de estas DNAP.

La abertura del arco helicoidal se consiguió mediante la inserción de un sitio de proteasa en el arco. Esto permitió la digestión post-traduccional de la proteína expresada con la proteasa apropiada para abrir el arco en su vértice. Las proteasas de este tipo reconocen extensiones cortas de secuencia de aminoácidos específica. Tales proteasas incluyen trombina y factor Xa. La escisión de una proteína con una proteasa de este tipo depende tanto de la presencia de ese sitio en la secuencia de aminoácidos de la proteína como de la accesibilidad de ese sitio en la proteína intacta plegada. Incluso con una estructura de cristal puede ser difícil predecir la susceptibilidad de cualquier región particular de una proteína a escisión por proteasa. En ausencia de una estructura de cristal se tiene que determinar empíricamente.

Para seleccionar una proteasa para una escisión específica de sitio de una proteína que se ha modificado para contener un sitio de escisión por proteasa, una primera etapa es someter a ensayo la proteína no modificada para escisión en sitios alternativos. Por ejemplo, DNAPTaq y Cleavase® BN se incubaron ambas en condiciones de escisión por proteasa con las proteasas factor Xa y trombina.

Ambas proteínas nucleasa se cortaron con factor Xa dentro del dominio de nucleasa 5’, pero ninguna nucleasa se

digirió con grandes cantidades de trombina. Por tanto, se seleccionó trombina para ensayos iniciales para abrir el arco de la enzima CLEAVASE BN.

En las modificaciones de proteasa/CLEAVAS descritas en el presente documento, la proteasa factor Xa se escindió intensamente en una posición inaceptable en la proteína nucleasa no modificada, en una región que probablemente compromete la actividad del producto final. Otras nucleasas no modificadas consideradas en el presente documento pueden ser no sensibles al factor Xa, pero pueden ser sensibles a trombina u otras proteasas de este tipo. Alternativamente, pueden ser sensibles a estas u otras proteasas de este tipo en sitios que son irrelevantes para la función de la nucleasa que se intenta modificar. Abordando cualquier proteína para la modificación por adición de un sitio de escisión por proteasa, la proteína no modificada se debe someter a ensayo con las proteasas teniendo en consideración determinar qué proteasas dan niveles aceptables de escisión en otras regiones.

Durante el trabajo con el segmento clonado de DNAPTaq por el que se expresa la proteína CLEAVASE® BN se introdujeron nucleótidos que codifican un sitio de escisión de trombina en fase cerca de la secuencia que codifica el aminoácido 90 del gen de nucleasa. Se determinó que esta posición está en o cerca del vértice de arco helicoidal por referencia tanto a la estructura 3-dimensional de DNAPTaq como a la estructura de exonucleasa 5’ de T5. La secuencia de aminoácidos codificada, LVPRGS, se insertó en el vértice del arco helicoidal por mutagénesis dirigida del gen de nucleasa. La prolina (P) en el sitio de escisión de trombina se colocó para sustituir una prolina que está normalmente en esta posición en CLEAVASE BN debido a que la prolina es un aminoácido de descomposición de hélice alfa y puede ser importante para la estructura 3-dimensional de este arco. Esta construcción se expresó, purificó y después se digirió con trombina. La enzima digerida se ensayó para su capacidad de escindir un ácido nucleico diana, ADN genómico de bacteriófago M13, que no proporciona extremos 5’ libres para facilitar escisión por el modelo enhebrado.

Aunque el arco helicoidal en esta nucleasa se abrió por escisión por proteasa, se considera que se podrían usar varias técnicas adicionales para conseguir el mismo fin. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos se podría redisponer de tal forma que, después de la expresión, la proteína resultante se configuraría de tal forma que la parte superior del arco helicoidal (aminoácido 90) estaría en el extremo amino de la proteína, los extremos naturales carboxilo y amino de la secuencia de la proteína se unirían y el nuevo extremo carboxilo se situaría en el aminoácido natural 89. Esta estrategia tiene el beneficio de que no se introducen secuencias extrañas y la enzima es una

cadena de aminoácidos única y por tanto, puede ser más estable que la nucleasa 5’ escindida. En la estructura de cristal de DNAPTaq, los extremos amino y carboxilo del dominio exonucleasa 5’ se sitúan en proximidad estrecha

entre sí, lo que sugiere que los extremos se pueden unir directamente sin el uso de una secuencia de péptido de engarce flexible como en ocasiones es necesario. Una redisposición de este tipo del gen, con clonación y expresión posterior, se podría conseguir por recombinación por PCR convencional y técnicas de clonación conocidas por los especialistas en la técnica.

La presente invención también considera el uso de nucleasas aisladas de un organismo que se desarrolla en una diversidad de condiciones. Los genes para la clase FEN-1/XPG de enzimas se encuentran en organismos que varían desde bacteriófagos a seres humanos a los termófilos extremos del Reino Archaea. Para ensayos en los que se tiene que usar temperatura alta, se considera que las enzimas aisladas de termófilos extremos pueden mostrar la termoestabilidad requerida para un ensayo de este tipo. Para ensayos en los que puede ser deseable tener actividad enzimática máxima a temperatura moderada o en los que puede ser deseable destruir la enzima con temperatura elevada, las enzimas de organismos que favorezcan temperaturas moderadas para el desarrollo pueden ser de valor concreto.

Un alineamiento de una colección de proteínas FEN-1 secuenciadas por otros se muestra en las Figuras 59A-E (SEC ID Nº 135-145). Se puede observar en este alineamiento que hay algunas regiones de conservación en esta clase de proteínas, lo que sugiere que están relacionadas en cuanto a función y, posiblemente, en estructura. Se pueden usar regiones de similitud a nivel de secuencia de aminoácidos para diseñar cebadores para amplificación in vitro (PCR) mediante un procedimiento de traducción inversa de la secuencia de aminoácidos a las posibles secuencias de ácido nucleico, seleccionando después cebadores con el menor número posible de variaciones dentro de las secuencias. Los mismos se pueden usar en PCR de baja rigurosidad para buscar secuencias de ADN relacionadas. Esta estrategia permite la amplificación de ADN que codifica una nucleasa FEN-1 sin conocimiento previo de la secuencia de ADN real.

También se puede observar a partir de este alineamiento que existen regiones en las secuencias que no están completamente conservadas. El grado de diferencia observado sugiere que las proteínas pueden tener diferencias sutiles o distintas en especificidad de sustrato. En otras palabras, pueden tener niveles diferentes de actividad de escisión en las estructuras de escisión de la presente invención. Cuando una estructura particular se escinde a una velocidad mayor que las demás, esto se denomina un sustrato preferido, mientras que una estructura que se escinde lentamente se considera un sustrato menos preferido. La denominación de sustratos preferidos o menos preferidos en este contexto no tiene por objeto ser una limitación de la presente invención. Se considera que algunas realizaciones de la presente invención usarán las interacciones de una enzima con un sustrato menos preferido. Se someten a ensayo enzimas candidatas para idoneidad en los ensayos de escisión de la presente invención usando los ensayos que se describen más adelante.

1. Ensayo de nucleasa específica de estructura

El ensayo de nucleasas candidatas para las actividades con especificidad de estructura en estos ensayos se realiza de un modo muy similar a lo descrito para el ensayo de ADN polimerasas modificadas en el Ej. 2, pero con el uso de una biblioteca diferente de estructuras modelo. Además de evaluar el rendimiento de la enzima en escisión independiente de cebador y dirigida por cebador, se usa un conjunto de horquillas sintéticas para examinar la longitud de dúplex cadena abajo del sitio de escisión preferido por la enzima.

Las nucleasas FEN-1 y XPG 5’ usadas en la presente invención se tienen que someter a ensayo para actividad en los ensayos en los que se pretenden usar, incluyendo, pero sin limitaciones, el ensayo de detección de escisión dirigida por INVASOR de la presente invención y el procedimiento CFLP de caracterización de ácidos nucleicos (el procedimiento CFLP se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.843.654. 5.843.669. 5.719.028. y 5.888.780 y la publicación PCT WO 96/15267). El ensayo INVASOR usa un modo de escisión que se ha denominado “dirigida por cebador” o “dependiente de cebador” para reflejar la influencia del oligonucleótido hibridado con el ácido nucleico

diana cadena arriba del sitio de escisión. Por el contrario, la reacción CFLP se basa en la escisión de la estructura plegada, u horquillas, dentro del ácido nucleico diana en ausencia de cualquier oligonucleótido hibridado. Los ensayos descritos en el presente documento no tienen por objeto limitarse al análisis de nucleasas con ningún sitio particular de escisión o modo de reconocimiento de estructuras de sustrato. Se considera que se pueden describir las enzimas como nucleasas 3’, utilizando el extremo 3’ como un punto de referencia para reconocer estructuras, o pueden tener un modo diferente de reconocimiento. Además, el uso de la expresión nucleasas 5’ no tiene por objeto limitar la consideración a enzimas que escinden las estructuras de escisión en algún sitio concreto. Se refiere una

clase general de enzimas que requieren alguna referencia o acceso a un extremo 5’ para realizar escisión de una

estructura.

Se ha creado un conjunto de estructuras de escisión modelo para permitir evaluar la capacidad de escisión de enzimas desconocidas en tales estructuras. Cada una de las estructuras modelo se construye a partir de uno o más oligonucleótidos sintéticos preparados por química de síntesis de ADN convencional. Los ejemplos de tales estructuras de sustrato modelo sintético se muestran en las Figuras 26 y 60. Los mismos pretenden solamente representar la configuración plegada general deseable en tales estructuras de ensayo. Aunque una secuencia que asumiría una estructura de este tipo se indica en las figuras, hay numerosas disposiciones de secuencia adicionales de nucleótidos que se esperaría que se plegaran de tales maneras. Las características esenciales a diseñar en un conjunto de oligonucleótidos para realizar los ensayos descritos en este documento son la presencia o ausencia de

un brazo 3’ lo suficientemente largo para permitir la hibridación de un ácido nucleico adicional para ensayar escisión de un modo “dirigido por cebador” y la longitud de la región dúplex. En el conjunto ilustrado en la Figura 60, las longitudes de dúplex de las estructuras S-33 y 11-8-0 son los pares de bases 12 y 8, respectivamente. diferencia en la longitud de las moléculas de ensayo facilita la detección de discriminación por la nucleasa candidata entre dúplex más largos y más cortos. Se pueden usar adiciones a esta serie que expande el intervalo de moléculas dúplex presentadas en las enzimas, tanto más cortas como más largas. El uso de un tetrabucle de ADN de estabilización (Antao y col., Nucl. Acids Res., 19:5901 [1991]) o tribucle (Hiraro y col., Nuc. Acids Res., 22:576 [1994]) en el extremo cerrado del dúplex ayuda a garantizar la formación de la estructura esperada por el oligonucleótido.

El sustrato modelo para ensayar escisión dirigida por cebador, la “horquilla S-60” (SEC ID Nº 40) se describe en el Ej. 11. En ausencia de un cebador, esta horquilla se escinde habitualmente para liberar los fragmentos del brazo 5’ de 18 y 19 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido, denominado P-14 (5’-CGAGAGACCACGCT-3’) (SEC ID Nº 108), que se extiende hasta la base del dúplex cuando hibrida con el brazo 3’ de la horquilla S-60 proporciona productos de escisión del mismo tamaño, pero a una mayor velocidad de escisión.

Para someter a ensayo la escisión invasiva se usa un cebador diferente, denominado P-15 (5’-CGAGAGACCACGCTG-3’; SEC ID Nº 30). En una escisión invasiva exitosa, la presencia de este cebador desplaza el sitio de escisión de S-60 a la región dúplex, liberando habitualmente productos de 21 y 22 nucleótidos de longitud.

La horquilla S-60 también se puede usar para ensayar los efectos de modificaciones de la estructura de escisión en escisión dirigida por cebador o invasiva. Tales modificaciones incluyen, pero sin limitaciones, el uso de apareamientos erróneos o análogos de bases en el dúplex de horquilla en una, unas pocas o toda las posiciones, alteraciones similares o modificaciones en el dúplex entre el cebador y el brazo 3’ de la S-60, modificaciones químicas u otras en uno o ambos extremos de la secuencia de cebador, o unión de restos u otras modificaciones al brazo 5’ de la estructura. En todos los análisis que usan la S-60 o una horquilla similar descrita en este documento, la actividad con y sin un cebador se puede comparar usando la misma estructura de horquilla.

El ensamblaje de estas reacciones de ensayo, incluyendo cantidades apropiadas de horquilla, cebador y nucleasa candidata se describen en el Ej. 2. Como se cita en el mismo, la presencia de productos de escisión se indica por la presencia de moléculas que migran a un menor peso molecular de lo que lo hace la estructura de ensayo no escindida. Cuando se usa la inversión de carga de un marcador, los productos llevarán una carga neta diferente que el material no escindido. Cualquiera de estos productos de escisión indica que la nucleasa candidata tiene la actividad de nucleasa con especificidad de estructura deseada. Con “actividad nucleasa con especificidad de estructura deseada” se quiere decir solamente que la nucleasa candidata escinde una o más moléculas de ensayo.

No es necesario que la nucleasa candidata escinda a ninguna velocidad o sitio de escisión particular para considerarse escisión exitosa.

2. Quimeras enzimáticas y variantes

La presente invención proporciona además nucleasas quiméricas específicas de estructura, como se define en las reivindicaciones. Las nucleasas quiméricas específicas de estructura comprenden una o más partes de cualquier enzima descrita en el presente documento en combinación con otra secuencia. En realizaciones preferidas, las nucleasas quiméricas específicas de estructura comprenden un dominio funcional (p. ej., unaregión de la enzima

que contiene una región o secuencia en arco asociada físicamente con el mismo) de una nucleasa 5’ en combinación con dominios de otras enzimas (p. ej., de otras nucleadas 5’). En algunas relizaciones preferidas, un dominio funcional dado comprende la secuencia de dos o más enzimas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un dominio funcional de una primera nucleasa específica de estructura se puede alterar en una o más posiciones de aminoácidos para convertir el dominio funcional, o una parte del mismo, en la secuencia de una segunda nucleasa específica de estructura, de modo que imparte características de la segunda nucleasa sobre la primera. Dichas características incluyen, entre otras, actividd catalítica, especificidad y estabilidad (p. ej., termoestabilidad).

En una realización, la presente invención proporciona enzimas quiméricas que comprenden partes de aminoácidos obtenidas de las enzimas seleccionadas del grupo de ADN polimerasas y endonucleasas FEN-1, XPG y RAD. En una realización preferida, las enzimas quiméricas comprenden porciones de aminoácidos derivados de las endonucleasas FEN-1 seleccionadas del grupo de Pyrococcus furiosus, Methanococcus jannaschi, Pyrococcus woesei, Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum, Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococ-cus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix.

Algunas realizaciones de la presente invención proporcionan formas mutantes o variantes de enzimas descritas en el presente documento. Es posible modificar la estructura de un péptido que tiene una actividad de las enzimas descritas en el presente documento para fines tales como potenciar la velocidad de escisión, la especificidad de sustrato, estabilidad y similares. Por ejemplo, se puede producir un péptido modificado en el que la secuencia de aminoácidos se ha alterado, tal como mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos. Por ejemplo, se contempla una sustitución aislada de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o una sustitución conservadora similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado (es decir, mutaciones conservadoras), no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. De acuerdo con esto, algunas realizaciones de la presente invención proporcionan variantes de enzimas descritas en el presente documento que contienen sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados por sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéricamente se pueden dividir en cuatro familias: (1) ácidos (aspartato, glutamato; (2) básicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); y (4) polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). En ocasiones, los aminoácidos fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican en conjunto como aminoácidos aromáticos. De un modo similar, el repertorio de aminoácidos se puede agrupar como (1) ácidos (Aspartato, glutamato), (2) básicos (lisina, arginina, histidina), (3) alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), estando la serina y la treonina opcionalmente agrupads por separado como alifáticoshidroxilo; (4) aromáticos (fenilalanina,tirosina, triptófano); (5) amida (asparagina, glutamina); y (6) que contienen azufre (cisteína y metionina) (véase, por ejemplo, Stryer (ed.), Biochemistry, 2ª ed, WH Freeman and Co. [1981]). Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un péptido tiene como resultad o no un homólogo funcional se puede determinar fácilmente evaluando la capacidad del péptido variante para producir una respuesta de un modo similar a la proteína de tipo silvestre usando los ensayos descritoe en el presente documento. Los péptidos en los que se ha producido más de una sustitución se pueden someter a ensayo fácilmente del mismo modo.

Se contempla que los ácidos nucleicos que codifican las enzimas s epueden usar como ácidos nucleicos de partida para la evolución dirigida. Estas técnicas se pueden usar para desarrollar variantes enzimáticas que tengan propiedades deseables. En algunas realizaciones, la evolución artificial se realiza mediante mutagénesis aleatoria

(p. ej., usando PCR propensa a error para introducir mutaciones aleatorias en una secuencia de codificación dada). Este procedimiento requiere un ajuste fino de la frecuencia de mutación. Como norma general, las mutaciones beneficiosas son raras, mientras que las mutaciones perjudiciales son infrecuentes. Esto es porque la combinación de una mutación perjudicial y una mutación beneficiosa a menudo tiene como resultado una enzima inactiva. El número ideal de sustituciones de bases para genes objetivo normalmente está entre 1,5 y 5 (Moore y Arnold, Nat. Biotech., 14, 458-67 [1996]; Leung y col., Technique, 1:11-15 [1989]; Eckert y Kunkel, PCR Methods Appl., 1:17-24 [1991]; Caldwell y Joyce, PCR Methods Appl., 2:28-33 (1992); y Zhao y Arnold, Nuc. Acids. Res., 25:1307-08 [1997]). Tras la mutagénesis, los clones resultantes se seleccionan según la actividad deseable (p. ej, capacidad para escindir una estructura de escisión como las descritas en el Ejemplo 66). A menudo son necearias rondas sucesivas de mutagénesis y selección para desarrollar enzimas con propiedades deseables. Cabe destacar que solo las mutaciones útiles se pasan a la siguiente ronda de mutagénesis.

En otras realizaciones de la presente invención, los polinucleótidos de la presente invención se usan en procedimientos de transposición genérica o PCR sexual (p. ej., Smith, Nature, 370:324-25 [1994]; patentes de EE.UU. nº 5.837.458; 5.830.721; 5.811:238; 5.733.731). La transposición genética implica fragmentación aleatoria de varios ADN mutantes, seguido de su reensamblaje mediante PCR en moléculas de longitud completa. Ejemplos de varios procedimientos de transposición genética incluyen, entre otros, ensamblaje tras tratamiento con ADNasa, el procedimiento de extensión escalonada (STEP) y cebado aleatorio en recombinación in vitro. En el procedimiento mediado por la ADNasa, los segmentos de ADN aislados de un conjunto de mutantes positivos se escinden en fragmentos aleatorios con ADNasa I y se someten a múltiples ronadas de PCR sin cebador añadido. Las longitudes de fragmentos aleataorios se acercan a las del segmento sin escindir a medida que progresan los ciclos de PCR, lo que tiene como resultado la mezcla de mutaciones en clones diferentes y la acumulación en alguns de las secuencias resultantes. Múltiples ciclos de selección y SHIFFLING han conducido a la potenciación funcional de una serie de enzimas (Stemmer, Nature, 370:398-91 [1994]; Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10747-51 [1994]; Crameri y col., Nat. Biotech., 14:315-19 [1996]; Zhang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4504-09 [1997]; y Crameri y col., Nat. Biotech., 15:436-38 [1997]).

La presente invención proporciona un medio para la detección selectiva rápida de enzimas por su actividad mejorada. En algunas realizaciones, el rápido procedimiento de detección selectiva de la presente invención comprende un sistema de instrumento que comprende una función de manipulación de líquidos (p. ej., BIOMEK 2000 Laboratory Automated work station, Beckman Coulter, Fullerton CA, o TECAN Automated workstation, Tecan U.S., Durham NC), una function de bloqueo del calentamiento, una function de incubador (p.ej., un Liconic Instruments Automated Incubator, Liconic Instruments, Fusrentum, Liechtenstein o un incubador automático HERAEUS) una function de carrusel de microplacas (p.ej., un BIOMEK Carousel, Beckman Coulter, Fullerton, CA), una function de lector de fluorescencia (p.ej., un lector de placas de multiples pocillos CYTOFLUOR Series 4000 o un lector de placas automático Sapphire (Tecan, U.S.) y una función Robotic (p.ej., un brazo de robot BIOMEK ORCA, Beckman Coulter). Un ejemplo de diagrama del sistema de detección selectiva de la presente invención se proporciona en la Figura 147. en una realización del procedimiento de detección selectiva de la presente invención, la función robot mueve las puntas de las pipetas, las placas con lisado (p. ej., 96 pocillos), las placas de cultivos (p.

ej., placa de crecimiento de pocillo profundo con cultivo mutado) con el brazo ORCA del Carousel al BIOMEK. A continuación, el BOMEK dispensa una mezcla de lisozimas en cada pocillo de las placas de lisado. Después, el vultivo celular se transfiere de cada pocillo de la placade cultivo a cada pocillo correspondiente de la placa de lisado. Después, las placas de lisado se transfieren mediante el brazo ORCA al incubador durante un periodo de tiempo (p. ej., a temperatura ambiente durante 15 minutos), después se transfieren al bloqueo de calentamiento y se calientan durante un periodo de tiempo (p. ej., a 83 ºC durante 3 minutos). Las placas de lisado, junto con los bloques con sustrato a media profundidad, las placas de reacción (p. ej., placas Griener de 384 pocillos) y las puntas se mueven desde el Carrusel o el bloqueo térmico al BIOMEK y el sustrato de ensayo (p. ej., 10 ul) se dispensa en cada pocillo de la placa de reacción. Un alícuota de lisado (p. ej., 5 ul) se transfiere desde cada pocillo de una placa de lisado a un pocillo correspondiente de la placa de reacción. Cada pocillo está revestido con aceite mineral (p. ej., 6,5 ul). La placa de reacción es movida por el brazo del robot al incubador y se incuba (p. ej., a 63 ºC) durante una hora. Después, la placa se muevo al lector de placas de fluorescencia, la fluorescencia se mide para cada pocillo y el brazo del robot devuelve la placa de ensayo completada, todas las demás placas y componentes de puntas al carrusel. Estas etapas se repiten hasta que se completan todos los ensayos deseados. Cuando una selección primaria indica un cambio deseado en la actividad, los clones cultivados para producir enzima adicional (p. ej., en condiciones de inducción), la enzima se puede purificar y usar tanto para verificar el resultado inicial y para usar en la caracterización adicional. Los clones que expresan las enzimas de interés pueden también secuenciarse para identificar o verificar las mutaciones. En ciertas realizaciones, 48 placas de cultivos se cultivan todos los días. En algunas realizaciones, de 12 a 16 placas de lisis se procesan mediante ensayos de detección en un día de 8 a 10 horas. En otras realizaciones, de 18 a 21 placas de lisis se procesan mediante ensayos de detección en un día de 12 a 15 horas. Otros detalles de las realizaciones de este sistema se proporcionan en el ejemplo 67.

IX. Ensayo INVASOR pada detección directa y medición de analitos específicos.

La descripción siguiente proporciona ejemplos ilustrativos de detección de la secuencia diana mediante el uso de las composiciones y procedimientos de la presente invención. Estos ejemplos incluyen la detección de ADN viral de citomegalovirus humano, polimorfismos de un solo nucleótido en el gen de la apolipoproteína E humana, mutaciones en el gen de la hemocromatosis, mutaciones en MTHFR humano, polimorfismo de protrombina 20210GA, la mutación HR-2 en el gen del factor V humano, polimorfismos de un solo nucleótido en el gen de TNF- humano y mutación Leiden en el gen del factor V humano. En estas descripciones se incluyen nuevas composiciones de ácido nucleico para usar en la detección de dicha secuencia. Los Ejemplos 54-61 siguientes proporcionan detalles sobre el diseño y ejecución de estas realizaciones ilustrativas. Se entiende que estos ensayos de detección se pueden realizar solos, por ejemplo en ensayos de detección individual o se pueden realizar en combinaciones. Las combinaciones pueden comprender análisis multiplex, por ejemplo en los que una pluralidad de diferentes secuencias diana se detecta en una única reacción (p. ej., usando un colorante inactivdo diferente en una sonda FRET para cada secuencia que se sospecha que está presente en una muestra o mezcla). Las combinaciones pueden comprender paneles, en los que una pluralidad de reacciones de detección se realizan de forma simultánea, por ejemplo una placa de ensayo.

A. Detección de ADN viral de citomegalovirus humano mediante escisión invasiva

El citomegalovirus humano (HCMV) produce, o está asociado con, una amplia variedad de enfermedades en seres humanos (Tabla 3). Más del 90 % de los receptores de transplante de médula ósea o riñón (huéspedes inmunocomprometidos) desarrolla infecciones por HCMV, la mayoría de las cuales se deben a reactivación de virus latente por fármacos inmunosupresores, así como transmisión de virus por tejido o sangre de donante infectado de forma latente (Ackerman y col., Transplant. Proc., 20(S1):468 [1988]; y Peterson y col., Medicine 59:283 [1980]).

TABLA 3

Enfermedades producidas por el citomegalovirus humano

Inclusión citomegálica Enfermedad negativa para heterófilos en neonatos mononucleosis Neumonía intersticial Neumonitis retinitis Hepatitis pancreatitis meningoencefalitis Enfermedad gastrointestinal Infección diseminada

Hay casos en los que es necesario un diagnostico rápido, sensible y específico de la enfermedad por HCMV. En los últimos años, el número de pacientes sometidos a transplantes de órganos y tejidos ha aumentado considerablemente. El HCMV es la causa más frecuente de muerte en receptores de transplante inmunocomprometidos, de modo que se confirma la necesidadde un diagnóstico de laboratorio rápido y fiable. Los linfocitos, monocitos y posiblemente las células de músculo liso o endoteliales arteriales son sitios de latencia del HCMV. Por tanto, la prevención de infecciones por HCMV en individuos inmunocomprometidos (p. ej., receptores de transplantes) incluye el uso de hemoderivados y órganos negativos para el HCMV. Adicionalmente, el HCMV se puede transmitir a través de la placenta y a neonatos por contacto con las secreciones cervicales infectadas durante el nacimiento. Por tanto, puede ser deseable un ensayo rápido, sensible y específico paradetectar HCMV en fluidos corporales o secreciones como medio para monitorizar la infección y, en consecuencia, determinar la necesidad de una cesárea.

El diagnóstico de la infección por HCMV se puede realizar por cultivo celular convencional usando fibrblastos humanos; cultivo en centrifugación de vial cubierto usando anticuerpos monoclonales y técnicas de tinción inmunofluorescente; procedimientos serológicos; el ensayo de antigenemia por HCMV que usa un anticuerpo monoclonal para detectar el antígeno del HCMV en leucocitos de sangre periférica (PBL) o mediante ensayos de hibridación de ácido nucleico. Estos diversos procedimientos tienen sus ventajas y limitaciones. El cultivo celular convencional es sensible pero lento, ya que el efecto citopático (ECP) puede requerir 30 o más días para desarrollarse. La centrifugación de vial cubierto es más rápida pero sigue requiriendo 24-48 horas para obtener los resultados iniciales. Ambos procedimientos de cultivo están afectados por la terapia antiviral. En pacientes inmunocomprometidos, la capacidad de montar respuestas de anticuerpos IgG y/o IgM frente a la infección por HCMV está aletrada y, por tanto, los procedimientos serológicos no son fiables en este contexto. Como alternativa, los anticuerpos IgM pueden persistir durante meses una vez resuelta la infección y, por tanto, su presencia puede no ser indicativa de infección activa. El ensayo de antigenemia de HCMV requiere trabajo intenso y no es aplicable a muestras que no sean PBL.

Los avances recientes en biología molecular han estimulado el uso de sondas de ADN en un intento de proporcionar un ensato más rápido, sensible y específico para detectar HCMV en muestras clínicas. Por ejemplo, se han usado las sondas de ADN radiomarcadas para hibridar con cultivos tisulares infectados con o por HCMV o en muestras clínicas que se sospecha que contienen HCMV (“ensayos de hibridación”). No obstante, el uso de sondas en los cultivos tisulares requiere al menos 18-24 horas de crecimiento para amplificar el antígeno (HCMV) que se va a detectar, si está presente, un tiempo adicional para desarrollar sistemas de detección autorradiográfica. Usando ensayos de hibridación para analizar muestras clínicas para HCMV pueden carecer de sensibilidad, en función del título del virus y la muestra clínica analizada. La detección del HCMV en las muestras clínicas se ha comunicado usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar enzimáticamente el ADN del HCMV. Los procedimientos que usan PCR se comparan favorablemente con el aislamiento de virus, ensayos de hibridación in situ y transferencia de tipo southern; véase, por ejemplo, Bamborschke y col. J. Neurol., 239:205 [1992]; Drouet y col., J. Virol. Meth., 45:259 [1993]; Einsele y col., Blood 77:1104-1110 [1991]; Einsele y col., Lancet 338:1170 [1991]; Lee y col., Aust. NZ J. Med., 22:249 [1992]; Miller et al., J. Clin. Microbiol., 32:5 [1994]; Rowley y col.., Transplant. 51:1028 [1991]; Spector y col. J. Clin. Microbiol., 30:2359 [1992]; y Stanier y col., Mol. Cell. Probes 8:51 [1992]). Otros autores, comparando el ensayo de antigenemia del HCMV con procedimientos de PCR, han descubierto procedimientos de PCR tan eficientes o ligeramente más eficientes en la detección del HCMV (van Dorp y col. (1992) Transplant. 54:661; Gema y col. (1991) J. Infect. Dis. 164:488; Vleiger y col. (1992) Bone Marrow Transplant. 9:247; Zipeto y col. (1992) J. Clin. Microbiol. 30:527]. Además, los procedimientos de PCR han exhibido una gran sensibilidad cuando se han analizado otras muestras distintas a PBL (Natori y col., Kansenshogaku Zasshi 67:1011 [1993]; Peterson y col., Medicine 59:283 [1980]; Prosch y col., J. Med. Virol., 38:246 [1992]; Ratnamohan y col., J. Med. Virol. 38:252 [1992]). No obstante, debido a los peligros de reacciones falsos positivos, estos procedimientos basados en PCR requieren controles rígidos para evitar la contaminación y la transferencia (Ehrlich y col., en PCR-Based Diagnostics in Infectious Diseases, Ehrlich and Greenberg (eds), Blackwell Scientific Publications, [1994], pág.3-18). Por tanto, existe la necesidad de un ensayo rápido, sensible y específico para HCMV que tenga un riesgo menor de resultados falsos positivos debido a la contaminación por el producto de reacción desde otras muestras.

Como se muestra en el presente documento, el ensayo de escisión dirigido por INVASOR es rápido, sensible y específico. Dado que los productos acumulados no contribuyen a la acumulación posterior de la sela, los productos de reacción llevados desde un esnato de escisión estándar dirigido por INVASOR (es decir, no secuencial) a otro no pueden estimular los resultados falsos positivos. El uso de múltiples ensayos de escisión dirigidos por INVASOR secuenciales reforzará adicionalmente la sensibilidad de la detección del HCMV sin sacrificar estas ventajas.

B. Detección de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen de la apolipoproteína E humana

La apolipoproteína E (ApoE) realiza varias funciones como constituyente de lipoproteínas plasmáticas, incluido su papel en el metabolismo del colesterol. Primero se identificó como constituyente de lipoproteínas de muy baja densidad sintetizadas en el hígado que funcionan en el transporte de triglicéridos desde el hígado a los tejidos periféricos. Hay tres isoformas principales de la ApoE, denominadas ApoE2, ApoE3 y ApoE4, que son productos de tres alelos en un único locus génico. Tres fenotipos homocigotos (Apo-E2/2, E3/3 y E4/4) y tres fenotipos heterocigotos (ApoE3/2, E4/3 y E4/2) surgen de la expression de dos cualquiera de los tres alelos. El fenotipo más habitual es ApoE3/3 y el alelo más habitual es E3. Véase Mahley, R. W., Science 240:622-630 (1988).

Las secuencias de aminoácidos de los tres tipos difieren únicamente ligeramente. La ApoE4 difiere de a ApoE3 en que la arginina de ApoE4 está sustituida por la cisteína normal en el residuo de aminoácido 112. La forma más habitual de ApoE2 difiere de ApoE3 en el residuo 158, en el que la cisteína está sustituida por la arginina normal. Véase Mahley, Science, supra. -

Se he demostrado que laecuencia del alelo apoE4 está marcadamente aumentada en la enfermedad de Alzheimer (EA) esporádica (Poirier, J. y col., 1993, Apolipoprotein E phenotype and Alzheimer’s Disease, Lancet, 342:697-699; Noguchi, S. y col., 1993, Lancet (letter), 342:737) y la enfermedad de Alzheimer (EA) familiar de inicio tardío (Corder,

E. H. y col., 1993, Science, 261:921-923; Payami, H. y col., 1993, Lancet (letter), 342:738). Este efecto de dosis sobre el gen se obserbó en los casos tanto esporádicos como familiares (es decir, a medida que la edad de inicio aumenta, disminuye el número de copias del alelo E4). Las mujeres, que en general tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedad de Alzheimer, muestran una mayor frecuencia del alelo E4 cuando se compara con varones de la misma edad.

C. Detección de mutaciones en el gen de la hemocromatosis humana

La hemocromatosis hereditaria (HH) es un trastorno hereditario del metabolismo del hierro en el que en el cuerpo se acumula un exceso de hierro. En individuos sintomáticos, este exceso de hierro conduce a efectos perjudiciales al depositarse en varios órganos que conduce a su fallo y tiene como resultado cirrosis, diabetes, esterilidad y otras enfermedades graves.

La HH se hereda como un rasgo recesivo; los heterocigotos son asintomáticos y solo loshomocigotos están afectados por la enfermedad. Se ha estimado que aproximadamente el 10 % de los individuos descendientes de Europa occidental portan una mutación en el gen de la HH y que hay aproximadamente un millón de homocigotos en EE.UU. Aunque en última instancia la HH produce síntomas debilitantes, la mayoría de los homocigotos no han sido diagnosticados. De hecho, se ha estimado que en EE.UU. no s eha diagnosticado esta afección a más de 10.000 personas. Los síntomas a menudo se confunden con los de otras afecciones y los graves efectos de la enfermedad no suelen aparecer inmediatamente. Sería deseable proporcionar un procedimiento para identificar personas que, en última instancia, están destinadas a ser sintomáticas con el fin de intervenir a tiempo y prevenir el excesivo daño tisular. Un motivo para la falta de diagnóstico precoc es lo inadecuado de los procedimientos diagnósticos disponibles actualmente para determinar qué individuos están en riesgo.

Aunque los parámetros de hierro en sangre se pueden usar como herramienta de detección selectiva, un diagnóstico confirmado a menudo emplea tipado de HLA, que es tedioso, inespecífico y caro, y/o biopsia hepática que es indeseablemente invastiva y costosa. De acuerdo con esto, otros autores han intentado desarrollar diagnósticos baratos y no invastivos para la detección de homocigotos que tienen la enfermedad existente, en cuanto a que la detección presintomática guiaría la intervención para prevenir los daños en los órganos y para la identificación de los portadores. La necesidad de dichos diagnósticos se documenta en, por ejemplo, Firich, C. A. West J Med (1990) 153:323-325; McCusick, V. y col. Mendelian Inheritance in Man 11ª ed., Johns Hopkins University Press (Baltimore, 1994) pág. 1882-1887; Informe conjunto de la Organización Mundial de la Salud/Fundaciión de la HH/Reunión de la Asociación Francesa de la HH, 1993.

D. Detección de mutaciones en el MTHFR humano

Los derivados de ácido fólico son coenzimas de vaias reacciones críticas de transfererencia carbono sencillo, incluidas las reacciones de biosíntesis de purinas, timidilato y metionina. La metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR; EC 1.5.1.20) cataliza la reducción unida a NADPH del 5,10-metilentetrahidrofolato en 5metiltetrahidrofolato, un cosustrato para la metilación de homocisteína en metionina. La enzima hepática porcina, una flavoproteína, se ha purificado hasta homogeneidad; es un homodímero de subunidades de 77 kDa. La proteólisis parcial del péptido porciones ha revelado dos dominios espacialmente distintos: un dominio en N terminal de 40 kDa y un dominio en C-terminal de 37 kDa. El último dominio contiene el sitio d eunión para el regulador alostérico S-adenosilmetionina.

La deficiencia hereditaria de MTHFR, un trastorno autosómico recesivo, es el error congénito más frecuente del metabolismo del ácido fólico. Un bloqueo en la producción de metiltetrahidrofolato condice a niveles elevados de homocisteína con niveles de bajos a normales de metionina. Los pacientes con deficiencias graves de MTHFR (actividad de 0-20 % en fibroblastos) pueden tener fenotipos variables. En este grupo se han comunicado retrasto en el desarrollo, retraso mental, anomalías motoras y en la marcha, neuropatía periférica, crisis y alteraciones psiquiátricas, aunque al menos un paciente con definciencia grave de MTHFR estaba asintomático. Los cambios ptológicos en la forma grave incluyen cambios vasculares que se han encontrdo en otras afecciones con niveles elevdos de homocisteína, así como niveles reducidos de neurotransmisor y de metionina en el SNC. Una definciencia más leve de MTHFR (actividad 35-50 %) se ha descrito en pacientes con arteriopatía coronaria. La heterogeneicidad genética es probable, considerando las diversas características clínicas, los niveles variables de la actividad enzimática y los perfiles de inactivación térmica diferencial de la reductasa en las células de los pacientes. Los procedimientos para detectar la mutación en MTHFR incluyen: AS-PCR (Hessner y col., Br J Haematol 106, 237-9 (1999)) y PCR-RFLP (Nature Genetics, Frosst y col. 1995:10; 111-113).

E. Detección del polimorfismo de la protrombina 20210GA y polimorfismo del factor V de Leiden

La cascada de coagulación es una serie compleja de bucles de activaciones de cimógeno, inactivaciones y retroalimentación en la que participan numerosas enzimas y sus cofactores. Toda la cascada, desde la lesión tisula

o traumatismo venoso hasta la coagulación se ha descrito bien (ref.). La cascada culmina en la conversión de protrombina (Factor II) en trombina. Esto se cataliza mediante la forma actvada del factor X, el factor Xa y su cofactor, factor V activado, factor Va. A continuaicó, la trombina convierte el fibrinógeno en fibrina y estimula la reticulación de la fibrina y la formación de coágulos por la activación del factor XIII. Además de las funciones indicadas anteriormente, la trombina, una serina proteasa, también puede activar el factor V en un bucle de retroalimentación positiva. El Factor Va es un cofactor procoagulante en la cascada de coagulación y cuando la formación de coágulos es suficiente, es inactivado por la proteína C activada (APC).

La trombosis venosa es la obstrucción de la circulación por coágulos que se han formado en las venas o que se han liberado de un trombo formado en otro lugar. Los sitios más frecuentes de formación de coágulos son las venas profundas de las piernas, pero también se pueden producir en las venas del cerebro, la retina, el hígado y el mesenterio. Factores distintos a defectos hereditarios que pueden desemèñar un papel en el desarrollo de la trombosis incluyen cirugía reciente, trastornos malignos, embarazo y parto e inmovilización prolongada.

Estudios de trombofilia hereditaria, definda como un incremento de la tendencia a enfermedad trombótica venosa en adultos relativamente jóvenes, han proporcionado ideas sobre los factores genéticos que regulan la trombosis. En 1993, Dahlback y col. (Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:1004-1008) describieron una insensibilidad a APC, un anticoagulante crítico en la cascada de coagulación, en tres familias no relacionadas con trombofilia hereditaria. La propiedad anticoagulante de APC reside en su capacidad para inactivar los cofactores activados Va y VIIIa mediante proteólisis limitada (Ref. 3). Esta inactivación de los cofactores Va y VIIIa tiene como resultado la reducción de la velocidad de formación de la trombina, el producto final de la cascada. Esta observación fue confirmada por otros investigadores (Ref.) y la expresión “resistencia a APC” se acuñó para describir este fenotipo concreto en los pacientes trombofílicos. En un estudio posterior de 20 familias con trombofilia y resistencia a APC, se observó un patrón dominante autosómico de herencia (17). Bertina y col. (Nature, 1994, May 5;369 (6475):64-7) demostraron que el fenotipo de la resistencia a PAC se asocial con heterocigosidad u homocigosidad para una única mutación punctual en el nucleotide 1691 en el ezón 10 del gen del factor V. Este cambio dde una sola base, una sustitución de guanina en adenina, da una molécula mutante del factor V en la que la arginina en la posición 506 es sustituida con glutamina. Esta forma de la molécula del factor V, que se caracterizó en la Universidad de Leiden (Bertenia et al), se conoce como FV Q506 o mutación FV de Leiden, u está inactivada con menos eficiencia por la APC que con la proteína Silvestre. Se ha postulado que la circulación prolomgada del factor V activado estimula un estado de hipercoagulación e incrementa el riesgo de trombosis. El análisis posterior de varios grupos de pacientes que exhiben síntomas de trombosis venosa indica que la mutación en el factor V de Leiden es el factor hereditario único más común que contribuye a un incremento del riesgo de trombosis venosa.

En 1996, estudios de Poort y col. (Blood. 1996:88; 3698-703) revelaron el segundo factor hereditario más frecuente de contribución a incrementar el riesgo trombótico. Al estudiar la secuencia del gen de la protrombina en pacientes seleccionados con un historial familiar documentado de trombofilia venosa, el grupo de Poort identificó una única mutación puntal en la región 3’ sin traducir. Esta transición de G a A en la posición 20210 correlaicona intensamente con los niveles plasmáticoselevados de protrombina y también se demostró que estaba sociado con un incremento casi en el umbral del riesgo de trombosis venosa (resumen, Howard)

El primer caso comunicado de un paciente de trombofilia genéticamente homocigoto para el polimorfismo de G a A en la región 3' sin traducir lo realizó Howard, y col. (Blood Coagulation Fibrinolysis 1997 Jul;8(5):316-9). El paciente, un varón mejicano joven y sano se presentó con un infarto de miocardio, trombosis venosa y embolia. Se encintró que el paciente era homcigoto para la mutación de protrombina y heterocigoto para la mutación del factor v de Leiden, que avala la teoría doble de trombofilia en pacientes jóvenes.

Los estudios realizados por Hessner y col. Muestran que el genotipo de la protrombina 20210GA era casi 5 veces tan prevalente en los portadores de FVL sintomáticos que en un grupo control caucasiano aleatorio (British Journal of Haematology, 1999, 106), y que las frecuencias de los alelos para los mutantes de protrombina y Factor V varían entre diferentes antecedents étnicos (Thromb Haemostat 1999; 81:733-8). La discusión anterior confirma que la detección precoz de la mutación del factor V de Leidn y la mutación del factor II protrombina es crucial en la evaluación del riesgo trombótico hereditario. La naturaleza de estas dos mutaciones, es decir, un cambio e una sola base en la secuencia de ácidos nucleicos, las hace sensibles a diversos procedimientos de detección de ácido nucleico conocidos en la técnica, aunque la demanda de ensayos más rápidos, más fiables, más económicos y cómodos para el usuario para la detección de secuencias de ácido nucleico continúa creciendo. Los procedimientos más frecuentes para analizar estas mutaciones incluyen PCR/RFLP, AS-PCR y ensayos de coagulación funcionales.

F. Detección de la mutación HR-2 en el gen del factor V humano

El polimorfismo R-2 se localiza en el exón 13 del gen del factor V y es el resultado de una transición de A a G en la base 4070, sustituyendo el aminoácido silvestre histidina con el mutante arginina en la proteína madura. El polimorfismo R-2 es uno de un conjunto de mutaciones denominadas en conjunto HR-2. El haplotipo de HR-2 se define por sustituciones de 6 bases nucleotídicas en los exones 13 y 16 del gen del factor V. El haplotipo está asociado con un incremento de la resistencia funcional a la proteína C activada, tanto en sujetos normalescomo en pacientes trombofílicos. Cuando está presente como un heterocigoto compuesto junto con la mutación en el factor V de Leiden, los síntomas clínicos son comparables con los observados en los pacientes homocigoros para la mutación en el factor V de Leiden e incluyen un incremento del riegso de trombosis venosa profunda.

G. Detección de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen de la TNF- humana

Se ha demostrado que la citocina humana factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) es un factor principal en el rechazo d einjertos; cuando más TNF-alfa hay presente en el sistema, mayor es la respuesta de rechazo al tejido transplantado. Las mutaciones en el TNF-alfa también se han correlacionad con la malaria cerebral (Nature 1994;371:508-510), púrpura fulminante (J Infect Dis. 1996;174:878-880) y leishmaniaisis mucocutánea (J Exp Med. 1995;182:1259-1264). La mutación detectada en este ejemplo se localiza en la región promotora del gen del TNFalfa en la posición menos 308. La guanina silvestre (G) está sustituida con una adenina mutante (A). Este resultado de esta mutación en el promotor es la multiplicación de la trasncripción del TNF-alfa por 6-7. Los procedimientos para detectar mutaciones en el TNF-alfa incluyen secuenciación, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, procedimientos de PCR y procedimientos que implican PCR e hibridación tras PCR con oligos específicos.

H. Detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina

Staphylococcus aureus está reconocido como una de las principales causas de infecciones en seres humanos que se producen en el hospital y en la comunidad en general. Uno de los problemas másgraves que ateñen al tratamiento de cualquier infección bacteriana es el incremento dela resistencia a antibióticos. La creciente incidencia de infecciones por S. aureus resistente a meticilina (MRSA) en todo el mundo ha subrayado la importancia de ladetección precoz del agente infeccioso y definer un perfil de resistencia de modo que se pueda administrar el tratamiento adecuado. El mecanismo principal de la resistencia a meticilina implica la producción de una proteína denominada PBP2a, condificada por el gen mecA. El gen mecA no es específico de Staphalococcus aureus, sino que es de origen en otras especies. No obstante, el gen mecA es indicativo de resistencia a meticilina y se usa como marcador para la detección de bacterias resistentes. Por tanto, para identificar S. aureus resistente a meticilina mediante técnicas de ácido nucleico, se deben tener como objetivo tanto el gen mecA como al menos un gen específico de especie. Un gen esecífico de especie concreto, el gen de nucleasa o nuc se usa en el ejemplo siguiente: Los procedimientos usados para detectar MRSA incluyen cultivo y laborioso y que requiere tiempo, y ensayos de coagulación y ensayps decrecimiento con medios antibióticos. Las estrategias moleculars incluyen un ensayo Cycling Probe™, el kit Cycling Probe™ de Alexon-Trend (Ramsey, MN nº de cat. 818-48), ensayo de anticuerpo que se unen a la proteína PBP2a, ensayo de bDNA (Chiron, Emeryville, CAtodos ellos analizan únicamente la presencia del gen mecA y no son específicos de Staph. Aureus.

X. Kits

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona kits que comprenden uno o más de los componentes necesarios para practivcar la presente invención, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la presente invención proporciona kits para almacenar o liberar enzimas de la presente invención y/o los componentes de la reacción necesarios para poner en práctica un ensayo de escisión (p. ej., el ensayo INVASOR). El kiut puede incluir todos y cada uno de los componentes necesarios o deseados para las enzimas o ensayos incluiros, entre otros, los propios reactivos, tampones, reactivos control (p. ej., muestras de tejido, oligonucleótidos diana control positivos y negativos etc.), soportes sólidos, marcadores, instrucciones escritas y/o de imagen e información delproducto, inhibidores, reactivos de marcaje y/o detección, controles ambientales para envases (p. ej., hielo, desecantes etc.) y similares. En algunas realizaciones, los kit proporcionan un subconjunto de los componentes requeridos, en el que cabe esperar que el usuario suministre los componentes restantes. En algunas realizaciones, los kit comprenden dos o más contenedores separados en los que cada contenedor aloja un subconjunto de los comonentes que se van a liberar. Por ejemplo, un primer contenedor (p. ej., una caja) puede contener una enzima (p. ej., enzima de escisión específica de estructura en un tampón de almacenamiento y contenedor adeciados), mientras que una segunda caja puede contener oligonucleótidos (p. ej., oligonucleótidos INVASOR, oligonucleótidos sonda, oligonucleótidos diana control etc.).

EJEMPLOS

La invención se define en las reivindicaciones.

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar determinadas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes de su ámbito.

En las siguiente divulgación, las siguientes abreviaturas se aplican a: Afu (Archaeoglobus fulgidus); Mth (Methanobacterium thermoautotrophicum); Mja (Methanococcus jannaschii); Pfu (Pyrococcus furiosus); Sso (Sulfolobus solfataricus); Pae (Pyrobaculum aerophilumI); Tli (Thermococcus litoralis); Ave (Archaeaglobus veneficus); Apr (Ar-chaeaglobus profundus); Abr (Acidianus brierlyi); Aam (Acidianus ambivalens); Dam (Desulfurococcus amylolyticus); Dmo (Desulfurococcus mobilis); Pbr (Pyrodictium brockii); Tgo (Thermococcus gorgonarius); Tzi (Thermococcus zilligii); Mke (Methanopyrus kandleri); Mig (Methanococcus igneus); Pho (Pyrococcus horikoshii); Ape (Aeropyrum pernix); Pwo (Pyrococcus woesei); Taq (Thermus aquaticus); DNAP de Taq, DNAPTaq y Taq Pol I (ADN polimerasa I de T. aquaticus); DNAPStf (el fragmento Stoffel de DNAPTaq); DNAPEcl (ADN polimerasa I de E. coli); Tth (Thermus thermophilus); Ej. Ejemplo); Fig. (Fig.); ºC (grados centígrados); g (campo gravitacional); h (hora); min (minuto), oligo (oligonucleótido), rxn (reacción), vol (volumen); p/v (peso a volumen); v/v (volumen a volumen); BSA (albúmina sérica bovina); CTAB (bromuro de

cetiltrimetilamonio); HPLC (cromatografía líquida de alta presión); ADN (ácido desoxirribonucleico); p (plásmido); μl (microlitros); ml (mililitros); μg (microgramos); mg (miligramos); M (molar); mM (miliMolar); μM (microMolar); pmol

(picomol); amol (atomol), zmol (zeptomol); nm (nanómetros); kdal (kilodalton); DO (densidad óptica); EDTA (ácido etileno diamino tetra-acético); FITC (isotiocianato de fluoresceína); SDS (dodecil sulfato sódico); NaPO4 (fosfato sódico); NP-40(Nonidet P-40); Tris (tris(hidroximetil)-aminometano); PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro); TBE (Tris-Borato- EDTA, es decir, tampón Tris titulado con ácido bórico en vez de HCl y que contiene EDTA); PBS (solución salina tamponada con fosfato); PPBS (solución salina tamponada con fosfato que tiene PMSF 1 mM); PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida); Tween (polioxietileno-sorbitán); ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD); Coriell (Coriell Cell Re-positories, Camden, NJ); DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellculturen, Braunschweig, Alemania), pigmento rojo (colorante REDMOND RED, Synthetic Genetics, San Diego, CA); Z28 (ECLIPSE Quencher, Synthetic Genetics, San Diego, CA); Ambion (Ambion, Inc., Austin, TX); Boehringer (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN); MJ. Research (MJ Research, Watertown, MA; Sigma (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO); Dynal (Dynal A.S., Oslo, Norway); Gull (Gull Laboratories, Salt Lake City, UT); Epicentre (Epicentre Technologies, Madison, WI); Lampire (Biological Labs., Inc., Coopersberg, PA); MJ Research (MJ Research, Watertown, MA); National Biosciences (National Biosciences, Plymouth, MN); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI);; Promega (Promega, Corp., Madison, WI); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Clonetech (Clonetech, Palo Alto, CA) Pharmacia (Pharmacia, Piscataway, NJ); Milton Roy (Milton Roy, Rochester, NY); Amersham (Amersham International, Chicago, IL); y USB (U.S. Biochemical, Cleveland, OH). Glen Research (Glen Research, Sterling, VA); Coriell (Coriell Cell Repositories, Camden, NJ); Gentra (Gentra, Minneapolis, MN); Third Wave Technologies (Third Wave Technologies, Madison, WI); PerSeptive Biosystems (PerSeptive Biosystems, Framington, MA); Microsoft (Mi-crosoft, Redmond, WA); Qiagen (Qiagen, Valencia, CA); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); VWR (VWR Scientific, ); Advanced Biotechnologies (Advanced Biotechnologies, INC., Columbia, MD); Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA) y Perkin Elmer (también conocido como PE Biosytems and Applied Biosystems, Foster City, CA).

EJEMPLO 1 - Referencia

Características de las ADN polimerasas termoestables nativas

A. Actividad 5’ nucleasa de DNAPTaq

Durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y col., Science 239:487 [1988]; Mullis y Faloona, Meth. Enzymol., 155:335 [1987]), la DNAPTaq es capaz de amplificar muchas, pero no todas de las secuencias de ADN. Una secuencia que no se puede amplificar usando DNAPTaq se muestra en la Fig. 5 (la Estructura de horquilla es la SEC ID Nº 15 también muestra un cebador: SEC ID Nº 17). Esta secuencia de ADN tiene la característica distintiva de ser capaz de plegarse sobre sí misma para formar una horquilla con dos brazos monocatenarios, que se corresponden a los cebadores usados en PCR.

Para ensayar si esta incapacidad de amplificación se debe a la actividad nucleasa 5’ de la enzima, se compararon

las capacidades de DNAPTaq y DNAPStf para amplificar esta secuencia de ADN durante 30 ciclos de PCR. Se obtuvieron oligonucleótidos sintéticos en el Centro de Biotecnología en la Universidad de Wisconsin-Madison. La DNAPTaq y DNAPStf se obtuvieron en Perkin Elmer (es decir, la ADN polimerasa de AMPLITAQ y el fragmento Stoffel de ADN polimerasa de AMPLITAQ). El ADN sustrato comprendía la estructura de horquilla mostrada en la Fig. 6 clonada en una forma de doble hélice en pUC19. Los cebadores usados en la amplificación se indican como las SEC ID Nº 16-17. El cebador de la SEC ID Nº 17 se muestra hibridado con el brazo 3’ de la estructura de horquilla en la Fig. 5. El cebador de la SEC ID Nº 16 se muestra como los primeros 20 nucleótidos en negrita del

brazo 5’ de la horquilla en la Fig. 5.

Las reacciones en cadena de la polimerasa comprendían 1 ng de ADN diana de plásmido superenrollado, 5 pmol de cada cebador, 40 μM de cada dNTP y 2,5 unidades de DNAPTaq o DNAPStf, en una solución de 50 μl de Tris·Cl 10 mM pH 8,3. Las reacciones de DNAPTaq incluyeron KCl 50 mM y MgCl2 1,5 mM. El perfil de temperatura fue de 95ºC durante 30 s, 55ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min, a lo largo de 30 ciclos. Diez por ciento de cada reacción se analizó por electroforesis en gel a través de poliacrilamida al 6% (reticulada 29:1) en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM.

Los resultados se muestran en la Fig. 6. El producto esperado se preparó por DNAPStf (indicado simplemente como “S”) pero no de DNAPTaq (indicado como “T”). Se concluyó que la actividad nucleasa 5’ de DNAPTaq es responsable de la ausencia de amplificación de esta secuencia de ADN.

Para ensayar si los nucleótidos no emparejados 5’ en la región sustrato de este ADN estructurado se eliminan por DNAPTaq, el destino del brazo 5’ marcado terminalmente durante cuatro ciclos de PCR se comparó usando las mismas dos polimerasas (Fig. 7). Los moldes de horquilla, tales como el descrito en la Fig. 6, se prepararon usando DNAPStf y un cebador marcado en el extremo 5’ con 32P. El extremo 5’ del ADN se liberó como unos pocos fragmentos grandes por DNAPTaq pero no por DNAPStf. Los tamaños de estos fragmentos (basándose en sus

movilidades) muestran que contienen la mayoría o todo el brazo 5’ no emparejado del ADN. Por tanto, la escisión tiene lugar en o cerca de la base del dúplex bifurcado. Estos fragmentos liberados terminan con grupos OH 3’, como se evidencia por análisis de secuencia directo y las capacidades de los fragmentos a extender por desoxinucleotidil transferasa terminal.

Las figuras 8-10 muestran los resultados de experimentos diseñados para caracterizar la reacción de escisión catalizada por DNAPTaq. A menos que se especifique de otro modo, las reacciones de escisión comprenden 0,01 pmol de ADN en horquilla desnaturalizado por calor, marcado terminalmente (estando también presente la cadena complementaria no marcada), 1 pmol de cebador (complementario al brazo 3’) y 0,5 unidades de DNAPTaq (que se estima que es 0,026 pmol) en un volumen total de 10 μl de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM y MgCl2 1,5 mM Como se ha indicado, algunas reacciones tenían concentraciones diferentes de KCl y los tiempos y temperaturas precisos usados en cada experimento se indican en las figuras Individuales. Las reacciones que incluían un cebador usaron el mostrado en la Fig. 5 (SEC ID Nº 17). En algunos casos, el cebador se extendió al sitio de unión proporcionando polimerasa y nucleótidos seleccionado.

Las reacciones se iniciaron a la temperatura de reacción final por la adición del MgCl2 o la enzima. Las reacciones

se detuvieron a sus temperaturas de incubación mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM

y colorantes marcadores al 0,05%. Los cálculos de Tf enumerados se realizaron usando el software de análisis de cebador OligoTM de National Biosciences, Inc. Los mismos se determinaron usando 0,25 μM como la concentración de ADN, a 15 ó 65 mM de sal total (al MgCl2 1,5 mM en todas las reacciones se dio el valor de sal 15 mM para estos cálculos).

La Fig. 8 es un autorradiograma que contiene los resultados de un conjunto de experimentos y condiciones del sitio. La Fig. 8A es una determinación de los componentes de reacción que permiten la escisión. La incubación del ADN de horquilla marcado en el extremo 5’ se realizó durante 30 minutos a 55ºC, con los componentes indicados. Los productos se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se indican las longitudes de los productos, en nucleótidos. La Fig. 8B describe el efecto de la temperatura sobre el sitio de escisión en ausencia de cebador añadido. Las reacciones se incubaron en ausencia de KCl durante 10 minutos a las temperaturas indicadas. Se indican las longitudes de los productos, en nucleótidos.

Sorprendentemente, la escisión por DNAPTaq no requiere ningún cebador ni dNTP (véase la Fig. 8A). Por tanto, la

actividad nucleasa 5’ se puede desacoplar de la polimerización. La actividad nucleasa requiere iones de magnesio,

aunque los iones de manganeso se pueden sustituir, aunque con cambios potenciales en especificidad y actividad. Ni iones de cinc ni de calcio soportan la reacción de escisión. La reacción tiene lugar a lo largo de un amplio intervalo de temperaturas, de 25ºC a 85ºC, aumentando la velocidad de escisión a temperaturas mayores.

Todavía con referencia a la Fig. 8, el cebador no se prolonga en ausencia de dNTP añadidos. Sin embargo, el cebador influye en el sitio y la velocidad de escisión de la horquilla. El cambio en el sitio de escisión (Fig. 8A) aparentemente se produce por la alteración de un dúplex corto formado entre los brazos del sustrato de ADN. En ausencia de cebador, las secuencias indicadas por el subrayado en la Fig. 5 se podrían emparejar, formando un dúplex extendido. La escisión en el extremo del dúplex extendido liberaría el fragmento de 11 nucleótidos observado en los carriles de la Fig. 9A sin cebador añadido. La adición de cebador en exceso (Fig. 8A, carriles 3 y 4) o incubación a una temperatura elevada (Fig. 8B) altera la extensión corta del dúplex y da como resultado un brazo 5’ más largo y, por tanto, productos de escisión más largos.

La ubicación del extremo 3’ del cebador puede influir en el sitio preciso de escisión. El análisis electroforético

demostró que en ausencia de cebador (Fig. 8B), la escisión tiene lugar en el extremo del dúplex sustrato (la forma extendida o acortada, dependiendo de la temperatura) entre el primer y el segundo par de bases. Cuando el cebador se extiende hasta la base del dúplex, la escisión también tiene lugar un nucleótido dentro del dúplex. Sin

embargo, cuando existe un hueco de cuatro o seis nucleótidos entre el extremo 3’ del cebador y el dúplex sustrato, el sitio de escisión se desplaza de cuatro a seis nucleótidos en la dirección 5’.

La Fig. 10 describe las cinéticas de escisión en presencia (Fig. 9A) o ausencia (Fig. 9B) de un oligonucleótido cebador. Las reacciones se realizaron a 55ºC con KCl 50 mM (Fig. 9A) o KCl 20 mM (Fig. 9B). Los productos de reacción se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se indican las longitudes de los

productos, en nucleótidos. “M”, que indica un marcador, es un oligonucleótido de 19 nucleótidos marcado en el extremo 5’. En estas condiciones de salinidad, las Figs. 9A y 9B indican que la reacción parece ser aproximadamente veinte veces más rápida en presencia de cebador que en ausencia de cebador. Este efecto sobre la eficacia se puede atribuir a alineamiento apropiado y estabilización de la enzima en el sustrato.

La influencia relativa de cebador sobre las velocidades de escisión es mucho mayor cuando ambas reacciones se realizan en KCl 50 mM. En presencia de cebador, la velocidad de escisión aumenta con la concentración de KCl, hasta a aproximadamente 50 mM. Sin embargo, la inhibición de esta reacción en presencia de cebador es evidente a 100 mM y es completa a KCl 150 mM. Por el contrario, en ausencia de cebador la velocidad mejora por la concentración de KCl hasta 20 mM, pero se reduce a concentraciones por encima de 30 mM. A KCl 50 mM, la reacción está prácticamente inhibida por completo. La inhibición de escisión por KCl en ausencia de cebador está afectada por la temperatura, siendo más pronunciada a temperaturas menores.

El reconocimiento del extremo 5’ del brazo a cortar parece ser una característica importante de reconocimiento de sustrato. El sustrato que carece de un extremo 5’ libre, tal como ADN de M13 circular, no se puede escindir en cualquier condición analizada. Incluso con sustratos que tienen brazos 5’ definidos, la velocidad de escisión por

DNAPTaq está influida por la longitud del brazo. En presencia de cebador y KCl 50 mM, la escisión de una extensión

5’ que tiene 27 nucleótidos de longitud está esencialmente completa en el intervalo de 2 minutos a 55ºC. Por el contrario, las escisiones de moléculas con brazos 5’ de 84 y 188 nucleótidos solamente está aproximadamente el 90% y el 40% completas después de 20 minutos. La incubación a temperaturas mayores disminuye los efectos inhibidores de extensiones largas indicando que la estructura secundaria en el brazo 5’ o una estructura termolábil en la enzima puede inhibir la reacción. Un experimento de mezcla, realizado en condiciones de exceso de sustrato, muestra que las moléculas con brazos largos no inmovilizan de forma preferente la enzima disponible en complejos

no productivos. Estos resultados pueden indicar que el dominio nucleasa 5’ obtiene acceso al sitio de escisión en el extremo del dúplex bifurcado moviendo hacia abajo el brazo 5’ desde un extremo al otro. Se esperaría que brazos 5’

más largo tuvieran estructuras secundarias más adventicias (particularmente cuando las concentraciones de KCl son altas), lo que probablemente impediría este movimiento.

La escisión no parece inhibirse por brazos 3’ largos de cualquiera de la molécula diana de cadena de sustrato ácido nucleico piloto, al menos hasta 2 kilobases. En el otro extremo, los brazos 3’ del ácido nucleico piloto tan cortos

como un nucleótido pueden soportar escisión en una reacción independiente de cebador, aunque de forma ineficaz. Los oligonucleótidos completamente emparejados no suscitan escisión de moldes de ADN durante la extensión por cebador.

La capacidad de DNAPTaq de escindir moléculas incluso cuando la cadena complementaria contiene solamente un nucleótido 3’ no emparejado puede ser útil para optimizar PCR específica de alelo. Los cebadores de PCR que tienen extremos 3’ no emparejados podrían actuar como oligonucleótidos piloto para dirigir la escisión selectiva de moldes indeseados durante la preincubación de potenciales complejos molde-cebador con DNAPTaq en ausencia de nucleósidos trifosfato.

B. Actividad 5’ Nucleasa de otras DNAP

Para determinar si otras nucleasas 5’ en otras DNAP serían adecuadas para la presente invención, se examinó una serie de enzimas, en la bibliografía se describió que varias de las ellas estaban libres de actividad nucleasa 5’ aparente. La capacidad de estas otras enzimas de escindir ácidos nucleicos de un modo específico de estructura se ensayó usando el sustrato de horquilla mostrado en la Fig. 5 en condiciones que se describieron que eran óptimas para síntesis por cada enzima.

Se obtuvieron DNAPEcl y DNAP Klenow de Promega Corporation; la DNAP de Pyrococcus furiosus (“Pfu”, Bargseid y col., Strategies 4: 34 [1991]) era de Strategene; la DNAP de Thermococcus litoralis (“Tli”, VentTM(exo-), Perler y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 5577 [1992]) era de New England Biolabs; la DNAP de Thermus flavus (“Tfl”, Kaledin y col., Biokhimiya 46: 1576 [1981]) era de Epicentre Technologies; y la DNAP de Thermus thermophilus

(“Tth”, Carballeira y col., Biotechniques 9: 276 [1990]; Myers y col., Biochem., 30: 7661 [1991]) era de U. S.

Biochemicals.

En este Ejemplo se ensayaron 0,5 unidades de cada ADN polimerasa en una reacción de 20 μl, usando los

tampones suministrados por los fabricantes para las reacciones dependientes de cebador o Tris·Cl 10 mM, pH 8,5, MgCl2 1,5 mM y KCl 20 mM. Las mezclas de reacción se mantuvieron a 72ºC antes de la adición de enzima.

La Fig. 10 es un autorradiograma que registra los resultados de estos ensayos. La Fig. 10A demuestra reacciones de endonucleasas de DNAP de varias bacterias termófilas. Las reacciones se incubaron a 55ºC durante 10 minutos en presencia de cebador o a 72ºC durante 30 minutos en ausencia de cebador y los productos se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se indican las longitudes de los productos, en nucleótidos.

La Fig. 10B demuestra escisión endonucleolítica por la nucleasa 5’ de DNAPEcl. Las reacciones de DNAPEcl y

DNAP Klenow se incubaron durante 5 minutos a 37ºC. Obsérvese la banda ligera de productos de escisión de 25 y 11 nucleótidos en los carriles de DNAPEcl (realizada en presencia y ausencia de cebador, respectivamente). La Fig. 8A también muestra reacciones de DNAPTaq en presencia (+) o ausencia (-) de cebador. Estas reacciones se realizaron en KCl 50 mM y 20 mM, respectivamente y se incubaron a 55ºC durante 10 minutos.

Con referencia a la Fig. 10A, las DNAP de las eubacterias Thermus thermophilus y Thermus flavus escinden el sustrato en el mismo sitio que DNAPTaq, tanto en presencia como ausencia de cebador. Por el contrario, las DNAP de las arqueobacterias Pyrococcus furiosus y Thermococcus litoralis son incapaces de escindir los sustratos endonucleolíticamente. Las DNAP de Pyrococcus furiosus y Thermococcus litoralis comparten poca homología de secuencia con enzimas de eubacterias (Ito y col., Nucl. Acids Res. 19:4045 (1991); Mathur y col., Nucl. Acids. Res. 19:6952 (1991); véase también Perler y col.). Con referencia a la Fig. 10B, la DNAPEcl también escinde el sustrato,

pero los productos de escisión resultantes son difíciles de detectar a menos que se inhiba la exonucleasa 3’. Las secuencias de aminoácidos de los dominios nucleasa 5’ de DNAPEcl y DNAPTaq tienen una homología de aproximadamente el 38% (Gelfand, anteriormente).

El dominio nucleasa 5’ de DNAPTaq también comparte aproximadamente el 19% de homología con la exonucleasa 5’ codificada por el gen 6 del bacteriófago T7 (Dunn y col., J. Mol. Biol. 166: 477 [1983]). Esta nucleasa, que no se une covalentemente a un dominio de polimerización de DNAP, también es capaz de escindir ADN

endonucleolíticamente, en un sitio similar o idéntico al sitio que se corta por las nucleasas 5’ que se han descrito

anteriormente, en ausencia de cebadores añadidos.

C. Transescisión

La capacidad de una nucleasa 5’ para ser dirigida para escindir de forma eficaz en cualquier secuencia específica se

demostró en el siguiente experimento. Un oligonucleótido parcialmente complementario denominado un

“oligonucleótido piloto” hibridó con secuencias en el punto deseado de escisión. La parte no complementaria del oligonucleótido piloto proporcionó una estructura análoga al brazo 3’ del molde (Véase la Fig. 6), mientras que la región 5’ de la cadena de sustrato se convirtió en el brazo 5’. Se proporcionó un cebador diseñando la región 3’ del piloto de tal forma que se plegaría sobre sí mismo creando una horquilla corta con un tetra-bucle de estabilización (Antao y col., Nucl. Acids Res. 19:5901 [1991). Se muestran dos oligonucleótidos piloto en la Fig. 11A. Los oligonucleótidos 19-12 (SEC ID Nº 18), 30-12 (SEC ID Nº 19) y 30-0 (SEC ID Nº 20) tienen 31, 42 ó 30 nucleótidos de longitud, respectivamente. Sin embargo, los oligonucleótidos 19-12 (SEC ID Nº 18) y 34-19 (SEC ID Nº 19) tienen solamente 19 y 30 nucleótidos, respectivamente, que son complementarios a diferentes secuencias en la hebra sustrato. Los oligonucleótidos pilotos se calculan para separarse por fusión de sus complementos a aproximadamente 50ºC (19-12) y a aproximadamente 75ºC (30-12). Ambos pilotos tienen 12 nucleótidos en sus

extremos 3’, que actúan como brazos 3’ con cebadores con emparejamientos de bases unidos.

Para demostrar que la escisión se podría dirigir por un oligonucleótido piloto, se incubó un ADN diana de hélice única con DNAPTaq en presencia de dos oligonucleótidos piloto potenciales. Las reacciones de transescisión, donde los ácidos nucleicos diana y piloto están unidos no covalentemente, incluyen 0,01 pmol de ADN sustrato marcado en

extremo único, 1 unidad de DNAPTaq y 5 pmol de oligonucleótido piloto en un volumen de 20 μl de los mismos

tampones. Estos componentes se combinaron durante un minuto de incubación a 95ºC para desnaturalizar el ADN sustrato de doble hélice generado por PCR y las temperaturas de las reacciones se redujeron después hasta sus temperaturas de incubación finales. Los oligonucleótidos 30-12 y 19-12 pueden hibridar con regiones de los ADN sustrato que están a 85 y 27 nucleótidos del extremo 5’ de la cadena dirigida.

La Fig. 19 muestra la secuencia completa del oligómero de 206 unidades (SEC ID Nº 27). El oligómero de 206 unidades se generó por PCR. El cebador de secuenciación (-48) inverso de oligómero de 24 unidades de M13/pUC y el cebador de secuenciación (-47) de M13/pUC de NEB (nº de catálogo 1233 y 1224, respectivamente) se usaron (50 pmol cada uno) con el vector plasmídico pGEM3z(f+) (Promega) como molde (10 ng) que contiene las secuencias diana. Las condiciones para PCR fueron las siguientes: 50 μM de cada dNTP y 2,5 unidades de ADN polimerasa de Taq en 100 μl de Tris-Cl 20 mM, pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM con Tween-20 al 0,05% y NP-40 al 0,05%. Las reacciones se ciclaron 35 veces a lo largo de 95ºC durante 45 segundos, 63ºC durante 45 segundos, después 72ºC durante 75 segundos. Después del ciclado, las reacciones se finalizaron con una incubación a 72ºC durante 5 minutos. El fragmento resultante se purificó por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 6%

(29:1 reticulación) en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM, se visualizó por tinción con bromuro de etidio o autorradiografía, se escindió del gel, se eluyó por difusión pasiva y se concentró por precipitación con etanol.

La escisión del ADN sustrato tuvo lugar en presencia del oligonucleótido piloto 19-12 a 50ºC (Fig. 11B, carriles 1 y 7) pero no a 75ºC (carriles 4 y 10). En presencia del oligonucleótido 30-12 se observó escisión a ambas temperaturas. No tuvo lugar escisión en ausencia de oligonucleótidos añadidos (carriles 3, 6 y 12) o aproximadamente a 80ºC incluso aunque a 50ºC, estructuras adventicias en el sustrato permitieron escisión independiente de cebador en ausencia de KCl (Fig. 11B, carril 9). Un oligonucleótido no específico sin complementariedad con el ADN sustrato no dirigió escisión a 50ºC, ni en ausencia ni en presencia de KCl 50 mM (carriles 13 y 14). Por tanto, la especificidad de las reacciones de escisión se puede controlar por el alcance de la complementariedad con el sustrato y por las condiciones de incubación.

D. Escisión De ARN

Una versión de ARN acortada de la secuencia usada en los experimentos de transescisión que se han discutido anteriormente se ensayó para su capacidad de servir como un sustrato en la reacción. El ARN se escinde en el sitio esperado, en una reacción que depende de la presencia del oligonucleótido piloto. El sustrato de ARN, preparado por ARN polimerasa de T7 en presencia de [ -32P]UTP, se corresponde a una versión truncada del sustrato de ADN usado en la Fig. 11B. Las condiciones de reacción eran similares a las usadas para los sustratos de ADN que se han descrito anteriormente, con KCl 50 mM; la incubación fue durante 40 minutos durante a 55ºC. El oligonucleótido piloto usado se denomina 30-0 (SEC ID Nº 20) y se muestra en la Fig. 12A.

Los resultados de la reacción de escisión se muestran en la Fig. 13B. La reacción se realizó en presencia o en ausencia de DNAPTaq u oligonucleótido piloto como se indica en la Fig. 12B.

Sorprendentemente, en el caso de escisión de ARN no se requiere un brazo 3’ para el oligonucleótido piloto. Es muy improbable que esta escisión se deba a RNasaH que se ha descrito previamente, que se esperaría que cortara el ARN en varios sitios a lo largo del dúplex de ARN-ADN de 30 pares de bases de longitud. La nucleasa 5’ de DNAPTaq es RNasaH con especificidad de estructura que escinde el ARN en un único sitio cerca del extremo 5’ de

la región en heterodúplex.

Es sorprendente que un oligonucleótido que carece de un brazo 3’ sea capaz de actuar como un piloto para dirigir la escisión eficaz de una diana de ARN debido a que tales oligonucleótidos son incapaces de dirigir la escisión eficaz de dianas de ADN usando DNAP nativas. Sin embargo, algunas nucleasas 5’ (por ejemplo, los clones E, F y G de la Fig. 4) pueden escindir ADN en ausencia de un brazo 3’. En otras palabras, no se requiere ninguna estructura de escisión no extensible para escisión específica con algunas nucleasas 5’ de la presente invención obtenidas de ADN

polimerasas termoestables.

Se ensayó si la escisión de un molde de ARN por DNAPTaq en presencia de un cebador completamente complementario podría ayudar a explicar por qué la DNAPTaq es incapaz de extender un oligonucleótido de ADN en un molde de ARN, en una reacción que se parece a la de la transcriptasa inversa. Otra DNAP termófila, DNAPTth, es capaz de usar ARN como un molde, pero solamente en presencia de Mn++, de tal forma que se predijo que esta enzima no escindiría a ARN en presencia de este catión. En consecuencia, se incubó una molécula de ARN con un oligonucleótido piloto apropiado en presencia de DNAPTaq o DNAPTth, en un tampón que contenía Mg++ o Mn++. Como se espera, ambas enzimas escindieron el ARN en presencia de Mg++. Sin embargo, DNAPTaq, pero no

DNAPTth, degradó el ARN en presencia de Mn++. Se concluyó que las actividades nucleasa 5’ de muchas DNAP

pueden contribuir a su incapacidad de usar ARN como moldes.

EJEMPLO 2 - Referencia

Generación de Nucleasas 5’ obtenidas de ADN polimerasas termoestables

Se generaron ADN polimerasas termoestables que tenían actividad sintética reducida, una actividad que es una reacción secundaria indeseable durante escisión de ADN en el ensayo de detección de la invención, aunque tiene actividad nucleasa termoestable mantenida. El resultado es una polimerasa termoestable que escinde ADN de ácido nucleico con especificidad extrema.

Las ADN polimerasas de Tipo A de eubacterias del género Thermus comparten identidad de secuencia de proteína amplia (el 90% en el dominio de polimerización, usando el procedimiento de Lipman-Pearson en el software de análisis de ADN de DNAStar, WI) y se comportan de forma similar, tanto en ensayos de polimerización como de nucleasa. Por lo tanto, se usaron los genes para la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (DNAPTaq) y Thermus flavus (DNAPTf1) como representantes de esta clase. Los genes de polimerasa de otros organismos eubacterianos, tales como Thermus thermophilus, Thermus sp., Thermotoga maritima, Thermosipho africanus y Bacillus stearothermophilus también son igualmente adecuados. Las ADN polimerasas de estos organismos termófilos son capaces de sobrevivir y funcionar a temperaturas elevadas y, por tanto, se pueden usar en reacciones en las que se usa la temperatura como una selección contra hibridación no específica de cadenas de ácido nucleico.

Los sitios de restricción usados para mutagénesis por deleción, descritos más adelante, se seleccionaron por conveniencia. Diferentes sitios situados con conveniencia similar están disponibles en el gen de Thermus thermophilus y se pueden usar para preparar construcciones similares con otros genes de polimerasa de Tipo A de organismos relacionados.

A. Creación de construcciones de nucleasa 5’

1. Genes de DNAPTaq modificados

La primera etapa fue poner un gen modificado para la ADN polimerasa de Taq en un plásmido bajo el control de un promotor inducible. El gen de polimerasa de Taq modificado se aisló del siguiente modo:: el gen de ADN polimerasa de Taq se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN genómico de Thermus aquaticus, cepa YT-1 (Lawyer y col., anteriormente), usando como cebadores los oligonucleótidos descrito en las SEC ID Nº 13-14. El fragmento resultante de ADN tiene una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción EcoRI en el extremo 5’ de la secuencia codificante y una secuencia BgIII en el extremo 3’. La escisión con BgIII deja un saliente 5’ o “extremo adhesivo” que es compatible con el extremo generado por BamHI. El ADN amplificado por PCR se digirió con EcoRI y BamHI. El fragmento de 2512 pb que contenía la región codificante para el gen de polimerasa se purificó en gel y después se ligó en un plásmido que contiene un promotor inducible.

En una realización de la invención, se usó el vector pTTQ18, que contiene el promotor trp-lac (tac) híbrido [M. J. R. Stark, Gene 5: 255 (1987)] y se muestra en la Fig. 13. El promotor tac está bajo el control del represor lac de E. coli. La represión permite que la síntesis del producto génico se suprima hasta que se haya conseguido el nivel deseado de desarrollo bacteriano, punto en el que se elimina la represión por adición de un inductor específico, isopropil--Dtiogalactopiranósido (IPTG). Un sistema de este tipo permite la expresión de proteínas extrañas que pueden ralentizar o evitar el crecimiento de transformantes.

Los promotores bacterianos, tales como tac, pueden no suprimirse de forma adecuada cuando están presentes en un plásmido de múltiples copias. Si una proteína altamente tóxica se pone bajo el control de un promotor de este tipo, la pequeña cantidad de expresión que se produce puede ser dañina para las bacterias. En otra realización de la invención se usó otra opción para reprimir la síntesis de un producto génico clonado. Se usó el promotor no bacteriano, del bacteriófago T7, encontrado en el vector plasmídico serie pET-3 para expresar los genes de polimerasa de Taq mutantes clonados [Fig. 15; Studier y Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986)]. Este promotor inicia la transcripción solamente por ARN polimerasa de T7- En una cepa adecuada, tal como BL21(DE3)pLYS, el gen para esta ARN polimerasa se lleva en el genoma bacteriano bajo el control de un operador lac. Esta disposición tiene la ventaja de que la expresión del gen de múltiples copias (en el plásmido) es completamente dependiente de la expresión de ARN polimerasa de T7, que se suprime de forma sencilla debido a que está presente en una única copia.

Para la ligación en el vector pTTQ18 (Fig. 13), el ADN de producto de PCR que contiene la región codificante de polimerasa de Taq (mutTaq, clon 4B, SEC ID Nº 21) se digirió con EcoRI y BgIII y este fragmento se ligó en

condiciones de “extremo adhesivo” convencionales [Sambrook y col. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp. 1.63-1.69 [1989]) en los sitios EcoRI y BamHI del vector plasmídico pTTQ18. La expresión de esta construcción proporciona un producto de fusión de traducción en el que los primeros dos restos de la proteína nativa (Met-Arg) se sustituyen por tres del vector (Met-Asn-Ser), pero el resto de la proteína natural no cambiaría. La construcción se introdujo por transformación en la cepa JM109 de E. coli y los transformantes se sembraron en condiciones de represión de forma incompleta que no permiten el desarrollo de bacterias que expresan la proteína nativa. Estas condiciones de sembrado permiten el aislamiento de genes que contienen mutaciones pre-existentes, tales como las que se producen por la infidelidad de polimerasa de Taq durante el procedimiento de amplificación

Usando este protocolo de amplificación/selección, se aisló un clon (ilustrado en la Fig. 3B) que contenía un gen de polimerasa de Taq mutado (mutTaq, clon 3B). El mutante se detectó en primer lugar por su fenotipo, en el que la

actividad nucleasa 5’ estable a temperatura en un extracto celular en bruto era normal, pero la actividad de

polimerización estaba prácticamente ausente (aproximadamente menos del 1% de actividad de polimerasa de Taq de tipo silvestre).

