ES2384736T3 - Un fragmento aislado de ADN del promotor humano de SPARC y su uso - Google Patents
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Abstract
Un ADN aislado que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO 1.
Description
Un fragmento aislado de adn del promotor humano de sparc y su uso
[0001] La presente invención se relaciona con el campo de la terapia génica. En particular la presente invención se refiere a una secuencia de ADN, aislada, con actividad promotora, capaz de dirigir la expresión de un gen de interés, particularmente en una célula tumoral. Más particularmente, la presente invención se refiere a vectores que contienen un fragmento de ADN aislado del promotor de SPARC asociado a un gen de interés, a composiciones farmacéuticas y su uso en terapia del cáncer.
[0002] La proteína SPARC (del inglés secreted protein, acidic and cystein-rich, es decir, proteína secretada, ácida y rica en cisteína,) también conocida como osteonectina o como BM40, es una glicoproteína secretada, ampliamente distribuida en tejidos humanos y no humanos, cuyas funciones y efectos son amplios y diversos. Se ha encontrado que interactúa con componentes de la matriz extracelular, con factores de crecimiento, con citoquinas y con la expresión de metaloproteinasas de matriz.
[0003] La proteína SPARC ha sido inicialmente descripta por Ledda, M.F. y col (Ledda, M.F., Adris, S., Bravo, A.I., Kairiyama, C., Bover, L., Chernajovsky, Y., Mordoh, J., y Podhajcer, O.L., Suppression of SPARC expression by antisense RNA abrogates the tumorigenicity of human melanoma cells. Nat Med, 3: 171-176, 1997) como poseedora de un rol central en la malignidad del melanoma humano. Estudios posteriores demostraron que la sobreexpresión de SPARC está asociada a la progresión maligna de diversos tipos de tumores (Porte, H., Triboulet, J.P., Kotelevets, L., Carrat, F., Prevot, S., Nordlinger, B., DiGioia, Y., Wurtz, A., Comoglio, P., Gespach, C., y Chastre, E. Overexpression of stromelysin-3, BM-40/SPARC, and MET genes in human esophageal carcinoma: implications for prognosis. Clin Cancer Res, 4: 1375-1382, 1998). La proteína SPARC se encuentra expresada en forma muy elevada tanto en endotelio como en fibroblastos activados de tumores in vivo (Lane, T.F. y Sage, E.H. The biology of SPARC, a protein that modulates cell-matrix interactions. Faseb J, 8: 163-173, 1994).
[0004] Los promotores de SPARC humano (Hafner, M., Zimmermann, K., Pottgiesser, J., Krieg, T., y Nischt, R.
A purine-rich sequence in the human BM-40 gene promoter region is a prerequisite for maximum transcription. Matrix Biol, 14: 733-741, 1995), promotores de SPARC murino (McVey, J.H., Nomura, S., Kelly, P., Mason, I.J., y Hogan, B.L. Characterization of the mouse SPARC/osteonectin gene. Intron/exon organization and an unusual promoter region. J Biol Chem, 263: 11111-11116, 1988) y promotores de SPARC bovino (Young, M. F., Findlay,
D. M., Dominguez, P., Burbelo, P. D., McQuillan, C., Kopp, J. B., Robey, P. G., and Termine, J. D. Osteonectin promoter. DNA sequence analysis and S1 endonuclease site potentially associated with transcriptional control in bone cells. J Biol Chem, 264: 450-456, 1989) han sido clonados y caracterizados. La comparación entre estos promotores muestra que, al igual a lo observado a nivel del gen, existe una alta homología de secuencia.
[0005] En la Figura 1 se muestra la estructura del promotor SPARC humano, donde se esquematizan el primer exón, las cajas GGA1 y GGA2, la región Inter-GGA de 10 nucleótidos que las separa y la secuencia TATA no consenso. El promotor de SPARC humano carece de una caja TATA consenso (Breathnach, R. y col., Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins, Annu Rev Biochem, 50: 349-383, 1981) pero contiene un elemento denominado TATA-like dado que comparte algunas bases con la secuencia convencional. El promotor contiene dos cajas GGA1 y GGA2, de las cuales la caja GGA1 exhibe una gran similitud entre las especies humana y bovina.
[0006] Hafner y colaboradores observaron que la caja GGA1 es necesaria y suficiente para obtener una máxima actividad transcripcional, mientras que el elemento espaciador que separa las dos cajas GGA posee un efecto negativo sobre su expresión (Hafner M. y col., 1995). Es importante destacar que este grupo ha demostrado que en humanos la región promotora que contiene sólo las cajas GGA no es suficiente por sí sola para conferir especificidad de expresión en diferentes líneas celulares. Domínguez y colaboradores describieron la región comprendida entre las bases -504 a +11 del promotor bovino como un elemento positivo para la transcripción de SPARC en células fetales bovinas. Este fragmento también confiere expresión específica, mostrando mayor actividad en células con mayor nivel de expresión de ARNm de SPARC (Dominguez, P., Ibaraki, K., Robey, P.G., Hefferan, T.E., Termine, J.D., y Young, M.F. Expression of the osteonectin gene potentially controlled by multiple cis- and trans-acting factors in cultured bone cells. J Bone Miner Res, 6: 11271136, 1991). Observaron también que sólo las cajas GC (también llamado GC box, que es un elemento común de muchas regiones promotoras; su secuencia consenso es GGGCGG. Puede estar presente en más de una copia.
Se localiza entre los -40 a -100 pb) y GGA1 no son suficientes para la máxima expresión de SPARC en células de hueso bovinas, y que la región localizada entre las bases -927 a -504 produce una dramática inhibición de la transcripción.
[0007] La terapia génica representa potencialmente uno de los más importantes desarrollos que están teniendo lugar en medicina. A fin de modificar un tipo de célula o tejido específicos, los genes terapéuticos deben ser suministrados eficientemente a la célula de modo que el gen se exprese en el nivel apropiado y durante una suficiente duración de tiempo. Dos tipos de estrategias se están aplicando para el suministro de ADN a células, esto es mediante vectores virales y no-virales. Si bien se ha desarrollado un gran número de virus destinados a la transferencia de genes, el mayor interés se ha centrado en retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus de herpes simplex tipo 1. Los adenovirus de primera generación son defectivos en la proteína E1A, por lo tanto no se replican. La proteína temprana E1A es la primera proteína que produce el ADN viral dentro de la célula. E1A tiene muchas funciones como la de ayudar a que se produzcan las demás proteínas virales y estimular el crecimiento celular (se une y suprime un inhibidor del crecimiento celular p53), facilitando la transcripción y replicación viral. Si bien aquellos adenovirus defectivos en la proteína E1A fueron utilizados con éxito como vectores en modelos preclínicos de cáncer, no se lograron los mismos resultados cuando fueron utilizados en ensayos clínicos, siendo uno de los mayores problemas su baja capacidad de transducción in vivo (Vile, R. Cancer gene therapy-new approaches to tumour cell killing. J Gene Med, 2: 141-143, 2000).
[0008] Una de las formas de superar este obstáculo ha sido mediante la creación de una nueva generación de vectores capaces de replicarse en forma condicional en el ambiente tumoral; a estos vectores se los denomina CRAds u oncolíticos (del inglés Conditionally Replicative Adenovirus u oncolytic adenoviruses, es decir adenovirus oncolíticos de replicación condicionada). Los CRAds se construyen modificando el genoma adenoviral de tal forma de regular la expresión de la proteína E1A con un promotor que resulte específicamente activo en el tejido o tipo celular requerido, de modo de evitar el daño de los tejidos vecinos.
[0009] En los últimos años distintos grupos de investigación se han dedicado al armado de adenovirus recombinantes. De esta manera algunos de los genes virales que fueron eliminados en un pasado son reinsertados nuevamente dado que mejoran la replicación viral. Tal es el caso de la región E3. E3 es un fragmento de ADN del virus que codifica para 9 proteínas cuya función principal es la de inhibir la muerte celular inducida por la respuesta inmune del huésped. Entre las 9 proteínas se destaca la ADP (Adenoviral Death Protein) que tiene una función contradictoria a sus compañeras E3 porque promueve la lisis celular tardía en el ciclo de infección viral para permitir la liberación de los viriones maduros al microambiente celular. Se ha visto que las células que fueron infectadas con un adenovirus que no expresa ADP permanecen mucho más tiempo viables que las células infectadas con el adenovirus wild type (Tollefson, A.E. y col. The E3-11.6-kDa adenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants, Virology, 220: 152-162, 1996; Tollefson, A.E y col., The adenovirus death protein (E3-11.6K) is required at very late stages of infection for efficient cell lysis and release of adenovirus from infected cells, J Virol, 70: 2296-2306, 1996; Kruyt,
F.A. y col., A new generation of conditionally replicating adenoviruses: pairing tumor selectivity with maximal oncolysis, Hum Gene Ther, 13: 485-495, 2002.).
[0010] Una de las modalidades más atractivas de terapia génica es el uso de genes suicidas. La base del sistema consiste en introducir un gen codificante para una enzima con capacidad para metabolizar una pro-droga no tóxica, convirtiéndola en tóxica. Uno de los genes más utilizados es el de la timidina quinasa del virus herpes simplex o HSV-TK (Herpes simplex virus thymidine kinase) que codifica para una enzima que es capaz de fosforilar a la pro-droga aciclovir / ganciclovir (antiviral de uso cotidiano en infecciones virales), un análogo de la guanosina. Bajo la forma fosforilada, el antiherpético se incorpora a la molécula de ADN, evitando su duplicación y provocando la muerte celular (Moolten, F. L., Drug sensitivity ("suicide") genes for selective cancer chemotherapy, Cancer Gene Ther, 1: 279-287, 1994). Las células tumorales vecinas no transducidas también pueden ser eliminadas por el denominado efecto bystander (en inglés, espectador) el cual permite que los metabolitos tóxicos se transfieran de una célula afectada a una no afectada.
[0011] Un tumor está formado por células tumorales, fibroblastos y células endoteliales. Es por ello que una terapia efectiva con vectores virales, requiere que el virus se pueda replicar en estos tres tipos celulares, que son los responsables de la progresión tumoral. Dado que SPARC se sobreexpresa en todos estos tipos celulares resulta un buen candidato para la construcción de un CRAd de tal forma que el promotor de SPARC dirija un gen de interés tal como un gen E1A y eventualmente otro gen terapéutico. En este sentido las células tumorales serían eliminadas por la replicación del propio virus o por la acción de una droga tóxica que es producida en el ambiente tumoral.
[0012] Es por lo tanto un objeto de la presente invención proveer una secuencia de ADN, aislada, con actividad promotora capaz de dirigir la expresión de un gen de interés, particularmente en una célula tumoral.
[0013] La invención provee una secuencia de ADN aislada que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste de SEQ ID NO 1 que corresponde a una región del promotor del gen SPARC humano desde –513 pares de bases hasta +35 pares de bases.
[0014] De acuerdo con un aspecto adicional, se provee un constructo de expresión recombinante de ADN aislado que comprende la secuencia promotora de la invención operablemente ligada a un gen de interés.
[0015] De acuerdo con otro aspecto adicional, la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO 1 que corresponde a una región del promotor humano del gen SPARC de acuerdo con la presente invención, puede estar además asociada a cualquier otra secuencia promotora/reguladora, tal como secuencias de respuesta a irradiación, a hipoxia, a radicales libres, etc.
[0016] De acuerdo con aún otro aspecto relevante de la presente invención se provee un vector viral recombinante de expresión, que contiene la secuencia de ADN promotora de la invención, definida anteriormente y/o el constructo de la invención definido anteriormente, donde la secuencia de ADN promotora se encuentra operablemente ligada a un gen de interés terapéutico.
[0017] La invención provee además un método para expresar ADN foráneo en una célula huésped que comprende introducir en la célula huésped un constructo de expresión recombinante de ADN o un vector viral recombinante de expresión de la invención que comprende la molécula de ADN promotora de secuencia polinucleotídica SEQ ID NO.1 operablemente ligada a un ADN foráneo que codifica un polipéptido o ARN deseado, en donde se expresa dicho ADN foráneo.
[0018] La presente solicitud describe un método para tratar un tumor en un paciente que sufre del mismo, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un constructo de expresión recombinante de ADN o un vector viral recombinante de expresión, que comprenden la secuencia promotora de la invención capaz de dirigir la expresión de un gen terapéutico y/ó la replicación viral, operablemente ligado a la misma.
Breve descripción de las figuras
[0019]
La Figura 1 muestra un esquema de la estructura del promotor de SPARC humano, HSBM40DNA (Genbank # X88259).
La Figura 2 muestra una evaluación comparativa de los niveles de expresión de ARNm de SPARC en diferentes líneas tumorales y normales.
La Figura 3 muestra dos esquemas de la región promotora de SPARC, de donde derivan los distintos fragmentos.
La Figura 4 A, muestra la actividad promotora de 11 fragmentos del promotor de SPARC, por medida de la actividad enzimática del gen reportero luciferasa, en las líneas celulares A375N (melanoma), HeLa (cérvix) y T47D (mama), etc.
La Figura 4 B compara la actividad promotora de los fragmentos –513/+35 (F512) y -1175/+71A10 (Spdel) del promotor de SPARC, por medida de la actividad enzimática del gen reportero luciferasa, en diversas líneas celulares normales y tumorales.
La Figura 5 A muestra esquemas de los adenovirus Ad-F512, Ad(I)-F512-TK y Ad(I)-F512(E3), construidos de acuerdo con la presente invención.
La Figura 5 B muestra el perfil de restricción con la enzima HindIII, de los adenovirus Ad(I)-F512-TK y Ad(I)F512(E3), de la presente invención.
La Figura 6 muestra el efecto citopático en monocapa en distintas líneas tumorales de los adenovirus Ad-F512, Ad(I)-F512-TK y Ad(I)-F512(E3), construidos de acuerdo con la presente invención, utilizando Ad5-wt como control.
Las Figuras 7 A, 7 B, 7 C y 7 D muestran el efecto lítico en monocapa (ensayo MTT) de los adenovirus Ad-F512 y Ad(I)-F512(E3), de la presente invención, a diferentes MOIs luego de 10 días de infección; A- Melanoma, células SB2; B- Melanoma, células MleJ; C- células de colon; D- células de mama.
La Figura 8 muestra la producción de los adenovirus Ad-F512 y Ad(I)-F512(E3) de la presente invención en distintas líneas tumorales humanas.
La Figura 9 muestra el efecto cooperativo del gen E1A aportado por Ad-F512 en la replicación del adenovirus Adp-gal.