El análisis de secuencia de ADN del gen recombinante mostró que tenía cambios en el dominio polimerasa dando como resultado dos sustituciones de aminoácidos: u un cambio de A a G en la posición del nucleótido 1394 provoca un cambio de Glu a Gly en la posición de aminoácido 465 (numerada de acuerdo con las secuencias naturales de ácido nucleico y aminoácidos, SEC ID Nº: 1 y 4) y otro cambio de A a G en la posición de nucleótido 2260 provoca un cambio de Gln a Arg en la posición de aminoácido 754. Debido a que la mutación de Gln a Gly es en una posición no conservada y debido a que la mutación de Glu a Arg altera un aminoácido que está conservado en prácticamente todas las polimerasas de Tipo A conocidas, esta última mutación es más probablemente la responsable de restringir la actividad de síntesis de esta proteína. La secuencia de nucleótidos para la construcción de la Fig. 3B se proporciona en la SEC ID Nº: 21. La enzima codificada por esta secuencia se denomina Cleavase® A/G.

Se prepararon derivados posteriores de construcciones de DNAPTaq a partir del gen mutTaq, por tanto, todas llevan estas sustituciones de aminoácidos además de sus otras alteraciones, a menos que estas regiones particulares se hayan delecionado. Estos sitios mutados se indican por casillas negras en estas ubicaciones en los diagramas en la

Fig. 3. En la Fig. 3, la denominación “Exo 3’” se usa para indicar la localización de la actividad exonucleasa 3’

asociada polimerasas de Tipo A que no está presente en DNAPTaq. Todas las construcciones excepto los genes mostrados en las Figs. 3E, F y G se realizaron en el vector pTTQ18.

El vector de clonación usado para los genes en las Figs. 3E y F era de la serie pET-3 disponible en el mercado que se ha descrito anteriormente. Aunque esta serie de vector tiene solamente un sitio BamHI para clonación cadena abajo del promotor de T7, la serie contiene variantes que permiten la clonación en cualquiera de las tres fases de lectura. Para la clonación del producto de PCR que se ha descrito anteriormente, se usó la variante denominada pET-3c (Fig. 14). El vector se digirió con BamHI, se desfosforiló con fosfatasa intestinal de ternero y los extremos adhesivos se introdujeron usando el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP. El gen para la DNAP de Taq mutante mostrado en la Fig. 3B (mutTaq, clon 3B) se liberó de pTTQ18 por digestión con EcoRI y SaII y los “extremos adhesivos” se introdujeron como se realizó con el vector. El fragmento se ligó al vector en condiciones de extremos

romos convencionales (Sambrook y col., Molecular Cloning, anteriormente), la construcción se introdujo por transformación en la cepa BL21(DE3)pLYS de E. coli y se exploraron los aislados para identificar los que se ligaron con el gen en la orientación apropiada con respecto al promotor. Esta construcción proporciona otro producto de fusión de traducción, en el que los dos primeros aminoácidos de DNAPTaq (Met-Arg) se sustituyen por 13 del vector más dos del cebador de PCR (Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly-Arg-Ile-Asn-Ser) (SEC ID Nº 24).

En estos experimentos, el objetivo era generar enzimas que carecen de la capacidad de sintetizar ADN, pero que

conservan la capacidad de escindir ácidos nucleicos con una actividad nucleasa 5’. El acto de síntesis cebada, con

molde de ADN es de hecho una serie de acontecimientos coordinados, de tal forma que es posible inutilizar la síntesis de ADN alterando un acontecimiento mientras no se afecte a los demás. Estas etapas incluyen, pero sin limitación, reconocimiento y unión de cebador, unión de dNTP y catálisis del enlace fosfodiéster inter-nucleotídico. Algunos de los aminoácidos en el dominio de polimerización de DNAPEcl se han ligado a estas funciones, pero los mecanismos precisos todavía están mal definidos.

Un modo de destruir la capacidad de polimerización de una ADN polimerasa es delecionar todo o parte del segmento génico que codifica ese dominio para la proteína o convertir de otro modo el gen de incapaz de preparar un dominio de polimerización completo. Las enzimas mutantes individuales pueden diferir entre sí en estabilidad y

solubilidad tanto dentro como fuera de células. Por ejemplo, en comparación con el dominio nucleasa 5’ de

DNAPEcl, que se puede liberar en una forma activa del dominio de polimerización por proteólisis cuidadosa (Setlow y Kornberg, J. Biol. Chem., 247: 232 [1972]), el dominio nucleasa de Thermus, cuando se trata de forma similar, se convierte en menos soluble y a menudo se pierde la actividad de escisión.

Usando el gen mutante mostrado en la Fig. 3B como material de partida, se crearon varias construcciones de deleción. Todas las tecnologías de clonación eran convencionales (Sambrook y col., anteriormente) y se resumen brevemente del siguiente modo:

Fig. 3C: La construcción mutTaq se digirió con PstI, que corta una vez dentro de la región codificante de polimerasa, como se indica y corta inmediatamente cadena abajo del gen en el sitio de clonación múltiple del vector. Después de la liberación del fragmento entre estos dos sitios, el vector se re-ligó, creando una deleción de 894 nucleótidos y llevando a fase un codón de terminación 40 nucleótidos cadena debajo de la unión. La

secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 4C) se proporciona en la SEC ID Nº 9.

Fig. 3D: La construcción mutTaq se digirió con NheI, que corta una vez en el gen en la posición 2047. Los

extremos salientes 5’ de cuatro nucleótidos resultantes se introdujeron, como se ha descrito anteriormente y los

extremos romos se volvieron a ligar. La inserción resultante de cuatro nucleótidos cambia la fase de lectura y provoca la terminación de traducción diez aminoácidos cadena debajo de la mutación. La secuencia de

nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 3D) se proporciona en la SEC ID Nº 10.

Fig. 3E: Todo el gen mutTaq se cortó de pTTQ18 usando EcoRI y SalI y se clonó en pET-3c, como se ha descrito anteriormente. Este clon se digirió con BstXI y XcmI, en sitios únicos que se sitúan como se muestra en la Fig. 3E. El ADN se trató con el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP, que dio como resultado que los salientes 3’ de ambos sitios se cortaran hasta extremos romos. Estos extremos romos se ligaron entre sí, dando como resultado una deleción fuera de fase de 1540 nucleótidos. Un codón de terminación en fase tiene lugar 18 tripletes más allá del sitio de unión. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 3E) se da en la SEC ID Nº 11, dando la secuencia líder apropiada en la SEC ID Nº 25. También se denomina Cleavase® BX.

Fig. 3F: Todo el gen mutTaq se cortó de pTTQ18 usando EcoRI y SalI y se clonó en pET-3c, como se ha descrito anteriormente. Este clon se digirió con BstXI y BamHI, en sitios únicos que se sitúan como se muestra en el diagrama. El ADN se trató con el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP, que dio como resultado que el saliente

3’ del sitio BstXI se cortara hasta un extremo romo, mientras que se introdujo el saliente 5’ del sitio BamHI para

preparar un extremo romo.. Estos extremos se ligaron entre sí, dando como resultado una deleción en fase de 903 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 3F) se da en la SEC ID Nº 12. También se denomina Cleavase® BB.

Fig. 3G: Esta polimerasa es una variante de la mostrada en la Fig. 4E.. Se clonó en el vector plasmídico pET-21 (Novagen). El promotor no bacteriano del bacteriófago T7, observado en este vector, inicia la transcripción solamente por ARN polimerasa de T7. Véase Studier y Moffatt, anteriormente. En una cepa adecuada, tal como (DES)pLYS, el gen para esta ARN polimerasa se lleva en el genoma bacteriano bajo el control del operador lac. Esta disposición tiene la ventaja de que la expresión del gen de múltiples copias (en el plásmido) es completamente dependiente de la expresión de ARN polimerasa de T7, que se suprime de forma sencilla debido a que está presente en una única copia. Debido a que la expresión de estos genes mutantes está bajo este promotor controlado de forma estrecha, los problemas potenciales de toxicidad de las proteínas expresadas para las células huésped son un motivo menor de preocupación.

El vector pET-21 también lleva un “Marcador*His”, una extensión de seis restos de histidina consecutivos que se añaden al extremo carboxi de las proteínas expresadas. Las proteínas resultantes se pueden purificar después en una única etapa por cromatografía con quelación de metales, usando una resina de columna disponible en el mercado (Novagen) con iones Ni++ inmovilizados. Las columnas de 2,5 ml son reutilizables y pueden unir hasta 20 mg de la proteína diana en condiciones nativas o desnaturalizantes (guanidina*HCl o urea).

Las células de E. coli (DES)pLYS se transforman con las construcciones que se han descrito anteriormente usando técnicas de transformación convencionales y se usan para inocular un medio de cultivo convencional (por ejemplo, caldo Luria-Bertani). La producción de ARN polimerasa de T7 se induce durante el crecimiento de fase logarítmica por adición de IPTG y se incuba durante 12 a 17 horas adicionales. Se retiran alícuotas de cultivo tanto antes como después de la inducción y las proteínas se examinan por SDS-PAGE. La tinción con Azul de Coomassie permite la visualización de las proteínas extrañas si representan aproximadamente el 3-5% de la proteína celular y no comigran con ninguna de las bandas de proteínas principales. Las proteínas que co-migran con la proteína de huésped principal se tienen que expresar como más del 10% de la proteína total a observar en esta etapa de análisis.

Algunas proteínas mutantes se secuestran por las células en cuerpos de inclusión. Estos son gránulos que se forman en el citoplasma cuando se preparan las bacterias para expresar niveles altos de una proteína extraña y se pueden purificar a partir de un lisado en bruto y analizar por SDS-PAGE para determinar su contenido de proteína. Si la proteína clonada se observa en los cuerpos de inclusión, se tiene que liberar para ensayar las actividades de escisión y polimerasa. Diferentes procedimientos de solubilización pueden ser apropiados para diferentes proteínas y se conocen diversos procedimientos. (Véase, por ejemplo, Builder & Ogez, Patente de Estados Unidos Nº

4.511.502 (1985); Olson, Patente de Estados Unidos Nº 4.518.526 (1985); Olson & Pai, Patente de Estados Unidos Nº 4.511.503 (1985); Jones y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.512.922 (1985)).

Después, la proteína solubilizada se purifica en la columna Ni++ como se ha descrito anteriormente, siguiendo las instrucciones del fabricante (Novagen). Las proteínas lavadas se eluyen de la columna mediante una combinación de competidor de imidazol (1 M) y alto contenido en sal (NaCl 0,5 M) y se dializan para cambiar el tampón y para permitir que las proteínas desnaturalizadas se replieguen. Las recuperaciones típicas dan como resultado

aproximadamente 20 μg de proteína específica por ml de cultivo de partida. El mutante de DNAP se denomina la

nucleasa CLEAVASE BN y la secuencia se da en la SEC ID Nº 26 (la secuencia de aminoácidos de la nucleasa CLEAVASE BN se obtiene traduciendo la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 26).

2. Gen de DNATfl Modificada

El gen de ADN polimerasa de Thermus flavus se aisló de la cepa de “T. flavus” AT-62 obtenida de la ATCC (ATCC 33923). Esta cepa tiene un mapa de restricción diferente de lo que tiene la cepa T. flavus usada para generar la secuencia publicada por Akhmetzjanov y Vakhitov, anteriormente. La secuencia publicada se indica como la SEC ID Nº 2. No se han publicado datos de secuencia para el gen de ADN polimerasa de la cepa AT-62 de T. flavus.

Se amplificó ADN genómico de T. flavus usando los mismos cebadores usados para amplificar el gen de ADN polimerasa de T. aquaticus (SEC ID Nº 13-14). El fragmento de PCR de aproximadamente 2.500 pares de bases se digirió con EcoRI y BamHI. Los extremos salientes se hicieron romos con el fragmento Klenow de DNAPEc1 y dNTP. El fragmento de aproximadamente 1800 pares de bases resultante que contenía la región codificante para el extremo N se ligó en pET-3c, como se ha descrito anteriormente. Esta construcción, clon 4B, se ilustra en la Fig. 4B. El gen de ADN polimerasa de T. flavus de tipo silvestre se ilustra en la Fig. 4A. El clon 4B tiene los mismos aminoácidos líderes que los clones de DNAPTaq 4E y F que se clonaron en pET-3c; no se conoce de forma precisa dónde tiene lugar la terminación de la traducción, pero el vector tiene una fuerte señal de terminación de la transcripción inmediatamente cadena abajo del sitio de clonación.

B. Crecimiento e inducción de células transformadas

Las células bacterianas se transformaron con las construcciones que se han descrito anteriormente usando técnicas de transformación convencionales y se usan para inocular 2 ml de un medio de cultivo convencional (por ejemplo, caldo Luria-Bertani). Los cultivos resultantes se incubaron de forma apropiada para la cepa particular usada y se indujeron si se requería un sistema de expresión concreto. Para todas las construcciones representadas en las Figs. 3 y 4, los cultivos se desarrollaron hasta una densidad óptica (a 600 nm de longitud de onda) DO de 0,5.

Para inducir expresión de los genes clonados, los cultivos se llevaron hasta una concentración final de IPTG 0,4mM y las incubaciones se continuaron durante 12 a 17 horas. Después, se extrajeron alícuotas de 50 μl de cada cultivo tanto antes como después de la inducción y se combinaron con 20 μl de un tampón de carga de gel convencional

para electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE). La tinción posterior con azul de Coomassie (Sambrook et al., anteriormente) permite la visualización de las proteínas extrañas si representan aproximadamente el 3-5% de la proteína celular y no co-migran con ninguna de las bandas de proteínas principales de E. coli. Las proteínas que sí co-migran con la proteína de huésped principal se tienen que expresar como más del 10% de la proteína total a observar en esta etapa de análisis.

C. Lisis por calor y fraccionamiento

Se aislaron proteínas termoestables expresadas, es decir, las nucleasas 5’, calentando extractos de células bacterianas en bruto para provocar desnaturalización y precipitación de las proteínas de E. coli menos estables. Después, las proteínas de E. coli precipitadas se eliminaron por centrifugación junto con otros restos celulares. A continuación, 1,7 ml del cultivo se sedimentaron por microcentrifugación a 12.000 a 14.000 rpm durante 30 a 60 segundos. Después de la retirada del sobrenadante, las células se resuspendieron en 400 μl de tampón A ((Tris-HCl 50 mM, pH 7,9, dextrosa 50 mM, EDTA 1 mM), se re-centrifugaron, después se resuspendieron en 80 μl de tampón A con 4 mg/ml de lisozima. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se combinaron con 80 μl de tampón B (Tris-HCl 10 mM, pH 7,9, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, Tween-20 al 0,5%, Nonidet-P40 al 0,5%).

Esta mezcla se incubó a 75ºC durante 1 hora para desnaturalizar y precipitar las proteínas del huésped. Este extracto celular se centrifugó a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo.

Una alícuota de 0,5 a 1 μl de este sobrenadante se usó directamente en cada reacción de ensayo y se determinó el contenido de proteína del extracto sometiendo 7 μl a análisis electroforético, como anteriormente. La ADN polimerasa de Taq recombinante nativa [Englke, Anal. Biochem.,191:396 [1990]), y la proteína de mutación puntual doble mostrada en la Fig. 3B son tanto solubles como activas en este punto.

La proteína extraña puede no detectarse después de los tratamientos con calor debido al secuestro de la proteína extraña por células en cuerpos de inclusión. Estos son gránulos que se forman en el citoplasma cuando se preparan las bacterias para expresar niveles altos de una proteína extraña y se pueden purificar a partir de un lisado en bruto y analizar por SDS-PAGE para determinar su contenido de proteína. En la bibliografía se han descrito muchos procedimientos y a continuación se describe una estrategia.

D. Aislamiento y solubilización de cuerpos de inclusión

Un cultivo pequeño se desarrolló e indujo como se ha descrito anteriormente. Una alícuota de 1,7 ml se sedimentó por centrifugación breve y las células bacterianas se resuspendieron en 100 μl de tampón de Lisis (Tris -HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM). A continuación se añadieron 2,5 l de PMSF 20 mM hasta una concentración final de 0,5 mM y se añadió lisozima hasta una concentración de 1,0 mg/ml. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadió ácido desoxicólico hasta un 1 mg/ml (1 l de 10 mg/ml de solución) y la mezcla se incubó adicionalmente a 37ºC durante aproximadamente 15 minutos o hasta que fue viscosa. Se añadió

ADNasa I hasta 10 μg/ml y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos o

hasta que no fuera viscosa.

De esta mezcla se recogieron los cuerpos de inclusión por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC y

se desechó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 100 μl de tampón de lisis con EDTA 10 mM (pH 8,0) y

Triton X-100 al 0,5%. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, los cuerpos de inclusión se sedimentaron como anteriormente y se almacenó el sobrenadante para análisis posterior. Los cuerpos de inclusión se

resuspendieron en 50 μl de agua destilada y se combinaron 5 μl con tampón de carga de gel SDS (que disuelve los

cuerpos de inclusión) y se analizaron electroforéticamente, junto con una alícuota del sobrenadante.

Si se encuentra la proteína clonada en los cuerpos de inclusión, se puede liberar para ensayar las actividades de escisión y polimerasa y el procedimiento de solubilización tiene que ser compatible con la actividad concreta. Diferentes procedimientos de solubilización pueden ser apropiados para diferentes proteínas y se discute una diversidad de procedimientos en Molecular Cloning (Sambrook y col., anteriormente). Lo siguiente es una adaptación que se usó para varios de los aislamientos usados en el desarrollo de la presente invención.

Veinte μl de la suspensión de cuerpo de inclusión-agua se sedimentaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente y se desechó el sobrenadante. Para lavar adicionalmente los cuerpos de inclusión, el sedimento se resuspendió en 20 μl de tampón de lisis con urea 2 M y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Los cuerpos de inclusión lavados se resuspendieron después en 2 μl de tampón de lisis con urea 8 M; la

solución se aclaró visiblemente cuando se disolvieron los cuerpos de inclusión. Los restos no disueltos se eliminaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante del extracto se transfirió a un tubo nuevo.

Para disminuir la concentración de urea, el extracto se diluyó en KH2PO4. Se preparó un tubo nuevo que contenía 180 μl de KH2PO4 50 mM, pH 9,5, EDTA 1 mM y NaCl 50 mM. Se añadió una alícuota de 2 μl del extracto y se agitó vorticialmente brevemente para la mezcla. Esta etapa se repitió hasta que se hubiera añadido todo el extracto durante un total de 10 adiciones. Se dejó que la mezcla reposara a temperatura ambiente durante 15 minutos, tiempo durante el cual a menudo se forma algo de precipitado. Los precipitados se eliminaron por centrifugación a

14.000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. A los 200 μl de proteína en la solución de KH2PO4 se añadieron 140-200 μl de (NH4)2SO4 saturado, de tal forma que la mezcla resultante era (NH4)2SO4 de aproximadamente el 41% al 50% de saturación. La mezcla se enfrió en hielo durante 30 minutos para permitir que precipitara la proteína y después se recogió la proteína por centrifugación a 14.000 rpm, durante 4 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó y el sedimento se disolvió en 20 μl de Tampón C (HEPES 20 mM, pH 7,9, EDTA 1 mM, PMSF al 0,5%, KCl 25 mM y el 0,5% de cada uno de Tween-20 y Nonidet P 40). La solución de proteína se volvió a centrifugar durante 4 minutos para sedimentar materiales insolubles y se pasó el sobrenadante a un tubo nuevo. Los contenidos de proteína de los extractos preparados de este modo se visualizaron separando 1-4 μl por SDS-PAGE; de 0,5 a 1 μl de extracto se ensayaron en los ensayos de escisión y polimerización como se describe.

E. Análisis de proteínas para presencia de actividad nucleasa y sintética

Las nucleasas 5’ que se han descrito anteriormente y que se muestran en las Figs. 3 y 4 analizaron mediante los

procedimientos siguientes.

1. Ensayo de nucleasa específica de estructura

Una polimerasa modificada candidata se ensaya para actividad nucleasa 5’ examinando su capacidad de catalizar escisiones con especificidad de estructura. Con la expresión “estructura de escisión” como se usa en este

documento se quiere decir una estructura de ácido nucleico que es un sustrato para escisión por la actividad

nucleasa 5’ de una DNAP.

La polimerasa se expone a complejos de ensayo que tienen las estructuras mostradas en la Fig. 15. El ensayo para actividad nucleasa 5’ implica tres reacciones: 1) una escisión dirigida por cebador (Fig. 15B) se realiza debido a que es relativamente insensible a variaciones en la concentración de sal de la reacción y, por lo tanto, se puede realizar en cualquier condición de soluto que requiera la enzima modificada para la actividad; esto generalmente son las mismas condiciones preferidas por polimerasas no modificadas; 2) una escisión dirigida por cebador similar se realiza en un tampón que permite escisión independiente de cebador, es decir, un tampón de bajo contenido en sal, para demostrar que la enzima es viable en estas condiciones; y 3) una escisión independiente de cebador (Fig. 15A) se realiza en el mismo tampón bajo en sales.

El dúplex bifurcado se forma entre una cadena sustrato y una cadena molde como se muestra en la Fig. 15. Con la

expresión “cadena sustrato” como se usa en este documento, se quiere decir la cadena de ácido nucleico en la que tiene lugar la escisión mediada por la actividad nucleasa 5’. La cadena sustrato se ilustra siempre como la cadena superior en el complejo bifurcado que sirve como un sustrato para la escisión de nucleasa 5’ (Fig. 15). Con la expresión “cadena molde” como se usa en el presente documento se quiere decir la cadena de ácido nucleico que

es al menos parcialmente complementaria a la cadena sustrato y que hibrida con la cadena sustrato para formar la estructura de escisión. La cadena molde se ilustra siempre como la cadena inferior de la estructura de escisión bifurcada (Fig. 15). Si se añade un cebador (un oligonucleótido corto de 19 a 30 nucleótidos de longitud) al complejo,

como cuando se tiene que ensayar escisión dependiente de cebador, se diseña para hibridar con el brazo 3’ de la

cadena molde (Fig. 15B). Un cebador de este tipo se extendería a lo largo de la cadena molde si la polimerasa usada en la reacción tiene actividad sintética.

La estructura de escisión se puede preparar como una molécula de horquilla única, con el extremo 3’ de la diana y el extremo 5’ del piloto unidos como un bucle como se muestra en la Fig. 15E. También se requiere un oligonucleótido cebador complementario al brazo 3’ para estos ensayos de tal forma que se pueda ensayar la sensibilidad de la

enzima a la presencia de un cebador.

Los ácidos nucleicos a usar para formar estructuras de escisión de ensayo se pueden sintetizar químicamente o se pueden generar por técnicas de ADN recombinante convencionales. Mediante el último procedimiento, se puede crear la parte de horquilla de la molécula insertando en un vector de clonación copias por duplicado de un segmento corto de ADN, adyacentes entre sí pero en orientación opuesta. El fragmento bicatenario que incluye esta repetición invertida y que incluye suficientes secuencias flanqueantes para dar brazos cortos (de aproximadamente 20 nucleótidos) 5’ y 3’ no emparejados se puede liberar después por el vector por digestión con enzima de restricción o mediante PCR realizada con una enzima que carezca de una exonucleasa 5’ (por ejemplo, el fragmento Stoffel de

ADN polimerasa de AMPLITAQ, ADN polimerasa de VentTM).

El ADN de ensayo se puede marcar en cada extremo, o internamente, con un radioisótopo o con un marcador no isotópico. Cuando el ADN de horquilla es una hélice única sintética o una doble hélice clonada, el ADN se calienta antes del uso para fundir todos los dúplex. Cuando se enfría en hielo se forma la estructura ilustrada en la Fig. 16E y es estable durante tiempo suficiente para realizar estos ensayos.

Para analizar la escisión dirigida por cebador (Reacción 1), una cantidad detectable de la molécula de ensayo (típicamente 1-100 fmol de molécula de horquilla marcada con 32P) y un exceso molar de 10 a 100 veces de cebador se ponen en un tampón que se conoce que es compatible con la enzima de ensayo. Para la Reacción 2, cuando se realiza escisión dirigida por cebador en una condición que permite escisión independiente de cebador, se ponen las mismas cantidades de molécula en una solución que es igual que el tampón usado en la Reacción 1 con respecto a pH, estabilizantes de enzima (por ejemplo, albúmina sérica bovina, detergentes no iónicos, gelatina) y agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol) pero que sustituye cualquier sal de catión monovalente con KCl 20 mM; KCl 20 mM es el óptimo demostrado para escisión independiente de cebador. Los tampones para enzimas, tales como DNAPEc1, que funcionan habitualmente en ausencia de sal, no se suplementan para conseguir esta concentración. Para ensayar para escisión independiente de cebador (Reacción 3) se combina la misma cantidad de la molécula de ensayo, pero no de cebador, en las mismas condiciones de tampón usadas para la Reacción 2.

Las tres reacciones de ensayo se exponen después a suficiente cantidad de la enzima para que la proporción molar de enzima a complejo de ensayo sea aproximadamente 1:1. Las reacciones se incuban a un diversidad de temperaturas hasta, pero no superior a, la temperatura permitida por la estabilidad de enzima o la estabilidad de complejo, lo que sea menor, hasta 80ºC para enzimas de termófilos durante un tiempo suficiente para permitir la escisión (de 10 a 60 minutos). Los productos de las Reacciones 1, 2 y 3 se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se visualizan por autorradiografía o por un procedimiento comparable apropiado para el sistema de marcaje usado. Los sistemas de marcado adicionales incluyen detección quimioluminiscente, tinciones con plata u otras, transferencia y sondado y similares. La presencia de productos de escisión se indica por la presencia de moléculas que migran a un menor peso molecular de lo que lo hace la estructura de ensayo no

escindida. Estos productos de escisión indican que la polimerasa candidata tiene actividad nucleasa 5’ con

especificidad de estructura.

Para determinar si una ADN polimerasa modificada tiene sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ que la de la ADN polimerasa nativa, los resultados de los ensayos que se han descrito anteriormente se comparan con los resultados obtenidos de estos ensayos con la ADN polimerasa nativa. Con “sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’” se quiere decir que la polimerasa modificada y la polimerasa nativa escindirán ambas moléculas de

ensayo del mismo modo. No es necesario que la polimerasa modificada escinda a la misma velocidad que la ADN polimerasa nativa.

Algunas enzimas o preparaciones de enzimas pueden tener otras actividades asociadas o contaminantes que pueden ser funcionales en las condiciones de escisión que se han descrito anteriormente y que pueden interferir con detección de nucleasa 5’ Las condiciones de reacción se pueden modificar teniendo en consideración estas otras actividades, para evitar destrucción de sustrato u otro enmascaramiento de la escisión por nucleasa 5’ y sus productos. Por ejemplo, la ADN polimerasa I de E. coli (Pol I), además de sus actividades polimerasa y nucleasa 5’, tiene una exonucleasa 3’ que puede degradar ADN en una dirección de 3’ a 5’. . En consecuencia, cuando la

molécula en la Fig. 15E se expone a esta polimerasa en las condiciones que se han descrito anteriormente, la

exonucleasa 3’ retira rápidamente el brazo 3’ no emparejado, destruyendo la estructura bifurcada requerida de un sustrato para la escisión con una exonucleasa 5’ y no se detecta escisión. La capacidad real de Pol I para escindir la estructura se puede poner de manifiesto si la exonucleasa 3’ se inhibe por un cambio de condiciones (por ejemplo,

pH), mutación o por adición de un competidor para la actividad. La adición de 500 pmol de un oligonucleótido competidor monocatenario, no relacionado con la estructura de la Fig. 15E, a la reacción de escisión con Pol I inhibe

de forma eficaz la digestión del brazo 3’ de la estructura de la Fig. 15E sin interferir con la liberación de la exonucleasa 5’ del brazo 5’. La concentración del competidor no es crítica, pero debe ser lo suficientemente alta para ocupar la exonucleasa 3’ durante la duración de la reacción.

Se puede provocar una destrucción similar de la molécula de ensayo por contaminantes en la preparación de la polimerasa candidata. Se pueden realizar varios conjuntos de las reacciones de nucleasa con especificidad de estructura para determinar la pureza de la nucleasa candidata y para encontrar la ventana entre la sub y sobre exposición de la molécula de ensayo a la preparación de polimerasa que se está investigando.

Las polimerasas modificadas que se han descrito anteriormente se ensayaron para actividad nucleasa 5’ del

siguiente modo: la Reacción 1 se realizó en un tampón Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 a 20ºC, MgCl2 1,5 mM y KCl 50 mM y en la Reacción 2 la concentración de KCl se redujo a 20 mM. En las Reacciones 1 y 2, 10 fmol de la molécula de

sustrato de ensayo mostrada en la Fig. 15E se combinaron con 1 pmol del cebador indicado y de 0,5 a 1,0 μl de

extracto que contenía la polimerasa modificada (preparada como se ha descrito anteriormente). Esta mezcla se incubó después durante 10 minutos a 55ºC. Para todas las polimerasas mutantes ensayadas, estas condiciones eran suficientes para dar escisión completa. Cuando la molécula mostrada en la Fig. 15E se marcó en el extremo 5’, el fragmento 5’ liberado, de 25 nucleótidos de longitud, se separó de forma conveniente en un gel de poliacrilamida

al 20% (reticulado 19:1) con urea 7 M en un tampón que contenía Tris-borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los clones 3C-F y 4B mostraron escisión con especificidad de estructura comparable con la ADN polimerasa no modificada Adicionalmente, los clones 3E, 3F y 3G tienen la capacidad añadida de escindir ADN en ausencia de un brazo 3’ como se ha discutido anteriormente. Se muestran reacciones de escisión representativas en la Fig. 16.

Para las reacciones mostradas en las Fig. 16, los clones de polimerasa mutante 3E (mutante Taq) y 4B (mutante Tfl) se examinaron para su capacidad de escindir la molécula de sustrato de horquilla mostrada en la Fig. 15E. La molécula de sustrato se marcó en el extremo 5’ con 32P. Se mezclaron 10 fmol de ADN sustrato desnaturalizado por calor, marcado en el extremo y 0,5 unidades de DNAPTaq (carril 1) o 0,5 μl de extracto 3E o 4B (Fig. 16, carriles 2-7, el extracto se preparó como se ha descrito anteriormente) entre sí en un tampón que contenía Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM y MgCl2 1,5 mM. El volumen de reacción final fue 10 μl. Las reacciones mostradas en los carriles 4 y 7 contienen además 50 μM de cada dNTP. Las reacciones mostradas en los carriles 3, 4, 6 y 7 contienen 0,2 μM del oligonucleótido cebador (complementario al brazo 3’ del sustrato e ilustrado en la Fig. 15E). Las reacciones se incubaron a 55ºC durante 4 minutos. Las reacciones se detuvieron por la adición de 8 μl de formamida al 95% que contenía EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05% por 10 μl del volumen de reacción. Después se aplicaron

las muestras a geles de acrilamida desnaturalizante al 12%. Después de la electroforesis, los geles se autorradiografiaron. La Fig. 16 muestra que los clones 3E y 4B muestran actividad de escisión similar a la DNAPTaq nativa. Obsérvese que tiene lugar cierta escisión en estas reacciones en ausencia del cebador. Cuando se usa una estructura de horquilla larga, tal como la usada en este documento (Fig. 15E) en reacciones de escisión realizadas en tampones que contienen KCl 50 mM, se observa un nivel bajo de escisión independiente de cebador. Concentraciones mayores de KCl reprimen, pero no eliminan, esta escisión independiente de cebador en estas condiciones.

2. Ensayo para actividad sintética

La capacidad de la enzima modificada o los fragmentos proteolíticos se analiza añadiendo la enzima modificada a un sistema de ensayo en el que un cebador hibrida con un molde y la síntesis de ADN se cataliza por la enzima añadida. Muchas técnicas de laboratorio convencionales emplean un ensayo de este tipo. Por ejemplo, el traslado de mella y la secuenciación enzimática implican la extensión de un cebador a lo largo de un molde de ADN por una molécula de polimerasa.

En un ensayo preferido para determinar la actividad sintética de una enzima modificada se hibrida un cebador oligonucleotídico con un molde de ADN monocatenario (por ejemplo, el ADN del bacteriófago M13) y el dúplex cebador/molde se incuba en presencia de la polimerasa modificada en cuestión, desoxinucleósidos trifosfato (dNTP) y el tampón y las sales que se conoce que son apropiadas para la enzima no modificada o nativa. La detección de extensión de cebador (por electroforesis en gel desnaturalizante) o incorporación de dNTP (por precipitación con ácido o cromatografía) es indicativa de una polimerasa activa. Preferiblemente se incluye un marcador, isotópico o no isotópico, en el cebador o como un dNTP para facilitar la detección de productos de polimerización. La actividad sintética se cuantifica como la cantidad de nucleótido libre incorporado en la cadena de ADN creciente y se expresa como cantidad incorporada por unidad de tiempo en condiciones de reacción específicas.

Los resultados representativos de un ensayo para actividad sintética se muestran en la Fig. 17. La actividad sintética de los clones de DNAPTaq mutantes 3B-F se ensayó del siguiente modo: Se preparó una mezcla madre del siguiente tampón: tampón de PCR 1,2X (tampón de PCR 1X contiene KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 y el 0,05% de cada uno de Tween-20 y Nonidet P- 40), 50 μM de cada uno de dGTP, dATP y dTTP, dCTP 5 μM y -32PdCTP 0,125 μM a 600 Ci/mmol. Antes de ajustar esta mezcla a su volumen final se dividió en dos alícuotas iguales. Una recibió agua destilada hasta un volumen de 50 μl para dar las anteriores concentraciones. La otra recibió 5 μg de ADN de M13mp18 de hélice única (aproximadamente 2,5 pmol o 0,05 μM de concentración final) y 250 pmol de cebador de secuenciación de M13 (concentración final 5 μM) y agua destilada hasta un volumen final de 50 μl. Cada combinación se calentó a 75ºC durante 5 minutos y después se enfrió hasta temperatura ambiente.

Esto permitió que los cebadores hibridaran con el ADN en las mezclas que contenían ADN.

Para cada ensayo se combinaron 4 μl de la combinación con el ADN con 1 μl de polimerasa mutante, preparada como se ha descrito, o 1 unidad de DNAPTaq (Perkin Elmer) en 1 μl de dH2O. Se realizó un control “sin ADN” en presencia de la DNAPTaq (Fig. 17, carril 1) y se realizó un control “sin enzima” usando agua en lugar de la enzima

(carril 2). Cada reacción se mezcló, después se incubó a temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC) durante 5 minutos, después a 55ºC durante 2 minutos, después a 72ºC durante 2 minutos. Esta etapa de incubación se realizó para detectar polimerización en cualquier mutante que pudiera tener temperaturas óptimas inferiores a 72ºC. Después de la incubación final, los tubos se centrifugaron brevemente para recoger cualquier condensación y se

pusieron en hielo. Un μl de cada reacción se aplicó de forma puntual en un origen a 1,5 cm del borde inferior de una

placa de cromatografía en capa fina de celulosa de polietilenoimina (PEI) y se dejó secar. La placa de cromatografía se procesó en NaH2PO4 0,75 M, pH 3,5, hasta que el frente del tampón hubiera avanzado aproximadamente a 9 cm del origen La placa se secó, se envolvió en paño de plástico, se marcó con tinta luminiscente y se expuso a película de rayos X. La incorporación se detectó como recuentos que se adhirieron donde se aplicó de forma puntual de manera originaria, mientras que los nucleótidos no incorporados se alejaron por la solución salina del origen.

La comparación de las ubicaciones de los recuentos con los dos carriles de control confirmó la ausencia de actividad de polimerización en las preparaciones mutantes. Entre los clones de DNAPTaq modificados, solamente el clon 3B conserva alguna actividad sintética residual como se muestra en la Fig. 17.

EJEMPLO 3 - Referencia

Las nucleasas 5’ obtenidas de ADN polimerasas termoestables pueden escindir estructuras de horquilla

cortas con especificidad

Se examinó la capacidad de las nucleasas 5’ de escindir estructuras de horquilla para generar una estructura de horquilla escindida adecuada como una molécula de detección. La estructura y secuencia de la molécula de ensayo de horquilla se muestra en la Fig. 18A (SEC ID Nº 15). El oligonucleótido (“cebador” marcado en la Fig. 18A, SEC ID Nº 22) se muestra hibridado con su secuencia complementaria en el brazo 3’ de la molécula de ensayo de horquilla.

La molécula de ensayo de horquilla se marcó en un único extremo con 32P usando un cebador de promotor de T7 marcado en una reacción en cadena de la polimerasa. El marcador está presente en el brazo 5’ de la molécula de ensayo de horquilla y se representa por la estrella en la Fig. 18A.

La reacción de escisión se realizó añadiendo 10 fmol de molécula de ensayo de horquilla desnaturalizada por calor,

marcada en el extremo, 0,2 μM del oligonucleótido cebador (complementario al brazo 3’ de la horquilla), 50 μM de cada dNTP y 0,5 unidades de DNAPTaq (Perkin Elmer) o 0,5 μl de extracto que contiene una nucleasa 5’ (preparada como se ha descrito anteriormente) en un volumen total de 10 μl en un tampón que contiene Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM y MgCl2 1,5 mM. Las reacciones mostradas en los carriles 3, 5 y 7 se realizaron en ausencia de dNTP.

Las reacciones se incubaron a 55 ºC durante 4 minutos. Las reacciones se detuvieron a 55 ºC mediante la adición

de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05% por 10 μl del volumen de reacción.

Las muestras no se calentaron antes de la carga en geles de poliacrilamida desnaturalizantes (poliacrilamida al 10%, reticulación 19:1, urea 7 M, Tris-borato 89 mM, pH 8,3, EDTA 2,8 mM). Las muestran no se calentaron para permitir la separación de moléculas de horquilla escindidas de cadena única y con nueva formación de dúplex.

La Fig. 18B muestra que las polimerasas alteradas que carecen de cualquier actividad sintética detectable escinden

una estructura de horquilla cuando un oligonucleótido hibrida con el brazo 3’ de hélice única de la horquilla para producir una especie única de producto escindido (Fig. 18B, carriles 3 y 4). Las nucleasas 5’, tales como el clon 3D, mostradas en los carriles 3 y 4, producen un producto escindido único incluso en presencia de dNTP. Las nucleasas 5’ que conservan una cantidad residual de actividad sintética (menos de 1% de actividad de tipo silvestre) producen múltiples productos de escisión, ya que la polimerasa puede extender el oligonucleótido hibridado con el brazo 3’ de

la horquilla moviendo de este modo el sitio de escisión (clon 3B, carriles 5 y 6). La DNAPTaq nativa produce incluso más especies de productos de escisión de lo que lo hacen las polimerasas mutantes que conservan actividad sintética residual y, adicionalmente, convierte la estructura de horquilla en una forma de doble hélice en presencia de dNTP debido al alto nivel de actividad sintética en la polimerasa nativa (Fig. 18B, carril 8).

EJEMPLO 4 - Referencia

Escisión de sustratos de ácido nucleico lineal

A partir de lo anterior, debe estar claro que las ADN polimerasas termoestables nativas (es decir, de “tipo silvestre”) son capaces de escindir estructuras de horquilla de un modo específico y que este descubrimiento se puede aplicar con éxito a un ensayo de detección. En este ejemplo, las DNAP mutantes de la presente invención se ensayan frente a tres estructuras de escisión diferentes mostradas en la Fig. 20A. La estructura 1 en la Fig. 20A simplemente es un oligómero de 206 unidades monocatenario (cuya preparación e información de secuencia se tratan en el Ejemplo 1C). Las estructuras 2 y 3 son dúplex; la estructura 2 es la misma estructura de horquilla que la mostrada en la Fig. 11A (parte inferior), mientras que la estructura 3 tiene eliminada la parte de horquilla de la estructura 2.

Las reacciones de escisión comprendían 0,01 pmol del ADN sustrato resultante y un 1 pmol de oligonucleótido piloto en un volumen total de 10 μl de Tris-Cl 10 mM, pH 8,3, KCl 100 mM, MgCl2 1 mM. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 55 ºC y se detuvieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 10% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM .

Los resultados se visualizaron por autorradiografía y se muestran en la Fig. 20B con las enzimas indicadas del siguiente modo: I es DNAP de Taq nativa; II es DNAP de Tfl nativa; III es CLEAVASE BX mostrada en la Fig. 3E; IV es CLEAVASE BB mostrada en la Fig. 3F; V es el mutante mostrado en la Fig. 4B; y VI es CLEAVASE BN mostrada en la Fig. 3G.

Se usó la Estructura 2 para “normalizar” la comparación. Por ejemplo, se observó que se necesitaron 50 ng de

DNAP de Taq y 300 ng de CLEAVASE BN para dar cantidades similares de escisión de la Estructura 2 en treinta

(30) minutos. En estas condiciones, la DNAP de Taq nativa es incapaz de escindir la Estructura 3 hasta ningún grado significativo. La DNAP de Tfl escinde la Estructura 3 de un modo que crea múltiples productos.

Por el contrario, todos los mutantes ensayados escinden el dúplex lineal de la Estructura 3. Esta observación indica que esta característica de las ADN polimerasas mutantes es uniforme en polimerasas termoestables entre las especies termófilas.

EJEMPLO 5 - Referencia

Escisión exonucleolítica 5’ (“recorte”) por DNAP termoestables

Se ha observado que DNAP termoestables, incluyendo las de la presente invención, tienen una exonucleasa 5’ verdadera capaz de recortar el extremo 5’ de una estructura de ácido nucleico dúplex lineal. En este ejemplo, se vuelve a emplear el sustrato dúplex de ADN de 206 pares de bases (véase el Ejemplo 1C). En este caso, se produjo mediante el uso de un cebador marcado con 32P y un cebador no marcado en una reacción en cadena de la polimerasa. Las reacciones de escisión comprendían 0,01 pmol de ADN sustrato desnaturalizado por calor, marcado en el extremo (estando también presente la cadena no marcada), 5 pmol de oligonucleótido piloto (véase oligonucleótidos piloto en la Fig. 11A) y 0,5 unidades de DNAPTaq o 0,5 μl de CLEAVASE BB en el extracto de E. coli (véase anteriormente), en un volumen total de 10 μl de Tris·Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM.

Las reacciones se iniciaron a 65 ºC mediante la adición de enzima pre-calentada, después se cambiaron a la temperatura durante 30 minutos. Los resultados se muestran en la Fig. 21A. Las muestras en los carriles 1-4 son los resultados con DNAP de Taq nativa, mientras que los carriles 5-8 muestran los resultados con CLEAVASE BB. Las reacciones para los carriles 1, 2, 5 y 6 se realizaron a 65ºC y las reacciones para los carriles 3, 4, 7 y 8 se realizaron a 50ºC y se detuvieron todas a temperatura por la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 10% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. El producto esperado en las reacciones 1, 2, 5 y 6 tiene 85 nucleótidos de longitud; en las reacciones 3 y 7, el producto esperado tiene 27 nucleótidos de longitud. Las reacciones 4 y 8 se realizaron sin piloto y deben permanecer a 206 nucleótidos. La banda débil observada a 24 nucleótidos es el cebador marcado en el extremo residual de la PCR.

El resultado sorprendente es que CLEAVASE BB en estas condiciones provoca que todo el marcador aparezca en una especie muy pequeña, sugiriendo la posibilidad de que la enzima hidrolizara completamente el sustrato. Para determinar la composición de la banda de migración más rápida observada en los carriles 5-8 (reacciones realizadas con el mutante de deleción), muestras de los dúplex de 206 pares de bases se trataron con exonucleasa de gen 6 de T7 (USB) o con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para producir mononucleótido marcado (carril a de la Fig. 21B) o fosfato inorgánico libre marcado con 32P (carril b de la Fig. 21B), respectivamente. Estos productos, junto con los productos observados en el carril 7 del panel A se separaron por electroforesis breve a través de un gel de acrilamida al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Por tanto, CLEAVASE BB es capaz de convertir el sustrato en mononucleótidos.

EJEMPLO 6 - Referencia

El recorte Depende de dúplex

El recorte por CLEAVASE BB depende de dúplex. En este ejemplo, marcado de forma interna, se produjeron hélices únicas del oligómero de 206 unidades mediante 15 ciclos de extensión por cebador que incorpora dCTP marcado con -32P combinados con los cuatro dNTP no marcados, usando un fragmento no marcado de 206 pb como un molde. Productos de hélice única y doble se separaron por electroforesis por un gel de poliacrilamida al 6% no desnaturalizante (reticulación 29:1) en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM, se visualizaron por autorradiografía, se escindieron del gel, eluyeron por difusión pasiva y se concentraron por precipitación con etanol.

Las reacciones de escisión comprendían 0,04 pmol de ADN sustrato y 2 μl de Cleavase® BB (en un extracto de E. coli como se ha descrito anteriormente) en un volumen total de 40 μl de Tris·Cl Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM. Las reacciones se iniciaron por la adición de enzima pre-calentada; se retiraron alícuotas de 10 μl a los 5, 10, 20 y 30 minutos y se transfirieron a tubos preparados que contenían 8 μl de formamida al 95% con EDTA 30 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75 ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 10% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los resultados se visualizaron por autorradiografía como se muestra en la Fig. 22. Claramente, la escisión por Cleavase® BB depende de una estructura dúplex; no se detecta escisión de la estructura de hélice única mientras que la escisión del dúplex de oligómero de 206 unidades es completa.

EJEMPLO 7 - Referencia

El recorte puede estar dirigido por diana

La actividad de recorte de las DNAP se puede emplear con éxito en un ensayo de detección. Una realización de un ensayo de este tipo se muestra en la Fig. 23. En este ensayo se emplea un oligonucleótido marcado que es específico para una secuencia diana. El oligonucleótido está en exceso con respecto a la diana de tal forma que la hibridación es rápida. En esta realización, el oligonucleótido contiene dos marcadores de fluoresceína cuya proximidad en el oligonucleótido provoca que se inactive su emisión. Cuando se permite a la DNAP recortar el oligonucleótido, los marcadores se separan y son detectables. El dúplex acortado se desestabiliza y se disocia. Lo que es aún más importante, la diana está ahora libre para reaccionar con un oligonucleótido marcado intacto. . La reacción puede continuar hasta que se consiga el nivel de detección deseado. Se ha descrito un tipo de ensayo de ciclado análogo, aunque diferente, empleando exonucleasa lambda. Véase C. G. Copley y C. Boot, Bio Techniques

13: 888 (1992).

El éxito de un ensayo de un ensayo de este tipo depende de la especificidad. En otras palabras, el oligonucleótido tiene que hibridar con la diana específica. También se prefiere que el ensayo sea sensible; el oligonucleótido debe ser capaz de forma ideal de detectar cantidades pequeñas de diana. La Fig. 24A muestra un cebador marcado con

32P en el extremo 5’ unido a una secuencia diana de plásmido. En este caso, el plásmido era pUC19 (disponible en

el mercado) que se desnaturalizó por calor llevando a ebullición dos (2) minutos y enfriando después rápidamente. El cebador es un oligómero de 21 unidades (SEC ID Nº 28). La enzima empleada era CLEAVASE BX (una dilución equivalente a 5 x 10−3 μl de extracto) en KCl 100 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 8,3, MnCl2 2 mM. La reacción se realizó a 55ºC durante dieciséis (16) horas con o sin ADN de fondo genómico (de sangre de pollo). La reacción se detuvo por

la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores.

Los productos de la reacción se separaron por PAGE (poliacrilamida al 10%, reticulación 19:1, TBE 1 x) como se observa en la Fig. 24B. El carril “M” contiene el oligómero de 21 unidades marcado. Los carriles 1-3 no contienen diana específica, aunque los Carriles 2 y 3 contienen 100 ng y 200 ng de ADN genómico, respectivamente. Los carriles 4, 5 y 6 contienen todos diana específica con 0 ng, 100 ng o 200 ng de ADN genómico, respectivamente. Es evidente que la conversión a mononucleótidos tiene lugar en los Carriles 4, 5 y 6 sin tener en cuenta la presencia o cantidad de ADN de fondo. Por tanto, el recorte puede ser dirigido por diana y específico.

EJEMPLO 8 - Referencia

Purificación de Cleavase

Como se ha señalado anteriormente, se aislaron proteínas termoestables expresadas (es decir, las nucleasas 5’) por

extractos de células bacterianas en bruto. Después, las proteínas de E. coli precipitadas se eliminaron por centrifugación junto con otros restos celulares. En este ejemplo se cultivaron y recogieron células que expresan el clon BN (500 gramos). Para cada gramo (peso húmedo) de E. coli se añadieron 3 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50

mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 100 μM). Las células se lisaron con 200 μg/ml de lisozima a temperatura ambiente

durante 20 minutos. Después de esto se añadió ácido desoxicólico para preparar una concentración final del 0,2% y la mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente.

El lisado se sonicó durante aproximadamente 6-8 minutos a 0ºC. El precipitado se eliminó por centrifugación (39.000 g durante 20 minutos). Se añadió polietilenoimina (al 0,5%) al sobrenadante y la mezcla se incubó en hielo durante 15 minutos. La mezcla se centrifugó (5.000 g durante 15 minutos) y se retuvo el sobrenadante. Esto se calentó durante 30 minutos a 60ºC y después se volvió a centrifugar (5.000 g durante 15 minutos) y se volvió a retener el sobrenadante.

El sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio al 35% a 4ºC durante 15 minutos. Después, la mezcla se centrifugó (5.000 g durante 15 minutos) y se retiró el sobrenadante. Después se disolvió el precipitado en KCl 0,25 M, Tris 20, pH 7,6, Tween al 0,2% y EDTA al 0,1) y después se dializó frente a Tampón de Unión (Tampón de Unión 8x comprende: imidazol 40 mM, NaCl 4 M, Tris-HCl 160 mM, pH 7,9).

Después, la proteína solubilizada se purifica en la columna Ni++ (Novagen). El Tampón de Unión se deja drenar hasta la parte superior del lecho de la columna y se carga la columna con el extracto preparado. Un caudal de aproximadamente 10 volúmenes de columna por hora es óptimo para purificación eficaz. Si el caudal es demasiado rápido, más impurezas contaminarán la fracción eluída.

La columna se lava con 25 ml (10 volúmenes) de Tampón de Unión 1X y después se lava con 15 ml (6 volúmenes) de Tampón de Lavado 1X (Tampón de Lavado 8X comprende: imidazol 480 mM, NaCl 4 M, Tris-HCl 160 mM, pH 7,9). La proteína unida se eluyó con 15 ml (6 volúmenes) de Tampón de Elución 1X (Tampón de Elución 4X comprende: imidazol 4 mM, NaCl 2 M, Tris-HCl 80 mM, pH 7,9). Después, la proteína se represivita con Sulfato de Amonio al 35% como anteriormente. , el precipitado se disuelve y dializa frente a: Tris 20 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM). La solución se lleva hasta el 0,1% de cada uno de Tween 20 y NP-40 y se almacena a 4ºC.

EJEMPLO 9 - Referencia

El uso de diversos cationes divalentes en la reacción de escisión influye en la naturaleza de los productos de escisión resultantes

Al comparar las nucleasas 5’ generadas por la modificación y/o deleción del dominio de polimerización C terminal de

la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (DNAPTaq), como se ilustra en las Figs. 3B-G, se observaron diferencias

significativas en la intensidad de las interacciones de estas proteínas con el extremo 3’ de cebadores localizados

cadena arriba del sitio de escisión (como se ilustra en la Fig. 5). Al escribir la escisión de estas estructuras por ADN polimerasas de tipo Pol I (véase el Ejemplo 1 y Lyamichev y col., Science 260: 778 [1993]), se observó que en ausencia de un cebador, la ubicación de la unión entre la región de doble hélice y los brazos 5’ y 3’ de hélice única determinaron el sitio de escisión, pero en presencia de un cebador, la ubicación del extremo 3’ del cebador se convirtió en el factor determinante para el sitio de escisión. Se postuló que esta afinidad por el extremo 3’ estaba de acuerdo con la función de síntesis de la ADN polimerasa.

La estructura 2, mostrada en la Fig. 20A, se usó para analizar los efectos de un extremo 3’ próximo al sitio de

escisión en reacciones de escisión que comprenden varias soluciones diferentes (por ejemplo, soluciones que contienen diferentes sales [KCl o NaCl], diferentes cationes divalentes [Mn2+ o Mg2+], etc.) así como el uso de diferentes temperaturas para la reacción de escisión. Cuando las condiciones de reacción eran tales que la unión de la enzima (por ejemplo, una DNAP que comprende una nucleasa 5’, una DNAP modificada o una nucleasa 5’) al extremo 3’ (del oligonucleótido piloto) cerca del sitio de escisión era fuerte, la estructura mostrada se escinde en el sitio indicado en la Fig. 20A. Esta escisión libera el brazo 5’ no emparejado y deja una mella entre la parte remanente del ácido nucleico diana y el extremo 3’ plegado del oligonucleótido piloto. Por el contrario, cuando las condiciones de reacción son tales que la unión de la DNAP (que comprende una nucleasa 5’) al extremo 3’ era débil, la escisión inicial era como se ha descrito anteriormente, pero después de la liberación del brazo 5’, el dúplex

remanente se digiere por la función exonucleasa de la DNAP.

Un modo de debilitar la unión de la DNAP al extremo 3’ es retirar todo o parte del dominio al que se ha atribuido al menos algo de esta función. Algunas de las nucleasas 5’ creadas por deleción del dominio de polimerización de

DNAPTaq tienen función exonucleasa verdadera mejorada, como se demuestra en el Ej.5.

La afinidad de estos tipos de enzimas (es decir, nucleasas 5’ asociadas u obtenidas de DNAP) por extremos 3’ con

huecos también se puede ver afectada por la identidad del catión divalente presente en la reacción de escisión. Longley y col. (Nucl. Acids Res., 18:7317 [1990]) demostraron que el uso de MnCl2 en una reacción con DNAPTaq

permitió que la polimerasa retirara nucleótidos del extremo 5’ de un cebador hibridado con un molde, aunque de

forma ineficaz. . De forma similar, mediante ensayo de los productos de escisión generados usando la Estructura 2 de la Fig. 20A, como se ha descrito anteriormente, en una reacción que contiene DNAPTaq o la nucleasa CLEAVASE BB, se observó que la sustitución de MgCl2 por MnCl2 en la reacción de escisión dio como resultado el

“recorte” exonucleolítico del dúplex cadena abajo del sitio de escisión inicial. Aunque no limita la invención a ningún

mecanismo particular, se considera que la sustitución de MgCl2 por MnCl2 en la reacción de escisión disminuye la

afinidad de estas enzimas por extremos 3’ con huecos.

En todos los casos, el uso de MnCl2 mejora la función nucleasa 5’, y en el caso de nucleasa CLEAVASE BB se observa una estimulación de 50 a 100 veces de la función nucleasa 5’. Por tanto, aunque se demostró la actividad exonucleasa de estas enzimas anteriormente en presencia de MgCl2, los ensayos descritos más adelante muestran una cantidad comparable de actividad exonucleasa usando de 50 a 100 veces menos de enzima cuando se usa MnCl2 en lugar de MgCl2. Cuando se usan estas cantidades reducidas de enzima en una mezcla de reacción que contiene MgCl2, la actividad de recorte o exonucleasa es mucho menos evidente que la observada en los Ejemplos 5-7.

Se observan efectos similares en la realización del ensayo de detección de ácido nucleico descrito en los siguientes Ejemplos 10-39 cuando se comparan reacciones realizadas en presencia de MgCl2 o MnCl2. En presencia de catión divalente, la presencia del oligonucleótido INVASOR (descrito más adelante) fuerza el sitio de escisión al interior del dúplex sonda, pero en presencia de MnCl2, el dúplex sonda se puede recortar adicionalmente produciendo una escala de productos que son visibles cuando está presente un marcador de extremo 3’ en el oligonucleótido sonda.

Cuando se omite el oligonucleótido INVASOR de una reacción que contiene Mn2+, la sonda se recorta del extremo 5’. Las reacciones basadas en Mg2+ muestran recorte mínimo del oligonucleótido sonda. En cualquiera de estos casos, la digestión de la sonda depende de la presencia del ácido nucleico diana. En los siguientes ejemplos, la escala producida por la actividad de recorte mejorada observada en presencia de Mn2+ se usa como un indicador positivo de que el oligonucleótido sonda ha hibridado con la secuencia diana.

EJEMPLO 10 - Referencia

Escisión endonucleolítica 5’ invasiva por nucleasas 5’ termoestables en ausencia de polimerización

Como se ha descrito en los anteriores Ejemplos, las nucleasas 5’ escinden cerca de la unión entre regiones de hélice única y con emparejamiento de bases en un dúplex bifurcado, habitualmente aproximadamente un par de

bases en la región con emparejamiento de bases. En este ejemplo, se muestra que nucleasas 5’ termoestables,

incluidas las de la presente invención (por ejemplo, nucleasa CLEAVASE BN, nucleasa CLEAVASE A/G), tienen la capacidad de escindir una mayor distancia al interior de la región con emparejamiento de bases cuando se

proporcionan con un oligonucleótido cadena arriba que lleva una región 3’ que es homóloga a una región 5’ del

dúplex sujeto, como se muestra en la Fig. 26.

La Fig. 26 muestra un oligonucleótido sintético que se diseñó para plegarse sobre sí mismo que está constituido por la siguiente secuencia: 5’-GTTCTCTGCTCTCTGGTCGCTG TCTCGCTTGTGAAACAAGCGAGACAGCGTGGTCTCTCG-3’ (SEC ID Nº 29). Este oligonucleótido se denomina la “Horquilla S-60”. La horquilla de 15 pares de bases formada por este oligonucleótido se estabiliza adicionalmente mediante la secuencia de “tri bucle” en el extremo del bucle (es decir, tres nucleótidos forman la parte de bucle de la horquilla) (Hiraro y col., Nucleic Acids Res., 22(4):576 [1994]). La Fig. 26 también muestra la secuencia del oligonucleótido P-15 y la ubicación de la región de complementariedad compartida por los oligonucleótidos de horquilla P-15 y S-60. La secuencia del oligonucleótido P-15 es 5’-CGAGAGACCACGCTG-3’ (SEC ID Nº 30). Como se discute con detalle más adelante, las puntas de flecha negras rellenas mostradas en la Fig. 26 indican los sitios de escisión de la horquilla S-60 en ausencia del oligonucleótido P-15 y las puntas de flecha vacías indican los sitios de escisión en presencia del oligonucleótido P-15. El tamaño de la punta de flecha indica la utilización relativa de un sitio concreto.

La molécula de horquilla S-60 se marcó en su extremo 5’ con biotina para detección posterior. La horquilla S-60 se incubó en presencia de una nucleasa 5’ termoestable en presencia o ausencia del oligonucleótido P-15. La presencia del dúplex completo que se puede formar por la horquilla S-60 se demuestra por escisión con la nucleasa 5’ Cleavase® BN, de un modo independiente de cebador (es decir, en ausencia del oligonucleótido P-15). La liberación de fragmentos de 18 y 19 nucleótidos del extremo 5’ de la molécula de horquilla S-60 mostró que la escisión tuvo lugar cerca de la unión entre las regiones de hélice única y doble cuando nada hibrida con el brazo 3’

de la horquilla S-60 (Fig. 27, carril 2).

Las reacciones mostradas en la Fig. 27 se realizaron del siguiente modo. Veinte fmol del ADN de horquilla marcado

con biotina 5’ (SEC ID Nº 29) se combinaron con 0,1 ng de enzima CLEAVASE BN y 1 μl de MOPS 100 mM (pH 7,5) que contenía el 0,5% de cada uno de Tween-20 y NP-40 en un volumen total de 9 μl. En la reacción mostrada en el carril 1, la enzima se omitió y el volumen se preparó por adición de agua destilada (esto sirvió como el control no cortado o sin enzima). La reacción mostrada en el carril 3 de la Fig. 27 también incluía 0,5 pmol del oligonucleótido P-15 (SEC ID Nº 30), que puede hibridar con el brazo 3’ no emparejado de la horquilla S-60 (SEC ID Nº 29), como se ilustra en la Fig. 26.

Las reacciones se cubrieron con una gota de aceite mineral, se calentaron a 95ºC durante 15 segundos, después se enfriaron a 37ºC y la reacción se inició por la adición de 1 μl de MnCl2 10 mM a cada tubo. Después de 5 minutos, las reacciones se detuvieron por la adición de 6 μl de formamida al 95% que contenía EDTA 20 mM y colorantes

marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 15% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM.

Después de la electroforesis, las placas de gel se separaron permitiendo que el gel permaneciera plano sobre una placa. Se puso una membrana de nylon cargada positivamente con poros de 0,2 mm (NYTRAN, Schleicher y Schuell, Keene, NH), pre-humidificada en H2O, sobre la parte superior del gel expuesto. Se eliminaron todas las burbujas de aire. Después se pusieron dos trozos de papel de filtro 3MM (Whatman) sobre la parte superior de la membrana, se sustituyó la otra placa de vidrio y el sándwich se afianzó con pinzas de unión Se dejó que la transferencia se realizara durante una noche. Después de la transferencia, la membrana se desprendió cuidadosamente del gel y se dejó secar al aire. Después del secado completo, la membrana se lavó en Tampón de Bloqueo Sequenase Images 1,2X (USB) usando 0,3 ml de tampón/cm2 de membrana. El lavado se realizó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (SAAP, United States Biochemical) a una dilución 1:4000 directamente a la solución de bloqueo y se agitó durante 15 minutos. La membrana se enjuagó brevemente con H2O y después se lavó tres veces durante 5 minutos por lavado usando 0,5 ml/cm2 de tampón SAAP 1X (Tris-HCl 100 mM, pH 10, NaCl 50 mM) con dodecil sulfato sódico al 0,1% (SDS). La membrana se enjuagó brevemente con H2O entre cada lavado. Después, la membrana se lavó una vez en tampón SAAP 1X que contenía MgCl2 1 mM sin SDS, se escurrió minuciosamente y se puso en una bolsa termosellable de plástico. Usando una pipeta estéril se añadieron 5 ml de sustrato quimioluminiscente CDP-StarTM (Tropix, Bedford, MA) para fosfatasa alcalina a la bolsa y se distribuyeron a lo largo de toda la membrana durante 2-3 minutos. La membrana tratada con CDP-StarTM se expuso a película de rayos X XRP (Kodak) durante una exposición inicial de 10 minutos.

La autorradiografía resultante se muestra en la Fig. 27. En la Fig. 27, el carril marcado con “M” contiene el

oligonucleótido P-15 biotinilado que sirvió como un marcador. Los tamaños (en nucleótidos) de la horquilla S-60 no escindida (60 nucleótidos; carril 1), el marcador (15 nucleótidos; carril “M”) y los productos de escisión generados por escisión de la horquilla S-60 en presencia (carril 3) o ausencia (carril 2) del oligonucleótido P-15 se indican.

Debido a que las regiones complementarias de la horquilla S-60 se localizan en la misma molécula, esencialmente no se debe necesitar retraso en el tiempo para permitir la hibridación (es decir, para formar la región dúplex de la horquilla). Cabe esperar que esta estructura de horquilla se forme mucho antes de que la enzima pudiera localizar y escindir la molécula. Como se espera, la escisión en ausencia del oligonucleótido cebador era en o cerca de la unión entre las regiones dúplex y monocatenarias, liberando el brazo 5’ no emparejado (Fig. 27, carril 2). Los productos de escisión resultantes tenían 18 y 19 nucleótidos de longitud.

Se esperó que la estabilidad de la horquilla S-60 con el tri-bucle evitaría que el oligonucleótido P-15 promoviera

escisión del modo “dirigido por cebador” descrito en el anterior Ejemplo 1, debido a que el extremo 3’ del “cebador” permanecería no emparejado. Sorprendentemente, se observó que la enzima parecía mediar una “invasión” por el

cebador P-15 en la región dúplex de la horquilla S-60, como se evidencia por el desplazamiento del sitio de escisión de 3 a 4 pares de bases más allá al interior de la región dúplex, liberando los productos más grandes (22 y 21 nucleótidos) observados en el carril 3 de la Fig. 27.

Los sitios precisos de escisión de la horquilla S-60 se ilustran en la estructura en la Fig. 26, indicando las puntas de flecha negras rellenas los sitios de escisión en ausencia del oligonucleótido P-15 e indicando las puntas de flecha vacías los sitios de escisión en presencia de P-15.

Estos datos muestran que la presencia en el brazo 3’ de un oligonucleótido que tiene cierta homología de secuencia con las primeras varias bases de la cadena orientada de forma similar del dúplex cadena abajo puede ser un factor dominante para determinar el sitio de escisión por nucleasas 5’. Debido a que el oligonucleótido que comparte cierta homología de secuencia con las primeras varias bases de la cadena orientada de forma similar del dúplex cadena abajo parece invadir la región dúplex de la horquilla, se denomina un oligonucleótido “INVASOR”. Como se muestra en los siguientes Ejemplos, un oligonucleótido INVASOR parece invadir (o desplazar) una región de ácido nucleico en dúplex independientemente de si la región dúplex está presente en la misma molécula (es decir, una horquilla) o si el dúplex se forma entre dos cadenas separadas de ácido nucleico.

EJEMPLO 11 - Referencia

El oligonucleótido INVASOR desplaza el sitio de escisión en un dúplex preformado de sonda/diana

En el Ej. 10 se demostró que un oligonucleótido INVASOR podría desplazar el sitio en el que una nucleasa 5’ escinde una región dúplex presente en una molécula de horquilla. En este ejemplo, se examinó la capacidad de un oligonucleótido INVASOR de desplazar el sitio de escisión al interior de una región dúplex formada entre dos cadenas separadas de moléculas de ácido nucleico.

Un ADN diana de hélice única que comprende la molécula de M13mp19 circular de hélice única y un oligonucleótido sonda marcado (fluoresceína) se mezclaron en presencia del tampón de reacción que contiene sal (KCl) y cationes divalentes (Mg2+ o Mn2+) para promover la formación de dúplex. El oligonucleótido sonda se refiere a un oligonucleótido marcado que es complementario a una región a lo largo de la molécula diana (por ejemplo, M13mp19). Se añadió un segundo oligonucleótido (no marcado) a la reacción después de que se hubiera dejado hibridar la sonda y la diana. El segundo oligonucleótido se une a una región de la diana que se localiza cadena abajo de la región a la que se une el oligonucleótido sonda. Este segundo oligonucleótido contiene secuencias que son complementarias a una segunda región de la molécula diana. Si el segundo oligonucleótido contiene una región que es complementaria a una parte de las secuencias a lo largo de la diana a la que también se une el oligonucleótido sonda, este segundo oligonucleótido se denomina un oligonucleótido INVASOR (véase la Fig. 28c).

La Fig. 32 ilustra la hibridación de dos oligonucleótidos con regiones a lo largo de la molécula diana de M13mg19 (cadena inferior en todas las tres estructuras mostradas). En la Fig. 28 solamente se muestra una parte de 52 nucleótidos de la molécula de M13mp19; esta secuencia de 52 nucleótidos se enumera en la SEC ID Nº 31. El oligonucleótido sonda contiene un marcador de fluoresceína en el extremo 3’; la secuencia de la sonda es 5’-AGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGG-3’ (SEC ID Nº 32). En la Fig. 28, las secuencias que comprenden el segundo oligonucleótido, incluyendo el oligonucleótido INVASOR, están subrayadas. En la Fig. 28a, el segundo oligonucleótido, que tiene la secuencia 5’-GACGGGGAAAGCCGGCGAACG-3’ (SEC ID Nº 33), es complementario a una región diferente y cadena abajo de la molécula diana de lo que es el oligonucleótido sonda (marcado con

fluoresceína o “flúor”); hay un hueco entre el segundo oligonucleótido cadena arriba y la sonda para la estructura mostrada en la Fig. 28a. En la Fig. 28b, el segundo oligonucleótido cadena arriba, que tiene la secuencia 5’-GAAAGCCGGCGAACGTGGCG-3’ (SEC ID Nº 34) es complementario a una región diferente de la molécula diana de lo que es el oligonucleótido sonda, pero en este caso, el segundo oligonucleótido y el oligonucleótido sonda se ponen en contacto entre sí (es decir, el extremo 3’ del segundo oligonucleótido cadena arriba está inmediatamente adyacente al extremo 5’ de la sonda de tal forma que no existe ningún hueco entre estos dos oligonucleótidos). En la Fig. 28c, el segundo oligonucleótido cadena arriba (5’-GGCGAACGTGGCGAGAAAGGA-3’) [SEC ID Nº 35]) y el oligonucleótido sonda comparten una región de complementariedad con la molécula diana. Por tanto, el

oligonucleótido cadena arriba tiene un brazo 3’ que tiene una secuencia idéntica a las primeras varias bases de la sonda cadena abajo. En esta situación, el oligonucleótido cadena arriba se denomina un oligonucleótido “INVASOR”.

Se examinó el efecto de la presencia de un oligonucleótido INVSOR en el patrón de escisión en un dúplex de sonda/diana formado antes de la adición del INVASOR. El oligonucleótido INVASOR y la enzima se añadieron después de que se hubiera dejado que la sonda hibridara con la diana y se examinaron la posición y el alcance de escisión de la sonda para determinar a) si el INVASOR era capaz de desplazar el sitio de escisión hasta una región interna específica de la sonda y b) si la reacción podría acumular productos de escisión específica a lo largo del tiempo, incluso en ausencia de termociclado, polimerización o eliminación por exonucleasa de la secuencia de sonda.

Las reacciones se llevaron a cabo del siguiente modo: Se prepararon veinte μl de cada una de las dos mezclas de enzimas, que contenían 2 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G (preparada como se describe en el Ejemplo 2), con o sin 50 pmol del oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35), como se indica, por 4 μl de la mezcla. Para cada una de las ocho reacciones mostradas en la Fig. 29 se combinaron 150 fmol de ADN de hélice única de M13mp19 (disponible en Life Technologies, Inc.) con 5 pmol de sonda marcada con fluoresceína (SEC ID Nº 32), para crear la estructura mostrada en la Fig. 28c, pero sin el oligonucleótido INVASOR presente (la mezcla

sonda/diana). La mitad (4 tubos) de las mezclas de las sonda/diana se combinaron con 1 μl de MOPS 100 mM, pH 7,5 con el 0,5% de cada uno de Tween-20 y NP-40, 0,5 μl de KCl 1 M y 0,25 μl de MnCl2 80 mM y agua destilada hasta un volumen de 6 μl. El segundo conjunto de mezclas de sonda/diana se combinó con 1 μl de MOPS 100 mM, pH 7,5 con el 0,5% de cada uno de Tween-20 y NP-40, 0,5 μl de KCl 1 M y 0,25 μl de MgCl2 80 mM. . El segundo conjunto de mezclas, por lo tanto, contenía MgCl2 en lugar del MnCl2 presente en el primer conjunto de mezclas.

Las mezclas (que contienen la sonda/diana con tampón, KCl y catión divalente) se cubrieron con una gota de barrera contra evaporación CHILLOUT y se llevaron a 60ºC durante 5 minutos para permitir la hibridación. Cuatro μl de las anteriores mezclas de enzima sin el oligonucleótido INVASOR se añadieron a reacciones cuyos productos se muestran en los carriles 1, 3, 5 y 7 de la Fig. 29. Las reacciones cuyos productos se muestran en los carriles 2, 4, 6 y 8 de la Fig. 29 recibieron la misma cantidad de enzima mezclada con el oligonucleótido invasor (SEC ID Nº 35). Las reacciones 1, 2, 5 y 6 se incubaron durante 5 minutos a 60ºC y las reacciones 3, 4, 7 y 8 se incubaron durante 15 minutos a 60ºC.

Todas las reacciones se detuvieron por la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes

marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 90ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de acrilamida al 20% (reticulado 19:1), que contenía urea 7 M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Después de la electroforesis, los productos de reacción se visualizaron mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO, cuya salida se observa en la Fig. 29. El material fluorescente de peso molecular muy bajo observado en todos los carriles en o cerca del frente de sal de la Fig. 29 y otras figuras de aparato para la formación de imágenes fluorescentes se observan cuando oligonucleótidos marcados fluorescentemente se someten a electroforesis y se representan en un aparato para la formación de imágenes fluorescentes. Este material no es un producto de la reacción de escisión.

El uso de MnCl2 en estas reacciones (carriles 1-4) estimula la actividad verdadera de exonucleasa o de “recorte” de la enzima CLEAVASE, como se describe en el Ejemplo 6, como se observa claramente en los carriles 1 y 3 de la Fig. 29. Este recorte del oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32) en ausencia de oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35) confirma que el oligonucleótido sonda está formando un dúplex con la secuencia diana. Los productos de tipo escala producidos por esta reacción de recorte pueden ser difíciles de diferenciar de degradación de la sonda por nucleadas que pueden estar presentes en una muestra clínica. Por el contrario, la introducción del oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35) provocó un desplazamiento claro en la escisión de la sonda, haciendo avanzar el sitio de escisión de 6 a 7 bases al interior de la sonda, confirmando la hibridación de ambos oligonucleótidos. En presencia de MnCl2, el “recorte” de exonucleasa puede tener lugar después del acontecimiento de escisión dirigida por INVASOR, hasta que el dúplex residual se desestabiliza y se deshace

En una reacción de escisión basada en magnesio (carriles 5-8), la función de recorte o exonucleasa verdadera de la CLEAVASE A/G se suprime por enzima (pero la función endonucleolítica de la enzima está esencialmente inalterada), de tal forma que el oligonucleótido sonda no se degrada en ausencia del INVASOR (Fig. 29, carriles 5 y 7). Cuando se añade el INVASOR, es evidente que el oligonucleótido INVASOR puede promover un desplazamiento en el sitio de escisión endonucleolítica de la sonda hibridada. La comparación de los productos de las reacción de 5 y 15 minutos por INVASOR (carriles 6 y 8 en la Fig. 29) muestra que la sonda adicional hibrida con la diana y se escinde. La temperatura de fusión (TF) calculada de la parte de sonda que no se invade (es decir, nucleótidos 9-26 de la SEC ID Nº 32) es 56 ºC, de tal forma que la renovación observada (como se evidencia por la acumulación de productos de escisión con tiempo de reacción creciente) sugiere que la longitud completa de la molécula de sonda, con una Tf calculada de 76ºC, tiene que estar implicada en los acontecimientos de hibridación de sonda posteriores en esta reacción de 60ºC.

EJEMPLO 12 - Referencia

El solapamiento de la secuencia del oligonucleótido INVASOR 3’ con la región 5’ de la sonda provoca un

desplazamiento en el sitio de escisión

En el Ejemplo 11 se demostró la capacidad de un oligonucleótido INVASOR de provocar un desplazamiento en el sitio de escisión de una sonda hibridada con una molécula diana. En este ejemplo, se realizaron experimentos para examinar si la presencia de un oligonucleótido cadena arriba de la sonda fue suficiente para provocar un desplazamiento en el sitio o los sitios de escisión a lo largo de la sonda o si la presencia de nucleótidos en el extremo 3’ del oligonucleótido invasor que tienen la misma secuencia que los primeros varios nucleótidos en el extremo 5’ del oligonucleótido sonda se requería para promover el desplazamiento en la escisión.

Para examinar este punto, se comparan los productos de escisión obtenidos de tres disposiciones diferentes de oligonucleótidos específicos de diana. Un diagrama de estos oligonucleótidos y el modo en el que hibridan con un ácido nucleico de ensayo, M13mp19, se muestra en la Fig. 28. En la Fig. 28a, el extremo 3’ del oligonucleótido cadena arriba (SEC ID Nº 33) se ubica cadena arriba del extremo 5’ del oligonucleótido “sonda” cadena abajo (SEC

ID Nº 32) de tal forma que está presente una región de la diana de M13 que no está emparejada con ningún oligonucleótido. En la Fig. 28b, la secuencia del oligonucleótido cadena arriba (SEC ID Nº 34) está inmediatamente cadena arriba de la sonda (SEC ID Nº 32), no teniendo ningún hueco ni ningún solapamiento entre las secuencias. La Fig. 28c ilustra la disposición de los sustratos usados en el ensayo de la presente invención, mostrando que el

oligonucleótido “INVASOR” cadena arriba (SEC ID Nº 35) tiene la misma secuencia en una parte de su región 3’ que la presente en la región 5’ de la sonda cadena abajo (SEC ID Nº 32). Esto quiere decir que estas regiones competirán para hibridar con el mismo segmento en el ácido nucleico diana de M13.

En estos experimentos se prepararon cuatro mezclas de enzimas del siguiente modo (planeando 5 μl por producto de digestión): la mezcla 1 contenía 2,25 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G (preparado como se describe en el Ejemplo 2) por 5 μl de mezcla, en MOPS 20 mM, pH 7,5 con el 0,1% de cada uno de Tween 20 y NP-40, MnCl2 4 mM y KCl 100 mM. La mezcla 2 contenía 2,25 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G por 5 μl de mezcla en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, MgCl2 4 mM y KCl 100 mM. La mezcla 3 contenía 2,25 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G por 5 μl de mezcla en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, MgCl2 4 mM y KCl 100 mM. La mezcla 4 contenía 11,25 unidades de ADN polimerasa de Taq por 5 μl de mezcla en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, MgCl2 4 mM y KCl 100 mM.

Para cada reacción, 50 fmol de ADN monocatenario de M13mp19 (el ácido nucleico diana) se combinaron con 5

pmol del oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32 que contenía un marcador de fluoresceína en el extremo 3’) y 50 pmol

de uno de los tres oligonucleótidos cadena arriba ilustrados en la Fig. 28 (es decir, una de las SEC ID N: 33-35) en

un volumen total de 5 μl de agua destilada. Las reacciones se cubrieron con una gota de barrera contra evaporación ChillOutTM y se calentaron a 62ºC. Las reacciones de escisión se iniciaron por la adición de 5 μl de una mezcla de enzima a cada tubo y las reacciones se incubaron a 62ºC durante 30 min. Las reacciones mostradas en los carriles 1-3 de la Fig. 34 recibieron la Mezcla 1; las reacciones 4-6 recibieron la Mezcla 2; las reacciones 7-9 recibieron la Mezcla 3 y las reacciones 10-12 recibieron la Mezcla 4.

Después de 30 minutos a 62 ºC, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con

EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM.

Después de la electroforesis, los productos de las reacciones se visualizaron mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO, cuya salida se observa en la Fig. 30. Los productos de reacción mostrados en los carriles 1, 4, 7 y 10 de la Fig. 30 eran de las reacciones que contenían la SEC ID Nº 33 como el oligonucleótido cadena arriba (véase la Fig. 28a). Los productos de reacción mostrados en los carriles 2, 5, 8 y 11 de la Fig. 30 eran de reacciones que contenían la SEC ID Nº 34 como el oligonucleótido cadena arriba (véase la Fig. 28b). Los productos de reacción mostrados en los carriles 3, 6, 9 y 12 de la Fig. 30 eran de reacciones que contenían la SEC ID Nº 35, el oligonucleótido INVASOR, como oligonucleótido cadena arriba (véase la Fig. 28c).

El examen de las reacciones basadas en Mn2+ usando nucleasa CLEAVASE A/G o DNAPTaq como el agente de escisión (carriles 1 a 3 y 4 a 6, respectivamente) muestra que ambas enzimas tienen función exonucleasa activa en estas condiciones de tampón. El uso de un marcador 3’ en el oligonucleótido sonda permite que los productos de la actividad de recorte permanezcan marcados y, por lo tanto, visibles en este ensayo. Las escalas observadas en los carriles 1, 2, 4 y 5 confirman que la sonda hibrida con el ADN diana como se pretende. Estos carriles también muestran que la ubicación de los oligonucleótidos no invasivos tiene poco efecto sobre los productos generados. La escala uniforme creada por estos productos de digestión sería difícil de distinguir de una escala provocada por una nucleasa contaminante, como se puede encontrar en una muestra clínica. Por el contrario, los productos mostrados en los carriles 3 y 6, donde se proporcionó un oligonucleótido INVASOR para dirigir la escisión, muestran un desplazamiento muy distinto, de tal forma que el producto de escisión primario es menor que los observados en la escisión no invasiva. Después, este producto se somete a recorte adicional en estas condiciones, como se indica por los productos más cortos en estos carriles. Estos productos de escisión dirigida por INVASOR se distinguirían de forma sencilla de un fondo de degradación no específica del oligonucleótido sonda.

Cuando se usa Mg2+ como el catión divalente, los resultados son incluso más distintivos. En los carriles 7, 8, 10 y 11 de la Fig. 30, donde los oligonucleótidos cadena arriba eran no invasivos, se observa recorte mínimo. Los productos en las reacciones de DNAPTaq muestran cierta acumulación de sonda que se ha acortado en el extremo 5’ por uno

o dos nucleótidos de forma coherente con examen previo de la acción de esta enzima sobre sustratos mellados (Longley y col., anteriormente). Sin embargo, cuando el oligonucleótido cadena arriba es invasivo, se observa la aparición de la banda de sonda desplazada de forma clara. Estos datos indicaron claramente que es la parte 3’ invasiva del oligonucleótido cadena arriba la que es responsable de fijar el sitio de escisión en la sonda cadena abajo.

Por tanto, los anteriores resultados demuestran que es la presencia de nucleótidos libres o inicialmente no

hibridados en el extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR los que median en el desplazamiento en el sitio de

escisión, no solamente la presencia de un oligonucleótido hibridado cadena arriba de la sonda. Los ensayos de detección de ácido nucleico que emplean el uso de un oligonucleótido INVASOR se denominan ensayos de

“escisión dirigida por INVASOR”.

EJEMPLO 13 - Referencia

La escisión dirigida por INVASOR reconoce moléculas diana monocatenarias y bicatenarias en un fondo de moléculas de ADN no diana

Para que un procedimiento de detección de ácido nucleico sea ampliamente útil, tiene que ser capaz de detectar una diana específica en una muestra que puede contener grandes cantidades de otros ADN (por ejemplo, ADN cromosómico bacteriano o humano). Se examinó la capacidad del ensayo de escisión dirigida por INVASOR para reconocer y escindir cada molécula diana monocatenaria o bicatenaria en presencia de grandes cantidades de ADN no diana. En estos experimentos, un ácido nucleico diana modelo, M13, en forma monocatenaria o bicatenaria (M13mp18 monocatenario está disponible en Life Technologies, Inc. y M13mp19 bicatenario está disponible en NEB), se combinó con ADN genómico humano (Novagen) y después se utilizó en reacciones de escisión dirigida por INVASOR. Antes del inicio de la reacción de escisión, los ADN se calentaron a 95ºC durante 15 minutos para desnaturalizar completamente las muestras, como es práctica convencional en ensayos, tales como reacción en cadena de la polimerasa o secuenciación de ADN enzimática, que implican hibridación en solución de oligonucleótidos con moléculas diana bicatenarias.

Para cada una de las reacciones mostradas en los carriles 2-5 de la Fig. 31, el ADN diana (25 fmol del ADN mc o un pmol del ADN bc) se combinó con 50 pmol del oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35); para la reacción mostrada en el carril 1 se omitió el ADN diana. Las reacciones 1, 3 y 5 también contenían 470 ng de ADN genómico humano. Estas mezclas se llevaron hasta un volumen de 10 μl con agua destilada, se cubrieron con una gota de barrera contra evaporación ChillOut® y se llevaron a 95ºC durante 15 minutos. Después de este periodo de incubación, y

todavía a 95ºC, cada tubo recibió 10 μl de una mezcla que comprendía

2,25 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G (preparado como se describe en el Ejemplo 2) y 5 pmol del oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32), en MOPS 20 mM, pH 7,5 con el 0,1% de cada uno de Tween-20 y NP-40, MnCl2 4 mm y KCl 100 mM. Las reacciones se llevaron a 62ºC durante 15 minutos y se detuvieron por la adición de

12 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75ºC

durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los productos de las reacciones se visualizaron mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO. Los resultados se muestran en la figura 31.

En la Fig. 31, el carril 1 contiene los productos de la reacción que contiene la sonda (SEC ID Nº 32), el oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35) y ADN genómico humano. El examen del carril 1 muestra que los oligonucleótidos sonda e INVASOR son específicos para la secuencia diana y que la presencia de ADN genómico no provoca ninguna escisión de fondo significativa.

En la Fig. 31, los carriles 2 y 3 contienen productos de reacción de reacciones que contienen el ADN diana de hélice única (M13mp18), el oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32) y el INVASOR (SEC ID Nº 35) en ausencia o presencia de ADN genómico humano, respectivamente. El examen de los carriles 2 y 3 demuestra que el ensayo de detección de INVASOR se puede usar para detectar la presencia de una secuencia específica en una molécula diana monocatenaria en presencia o ausencia de un gran exceso de ADN competidor (ADN genómico humano).

En la Fig. 31, los carriles 4 y 5 contienen productos de reacción de reacciones que contienen el ADN diana bicatenario (M13mp19), el oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32) y el INVASOR (SEC ID Nº 35) en ausencia o presencia de ADN genómico humano, respectivamente. El examen de los carriles 4 y 5 muestra que moléculas diana monocatenarias son eminentemente adecuadas para reacciones de detección dirigida por INVASOR. El éxito de esta reacción usando una molécula en dúplex corta, M13mp19, como la diana en un fondo de un gran exceso de ADN genómico es especialmente notable ya que se anticiparía que las cadenas de ADN de M13 más cortas y menos complejas se esperaría que encontrasen su cadena complementaria de forma más sencilla de lo que lo harían las cadenas del ADN genómico humano más complejo. Si el ADN de M13 rehibridara antes de que los oligonucleótidos sonda y/o INVASOR se pudieran unir a las secuencias diana a lo largo del ADN de M13, se evitaría la reacción de escisión. Además, debido a que el ADN genómico desnaturalizado contendría potencialmente regiones complementarias con los oligonucleótidos sonda y/o INVASOR fue posible que la presencia del ADN genómico inhibiera la reacción uniendo estos oligonucleótidos evitando de este modo su hibridación con la diana M13. Los resultados anteriores demuestran que estos aspectos teóricos no son un problema en las condiciones de reacción que se han empleado anteriormente.

Además de demostrar que el ensayo de detección por INVASOR se puede usar para detectar secuencias presentes en una diana de doble hélice, estos datos también muestran que la presencia de una gran cantidad de ADN no diana

(470 ng/20 μl de reacción) no disminuye la especificidad de la escisión. Aunque esta cantidad de ADN muestra

cierto impacto sobre la velocidad de acumulación de producto, probablemente uniendo una parte de la enzima, la naturaleza de la secuencia diana, bien ácido nucleico de hélice única o doble, no limita la aplicación de este ensayo.

EJEMPLO 14 - Referencia

Acumulación de señal en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR como una función de concentración de la diana

Para investigar si el ensayo de escisión dirigida por INVASOR se podría usar para indicar la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra, se realizó el siguiente experimento. Se ensamblaron reacciones de escisión que contenían un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35), una sonda marcada (SEC ID Nº 32) y un ácido nucleico diana, M13mp19. Se empleó una serie de reacciones, que contenían cantidades menores y menores del ADN diana de M13, para examinar si los productos de escisión se acumularían de un modo que reflejara la cantidad de ADN diana presente en la reacción.

Las reacciones se realizaron del siguiente modo. Se ensambló una mezcla madre que contenía enzima y tampón. Cada 5 μl de la mezcla madre contenían 25 ng de nucleasa Cleavase® A/G en MOPS 20 mM (pH 7,5) con el 0,1%

de cada uno de Tween 20 y NP-40, MnCl2 4mMy KCl 100 mM. Para cada una de las reacciones de escisión mostradas en los carriles 4-13 de la Fig. 36 se generó una mezcla de ADN que contenía 5 pmol del oligonucleótido sonda marcado con fluoresceína (SEC ID Nº: 43), 50 pmol del oligonucleótido invasor (SEC ID Nº 35) y 100, 50, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 fmol de M13mp19 monocatenaria, respectivamente, para cada 5 μl de la mezcla de ADN. Las soluciones de ADN se cubrieron con una gota de barrera contra evaporación CHILLOUT y se llevaron

hasta 61ºC. Las reacciones de escisión se iniciaron por la adición de 5 μl de la mezcla de enzima a cada uno de los tubos (volumen de reacción final era 10 μl). Después de 30 minutos a 61 ºC, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se

calentaron a 90ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% desnaturalizante (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón que contiene Tris·Borato 45 mM (pH 8,3), EDTA 1,4 mM. Para proporcionar referencia (es decir, patrones), 1,0, 0,1 y 0,01 pmol de alícuotas de oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32) marcado con fluoresceína se diluyeron con la anterior solución de formamida hasta un volumen final de 18 μl. Estos marcadores de referencia se cargaron en los carriles 1-3, respectivamente, del gel. Los productos de las reacciones de escisión (así como los patrones de referencia) se visualizaron después de la electroforesis mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO. Los resultados se muestran en la figura 32.

En la Fig. 32 aparecen casillas alrededor de ácido nucleico que contiene fluoresceína (es decir, las moléculas de sonda no escindidas y escindidas) y la cantidad de fluoresceína contenida dentro de cada casilla se indica debajo de

la casilla. La fluorescencia de fondo del gel (véase casilla denomina “fondo”) se restó por el aparato para la

formación de imágenes fluorescentes para generar cada valor presentado debajo de una casilla que contenía productos de sonda escindidos o no escindidos (las casillas se numeran de 1-14 en la parte superior izquierda con una V seguido de un número debajo de la casilla). EL carril marcado con “M” contiene oligonucleótidos fluoresceínados que sirven como marcadores.

Los resultados mostrados en la Fig. 32 demuestran que la acumulación de moléculas de sonda escindidas en un periodo de incubación de longitud fija refleja la cantidad de ADN diana presente en la reacción. Los resultados también demuestran que los productos de sonda escindidos se acumulan en exceso con respecto al número de copias de la diana. Esto se demuestra claramente comparando los resultados en el carril 3, en la que se muestran 10 fmol (0,01 pmol) de sonda no cortada, con los resultados mostrados en 5, donde se muestran los productos que se acumularon en respuesta a la presencia de 10 fmol de ADN diana. Estos resultados muestran que la reacción puede escindir cientos de moléculas de oligonucleótidos sonda para cada molécula diana presente, amplificando de forma espectacular la señal específica de diana generada en la reacción de escisión dirigida por INVASOR.

EJEMPLO 15 - Referencia

Efecto de extracto de saliva sobre el ensayo de escisión dirigida por INVASOR

Para que un procedimiento de detección de ácido nucleico sea útil en un entorno médico (es decir, uno de diagnóstico), no se tiene que inhibir por materiales y contaminantes que se encuentran probablemente en una muestra clínica típica. Para analizar la susceptibilidad del ensayo de escisión dirigida por INVASOR a diversos materiales, incluyendo, entre otros, ácidos nucleicos, glucoproteínas e hidratos de carbono, encontrados probablemente en una muestra clínica, se preparó una muestra de saliva humana de un modo coherente con las prácticas en laboratorio clínico y el extracto de saliva resultante se añadió al ensayo de escisión dirigida por INVASOR. Se examinó el efecto del extracto de saliva sobre la inhibición de escisión y sobre la especificidad de la reacción de escisión.

Se recogieron un mililitro y medio de saliva humana y se extrajeron una vez con un volumen igual de una mezcla que contenía fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). La mezcla resultante se centrifugó en una microcentrífuga para separar las fases acuosa y orgánica. La fase superior acuosa se transfirió a un tubo nuevo. Se añadió un décimo de volúmenes de NaOAc 3M y se mezclaron los contenidos del tubo. Se añadieron dos volúmenes de alcohol etílico al 100% a la mezcla y la muestra se mezcló e incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos para dejar que se formara un precipitado. La muestra se centrifugó en un microcentrífuga a 13.000 rpm durante 5 minutos y se retiró y desechó el sobrenadante. Se pudo ver de forma sencilla un sedimento blanquecino. El sedimento se enjuagó una vez con etanol al 70%, se secó al vacío y se disolvió en 200 μl de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM(esto constituye el extracto de saliva). Cada μl del extracto de saliva era equivalente a 7,5 μl de

saliva. El análisis del extracto de saliva por espectrofotometría ultravioleta de barrido mostró una absorbancia

máxima aproximadamente a 260 nm e indicó la presencia de aproximadamente 45 ng de ácido nucleico total por μl

de extracto.

Se examinó el efecto de la presencia de extracto de saliva en las siguientes enzimas: nucleasa CLEAVASE BN, nucleasa CLEAVASE A/G y tres lotes diferentes de DNAPTaq: AmpliTaq® (Perkin Elmer; una forma recombinante de DNAPTaq), AmpliTaq® LD (Perkin-Elmer: una preparación de DNAPTaq recombinante que contiene niveles muy bajos de ADN) y ADN polimerasa de Taq (Fisher). Para cada enzima sometida a ensayo se preparó una mezcla de enzima/sonda que comprendía la cantidad seleccionada de enzima con 5 pmol del oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32) en 10 μl de MOPS 20 mM (pH 7,5) que contenía el 0,1% cada uno de Tween 20 y NP-40, MnCl2 4 mM, KCl 100 mM y 100 μg/ml de BSA. Se usaron las siguientes cantidades de enzima: 25 ng de CLEAVASE BN preparada como se describe en el Ejemplo 8; 2 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G preparada como se describe en el Ejemplo 2; 2,25 μl (11,25 unidades de polimerasa) de las siguientes ADN polimerasas: ADN polimerasa AmpliTaq®

(Perkin Elmer); ADN polimerasa LD AmpliTaq® (baja en ADN; de Perkin Elmer); ADN polimerasa de Taq (Fisher Scientific).

Para cada una de las reacciones mostradas en la Fig. 33, excepto por la mostrada en el carril 1, el ADN diana (50 fmol de ADN de M13mp19 monocatenario) se combinó con 50 pmol del oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35) y 5 pmol del oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32); se omitió el ADN diana en la reacción 1 (carril 1). Las reacciones 1, 3, 5, 7, 9 y 11 incluían 1,5 μl de extracto de saliva. Estas mezclas se llevaron hasta un volumen de 5 μl con agua destilada, se cubrieron con una gota de barrera contra evaporación CHILLOUT y se llevaron a 95ºC durante 10

minutos. Las reacciones de escisión se iniciaron después mediante la adición de 5 μl de la mezcla deseada de

enzima/sonda; las reacciones 1, 4 y 5 recibieron nucleasa CLEAVASE A/G. Las reacciones 2 y 3 recibieron CLEAVASE BN; las reacciones 6 y 7 recibieron AmpliTaq®, las reacciones 8 y 9 recibieron AmpliTaq® LD y las reacciones 10 y 11 recibieron ADN polimerasa de Taq de Fisher Scientific

Las reacciones se incubaron a 63ºC durante 30 minutos y se detuvieron por la adición de 6 μl de formamida al 95%

con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los productos de las reacciones se visualizaron mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO y los resultados se muestran en la Fig. 33.

Una comparación pareada de los carriles mostrados en la Fig. 33 sin y con el extracto de saliva, tratadas con cada una de las enzimas, muestra que el extracto de saliva tiene diferentes efectos sobre cada una de las enzimas. Mientras que la nucleasa CLEAVASE BN y la AmpliTaq® estaban inhibidas significativamente en cuanto a escisión en estas condiciones, la nucleasa CLEAVASE A/G y AmpliTaq® LD muestran poca diferencia en el rendimiento de la sonda escindida. La preparación de ADN polimerasa de Taq de Fisher Scientific muestra una respuesta intermedia, con una reducción parcial en el rendimiento del producto escindido. Desde el punto de vista de polimerización, las tres variantes de DNAPTaq deben ser equivalentes; las mismas deben ser la misma proteína con la misma cantidad de actividad sintética. Es posible que las diferencias observadas se puedan deber a variaciones en la cantidad de actividad nucleasa presente en cada preparación provocada por una manipulación diferente durante la purificación o por diferentes protocolos de purificación. En cualquier caso, los ensayos de control de calidad diseñados para evaluar actividad de polimerización en preparaciones comerciales de DNAP probablemente no mostrarán variación en la cantidad de actividad nucleasa presente. Si preparaciones de DNAPTaq se exploraran

para actividad nucleasa 5’ completa (es decir, si la actividad nucleasa 5’ se cuantificara específicamente), es

probable que las preparaciones mostraran sensibilidades (a extracto de saliva) más en línea con las observadas usando nucleasa CLEAVASE A/G, de la que DNAPTaq difiere en muy poco aminoácidos.

Merece señalarse que incluso en las reacciones ralentizadas de CLEAVASE BN y las variantes de DNAPTaq no hay aumento evidente en escisión no específico del oligonucleótido sonda debido a hibridación inapropiada o nucleasas incluidas en saliva.

EJEMPLO 16 - Referencia

Comparación de nucleasas 5’ adicionales en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR

Se ha demostrado que varias ADN polimerasas de Tipo A eubacterianas (es decir, ADN polimerasas de tipo Pol I) funcionan como endonucleasas con especificidad de estructura (véase el Ejemplo 1 y Lyamichev y col., anteriormente). En este ejemplo se demostró que las enzimas de esta clase también se pueden preparar para catalizar la escisión dirigida por invasor de la presente invención, aunque no de forma tan eficaz como las enzimas CLEAVASE.

La nucleasa CLEAVASE BN y la nucleasa CLEAVASE A/G se ensayaron junto con tres diferentes ADN polimerasas termoestables: ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Promega), ADN polimerasas de Thermus thermophilus y Thermus flavus (Epicentre). Las mezclas de enzimas usadas en las reacciones mostradas en los carriles 1-11 de la Fig. 34 contenían lo siguiente, cada uno en un volumen de 5 μl: Carril 1: MOPS 20 mM (pH 7,5) con el 0,1% de cada uno de Tween 20 y NP-40, MnCl2 4 mM, KCl 100 mM; Carril 2: 25 ng de nucleasa CLEAVASE BN en la misma solución descrita para el carril 1; Carril 3: 2,25 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G (preparado como se describe en el Ejemplo 2), en la misma solución descrita para el carril 1; Carril 4: 2,25 μl de extracto de nucleasa

CLEAVASE A/G en Tris-Cl 20 mM, (pH 8,5), MgCl2 4 mM y KCl 100 mM; Carril 5: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Taq en el mismo tampón descrito para el carril 4; Carril 6: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tth en el mismo tampón descrito para el carril 1; Carril 7: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tth en una concentración 2X del tampón suministrado por el fabricante, suplementado con MnCl2 4 mM; Carril 8: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tth en una concentración 2X del tampón suministrado por el fabricante, suplementado con MgCl2 4 mM; Carril 9: 2,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tfl en el mismo tampón descrito para el carril 1; Carril 10: 2,25 unidades de polimerasa de polimerasa de Tfl en una concentración 2X del tampón suministrado por el fabricante, suplementado con MnCl2 4 mM; Carril 11: 2,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tfl en una concentración 2X del tampón suministrado por el fabricante, suplementado con MgCl2 4 mM.

Se combinaron suficiente ADN diana, sonda e INVASOR para todas las 11 reacciones en una mezcla madre. Esta mezcla contenía 550 fmol de ADN diana de M13mp19 monocatenario, 550 pmol del oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35) y 55 pmol del oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32), cada uno como se ilustra en la Fig. 28c, en 55 μl de agua destilada. Se dispensaron cinco μl de la mezcla de ADN en cada uno de los 11 tubos marcados y se cubrieron

con una gota de barrera contra evaporación CHILLOUT. Las reacciones se llevaron a 63ºC y se inició la escisión por la adición de 5 μl de la mezcla de enzima apropiada. Después, las mezclas de reacción se incubaron a temperatura de 63ºC durante 15 minutos. Las reacciones se detuvieron por la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20

mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 90ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, (pH 8,3), EDTA 1,4 mM. Después de la electroforesis, los productos de las reacciones se visualizaron mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO y los resultados se muestran en la Fig. 34. El examen de los resultados mostrados en la Fig. 34 demuestra que todas las

nucleasas 5’ analizadas tienen la capacidad de catalizar escisión dirigida por INVASOR en al menos uno de los

sistemas de tampón analizados. Aunque no se optimizan en este documento, estos agentes de escisión son adecuados para el uso en los procedimientos de la presente invención.

EJEMPLO 17 - Referencia

El ensayo de escisión dirigida por INVASOR puede detectar diferencias de una sola base en secuencias de ácido nucleico diana

Se examinó la capacidad del ensayo de escisión dirigida por invasor para detectar mutaciones de apareamiento erróneo de una sola base. Se sintetizaron químicamente dos secuencias de ácido nucleico diana que contenían estructuras principales de fosforotioato resistentes a enzima CLEAVASE y se purificaron por electroforesis en gel de poliacrilamida. Se usaron dianas que comprendían estructuras principales de fosforotioato para evitar el recorte exonucleolítico de la diana en dúplex con un oligonucleótido. El oligonucleótido diana, que proporciona la secuencia diana que es completamente complementaria al oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35) y el oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 32), contenía la siguiente secuencia: 5’-CCTTTCGCTTTCTTCCCTTC-CTTTCTCGCCACGTTCGCCGGC-3’ (SEC ID Nº 36). Se sintetizó una segunda secuencia diana que contenía un solo cambio de base con respecto a la SEC ID Nº 36: 5’-CCTTTCGCTCTCTTCCCT TCCTTTCTCGCC ACGTTCGCCGGC-3 (SEC ID Nº 37; cambio de una sola base con respecto a la SEC ID Nº 36 se muestra usando negrita y subrayado). El consiguiente apareamiento erróneo se produce dentro de la región “Z” de la diana como se representa en la Fig. 25.

Para distinguir dos secuencias diana que difieren por la presencia de un solo apareamiento erróneo, se realizaron reacciones de escisión dirigida por INVASOR usando dos temperaturas de reacción diferentes (55ºC y 60ºC). Se ensamblaron mezclas que contenían 200 fmol de la SEC ID Nº 36 o la SEC ID Nº 37, 3 pmol del oligonucleótido sonda marcado con fluoresceína (SEC ID Nº 32), 7,7 pmol de oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 35) y 2 μl de extracto de nucleasa CLEAVASE A/G (preparado como se describe en el Ejemplo 2) en 9 μl de MOPS 10mM (pH

7,4) con KCl 50 mM, se cubrieron con una gota de barrera contra evaporación CHILLOUT y se llevaron a la temperatura de reacción apropiada. Las reacciones de escisión se iniciaron mediante la adición de 1 μl de MgCl2 20 mM. Después de 30 minutos a 55 ºC o 60 ºC, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de

formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las mezclas de reacción después se

calentaron a 90ºC durante un minuto antes de cargar 4 μl en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 20%. Los

productos de reacción separados se visualizaron usando un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO. La imagen resultante se muestra en la Fig. 35.

En la Fig. 35, los carriles 1 y 2 muestran los productos de reacciones realizadas a 55ºC; los carriles 3 y 4 muestran los productos de reacciones realizadas a 60ºC. Los carriles 1 y 3 contenían productos de reacciones que contenían la SEC ID Nº 36 (acoplamiento perfecto con la sonda) como diana. Los carriles 2 y 4 contenían productos de reacciones que contenían la SEC ID Nº 37 (apareamiento erróneo de una sola base con la sonda) como diana. La diana que no tiene una correspondencia de hibridación perfecta (es decir, complementariedad completa) con la sonda no se unirá tan fuertemente (es decir, el valor de Tf de ese dúplex será menor que el valor de Tf de la misma región si se acopla perfectamente). Los resultados presentados en este documento demuestran que las condiciones de reacción pueden variarse para acomodar el apareamiento erróneo (por ejemplo, reduciendo la temperatura de la reacción) o para excluir la unión de la secuencia con apareamiento erróneo (por ejemplo, elevando la temperatura de reacción).

Los resultados mostrados en la Fig. 35 demuestran que el acontecimiento de escisión específica que se produce en las reacciones de escisión dirigida por INVASOR puede eliminarse por la presencia de un apareamiento erróneo de una sola base entre el oligonucleótido sonda y la secuencia diana. De esta manera, pueden elegirse condiciones de reacción para excluir la hibridación de sondas de escisión dirigida por INVASOR mal apareadas disminuyendo de esta manera o incluso eliminando la escisión de la sonda. En una extensión de este sistema de ensayo, también podrían usarse múltiples sondas de escisión, teniendo cada una molécula indicadora separada (es decir, un único marcador) en una sola reacción de escisión, para sondar simultáneamente dos o más variantes en la misma región diana. Los productos de esta reacción permitirían no solo la detección de mutaciones que existen dentro de una molécula diana, sino que también permitirían una determinación de las concentraciones relativas de cada secuencia (es decir, mutante y tipo silvestre o múltiples mutantes diferentes) presente dentro de muestras que contienen una mezcla de secuencias diana. Cuando se proporcionan en cantidades iguales, pero un gran exceso (por ejemplo, al menos un exceso molar de 100 veces; típicamente se usaría al menos 1 pmol de cada oligonucleótido sonda cuando la secuencia diana estaba presente en una concentración de aproximadamente 10 fmol o menos) con respecto a la diana y se usaría en condiciones optimizadas. Como se ha descrito anteriormente, ninguna diferencia en las cantidades relativas de las variantes diana afectará la cinética de hibridación, de manera que las cantidades de escisión de cada sonda reflejarán las cantidades relativas de cada variante presente en la reacción.

Los resultados mostrados en el ejemplo demuestran claramente que la reacción de escisión dirigida por INVASOR puede usarse para detectar diferencias de una sola base entre ácidos nucleico diana.

Ejemplo 18- Referencia

La reacción de escisión dirigida por INVASOR es insensible a grandes cambios en las condiciones de reacción

Los resultados mostrados anteriormente demostraron que la reacción de escisión dirigida por INVASOR puede usarse para la detección de secuencias de ácido nucleico diana y que este ensayo puede usarse para detectar diferencias de una sola base entre ácidos nucleico diana. Estos resultados demostraron que podrían usarse nucleasas 5’ (por ejemplo, CLEAVASE BN, CLEAVASE A/G, DNAPTaq, DNAPTth, DNAPTfl) junto con un par de oligonucleótidos solapantes como forma eficaz para reconocer dianas de ácido nucleico. En los experimentos presentados más adelante se demuestra que la reacción de escisión invasiva es relativamente insensible a grandes cambios en las condiciones, lo que hace que el procedimiento sea más adecuado para la práctica en laboratorios clínicos.

Se examinaron los efectos de la variación de las condiciones de la reacción de escisión sobre la especificidad de la escisión invasiva y sobre la cantidad de señal de acumulada en el transcurso de la reacción. Para comparar

variaciones en la reacción de escisión, primero se definió una reacción de escisión por INVASOR “convencional”.

En cualquier caso, a menos que se indique específicamente otra cosa, se varió el parámetro indicado de la reacción, mientras que los aspectos invariables de un ensayo concreto fueron los de esta reacción convencional. Los resultados de estos ensayos se muestran en las Figs. 38-40 o los resultados que se describen más adelante.

a) La reacción de escisión dirigida por INVASOR convencional

La reacción convencional se definió como una reacción que comprendía 1 fmol de ADN diana monocatenario de M13mp18 (NEB), 5 pmol del oligonucleótido sonda marcado (SEC ID Nº 38), 10 pmol del oligonucleótido INVASOR

cadena arriba (SEC ID Nº 39) y 2 unidades de CLEAVASE A/G en 10 μl de MOPS 10 mM, pH 7,5 con KCl 100 mM,

MnCl2 4 mM y un 0,05% de Tween-20 y de Nonidet-P40. Para cada reacción, se combinaron los tampones, sales y enzima en un volumen de 5 μl; los ADN (diana y dos oligonucleótidos) se combinaron en 5 μl de dH2O y se cubrieron con una gota de barrera contra evaporación CHILLOUT. Cuando se realizaron múltiples reacciones con los mismos constituyentes de reacción, estas formulaciones se expandieron proporcionalmente.

A menos que se indique otra cosa, los tubos de muestra con las muestras de ADN se calentaron a 61ºC y las

reacciones se iniciaron por medio de la adición de 5 μl de la mezcla de enzima. Después de 20 minutos a esta temperatura, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y

colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los productos de las reacciones se visualizaron mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO. En todos los casos, el material de sonda no cortado fue visible como una banda o mancha negra intensa, normalmente en la mitad superior del panel, mientras que los productos deseados de la escisión específica por INVASOR fueron visibles como una o dos bandas negras más estrechas, habitualmente en la mitad inferior del panel. En algunas condiciones de reacción, particularmente en condiciones con concentraciones elevadas de sal, también es visible un producto de escisión secundario (generándose de esta manera un doblete). Las escalas de bandas grises más claras generalmente indican recorte por exonucleasa del oligonucleótido sonda o fragmentación no específica inducida por calor de la sonda.

La Fig. 37 ilustra la hibridación de los oligonucleótidos sonda e INVASOR con regiones a lo largo de la molécula diana de M13mg18 (cadena inferior). En la Fig. 37 sólo se muestra una parte de 52 nucleótidos de la molécula M13mp18; esta secuencia de 52 nucleótidos se indica en la SEC ID Nº 31 (esta secuencia es idéntica tanto en M13mp18 como en M13mp19). El oligonucleótido sonda (cadena superior) contiene un marcador amidita Cy3 en el extremo 5’; la secuencia de la sonda es 5’-AGAAAGGAAGGGAA-GAAAGCGAAAGGT-3’ (SEC ID Nº 38. Los caracteres en negrita indican la presencia de una base modificada (2’-O-CH3). Amidita Cy3 (Pharmacia) es una amidita colorante de indodicarbocianina que puede incorporarse en cualquier posición durante la síntesis de oligonucleótidos; Cy3 emite fluorescencia en la región amarilla (máximo de excitación y emisión de 554 y 568 nm, respectivamente). El oligonucleótido invasor (cadena intermedia) tiene la siguiente secuencia: 5’-GCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGA-3’ (SEC ID Nº 39).

b) Titulación con KCl

La Fig. 38 muestra los resultados de la variación de la concentración de KCl en combinación con el uso de MnCl2 2 mM, en una reacción por lo demás convencional. Las reacciones se realizaron por duplicado para confirmar las observaciones; las reacciones mostradas en los carriles 1 y 2 no contenían KCl añadido, los carriles 3 y 4 contenían KCl a 5 mM, los carriles 5 y 6 contenían KCl 25 mM, los carriles 7 y 8 contenían KCl 50 mM, los carriles 9 y 10 contenían KCl 100 mM y los carriles 11 y 12 contenían KCl 200 mM. Estos resultados demuestran que la inclusión de KCl permite la generación de un producto de escisión específico. Aunque la señal más fuerte se observa a la concentración de KCl 100 mM, la especificidad en las otras reacciones con KCl a una concentración de 25 mM o superior indica que pueden elegirse concentraciones en el intervalo completo (es decir, 25-200 mM) si se desea para cualquier condición de reacción concreta.

Como se muestra en la Fig. 38, la reacción de escisión dirigida por INVASOR requiere la presencia de una sal (por ejemplo, KCl) para que se produzca una escisión eficaz. En otras reacciones, se ha descubierto que KCl puede inhibir la actividad de ciertas enzimas CLEAVASE cuando están presentes a concentraciones por encima de aproximadamente 25 Mm. Por ejemplo, en reacciones de escisión que usan el oligonucleótido S-60 mostrado en la Fig. 26, en ausencia de cebador, la enzima CLEAVASE BN pierde aproximadamente un 50% de su actividad en KCl 50 mM. Por lo tanto, se examinó el uso de sales alternativas en la reacción de escisión dirigida por INVASOR. En estos experimentos, el ion potasio se reemplazó por Na+ o Li+ o el ion cloruro se reemplazó por ácido glutámico. El reemplazo de KCl con sales alternativas se describe más adelante en las secciones c-e.

c) Titulación con NaCl

Se usó NaCl en lugar de Kcl a 75, 100, 150 o 200 mM, en combinación con el uso de MnCl2 2 mM, en una reacción por lo demás convencional. Estos resultados demuestran que el NaCl puede usarse como sustituto del KCl en la reacción de escisión dirigida por INVASOR, dando la concentración similar resultados similares (es decir, la presencia de NaCl, al igual que KCl, aumenta la acumulación de producto).

d) Titulación con LiCl

Se usó LiCl en lugar de Kcl en reacciones por lo demás convencionales. Las concentraciones analizadas fueron 25, 50, 75, 100,150 y 200 Mm de LiCl. Los resultados demostraron que LiCl puede usarse como sustituto adecuado del KCl en la reacción de escisión dirigida por INVASOR (es decir, la presencia de LiCl, al igual que KCl, aumenta la acumulación de producto) en concentraciones de aproximadamente 100 mM o superiores.

e) Titulación con KGlu

Se examinaron los resultados del uso de una sal glutamato de potasio (KGlu) en lugar de la sal cloruro (KCl) usada con más frecuencia en reacciones realizadas en un intervalo de temperaturas. Se ha demostrado que KGlu es una fuente de sal muy eficaz para algunas reacciones enzimáticas, mostrando un intervalo más amplio de concentraciones que permiten una actividad enzimática máxima (Leirmo y col., Biochem. 26: 2095 [1987]). La capacidad de KGlu de facilitar la hibridación de los oligonucleótidos sonda e INVASOR con el ácido nucleico diana se comparó con la de LiCl. En estos experimentos, las reacciones se realizaron durante 15 minutos, en lugar de los 20 minutos convencionales en reacciones convencionales que sustituyeron a KCl 200 mM, 300 mM o 400 mM KGlu. Las reacciones se realizaron a 65 °C, 67 °C, 69 °C o 71 °C. Los resultados mostrados demostraron que KGlu era muy eficaz como sal en las reacciones de escisión invasiva, co una actividad evidente completa incluso a KGlu 400 mM, aunque a la temperatura más baja la escisión se redujo en aproximadamente un 30 % a KGlu 300 mM y en aproximadamente 90 % a KGlu 400 mM.

f) Titulación con MnCl2 y MgCl2 y capacidad de reemplazar MnCl2 por MgCl2

En algunos casos puede ser deseable realizar la reacción de escisión invasiva en presencia de Mg2+, además de o en lugar de Mn2+ como el catión divalente necesario requerido para la actividad de la enzima empleada. Por ejemplo, algunos procedimientos comunes para preparar ADN a partir de cultivos o tejidos bacterianos usan MgCl2 en soluciones que se usan para facilitar la recogida de ADN por precipitación. Además, pueden usarse concentraciones elevadas (es decir, mayores de 5 mM) de catión divalente para facilitar la hibridación de ácidos nucleicos, de la misma forma que se usaron las sales monovalentes anteriormente, mejorando de esta manera la reacción de escisión invasiva. En este experimento se examinó la tolerancia de la reacción de escisión invasiva para 1) la sustitución de MnCl2 por MgCl2 y para la capacidad de producir un producto específico en presencia de concentraciones crecientes de MgCl2 y de MnCl2.

La Fig. 39 muestra los resultados de variar la concentración de MnCl2 de 2 mM a 8 mM, reemplazar el MnCl2 por MgCl2 de 2 a 4 mM o de usar estos componentes en combinación en una reacción por lo demás convencional Las reacciones analizadas en los carriles 1 y 2 contenían 2 mM de MnCl2 y MgCl2, los carriles 3-4 contenían sólo MnCl2, los carriles 5 y 6 contenían MnCl2 3 mM, los carriles 7 y 8 contenían MnCl2 4 mM y los carriles 9 y 10 contenían MnCl2 8 mM. Las reacciones analizadas en los carriles 11 y 12 contenían MgCl2 2 mM y los carriles 13 y 14 contenían MgCl2 4 mM Estos resultados demuestran que puede usarse tanto MnCl2 como MgCl2 como catión divalente necesario para permitir la actividad de escisión de la enzima CLEAVASE A/G en estas reacciones y que la reacción de escisión invasiva puede tolerar un amplio intervalo de concentraciones de estos componentes.

Además de examinar los efectos de entorno de sal sobre la velocidad de acumulación de producto en la reacción de escisión invasiva, se examinó el uso de constituyentes de la reacción que habían demostrado ser eficaces para aumentar la hibridación de ácidos nucleicos en ensayos de hibridación convencionales (por ejemplo, hibridación de transferencia) o en reacciones de ligamiento. Estos componentes pueden actuar como excluidores de volumen, aumentando la concentración eficaz de los ácidos nucleicos de interés y de esta manera, aumentando la hibridación,

o pueden actuar como agentes de protección de carga para minimizar la repulsión entre las estructuras principales altamente cargadas de las cadenas de ácido nucleico. Los resultados de estos experimentos se describen en las secciones g y h mostradas más adelante.

g) Efecto de la Adición de CTAB

Se ha demostrado que el detergente policatiónico bromuro de cetiltrietilamonio (CTAB) aumenta espectacularmente la hibridación de ácidos nucleicos (Pontius y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8237 [1991]). También se investigó el efecto de la adición del detergente CTAB en concentraciones de 100 mM a 1 mM a reacciones de escisión invasiva en las que se usó LiCl 150 mM en lugar del KCl en reacciones por lo demás convencionales. Estos resultados mostraron que CTAB 200 mM pueden tener un efecto potenciador muy moderado en estas condiciones de reacción y la presencia de CTAB por encima de aproximadamente 500 M era inhibidora con respecto a la acumulación del producto de escisión específica.

h) Efecto de la Adición de PEG

También se examinó el efecto de la adición de polietilenglicol (PEG) a concentraciones 4,8 o 12 % (p/v) a reacciones por lo demás convencionales. También se examinaron los efectos del aumento de la temperatura de reacción de las reacciones que contenían PEG realizando series por duplicado de reacciones de titulación con PEG a 61 ºC y 65 ºC. Los resultados mostraron que todos los porcentajes analizados y a ambas temperaturas analizadas, la inclusión de PEG eliminaba sustancialmente la producción de producto de escisión específico.

Además, se encontró que la presencia de solución de Denhardt 1X en la mezcla de reacción no tenía ningún efecto adverso tras la reacción de escisión (solución de Denhardt 50X contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll, 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de BSA). Además, se examinó individualmente la presencia de cada componente de la solución de Denhardt (es decir, Ficoll solo, polivinilpirrolidona sola y BSA solo) con respecto al efecto sobre la reacción de escisión dirigida por INVASOR; no se observó ningún efecto adverso.

I) Efecto de la adición de agentes estabilizadores

Otra estrategia para aumentar el rendimiento de la reacción de escisión invasiva es aumentar la actividad de la enzima empleada, aumentando su estabilidad en el medio de la reacción o aumentando su velocidad de renovación. Sin tener en cuenta el mecanismo preciso por medio del cual diversos agentes actúan en la reacción de escisión invasiva, se analizó la capacidad de aumentar la acumulación de producto de escisión específico en la reacción de escisión invasiva de varios agentes usados con frecuencia para estabilizar enzimas durante el almacenamiento prolongado.

También se examinaron los efectos de la adición de glicerol al 15% y de la adición de los detergentes Tween 20 y Nonidet-P40 al 1,5%, solos o en combinación, en reacciones por lo demás convencionales. Los resultados demostraron que en estas condiciones estos aductos tenían un efecto pequeño o nulo sobre la acumulación de producto de escisión específica.

También se investigaron los efectos de la adición de gelatina a reacciones en las que se variaron la identidad y la concentración de sal con respecto a la reacción convencional. Los resultados demostraron que en ausencia de sal, la gelatina tenía un efecto moderadamente potenciador sobre la acumulación de producto de escisión específica, pero cuando se añadía cualquier sal (KCl o LiCl) a reacciones realizadas en estas condiciones, las cantidades crecientes de gelatina reducían la acumulación del producto.

j) Efecto de la adición de grandes cantidades de ácido nucleico no diana

Para detectar secuencias de ácido nucleico específicas dentro de muestras, es importante determinar si la presencia de material genético adicional (es decir, ácidos nucleicos no diana) tendrá un efecto negativo sobre la especificidad del ensayo. En este experimento, se examinó el efecto de incluir grandes cantidades de ácido nucleico no diana, ADN o ARN, sobre la especificidad de la reacción de escisión invasiva. Los datos se examinaron para una alteración en el sitio esperado de escisión o un aumento en la degradación no específica del oligonucleótido sonda.

La Fig. 40 muestra los efectos de la adición de ácido nucleico no diana (por ejemplo, ADN genómico o ARNt) a una reacción de escisión invasiva realizada a 65º, con LiCl 150 mM en lugar del KCl en la reacción convencional. Las reacciones analizados en los carriles 1 y 2 contenían 235 y 470 ng de ADN genómico, respectivamente. Las

reacciones analizadas en los carriles 3, 4, 5 y 6 contenían 100 ng, 200 ng, 500 ng y 1 μg de ARNt, respectivamente.

El carril 7 representa una reacción de control que no contenía ácido nucleico añadido por encima de las cantidades usadas en la reacción convencional. Los resultados mostrados en la Fig. 40 demuestran que la inclusión de ácido nucleico no diana en grandes cantidades podría ralentizar visiblemente la acumulación de producto de escisión específica (aunque sin limitar la invención a ningún mecanismo particular, se cree que el ácido nucleico adicional compite por la unión de la enzima con los componentes de reacción específicos). En otros experimentos se descubrió que el efecto de añadir grandes cantidades de ácido nucleico no diana puede compensarse aumentando la enzima en la reacción. Los datos mostrados en la Fig. 40 también demuestran que por la presencia de grandes cantidades de ácido nucleico no diana no se comprometía una característica clave de la reacción de escisión invasiva, la especificidad de la detección.

Además de los datos presentados anteriormente, se realizaron reacciones de escisión invasiva con tampón

succinato a pH 5,9 en lugar del tampón MOPS usado en la reacción “convencional”; no se observaron efectos

adversos.

Los datos mostrados en las Figs. 38-40 y descritos anteriormente demuestran que la reacción de escisión invasiva puede realizarse usando una amplia diversidad de condiciones de reacción y por lo tanto es adecuada para la práctica en laboratorios clínicos.

EJEMPLO 19 - Referencia

Detección de dianas de ARN por escisión dirigida por INVASOR

Además de la necesidad clínica de detectar secuencias de ADN específicas para enfermedades infecciosas y genéticas, existe la necesidad de tecnologías que puedan detectar cuantitativamente ácidos nucleico diana que están compuestos por ARN. Por ejemplo, varios agentes virales, tales como el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tienen material genómico ARN, cuya detección cuantitativa puede usarse como una medida de la carga viral en la muestra de un paciente. Esta información puede tener un valor crítico de diagnóstico o pronóstico.

La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es la causa principal de hepatitis no A, no B (NANB) después de una transfusión en todo el mundo. Además, el VHC es el agente etiológico principal de carcinoma hepatocelular (HCC) y enfermedad hepática crónica en todo el mundo. El genoma del VHC es una molécula de ARN pequeña (9,4 kb). En estudios de transmisión de VHC por transfusión de sangre se ha descubierto que la presencia de anticuerpo contra VHC, medida en ensayos inmunológicos convencionales, no siempre se correlaciona con la infectividad de la muestra, mientras que la presencia de ARN de VHC en una muestra de sangre se correlaciona fuertemente con la infectividad. Por el contrario, los ensayos serológicos pueden permanecer negativos en individuos infectados inmunosuprimidos, mientras que el ARN de VHC puede detectarse fácilmente (Cuthbert, Clin. Microbiol. Rev. 7: 505[1994]).

La necesidad y el valor de desarrollar un ensayo basado en sondas para la detección de ARN de VHC son claros. La reacción en cadena de la polimerasa se ha usado para detectar VHC es muestras clínicas, pero han supuesto una preocupación los problemas asociados con la contaminación por traspaso de las muestras. La detección directa del ARN viral sin necesidad de realizar transcripción inversa o amplificación permitiría la eliminación de varios de los puntos en los que pueden fallar los ensayos existentes.

El genoma del virus de la hepatitis C de ARN de cadena positiva comprende varias regiones que incluyen regiones no codificantes 5’ y 3’ (es decir, regiones 5’ y 3’ no traducidas) y una región codificante de poliproteína que codifica la proteína nuclear (C), dos glucoproteínas de la cubierta (E1 y E2/NS1) y seis glucoproteínas no estructurales (NS2-NS5b). El análisis de biología molecular del genoma de VHC ha demostrado que algunas regiones del genoma están muy conversadas entre aislados, mientras que otras regiones pueden cambiar de una manera bastante rápida.

La región no codificante 5’ (NCR) es la región más conservada en el VHC. Estos análisis han permitido dividir estos

virus en seis grupos genotípicos básicos y después clasificarlos en más de una docena de subtipos (la nomenclatura y división de los genotipos del VHC está en desarrollo; véase un esquema de clasificación reciente en Altamirano y col., J. Infect. Dis. 171: 1034 (1995)).

Para desarrollar un procedimiento rápido y preciso para detectar el VHC presente en individuos infectados, se examinó la capacidad de la reacción de escisión dirigida por invasor para detectar ARN de VHC. Se usaron plásmidos que contenían ADN procedente de la región 5’ no traducida conservada de seis aislados de ARN de VHC diferentes para generar moldes para la transcripción in vitro. Las secuencias de VHC contenidas dentro de estos seis plásmidos representan los genotipos 1 (cuatro subtipos representados; 1a, 1b, 1c y 1c), 2 y 3. La nomenclatura de los genotipos de VHC usados en este documento es la de Simmonds y col., (como se describe en Altamirano y col., anteriormente). En la reacción de detección modelo descrita más adelante se usó el subtipo 1c.

a) Generación de plásmidos que contienen secuencias de VHC

Se generaron seis fragmentos de ADN obtenidos de VHC por RT-PCR usando ARN extraído de muestras de suero de donantes de sangre; estos fragmentos de PCR fueron una donación del Dr. M. Altamirano (University of British Columbia. Vancouver). Estos fragmentos de PCR representan secuencias de VHC obtenidas de los genotipos de VHC 1a, 1b, 1c, 1c, 2c y 3a. La extracción del ARN, la transcripción inversa y la PCR se usaron usando técnicas convencionales (Altamirano y col., anteriormente). En resumen, se extrajo ARN de 100 μl de suero usando isotiocianato de guanidina, lauril sarcosato sódico y fenol-cloroformo (Inchauspe y col., Hepatol. 14: 594 (1991)). La transcripción inversa se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un kit de PCR de ARN de transcriptasa inversa GeneAmp rTth (Perkin-Elmer) en presencia de un cebador antisentido externo, HCV342. La secuencia del cebador HCV342 es 5’-GGTTTTTCTTTGAGGTTTAG-3’ (SEC ID Nº 40). Después de terminar la reacción a TA, se añadieron el cebador con sentido HCV7 (5’-GCGACACTCCACCATAGAT-3’ [SEC ID Nº 41]) y magnesio y se realizó una primera PCR. Se usaron alícuotas de los productos de la primera PCR en una segunda PCR (anidada) en presencia de cebadores HCV46 [5’-CTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’ (SEC ID Nº 42]) y HCV308 [5’-GCACGGT CTACGAGACCTC-3’ [SEC ID Nº 43]). Los PCR produjeron un producto de 281 pb que se corresponde a una región 5’ no codificante (NCR)

conservada de VHC entre las posiciones -284 y -4 del genoma de VHC (Altamirano y col., anteriormente).

Los seis fragmentos de PCR de 281 pb se usaron directamente para la clonación o se sometieron a una etapa de

amplificación adicional usando una PCR de 50 μl que comprendía aproximadamente 100 fmol de ADN, los cebadores de HCV46 y HCV308 a 0,1 μM, 100 μM de los cuatro dNTP y 2,5 unidades de ADN polimerasa de Taq en un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM y Tween-20 al 0,1%. Las PCR se sometieron a ciclos 25 veces a 96ºC durante 45 s, 55 ºC durante 45 s y 72 ºC durante 1 min. Se usaron dos microlitros de las muestras de ADN originales o los productos de PCR reamplificados para clonación en el vector pT7Blue T lineal (Novagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de ligar los productos de PCR al vector pT7blue T, la mezcla de reacción de ligamiento se usó para transformar células JM109 competentes (Promega). Se seleccionaron clones que contenían el vector pT7blue T con un inserto por la presencia de colonias que tenían un color blanco en placas LB que contenían 40 μg/ml de X-Gal, 40 μg/ml de IPTG y 50 μg/ml de ampicilina. Se seleccionaron cuatro colonias para cada muestra de PCR y se cultivaron durante una noche en 2 ml de medio LB que contenía 50 μg/ml de carbenicilina. Se aisló ADN plasmídico usando el siguiente protocolo de minipreparación alcalina. Se recogieron células de 1,5 mm del cultivo de una noche por centrifugación durante 2 min

en una microcentrífuga (14K rpm); se desechó el sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió en 50 μl de tampón TE con 10 μg/ml de ENASA A (Pharmacia). Se añadieron cien microlitros de una solución que contenía NaOH, SDS al 1% y las células se lisaron durante 2 min. El lisado se mezcló suavemente con 100 μl de acetato

potásico 1,32 M, pH 4,8 y la mezcla se centrifugó durante 4 min en una microcentrífuga (14K rpm); se desechó el

sedimento que comprendía restos celulares. El ADN plasmídico se precipitó en el sobrenadante con 200 μl de etanol

y se sedimentó por centrifugación en una microcentrífuga (14K rpm). El sedimento de ADN se secó al aire durante 15 min y después se redisolvió en 50 μl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,8, EDTA 1 mM).

b) Reamplificación de clones de VHC para añadir el promotor del fago T7 para posterior transcripción in vitro

Para asegurar que el producto de ARN de la transcripción tenía un extremo 3’ discreto, fue necesario crear moldes de transcripción lineales que se detuvieran al final de la secuencia del VHC. Estos fragmentos se produjeron convenientemente usando la PCR para reamplificar el segmento del plásmido que contenía la secuencia promotora del fago y el inserto de VHC. Para estos estudios, el clon de VHC de tipo _1C se reamplificó usando un cebador que hibrida con la secuencia del promotor de T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEC ID Nº 44; "el cebador del promotor de T7") (Novagen) en combinación con el cebador específico para VHC 3’ terminal HCV308 (SEC ID Nº 43). Para estas reacciones se reamplificó 1 μl de ADN plasmídico (de aproximadamente 10 a 100 ng) en una PCR de 200 μl usando los cebadores de T7 y HCV308 como se ha descrito anteriormente con la excepción de que se emplearon 30 ciclos de amplificación. El amplicón resultante tenía una longitud de 345 pb. Después de la amplificación, la mezcla de PCR se transfirió a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 ml, la mezcla se llevó a una concentración final de NH4OAc 2M y los productos se precipitaron por la adición de un volumen de isopropanol al 100%. Después de una incubación de 10 min a temperatura ambiente, los precipitados se recogieron por

centrifugación, se lavaron una vez con etanol al 80% y se secaron al vacío. El material recogido se disolvió en 100 μl

de agua destilada sin nucleasa (Promega).

Se produjeron segmentos de ARN a partir de este amplicón por transcripción in vitro usando el Sistema de Producción de ARN a Gran Escala RiboMAX TM (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando 5,3 g del amplicón que se ha descrito anteriormente en una reacción de 100 μl. La reacción de transcripción se incubó durante 3,75 horas, después de lo cual el molde de ADN se destruyó mediante la adición de 5-6 μl de ADNasa sin RNasa RQ1 (1 unidad/μl) de acuerdo con las instrucciones del kit RiboMAXTM. La reacción se extrajo dos veces con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (50:48:2) y la fase acuosa se transfirió a un tubo de

microcentrífuga nuevo. Después, el ARN se recogió mediante la adición de 10 μl de NH4OAc 3M, pH 5,2 y 110 μl de

isopropanol al 100%. Después de una incubación a 4 ºC, de 5 min a temperatura ambiente, el precipitado se recogió por centrifugación, se lavó una vez con etanol al 80% y se secó al vacío. La secuencia del transcrito de ARN resultante (transcrito de HCV1.1) se indica en la SEC ID Nº 45.

c) Detección del transcrito de HCV1.1 en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR

Se ensayó la detección del transcrito de HCV1.1 en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR usando un oligonucleótido sonda específico para VHC (5’-CCGGTCGTCCTGGCAATXCC-3’ [SEC ID Nº 46]); X indica la presencia de un colorante de fluoresceína en un enlace abásico) y un oligonucleótido INVASOR específico de VHC (5’-GTTTATCCAAGAAAGGACCCGGTC-3’ [SEC ID Nº 47] que produce una escisión invasiva de 6 nucleótidos de la sonda.

Cada 10 μl de mezcla de reacción comprendían 5 pmol del oligonucleótido sonda (SEC ID Nº 46) y 10 pmol del oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 47) en un tampón de MOPS 10 mM, pH 7,5 con KCl 50 mM, MnCl2 4 mM, un 0,05% de Tween-20 y Nonidet-P40 y 7,8 unidades de inhibidor de ribonucleasa RNasin® (Promega). Los agentes de escisión empleados fueron CLEAVASE A/G (usada a 5,3 ng/10 μl de reacción) o DNAPTth (usada a 5 unidades de polimerasa/10 μl de reacción). La cantidad de diana de ARN se varió como se indica a continuación. Cuando se indica el tratamiento con RNasa, los ARN diana se pre-trataron con 10 μg de RNasa A (Sigma) a 37ºC durante 30 min para demostrar que la detección era específica para el ARN en la reacción y no se debía a la presencia de ningún molde de ARN residual procedente de la reacción de transcripción. Se usaron directamente alícuotas tratadas con RNasa del ARN de VHC sin purificación intermedia.

Para cada reacción, los ARN diana se suspendieron en las soluciones de reacción que se han descrito anteriormente, pero que carecían del agente de escisión y el MnCl2 para un volumen final de 10 μl, con el INVASOR y la sonda a las concentraciones indicadas anteriormente. Las reacciones se calentaron a 46ºC y las reacciones se iniciaron por medio de la adición de una mezcla de la enzima apropiada con MnCl2. Después de incubación durante

30 min a 46ºC, las reacciones se detuvieron por la adición de 8 μl de formamida al 85%, EDTA 10 mM y violeta de

metilo al 0,02% (tampón de carga de violeta de metilo). Después, las muestras se separaron por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15% (reticulado 19:1), que contenía urea 7 M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. . Después de la electroforesis, los productos de reacción marcados se visualizaron usando el Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi), con la exploración del aparato de formación imágenes resultante mostrada en la Fig. 41.

En la Fig. 41, las muestras analizadas en los carriles 1-4 contenían 1 pmol de diana de ARN, las reacciones mostradas en los carriles 5-8 contenían 100 fmol de la diana de ARN y las reacciones mostradas en los carriles 9-12 contenían 10 fmol de diana de ARN. Todos los carriles con números impares representan reacciones realizadas usando enzima CLEAVASE A/G y todos los carriles con números pares representan reacciones realizadas usando DNAPTth. Las reacciones analizadas en los carriles 1, 2, 5, 6, 9 y 10 contenían ARN que se había predigerido con RNasa A. Estos datos demuestran que la reacción de escisión invasiva detecta eficazmente dianas de ARN y además, la ausencia de cualquier señal de escisión específica en las muestras tratadas con RNasa confirma que el producto de escisión específica observado en los otros carriles depende de la presencia de ARN de entrada.

EJEMPLO 20 - Referencia

El destino del ARN diana en la reacción de escisión dirigida por INVASOR

En este ejemplo, se examinó el destino de la diana de ARN en la reacción de escisión dirigida por INVASOR. Como se ha mostrado anteriormente en el Ej. 1D, cuando se hibrida ARN con oligonucleótidos de ADN, las nucleasas 5’ asociadas con ADN polimerasas pueden usarse para escindir los ARN; esta escisión puede reprimirse cuando el

brazo 5’ es largo o cuando está muy estructurado [Lyamichev y col., Science 260: 778 [1993] y la Patente de

Estados Unidos Nº 5.422.253]. En este experimento, se examinó el grado en el que se escindiría la diana de ARN por los agentes de escisión cuando se hibridan con los oligonucleótidos de detección (es decir, los oligonucleótidos sonda e INVASOR) usando reacciones similares a las descritas en el Ejemplo 20, realizadas usando ARN marcado con fluoresceína como una diana.

Se realizaron reacciones de transcripción como se describe en el Ejemplo 19 con la excepción de que el 2% del UTP en la reacción se reemplazó por fluoresceína-12-UTP (Boehringer Mannheim) y se usaron 5,3 μg del amplicón en una reacción de 100 μl. La reacción de transcripción se incubó durante 2,5 horas y, después de esto, el molde de ADN se destruyó por la adición de 5-6 μl de ADNasa sin RNasa RQ1 (1 unidad/μl) de acuerdo con las instrucciones del kit RiboMAXTM. La extracción orgánica se omitió y el ARN se recogió por la adición de 10 μl de NaOAc 3 M, pH 5,2 y 110 μl de isopropanol al 100%. . Después de una incubación a 4 ºC, de 5 min a temperatura ambiente, el precipitado se recogió por centrifugación, se lavó una vez con etanol al 80% y se secó al vacío. El ARN resultante

se disolvió en 100 μl de agua sin nucleasa. El 50% de la muestra se purificó por electroforesis a través de un gel de

poliacrilamida desnaturalizante al 8% (reticulado 19:1), que contenía urea 7 M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. El corte de gel que contenía el material de longitud completa se escindió y el ARN se eluyó humedeciendo el corte durante una noche a 4ºC en 200 μl de Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM y NaOAc 0,3 M. El ARN se precipitó después mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Después de la incubación a 20ºC durante 30 min, los precipitados se recuperaron por centrifugación, se lavaron una vez con etanol al 80% y se

secaron al vacío. El ARN se disolvió en 25 μl de agua sin nucleasa y después se cuantificó por absorbancia UV a

260 nm.

Se incubaron muestras de la diana de ARN purificada durante 5 ó 30 min en reacciones que duplicaron las reacciones por invasor con CLEAVASE A/G y DNAPTth descritas en el Ejemplo 20 con la excepción de que las reacciones carecían de los oligonucleótidos sonda e INVASOR. El análisis posterior de los productos demostró que el ARN era muy estable, con un fondo muy ligero de degradación no específica, que aparecía como un fondo gris en el carril de gel. El fondo no dependía de la presencia de enzima en la reacción.

Se realizaron reacciones de detección de INVASOR usando la diana de ARN purificada usando el par de sonda/INVASOR descrito en el Ejemplo 19 (SEC ID Nº 46 y 47). Cada reacción incluía 500 fmol del ARN diana, 5 pmol de la sonda marcada con fluoresceína y 10 pmol del oligonucleótido invasor en un tampón de MOPS 10 mM, pH 7,5 con LiCl 150 mM, MnCl2 4 mM, un 0,05% de Tween-20 y de Nonidet-P40 y 39 unidades de RNAsin® (Promega). Estos componentes se combinaron y calentaron a 50ºC y las reacciones se iniciaron por la adición de 53 ng de CLEAVASE A/G o 5 unidades de polimerasa de DNAPTth. El volumen de reacción final fue 10 μl. Después de 5 min a 50ºC, se retiraron alícuotas de 5 μl de cada reacción a tubos que contenían 4 μl de formamida al 95%,

EDTA 10 mM y violeta de metilo al 0,02%. La alícuota restante recibió una gota de barrera contra evaporación

CHILLOUT y se incubó durante 25 min adicionales. Estas reacciones se detuvieron después por la adición de 4 μl de

la solución de formamida anterior. Los productos de estas reacciones se separaron por electroforesis a través de geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 20% separados (reticulados 19:1), que contenían urea 7 M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Después de la electroforesis, los productos de reacción marcados se visualizaron usando el Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi), con las exploraciones del aparato de formación de imágenes resultantes mostradas en las Figs 42A (reacciones de 5 min) y 42B (reacciones de 30 min).

En la Fig. 53, el ARN diana se observa muy cerca de la parte superior de cada carril, mientras que la sonda marcada y sus productos de escisión se ven justo por debajo de la mitad de cada panel. Se usó el Analizador de Imágenes FMBIO-100 para cuantificar la señal de fluorescencia en las bandas de sonda. En cada panel, el carril 1 contiene productos de reacciones realizadas en ausencia de un agente de escisión, el carril 2 contiene productos de reacciones realizadas usando CLEAVASE A/G y el carril 3 contiene productos de reacciones realizadas usando DNAPTth.

La cuantificación de la señal de fluorescencia en las bandas de sonda reveló que después de una incubación de 5 min, se escindió el 12% o 300 fmol de la sonda por la CLEAVASE A/G y se escindió un 29% o 700 fmol por la DNAPTth. Después de una incubación de 30 min, CLEAVASE A/G había escindido un 32% de las moléculas de sonda y DNAPTth había escindido el 70% de las moléculas de sonda. (Las imágenes mostradas en las Figs. 42A y 42B se imprimieron con la intensidad ajustada para mostrar la pequeña cantidad de fondo de la degradación de ARN, de forma que las bandas que contienen señales fuertes se saturan y por lo tanto, estas imágenes no reflejan de forma precisa las diferencias en la fluorescencia medida.)

Los datos mostrados en la Fig. 42 demuestran claramente que, en condiciones de escisión invasiva, las moléculas de ARN son suficientemente estables como para detectarse como una diana y que cada molécula de ARN puede soportar muchas rondas de escisión de sonda.

EJEMPLO 21 - Referencia

Titulación de ARN diana en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR

Una de las ventajas principales del ensayo de escisión dirigida por INVASOR como un medio para detectar la presencia de ácidos nucleicos diana específicos es la correlación entre la cantidad de producto de escisión generado en una cantidad establecida de tiempo y la cantidad del ácido nucleico de interés presente en la reacción. Las ventajas de la detección cuantitativa de secuencias de ARN se describieron en el Ejemplo19. En este ejemplo, se demuestra la naturaleza cuantitativa del ensayo de detección por medio del uso de diversas cantidades de material de partida diana. Además de demostrar la correlación entre las cantidades de diana de entrada y producto de escisión de salida, estos datos demuestran gráficamente el grado en el que puede reciclarse la diana de ARN en este ensayo.

La diana de ARN usada en estas reacciones fue el material marcado con fluoresceína descrito en el Ejemplo 20 (es decir, la SEC ID Nº 45). Como no se conocía la eficacia de incorporación de la fluoresceína-12-UTP por la ARN polimerasa de T7, la concentración del ARN se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm, no por la intensidad de fluorescencia. Cada reacción comprendía 5 pmol de la sonda marcada con fluoresceína (SEC ID Nº 46) y 10 pmol del oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 47) en un tampón de MOPS 10 mM, pH 7,5 con LiCl 150 mM, MnCl2 4 mM, 0,05% de Tween-20 y de Nonidet-P40 y 39 unidades de RNAsin® (Promega). La cantidad de ARN diana varió de 1 a 100 fmol, como se indica más adelante. Estos componentes se combinaron, se cubrieron con barrera contra evaporación CHILLOUT y se calentaron a 50ºC; las reacciones se iniciaron por la adición de 53 ng de Cleavase® A/G o 5 unidades de polimerasa de DNAPTth, hasta un volumen de reacción final de 10 μl. Después de 30 minutos a 50 ºC, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 10 mM y violeta de

metilo al 0,02%. Los marcadores que no habían reaccionado en los carriles 1 y 2 se diluyeron en el mismo volumen

total (18 μl). Las muestras se calentaron a 90ºC durante 1 minuto y 2,5 μl de cada una de estas reacciones se

separaron por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (reticulación 19:1) con urea 7 M en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM y los productos de reacción marcados se visualizaron usando el Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi), con las exploraciones del aparato de formación de imágenes resultantes mostradas en la Fig. 43.

En la Fig. 43, los carriles 1 y 2 muestran 5 pmol de sonda no cortada y 500 fmol de ARN no tratado, respectivamente. La sonda es la señal muy oscura cerca de la parte media del panel, mientras que el ARN es la línea fina cercana a la parte superior del panel. Estos ARN se transcribieron con una sustitución del 2% de UTP natural por fluoresceína-12-UTP en la reacción de transcripción. El transcrito resultante contiene 74 restos de U, que darían una media de 1,5 marcadores de fluoresceína por molécula. Con un décimo de la cantidad molar de ARN cargado en el carril 2, la señal del carril 2 debe ser aproximadamente un séptimo (0,15X) de la intensidad de fluorescencia de la sonda en el carril 1. Las mediciones indicaron que la intensidad estaba más próxima a un cuadragésimo, indicando una eficacia de incorporación de marcador de aproximadamente un 17%. Como la concentración de ARN se verificó por la medición de A260, esto no altera las observaciones experimentales indicadas más adelante, pero debe señalarse que la señal del ARN y las sondas no refleja de forma precisa las cantidades relativas en las reacciones.

Las reacciones analizadas en los carriles 3 a 7 contenían 1, 5, 10, 50 y 100 fmol de diana, respectivamente, realizándose la escisión de la sonda por Cleavase® A/G. Las reacciones analizadas en los carriles 8 a 12 repitieron la misma serie de cantidades diana, realizándose la escisión de la sonda por DNAPTth. Las casillas que se observan rodeando las bandas de producto muestran el área de la exploración en la que se midió la fluorescencia para cada reacción. El número de unidades de fluorescencia detectadas dentro de cada casilla se indica debajo de cada casilla; también se midió la fluorescencia de fondo.

Comparando la fluorescencia detectada en cada carril se puede ver que la cantidad de producto formado en estas reacciones de 30 minutos puede correlacionarse con la cantidad de material diana. La acumulación de producto en estas condiciones aumenta ligeramente cuando se usa DNAPTth como el agente de escisión, pero permanece la correlación con la cantidad de diana presente. Esto demuestra que el ensayo de INVASOR puede usarse como medio para medir la cantidad de ARN diana dentro de una muestra.

La comparación de la intensidad de fluorescencia del ARN de entrada con la del producto escindido muestra que el ensayo de escisión dirigida por INVASOR crea una señal en exceso con respecto a la cantidad de diana, de forma que la señal visible como sonda escindida es bastante más intensa que la que representa el ARN diana. Esto confirma adicionalmente los resultados descritos en el Ejemplo 20, en el que se demostró que cada molécula de ARN podría usarse muchas veces.

EJEMPLO 22 - Referencia

Detección de ADN por inversión de carga

La detección de dianas específicas se consigue en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR por medio de la escisión del oligonucleótido sonda. Además de los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores, la sonda escindida puede separarse de la sonda no escindida usando la técnica de inversión de carga descrita más adelante. Esta técnica de separación novedosa está relacionada con la observación de que aductos cargados positivamente pueden afectar al comportamiento electroforético de pequeños oligonucleótidos debido a que la carga del aducto es significativamente relativa con respecto a la carga de todo el complejo. En la bibliografía se han presentado observaciones de movilidad aberrante debida a aductos cargados, pero en todos los casos encontrados, las aplicaciones seguidas por otros científicos han implicado la obtención de nucleótidos de mayor tamaño por extensión enzimática. Según se añaden nucleótidos cargados negativamente, se reduce hasta un nivel insignificante la influencia positiva del aducto Como resultado, los efectos de los aductos cargados positivamente se han reducido y han recibido una atención infinitesimal en la bibliografía existente.

Este efecto observado es de particular utilidad en ensayos basados en la escisión de moléculas de ADN. Cuando un oligonucleótido se acorta por medio de la acción de una CLEAVASE® u otro agente de escisión, la carga positiva se puede preparar para no solamente disminuir significativamente la carga neta negativa, sino para de hecho anularla, “invirtiendo” de forma eficaz la carga neta de la entidad marcada. Esta inversión de carga permite que los productos de escisión específica de diana se dividan de la sonda no escindida mediante medios extremadamente simples. Por ejemplo, los productos de escisión se pueden preparar para que migren hacia un electrodo negativo colocado en cualquier punto en un recipiente de reacción, para detección focalizada sin electrofóresis basada en gel. Cuando se usa un gel en placa, los pocillos de muestra se pueden colocar en el centro del gel, de tal forma que se puede observar que las sondas escindidas y no escindidas migran en direcciones opuestas. Como alternativa se puede usar un gel vertical tradicional, pero con los electrodos invertidos con respecto a los geles de ADN habituales (es decir, el electrodo positivo en la parte superior y el electrodo negativo en la parte inferior) de tal forma que las moléculas escindidas entran en el gel, mientras que las no escindidas se dispersan al depósito superior de tampón de electroforesis.

Una ventaja adicional de este tipo de lectura es que la naturaleza absoluta de la división de productos de sustratos significa que puede suministrarse una abundancia de sonda no escindida para dirigir la etapa de hibridación del ensayo basado en sonda, pero la sonda no consumida puede restarse del resultado para reducir el fondo.

Mediante el uso de múltiples aductos cargados positivamente se pueden construir moléculas sintéticas con suficiente modificación para que la cadena cargada normalmente de forma negativa se haga prácticamente neutra. Cuando se construye de este modo, la presencia o ausencia de un único grupo fosfato puede significar la diferencia entre una carga neta negativa o una positiva neta. Esta observación tiene utilidad particular cuando un objetivo es diferenciar entre fragmentos de ADN generados enzimáticamente, que carecen de un fosfato 3’ y los productos de degradación térmica, que conservan un fosfato 3’ (y, por lo tanto, dos cargas negativas adicionales).

a) Caracterización de los productos de descomposición térmica de oligonucleótidos de ADN

La degradación térmica de sondas de ADN produce un alto fondo que puede oscurecer las señales generadas por escisión enzimática específica, reduciendo la relación entre señal y ruido. Para entender mejor la naturaleza de los productos de degradación térmica del ADN se incubaron los oligonucleótidos marcados con tetraclorofluoresceína (TET) 5’ 78 (SEC ID Nº: 59) y 79 (SEC ID Nº: 60) (100 pmol de cada uno) en 50 μl de NaCO3 10 mM (pH 10,6), NaCl 50 mM a 90ºC durante 4 horas. Para impedir la evaporación de las muestras, la mezcla de reacción se cubrió con 50 μl de cera líquida de CHILLOUT Las reacciones después se dividieron en dos alícuotas iguales (A y B). La alícuota A se mezcló con 25 μl de tampón de carga con violeta de metilo y la Alícuota B se desfosforiló por la adición de 2,5 μl de MgCl2 100 mM y 1 μl de 1 unidad/μl de Fosfatasa Alcalina Intestinal de Ternero (CIAP) (Promega), con incubación a 37ºC durante 30 min, después de lo cual se añadieron 25 μl de tampón de carga con violeta de metilo.

Un microlitro de cada muestra se separó por electroforesis a través de un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 12% y se obtuvieron imágenes como se describe en el Ejemplo 21; con el Analizador de Imágenes FMBIO se usó un filtro de 585 nm. La exploración del aparato de formación de imágenes resultante se muestra en la Fig. 44.

En la Fig. 44, los carriles 1-3 contienen el oligonucleótido marcado con TET 78 y los carriles 4-6 contienen el oligonucleótido marcado con TET 79. Los carriles 1 y 4 contienen productos de reacciones que no se trataron con calor. Los carriles 2 y 5 contienen productos de reacciones que se trataron con calor y los carriles 3 y 6 contienen productos de reacciones que se trataron con calor y se sometieron a tratamiento con fosfatasa.

Como se muestra en la Fig. 44, el tratamiento térmico produce una descomposición significativa del ADN marcado con TET 5’, generando una escala de productos de degradación (Fig. 44, carriles 2, 3, 5 y 6). Las intensidades de las bandas se correlacionan con la colocación de las bases purina y pirimidina en las secuencias oligonucleotídicas, indicando que puede producirse hidrólisis de la estructura principal por medio de la formación de productos intermedios abásicos que tienen velocidades más rápidas para purinas que para pirimidinas (Lindahl y Karlström, Biochem, 12:5151 [1973]).

La desfosforilación reduce la movilidad de todos los productos generados por el procedimiento de degradación térmica, observándose el efecto más pronunciado en los productos de menor tamaño (Fig. 44, carriles 3 y 6). Esto demuestra que los productos degradados térmicamente poseen un grupo fosforilo terminal en el extremo 3’ que puede retirarse por desfosforilación con CIAP. La eliminación del grupo fosforilo reduce la carga negativa total por 2. Por lo tanto, los productos más cortos que tienen un pequeño número de cargas negativas están influenciados en una mayor medida después de la eliminación de dos cargas. Esto conduce a un mayor cambio de movilidad en los productos más cortos que el observado en las especies de mayor tamaño.

El hecho de que la mayoría de los productos de ADN degradados térmicamente contenga grupos fosfatos en el

extremo 3’ y productos generados por la enzima CLEAVASE no permitió el desarrollo de procedimientos de

aislamiento sencillos para productos generados en el ensayo de escisión dirigida por INVASOR. Las dos cargas adicionales encontradas en los productos de descomposición térmica no existen en los productos de escisión específica. Por lo tanto, si se diseñan ensayos que producen productos específicos que contienen una carga neta positiva de uno o dos, entonces los productos de descomposición térmica similares serán negativos o neutros. La diferencia puede usarse para aislar productos específicos por procedimientos de carga inversa como se muestra más adelante.

b) La desfosforilación de oligonucleótidos amino-modificados cortos puede invertir la carga neta del producto marcado

Para demostrar cómo pueden transformarse oligonucleótidos desde compuestos con una carga neta negativa a compuestos con una carga neta positiva, se sintetizaron los cuatro oligonucleótidos amino-modificados cortos indicados 70, 74, 75 y 76 y mostrados en las Figs. 45-47 (la Fig. 45 muestra tanto el oligonucleótido 70 como el 74). Los cuatro oligonucleótidos modificados poseen colorantes Cy-3 situados en el extremo 5’ que están cargados positivamente de forma individual en las condiciones de reacción y aislamiento descritas en este ejemplo. Los compuestos 70 y 74 contienen dos timidinas amino modificadas que, en condiciones de reacción, presentan grupos R-NH3+ cargados positivamente unidos a la posición C5 a través de un engarce C10 o C6, respectivamente. Como los compuestos 70 y 74 están fosforilados en el extremo 3’, están constituidos por cuatro cargas negativas y tres cargas positivas. El compuesto 75 difiere de 74 en que el fosfato de timidina amino-modificada C6 interna de 74 se reemplaza por un metil fosfonato de timidina. La estructura principal de fosfonato no está cargada y por lo tanto hay un total de tres cargas negativas en el compuesto 75. Esto proporciona al compuesto 75 una carga neta negativa. El compuesto 76 difiere de 70 en que la timidina amino-modificada interna se reemplaza por un fosfonato de citosina interno. El pKa del nitrógeno N3 de citosina puede ser de 4 a 7. De esta manera, las cargas netas de este compuesto pueden ser de -1 a 0 dependiendo del pH de la solución. Para la simplicidad del análisis, a cada grupo se le asigna un número entero de cargas, aunque se observa que, dependiendo del pKa de cada grupo químico y el pH ambiental, una carga real puede diferir del número entero asignado. Se supone que esta diferencia no es significativa en el intervalo de pH usados en las reacciones enzimáticas estudiadas en el presente documento.

La desfosforilación de estos compuestos o la eliminación del grupo fosforilo terminal del extremo 3’ tiene como resultado la eliminación de dos cargas negativas y genera productos que tienen una carga neta positiva de uno. En este experimento se usó el procedimiento de enfoque isoeléctrico (IEF) para demostrar un cambio de una carga neta negativa a una positiva para los sustratos descritos durante la desfosforilación.

Los sustratos 70, 74, 75 y 76 se sintetizaron por químicas de fosforamidita convencionales y se desprotegieron durante 24 horas a 22ºC en solución acuosa de hidróxido amónico 14 M, después de lo cual el disolvente se retiró al vacío. Los polvos secos se resuspendieron en 200 μl de H2O y se filtraron a través de filtros de 0,2 μm. La concentración de las soluciones madre se estimó por absorbancia UV a 261 nm de muestras diluidas 200 veces en H2O usando un espectrofotómetro (Spectronic Genesys 2, Milton Roy, Rochester, NY).

La desfosforilación de los compuestos 70 y74, 75 y 76 se realizó tratando 10 μl de soluciones madre brutas (que variaban en concentración de aproximadamente 0,5 a 2 mM) con 2 unidades de CIAP en 100 μl de tampón CIAP

(Promega) a 37ºC durante 1 hora. Las reacciones se calentaron después a 75ºC durante 15 min para inactivar el

CIAP. Para proporcionar una mayor claridad, los compuestos desfosforilados se denominan “dp”. Por ejemplo,

después de la desfosforilación, el sustrato 70 se convierte en 70dp.

Para preparar muestras para experimentos de IEF, la concentración de las soluciones madre de sustrato y producto desfosforilado se ajustaron a una absorbancia uniforme de 8,5 x 10−3 a 532 nm por dilución con agua. Se analizaron dos microlitros de cada muestra por IEF usando una unidad de electroforesis PhastSystem (Pharmacia) y medio PhastGel IEF 3-9 (Pharmacia) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La separación se realizó a 15ºC con el siguiente programa: pre-separación; 2.000 V, 2,5 mA, 3,5 W, 75 Vh; carga; 200 V, 2,5 mA, 3,5 W, 15 Vh; separación;

2.000 V; 2,5 mA; 3,5 W, 130 Vh. Después de la separación, las muestras se visualizaron usando el Analizador de Imágenes FMBIO (Hitachi) equipado con un filtro de 585 nm. La exploración del aparato de formación de imágenes resultante se muestra en la Fig. 48.

La Fig. 48 muestra resultados de la separación por IEF de sustratos 70, 74, 75 y 76 y sus productos desfosforilados. La flecha donde dice “Posición de Carga de Muestra” indica una línea de carga, el signo “+” muestra la posición del electrodo positivo y el signo “-” indica la posición del electrodo negativo.

Los resultados mostrados en la Fig. 48 demuestran que los sustratos 70, 74, 75 y 76 migraron hacia el electrodo positivo, mientras que los productos desfosforilados 70dp, 74dp, 75dp y 76dp migraron hacia el electrodo negativo. Las diferencias observadas en la dirección de la movilidad estaban de acuerdo con la carga neta predicha de los estratos (menos uno) y los productos (más uno). Pequeñas perturbaciones en las movilidades de los compuestos fosforilados indican que los pI globales varían. . Esto también ocurría en el caso de los compuestos desfosforilados. La presencia de la citosina en 76dp, por ejemplo, desplazó este compuesto adicionalmente hacia el electrodo negativo, lo cual indicaba un mayor pI global con respecto a los otros compuestos desfosforilados. Es importante tener en cuenta que pueden obtenerse cargas positivas adicionales usando una combinación de bases aminomodificadas naturales (70dp y 74dp) junto con puentes metilfosfonato no cargados (productos 75dp y 76dp).

Los resultados mostrados anteriormente demuestran que la eliminación de un solo grupo fosfato puede cambiar la carga neta de un oligonucleótido para producir una inversión en el campo eléctrico, permitiendo una fácil separación de los productos y que la composición de bases precisa de los oligonucleótidos afecta a la movilidad absoluta pero no al efecto de inversión de carga.

EJEMPLO 23 - Referencia

Detección de productos de escisión específica en la reacción de escisión dirigida por INVASOR por inversión de carga

En este ejemplo se demostró la capacidad de aislar productos generados en el ensayo de escisión dirigida por invasor de todos los demás ácidos nucleicos presentes en la combinación de reacción usando inversión de carga. Este experimento utilizó el siguiente oligonucleótido marcado con Cy3: 5’-Cy3-AminoT-AminoT-CTTTTCACCAGCGAGACGGG-3’ (SEC ID Nº 50 denominada "oligo 61 "). El oligonucleótido 61 se diseñó para liberar después de la escisión un producto marcado con una carga neta positiva. Para ensayar si un producto marcado en el extremo 5’ con carga neta positiva se reconocería o no por las enzimas Cleavase® en el formato de ensayo de escisión dirigida por INVASOR, se sintetizaron químicamente el oligonucleótido sonda 61 (SEC ID Nº 50) y el oligonucleótido invasor 67 (SEC ID Nº 51) en un sintetizador de ADN (ABI 391) usando química de fosforamidita convencional y reactivos obtenidos en Glen Research (Sterling, VA).

Cada reacción de ensayo comprendía 100 fmol de ADN de hélice única de M13mp18, 10 pmol de los oligonucleótidos sonda (SEC ID Nº 50) e INVASOR (SEC ID Nº 51) y 20 unidades de CLEAVASE A/G en 10 μl de solución MOPS 10 mM, pH 7,4 con KCl 100 mM. Las muestras se cubrieron con aceite mineral para impedir la

evaporación. Las muestras se llevaron a 50ºC, 55ºC, 60ºC o 65ºC y la escisión se inició por la adición de 1 μl de

MnCl2 40 mM. Se dejó que las reacciones continuaran durante 25 minutos y después se terminaron por la adición de

10 μl de formamida al 95% que contenía EDTA 20 mM y violeta de metilo al 0,02%. El experimento de control

negativo carecía del M13mp18 diana y se realizó a 60ºC. Cinco microlitros de cada reacción se cargaron en pocillos separados de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (reticulado 29:1) con urea 8 M en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 8,3) y EDTA 1,4 mM. Se aplicó un campo eléctrico de 20 vatios durante 30 minutos, con los electrodos orientados como se indica en la Fig. 49B (es decir, en orientación inversa). Los productos de estas reacciones se visualizaron usando el aparato de formación de imágenes fluorescentes FMBIO y la exploración del aparato de formación de imágenes resultante se muestra en la Fig.49B.

La Fig. 49A proporciona una ilustración esquemática que muestra un alineamiento del INVASOR (SEC ID Nº 50) y la sonda (SEC ID Nº 51) a lo largo del ADN de M13mp 18; sólo se muestran 53 bases de la secuencia de M13mp18 (SEC ID Nº 52). La secuencia del oligonucleótido INVASOR se presenta debajo de la diana de M13mp18 y se usa una flecha encima de la secuencia de M13mp18 para indicar la posición del INVASOR con respecto a la sonda y la diana. Como se muestra en la Fig. 49A, los oligonucleótidos INVASOR y sonda comparten una región de solapamiento de 2 bases.

En la Fig. 49B, los carriles 1-6 contienen reacciones realizadas a 50ºC, 55ºC, 60ºC y 65ºC, respectivamente; el carril 5 contenía la reacción de control (que carecía de diana). En la Fig. 49B, los productos de escisión se ven como bandas oscuras en la mitad superior del panel; la banda inferior observada débil aparece en proporción a la cantidad de producto primario producido y, aunque no limita la invención a ningún mecanismo particular, puede representar la escisión de un nucleótido al interior del dúplex. La sonda no escindida no entra en el gel y por lo tanto no es visible. El carril de control no mostró ninguna señal detectable sobre el fondo (carril 5). Como es de esperar en una reacción de escisión invasiva, la velocidad de acumulación de producto de escisión específica era dependiente de la temperatura. Usando estos oligonucleótidos y diana particulares, la máxima velocidad de acumulación de producto se observó a 55ºC (carril 2) y se observó muy poco producto a 65ºC (carril 4).

Cuando se incuban durante periodos prolongados a alta temperatura, las sondas de ADN pueden descomponerse de forma no específica (es decir, pueden experimentar degradación térmica) y los fragmentos resultantes aportan un fondo de interferencia al análisis. Los productos de esta descomposición térmica se distribuyen desde nucleótidos individuales hasta la sonda de longitud completa. En este experimento se examinó si la capacidad de separación basada en la carga de productos de escisión (es decir, inversión de carga) permitiría la separación sensible de los productos específicos de escisión dependiente de diana de fragmentos de sonda generados por degradación térmica.