Las Figuras 10 A a 10 F muestran resultados de ensayos in vivo. La Figura 10 A muestra la curva de crecimiento tumoral para el ensayo con Ad(I)F512-TK. La Figura 10B muestra la curva de crecimiento tumoral de los animales del primer ensayo con Ad-F512. La Figura 10 C muestra tumores tratados con Ad-p-gal y con Ad-F512. La Figura 10 D muestra fotos histológicas a los 14 días de la región mostrada en 10 C. La Figura 10 E muestra la curva de Kaplan-Meier para el ensayo B. La Figura 10 F muestra la curva de Kaplan-Meier del segundo ensayo con Ad-F512.
La Figura 11 muestra el efecto citopático en monocapa de CRAds de Ad-F512, Ad(I)-F512-TK y Ad(I)-F512 (E3) de la invención. Se muestra el efecto lítico (tinción con cristal violeta) de los CRAds en monocapas de células en concentraciones diferentes luego de 10 días post-infección.
Las Figuras 12A a 12E muestran el efecto citopático de CRAds de Ad-F512, Ad(I)-F512-TK y Ad(I)-F512 (E3) de la invención en células normales; la Figura 12A muestra fotografías de CRAds tomadas 10 días pos-infección en melanocitos normales; se incluyen fotografías de AD-wt y controles de no-tratamiento (PBS); la Figura 12B muestra el efecto citopático sobre células normales de colon CCD841; la Figura 12C muestra el efecto citopático sobre células de mama normales MCF12A; la Figura 12D muestra el efecto lítico sobre células microendoteliales; la Figura 12E muestra el efecto viral sobre queratinocitos y fibroblastos (CCD1140 y Malme-3).
Las Figuras 13A a 13C muestran el efecto citopático en monocapa de Ad(I)-F512-TK; el efecto lítico (teñido con cristal violeta o sobrevida medida mediante MTT) de Ad(I)-F512-TK sobre monocapas de células a diferentes concentraciones virales después de 10 días pos-infección en presencia o ausencia de la prodroga GCV. La Figura 13A muestra el ensayo con células de melanoma SB2; la Figura 13B muestra la sobrevida de células hMEC-1 en presencia de GCV y GCV + virus; la Figura 13C muestra el efecto citopático sobre células BAEC.
Las Figuras 14A a 14D muestran ensayos in vivo con tumores de melanoma; la Figura 14A muestra ensayos con tumores SB2/WI-38/hMEC-1 tratados con Ad-F512; la Figura 14B muestra tumores SB2/Wl-38 tratados Ad-F512; La Figura 14C muestra tumores SB2/hMEC-1 tratados con Ad-F512; La Figura 14D muestra tumores SB2/WI-38 tratados con Ad(I)-F512-TK + GCV, n=5 o PBS+GCV, n = 4, donde n es el número de animales tratados.
Las Figuras 15A a 15D muestran ensayos in vivo con tumores de colon y páncreas; la Figura 15A muestra ensayos sobre tumores LoVo tratados con Ad-F512 (n=7), Ad(I)-F512-TK (n=6) o PBS (n=7); la Figura 15B muestra el promedio de tumores LoVo/hMEC-1 tratados con Ad-F512 (n=6), Ad(I)-F512-TK + GCV (n=6) o PBS + GCV (n=6); la Figura 15C muestra el crecimiento tumoral de Mia-PaCa/hMEC-1 tratado con Ad-F512 (n=6), Ad(I)F512-TK + GCV (n=6) o PBS + GCV (n=5). En todos los casos n indica el número de animales tratados.
Descripción detallada de la invención
[0020] Como se definió anteriormente, en un aspecto principal, la presente la invención provee una secuencia aislada de ADN que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste de SEQ ID NO 1, que corresponde a una región del promotor del gen SPARC humano desde –513 pares de bases hasta +35 pares de bases.
[0021] El término “aislada”, como se lo utiliza en la presente, significa sustancialmente separada o purificada respecto de secuencias contaminantes en la célula u organismo en los que está presente naturalmente el ácido nucleico e incluye ácidos nucleicos purificados mediante técnicas de purificación estándar así como ácidos nucleicos preparados mediante tecnología recombinante así como de síntesis química.
[0022] El término “variante” como se utiliza en la presente se refiere a una molécula de ADN en donde la secuencia de nucleótidos es sustancialmente idéntica a la secuencia establecida como SEQ ID NO 1. La variante se puede lograr mediante modificaciones tales como por inserción, sustitución o deleción de uno o más nucleótidos, si tales modificaciones son mutaciones neutras y no afectan el funcionamiento de la molécula de ADN.
[0023] Un “fragmento” de secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención, es una porción de secuencia de ácidos nucleico que es menor que la longitud completa y comprende al menos una longitud mínima capaz de hibridizarse específicamente con la secuencia de ácido nucleico de la presente invención bajo condiciones de astringencia, conservando dicho fragmento las condiciones biológicas requeridas en la presente invención.
[0024] La presente invención provee también un constructo de expresión recombinante efectivo para dirigir la transcripción de una secuencia codificante seleccionada que comprende: (a) una secuencia de ADN que corresponde al promotor humano de SPARC; y (b) una secuencia codificante de un gen de interés, operablemente ligada al promotor de (a) de modo que la secuencia del gen de interés pueda ser transcripta y traducida en una célula huésped.
[0025] De acuerdo con una realización la secuencia de ADN que corresponde al promotor humano de SPARC preferida desde –513 pares de bases hasta +35 pares de bases de acuerdo a la secuencia mostrada en SEQ ID NO 1 del Listado de Secuencias.
[0026] Un gen “heterólogo” tal como utilizado en la presente, significa una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos o proteína de interés, en asociación con otra secuencia de ADN, tal que dicha asociación no se encuentra en la naturaleza.
[0027] En general tal como utilizado en la presente “un gen terapéutico” significa una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos o proteína, capaz de ejercer un efecto terapéutico sobre las células huésped. Preferiblemente, de acuerdo con una realización de la presente invención las células huésped son células tumorales, más particularmente la células tumorales son células de melanoma, células de mama, células de colon, células de cervix.
[0028] De acuerdo con una realización preferida, el gen de interés puede ser seleccionado de: el gen de E1A, un gen suicida tal como el gen hsv-TK, la región genómica adenoviral denominada E3, el gen de una interleuquina tal como IL-10, IL-12 o IL-23, etc
[0029] De acuerdo con realizaciones particulares, la secuencia polinucleotídica SEQ ID NO 1 que corresponde a una región del promotor humano del gen SPARC, de acuerdo con la presente invención puede dirigir genes solos o puede estar asociada con secuencias de respuesta a irradiación, hipoxia, radicales libres, etc. Estas son secuencias de ADN definidas, las cuales suelen estar posicionadas río arriba de dicho promotor. Uno de los ejemplos característicos de este tipo de combinaciones es el del uso del elemento de respuesta a hipoxia (HRE) que ya ha sido utilizado para potenciar la actividad transcripcional de un promotor o elemento respondedor en condiciones de baja tensión de oxígeno. Hernandez-Alcoceba y colaboradores han utilizado los elementos de respuesta a hipoxia (HRE) para potenciar la respuesta de un promotor conteniendo elementos de respuesta a estrógeno (ERE) en tumores de mama (Hernandez-Alcoceba R, Pihalja M, Nunez G, Clarke MF, Evaluation of a new dual-specificity promoter for selective induction of apoptosis in breast cancer cells Cancer Gene Ther. 2001 Apr;8(4):298-307). Estos mismos elementos de respuesta a hipoxia han sido combinados con elementos de respuesta a radiación (Greco O y col., Novel chimeric gene promoters responsive to hypoxia and ionizing radiation. Gene Ther 2002; 9: 1403-1411). Pueden estar formando parte de un adenovirus replicativo o no replicativo, (Ido A, Uto H, Moriuchi A, Nagata K, Onaga Y, Onaga M, Hori T, Hirono S, Hayashi K, Tamaoki T, Tsubouchi H., Gene therapy targeting for hepatocellular carcinoma: selective and enhanced suicide gene expression regulated by a hypoxia-inducible enhancer linked to a human alpha-fetoprotein promoter, Cancer Res. 2001 Apr 1;61(7):3016-21; Park JO, Lopez CA, Gupta VK, Brown CK, Mauceri HJ, Darga TE, Manan A, Hellman S, Posner MC, Kufe DW, Weichselbaum RR., Transcriptional control of viral gene therapy by cisplatin. J Clin Invest. 2002 Aug;110(3):403-10.; Cowen RL, Williams KJ, Chinje EC, Jaffar M, Sheppard FC, Telfer BA, Wind NS, Stratford IJ, Hypoxia targeted gene therapy to increase the efficacy of tirapazamine as an adjuvant to radiotherapy: reversing tumor radioresistance and effecting cure. Cancer Res. 2004 Feb 15;64(4):1396-402).
[0030] De acuerdo con la invención, se provee además un método para expresar ADN foráneo en una célula huésped que comprende introducir en la célula huésped un constructo de expresión recombinante de ADN o un vector viral recombinante de expresión de la invención que comprende la molécula promotora de secuencia
polinucleotídica SEQ ID NO.1 operablemente ligada a un ADN foráneo que codifica un polipéptido o ARN deseado, en donde se expresa dicho ADN foráneo.
[0031] La introducción de ADN en las células huésped podrá llevarse a cabo mediante cualquier constructo e incluye plásmidos, virus de ADN, retrovirus, así como moléculas de nucleótidos aisladas. También puede utilizarse transferencia mediada por liposomas.
[0032] Un ejemplo de tales virus de ADN que pueden ser empleados en la presente invención son los adenovirus. Son bien conocidos más de 40 diferentes serotipos de adenovirus humano, siendo el adenovirus Ad5 especialmente preferido como vector viral en la presente invención, aunque no se descartan adenovirus Ad5 de cápside y/o fibra modificados, tales como con la cápside del adenovirus 3 o la modificación de la fibra con un motivo RGD.
[0033] La construcción de los vectores adecuados que contienen la secuencia promotora y la secuencia de gen terapéutico deseado puede ser realizada mediante técnicas de ligación y restricción estándar, que son bien conocidas en el arte. Los cortes de ADN en sitio específico se realizaron mediante tratamiento con enzimas de restricción apropiadas, en las condiciones indicadas por el proveedor, durante aproximadamente 3-16 horas. En general los resultados de la restricción se pueden verificar por separación electroforética en geles de agarosa (0,8-1,6%) en solución TAE (40 mM de triacetato, 2mM de Na2EDTA.2H2O, pH 8,5), utilizando bromuro de etidio y visualizados con luz UV en trans-iluminador (Ultraviolet Products Inc., Upland, CA). Las ligaciones se realizan mediante la ADN ligasa del bacteriófago T4, siguiendo los protocolos del proveedor (New Englands Biolabs Inc., Beverly, MA). Se utilizaron relaciones inserto:vector de 1:1 hasta 3:1, calculando la razón entre los fragmentos por la siguiente fórmula:
*
[0034] En la construcción de un vector, es ventajoso poder distinguir el vector que incorpora ADN foráneo de vectores no modificados mediante un rápido ensayo. Se conocen sistemas marcadores que comprenden en general un gen cuya expresión confiere un fenotipo identificable a las células transformadas cuando las células se hacen crecer en un medio apropiado. El gen p-galactosidasa es por ejemplo un gen detectable en clones que exhiben un fenotipo azul en placas con X-gal.
[0035] Esta invención involucra dirigir un gen de interés hacia una célula tumoral de modo que la proteína codificada por el gen se exprese y, directa o indirectamente mejore el estado de enfermedad.
[0036] De acuerdo con una realización particular de la invención, se prepara un vector CRAd u oncolítico (Adenovirus Oncolítico de Replicación Condicionada) sobre la base de un adenovirus, que comprende un gen de la proteína E1A, bajo la regulación de un fragmento de la secuencia de ADN del promotor de SPARC. Ventajosamente, los CRAds de la invención dirigen la expresión de E1A en distintos tipos de células tumorales (melanoma, mama, colon, cervix) ocasionando la lisis y eliminación por la replicación del propio virus. También ventajosamente, los CRAds de la invención conteniendo el gen de E1A, tal como se ejemplifica más adelante, tienen actividad lítica atenuada en células normales (mesenquimales, endotelio y fibroblastos) dado que su expresión está dirigida por un promotor que se expresa principalmente en células tumorales.
[0037] Asimismo, de acuerdo a otra realización particular se preparan vectores CRAds que comprenden además, un gen suicida tal como por ejemplo timidina quinasa del virus del herpes simplex (hsv-TK) que codifica para una enzima que es capaz de fosforilar a las pro-drogas aciclovir/ganciclovir. Bajo la forma fosforilada, el agente antiherpético se incorpora a la molécula de ADN, evitando su duplicación y provocando la muerte celular. Los CRAds preparados de acuerdo con esta realización particular, dirigen la expresión de hsv-TK en los distintos tipos de células tumorales, completando la acción lítica y al tiempo que tiene una actividad atenuada en células normales dado que su expresión está dirigida por un promotor que se expresa principalmente en células tumorales.
[0038] Asimismo, de acuerdo con otra realización particular se preparan vectores CRAds que comprenden además, una región genómica adenoviral denominada E3 que codifica para 9 proteínas. Entre ellas se destaca la ADP (Adenoviral Death Protein) que promueve la lisis celular tardía en el ciclo de infección viral para permitir la liberación de los viriones maduros al microambiente celular. Los CRAds conteniendo la región E3 potencian la actividad lítica de E1A, al tiempo que tiene una actividad lítica atenuada en células normales dado que su expresión está dirigida por un promotor que se expresa principalmente en células tumorales
[0039] Los constructos o vectores de la presente invención pueden ser administrados a un paciente en necesidad de ellos, mediante inyección, administración oral o tópica, vehiculizados en un portador adecuado. Portadores adecuados pueden ser de tipo acuoso, lipídico, liposomal, etc.
[0040] Se utilizó análisis de varianza (ANOVA) seguido del test de Tukey para el análisis de los datos de los estudios de luciferasa, esferoides y los experimentos in vivo. Un valor P menor a 0,05 fue considerado significativo. Asimismo, las curvas de sobrevida fueron realizadas según el método de Kaplan-Meyer y las comparaciones estadísticas entre los diferentes grupos se realizó aplicando log-rank test.