Para ensayar el límite de sensibilidad de este procedimiento de detección, se diluyó en serie el ADN de M13mp18 diana diez veces con respecto al intervalo de 1 fmol a 1 amol. Los oligonucleótidos INVASOR y sonda fueron los descritos anteriormente (es decir, SEC ID Nº 50 y 51). Las reacciones de escisión invasiva se realizaron como se ha descrito anteriormente con las siguientes modificaciones: las reacciones se realizaron a 55ºC, se usó KGlu 250 mM

o 100 mM en lugar de KCl 100 mM y sólo se añadió 1 pmol del oligonucleótido INVASOR. Las reacciones se iniciaron como se ha descrito anteriormente y se dejaron continuar durante 12,5 horas. También se realizó una reacción de control negativo que carecía de ADN diana de M13m18 añadido. Las reacciones se terminaron por la

adición de 10 μl de formamida al 95% que contenía EDTA a 20 mM y violeta de metilo al 0,02% y 5 μl de estas

mezclas se sometieron a electroforesis y se visualizaron como se ha descrito anteriormente. La exploración del aparato de formación de imágenes resultante se muestra en la Fig. 50.

En la Fig. 50, el carril 1 contiene el control negativo; los carriles 2-5 contienen reacciones realizadas usando KGlu 100 mM; y los carriles 6-9 contienen reacciones realizadas usando KGlu 250 mM. Las reacciones separadas en los carriles 2 y 6 contenían 1 fmol de ADN diana; las de los carriles 3 y 7 contenían 100 amol de diana; las de los carriles 4 y 8 contenían 10 amol de diana y las de los carriles 5 y 9 contenían 1 amol de diana. Los resultados mostrados en la Fig. 50 demuestran que el límite de detección usando inversión de carga para detectar la producción de productos de escisión específica en una reacción de escisión invasiva es de 1 atomol o inferior o de aproximadamente 6,02 x 105 moléculas diana. No se observó ninguna señal detectable en el carril de control, lo que indica que los productos de hidrólisis no específica u otros productos de degradación no migran en la misma dirección que los productos de escisión específica con enzima. Los máximos de excitación y emisión para Cy3 son 554 y 568, respectivamente, mientras que el Analizador de Imágenes FMBIO tiene una excitación a 532 y detección a 585. Por lo tanto, el límite de detección de productos de escisión específica puede mejorarse por medio del uso de una fuente de excitación y filtros de detección más coincidentes.

EJEMPLO 24 - Referencia

Dispositivos y procedimientos para la separación y detección de productos de reacción cargados

Este ejemplo se refiere a procedimientos y dispositivos para aislar y concentrar productos de reacción específico producidos por reacciones enzimáticas realizadas en solución, con lo que las reacciones generan productos cargados a partir de un sustrato de carga neutra o un sustrato que lleva la carga opuesta al producto de reacción específica. Los procedimientos y dispositivos de este ejemplo permiten aislar, por ejemplo, los productos generados por el ensayo de escisión dirigida por INVASOR.

Los procedimientos y dispositivos de este ejemplo se basan en el principio de que cuando se aplica un campo eléctrico a una solución de moléculas cargadas, la migración de las moléculas hacia el electrodo de la carga opuesta se produce muy rápidamente. Si se introduce una matriz u otro material inhibidor entre las moléculas cargadas y el electrodo de carga opuesta de tal forma que esta migración rápida se ralentiza espectacularmente, las primeras moléculas en alcanzar la matriz casi se detendrán, permitiendo de esta manera la recuperación de las moléculas rezagadas. De esta manera, una población dispersa de moléculas cargadas en solución puede concentrarse eficazmente en un volumen más pequeño. Marcando las moléculas con un resto detectable (por ejemplo, un colorante fluorescente), la detección se facilita tanto por la concentración como por la localización de los analitos. Este ejemplo ilustra dos realizaciones de dispositivos contemplados por la presente invención; por supuesto, las variaciones de estos dispositivos serán evidentes para los expertos en la técnica y entran dentro del espíritu y alcance de la presente invención.

La Fig. 51 representa una realización de un dispositivo para concentrar los productos cargados positivamente generados usando los procedimientos de la presente invención. Como se muestra en la Fig. 51, el dispositivo comprende un tubo de reacción (10) que contiene la solución de reacción (11). Un extremo de cada uno de dos capilares finos (u otros tubos con una parte central hueca) (13A y 13B) se sumergen en la solución de reacción (11). Los capilares (13A y 13B) pueden suspenderse en la solución de reacción (11) de tal forma que no estén en contacto con el propio tubo de reacción; un procedimiento de apropiado para suspender los capilares es mantenerlos en su sitio con abrazaderas (no mostradas). Como alternativa, los capilares pueden suspenderse en la solución de reacción (11) de tal forma que estén en contacto con el propio tubo de reacción. Los capilares adecuados incluyen tubos capilares de vidrio disponibles comúnmente en compañías proveedoras de material científico (por ejemplo, Fisher Scientific o VWR Scientific) o de proveedores de productos médicos que tienen materiales para la extracción y análisis de sangre. Aunque la presente invención no se limita a capilares de ningún diámetro interno particular, se prefieren particularmente para el uso con la presente invención tubos con diámetros internos de hasta aproximadamente 1/8 pulgadas (aproximadamente 3 mm); por ejemplo, los tubos Kimble Nº 73811-99 (VWR Scientific) tienen un diámetro interno de 1,1 mm y son un tipo adecuado de tipo capilar. Aunque los capilares del dispositivo están compuestos normalmente de vidrio, es adecuado para el uso en la presente invención cualquier material tubular no conductor, rígido o flexible, que pueda contener un material conductor o un material de captura. Un ejemplo de un tubo flexible adecuado es el tubo de plástico transparente Tygon® (Pieza Nº R3603; diámetro interno = 0,16 centímetros; diámetro externo = 0,32 centímetros).

Como se ilustra en la Fig. 51, el capilar 13A está conectado al electrodo positivo de una fuente de energía (20) (por ejemplo, una fuente de energía controlable disponible en los proveedores de material de laboratorio indicados anteriormente o en los proveedores de material electrónico tales como Radio Shack) y el capilar 13B está conectado al electrodo negativo de la fuente de energía (20).

El capilar 13B se rellena con un material de captura (14) que puede capturar los productos de reacción cargados positivamente permitiendo una migración mínima de los productos que han entrado en el material de captura (14). Los materiales de captura adecuados incluyen, pero sin limitación, acrilamida de alto porcentaje (por ejemplo, aproximadamente un 20%) polimerizada en un tampón de alta concentración de sal (acetato sódico 0,5 M o superior

o una sal similar); tal alto porcentaje de matriz de poliacrilamida ralentiza espectacularmente la migración de los productos de reacción cargados positivamente. Como alternativa, el material de captura puede comprender una matriz sólida cargada negativamente, tal como perlas de látex cargadas negativamente, que pueden unirse a los productos cargados positivamente entrantes. Debe tenerse en cuenta que puede usarse cualquier cantidad de material de captura (14) capaz de inhibir cualquier concentración de los productos de reacción cargados positivamente. De esta manera, aunque el capilar 13B de la Fig. 51 sólo contiene material de captura en la parte inferior sumergida del tubo, el material de captura (14) puede estar presente en el capilar entero (13B); de forma similar, podría estar presente menos material de captura (14) que el mostrado en la Fig. 51, porque los productos de reacción cargados positivamente generalmente se acumulan dentro de una parte muy pequeña de la parte inferior del capilar (13B). La cantidad de material de captura sólo necesita ser suficiente para entrar en contacto con la solución de reacción (11) y tener la capacidad de recoger los productos de reacción. Cuando el capilar 13B no está completamente relleno con material de captura, el espacio que queda se rellena con cualquier material conductor (15); son materiales conductores adecuados los descritos más adelante.

Por comparación, el capilar (13A) conectado al electrodo positivo de la fuente de energía 20 puede rellenarse con cualquier material conductor (15; indicado por las líneas sombreadas en la Fig. 51). Este puede ser el tampón de reacción de la muestra (por ejemplo, MOPS 10 mM, pH 7,5 con LiCl 150 mM, MnCl2 4 mM), un tampón de electroforesis convencional (por ejemplo, Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM), o la propia solución de reacción (11). El material conductor (15) con frecuencia es un líquido, pero podría ser más fácil de usar un material semisólido (por ejemplo, un gel) u otro material adecuado y está dentro del alcance de la presente invención. Además, el material de captura usado en el otro capilar (es decir, 13B) también puede usarse como el material conductor. Por el contrario, debe tenerse en cuenta que en el capilar 13B también puede usarse el mismo material conductor usado en el capilar (13A) unido al electrodo positivo para rellenar el espacio por encima de la región que contiene el material de captura (14) (véase la Fig. 51).

El extremo superior de cada uno de los capilares (13A y 13B) está conectado al electrodo apropiado de la fuente de energía (20) por un cable de electrodo (18) u otro material adecuado. . Como cable conductor comúnmente se usa un cable de platino fino (por ejemplo, de 0,1 a 0,4 mm, Aesar Johnson Matthey, Ward Hill, MA) porque no se corroe en condiciones de electroforesis. El cable de electrodo (18) puede unirse a los capilares (13A y 13B) por medio de un adhesivo no conductor (no mostrado) tal como los adhesivos de silicona que se venden comúnmente en las tiendas de hardware para sellar instalaciones de tuberías Si los capilares se construyen de un material flexible, el cable de electrodo (18) puede fijarse con una pequeña abrazadera de manguera o cable de constricción (no mostrado) para comprimir la abertura de los capilares alrededor del cable de electrodo. Si el material conductor (15) es un gel, puede insertarse directamente un cable de electrodo (18) en gel dentro del capilar.

La reacción de escisión se monta en el tubo de reacción (10) y se deja continuar como se describe en los ejemplos anteriores (por ejemplo, Ejemplos 22-23). Aunque no hay limitación a ningún volumen de solución de reacción (11) concreto, el volumen preferido es menor de 10 ml y más preferiblemente menor de 0,1 ml. El volumen sólo necesita ser suficiente para permitir el contacto con los dos capilares. Después de completarse la reacción de escisión, se aplica un campo eléctrico a los capilares encendiendo la fuente de energía (20). Como resultado, los productos cargados positivamente generados en el transcurso de la reacción de escisión dirigida por INVASOR que emplea un oligonucleótido, que cuando se escinde, genera un fragmento cargado positivamente (descrito en el Ejemplo 23) pero cuando no se escinde lleva una carga neta negativa, migran al capilar negativo, donde su migración se ralentiza o se detiene por el material de captura (14) y las moléculas de sonda degradadas térmicamente y no cortadas cargadas negativamente migran hacia el electrodo positivo. Por medio del uso de este dispositivo o un dispositivo similar, los productos cargados positivamente de la reacción de escisión invasiva se separan del otro material (es decir, la sonda degradada térmicamente y no cortada) y se concentran a partir de un gran volumen. La concentración del producto en una pequeña cantidad de material de captura (14) simplifica la detección, con una relación entre señal e interferencia mucho mayor que la posible con la detección en el volumen de reacción original. Como el producto concentrado está marcado con un resto detectable como un colorante fluorescente, puede usarse un lector de placas fluorescente disponible en el mercado (no mostrado) para averiguar la cantidad de producto. Los lectores de placa adecuados incluyen lectores láser tanto superior como inferior. El capilar 13B puede colocarse con el tubo de reacción (10) en cualquier posición deseada para acomodar el uso con un dispositivo de lectura de placa superior o inferior.

En la realización alternativa de la presente invención representada en la Fig. 52, el procedimiento que se ha descrito anteriormente se realiza utilizando únicamente un solo capilar (13B). El capilar (13B) contiene el material de captura

(14) que se ha descrito anteriormente y está conectado a un cable de electrodo (18) que a su vez está unido al electrodo negativo de una fuente de energía (20). El tubo de reacción (10) tiene un electrodo (25) insertado en su superficie de tal forma que una superficie del electrodo se expone al interior del tubo de reacción (10) y otra superficie se expone al exterior del tubo de reacción. La superficie del electrodo (25) en el exterior del tubo de reacción está en contacto con una superficie conductora (26) conectada al electrodo positivo de la alimentación (20) mediante un cable del electrodo (18). En la presente invención también se contemplan variaciones de la disposición representada en la Fig. 52. Por ejemplo, el electrodo (25) puede estar contacto con la solución de reacción (11) por medio del uso de un pequeño orificio en el tubo de reacción (10); además, el cable de electrodo (18) puede unirse directamente al cable de electrodo (18), eliminando de esta manera la superficie conductora (26).

Como se indica en la Fig. 52, el electrodo (25) se incrusta en la parte inferior de un tubo de reacción (10) de tal forma que en la superficie conductora (26) pueden situarse uno o más tubos de reacción. Esta superficie conductora podría servir como electrodo negativo para múltiples tubos de reacción; una superficie de este tipo con contactos apropiados podría aplicarse por medio del uso de láminas metálicas (por ejemplo, de cobre o platino, Aesar Johnson Matthey, Ward Hill, MA) más o menos de la misma manera en la que se aplican contactos a circuitos impresos. Como un contacto de superficie de este tipo no estaría expuesto directamente a la muestra de reacción, podrían usarse metales menos caros, tales como cobre, para realizar las conexiones eléctricas.

Los dispositivos y procedimientos anteriores no se limitan a la separación y concentración de oligonucleótidos cargados positivamente.

Como será evidente para los especialistas en la técnica, productos de reacción cargados negativamente pueden separarse de reactantes cargados positivamente o neutros usando el dispositivo y los procedimientos anteriores con la excepción de que el capilar 13B esté unido al electrodo positivo de la fuente de energía (20) y el capilar 13A o, como alternativa, el electrodo 25, esté unido al electrodo negativo de la fuente de energía (20).

EJEMPLO 25

La escisión dirigida por cebador e independiente de cebador se produce en el mismo sitio cuando el cebador se extiende al lado 3’ de una “burbuja” con apareamiento erróneo en el dúplex cadena abajo

Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, la presencia de un cebador cadena arriba de un dúplex

bifurcado puede influir en el sitio de escisión y la existencia de un hueco entre el extremo 3’ del cebador y la base del dúplex puede producir un desplazamiento del sitio de escisión hasta el brazo 5’ no emparejado de la estructura (véase también Lyamichev y col., anteriormente y la Patente de Estados Unidos Nº 5.422.253). El desplazamiento no invasivo resultante del sitio de escisión en respuesta a un cebador se demuestra en las Figs. 8, 9 y 10, en las que el cebador usado deja un hueco de 4 nucleótidos (con respecto a la base del dúplex). En las figuras 8-10 todas las

reacciones de escisión “dirigida por cebador” produjeron un producto de 21 nucleótidos, mientras que las reacciones

de escisión independiente de cebador produjeron un producto de 25 nucleótidos. Se examinó el sitio de escisión obtenido cuando el cebador se extendió a la base del dúplex, sin dejar huecos. Los resultados se muestran en la Fig. 53 (la Fig. 53 es una reproducción de la Fig. 2C en Lyamichev y col.). Estos datos se obtuvieron a partir de la escisión de la estructura mostrada en la Fig. 5, como se describe en el Ejemplo 1. A menos que se especifique otra cosa, las reacciones de escisión comprendían 0,01 pmol de ADN de horquilla marcado terminalmente, desnaturalizado con calor (estando también presente la cadena complementaria no marcada), 1 pmol de cebador [complementario al brazo 3’ mostrado en la Fig. 5 y que tenía la secuencia: 5’-GAATTCGATTTAGGTGACAC TATAGAATACA [SEC ID Nº 53]) y 0,5 unidades de DNAPTaq (una cantidad estimada de 0,026 pmol) en un volumen total de 10 μl de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 y MgCl2 1,5 mM y KCl 50 mM. El cebador se omitió de la reacción mostrada en el primer carril de la Fig. 53 se incluyó en el carril 2. Estas reacciones se incubaron a 55ºC durante 10 minutos. Las reacciones se iniciaron a la temperatura de reacción final mediante la adición de MgCl2 o la enzima. Las reacciones se interrumpieron en sus temperaturas de incubación mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 20 mM y colorantes marcadores al 0,05 %.

La Fig. 53 es un autorradiograma que indica los efectos del sitio de escisión de una estructura dúplex bifurcada en presencia de un cebador que se extiende a la base del dúplex de horquilla. El tamaño del producto de escisión liberado muestra en la izquierda (es decir, 25 nucleótidos). En la derecha se muestra como un marcador (carriles 36) una escala de secuenciación de didesoxinucleótidos del sustrato de escisión.

Éstos datos muestran que la presencia de un cebador que es adyacente a un dúplex cadena abajo (carril 2) produce escisión en el mismo sitio que se observa en las reacciones realizadas en ausencia del cebador (carril 1). (Véanse otras comparaciones en las Figs. 8A y B, 9B y 10A). Cuando los nucleótidos 3’ terminales del oligonucleótido cadena arriba pueden formar pares de bases con la cadena molde pero no son homólogos a la cadena desplazada en la región inmediatamente cadena arriba del sitio de escisión (es decir, cuando el oligonucleótido cadena arriba está

abriendo una “burbuja” en el dúplex), el sitio al que aparentemente se desplaza la escisión no depende totalmente

de la presencia de un oligonucleótido cadena arriba.

Como se ha descrito anteriormente en la sección de Antecedentes y en la Tabla 1, el requisito de que dos secuencias independientes se reconozcan en un ensayo proporciona un nivel altamente deseable de especificidad. En las reacciones de escisión invasiva de la presente invención, los oligonucleótidos INVASOR y sonda deben hibridar con el ácido nucleico diana con la orientación y la separación correctas para permitir la producción del producto de escisión correcto. Cuando el patrón de escisión característico no depende del alineamiento satisfactorio de los dos oligonucleótidos en el sistema de detección, se pierden estas ventajas de reconocimiento independiente.

EJEMPLO 26

Escisión invasiva y escisión dirigida por cebador cuando hay sólo homología parcial en la región de

solapamiento “X”

Aunque sin limitar la presente invención a un ningún mecanismo particular, se produce escisión invasiva cuando el sitio de escisión se cambia a un sitio dentro del dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico diana de una manera que es dependiente de la presencia de un oligonucleótido cadena arriba que comparte una región de

solapamiento con el oligonucleótido sonda cadena abajo. En algunos casos, la región 5’ del oligonucleótido cadena

bajo puede no ser completamente complementaria al ácido nucleico diana. En estos casos, la escisión de la sonda puede producirse en un sitio interno dentro de la sonda incluso en ausencia de un oligonucleótido cadena arriba (a diferencia del recorte base por base observado cuando se usa una sonda completamente emparejada sin un INVASOR). La escisión invasiva se caracteriza por un cambio aparente de la escisión a un sitio dentro de un dúplex cadena abajo que es dependiente de la presencia de oligonucleótido INVASOR.

Puede ilustrarse una comparación entre la escisión invasiva y la escisión dirigida por cebador comparando los sitios de escisión esperados de una serie de oligonucleótidos sonda que tienen grados decrecientes de

complementariedad con la cadena diana en la región 5’ de la sonda (es decir, la región que se solapa con

INVASOR). Puede realizarse un ensayo sencillo, similar al realizado en el sustrato de horquilla anterior (Ej. 25) para comparar la escisión invasiva con la escisión dirigida por cebador no invasiva que se ha descrito anteriormente. Esta serie de oligonucleótidos de ensayo representa en la Fig. 54. Las estructuras mostradas en la Fig. 65 se agrupan en

pares, denominados “a”, “b”, “c” y “d”. Cada par tiene la misma secuencia de sonda hibridada con la cadena diana

(SEC ID Nº 54), pero la estructura superior de cada par se dibuja sin un oligonucleótido cadena arriba, mientras que la estructura inferior incluye este oligonucleótido (SEC ID Nº 55). Las secuencias de las sondas mostradas en las Figs. 54a-54d se indican en las SEC ID Nº 32, 56, 57 y 58, respectivamente. Se indican sitios probables de escisión por las puntas de flecha negras. (Debe tenerse en cuenta que el sitio de escisión preciso en cada una de estas estructuras puede variar dependiendo de la elección del agente de escisión y otras variables experimentales. Estos sitios particulares se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.)

Para realizar este ensayo se determina el sitio de escisión de cada sonda tanto en presencia como en ausencia del oligonucleótido cadena arriba, en condiciones de reacción tales como las descritas en el Ejemplo 18. Después se

comparan los productos de cada par de reacciones para determinar si el fragmento liberado del extremo 5’ de la

sonda aumenta en tamaño cuando en la reacción se incluye el oligonucleótido cadena arriba.

La disposición mostrada en la Fig. 54a, en la que la molécula de sonda es completamente complementaria a la

cadena diana, es similar a la mostrada en la Fig. 28. El tratamiento de la estructura superior con la nucleasa 5’ de

una ADN polimerasa produciría el recorte exonucleolítico de la sonda (es decir, en ausencia del oligonucleótido cadena arriba). Por el contrario, la inclusión de un oligonucleótido INVASOR produciría un cambio de escisión distintivo similar a los observados en la Fig. 29.

Las disposiciones mostradas en las Figs. 54b y 54c tienen alguna cantidad de secuencia no emparejada en el

extremo 5’ de la sonda (3 y 5 bases, respectivamente). Estos pequeños brazos 5’ son un sustrato de escisión adecuado para las nucleasas 5’ y se escindiría dentro de una distancia de 2 nucleótidos de la unión entre la región de hélice única y el dúplex. En estas disposiciones, el extremo 3’ del oligonucleótido cadena arriba comparte identidad con una parte de la región 5’ de la sonda que es complementaria a la secuencia diana (es decir, el extremo 3’ del INVASOR tiene que competir por la unión a la diana con una parte del extremo 5’ de la sonda). Por lo tanto,

cuando se incluye el oligonucleótido cadena arriba, se cree que media un cambio en el sitio de escisión al dúplex cadena abajo (aunque la presente invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular) y, por lo tanto,

esto constituiría una escisión invasiva. los nucleótidos del extremo 5’ de la región no emparejada de la sonda

pudieran hibridar con la cadena diana, el sitio de escisión en ausencia del INVASOR podía cambiar, pero la adición del oligonucleótido invasor todavía cambiaría el sitio de escisión a la posición apropiada.

Finalmente, en la disposición mostrada en la Fig. 54d, la sonda y los oligonucleótidos cadena arriba no comparten regiones de homología significativas y la presencia de oligonucleótido cadena arriba no competiría por la unión a la diana con la sonda. La escisión de las estructuras mostradas en la Fig. 5 4d se producirían en el mismo sitio con o sin oligonucleótido cadena arriba y, por lo tanto, no constituiría escisión invasiva.

Examinando cualquier par de oligonucleótido cadena arriba/sonda de esta manera, puede determinarse fácilmente si la escisión resultante es invasiva o simplemente está dirigida por cebador. Este análisis es particularmente útil cuando la sonda no es completamente complementaria al ácido nucleico diana, de forma que el resultado esperado puede no ser obvio por simple inspección de las secuencias.

EJEMPLO 27 - Referencia

Enzimas CLEAVASE modificadas

Para desarrollar nucleasas que tengan actividades útiles para la escisión de ácidos nucleicos, se produjeron las siguientes nucleasas modificadas.

a) Nucleasa CLEAVASE BN/trombina

i) Clonación y expresión de nucleasa CLEAVASE BN/trombina

Se usó mutagénesis dirigida para introducir una secuencia de proteína reconocida por la proteasa trombina en la región de la nucleasa CLEAVASE BN que se cree que forma el arco helicoidal de la proteína a través del cual supuestamente debe pasar el ADN de hélice única que se escinde. realizó mutagénesis usando el kit de mutagénesis TransformerTM (Clonetech, Palo Alto, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante usando el oligonucleótido mutagénico 5’-GGGAAAGTC-CTCGCAGCCGCGCG GGACGAGCGTGGGGGCCCG (SEC ID Nº 59). Después de la mutagénesis, el ADN se secuenció para verificar la inserción del sitio de escisión de la trombina. La secuencia de ADN que codifica nucleasa Cleavase® BN/trombina se proporciona en la SEC ID Nº 60; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa CLEAVASE BN/trombina se proporciona en la SEC ID Nº 61.

Se realizó una preparación a gran escala del mutante de trombina (es decir, CLEAVASE BN/trombina) usando células de E. coli que sobre-expresaban la nucleasa CLEAVASE BN/trombina como se describe en el Ejemplo 28.

ii) Escisión por trombina de CLEAVASE BN/trombina

Se digirieron seis coma cuatro (6,4) mg de la nucleasa CLEAVASE BN/trombina purificada con 0,4 U de trombina (Novagen) durante 4 horas a 23ºC o 37ºC. La digestión completa se verificó por electroforesis en un gel de SDS poliacrilamida al 15% seguido de tinción con Azul Brillante de Coomassie R. Como un control también se digirió nucleasa CLEAVASE BN de tipo silvestre con trombina. El gel resultante se muestra en la Fig. 61.

En la Fig. 61, el carril 1 contiene marcadores de peso molecular (Low-Range Protein Molecular Weight Markers; Promega), el carril 2 contiene nucleasa CLEAVASE BN/trombina no digerida, los carriles 3 y 4 contienen nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida con trombina a 23ºC durante 2 y 4 horas, respectivamente y los carriles 5 y 6 contienen nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida con trombina a 37ºC durante 2 y 4 horas, respectivamente. Estos resultados muestran que la nucleasa CLEAVAGE BN/trombina tiene un peso molecular aparente de 36,5 kilodalton y demuestra que la nucleasa CLEAVAGE BN/trombina se escinde eficazmente por la trombina. Además, los productos de escisión de trombina tienen pesos moleculares aproximados de 27 kilodalton y 9 kilodalton, el tamaño esperado basándose en la posición del sitio de trombina insertado en la nucleasa CLEAVASE BN/trombina.

Para determinar el nivel de actividad de escisión de horquilla en la nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida y no digerida, se realizaron diluciones y se usaron para escindir una horquilla de ensayo que contenía un marcador de

fluoresceína 5’. Se incubaron cantidades variables de nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida y no digerida con horquilla de oligonucleótido S-60 5 μM (SEC ID Nº 29; véase la Fig. 26) en MOPS 10 mM (pH 7,5), Tween-20 al 0,05%, NP-40 al 0,05% y MnCl2 1 mM durante 5 minutos a 60ºC. La mezcla digerida se sometió a electroforesis en un gel acrilamida al 20% y se visualizó en un aparato de formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO 100. La imagen resultante se muestra en la Fig. 62.

En la Fig. 62, el carril 1 contiene el control sin enzima, el carril 2 contiene productos de reacción producidos usando 0,01 ng de nucleasa CLEAVASE BN/trombina, los carriles 3, 4 y 5 contienen productos de reacción producidos usando 0,01 ng, 0,04 ng y 4 ng de nucleasa CLEAVASE BN/trombina no digerida, respectivamente y los carriles 6, 7 y 8 contienen productos de reacción producidos usando 0,01 ng, 0,04 ng y 4 ng de nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida con trombina, respectivamente. Los resultados mostrados en la Fig. 62 demostraron que la inserción del sitio de escisión de trombina redujo la actividad de escisión aproximadamente 200 veces (con respecto a la actividad de la nucleasa CLEAVASE BN/trombina), pero que la digestión con trombina no reducía la actividad significativamente.

Se usó ADN de hélice única de M13 como un sustrato para escisión por nucleasa CLEAVASE BN y nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida y no digerida. Se incubaron setenta nanogramos de ADN M13 de hélice única (NEB) en MOPS 10 mM, pH 7,5, Tween-20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, MgCl2 1 mM o MnCl2 1 mM, con 8 ng de nucleasa CLEAVASE BN, nucleasa CLEAVASEBN/trombina no digerida o nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida durante 10 minutos a 50ºC. Las mezclas de reacción se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al

0,8% y después se tiñeron con una solución que contenía 0,5 μg/ml de bromuro de etidio (EtBr) para visualizar las

bandas de ADN. En la Fig. 63 se muestra una imagen negativa del gel teñido con EtBr.

En la Fig. 63, el carril 1 contiene el control sin enzima, el carril 2 contiene productos de reacción producidos usando nucleasa CLEAVASE BN y MgCl2 1 mM, el carril 3 contiene productos de reacción producidos usando nucleasa CLEAVASE BN y MnCl2 1 mM, el carril 4 contiene productos de reacción producidos usando nucleasa CLEAVASE BN/trombina no digerida y MgCl2 1 mM, el carril 5 contiene productos de reacción producidos usando nucleasa CLEAVASE BN/trombina no digerida y MnCl2 1 mM, el carril 6 contiene productos de reacción producidos usando nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida con trombina y MgCl2 1 mM y el carril 7 contiene productos de reacción producidos usando nucleasa CLEAVASE BN/trombina digerida con trombina y MnCl2 1 mM. Los resultados mostrados en la Fig. 63 demostraron que la nucleasa CLEAVASE BN/trombina tenía una mayor capacidad de

escindir ADN circular (y por lo tanto, una menor necesidad de la presencia de un extremo 5’ libre) en comparación

con la nucleasa CLEAVASE BN.

Por estos datos puede verse que el arco helicoidal de estas proteínas puede abrirse sin destruir la enzima o su capacidad de reconocer específicamente estructuras de escisión. El mutante CLEAVASE BN/trombina tiene una mayor capacidad de escindir sin referencia a un extremo 5’, como se ha descrito anteriormente. La capacidad de escindir estas estructuras permitirá la escisión de moléculas largas, tales como ADN genómico que, aunque a menudo no son circulares, pueden presentar muchos sitios de escisión deseables que están bastante retirados de

cualquier extremo 5’ disponible. Pueden realizarse estructuras de escisión en estos sitios por plegamiento de las

cadenas (es decir, escisión CFLP®) o por la inclusión de oligonucleótidos formadores de estructuras (Patente de

Estados Unidos Nº 5.422.253). También es posible que no estén disponibles los extremos 5’ de ácidos nucleicos

debido a la unión de una sustancia demasiado grande para enhebrarse a través del arco helicoidal. Estos restos de unión pueden incluir proteínas tales como estreptavidina o anticuerpos o soportes sólidos tales como perlas o las paredes de un vaso de reacción. Una enzima de escisión con una abertura en el bucle en el arco helicoidal podrá escindir ADN que están configurados de esta forma, ampliando el número de formas en las que pueden formatearse reacciones que usan están enzimas.

b) Nucleasa CLEAVASE DN

i) Clonación y expresión de nucleasa CLEAVASE DN

Se construyó un mutante deficiente en la polimerización de ADN polimerasa de Taq, denominada nucleasa CLEAVASE DN. La nucleasa CLEAVASE DN contiene un resto de asparagina en lugar del resto de ácido aspártico de tipo silvestre en la posición 785 (D785N).

Se construyó ADN que codifica la nucleasa CLEAVASE DN partir del gen que codifica CLEAVASE A/G (mutTaq, Ej. 2) en dos rondas de mutagénesis dirigida. En primer lugar, la G en la posición 1397 y la G en la posición 2264 del gen de CLEAVASE A/G (SEC ID Nº 21) se cambiaron por A en las dos posiciones para recrear un gen de DNAPTaq de tipo silvestre. Como segunda ronda de mutagénesis, el gen de DNAPTaq de tipo silvestre se convirtió en el gen de CLEAVASE DN cambiando la G la posición 2356 por A. Estas manipulaciones se realizaron como se indica a continuación.

Se volvió a clonar ADN que codifica la nucleasa CLEAVASE A/G a partir del plásmido pTTQ18 (Ej. 2) en el plásmido pTrc99A (Pharmacia) en un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, el vector pTrc99A se modificó retirando la G en la posición 270 del mapa del pTrc99A, creando el vector de clonación pTrc99G. Para este fin, se cortó el ADN del plásmido pTrc99A con NcoI y los extremos 3’ recesivos introdujeron usando el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli en presencia de los cuatro dNTP a 37ºC durante 15 min. Después de la inactivación del fragmento Klenow por incubación a 65ºC durante 10 min, el ADN plasmídico se cortó con EcoRI, los extremos se introdujeron de nuevo usando el fragmento Klenow en presencia de los cuatro dNTP a 37ºC durante 15 min. El fragmento Klenow después de inactivó por incubación a 65ºC durante 10 min. El ADN plasmídico se precipitó con etanol, se recircularizó por ligamiento y se usó para transformar células de E. coli JM109 (Promega). Se aisló ADN plasmídico a partir de colonias individuales y la deleción de la G en posición 270 del mapa de pTrc99A se confirmó por secuenciación del ADN.

Como una segunda etapa se retiró ADN que codificaba la nucleasa CLEAVASE A/G del plásmido pTTQ18 usando EcoRI y SalI y el fragmento de ADN que llevaba el gen de la nucleasa CLEAVASE A/G se separó en un gel de agarosa al 1% y se aisló con el kit Geneclean II (Bio 101, Vista, CA). El fragmento purificado se ligó al vector pTrc99G se que se había cortado con EcoRI y SalI. La mezcla de ligamiento se usó para transformar células de E. coli JM109 (Promega) competentes. Se aisló ADN plasmídico a partir de colonias individuales y la inserción del gen de nucleasa CLEAVASE A/G se confirmó por análisis de restricción usando EcoRI y SalI.

El ADN plasmídico de pTrcAG que llevaba el gen de la nucleasa Cleavase® A/G clonado en el vector pTrc99A se purificó a partir de 200 ml de un cultivo de una noche de JM109 usando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (QIAGEN, Chatsworth, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN plasmídico de pTrcAG se mutagenizó usando dos cebadores mutagénicos, E465 (SEC ID Nº 62) (Integrated DNA Technologies, Iowa) y R754Q (SEC ID Nº 63) (Integrated DNA Technologies) y el cebador de selección Trans Oligonucleotide AlwNI/SpeI (Clontech, Palo Alto, CA, Nº de catálogo 6488-1) de acuerdo con el protocolo de kit de Mutagénesis Dirigida TransformerTM (Clontech, Palo Alto, CA) para producir un gen de DNAPTaq de tipo silvestre restaurado (pTrcWT).

Se purificó ADN del plásmido pTrcWT que llevaba el gen de DNAPTaq de tipo silvestre clonado en el vector pTrc99A a partir de 200 ml de cultivo de una noche de JM109 usando el kit QIAGEN Plasmid Maxi (QIAGEN, Chatsworth, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después se mutagenizó pTrcWT usando el cebador mutagénico D785N (SEC ID Nº 64) (Integrated DNA Technologies) y el cebador de selección Switch Oligonucleotide SpeI/AlwNI (Clontech, Nº de catálogo 6373-1) de acuerdo con el protocolo del kit de Mutagénesis Dirigida TransformerTM (Clontech) para crear un plásmido que contenía ADN que codificaba la nucleasa CLEAVASE DN. La secuencia de ADN que codifica la nucleasa CLEAVASE DN se proporciona en la SEC ID Nº 65; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa CLEAVASE DN se proporciona en la SEC ID Nº 66.

Se realizó una preparación a gran escala de la nucleasa Cleavase® DN usando células de E. coli que sobreexpresaban la nucleasa CLEAVASE DN como se describe en el Ejemplo 28.

c) Nucleasa CLEAVASE DA y Nucleasa CLEAVASE DV

Se construyó dos mutantes deficiente en la polimerización de ADN polimerasa de Taq, denominada nucleasa CLEAVASE DA y CLEAVASE DV. La nucleasa CLEAVASE DA contiene un resto de alanina en lugar del resto de ácido aspártico de tipo silvestre en la posición 610 (D785A). La nucleasa CLEAVASE DV contiene un resto de valina en lugar del resto de ácido aspártico de tipo silvestre en la posición 610 (D610V).

i) Construcción y expresión de las nucleasas CLEAVASE DA y CLEAVASE DV

Para construir vectores que codifican las nucleasas CLEAVASE DA y DV, el gen de la nucleasa CLEAVASE A/G contenido dentro de pTrcAG se mutagenizó con dos cebadores mutagénicos, R754Q (SEC ID Nº 63) y D610AV (SEC ID Nº 67) y el cebador de selección Trans Oligonucleotide AlwNI/SpeI (Clontech, Nº de catálogo 6488-1) de acuerdo con el protocolo del Kit de Mutagénesis Dirigida TransformerTM (Clontech) para crear un plásmido que contenía ADN que codificaba la nucleasa CLEAVASE DA o la nucleasa CLEAVASE DV. El oligonucleótido D610AV se sintetizó de manera que tuviera una purina, A o G, en la posición 10 desde el extremo 5’ del oligonucleótido. Después de la mutagénesis, se aisló el ADN plasmídico a partir de colonias individuales y se determinó el tipo de mutación presente, DA o DV, por secuenciación del ADN. La secuencia de ADN que codifica la nucleasa CLEAVASE DA se proporciona en la SEC ID Nº 68; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa CLEAVASE DA se proporciona en la SEC ID Nº 69. La secuencia de ADN que codifica la nucleasa CLEAVASE DV se proporciona en la SEC ID Nº 70; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa CLEAVASE DV se proporciona en la SEC ID Nº 71.

d) Nucleasa CLEAVASE Tth DN

i) Construcción y expresión de nucleasa CLEAVASE Tth DN

La enzima ADN polimerasa de la especie bacteriana Thermus thermophilus (Tth) se produjo clonando el gen de esta proteína en un vector de expresión y sobreproduciéndolo en células de E. coli. Se preparó ADN genómico a partir de 1 vial de Thermus thermophilus de la cepa HB-8 secado procedente de la ATCC (ATCC Nº 27634) como se describe en el Ej. 28a. gen del ADN polimerasa se amplificó por PCR como se describe en el Ej. 27b usando los siguientes cebadores: 5’-CACGAATTCCGAGGCGAT-GCTTCCGCTC-3’ (SEC ID Nº 254) y 5’-TCGACGTCGACTAACCCTTGGCGGAAAGCC-3’ (SEC ID Nº 255), como se describe en el Ej. 28a.

El producto de PCR resultante se digirió con las endonucleasas de restricción EcoR I y SalI y se insertó en el vector plasmídico pTrc99g (descrito en el Ejemplo 27b) digerido con EcoRI/SalI por ligamiento, como se describe en el Ejemplo 27b, para crear el plásmido pTrcTth-1. Esta construcción de polimerasa de Tth carece de un solo nucleótido

que se omitió de forma inadvertida del oligonucleótido 5’, dando como resultado que el gen de la polimerasa

estuviera fuera de fase. Este error se corrigió por mutagénesis de pTrcTth-1 como se describe en el Ejemplo 27b usando el siguiente oligonucleótido: 5’-GCATCGCCTCGGAAT-TCATGGTC-3’ (SEC ID Nº 256), para crear el plásmido pTrcTth-2. La construcción de DN de Tth se creó por mutación de la secuencia que codifica un ácido aspártico de la posición 787 a una secuencia que codifica asparagina. realizó mutagénesis de pTrcTth-2 con el siguiente oligonucleótido: 5’-CAGGAGGAGCTCGTTGTGGACCTGGA-3’ (SEC ID Nº 257) como se describe en el Ejemplo 27b, para crear el plásmido pTrcTth-DN. La nucleasa deficiente en polimerasa resultante, Cleavase® TthDN, se expresó y purificó como se describe en el Ej. 28.

Se realizó una preparación a gran escala de las nucleasas CLEAVASE DA y CLEAVASE DV usando células de E. coli que sobreexpresaban la nucleasa CLEAVASE DA o la nucleasa CLEAVASE DV como se describe en el Ejemplo

28.

EJEMPLO 28

Clonación y expresión de endonucleasas FEN-1 termoestables

Se clonaron secuencias que codificaban proteínas FEN-1 termoestables procedentes de tres especies de Arqueobacterias y se sobre-expresaron en E. coli. Este ejemplo implicó: a) clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Methanococcus jannaschii; b) clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Pyrococcus furiosus; c) clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Pyrococcus woesei; d) clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Archaeoglobus fulgidus; e) preparación a gran escala de proteínas FEN-1 termoestables recombinantes; y f) ensayos de actividad usando endonucleasas FEN-1.

a) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Methanococcus jannaschii

El ADN que codifica la endonucleasa FEN-1 de Methanococcus jannaschii (M. jannaschii) se aisló partir de células de M. jannaschii y se insertó en un plásmido bajo el control transcripcional de un promotor inducible del siguiente modo. Se preparó ADN genómico a partir de 1 vial de la bacteria M. jannaschii viva (DSMZ, Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Alemania, nº 2661) el kit DNA XTRAX (Gull Laboratories, Salt

Lake City, UT), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El sedimento de ADN final se resuspendió en 100 μl de

TE (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, 1 EDTA mM). Un microlitro de la solución de ADN se empleó en una PCR usando el kit de PCR de ADNc AdvantageTM (Clonetech); la PCR se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El cebador del extremo 5’ (SEC ID Nº: 72) es complementario al extremo 5’ de la fase de lectura abierta de FEN-1 de Mja con una sustitución de una base para crear un sitio de restricción NcoI (un fragmento del genoma de M. jannaschii que contiene el gen que codifica FEN-1 de M. jannaschii (Mja) está disponible en GenBank con el Nº de acceso U67585). El cebador del extremo 3’ (SEC ID Nº 73) es complementario a una secuencia aproximadamente a 15 pares de bases cadena abajo del extremo 3’ de la fase de lectura abierta de FEN-1 de Mja con 2 sustituciones de bases para crear un sitio de enzima de restricción SalI. Las secuencias de los cebadores del extremo 5’ y del extremo 3’ son: 5’-GGGATACCA TGGGAGTGCAGTTTGG-3’ (SEC ID Nº 72) y 5’-GGTAAATTTTTCTCGTCGA CATCCCAC-3’ (SEC ID Nº 73), respectivamente. La reacción de PCR produjo la amplificación (es decir, la producción) de una sola banda principal con una longitud de aproximadamente 1 kilobase. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Mja se proporciona en la SEC ID Nº 74; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 75.

Después de la amplificación por PCR, la reacción entera se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% y la banda principal se escindió del gel y se purificó usando el kit Geneclean II (Bio101, Vista, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1 μg del producto de PCR FEN-1 de Mja purificado en gel se digirió con NcoI y SalI. Después de la digestión, el ADN se purificó usando el kit Geneclean II de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un microgramo del vector pTrc99a (Pharmacia) se digirió con NcoI y SalI en preparación para ligamiento con el producto de PCR digerido. Se combinaron cien nanogramos del vector pTrc99a digerido y 250 ng del producto PCR de FEN-1 de Mja y se ligaron para crear pTrc99-MJFEN-1. pTrc99-MJFEN-1 se usó para transformar células de E. coli JM109 competentes (Promega) usando técnicas convencionales.

b) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Pyrococcus furiosus

Se obtuvo ADN que codificaba la endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus furiosus (P. furiosus) mediante amplificación por PCR usando un plásmido que contenía ADN que codificada la endonucleasa FEN-1 de P. furiosus (Pfu) (obtenida del Dr. Frank Robb, Center of Marine Biotechnology, Baltimore, MD). Pueden obtenerse secuencias de ADN que codifican una parte de la endonucleasa FEN-1 de Pfu en GenBank (Nº de Accesos AA113505 y W36094. El gen de FEN-1 de Pfu amplificado se insertó en el vector de expresión pTrc99a (Pharmacia) para poner el gen de FEN-1 de Pfu bajo el control transcripcional del promotor de trc inducible. La amplificación por PCR se realizó como se indica a continuación. Las reacciones de cien microlitros contenían Tris HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 20 mM, MgCl2 2 mM, dNTP 50 mM, 50 pmol de cada cebador, 1 U de polimerasa de Tfl (Epicentre Technologies, Madison, WI) 1 ng de ADN plasmídico que contenía el gen de FEN-1. El cebador del extremo 5’ (SEC ID Nº 76) es complementario al extremo 5’ del marco de lectura abierta de FEN-1 de Pfu con dos sustituciones para crear un sitio de restricción NcoI y el cebador del extremo 3’ (SEC ID Nº 77) es complementario a una región localizada aproximadamente 30 pares de bases cadena abajo del marco de lectura abierta de FEN-1 con dos sustituciones para crear un sitio PstI. Las secuencias de los cebadores del extremo 5’ y del extremo 3’ son: 5’-GAGGTGATACCATG GGTGTCC-3’ (SEC ID Nº 76) y 5’-GAAACTCTGCAGCGCGTCAG-3’ (SEC ID Nº 77), respectivamente. La reacción de PCR produjo la amplificación de una sola banda principal con una longitud de aproximadamente 1 kilobase. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Pfu se proporciona en la SEC ID Nº 78; la secuencia de aminoácidos codificada por este. El ORF se proporciona en la SEC ID Nº 79.

Después de la amplificación por PCR, la reacción entera se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% y la banda principal se escindió del gel y se purificó usando el kit Geneclean II (Bio101) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1 μg del producto de PCR FEN-1 de Pfu purificado en gel se digirió con NcoI y PstI. Después de la digestión, el ADN se purificó usando el kit Geneclean II de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un microgramo del vector pTrc99a se digirió con Pstl antes del ligamiento con el producto de PCR digerido. Se combinaron cien nanogramos de pTrc99a digerido y 250 ng del producto PCR de FEN-1 de Pfu y se ligaron para crear pTrc99-PFFEN1. pTrc99-PFFEN1 se usó para transformar células de E. coli JM109 competentes (Promega) usando técnicas convencionales.

c) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Pyrococcus woesei

Para la clonación de ADN que codifica la endonucleasa FEN-1 de Pyrococcus woesei (Pwo), se preparó ADN a partir de bacterias P. woesei liofilizadas (DSMZ Nº 3773) como se describe (Zwickl y col., J. Bact., 172: 4329 [1990]) con varios cambios. resumen, un vial de bacteria P. woesei se rehidrató y se resuspendió en 0,5 ml de LB (caldo Luria). Las células se centrifugaron a 14.000 x g durante 1 min y el sedimento celular se resuspendió en 0,45 ml de TE. Se añadieron 50 microlitros de SDS al 10% y la mezcla se incubó a TA durante 5 min. El lisado de células después extrajo tres veces con 1:1 de fenol: cloroformo y tres veces con cloroformo. Se añadieron quinientos microlitros de isopropanol al lisado extraído y el ADN se sedimentó por centrifugación a 14.000 x g durante 10 min. El sedimento de ADN se lavó en 0,5 ml de etanol al 70% y el ADN se sedimentó de nuevo por centrifugación a

14.000 x g durante 5 min. El sedimento de ADN se secó y se resuspendió en 100 μl de tE y se usó para las

reacciones de PCR sin purificación adicional.

Para generar un fragmento de gen de FEN-1 de P. woesei para la clonación en un vector de expresión, se intentó realizar una PCR de baja rigurosidad con cebadores complementarios a los extremos de la fase de lectura abierta del gen de FEN-1 de P. furiosus. Las secuencias de los cebadores de los extremos 5’ y 3’ son 5’-GATACCATGGGTGTCCCAATTGGTG-3’ (SEC ID Nº 80) y 5’-TCGACGTCGACTTATCTCTTGAACCAACTTTCAAGGG (SEC ID Nº 81) respectivamente. El alto nivel de similitud de secuencia de homólogos de proteína (es decir, proteínas distintas de FEN-1) de P. furiosus y P. woesei sugirió que había una alta probabilidad de que el gen FEN-1 de P. woesei se amplificara usando cebadores que contenían secuencias complementarias al gen de FEN-1 de P. furiosus. No obstante, esta estrategia no fue satisfactoria en varias condiciones de PCR diferentes.

La secuencia de ADN de genes de FEN-1 de P. furiosus y M. jannaschii se alinearon y se identificaron bloques de identidad de secuencia entre los dos genes. Estos bloques se usaron para diseñar cebadores internos (es decir, complementarios a secuencias localizadas internamente en los extremos 5’ y 3’ del ORF) para el gen de FEN-1 que son complementarios al gen de FEN-1 de P. furiosus en esas regiones conservadas. Las secuencias de los cebadores internos 5’ y 3’ son 5’-AGCGAG-GGAGAGGCCCAAGC-3’ (SEC ID Nº 82) y 5’-GCCTATGCCCTTTATTCCTCC-3’ (SEC ID Nº 83) respectivamente. Se realizó una PCR empleando estos cebadores internos usando el kit de PCR AdvantageTM y dio como resultado la producción de una banda principal de ~300 pb

Como la PCR con los cebadores internos fue exitosa, se intentaron reacciones que contenían mezclas de los cebadores internos (SEC ID Nº 82 y 83) y externos (SEC ID Nº 80 y 81). Una reacción que contenía el cebador

externo del extremo 5’ (SEC ID Nº 80) y el cebador interno del extremo 3’ (SEC ID Nº 83) dio como resultado la producción de una banda de 600 pb y una reacción que contenía el cebador interno del extremo 5’ (SEC ID Nº 82) y el cebador externo del extremo 3’ (SEC ID Nº 81) dio como resultado la producción dio como resultado la producción de una banda de 750 pb. Estos fragmentos de ADN solapantes se purificaron en gel y se combinaron con los cebadores externos (SEC ID Nº 80 y 81) en una reacción de PCR. Esta reacción generó un fragmento de ADN de 1 kb que contenía el marco de lectura abierta entera del gen FEN-1 de Pwo. El producto de PCR resultante se purificó en gel, se digirió y se ligó exactamente como se ha descrito anteriormente para el producto de PCR del gen de FEN1 de Mja. El plásmido resultante se denominó pTrc99-PWFEN1. pTrc99-PWFEN1 se usó para transformar células de

E. coli JM109 (Promega) competentes usando técnicas convencionales.

d) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Archueoglobus fulgidus

La secuencia preliminar del cromosoma de Archaeoglobus fulgidus (Afu) de 2,2 millones de bases se descargó de la página de la red global mundial del TIGR (The Institute for Genomic Research) y se importó a un programa de software (MacD-NAsis), usado para analizar y manipular secuencias de ADN y de proteínas. La secuencia sin comentar se tradujo en los 6 marcos de lectura posibles, comprendiendo cada una aproximadamente 726.000

aminoácidos. En cada marco buscó individualmente la presencia de la secuencia de aminoácidos “VFDG” (valina,

fenilalanina, ácido aspártico, glicina), una secuencia que está conservada en la familia de FEN-1. La secuencia de aminoácidos se encontró en un marco de lectura abierto que contenía otras secuencias de aminoácidos conservadas en los genes de FEN-1 y que tenía aproximadamente el mismo tamaño que los otros genes de FEN-1. La secuencia de ADN de la ORF se muestra en la SEC ID Nº 164, mientras que la secuencia proteica del ORF se muestra en la SEC ID Nº 165. Basándose en la posición de esta secuencia de aminoácidos en la fase de lectura, se identificó la secuencia de ADN que codifica un supuesto gen de FEN-1.

La información de secuencia se usó para diseñar cebadores oligonucleotídicos que se usaron para amplificación por PCR de la secuencia de tipo FEN-1 de ADN genómico de A. fulgidus. ADN genómico se preparó a partir de A. fulgidus como se ha descrito en el Ej. 29a en relación con M jannaschii, con la excepción de que se usó un vial (aproximadamente 5 ml de cultivo) de bacteria A. fulgidus viva de DSMZ (DSMZ Nº 4304). Para la reacción de PCR

se usó un microlitro del ADN genómico como se describe en el Ej. 29a. El cebador del extremo 5’ es complementario al extremo 5’ del gen de FEN-1 de Afu con la excepción que tiene una sustitución de 1 par de bases para crear un sitio Nco I. El cebador del extremo 3’ es complementario al extremo 3’ del gen de FEN-1 de Afu cadena debajo del ORF de FEN-1 con la excepción de que contiene una sustitución de 2 bases para crear un sitio SalI. Las secuencias de los cebadores de los extremos 5’ y 3’ son 5’-CCGTCAACATTTACCATGGGTGCGGA-3’ (SEC ID Nº 166) y 5’-CCGCCACCTCGTAGTCGACATCCTTTTCGTG-3’ (SEC ID Nº 167) respectivamente.

La clonación del fragmento resultante fue como se ha descrito para el gen PfuFEN1, anteriormente, para crear el plásmido pTrc99-AFFEN1. El plásmido pTrcAfuHis se construyó modificando pTrc99-AFFEN1, mediante la adición de una cola de histidina para facilitar la purificación. Para añadir esta cola de histidina se usaron procedimientos de mutagénesis dirigida por cebador mediante PCR estándar con el fin de insertar la secuencia de codificación para seis residuos de histidina entre el último codón de aminoácidos de la región de codificación pTrc99-AFFEN1 y el codón de terminación. El plásmido resultante se denominó pTrcAfuHis. Después, la proteína se expresó como se ha descrito en el ejemplo 28f) y se purificó mediante la unión a una columna de afinidad de Ni++ como se ha descrito en el Ejemplo 8.

d) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN-1 a partir de Methanobacterium thermoautotrophicum

En una lista provisional de todas las fases de lectura abiertas del genoma de Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) en la página de la red global mundial de Genome Therapeutics se buscaron secuencias de aminoácidos conservadas en los genes de FEN-1. En un marco de lectura abierta que también contenía otras secuencias de FEN-1 conservadas se encontró la secuencia de aminoácidos “VFDG” (valina, fenilalanina, ácido aspártico, glicina). La SEC ID Nº 260 proporciona la secuencia de ADN del ORF de FEN-1 de Mth indicada por Genome Therapeutics, mientras que la SEC ID Nº 261 proporciona la secuencia proteica del ORF de FEN-1 de Mth como indica Genome Therapeutics. Sin embargo, esta fase de lectura abierta tenía una longitud de 259 aminoácidos, en comparación con los otros genes de FEN-1 de arqueobacterias, que tienen una longitud de aproximadamente 325 aminoácidos. Para determinar la causa de esta discrepancia, la secuencia de ADN para FEN1 de Mth se obtuvo de una manera idéntica a la que se ha descrito anteriormente en el caso de FEN-1 de Afu.

Después de examinar la secuencia, era evidente que el marco de lectura abierta podía extenderse a 328 aminoácidos mediante deleción de una sola base aproximadamente en la posición 750 del marco de lectura abierta. La secuencia de aminoácidos adicional añadida delecionando una base tiene una identidad del 39% con la misma región del gen de FEN-1 de P. furiosus. La secuencia de ADN del supuesto gen de FEN-1 de Mth se usó para diseñar cebadores oligonucleotídicos complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. Este oligonucleótido 5’ es complementario al extremo 5’ del gen de FEN-1 de Mth con la excepción de que contiene 2 sustituciones que crean un sitio NcoI. El oligonucleótido 3’ es complementario al extremo 3’ del gen aproximadamente 100 pares de bases cadena abajo de donde se cree que termina el verdadero marco de lectura abierta. Esta región contiene un sitio PstI natural. Las secuencias de los oligonucleótidos 5’ y 3’ son 5’-GGGTGTTCCCATGGGAGTTAAACTCAGG-3’ (SEC ID Nº 262) y 5’-CTGAATTCTGCAGAAAAAGGGG-3’ (SEC ID Nº 263) respectivamente.

Se preparó ADN genómico a partir de 1 vial de bacterias de M. thermoautotrophicum congelada procedente de la ATCC (ATCC Nº 29096) como se describe en el Ej. 28a. La PCR, clonación, expresión y purificación de FEN-1 de Mth se realizaron como se describe en los Ejemplos 28a y 28f, con la excepción de que se usó PstI en lugar de SalI. El plásmido resultante se denominó pTrc99-MTFEN1. La secuenciación del gen de FEN-1 de Mth clonado reveló la

presencia de un nucleótido “T” adicional en comparación con la secuencia genómica publicada en la red global mundial. Este resto de “T” en posición 775 del marco de lectura abierta de FEN-1 produce un cambio de marco, creando el marco de lectura abierta de mayor tamaño que se pensaba originalmente basándose en la comparación con los genes de FEN de otros organismos. La SEC ID Nº 264 proporciona la secuencia de ADN del ORF de Mth la presente invención, mientras que la SEC ID Nº 265 proporciona la secuencia de la secuencia de la secuencia de la proteína FEN-1 de Mth de la presente invención.

f) Producción a gran escala de proteínas FEN-1 termoestables recombinantes

Las proteínas FEN-1 de Mja, Pwo y Pfu se purificaron por la siguiente técnica obtenida de un protocolo de preparación de ADN polimerasa de Taq (Engelke y col., Anal. Biochem., 191: 396 [1990]) como se indica a continuación. Se inocularon células de E. coli (cepa JM109) que contenían pTrc99-PFFEN1, pTrc99-PWFEN1 o pTrc99-MJFEN1 en 3 ml de LB (Caldo Luria) que contenía 100 μg/ml de ampicilina y se cultivaron durante 16 horas

a 37ºC. El cultivo de una noche entero se inoculó en 200 ml o 350 ml de LB que contenía 100 μg/ml de ampicilina y

se cultivó a 37ºC con agitación enérgica hasta una A600 de 0,8. Se añadió IPTG (solución madre 1 M) a una concentración final de 1 mM y se continuó el cultivo durante 16 h a 37ºC.

Las células inducidas se sedimentaron y el sedimento celular se pesó. Se añadió un volumen igual de tampón DG 2X (Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, EDTA 0,1 mM) y el sedimento se resuspendió mediante agitación. Se añadieron cincuenta mg/ml de lisozima (Sigma) a una concentración final de 1 mg/ml y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió gota a gota ácido desoxicólico (solución al 10%) a una concentración final del 0,2% mientras se agitaba vorticialmente. Se añadió un volumen de H2O y 1 volumen de tampón DG 2X y la mezcla resultante se sonicó durante 2 minutos en hielo para reducir la viscosidad de la mezcla. Después de la sonicación, se añadió (NH4)2SO4 3M a una concentración final de 0,2M y el lisado se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min a 4ºC. El sobrenadante se retiró y se incubó a 70ºC durante 60 min, después de lo cual se añadió polietilimina (PEI) al 10% hasta el 0,25%. Después la incubación en hielo durante 30 min, la mezcla se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min a 4ºC. En este punto, el sobrenadante se retiró y las proteínas FEN-1 se precipitaron por la adición de (NH4)2SO4 como se indica a continuación.

Para las preparaciones de FEN-1 de Pwo y de Pfu, la proteína FEN-1 se precipitó por la adición de 2 volúmenes de (NH4)2SO4 3M. La mezcla se incubó durante una noche a temperatura ambiente durante 16 h y la proteína se centrifugó a 14.000 x g durante 20 min a 4ºC. El sedimento de proteína se resuspendió en 0,5 ml de tampón Q (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM, Tween 20 al 0,1%). Para la preparación de FEN-1 de Mja se añadió (NH4)2SO4 sólido a una concentración final de 3 M (saturado ~75%), la mezcla se incubó en hielo durante 30 min y la proteína se centrifugó y se resuspendió como se ha descrito anteriormente.

Las preparaciones de proteína resuspendida se cuantificaron por la determinación de la A279 y se sometieron electroforesis en un gel de SDS de poliacrilamida al 10% (29:1 acrilamida: bis-acrilamida) en tampón estándar de Laemmli [Laemmli, Nature 277:680 [1970]) alícuotas que contienen 2-4 μg de proteína total y se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie R. Los resultados se muestran en la figura 64.

En la Fig. 64, el carril 1 contiene marcadores de peso molecular ((Mid-Range Protein Molecular Weight Markers Promega); el tamaño de las proteínas marcadoras se indica a la izquierda del gel. El carril 2 contiene nucleasa CLEAVASE BN purificada; los carriles 3-5 contienen extractos preparados a partir de E. coli que expresa las nucleadas FEN-1 de Pfu, Pwo y Mja, respectivamente. El peso molecular calculado (es decir, usando una traducción de la secuencia de ADN que codifica la nucleasa) de la nucleasa FEN-1 de Pfu es de 38.714 dalton y el peso molecular calculado para la nucleasa FEN-1 de Mja es de 37.503 Dalton. Las proteínas FEN-1 de Pwo y Pfu comigraban en el gel de SDS-PAGE y por lo tanto, se estimó que el peso molecular de la nucleasa FEN-1 de Pwo era de 38,7 kDa

g) Ensayos de Actividad usando Endonucleasas FEN-1

i) Ensayo de Horquilla Mixta

La nucleasa CLEAVASE BN tiene una afinidad aproximadamente 60 veces mayor por una estructura de tallo-bucle de 12 pares de bases que por una estructura de ADN de tallo-bucle de 8 pares de bases Como un ensayo de diferencias de actividad entre la nucleasa CLEAVASEBN y las nucleasas FEN-1, una mezcla de oligonucleótidos que tenían un tallo-bucle de 8 ó 12 pb (véase la Fig. 60 que presenta los oligonucleótidos S-33 y 11-8-0) se incubó con un extracto preparado a partir de células de E. coli que sobre-expresaban la nucleasa FEN-1 de Mja (preparada como se ha descrito anteriormente). Las reacciones contenían 0,05 μM de oligonucleótidos S-33 (SEC ID. Nº 84) y 11-8-0 (SEC ID Nº 85) (los dos oligonucleótidos contenían marcadores de fluoresceína 5’), MOPS 10 mM, pH 7,5, Tween-20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, MnCl2 1 mM. Las reacciones se calentaron a 90ºC durante 10 segundos, se enfriaron a 55ºC, después se añadió un 1 μl de extracto bruto (FEN-1 de Mja) o enzima purificada (nucleasa CLEAVASE BN) y las mezclas se incubaron a 55ºC durante 10 minutos; también se realizó un control sin enzima. Las reacciones se detuvieron por la adición de formamida/EDTA, las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de acrilamida al 20% desnaturalizante y se visualizaron en un aparato de formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO 100. La imagen resultante se muestra en la Fig. 65.

En la Fig. 65, el carril 1 contiene los productos de reacción generados por la Nucleasa CLEAVASE BN N, el carril 2 contiene los productos de reacción de la reacción de control sin enzima y el carril 3 contiene los productos de reacción generados por la nucleasa FEN-1 de Mja. Los datos mostrados en la Fig. 76 demuestran que la nucleasa CLEAVASE BN prefiere intensamente la estructura S33 (tallo-bucle de 12 pb), mientras que la nucleasa FEN-1 de Mja escinde estructuras que tienen un tallo-bucle de 8 ó 12 pb con aproximadamente la misma eficacia. Esto muestra que la nucleasa FEN-1 de Mja tienen una especificidad de sustrato diferente que la nucleasa CLEAVASE BN , una característica útil para ensayos de INVASOR o análisis CFLP® como se describe en la Descripción de la Invención.

EXAMPLE 29

La desoxinucleotidil transferasa terminal extiende selectivamente los productos de escisión dirigida por INVASOR

La mayoría de los productos de degradación térmica de sondas de ADN tendrán un fosfato en el extremo 3’. Para investigar si la ADN polimerasa independiente de molde, desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) puede extender polimerizar los fosfatos del extremo 3’ que se han mencionado anteriormente (es decir, añadir nucleótidos trifosfato al extremo 3’), se realizó el siguiente experimento.

Para crear una muestra que contuviera un gran porcentaje de productos de degradación térmica, el oligonucleótido marcado con fluoresceína 5’ 34-078-01 (SEC ID Nº 86) (200 pmol) se incubó en 100 μl de NaCO3 10 mM (pH 10,6), NaCl 50 mM a 95 ºC durante 13 horas. Para impedir la evaporación de las muestras, la mezcla de reacción se cubrió con 60 μl de cera líquida de ChillOut™. Las mezcla de reacción se dividió después en dos alícuotas iguales (A y B). La alícuota A se mezcló con un volumen de un décimo de NaOAc 3 M seguido de tres volúmenes de etanol y se almacenó a -20 ºC. La alícuota B se desfosforiló por la adición de 0,5 μl de MgCl2 1 M y 1 μl de 1 unidad/μl de Fosfata Alcalina Intestinal de Ternero (CIAP) (Promega) con incubación a 37ºC durante 30 minutos. Se añadió un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (24:24:1) a la muestra seguido de agitación vorticial durante un minuto y después centrifugación durante 5 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga para separar las fases. La fase acuosa se retiró a un nuevo tubo al que se añadieron un volumen de un décimo de NaOAc 3M y tres volúmenes de etanol, seguido de almacenamiento a -20ºC durante 30 minutos. Después, las dos alícuotas (A y B) se centrifugaron durante 10 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga para sedimentar el ADN. Los sedimentos se lavaron después dos veces con etanol al 80% cada vez y después se desecaron a sequedad. Los sedimentos secados después se disolvieron en 70 μl de ddH2O cada uno.

Las reacciones de TdT se realizaron como se indica a continuación. Se montaron seis mezclas, todas las mezclas contenían TrisOAc 10 mM (pH 7,5), MgOAc 10 mM, KCl 50 mM y dATP 2 mM Las mezclas 1 y 2 contenían un pmol de 34-078-01 (SEC ID Nº 86) no tratado, las mezclas 3 y 4 contenían 2 μl de alícuotas A (anterior) y las mezclas 5 y 6 contenían 2 μl de alícuota B (anterior). A cada 9 μl de mezclas 1, 3 y 5 se añadió 1 μl de ddH2O, a cada 9 μl de mezclas 2, 4 y 6, se añadió 1 μl de 20 unidades/μl de TdT (Promega). Las mezclas se incubaron a 37ºC durante 1 hora y después la reacción se terminó por la adición de 5 μl de formamida al 95% con EDTA 10 mM y colorantes

marcadores al 0,05%. Cinco microlitros de cada mezcla se separaron por electroforesis a través de un gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (reticulado 19:1) con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 8,3), EDTA 1,4 mM y se obtuvieron imágenes con un filtro de 505 nm con el Analizador de Imágenes FMBIO. La exploración del aparato de formación de imágenes resultante se muestra en la Fig. 66.

En la Fig. 66, los carriles 1, 3 y 5 contienen 34-078-01(SEC ID Nº 86) no tratado, 34-078-01 degradado por calor y desfosforilado 34-078-01, respectivamente incubados en ausencia de TdT. Los carriles 2, 4 y 6 contienen 34 078-01 degradado con calor, 34-078-01 desfosforilado y degradado con calor, respectivamente incubados en presencia de TdT.

Como se muestra en la Fig. 66, carril 4, TdT no pudo extender los productos de degradación térmica que contienen

un grupo fosfato en el extremo 3’ y extiende selectivamente moléculas que tienen un grupo hidroxilo en el extremo 3’. -

EJEMPLO 30

Extensión Específica de TdT de los productos de escisión dirigida por INVASOR con posterior captura y detección en soportes de nitrocelulosa

Cuando se usa TdT para extender los productos específicos de escisión, una forma para detectar los productos prolongados es la captura selectiva de los productos de extensión en un soporte sólido antes de la visualización. Este ejemplo demuestra que los productos de escisión pueden prolongarse de forma selectiva por medio de uso de TdT y desoxinucleótidos trifosfato y que los productos prolongados pueden visualizarse por captura usando un oligonucleótido complementario unido a un soporte de nitrocelulosa.

Para extender el producto de escisión producido en una reacción de escisión dirigida por INVASOR, se realizó el siguiente experimento. Se montaron tres mezclas de reacción, cada una en un tampón de MES 10 mM (pH 6,5), Tween-20 al 0,5% y NP-40 al 0,5%. La primera mezcla contenía 5 fmol de ADN diana de M13mp18, 10 pmol de oligonucleótido sonda 32-161-2 (SEC ID Nº 87; este oligonucleótido sonda contiene ddC 3’ y un grupo amidita Cy3 cerca del extremo 3’) y 5 pmol del oligonucleótido INVASOR TM 32-161-1 (SEC ID Nº 88; este oligonucleótido contiene una ddC 3’). La segunda mezcla contenía los oligonucleótidos sonda e INVASOR sin ADN diana. La tercera mezcla era igual a la primera mezcla y contenía la misma secuencia de sonda, pero con un marcador de fluoresceína 5’ (oligonucleótido 32-161-4 [SEC ID Nº 89; este oligonucleótido contiene una ddC 3’, marcador de fluoresceína 5’ y un grupo amidita Cy3 cerca del extremo 3’]), de forma que los productos de escisión dirigida por

INVASOR podían detectarse antes y después de la escisión por medio de la formación de imágenes fluorescentes. La muestra de control solo con sonda contenía 10 pmol de oligonucleótido 32 161-2 (SEC ID Nº 87). Cada 3 μl de mezcla de enzima contenían 5 ng de nucleasa CLEAVASE DN en MgCl2 7,5 mM. La mezcla de TdT (por cada 4 μl) contenía: 10 U de TdT (Promega), CoCl2 1 M, KCl 50 mM y 100 μM de dTTP. Las mezclas de reacción de escisión

con INVASOR que se han descrito anteriormente se montaron en tubos de paredes finas y las reacciones se

iniciaron por la adición de 3 μl de mezcla de enzima CLEAVASE DN. Las reacciones se incubaron a 65ºC durante 20 min. Después de enfriar a 37ºC, se añadieron 4 μl de la mezcla de TdT y las muestras se incubaron durante 4 min a 37ºC, después se añadió Biotina-16-dUTP a 100 μM y las muestras se incubaron durante 50 min a 37ºC. Las reacciones se terminaron por la adición de 1 μl de EDTA 0,5 M.

Para analizar la eficacia de prolongación, los productos se procesaron en un gel de acrilamida. Se mezclaron cuatro

microlitros de cada mezcla de reacción con 2,6 μl de formamida al 95%, EDTA 10 M y violeta de metilo al 0,05% y se calentaron hasta 90ºC durante 1 min y se cargaron 3 μl en un gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (reticulado 19:1) con urea 7 M, en tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 8,3) y EDTA 1,4 mM. También se añadió un marcador (FX174-HinfI [marcado con fluoresceína]). Después de la electroforesis, el gel se analizó usando un Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi) equipado con un filtro de 505 nm. La exploración resultante se muestra en la Fig. 67.

En la Fig. 67, el carril 1 contenía solamente la sonda 32-161-2, sin ningún tratamiento. Los carriles 2 y 3 contenían los productos de reacciones realizadas sin ADN diana, sin o con prolongación por TdT, respectivamente. Los carriles 4 y 5 contenían los productos de reacciones realizadas con ADN diana, oligonucleótido sonda 32-161-4 (SEC ID Nº 87) y oligonucleótido INVASOR 32-161-1 (SEC ID Nº 88), sin o con prolongación con TdT posterior, respectivamente. Los carriles 6 y 7 muestran los productos de reacciones que contenían ADN diana, oligonucleótido sonda 32-161-4 (SEC ID Nº 89) y oligonucleótido INVASOR 32-161-1 (SEC ID Nº 88), sin o con prolongación por TdT posterior, respectivamente. El carril “M” contiene el marcador X174-HinfI. Los productos de reacción de los carriles 4 y 5 fueron iguales que los observados en los carriles 6 y 7, con la

excepción de que la ausencia de una fluoresceína 5’ en la sonda evita la detección del producto 5’ liberado (indicado como “A” cerca de la parte inferior del gel) o el producto 5’ extendido por TdT (indicado como “B” cerca de la parte superior del gel). La parte 3’ marcada con Cy3 de la sonda escindida es visible en todas estas reacciones (indicado como “C”, justo debajo del centro del gel).

Para demostrar la detección de productos de escisión dirigida por INVASOR dependiente de diana en un soporte sólido, se ensayaron las reacciones de los carriles 3 y 5 en el Universal GENECOMB (Bio-Rad) que es una matriz de nitrocelulosa convencional en un soporte rígido de nylon diseñado en un formato de peine, como se representa en la Fig. 68. Se siguió el protocolo del fabricante con una modificación: se usaron 10 μl de las reacciones de escisión dirigidas por INVASOR en lugar del 10% recomendado de una PCR. Para capturar los productos de escisión, se aplicaron puntualmente 2,5 pmol del oligonucleótido de captura 59-28-1 (SEC ID Nº 90) en cada diente. Las etapas de captura y visualización se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en la figura 68.

En la Fig. 68, los dientes con los números 6 y 7 muestran los resultados de captura de reacciones realizadas sin y con ADN diana presente. El diente 8 muestra el control positivo del kit.

La oscuridad de la mancha observada en el diente 7, en comparación con el diente 6, indica claramente que pueden detectarse específicamente productos de ensayos de escisión dirigida por INVASOR en soportes sólidos. Aunque el Universal GENECOMB se usó para demostrar la captura en soporte sólido en este caso, serían igualmente adecuados otros procedimientos de captura en soporte conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, pueden revestirse fácilmente perlas o las superficies de recipientes de reacción con oligonucleótidos de captura de manera que puedan usarse en esta etapa. Como alternativa, pueden revestirse fácilmente soportes sólidos similares con estreptavidina o anticuerpos para la captura de productos marcados con biotina o con hapteno de la reacción escisión/prolongación. En cualquiera de estas realizaciones, los productos pueden visualizarse de forma apropiada detectando la fluorescencia, quimioluminiscencia, cambios colorimétricos, emisiones radiactivas, cambio de densidad óptica resultantes o cualquier otra característica distinguible del producto.

EJEMPLO 31

Comparación de los efectos de longitud de invasión y marcador 5’ de la sonda sobre escisión dirigida por INVASOR por las nucleasas CLEAVASE A/G y FEN-1 de Pfu

Para investigar el efecto de la longitud de invasión así como el efecto del tipo de colorante sobre la capacidad de FEN-1 de Pfu y de la nucleasa CLEAVASE A/G de escindir brazos 5’, se realizó el siguiente experimento. Se montaron tres sondas de secuencias similares marcadas con fluoresceína, TET o Cy3, en reacciones con tres oligonucleótidos INVASOR que crearon regiones de hibridación con diana solapantes de ocho, cinco y tres bases a lo largo del ácido nucleico diana, M13mp18

Las reacciones se realizaron del siguiente modo. Todas las condiciones se realizaron por duplicado. Se ensamblaron mezclas de enzimas para FEN-1 de Pfu y la nucleasa CLEAVASE A/G. Cada 2 μl de la mezcla de FEN-1 de Pfu contenían 100 ng de FEN-1 de Pfu (preparado como se describe en el Ej. 28) y 7,5 mM MgCl2. Cada 2 μl de la mezcla CLEAVASE A/G contenían 5,3 ng de la nucleasa CLEAVASE A/G y MnCl2 4,0 mM. Se montaron seis mezclas maestras que contenían tampón, M13mp18 y oligonucleótidos INVASOR. Cada 7 μl de mezclas 1-3 contenían 1 fmol de M13mp18,d 10 pmol de oligonucleótido INVASOR (34-078-4 [SEC ID Nº 39], 24-181-2 [SEC ID Nº 91] o 24-181-1 [SEC ID Nº 92] en MOPS 10 mM (pH 7,5), LiCl 150 mM. Cada 7 μl de mezclas 4-6 contenían 1 fmol de M13mp18,d 10 pmol de oligonucleótido INVASOR (34-078-4 [SEC ID Nº 39], 24-181-2 [SEC ID Nº 91] o 24181-1 [SEC ID Nº 92] en Tris 10 mM (pH 8,0). Las mezclas 1-6 se dividieron después en tres mezclas cada una, a las que se añadió la sonda marcada con fluoresceína (oligonucleótido 34-078-01; SEC ID Nº 86), la sonda marcada con Cy3 (oligonucleótido 43-20; SEC ID Nº 93) o la sonda marcada con TET (oligonucleótido 90; SEC ID Nº 32 que contiene un marcador TET 5’). Cada 7 μl de todas las mezclas contenían 10 pmol de sonda correspondiente. Las soluciones de ADN que se han descrito anteriormente se cubrieron con 10 μl de barrera contra evaporación

CHILLOUT y se llevaron a 68ºC.

Las reacciones obtenidas a partir de las mezclas 1-3 se iniciaron con 2 μl de la mezcla de nucleasa CLEAVASE A/G y las reacciones obtenidas a partir de las mezclas 4-6 se empezaron con 2 μl de la mezcla de FEN-1 de Pfu. Después de 30 minutos a 68 ºC, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 10 mM y colorantes marcadores al 0,05%. Las muestras se calentaron a 90ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% desnaturalizante (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón que contiene Tris·Borato 45 mM (pH 8,3), EDTA 1,4 mM. Los productos de las reacciones de escisión se visualizaron tras la electroforesis mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO. Los resultados de la sonda marcada con fluoresceína se muestran en la Fig. 69, los resultados de la sonda marcada con Cy3 en la Fig. 70 y los resultados de la sonda marcada con TET en la Fig. 71. En cada una de estas figuras, los productos de escisión por CLEAVASE A/G se muestran en los carriles 1-6 y los productos de escisión por FEN-1 de Pfu se muestran en los carriles 7-12. En todos los casos, el material no cortado aparece como una banda muy oscura cerca de la parte superior del gel, indicada por una “U” a la izquierda. Los productos de escisión dirigida por oligonucleótidos INVASOR con 8, 5 ó 3 bases de solapamiento (es decir, la región “X” tenía una longitud de 8, 5 ó 3 nucleótidos) se muestran en el primer, segundo y tercer par de carriles en cada serie, respectivamente y los extremos 5’ marcados liberados de estas reacciones se indican por los números 8,

5 y 3 a la izquierda. Debe tenerse en cuenta que en las reacciones de escisión mostradas en la Fig. 70, la presencia del colorante Cy3 cargado positivamente hace que los productos más cortos migren más lentamente que los productos de mayor tamaño. Estos productos no contienen ninguna carga positiva adicional (por ejemplo, modificaciones amino como las usadas en el Ej. 23) y por lo tanto, todavía llevan una carga neta negativa y migran hacia el electrodo positivo en una separación por electroforesis convencional.

Por estos datos puede verse que las nucleasas con especificidad de estructura FEN-1 de Pfu y CLEAVASE A/G responden de manera diferente tanto a la identidad del colorante como al tamaño de la pieza a escindir de la sonda. La nucleasa FEN-1 de Pfu mostró mucha menos variabilidad en la respuesta a la identidad del colorante que la nucleasa CLEAVASE A/G, lo que demuestra que cualquier colorante sería adecuado para el uso con esta enzima Por el contrario, la cantidad de escisión catalizada por la nucleasa CLEAVASE A/G variaba sustancialmente con la identidad del colorante. El uso del colorante fluoresceína dio resultados muy parecidos a los observados con la nucleasa FEN- 1 de Pfu, mientras que el uso de Cy3 o TET proporcionó una señal reducida espectacularmente en comparación con las reacciones de FEN-1 de Pfu. La única excepción a esto estuvo en la escisión del producto de 3 nucleótidos que llevaba un colorante TET (carriles 5 y 6, Fig. 71), en el que la nucleasa CLEAVASE A/G proporcionó escisión a la misma velocidad que la nucleasa FEN-1 de Pfu. Estos datos indican que, aunque puede usarse CLEAVASE A/G para escindir sondas marcadas con estos otros colorantes, la nucleasa FEN-1 de Pfu es una nucleasa preferida para escindir sondas marcadas con Cy3 y TET.

EJEMPLO 32

Examen de los efectos de una carga positiva 5’ sobre la velocidad de escisión invasiva usando las nucleasas

CLEAVASE A/G FEN-1 de Pfu

Para investigar si las cargas positivas en el extremo 5’ de oligonucleótidos sonda que contienen uno o más aductos

cargados positivamente (es decir, tecnología de inversión de carga o sondas CRT como se describen en los Ej. 23 y 24 tienen un efecto sobre la capacidad de las nucleasas CLEAVASE A/G o FEN-1 de Pfu para escindir el brazo 5’ de la sonda, se realizó el siguiente experimento.

En las reacciones con INVASOR se utilizaron dos oligonucleótidos sonda que tenían las siguientes secuencias: Sonda 34-180-1: (N-Cy3)TNH2TNH2CCAGAGCCTAATTTGCC AGT(N-fluoresceína)A, en la que N representa un espaciador que contiene Cy3 o un grupo fluoresceína (SEC ID Nº 94) y la sonda 34-180-2: 5’-(N-TET)TTCCAGAGCC TAATTT-GCCAGT-(N-fluoresceína)A, en la que N representa un espaciador que contiene el grupo TET o fluoresceína (SEC ID Nº 95). La sonda 34-180-1 tiene modificadores amino en los dos restos T del extremo 5’ y un marcador Cy3 en el extremo 5’, creando cargas positivas adicionales en el extremo 5’. La sonda 34180-2 tiene un marcador TET en el extremo 5’, sin cargas positivas adicionales. El marcador de fluoresceína en el extremo 3’ de la sonda 34-180-1 permite la visualización de los productos escindidos 3’ y sondas no escindidas conjuntamente en un gel de acrilamida procesado en la dirección convencional (es decir, migrando el ADN hacia el electrodo positivo). El producto escindido 5’ de la sonda 34-180-1 tiene una carga neta positiva y no migrará en la misma dirección que la sonda no escindida y, por lo tanto, se visualiza por separación en un gel procesado en la dirección opuesta (es decir, migrando este ADN hacia el electrodo negativo).

Las reacciones se realizaron del siguiente modo. Todas las condiciones se realizaron por duplicado. Se ensamblaron mezclas de enzimas para las nucleasas FEN-1 de Pfu y CLEAVASE A/G. Cada 2 μl de la mezcla de FEN-1 de Pfu contenían 100 ng de FEN-1 de Pfu (preparado como se describe en el Ej. 28) y 7,5 mM MgCl2. Cada 2 μl de la mezcla de nucleasa CLEAVASE A/G contenían 26,5 ng de la nucleasa CLEAVASE A/G y MnCl2 4,0 mM. Se montaron seis mezclas maestras que contenían tampón, M13mp18 y oligonucleótidos INVASOR. Cada 7 μl de

mezcla 1 contenían 5 fmol de M13mp18, 10 pmol de oligonucleótido INVASOR 123 (SEC ID Nº 96) en HEPES 10 mM (pH 7,2). Cada 7 μl de mezcla 2 contenían 1 fmol de M13mp18, 10 pmol de oligonucleótido INVASOR 123 en HEPES 10 mM (pH 7,2). Cada 7 μl de mezcla 3 contenían 5 fmol de M13mp18, 10 pmol de oligonucleótido INVASOR 123 en HEPES 10 mM (pH 7,2), KGlu 250 mM. Cada 7 μl de mezcla 4 contenían 1 fmol de M13mp18, 10 pmol de oligonucleótido INVASOR 123 en HEPES 10 mM (pH 7,2), KGlu 250 mM. Para cada 7 μl de cada mezcla se

añadieron 10 pmol de sonda 34-180-1 (SEC ID Nº 94) o sonda 34-180-2 (SEC ID Nº 95). Las soluciones de ADN que se han descrito anteriormente se cubrieron con 10 μl de barrera contra evaporación CHILLOUT y se llevaron a 65ºC. Las reacciones preparadas a partir de las mezclas 1-2 se iniciaron mediante la adición de 2 μl de la mezcla FEN-1 de Pfu y las reacciones preparadas a partir de las mezclas 3-4 se iniciaron mediante la adición de 2 μl de la mezcla de nucleasa CLEAVASE A/G. Después de 30 minutos a 65 ºC, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95% con EDTA 10 mM. Las muestras se calentaron a 90ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 20% desnaturalizante (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón que contiene Tris·Borato 45 mM (pH 8,3), EDTA 1,4 mM y un gel de acrilamida nativo al 20% (reticulado a 29:1) en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 8,3) y EDTA 1,4 mM.