[0041] Esta invención se ilustra a continuación mediante ejemplos experimentales detallados. Dichos ejemplos están destinados a proporcionar un mejor entendimiento de la invención, sin que deba considerarse a los mismos como limitando de ningún modo la invención, cuyo alcance se establece en las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS
[0042] Se evaluaron los niveles producidos de ARN mensajero (ARNm) de la proteína SPARC por Real-Time PCR en líneas celulares tumorales y en líneas celulares normales.
[0043] Las líneas humanas HeLa (cáncer de cervix, ATCC N° CCL-2), T-47D (cáncer de mama, ATCC N° HTB133), WI-38 (fibroblastos fetales pulmonares, ATCC N° CCL-75), WI-38 VA (fibroblastos fetales pulmonares transformados, ATCC N° CCL-75.1), HFL-1 (fibroblastos, ATCC N° CCL-153), 293 (embrionales de riñón, ATCC N° CRL-1573), LoVo (cáncer de colon, ATCC N° CCL-229), HCT-116 (cáncer de colon, ATCC N° CCL-247), CaCO2 (cáncer de colon, ATCC N° HTB-37), HT-29 (cáncer de colon, ATCC N° HTB-38), T84 (cáncer de colon, ATCC N° CCL-248) y las células endoteliales de aorta (Bovine Aortic Endothelial Cells, BAEC ATCC N° CRL1395) fueron obtenidas de ATCC (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA). Las líneas celulares humanas de melanoma IIB-MEL-LES y IIB-MEL-J-N fueron previamente descritas por Ledda y col., 1997; las líneas humanas de melanoma SB2, A375N y MEL-888 fueron gentilmente cedidas por Dr. Estela Medrano (Houston, Texas). Todas las células fueron cultivadas en el medio recomendado suplementado con suero fetal bovino 10% (Natocor, Carlos Paz, Argentina), 2,5 U/ml de penicilina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) y 2,5 Jg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) y mantenidas a 37°C con una atmósfera de CO2 5%. Mientras que las células BAEC fueron suplementadas con SFB 5%.
[0044] La cuantificación relativa de los niveles de ARNm de SPARC fue llevada a cabo según lo descrito por Pfaffl, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res, 29: e45, 2001. El ARN total fue extraído usando Tri Reagent (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). 5 Jg de ARN se retrotanscribieron con 200U de SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando 500 ng de cebadores Oligo(dT). La reacción de Real-Time PCR del ADNc fue llevada a cabo en un termociclador iCycler iQ System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La reacción se llevó a cabo en un volumen de 25 Jl conteniendo 1 unidad de Platinum® Taq DNA polymerasa (Invitrogen), 1X PCR Reaction Buffer (20 mM Tris–HCl, pH 8,4, y 50 mM KCl), 1,5 mM Mg2Cl, 2,5 Jg BSA, 0,01% glicerol, 0,4 JM de cada cebador específico: SPARC (SRTse; AACCGAAGAGGAGGTGGTG, SEQ ID NO 2 /SRTas; GCAAAGAAGTGGCAGGAAGA, SEQ ID NO 3) y p-actina (Acse; AGAAAATCTGGCACCACACC, SEQ ID NO 4 /Acas; CAGAGGCGTACAGGGATAGC, SEQ ID NO 5) 200 !M de dNTPs y 0,3 X de la solución de SYBR Green. Las condiciones de la reacción fueron 90 segundos a 94ºC y luego 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 30 segundos a 72ºC. Cada reacción se realizó por triplicado y los resultados obtenidos para SPARC fueron normalizados con los resultados obtenidos simultáneamente para p-actina.
[0045] Los resultados se muestran en la Figura 2, donde se observa que las células de melanoma A375N expresan los mayores niveles de ARNm de SPARC. El resto de las líneas de melanoma expresan niveles bajos a moderados de ARNm comparados con A375N. Se observó que las líneas de cáncer de mama (T-47D), cervix (HeLa) y colon (LoVo, HCT-116, CaCO2, HT-29 y T84) expresan niveles despreciables de SPARC. En la línea de riñón se han observado niveles bajos de expresión de SPARC, mientras que las líneas de fibroblastos presentan valores moderados de expresión y una línea de endotelio aórtico bovino (BAEC) expresa niveles de ARNm más altos que A375N.
Ejemplo 2.- Clonado de 11 fragmentos del promotor humano de SPARC en los plásmidos pGEM y TOPO
[0046] Un análisis de la secuencia del promotor humano de SPARC realizada por los inventores de la presente, reveló además de los 2 posibles sitios de inicio de transcripción que ya habían sido descriptos, INR1 e INR2 (ver la anteriormente citada Figura 1), una secuencia DPE (Downstream Promoter Elements) presente entre las bases +29-+33. La secuencia DPE fue descripta en promotores de Drosophila y se le atribuye un rol en el armado del 5 transcriptosoma en los promotores que no contienen secuencias TATA (Kadonaga, J.T. The DPE, a core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Exp Mol Med, 34: 259-264, 2002). A partir de este análisis se decidió hacer una mutación dirigida del promotor. Para ello se trabajó con los extremos 5´: -1175 (con el propósito de clonar el promotor completo), -513 (por analogía con el promotor bovino) y –120 (que incluye exactamente la secuencia GGA1). Las mutaciones del extremo 3´ incluyen el exón 1 entero y diversas deleciones 10 que incluyen o no a la secuencia DPE (+24, +28, +35, +71). En la Figura 3 se muestran dos esquemas del promotor de SPARC de donde derivan distintos fragmentos. Se indican las ubicaciones de las cajas GGA, de la secuencia TATA-like, de los posibles sitios de inicio de transcripción (INR) y la secuencia DPE. Se señalan las distintas cotas que fueron utilizadas para construir los fragmentos promotores de SPARC. En el extremo 5´ se clonaron hasta las bases –1175, -513 y –120; mientras que desde el extremo 3´ se clonaron hasta las bases +24,
15 +28, +35 y +71. Se indica además, la región delecionada entre las cajas GGA, esta deleción da origen al fragmento –1175/+71A10.
[0047] Se amplificó por PCR un fragmento de 1246 pb de la región promotora humana de SPARC (-1175 a +71 pb relativo al sitio de inicio de la transcripción) a partir de ADN genómico de linfocitos humanos, con los oligonucleótidos Spfse y SPP3´2 (ver Tabla 1). Este producto de PCR, -1175/+71 fue clonado en el vector pGEM
20 T-easy (Promega Corp., Madison, WI) para obtener pGEM (-1175/+71). Este plásmido se usó como templado de las variantes del promotor, cuyos fragmentos fueron amplificados a su vez por PCR, utilizando los cebadores tal como se detalla en la Tabla 1 siguiente:
Tabla 1
[0048] El ciclo de amplificación corresponde a una desnaturalización inicial de 94 °C durante 3 minutos, seguida de 35 ciclos de amplificación: 94 °C, 1 minuto, T annealing (variable depende de cada producto, Tabla I), 1 minuto, y 72 °C 2 minutos, seguido de una extensión final a 72 °C de 10 minutos. Las PCRs fueron llevadas a
5 cabo en el termociclador PTC-200 (MJ Research Inc.,Whaltam, MA). [0049] Los productos de PCR fueron clonados en una primera instancia en los vectores pGEM-t-easy (Promega Corp., Madison, WI) ó TOPO-pCR4 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), obteniéndose los vectores: a-pGEM(-1175/+71), (SEQ ID NO 17), promotor completo. La secuencia +1- +70, incluye el primer exon que no se traduce. 10 b-pGEM(-1175/+71A10) (SEQ ID NO 18). Este promotor es una modificación del promotor completo de SPARC -1175/+71, en el cual se delecionó una secuencia de 10 pb que es considerada inhibidora de la transcripción que está comprendida entre las dos cajas GGA (Hafner, M. y col., 1995). Para ello se aplicó la técnica de extensión por solapamiento (PCR SOE), y se utilizaron dos fragmentos del promotor de SPARC que habían sido clonados previamente en el laboratorio: Spdel1.1Kb de 1084 pares de bases y GGA1 de
15 209 pares de bases. El producto final de PCR se clonó en el vector pGEM y la deleción fue confirmada por secuenciación. c-TOPO(-1175/+35), (SEQ ID NO 19), incluye la secuencia DPE d-TOPO(-1175/+28), (SEQ ID NO 20), excluye la secuencia DPE e-TOPO(-513/+71), (SEQ ID NO 21), incluye el primer exón completo.
20 f-TOPO(-513/+35), (SEQ ID NO. 1), incluye la secuencia DPE e-TOPO(-513/+28), (SEQ ID NO. 22), excluye la secuencia DPE h-TOPO(-513/+24), (SEQ ID NO 23), incluye hasta la secuencia INR2 i-TOPO(-120/+71), (SEQ ID NO 24), incluye el primer exón completo j-TOPO(-120/+35), (SEQ ID NO 25), incluye la secuencia DPE
25 k-TOPO(-120/+28), (SEQ ID NO 26), excluye la secuencia DPE
[0050] Los promotores obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 2 fueron subclonados en los sitios MluI/BglII, MluI/XhoI o NheI/XhoI del plásmido pGL3-Basic (Promega Corp., Madison, WI, USA) aguas arriba del gen reportero luciferasa. Todas las clonaciones fueron comprobadas por perfiles de restricción y mediante la secuenciación de los vectores (pGEM, TOPO y/o pGL3) con los cebadores universales T7 (TACGACTCACTATAGGG; SEQ ID NO 27); Sp6 (ATTTAGGTGACACTATAG; SEQ ID NO 28), T3 (ATTAACCCTCACTAAAGGGA; SEQ ID NO 29) ó P2 (CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA; SEQ ID NO 30) y P3 (CTAGCAAAATAGGCTGTCCCC; SEQ ID NO 31).
[0051] El plásmido pGL3-Basic contiene el gen reportero luciferasa de Firefly modificado (luc+) para evitar la unión de factores reguladores génicos, eliminar sitios de restricción, evitar el transporte proteico a peroxisomas y la presencia de una secuencia de Kozak en el extremo 5’ del gen luciferasa para optimizar la eficiencia de traducción. La presencia del gen reportero luciferasa permitió cuantificar la actividad promotora de SPARC de los 11 fragmentos obtenidos en el Ejemplo 2, mediante la medición de la actividad de la enzima luciferasa. El ensayo se realizó en tres líneas celulares, utilizando como modelo la línea A375N (melanoma) que expresa altos niveles de SPARC y las líneas HeLa (cervix) y T-47D (mama), que no expresan SPARC, de acuerdo a las enseñanzas del anterior Ejemplo 1.
[0052] Las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos con una densidad de 4 x 104 células/pocillo. A las 24 horas fueron transfectadas utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) según las condiciones indicadas por el proveedor. Cada tratamiento se realizó al menos por duplicado en cada línea celular, incubando 0,8 Jg de plásmido de tratamiento con 0,1 Jg de plásmido pRL-CMV durante 5 minutos con 50 Jl de medio DMEM sin antibiótico y, simultáneamente, 1 Jl de Lipofectamine2000 con 50 Jl del mismo medio. Se mezclaron estas dos preparaciones y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se removió el medio con suero de las células, se lavó con PBS y agregó 200 Jl de DMEM alta glucosa sin suero y sin antibióticos; posteriormente se agregó 100 Jl de medio conteniendo la mezcla de lipofección y a las 4 horas se agregaron 800 Jl de medio de cultivo correspondiente a cada línea celular, suplementado con SFB. Las células utilizadas fueron mantenidas durante 46 horas en estufa a 37ºC con 5% CO2. Se utilizó el kit Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega Corp., Madison, WI) para el ensayo de luciferasa. Este sistema implica la expresión simultánea de dos enzimas reporteras individuales en un mismo sistema, pudiéndose evaluar la actividad producida por las enzimas luciferasa de la luciérnaga Firefly (Photinus pyralis) y del celenterado Renilla (Renilla reniformis) en un sólo ensayo secuencial (Sherf, B.A. y col., Dual Luciferase Reporter Assay: An Advanced Co-Reporter Technology Integrating Firefly and Renilla Luciferase Assays. Promega Notes Magazine: 2-9, 1996). Los datos se normalizaron de la siguiente manera:
[0053] Los datos se expresan como cantidad de inducción relativa a la actividad obtenida con el plásmido control pGL3-Basic (sin promotor). Los resultados se muestran en la Figura 4A. Como control de transfección se utilizó el plásmido pGL3-promoter (pGL3-prom, Promega Corp., Madison, WI) en el cual el promotor viral de SV40 dirige la expresión de la enzima luciferasa.
[0054] La menor actividad promotora en líneas de melanoma se observó con el promotor completo de SPARC (-1175/+71). La mayor inespecificidad fue observada con el fragmento -120/+71 y el fragmento que mostró mayor especificidad y mayor actividad en la línea que expresa SPARC resultó ser -513/+35 (Figura 4A). A través de este análisis se seleccionó el promotor -513/+35 (de ahora en más, F512) para continuar con su caracterización en comparación con el promotor -1175/+71.10 denominado Spdel dado que tenía la misma actividad en la línea de melanoma A375N que F512.
Ejemplo 3B.- Selección de un fragmento del promotor humano de SPARC
[0055] Se ensayaron los dos promotores F512 y Spdel con similar actividad promotora identificados a través del anterior Ejemplo 3A, en distintas líneas celulares tumorales y normales (ver referencias en Ejemplo 1). Los resultados se muestran en la Figura 4B.
[0056] A partir de los resultados comparativos, se observa que Spdel presenta en promedio 140 veces mayor actividad, con respecto al vector vacío pGL3-Basic, tanto en las líneas tumorales como en las normales, con la excepción de la línea de melanoma MEL888 en donde su actividad es de 430 veces (Figura 4B). La actividad de Spdel resulta por lo tanto independiente de la expresión de SPARC de la línea celular utilizada.
[0057] El promotor F512 resultó ser activo en las líneas de melanoma y en la línea de endotelio BAEC que tiene la mayor expresión de SPARC. La línea SB2 tiene la menor actividad del promotor, aproximadamente 1/3 de la actividad observada en A375N, coincidiendo este resultado con la relación de expresión de ARNm de SPARC (Figuras 2 y 4B). Sorprendentemente, en dos líneas de melanoma Mel888 y MelJ la actividad es 3,5 a 4 veces mayor que para A375N. Estos resultados muestran que el fragmento F512 es activo en las líneas de melanoma pero que su comportamiento no siempre es coincidente con la expresión de ARNm de SPARC. A diferencia de Spdel que tiene la misma actividad en todas las líneas, F512 tiene menor actividad en las líneas con escasa o nula expresión de SPARC como las de colon (T84, LoVo), glioma (U87) o cervix (HeLa) (Figura 4B). Sin embargo, esta actividad no es despreciable sino que por el contrario en algunos casos como T84 llega a la mitad de la actividad observada para las líneas de melanoma. Por otra parte, el promotor también es activo en la línea de fibroblasto utilizada (WI-38 VA).