Los productos de las reacciones de escisión se visualizaron tras la electroforesis mediante el uso de un aparato para la formación de imágenes fluorescentes Hitachi FMBIO. Las imágenes resultantes se muestran en las Figs. 72. La Fig. 72A muestra el gel desnaturalizante que se procesó en la dirección de electroforesis convencional y la Fig. 72B muestra el gel nativo que se procesó en la dirección inversa. Los productos de reacción producidos por las nucleasas FEN-1 de Pfu y CLEAVASE A/G se muestran en los carriles 1-8 y 9-16, respectivamente. Los productos de las reacciones de 5 fmol de M13mp18 y 1 fmol de M13mp18 se muestran en los carriles 1-4, 9-12 (6 fmol) y 5-8, 13-16 (1 fmol). La sonda 24-180-1 está en los carriles 1-2, 5-6, 9-10, 13-14 y la sonda 34-180-2 está en los carriles 3-4, 7-8, 11-12, 15-16.

Los fragmentos del extremo 3’ marcados con fluoresceína de todas las reacciones de escisión se muestran en la Fig. 72A y se indican por una marca “3’” a la izquierda. Los productos marcados con TET 5’ de 3 nucleótidos no son visibles en esta figura, mientras que los productos marcados con Cy3 5’ se muestran en la Fig. 72B.

Las bandas del extremo 3’ de la Fig. 72A pueden usarse para comparar las velocidad de escisión por las diferencias enzimas en presencia de los diferentes marcadores del extremo 5’. Por esta banda puede observarse que

independientemente de la cantidad de ácido nucleico diana presente, tanto la nucleasa FEN-1 de Pfu como la nucleasa CLEAVASE A/G muestran más producto a partir de la sonda marcada con TET 5’. Con la nucleasa FEN-1 de Pfu esta preferencia es modesta, con un aumento en la señal de sólo un 25 al 40%. Sin embargo, en el caso de la nucleasa CLEAVASE A/G hay una fuerte preferencia por el marcador TET 5’. Por lo tanto, aunque cuando se usa el procedimiento de inversión de carga para separar los productos, se observa una cantidad sustancial de producto en las reacciones catalizadas por nucleasa CLEAVAGE A/G, la nucleasa FEN-1 de Pfu es una enzima preferida para la escisión de las sondas marcadas con Cy3.

EJEMPLO 33

El uso de bases universales en la detección de apareamientos erróneos por escisión dirigida por INVASOR

La expresión “base degenerada” se refiere a una base en un nucleótido que no forma enlaces de hidrógeno de una forma convencional de “Watson-Crick” con una base específica complementaria ( es decir, A con T y G con C). Por ejemplo, puede hacerse que la base inosina se empareje por medio de uno o dos enlaces de hidrógeno con todas

las bases naturales (el efecto de “tambaleo” (wobble)) y por lo tanto se denomina degenerada. Como alternativa, una base degenerada puede no formar pares de bases; este tipo de base se ha denominado base “universal” porque

puede colocarse en la posición opuesta a cualquier nucleótido en un dúplex y aunque no puede contribuir a la estabilidad por la formación de pares de bases, no desestabiliza activamente empujando a la base opuesta. Los dúplex que usan estas bases universales se estabilizan únicamente por interacciones de apilamiento. En la Fig. 73 se muestran dos ejemplos de bases universales, 3-nitropirrol y 5-nitroindol. En la hibridación, la colocación de un 3 nitropirrol a tres bases de una posición de apareamiento erróneo mejora el reconocimiento diferencial de apareamientos erróneos de una base. La mejor discriminación parece deberse al efecto de desestabilización de la base no natural (es decir, una Tf alterada muy cerca del apareamiento erróneo). Para ensayar este mismo principio como una forma para detectar sensiblemente apareamientos erróneos usando en el ensayo de escisión dirigida por INVASORTM, se diseñaron oligonucleótidos INVASOR que usan las bases universales mostradas en la Fig. 73, en presencia o ausencia de un apareamiento erróneo natural. En estos experimentos, se examinó el uso de una sola base de nitropirrol o pares de bases de nitroindol que flanquean el sitio del apareamiento erróneo.

Los oligonucleótidos diana, sonda e INVASOR usados en estos ensayos se muestran en la Fig. 74. Como diana se usó un oligonucleótido de 43 nucleótidos (oligonucleótido 109; SEC ID Nº 97). El oligonucleótido sonda (oligonucleótido 61; SEC ID Nº 50) libera un producto marcado con una carga neta positiva tras la escisión. En la Fig. 74, el oligonucleótido INVASOR se muestra esquemáticamente encima del oligonucleótido diana como una flecha; la punta de flecha grande indica la localización del apareamiento erróneo entre los oligonucleótidos INVASOR y la diana. Debajo del oligonucleótido diana se muestra el oligonucleótido INVASOR completamente natural (es decir, sin bases universales) y completamente complementario (oligonucleótido 67; SEC ID Nº 51) y un compuesto de oligonucleótidos INVASOR que contienen bases universales (“X”) en cualquier lado del apareamiento erróneo (“M”). Se emplearon los siguientes oligonucleótidos INVASOR: el oligonucleótido 114 (SEC ID Nº 98) que

contiene un apareamiento erróneo de un solo nucleótido; el oligonucleótido 115 (SEC ID Nº 99) que contiene dos bases de 5-nitroindol y ningún apareamiento erróneo; el oligonucleótido 116 (SEC ID Nº 100) que contiene dos bases de 5-nitroindol y un apareamiento erróneo de un solo nucleótido; el oligonucleótido 112 (SEC ID Nº 101) que contiene una base de 3-nitropirrol y ningún apareamiento erróneo; el oligonucleótido 113 (SEC ID Nº 102) que contiene una base de 5-nitropirrol y un apareamiento erróneo de un solo nucleótido; y el oligonucleótido 67 (SEC ID Nº 51) que es completamente complementario a la diana.

Las reacciones de escisión dirigida por IINVASOR se realizaron en 10 μl de MOPS 10 mM (pH 7,2), KCl 100 mM que contienen 1 μM del oligonucleótido invasor apropiado (oligonucleótido 67, 112-116), diana sintética 109 10 nM, sonda 61 marcada con Cy3 1 μM y 2 unidades de CLEAVASE DV (preparada como se describe en el Ej. 27). Las reacciones se cubrieron con cera líquida Chill-Out®, se llevaron a la temperatura de reacción apropiada, 52ºC, 55ºC

o 58ºC y se iniciaron con la adición de 1 μl de MnCl2 40 mM.. Las reacciones se dejaron continuar durante 1 hora y se detuvieron por la adición de 10 μl de formamida. Un cuarto del volumen total de cada reacción se cargó en geles

de poliacrilamida no desnaturalizantes al 20% que se sometieron a electroforesis en la dirección inversa. Los productos se visualizaron usando un explorador fluorescente Hitachi FMBIO-100 usando un filtro de 585 nm. . Las imágenes resultantes se muestran en las Figs. 75A-C. En cada panel, los carriles 1-6 contienen productos de reacción de reacciones que usan el oligonucleótido INVASOR 67, 114, 115, 116, 112 y 113, respectivamente. Las reacciones realizadas a 52ºC, 55ºC y 58ºC se muestran en los Paneles A, B y C, respectivamente.

Estos datos muestran que dos 5-nitroindoles flanqueantes presentan una diferenciación significativamente mayor que el sistema de un 3-nitropirrol o la hibridación de todas las bases naturales y este aumento de sensibilidad no depende de la temperatura. Esto demuestra que el uso de bases universales es una forma útil para detectar sensiblemente apareamientos erróneos de una sola base entre el ácido nucleico diana y el complejo de oligonucleótidos de detección de la presente invención.

EJEMPLO 34 - Referencia

Detección de mutaciones puntuales en el oncogen ras humano usando una minisonda

En este documento se demuestra que pueden usarse sondas muy cortas para una detección sensible de secuencias de ácido nucleico diana (Ej. 37). En este ejemplo se demuestra que las sondas cortas funcionan de forma muy deficiente cuando se aparean erróneamente con la diana y por lo tanto pueden usarse para distinguir una secuencia de ácido nucleico dada de una muy relacionada con una diferencia en únicamente una sola base. Para analizar este sistema se crearon secuencias diana sintéticas del oncogen ras humano que variaban entre sí en una posición. El oligonucleótido 166 (SEC ID Nº 103) proporcionó la secuencia diana de ras de tipo silvestre. El oligonucleótido 165 (SEC ID Nº 104) proporcionó la secuencia diana de ras mutante. La secuencia de estos oligonucleótidos se muestra en la Fig. 76 y el sitio de variación de secuencia en el sitio correspondiente al codón 13 del gen ras está indicado. El oligonucleótido INVASOR (oligo 162) tiene la siguiente secuencia: 5’-GSCSTSCSASASGSGSCSACTCTTGCC TACGA-3’ (SEC ID Nº 105), en la que “S” indica enlaces tiol –(es decir, éstos son 2’-desoxinucleótidos-5’-O-(1tiomonofosfato)). La minisonda (oligonucleótido 161) tiene la secuencia: 5’-(N-Cy3) TNH2TNH2CACCAG-3’ (SEC ID Nº 106) está diseñada para detectar la secuencia diana de ras mutante (es decir, es completamente complementaria al oligonucleótido 165). El oligonucleótido apilador (oligonucleótido 164) tiene la secuencia: 5’-CSTSCSCSASASCS TSASCCACAAGTTTATATTCAG-3’ (SEC ID Nº 107). En la Fig. 76 se representa un esquema que muestra el montaje de estos oligonucleótidos en una estructura de escisión.

Cada reacción de escisión contenía 100 nM tanto del oligonucleótido invasor (oligonucleótido 162) como del oligonucleótido apilador (oligonucleótido 164), sonda marcada con Cy3 10 μM (oligonucleótido 161) y 100 pM del oligonucleótido 165 o el oligonucleótido 166 (ADN diana) en 10 μl de HEPES 10mM (pH 7,2), KGlu 250 mM, MnCl2

4 mM. Las mezclas de ADN se cubrieron con aceite mineral, se calentaron a 90ºC durante 15 s y después se llevaron a una temperatura de reacción de 47ºC, 50ºC, 53ºC o 56ºC. Las reacciones se iniciaron por la adición de 1 μl de 100 ng/μl de FEN-1 de Pfu. Las reacciones se dejaron continuar durante 3 horas y se detuvieron mediante la adición de 10 μl de formamida. Un cuarto del volumen total de cada reacción se cargó en gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 20% que se sometió a electroforesis en la dirección inversa. El gel se exploró usando un explorador fluorescente Hitachi FMBIO-100 equipado con un filtro de 585 nm y la imagen resultante se muestra en la Fig. 77.

En la Fig. 77, para cada temperatura de reacción ensayada, se muestran los productos de reacciones que contenían la secuencia diana de ras mutante (oligonucleótido 165) o de tipo silvestre (oligonucleótido 166).

Estos datos demuestran que la minisonda puede usarse para discriminar de forma sensible entre secuencias que difieren en un solo nucleótido. La minisonda se escindió produciendo una señal fuerte en presencia de la secuencia diana mutante, pero se escindió una cantidad de minisonda pequeña o nula en presencia de la secuencia diana de tipo silvestre. Además, la discriminación entre dianas muy relacionadas es eficaz en un intervalo de temperaturas de al menos 10ºC, que es un intervalo mucho más amplio de temperaturas que las que pueden tolerarse normalmente cuando la selección se basa únicamente en hibridación (por ejemplo, hibridación con ASO). Esto sugiere que la enzima puede ser un factor en la discriminación, siendo la minisonda perfectamente acoplada el sustrato preferido en comparación con la minisonda desacoplada. De esta manera, este sistema proporciona una detección sensible y específica de secuencias de ácido nucleico diana.

EJEMPLO 35

Efectos de identidad del extremo 3’ sobre el sitio de escisión de una estructura oligonucleotídica modelo

Como se ha descrito en los anteriores Ejemplos, las nucleasas específicas de estructura escinden cerca de la unión entre regiones de hélice única y con emparejamiento de bases en un dúplex bifurcado, habitualmente aproximadamente un par de bases en la región con emparejamiento de bases. En el Ejemplo 10 se mostró que

nucleasas 5’ termoestables, incluidas las de la presente invención (por ejemplo, nucleasa CLEAVASE BN, nucleasa

CLEAVASE A/G), tienen la capacidad de escindir una mayor distancia al interior de la región con emparejamiento de

bases cuando se proporcionan con un oligonucleótido cadena arriba que lleva una región 3’ que es homóloga a una región 5’ del dúplex sujeto, como se muestra en la Fig. 26. También se ha determinado que el nucleótido 3’ terminal

del oligonucleótido INVASOR puede estar no emparejado con el ácido nucleico diana y todavía desplazar la escisión la misma distancia dentro del dúplex cadena abajo que cuando está emparejado. En este ejemplo se demuestra que éste es el componente base del nucleótido, no el azúcar ni el fosfato, que es necesario para desplazar la escisión.

Las figuras 78A y B muestran un oligonucleótido sintético que se diseñó para plegarse sobre sí mismo que está constituido por la siguiente secuencia: 5’-GTTCTCTGCTCTCTGGTC GCTGTCTCGCTTGTGAAACAAGCGAGACAGCGT- GGTCTCTCG-3’ (SEC ID Nº 29). Este oligonucleótido se denomina la “Horquilla S-60”. La horquilla de 15 pares de bases formada por este oligonucleótido se estabiliza adicionalmente mediante la secuencia de “tri bucle” en el extremo del bucle (es decir, tres nucleótidos forman la

parte de bucle de la horquilla) (Hiraro y col., Nucleic Acids Res., 22(4): 576 [1994]). La Fig. 78B también muestra la secuencia del oligonucleótido P-15 (SEC ID Nº 30) y la ubicación de la región de complementariedad compartida por los oligonucleótidos de horquilla P-15 y S60. Además del oligonucleótido P-15 mostrado, también se analizó la escisión en presencia del oligonucleótido P-14 (SEC ID Nº 108) (P-14 tiene una base menos en el extremo 3’ que P15), el P-14 con un azúcar abásico (P-14d; SEC ID Nº 109) y el P14 con un azúcar abásico con un fosfato 3’ (P14dp; SEC ID Nº 110). También se examinó un oligonucleótido P-15 con un fosfato 3’ (SEC ID Nº 111). Las flechas negras mostradas en la Fig. 78 indican los sitios de escisión de la horquilla S-60 en ausencia (estructura superior; A)

o en presencia (estructura inferior; B) del oligonucleótido P-15.

La molécula de horquilla S-60 se marcó en su extremo 5’ con fluoresceína para detección posterior. La horquilla S60 se incubó en presencia de una nucleasa 5’ termoestable en presencia o ausencia del oligonucleótido P-15. La presencia del dúplex completo que se puede formar por la horquilla S-60 se demuestra por escisión con la nucleasa 5’ Cleavase® BN, de un modo independiente de cebador (es decir, en ausencia del oligonucleótido P-15). La liberación de fragmentos de 18 y 19 nucleótidos del extremo 5’ de la molécula de horquilla S-60 mostró que la escisión tuvo lugar cerca de la unión entre las regiones de hélice única y doble cuando nada hibrida con el brazo 3’

de la horquilla S-60 (Fig. 27, carril 2).

Las reacciones mostradas en la Fig. 78C se realizaron en 10 μl de tampón CFLP 1X con MnCl2 1 mM y K-Glutamato 50 mM, en presencia de S-60 0,02 μM, oligonucleótido INVASORTM 0,5 μM y 0,01 ng por μl de nucleasas CLEAVASE BN. Las reacciones se incubaron durante 5 minutos a 40 ºC y se detuvieron mediante la adición de 8 μl

de tampón de detención (formamida al 95%, EDTA 20 mM, violeta de metilo al 0,02%). Las muestras se calentaron a 75ºC durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 15% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los geles se analizaron después con un Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi) equipado con un filtro de 505 nm. La imagen resultante se muestra en la Fig. 78C.

En la Fig. 78C, el carril 1 contiene productos del control sin enzima; el carril 2 contiene productos de una reacción realizada en ausencia de un oligonucleótido INVASOR; los carriles 3-6 contienen productos de reacciones realizadas en presencia de los oligonucleótidos INVASOR P-14d, P-14dp, P-15 y P-15p respectivamente.

A partir de los datos mostrados en la Fig. 78C, puede verse que el uso del oligonucleótido INVASOR P-15 produce un cambio en el sitio de escisión, mientras que el oligonucleótido INVASOR P-14 con una ribosa (P14d) o una ribosa fosforilada (P14dp) no lo hacía. Esto indica que el 15º resto del oligonucleótido INVASOR debe tener el grupo de base unido para promover el cambio en la escisión. Es interesante el hecho de que la adición de fosfato al extremo 3’ del oligonucleótido P15 aparentemente invertía el cambio del sitio de escisión. La escisión en este carril puede ser, de hecho, una escisión en ausencia de un oligonucleótido INVASOR como se observa en el carril 2. En experimentos con oligonucleótidos INVASOR marcados con colorante 5’ con grupos fosfato 3’, estos oligonucleótidos se han retrasado gravemente en la migración en el gel, lo que sugiere que la enzima u otro

constituyente de la reacción (por ejemplo, BSA) puede unirse al fosfato 3’ independientemente del resto de la

estructura de escisión. Si efectivamente los oligonucleótidos INVASOR se están secuestrando de la estructura de 5 escisión, la escisión resultante de la horquilla S-60 se produciría de una forma “independiente de cebador” y por lo tanto, no se desplazaría.

Además del estudio que se ha citado anteriormente, se investigaron los efectos de otros sustituyentes sobre los

extremos 3’ de los oligonucleótidos INVASOR en presencia de varias enzimas diferentes y en presencia de Mn++ o Mg++. Los efectos de estas modificaciones en el extremo 3’ sobre la generación del producto escindido se resumen

10 en la siguiente tabla. Todas las modificaciones se realizaron durante síntesis de oligonucleótidos convencional por medio del uso de columnas de síntesis con vidrio de poro controlado (CPG) con el resto químico indicado proporcionado en el soporte como residuo de inicio de la síntesis. Todos estos materiales de CPG se obtuvieron en Glen Research Corp. (Sterling, VA).

La Fig. 79 proporciona las estructuras para los sustituyentes del extremo 3’ usados en estos experimentos.

15 TABLA 4

Estudios de modificación en el extremo 3’ de oligonucleótido INVASOR

Modificación en el extremo 3’: Extensión por transferasa terminal Efecto sobre reacción con INVASOR (como INVASOR) Efecto de Enzima: Condición

3’ fosfato Parte Glen nº 20-2900-42: No A:5 – inhibe la reacción, sin actividad detectable

3’ acridina Parte Glen nº 20-2973-42: SÍ, poco A:5 – disminución de la actividad, <10% B:5 – disminución de la actividad, <10% B:4 – disminución de la actividad, <10% C:1 – disminución de la actividad, <10% C:2 – disminución de la actividad, ~20% C:4 – disminución de la actividad, ~50% C:3 – disminución de la actividad, <5%

3’ carboxilato Parte Glen nº 20-4090-42: No A:1 – disminución de la actividad, ~50% cambio de la actividad en el sitio de escisión C:3 – reduce la actividad, <10%

3’ nitropirrol Parte Glen nº 20-2143-42: Sí A:5 – disminución de la actividad, ~2X

3’ nitroindol Parte Glen nº 20-2144-42: Sí A:5 – disminución de la actividad, ~33%

3’ arabinosa Parte Glen nº 10-4010-90: Sí A:5 – disminución de la actividad, ~50% de actividad

Estudios de modificación en el extremo 3’ de oligonucleótido INVASOR

3’didesoxiUTP-fluoresceína: No A:5 – disminución de la actividad, ~40% de actividad

Enlace 3’-3’ Parte Glen nº 20-0002-01: No A:1 – cambio de actividad de escisión equivalente en el sitio de escisión C:3 – disminución de la actividad, ~25% de la actividad

3’ glicerilo Parte Glen nº 20-2902-42: SÍ, muy poco C:3 – disminución de la actividad, ~30% de pérdida de actividad de escisión (2 sitios)

Modificador amino 3’ C7 Parte Glen nº 20-2957-42: Sí C:3 – disminución de la actividad, ~30% de pérdida de actividad de escisión, múltiples sitios

3’desoxi, 2’OH Parte Glen nº 20-2104-42: SÍ, muy poco A:5 – disminución de la actividad, <20% de la actividad B:5 – disminución de la actividad, <20% de la actividad B:3 – disminución de la actividad, <20% de la actividad C:1 – actividad equivalente C:2 – actividad equivalente C:4 – incremento de la actividad C:3 – disminución de la actividad, ~40% de la actividad

Enzimas: b) Nucleasa CLEAVASE DV B) Nucleasa CLEAVASE BN

5 C) FEN-1 de Pfu

Condiciones: 1) MnCl2 4mM, LiCl 150mM 2) MnCl2 4mM, KCl 50mM

10 3) MgCl2 7,5mM , no monovalente 4) MgCl2 4mM, KCl 50mM 5) MgOAc 10mM, KCl 50mM

Por estos datos puede verse que pueden usarse muchas modificaciones diferentes en el extremo 3’ del

oligonucleótido INVASOR sin que esto sea perjudicial. En varias realizaciones de la presente invención, dichas modificaciones del extremo 3’ pueden usarse para bloquear, facilitar o alterar de otra manera las características de hibridación del oligonucleótido INVASOR (por ejemplo, para aumentar la discriminación contra apareamientos erróneos o para aumentar la tolerancia de apareamientos erróneos o para reforzar la asociación entre el oligonucleótido INVASORTM y el ácido nucleico diana). Pueden usarse algunos sustituyentes para alterar el comportamiento de la enzima en el reconocimiento y escisión dentro del complejo montado.

También pueden usarse extremos 3’ alterados para evitar la extensión del oligonucleótido INVASOR por

polimerasas de ácido nucleido dependientes de molde o independientes de molde. El uso de didesoxioligonucleótidos no modificados de otra manera (es decir, sin colorantes u otros restos unidos) son una forma particularmente preferida para bloquear la extensión de oligonucleótidos INVASOR porque no reducen la actividad de escisión y son completamente inextensibles.

EJEMPLO 36

Efecto de la concentración de sonda, la temperatura y un oligonucleótido apilador sobre la escisión de minisondas por escisión dirigida por INVASOR

Los oligonucleótidos apiladores empleados para formar estructuras de escisión pueden tener dos fines en la detección de una diana de ácido nucleico usando una minisonda. El oligonucleótido apilador puede ayudar a estabilizar la interacción de la minisonda con el ácido nucleido diana, llevando a una mayor acumulación de sonda escindida. Además, la presencia de este oligonucleótido en el complejo alarga el dúplex cadena abajo del sitio de escisión, lo cual puede mejorar la actividad de escisión de algunas de las enzimas de la presente invención. Un ejemplo de diferentes preferencias para longitud de este dúplex por diferentes nucleasas con especificidad de estructura se ve en la comparación de la escisión por la nucleasa CLEAVASE BN y la escisión por la nucleasa FEN1 de Mja de regiones dúplex de 8 pb y 12 pb en la Fig. 65. La mayor afinidad de la enzima por la estructura de escisión también tiene como resultado una mayor acumulación de sonda escindida durante reacciones realizadas durante un periodo de tiempo establecido.

La cantidad de minisonda que se une a la diana también se ve afectada por la concentración de la minisonda en la mezcla de reacción. Aunque una minisonda sólo tiene una probabilidad marginal de hibridar (por ejemplo, cuando la reacción se realiza a temperaturas superiores a la temperatura de fusión esperada del dúplex sonda/diana), la cantidad de sonda en la diana en cualquier momento dado puede aumentarse usando altas concentraciones de la minisonda.

La necesidad de un oligonucleótido apilador para mejorar la escisión de la minisonda se examinó tanto a bajas como a altas concentraciones de sonda. Las reacciones se realizaron en 10 μl de HEPES 10 mM (pH 7,2), KGlu 250 mM, MnCl2 4 mM, que contenían 100 nM tanto del oligonucleótido invasor (oligonucleótido 135; SEC ID Nº 112) como del apilador (oligonucleótido 147; SEC ID Nº 113) y ADN de ssM13 100 pM. Las reacciones se cubrieron con aceite mineral, se calentaron a 90ºC durante 15 s y después se llevaron a la temperatura de reacción. Las reacciones se

realizaron a 35º, 40º, 50º, 55º, 60º y 65º. Las reacciones de escisión se iniciaron por la adición de 1 μl de 100 ng/μl de FEN-1 de Pfu y 1 μl de concentraciones variables de oligonucleótido minisonda 142 marcado con Cy3 (SEC ID Nº 114). Las reacciones se dejaron continuar durante 1 hora y se detuvieron por la adición de 10 μl de formamida. Un

cuarto del volumen total de cada reacción se cargó en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes al 20% que se sometieron a electroforesis en la dirección inversa. Los geles se visualizaron usando un explorador fluorescente Hitachi FMBIO-100 usando un filtro de 585 nm. . Se midió la fluorescencia en cada banda de producto y se creó el gráfico mostrado en la Fig. 80 usando una hoja de cálculo Microsoft Excel.

Los datos resumidos en la Fig. 80 mostraron que la concentración de la minisonda tenía un efecto significativo sobre la medida final de producto, mostrando aumentos espectaculares cuando se aumentaba la concentración. Los aumentos de la concentración de la minisonda también desplazaron hacia arriba la temperatura óptima de la reacción. En la técnica se sabe que la concentración de las cadenas complementarias en una hibridación afectará a la Tf aparente del dúplex formado entre ellas. Es más significativo para los procedimientos y las composiciones de la presente invención el hecho de que la presencia del oligonucleótido apilador tenga una influencia profunda sobre la velocidad de escisión de la minisonda a todas las concentraciones de sonda. En cada una de las concentraciones de sonda, la presencia del apilador puede llegar a doblar la señal del producto escindido. Esto demostró la utilidad del uso del oligonucleótido apilador en combinación con las minisondas descritas en el presente documento.

EJEMPLO 37

La presencia de un apareamiento erróneo en el oligonucleótido INVASOR disminuye la actividad de escisión de la nucleasa CLEAVASE A/G

En cualquier ensayo de detección de ácido nucleico hay una ventaja adicional si el ensayo puede realizarse para detectar sensiblemente pequeñas diferencias entre ácidos nucleicos relacionados. En el siguiente experimento se usaron sustratos de escisión modelo que eran idénticos excepto por la presencia o ausencia de un apareamiento

erróneo cerca del extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR cuando hibridaba con el ácido nucleico diana modelo.

Después se evaluó el efecto de un apareamiento erróneo en esta región sobre la acumulación de sonda escindida.

Para demostrar el efecto de la presencia de un apareamiento erróneo en el oligonucleótido INVASOR sobre la capacidad de la nucleasa CLEAVASE A/G de escindir el oligonucleótido sonda en un ensayo de INVASOR, se realizó el siguiente experimento. Escisión del oligonucleótido de ensayo IT-2 (SEC ID Nº 115) en presencia de oligonucleótidos INVASOR IT-1 (SEC ID Nº 116) e IT-1A4 (SEC ID Nº 117). El oligonucleótido IT-1 es completamente complementario al brazo 3’ de IT-2, mientras que el oligonucleótido IT-1A4 tiene una sustitución T>A en la posición 4 desde el extremo 3’ que tiene como resultado un apareamiento erróneo A/A en el dúplex

INVASOR -diana. Sería de esperar que los oligonucleótidos INVASOR tanto apareados como apareados incorrectamente hibridaran a la temperatura a la que se realizó la siguiente reacción. La Fig. 91 proporciona un esquema que muestra IT-1 hibridado con la estructura IT-2 plegada y que muestra IT-1A4 hibridado con la estructura IT-2 plegada

Las reacciones se realizaron del siguiente modo. Se incubó oligonucleótido de ensayo IT-2 (0,1 μM) marcado en el extremo 5’ con fluoresceína (Integrated DNA Technologies) con 0,26 ng/l de CLEAVASE AG en 10 μl de tampón CFLP® con MgCl2 4 mM, en presencia de IT-1 1 μM o IT-1A4 a 40ºC durante 10 min; también se procesó un control sin enzima. Las muestras se cubrieron con 15 μl de cera líquida Chill-Out® para evitar la evaporación. Las reacciones se detuvieron por la adición de 4 μl de tampón de terminación (formamida al 95%, EDTA a 20 mM, violeta de metilo al 0,02%). Los productos de escisión se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% y se analizaron con el Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi) equipado con un filtro de 505 nm. La imagen resultante se muestra en la Fig. 82.

En la Fig. 82, el carril 1 contiene productos de reacción del control sin enzima y muestra la migración del oligonucleótido IT-2 no cortado, los carriles 2 -4 contienen productos de reacciones que no contienen oligonucleótido INVASOR, el oligonucleótido INVASOR IT-1 y el oligonucleótido INVASOR IT-1A4, respectivamente.

Estos datos muestran que la escisión se reduce notablemente por la presencia del apareamiento erróneo, incluso en condiciones en las que no sería de esperar que el apareamiento erróneo alterara la hibridación. Esto demuestra que la región de unión al oligonucleótido INVASOR es una de las regiones dentro del complejo en el que puede usarse para detección de apareamiento erróneo, como se muestra por una disminución de la velocidad de escisión.

EJEMPLO 38

Comparación de la actividad de las nucleasas FEN-1 de Pfu y FEN-1 de Mja en la reacción con INVASOR

Para comparar la actividad de las nucleasas FEN-1 de Pfu y FEN-1 de Mja en la reacción con INVASOR se realizó el siguiente experimento. En los ensayos INVASOR se emplearon un oligonucleótido de ensayo IT3 (SEC ID Nº 118) que forma una estructura de horquilla INVASOR-Diana y el oligonucleótido sonda PR1 (SEC ID Nº 119) marcado en el extremo 5’ con fluoresceína (Integrated DNA Technologies) usando las nucleasas FEN-1 de Pfu o FEN-1 de Mja.

Los ensayos se realizaron como se indica a continuación. Se incubaron FEN-1 de Pfu (13 ng/μl) y FEN-1 de Mja (10 ng/μl) (preparadas como se describe en el Ej. 28) con los oligonucleótidos IT3 (0,1 nM) y PR1 (2 y 5 μM) en 10 μl de tampón CFLP®, MgCl2 4 mM, 20 mg/ml de ARNt a 55ºC durante 41 min. Las muestras se cubrieron con 15 μl de barrera contra evaporación Chill-Out® para impedir la evaporación Las reacciones se detuvieron por la adición de 70

μl de tampón de terminación (formamida al 95%, EDTA a 20 mM, violeta de metilo al 0,02%). Los productos de reacción (1 μl) se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20%, se visualizaron usando un aparato

de formación de imágenes fluorescentes y se cuantificaron las bandas correspondientes a la sonda y al producto. La imagen resultante se muestra en la Fig. 83. En la Fig. 83, se muestra la velocidad de renovación por diana y por minuto debajo de la imagen para cada nucleasa a cada concentración de sonda y diana analizada.

En el Ej. 32 se demostró que el uso de la nucleasa con especificidad de estructura FEN-1 de Pfu en la reacción de escisión dirigida por INVASOR producía una velocidad de acumulación de producto más rápida que el uso de CLEAVASE A/G. Los datos presentados en el presente documento demuestran que el uso de nucleasa FEN-1 de Mja con la sonda marcada con fluoresceína aumenta adicionalmente la cantidad de producto generado en una media de aproximadamente un 50%, demostrando que, además de la nucleasa FEN-1 de Pfu, la nucleasa FEN-1 de Mja es una nucleasa con especificidad de estructura preferida para la detección de dianas de ácido nucleico mediante el procedimiento de la presente invención.

EJEMPLO 39

Detección de ácidos nucleicos diana de ARN usando oligonucleótidos minisonda y apilador

Además de la detección del material diana de ADN de M13 que se ha descrito anteriormente, se diseñó un sistema de minisonda/apilador para detectar las secuencias de ARN obtenidas de VHC descritas en el Ej. 19. También se sometió a ensayo a una sonda de longitud intermedia, una sonda de longitud media o una corta convencional. La minisonda (oligonucleótido 42-168-1) tiene la secuencia: 5’-TET-CCGGTCGTCCTGG-3’ (SEC ID Nº 120), oligonucleótido apilador usado (oligonucleótido 32-085) con esta minisonda tiene la secuencia: 5’-CAATTCCGGTGTACTACCGGTTCC-3’ (SEC ID Nº 121). La sonda ligeramente más larga, usada sin oligonucleótido apilador (oligonucleótido 42-088), tiene la secuencia: 5’-TET-CCGGTCGTCCTGGCAA-3’ (SEC ID Nº 122). El oligonucleótido INVASOR usado con ambas sondas tiene la siguiente secuencia: 5’-GTTTATCCAAGAAAGGACCCGGTC-3’ (SEC ID Nº 47). Las reacciones incluían 50 fmol de ARN diana, 10 pmol del oligonucleótido INVASOR y 5 pmol del oligonucleótido minisonda en 10 μl de tampón que contiene MES 10 mM, pH 6,5 con LiCL 150 mM, MnCl2 4 mM, un 0,05% de Tween-20 y un 0,05% de NP-40 y 39 unidades de ARNsin (Promega). Cuando se usó, se añadieron 10 pmol del oligonucleótido apilador. Estos componentes se combinaron, se cubrieron con barrera contra evaporación CHILLOUT y se calentaron a 50ºC; las reacciones se iniciaron mediante la adición de 5 unidades de polimerasa de DNAPTth, hasta un volumen de reacción final de 10 μl. Después de 30 minutos a 50ºC, las reacciones se interrumpieron mediante la adición de 8 μl de formamida al 95%, EDTA a 10mM y violeta de metilo al 0,02%. Las muestras se calentaron hasta 90ºC durante 1 minuto y 2,5 μl de cada una de estas

reacciones se separaron por electroforesis a través de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (reticulación 19:1) con urea 7 M en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 9,4, EDTA 1,4 mM y los productos de reacción marcados se visualizaron usando el Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi). La imagen resultante se muestra en la Fig. 84.

En la Fig. 84, los carriles 1 y 2 muestran los productos de reacciones que contienen el oligonucleótido INVASOR de VHC y la sonda más larga (oligonucleótido 42-088), sin y con el ARN diana presente, respectivamente. Los carriles 3, 4 y 5 muestran los productos de reacciones que contienen el oligonucleótido INVASOR y la sonda más corta (oligonucleótido 42-168-1). El carril 3 es una reacción de control sin ARN diana presente, mientras que los carriles 4 y 5 tienen la diana pero carecen o tienen el oligonucleótido apilador, respectivamente.

En estas condiciones, el oligonucleótido sonda ligeramente más largo (16 nucleótidos) se escindió de una forma bastante fácil sin la ayuda de un oligonucleótido apilador. Por el contrario, la sonda más corta (13 nucleótidos) necesitó la presencia del oligonucleótido apilador para producir niveles de escisión detectables. Estos datos demuestran que el sistema de minisonda de detección de diana por escisión dirigida por INVASOR es igualmente aplicable a la detección de dianas de ARN y ADN. Además, la comparación del comportamiento de escisión de sondas más largas y más cortas en ausencia de un oligonucleótido apilador proporciona un ejemplo de la distinción entre el comportamiento del sistema de minisonda/oligonucleótido apilador y el comportamiento de las sondas de longitud intermedia y largas en la detección de dianas de ácido nucleico.

EJEMPLO 40

Efecto de una cola en 3’ no apareada sobre la transcripción de un promotor completo (sin mella)

Al diseñar el procedimiento de visualización basado en la transcripción de los productos de la escisión dirigida por INVASOR, primero fue necesario evaluar el efecto de una cola 3' sobre la eficacia de la transcripción desde un promotor de longitud completa. Los dúplex analizados en este ejemplo se muestran en la parte inferior de la Fig. 93 y se presentan esquemáticamente en las Fig. 85A-C.

Las reacciones de transcripción se realizaron usando el sistema MEGAshortscriptTM de Ambion, Inc. (Austin, TX), según las instrucciones del fabricante a excepción de la adición de un ribonucleótido marcado con fluoresceína. Cada muestra de ADN se preparó en 4 μl de H2Od libre de RNasa Las reacciones 1-3 contenían cada una 10 pmol del oligo molde de copia 150 (SEC ID Nº 123); la reacción 2 contenía 10 pmol del oligo promotor 151 (SEC ID Nº 124); la muestra 3 contenía 10 pmol del oligo promotor prolongado en 3' 073-065 (SEC ID Nº 125); la muestra 4 no tenía ADN añadido. Se añadieron a cada muestra 6 μl de una solución que contenía 1 μl de 10 x tampón de transcripción, 7,5 mM de cada rNTP; fluoresceína-12-UTP 0,125 mM (Boehringer) y 1 μl de mezcla enzimática MEGAshortscriptTM de T7. Después, las placas se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Se añadió un microlitro de ADNasa 1 libre de RNasa (2 U/μl) a cada muestra y se incubaron las muestras durante 15 minutos más a 37ºC. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de una solución de formamida al 95%, Na2EDTA 5 mM con colorantes de carga. Se calentaron todas las muestras hasta 95ºC durante 2 minutos y se resolvieron 4 μl de cada muestra mediante electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 7 M (pH 8,3) y EDTA 1,4 mM. El gel se analizó usando un analizador de imágenes fluorescentes FMBIO II y la imagen resultante se muestra en la Fig. 93. El ARN producido mediante una transcripción correcta aparece cerca de la mitad del panel, según lo indicado ("ARN").

El examen de los productos de transcripción mostrados en los carriles 2 y 3 muestra que la presencia de la cola 3' sobre el promotor de longitud completa tiene un efecto negativo sobre la eficacia de la transcripción, pero que no la desactiva por completo. Como el objetivo de los análisis de visualización basados en la transcripción de la presente invención consiste en diferenciar entre la sonda sin escindir y los productos más cortos del análisis de escisión invasiva (sonda cortada), estos datos indican que la producción de un promotor de longitud completa en la reacción de escisión sería difícil de resolver desde el fondo creado mediante la transcripción desde los promotores que contienen la sonda sin escindir si no se incluyeran otros oligonucleótidos en el análisis. Los medios para suprimir la transcripción desde tal promotor ramificado se tratan en el apartado de Descripción de la invención y en el Ej. 43.

EJEMPLO 41

Examen de la influencia de la posición de la mella sobre la eficacia de transcripción desde promotores del bacteriófago T7 compuestos parciales y completos

En el apartado de Descripción de la invención, se describe el procedimiento para analizar posibles trozos de promotor para su idoneidad en un análisis relacionado con la escisión invasiva. Un aspecto del análisis consiste en examinar el efecto que tiene un determinado sitio de mella sobre la eficacia de la transcripción desde el promotor compuesto final. Además, se analizan los trozos individuales del promotor mellado en cuanto a la actividad de transcripción en presencia de la cadena sin mellar de longitud completa. En este experimento, se hace una comparación sobre estos puntos entre un promotor compuesto que tiene una mella en la cadena no molde entre los nucleótidos -11 y -10 con respecto al sitio de iniciación (+1), y un promotor que tiene una mella sobre la misma cadena, pero colocada entre los nucleótidos -8 y -7. Los números de figura para las representaciones esquemáticas de los contenidos de cada reacción se indican bajo cada carril (p. ej., 85A = Fig. 85A). El sitio en el que estaría la mella en un promotor compuesto completamente ensamblado usando los oligonucleótidos de la reacción también se indica bajo cada carril ("-11/-10" y "-8/-7").

Las reacciones de transcripción se realizaron usando el sistema MEGAshortscriptTM según las instrucciones del fabricante a excepción de la adición de un ribonucleótido marcado con fluoresceína. Cada muestra de ADN se preparó en 4 μl de H2Od libre de RNasa La reacción 1 no tenía ADN añadido. Las reacciones 2-9 contenían cada una 10 pmol del oligo molde de copia 150 (SEC ID Nº 123). Las reacciones 3 y 4 contenían 10 pmol del oligo sonda "cortada" -11 (oligonucleótido 073-061-01; SEC ID Nº 127) o 20 pmol del oligo promotor parcial -10 073-061-02 (SEC ID Nº 130), respectivamente; y la reacción 5 contenía ambos. Las reacciones 6 y 7 contenían 10 pmol del oligo sonda "cortada" -8 (oligonucleótido 073-062-01; SEC ID Nº 126) o 20 pmol del oligo promotor parcial -7 073062-02 (SEC ID Nº 129), respectivamente; y la reacción 8 contenía ambos. La reacción 9 contenía 10 pmol del oligo promotor intacto 151 (SEC ID N.º 124).

Las reacciones de transcripción Se iniciaron, se incubaron y se finalizaron, y los productos de reacción se resolvieron y se crearon imágenes según lo descrito en el Ej. 40. En la Fig. 92, se muestra la imagen resultante. Los números de reacción corresponden a los números de carril sobre la imagen. El ARN creado mediante la transcripción correcta aparece en el tercio superior de la imagen. La comparación con la reacción control positiva (rxn. 9) muestra que el ARN de longitud completa producido por cada uno de los promotores compuestos es del mismo tamaño que el producido en la reacción de control, indicando que la transcripción se inició en el mismo sitio en cada reacción.

En la Fig. 92, los carriles 3, 4 y 5 comparan la transcripción procedente de las dos especies de promotores ensamblados parcialmente (véanse los esquemas de las Figs. 86A y B) y el promotor compuesto completamente ensamblado (Fig. 88B) que tiene una mella entre los nucleótidos -11 y -10 con respecto al inicio de la transcripción. Se puede observar a partir de estos datos que ningún promotor parcial (carriles 3 y 4) es capaz de mantener la transcripción del molde de copia, pero que el promotor compuesto (carril 5) con este sitio de mella es potentemente transcrito. Lo sorprendente es que la comparación con la reacción de control (carril 9) muestra que la presencia de una mella en este sitio (-11/-10) aumenta realmente la transcripción. Aunque sin limitar la presente invención a un mecanismo en particular, se cree que el aumento de la transcripción es un resultado de tanto la supresión de la formación de los transcriptos abortivos más cortos como de permitir una mayor acumulación del producto de longitud completa. Este resultado es altamente reproducible.

En la Fig. 92, los carriles 6, 7 y 8 comparan la transcripción de un conjunto similar de promotores parciales y completos en los que la mella está desplazada 3 residuos más cerca del sitio de iniciación de la transcripción. El examen del carril 6 muestra que la presencia de 3 bases más sobre las sonda "cortada" -8 (en comparación con la sonda "cortada" -11 del carril 3) permite a este promotor parcial iniciar la transcripción. Esto indica que el sitio -8/-7 sería una mala elección para su uso en esta realización de la presente invención.

Este experimento demuestra el procedimiento para determinar la colocación adecuada de una mella dentro de un ensamblaje de promotores para alcanzar el resultado deseado. Se pueden diseñar fácilmente análisis similares para analizar otras mellas del promotor del bacteriófago T7 analizado en este ejemplo, o para analizar la colocación adecuada de la mella en cualquier promotor de fago, procariota o eucariota deseado.

EJEMPLO 42

Detección de los productos de la escisión dirigida por INVASOR a través de la transcripción desde un promotor compuesto

Los ejemplos descritos anteriormente indican que es posible usar un oligonucleótido pequeño para completar el ensamblaje de un promotor de T7 compuesto, permitiendo así la transcripción desde ese promotor. Los ejemplos anteriores demuestran que la reacción de escisión invasiva se puede usar para liberar productos de oligonucleótido pequeños específicos desde oligonucleótidos sonda más largos. En este ejemplo, se demuestra que estas dos observaciones se pueden combinar, y que los productos de la reacción de escisión invasiva se pueden usar para completar un promotor y permitir la posterior transcripción. En la Fig. 88, se muestran las representaciones esquemáticas de los promotores compuestos analizados en este ejemplo.

Se prepararon dos reacciones de escisión invasiva, una sin (rxn 1) y otra con (rxn. 2) ADN diana de entrada. Las reacciones (1 y 2) comprendían MOPS 10 mM (pH 7,5), Tween-20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, y 20 pmol de oligo sonda 073-067-01 (SEC ID Nº 132) y 10 pmol de oligo INVASOR 073-073-02 (SEC ID Nº 134) en un volumen de 14

μl. La reacción 2 también incluía 100 fmol de ADNmc de M13mp18. Se colocaron las muestras a 60ºC y se añadieron 6 μl de una solución que contenía 20 ng de la FEN-1 de Mja y Mg2Cl 40 mM a cada muestra para iniciar las reacciones. Las muestras se incubaron a 60ºC durante 30 minutos y se detuvieron mediante la adición de 3 μl

NaOAc 2,5 M y Na2EDTA 83 mM (pH 8,0). Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml y luego se precipitaron los ADN mediante la adición de 60 μl de etanol enfriado al 100%, y se almacenaron a -20ºC durante 20 minutos. Se recogieron los sedimentos mediante microcentrifugación, se lavaron una vez con etanol al 80% para eliminar el exceso de sal y luego se secaron al vacío. El producto de esta reacción de escisión invasiva es un oligonucleótido de 12 nucleótidos que tiene la secuencia: 5’-CGAAATTAATAC-3’ (SEC ID Nº 128), denominado sonda cortada -12 (la misma secuencia que el oligo 073-073-03).

Para la transcripción, se disolvió cada una de las muestras secas en 4 μl de una solución que contenía 1 pmol del oligo molde de copia 150 y 2 pmol del oligo promotor parcial -11 073-073-012 (SEC ID Nº 131). Las muestras control 3 y 4 contenían cada una 1 pmol del oligo molde de copia 150; la muestra 3 contenía 1 pmol del oligo sonda 073-067-01 (SEC ID Nº 132) y 2 pmol del oligo promotor parcial -11 073-073-012 (véase la estructura 88A); la muestra 4 contenía 1 pmol del oligo sonda "cortada" -12 073-073-03 (SEC ID Nº 128) y 2 pmol del oligo promotor parcial -11 073-073-012 (véase la estructura 88B). Estas son las estructuras que se esperaría que existieran en las reacciones de transcripción procedentes de las dos reacciones de escisión invasiva descritas anteriormente.

Las reacciones de transcripción Se iniciaron, se incubaron y se finalizaron, y los productos se resolvieron y se crearon imágenes según lo descrito en el Ej. 40. La imagen resultante se muestra en la mitad derecha de la Fig. 89 (carriles 6-9). Las muestras 3 y 4 aparecen en los carriles 6 y 7, respectivamente, y las reacciones 1 y 2 procedentes de los productos de reacción de escisión invasiva (indicados mediante el uso de la "i" minúscula) aparecen en los carriles 8 y 9, respectivamente. El número de Fig. que muestra la representación esquemática de la estructura esperada de promotor en cada reacción se indica sobre cada carril, indicándose también la colocación de la mella. Las letras mayúsculas indican qué estructura de la figura en particular examinar para cada reacción. La "i" minúscula sobre los carriles 8 y 9 indica que estas transcripciones se obtuvieron de las verdaderas reacciones de escisión invasiva. Estos productos se comparan con el ARN producido en la reacción de control en el carril 5, cuyo procedimiento se describe en el Ej. 44. El ARN creado mediante la transcripción correcta aparece en el tercio superior de la imagen (indicado como "ARN").

La reacción mostrada en el carril 6 no muestra transcripción. Esto demuestra que una mella entre los nucleótidos 12 y -11 de la cadena no molde del promotor de T7 elimina la transcripción si el promotor está ensamblado desde la sonda sin cortar tal que el extremo 3' de la sonda forme una ramificación dentro de la secuencia promotora. Esto contrasta con los resultados observados con la mella -11/-10 examinada más adelante. Además, el transcripto aparente del carril 7 muestra que un promotor no ramificado con una mella en el mismo sitio (-12/-11) produce el ARN correcto con pocos productos de iniciación abortivos (véanse los carriles 2 y 5 de la Fig. 89, descritos en el Ej. 44). Las reacciones de los carriles 8 y 9 demuestran que se observa el mismo efecto cuando la reacción de escisión invasiva es el único origen del trozo de secuencia arriba (sonda cortada -12) del promotor de T7. Cabe señalar que el promotor que está transcrito en el carril 8 se completa mediante la presencia de 1 pmol de un oligo sonda "cortada" sintético, sin ninguna sonda sin cortar en la mezcla, mientras que el promotor que está transcrito en el carril 9 se completa mediante el producto de una reacción de escisión invasiva que sólo tiene 100 fmol de ADN diana en el mismo. Esta reacción también incluyó la sonda sin cortar residual (de hasta aprox. 10 pmol) que puede competir por la unión en el mismo sitio. No obstante, la eficacia de las transcripciones procedentes de los productos de la reacción de escisión invasiva se reduce solo ligeramente y las transcripciones están justo tan libres de fondo como la muestra "sin diana" (carril 8). Este ejemplo demuestra claramente que los productos de escisión procedentes de la reacción de escisión invasiva se pueden usar en combinación con un oligo promotor parcial para promover la producción de ARN, sin la transcripción de fondo generada por la presencia de la sonda sin cortar. Este producto de ARN depende claramente de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva.

EJEMPLO 43

Desactivación de la transcripción desde un promotor compuesto de T7 ramificado "agujereado" mediante el uso de un oligonucleótido promotor parcial cadena abajo que tiene una cola en 5'

El ejemplo anterior demostraba que la colocación de una mella en la cadena no molde de un promotor de bacteriófago T7 entre los nucleótidos -12 y -11 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción evita la transcripción del promotor ramificado, mientras que cuando el promotor compuesto se ensambla usando la sonda cortada se permite la transcripción. Cuando la mella está colocada en otras zonas del promotor de T7, es posible iniciar la transcripción desde cualquier promotor, aunque habitualmente es menos eficaz hacerlo desde el promotor ramificado. Este ejemplo demuestra que la adición de una cola en 5' que se puede aparear a la sonda sin cortar (Fig. 90A) al trozo de promotor parcial cadena abajo bloquea eficazmente la transcripción desde ese promotor, pero no evita la transcripción cuando hay una sonda cortada completando el promotor (Fig. 90B).

Se prepararon dos reacciones de escisión invasiva, una sin (rxn 7) y otra con (rxn. 8) ADN diana de entrada. Las reacciones (7 y 8) comprendían MOPS 10 mM (pH 7,5), Tween-20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, y 20 pmol de oligo sonda 073-067-01 (SEC ID Nº 132) y 10 pmol de oligo INVASOR 073-067-02 (SEC ID Nº 133) en un volumen de 14

μl. La reacción 8 también incluía 100 fmol de ADNmc de M13mp18. Se colocaron las muestras a 60ºC y se añadieron 6 μl de una solución que contenía 20 ng de la FEN-1 de Mja y Mg2Cl 40 mM a cada muestra para iniciar las reacciones. Las muestras se incubaron a 60ºC durante 30 minutos y se detuvieron mediante la adición de 3 μl NaOAc 2,5 M y Na2EDTA 83 mM (pH 8,0). Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 m, y luego se precipitaron los ADN, se lavaron y se secaron según lo descrito en el Ej. 42. El producto de esta reacción de escisión invasiva es la secuencia de oligonucleótido de 13 nucleótidos 5'-CGAAATTAATACG-3' (SEC ID Nº 127), denominada sonda cortada -11 (la misma secuencia que el oligo 073-061-03, que se denomina sonda "cortada" -11 para indicar que no fue generada en una reacción de escisión invasiva)

En las reacciones de transcripción, todos los ADN se disolvieron en 4 μl de H2Od libre de RNasa. La muestra 1 no tenía ADN añadido; las muestras 2-8 contenían 1 pmol del oligo molde de copia 150 (SEC ID Nº 123). Además, la muestra 3 contenía 1 pmol del oligo sonda "cortada" -11 073-061-01 (SEC ID Nº 127) y 2 pmol del oligo promotor parcial -10 073-061-02 (SEC ID Nº 130); la muestra 4 contenía 1 pmol del oligo sonda 073-067-01 y 2 pmol del oligo promotor parcial -10 073-061-02. La muestra control 5 contenía 1 pmol del oligo sonda 073-067-01 y 2 pmol del oligo promotor parcial con cola 5' 073-074 (5'-TACTGACTCACTATAGGGTCTTCTATGGAGGTC-3'; SEC ID Nº 146) (véase la estructura de la Fig. 90A) y la muestra 6 contenía 1 pmol del oligo sonda "cortada" -11 073-061-01 y 2 pmol del oligo promotor parcial con cola 5' 073-074 (véase la estructura de la Fig. 90B). Estas son las estructuras (es decir, 90A y 90B) que se esperaría que existieran en las reacciones de transcripción procedentes de las dos reacciones de escisión invasiva descritas anteriormente.

Se disolvieron cada una de las muestras secas 7 y 8 procedentes de la escisión invasiva (anterior) en 4 μl de H2Od que contenía 1 pmol del oligo molde de copia 150 y 2 pmol del oligo promotor parcial con cola 5' 073-074. Se iniciaron las reacciones de transcripción, se incubaron, y se finalizaron, resolviéndose los productos de reacción y creándose imágenes según lo descrito en el Ej. 40. La imagen resultante se muestra en la Fig. 91.

En la Fig. 91, los números de carril corresponden a los números de muestra; el número de la figura que muestra la representación esquemática de la estructura esperada de promotor en cada reacción se indica sobre cada carril ("88" y "90"), indicándose también la colocación de la mella ("-11/-10"). Las letras mayúsculas indican qué estructura de la figura en particular examinar para cada reacción. La "i" minúscula sobre los carriles 7 y 8 indica que estas transcripciones se obtuvieron de las verdaderas reacciones de escisión invasiva. El ARN creado mediante la transcripción correcta aparece en el tercio superior de la imagen ("ARN").

Las reacciones control de los carriles 1 y 2, bien sin ADN o sólo con el molde de copia, no produjeron ARN según lo esperado. El producto del carril 4 demuestra que el promotor de T7 ramificado con una mella en la cadena no molde entre los nucleótidos -11 y -10 puede mantener la transcripción, aunque no tan eficazmente como el promotor no ramificado con la mella en el mismo sitio (carril 3). El examen del carril 5 muestra que el uso de un oligonucleótido promotor parcial con una cola 5' corta que se puede aparear a la sonda sin cortar según lo representado en la Fig. 90A suprime eficazmente esta transcripción, pero permite la transcripción cuando la sonda no tiene una cola 3' (carril

6: Fig. 90B esquemática). Las reacciones de los carriles 7 y 8 demuestran que se observa el mismo efecto cuando la reacción de escisión invasiva es el único origen del trozo de secuencia arriba (sonda cortada -11, SEC ID Nº 127) del promotor de T7. Cabe señalar que el promotor que está transcrito en el muestra 8 se completa mediante la presencia de 1 pmol de un oligo sonda "cortada" sintético, sin ninguna sonda sin cortar en la mezcla, mientras que el promotor que está transcrito en el carril 9 se completa mediante el producto de una reacción de escisión invasiva que sólo tiene 100 fmol de ADN diana en el mismo. Esta reacción también incluyó la sonda sin cortar residual (de hasta aprox. 19 pmol) que puede competir por la unión en el mismo sitio. No obstante, las transcripciones procedentes de los productos de la reacción de escisión invasiva son justo tan potentes y están justo tan libres de fondo en las muestras "no diana".

Este ejemplo demuestra claramente que los productos de escisión procedentes de la reacción de escisión invasiva se pueden usar en combinación con un oligo promotor parcial que tenga una cola 5' para promover la producción de ARN sin la transcripción de fondo generada por la sonda sin cortar.. Este producto de ARN depende claramente de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva.

EJEMPLO 44

Creación de un promotor de bacteriófago T7 completo mediante la prolongación mediada por una ADN polimerasa de una sonda cortada que comprende un promotor de T7 parcial

Como se demuestra en los ejemplos anteriores, la transcripción no puede tener lugar desde el promotor de T7 a no ser que esté presente un promotor completo. En los ejemplos anteriores, se creó un promotor completo que contenía una mella en una cadena mediante al apareamiento de una sonda cortada generada en una reacción de escisión invasiva con un molde de copia que estaba apareado a un oligo promotor parcial. Un procedimiento alternativo para crear un promotor completo de una manera dependiente de la detección de una secuencia diana en una reacción de escisión invasiva consiste en aparear la sonda cortada a un molde de copia carente de un oligo promotor parcial. El OH de 3' presente en el extremo de la sonda cortada apareada es entonces prolongado mediante una ADN polimerasa para crear un promotor completo y sin mellar que sea competente en la transcripción.

En este Ejemplo, el promotor se completó a través del uso de una prolongación del cebador, en lugar de hacerlo mediante la co-hibridación de otro oligonucleótido. En la figura 87, se representan esquemáticamente las etapas de reacción. Se prepararon dos reacciones de escisión invasiva, una sin (rxn. 1) y otra con (rxn. 2) ADN diana de entrada. Las reacciones (1 y 2) comprendían MOPS 10 mM (pH 7,5), Tween-20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, y 20 pmol de oligo sonda 073-067-01 (SEC ID Nº 132) y 10 pmol de oligo INVASORTM 073-073-02 (SEC ID N.º 134) en

un volumen de 14 μl. La reacción 2 también incluía 100 fmol de ADNmc de M13mp18. Se colocaron las muestras a 60ºC y se añadieron 6 μl de una solución que contenía 20 ng de la FEN-1 de Mja y Mg2Cl 40 mM a cada muestra para iniciar las reacciones. Las muestras se incubaron a 60ºC durante 30 minutos y se detuvieron mediante la adición de 3 μl NaOAc 2,5 M y Na2EDTA 83 mM (pH 8,0). Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 m, y luego se precipitaron los ADN, se lavaron y se secaron según lo descrito en el Ej.

42. El producto de esta reacción de escisión invasiva es un oligonucleótido de 12 nucleótidos de secuencia: 5’-CGAAATTAATAC-3’ (SEC ID Nº 128), denominada sonda cortada -12 (la misma secuencia que el oligo 073-073-03, que se denomina sonda "cortada" -12 para indicar que no fue generada en una reacción de escisión invasiva).

Para permitir la prolongación de estos productos usando una ADN polimerasa dependiente del molde, se añadió a cada una de las muestras de escisión secas una solución de 20 μl que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), Mg2Cl 1,5 mM, KCl 50 mM, Tween-20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, 25 μM de cada dNTP, 0,25 unidades de ADN polimerasa de Taq (Boehringer) y oligo molde de copia 150 2 μM (SEC ID N.º 123). Las muestras se incubaron a 30 ºC durante 1 hora. Se detuvieron todas las reacciones de prolongación del cebador mediante la adición de 3 μl de NaOAc 2,5 M

con Na2EDTA 83 mM (pH 8,0). Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 m, y luego se precipitaron los ADN, se lavaron y se secaron según lo descrito en el Ej. 42.

Las muestras 1 y 2 se disolvieron en 4 μl de H2Od libre de RNasa. Las muestras 3, 4 y 5 son reacciones de control; la muestra 3 era 4 μl de H2Od libre de RNasa sin ADN añadido; la muestra 4 contenía 1 pmol del oligo molde de copia 150 (SEC ID Nº 123) en 4 μl de H2Od libre de ENASA, y la muestra 5 contenía 1 pmol del mismo molde de copia y 1 pmol del oligo promotor completo 151 (SEC ID Nº 124) en H2Od libre de RNasa.

Las reacciones de transcripción se realizaron usando el sistema MEGAshortscriptTM según las instrucciones del

fabricante pero con la adición de un ribonucleótido marcado con fluoresceína. Se añadieron a cada muestra 6 μl de una solución que contenía 1 μl de 10 x tampón de transcripción, 7,5 mM de cada rNTP; fluoresceína-12-UTP 0,125 mM (Boehringer) y 1 μl de mezcla enzimática MEGAshortscriptTM de T7. Las muestras se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Se añadió un microlitro de ADNasa 1 libre de RNasa (2 U/μl) a cada muestra y se incubaron las muestras durante 15 minutos más a 37ºC. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de una solución de

formamida al 95%, Na2EDTA 5 mM con colorantes de carga. Se calentaron todas las muestras hasta 95ºC durante

2 minutos y se resolvieron cuatro μl de cada muestra mediante electroforesis a través de gel de acrilamida

desnaturalizante al 20% (19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 8,3) y EDTA 1,4 mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 nm y la emisión detectada a 530 nm.

La imagen resultante se muestra en los carriles 1 a 5 de la Fig. 89; los números de carril corresponden a los números de muestra. Los números de figura corresponden a las representaciones esquemáticas de los promotores transcritos en cada reacción como se indican sobre los carriles. El producto ARN mediante la transcripción correcta aparece en el tercio superior de la imagen ("ARN"). El nucleótido marcado no incorporado aparece como una señal densa cerca de la parte inferior ("NTP"). Los productos de transcripción cortos generados por iniciaciones abortadas (Milligan y Uhlenbeck (1989) Methods Enzymol. 180:51 [1989]) aparecen como bandas justo encima del nucleótido libre en los carriles que muestran una transcripción activa (es decir, los carriles 2 y 5).

Se puede observar claramente a partir de los datos de los carriles 1 y 2 que la transcripción depende de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva. En otro sitio se muestra (véase el carril 3, Fig. 92) que el producto de la reacción de escisión no es suficiente por sí mismo para permitir la transcripción desde el molde de copia. De este modo, la acción de la ADN polimerasa prolongando la sonda cortada hibridada a través del promotor es una etapa necesaria para permitir la transcripción en esta realización. Estos datos demuestran claramente que tanto la prolongación dependiente del molde realizada por una ADN polimerasa como la prolongación seguida por la transcripción son procedimientos adecuados de visualización de los productos del análisis de escisión invasiva. Según lo tratado en el apartado de Descripción de la invención, los productos de la degradación térmica que poseen fosfatos en el terminal 3' no se prolongarían, y, por tanto, no podría contribuir a la transcripción de fondo.

EJEMPLO 45

Ensayo de la dependencia de una enzima de la presencia de un oligonucleótido cadena arriba

Al elegir una nucleasa específica de estructura para usar en una reacción de escisión invasiva, es preferible que la enzima tenga poca capacidad para escindir una sonda 1) en ausencia de de un oligonucleótido cadena arriba y 2) en ausencia de solapamiento entre el oligonucleótido cadena arriba y el oligonucleótido sonda marcado cadena abajo. Las Figs. 99a-e representan las diversas estructuras que se pueden usar para examinar la actividad de una enzima confrontada con cada uno de estos tipos de estructuras. La estructura (Fig. 99a) muestra la alineación de un oligonucleótido sonda con un sitio diana sobre el ADN del bacteriófago M13 (las secuencias de M13 mostradas en la Fig. 99 se proporcionan en la SEC ID Nº 163) en ausencia de un oligonucleótido cadena arriba. La estructura b (Fig. 99b) se proporciona con un oligonucleótido cadena arriba que no contiene una región de solapamiento con la sonda marcada (el marcador está indicado con una estrella). En las estructuras c, d y e (Figs. 99c-e), los oligonucleótidos cadena arriba tienen solapamientos de 1, 3 o 5 nucleótidos, respectivamente, y cada oligonucleótido sonda cadena abajo y cada una de estas estructuras representa una estructura de escisión invasiva adecuada. Se sometió a ensayo la FEN-1 de Pfu para determina la actividad sobre cada una de estas estructuras y todas las reacciones se realizaron por duplicado.

Cada reacción comprendió el oligonucleótido sonda marcado 5’TET 89-15-1 1 μM (SEC ID Nº 152), oligonucleótido cadena arriba 50 Mm (oligo 81-69-2 [SEC ID Nº 153], oligo 81-69-3 [SEC ID Nº 154], oligo 81-69-4 [SEC ID Nº 155], oligo 81-69-5 [SEC ID Nº 156], o sin oligonucleótido cadena arriba ), 1 fmol de ADN de M13 diana, 10 mg/ml de ARNt y 10 ng de FEN-1 de Pfu en 10 μl de MOPS 10 mM (pH 7,5), MgCl2 7,5 mM con 0,05% de cada uno de Tween 20 y Nonidet P-40.

Todos los componentes excepto la enzima y el MgCl2 se montaron en un volumen final de 8 μl y se cubrieron con 10 μl de cera líquida Chill-Out™. Las muestras se calentaron hasta la temperatura de reacción de 69 ºC. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de FEN-1 de Pfu y MgCl2 en un volumen de 2 μl. Después de incubación durante 30 min a 69 ºC, las reacciones se detuvieron por la adición de 10 μl de formamida al 95%, EDTA 10 mM y

violeta de metilo al 0,02%. Las muestras se calentaron a 90 ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los geles se analizaron después con un Analizador de Imágenes FMBIO-100. La imagen resultante se muestra en la Fig. 100.

En la Fig. 100, los carriles marcados "a" contienen los productos generados a partir de reacciones realizadas sin un oligonucleótido cadena arriba (estructura a), los carriles marcados "b" contiene el oligonucleótido cadena arriba (que no invade el dúplex sonda/diana (estructura b). Los carriles marcados "c", "d" y "e" contienen los productos generados a partir de las reacciones realizadas usando un oligonucleótido cadena arriba que invade el dúplex/sonda en 1, 3 o 5 bases, respectivamente. El tamaño (en nucleótidos) de la sonda sin escindir y los productos de escisión se indica a la izquierda de la imagen en la Figura 100.

Como se muestra en la Fig. 100, la escisión de la sonda no se pudo detectar cuando se usaron las estructuras a y b. En contraste con ello, los productos de escisión se generaron cuando se usaron estructuras de escisión invasiva (estructuras c-e). Estos datos muestran que la enzima FEN-1 de Pfu requiere un oligonucleótido cadena arriba solapante para la escisión específica de la sonda.

Todas las enzimas se pueden examinar para comprobar su idoneidad de uso en una reacción de escisión invasiva secuencial examinando la capacidad de la enzima de ensayo para escindir las estructuras a-e (los expertos en la técnica entienden que las secuencias del oligonucleótido específico mostradas en las Figs. 99a-e no tienen que usarse en las reacciones de ensayo, estas estructuras son simplemente ilustrativas de estructuras de ensayo adecuadas). Las enzimas deseables muestran pocas o ninguna escisión de las estructuras a y b, y muestran estructuras de escisión específica c-e (es decir, generan productos de escisión del tamaño previsto a partir del grado de solapamiento entre los dos oligonucleótidos empleados para formar la estructura de escisión invasiva).

EJEMPLO 46

Uso de los productos de una primera reacción de escisión invasiva para permitir una segunda reacción de escisión invasiva con una ganancia neta de sensibilidad

Según lo tratado en el apartado de Descripción de la invención anterior, la sensibilidad de la detección de la reacción de escisión invasiva se puede aumentar realizando una segunda ronda de escisión invasiva usando los productos de la primera reacción para completar la estructura de escisión en la segunda reacción (mostrado esquemáticamente en la Fig. 96). En este Ejemplo se ilustra el uso de una sonda que cuando se escinde en una primera reacción de escisión invasiva forma un oligo INVASOR y molécula diana para usar en una segunda reacción de escisión invasiva (mostrado esquemáticamente en la Fig. 97).

Se diseñó una primera sonda para contener alguna complementariedad interna de modo que, cuando se escinda en

una primera reacción de escisión invasiva, el producto (“Sonda Cortada 1”) podría formar una hebra diana que

comprende un oligonucleótido INVASOR integral, como se representa en la Fig. 97. Se proporcionó una segunda sonda en la reacción que se escindiría en el sitio indicado cuando se hibrida con la diana/INVASOR recién formado (Fig. 97). Para demostrar la ganancia de señal debido al rendimiento de escisiones invasivas secuencias, en paralelo se realizó un ensayo de escisión invasiva estándar, como se ha descrito anteriormente.

Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Cada reacción de escisión invasiva estándar (es decir, no secuencial) comprendía oligonucleótido sonda marcado en 5’ con fluoresceína 1 μM 073-182 (5’ F1-AGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAA-3’; SEC ID Nº 157), oligo cadena arriba 10 nM 81-69-4 (5’-CTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGA-3’; SEC ID Nº 155), de 10 a 100 atomol de AND Diana de M13, 10 mg/ml de ARNt y 10 ng de FEN-1 de Pfu en 10 μl de MOPS 10 mM (pH 7,5), MgCl2 8 mM con 0,05% de cada uno de Tween 20 y Nonidet P-40. Todos los componentes excepto la enzima y el MgCl2 se montaron en un volumen final de 7 μl y se cubrieron con 10 μl de cera líquida Chill-Out™. Las muestras se calentaron hasta la temperatura de reacción de 62 ºC. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de FEN-1 de Pfu y MgCl2 en un volumen de 2 μl. Después de incubación durante 30 min a 62 ºC, las reacciones se detuvieron por la adición de 10 μl de formamida al 95%, EDTA 10 mM y violeta de metilo al 0,02%.

Cada reacción de escisión invasiva secuencial comprendía oligonucleótido marcado con fluoresceína en 5’ 1 μM 073-191 (la primera sonda o “Sonda 1” 5’ Fl-TGGAGGTCAAAACATCG ATAAGTCGAAGAAAGGAAGGGAAGAAAT3’; SEC ID Nº 158), oligonucleótido 10 nM cadena arriba 81-69-4 (5’-CTTGACGGGGAAA GCCGGCGAACGTGGCGA-3’; SEC ID Nº 155), oligonucleótido marcado con fluoresceína en 5’ 1 μM 106-32 (la segunda sonda o “Sonda 2” 5’ F1-TGTTTTGACCT CCA-3’; SEC ID Nº 159), de 1 a 100 atomol de AND Diana de M13, 10 mg/ml de ARNt y 1 ng de FEN-1 de Pfu en 10 μl de MOPS 10 mM (pH 7,5), MgCl2 8 mM con 0,05% de cada uno de Tween 20 y Nonidet P-40. Todos los componentes excepto la enzima y el MgCl2 se montaron en un volumen final de 8 μl y se cubrieron con 10 μl de cera líquida Chill-Out™. Las muestras se calentaron hasta la temperatura de reacción de 62 ºC (esta temperatura es la temperatura óptima para hibridar la Sonda 1 a la primera diana). Las reacciones se iniciaron mediante la adición de FEN-1 de Pfu y MgCl2 en un volumen de 2 μl. Tras la incubación a 62 ºC durante 15 meses, la temperatura se disminuyó a 58 ºC (esta temperatura es la temperatura óptima para hibridar la Sonda 2 a la segunda diana) y las muestras se incubaron durante otros 15 minutos. Las

reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de formamida al 95 %, EDTA 20 mM y violeta de metilo al

0,02 %). Las muestras de las reacciones de escisión invasiva tanto convencional como secuencial se calentaron a 90 ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (reticulación 19:1), con urea 7 M, en un tampón de Tris·Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Después, el gel se analizó con un aparato Molecular Dynamics FluorImager 595. La imagen resultante se muestra en la Fig. 101a. En la Fig. 101b se muestra un gráfico que mide la intensidad de fluorescencia para cada una de las bandas de producto.

En la Fig. 101a, los carriles 1-5 contienen los productos generados en las reacciones de escisión invasiva convencionales que contenían o ausencia de diana (Carril 1), 10 atomol de diana (carriles 2 y 3) o 100 atomol de diana (carriles 4 y 5). La sonda sin escindir se ve como una banda oscura en cada carril a medio camino del panel y los productos de escisión aparecen como una banda negra más pequeña cerca de la parte inferior del panel, la posición del producto de escisión se indica como la punta de una flecha a la izquierda de la Fig. 101a. La escala gris de bandas observadas en los carriles 1-5 se debe a la degradación térmica de la sonda como se ha tratado anteriormente y no está relacionada con la presencia o ausencia del ADN diana. Los carriles restantes muestran productos generados en las reacciones de escisión invasiva secuencial que contenían 1 atomol de la diana (carriles 6 y 7), 10 atomol de la diana (carriles 8 y 9) y 100 atmol de la diana (carriles 10 y 11). La primera sonda sin escindir

(Sonda 1, “1 sin cortar” marcada) se ve cerca de la parte superior del panel, mientras que la primera sonda escindida se indica como "1: cortada”. De forma similar, la segunda sonda sin escindir y escindida se indican como “2: sin cortar” y 2: cortada”, respectivamente.

El gráfico mostrado en la Fig. 101b compare la cantidad de producto generado a partir de la reacción convencional

(“Serie 1) con la cantidad de producto generado a partir de la segunda etapa de la reacción secuencial (“Serie 2”). El

nivel de fluorescencia de fondo medido en una reacción sin ADN diana se restó de cada medición. A partir de la tabla que se encuentra debajo del gráfico se puede ver que la señal del ensayo de escisión invasiva convencional que contenía 100 atomol del ADN diana era casi idéntica a la señal del ensayo de escisión invasiva secuencial en el que había 1 atomol de la diana, Lo que indica que la inclusión de una segunda estructura de escisión multiplica por 100 o 200 la sensibilidad del ensayo. Este refuerzo de la señal permite la detección sencilla de ácidos nucleicos diana a nivel de subatomoles usando el ensayo de escisión invasiva secuencial, mientras que el ensayo convencional, cuando se realiza usando esta enzima durante solo 30 minutos, no genera producto detectable en presencia de 10 atomol de diana.

Cuando la cantidad de la diana disminuyó en 10 o 100 en el ensayo de escisión invasiva secuencial, la intensidad de la señal disminuyó en la misma proporción. Esto indica que la capacidad cuantitativa del ensayo de escisión invasiva se conserva incluso cuando las reacciones se realizan en serie, de modo que proporciona un procedimiento de detección de ácido nucleico sensible y cuantitativo.

Aunque en este Ejemplo las dos sondas usadas tenían diferentes temperaturas de hibridación óptimas (es decir, la temperatura determinada empíricamente para dar la tasa de renovación más alta en las condiciones de reacción dadas), las sondas pueden seleccionarse (diseñarse) también de modo que tengan la misma temperatura de hibridación óptima de modo que no es necesario un cambio de temperatura durante la incubación.

EJEMPLO 47

Los productos de una reacción de escisión invasiva secuencial completada no pueden producir contaminación cruzada posterior a reacciones similares

Según lo tratado en el apartado de Descripción de la invención, la naturaleza en serie de múltiples acontecimientos de escisión invasiva que se producen en la reacción de escisión invasiva secuencial, en contraste con la naturaleza de reciprocidad de la reacción en cadena de la polimerasa y ensayos de duplicación similares, significa que la reacción de escisión invasiva secuencial no está sujeta a contaminación por los productos de reacciones similares porque los productos de la primera reacción de escisión no participan en la generación de señal nueva en la segunda reacción de escisión. Si se tiene que añadir una gran cantidad de una reacción completada a una reacción recién montada, el fondo que produciría procedería de la cantidad de diana que también se introdujo, combinado con la cantidad de sonda ya escindida que se había introducido. En este Ejemplo, se demuestra que en la reacción secundaria se debe introducir una parte muy grande de una reacción primaria para crear una señal significativa.

Una primera reacción de escisión invasiva secuencial o primaria se realizó como se ha descrito anteriormente usando 100 atomol de ADN diana. Se montó un segundo conjunto de 5 reacciones como se describe en el Ej. 46 con la excepción de que se introdujeron partes de la primera reacción y no se incluyó ADN diana adicional. Estas reacciones secundarias se iniciaron e incubaron como se ha descrito anteriormente e incluyeron 0, 0,01, 0,1, 1, o 10% del primer material de reacción. Una reacción control con 100 atomol de la diana se incluyó también en el segundo conjunto. Las reacciones se detuvieron, separaron mediante electroforesis y visualizaron como se ha descrito anteriormente y la imagen resultante se muestra en la Fig. 102. La sonda primaria, segunda sonda sin cortar y segunda sonda cortada se indican a la izquierda como "1: cortada”, 2: sin cortar” y 2: cortada”, respectivamente.

En la Fig. 102, el carril 1 muestra los resultados de la primera reacción con el producto acumulado en la parte inferior del panel y el carril 2 muestra una dilución a 1:10 de la misma reacción, para demostrar el nivel de señal que cabría esperar del nivel de contaminación, sin amplificación adicional. Los carriles 3 a 7 muestran los resultados de las reacciones de escisión secundarias que contenían 0, 10, 1, 0,1 o 0,01% del primer material de reacción añadido como contaminante, respectivamente, y el carril 8 muestra una reacción control que tenía 100 atomol de ADN Diana añadido para verificar la actividad del sistema en la reacción secundaria. El nivel de señal en el carril 4 es como cabría esperar cuando el 10 % del material pre-escindido se transfiere (como en el carril 2) y el 10 % del material diana transferido desde la reacción del carril 1 se purifica adicionalmente. A todos los niveles de dilución adicional, la señal no se distingue fácilmente del fondo. Estos datos demuestran que aunque una transferencia a gran escala de una reacción a otra puede ser detectable, la contaminación cruzada por cantidades mínimas que cabría esperar por aerosol o por contaminación del equipo no se confundiría fácilmente con un resultado falso positivo. Estos datos también demuestran que cuando los productos de una reacción se pasan deliberadamente a una muestra fresca, estos productos no participan en la reacción nueva y, por tanto, no afectan al nivel de señal dependiente de la diana que se puede generar en dicha reacción.

EJEMPLO 48

Detección de ADN viral de citomegalovirus humano mediante escisión invasiva

El Ejemplo anterior demuestra la capacidad de la reacción de escisión invasiva para detectar cantidades mínimas de ADN viral en presencia de ADN genómico humano. En este Ejemplo, los oligonucleótidos sonda e INVASOR se diseñaron para dirigirse a la región 3104-3061 del gen temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (HCMV) como se muestra en la Fig. 103. En la Fig. 103, el oligonucleótido INVASOR (89-44; SEC ID Nº 160) y el oligonucleótido sonda marcado con fluoresceína (Fl) (89-76; SEC ID Nº 161) se muestran hibridados a lo largo de una región del genoma del HCMV correspondiente a los nucleótidos 3057-3110 del ADN viral (SEC ID Nº 162). La sonda usada en este Ejemplo es una sonda de polipirimidina y, como se muestra en el presente documento, el uso de una sonda de polipirimidina reduce la señal de fondo generada por la degradación térmica de los oligonucleótidos sonda.

El ADN genómico viral se adquirió en Advanced Biotechnologies, Incorporated (Columbia, MD). El personal de Advanced Biotechnologies estimó (pero no certificó) una concentración del ADN de 170 atomol (1 x 108 copias) por microlitro. Las reacciones se realizaron por cuadruplicado. Cada reacción comprendía oligonucleótido sonda marcado con fluoresceína en 5' 1 μM 89-76 (SEC ID Nº 161), oligonucleótido INVASOR 100 nM 89-44 (SEC ID Nº 160), 1 ng/ml de ADN genómico humano y una de cinco concentraciones del ADN diana de HCMV en las cantidades indicadas sobre cada carril en la Fig. 104 y 10 ng de FEN-1 de Pfu en 10 μl de MOPS 10 mM (pH 7,5), MgCl2 6 mM con 0,05% de cada uno de Tween 20 y Nonidet P-40. Todos los componentes excepto la enzima y el MgCl2 se montaron en un volumen final de 7 μl y se cubrieron con 10 μl de cera líquida Chill-Out™. Las muestras se

calentaron hasta 95 ºC durante 5 minutos, después se reduce a 62 ºC. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de sonda, FEN-1 de Pfu y MgCl2 en un volumen de 3 μl. Después de incubación durante 60 min a 62 ºC, las reacciones se detuvieron por la adición de 10 μl de formamida al 95%, EDTA 10 mM y violeta de metilo al 0,02%.

Las muestras se calentaron a 90ºC durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de un gel de acrilamida al 20 % (19:(:1), que contenía urea 7 M, en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM. Los geles se analizaron después con un aparato Molecular Dynamics FluorImager 595.

La imagen resultante se muestra en la Fig. 104. Las reacciones duplicadas se realizaron por grupos en cuatro carriles con el contenido del ADN diana del HCMV de las reacciones indicadas sobre cada conjunto de carriles (0170 amol). La sonda sin escindir se ve en el tercio superior del panel (“89-76 sin cortar”), mientras que los productos de escisión se ven en los dos tercios inferiores del panel (“89-76 cortado”). Se puede ver que la intensidad del producto de escisión acumulado es proporcional a la cantidad del ADN diana en la reacción. Además, se puede ver

claramente en las reacciones que no contenían ADN diana (“sin diana”) que la sonda no se escinde, incluso en un

fondo de ADN genómico humano. Aunque se incluyeron 10 ng del ADN genómico humano en cada una de las reacciones mostradas en la Fig. 104, la inclusión del ADN genómico hasta 200 ng tiene poco impacto sobre la

cantidad de producto acumulado. Los datos no sugirieron que 200 ng por 10 μl de la mezcla de reacción

representaban la cantidad máxima de ADN genómico que se podía tolerar sin una reducción significativa de la acumulación de la señal. Por referencia, esta cantidad de ADN supera la que se podría encontrar en 0,2 ml de orina (una cantidad analizada habitualmente para HCMV en neonatos) y es equivalente a la cantidad que se encontraría

en aproximadamente 5 μl de sangre entera.