[0058] Estos resultados permitieron seleccionar al promotor F512 para dirigir la expresión de genes de interés en un adenovector.
Ejemplo 4.- Construcción de un plásmido shuttle conteniendo F512 aguas arribas del gen E1A.
[0059] La construcción de un plásmido shuttle conteniendo los genes de interés se llevó a cabo a partir del vector shuttle pADPSY, que contiene el extremo izquierdo del adenovirus humano tipo 5 al que se le han delecionado los genes de las regiones E1 (necesarios para su replicación) y E3. A su vez, en la región AE1 se ha insertado el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y la señal de poliadenilación del virus SV40 (Mariano
J. Alvarez, Federico Prada, Edgardo Salvatierra, Alicia I. Bravo, Viviana P. Lutzky, Cecilia Carbone, Fernando J. Pitossi, H. Eduardo Chuluyan y Osvaldo L. Podhajcer; Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine Produced by Human Melanoma Cells Modulates Polymorphonuclear Leukocyte Recruitment and Antitumor Cytotoxic Capacity; Cancer Research 65, 5123-5132, June 15, 2005). Con el propósito de mejorar este vector de tal manera de aumentar la variedad de sitios únicos de clonado se diseñó e incluyó un sitio de clonado múltiple (SCM) en reemplazo del promotor RSV, obteniéndose el plásmido pAd-Xp (SEQ. ID. NO 32); este vector fue secuenciado para verificar la presencia del sitio de múltiple clonado.
[0060] En los últimos años muchos trabajos demostraron que los promotores que resultaban específicos de determinado tipo celular, no se comportaban como tales cuando se los introducía en el genoma viral (Steinwaerder, D. S. y Lieber, A. Insulation from viral transcriptional regulatory elements improves inducible transgene expression from adenovirus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther, 7: 556-567, 2000.). Esto se debe a que las secuencias de ITR (repeticiones terminales invertidas) y la señal de encapsulación del genoma del adenovirus presentan enhancers que influyen en la actividad de los promotores modificando su especificidad (Hearing, P. y Shenk, T. The adenovirus type 5 E1A enhancer contains two functionally distinct domains: one is specific for E1A and the other modulates all early units in cis. Cell, 45: 229-236, 1986.). Este problema se puede evitar en parte mediante la utilización de secuencias llamadas insulators que aíslen la actividad del promotor y le permitan ejercer su especificidad (Steinwaerder, D. S. y col., 2000; Martin-Duque, P., Jezzard, S., Kaftansis, L., y Vassaux, G. Direct comparison of the insulating properties of two genetic elements in an adenoviral vector containing two different expression cassettes. Hum Gene Ther, 15: 995-1002, 2004.). A partir de estos hallazgos se decidió clonar, en el SCM del vector shuttle pAd-Xp, una secuencia insulator (la señal de stop de la hormona de crecimiento bovina (Martin-Duque, P. y col., 2004)) dando lugar al nuevo vector shuttle pAd(I)-Xp (SEQ. ID. NO 33). La secuencia insulator fue amplificada por PCR utilizando los cebadores INSU-F-SpeI (CCACTAGTGCTAGAGCTCGCTGATCAGC; SEQ. ID. NO 34) y INSU-R-KpnI (CGGTACCATCCCCAGCATGCCTGC; SEQ. ID. NO 35). EL producto de esta reacción fue clonado en TOPOpCR4 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y posteriormente subclonado en los sitios SpeI y KpnI de pAd-Xp, dando lugar a pAd(I)-Xp.
[0061] El ADNc de la proteína E1A fue clonada por PCR a partir de ADN genómico de células embrionarias de riñón humano 293 (ATCC N° CRL-1573) que la expresan constitutivamente. Se amplificó por PCR un fragmento correspondiente a los nucleótidos 560-1632 del genoma del virus. Este fragmento fue clonado en el vector TOPOpCR4 (SEQ ID NO 36 y SEQ ID NO 37) y secuenciado para verificar la identidad de la secuencia. Las construcciones fueron subclonadas en el vector de expresión pcDNA3 y expresadas en células HeLa. Se realizó un Western Blot del lisado completo de las proteínas y se pudieron identificar con el anticuerpo anti-E1A (BD Pharmigen, #554155).
[0062] En una primera etapa se clonó el gen de la proteína E1A en los vectores pAd(I)-Xp y pAd-Xp. Para ello se extrajo el ADNc de la proteína E1A del vector TOPO-pCR4-E1A (SEQ IND NO 36) con las enzimas BglII y BamHI y se insertó en el sitio BglII de pAd(I)-Xp y pAd-Xp dando lugar a pAd(I)-Xp-E1A (SEQ. ID. NO 38) y pAdXp-E1A (SEQ. ID. NO 39). En una segunda etapa se extrajo F512 de pGL3(-513/+35) con MluI y BglII y se lo clonó en los sitios MluI y BglII de pAd(I)-Xp-E1A y pAd-Xp-E1A, dejando el ADNc de la proteína E1A aguas abajo de F512. De esta manera se obtuvieron los vectores pAd(I)-F512 (SEQ. ID. NO 40) y pAd-F512 (SEQ. ID. NO 41); las secuencias de ambos vectores fueron confirmadas mediante la secuenciación con el cebador pAd-sense (TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG; SEQ. ID. NO 42).
Ejemplo 5.- Construcción de un plásmido shuttle conteniendo F512 aguas arribas del gen suicida hsv-TK.
[0063] El ADNc que codifica para hsv-TK fue amplificado por PCR usando como molde el ADN del plásmido pAGO (Berenstein, M., Adris, S., Ledda, F., Wolfmann, C., Medina, J., Bravo, A., Mordoh, J., Chernajovsky, Y. y Podhajcer, O. L. Different efficacy of in vivo herpes simplex virus thymidine kinase gene transduction and ganciclovir treatment on the inhibition of tumor growth of murine and human melanoma cells and rat glioblastoma cells. Cancer Gene Ther, 6: 358-366, 1999) y los cebadores FTK/RTK (GCCCATGGCTTCGTACCCCGGCC; SEQ. ID. NO 43 /GCGTCGACTCAGTTAGCCTCCCCCATCTC; SEQ. ID. NO 44). El producto de esta reacción de PCR se clonó en el vector TOPO-pCR4. El plásmido TK-TOPO-pCR4 (SEQ. ID. NO 45) fue confirmado por digestión con enzimas de restricción y por secuenciación usando los cebadores universales T3 (ATTAACCCTCACTAAAGGGA; SEQ. ID. NO 29) y T7 (TAATACGACTCACTATAGGG; SEQ. ID. NO 27).
[0064] El ADNc de la enzima hsv-TK fue extraído del plásmido TK-TOPO-pCR4 (SEQ ID NO 45) mediante digestión enzimática con NcoI y SalI. Este fragmento NcoI-TK-SalI fue clonado en el vector pCITE (Invitrogen, Carlsbad, CA) aguas abajo de un sitio interno de inserción ribosomal (IRES) que permite una mayor eficiencia de traducción en ausencia de “capping”. El vector resultante pCITE-TK fue confirmado por digestión con enzimas de restricción. Posteriormente se extrajo el fragmento IRES-TK del vector pCITE-TK digiriendo con las enzimas EcoRI y SalI. El sitio EcoRI fue rellenado con la enzima Klenow y el fragmento IRES-TK-SalI fue subclonado en el vector pAd(I)-F512 obtenido en el Ejemplo 4, digerido previamente con las enzimas EcoRV y SalI. La obtención del vector resultante de esa clonación, pAd(I)-F512-TK (SEQ ID NO 46 Y SEQ ID NO 47), fue confirmada por digestión con enzimas de restricción y secuenciación con los cebadores pAd-sense (TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG; SEQ. ID. NO 42) y pAd-antisense (CACAAATTTCACAAATAAAGCATTT; SEQ. ID. Nº 48).
Ejemplo 6.- Construcción de un plásmido shuttle conteniendo F512 aguas arribas del gen codificante para la proteína verde EGFP.
[0065] El ADNc de la proteína EGFP unido a una secuencia IRES en su extremo 5’ fue extraído del plásmido pDC315-iGFP (plásmido modificado del plásmido comercial pDC315 de Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada) mediante digestión con las enzimas EcoRI y SalI. El sitio EcoRI fue rellenado con la enzima Klenow y el fragmento IRES-EGFP-SalI fue subclonado en el vector pAd(I)-F512 obtenido conforme lo descripto en el Ejemplo 4, digerido previamente con las enzimas EcoRV y SalI. La obtención del vector resultante de esa clonación, pAd(I)-F512-EGFP (SEQ ID NO 49 y SEQ ID NO 50), fue confirmada por digestión con enzimas de restricción y secuenciación con los cebadores pAd-sense (TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG; SEQ ID NO 42) y pAd-antisense (CACAAATTTCACAAATAAAGCATTT; SEQ ID NO 48).
Ejemplo 7.- Obtención del virus recombinante Ad-F512.
[0066] El plásmido pAd-F512 (SEQ ID NO 41) obtenido de acuerdo a lo descripto en el Ejemplo 4, fue linearizado con la enzima FspI y cotransfectado junto a un fragmento del adenovirus tipo 5, previamente restringido con la enzima ClaI, que incluye desde mu 2.6 a mu 100 con deleción en la región E3. La cotransfección se realizó en células 293por el método de fosfato de calcio (Ferrari, C. C., Depino, A. M., Prada, F., Muraro, N., Campbell, S., Podhajcer, O., Perry, V. H., Anthony, D. C., y Pitossi, F. J. Reversible demyelination, blood-brain barrier breakdown, and pronounced neutrophil recruitment induced by chronic IL-1 expression in the brain. Am J Pathol, 165: 1827-1837, 2004) y según el protocolo de Nevins y col. en células 293 (Nevins, J. R. Definition and mapping of adenovirus 2 nuclear transcription. Methods Enzymol, 65: 768-785, 1980). Por recombinación homóloga entre las regiones adenovirales de los dos fragmentos cotransfectados se obtuvo el adenovirus recombinante Ad-F512 (SEQ ID NO 51 y SEQ ID NO 52). Un esquema del adenovirus Ad-F512 construido se muestra en la Fig. 5A.
[0067] Una vez obtenido, el adenovirus recombinante Ad-F512 se clonó y se hizo una purificación de stock mediante un doble gradiente de cloruro de cesio (Lieber, A., He, C. Y., Kirillova, I., y Kay, M. A. Recombinant
adenoviruses with large deletions generated by Cre-mediated excision exhibit different biological properties compared with first-generation vectors in vitro and in vivo. J Virol, 70: 8944-8960, 1996). La preparación de adenovirus se tituló mediante DICT50 (Lieber, A. y col., 1996) en células 293 obteniéndose 1012 pv/ml para Ad-F512. Como control positivo de replicación en el ensayo se incluyó Ad5-wt del que se obtuvo una preparación cuyo título fue 6,8 x 1011 pv/ml.
[0068] Asimismo, para confirmar la identidad del stock viral se realizó una preparación de ADN viral, la cual se utilizó para digerir con enzimas de restricción y para secuenciar usando los cebadores internos pAd-sense (TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG; SEQ ID NO 42) y pAd-antisense (CACAAATTTCACAAATAAAGCATTT; SEQ ID N 48), (ver Figura 5B).
Ejemplo 8.- Obtención del virus recombinante Ad(I)-F512-TK.
[0069] En forma análoga a lo descripto en el Ejemplo 4, el plásmido pAd(I)-F512-TK (SEQ ID NO 46 y SEQ ID NO 47) obtenido en el Ejemplo 5, fue linearizado con la enzima FspI y cotransfectado junto a un fragmento del Ad5, previamente restringido con la enzima ClaI, que incluye desde mu 2.6 a mu 100, con deleción en la región E3. La cotransfección se realizó en células 293 por el método de fosfato de calcio (Ferrari, C. C. y col.; 2004) y según el protocolo de Nevins en células 293 (Nevins, J. R.; 1980). Por recombinación homóloga entre las regiones adenovirales de los dos fragmentos cotransfectados se obtuvo el adenovirus recombinante Ad(I)-F512-TK (SEQ ID NO 53 y SEQ ID NO 54). Un esquema del mismo se muestra en la Fig. 5A.
[0070] Una vez obtenido, el adenovirus Ad(I)-F512-TK se clonó y se hizo una purificación del stock mediante un doble gradiente de cloruro de cesio (Lieber, A. y col.; 1996). La preparación de adenovirus se tituló mediante DICT50 (Lieber, A. y col., 1996) en células 293 obteniéndose un título de 1012 pv/ml. Como control positivo de replicación en el ensayo se incluyó Ad5-wt del que se obtuvo una preparación cuyo título fue 6,8 x 1011 pv/ml.
[0071] Asimismo, para confirmar la identidad del stock viral se realizó una preparación de ADN viral, la cual se utilizó para digerir con enzimas de restricción y para secuenciar usando los cebadores internos pAd-sense (TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG; SEQ ID NO 42) y pAd-antisense (CACAAATTTCACAAATAAAGCATTT; SEQ ID NO 48), (Ver Figura 5B).
Ejemplo 9.- Obtención del virus recombinante Ad(I)-F512(E3).
[0072] El plásmido pAd(I)-F512-EGFP (SEQ ID NO 49 y SEQ ID NO 50) obtenido en el Ejemplo 6, fue linearizado con la enzima FspI, tal como en los Ejemplos 7 y 8, pero en este caso la cotransfección se realizó junto a otro plásmido JM17 (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada) que contiene el genoma entero del Ad5, con la excepción de la región E1, pero conteniendo la región E3. La cotransfección se realizó en células 293 por el método de fosfato de calcio (Ferrari, C. C. y col.; 2004) y según el protocolo de Nevins en células 293 (Nevins, J. R.; 1980). Por recombinación homóloga entre las regiones adenovirales de los dos fragmentos cotransfectados se obtuvo el adenovirus recombinante Ad(I)-F512(E3) (SEQ ID NO 55 y SEQ ID NO 56), cuyo esquema se muestra en la Fig. 5A, y que contiene la región E3 del virus original (Ad5).
[0073] Una vez obtenido, el adenovirus recombinante que contiene la región E3 se clonó y se hizo la purificación del stock mediante un doble gradiente de cloruro de cesio (Lieber, A. y col., 1996). La preparación de adenovirus se tituló mediante DICT50 (Lieber, A. y col., 1996) en células 293 obteniéndose un título de 1,5 x 1012 pv/ml. Como control positivo de replicación en el ensayo se incluyó Ad5-wt del que se obtuvo una preparación cuyo título fue 6,8 x 1011 pv/ml.
[0074] Asimismo, para confirmar la identidad del stock viral se realizó una preparación de ADN viral, la cual se utilizó para digerir con enzimas de restricción y para secuenciar usando los cebadores internos pAd-sense (TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG; SEQ ID NO 42) y pAd-antisense (CACAAATTTCACAAATAAAGCATTT; SEQ ID NO 48), (ver Fig. 5B).
Ejemplo 10.- Ensayos in vitro con los adenovirus Ad-F512, Ad(I)-F512-TK y Ad(I)-F512(E3) para la determinación de infectividad celular.
[0075] Para los ensayos in vitro se utilizaron los adenovirus obtenidos en los Ejemplos 7, 8 y 9. Las líneas celulares empleadas ya han sido descriptas en el Ejemplo 1.
[0076] Los virus utilizados en la presente invención están basados en el Ad5, cuya vía de entrada en las células es a través del receptor CAR (coxsackie-adenovirus receptor) e integrinas (Kanerva, A. y Hemminki, A. Adenoviruses for treatment of cancer. Ann Med, 37: 33-43, 2005). Dado que la expresión de CAR es
heterogénea, se realizaron ensayos de transducción en diferentes líneas celulares con un adenovirus no replicativo que expresa la enzima �-galactosidasa (Ad-�-gal).
[0077] Las distintas líneas tumorales y normales fueron infectadas a distintas multiplicidades de infección (MOI) con Ad-�-gal, y se registró el porcentaje de infección (ver Tabla 2). Luego de 3 días se realizó un ensayo con Xgal para revelar �-galactosidasa. Se contaron las células azules (indicador de célula infectada) y se calculó el porcentaje con respecto a las células no infectadas. Se contaron al menos tres campos diferentes.
Tabla 2
- % de infección
- MOI
- A375N HeLa LoVo T84 SB2 WI-38 WI-38 VA BAEC
- 1
- 0,03125 0,25325 0,006 0,0215 5,833333 0,02 0,24 0,0266
- 10
- 3,05 7,5 0,0095 0,64 27,9 0,41 2,86 0,85
- 100
- 27,675 21,5 2,15 10 95,2 24,69 20,5 13,9
- 500
- 35,33333 77 32,5 80,5 ND 60,35 75,25 52,6
- 1000
- 53,33333 84,75 73,33334 85 ND 91 79,65 55,94
[0078] Se observó que, a una multiplicidad de infección (MOI) de 1000, prácticamente todas las líneas están
10 infectadas al menos en un 75%, con la excepción de las células BAEC y A375N, que sólo se infectan un 50%. A una MOI menor de 100 se observa una baja infectividad de las células (aproximadamente 25%) con la excepción de la línea de melanoma SB2 que tiene una infectividad de más del 95%. A una MOI de 10 prácticamente no se ven células infectadas en ninguna línea, salvo SB2.
[0079] En resumen, la capacidad de infección de las líneas celulares testeadas sería SB2>T84>HeLa>WI-38 15 VA>WI-38>LoVo>BAEC>A375N.
Ejemplo 11.- Ensayos in vitro con los adenovirus Ad-F512, Ad(I)-F512-TK y Ad(I)-F512(E3) para la determinación de capacidad oncolítica.
[0080] A fin de comprobar la capacidad oncolítica de los adenovirus (CRAds) construidos de acuerdo con la presente invención, los mismos fueron utilizados para infectar in vitro células que poseen diferentes niveles de 20 expresión de SPARC. Particularmente, se emplearon las líneas de melanoma SB2, A375N y MelJ; las líneas WI38, WI-38 VA y HFL-1 de fibroblastos; las líneas de colon T84 y LoVo; la línea HeLa de cervix; la línea endotelial BAEC; y células mesenquimales normales. Se utilizó como control el Ad5-wt (wild type o salvaje). Se infectaron las distintas líneas tumorales con los adenovirus Ad-F512 (SEQ ID NO 51 y SEQ ID NO 52), Ad(I)-F512-TK (SEQ ID NO 53 y SEQ ID NO 54), Ad-(I)F512(E3) (SEQ ID NO 55 y SEQ ID NO 56) y Ad5-wt. El efecto lítico de los
25 adenovirus fue evaluado mediante tinción con cristal violeta de las células que permanecieron adheridas luego del experimento y a través de la cuantificación de la actividad metabólica con el ensayo de MTT.
[0081] El efecto lítico de los adenovirus fue evaluado mediante tinción con cristal violeta: Haciendo referencia a la Fig. 6, el procedimiento de infección en monocapa para el estudio del efecto citopático se describe a continuación. Las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos con una densidad de 1 x 104 células/pocillo. 30 Al día siguiente se infectaron en un volumen de 200 μl de DMEM alta glucosa 2% SFB durante 3 horas a distintas multiplicidades de infección (MOIs). Luego de la infección se agregaron 800 μl del medio correspondiente de cada línea celular. Diez días después se tiñeron las células con cristal violeta (solución 0,75 % en 40% de metanol) o tinción de �-galactosidasa, y en este último caso se contaron dos campos o más para registrar el porcentaje de infección. En la Figura 6 se muestra una fotografía del ensayo tinción con cristal violeta en placa, para las
35 distintas líneas celulares empleadas.
[0082] El efecto lítico de los adenovirus fue evaluado a través de la cuantificación de la actividad metabólica con el ensayo de MTT: El ensayo de MTT (viabilidad celular) se basa en el clivaje de la sal amarilla de tetrazolio en un compuesto de color púrpura (formazan). Esta reacción sólo ocurre en células metabólicamente activas que tienen la enzima succinato-tetrazolio reductasa presente en la cadena respiratoria de las mitocondrias. El efecto lítico
medido en función de la actividad metabólica (ensayo MTT) se muestra en la Figura 7. En este ensayo se sembraron placas de 96 pocillos con una densidad de 5 x 103 células/pocillo y el día posterior se infectaron durante 2 horas en un volumen de 25 μl (DMEM alta glucosa 2%). Luego de 2 horas se adicionó 100 μl del medio correspondiente de cada línea. Diez días después se cuantificó la viabilidad celular por el método de MTT (Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 65: 55-63, 1983).
[0083] Los ensayos de viabilidad con MTT se muestran en la Figura 7. En líneas generales, se observa una actividad lítica para los diversos tipos celulares similar a la mostrada por cristal violeta; sólo que en este caso se observó mayor viabilidad para cada MOI que en las correspondientes tinciones con cristal violeta. En estos ensayos se incluyeron tres líneas de cáncer de mama (578T, MCF7 y T-47D), todas con muy baja expresión de SPARC, y en el caso de T-47D con baja actividad de F512. Sorprendentemente, dos de las líneas (MCF7 y T47D) resultaron susceptibles a los CRAds a una MOI de 100.
[0084] Sorprendentemente, todas las células tumorales fueron lisadas por los CRAds. Sin embargo, la actividad lítica de los CRAds en las células tumorales resultó independiente del grado de expresión de ARNm de SPARC o de la actividad del promotor en la línea celular. Así, por ejemplo, para células de melanoma, todos los virus resultaron más efectivos en SB2 que en MelJ o A375N. Este resultado es coincidente con la infectividad de las células pero no con la actividad del promotor o la expresión de SPARC. Dado que los virus poseen diferente capacidad de infección en cada línea, la comparación entre los diferentes virus se realizó principalmente dentro de la misma línea celular. En primer lugar, SB2 se lisa con mayor efectividad con Ad(I)-F512(E3) > Ad-F512 ~ Ad(I)-F512-TK±GCV, mientras que en MelJ (en donde el promotor mostró una actividad mucho mayor) Ad(I)F512(E3) ~ Ad-F512 > Ad(I)-F512-TK±GCV.
[0085] De esta comparación resulta claro que el virus menos potente es aquel que tiene incorporada la secuencia insulator, y que el agregado de la región E3 hace más efectiva la lisis. Por otra parte, no se observa un aumento del efecto lítico al agregar GCV al cultivo de células infectadas con Ad(I)-F512-TK.
[0086] Por otro lado, se observó que las líneas de colon T84 y LoVo resultaron muy susceptibles al Ad-F512. En el caso de LoVo este efecto es más fuerte que el observado para las células SB2 de melanoma. Observamos que Ad-F512 fue capaz de lisar a fibroblastos WI-38 (los cuales expresan la proteína SPARC en forma moderada), a una MOI de 500, mientras que los dos virus que tienen una secuencia insulator entre el ITR del virus y el promotor, resultaron líticos a una MOI de 1000. El agregado de GCV aumenta ligeramente la capacidad lítica de Ad(I)-F512-TK. Dos líneas adicionales de fibroblastos (WI-38VA y HFL-1) analizadas con el virus Ad-F512 fueron pobremente lisados a MOI de 1000. En las tres líneas de fibroblastos el Ad5-wt fue capaz de lisar a una MOI de 1. Las células endoteliales no resultaron susceptibles al Ad-F512, independientemente de su alta expresión de SPARC. Las células mesenquimales primarias derivadas de medula ósea no fueron afectadas por Ad-F512 pero sí por Ad5-wt, a una MOI de 100.
[0087] En conclusión, el F512 en el contexto de tres adenovectores resulta lítico en la mayor parte de las líneas tumorales, mientras que no afecta a células normales como mesenquimales, endotelio, y algunos fibroblastos.
Ejemplo 12.- Producción de virus en diferentes líneas celulares
[0088] Con el propósito de evaluar la capacidad de replicación de los CRAds en diferentes líneas tumorales, se llevó a cabo un ensayo de “Producción de Virus” (virus yield). Los resultados del mismo se muestran en la Figura
8.
[0089] El procedimiento general para la producción de virus en las distintas líneas celulares se describe a continuación:
[0090] El día 0 se sembraron 100000 células en cada pocillo de una placa de 6. El día 1 se infectaron las células a una MOI de 50 en un volumen de 300 μl por pocillo en medio DMEM alta glucosa al 2% SFB. La infección se llevó a cabo durante 1 hora a 37ºC con al menos dos agitaciones. Posteriormente se sacó el medio, se lavó dos veces con PBS y se agregó 1 ml del medio 10% de SFB. Luego de tres días, las células se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos y se levantaron conjuntamente con el medio. Se colocó el sobrenadante en un tubo Ependorff y se realizaron tres ciclos de congelado y descongelado con nitrógeno líquido. Posteriormente se centrifugó a 4500 rpm y se hicieron diluciones seriadas de 1/10 de ese sobrenadante en medio DMEM alta glucosa 5% de SFB y 0,01 M de HEPES. Se sembraron 100 μl de cada dilución (sextuplicado) en un pocillo de una placa de 96 que el día anterior fue sembrado con células 293 a razón de
20000 células/pocillo. Cinco días después se fijaron las células con paraformaldehído 4% y se tiñeron con la solución de cristal violeta.
[0091] Haciendo referencia a la Fig. 8, la producción de los adenovirus en las distintas líneas (melanoma, colon, mama, fibroblastos y endotelio) está expresada como partículas virales por ml (pv/ml), y cada barra representa el promedio de al menos dos ensayos independientes.
[0092] En primer lugar, se destaca que la producción de los adenovirus es independiente de la expresión de ARNm de SPARC. En segundo lugar, todas las líneas muestran mayor replicación de Ad(I)-F512(E3) que del virus Ad-F512. En tercer lugar, la producción del adenovirus Ad5-wt difiere entre las distintas líneas hasta 5 órdenes de magnitud (comparar 578T con respecto a LoVo), lo cual en parte puede ser atribuido a la baja infectividad de algunas de las líneas. Por otro lado, las líneas que producen mayor cantidad de CRAds son las que presentan mayor susceptibilidad a los CRAds (líneas de colon).
Ejemplo 13.- Estudio del efecto cooperativo entre virus no replicativos y virus replicativos
[0093] Tal como se enunció anteriormente, un adenovirus no replicativo requiere del aporte en trans de la proteína E1A para poder iniciar la replicación. Cuando se amplifica un adenovirus no replicativo se utilizan las células 293 que han sido modificadas para expresar constitutivamente la proteína E1A, pero esta proteína también puede ser provista por un adenovirus replicativo. Con el propósito de estudiar la cooperación de Ad-F512 y un adenovirus no replicativo (Ad-�-gal) se infectaron células de colon T84 con una cantidad constante de Ad-gal (MOI 10) y cantidades crecientes de Ad-F512. El Ad-F512 es capaz de complementar al adenovirus no replicativo, permitiendo su replicación y distribución a las células vecinas, dado que a medida que aumenta la cantidad de Ad-F512 se observa un aumento de las células teñidas de azul que evidencian el aumento local del virus Ad-�-gal. La Figura 9 muestra la tinción de -gal para las distintas MOI ensayadas en las células de colon T84.
Ejemplo 14.- Ensayos in vivo utilizando los CRAds Ad-F512 y Ad(I)-F512-TK
[0094] Se utilizaron ratones machos atímicos N:NIH(S)-nu de 6-8 semanas de edad (obtenidos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de La Plata). Se llevaron a cabo tres ensayos in vivo diferentes utilizando los adenovirus recombinantes obtenidos de acuerdo con la presente invención: dos ensayos con Ad-F512 y uno con Ad-(I)F512-TK.
[0095] Los animales fueron inyectados subcutáneamente con un inóculo de 4 x 106 células SB2 de melanoma. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 100 mm3 (aproximadamente a los 20 días), se inició la inyección intratumoral del adenovirus a razón de 1010 pv/30 μl por dosis. Cada animal recibió un total de tres dosis a los días 0, 2 y 8 de iniciado el tratamiento. En uno de los ensayos, cuando se utilizó el CRAd que expresa en forma simultánea la enzima herpética hsv-TK, se alternó el tratamiento del adenovirus con la inyección de la prodroga ganciclovir (GCV, Cytovene®, Rotang), según lo esquematizado en la Figura 10A, donde se indican con flechas las inyecciones del CRAd, así como también el tratamiento con GCV. Esta droga fue administrada una vez al día a razón de 30 mg/kg.
[0096] El grupo control recibió la inyección de un adenovirus no replicativo (Ad--gal), que además expresa un gen que no es terapéutico, en lugar de alguno de los dos CRAds utilizados en el presente ensayo.