Estos resultados demuestran que la reacción de escisión invasiva convencional (es decir, no secuencial) es un medio sensible, específico y reproducible de detectar ADN viral. A partir de estos datos también se puede ver que el uso de una sonda de polipirimidina reduce el fondo de degradación térmica de la sonda, como se trata en el Ejemplo

22. La detección de 1,7 amol de diana es aproximadamente equivalente a la detección de 106 copias del virus. Esto es equivalente al número de genomas virales que podrían encontrarse en 0,2 ml de orina de un neonato con infección congénita (102 a 106 de equivalentes de genoma por 0,2 ml; Stagno y col., J. Infect. Dis., 132:568 [1975]). El uso del ensayo de escisión invasiva secuencial permitiría la detección de incluso menos moléculas de ADN viral, lo que facilita la detección en sangre (101 a 105 de partículas virales por ml; Pector y col., J. Clin. Microbiol., 30:2359 [1992]), que pora una cantidad mucho mayor de AND heterólogo.

De lo anterior queda claro que la invención proporciona reactivos y procedimientos para permitir la detección y caracterización de secuencias de ácido nucleico y variaciones en las secuencias de ácido nucleico. La reacción de escisión dirigida por INVASOR y la reacción de escisión dirigida por INVASOR secuencial de la presente invención proporcionan procedimientos de detección directa ideales que combinan las ventajas de los ensayos de detección directa (por ejemplo, cuantificación sencilla y riesgo mínimo de contaminación por traspaso) con la especificidad proporcionada por un ensayo de hibridación de oligonucleótido doble.

Como se ha indicado en la Descripción de la Invención, el uso de reacciones de escisión invasiva secuencial pueden suponer un problema de la sonda residual sin cortar primera, o primaria, que interacciona con la segunda diana, y competir con la sonda cortada para unir, o crear fondo a través de escisión de nivel bajo de la estructura resultante. Esto se muestra en diagrama en las Figs. 105 y 106. En la Fig. 105, la reacción representada usa el producto de escisión de la primera estructura de escisión para formar un oligonucleótido INVASOR para una segunda reacción de escisión. La estructura formada entre la diana secundaria, la sonda secundaria y la sonda primaria sin cortar se representa en la Fig. 105, como la estructura de la derecha mostrada en la etapa 2a. Esta estructura es reconocida y escindida por las nucleasas 5’, pero de forma ineficaz (es decir, a menos de aproximadamente 1 % en la mayoría de las condiciones de reacción). No obstante, el producto resultante es indistinguible del producto específico y, por tanto, puede conducir a un resultado falso positivo. Se puede producir el mismo efecto cuando la sonda primaria escindida crea una molécula diana/INVASOR integrada (IT) como se describe en el Ejemplo 46; la formación del complejo indeseable se representa esquemáticamente en la Fig. 106, como la estructura de la derecha mostrada en la etapa 2a.

Las mejoras proporcionadas por la inclusión de oligonucleótidos de DETENCIÓN de varias composiciones en cada uno de estos tipos de ensayos INVASOR secuencial se demuestran en los Ejemplos siguientes. Estosoligonucleótidos de DETENCIÓN están configurados para unirse a la sonda sin cortar residual de la primera reacción de escisión en la serie, de modo que se aumenta la eficacia y reducir el fondo inespecífico en la(s) reacción(es) posteriores.

EJEMPLO 49

Oligonucleótidos “DE DETENCIÓN” mejoran la sensibilidad de múltiples ensayos de escisión invasiva

secuencial

En este Ejemplo se demuestra el efecto de incluir un oligonucleótido DE DETENCIÓN sobre la generación de laseñal usando el sistema de sonda IT representado en las Figs. 97 y 106. El oligonucleótido DE DETENCIÓN hibrida con la sonda primaria, principalmente en la parte que reconoce el ácido nucleico diana durante la primera reacción de escisión. Además de examinar los efectos de añadir un oligonucleótido de DETENCIÓN, también se investigaronlos efectos de usar oligonucleótido de DETENCIÓN que se extienden en complementariedad diferentes distancias en la región de la sonda primaria que compone la estructura IT secundaria. Estos efectos se compararon en las reacciones que incluyeron el ADN diana en una serie de concentraciones o que carecían de ADN diana, con el fin de demostrar el nivel de fondo inespecífico (Es decir no relacionado con el ácido nucleico diana) en cada conjunto de condiciones de reacción.

El ADN diana para estas reacciones fue un fragmento que comprendía la longitud completa del genoma de la hepatitis B de la cerpa del serotipo adw. Este material se creó usando la reacción en cadena de la polimerasa del plásmido pAM6 (ATCC Nº 45020D). Las PCR se realizaron usando un cebador directo basado en el vector, el oligo nº 156-022-001 (5’-ggcgaccacacccgtc-ctgt-3’; SEC ID Nº 168) y un cebador inverso, el oligo nº 156-022-02 (5’ccacgatgcgtccggcgtag-3’; SEC ID Nº 169) para amplificar la longitud completa del inserto de HBV, un amplicón de aproximadamente 3,2 kb. Las condiciones de ciclado incluyeron una desnaturalización del plásmido a 95 ºC durante 5minutos, seguido de 30 ciclos de 95 ºC, 30 segundos; 60 ºC. 40 segundos y 72 ºC, 4 minutos. A esto le siguió una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. El amplicón resultante, denominado pAM6#2, se ajustó a NH4OAc 2M y se recogió mediante precipitación con isopropanol. Después de secar al vacío, el ADN se disolvió en Tris 10 mM, pH, 0, EDTA 0,1 mM. La concentración se determinó mediante medición de la DO200 y mediante ensayo INVASOR con comparación con un patrón de concentración conocida.

Las reacciones INVASOR se realizaron del siguiente modo. Se montaron seis mezclas maestras denominadas "A," "B,’ "C," "D," y "E,"; todas las mezclas contenían MOPS 12,5mM, pH 7,5, 500 fmol del oligo INVASOR primario nº 218-55-05 (SEC ID Nº 171), 10 ng de ADN genómico humano (Novagen) y 30 ng de enzima FEN1 de Afu por cada 8 μl de mezcla. La mezcla A no contenía ADN amplicón genómico de VHB; la mezcla B contenía 600 moléculas del ADN amplicón genómico de VHB pAM6 #2; la mezcla C contenía 6000 moléculas de pAM6 #2; la mezcla C contenía

60.000 moléculas de pAM6 #2 y la mezcla E contenía 600.000 moléculas de pAM6 #2. Las mezclas se alicuotaron en los tubos de reacción, 8 μl/tubo. La mezcla A a los tubos 1, 2, 11, 12, 21 y 22; la mezcla B a los tubos 3, 4, 13, 14, 23 y 24; la mezcla C a los tubos 5, 6,15, 16, 25 y 26; la mezcla D a los tubos 7, 8, 17, 18, 27 y 28; y la mezcla E a los tubos 9, 10, 19, 20, 29 y 30. Las muestras se incubaron a 95 °C durante 4 minutos para desnaturaliza el ADN del

amplicón genómico del VHB. Después, las reacciones se enfriaron hasta 67 ºC y a cada muestra se añadieron 2 μl de una mezcla que contenía MgCl2 37,5 mM y 2,5 pmol de 218-95-06 (SEC ID Nº 183) por cada 2 μl. Las muestras se incubaron a 67ºC durante 60 minutos. Se prepararon tres mezclas maestras de reacción secundaria, todas las mezclas contenían 10 pmol del oligonucleótido sonda secundario nº 228-48-04 (SEC ID Nº 173) por cada 2 μl de mezcla. La mezcla 2A no contenía oligonucleótido adicional, la mezcla 2 B contenía 5 pmol del oligonucleótido "DEDETENCIÓN" Nº 218-95-03 (SEC ID Nº 184) y la mezcla 2C contenía 5 pmol del oligonucleótido "DE DETENCIÓN" nº 218-95-01 (SEC ID Nº 174). Después de una incubación de 60 minutos a 67 ºC (la reacción primaria descrita

anteriormente), a cada muestra se añadieron 2 μl de la mezcla de reacción secundaria: La mezcla 2A se añadió a

las muestras nº 1-10; la mezcla 2B se añadió a las muestras nº 11-20 y la mezcla 2C se añadió a las muestras nº 21-30. La temperatura se ajustó a 52 ºC y las muestras se incubaron a 52 °C durante 30 minutos. Después, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de una solución de formamida al 95%, EDTA 5 mM y violeta cristal al 0,02 %. Se calentaron todas las muestras hasta 95ºC durante 2 minutos y se resolvieron cuatro μl de cada

muestra mediante electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 1,4) y EDTA 1,4 mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 nm y la emisión detectada a 530 nm. Las imágenes resultantes se muestran en la Fig. 107

En la Fig. 107, el Panel A muestra los resultados de la titulación de la diana cuando no se incluyó oligonucleótido DEDETENCIÓN en la reacción secundaria; el Panel B muestra los resultados de la misma titulación de la diana usandoun oligonucleótido DE DETENCIÓN que se extendió 2 nucleótidos en la región complementaria no diana de la sonda primaria; y el Panel C muestra los resultados de la misma titulación de la diana usando un oligonucleótido DEDETENCIÓN que se extendió 4 nucleótidos en la región complementaria no diana de la sonda primaria. El producto de la reacción de escisión secundaria se ve como una banda cerca de la parte inferior de cada panel. Los primeros dos carriles de cada panel (es decir, 1 y 2, 11 y 12, 21 y 22) carecía de ADN diana y la señal que comigra con la banda del producto representa el fondo no específico bajo cada conjunto de condiciones.

Mediante inspección visual de estos paneles se puede ver que la señal de fondo está reducida y se hace máspredecible, mediante la inclusión de cualquier especie de oligonucleótido DE DETENCIÓN. Además De reducir el fondo en los carriles control no diana, la reducción de fondo en las reacciones que tenían las cantidades más diluidas de la diana incluidas se reduce, lo que conduce a una señal que es un reflejo más preciso de la diana contenida dentro de la reacción, de modo que se mejora el intervalo cuantitativo de la reacción múltiple de escisión invasiva secuencial.

Para cuantificar el impacto de incluir el oligonucleótido DE DETENCIÓN en la reacción de escisión secundaria en estas condiciones, la señal media de la banda del producto de las reacciones que tienen la mayor cantidad de diana (es decir, las medias de las señales de los carriles 9 y 10, carriles 19 y 20 y carriles 29 y 30) se compararon con la

señal media de los carriles control sin diana para cada panel, se determinó la “cantidad sobre el fondo”, el factor de

amplificación de señal sobre el fondo, en cada conjunto de condiciones. Para las reacciones sin oligonucleótido DE DETENCIÓN, Panel A, la cantidad sobre el fondo fue 5,3; para el Panel B, la cantidad sobre el fondo fue 12,7; y para el Panel C, la cantidad sobre el fondo fue 13,4, lo que indica que en este sistema, la inclusión de cualquier oligonucleótido DE DETENCIÓN al menos duplicó la especificidad de la señal sobre las reacciones sin oligonucleótido DE DETENCIÓN y que el oligonucleótido DE DETENCIÓN que se extendió ligeramente más allá en la región complementaria no diana puede ser ligeramente más eficaz, al menos en esta realización del sistema. Esto muestra claramente los beneficios de usar un oligonucleótido DE DETENCIÓN para potenciar la especificidad de estas reacciones, una ventaja que es de particular beneficio a niveles bajos del ácido nucleico diana.

EJEMPLO 50

Los oligonucleótidos “DE DETENCIÓN” permiten el uso de concentraciones más elevadas de sonda primaria

sin incrementar la señal de fondo

En el Ejemplo 36 se demostró que incrementando la concentración de la sonda en la reacción de escisión invasiva se puede incrementar espectacularmente la cantidad de señal generada para una cantidad dada de ADN diana. Aunque sin pretender limitar la explicación a ningún mecanismo específico, se cree que se debe al hecho de que una concentración mayor de la sonda aumenta la velocidad a la cual la sonda escindida es suplantada por una copia sin escindir, de modo que se aumenta la velocidad de renovación de la reacción de escisión. Por desgracia, este efecto no se pudo aplicar después a la reacción de escisión primaria de un ensayo INVASOR secuencial múltiple porque la sonda primaria sin escindir residual puede hibridar con la diana secundaria, en competición con las moléculas escindidas, de modo que se reduce la eficacia de la reacción secundaria. Las concentraciones elevadas de la sonda primaria exacerban este problema. Además, los complejos resultantes, como se ha descrito anteriormente, pueden escindirse a un nivel bajo, lo que contribuye al fondo. Por tanto, incrementar la sonda primaria puede tener un efecto negativo doble de ralentizar la reacción secundaria e incrementar el nivel de estaforma de fondo específico no diana. El uso de un oligonucleótido DE DETENCIÓN para secuestrar o neutralizar la sonda primaria residual permite aplicar este efecto de potenciación de la concentración a estas reacciones secuenciales.

Para demostrar este efecto se realizaron dos conjuntos de reacciones. En el primer conjunto de reacciones, las reacciones se realizaron usando una serie de concentraciones de la sonda primaria, por ningún oligonucleótido DEDETENCIÓN se suministró en la reacción secundaria. En el segundo conjunto de reacciones se usaron las mismasconcentraciones de la sonda, pero se añadió un oligonucleótido DE DETENCIÓN para las reacciones secundarias.

Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Las reacciones INVASOR primarias se realizaron en un volumen final de 10 μl y contenían: MOPS 10 mM, pH 7,5, MgCl2 7,5 mM, 500 fm del INVASOR primario (218-55-05; SEC ID Nº 171); 30 ng de la enzima FEN1 de Afu y 10 ng de ADN genómico humano. Se incluyeron 100 zeptomoles del amplicón del VHB pAM6 #2 en todas las reacciones de número par (por referencia a las Figs. 108A y B). Las reacciones incluyeron 10 pmol, 20 pmol, 50 pmol, 100 pmol o 150 pmol de la sonda primaria (218-55-02; SEC ID Nº 170). MOPS, oligonucleótidos diana e INVASOR se combinaron hasta un volumen final de 7 μl. Las muestras se desnaturalizaron con calor a 95 ºC durante 5 minutos, después se enfriaron hasta 67 ºC. Durante la desnaturalización de 5 minutos se combinaron MgCl2, la sonda y la enzima. Las reacciones INVASOR primarias se iniciaron mediante la adición de 3 μl de MgCl2, la sonda y la mezcla de enzimas a las concentraciones finales indicadas anteriormente. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 67 ºC. Después, las reacciones se enfriaron hasta 52 ºC y cada reacción INVASOR primaria recibió los componentes de reacción secundaria siguientes en un volumen total de 4 μl: 2,5 pmol de diana secundaria (número de oligonucleótido 218-95-04; SEC ID Nº 172); 10 pmol de sonda secundaria (número de oligonucleótido 228-48-04; SEC ID Nº 173). Las reacciones que incluyeronel oligonucleótido DE DETENCIÓN tenían 40 pmol, 80 pmol, 200 pmol, 400 pmol o 600 pmol del oligonucleótido DEDETENCIÓN (número de oligonucleótido 218-95-01; SEC ID Nº 174), añadidos con un exceso molar de 4 veces sobre la cantidad de la sonda primaria para cada reacción, con esta mezcla. Las reacciones se incubaron a 52 ºC durante 30 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de una solución de formamida al 95% con EDTA 10 mM y cristal violeta al 0,02%. Se calentaron todas las muestras hasta 95ºC durante 1 minuto y se

resolvieron cuatro μl de cada muestra mediante electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20%

(19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 1,4) y EDTA 1,4 mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 y la emisión detectada a 530. Las imágenes resultantes para las reacciones con o sin unoligonucleótido DE DETENCIÓN se muestran en las Figs. 108A y 108B, respectivamente. Los productos de escisión de la sonda secundaria se ve como una banda cerca de la parte inferior de cada panel.

En la Fig. 108A, los conjuntos de carril 1 y 2 muestran los resultados con 10 pmol de sonda primaria; 3 y 4 tenían 20 pmol; 5 y 6 tenían 50 pmol; 7 y 8 tenían 100 pmol; y 9 y 10 tenían 150 pmol. Mediante examen visual se puede ver que los incrementos en la cantidad de sonda primaria tienen el efecto combinado de incrementar ligeramente el fondo en los carriles sin diana (números impares) y reducen la señal específica en presencia de diana (carriles con números pares) y, de este modo se reduce la especificidad de la reacción si se ve como la medida de la “cantidad sobre el fondo”, lo que demuestra que el enfoque de incrementar la señal aumentando la sonda no se puede aplicar

en estas reacciones secuenciales.

En la Fig. 108B, los conjuntos de carril 1 y 2 muestran los resultados con 10 pmol de sonda primaria; mientras que 3 y 4 tenían 20 pmol; 5 y 6 tenían 50 pmol; 7 y 8 tenían 100 pmol; y 9 y 10 tenían 150 pmol. Además, cada reacciónincluyó un exceso molar por 4 del oligonucleótido DE DETENCIÓN añadido antes de la reacción de escisión secundaria. Mediante examen visual se puede ver que el fondo en los carriles sin diana (números impares) es menor en todos los casos, mientras que la señal específica en presencia de diana (carriles con números pares) aumenta con cantidades crecientes de la sonda primaria, lo que conduce a una mayor sensibilidad de “cantidad sobre el fondo a este nivel de la diana.

Para comparar cuantitativamente estos efectos se midió la señal de fluorescencia de los productos de escisión inespecífica y específica. Los resultados se representan gráficamente en la Fig. 108C, como una medida del porcentaje de la sonda secundaria escindida durante la reacción, en comparación con la cantidad de sonda primaria usada. El examen de los gráficos de las reacciones sin diana confirma que el fondo en ausencia del oligonucleótidoDE DETENCIÓN es, en general, aproximadamente dos veces mayor, y que ambos aumentan ligeramente con las cantidades crecientes de la sonda. No obstante, las señales específicas divergen entre los dos conjuntos dereacción de forma espectacular. Aunque la señal en las reacciones sin oligonucleótido DE DETENCIÓN disminuye de forma constante a medida que aumenta la sonda primaria, la señal en las reacciones con oligonucleótido DEDETENCIÓN siguió aumentando. A las concentraciones más altas de la sonda primaria analizadas, las reaccionessin oligonucleótido DE DETENCIÓN tenían una señal específica que era solo 1,7 veces sobre el fondo, mientras que las reacciones con oligonucleótido DE DETENCIÓN detectaron los 100 zmol (60.000 copias) de diana con una señal 6,5 sobre el fondo, de modo que se demuestra la mejora de la reacción de escisión invasiva secuencial cuando seincluye el oligonucleótido DE DETENCIÓN.

EJEMPLO 51

Las estructuras modificadas mejoran el rendimiento de los oligonucleótidos DE DETENCIÓN Oligos “DE DETENCIÓN” naturales sin 3’-amina

Las reacciones descritas en los dos Ejemplos anteriores usaron oligonucleótidos DE DETENCIÓN construidos usando una estructura de 2’ O-metil ribosa y que incluían un grupo amino cargado positivamente en el nucleótido en 3’. Las modificaciones se realizaron específicamente para reducir la interacción enzimática con el complejo sonda

primaria/oligonucleótido DE DETENCIÓN. Durante el desarrollo de la presente invención se determinó que los oligonucleótidos 2’-O-metil modificados son algo resistentes a la escisión por las nucleasas 5’, en la medida en la que son degradados lentamente por las nucleasas cuando se usan en aplicaciones antisentido (véase, por ejemplo, Kawasaki y col., J. Med. Chem., 36:831 [1993]).

Además, como se demuestra en el ejemplo 35, la presencia de un grupo amino en el extremo 3’ de un

oligonucleótido reduce su capacidad para dirigir la escisión invasiva. Para reducir la posibilidad de que eloligonucleótido DE DETENCIÓN forme una estructura de escisión de este modo se incluyó un grupo amino en el diseño de los experimentos descritos en este y en otros Ejemplos..

Los diseños iniciales de los oligonucleótidos DE DETENCIÓN (en ocasiones denominados “bloqueantes”) no incluyeron estas modificaciones y se encontró que estas moléculas no proporcionaban beneficios en la reducción de la escisión de fondo en el ensayo de escisión invasiva secuencial y, de hecho, en ocasiones contribuyó al fondo induciendo la escisión en un sitio imprevisto, probablemente proporcionando algún elemento a una estructura deescisión alternativa. Los efectos del oligonucleótido DE DETENCIÓN natural y modificado sobre el ruido de fondo en estas reacciones se investigan en este Ejemplo.

La eficacia de un “oligonucleótido DE DETENCIÓN natural” (es decir, un oligonucleótido DE DETENCIÓN que no

contenía ningún análogo de base o modificación de base) se examinó mediante comparación con una reacción idéntica que carecía de oligonucleótido DE DETENCIÓN. Todas las reacciones se realizaron por duplicado y se efectuaron del siguiente modo. Se montaron dos mezclas maestras, cada una de las cuales contenía MOPS 12,5 mM, pH 7,5, 500 fmol de oligonucleótido INVASOR primario nº 218-55-05 (SEC ID Nº 171),10 ng de ADN genómico humano (Novagen) y 30 ng de la enzima FEN1 de Afu. La mezcla A no contenía ADN de amplicón genómico del VHB añadido, la mezcla B contenía 600.000 moléculas de ADN de amplicón genómico del VHB, pAM6 #2. Las mezclas se distribuyeron a los tubos de reacción, en alícuotas de 8 μl/tubo del siguiente modo: La mezcla A a los tubos 1, 2, 5 y 6; y la mezcla B a los tubos 3, 4, 7 y 8. Las muestras se incubaron a 95 °C durante 4 minutos para desnaturalizar el ADN de amplicón genómico del VHB. Las reacciones se enfriaron hasta 67 ºC y a cada muestra se añadieron 2 μl de una mezcla que contenía MgCl2 37,5 mM y 10 pmol de 218-55-02B (SEC ID Nº 185) por cada 2 μl. Después, las muestras se incubaron a 67ºC durante 30 minutos. Se prepararon dos mezclas maestras de reacción secundaria, cada una de las cuales contenía 10 pmol del oligonucleótido sonda secundario nº 228-48-04 (SEC ID Nº 178) y 2,5 pmol del oligonucleótido diana secundario nº 218-95-04 (SEC ID Nº 172) por cada 3 μl de mezcla. La mezcla 2A no contenía oligonucleótido adicional, mientras que la mezcla 2B contenía 50 pmol del oligonucleótido“DE DETENCIÓN" natural nº 241-62-02 (SEC ID Nº 186). Después de una incubación inicial de 30 minutos a 67 ºC, la temperatura se ajustó a 52 ºC y a cada muestra se añadieron 3 μl de la mezcla de reacción secundaria, del siguiente modo: La mezcla 2A se añadió a las muestras 1-4; y la mezcla 2B se añadió a las muestras 5-8. Después, las muestras se incubaron a 52 °C durante 30 minutos. Después, las reacciones se detuvieron mediante la adición

de 10 μl de formamida al 95% con EDTA 10 mM y cristal violeta al 0,02 %.

Se calentaron todas las muestras hasta 95ºC durante 2 minutos y se resolvieron cuatro μl de cada muestra mediante

electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 1,4) y EDTA 1,4 mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 nm y la emisión detectada a 530 nm. Las imágenes resultantes se muestran en la Fig. 109A.

Para comparar los efectos de las diversas modificaciones realizadas en los oligonucleótidos DE DETENCIÓN, lasreacciones se realizaron usando los oligonucleótidos DE DETENCIÓN que tienen bases naturales pero que incluyenuna amina en el extremo 3’: el oligonucleótido DE DETENCIÓN que tiene la parte 3’ compuesta por 2-O’-metil nucleótidos, más la amina en el extremo 3’, y el oligonucleótido DE DETENCIÓN compuesto completamente por 2O’-metil nucleótidos más la amina en el extremo 3’. Estos se compararon con las reacciones realizadas sin unoligonucleótido DE DETENCIÓN. Las reacciones se realizaron del siguiente modo. Se montaron dos mezclas maestras, cada una de las cuales contenía MOPS 14,3 mM, pH 7,5, 500 fmol de oligonucleótido INVASOR primario nº 218-55-05 (SEC ID Nº 171) y 10 ng de ADN genómico humano (Novagen) por cada 7 μl de mezcla. La mezcla A no contenía ADN de amplicón genómico del VHB añadido, la mezcla B contenía 600.000 moléculas de ADN de

amplicón genómico del VHB, pAM6 #2. Las mezclas se distribuyeron a los tubos de reacción, a 7 μl/tubo: La mezcla

A a los tubos 1, , 2, 5, 6, 9, 10, 13 y 14; y la mezcla B a los tubos 33, 4, 7, 8, 11, 12, 15 y 16. Las muestras se calentaron hasta 95 °C durante 4 minutos para desnaturalizar el ADN del VHB. Después, las reacciones se enfriaron hasta 67 ºC y a cada muestra se añadieron 3 μl de una mezcla que contenía MgCl2 25 mM, 25 pmol de 218-55-02B (SEC ID Nº 185) y 30 ng de enzima FEN1 de Afu por cada 3 μl. Después, las muestras se incubaron a 67ºC durante 30 minutos. Se prepararon cuatro mezclas maestras de reacción secundaria, cada una de las cuales contenía 10 pmol del oligonucleótido sonda secundario nº 228-48-04 (SEC ID Nº 190) y 2,5 pmol del oligonucleótido diana secundario nº 218-95-04 (SEC ID Nº 172) por cada 3 μl de mezcla. La mezcla 2A no contenía oligonucleótidoadicional, mientras que la mezcla 2B contenía 100 pmol del oligonucleótido DE DETENCIÓN natural + amina nº 24162-01 (SEC ID Nº 187), la mezcla 2C contenía 100 pmol del oligonucleótido parcialmente O-metil+amina nº 241-6203 (SEC ID Nº 188) y la mezcla 2D contenía 100 pmol del oligonucleótido completamente O-metil+amina nº 241-6401 (SEC ID Nº 189). Después de una incubación inicial de 30 minutos a 67 ºC, la temperatura se ajustó a 52 ºC y a

cada muestra se añadieron 3 μl de la mezcla de reacción secundaria, del siguiente modo: La mezcla 2A se añadió a

las muestras 1-4; la mezcla 2B se añadió a las muestras 5-8; la mezcla 2C se añadió a las muestras 9-12 y la mezcla 2D se añadió a las muestras 13-17. Las muestras se incubaron a 52 °C durante 30 minutos, después, se detuvieron mediante la adición de 10 μl de formamida al 95% con EDTA 10 mM y cristal violeta al 0,2%.

electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 1,4) y EDTA 1,4 mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 nm y la emisión detectada a 530 nm. Las imágenes resultantes se muestran en la Fig. 109B.

En la Fig. 109A, el panel izquierdo muestra las reacciones que carecían el oligonucleótido DE DETENCIÓN, mientras que el panel derecho muestra los datos de las reacciones que incluyeron oligonucleótido DE DETENCIÓN natural. Los primeros dos carriles de cada panel proceden de controles sin diana, el segundo conjunto de carriles contenían la diana. Los productos de la escisión son visibles en el cuarto inferior de cada panel. La posición a la cual se debe realizar los productos de reacción específica se indican con flechas a la izquierda y a la derecha.

Mediante examen de estos datos se puede ver que las reacciones realizadas sin oligonucleótido DE DETENCIÓN muestran una calidad reproducible entre los duplicados y muestran una escisión significativa solo cuando hay diana presente. Por el contrario, la adición de otro oligonucleótido sin modificar en las reacciones produce una gran variación entre los carriles duplicados (p. ej., los carriles 5 y 6 se proporcionaron con los mismos reactantes, peor produjeron resultados marcadamente diferentes). La introducción del oligonucleótido DE DETENCIÓN natural produjo, en lugar de reducir, fondo en estos carriles no diana y aumentó la escisión en otros sitios (es decir, las bandas distintas a las indicadas por las flechas que flanquean los paneles). Por estos motivos se incorporaron las modificaciones descritas anteriormente, cuyos efectos se muestran en la Fig. 109B.

Los primeros 4 carriles de la Fig. 109B muestran los productos de reacciones duplicadas sin un oligonucleótido DEDETENCIÓN, más o menos la diana del VHB (carriles 1, 2 y carriles 3, 4, respectivamente); los siguientes 4 carriles,5, 6, y 7, 8 usaron un oligonucleótido DE DETENCIÓN natural con una amina en 3’; los carriles 9, 10 y 11, 12 usaron el oligonucleótido DE DETENCIÓN con una porción en 3’ compuesta por 2’-O-metil nucleótidos y que tienen una amina en 3’; los carriles 13, 14 y 15, 15 usaron el oligonucleótido DE DETENCIÓN compuesto completamente por 2’-O-metil nucleótidos y que tienen una amina en 3’. Los productos de escisión de la sonda secundaria son visibles en el tercio inferior de cada panel.

La inspección visual de estos datos muestra que la adición de la amina en 3’ al oligonucleótido DE DETENCIÓN

natural suprime la escisión aberrante observada en la Fig. 109A, pero este oligonucleótido DE DETENCIÓN no mejora el rendimiento de la reacción en comparación con los controles sin oligonucleótido DE DETENCIÓN. En contraste con ello, el uso de 2’-O-metil nucleótidos en el cuerpo del oligonucleótido DE DETENCIÓN sí reduce el fondo, parcial o completamente sustituido. Para cuantificar los efectos relativos de estas modificaciones se midió la fluorescencia de cada una de las bandas de producto que comieran, se obtuvo la media de las señales de los carriles duplicados y se calculó "la cantidad sobre el fondo" para cada reacción que contiene ácido nucleico diana.

Cuando se omitió el oligonucleótido DE DETENCIÓN, la señal diana específica (carriles 3, 4) fue 27 veces mayorque el fondo diana; el oligonucleótido DE DETENCIÓN + amina dio una señal de 17 sobre el fondo; el 2’-Ometil+amina dio una señal de 47 sobre el fondo; y el 2’-O-metil+amina completo dio una señal de 33 sobre el fondo.

Estas Figuras muestran que ambas modificaciones pueden tener un efecto beneficioso sobre la especificidad del ensayo múltiple de escisión invasiva secuencial. También muestran que el uso de la estructura 2’-O-metil sustituida, parcial o completa, mejora marcadamente la especificidad de estas reacciones. Se pretende que en varias realizaciones de la presente invención que cualquier número de modificaciones que forman el oligonucleótido DE DETENCIÓN o el complejo que forma con la diana primaria resistente a nucleasas proporcione una potenciación similar.

EJEMPLO 52

Efecto de la longitud del oligonucleótido de DETENCIÓN sobre la mejora de la señal en ensayos múltiples de de escisión invasiva secuencial

Como se indica en la Descripción de la Invención, la longitud óptima de un oligonucleótido DE DETENCIÓN depende del diseño de otros elementos de ácido nucleico de la reacción INVASOR, particularmente sobre el diseño de la sonda primaria. En este Ejemplo se exploraron los efectos de variar la longitud del oligonucleótido DEDETENCIÓN en sistemas usando dos sondas secundarias diferentes. En la Fig. 110C se proporciona un diagrama esquemático que muestra estos oligonucleótido DE DETENCIÓN alineados como se hibridarían con el oligonucleótido sonda primaria. En esta Figura, la región de la sonda primaria que reconoce el ácido nucleico diana se muestra subrayada; la porción sin subrayar, más la primera base sin subrayar es la porción que se libera mediante la primera escisión y pasa a participar en la segunda o posterior estructura de escisión.

Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Las reacciones INVASOR se realizaron en un volumen final de 10 μl, que contiene MOPS 10 mM, pH 7,5, MgCl2 mM ; 500 fmol de INVASOR primario 241-95-01, (SEC ID Nº 176), 25 pmol de sonda primaria 241-95-02 (SEC ID Nº 175), 30 ng de la enzima FEN1 de Afu y 10 ng de AND genómico humano y, sin se incluyen, 1 amol del amplicón del VHB pAM 6 #2. MOPS, el AND Diana y los oligonucleótidos INVASOR se combinaron hasta un volumen final de 7 μl. Las muestras de desnaturalizaron con calor a 95 °C durante 5 minutos, después se enfriaron hasta 67 °C. Durante la desnaturalización de 5 minutos se combinaron, MgCl2, la sonda y la enzima. Las reacciones INVASOR primarias se iniciaron mediante la adición de 3 μl de MgCl2, la sonda y la mezcla de enzimas a las concentraciones finales indicadas anteriormente. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 67 ºC. Después, las reacciones se enfriaron hasta 52 ºC y cada reacción INVASOR primaria recibió los componentes de reacción secundaria siguientes en un volumen total de 3 μl: 2,5 pmol de diana secundaria 241-95-07 (SEC ID Nº 177), 10 pmol de sonda secundaria 228-48-04 (SEC ID Nº 173), o 228-48-04N(SEC ID Nº 178) y 100 pmol de un oligonucleótido DE DETENCIÓN, bien 241-95-03 (SEC ID Nº 179), 241-95-04(SEC ID Nº 180), 241-95-05 (SEC ID Nº 181) o 241-95-06 (SEC ID Nº 182). El oligonucleótido DE DETENCIÓN se omitió en algunas reacciones como controles para los efectos del oligonucleótido DE DETENCIÓN.

Las reacciones se incubaron a 52ºC durante 34 minutos y se detuvieron después mediante la adición de 10 μl de formamida al 95% con EDTA 10 mM y cristal violeta al 0,02%. Se calentaron todas las muestras hasta 95ºC durante 1 minuto y se resolvieron cuatro μl de cada muestra mediante electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 1,4) y EDTA 1,4 mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 nm y la emisión detectada a 530 nm. Las imágenes resultantes para las reacciones con las sondas secundarias más cortas y más largas se muestran en las Figs. 110A y 110B, respectivamente.

En cada Figura, los productos de la escisión son visibles como bandas en la mitad inferior de cada carril. Los primeros 4 carriles de cada Figura muestran los productos de reacciones duplicadas sin un oligonucleótido DEDETENCIÓN más o menos la diana del VHB (conjuntos de carriles 1 y 2, respectivamente), en los siguientes 4carriles, los conjuntos 3 y 4 usaron el DE DETENCIÓN más corto 241-95-03 (SEC ID Nº 179); los carriles 5 y 6 usaron 241-95-04 (SEC ID Nº 180); los carriles 7 y 8 usaron 241-95-05 (SEC ID Nº 181); y los carriles 9 y 10 usaron 241-95-06 (SEC ID Nº 182).

EL fondo principal de atención es la banda que aparece en los carriles control “sin diana” (números impares; esta

banda comiera con la señal específica de la diana cerca de la parte inferior de cada panel del gel). La inspecciónvisual muestra que el oligonucleótido DE DETENCIÓN más corto fue el menos eficaz en la supresión de este fondo y que la eficacia aumentaba cuando el oligonucleótido DE DETENCIÓN se extendía más allá en la parte que participa en la posterior reacción de escisión. Incluso con esta diferencia en el efecto, se puede ver a partir de estos datos que hay mucha diferencia en el diseño del oligonucleótido DE DETENCIÓN. La elección de las longitudes severá influida por la temperatura a la cual se realiza la reacción que usa el oligonucleótido DE DETENCIÓN, las longitudes de los dúplex formados entre la sonda primaria y la diana, la sonda primaria y la diana secundaria, y las concentraciones relativas de la especie de ácido nucleico diferente en las reacciones.

EJEMPLO 53

Efecto de la concentración del oligonucleótido de DETENCIÓN sobre la mejora de la señal en ensayos múltiples de de escisión invasiva secuencial

Al examinar los efectos de incluir oligonucleótidos DE DETENCIÓN en estas reacciones de escisión, fue de interésdeterminar su la concentración del oligonucleótido DE DETENCIÓN en exceso de la concentración de la sonda primaria tendría un efecto sobre los rendimientos de la señal inespecífica o específica, y si la longitud deloligonucleótido DE DETENCIÓN fuera un factor. Estas dos variables se investigaron en el Ejemplo siguiente.

Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Las reacciones con INVASOR primario se realizaron en un volumen final de 10 μl y contenían MOPS 10 mM, pH 7,5; MgCl2 7,5 mM, 500 fmol de INVASOR primario 241-95-01 (SEC ID Nº 176), 25 pmol de sonda primaria 241-95-02 (SEC ID Nº 175), 30 ng de la enzima FEN-1 de Afu y 10 ng de AND genómico humano. Cuando se incluyeron, el ADN diana fue 1 atomol del amplicón del VHB pAM 6 #2, como

se ha descrito anteriormente. MOPS, la diana y el INVASOR se combinaron hasta un volumen final de 7 μl. Las

muestras se desnaturalizaron con calor a 95 ºC durante 5 minutos, después se enfriaron hasta 67 ºC. Durante la desnaturalización de 5 minutos se combinaron MgCl2, la sonda y la enzima. Las reacciones INVASOR primarias se iniciaron mediante la adición de 3 μl de MgCl2, la sonda y la mezcla de enzimas. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a 67 ºC. Después, las reacciones se enfriaron hasta 52 ºC y cada reacción INVASOR primaria recibió los componentes de reacción secundaria siguientes: 2,5 pmol de Diana secundaria 241-95-07 (SEC ID Nº 177), 10 pmol de sonda secundaria 228-48-04 (SEC ID Nº 173); y, si se incluye, 50, 100 o 200 pmol del oligonucleótido DE DETENCIÓN 241-95-03 (SEC ID Nº 179) o 241-95 o 1813 (SEC ID Nº 181) en un volumen total

de 3 μl. Las reacciones se incubaron a 52 ºC durante 35 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de una solución de formamida al 95% con EDTA 10 mM y cristal violeta al 0,02%. Se calentaron todas las muestras hasta 95ºC durante 1 minuto y se resolvieron cuatro μl de cada muestra mediante electroforesis a través

de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (19:1 reticulación), con urea 7 M, en un tampón que contenía Tris-Borato 45 mM (pH 8,3) y EDTA 1,4 mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 nm y la emisión detectada a 530 nm. Las imágenes resultantes se muestran como una imagen compuesta en la Fig. 111.

Cada una de las reacciones duplicadas se cargaron en el gen en los carriles adyacentes y se marcan con un único número de carril. Todos los carriles con número impar eran controles sin diana. Los carriles 1 y 2 no teníanoligonucleótido DE DETENCIÓN añadido; los carriles 3-8 muestran los resultados de las reacciones que contienen el oligonucleótido DE DETENCIÓN más corto, 241-95-03 (SEC ID Nº 179); los carriles 9-14 muestran los resultadosde las reacciones que contienen el oligonucleótido DE DETENCIÓN más largo, 241-95-05 (SEC ID Nº 181). Los productos de escisión de la reacción secundaria son visibles en el tercio inferior de cada panel. La inspección visual de estos datos (es decir, la comparación de los productos específicos con las bandas de fondo) muestra que ambosoligonucleótidos DE DETENCIÓN tienen algunos efectos beneficiosos en toda la concentración.

Para cuantificar los efectos relativos de la longitud y la concentración del oligonucleótido DE DETENCIÓN se midió la fluorescencia de cada una de las bandas de producto que comieran, se obtuvo la media de las señales de los carriles duplicados y se calculó "la cantidad sobre el fondo" para cada reacción que contiene ácido nucleico diana.La reacción que carece de un oligonucleótido DE DETENCIÓN dio una señal de aproximadamente 27 sobre elfondo. La inclusión del oligonucleótido DE DETENCIÓN más corto a 50, 100 o 200 pmol produjo productos a 42, 51 y 60 sobre el fondo, respectivamente. Esto muestra que mientras que el oligo de detención corto a la concentración más baja parece ser menos eficaz que los oligonucleótidos DE DETENCIÓN más largos (véase el Ejemplo previo),esto se puede compensar incrementando la concentración del oligonucleótido DE DETENCIÓN y, de este modo, laproporción oligonucleótido DE DETENCIÓN:sonda primaria.

En contraste con ello, la inclusión del oligonucleótido DE DETENCIÓN más corto a 50, 100 o 200 pmol produjo productos a 60, 32 y 24 sobre el fondo, respectivamente. A la concentración más baja, la eficacia de este oligonucleótido DE DETENCIÓN más largo respecto al oligonucleótido DE DETENCIÓN más corto es consistente con el Ejemplo anterior. No obstante, incrementar la concentración disminuyó el rendimiento del producto específico, lo que sugiere un efecto de competición con algún elemento de la reacción de escisión secundaria.

Estos datos muestran que los oligonucleótidos DE DETENCIÓN se pueden usar para aventajar en un número de diseños de reacción específica. La elección de la concentración se verá influida por la temperatura a la cual serealiza la reacción que usa el oligonucleótido DE DETENCIÓN, las longitudes de los dúplex formados entre la sonda primaria y la diana, la sonda primaria y la diana secundaria, y entre la sonda primaria y el oligonucleótido DEDETENCIÓN .

La selección de oligonucleótidos para ácidos nucleicos diana distintos al VHB mostrado aquí (p. ej., la composición y la longitud del oligonucleótido) y la optimización de las condiciones de reacción de escisión de acuerdo con los modelos proporcionados en el presente documento siguen procedimientos rutinarios y la práctica común bien conocido para los expertos en biología molecular.

El Ejemplo 45 demostró que algunas enzimas requieren un solapamiento entre un oligonucleótido INVASOR cadena arriba y un oligonucleótido sonda cadena abajo para crear una estructura de escisión (Figura 100). También se ha determinado que el nucleótido en 3’ del un oligonucleótido INVASOR no tiene que ser complementario de la hebra diana, aunque sea la única base solapante en el un oligonucleótido INVASOR (p. ej., como con las sondas del HCMV mostradas en la Figura 103). El requisito de un solapamiento puede servir de base conveniente para detectar polimorfismos de una sola base (SNP) o mutaciones en una muestra de ácido nucleico.

Para la detección de variaciones de una base, al menos dos oligonucleótidos (p. ej., una sonda y un oligonucleótido INVASOR) hibridan en tándem con el ácido nucleico diana para formar la estructura solapante reconocida por la

enzima CLEAVASE que se va a usar en la reacción. Una “aleta” sin aparear se incluye en el extremo 5' de la sonda.

La enzima reconoce el solapamiento y escinde la aleta sin aparear, liberándola como producto específico de la diana. Las enzimas que tienen una fuerte preferencia por una estructura solapante, es decir que escinden la estructura solapante a una velocidad mucho mayor de la que escinden una estructura no solapante incluyen las enzimas FEN-1 de Archaeoglobus fulgidus y Pyrococcus furiosus y dichas enzimas son particularmente preferidas en la detección de mutaciones y SNP. En la reacción secundaria, la aleta liberada sirve como oligonucleótido INVASOR para crear otra estructura de escisión solapante (p. ej., como se muestra en la Figura 96). En los ejemplos siguientes, la aleta libera crea esta estructura solapante junto con un casete FRET, un único oligonucleótido que tiene una región de autocomplementariedad para formar una horquilla (Figura 112A). Cuando el casete FRET se

escinden para liberar el nucleótido en 5’, el colorante fluorescente (F) y el inactivador (Q) en el casete están

separados y se produce una señal de fluorescencia detectable. Si la sonda y la secuencia diana no coinciden perfectamente en el sitio de escisión (p. ej., como en la Figura 112B), la estructura solapada no se forma, la escisión se suprime y no se producirá fluorescencia.

Las reacciones se pueden realizar en condiciones en las que las sondas y los casetes FRET se renuevan de forma continua sin ciclado de la temperatura o escisión. Cuando una sonda sin cortar hibrida con la diana al lado de un oligonucleótido INVASOR solapante, la sonda se puede escindir para producir un producto específico de diana que, a su vez, permite la escisión de muchos casetes FRET.

Los siguientes ocho ejemplos demuestran el diseño y la aplicación del ensayo con INVASOR secuencial con detección del casete FRET al análisis de SNP y mutaciones en diversas muestras de ácido nucleico.

EJEMPLO 54

Detección de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen de la apolipoproteína E humana

Este Ejemplo describe un ensayo para la detección de SNP en el gen de la apolipoproteína E humana Se diseñaron oligonucleótidos sonda e INVASOR dirigidos a polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en dos posiciones en el gen de la apolipoproteína E (apoE) humana. Existen tres alelos diferentes para el gen de la apoE, épsilon 2, épsilon 3 y épsilon 4, que codifican 3 isoformas diferentes de la proteína apoE, denominadas E2, E3 y E4. Las diferentes isoformas varían en las posiciones de aminoácidos 112 o 158 (véase la Tabla A) y cada variación se debe a un único cambio de base en el codón correspondiente.

Tabla A

ISOFORMA: 112 158

Codón: aminoácido Codón aminoácido

E2 E3 E4: TGC TGC CGC cys cys arg TGC CGC CGC cys arg arg

Los oligonucleótidos INVASOR y sonda se diseñaron usando el algoritmo descrito anteriormente (Descripción detallada de la invención), fijando la sonda seleccionada a 63 ºC. Como se muestra en las Figuras 113 A-D, para cada codón se diseñaron un oligonucleótido INVASOR y dos oligonucleótidos sonda sin marcar, una por cada variante en un locus dado. Para el codón 112, las sondas se diseñaron para detectar el nucleótido C (para codificar arginina; SEC ID Nº 197) o el nucleótido T (para codificar cisteína; SEC ID Nº 198). Para el codón 158, las sondas se diseñaron para detectar el nucleótido C (para codificar arginina; SEC ID Nº 199) o un nucleótido T (para codificar cisteína; SEC ID Nº 200). Un casete FRET que se va a usar con todos los conjuntos de sondas también se sintetizó (SEC ID Nº 201, Figura113). En este Ejemplo, y en los Ejemplos siguientes, todos los oligonucleótidos se sintetizaron usando química de fosforamidita convencional. Los oligonucleótidos sonda primarios no estaban marcados. Los casete FRET se marcaron mediante la incorporación de fosforamidita Cy3 y fosforamidita (Glen

Research). Aunque diseñada para su uso en el extremo 5’, la fosforoamidita Cy3 tiene un grupo monometoxitritilo

(MMT) adicional en el colorante que se puede eliminar para permitir la extensión adicional de la cadena sintética, Lo que tiene como resultado un marcador interno con el colorante unido en un hueco en la estructura de azúcar-fosfato del oligonucleótido (según el diagrama en los paneles de la Figura 113). Aunque un nucleótido se puede omitir en esta posición para adaptar el colorante, los inventores han determinado que no es necesario y ningún nucleótido se omitió de los casetes FRET usados en estos ejemplos. Las modificaciones amina o fosfato, cuando está indicado,

se usaron en los extremos 3’ de las sondas primarias y los casetes FRET para prevenir su uso como oligonucleótidos invasivos. Las bases 2’-O-metil en los oligonucleótidos diana secundarios se inducen mediante subrayado y también se usaron para minimizar el reconocimiento enzimático de los extremos 3'. Además, las reacciones que tienen ADN diana sintéticos se usaron como controles positivos para verificar la actividad de los componentes de la reacción. Las dianas control se ilustran en las Figuras 113 A-D. Los oligonucleótidos control 112 arg, 112 cys, 158 arg y 158 cys son las SEC ID Nº 191-194, respectivamente.

La muestra de ADN genómico AG09714 se adquirió en Coriell. Esta muestra se cuantificó mediante Pico Green y se diluyó con Tris con EDTA 0,1 mM hasta una concentración de aproximadamente 100 ng/μl Esta muestra (9714 en la figura 114A) se usó para analizar la mutación 112. Las muestras 39634, 32435 y 31071 se adquirieron como sangre entera de Lampire Biological Labs., Inc. Samples 511, 537, 538 y 539 fueron muestras de sangre entera donadas por el Blood Center of Southeast Wisconsin (Milwaukee, WI). El ADN genómico de preparó con el PUREGENE Blood Kit (Gentra) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras 39634 y 32435 se usaron para analizar la mutación 112 y las muestras 31071, 511, 537, 38 y 539 se usaron para analizar la mutación 158. Un μl de ADN genómico se usó por reacción con 9 μl de agua para un volumen final de 10 μl. Aunque la determinación del

genotipo completo para una muestra cualquiera suele requerir el análisis de ambos loci, las muestras enumeradas anteriormente se seleccionaron para mostrar señales representativas y, por tanto el funcionamiento, de cada conjunto de sondas. El genotipado completo requiere analizar cada muestra con los conjuntos de sondas.

El experimento comprendía analizar cada ADN genómico los alelos indicados junto con las reacciones que no tienen ADN diana para permitir la medición de cualquier señal de fondo no atribuible a la presencia de una secuencia diana. Las reacciones que analizan el locus 112 se realizaron por cuadruplicado, las reacciones que analizan el locus 158 se realizaron por triplicado.

Los componentes de la reacción se prepararon como mezclas discontinuas para dispensarse a las reacciones de ensayo individuales. Se prepararon lotes de la mezcla con INVASOR para cada alelo que comprendían para cada

reacción planeada: 4 μl de PEG 8000 al 16%/MOPS 50mM a pH 7,5 y 1 μl de oligonucleótido INVASOR 1 μM (el

112 o 158). Se prepararon lotes de la mezcla encima CLEAVASE/Mg2+/sonda para cada alelo que comprendían para

cada reacción planeada: 2 μl de MgCl2 75mM, 1 μl del casete FRET 10 μM, 1 μl de oligonucleótido sonda 10μM (uno cualquiera de los oligonucleótidos sonda 112 o 158 T o C) y 1 μl de la enzima FEN-1 de Afu 200ng/μl.

Para cada reacción se alicuotaron 5 μl de la reacción co INVASOR en cada pocillo de una microplaca de polipropileno de perfil bajo de 96 pocillos (MJ Research). Diez μl de cada AND control o muestra genómica

(aproximadamente 100 ng-190 ng) se añadieron y mezclaron pipetando arriba y abajo. Los controles sin diana recibieron 1 g del ARNt de levadura en lugar del ADN diana. Las reacciones que comprenden las dianas sintéticas como controles positivos incluyeron 150 o 100 zeptomoles (zmol) de las dianas sintéticas 112 o 158, respectivamente, y 1 g del ARNt de levadura. Cada reacción se cubrió con 20μl cera líquida de CHILLOUT u se incubó a 95 ºC durante 5 minutos. Después, la temperatura de reacción de redujo a 63 ºC, a cada reacción se añadieron 5μl de la mezcla de reacción enzima CLEAVASE/Mg2+/Sonda y se mezclaron pipeteando arriba y abajo 35 veces y las reacciones se incubaron después durante 4 horas a 63 ºC y se leyeron directamente en un lector de placas de multipocillos de fluorescencia CYTOFLUOR Series 4000 (PerSeptive Biosystems), usando los siguientes parámetros: Excitación (longitud de onda/ancho de banda): 485/20 nm; Emisión (longitud de onda/ancho de banda): 530/25 nm; Ganancia: 37. La señal de fluorescencia media neta se calculó restando la señal media no diana (fondo) de la correspondiente señal media de reacción de ADN diana y los datos se representaron usando el software de hoja de cálculo Excel (Microsoft).

De los resultados para los loci de ApoE 112 y ApoE 158 se muestran gráficamente en las Figuras 114A y 114B, respectivamente, con ADN Diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el

eje vertical. Las barras blancas representan la señal media neta de la sonda “C”, mientras que las barras oscuras representan señal media neta de la sonda “T”. Las reacciones que tienen dianas sintéticas se indican como Syn C y Syn T para los controles C y T, respectivamente. En ambos loci, las muestras que son homozigotas para el alelo C o T se identifican fácilmente por tener una señal fuerte de solo una sonda o la otra, mientras que las muestras heterocigotos se identifican fácilmente por tener señales fuertes de las sondas C y T.

EJEMPLO 55 Detección de mutaciones en el gen de la hemocromatosis humana (HFE)

El gen de la hemocromatosis humana (HFE) se localiza en la región MHC del cromosoma 6 e inicialmente se denominó HLA-H, para más tarde denominarse gen HFE, de acuerdo con el comité de la OMS para Nomenclatura de Factores del Sistema HLA. Dos variaciones diferentes de una sola base en el gen HFE son responsables de la gran mayoría de los casos de hemocromatosis hereditaria, o enfermedad de la sobrecarga férrica. La variante más habitual, denominada C282Y, se debe a un cambio de la adenina (A) de tipo Silvestre (WT) a la guanine (G) mutante (MT) en el codón 282 que produce un cambio de aminoácidos de un residuo de cisteína a una tirosina. La segunda variación detectada habitualmente en individuos que sufren el trastorno de la sobrecarga de hierro se denomina H63D y se debe a un cambio de una citosina (C) WT por una guanina (G) MT en el codón 63 que produce un cambio de aminoácido de histidina a un residuo de ácido aspártico en la proteína expresada.

Los conjuntos de oligonucleótido INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar los alelos WT y MT en los sitios C282Y y H63D se muestran en las Figuras 115 A-D. La detección del polimorfismo C282 usó un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 202), una sonda específica para cada variante del alelo (WT y MT, SEC ID Nº 208 y 209, respectivamente) y un primer casete FRET (SEC ID Nº 210). Los oligonucleótidos para el locus H63 incluyeron un oligonucleótido INVASOR (SEC ID Nº 203), una sonda específica para cada variante del alelo (WT y MT, SEC ID Nº 211 y 212, respectivamente) y un segundo casete FRET (SEC ID Nº 213). Además, las reacciones que tienen ADN diana sintéticos se usaron como controles positivos para verificar la actividad de los componentes de la reacción. Las dianas control se ilustran en las Figuras 115 A-D. Los oligonucleótidos control C282 WT, C282 MT, H63 WT y H63 MT son las SEC ID Nº 204-207, respectivamente. Las muestras de ADN genómico humano 14640,14641,14646, 14690, and 14691 se adquirieron en los Depósitos de Coriell Cell (nº de catálogo NA14640, NA14641, NA1446, NA14690, y NA14691). Las reacciones se realizaron y analizaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 54. Las reacciones que comprenden las dianas sintéticas como controles positivos incluyeron 100 zeptomol de la diana sintética y 1 g del ARNt de levadura. Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 116, con los ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Las barras blancas representan la señal neta de la sonda silvestre, mientras que las barras oscuras representan señal neta de la sonda mutante. La mitad de la izquierda del gráfico indica las muestras analizadas para el polimorfismo C282Y, mientras que la mitad derecha del gráfico indica las muestras analizadas para el polimorfismo H63D. Los controles sin diana se indican como "NT" y las dianas sintéticas se indican como SynWT y SynMT para los controles de tipo silvestre y mutantes, respectivamente. En ambos loci, las muestras que son homozigotas WT o MT se identifican fácilmente por tener una señal fuerte de solo una sonda o la otra, mientras que las muestras heterocigotos se identifican fácilmente por tener señales fuertes de las sondas WT y MT.

EJEMPLO 56

Detección de mutaciones en el MTHFR humano

La 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) es una enzima principal en la regulación dependiente de folato de las concentraciones de metionina y homocisteína. La proteína de tipo silvestre desempeña un papel crucial en la conversión de la homocisteína en metionina. Una variación concreta en la proteína MTHFR, denominada C677T, y causada por una transición de C a T en el gen MTHFR, se ha correlacionado con una miríada de enfermedades y defectos, incluidos trastornos cardiovasculares y neurológicos. Este Ejemplo describe un ensayo para la detección de los alelos WT y MT para el SNP MTHFR 677.

Los conjuntos de oligonucleótido INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar el alelo WT y MT para el sitio MTHFR 677 (INVASOR, sonda WT, sonda MT y casete FRET son las SEC ID Nº 216, 217, 218 y 225), respectivamente). Las dianas control positivo se sintetizaron para los alelos WT y MT en el sitio 677 (SEC ID Nº 214 y 215, respectivamente); los oligonucleótidos se muestran en las Figuras 117A y 117B.

Las muestras de ADN genómico humano 01532 y 01560 se adquirieron en Coriell. Estas muestras se habían

caracterizado mediante “PCR” en Coriell para el genotipo MTHFR. También se caracterizaron internamente

mediante análisis PCR/RFLP para confirmación del genotipo. La muestra genómica humana 32435 se adquirió como sangre entera de Lampire Bio-logical Labs., Inc. (Coopersberg, PA) y el ADN genómico se preparó mediante el kit Gentra PUREGENE Blood (Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se cuantificaron mediante Pico Green (Molecular Probes, Eugene OR) y se diluyeron con TE hasta una concentración

de aproximadamente 10 ng/μl. En cada reacción se usaron 100 ng (10 μl) de cada muestra.

Se realizaron reacciones por triplicado y se analizaron como s eha descrito en el Ejemplo 54, a excepción de que las

mezclas con INVASOR contenían 1 μl del oligonucleótido INVASOR 0,5 μM para cada reacción. Las reacciones que

comprenden las dianas sintéticas como controles positivos incluyeron 50 zeptomol de la diana sintética y 1 ARNt de levadura. Las reacciones que simulan una muestra heterozigota incluyeron 50 zmol de cada diana control.

Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 118, con los ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Las barras blancas representan la señal media neta de la sonda silvestre, mientras que las barras oscuras representan señal media neta de la sonda mutante. Las dianas sintéticas se indican como SynWT y SynMT para los controles de tipo silvestre y mutantes, respectivamente, y SynHET para una mezcla de los dos para simular una muestra heterozigótica. En ambos loci, las muestras que son homozigotas WT o MT se identifican fácilmente por tener una señal fuerte de solo una sonda o la otra, mientras que las muestras heterocigotos se identifican fácilmente por tener señales fuertes de las sondas WT y MT.

EJEMPLO 57

Detección de mutaciones en el gen de la protrombina humana (Factor II)

Se ha determinado que la mutación A20210G de la protrombina es un factor de riesgo para la tromboembolia. La

mutación se produce en la región 2’ sin traducir del gen de la protrombina, sustituyendo a la adenina (A) WT en la

posición 20210 con la guanina (G) MT. Este Ejemplo describe un ensayo para la detección de los alelos WT y MT de la mutación A20210G de la protrombina.

Los conjuntos de oligonucleótido INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar los alelos WT y MT en el sitio 20210 de la protrombina (INVASOR, sonda WT, sonda MT y casete FRET son las SEC ID Nº 222-225, respectivamente). Las dianas control positivo se sintetizaron para los alelos WT y MT en el sitio 20210 (SEC ID Nº 220 y 221, respectivamente); los oligonucleótidos se muestran en las Figuras 119A y 119B.

Tres muestras de pacientes en el ADN genómico humano fueron donadas por el Blood Center of Southeast Wisconsin y se identificaron como 2196, 2263 and 2265. Estas muestras se peurificaron en el Blood Center via QIAGEN BioRobot 9600 (QIAGEN # 900200), se cuantificaron mediante Pico Green (Molecular Probes) y se encontró que estaban a una concentración de 30-50 ng/ul.

Las reacciones por duplicaso se realizaron y analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 54, a excepción de que

las mezclas con INVASOR contenían 1 μl del oligonucleótido INVASOR 0,5 μM para cada reacción y la mezcla se diluyó con 1 volumen de dH2O (es decir, 5 μl por reacción) de modo que la mezcla del INVASOR se dispensó en alícuotas de 10 μl, mientras que el ADN se dispensó en alícuotas de 5 μl, añadiendo 150 -250 ng de ADN genómico por reacción. Cada reacción control sin diana recibió 1 g del ARNt de levadura y las reacciones que comprenden las dianas sintéticas como controles positivos incluyeron 300 zmol de control WT o 50 zmol de control MT y 1 g del ARNt de levadura.

Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 120, con los ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Las barras blancas representan la señal media neta de la sonda silvestre, mientras que las barras oscuras representan señal media neta de la sonda mutante. Las dianas sintéticas se indican como SynWT and SynMT para los controles de tipo silvestre y mutantes, respectivamente. Las muestras que son homozigotas para WT se identifican fácilmente por tener una señal fuerte de solo la sonda WT, mientras que la muestra heterocigoto se identifica fácilmente por tener señales fuertes de las sondas WT y MT.

EJEMPLO 58

Detección de la mutación HR-2 en el gen del factor V humano

Este Ejemplo describe un ensayo para la detección del polimorfismo R-2 en el gen del factor V humano. El polimorfismo R-2 en el genl de factor V humano se localiza en el exón 13 del gen del factor V y es el resultado de una transición de A a G en la base 4070, sustituyendo el aminoácido silvestre histidina con el mutante arginina en la proteína madura. El polimorfismo R-2 es uno de un conjunto de mutaciones denominadas en conjunto HR-2. El haplotipo de HR-2 se define por sustituciones de 6 bases nucleotídicas en los exones 13 y 16 del gen del factor V y está asociado con un incremento de la resistencia funcional a la proteína C activada tanto en sujetos normales como en pacientes trombofílicos. Cuando está presente como un heterocigoto compuesto junto con la mutación en el factor Leiden (véase el Ejemplo 60, a continuación), los síntomas clínicos son comparables con los observados en los pacientes homocigotos para la mutación de Leiden.

En una región de aproximadamente 600 pares de bases que rodean al alelo R2, cuatro subregiones de ADN, cada una de las cuales abarca la secuencia del conjunto sonda INVASOR WT (longitud de aproximadamente 22 bases) contiene la secuencia similar a la inmediatamente adyacente al alelo R2. Estas secuencias repetidas se pueden detectar mediante un conjunto de oligonucleótido INVASOR y sonda diseñado para la secuencia R-2 de tipo silvestre. Por la secuencia repetida, las reacciones con el conjunto de oligonucleótido INVASOR y sonda dan una señal muy alta, incluso con las muestras genómicas que contienen mutantes R-2, de modo que se aumenta considerablemente el riesgo de interpretar erróneamente los datos. En el ejemplo de un heterocigoto R-2, la señal generada por el mutante R-2 sería extremadamente baja en comparación con la señal de tipo silvestre. Por tanto, es posible que se pueda errar e interpretar los datos como de tipo silvestre, no como heterocigoto. Lo mismo se aplicaría incluso para una muestra de R-2 mutante homocigota. Por tanto, en lugar de tener un conjunto de INVASOR/sonda para detectar el alelo R-2 WT, se desarrolló un un conjunto de INVASOR/sonda para detectar secuencias en el gen de la -actina de copia única, de modo que se proporciona un control interno de la reacción, así como un control interno de la intensidad de la señal. Dado que el gen de la -actina es una copia única, los niveles de señal generados en la detección de esta secuencia serán comparables a los generados en la detección del alelo mutante de R-2 y la probabilidad de interpretación incorrecta de los datos debido a la superación por la señal WT de la generada por el MT ya no es un problema.

En los ejemplos anteriores cada muestra se analizó en dos reacciones diferentes, una reacción analizó la presencia de secuencia de tipo silvestre y una reacción se analizó por la presencia de secuencia mutante. En este ejemplo, cada muestra se analiza con el control interno de la -actina y los conjuntos de MT R-2 INVASOR/sonda. Los conjuntos de oligonucleótido INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar la secuencia control de MT R-2 y -actina (INVASOR MT R-2 y sonda, y el casete FRET son las SEC ID Nº 228, 229 y 230, respectivamente; INVASOR -actina y la sonda son las SEC ID Nº 231 y 232, respectivamente). Las dianas control positivo se sintetizaron para el alelo mutante de R-2 y el gen de la -actina (SEC ID Nº 226 y 227, respectivamente); los oligonucleótidos se muestran en las Figuras 121A y B.

La muestra de ADN genómico 39021 se obtuvo en Sigma (nº de catálogo D6537) y la muestra genómicahumana sin caracterizar 15506 se obtuvo en Coriell(nº de catálogo NA15506, Camden, NJ 08103). Las muestras se diluyeron a 10 ng/μl con Tris-EDTA, pH 8,0. Se usaron diez μl (100 ng) por reacción. Los controles sin diana recibieron 1 ARNt de levadura en lugar del ADN genómico humano. Las reacciones se realizaron y se analizaron como se ha

descrito en el Ejemplo 54, a excepción de que las mezclas con INVASOR contenían 0,5 μl del oligonucleótido INVASOR 2 μM y oligonucleótido INVASOR DE -actina 2 μM. Las mezclas maestras de sonda contenían 1 μl de la sonda R-2 10 μM o 1 μl de la sonda -actina 10 μM, , 2 μl de MgCl2 75 mM, 1 μl de casete FRET 10 μM y 1 μl de la enzima FEN-1 de Afu 200 ng/μl por reacción. Las reacciones que comprenden las dianas sintéticas como controles positivos incluyeron 100 zeptomol de la diana sintética y 1 g del ARNt de levadura. Las reacciones SynHET y SynMT contenían mezclas de dianas sintéticas a 2: 1 y 1: 1 de la -actina: Dianas mutantes de R-2, respectivamente.

Las reacciones se leyeron directamente en un lector de placas de múltiples pocillos CYTOFLUOR Series 4000 (PerSeptive Biosystems) usando los parámetros siguientes: Longitud de onda/ancho de banda de excitación 485 nm/20 nm, Longitud de onda/ancho de banda de emisión 530nm/ 25 nm, ganancia 36.

Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 122, con los ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Las barras blancas representan la señal neta de la sonda control interno, mientras que las barras oscuras representan señal neta de la sonda mutante de R-2. Las dianas sintéticas se indican como SynIC y SynMT para control interno y controles de R-2 mutantes, respectivamente, y SynHET para una mezcla de los dos para simular una muestra heterozigótica en el alelo R-2. La muestra que no tiene el alelo R-2 MT se identifica fácilmente por tener una señal fuerte de únicamente la sonda IC, mientras que la que es herocigota en el alelo R-2 se identifica por tener señales de las sondas IC y R-2 MT, per a una proporción cercana a 2: 1. Una muestra homocigota para la mutación en el alelo R-2 (no mostrado) mostraría una señal casi igual de cada sonda, como se muestra con el control SynMT.

EJEMPLO 59

Detección de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen de la TNF- humana

Se ha demostrado que la citocina humana factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) es un factor principal en el rechazo de injertos; cuando más TNF-alfa hay presente en el sistema, mayor es la respuesta de rechazo al tejido transplantado. La mutación detectada en este ejemplo se localiza en la región promotora del gen del TNF-alfa en la posición -308 (menos 308). La guanina (G) WT es sustituida por una adenina (A) MT. Este resultado de esta mutación en el promotor es la multiplicación de la trasncripción del TNF-alfa por 6 a 7. Este Ejemplo describe un ensayo para la detección de lamutación en -308 en el promotor del gen del TNF-humano. Los conjuntos de oligonucleótido INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar los alelos WT y MT en el sitio -308 (INVASOR, sonda WT, sonda MT son las SEC ID Nº 235, 236 y 237 respectivamente; casete FRET (SEC ID Nº 225). Las dianas control positivo se sintetizaron para los alelos WT y MT en el sitio -308 (SEC ID Nº 233 y 234, respectivamente); los oligonucleótidos se muestran en las Figuras 123A y 123B.

Las muestras de ADN genómico purificado (M2, M3 and M4) fueron donadas por la Mayo Clinic (Rochester MN). Las reacciones por triplicado se realizaron y analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 54, a excepción de que se

humano. 100 μl de cada reacción detenida se transfirieron a una placa Nunc Maxisorb de 96 pocillos (VWR Scientific) y se leyeron en un lector de placas de múltiples pocillos CYTOFLUOR Series 4000 (PerSeptive Biosystems) usando los parámetros siguientes: Longitud de onda/ancho de banda de excitación 485 nm/20 nm, Longitud de onda/ancho de banda de emisión 530nm/ 65 nm, ganancia 65.

Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 124, con los ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Las barras blancas representan la señal media neta de la sonda silvestre, mientras que las barras oscuras representan señal media neta de la sonda mutante. Las dianas sintéticas se indican como SynWT y SynMT para los controles de tipo silvestre y mutantes, respectivamente, y SynHET para una mezcla de los dos para simular una muestra heterozigótica. Las muestras que son homozigotas WT o MT se identifican fácilmente por tener una señal fuerte de solo una sonda o la otra, mientras que las muestras heterocigotos se identifican fácilmente por tener señales fuertes de las sondas WT y MT.

EJEMPLO 60

Detección de la mutación de Leiden del Factor V

La mutación de “Leiden” en el factor V de coagulación sanguínea es el resultado de un cambio de base en la citosina “C” en una timidina “Y” en el exón 1 del gen del factor V. La proteína mutante tiene una glutamina en el aminoácido en la posición 506, en lugar de la arginina de tipo silvestre. Esta sustitución evita que la proteína C activada escinda e inactive el factor V. Por tanto, la forma activa de la proteína sigue siendo abundante en la corriente sanguínea y continúa estimulando la coagulación. Este Ejemplo describe un ensayo para la detección de la mutación de Leiden en el gen del factor V humano.

Los conjuntos de oligonucleótido INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar los alelos WT y MT en el sitio 506 (INVASOR, sonda WT, sonda MT son las SEC ID Nº 240, 241 y 242 respectivamente; el casete FRET es la SEC ID Nº 225). Las dianas control positivo se sintetizaron para los alelos WT y MT en el sitio 506 (SEC ID Nº 238 y 239, respectivamente); los oligonucleótidos se muestran en las Figuras 125A y 125B.

Las muestras de sangre entera se obtuvieron del Midwest Hemostasis Center (Muncie, Indiana). Las muestras se caracterizaron por el genotipo del Factor V de Leiden por Midwest Hemostasis Center mediante procedimientos que implican PCR. Las capas leucocitarias se aislaron como se ha descrito anteriormente y el ADN genómico se purificó usando el kit QIAamp 96 DNA Blood Kit (Qiagen, Valencia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a

excepción de que las muestras eluyeron en 200 μl del tampón de elución. Las muestras de ADN purificadas se

cuantificaron mediante Pico Green (Molecular Probes) y después se diluyeron con TE hasta una concentración de15-60 ng por μl. Las reacciones sencillas se realizaron como se describe en el Ejemplo 54. La reacción control sin diana recibió 1 g del ARNt de levadura en lugar de ADN y las reacciones que comprenden las dianas sintéticas como controles positivos incluyeron 200 zmol de la diana sintética y 1 g del ARNt de levadura.

Tras una incubación de 4 horas a 63 ºC,las reacciones se leyeron directamente en un lector de placas de múltiples pocillos CYTOFLUOR Series 4000 (PerSeptive Biosystems) usando los parámetros siguientes: Longitud de onda/ancho de banda de excitación 485 nm/20 nm, Longitud de onda/ancho de banda de emisión 530nm/ 65 nm, ganancia 65.

Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 126, con los ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Las barras blancas representan la señal media neta de la sonda silvestre, mientras que las barras oscuras representan señal media neta de la sonda mutante. Las dianas sintéticas se indican como SynWT y SynMT para los controles de tipo silvestre y mutantes, respectivamente, y SynHET para una mezcla de los dos para simular una muestra heterozigótica. Las muestras que son homozigotas WT o MT se identifican fácilmente por tener una señal fuerte de solo una sonda o la otra, mientras que las muestras heterocigotas se identifican fácilmente por tener señales fuertes de las sondas WT y MT.

EJEMPLO 61

Detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina

Staphylococcus aureus está reconocido como una de las principales causas de infecciones en seres humanos que se producen en el hospital y en la comunidad en general. Uno de los problemas más graves que atañen al tratamiento de cualquier infección bacteriana es el incremento dela resistencia a antibióticos. La creciente incidencia de infecciones por S. aureus resistente a meticilina (MRSA) en todo el mundo ha subrayado la importancia de ladetección precoz del agente infeccioso y definer un perfil de resistencia de modo que se pueda administrar el tratamiento adecuado. El mecanismo principal de la resistencia a meticilina implica la producción de una proteína denominada PBP2a, condificada por el gen mecA. El gen mecA no es nativo de Staphalococcus aureus, sino que es de origen en otras especies. No obstante, el gen mecA es indicativo de resistencia a meticilina y se usa como marcador para la detección de bacterias resistentes. Para identificar S. aureus resistente a meticilina mediante técnicas de ácido nucleico, se deben tener como objetivo tanto el gen mecA como al menos un gen específico de especie. Un gen específico de especie concreto, el gen de nucleasa o nuc se usa en el ejemplo siguiente: Este Ejemplo describe un ensayo para la detección de MRSA.

Los conjuntos de oligonucleótido INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar el gen mecA y el gen nuc (INVASOR meA y sonda son las SEC ID Nº 243 y 244, respectivamente; INVASOR nuc y la sonda son las SEC ID Nº 246 y 247, respectivamente; el casete FRET para los conjuntos INVASOR/sonda es la SEC ID Nº 245); los oligonucleótidos se muestran en las Figuras 127A y 127B. Las secuencias diana mecA y nuc mostradas son las SEC ID Nº 252 y 253, respectivamente. Las muestras de Staphalococcus aureus resistenntes a meticilina se adquirieron en la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, Nº de catálogo 33591). Las muestras de Staphalococcus aureus sensibles a meticilina (MSSA) se obtuvieron de Gene Trak, Inc. (GT#2431), y las muestras de staphalococcus haemolyticus se obtuvieron en la ATCC (ATCC Nº 29970). Las muestras bacterianas se sembraron en placas con agar sangre estándar y se cultivaron a 37 ºC durante 14-18 horas. Las muestras de ADN de MRSA, MSSA y S. haemolyticus se prepararon del siguiente modo. Una única colonia se suspendió en 50 μl de TRIS 10 mM pH 7,5 en un tubo de microfuga de 1,5 ml. La muestra se incubó a 65 ºC durante 5 minutos y, después,

se sometió a microondas con el parámetro más alto durante 4 minutos. En cada reacción se usaron diez μl de esta

preparación.

Los controles positivos se crearon mediante reacción en cadena de la polimerasa. Un fragmento de ADN de 533 pares de bases de la secuencia de mecA y un fragmento de ADN de 467 pares de bases de la secuencia del gen nuc se amplificaron y aislaron del siguiente modo. Las secuencias del cebador para PCR usadas para la amplificación del gen mecA fueron 5’-AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C-3" (SEC ID Nº 248) y 5’-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C-3’ (SEC ID Nº 249). Las secuencias del cebador para PCR usadas para la amplificación del gen nuc fueron 5’-TCGCTACTAGTTGCTTAGTG-3’ (SEC ID Nº 250 y 5’-GTAAACATAAGCAACTT-TAG-3’ (SEC ID Nº 251). El ADN de MRSA y MSSA se aisló como se ha descrito en lo que antecede. Las reacciones de PCR se realizaron usando el kit AMPLITAQ DNA Polymerase Kit con GENEAMP (PE Corporation nº de catálogo N8080152). Se realizaron reacciones separadas para las secuencias de mecA y nun y se efectuaron en un volumen final

de 100 μl que contienen los componentes siguientes: 10 μl de 10X tampón para PCR, 2,5 μl del de cebador cadena arrila y el cebado cadena abajo 10μM, 2 μl de mezcla de dNTP 10mM, 1,0 μl de ADN polimerasa AMPLITAQ, 2 μl (10-50 ng) de ADN bacteriano (MRSA o MSSA) y 80 μl de agua para un volumen final de 100 μl. Las reacciones se cubrieron con aproximadamente 50 μl de cera líquida CHILLOUT (MJ Research) y se ciclaron del siguiente modo. Las reacciones de mecA se desnaturalizaron a 97ºC durante 3 minutos. Después, las reacciones se ciclaron a 97ºC durante 1 minuto, 52 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto. Esto se repitió 5 veces. Después de la incubación final de 1 minuto a 72 ºC, las reacciones se calentaron de nuevo hasta 94 ºC durante 30 segundos, 52 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 1 minutos, para 30 ciclos. Las reacciones con mecA se incubaron después a y 72 ºC durante 7 minutos, después se mantuvieron a 4 ºC hasta su purificación.

Las reacciones de amplificación de nuc se desnaturalizaron a 97ºC durante 3 minutos. Después, las reacciones se ciclaron a 97ºC durante 1 minuto, 48 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto. Esto se repitió para 5 ciclos. Después de la última incubación de 72 ºC durante 1 minuto, las reacciones se calentaron hasta 94 ºC durante 30 segundos, 48 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 1 minuto. Esto se repitió para 30 ciclos. Después, las reacciones se incubaron a 72 ºC durante 7 minutos y, por último, se enfriaron hasta 4 ºC y se mantuvieron hasta la purificación.

Tras la amplificación, las reacciones se realizaron en un gel de agarosa al 1 % en tampón 1 % de TBE con marcadores de 50-2000 pares de bases (Novagen, nº decatálogo 69278-3); las bandas se visualizaron con tinci´n de bromuro de etidio seguido por iluminación con ultravioleta. Las bandas de tamaño adecuado se escindieron del gel y se purificaron el kit de extracción QlAquick Gel de Qiagen (Qiagen nº de catálogo 28704) de acuerdo con las

instrucciones del fabricante. Cada columna se eluyó dos veces con 50μl de tampón de elución. La concentración del

ADN diana sintético por PCR purificado se determinó mediante DO260 y se diluyó hasta una concentración madre de 50 fmol por microlitro. Los controles positivos se usaron a una concentración de 10 amol por reacción con la adición

de 10 μl. Las reacciones control sin diana también se realizaron usando ADN genómico humano a 10 ng/μl en lugar de una muestra bacteriana. Todas las muestras se añadieron en un volumen de 10 μl.

Las reacciones INVASOR se realizaron en microplacas de polipropileno de perfil bajo de 96 pocillos de MJ (MJ Research MLL-9601) por duplicado en un volumen final de 15 μl. Se preparó una mezcla maestra de la reacción INVASOR y contenía (por reacción) 1,5 μl de agua, 2,5 μl de MOPS 100 mM, 5μl de PEG al 20 % (8000MW), 0,5 μl de oligonucleótido INVASOR nuc 1μM y 0,5 μl de oligonucleótido INVASOR mecA. A cada pocillo con muestra y control se añadieron cinco μl de la mezcla maestra INVASOR. A cada pocillo se añadieron 10 μl de las muestras de AD bacteriano diana, preparadas como se ha descrito anteriormente, o 10 μl (10 amoles) de la diana control positivo

o 10 μl (100ng de ADN genómico humano) de la muestra control sin diana. Las muestras se cubrieron con 15 μl de

cera transparente Chill-out wax (MJ Research, ) y se incubaron a 95 °C durante 5 minutos en un MJ Research Thermocycler con Hot Bonnet. Se prepararon dos mezclas maestras sonda diferentes, una que contenía el oligonucleótido sonda mecA, una que contenía el oligonucleótido sonda nunc. Las mezclas maestras sonda

contenían (por reacción) 2μl de MgCl2 93,75 mM, 1μl del oligonucleótido FRET 10μM, 1μl del oligonucleótido sonda de mecA 10μM o del oligonucleótido sonda de nuc 10μM, 1 μl de la enzima FEN-1 de Afu 100 ng/μl (Third Wave Technologies, nº de catálogo 96004D). La temperatura se enfrió hasta 64 ºC y se añadieron a cada pocillo 5 μl de la mezcla maestra de sonda adecuada (de modo que cada reacción control o de la muestta se analiza con la sonda mecA y nuc) debajo de la capa de cera Chill-out y se mezclaron pipeteando arriba y abajo 5 veces. La placa se cubrió con MICROSEAL ’A’ Film (MJ Research) y se incubó a 64 ºC durante 30 minutos. Tras La incubación de 30 minutos, las reacciones se enfriaron, se colocaron en una base Perkin Elmer MICROAMP base (n1 de catálogo N801-0531) y se leyó en un lector de placas ee múltiples pocillos CYTOFLUOR Series 4000 (PerSeptiveBiosystems) usando los parámetros siguientes: Longitud de onda/ancho de banda de excitación 485 nm/20 nm, Longitud de onda/ancho de banda de emisión 530nm/ 40 nm, ganancia 40, 30 lecturas por pocillo, temperatura 25 ºC.

Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 128, con los ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Las barras blancas representan la señal media neta de la sonda mecA, mientras que las barras oscuras representan señal media neta de la sonda nuc.

EJEMPLO 62

Construcción de las nucleasas específicas de estructura quiméricas

La Fig. 59 proporciona un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de varias nucleasas con especificidad de estructura que incluyen varias de las nucleasas de tipo FEN-1, XPG y RAD. Los números a la izquierda de cada línea de secuencia se refieren al número de restos aminoacídicos; no se mostraron partes de la secuencia de aminoácidos de algunas de estas proteínas para maximizar el alineamiento entre proteínas. Los guiones representan huecos introducidos para maximizar el alineamiento. En este alineamiento, puede verse que las proteínas pueden dividirse de forma general en bloques de conservación, que también pueden representar regiones funcionales de las proteínas. Aunque no tienen por objeto ninguna limitación para las nucleasas quiméricas de la presente invención, estos bloques de conservación pueden usarse para seleccionar sitios de unión para la creación de dichas proteínas quiméricas.

La proteína FEN-1 de Methanococcus jannaschii (MJAFEN1.PRO), la proteína FEN-1 de Pyrococcus furiosus (PFUFEN1.PRO) se muestran en el alineamiento en la Fig. 59. Estos dos genes naturales se usaron para demostrar la creación de nucleasas quiméricas que tenían diferentes actividades que cualquiera de las nucleasas precursoras. Como conocen los especialistas en la técnica, la escisión con endonucleasas de restricción en sitios apropiados y el ligamiento también sería un medio adecuado para crear las nucleasas de la presente invención. En los datos mostrados en las Figuras 129A y 129B se muestran, respectivamente, las actividades de las nucleasas precursoras sobre dos tipos de estructuras de escisión, particularmente estructuras plegadas (Véase, por ejemplo, la Fig. 60) y estructuras invasivas (Véase, por ejemplo, la Fig. 26). Estas moléculas de ensayo se digirieron como se describe en el Ej. 29g. Los carriles marcados con “1” muestran la escisión por FEN-1 de Pfu, mientras que los carriles marcados con “2” indican la escisión por FEN-1 de Mja.