[0097] La Figura 10A muestra las curvas de crecimiento tumoral en el ensayo utilizando el CRAd Ad-F512-TK, donde además se indican las inyecciones efectuadas del CRAd y la administración de ganciclov. La Figura 10B muestra las curvas del crecimiento tumoral en los ratones utilizados en el ensayo con Ad-F512. La Figura 10C es una fotografía de la zona tumoral en un ratón control (inyectado con Ad--gal) y en uno tratado con el CRAd Ad-F512. La Figura 10D muestra fotografías histológicas de cortes realizados sobre algunos animales a los 14 días de iniciado el tratamiento. Las Figuras 10E y 10F son curvas de Kaplan-Meier (% de sobrevida) para los dos ensayos realizados con Ad-F512.
[0098] En los dos ensayos con el Ad-F512 se observó total remisión en la mayor parte de los tumores tratados (Figuras 10B, 10E y 10F) con la presencia de una cicatriz en el lugar del tumor (indicada con una flecha en la Figura 10C). Haciendo referencia nuevamente a las Figuras 10E y 10F, estas curvas indican que la mayor parte de los animales tratados con Ad-F512 continúan con vida luego de 90 días, ya sea porque su tumor no crece, se regresiona totalmente o crece a más baja tasa, mientras que los animales controles (tumor + Ad--gal) se mueren debido a que el tumor continúa creciendo.
[0099] Se realizaron estudios histológicos de algunos animales, que fueron fijados en formol 10% y posteriormente procesados. De esta forma, un estudio histológico de la zona de la cicatriz reveló diferencias entre los días 14 y 90 de iniciado el tratamiento: mientras que a los 14 días se observa abundante infiltrado de macrófagos con pigmentación en su interior, con focos polimorfonucleares, restos nucleares y vascularización granulomatosa (ver Figura 10D), a los 90 días se observa que el tejido se ha reparado completamente. En ambos casos se realizó la autopsia del animal entero no encontrando metástasis; sin embargo, en uno de los animales a los 90 días se observó el bazo con un foco de fibrosis y el hígado con un foco de hepatitis. Ninguno de los controles analizados mostró estas características.
[0100] Las curvas de sobrevida (Figuras 10E y 10F) en los dos ensayos con Ad-F512 son muy similares entre sí y difieren significativamente del control.
[0101] Por otro lado, haciendo referencia a la Figura 10A, el ensayo con el CRAd que expresa el gen suicida TK no mostró diferencias estadísticamente significativas en presencia o en ausencia de GCV, pero el virus resulta igualmente efectivo comparado con el control.
Ejemplo 15 – Ensayos in vitro utilizando los CRADs Ad-F512, Ad(I)-F512-TK y Ad(I)-F512(E3)
a) Análisis de líneas tumorales
[0102] En esta etapa, el análisis previo llevado a cabo como se describió en el Ejemplo 11 se extendió mediante el ensayo de otras líneas tumorales de cáncer de melanoma, colon, mama y páncreas. Se analizó el efecto citopático de virus sobre células mediante la tinción con cristal violeta de las células que permanecieron pegadas al pocillo después de 10 días de pos-infección con el adenovirus. Los resultados se muestran en la Figura 11.
[0103] Las células de melanoma Mel888 (amablemente provistas por la Dr. Estela Medrano, Houston, TX) fueron lisadas mediante adenovirus a las mismas concentraciones virales que para los ensayos con células SB2 y IIB-Mel-J (las primeras amablemente provistas por Dr. Estela Medrano, Houston, TX y las segundas por Ledda y col, Suppression of SPARC by antisense RNA abrogates the tumorigenicity of human melanoma cells, Nat. Med. 1997 Feb; 3(2):171-6) ensayado en el Ejemplo 11 anterior. Las dos líneas de colon HT29 (ATCC N° HTB-38) y CaCo-2 (ATCC N° HTB-37) incluidas en estos nuevos ensayos mostraron también la susceptibilidad de las células de colon a los CRADs construidos. Se ha encontrado que la línea de cáncer de páncreas MIA-PaCa-2 (ATCC N° HTB-22) es sensible a una concentración de adenovirus de 5 x 107 pv/ml, mientras que las cuatro líneas de 578T de mama (ATCC N° HTB-126), T-47D (ATCC N° HTB-133), MCF-7 (ATCC No. HTB-22) y MDA231 (ATCC N° HTB-26) no son afectadas por los CRAds, (ver Figura 11). En todos los casos el virus tipo salvaje (Ad5-wt) es capaz de eliminar todas las células tumorales.
b) Análisis de líneas normales
[0104] Uno de los requerimientos para utilizar un adenovirus oncolítico en un ensayo clínico es que debería ser activo en células de tumor e inactivo en células normales. A fin de establecer el nivel de atenuación en células normales de los tres virus oncolíticos construidos, se analizó su actividad en un panel de dichas células. Se incluyeron líneas celulares de melanocitos, colon y mama normales así como fibroblastos, queratinocitos y células microendoteliales humanas. Después de 10 días de pos-infección con 5 x 106 partículas virales /ml de Ad-F512, Ad(I)-F512-TK o Ad(I)-F512(E3) la viabilidad de los melanocitos fue mayor al 95% mientras que 100% de las células fueron lisadas mediante el Ad-wt (ver Figura 12A). Se mostró (ver Figura 12B) que los virus oncolíticos tampoco tuvieron ningún efecto sobre las células normales de colon CCD841 (ATCC N° CRL-1790), o de mama MCF-12A (ATCC N°CRL-10782), (ver Figura 12C). Estas líneas no tienen expresión de SPARC (ver Tabla 3 abajo). También se analizaron células microendoteliales humanas hMEC-1 (gentilmente cedidas por Isaiah Fidler, Houston, TX) con expresión de SPARC y se observó que las mismas son lisadas por los adenovirus a una alta MOI (ver Figura 12D). Posteriormente se analizaron otros componentes celulares presentes en la piel como los queratinocitos o los fibroblastos. Los primeros no producen SPARC mientras que los segundos tienen una expresión intermedia de SPARC comparada con la línea de células tumorales A375N (ver Tabla 3, abajo). En la Figura 12E se muestra el efecto viral en queratinocitos (HaCaT, gentilmente cedidas por el laboratorio Craveri) y en las células fibroblastos CCD1140 (ATCC N° CRL-2714) y Malme-3 (ATCC N° HTB-102). Se observó que ni los queratinocitos ni las líneas de fibroblastos fueron lisadas por los adenovirus.
[0105] Por consiguiente, los CRADs no lisan las células normales que no expresan SPARC (colon, mama, melanocitos, queratinocitos), lisando en cambio las células microendoteliales hMEC-1 que expresan SPARC.
Tabla 3: Expresión relativa de SPARC de las líneas celulares utilizadas en el estudio. La expresión promedio de ARNm se muestra en relación a la expresión en la línea tumoral A375N. DS: Desviación estándar
- Línea celular
- Orígen Promedio DS
- A375N
- Melanoma 1 0
- Mel888
- Melanoma 0,1523333 0,00617342
- HT-29
- Colon 0,00083554 1,4217E-05
- CaCO2
- Colon 0,00194873 0,00047591
- 578T
- Mama 1,585 0,345
- T-47D
- Mama 0,00152448 0,00045275
- MCF-7
- Mama 0 0
- MDA-231
- Mama 0 0
- BxPC3
- Páncreas 0 0
- MiaPaca-2
- Páncreas 0 0
- NHM
- Melanocitos normales 0,05 0
- CCD841
- Colon normal 0,04033333 0,01125956
- MCF12-A
- Mama normal 0 0
- hMEC-1
- microendotelial 0,20225 0,01271728
- HACAT
- queratinocitos 0,0005 0,0005
- CCD1140
- fibroblastos 0,417 0,0609836
5 c) Efecto lítico de Ad(I)-F512-TK en células que expresan SPARC: células tumorales y estromales (fibroblastos y endotelio) creciendo en monocapa.
[0106] Los ensayos in vitro con células del estroma tumoral (endoteliales y fibroblasatos) demostraron que aún con alta o moderada expresión de SPARC los adenovirus no tuvieron la misma actividad que en las células tumorales. De acuerdo con una hipótesis de los inventores de la presente, las células normales tienen más 10 resistencia a la replicación viral. En este caso, el agregado de un gen tóxico permitiría aumentar la capacidad lítica en forma específica en aquellas células en donde el promotor de SPARC fuera activo. Es por ello que se llevaron a cabo experimentos in vitro con Ad(I)-F512-TK en los cuales las células fueron tratadas también con el agregado de la prodroga ganciclovir (GCV). En primer lugar se observó que el agregado de GCV mejora la lisis del virus en las células de melanoma SB2 (ver Figura 13A); esta mejora es más efectiva si se deja actuar al virus 15 oncolítico y luego de 72 hs se comienza con el agregado de GCV. En cuanto a las células endoteliales, son más sensibles a la presencia de la prodroga sola (ver Figura 13B, las tres primeras barras a la izquierda). El agregado del virus a una MOI de 750 y en presencia de 50 μM o 100 μM de CGV permite eliminar la casi totalidad de las células (últimas dos columnas de la Figura 13B). Otras células endoteliales analizadas fueron las de aorta bovina (BAEC, gentilmente cedidas por Helene Sage, Seattle, USA). Estas células que expresan valores mayores de
20 SPARC que A375N y en las cuales el promotor humano F512 es muy activo (ver Ejemplo 1 y 3B anteriores), sin embargo no se infectan bien con la cápside de Ad5. Al igual que lo que ocurre con hMEC-1, las células son sensibles a la prodroga, pero la presencia de la prodroga GCV sumada al virus permite la eliminación de las células a concentraciones virales en las cuales el virus por si mismo no posee efecto (ver Figura 13C).
Ejemplo 16 – Ensayos in vivo utilizando los CRAds Ad-F512 y Ad(I)-F512-TK
[0107] Se llevaron a cabo ensayos in vivo en animales (ratones machos atímicos N:NIH (S) – nu de 6-8 semanas de edad), en los cuales se inyectaron tumores mixtos de melanoma de compuestos de células tumorales y estromales. Posteriormente, estos tumores fueron tratados con los CRAds obtenidos de acuerdo con la presente invención, utilizando el mismo protocolo para los tumores de solo células de melanoma.
[0108] En la Figura 14A se muestra el resultado de un ensayo en el cual los animales eran portadores de tumores mixtos SB2-hMEC-1/WI38 y fueron tratados con Ad-F512. Se observó que el tratamiento con el adenovirus produce un retraso relevante en el crecimiento del tumor incluso cuando las células malignas fueron co-inyectadas con células endoteliales (hMEC-1) y fibroblastos (WI38), demostrando que este virus puede ser efectivo, en una situación similar a la que se da en un tumor.
[0109] Este mismo resultado se obtuvo al repetir el ensayo (datos no mostrados).
[0110] Posteriormente, se probó la eficacia del tratamiento adenoviral sobre tumores mixtos de células tumorales y fibroblastos. Se observó que el tratamiento de tumores SB2/WI38 con Ad-F512 resultó parcialmente efectivo (Figura 14B). Cuando se inyectaron células SB2/hMEC-1, se observó que algunos de los animales respondían mucho mejor al tratamiento aunque no hubo ningún rechazo (Figura 14C). Finalmente los tumores SB2/WI38 fueron tratados con Ad(I)-F512-TK + GCV, observándose que 3 de un total de 5 animales rechazaron completamente el tumor, indicando que el agregado del gen tóxico TK mejora significativamente el efecto del virus (Figura 14D).
[0111] Por otra parte, esta descrito (Yamazaki, M., Straus, F. H., Messina, M., Robinson, B.G., Takeda, T., Hashizume, K., y DeGroot, L. J., Adenovirus-mediated tumor-specific combined gene therapy using Herpes simplex virus thymidine/ganciclovir system murine interleukin-12 induces effective antitumor activity againts medullary thyroid carcinoma, Cancer Gene Ther., 11:8-15, 2004) que muchos CRAds muestran mayor especificidad in vitro que in vivo. Como se vió en el Ejemplo 11, los virus de la presente invención eran capaces de eliminar células de cáncer de colon in vitro. Sin embargo, estudios previos (Yamazaki y col., 2004, que antecede) sugerirían que esto podía deberse a efectos inespecíficos. En consecuencia, se llevaron a cabo ensayos in vivo con tumores de cáncer de colon y páncreas.
[0112] Un dato a destacar fue el efecto observado in vivo con tumores de colon. De hecho, Ad-F512 y Ad(I)F512-TK fueron incapaces de eliminar in vivo el tumor de células LoVo (Figura 15A); sin embargo, el agregado de células endoteliales hMEC-1 a esos tumores en presencia de GCV permitió retrasar el crecimiento de los tumores de colon comparado con los tumores del grupo control, indicando que la presencia de células endoteliales que expresan SPARC podría favorecer la eliminación de tumores cuyas células malignas no expresan SPARC (Figura 15B).
[0113] Sobre esta misma base, en otro grupo de experimentos se trataron tumores mixtos de Mia-PaCa-2 (ATCC Nº CRL-1420) (páncreas maligno)/hMEC-1 con Ad-F512 y Ad(I)-F512-TK + GCV, observándose sorprendentemente que estos tumores se eliminan completamente (Figura 15C).
LISTADO DE SECUENCIAS
[0114]
<110> INIS Biotech LLC
<120> Un Fragmento de ADN Aislado del Promotor Humano de SPARC y su Uso para Dirigir la Expresión de un Gen Heterólogo en Células Tumorales
<130> SPARC
<160> 56
<170> PatentIn Versión 3.4
<210> 1
<211> 548
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia promotora derivada del promotor completo humano de la proteína SPARC humana
<400> 1 gcagcttgtc ttgtctgtac agtggtaagt cctggccttg cctttgtggc aaatacaacc 60 cccttgaatt gcttggccct tctcagcatt gcctaatatt agggaggact cctgtaaagc 120 tcactggtta gaagatcaag acacttgggc ctggttctgc ccctgggggc cattgggtaa 180 ttccttgcag tctccaggcc tcacttgccc tctgaacaag aaagaggctg ttctgggtca 240 tccctccagg cctgtccagc cctggcactc tgtgagtcgg tttaggcagc agccccggaa 300 cagatgaggc aggcagggtt gggacgtttg gtcaggacag cccaccgcaa aaagaggagg 360 aaagaaatga aagacagaga cagctttggc tatgggagaa ggaggaggcc gggggaagga 420 ggagacagga ggaggaggga ccacggggtg gaggggagat agacccagcc cagagctctg 480 agtggtttcc tgttgcctgt ctctaaaccc ctccacattc ccgcggtcct tcagactgcc 540 cggagagc 548
<210> 2
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 2 aaccgaagag gaggtggtg 19
<210> 3
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 3 gcaaagaagt ggcaggaaga
- 20
- <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 4 agaaaatctg gcaccacacc
- 20
- <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 5 cagaggcgta cagggatagc
- 20
- <210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 6 ctagctagca gctgggtgtt gtggcat
- 27
- <210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 7 acgcgtcgac ctcagtggca ggca
- 24
- <210> 8 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 8 cggcctcctc cttctcccct gtctctgtct ttcatttc
- 38
- <210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 9 ctagctagcg ggagaaggag gaggcc
- 26
- <210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 10 gcagatctcc tcagtggcag gc
- 22
- <210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 11 gcacgcgtag ctgggtgttg tgg
- 23
- <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 12 cgagatctgc tctccgggca g
- 21
- <210> 13 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 13 cgagatctgg gcagtctgaa ggacc
- 25
- <210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
- <400> 14 cgacgcgtgc agcttgtctt gtc
- 23
- <210> 15 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 15 gcagatctag tctgaaggac cgcg 24
<210> 16
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 16 gaacgcgtgg gagaaggagg ag 22
<210> 17
<211> 1246
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia del promotro humano de SPARC correspondiente a las bases -1175/+71 desde el incio de la transcripción.
<400> 17 agctgggtgt tgtggcatgt gcgcctgtaa tcccagctac tctggaggct gaggcgcgat 60 aattgcttga acccgggagg cagaggttgc agtgagccga aatcatacca ctgcactcca 120 gcctgggcga cagagtgagt gagactctgt ctcaaaacaa aacaaaacaa acaaacaaaa 180 aaaccggaaa ccacaaaact ttttgaggac aaggaccagg tatttattaa ttctcatacc 240 tcccagagtg ttaggcacaa aataaacatt caaccaagac ctgttgcact gagcagttca 300 tatataacag gagtgaccca agttgaaacg tagaatcagc cctctcatac cactttttgc 360 caggtgatca taggcaagtt acttagcatc tatgtttcct tattattaaa atggtcataa 420 ttacaatgcc taagataagg ggttgctgtg aagattatta aatcctcagt aaactttggc 480 tattgttact cctatgatta tcatcaatat catcaattac cttatctgtt caatactggt 540 ggcacaggtc caccagctag atgtctaatc ccttatgtgt ctattagtgg tacaagtgga 600
gtttgagtgg gatttttttt tttaagacca gttccaaatc atcaaggatg ataccactag 660 tagcagcttg tcttgtctgt acagtggtaa gtcctggcct tgcctttgtg gcaaatacaa 720 cccccttgaa ttgcttggcc cttctcagca ttgcctaata ttagggagga ctcctgtaaa 780 gctcactggt tagaagatca agacacttgg gcctggttct gcccctgggg gccattgggt 840 aattccttgc agtctccagg cctcacttgc cctctgaaca agaaagaggc tgttctgggt 900 catccctcca ggcctgtcca gccctggcac tctgtgagtc ggtttaggca gcagccccgg 960 aacagatgag gcaggcaggg ttgggacgtt tggtcaggac agcccaccgc aaaaagagga 1020 ggaaagaaat gaaagacaga gacagctttg gctatgggag aaggaggagg ccgggggaag 1080 gaggagacag gaggaggagg gaccacgggg tggaggggag atagacccag cccagagctc 1140 tgagtggttt cctgttgcct gtctctaaac ccctccacat tcccgcggtc cttcagactg 1200 cccggagagc gcgctctgcc tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagg 1246
<210> 18
<211> 1236
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Este promotor es una modificación del promotor completo de SPARC -1175/+71, en donde se delecionó una secuencia de 10 pb comprendida entre las dos cajas GGA.
<400> 18 agctgggtgt tgtggcatgt gcgcctgtaa tcccagctac tctggaggct gaggcgcgat 60 aattgcttga acccgggagg cagaggttgc agtgagccga aatcatacca ctgcactcca 120 gcctgggcga cagagtgagt gagactctgt ctcaaaacaa aacaaaacaa acaaacaaaa 180 aaaccggaaa ccacaaaact ttttgaggac aaggaccagg tatttattaa ttctcatacc 240 tcccagagtg ttaggcacaa aataaacatt caaccaagac ctgttgcact gagcagttca 300 tatataacag gagtgaccca agttgaaacg tagaatcagc cctctcatac cactttttgc 360 caggtgatca taggcaagtt acttagcatc tatgtttcct tattattaaa atggtcataa 420 ttacaatgcc taagataagg ggttgctgtg aagattatta aatcctcagt aaatgttact 480 cctatgatta tcatcaatat catcaattac cttatctgtt caatactggt ggcacaggtc 540 caccagctag atgtctaatc ccttatgtgt ctattagtgg tacaagtgga gtttgagtgg 600 gatttttttt tttaagacca gttccaaatc atcaaggatg ataccactag tagcagcttg 660 tcttgtctgt acagtggtaa gtcctggcct tgcctttgtg gcaaatacaa cccccttgaa 720 ttgcttggcc cttctcagca ttgcctaata ttagggagga ctcctgtaaa gctcactggt 780 tagaagatca agacacttgg gcctggttct gcccctgggg gccattgggt aattccttgc 840 agtctccagg cctcacttgc cctctgaaca agaaagaggc tgttctgggt catccctcca 900 ggcctgtcca gccctggcac tctgtgagtc ggtttaggca gcagccccgg aacagatgag 960 gcaggcaggg ttgggacgtt tggtcaggac agcccaccgc aaaaagagga ggaaagaaat 1020 gaaagacaga gacagctttg gctatgggag aaggaggagg ccgggggaag gaggagacag 1080 gaggaggagg gaccacgggg tggaggggag atagacccag cccagagctc tgagtggttt 1140 cctgttgcct gtctctaaac ccctccacat tcccgcggtc cttcagactg cccggagagc 1200 gcgctctgcc tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagg 1236
<210> 19
<211> 1210
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 19 agctgggtgt tgtggcatgt gcgcctgtaa tcccagctac tctggaggct gaggcgcgat 60 aattgcttga acccgggagg cagaggttgc agtgagccga aatcatacca ctgcactcca 120
gcctgggcga cagagtgagt gagactctgt ctcaaaacaa aacaaaacaa acaaacaaaa 180 aaaccggaaa ccacaaaact ttttgaggac aaggaccagg tatttattaa ttctcatacc 240 tcccagagtg ttaggcacaa aataaacatt caaccaagac ctgttgcact gagcagttca 300 tatataacag gagtgaccca agttgaaacg tagaatcagc cctctcatac cactttttgc 360 caggtgatca taggcaagtt acttagcatc tatgtttcct tattattaaa atggtcataa 420 ttacaatgcc taagataagg ggttgctgtg aagattatta aatcctcagt aaactttggc 480 tattgttact cctatgatta tcatcaatat catcaattac cttatctgtt caatactggt 540 ggcacaggtc caccagctag atgtctaatc ccttatgtgt ctattagtgg tacaagtgga 600 gtttgagtgg gatttttttt tttaagacca gttccaaatc atcaaggatg ataccactag 660 tagcagcttg tcttgtctgt acagtggtaa gtcctggcct tgcctttgtg gcaaatacaa 720 cccccttgaa ttgcttggcc cttctcagca ttgcctaata ttagggagga ctcctgtaaa 780 gctcactggt tagaagatca agacacttgg gcctggttct gcccctgggg gccattgggt 840 aattccttgc agtctccagg cctcacttgc cctctgaaca agaaagaggc tgttctgggt 900 catccctcca ggcctgtcca gccctggcac tctgtgagtc ggtttaggca gcagccccgg 960 aacagatgag gcaggcaggg ttgggacgtt tggtcaggac agcccaccgc aaaaagagga 1020 ggaaagaaat gaaagacaga gacagctttg gctatgggag aaggaggagg ccgggggaag 1080 gaggagacag gaggaggagg gaccacgggg tggaggggag atagacccag cccagagctc 1140 tgagtggttt cctgttgcct gtctctaaac ccctccacat tcccgcggtc cttcagactg 1200 cccggagagc 1210
<210> 20
<211> 1203
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente <400> 20 agctgggtgt tgtggcatgt gcgcctgtaa tcccagctac tctggaggct gaggcgcgat 60 aattgcttga acccgggagg cagaggttgc agtgagccga aatcatacca ctgcactcca 120 gcctgggcga cagagtgagt gagactctgt ctcaaaacaa aacaaaacaa acaaacaaaa 180 aaaccggaaa ccacaaaact ttttgaggac aaggaccagg tatttattaa ttctcatacc 240 tcccagagtg ttaggcacaa aataaacatt caaccaagac ctgttgcact gagcagttca 300 tatataacag gagtgaccca agttgaaacg tagaatcagc cctctcatac cactttttgc 360 caggtgatca taggcaagtt acttagcatc tatgtttcct tattattaaa atggtcataa 420 ttacaatgcc taagataagg ggttgctgtg aagattatta aatcctcagt aaactttggc 480 tattgttact cctatgatta tcatcaatat catcaattac cttatctgtt caatactggt 540 ggcacaggtc caccagctag atgtctaatc ccttatgtgt ctattagtgg tacaagtgga 600 gtttgagtgg gatttttttt tttaagacca gttccaaatc atcaaggatg ataccactag 660 tagcagcttg tcttgtctgt acagtggtaa gtcctggcct tgcctttgtg gcaaatacaa 720 cccccttgaa ttgcttggcc cttctcagca ttgcctaata ttagggagga ctcctgtaaa 780 gctcactggt tagaagatca agacacttgg gcctggttct gcccctgggg gccattgggt 840 aattccttgc agtctccagg cctcacttgc cctctgaaca agaaagaggc tgttctgggt 900 catccctcca ggcctgtcca gccctggcac tctgtgagtc ggtttaggca gcagccccgg 960 aacagatgag gcaggcaggg ttgggacgtt tggtcaggac agcccaccgc aaaaagagga 1020 ggaaagaaat gaaagacaga gacagctttg gctatgggag aaggaggagg ccgggggaag 1080 gaggagacag gaggaggagg gaccacgggg tggaggggag atagacccag cccagagctc 1140 tgagtggttt cctgttgcct gtctctaaac ccctccacat tcccgcggtc cttcagactg 1200 ccc 1203
<210> 21
<211> 584
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 21 gcagcttgtc ttgtctgtac agtggtaagt cctggccttg cctttgtggc aaatacaacc 60 cccttgaatt gcttggccct tctcagcatt gcctaatatt agggaggact cctgtaaagc 120 tcactggtta gaagatcaag acacttgggc ctggttctgc ccctgggggc cattgggtaa 180 ttccttgcag tctccaggcc tcacttgccc tctgaacaag aaagaggctg ttctgggtca 240 tccctccagg cctgtccagc cctggcactc tgtgagtcgg tttaggcagc agccccggaa 300 cagatgaggc aggcagggtt gggacgtttg gtcaggacag cccaccgcaa aaagaggagg 360 aaagaaatga aagacagaga cagctttggc tatgggagaa ggaggaggcc gggggaagga 420 ggagacagga ggaggaggga ccacggggtg gaggggagat agacccagcc cagagctctg 480 agtggtttcc tgttgcctgt ctctaaaccc ctccacattc ccgcggtcct tcagactgcc 540 cggagagcgc gctctgcctg ccgcctgcct gcctgccact gagg 584
<210> 22
<211> 541
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 22 gcagcttgtc ttgtctgtac agtggtaagt cctggccttg cctttgtggc aaatacaacc 60 cccttgaatt gcttggccct tctcagcatt gcctaatatt agggaggact cctgtaaagc 120
tcactggtta gaagatcaag acacttgggc ctggttctgc ccctgggggc cattgggtaa 180 ttccttgcag tctccaggcc tcacttgccc tctgaacaag aaagaggctg ttctgggtca 240 tccctccagg cctgtccagc cctggcactc tgtgagtcgg tttaggcagc agccccggaa 300 cagatgaggc aggcagggtt gggacgtttg gtcaggacag cccaccgcaa aaagaggagg 360 aaagaaatga aagacagaga cagctttggc tatgggagaa ggaggaggcc gggggaagga 420 ggagacagga ggaggaggga ccacggggtg gaggggagat agacccagcc cagagctctg 480 agtggtttcc tgttgcctgt ctctaaaccc ctccacattc ccgcggtcct tcagactgcc 540 c 541
<210> 23
<211> 537
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 23 gcagcttgtc ttgtctgtac agtggtaagt cctggccttg cctttgtggc aaatacaacc 60 cccttgaatt gcttggccct tctcagcatt gcctaatatt agggaggact cctgtaaagc 120 tcactggtta gaagatcaag acacttgggc ctggttctgc ccctgggggc cattgggtaa 180 ttccttgcag tctccaggcc tcacttgccc tctgaacaag aaagaggctg ttctgggtca 240 tccctccagg cctgtccagc cctggcactc tgtgagtcgg tttaggcagc agccccggaa 300 cagatgaggc aggcagggtt gggacgtttg gtcaggacag cccaccgcaa aaagaggagg 360 aaagaaatga aagacagaga cagctttggc tatgggagaa ggaggaggcc gggggaagga 420 ggagacagga ggaggaggga ccacggggtg gaggggagat agacccagcc cagagctctg 480 agtggtttcc tgttgcctgt ctctaaaccc ctccacattc ccgcggtcct tcagact 537
<210> 24 <211> 191
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 24 gggagaagga ggaggccggg ggaaggagga gacaggagga ggagggacca cggggtggag 60 gggagataga cccagcccag agctctgagt ggtttcctgt tgcctgtctc taaacccctc 120 cacattcccg cggtccttca gactgcccgg agagcgcgct ctgcctgccg cctgcctgcc 180 tgccactgag g 191
<210> 25
<211> 155
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 25 gggagaagga ggaggccggg ggaaggagga gacaggagga ggagggacca cggggtggag 60 gggagataga cccagcccag agctctgagt ggtttcctgt tgcctgtctc taaacccctc 120 cacattcccg cggtccttca gactgcccgg agagc 155
<210> 26
<211> 148
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 26 gggagaagga ggaggccggg ggaaggagga gacaggagga ggagggacca cggggtggag 60 gggagataga cccagcccag agctctgagt ggtttcctgt tgcctgtctc taaacccctc 120
cacattcccg cggtccttca gactgccc 148
<210> 27
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 27 tacgactcac tataggg 17
<210> 28
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 28 atttaggtga cactatag 18
<210> 29
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 29 attaaccctc actaaaggga 20
<210> 30
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente <400> 30 ctttatgttt ttggcgtctt cca 23
<210> 31
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 31 ctagcaaaat aggctgtccc c 21