En este ejemplo, se usó PCR para construir secuencias codificantes completas para las proteínas quiméricas. Esta es una pequeña subserie de las posibles combinaciones. También estaría dentro de la práctica común en la técnica diseñar cebadores que permitan la combinación de cualquier fragmento de un gen para una nucleasa con uno o más fragmentos génicos de nucleasa distintos, para crear nucleasas quiméricas adicionales. La memoria descriptiva proporciona procedimientos, incluyendo un ensayo de actividad, de forma que pueda determinarse y caracterizarse la actividad de cualquiera de estas nucleasas quiméricas no descritas explícitamente en este documento. De esta manera, puede usarse cualquier nucleasa quimérica que cumpla los requisitos de las nucleasas quiméricas, determinados por procedimientos tales como los procedimientos de ensayo descritos en el presente documento.

Para preparar nucleasas quiméricas a partir de genes de nucleasa 5' de M. jannaschii y P. furiosus, se amplificaron por PCR partes homólogas usando series de cebadores externos e internos como se muestra en la Fig. 130. En la siguiente etapa, se unieron partes 5' de un gen y partes 3' de otro gen por parejas por medio de PCF recombinante, de tal forma que cada combinación creó un gen quimérico de tamaño completo diferente. Las regiones codificantes resultantes se clonaron en el vector pTrc99A y se expresaron para producir nucleasas quiméricas. Los detalles específicos de construcción de cada uno de los genes quiméricos mostrados en la Fig. 130 se describen más adelante.

a) Construcción de nucleasa 5' quimérica con parte N-terminal de M. jannaschii y parte C-terminal de P. furiosus con un punto de unión en el codón 84 (Figura 130g).

Un fragmento del vector pTrc99A que llevaba el gen de nucleasa 5' de M. jannaschii se amplificó por PCR con cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y 025-141-02 (SEC ID Nº 267) (5 pmol de cada uno) en una reacción de 50 μl usando el kit de PCR de ADNc AdvantageTM (Clonetech), durante 30 ciclos (92ºC, 30 s; 55ºC, 1 min; 72ºC 1 min) para obtener un fragmento génico codificante de extremo N (SEC ID Nº 268). Los cebadores TrcRev (SEC ID Nº 269) y 025-141-01 (SEC ID Nº 270) se usaron para amplificar un fragmento del vector pTrc99A que llevaba el gen de P. furiosus para producir un fragmento génico codificante del extremo C (SEC ID Nº 271). Los productos de PCR se limpiaron con el kit de Purificación de Producto de PCR High Pure (Boehringer Mannheim, Alemania) como se describe en el protocolo del fabricante y se eluyó en 100 μl de agua. El cebador 025-141-02 (SEC ID Nº 267) y el cebador 025-141-01 (SEC ID Nº 270) son complementarios entre sí, de forma que los fragmentos de PCR creados anteriormente tenían las regiones correspondientes de complementariedad en un extremo. Cuando estos fragmentos se combinan en una reacción de amplificación, la región de complementariedad permite que las partes hibriden entre sí, se introduzcan con la ADN polimerasa y después se amplifiquen usando el par de cebadores externos, TrcFwd (SEC ID Nº 266) y TrcRev (SEC ID Nº 269) en este caso, para formar un fragmento (SEC ID Nº 272). Después se pusieron cinco pmol de cada cebador externo en 50 μl de reacción de PCR usando el kit de PCR de ADNc AdvantageTM (Clonetech) como se ha descrito anteriormente. El producto de PCR de longitud completa (SEC ID Nº 272) que incluía la región codificante quimérica (posiciones 45-1067 de la SEC ID Nº 272) se separó en un gel de agarosa al 1% por procedimientos convencionales y se aisló usando el Kit Geneclean II (Bio 101, Vista, CA). El fragmento aislado se cortó después con enzimas de restricción NcoI y PstI y se clonó en el vector pTrc99A.

b) Construcción de nucleasa 5' quimérica con la parte N-terminal de P. furiosus y la parte C-terminal de M. jannaschii con un punto de unión en el codón 84 (Fig 130f).

Un fragmento del vector pTrc99A que llevaba el gen de nucleasa 5' de P. furiosus se amplificó por PCR con los cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y 025-141-02 (SEC ID Nº 267) (5 pmol de cada uno) como se ha descrito anteriormente para obtener una fragmento génico codificante del extremo N (SEC ID Nº 273). Los cebadores TrcRev (SEC ID Nº 269) y 025-141-01 (SEC ID Nº 270) usaron para amplificar un fragmento del vector pTrc99A que llevaba el gen de M. jannaschii para producir un fragmento génico codificante del extremo C (SEC ID Nº 274). Los fragmentos se purificaron y se combinaron en una PCR como se ha descrito anteriormente para formar un fragmento (SEC ID Nº 275), que contenía el gen quimérico entero (posiciones 45-1025 de la SEC ID Nº 275). Este gen quimérico se cortó con NcoI y PstI y se clonó en el vector pTrc99A como se ha descrito en a) anteriormente.

c) Construcción de nucleasa 5' quimérica con la parte N-terminal de P. furiosus y la parte C-terminal de M. jannaschii con un punto de unión en el codón 114 (Fig. 130e).

Un fragmento del plásmido pTrcPfuHis se amplificó con PCR con cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y 025-16404 (SEC ID Nº 277) (5 pmol de cada uno), como se ha descrito anteriormente para obtener un fragmento génico codificante del extremo N (SEC ID Nº 276). El plásmido pTrcPfuHis se construyó modificando Trc99-PFFFEN1 (descrito en el Ej. 28), añadiendo una cola de histidina para facilitar la purificación. Para añadir esta cola de histidina, se usaron procedimientos de mutagénesis dirigida a cebadores convencionales para insertar la secuencia codificante de seis restos de histidina entre el último codón de aminoácidos de la región codificante de pTrc99-PFFFEN1 y el codón de terminación. El plásmido resultante se denominó pTrcPfuHis. Los cebadores 159-006-01 (SEC ID Nº 279) y 025-164-07 (SEC ID Nº 280) se usaron como se describe en la sección a) anterior, para amplificar un fragmento del plásmido pTrcMjaHis para producir un fragmento génico codificante del extremo C (SEC ID Nº 278). El plásmido pTrcMjasHis se construyó modificando pTrc99-MJFEN1 (descrito en el Ej. 28), añadiendo una cola de histidina para facilitar la purificación. Para añadir esta cola de histidina se usaron procedimientos de mutagénesis por PCR convencionales para insertar esta secuencia codificante de seis restos de histidina entre el último codón de aminoácidos de la región codificante de pTrc99-MJFEN1 y el codón de terminación. El plásmido resultante se denominó pTrcMjaHis. Los fragmentos se purificaron y se combinaron por amplificación por PCR con cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y 150-006-01 (SEC ID Nº 279) en un fragmento (SEC ID Nº 281) que contenía el gen quimérico (posiciones 45-1043). Este gen quimérico se cortó con NcoI y PstI y se clonó en el vector pTrc99A como se ha descrito en a), anteriormente.

d) Construcción de nucleasa 5' quimérica con la parte N-terminal de M. jannaschii y la parte C-terminal de P. furiosus con un punto de unión en el codón 148 (Fig. 130d).

Un fragmento del vector pTrc99A que llevaba el gen de nucleasa 5' de M. jannaschii se amplificó por PCR con cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y 025-119-05 (SEC ID Nº 283), como se ha descrito anteriormente para obtener una fragmento génico codificante del extremo N (SEC ID Nº 282). Los cebadores TrcRev (SEC ID Nº: 269) y 025-119-04 (SEC ID Nº 285) se usaron para amplificar un fragmento del vector pTrc99A que llevaba el gen de P. furiosus para producir un fragmento génico codificante del extremo C (SEC ID Nº 284). Los fragmentos se purificaron como se ha descrito anteriormente y se combinaron por amplificación por PCR con los cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y TrcRev (SEC ID Nº 269) en un fragmento (SEC ID Nº 286) que contenía el gen quimérico (posiciones 45-1067). Este gen quimérico se cortó con NcoI y PstI y se clonó en el vector pTrc99A como se ha descrito en a), anteriormente.

e) Construcción de nucleasa 5' quimérica con la parte N-terminal de P. furiosus y la parte C-terminal de M. jannaschii con un punto de unión en el codón 148 (Fig. 130c).

Un fragmento del plásmido pTrcPfuHis se amplificó por PCR con los cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y 025119-05 (SEC ID Nº 283) como se ha descrito anteriormente para obtener un fragmento génico codificante del extremo N (SEC ID Nº 287). Los cebadores TrcRev (SEC ID Nº 269) y 025-119-04 (SEC ID Nº 285) se usaron para amplificar un fragmento del plásmido pTrcMjaHis para producir un fragmento génico codificante del extremo C (SEC ID Nº 288). Los fragmentos se purificaron como se ha descrito anteriormente y se combinaron por amplificación por PCR con cebadores TrcFwd (SEC ID Nº 266) y y TrcRev (SEC ID Nº 269) en un fragmento (SEC ID Nº 289) que contenía el gen quimérico (posiciones 45-1025). Este gen quimérico se cortó con NcoI y PstI y se clonó en el vector pTrc99A como se ha descrito en a), anteriormente.

f) Expresión y purificación de quimeras

Todas las enzimas quiméricas que se han descrito anteriormente excepto la construcción de P. furiosus -M. jannaschii que contenía un punto de unión en el codón 114 (es decir, Ejemplo 62c) se purificaron como se ha descrito para el DN de Taq. La quimera del codón 114 de P. furiosus - M. jannaschii con un marcador His se purificó como se ha descrito para el dominio de nucleasa 5' BN de la Pol I de Taq.

g) Caracterización de Actividad Nucleasa con Especificidad de Estructura Natural y Quimérica.

Todas las enzimas quiméricas producidas como se ha descrito anteriormente se caracterizaron. En un ensayo, las enzimas se ensayaron usando una mezcla de sustratos de horquilla larga y corta en el sistema de ensayo descrito en el Ejemplo 28g.

En estos ensayos, las reacciones se realizaron usando 50 ng de cada enzima durante 2 min, a 50ºC. Los resultados del análisis se muestran en la Fig. 131A. En esta Figura, los carriles marcados con "1" y "2" en la Figura 131A indican reacciones con las enzimas precursoras de Pfu y Maj respectivamente. Las moléculas de horquilla no cortadas restantes son visibles como dos bandas en la parte superior de cada carril. Cada enzima quimérica ensayada se representa haciendo referencia a la Figura 130. Por ejemplo, el carril marcado con "130f" muestra la escisión de estas moléculas de ensayo por la nucleasa 5' quimérica con el extremo N de P. furiosus y el extremo C de M. jannaschii unidos en el codón 84. Los diversos productos de escisión se ven la parte inferior de cada carril. Estos datos muestran que las nucleasas quiméricas pueden presentar actividades de escisión (es decir, especificidades de sustrato) iguales que cualquier molécula precursora (por ejemplo, 130c y la FEN-1 de Pfu precursora muestran poca escisión en este ensayo) o distintas de cualquier molécula precursora (es decir, diferentes perfiles de producto).

De forma similar, las enzimas quiméricas se examinaron para actividad de escisión invasiva usando la estructura S60 y el oligonucleótido P15 representado en la Fig. 26, como se describe en el Ejemplo 11. Los resultados se muestran en la Fig. 131B. El oligonucleótido P15 marcado no escindido aparece en la parte superior de cada carril, mientras que el producto marcado de escisión aparece en la parte inferior.

Estos resultados indican que las enzimas quiméricas son diferentes en actividad y especificidad de las nucleasas 5' originales (es decir, de tipo silvestre) de M. jannaschii y P. furiosus.

EJEMPLO 63

Comparación de digestión de estructuras de escisión plegadas con nucleasas quiméricas

Se aplicó un análisis CFLP a un segmento amplificado por PCR obtenido de genes de ARNr 16S de E. coli. Aunque los genes de ARNr 16S bacterianos varían a lo largo del árbol filogenético, estos genes contienen segmentos que están conservados a nivel de especie, género o reino. Estas características se han aprovechado para generar cebadores que contienen secuencias consenso que flanquean regiones de variabilidad. En procariotas, los genes de ARN ribosómico están presentes en 2 a 10 copias, con una media de 7 copias en cepas de Escherichia. Cualquier amplificación por PCR produce una población mixta de estos genes y es esencialmente una PCR "múltiplex" de esa cepa. El análisis CFLPTM representa un patrón compuesto de los genes de ARNr ligeramente variados dentro de ese organismo, de tal forma que ninguna secuencia de ARNr particular es directamente responsable del "código de barras" entero. Como ejemplo representativo de un amplicón como se describe más adelante de 16s de E. coli se proporciona el gen rrsE de E. coli (SEC ID Nº 290). A pesar de la naturaleza variable de estos genes, puede realizarse una amplificación por PCR entre regiones conservadas de los genes de ARNr, de forma que el conocimiento previo de la colección entera de secuencias de ARNr para cualquier microbio de interés no sea necesario (Véase, por ejemplo, Brow y col., J. Clin. Microbiol., 34: 3129 [1996]).

En este Ejemplo, se usó el par de cebador 1638 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') (SEC ID Nº: 174)/TET-1659 (5'-CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3') (SEC ID Nº 292) para amplificar un fragmento de aproximadamente 350 pb de rrsE a partir de ADN genómico obtenido de E. coli O157:H7 (ATCC Nº 43895). Las reacciones de PCR contenían Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a 25ºC), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gelatina al 0,001% p/v, 60 μM de cada uno de dGTP, dATP, dTTP y dCTP, 1 μM de cada cebador, 25 ng de ADN genómico y 2,5 unidades de ADN polimerasa Ampli Taq LD en un volumen de 100 μl. Las reacciones de control que no contenían ADN genómico bacteriano de entrada también se procesaron para examinar la cantidad de producto de ARNr 16S producido debido a los contaminantes en las preparaciones de ADN polimerasa. Las reacciones se sometieron a 30 ciclos de 95ºC durante 30 s; 60ºC durante 1 min; 72ºC durante 30 s; después del último ciclo los tubos se enfriaron a 4ºC.

Después de los ciclos térmicos, las mezclas de PCR se trataron con exonucleasa I de E. coli (Exo I, Amersham) para retirar los amplicones parciales y cebadores de hélice única. Se añadió una unidad de ExoI directamente a cada mezcla de PCR y las muestras se incubaron a 37ºC durante 20 minutos. Después, la nucleasa se inactivó por calentamiento a 70ºC durante 15 min. Las mezclas de reacción se llevaron a NH4OAc 2 M y los ADN se precipitaron por la adición de 1 volumen de etanol al 100%.

Después se realizaron reacciones de escisión que comprendían un 1 μl de producto de PCR marcado con TET (aproximadamente 100 fmol) en un volumen total de 10 μl que contenía tampón CFLPTM 1X (MOPS 10 mM, pH 7,5; un 0,5% de Tween-20 y un 0,5% de NP-40) y MnCl2 0,2 mM. Todos los componentes excepto la enzima se

reunieron en un volumen de 9 μl. Las reacciones se calentaron a 95ºC durante 15 s, se enfriaron a 55ºC y las

reacciones de escisión se iniciaron por la adición de 50 ng de enzima. Después de 2 minutos a 55ºC, las reacciones

se detuvieron por la adición de 6 μl de una solución que contenía formamida al 95%, EDTA 10 mM y violeta de

metilo al 0,02%.

Las mezclas de reacción se calentaron a 85ºC durante 2 min y después se separaron por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% (reticulación 19:1) con urea 7 M en un tampón de Tris-Borato 45 mM, pH 8,3, EDTA 1,4 mM y se visualizaron usando el Analizador de Imágenes FMBIO-100 (Hitachi). La imagen explorada resultante se muestra en la Fig. 132. En esta Figura, las enzimas usadas en cada digestión se indican en la parte superior de cada carril. Cleavase® BN se describe en el Ej. 2. El carril 2 muestra los resultados de la digestión con la nucleasa precursora FEN-1 de Mja, mientras que las digestiones con las nucleasas quiméricas se indican por referencia a los diagramas de la Fig. 130. Estos datos demuestran que el uso de cada una de estas nucleasas en condiciones de reacción idénticas (es decir, condiciones en las que el ADN asume estructuras plegadas similares) puede producir diferencias de patrones distintas, que indican diferencias en las especificidades de las enzimas. De esta manera, cada enzima puede proporcionar información adicional sobre la estructura plegada asumida por un ácido nucleico de interés, permitiendo de esta manera comparaciones más precisas de moléculas para identificación, genotipado y/o detección de mutación.

Estos datos muestran que las actividades de estas enzimas pueden variar sustancialmente en situaciones de reacción similares. La realización de un panel de optimización para una enzima desconocida puede ayudar en la selección de la enzima y las condiciones óptimas para una aplicación dada. Por ejemplo, en las reacciones de escisión invasiva a menudo es deseable elegir una combinación de nucleasa y condiciones que realizan escisión invasiva, pero que no presentan actividad en ausencia del oligonucleótido invasor (es decir, no cortan un sustrato de tipo horquilla). El panel de optimización permite la selección de condiciones que no favorecen la escisión de horquilla, tales como el uso de la enzima FEN-1 de Pfu en una solución que contiene MgCl2. Por el contrario, la escisión de horquilla es deseable para la escisión de tipo CFLP, de forma que se contempla que las condiciones de reacción se seleccionarán de acuerdo con la intensidad de esta actividad.

EJEMPLO 64

Caracterización del comportamiento de nucleasas con especificidad de estructura

Se usaron dos sustratos para determinar las condiciones óptimas para siete enzimas, FEN-1 de Afu, Pfu, Mth y Mja, CLEAVASE BN, DN de Taq y DN de Tth. Como se muestra en la Figura 140 Panel A, el Sustrato 25-65-1 (5’-Fluoresceína -TTT-TCGCTGTCTCGCTGAAAGCGAGACAGCGTTT-3; SEC ID Nº 293) es una estructura de tallobucle con un brazo 5' marcado en su extremo 5' con fluoresceína. Como se muestra en la Figura 140 Panel B, el Sustrato 25-184-5 (sustrato de ensayo "IT" de tipo invasor'') (5’-Fluoresceína -TTTTCGCTGTCTCGCTGAAAGCGAGACAGCGAAAGACGCTCGTGAAACGAGC GTCTTTG-3; SEC ID Nº 294) es un sustrato con un cebador cadena arriba adyacente al brazo marcado con fluoresceína 5'; esto imita un oligonucleótido invasor y la diana ("IT"). Las reacciones convencionales contenían sustrato marcado 2 μM, MOPS 10 mM, pH 7,5, TWEEN 20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, 20 μg/ml de ARNt (Sigma Nº R-5636) y MgCl2 2 mM o MnCl2 2 mM. Se calentaron reacciones de diez 10 μl a 90ºC durante 15 segundos en ausencia de enzima y catión divalente, después de lo cual las reacciones se enfriaron a temperatura ambiente y se añadió enzima. Las reacciones se calentaron a 50ºC durante 20 segundos y después se añadió catión divalente para iniciar la reacción. El tiempo de incubación varió de 1 minuto a 1 hora dependiendo de la combinación particular de enzima/sustrato. Los tiempos de reacción se ajustaron de forma que se escindió menos de un 25% del sustrato durante la incubación. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de una solución de formamida al 95% con EDTA 20 mM y violeta de metilo. Un μl de cada reacción se sometió a electroforesis en un gel de acrilamida desnaturalizante al 20% y después se exploró en un explorador FMBIO-100 (Hitachi).

Las titulaciones de catión divalente variaron de MgCl2 o MnCl2 0,25 mM a 7 mM en condiciones por lo demás convencionales. Las titulaciones con sal variaron de KCl 0 mM a 200 mM o 400 mM para enzimas tolerantes a sales en condiciones por lo demás convencionales. Para las titulaciones de temperatura, las reacciones con las enzimas Cleavase® BN y FEN-1 contenían KCl 50 mM y MgCl2 o MnCl2 4 mM. Las titulaciones de temperatura de DN de Taq y DN de Tth contenían KCl 200 mM y MgCl2 o MnCl2 4 mM. La temperatura varió de 40ºC a 85ºC en incrementos de 5 ó 10 grados dependiendo de la enzima particular usada.

Los resultados se muestran en las Figuras 133-139. La Figura 133 muestra los resultados para CLEAVASE BN, mientras que la Figura 134 muestra los resultados para DN de Taq, la Figura 135 muestra los resultados para DN de Tth, la Figura136 muestra los resultados para FEN-1 de Pfu, la Figura 137 muestra los resultados para FEN-1 de Mja, la Figura 138 muestra los resultados para FEN-1 de Afu y la Figura 139 muestra los resultados para FEN-1 de Mth. En cada uno de los Paneles dentro de estas Figuras, la actividad de la enzima se define como escisiones por moléculas de enzima por minuto. Los Paneles marcados con "IT" se refieren a la escisión de la estructura 25-184-5 (SEC ID Nº 294; Fig. 140B), que imita una estructura de oligonucleótido invasor/ADN diana, mientras que los Paneles marcados con "horquilla" se refieren a la escisión de la estructura 25-65-1 (SEC ID Nº 293; Fig. 140A), que indica la actividad sobre estructuras de escisión plegadas.

En cada una de estas Figuras, el Panel A muestra los resultados de reacciones que contienen MgCl2 2 mM y el sustrato IT descrito en el texto, variando el KCl como se indica; el Panel B muestra los resultados de reacciones que contienen MnCl2 2 mM y el sustrato IT como se describe en el texto, variando el KCl como se indica; el Panel C muestra los resultados de reacciones que contienen MgCl2 2 mM y el sustrato de horquilla como se describe en el texto, variando el KCl como se indica; el Panel D muestra los resultados de reacciones que contienen MnCl2 2 mM y el sustrato de horquilla como se describe en el texto, variando el KCl como se indica; el Panel E muestra los resultados de reacciones que contienen el sustrato IT como se describe en el texto, variando el MgCl2 como se indica; el Panel F muestra los resultados de reacciones que contienen el sustrato IT como se describe en el texto, variando el MnCl2 como se indica; el Panel G muestra los resultados de reacciones que contienen el sustrato de horquilla como se describe en el texto, variando el MgCl2 como se indica; el Panel H muestra los resultados de reacciones que contienen el sustrato de horquilla como se describe en el texto, variando el MnCl2 como se indica; el Panel I muestra los resultados de reacciones que contienen el sustrato IT, MgCl2 4 mM y KCl 50 mM (FEN-1 de Afu, FEN-1 de Pfu, FEN-1 de Mja, FEN-1 de Mth y Cleavase® FN) o KCl 200 mM (DN de Taq y DN de Tth) como se describe en el texto, variando la temperatura como se indica; y el Panel J muestra los resultados de reacciones que contienen el sustrato IT, MnCl2 4 mM y KCl 50 mM (FEN-1 de Afu, FEN-1 de Pfu, FEN-1 de Mja, FEN-1 de Mth y CLEAVASE® BN) o KCl 200 mM (DN de Taq y DN de Tth) como se describe en el texto, variando la temperatura como se indica. Debe indicarse que algunas de estas Figuras (p. ej., 134, 135, 136, y138) no muestran cada uno de los paneles A-J indicados anteriormente.

Por lo anterior, es evidente que la invención proporciona reactivos y procedimientos para permitir la detección y caracterización de secuencias de ácido nucleico y variaciones en secuencias de ácido nucleico. La reacción de escisión dirigida por INVASOR de la presente invención proporciona un procedimiento de detección directa ideal que combina las ventajas de los ensayos de detección directa (por ejemplo, fácil cuantificación y mínimo riesgo de contaminación por traspaso) con la especificidad proporcionada por un ensayo de hibridación de dos o tres oligonucleótidos.

EJEMPLO 65

Clonación y expresión de nucleadas FEN1 desconocidas

La invención se define en las reivindicaciones.

Un procedimiento habitual para clonar miembros nuevos de una familia de genes es ejecutar reacciones de PCR usando oligonucleótidos degenerados complementarios a las secuencias de aminoácidos conservadas en dicha familia y, después, clonar y secuenciar los fragmentos de PCR específicos del gen. Esta información de la secuencia se puede usar después para diseñar cebadores específicos del gen sentido y antisentido que se pueden usar en reacciones PCR circulante (Nucleic Acids Res. 1.995a. 23(6)1087-1088) para obtener el resto de la secuencia génica. Las secuencias obtenidas de las trayectorias de PCR sentido y antisentido se pueden combinar después para generar la secuencia de ADN para todo el marco de lectura abierto (ORF) del gen de interés. Una vez

que se conoce todo el ORF, los cebadores específicos para los extremos 5’ y 3’ del gen se pueden diseñar y se

pueden realizar reacciones de PCR sobre el ADN genómico para amplificar el gen en su totalidad. Este fragmento amplificado específico del organismo se pueden clonar después en un vector de expresión y mediante procedimientos conocidos en la técnica, y detallados más adelante, la proteína de interés se puede expresar y purificar.

Los ejemplos siguientes usan esta serie de etapas en la clonación y expresión de 14 nucleasas FEN-1 nuevas. Las etapas y reactivos (como los vectores de clonación, vectores de expresión, kit de PCR o kit de PCR circulante etc.) se pretende que sean ejemplos y no limitaciones a la presente invención; los expertos en la técnica conocerían que diferentes vectores de clonación, vectores de expresión, kit de PCR o kit de PCR circulante se pueden sustituir por los de los ejemplos.

El ejemplo siguiente se divide en 2 secciones principales:

A. PCR degenerada y PCR circulante para obtener la secuencia de 14 nucleasas FEN-1 nuevos

B. Clonación y expresión de 16 nucleasas FEN-1

A. PCR degenerada y PCR circulante para obtener la secuencia de 14 nucleasas FEN-1 nuevas

Las secuencias proteicas de los genes FEN1 de Pyrococcus juriosus (SEC ID Nº 79) Methanococcus jannaschii (SEC ID Nº 75), Methanobacterium thermoautotrophicum (SEC ID Nº 265) y Archaeoglobus fulgidus (SEC ID Nº 165) se alinearon y se identificaron los bloques de aminoácidos conservados. Los bloques de secuencia conservados (valina, fenilalanina, ácido aspártico, glicina), EGEAQ (ácido glutámico, glicina, ácigo glutámico, alanina, glutamina), SQDYD (serina, glutamina, ácido aspártico, tirosina, ácido aspártico), y GTDYN/GTDFN (glicina, treonina, ácido aspártico, tirosina o fenilalanina, asparagina) se escogieron como las secuencias que probablemente estarían presenntes en los genes de FEN1 de arqueobacterias.

Se diseñaron oligonucleótidos degenerados para cada uno de estos bloques de secuencia conservada. Además de

la parte específica del gen de FEN1 de los oligonucleótidos se añadió una cola de 15 nucleótidos en el extremo 5’ de

los oligonucleótidos para permitir la PCR anidada. Se usó una secuencia de la cola diferente dependiendo de si el oligonucleótido degenerado estaba dirigido a la hebra sentido o antisentido del gen de FEN1.

Se prepararon versiones directa y/o inversa de los oligonucleótidos y dirigidos a las hebras sentido y antisentido del gen FEN1, respectivamente. Los oligonucleótidos son VFDG-Fwd (SEC ID Nº 295), EGEAQ-Fwd (SEC ID Nº 296) QDYD-Fwd (SEC ID Nº 297), EGEAQ-Rev (SEC ID Nº 298), SQDYD-Rev1 (SEC ID Nº 299), SQDYD-Rev2 (SEC ID Nº 300), and GTDYN-Rev (SEC ID Nº 301). Se prepararon dos oligonucleótidos para la secuencia SQDYD-Rev porque la serina está codificada por 6 codones diferentes. Para usar en la PCR, los oligonucleótidos SQDYD-Rev1 y SQDYD-Rev2 se mezclaron en una proporción de 1: 2. Para el oligonucleótido QDYD-Fwd se evitó el requisito de mezclar apuntando solo a los últimos cuatro aminoácidos de la secuencia SQDYD conservada. El oligonucleótido GTDYN-Rev también reconoce la secuencia GTDFN, dadyo que los codones para tirsoina y fenilalanina comparten 2 de 3 nucleótidos.

En primer lugar, se preparó el ADN genómico a partir de 1 vial de la cepa bacteriana viva como se describe más adelante. Todas las cepas bacterianas se obtuvieron de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Acidianus ambivalens-DSM # 3772). Cuando las células se liofilizaron, se resuspendieron en 200 μl deTNE (TrisHCL 10 mM, pH 8,0, EDTA 1mM, NaCl 100 mM). Cuando las células estaban en suspensión líquida, se centrifugaron a 20.000 x G durante 2 minutos y los precipitados celulares se resuspendieron en 200 μl de TNE. 20 μl de SDS (docecilsulfato sódico) al 20% y 2 μl de la proteinasa K 1 mg/ml se añadieron y la suspensión se incubó a 65

ºC durante 30 minutos. La suspensión celular lisada se extrajo en orden secuencial con fenol tamponad, 1: 1 fenol: cloroformo y cloroformo. El ácido nucleico se precipitó mediante la adición de un volumen igual de etanol al 100 % frío. El ácido nucleico se precipitó centrifugando a 20.000 x G durante 5 minutos. El sedimento de ácido nucleico se lavó con etanol al 70 %, se secó al aire y se resuspendió en 50 μl de TE (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, 1 EDTA mM). El sedimento de ADN final se resuspendió en 50 μl de TE (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, 1 EDTA mM).

Ambas reacciones de la PCR anidada se realizaron usando el kit de PCR Advantage cDNA PCR kit (Clontech) de

acuerdo con las instrucciones del fabricante usando una concentración final de 1 μM para todos los oligonucleótidos. La primera reacción se realiza en un volumen de 20 μl con una de las 6 posibles combinaciones de oligonucleótidos degenerados directos e inversos e incluye 1 μl de la preparación de ADN genómico descrita anteriormente o en el caso de Tgo y Tzi, 1 μl (4 ng/μl de madrek y 6 ng/μl de madre, respectivamente) de ADN adquirido de la ATCC

(ATCC#s 700654D y 700529D, respectivamente). Las condiciones de ciclado fueron 20 ciclos de 95 ºC durannte 15 segundos, 50 ºC o 55 ºC durante 15 segundos, y 68 ºC durante 30 segundos. Las segundas reacciones usa cebadores que tienen la misma secuencia que la secuencia de la cola en 5’ de los oligonucleótidos degenerados descritos anteriormente. Los dos cebadores son 203-01-01 (SEC ID Nº 302) y 203-01-02 (SEC ID Nº 303). La segunda reacción se lleva a cabo exactamente como se ha descrito para la primera reacción, a excepción de que se

efectúan 30 ciclos en lugar de 20 y el volumen de la reacción es 25 μl. Tras la segunda PCR, se cargaron 5 μl de la

reacción en un gel de agarosa al 2 % o al 4 % y el ADN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. Los tamaños previstos del producto basados en las secuencias de FEN1 identificadas anteriormente para todos los pares de cebadores fueron los siguientes: VFDG-Fwd y EGEAQ-Rev; 275 pares de baes, VFDG-Fwd y SQDYD-Rev; 325 pares de bases, VFDG Fwd y GTDYN-Rev; 510 pares de bases, EGEAQ-Fwd y SQDYD-Rev; 100 pares de bases, EGEAQ-Fwd y GTDYN-Rev; 290 pares de bases, QDYD-Fwd y GTDYN-Rev; 230 pares de bases. El par de cebadores VFDG-Fwd and EGEAQ-Rev pudo generar un producto de ADN del tamaño correcto para todas las muestras que se intentó. El par de cebadores VFDG-Fwd y GTDYN-Rev pudo generar un producto de ADN del tamaño correcto para la mayoría de las muestras que se intentó.

Cuando mediante PCR degenerada se fabricó un producto de ADN del tamaño previsto, dicho fragmento de ADN se aisló y clonó en pGEM-T Easy (Promega) usando el kit de ligación pGEM-T Easy de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se determinó la secuencia de ADN y la secuencia se usó para generar el genoma sentido y antisentido de los oligonucleótidos circulantes para clonar el resto de los genes FEN1. Los oligonucleótidos se diseñaron según los parámetros del kit GenomeWalker kit (Clontech), que se usó para preparar las diverasas muestras de ADN genómico para las reacciones de PCR circulante del genoma.

Dado que muchos de los organismos de interés no se pueden cultivar fácilmente en una situación de laboratorio convencional (debido a los requisitos de temperatura, presión y condiciones del medio muy especializados), las cantidades de ADN genómico eran limitantes. Por tanto, el ADN se amplificó aleatoriamente usando un oligonucleótido aleatorio de 12 unidades. Se fijaron reacciones de PCR con cien -μl con el kit Advantage cDNA PCR kit (Clontech) y contenían 10 μl de ADN genómico y oligonucleótido aleatorio de 12 unidades 15 μM. Se llevaron a cabo 50 ciclos con los parámetros siguientes: 95 ºC durante 30 segundos, 50 ºC durante 30 segundos, 68 ºC durante 5 minutos. Una vez completadas las reacciones de PCR, el ADN amplificado se purificó con el kit de purificación del producto para PCR de alta pureza (Boehringer Mannheim). El ADN purificado se eluyó en un total de

200 μl de TrisHCL 10 mM, pH 8,5.

El protocolo circulante del genoma consta de 3 etapas: Primera, una muestra de ADN genómico se corta con 5 encimas de restricción de extremos romos en 5 reacciones distintas. Segunda, el ADN cortado se liga en un adaptador que sirve como secuencia de marcaje y también está diseñado para evitar la amplificación de fondo. Tercera, el ADN ligado se amplifica con un cebador específico de gen y un cebador con la misma secuencia que una porción de la secuencia adaptadora.

50 μl de encimas de restricción contenían 30 μl de ADN genómico amplificado aleatoriamente y una de las enzimas

siguientes. Dra I, Eco RV, Pvu II, Sca I o Stu L Tras cuatro horas a 37°C, el ADN cortado se purificó con GENECLEANII (Bio 101) o QIAEX II (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se eluyó en

10 μl TrisHCl de 10 mM, pH 8,5 en cualquiera de los casos. Se usaron 5.6μl de este ADN cortado en las reacciones de ligación de 10 μl que contienen el adaptador GenomeWalker 6μM. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante la noche, seguidas de calentamiento a 70 ºC durante 10 minutos para inactivar la ADN ligasa de T4. Las reacciones de ligación de diluyeron después con 70 μl de TE (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, 1 EDTA mM).

Un μl de la mezcla de ligación diluida se usó en reacciones de PCR de in 25 μl con cebador específico del gen 0,2 μM y cebador P-1 0,2 μM (Clontech), que tiene la misma secuencia que la parte en 5’ del adaptador del Genome Walker. Se realizaron diez reacciones para cada muestra de ADN. Se realizaron cinco reacciones de PCR circulantes antisentido (para las cinco enzimas de restricción diferentes usadas para cortar la muestra genómica) usando el cebador específico de gen sentido y se realizaron cinco reacciones de PCR circulantes sentido usando el cebador específico de gen antisentido para cada muestra de ADN. Loas parámetros de ciclado fueron como recomiendan en el kit Universal Genome Walking kit (Clontech) y fueron los siguientes: 7 ciclos de 94ºC durante 25 segundos y 72 ºC durante 3 minutos; 32 ciclos de 94 ºC durante 25 segundos y 67 ºC durante 3 minutos; seguido por 67 ºC durante 7 minutos. La fuente del ADN para las reacciones de PCR circulante del genoma fue, en la mayoría de los casos, ADN genómico que se había amplificado aleatoriamente con un oligonucleótido aleatorio de 12 unidades, como se ha descrito anteriormente. Las excepciones fueron Sulfolobus solfataricus (Sso), Thermococcus gorgonarius (Tgo), y Thermococcus zilligii (Tzi). Dado que se pudo culltivar Sso, había una gran cantidad de ADN genómico de Sso y el ADN se usó directamente. Un cultivo de 500 ml de Sulfolobus solfataricus (ATCC nº 35091) se cultivó en medio DSM 182 a 75 ºC durante 48 horas. Después del cultivo, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 20.000 xG a 4 ºC. El precipitado celular se resuspendió en 10 ml de TE (Tris HCL 10 mM, EDTA 1 mM) y se congeló en alícuotas de 1 ml a -70 ºC. El ADN se preparó mediante el procedimiento descrito anteriormente usando alícuotas de 1 ml, pero todos los vollúmenes aumentaron 10 veces. Como se ha indicado anteriormente, los ADN genómicos de Tgo y Tzi se adquirieron en la ATCC

Una vez completadas las reacciones de PCR, 5 μl de cada reacción se cargaron en un gel de agarosa al 1% y el ADN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. La presencia de un producto principal se usó como indicación de una reacción con éxito. Cuando se preparó un producto principal, se purificó en gel con GENECLEAN II (Bio101) o QIAEX II (Qiagen) y se ligó en pGEM-T Easy (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se secuenciaron con cebadores flanqueantes del inserto y la secuencia obtenida se comparó con la secuencia del fragmento generado por PCR con los oligonucleótidos degenerados de la misma especie. Las secuencias obtenidas para la PCR degenerada y las trayectorias sentido y antisentido se combinaron para generar la secuencia de ADN para todo el marco de lectura abierto de FEN1. Información específica sobre el genoma circulante y la clonación para cada una de las 14 nucleadas FEN1 nuevas se detalla más adelante.

1. Acidianus ambivalens (Aam)

Las trayectorias del genoma de Acidianus ambivalens (Aam) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue Aam 39AS (SEC ID Nº 304) y el cebador sentido fue Aam 44S (SEC ID Nº 305). La trayectoria de PCR antisentido en lamuestra genómica de Aam digerida con ScaI generó un producto de ADN de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Aam digerida con Dra I generó un fragmento de 600 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

2. El Acidianus brierlyi (Abr)

Las trayectorias del genoma de Acidianus brierlyi (Abr) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Abr 39AS (SEC ID Nº 306) y el cebador sentido fue Abr 40S (SEC ID Nº 307). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Abr digerida con Eco RV generó un producto de ADN de 1,5 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Abr digerida con Dra I generó un fragmento de 600 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

3. Archaeoglobus profundus (Apr)

Las trayectorias del genoma de Acidianus brierlyi (Abr) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Apr 35AS (SEC ID Nº 308) y el cebador sentido fue Abr 63S (SEC ID Nº 309). La trayectoria de PCR antisentido en lamuestra genómica de Apr digerida con Dra I generó un producto de ADN de 1,8 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR antisentido en lamuestra genómica de Apr digerida con Pvu II generó un producto de ADN de 2 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Apr digerida con Dra I generó un fragmento de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

4. Archaeoglobus veneficus (Ave)

Las trayectorias del genoma de Archaeoglobus veneficus (Ave) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido primario fue en Ave 34AS (SEC ID Nº 310) y el cebador sentido primario fue en Ave 65S (SEC ID Nº 311). Para Ave, las reacciones de PCR circulante del genoma primario generó un producto fuerte para únicamente la trayectoria sentido en la muestra de ADN de Ave cortada con Dra I. Por tanto, se realizaron reacciones de PCR anidadas suando el cebador anidado AP-2 y el cebaro antisentido anidado Ave 32AS (SEC ID Nº 312) y el cebador sentido anidado fue en Ave 67S (SEC ID Nº 313). Se realizaron reacciones anidadas con 25 μl como se ha descrito anteriormente para las reacciones de PCR circulante primarias. Las reacciones primarias se diluyeron a 1: 50 en H2O y se añadieron 0,5 μl de dichas diluciines a las reacciones de PCR anidada. Los parámetros de ciclado para las reacciones de PCR anidadas fueron como recomiendan en el kit Universal Genome Walking kit (Clontech) y fueron los siguientes: 5 ciclos de 94°C durante 25 segundos y 72°C durante 3 minutos, 20 ciclos de 94°C durante 25 segundos y 67°C durante 3 minutos, seguido de 7 minutos a 67°C. La reacción de PCR anidada antisentido en una muestra de Ave cortada con Stu I generó un producto de ADN de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La reacción de PCR sentido anidada en la muestra genómica de Ave digerida con Eco RV generó un producto de ADN de 1,1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

5. Desulfurococcus amylolyticus (Dam)

Las trayectorias del genoma de Desulfurococcus amylolyticus (Dam) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue Dam 3 1 AS (SEC ID Nº 314) y el cebador sentido fue Dam 65S (SEC ID Nº 315). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Dam digerida con Stu I generó un producto de ADN de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Dan digerida con Pvu II generó un producto de ADN de 800 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Dam digerida con Stu I generó un fragmento de 400 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

6. Desulfurococcus mobilis (Dmo)

Las trayectorias del genoma de Desulfurococcus mobilis (Dmo) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue Dmo 31 AS (SEC ID Nº 316) y el cebador sentido fue Dmo 66S (SEC ID Nº 317). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Dmo digerida con Eco RV generó un producto de ADN de 450 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Dmo digerida con Pvu II generó un fragmento de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

7. Methanococcus igneus (Mig)

Las trayectorias del genoma de Methanococcus igneus (Mig) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Mig 36AS (SEC ID Nº 318) y el cebador sentido fue Mig 39S (SEC ID Nº 319). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Mig digerida con Dra I generó un producto de ADN de 900 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Mig digerida con Eco RV generó un fragmento de 2,5 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

8. Methanopyrus kandleri (Mka)

Las trayectorias del genoma de Methanopyrus kandleri (Mka) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue Mka 31AS (SEC ID Nº 320) y el cebador sentido fue Mka 41 S (SEC ID Nº 321). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Mka digerida con Eco RV generó un producto de ADN de 500 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Mka digerida con Eco RV generó un fragmento de 1,6 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

9. Pyrobaculum aerophilum (Pae)

Las trayectorias del genoma de Pyrobaculum aerophilum (Pae) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Pae 28AS (SEC ID Nº 322) y el cebador sentido fue Pae 45S (SEC ID Nº 323). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Pae digerida con Eco RV generó un producto de ADN de 400 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Pae digerida con Pvu II generó un fragmento de 700 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

10. Pyrodictium brockii (Pbr)

Las trayectorias del genoma de Pyrodictium brockii (Pbr) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Pbr 42AS (SEC ID Nº 324) y el cebador sentido fue Pbr 56S (SEC ID Nº 325). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Pbr digerida con Eco RV generó un producto de ADN de 650 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Pbr digerida con Pvu II generó un fragmento de 800 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

11. Sulfolobus solfataricus (Sso)

Las trayectorias del genoma de Sulfolobus solfataricus (Sso) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Sso 27AS (SEC ID Nº 326) y el cebador sentido fue Sso 27S (SEC ID Nº 327). La trayectoria de PCR antisentido en lamuestra genómica de Sso digerida con Pvu II generó un producto de ADN de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Sso digerida con Dra I generó un fragmento de 750 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

12. Thermococcus gorgonarius (Tgo)

Las trayectorias del genoma de Thermococcus gorgonarius (Tgo) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Tgo 55AS (SEC ID Nº 330) y el cebador sentido fue Tgo 67S (SEC ID Nº 331). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Tgo digerida con Dra I generó un producto de ADN de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Tgo digerida con Stu I generó un fragmento de 850 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

13. Thermococcus litoralis (Tli)

Las trayectorias del genoma de Thermococcus litoralis (Tli) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Tli 28AS (SEC ID Nº 328) y el cebador sentido fue Tli 48S (SEC ID Nº 329). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Tli digerida con Eco RV generó un producto de ADN de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Tli digerida con Eco RV generó un fragmento de 1,9 kilobases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

14. Thermococcus zilligii (Tzi)

Las trayectorias del genoma de Thermococcus zilligii (Tzi) se realizaron del siguiente modo. El cebador antisentido fue en Tzi 55AS (SEC ID Nº 332) y el cebador sentido fue Tzi 67S (SEC ID Nº 333). La trayectoria de PCR antisentido en la muestra genómica de Tzi digerida con Dra I generó un producto de ADN de 1 kilobase que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció. La trayectoria de PCR sentido en la muestra genómica de Tzi digerida con Stu I generó un fragmento de 850 pares de bases que se clonó en pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció.

B. Clonación de 16 nucleasas FEN-1

La sección anterior detalló la clonación y secuenciación de nuevas nucleadas FEN1. Esta sección describirá la clonación de esas nuevas FEN-1 en un vector de expresión, así como la clonación de dos FEN-1 adicionales conocidas previamente Aeropyrnum pernix (Ape) y Pyrococcus horikoshii (Pho). El procedimiento comprende 4 o 5 etapas y se explica ampliamente más adelante.

La primera etapa implica el diseño de cebadores de PCR específicos de gen en 5’ y 3’. Dado que se ha determinado la secuencia completa de los 16 genes de FEN-1, se diseñaron cebadores específicos para dirigir y amplificar el gen de FEN-1 de interés en su totalidad. Para cada endonucleasa FEN1 a clonar, el cebador del extremo 5’ y en el extremo 3’ son en su mayoría complementarios del extremo 5’ y del extremo 3’ del marco de lectura abierto de FEN1. Los primeros pocos nucleótidos del cebador constituyen un espaciador y secuencias necesarias para introducir una endonucleasa de restricción para facilitar la clonación. La elección de la secuencia de endonucleasa de restricción para incorporar en el cebador depende de la secuencia de la enzima FEN-1. Idealmente, los sitios de

restricción únicos se crean en los extremos 5’ y 3’ del producto de la PCR (no son los mismos que cualquier sitio de

restricción interno en la secuencia de FEN-1). Asimismo, los sitios incorporados en los cebadores corresponden a sitios de enzimas de restricción habitualmente encontrados en los vectores de expresión usados en la técnica. Ejemplos de dichas enzimas son EcoRI, SalI, NcoI, XbaI y PstI.

En segundo lugar, las reacciones de la PCR se realizaron usando los cebadores diseñados anteriormente y el ADN genómico del organismo de interés. En tercer lugar, los productos de la PCR se purificaron en gel y después se cortaron con endonucleasas de restricción correspondientes a los sitios incorporados en los cebadores para PCR. Los productos de la PCR cortada se purificaron después a partir de los fragmentos de digestión más pequeños y, en cuarto lugar, los productos cortados se clonaron en un vector de expresión. En algunos casos, esta fue la etapa final del proceso de clonación, antes de la transformación y expresión/purificación de proteínas. En algunos casos fue necesaria una quinta etapa. En algunos casos, se tuvo que realizar una etapa de mutagénesis para eliminar cualquier nucleótido incorporado en el ORF como resultado de las secuencias cebadoras requeridas para la clonación.

Por último, un huésped bacteriano (p. ej., JM109 de E. coli) se transformó con el vector de expresión que contenía la FEN-1 clonada y la expresión y purificación se realizaron como se detalla en el Ejemplo Experimental 28f. Cuatro de las construcciones génicas de FEN aisladas (Pae FEN-1, Pbr FEN-1, Mig FEN-1 and Mka FEN-1) produjeron poca o ninugna proteína detectable en el huésped se transformó.

La sección siguiente detalla la PCR, los digestos de restricción, las reacciones de clonación y mutagénesis (si se requieren) y la transformación para cada nucleasa FEN-1. La descripción se subdivide en orden para agrupar las nucleasas FEN-1 de acuerdo con las endonucleasas de restricción usadas en la clonación. Las subdivisiones son las siguientes:

I. Endonucleasas FEN-1 clonadas on las endonucleasa de restricción NcoI/SalI

II. Endonucleasas FEN-1 clonadas on las endonucleasa de restricción EcoRI/SalI

III. Endonucleasas FEN-1 clonadas con otras endonucleasas de restricción

I. Clonación de endonucleasas FEN-1 usando las endonucleasas de restricción NcoI y SalI

En este ejemplo, el ADN que codifica la endonucleasa FEN-1 de Acidianus ambivalens (Aam), Acidianus brierlyi (Abr), Aeropyrum pernix (Ape), Archaeaglobus profundus (Apr), Methanococcus igneus (Mig), Pyrococcus horikoshii (Pho), Sulfolobus solfataricus (Sso), Thermococcus gorgonarius (Tgo), se aisló y se insertó en un plásmido bajo e control transcripciopnal de un promotor inducible del siguiente modo.

1. Clonación de FEN-1 de Acidianus ambivalens (Aam)

Un microlitro de la solución de ADN genómico descrito anteriormente (en la sección 65A) se empleó en una PCR usando el kit ADVANTAGE cDNA PCR kit (Clonetech); la PCR se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para cada endonucleasa FEN1 a clonar, el cebador del extremo 5’ es en su mayoría complementario del extremo 5’ del marco de lectura abierto de FEN1. Los primeros 6 nucleótidos del cebador constituyen un espaciador y 2 bases de un sitio de Nco I para facilitar la clonación. Una ’A’ en la posición 3 de la secuencia del ORF de Aam (SEC ID Nº 336) se mutó a una ’G’ en el cebador 5’ para crear un codón de iniciación ATP. Asmismo, el cebador del extremo 3’ es en su mayoría complementario del extremo 3’ del marco de lectura abierto de FEN1. Los primeros 10 oligonucleótidos contituyen un espaciador y un sitio Sal I para facilitar la clonación. Los cebadores par PCR usados para Aam son: Aam5’-5’ GCAACCATG GGAGTAGACCTTGCTGATTTGG (SEC ID Nº 334) y Aam 3’ -5’ CCATGTCGACTAAAAC CACT-GATCTAAACCGC (SEC ID Nº 335). La reacción de PCR para cada FEN1 produjo la amplificación (es decir, la producción) de una sola banda principal con una longitud de aproximadamente 1 kilobase. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Aam se proporciona en la SEC ID Nº . 336; la secuencia de aminoácidos codificada por el ORF de Aam se proporciona en la SEC ID Nº 337.

Después de la amplificación por PCR, la reacción entera se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% y la banda principal se escindió del gel y se purificó usando el kit GENECLEAN II kit (Bio 101, Vista CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1 μg del producto de PCR FEN-1 purificado en gel se digirió con NcoI y SalI. Después de la digestión, el ADN se purificó usando el kit Geneclean II de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un microgramo del vector pTrc99a (Pharmacia) se digirió con NcoI y SalI en preparación para ligamiento con el producto de PCR digerido. Se combinaron cien nanogramos del vector pTrc99a digerido y 250 ng del producto PCR de FEN-1 de Mja y se ligaron para crear FEN 1 pTrc99-MJFEN-1 (enzima TLA). pTrc99-(enzima TLA) se usó para transformar células de E. coli JM109 competentes (Promega) usando técnicas convencionales.

2. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Acidianus brierlyi

La clonación de una FEN-1 de Acidianus brierlyi (Abr) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 1651, los cebadores de PCR usados son Abr 5’ -5’ CATACCATGGGAGTAGATTTATCTGACTTAG (SEC ID Nº 338) y Abr 3’ -5’ CTTGGTCGACTTAAAACCATTGGTCAAGTCCAG (SEC ID Nº 339). Una ’C’ en la posición 3 de la secuencia del ORF de Abr (SEC ID Nº 338) se mutó a ua “G” en el cebador del 5’ para crear un codón de iniciación ATP. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Abr se proporciona en la SEC ID Nº . 340; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 341.

3. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Aeropyrum pernix

La clonación de una FEN-1 de Aeropyrum pernix (Ape) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción de que la secuencia de la enzima se obtuvo de GENBANK (nº de registro H72765), el DSM 11879, los cebadores de PCR usados son Ape 5’ -5’ TTAGCCATGGGAGTCAACCTTAGGGAG (SEC ID Nº 342) y Ape 3’-5’ GTAAGTCGACTATCCGAAC-CACATGTCGAG (SEC ID Nº 343). Una ’T’ en la posición 1 de la secuencia del ORF de Ape (SEC ID Nº 344) se mutó a una ’A’ en el cebador 5’ para crear un codón de iniciación ATP. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Ape se proporciona en la SEC ID Nº . 344; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 345.

4. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Archaeaglobus profundus

La clonación de una FEN-1 de Archaeaglobus profundus (Apr) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 5631, los cebadores de PCR usados son Apr 5’-5’ CTTACCATGGGCGCTGATATAGGAGAGC (SEC ID Nº 346) y Apr 3’-5’ TGGAGTCGACTTAAAACCACCTGTCCAGAG (SEC ID Nº 347). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Apr se proporciona en la SEC ID Nº . 348; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 349.

5. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Methanococcus igneus

La clonación de una FEN-1 de Methanococcus igneus (Mig) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 5666, los cebadores de PCR usados son Mig 5’ -5’ CATTCCATGGGAGTGCAGTTTAATG (SEC ID Nº 350) y Mig 3’ -5’ CGGAGTCGACTCATCTCCCAAACCATGC(SEC ID Nº 351). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Mig se proporciona en la SEC ID Nº . 352; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 353.

6. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Pyrococcus horikoshii

La clonación de una FEN-1 de Pyrococcus horikoshii (Pho) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción de que la secuencia de la enzima se obtuvo de GENBANK (nº de registro A71015), el DSM es 12428, los cebadores de PCR usados son Pho 5’ -5’ GATACCATGGGTGTTCCTATCGGTGAC (SEC ID Nº 354) Pho 3’ - 5’ CTTGGTC-GACTTAGGGTTTCTTTTTAACGAACC (SEC ID Nº 355). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Pho se proporciona en la SEC ID Nº . 356; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 357.

7. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Sulfolobus solfataricus

La clonación de una FEN-1 de Sulfolobus solfataricus (Sso) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción de que se obtuvieron reservas bacterianas de a Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) (ATCC, Nº 5091) y los cebadores de PCR usados son Sso 5’-5’ TAAGCCATGGGTGTAGATTTAGGCGAAATAG (SEC ID Nº 358) Sso 3’-5’ ACTAGTCGACTTAAAACCACTGATCAAGACCTGTC (SEC ID Nº 359). Una ’A’ en la posición 3 de la secuencia del ORF de Sso (SEC ID Nº 360) se mutó a una ’G’ en el cebador 5’ para crear un codón de iniciación ATP. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Sso se proporciona en la SEC ID Nº . 360; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 361.

8. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Thermococcus gorgonarius

La clonación y expresión de Thermococcus gorgonarius (Tgo) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción de que el número de la ATCC es 700653D y los cebadores de PCR usados son Tgo 5’ -5’ CTAGCCATGGGAGTTCAGATAGGTGAGC (SEC ID Nº 362) y Tgo 3’ -5’ TGGAGTCGACTACCGTGTGAACCAGCTTTC (SEC ID Nº 363). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Tgo se proporciona en la SEC ID Nº . 364; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 365.

II. Clonación de endonucleasas FEN-1 con EcoRI/SalI

Las FEN-1 de este grupo se clonaron como se ha indicado anteriormente, a excepción de que las endonucleasas de restricción usadas para la etapa de clonación son EcoRI y SalI. Esto se debe a la presencia de un sitio NcoI interno en estas secuencias de FEN-1. EcoRI es una buena elección ya que es habitual en la técnica de la clonación, se encuentra en muchoas vectores de expresión y las siguientes FEN-2 no contienen sitios internos para EcoRI. Es interesante el hecho de que la clonación de estos fragmentos de PCR en el vector pTRC99a da un ORF que contiene dos aminoácidos no presentes en la secuencia nativa. Para corregir esto y obtener un ORF nativo, se realizaron reacciones de mutagénesis con el kit Transformer™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Palo Alto CA, número de catálogo K1600-1) siuguiendo las instrucciones del fabricante, usando el oligonucleótido mutagénico especificado para cada endonucleasa FEN1. Tras la reacción de mutagénesis, se seleccionó cortando los productos con Ncori. Dado Que las construcciones mutantes no tiene sitio EcoRI, no se cortarán. Ninguna construcción no mutageneizada adecuadamente seguriá conteniendo un sitio de restricción EcoRI y se cortará con la reacción de digestión. Las células bacterianas se transformaron y cultivaron en medio selectivo (ampicilina) según las instrucciones del kit Transformer™ Site-Directed Mutagenesis. El plásmido mutagénico se aisló según las instrucciones del fabricante, el ADN resultante se cortó de nuevo con EcoRI y los productos de esta reacción se usaron para transformar células JM 109 de E. coli (Promega) usando técnicas estándar.

9. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Archaeaglobus veneficus

La clonación de una FEN-1 de Archaeaglobus veneficus (Ave) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 11195, los cebadores de PCR usados son Ave 5’-5’ TAACGAATTCGGTGCAGACATAGGCGAACTAC (SEC ID Nº 366) y Ave 3’-5’ CGGTGTCGACTCAGGAAAACCACCTCTCAAGCG (SEC ID Nº 367), y el oligonucleótido mutagénico usado fue Ave .R1 -5’ CACAGGAAACAGACCATGGGTGCAGACATAGGCGAAC (SEC ID Nº 368). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Ave se proporciona en la SEC ID Nº . 369; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 370.

10. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Desulfurococcus amylolyticus

La clonación de una FEN-1 de Desulfurococcus amylolyticus (Dam) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 3822, los cebadores de PCR usados son Dam 5’-5’ CTAAGAATTCGGAGTAGACTTAAAAGACATTATACC (SEC ID Nº 371) y Dam 3’-5’ AGTTGTCGACTACTTCGGCTTACTGAACC (SEC ID Nº 372), y el oligonucleótido mutagénico usado fue Dam .R1 5’ CAGGAAACAGACCATGGGAGTAGACTTAAAAGAC (SEC ID Nº 373). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Dam se proporciona en la SEC ID Nº . 374; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 375.

11. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Pyrobaculum aerophilum

La clonación de una FEN-1 de Pyrobaculum aerophilum (Pae) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 7523, los cebadores de PCR usados se clonaron usando EcoR I y Sal I Pae 5’ -5’ CGTTGAATTCGGAGTTACTGAGTT-GGGTAAG (SEC ID Nº 376) y Pae 3’ -5’ TACTGTCGACAGAAAAAGGAGTCGAGAGAGGAAG (SEC ID Nº 377). A’G’ en la posición 1 de la secuencia del ORF de Pae (SEC ID Nº 378) se mutó a una ’A’ en el cebador 5’ para crear un codón de iniciación ATP. La reacción de mutagénesis para esta enzima todavía no se ha realizado. Hay dos aminoácidos no nativos en el extremo 5’ de esta proteína. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Pae se proporciona en la SEC ID Nº 378; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 379.

12. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Thermococcus litoralis

La clonación de una FEN-1 de Thermococcus litoralis (Tli) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 5473, los cebadores de PCR usados fueron Tli 5’-5’ TCATGAATTCGGAGTCCAGATTGGTGAGCTT (SEC ID Nº 380) y Tli 3’ -5’ GATTGTCGACTCACTTTTTAAACCAGCTGTCC (SEC ID Nº 381); el cebador mutagénico fue Tli .R1 -5’ AAGCTCACCAATCTGGACTCCCATGGTCTGTTTCCTGTG (SEC ID Nº 382). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Tli se proporciona en la SEC ID Nº . 383; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 384.

13. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Desulfurococcus mobilis

La clonación de una FEN-1 de Desulfurococcus mobilis (Dmo) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 2161, los cebadores de PCR usados fueron Dmo 5’-5’ CTTGGAATTCGGCGTCGACCTAAGGGAACTC (SEC ID Nº 385) y Dmo 3’-5’ AGGTCTGCAGTTAACCCTGCTTACCGGGCTTAGC (SEC ID Nº 386), y el cebador mutagénico usado fue Dmo .R1 -5’ CAGGAAACAGACCATGGGCGTCGACCTAAGG (SEC ID Nº 387). El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Dmo se proporciona en la SEC ID Nº . 388; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 389.

14. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Pyrodictium brockii

La clonación de una FEN-1 de Pyrodictium brockii (Pbr) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 2708, los cebadores de PCR usados fueron Pbr 5’-5’ TAGCGAATTCGGCGTCAACCTCCGCGAG (SEC ID Nº 390) y Pbr 3’-5’ CATTCTGCAGCTAGCGGCGCAGCCACGC (SEC ID Nº 391); el cebador mutagénico fue Pbr .R1-5’ CAG-GAAACAGACCATGGGCGTCAACCTCCGC (SEC ID Nº 392). A’G’ en la posición 1 de la secuencia del ORF de Pbr (SEC ID Nº 393) se mutó a una ’A’ en el cebador 5’ para crear un codón de iniciación ATP. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Pbr se proporciona en la SEC ID Nº . 393; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 394.

III. Clonación de endonucleasas FEN-1 con otras enzimas

Las siguientes endonucleasas FEN-1 se clonaron usando endonucleasas de restricción distintas a las ya descritas. Estas secuencias de FEN-1 concretas contienen sitios internos para EcoRI o sitios internos para SalI y, por tanto, requieren diferentes enzimas de restricción en la etapa de clonación. Ninguno de los cebadores usados en esta sección da productos clonados que contengan un ORF con nucleótidos aberrantes (no naturales), por tanto no hay necesidad de una etapa de mutagénesis adicional. Todas las reacciones descritas en esta sección se realizaron como en la sección I, con todas las excepciones indicadas debajo.

15. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Methanopyrus kandleri

La clonación de una FEN-1 de Methanopyrus kandleri (Mka) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción del DSM 6324, los cebadores de PCR usados fueron Mka 5’ -5’ CATACCATGGGACTAGCTGAACTCCGAG (SEC ID Nº 395) y Mka 3’-5’ TGGATCTAGATCAGAAGAACGCGTCCAGGG (SEC ID Nº 396). A’G’ en la posición 1 de la secuencia del ORF de Mka (SEC ID Nº 397) se mutó a una ’A’ en el cebador 5’ para crear un codón de iniciación ATP. Las enzimas de restricción usadas en la reacción de clonación fueron NcoI y XbaI. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Mka se proporciona en la SEC ID Nº . 397; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 398.

16. Clonación de una edonucleasa FEN-1 a partir de Thermococcus zilligii

La clonación de una FEN-1 de Thermococcus zilligii (Tzi) se realizó como se ha indicado anteriormente a excepción de que el ADN genómico obtenido se obtuvo de la colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Nº 700529D) y los cebadores de PCR usados fueron Tzi 5’ -5’ CGATCCATGGGAGTTCAGATCGGTGAGC (SEC ID Nº 399) y Tzi 3’-5’ CAGGCTGCAGTCACCT-TCCGAACCAGCTCTC (SEC ID Nº 400). Las enzimas de restricción usadas en la reacción de clonación fueron NcoI y PstI. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la endonucleasa FEN-1 de Tzi se proporciona en la SEC ID Nº 401; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID Nº 402.

IV. Mutantes dirigidos a sitio y recombinantes de las enzimas FEN1.

Quimeras de cambio de arco

La región del arco de las enzimas FEN1 comprende aproximadamente 58 aminoácidos desde el aminoácido 78 (comenzando con la secuencia VFDG conservvada) al aminoácidos 135. Las enzimas FEN1 de Archaeoglobus fulgidus (Afu), Pyrococcus furiosus (Pfu), y Methanococcus jannaschii (Mja) tienen diferentes especificidades, las

regiones del arco se “cambiaron” entra las enzimas y se examinaron los efectos sobre la especificidad de la enzima.

Los aminoácidos 78 a 84 (comenzando en la región del arco) son idénticas en las enzimas FEN1 Afu, Pfu y Mja, los aminoácidos 85 a 135 de Mja, Pfu y Afu se cambiaron para crear nuevas enzimas quiméricas. Las cuatro enzimas creadas son MPM, PMP, MAM, y PAP.

MPM consiste en los aminoácidos 1-84 de la enzima FEN1 de Mja, los aminoácidos 85-135 de la enzima FEN1 de Pfu y los aminoácidos 136-326 de la enzima FEN1 de Mja. PMP consiste en los aminoácidos 1-84 de la enzima FEN1 de pFU, los aminoácidos 85-135 de la enzima FEN1 de Mja y los aminoácidos 136-340 de la enzima FEN1 de Pfu. MAM consiste en los aminoácidos 1-84 de la enzima FEN1 de Mja, los aminoácidos 85-134 de la enzima FEN1 de Afu y los aminoácidos 136-326 de la enzima FEN1 de Mja (la discrepancia en la numeración se debe al hecho de que el arco es un aminoácido más corto en la FEN1 de Afu que en las FEN1 de Pfu y Mja). PAP consiste en los aminoácidos 1-84 de la enzima FEN1 de Pfu, los aminoácidos 85-134 de la enzima FEN1 de Afu y los aminoácidos 136-340 de la enzima FEN1 de Pfu.

La quimera MPM se construyó del siguiente modo. Se realizaron tres reacciones PCR, una por cada fragmento de la quimera. Las reacciones PCR se llevaron a cabo como se ha descrito. La reacción 1 usó los cebadores Mja5’ (5’-GGGATAC-CATGGGAGTGCAGTTTGG, SEC ID Nº 411) y MPM84AS 5’(GAGCTCTTTCTTTTTGAATTCTGGTGGCTCAC-CATCAAAAAC, SEC ID Nº 412) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Mja FEN1. La reacción 2 usó los cebadores P84S (5’-GAATTCAAAAAGAAAGAGCTC, SEC ID Nº 413) y P135AS (5’-TGCATCCTCGATGAGCATTTC, SEC ID Nº: 414) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Pfu FEN1. La reacción 3 usó los cebadores P84S MPM135S (5’-GAAATGCTCATCGAGGAT-GCAAAATATTTGTTAAGTTTGATGGG, SEC ID Nº 415) y Mja3’ (5’-GGTAAATTTTTCTCGTCGACATCCCAC, SEC ID Nº 416) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Mja FEN1. Tras la primera reacción, los fragmentos se purificaron en gel y eluyeron en 50 μl del tampón de elución. Los fragmentos de ADN se diluyeron de 1 a 10 en agua y a la PCR final, que se realizó como s eha descrito anteriormente para los cebadores Mja5’ y Mja3’, se añadió 1 μl de cada fragmento diluido. Tras la PCR final, el ADN se purificó en gel y se clonó en el vector pTrc99a como se ha descrito. º El marco de lectura abierto de MPM es la SEC ID Nº 417; la secuencia de aminoácidos de MPM es la SEC ID Nº 418.

La quimera PMP se construyó del siguiente modo. Se realizaron tres reacciones PCR, una por cada fragmento de la quimera. Las reacciones PCR se llevaron a cabo como se ha descrito. La reacción 1 usó los cebadores Pfu5’ (5’-GATTCCAT-GGGTGTCCCAATTGGTGAG, SEC ID Nº 419) y Pmp84AS (5’-CCTTGTTTTCTCCTTTAACTTTGGAGGTTCTC-CATCAAAAAC, SEC ID Nº 420) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Pfu FEN1. La reacción 2 usó los cebadores M84S (5’-AAGTTAAAGGAGAAAACAAGG, SEC ID Nº 421) y M135AS (5’-GCAGTTTTCAACCATTTTCGG, SEC ID Nº: 422) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Mja FEN1. La reacción 3 usó los cebadores Pmp135S (5’-CCGAAAATGGTTGAAAACT-GCAAAAAACTCTTAGAGCTTATG, SEC ID Nº 423) y Pfu3’ (5’-CGGAGTCGACTTATCTCTTGAACCAACTT-TCAAG, SEC ID Nº 424) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Pfu FEN1. Tras la primera reacción, los fragmentos se purificaron en gel y eluyeron en 50 μl del tampón de elución. Los fragmentos de ADN se diluyeron de 1 a 10 en agua y a la PCR final, que se realizó como s eha descrito anteriormente para los cebadores Pfu5’ y Pfu3’ , se añadió 1 μl de cada fragmento diluido. Tras la PCR final, el ADN se purificó en gel y se clonó en el vector pTrc99a como se ha descrito. La secuencia del marco de lectura abierto de PMP es SEC ID Nº 425, la secuencia de aminoácidos de PMP es SEC ID Nº 426.

La quimera MAM se construyó del siguiente modo. Se realizaron tres reacciones PCR, una por cada fragmento de la quimera. Las reacciones PCR se llevaron a cabo como se ha descrito. La reacción 1 usó los cebadores Mja5’ y MAM84AS (5’-CAATTTCAGCCTTCTTGAACTCTGGTGGCTCACCATCAAAAAC, SEC ID Nº 427) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Mja FEN1. La reacción 2 usó los cebadores A84S (5’-GAGTTCAAGAAGGCTGAAATTG, SEC ID Nº 428) y A135AS (5’-TGCGGAGTCAACAATGTACTC, SEC ID Nº: 429) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Afu. La reacción 3 usó los cebadores MAM135S (5’-GAGTACATTGTTGACTCCGCAAAATATTTGTTAAGTTTGATGGGC, SEC ID Nº 430) y Mja3’ y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Mja. Tras la primera reacción, los fragmentos se purificaron en gel y eluyeron en 50 μl del tampón de elución. Los fragmentos de ADN se diluyeron de 1 a 10 en agua y a la PCR final, que se realizó como s eha descrito anteriormente para los cebadores Pfu5’ y Pfu3’ , se añadió 1 μl de cada fragmento diluido. Tras la PCR final, el ADN se purificó en gel y se clonó en el vector pTrc99a como se ha descrito. La secuencia del marco de lectura abierto de MAM es SEC ID Nº 431, la secuencia de aminoácidos de MAM es SEC ID Nº 432.

La quimera PAP se construyó del siguiente modo. Se realizaron tres reacciones PCR, una por cada fragmento de la quimera. Las reacciones PCR se llevaron a cabo como se ha descrito. La reacción 1 usó los cebadores Pfu5’ y PAP84AS (5’-CAATTTCAGCCTTCTTGAACTCTGGAGGTTCTCCATCAAAAAC, SEC ID Nº 433) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Pfu FEN1. La reacción 2 usó los cebadores A84S y A135AS y 1 ng del plásmido que contiene el gen de la FEN1 de Afu. La reacción 3 usó los cebadores PAP135S (5’-GAGTACATTGTTGACTCCGCAAAAAAACTCTTAGAGCTTATGGG, SEC ID Nº 434) y Pfu3’’ y 1 ng del plásmido que contiene el gen de la FEN1 de Mja. Tras la primera reacción, los fragmentos se purificaron en gel y eluyeron en 50 μl del tampón de elución. Los fragmentos de ADN se diluyeron de 1 a 10 en agua y a la PCR final, que se realizó como s eha descrito anteriormente para los cebadores Pfu5’ y Pfu3’ , se añadió 1 μl de cada fragmento diluido. Tras la PCR final, el ADN se purificó en gel y se clonó en el vector pTrc99a como se ha descrito. La secuencia del marco de lectura abierto de PAP es SEC ID Nº 435: la secuencia de aminoácidos de PAP es la SEC ID N 436.

Quimeras de cambio de bucle

Cuando se compara la secuencia de las enzimas FEN1, la mayoría de las enzimas FEN1 de arqueobacterias, con la excepción de la FEN1 de Mja y FEN1 de Mth, tienen 10 aminoácidos adicionales cuadno se comparan con las enzimas FEN1 ecuarióticas. Esta secuencia de aminoácidos forma un bucle en forma de lazo ß que sobresale de la superfice de la enzima. Dado que tanto la FEN1 de Mja como la FEN1 de Mth tienen una actividad elevada sobre los sustratos de la horquilla y de la estructura X y carecen de esta secuencia del bucle, se realizaron ensayos para determinar el efecto de la presencia del bucle sobre la especificidad de la enzima.

Se construyeron dos enzimas quiméricas: Mja+Pfu16, que es la enzima FEN1 de Mja FEN1 con la secuencia del bucle de Pfu insertada en la ubicación adecuada; y Pfu+Mja4, que es la enzima FEN1 de Pfu con la secuencia del bucle eliminada y los 4 aminoácidos de la FEN1 de Mja inservados en su lugar. Ambas enzimas se crearon mediante PCR recombinante.

Para la creación de Mja+Pfu16 se realizaron doce PCR. La primera reacción contenía los cebadores de Mja5’ y Mja+Pfu16AS (5’-CGTAGACATTTTTCCCAGGCAACTTTCTTTTTCCTGTAGTTGTTAAATTTCTAA C, SEC ID Nº 437) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Mja FEN1. La segunda reacción contenía los cebadores de Mja5’ y Mja+Pfu16S (5’-CCTGGGAAAAATGTCTACGTCGAGATAAAGCCCGAACTTATTGAATTAAATG, SEC ID Nº 438) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de of MjaFEN1. Tras la primera reacción, los fragmentos se purificaron en gel y eluyeron en 50 μl del tampón de elución. Los fragmentos de ADN se diluyeron de 1 a 10 en agua y a la PCR final, que se realizó como s eha descrito anteriormente para los cebadores Mja5’ y Mja3’, se añadió 1 μl de cada fragmento diluido. Tras la PCR final, el ADN se purificó en gel y se clonó en el vector pTrc99a como se ha descrito. La secuencia del marco de lectura abierto Mja+Pfu16 es la SEC ID Nº 439; la secuencia de aminoácidos Mja+Pfu16 es la SEC ID Nº 440.

Para la creación de Pfu+Mja4, se realizaron dos PCR. La pirmera reacción contenía los cebadores de Pfu5’ y Pfu+Mja4AS (5’-CTCTGGCATCTCCTTTGTTATTGTTAAGTTTCTAAC, SEC ID Nº 441) y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Pfu. La segunda reacción contenía los cebadores de Pfu+Mja4S (5’-ACAAAGGAGATGCCAGAGTTGATAATTTTGGAGGAAG, SEC ID Nº 442) y Pfu3’ y 1 ng del plásmido que contiene la FEN1 de Pfu. Tras la primera reacción, los fragmentos se purificaron en gel y eluyeron en 50 μl del tampón de elución. Los fragmentos de ADN se diluyeron de 1 a 10 en agua y a la PCR final, que se realizó como s eha descrito anteriormente para los cebadores Pfu5’ y Pfu3’ , se añadió 1 μl de cada fragmento diluido. Tras la PCR final, el ADN se purificó en gel y se clonó en el vector pTrc99a como se ha descrito. º Las enzimas se han purificado como se ha descrito. La secuencia del marco de lectura abierto de Pfu+Mja4 es SEC ID Nº 443; la secuencia de aminoácidos de Pfu+Mja4 es SEC ID Nº 444.

Mutaciones en la tirosina conservada

En estudios de modelación de las enzimas FEN1 con sustratos de ADN se observó que el extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR está cercan a una tirosina conservada en la posición 33 de la secuencia de proteínas FEN1 de Pfu. Dicho aminoácido es una tirosina en todas las secuencias de FEn1 de arqueobacterias conocidas y es fenilalanina o tirosina en los homólogos de la ADN polimerasa 1 bacteriana. La tirosina en la posición 33 de la enzima FEN1 de Pfu se mutó en una alanina o una fenilalanina para determinar el efecto sobre el reconocimiento del extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR. Las construcciones se realizaron individualmente usando la técnica de mutagénesis dirigida a sitio usando la técnica QuikChange (Stratagene). Los oligonucleótidos usados en la mutagénesis Y33A eran PfuY33A-S (5’-CTCTTAATGCAATCGCCCAATTTTTGTCCAC, SEC ID Nº 445) y Pfu Y33A-AS (5’-GTGGACAAAAATTGGGCGATTGCATTAAGAG, SEC ID Nº 446). Los oligonucleótidos usados en la mutagénesis Y33F eran PfuY33F-S (5’-CTCTTAATGCAATCTTCCAATTTTTGTCCAC, SEC ID Nº 447) y PfuY33F-AS (5’-GTGGACAAAAATTGGAAGATTGCATTAAGAG, SEC ID Nº 448). La secuencia del marco de lectura abierto de PfuY33F es SEC ID Nº 449; la secuencia de aminoácidos de PfuY33 es SEC ID Nº 450. La secuencia del marco de lectura abierto de PfuY33A F es SEC ID Nº 451; la secuencia de aminoácidos de PfuY33A es SEC ID Nº 452. Tras la mutagénesis y la detección selectiva de la presencia de las mutaciones, las enzimas se purifican como se ha descrito.

Mutantes arq. de Pho y Pfu

La enzima FEN1 de Pho tiene una velocidad de escisión en los sustratos de la horquilla y estructura X que es de 1 a 2 órdenes de magnitud mayor que las mismas velocidades medidas usando la enzima FEN1 de Pfu. Cuando las secuencias de aminoácidos de las dos enzimas se compararon, se observó que había 4 cambios entre las dos enzimas en la región arq. (en las posiciones aminoacídicas 82, 103, 110, y 113). En cada una de las posiciones en las que se producen diferencias entre las dos enzimas, la FEN1 de Pfu tiene un residuo de ácido glutámico cargado negativamente, mientras que la Fen1 de Pho tiene un aminoácido neutro o cargado positivamente en dichas posiciones. Los ensayos se realizaron para examinar los efectos de estos residuos sobre las especificidades de estas enzimas. Los inventores realizaron mutantes de las enzimas FEN1 de Pfu y Pho para barrer los aminoácidos en la región del arco y determinar los efectos de las mutaciones sobre la especificidad. Las construcciones siguientes se realizaron usando la técnica de mutagénesis QuikChange (Stratagene). Para las construcciones con múltiples mutaciones se realizaron reacciones de mutagénesis secuencial. Pfu1M tiene la mutación E82K efectuada usando los oligonucleótidos PfuE82K-S (5’-GTGTATGTTTTTGATGGAAAACCTCCAGAATTC, SEC ID Nº 453) y PfuE82K-AS (5’-GAATTCTGGAGGTTTTCCATCAAAAACATACAC, SEC ID Nº 454). Pfu1M tiene la mutación E82K y la mutación E103L efectuada usando los oligonucleótidos PfuE103L-S (5’-GAGAGAGGAAGCTGAACTAAAGT-GGAGAGAAGC, SEC ID Nº 455) y PfuE103L-AS (5’-GCTTCTCTCCACTTTAGTTCAGCTTCCTCTCTC, SEC ID Nº 456). Pfu1M tiene las mutaciones E82K and E103L y la mutación E110A efectuada con PfuE110A-S (5’-GAGAGAAG-CACTTGCAAAAGGAGAGATAGAGG, SEC ID Nº 457) y PfuE110A-AS (5’-CCTCTATCTCTCCTTTTGCAAGT-GCTTCTCTC, SEC ID Nº 458). Pfu1M tiene las mutaciones E82K, E103L y E110A y la mutación E113N efectuada con PfuE113N-S (5’-GAAGCACTTGCAAAAGGAAACATAGAGGAAGCAAGAA, SEC ID Nº 459) y PfuE113N-AS (5’-TTCTTGCTTCCTCTATGTTTCCTTTTGCAAGTGCTTC, SEC ID Nº 460). Pho1M tiene la mutación K82E efectuada con PhoK82E-S (5’-CCTACGTCTTTGATGGAGAGCCTCCGGAATTCAAAAGG, SEC ID Nº 461) y PhoK82E-AS (5’-CCTTTTGAATTCCGGAGGCTCTCCATCAAAGACG, SEC ID Nº 462). Pho1M tiene la mutación K82E y la mutación L103E efectuada con PhoL103E-S (5’-GAGAAGAGGCAGAAGAAAATGGAAAGAAGC, SEC ID Nº 463) y PhoL103E-AS (5’-GCTTCTTTCCATTTTTCTTCTGCCTCTTCTC, SEC ID Nº 464). Pho1M tiene las mutaciones K82E and L103E y la mutación A110E efectuadas con PhoA110E-S (5’-GGAAAGAAGCTCCAGAGAAGGGAAACCTGGAGG, SEC ID Nº 465) y PhoA110E-AS (5’-CCTCCAGGTTTCCCTTCTCTAGAGCTTCTTTCC, SEC ID Nº 466). Pho4M tiene las mutaciones K82E, L103E y A110E y la mutación N113E efectuadas con PhoN113E-S (5’-GCTCTAGAGAAGGGAGAACT-GGAGGAAGCTAGG, SEC ID Nº 467) y PhoN1 13E-AS (5’-CCTAGCTTCCTCCAGTTCTCCCTTCTCTAGAGC, SEC ID Nº 468).

La secuencia del marco de lectura abierto de Pfu1M es SEC ID Nº 469; la secuencia de aminoácidos de Pfu1M es SEC ID Nº 470. La secuencia del marco de lectura abierto de Pfu2M es SEC ID Nº 471; la secuencia de aminoácidos de Pfu2M es SEC ID Nº 472. La secuencia del marco de lectura abierto de Pfu3M es SEC ID Nº 473; la secuencia de aminoácidos de Pfu3M es SEC ID Nº 474. La secuencia del marco de lectura abierto de Pfu4M es SEC ID Nº 475; la secuencia de aminoácidos de Pfu4M es SEC ID Nº 476. La secuencia del marco de lectura abierto de Pho1M es SEC ID Nº 477; la secuencia de aminoácidos de Pho1M es SEC ID Nº 478. La secuencia del marco de lectura abierto de Pho2M es SEC ID Nº 479; la secuencia de aminoácidos de Pho2M es SEC ID Nº 480. La secuencia del marco de lectura abierto de Pho3M es SEC ID Nº 481; la secuencia de aminoácidos de Pho3M es SEC ID Nº 482. La secuencia del marco de lectura abierto de Pho4M es SEC ID Nº 483; la secuencia de aminoácidos de Pho4M es SEC ID Nº 484.

Mutación que afecta a la interacción del extremo 3’

Las mutaciones en la posición Y33 de la FEN1 de Pfu se realizaron porque se pensó que el aminoácido interaccionaba con el extremo 3’ del oligonucleótido INVASOR. Para comprobar dicha hipótesis, se analizaron las enzimas FEN 1 Pfu, PfuY33F, y PfuY33A sobre los oligonucleótidos INVASOR con diferentes extremos 3’ para determinar el efecto de las mutaciones sobre la escisión de dichos sustratos. El oligonucleótido diana-sonda combinado 203-15-2 (5’-TET-AAAACGCTGTCTCGCTGAAAGCGA-GACAGCGAAAGACGCTCGT, SEC ID Nº 485) se usó con oligonucleótidos INVASOR que solo difieren en su extremo 3’. Los diferentes oligonucleótidos INVASOR son 203-15-3 (5’-ACGAGCGTCTTT, SEC ID Nº 486), 203-15-4 (5’-AC-GAGCGTCTTTA, SEC ID Nº 487), 203-15-5 (5’-ACGAGCGTCTTTT, SEC ID Nº 488), 203-15-6 (5’-AC-GAGCGTCTTTG, SEC ID Nº 489), 203-15-7 (5’-ACGAGCGTCTTTC, SEC ID Nº 490), 203-15-8 (5’-AC-GAGCGTCTTT-didesoxiC, SEC ID Nº 491) 203-15-9 (5’-ACGAGCGTCTTTC-PO4, SEC ID Nº 492), y 203-15-10 (5’-ACGAGCGTCTTT-dribosa, SEC ID Nº 493). Las reacciones de 10 μl contenían 203-15-2 2 μM y 2 μM de uno de oligonucleótidos INVASOR (anterior), MOPS 10 mM, pH 7,5, TWEEN 20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, MgCl2 4 mM y enzima 0,35 nM (FEN1 de Pfu y FEN1 de PfuY33F) o enzima 3,5 nM (FEN1 de PfuY33A) enzyme. Las reacciones se realizaron a 50ºC durante entre 10 a 30 minutos. Las

reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de formamida al 95% y violeta de metilo al 0,02 %. 1 μl de la

mezcla se cargó en un gel de acrilamida al 20 % desnaturalizante y se somete a electroforesis durante 15 minutos o hasta alcanzar una buena separación entre la sonda escindida y sin escindir. Los geles se exploran usando un aparato escáner de geles para fluorescencia FMBIO y las bandas se cuantifican con software de análisis FMBIO. Las velocidades de escisión se determinaron a partir del porcentaje de sonda escindida. La velocidad de la escisión se define como el número de oligonucleótidos sonda-diana escindidas por minuto por enzima. Aunque la velocidad de escisión se reduce para Y33F de Pfu y más para Y33A para Pfu no se observa ningún cambio de la especificidad.

La velocidad de escisión frente al extremo 3’ se representa para las 3 enzimas (Figura 148).

EJEMPLO 66

Ensayo de actividad para nucleasas FEN1 clonadas

La prueba del ensayo INVASOR se realizó usando una combinación de oligonucleótido diana y cadena arriba (INVASOR) y un gran excesomolar de oligonucleótido sonda marcado (como se representa en la Figura 141A). Las reacciones de diez μl contenían MOPS 10 mM, (pH 7,5), TWEEN 20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, ARNt 20 ng/μl (Sigma), MgCl2 4 mM, 100 ng de enzima, oligonucleótido sonda marcado 203-91-01 (5’(Tet)TTTTCAACTGCCGTGA, SEC ID Nº 403) y oligonucleíotido INVASOR-diana 0,2 mM 203-91-04 (5’-TCACG-GCAGTTGGTGCGCCTCGGAACGAGGCGCACA, SEC ID Nº 404),. Las reacciones se fijaron añadiendo todos los componentes a los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos en un baño de agua helada. Las reacciones se iniciaron colocando la placa de 96 pocillos en un ciclador térmico de gradiente precalentado (Eppendorf Mastercycler) y se incubaron a la temperatura fijada durante 20 minutos. Después, la placa de 96 pocillos se volvió a introducir en el baño de agua para detener las reacciones y se añadieron 10 μl de mezcla de terminación (formamida al 95 %, EDTA 20 mM, violeta de metilo al 0,05 %). 1 μl de cada reacción se cargó en un gel de acrilamida al 20% desnaturalizante. Tras la electroforesis, los geles se visualizaron usando un cisro de imágenes FMBIO (Hitachi) y se cuantificaron con el software de análisis FMBIO. Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 142.

La escisión de una “estructura de X” se representa en la Figura 141B puede proporcionar una fuente de señal de

fondo en las reacciones de escisión invasiva secuencial de la presente invención, por tanto, es deseable determinar el nivel de actividad que tienen las enzimas en la escisión de tal estructura. Las reacciones de diez μl sobre el sustrato de estructura X contenían MOPS 10 mM, (pH 7,5), TWEEN 20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, ARNt 20 ng/μl (Sigma), MgCl2 4 mM, 100 ng de enzima y 203-81-02 marcado 2 μM (5’(Tet)TTTTCAACTGCTTAGAGAATCTAAGCAGTTGGTGCGCCTCGTTAA-NH2, SEC ID Nº 405) y diana 594-09-01 2 μM (5’-AACGAGGCGCACATTTTTTTT; SEC ID Nº 406). Las reacciones se realizaron como se ha descrito anteriormente a excepción de que la incubación a la temperatura de reacción se llevó a cabo durante 60 minutos. Las muestras se sometieron a electroforesis y se analizaron como se ha descrito en lo que antecede. Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 143.

Juntos, estos ensayos permiten la caracterización de las actividades de la escisión de las enzimas FEN y otras

nucleadas 5’ y de cualquier enzima nueva que se sospeche que es capaz de escindir una estructura de escisión

invasiva.

Evaluación de enzimas FEN1 quiméricas y mutantes

Para la evaluación de enzimas quiméricas se realizaron ensayos convencionales para medir el rendimiento y la especificidad de las enzimas. El ensayo de la prueba con INVASOR contiene MOPS 10 mM, pH 7,5, TWEEN 20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, MgCl2 4 mM, oligonucleótido diana-INVASOR 0,5nM 594-12-1 (5’-Biotina-TTTTTCACGGCAGTTGGTGC-GCCTCG-GAACGAGGCGCACA, SEC ID Nº 517), el oligonucleótido sonda 203-911 1 μM (5’-Tet-TTTTCAACTGCCGTGA, SEC ID Nº 518), estreptavidina 2 nM y enzima 256 nM. Las reacciones de 10 μl se reaizan a 59 ºC durante entre 5 a 60 minutos en función de la enzima. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 μl de formamida al 95% y violeta de metilo al 0,02 %. 1 μl de la mezcla se carga en un gel de acrilamida al 20 % desnaturalizante y se somete a electroforesis durante 15 minutos o hasta alcanzar una buena separación entre la sonda escindida y sin escindir. Los geles se exploran usando un aparato escáner de geles para fluorescencia FMBIO y las bandas se cuantifican con software de análisis FMBIO. Las velocidades de escisión se determinan a partir del porcentaje de sonda escindida. La velocidad de la escisión para el sustrato INVASOR se define como el número de moléculas sonda escindidas por molécula diana por minuto. En la Tabla 5, más adelante, las velocidades de escisión para las enzimas mutantes se comparan con las velocidades de escisión para la enzima FEN1 de Pfu sin modificar en el ensayo INVASOR y los sustratos de estructura X.

El sustrato de estructura X se usa para determinar la cantidad de escisión de fondo que llevará a cabo una enzima en una reacción con INVASOR. Imita la estructura creada por la sonda primaria sin cortar y el casete FRET secundario en la reacción cuadrada INVASOR. Las reacciones de estructura X contienen MOPS 10 mM, pH 7,5, TWEEN 20 al 0,05%, NP-40 al 0,05%, MgCl2 4 mM, oligonucleótido diana-sonda 2 μM 203-81-2 (5’-TET-TTTTCAACTGCTTAGAGAA-TCTAAGCAGTTGGT-GCGCCTCGTTAA-NH2, SEC ID Nº 494), el oligonucleótido sonda 203-91-2 2 μM (5’-AACGAGGCGCACATT, SEC ID Nº 495), y enzima 4 a 256 nM. Las reacciones de 10 μl se reaizan a 59 ºC durante entre 3 a 30 minutos en función de la enzima. Las reacciones se detuvieron mediante la

adición de 10 μl de formamida al 95% y violeta de metilo al 0,02 %. 1 μl de la mezcla se carga en un gel de

acrilamida al 20 % desnaturalizante y se somete a electroforesis durante 15 minutos o hasta alcanzar una buena separación entre la sonda escindida y sin escindir. Los geles se exploran usando un aparato escáner de geles para fluorescencia FMBIO y las bandas se cuantifican con software de análisis FMBIO. Las velocidades de escisión se determinan a partir del porcentaje de sonda escindida. La velocidad de la escisión para el sustrato estructura X se define como el número de moléculas sonda-diana escindidas por molécula de enzima.

TABLA 5

Velocidades de escisión de las enzimas FEN1 modificadas sobre sustratos INVASOR y estructura X (respecto a las velocidades para FEN1 de Pfu sin modificar)

Enzima: Ensayo INVASOR relativo Velocidad de escisióna Velocidad de escisión relativa de la estructura Xb

Pfu FEN1: 1 1

Pho FEN1: 1,6 120

Pfu1M FEN1: 0,83 0,85

Pfu2M FEN1: 1,4 3

Pfu3M FEN1: 1,8 4,9

Pfu4M FEN1: 2,2 62

Pho1M FEN1: 1,1 18

Pho2M FEN1: 1,6 31

Pho3M FEN1: 0,95 6,6

Pho4M FEN1: 1,3 2,2

Mja FEN1: 1,9 203

Afu FEN1: 0,52 0,5

MPM FEN1: 0,14 0,1

PMP FEN1: 2,4 1,37

MAM FEN1: 0,03 0,07

PAP FEN1: 0,56 0,52

Pfu+M4 FEN1: 0,05 0,28

Mja+P16 FEN1: 1,2 59

Pfu Y33F FEN1: 0,96 N.D.

Pfu Y33A FEN1: 0,05 N.D.

a La velocidad de escisión del ensayo INVASOR es relativa a la velocidad de escisión de la enzima FEN1 de Pfu a la que se le ha dado un valor de 1. bLa velocidad de escisión de la estructura X es relativa a la velocidad de escisión de la enzima FEN1 de Pfu a la que se le ha dado un valor de 1. ND -no determinado.

EJEMPLO 67 Detección selectiva de alto rendimiento para la selección de enzimas candidatas

Para la detección selectiva de alto rendimiento se escogen colonias individuales y se inoculan en 1 ml de caldo Luria-Bertani (LB) suplenentado con 100 g/ml de ampicilina e isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG) en placas de 96 pocillos de fondo profundo. Los cultivos se cultivan durante aproximadamente 20 horas con agitación enérgica 37 ºC. Las placas de cultivo se cortan después en al robot automático (p. ej., como se repreenta en la Figura 147) para detección selectiva.

Las placas de ensayo se establecen del siguiente modo. Para cada cultivo durante la noche se crean pocillos de ensayo, dos sin diana y 1 con diana (descritos más adelante). De este modo, cada placa de 96 pocillos para cultivo durante la noche genera una placa de 96 pocillos de lisados y una placa de 384 pocillos de ensayo. Los lisados se pueden someter a detección selectiva en condiciones adicionales, por ejemplo en presencia de sales, o desnaturalizntes tales como guanidina clorhidrato, ambos conocidos porque inhiben las enzimas de escisión de la presente invención. En este caso, cada placa de 96 pocillos de lisados podrían dar 2 o más placas de ensayo.

Las etapas siguientes se suelen realizar con un robot en una placa de 96 pocillos (lisis celular) o de 384 pocillos (ensayo de actividad) (p. ej., como se representa en la Figura 147).

Lisis celular

75 μl del cultivo durante la noche se mezclam 100 μl de TWEEN 20 al 0,02%,1 mg/ml de lisozima y se incubó a

temperatura ambiente durante 15 minutos. Las placas de lsisis e calientan después a 83 C for 3 minutos y las placas se centrifugan 1 1100 x G durante 5 minutos a temperatura ambiente para obtener el residuo celular.

Ensayo sobre las dianas de ADN

Se crearon los plásmidos que contienen Factor II mutante y el Factor V de tipo silvestre para usar en ensayos de alto rendimiento. El plásmido diana mutante de factor II contiene un inserto de 345 pares de bases de un factor II mutante (gen de la protrombina humana; SEC ID Nº 510) insertda en pCR Topo2.1 (Invitrogen). El plásmido diana silvestre factor V contiene un inserto de 220 pares de bases (SEC ID Nº 509) Ddel gen del factor VI humano de tipo silvestre insertado en pCR-Topo2.1 (Invitrogen). Para analizar los ensayos celulares, se añadieron , 5 μl del lisado celular a 10 μl del tampón, los oligonucleótidos sonda, los oligonucleótidos SECUENCIADOR, los oligonucleótidos FRET en una mezcla diana. La concentración final de los componentes del tampón es 3,5% PEG, MOPS 10 mM , pH 7,5, MgCl2 14 mM Las reacciones de 15 μl contienen 0,33 mM de cada uno de la sonda Fre de Factor II ((5’-F1-TCT-Z28-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACGTCCGTGGCCT-Hex, SEC ID Nº 516) sonda Fret de Factor ((5’-F1-TCT-Z28-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACGTCCGTGGCCT-Hex, SEC D Nº 513) 0,66 mM de cada uno de la sonda del factor V de tipo silvestre 23-445 (5’-F1-TCT-Z28-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACGTCCGTGGCCT-Hex, SEC ID Nº 511) y la sonda mutante del factor II 23-215 (5’-AGGCCACGGACGAAGCCTCAATGCTCC-Hex, SEC ID Nº 514) Y oligonucleíotido INVASOR del Fcator V 66 nM 23-200 (5’-TCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGACC, SEC ID Nº 512) y un oligonucleótiod INVASOR del factor II 23-415 (5’-AGGCCACGGACGAAGCCTCAATGCTCC-Hex, SEC ID Nº 515). Para la reacción se usan entre 20 y 100 pg de cada lásmido diana (descrito anteriormente).

Después de mezclar los reactivos, las placas de 384 pocillos se incuban a 63 ºC durante 1 horas, tras lo cual desaparece la señal en un lector de placas de fluorescencia CYTOFLUOR. Los parámetros de la longitud de onda sin 485 nm de excitación y 530 nm de emisión para la sonda que contiene fluoresceína y excitación a 560 nm t emisión a 620 nm para la sonda que contiene colorante REDMOND RED. Las mediciones de fluorescencia se comparan con las mediciones usando enzimas no modificados en las mismas condiciones de reacción. Las enzimas que muestran un incremento de la señal en un conjunto concreto de condiciones de reacción (es decirm más fluorescencia ) y se consideran para el análisis adicioinal. En general, las enzimas mutantes muestran incrementos de al menos 20 al 50 % que se purifican después para análisis adicionales.

Ensayo sobre las dianas de ARN

Para analizar las actividades de las enzimas sobre las dianas de ARN, se usan conjuntos de sondas de ensayo INVASOR para la detección del ARNm de la ubiquitina humana y para la interleucina 8 humana (IL-8). Para analizar

los ensayos celulares, se añadieron , 5 μl del lisado celular a 10 μl del tampón, los oligonucleótidos sonda, los

oligonucleótidos INVASOR, los oligonucleótidos FRET en una mezcla diana. La concentración final de los componentes tamoón en la reacción primaria son PEG al 4 %, MgSO4 12,5mM, MOPS 10mM, pH 7,5, KCl 100mM, Tween 20 al 0,05% y NP-40 al 0,05%. Las reacciones primarias se incuban a 60 ºC durante 1 hora. Después, las reacciones secundarias se inician mediante la adición de la mezcla de reacción secundaria que comprenden los oligonucleótidos de detención y los conjuntos de oligonucleótido sonda y diana secundarios. Las concentraciones finales de los componentes tampón en la reacción secundaria son PEG al 2,67%, MgSO4 6,5mM, MOPS 6.67mM, pH 7,5, KCl 6.67mM, Tween 20 al 0,033% y NP-40 al 0,033%. Las reacciones secundarias se incuban a 60 ºC durante 1 hora, tras lo cual la señal selle en un lector de placas de fluorescencia CYTOFLUOR. Los parámetros de la longitud de onda sin 485 nm de excitación y 530 nm de emisión para la sonda que contiene fluoresceína y excitación a 560 nm t emisión a 620 nm para la sonda que contiene colorante REDMOND RED. Las mediciones de fluorescencia se comparan con las mediciones usando enzimas no modificados en las mismas condiciones de reacción. Las enzimas que muestran un incremento de la señal en un conjunto concreto de condiciones de reacción (es decirm más fluorescencia ) y se consideran para el análisis adicioinal. En general, las enzimas mutantes que muestran incrementos de al menos 20 al 50 % se purifican después para análisis adicionales.

Las reacciones primarias comprenden el oligonucleótido INVASOR de la ubiquitina Hu (514) 0,5 μM, 5’ CCTTCCTTATCCTGGATCTT-GGCA, SEC ID Nº 496), el oligonucleótido sonda de la ubiquitina Hu (1 μM, 5’ CGCCGAGATCACCTTTACATTTTCTATCGT-NH2, SEC ID Nº 497), la sonda de la Hu IL-8 (1 μM, 5’ CCGTCACGCCTCCTCTCAGTTCT-NH2, SEC ID Nº 502), la sonda apilador de la Hu IL-8 (1 μM, todas las bases 2’O-metil, 5’ TTGATAAATTTGGGGTGGAAAGGTTTGGA, SEC ID Nº 503), el oligonucleótido INVASOR de Hu IL-8 (0,5 μM, 5’ GTGTGGTCCACTCTCAATCAA, SEC ID Nº 504). Las aletas en 5’ escindidas de la reacción primaria son la aleta en 5’ Hu ubiquitina (5’ CCGCCGAGATCACC, SEC ID Nº 500) y la aleta en 5’ Hu IL-8 (5’-CCGTCACGCCTCT, SEC ID Nº 507). Al final de la reacción primaria, se añade la mezcla de reacción secundaria que comprende el oligonucleótido de detención de Hu ubiquitina (2,67 μM, todas las bases 2’-O-metil, 5’ ACGATAGAAAATGTAAAGGTGATC, SEC ID Nº 498), la sonda secundaria de ubiquitina Hu (0,67 μM, colorante rojoCTC-Z28-TTCTCAGTGCG, SEC ID Nº 499), la sonda secundaria de Hu ubiquitina (0,1 μM, los últimos 3 nt en el extremo 3’ son 2’-O-metil; 5’ CGCAGTGAGAATGAGGTGATCTCG-GCGGU, SEC ID Nº 501), el oligonucleótido de detención Hu-IL-8 (2,67 μM, todas las baes 2’-O-metil, 5’ AGAACTGAGAGGAGGC, SEC ID Nº 505), la sonda secundaria de Hu-IL8 (0,67 μM, F1-CAC-Z28-TGCTTCGTGG, SEC ID Nº 506), la diana secundaria de Hu IL-8 (0,1 μM, los últimos 3 nt en el extremo 3’ son bases 2’-O-metil; 5’ CCAGGAAGCAAGTGGAGGCGT-GACGGU, SEC ID Nº 508).

EJEMPLO 68

Detección del gen pol del citomegalovirus humano

El Ejemplo 48 demostró el uso del ensayo de escisión invasiva para detectar secuencias de citomegalovirus humano en un fondo de ADN genómico humano. En este ejemplo, se demostrará otra realización de la reacción de escisión múltiple invasiva para la detección de secuencias de citomegalovirus humano. El Ejemplo 48 usó un oligonucleótido INVASOR y sonda primario marcado dirigidos a la región 3104-3061 del HCMV. En este ejemplo se apuntó a las bases 2302-2248 del genoma del HCMV. Como en los ejemplos previos, se usó un casete FRET para generar señal en presencia del ADN diana.

Los oligonucleótidos INVASOR y sonda se diseñaron como se ha descrito anteriormente para detectar el gen de la polimerasa de HCMV (SEC ID Nº 407 y 408 respectivamente; el casete FRET es la SEC ID Nº 409. Los oligonucleótidos se representan en la Figura 144. La secuencia del HCMV/diana detectada mediante este conjunto de sondas es la SEC ID Nº 410.

El ADN genómico viral se adquirió en Advanced Biotechnologies, Inc. (Columbia, MD). El personal de Advanced Biotechnologies estimó (pero no certificó) una concentración del ADN de 170 atomol (1 x 108 copias) por microlitro. La madre viral se diluyó en ADN genómico humano 10ng/μl hasta concentraciones finales de 45,7, 137,2, 411,5 y 1234,6 copias de virus por microlitro. Las reacciones se realizaron en MJ 96 well MULTIPLATE de 96 pocillos (MJ Research MLL-9601) por triplicado en un volumen final de 15 μl. Cada reacción comprendió MOPS 12 mM (pH 7,5), MgCl212 mM, 0,5 pmol del oligonucleótido INVASOR, 10 pmol de sonda primaria sin marcar, 5 pmol de casete One-Piece FRET, 0, 457, 1372, 4115 o 12346 copias del ADN del virus de CMV, 100 ng de ADN genómico humano y 60ng de FEN1 de Ave y agua hasta un volumen final de 2 μl MOPS, oligonucleótido INVASOR, agua, ADN del virus de CMV y ADN genómico humano se combinaron, cubrieron con cera líquida CHILLOUT y se desnaturalizaron durante 5 minutos a 95°C. Después, las reacciones se enfriaron hasta 20 ºC y se añadieron MgCl2, sonda primaria sin marcar, casete FRET y enzima AveFEN1 debajo de la capa Chill-out. La reacción se mezcló pipeteando arriba y abajo 5-10 veces, teniendo precaución para que quede transparente la capa CHILLOUT. Después, las reacciones se incubaron durante 4 horas a 65 ºC y las placas se leyeron directamente en un lector de placas Cytoflour usando los parámetros siguientes: Excitación = 485/20, Emisión = 530/25, Ganancia = 40 a 10 lecturas/pocillo.

Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 145, con el número de copias del ADN diana indicados sobre el eje horizontal y las unidades de fluorescencia indicadas en el eje vertical. Estos resultados indican detección sensible de HCMV usando el formato FRET de escisión invasiva secuencial.

La selección de oligonucleótidos para ácidos nucleicos diana distintos a los analitos mostrados aquí (p. ej., la composición y la longitud del oligonucleótido) y laoptimización de las condiciones de reacción de escisión de acuerdo con los modelos proporcionados en el presente documento siguen procedimientos rutinarios y la práctica común bien conocido para los expertos en biología molecular.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> KAISER, Michael LYAMICHEV, Victor I. LYAMICHEVA, Natasha

<120> Endonucleasas FEN

<130> FORS-06647

<140> Pendiente de asignación

<141> 2001-11-15

<160> 518

<170> Patent In Ver. 2.0

<210> 1

<211> 2506

<212> ADN

<213> Thermus aquaticus

<400> 1

<210> 2

<211> 2496

<212> ADN

<213> thermus flavus

<400> 2

<210> 3

<211> 2504

<212> ADN

<213> Thermus thermophilus

<400> 3

<210> 4 5 <211> 832

<212> PRT

<213> Thermus aquaticus

10 <400> 4

<210> 5

<211> 831

<212> PRT

<213> thermus flavus

<400> 5

<210> 6

<211> 834

<212> PRT

<213> Thermus thermophilus

<400> 6

5 <210> 7

<211> 2502

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 7

<210> 8

<211> 833 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 8

<210> 9

<211> 1647

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 9

<210> 10

<211> 2088 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 10

<210> 11

<211> 962 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética 10

<400> 11 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 12

<210> 13

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 13 acgaattcg gggatgctgc ccctctttga gcccaa 36

<210> 14

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 14 gtgagatcta tcactccttg gcggagagcc agtc 34

<210> 15

<211> 91

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 15

<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 16 taatacgact cactataggg: 20

<210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 17 gaattcgatt taggtgacac tatagaa: 27

<210> 18 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 18 gtaatcatgg tcatagctgg tagcttgcta c: 31

<210> 19 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 19 ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc ctaccttggt ag: 42

<210> 20 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 20 ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc: 30

<210> 21 <211> 2502 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 21

<210> 22 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 22 gatttaggtg acactatag: 19

<210> 23 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 23 acacaggtac cacatggtac aagaggcaag agagacgaca cagcagaaac: 50

<210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 24

<210> 25

<211> 969

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 25 10

<210> 26

<211> 948

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 26

<210> 27

<211> 206

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 27 <220> <400> 33 <210> 37

<210> 28 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial ‘

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 28 aacagctatg accatgatta c: 21

<210> 29 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 29 gttctctgct ctctggtcgc tgtctcgctt gtgaaacaag cgagacagcg tggtctctcg: 60

<210> 30 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 30 cgagagacca cgctg: 15

<210> 31 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 31 cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tc: 52

<210> 32 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 32 agaaaggaag ggaagaaagc gaaagg: 26

<210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

gacggggaaa gccggcgaac g: 21

<210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 34 gaaagccggc gaacgtggcg: 20

<210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 36 ggcgaacgtg gcgagaaagg a: 21

<210> 36 <211> 4.2 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 36 cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gc: 42

<211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 37 cctttcgctc tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gc: 42

<210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> base modificada <222> (8) <223> The A residue at this position is 2’-O-methyladenosine.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 38 agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggt: 27

<210> 39 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 39

gccggcgaac gtggcgagaa agga: 24

<210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 40 g gtttttctt tgaggtttag: 20

<210> 41 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 41 gcgacactcc accatagat: 19

<210> 42 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 42 ctgtcttcac gcagaaagc: 19

<210> 43

<211> 19

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 43 gcacggtcta cgagacctc: 19

<210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 44 taatacgact cactataggg: 20

<210> 45 <211> 337 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 45

<210> 46

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> base modificada

<222> (18)

<223> The N at this position indicates the presence of a fluorescein dye on an abasic linker.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 46 ccggtcgtcc tggcaatncc 20

<210> 47

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 47 gtttatccaa gaaaggaccc ggtc 24

<210> 48

<211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 48 cagggtgaag ggaagaagaa agcgaaaggt: 30

<210> 49 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética <400> 49 cagggggaag ggaagaagaa agcgaaaggt: 30

<210> 50 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> base modificada <222> (1)..(2) <223> The T residues at positions 1 and 2 are amino modified T residues.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 50 ttcttttcac cagcgagacg gg: 22

<210> 51 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 51 attgggcgcc agggtggttt tt: 22

<210> 52 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 52 cccgtctcgc tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca atacgcaaac cgc: 53

<210> 53 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 53 gaattcgatt taggtgacac tatagaatac a: 31

<210> 54 <211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 54 cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gc: 42

<210> 55 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 55 gccggcgaac gtggcgagaa agga: 24

<210> 56 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 56 cagaaggaag ggaagaaagc gaaagg: 26

<210> 57 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 57 cagggggaag ggaagaaagc gaaagg: 26

<210> 58 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 58 cagggtacag ggaagaaagc gaaagg: 26

<210> 59 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 59 gggaaagtcc tcggagccgc gcgggacgag cgtgggggcc cg: 42

<210> 60 <211> 963 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> CDS <222> (1)..(960)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 60

<210> 61

<211> 320

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 61

5: <210> 62 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética <400> 62 cgatctcctc ggccacctcc 20

15: <210> 63 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 63 ggcggtgccc tggacgggca: 20

<210> 64 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 64 ccagctcgtt gtggacctga: 20

<210> 65 <211> 2505 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> CDS <222> (1)..(2499)

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 65

<210> 66

<211> 833

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 66

<210> 67

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 67 tggctatagr ccagggccac

<210> 68

<211> 2505

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2499)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 68

<210> 69

<211> 833

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 69

<210> 70

<211> 2505 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2499)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

15 <400> 70

<210> 71

<211> 833

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 71

<210> 72

<211> 25

<212> ADN 263

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 72 gggataccat gggagtgcag tttgg: 25

<210> 73 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 73 ggtaaatttt tctcgtcgac atcccac: 27

<210> 74 <211> 981 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> CDS <222> (1)..(978)

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 74

<210> 75

<211> 326

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 75

<210> 76 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 76 gaggtgatac catgggtgtc c: 21

<210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 77 gaaactctgc agcgcgtcag: 20

<210> 78 <211> 1023

<212> ADN

<213> Pyrococcus furiosus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1020)

<400> 78

<210> 79

<211> 340

<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 79

<210> 80 <211> 25 <212> ADN <213> Pyrococcus wosei

<400> 80 gataccatgg gtgtcccaat tggtg: 25

<210> 81 <211> 37 <212> ADN <213> Pyrococcus wosei

<400> 81 tcgacgtcga cttatctctt gaaccaactt tcaaggg: 37

<210> 82 <211> 20 <212> ADN <213> Pyrococcus wosei

<400> 82 agcgagggag aggcccaagc: 20

<210> 83 <211> 21 <212> ADN <213> Pyrococcus wosei

<400> 83 gcctatgccc tttattcctc c: 21

<210> 84 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 84 tggtcgctgt ctcgctgaaa gcgagacagc gtg: 33

<210> 85 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 85 tgctctctgg tcgctgtctg aaagacagcg: 30

<210> 86 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<223> El residuo en esta posición es un espaciador que contiene un marcador de fluoresceína.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 86 nagaaaggaa gggaagaaag cgaaagg 27

<210> 87

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc difference

<222> (27)

<223> El residuo en esta posición es un espaciador portador de un colorante Cy3.

<220>

<221> base modificada

<222> (28)

<223> El residuo en esta posición es didesoxicitidina.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 87 agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggnc 28

<210> 88

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> base modificada

<222> (24)

<223> El residuo en esta posición es didesoxicitidina.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 88 gccggcgaac gtggcgagaa aggc 24

<210> 89

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<221> misc_difference

<222> (28)

<220> <221> base modificada <222> (29) <223> El residuo en esta posición es didesoxicitidina.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 89 nagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggnc: 29

<210> 90 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 90 aaaattcctt tctctttgcc ctttgcttcc: 30

<210> 91 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 91 ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaa 26

<210> 92

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 92 ggaaagccgg cgaacgtggc gaga 24

<210> 93

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<221> misc_difference

<222> (28)

<223> El residuo en esta posición es un espaciador portador de un grupo biotina.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 93 nagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggnt 29

<210> 94

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<221> base modificada

<222> (2)..(3)

<223> Los residuos en estas posiciones tienen un grupo amino añadido.

<220>

<221> misc_difference

<222> (24)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 94 nttccagagc ctaatttgcc agtna 25

<210> 95

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> base modificada

<222> (1)

<223> The residue at this position has a 5’ TET-label.

<220>

<221> misc difference

<222> (23)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 95 ttccagagcc taatttgcca gtna 24

<210> 96

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial,

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 96 cttaccaacg ctaacgagcg tcttg 25

<210> 97 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 97 cccgtctcgc tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca ata: 43

<210> 98 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 98 tattgggcgc catggtggtt ttt: 23

<210> 99 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (10) <223> El residuo en esta posición esa 5-nitroindol.

<220> <221> misc_difference <222> (16) <223> El residuo en esta posición esa 5-nitroindol.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 99 tattgggcgn cagggnggtt ttt: 23

<210> 100 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (10) <223> "El residuo en esta posición es un 5-nitroindol.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 100 tattgggcgn catggnggtt ttt: 23

<210> 101 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (16) <223> El residuo en esta posición esa 3-nitropyrrole.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 101 tattgggcgc cagggnggtt ttt: 23

<210> 102 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (16) <223> El residuo en esta posición es un grupo de 3-nitropirrol.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 102 tattgggcgc catggnggtt ttt: 23

<210> 103

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<223> El residuo en esta posición es a 2’desoxicitosina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (2)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxitimidina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (3)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxiguanosina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (4)..(5)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’desoxiadenosina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220> <221> misc_difference

<222> (6)

<220>

<221> misc_difference

<222> (7)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxiadenosina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (8)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxitimidina 5’ -O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc difference

<222> (9) .. (10)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 103 ctgaatataa acttgtggta gttggagctg gtgccgtagg caagagtgcc ttgacg 56

<210> 104

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxicitosina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (2)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxitimidina 5 ’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (3)

<220>

<221> misc_difference

<222> (4) .. (5)

<220>

<221> misc_difference

<222> (6)

<220>

<221> misc_difference

<222> (7)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxiadenosina 5’ -O- (1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (8)

<220>

<221> misc_difference

<222> (9) .. (10)

<223> The residues at these positions are a 2’desoxiadenosina 5’ -O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 104 ctgaatataa acttgtggta gttggagctg gtgacgtagg caagagtgcc ttgacg 56

<210> 105

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<221> misc_difference

<222> (2)

<220>

<221> misc_difference

<222> (3)

<220>

<221> misc_difference

<222> (4)

<220>

<221> misc_difference

<222> (5) .. (6)

<223> The residues at these positions are 2 ’ desoxiadenosina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (7) .. (8)

<223> The residues at these positions are 2 ’ desoxiguanosina5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (9)

<223> El residuo en esta posición esa 2’desoxicitosina 5’ -O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 105 gctcaaggca ctcttgccta cga 23

<210> 106

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<223> El residuo en esta posición es un espaciador portador de un marcador de Cy3 amidita.

<220>

<221> misc_difference

<222> (2) .. (3)

<223> Los residuos en estas posiciones tienen un grupo amino añadido.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 106 nttcaccag 9

<210> 107

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<221> misc_difference

<222> (2)

<220>

<221> misc difference

<222> (3) .. (4)

<223> The residues at these positions are a 2’desoxicitosina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (5) .. (6)

<220>

<221> misc_difference

<222> (7)

<220> <221> misc_difference

<222> (8)

<220>

<221> misc_difference

<222> (9)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 107 ctccaactac cacaagttta tattcag 27

<210> 108

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 108 cgagagacca cgct 14

<210> 109

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (14)

<223> El residuo en esta posición contiene una ribosa abásica.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 109 cgagagacca cgct 14

<210> 110

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (14)

<223> El residuo en esta posición contiene una ribosa abásica con un grupo 3’fosfato.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 110 cgagagacca cgct 14

<210> 111

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (15)

<223> El residuo en esta posición contiene un grupo fosfato en 3’.

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 111

cgagagacca cgctg

<210> 112

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<221> misc_difference

<222> (2)

<220>

<221> misc_difference

<222> (3) .. (4)

<220>

<221> misc_difference

<222> (5)

<220>

<221> misc_difference

<222> (6)

<220>

<221> misc_difference

<222> (7) .. (8)

<223> The residues at these positions are a 2’desoxitimidina 5’-O-(1-Tiomonofosfato).

<220>

<221> misc_difference

<222> (9)

<220>

<221> misc_difference

<222> (10)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 112 gtaatcttac caacgctaac gagcgtcttg 30

<210> 113

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1) .. (2)

<220>

<221> misc difference

<222> (3)

<220>

<221> misc_difference

<222> (4) .. (5)

<220>

<221> misc_difference

<222> (6) .. (8)

<220>

<221> misc_difference

<222> (9)

<220>

<221> misc_difference

<222> (10)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 113 cctaatttgc cagttacaaa ataaacagcc c 31

<210> 114

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<221> misc_difference

<222> (2) .. (3)

<223> Los residuos en estas posiciones tienen un grupo amino añadido.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 114 nttccagag: 9

<210> 115 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 115 ttttccagag cctaatgaaa ttaggctctg gaaagacgct cgtg: 44

<210> 116 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 116 aacgagcgtc tttg: 14

<210> 117 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 117 aacgagcgtc attg: 14

<210> 118 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 118 ttttttttta attaggctct ggaaagacgc tcgtgaaacg agcgtctttg: 50

<210> 119 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 119 ttttccagag cctaatg: 17

<210> 120 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (1) <223> The residue at this position has a TET label.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 120 ccggtcgtcc tgg: 13

<210> 121 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 121 caattccggt gtactcaccg gttcc: 25

<210> 122 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 122 ccggtcgtcc tggcaa: 16

<210> 123 <211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 123 tgttttgacc tccatagaag accctatagt gagtcgtatt aatttcg: 47

<210> 124 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 124 cgaaattaat acgactcact ata: 23

<210> 125 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 125 cgaaattaat acgactcact atacccagaa: 30

<210> 126 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 126 cgaaattaat acgact: 16

<210> 127 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 127 cgaaattaat acg: 13

<210> 128 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética <400> 128 cgaaattaat ac: 12

<210> 129 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 129 cactataggg tcttctatgg aggtc: 25

<210> 130 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 130 actcactata gggtcttcta tggaggtc: 28

<210> 131 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 131 gactcactat agggtcttct atggaggtc: 29

<210> 132 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 132 cgaaattaat acgcagtatg ttagcaaacg: 30

<210> 133 <211> 30

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 133 gaactggcat gattaagact ccttattacc: 30

<210> 134 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 134 gaactggcat gattaagact ccttattaa: 29

<210> 135 <211> 326 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii

<400> 135

<210> 136

<211> 340

<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 136 305

<210> 137

<211> 380

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 137

<210> 138

<211> 378

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 138

<210> 139

<211> 382

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 139

<210> 140

<211> 387

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 140

<210> 141

<211> 488

<212> PRT

<213> Shizosaccharomyces pombe

<400> 141

<210> 142

<211> 550

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 142

<210> 143

<211> 543

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 143

<210> 144

<211> 527

<212> PRT

<213> Xenopus laevis

<400> 144

<210> 145

<211> 434

<212> PRT

<213> Cunninghamella elegans

<400>: 145

<400>: 164

<210> 146 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 146 tactgactca ctatagggtc ttctatggag gtc: 33

<210> 147 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 147 ttttttttta attaggctct ggaagacgct gaaagcgtct tg: 42

<210> 148 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 148 ttttttttta attaggctct ggaagacgga acgtcttg: 38

<210> 149 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 149 ttttttttta attaggctct ggaagagaat cttg: 34

<210> 150 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 150 ttttttttta attaggctct ggaaggaact tg: 32

<210> 151 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 151 ttttttttta attaggctct ggaag: 25

<210> 152 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (1) <223> The residue at this position contains a TET-label.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 152 attagaaagg aagggaagaa agcgaa: 26

<210> 153 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 153 acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa: 30

<210> 154 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 154 tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga: 30

<210> 155 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 155 cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga: 30

<210> 156 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 156 gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg: 30

<210> 157 , <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (1) <223> El residuo en esta posición contiene un marcador de fluoresceína.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 157 agaaaggaag ggaagaaa: 18

<210> 158 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 158 tggaggtcaa aacatcgata agtcgaagaa aggaagggaa gaaat: 45

<210> 159 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 159 tgttttgacc tcca: 14

<210> 160 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 160 acacagtgtc ctcccgctcc tcctgagcaa: 30

<210> 161 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> misc_difference <222> (1) <223> El residuo en esta posición contiene un marcador de fluoresceína.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 161 tttccctcct cctcttcc: 18

<210> 162 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 162 atgaggaaga ggaggagggt gctcaggagg agcgggagga cactgtgtct gtca: 154

<210> 163 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 163 ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agc: 53

<210> 164 <211> 1011 <212> ADN <213> Archaeoglobus fulgidus

<210> 165

<211> 336

<212> PRT

<213> Archaeoglobus fulgidus

<400> 165

<210> 166 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 166 ccgtcaacat ttaccatggg tgcgga: 26

<210> 167 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 167 ccgccacctc gtagtcgaca tccttttcgt g: 31

<210> 168 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 168 ggcgaccaca cccgtcctgt: 20

<210> 169 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 169 ccacgatgcg tccggcgtag: 20

<210> 170 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (29) <223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 170 aacgaggcgc acccacccaa ggcacagcn: 29

<210> 171 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 171 acgggtcaat gtccatgccc caaaga: 26

<210> 172 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (23) .. (27) <223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos

<220> <221> misc_difference <222> (28) <223> El residuo en esta posición es un 3’amina

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 172 gtctgagatg aaagtgcgcc tcgttaan: 28

<210> 173

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<223> El residuo en esta posición es un espaciador que contiene un marcador de fluoresceína

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 173 ntcttcgcac atttcatctc agacgga 27

<210> 174

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1) .. (21)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos

<220>

<221> misc_difference

<222> (22)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 174 gctgtgcctt gggtgggtgc gn: 22

<210> 175 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 175 aacgaggcgc acccacccaa ggcacagcn: 29

<210> 176 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 176 acgggtcaat gtccatgccc caaaga: 26

<210> 177

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (23) .. (27)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos

<220>

<221> misc_difference

<222> (28)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 177 gtctgagatg aaagtgcgcc tcgttaan 28

<210> 178

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 178 ntcttcgcac atttcatctc agac: 24

<210> 179 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (1) .. (17) <223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos

<220> <221> misc_difference <222> (18) <223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 179 gctgtgcctt gggtgggn: 18

<210> 180 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1) .. (19)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos

<220>

<221> misc_difference

<222> (20)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 180 gctgtgcctt gggtgggtgn

<210> 181

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1) .. (21)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos

<220>

<221> misc_difference

<222> (22)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 181 gctgtgcctt gggtgggtgc gn 22

<210> 182

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1) .. (22)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos

<220>

<221> misc_difference

<222> (23)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 182 gctgtgcctt gggtgggtgc gcn 23

<210> 183

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)

<223> El residuo en esta posición es un espaciador que contiene un marcador de fluoresceína <220>

<221> misc_difference

<222> (23)

<223> El residuo en esta posición indica un 2’-O-metilazúcar

<220>

<221> misc_difference

<222> (43)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 183 ngtctgagat gaaagtgctc ccgcacccac ccaaggcaca gcn

<210> 184

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (1) .. (17)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilazúcares

<220>

<221> misc_difference

<222> (18)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 184 gctgtgcctt gggtgggn: 18

<210> 185 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (29) <223> El residuo en esta posición es un cebador en 3’

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 185 aacgaggcgc acccacccaa ggcacagcn: 29

<210> 186 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 186 gctgtgcctt gggtgggtgc g: 21

<210> 187

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (21)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 187 gctgtgcctt gggtgggtgc n

<210> 188

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_difference

<222> (15) .. (20)

<223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilazúcares

<220>

<221> misc_difference

<222> (21)

<223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220>

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 188 gctgtgcctt gggtgggtgc n: 21

<210> 189 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_difference <222> (1) .. (20) <223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilazúcares

<220> <221> misc_difference <222> (21) <223> El residuo en esta posición es una 3’amina

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 189 gctgtgcctt gggtgggtgc n: 21

<210> 190 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<221> misc_difference

<222> (1)

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 190 ntcttcgcac atttcatctc agacgga 27

<210> 191

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 191 ctgggcgcgg acatggagga cgtgcgcggc cgcctggtgc agtaccgcgg cgag 54

<210> 192

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 192 ctgggcgcgg acatggagga cgtgtgcggc cgcctggtgc agtaccgcgg cgag 54

<210> 193

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 193 cgcgatgccg atgacctgca gaagcgcctg gcagtgtacc aggccggggc ccgcga 56

<210> 194

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 194 cgcgatgccg atgacctgca gaagtgcctg gcagtgtacc aggccggggc ccgcga 56

<210> 195

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 195 23 cggtactgca ccaggcggcc gct: 23

<210> 196 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 196 ccccggcctg gtacactgcc aggct: 25

<210> 197 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 197 aacgaggcgc acgcacgtcc tccatgt: 27

<210> 198 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_feature <222> (25) <223> El residuo en esta posición esa 2-amino desoxiadenosina.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 198 gaacgaggcg cacacacgtc ctccntgt: 28

<210> 199 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 199 aacgaggcgc acgcttctgc aggtcatc: 28

<210> 200 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_feature <222> (21) <223> El residuo en esta posición esa 2-amino desoxiadenosina.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 200 aacgaggcgc acacttctgc nggtcatc: 28

<210> 201 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_feature <222> (5) <223> El residuo en esta posición es un ligador abásico (CY3).

<220> <221> misc_feature <222> (38) .. (40) <223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 201 cctcngtctc ggttttccga gacgagggtg cgcctcgttc: 40

<210> 202 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 202 cccctgggga agagcagaga tatacgtc: 28

<210> 203 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Description.of Secuencia artificial: Sintética

<400> 203 gggctccaca cggcgactct catt: 24

<210> 204 <211> 39 <212> ADN < 213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 204 ggtgctccac ctggcacgta tatctctgct cttccccag: 39

<210> 205 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 205 ggtgctccac ctggtacgta tatctctgct cttccccag: 39

<210> 206 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 206 agctgttcgt gttctatgat catgagagtc gccgtgtgga gccccg: 46

<210> 207 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 207 agctgttcgt gttctatgat gatgagagtc gccgtgtgga gccccg: 46

<210> 208 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 208 aacgaacgcg caggccaggt ggagcattt: 29

<210> 209 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 209 aacgaacgcg cagaccaggt ggagcac: 27

<210> 210 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <221> misc_feature <222> (39) .. (41) <223> Los residuos en estas posiciones son 2’-O-metilos.

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 210 ctccngtctc ggttttccga gacggagctg cgcgttcguu u: 41

<210> 211 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 211 aagcacgcag cacgatcata gaacacgaac agttt: 35

<210> 212 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 212 aagcacgcag caccatcata gaacacgaac agttt: 35

<210> 213 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 213 acgcngtctc ggttttccga gacgcgtgtg ctgcgtgcuu u: 41

<210> 214 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 214 gaaggtgtct gcgggagccg atttcatcat cacgcagctt ttctttgagg: 50

<210> 215 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 215 gaaggtgtct gcgggagtcg atttcatcat cacgcagctt ttctttgagg: 50

<210> 216 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 216 caaagaaaag ctgcgtgatg atgaaatcgc: 30

<210> 217 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 217 aacgaggcgc acgctcccgc agacac: 26

<210> 218 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 218 aacgaggcgc acactcccgc agacacc: 27

<210> 219 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 219 cctcngtctc ggttttccga gacgagggtg cgcctcgttt: 40

<210> 220 <211> 51 <232> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 220 actgggagca ttgaggctcg ctgagagtca cttttattgg gaaccatagt t: 51

<210> 221 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 221 actgggagca ttgaggcttg ctgagagtca cttttattgg gaaccatagt t: 51

<210> 222 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 222 tatggttccc aataaaagtg actctcagct: 30

<210> 223 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 223 aacgaggcgc acgagcctca atgctccc: 28

<210> 224 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 224 aacgaggcgc acaagcctca atgctccc: 28

<210> 225 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 225 cctcngtctc ggttttccga gacgagggtg cgcctcgttt: 40

<210> 226 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 226 tgaagtctag agaaagggtt gtacggctga ggtctggaga aatgggcatc tg 52

<210> 227

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 227 tttgaaatgt cacagggttc ctaacagcca ctcttccctg gatggg 46

<210> 228

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 228 agatgcccat ttctccagac ctcagccc 28

<210> 229

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 229 aagcacgcag cacgtacaac cctttctcta gacaaa: 36

<210> 230 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 230 ctccngtctc ggttttccga gacggaggtg ctgcgtgcuu u: 41

<210> 231 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 231 ccatccaggg aagagtggcc tgttt: 25

<210> 232 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 232 aagcacgcag cacaggaacc ctgtgacat: 29

<210> 233 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 233 taggttttga ggggcatggg gacggggttc agcctccagg gtccta: 46

<210> 234 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 234 taggttttga ggggcatgag gacggggttc agcctccagg gtccta: 46

<210> 235 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 235 gaccctggag gctgaacccc gtcca: 25

<210> 236 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 236 aacgaggcgc acccatcggg gtcaaaac: 28

<210> 237 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 237 aacgaggcgc actcatgccc ctcaaaac: 28

<210> 238 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 238 aaggacaaaa tacctgtatt cctcgcctgt ccagggatct gctcttacag attaga: 56

<210> 239 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 239 aaggacaaaa tacctgtatt ccttgcctgt ccagggatct gctcttacag attaga: 56

<210> 240 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 240 taatctgtaa gagcagatcc ctggacagrc c: 31

<210> 241 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 241 aacgaggcgc acgaggaata caggtatttt gtc: 33

<210> 242 <211> 33 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 242 aacgaggcgc acaaggaata caggtatttt gtc: 33

<210> 243 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 243 ggtaaaggtt ggcaaaaaga taac: 24

<210> 244 <210> 244 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 244 gcgccgaggt cttggggtgg ttacaag: 27

<210> 245 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 245 tctcngtctc ggttttccga gactgagacc tcggcgcg: 38

<210> 246 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 246 cacttgcttc aggaccatat ttctctctc 29

<210> 247

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 247 cgcgccgagg acaccttttt tagggtgctt tgt 33

<210> 248

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 248 aaaatcgatg gtaaaggttg gc 22

<210> 249

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 249 agttctgcag taccggattt gc 22

<210> 250

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 250 tcgctactag ttgcttagtg 20

<210> 251

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 251 gtaaacataa gcaactttag 20

<210> 252

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 252 cttgtaacca ccccaagatt atctttttgc caacctttac c 41

<210> 253

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 253 acaaagcacc ctaaaaaagg tgtagagaga aatatggtcc tgaagcaagt g 51

<210> 254

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 254 cacgaattcc gaggcgatgc ttccgctc 28

<210> 255

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 255 tcgacgtcga ctaacccttg gcggaaagcc 30

<210> 256

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 256 gcatcgcctc ggaattcatg gtc 23

<210> 257

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 257 caggaggagc tcgttgtgga cctgga 26

<210> 258

<211> 2511

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 258

<210> 259

<211> 836

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 259

<210> 260

<211> 777

<212> ADN

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

<400> 260 <210> 261

<211> 258

<212> PRT

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

<400> 261

5: <210> 262 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética <400> 262 gggtgttccc atgggagtta aactcagg 28

<210> 263

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 263 ctgaattctg cagaaaaagg gg 22 10

<210> 264

<211> 987

<212> ADN

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum 15

<400> 264 <210> 265

<211> 328

<212> PRT

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

<400> 265

<210> 266

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 266 tgtggaattg tgagcgg 17

<210> 267

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 267 tggaggctct ccatcaaaaa c 21

<210> 268

<211> 296

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 268

<210> 269 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 269 taatctgtat caggctg: 17

<210> 270 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 270 gtttttgatg gagagcctcc a: 21

<210> 271 <211> 889 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

<400> 271

<210> 272

<211> 1164

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética

15 <400> 272 <210> 273

<211> 296 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética 10

<400> 273 5 <210> 274

<211> 840

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 274

<210> 275

<211> 1115 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética 10

<400> 275

<210> 276

<211> 386

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

10 <400> 276

5: <210> 277 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 277 tacttagcag cttcttctat ctctcctttt tca: 33

15: <210> 278 <211> 668 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 278

5: <210> 279 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética <400> 279 taccgctgca gttagtggtg gtggtggtgg tgtttaaacc atgcatctaa tgt 53

15: <210> 280 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 280

gaagaagctg ctaagta: 17

5: <210> 281 <211> 1054 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética <400> 281

<210> 282

<211> 514

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 282 10

15: <210> 283 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética <400> 283 gcttgggcct ctccctc 17

25: <210> 284 <211> 667 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 284

10: <210> 285 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

20: <400> 285 gagggagagg cccaagc <210> 286 <211> 1164 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 286

<210> 287

<211> 514 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 287

<210> 288

<211> 618

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 288 20

<210> 289

<211> 1115 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética 10

<400> 289

<210> 290

<211> 350

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 290

<210> 291

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <400> 294 <210> 298

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 291 agagtttgat cctggctcag: 20

<210> 292 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 292 ctgctgcctc ccgtaggagt: 20

<210> 293 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 293 ttttcgctgt ctcgctgaaa gcgagacagc gttt: 34

<210> 294 <211> 59 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

ttttcgctgt ctcgctgaaa gcgagacagc gaaagacgct cgtgaaacga gcgtctttg: 59

<210> 295 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 295 atctctagca ctgctgtntt ygayggn: 27

<210> 296 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 296 gatctctagc actgctgarg gngargcnca r: 31

<210> 297 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 297 gatctctagc actgctcarg aytaygay: 28

<211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 298 cttaaggtag gactacytgn gcytcnccyt c: 31

<210> 299 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 299 ttaaggtagg actacytcrt aytcytgrct: 30

<210> 300 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 300 ttaaggtagg actacytcrt aytcytgnga: 30

<210> 301 <211> 30 <212> ADN

<213>: Secuencia artificial

<213>: Homo sapiens

<213>: Acidianus ambivalens

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 301 ttaaggtagg actacrttrw artcngtncc: 30

<210> 302 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 302 gatctctagg actgct: 16

<210> 303 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 303 cttaaggtag gactac 16

<210> 304 <211> 27 <212> ADN <213> Acidianus ambivalens

<400> 304 gccatgtcat tagttaacct agttgcc: 27

<210> 305 <211> 27 <212> ADN <213> Acidianus ambivalens

<400> 305 ggcaatggga attccagtag tgcaagc: 27

<210> 306 <211> 27 <212> ADN <213> Acidianus brierleyi

<400> 306 gccatctcgt ttgtaagtct ggttgcc: 27

<210> 307 <211> 26 <212> ADN <213> Acidianus brierleyi

<400> 307 cttacaaacg agatggcaga cgaagg: 26

<210> 308 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 308 ttgctgtgca tacttcctcg cttcagc: 27

<210> 309 <211> 27 <212> ADN

<400> 309 ccgaggtgat agacttagaa tacaacc: 27

<210> 310 <211> 27 <212> ADN <213> Archaeoglobus veneficus

<400> 310 tatcgcagcg atccacttct cctctgc: 27

<210> 311 <211> 27 <212> ADN <213> Archaeoglobus veneficus

<400> 311 cttaaacggc aacctgagaa ggcttgg: 27

<210> 312 <211> 28 <212> ADN <213> Archaeoglobus veneficus

<400> 312 ctatctcctt ctgcttgaaa acaggagg: 28

<210> 313 <211> 27 <212> ADN <213> Archaeoglobus veneficus

<400> 313 acaagggaac agctcgtcga tatcgcg: 27

<210> 314 <211> 26 <212> ADN <213> Desulfurococcus amylolyticus

<400> 314 tgctgcctcc tccttaacgg ctttcc: 26

<210> 315 <211> 27 <212> ADN <213> Desulfurococcus amylolyticus

<400> 315 ccggagctca tagagctcga caaactc: 27

<210> 316 <211> 26 <212> ADN <213> Desulfurococcus mobilis

<400> 316 tctcgcagcc tcctccctga caaccc: 26

<210> 317 <211> 27 <212> ADN <213> Desulfurococcus mobilis

<400> 317 ctcgataaac tgctttcaaa gctgggc: 27

<210> 318 <211> 27 <212> ADN

<213> Methanococcus igneus

<400> 318 cctctttgcg tatttttgca tctcatc: 27

<210> 319 <211> 27 <212> ADN <213> Methanococcus igneus

<400> 319 cttaacaaag gacatcgtag agaactc: 27

<210> 320 <211> 26 <212> ADN <213> Methanopyrus kandleri

<400> 320 cagtttctcc atcgcctcct ccttcc: 27

<210> 321 <211> 27 <212> ADN <213> Methanopyrus kandleri

<400> 321 ttggtggaag acgcgaagag gctgttg: 27

<210> 322 <211> 26 <212> ADN <213> Pyrobaculum aerophilum

<400> 322 catggccttc tcacgcgtct tcctcc: 26

<210> 323 <211> 26 <212> ADN <213> Pyrobaculum aerophilum

<400> 323 ctgagctata tgggcgtacc ctgggt: 26

<210> 324 <211> 26 <212> ADN <213> Methanopyrus kandleri

<400> 324 cccatggcct ccagcagctt cttagc: 26

<210> 325 <211> 27 <212> ADN <213> Pyrodictium brockii

<400> 325 aacctcgcta taacgggtaa gaggaag: 27

<210> 326 <211> 27 <212> ADN <213> Sulfolobus solfataricus

<400> 326 agcttgaact acaggtatac ccatagc: 27

<210> 327 <211> 27 <212> ADN <213> Sulfolobus solfataricus

<400> 327 gctatgggta tacctgtagt tcaagct: 27

<210> 328 <211> 26 <212> ADN <213> Thermococcus litoralis

<400> 328 ctgcgcttcc tccctagcct cagctc: 26

<210> 329 <211> 26 <212> ADN <213> Thermococcus litoralis

<400> 329 atgggcatcc catgggtgca ggctcc: 26

<210> 330 <211> 26 <212> ADN <213> Thermococcus gorgonarius

<400> 330 aggttcctta caagtctcgg cgcgcc: 26

<210> 331

<211> 26 <212> ADN <213> Thermococcus gorgonarius

<400> 331 agctcggcat agacagggaa aagctg: 26

<210> 332 <211> 26 <212> ADN <213> Thermococcus zilligii

<400> 332 aggtttctca cgagtttcgg cgcgcc: 26

<210> 333 <211> 26 <212> ADN <213> Thermococcus zilligii

<400> 333 agcttggcat agaccgggag aaactc: 26

<210> 334 <211> 31 <212> ADN <213> Acidianus ambivalens

<400> 334 gcaaccatgg gagtagacct tgctgatttg g: 31

<210> 335 <211> 32 <212> ADN <213> Acidianus ambivalens

<400> 335 ccatgtcgac taaaaccact gatctaaacc gc: 32

<210> 336 <211> 1056 <212> ADN

<400> 336

<210> 337

<211> 351

<212> PRT

<213> Acidianus ambivalens

<400> 337

<210> 338

<211> 31

5: <212> ADN

<213> Acidianus brierleyi

<400> 338

cataccatgg gagtagattt atctgactta g: 31

10

<210> 339

<211> 33

<212> ADN

<213> Acidianus brierleyi

15

<400> 339

cttggtcgac ttaaaaccat tggtcaagtc cag: 33

<210> 340

<211> 1056

<212> ADN

<213> Acidianus brierleyi

<400>: 340

<400>: 341

10

<210> 341

<211> 351

<212> PRT

<213> Acidianus brierleyi

15

<210> 342

<211> 27

<212> ADN

<213> Aeropyrum pernix

<400> 342 ttagccatgg gagtcaacct tagggag 27

5 <210> 343

<211> 30

<212> ADN

<213> Aeropyrum pernix

10 <400> 343 gtaagtcgac tatccgaacc acatgtcgag 30

<210> 344

<211> 1053 15 <212> ADN

<213> Aeropyrum pernix

<400> 344

<210> 345

<211> 350

<212> PRT

<213> Aeropyrum pernix

<400> 345

<210> 346 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 346 28 cttaccatgg gcgctgatat aggagagc: 28

<210> 347 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 347 30 tggagtcgac ttaaaaccac ctgtccagag: 30

<210> 348 <211> 1008 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 348

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 349 10

5: <210> 350 <211> 25 <212> ADN <213> Methanococcus igneus

10 15: <400> 350 cattccatgg gagtgcagtt taatg <210> 351 <211> 28 <212> ADN <213> Methanococcus igneus <400> 351 cggagtcgac tcatctccca aaccatgc 25 28

<210> 352

<211> 981

<212> ADN

<213> Methanococcus igneus

<400> 352

10 <210> 353

<211> 326

<212> PRT

<213> Methanococcus igneus

15 <400> 353

5: <210> 354 <211> 27 <212> ADN <213> Pyrococcus horikoshii

10: <400> 354 gataccatgg gtgttcctat cggtgac 27

<210> 355

<211> 33

<212> ADN

<213> Pyrococcus horikoshii 5

<400> 355 cttggtcgac ttagggtttc tttttaacga acc 33

<210> 356 10 <211> 1032

<212> ADN

<213> Pyrococcus horikoshii

<400> 356 15

<210> 357

<211> 343

<212> PRT

<213> Pyrococcus horikoshii

<400> 357

5: <210> 358 <211> 31 <212> ADN <213> Sulfolobus solfataricus

<400> 358 taagccatgg gtgtagattt aggcgaaata g: 31

10: <210> 359 <211> 35 <212> ADN <213> Sulfolobus solfataricus

15: <400> 359 actagtcgac ttaaaaccac tgatcaagac ctgtc 35

20: <210> 360 <211> 1056 <212> ADN <213> Sulfolobus solfataricus

<400> 360

5 <210> 361

<211> 351

<212> PRT

<213> Sulfolobus solfataricus

10 <400> 361

<210> 362

<211> 28

5: <212> ADN

<213> Thermococcus gorgonarius

<400> 362

ctagccatgg gagttcagat aggtgagc

10

<210> 363

<211> 30

<212> ADN

<213> Thermococcus gorgonarius

15

<400> 363

tggagtcgac taccgtgtga accagctttc

<210> 364

20: <211> 1023

<212> ADN

<213> Thermococcus gorgonarius

<400> 364

<210> 365

<211> 340

<212> PRT

<213> Thermococcus gorgonarius

<400> 365

<210> 366

<211> 32

<212> ADN

<213> Archaeoglobus veneficus

<400> 366 taacgaattc ggtgcagaca taggcgaact ac 32

5: <210> 367 <211> 33 <212> ADN <213> Archaeoglobus veneficus

<400> 367 cggtgtcgac tcaggaaaac cacctctcaa gcg: 33

10: <210> 368 <211> 37 <212> ADN <213> Archaeoglobus veneficus

15: <400> 368 cacaggaaac agaccatggg tgcagacata ggcgaac 37

20: <210> 369 <211> 1017 <212> ADN <213> Archaeoglobus veneficus

<400> 369

<210> 370

<211> 338

<212> PRT

<213> Archaeoglobus veneficus

<400> 370

<210> 371 <211> 36 <212> ADN <213> Desulfurococcus amylolyticus

<400> 371 ctaagaattc ggagtagact taaaagacat tatacc: 36

<210> 372 <211> 29 <212> ADN <213> Desulfurococcus amylolyticus

<400> 372 agttgtcgac tacttcggct tactgaacc: 29

<210> 373 <211> 34 <212> ADN <213> Desulfurococcus amylolyticus

<400> 373 caggaaacag accatgggag tagacttaaa agac: 34

<210> 374

<211> 1062

<212> ADN

<213> Desulfurococcus amylolyticus

<400>: 374

<400>: 375

10

<210> 375

<211> 353

<212> PRT

<213> Desulfurococcus amylolyticus

15

<210> 376

<211> 31

<212> ADN

<213> Pyrobaculum aerophilum

<400> 376

cgttgaattc ggagttactg agttgggtaa g: 31

5: <210> 377 <211> 34 <212> ADN <213> Pyrobaculum aerophilum

10: <400> 377 tactgtcgac agaaaaagga gtcgagagag gaag 34

15: <210> 378 <211> 1041 <212> ADN <213> Pyrobaculum aerophilum

<400> 378

<210> 379

<211> 346

<212> PRT

<213> Pyrobaculum aerophilum

<400> 379

<210> 380 <211> 31 <212> ADN <213> Thermococcus litoralis

<400> 380 tcatgaattc ggagtccaga ttggtgagct t: 31

<210> 381 <211> 32 <212> ADN <213> Thermococcus litoralis

<400> 381 gattgtcgac tcacttttta aaccagctgt cc: 32

<210> 382 <211> 39 <212> ADN <213> Thermococcus litoralis

<400> 382 aagctcacca atctggactc ccatggtctg tttcctgtg: 39

<210> 383 <211> 1023 <212> ADN

<213> Thermococcus litoralis

<400> 383

<210> 384

<211> 340

<212> PRT

<213> Thermococcus litoralis

<400> 384

<210> 385

<211> 31

5: <212> ADN

<213> Desulfurococcus mobilis

<400> 385 31

cttggaattc ggcgtcgacc taagggaact c: 31

10

<210> 386

<211> 34

459

<212> ADN

<213> Desulfurococcus mobilis

<400> 386 34 5 aggtctgcag ttaaccctgc ttaccgggct tagc 34

<210> 387

<211> 31

<212> ADN 10 <213> Desulfurococcus mobilis

<400> 387 31 caggaaacag accatgggcg tcgacctaag g 31

15 <210> 388

<211> 1071

<212> ADN

<213> Desulfurococcus mobilis

20 <400> 388

<210> 389

<211> 356

<212> PRT

<213> Desulfurococcus mobilis

<400> 389

<210> 390 <211> 28 <212> ADN <213> Pyrodictium brockii

<400> 390 tagcgaattc ggcgtcaacc tccgcgag: 28

<210> 391 <211> 28 <212> ADN <213> Pyrodictium brockii

<400> 391 cattctgcag ctagcggcgc agccacgc: 28

<210> 392 <211> 31 <212> ADN <213> Pyrodictium brockii

<400> 392 caggaaacag accatgggcg tcaacctccg c: 31

<210> 393

<211> 1053

<212> ADN

<213> Pyrodictium brockii

<400>: 393

<400>: 394

10

<210> 394

<211> 350

<212> PRT

<213> Pyrodictium brockii

15

5: <210> 395 <211> 28 <212> ADN <213> Methanopyrus kandleri

10: <400> 395 cataccatgg gactagctga actccgag 28

<210>: 396

<210>: 398

5: <211> 30 <212> ADN <213> Methanopyrus kandleri <400> 396 tggatctaga tcagaagaac gcgtccaggg 30

10: <210> 397 <211> 985 <212> ADN <213> Methanopyrus kandleri

15: <400> 397

<211> 328

<212> PRT

<213> Methanopyrus kandleri

<400> 398

<210> 399 <211> 28 <212> ADN <213> Thermococcus zilligii

<400> 399 cgatccatgg gagttcagat cggtgagc: 28

<210> 400 <211> 31 <212> ADN <213> Thermococcus zilligii

<400> 400 caggctgcag tcaccttccg aaccagctct c: 31

<210> 401 <211> 1023 <212> ADN <213> Thermococcus zilligii

<400> 401

<212> PRT

<213> Thermococcus zilligii

<400> 402 10

5: <210> 403 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética <400> 403 ttttcaactg ccgtga 16

15: <210> 404 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 404

tcacggcagt tggtgcgcct cggaacgagg cgcaca: 36

<210> 405 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 405 ttttcaactg cttagagaat ctaagcagtt ggtgcgcctc gttaa: 45

<210> 406 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 406 aacgaggcgc acattttttt t: 21

<210> 407 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 407 ccgaagcacg cacaaagcgg tgtgtcacga: 30

<210> 408

<211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 408 gcgccgaggc cgttctctag cgtga: 25

<210> 409 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 409 tcnctgccgg ttttccggca gagacctcgg cgcact: 36

<210> 410 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 410 gtatacagcg tcacgctaga gaacggcgtg acccaccgct ttgtgcgtgc ttcgg: 55

<210> 411 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 411 gggataccat gggagtgcag tttgg: 25

<210> 412 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 412 gagctctttc tttttgaatt ctggtggctc accatcaaaa ac: 42

<210> 413 <211> 21 <212> DA1A <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 413 gaattcaaaa agaaagagct c: 21

<210> 414 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 414 tgcatcctcg atgagcattt c 21

<210> 415

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 415 gaaatgctca tcgaggatgc aaaatatttg ttaagtttga tggg 44

<210> 416

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 416 ggtaaatttt tctcgtcgac atcccac 27

<210> 417

<211> 981

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 417 <210> 418

<211> 326 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400>: 418

<400>: 420

5: <210> 419 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223 Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 419 gattccatgg gtgtcccaat tggtgag: 27

15: <210> 420 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

ccttgttttc tcctttaact ttggaggttc tccatcaaaa ac: 42

<210> 421 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 421 aagttaaagg agaaaacaag g: 21

<210> 422 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 422 gcagttttca accattttca g: 21

<210> 423 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 423 ccgaaaatgg ttgaaaactg caaaaaactc ttagagctta tg: 42

<210> 424

<211> 34

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

10 <400> 424 cggagtcgac ttatctcttg aaccaacttt caag 34

<210> 425

<211> 1014 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 20

<400> 425

<210> 426

<211> 338

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 426 15

<210> 427

<211> 43 5 <212> ADNP

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 427

caatttcagc cttcttgaac tctggtggct caccatcaaa aac 43

<210> 428

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 428 gagttcaaga aggctgaaat tg 22

<210> 429

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 429 tgcggagtca acaatgtact c 21

<210> 430

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

5: <400> 430 gagtacattg ttgactccgc aaaatatttg ttaagtttga tgggc 45

10: <210> 431 <211> 978 <212> ADN , <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

15: <400> 431

<210> 432

<211> 325 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 432

<210> 433

<211> 43

5: <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

10

<400> 433

caatttcagc cttcttgaac tctggaggtt ctccatcaaa aac: 43

<210> 434

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 434 10 gagtacattg ttgactccgc aaaaaaactc ttagagctta tggg 44

<210> 435

<211> 1020

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

20 <400> 435

<210> 436

<211> 339

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 436 10

<210> 437 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 437 cgtagacatt tttcccaggc aactttcttt ttcctgtagt tgttaaattt ctaac: 55

<210> 438 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 438 cctgggaaaa atgtctacgt cgagataaag cccgaactta ttgaattaaa tg: 52

<210> 439 <211> 1017 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 439

<210> 440

<211> 338 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 15

<400> 440

<210> 441

<211> 36

5: <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

10

<400> 441

ctctggcatc tcctttgtta ttgttaagtt tctaac: 36

<210> 442

<211> 37

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

10 <400> 442 acaaaggaga tgccagagtt gataattttg gaggaag 37

<210> 443

<211> 987 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 20

<400> 443 <210> 444

<211> 328 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 444

<210> 445 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 445 ctcttaatgc aatcgcccaa tttttgtcca c: 31

<210> 446 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 446 gtggacaaaa attgggcgat tgcattaaga g: 31

<210> 447 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 447 ctcttaatgc aatcttccaa tttttgtcca c: 31

<210> 448 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 448 31 gtggacaaaa attggaagat tgcattaaga g: 31

<210> 449 <211> 1023 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 449

<210> 450

<211> 340 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 450

<210> 451

<211> 1023 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 451 <210> 452

<211> 340 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 452

<210> 453 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 453 gtgtatgttt ttgatggaaa acctccagaa ttc: 33

<210> 454 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 454 gaattctgga ggttttccat caaaaacata cac: 33

<210> 455 <211> 33

<212> ADN <220> <400> 461

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 455 gagagaggaa gctgaactaa agtggagaga agc: 33

<210> 456 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética .

<400> 456 gcttctctcc actttagttc agcttcctct ctc: 33

<210> 457 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 457 gagagaagca cttgcaaaag gagagataga gg: 32

<210> 458 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 458 cctctatctc tccttttgca agtgcttctc tc: 32

<210> 459 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 459 gaagcacttg caaaaggaaa catagaggaa gcaagaa: 37

<210> 460 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 460 ttcttgcttc ctctatgttt ccttttgcaa gtgcttc: 37

<210> 461 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

cctacgtctt tgatggagag cctccggaat tcaaaagg: 38

<210> 462 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 462 ccttttgaat tccggaggct ctccatcaaa gacg: 34

<210> 463 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 463 gagaagaggc agaagaaaaa tggaaagaag c: 31

<210> 464 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 464 gcttctttcc atttttcttc tgcctcttct c: 31

<210>: 465

<210>: 470

<211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 465 ggaaagaagc tctagagaag ggaaacctgg agg: 33

<210> 466 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 466 cctccaggtt tcccttctct agagcttctt tcc: 33

<210> 467 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 467 gctctagaga agggagaact ggaggaagct agg: 33

<210> 468 <211> 33 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética <400> 468 cctagcttcc tccagttctc ccttctctag age 33

10: <210> 469 <211> 1023 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 469

<211> 340 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 470

<210> 471

<211> 1023

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 471

5 <210> 472

<211> 340

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 472

<210> 473

<211> 1023

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 473 <220>

10

<210> 474

<211> 340

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 474

<210> 475

<211> 1023 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 475 <210> 476

<211> 340 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 476 .

<210> 477

<211> 1024 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 477 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 478

<210> 479

<211> 1024 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 479 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 480

<210> 481

<211> 1024 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética 10

<400> 481 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 482

<210> 483

<211> 1024 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 483 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 484

<210> 485

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 485 aaaacgctgt ctcgctgaaa gcgagacagc gaaagacgct cgt: 43

<210> 486 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 486 acgagcgtct tt: 12

<210> 487 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 487 acgagcgtct tta: 13

<210> 488 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 488 acgagcgtct ttt: 13

<210> 489 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<400> 489 acgagcgtct ttg: 13

<210> 490 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 490 acgagcgtct ttc: 13

<210> 491 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220> <221> modified base <222> (13) <223> El nucleótido en esta posición es didesoxicitosina

<400> 491 <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

acgagcgtct ttn: 13

<210> 492 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220> <221> modified base <222> (14) <223> El nucleótido en esta posición es didesoxicitosina,

<400> 492 acgagcgtct ttc: 13

<210> 493 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 493 acgagcgtct tt: 12

<210> 494 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 494 ttttcaactg cttagagaat ctaagcagtt ggtgcgcctc gttaa: 45

<210> 495 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Description of Secuencia artificial:Sintética <400> 495 aacgaggcgc acatt: 15

<210> 496 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 496 ccttccttat cctggatctt ggca: 24

<210> 497 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 497 cgccgagatc acctttacat tttctatcgt: 30

<210> 498

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220>

<221> base modificada

<222> (1) .. (24)

<223> The nucleotides at these positions are 2’ O-methyl

<400> 498 acgatagaaa atgtaaaggt gatc 24

<210> 499

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sintética

<220>

<221> base modificada

<222> (3)

<223> El nucleótido en esta posición es una cirosina unida a un resto inactivador Z28

<400> 499 ctnttctcag tgcg 14

<210> 500

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 500 ccgccgagat cacc

<210> 501

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220>

<221> base modificada

<222> (5)

<223> El nucleótido en esta posición es a guanosine to a 2’ O-methyl

<220>

<221> base modificada

<222> (27)

<223> El nucleótido en esta posición es una guanosina a un 2’ O-metilo

<220>

<221> base modificada

<222> (28)

<223> El nucleótido en esta posición es una guanosina a un 2’ O-metilo

<220>

<221> base modificada

<222> (29)

<223> El nucleótido en esta posición es desoxiuridina

<400> 501

cgcantgaga atgaggtgat ctcggcnnn: 29

<210> 502 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220> <221> base modificada <222> (24) <223> El nucleótido en esta posición es una amina T

<400> 502 ccgtcacgcc tcctctcagt tctn: 24

<210> 503 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 503 ttgataaatt tggggtggaa aggtttgga: 29

<210> 504 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 504 gtgtggtcca ctctcaatca a 21

<210> 505

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 505 agaactgaga ggaggc 16

<210> 506

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificials

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220>

<221> base modificada

<222> (3)

<223> El nucleótido en esta posición es una citosina unida a un resto inactivador Z28

<400> 506 cantgcttcg tgg 13

<210> 507

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 507 ccgtcacgcc tct: 13

<210> 508 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220> <221> base modificada <222> (27) <223> El nucleótido en esta posición es desoxiuridina

<400> 508 ccaggaagca agtggaggcg tgacggn: 27

<210> 509 <211> 220 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 509

<210> 510

<211> 339 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética 10

<400> 510

15: <210> 511 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 511 cgcgaggccg gaggaataca ggtattttgt cc: 32

<210> 512

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 512 tctaatctgt aagagcagat ccctggacag acc 33

<210> 513

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220>

<221> base modificada

<222> (3)

<223> El nucleótido en esta posición es una timidina unida a un resto inactivador Z28

<400> 513 tcnagccggt tttccggctg agacggcctc gcg 33

<210> 514

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 514

aggccacgga cgaagcctca atgctcc 27

<210> 515

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<400> 515 tatggttccc aataaaagtg actctcagct 30

<210> 516

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

<220>

<221> base modificada

<222> (3)

<400> 516 tcnagccggt tttccggctg agacgtccgt ggcct 35

<210> 517

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética

5: <400> 517 tttttcacgg cagttggtgc gcctcggaac gaggcgcaca 40

10: <210> 518 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial:Sintética <400> 518 ttttcaactg ccgtga 16

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.
2.

Una composición que comprende un ácido nucleico aislado, en el que dicho ácido nucleico codifica la endonucleasa de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico aislado comprende la SEC ID Nº 369.
3.

Una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 quimérica, comprendiendo dicha endonucleasa FEN-1 quimérica la endonucleasa de la reivindicación 1.
4.

Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2.
5.

Una composición que comprende una célula huésped, comprendiendo dicha célula huésped el vector de la reivindicación 4.
6.

La composición de la reivindicación 3, en la que dicha endonucleasa FEN-1 quimérica comprende un dominio funcional.
7.

La composición de la reivindicación 6, en la que dicha endonucleasa FEN-1 quimérica comprende la SEC ID Nº
370.
8.

Una mezcla que comprende: i) una primera nucleasa con especificidad de estructura que comprende una endonucleasa FEN-1 de Archaeaglobus veneficus; y ii) una segunda nucleasa con especificidad de estructura, en la que dicha nucleasa con especificidad de estructura comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370.
9.

La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha nucleasa específica de estructura purificada comprende una nucleasa específica de estructura de un organismo seleccionado del grupo que consiste en Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii y Aeropyrum pernix.
10.

La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha nucleasa específica de estructura purificada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 375, 379, 384, 389, 394, 398, 402, 418, 426, 432, 436, 440, 444, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, and
484.
11.

La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha segunda nucleasa específica de estructura comprende una polimerasa.
12.

La mezcla de la reivindicación 11, en la que dicha polimerasa comprende una ADN polimerasa.
13.

La mezcla de la reivindicación 12, en la que dicha ADN polimerasa comprende una ADN polimerasa termoestable.
14.

En La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha segunda nucleasa específica de estructura comprende una

nucleasa 5’ derivada de una ADN polimerasa alterada en la secuencia de aminoácidos de tal forma que

muestra actividad sintética de ADN reducida con respecto a la de la ADN polimerasa de tipo silvestre pero

conserva sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’ de la ADN polimerasa de tipo silvestre.
15.

La mezcla de la reivindicación 14, en la que dicha nucleasa 5’ comprende una nucleasa en 5’ termoestable.
16.

La mezcla de la reivindicación 8, en la que dicha seguna nucleasa específica de estructura se selecciona del grupo que consiste en la enzima CLEAVASE BN, la enzima CLEAVASE DA, la enzima CLEAVASE DN, la enzima CLEAVASE DV, la enzima CLEAVASE BN/trombina, la enzima CLEAVASE TThDN, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, ADN polimerasa de Thermus thermophilus, Exo III de Escherichia coli y complejo Rad1/Rad10 de Saccharomyces cerevisiae.
17.

Un kit de tratamiento de ácido nucleico, que comprende:

a) una composición que comprende una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370; y

b) oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasiva en presencia de un ácido nucleico diana.
18. El kit de la reivindicación 17, en el que dichos oligonucleótidos comprenden:

a) un primer oligonucleótido que comprende una porción en 5’ complementaria de una primera porción de un

ácido nucleico diana; y

b) un segundo oligonucleótido que comprende: una porción en 5’ complementaria de una segunda porción de dicho ácido nucleico diana cadena debajo de y contiguo a dicha primera porción; y una porción 3’.
19.

El kit de la reivindicación 18, en el que dicha porción 3’ de dicho segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en 3’ terminal no complementario a dicho ácido nucleico diana.
20.

El kit de la reivindicación 19, en el que dicha porción 3’ de dicho segundo oligonucleótido consiste en un único nucleótido no complementario a dicho ácido nucleico diana.
21.

El kit de la reivindicación 18, que comprende un soporte sólido.
22.

El kit de la reivindicación 21, en el que dicho primer oligonucleótido está unido a dicho soporte sólido.
23.

El kit de la reivindicación 21, en el que dicho segundo oligonucleótido está unido a dicho soporte sólido.
24.

El kit de la reivindicación 18, que además comprende una solución tampón.
25.

El kit de la reivindicación 24, en el que dicha solución tampón comprende una fuente de cationes divalentes.
26.

El kit de la reivindicación 25, en el que dicho catión divalente comprende Mn2+.
27.

El kit de la reivindicación 25, en el que dicho catión divalente comprende Mg2+.
28.

El kit de la reivindicación 18, que además comprende un tercer oligonucleótido complementario a una tercera porción de dicho ácido nucleico diana cadena arriba de la primera porción del primer ácido nucleico diana.
29.

El kit de la reivindicación 28, que además comprende uno o más ácidos nucleicos diana.
30.

Un procedimiento para detectar una secuencia diana, que comprende: a) proporcionar:

i) una estructura de escisión que comprende una secuencia Diana y oligonucleótidos capaces de formar una estructura de escisión invasive en presencia de dicha secuencia diana; y ii) una endonucleasa FEN-1 purificada de Archaeaglobus veneficus, en la que dicha endonucleasa FEN-1

comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 370; y b) exponer dicha estructura de escisión a dicha endonucleasa FEN-1; y c) detectar la escisión de dicha estructura de escisión.
31.

El procedimiento de la reivindicación 30, en el que dicha secuencia diana comprende una primera región y una segunda región, dicha segunda región cadena abajo y contigua a dicha primera región, y en la que dichos oligonucleótidos comprenden los oligonucleótidos primero y segundo, en la que dicha al menos una porción de dicho primer oligonucleótido es completamente complementaria a dicha primera porción de dicha secuencia diana y en la que dicho segundo oligonucleótido comprende una porción en 3’ y una porción en 5’, en la que dicha porción en 5’ es completamente complementaria a dicha segunda porción de dicho ácido nucleico diana.
32.

El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicha porción 3’ de dicho segundo oligonucleótido comprende un nucleótido en 3’ terminal no complementario a dicho ácido nucleico diana.
33.

El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicha porción 3’ de dicho segundo oligonucleótido consiste en un único nucleótido no complementario a dicho ácido nucleico diana.
34.

El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho primer oligonucleótido está unido a un soporte sólido.
35.

El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho segundo oligonucleótido está unido a un soporte sólido.
36.

El procedimiento de la reivindicación 30, en el que exponer dicha estructura de escisión a dicha endonucleasa FEN-1 comprende exponer en presencia de una solución tampón que comprende una fuente de cationes divalentes.

554
37.

El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicho catión divalente comprende Mn2+.
38.

El procedimiento de la reivindicación 36, en el que dicho catión divalente comprende Mg2+.
39.

El procedimiento de la reivindicación 31, que además comprende un tercer oligonucleótido complementario a una tercera porción de dicho ácido nucleico diana cadena arriba de la primera porción de dicho ácido nucleico diana.