<210> 32
<211> 93
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sitio de clonado multiple, incluido en el vector pADPSY, sintetizado químicamente
<400> 32
ggtaccggag gcctcgctag ccacgcgtgg cggcagatct tgcagatatc cgcggatcga 60
tccgccagta cgtactttcc ttaggcagtc gac 93
<210> 33
<211> 7303
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 33
ttctcatgtt tgacagctta tcatcatcaa taatatacct tattttggat tgaagccaat 60
atgataatga gggggtggag tttgtgacgt ggcgcggggc gtgggaacgg ggcgggtgac 120
gtagtagtgt ggcggaagtg tgatgttgca agtgtggcgg aacacatgta agcgacggat 180
gtggcaaaag tgacgttttt ggtgtgcgcc ggtgtacaca ggaagtgaca attttcgcgc 240 ggttttaggc ggatgttgta gtaaatttgg gcgtaaccga gtaagatttg gccattttcg 300 cgggaaaact gaataagagg aagtgaaatc tgaataattt tgtgttactc atagcgcgta 360 atatttgtct agggccgcgg ggactttgac cgtttacgtg gagactcgcc caggtgtttt 420 tctcaggtgt tttccgcgtt ccgggtcaaa gttggcgttt tattattata gtcaggggga 480 tcctctagaa ctagtgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 540 ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 600 gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 660 ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 720 gctggggatg gtaccggagg cctcgctagc cacgcgtggc ggcagatctc cgggactgaa 780 aatgagacat attatctgcc acggaggtgt tattaccgaa gaaatggccg ccagtctttt 840 ggaccagctg atcgaagagg tactggctga taatcttcca cctcctagcc attttgaacc 900 acctaccctt cacgaactgt atgatttaga cgtgacggcc cccgaagatc ccaacgagga 960 ggcggtttcg cagatttttc ccgactctgt aatgttggcg gtgcaggaag ggattgactt 1020 actcactttt ccgccggcgc ccggttctcc ggagccgcct cacctttccc ggcagcccga 1080 gcagccggag cagagagcct tgggtccggt ttctatgcca aaccttgtac cggaggtgat 1140 cgatcttacc tgccacgagg ctggctttcc acccagtgac gacgaggatg aagagggtga 1200 ggagtttgtg ttagattatg tggagcaccc cgggcacggt tgcaggtctt gtcattatca 1260 ccggaggaat acgggggacc cagatattat gtgttcgctt tgctatatga ggacctgtgg 1320 catgtttgtc tacagtaagt gaaaattatg ggcagtgggt gatagagtgg tgggtttggt 1380 gtggtaattt tttttttaat ttttacagtt ttgtggttta aagaattttg tattgtgatt 1440 tttttaaaag gtcctgtgtc tgaacctgag cctgagcccg agccagaacc ggagcctgca 1500 agacctaccc gccgtcctaa aatggcgcct gctatcctga gacgcccgac atcacctgtg 1560 tctagagaat gcaatagtag tacggatagc tgtgactccg gtccttctaa cacacctcct 1620 gagatacacc cggtggtccc gctgtgcccc attaaaccag ttgccgtgag agttggtggg 1680 cgtcgccagg ctgtggaatg tatcgaggac ttgcttaacg agcctgggca acctttggac 1740 ttgagctgta aacgccccag gccataaggt gtaaacctgt gattgcgtgt gtggttaacg 1800 cctttgtttg ctgaatgagt tgatgtaagt ttaataaagg gtgagataat gtttggatct 1860 tgcagatatc cgcggatcga tccgccagta cgtactttcc ttaggcagtc gacctcgaga 1920 tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 1980 aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 2040 caataaacaa gttggggatc tcgagggggg gcccatcgaa ttcctgcagc ccgggggatc 2100 tggaaggtgc tgaggtacga tgagacccgc accaggtgca gaccctgcga gtgtggcggt 2160 aaacatatta ggaaccagcc tgtgatgctg gatgtgaccg aggagctgag gcccgatcac 2220 ttggtgctgg cctgcacccg cgctgagttt ggctctagcg atgaagatac agattgaggt 2280 actgaaatgt gtgggcgtgg cttaagggtg ggaaagaata tataaggtgg gggtcttatg 2340 tagttttgta tctgttttgc agcagccgcc gccgccatga gcaccaactc gtttgatgga 2400 agcattgtga gctcatattt gacaacgcgc atgcccccat gggccggggt gcgtcagaat 2460 gtgatgggct ccagcattga tggtcgcccc gtcctgcccg caaactctac taccttgacc 2520 tacgagaccg tgtctggaac gccgttggag actgcagcct ccgccgccgc ttcagccgct 2580 gcagccaccg cccgcgggat tgtgactgac tttgctttcc tgagcccgct tgcaagcagt 2640 gcagcttccc gttcatccgc ccgcgatgac aagttgacgg ctcttttggc acaattggat 2700 tctttgaccc gggaacttaa tgtcgtttct cagcagctgt tggatctgcg ccagcaggtt 2760 tctgccctga aggcttcctc ccctcccaat gcggtttaaa acataaataa aaaaccagac 2820 tctgtttgga tttggatcaa gcaagtgtct tgctgtcttt atttaggggt tttgcgcgcg 2880
cggtaggccc gggaccagcg gtctcggtcg ttgagggtcc tgtgtatttt ttccaggacg 2940 tggtaaaggt gactctggat gttcagatac atgggcataa gcccgtctct ggggtggagg 3000 tagcaccact gcagagcttc atgctgcggg gtggtgttgt agatgatcca gtcgtagcag 3060 gagcgctggg cgtggtgcct aaaaatgtct ttcagtagca agctgattgc caggggcagg 3120 cccttggtgt aagtgtttac aaagcggtta agctgggatg ggtgcatacg tggggatatg 3180 agatgcatct tggactgtat ttttaggttg gctatgttcc cagccatatc cctccgggga 3240 ttcatgttgt gcagaaccac cagcacagtg tatccggtgc acttgggaaa tttgtcatgt 3300 agcttagaag gaaatgcgtg gaagaacttg gagacgccct tgtgacctcc aagattttcc 3360 atgcattcgt ccataatgat ggcaatgggc ccacgggcgg cggcctgggc gaagatattt 3420 ctgggatcac taacgtcata gttgtgttcc aggatgagat cgtcataggc catttttaca 3480 aagcgcgggc ggagggtgcc agactgcggt ataatggttc catccggccc aggggcgtag 3540 ttaccctcac agatttgcat ttcccacgct ttgagttcag atggggggat catgtctacc 3600 tgcggggcga tgaagaaaac ggtttccggg gtaggggaga tcagctggga agaaagcagg 3660 ttcctgagca gctgcgactt accgcagccg gtgggcccgt aaatcacacc tattaccggg 3720 tgcaactggt agttaagaga gctgcagctg ccgtcatccc tgagcagggg ggccacttcg 3780 ttaagcatgt ccctgactcg catgttttcc ctgaccaaat ccgccagaag gcgctcgccg 3840 cccagcgata gcagttcttg caaggaagca aagtttttca acggtttgag accgtccgcc 3900 gtaggcatgc ttttgagcgt ttgaccaagc agttccaggc ggtcccacag ctcggtcacc 3960 tgctctacgg catctcgatc cagcatatct cctcgtttcg cgggttgggg cggctttcgc 4020 tgtacggcag tagtcggtgc tcgtccagac gggccagggt catgtctttc cacgggcgca 4080 gggtcctcgt cagcgtagtc tgggtcacgg tgaaggggtg cgctccgggc tgcgcgctgg 4140 ccagggtgcg cttgaggctg gtcctgctgg tgctgaagcg ctgccggtct tcgccctgcg 4200 cgtcggccag gtagcatttg accatggtgt catagtccag cccctccgcg gcgtggccct 4260
tggcgcgcag cttgcccttg gaggaggcgc cgcacgaggg gcagtgcaga cttttgaggg 4320 cgtagagctt gggcgcgaga aataccgatt ccggggagta ggcatccgcg ccgcaggccc 4380 cgcagacggt ctcgcattcc acgagccagg tgagctctgg ccgttcgggg tcaaaaacca 4440 ggtttccccc atgctttttg atgcgtttct tacctctggt ttccatgagc cggtgtccac 4500 gctcggtgac gaaaaggctg tccgtgtccc cgtatacaga cttgagaggc ctgtcctcga 4560 gcggtgttcc gcggtcctcc tcgtatagaa actcggacca ctctgagaca aaggctcgcg 4620 tccaggccag cacgaaggag gctaagtggg aggggtagcg gtcgttgtcc actagggggt 4680 ccactcgctc cagggtgtga agacacatgt cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg 4740 gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg ttcctgaagg ggggctataa aagggggtgg 4800 gggcgcgttc gtcctcactc tcttccgcat cgctgtctgc gagggccagc tgttggggtg 4860 agtactccct ctgaaaagcg ggcatgactt ctgcgctaag attgtcagtt tccaaaaacg 4920 aggaggattt gatattcacc tggcccgcgg tgatgccttt gagggtggcc gcatccatct 4980 ggtcagaaaa gacaatcttt ttgttgtcaa gcttggtggc aaacgacccg tagagggcgt 5040 tggacagcaa cttggcgatg gagcgcaggg tttggttttt gtcgcgatcg gcgcgctcct 5100 tggccgcgat gtttagctgc acgtattcgc gcgcaacgca ccgccattcg ggaaagacgg 5160 tggtgcgctc gtcgggcacc aggtgcacgc gccaaccgcg gttgtgcagg gtgacaaggt 5220 caacgctggt ggctacctct ccgcgtaggc gctcgttggt ccagcagagg ccggccgacg 5280 cgctgggcta cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga 5340 ttcttctcgc ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg 5400 tagatgacga ccatcaggga cagcaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 5460 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 5520 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 5580
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 5640 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 5700 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 5760 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 5820 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 5880 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 5940 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 6000 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 6060 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 6120 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 6180 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 6240 tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 6300 tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 6360 gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 6420 gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 6480 aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 6540 gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 6600 ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 6660 tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 6720 atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 6780 ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 6840 ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 6900 gggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 6960
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 7020
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 7080
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 7140
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 7200
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 7260
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaa 7303
<210> 34
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 34 ccactagtgc tagagctcgc tgatcagc 28
<210> 35
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetizado químicamente
<400> 35 cggtaccatc cccagcatgc ctgc 24
<210> 36
<211> 1020
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador T3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1009)..(1009)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1013)..(1013)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36 gaatgccctt gatcactatc cggtgaattg aattagcggc cgcgaattcg cccttcgaga 60 tctccggact gaaaatgaga catattattt gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg 120 ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta 180 gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg gcccccgaag 240 atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc tgtaatgttg gcagtgcagg 300 aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg cctcaccttt 360 cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg ccaaaccttg 420 taccggaggt gatcgatctt acctgccacg aggctggctt tccacccagt gacgacgagg 480 atgaagaggg tgaggagttt gtgttagatt atgtggagca ccccgggcac ggttgcaggt 540 cttgtcatta tcaccggagg aatacggggg acccagatat tatgtgttcg ctttgctata 600 tgaggacctg tggcatgttt gtctacagta agtgaaaatt atgggcagtg ggtgatagag 660 tggtgggttt ggtgtggtaa tttttttttt aatttttaca gttttgtggt ttaaagaatt 720 ttgtattgtg atttttttaa agggtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga 780 accggagcct gcaagaccta cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc 840 gacatcacct gtgtctagag aatgcaatag tagtacggat agctgtgact ccggtccttc 900 taacacacct cctgagatac acccggtggt cccgctgtgc ccattaaacc agttgccgtg 960 agagttggtg ggcgtcgcca ggctgtggaa tgtatcgagg acttgcttna cgncctgggc 1020
<210> 37
<211> 1029
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador T7
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 37
ccccatttta tacancatta cgccaagctc anaattaacc ctcactaaag ggactanctc 60
ctgcaggttt aaacnaattc gcccttncgg atccaaacat tatctcaccc tttattaaac 120
ttacatcaac tcattcagca aacaaaggcg ttaaccacac acgcaatcac aggtttacac 180
cttatggcct ggggcgttta cagctcaagt ccaaaggttg cccaggctcg ttaagcaagt 240
cctcgataca ttccacagcc tggcgacgcc caccaactct cacggcaact ggtttaatgg 300
ggcacagcgg gaccaccggg tgtatctcag gaggtgtgtt agaaggaccg gagtcacagc 360
tatccgtact actattgcat tctctagaca caggtgatgt cgggcgtctc aggatagcag 420 gcgccatttt aggacggcgg gtaggtcttg caggctccgg ttctggctcg ggctcaggct 480 caggttcaga cacaggaccc tttaaaaaaa tcacaataca aaattcttta aaccacaaaa 540 ctgtaaaaat taaaaaaaaa attaccacac caaacccacc actctatcac ccactgccca 600 taattttcac ttactgtaga caaacatgcc acaggtcctc atatagcaaa gcgaacacat 660 aatatctggg tcccccgtat tcctccggtg ataatgacaa gacctgcaac cgtgcccggg 720 gtgctccaca taatctaaca caaactcctc accctcttca tcctcgtcgt cactgggtgg 780 aaagccagcc tcgtggcagg taagatcgat cacctccggt acaaggtttg gcatagaaac 840 cggacccaag gctctctgct ccggctgctc gggctgccgg gaaaggtgag gcggctccgg 900 agaaccgggc gccggcggaa aagtgagtaa gtcaatccct tcctgcactg ccaacattac 960 agagtcggga aaaatctgcg aaaccgcctc ctcgttggga tcttgggggc cgtcacgtct 1020 aatcataca 1029
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<212> ADN
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<223> Sintetizado químicamente
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintetizado químicamente
<400> 39 tctcaggtgt tttccgcgtt ccgggtcaaa gttggcgttt tattattata gtcaggggga 60 tcctctagaa ctagtgtgat caggtaccgg aggcctcgct agccacgcgt ggcggcagat 120 ctccgggact gaaaatgaga catattatct gccacggagg tgttattacc gaagaaatgg 180 ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt ccacctccta 240 gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg gcccccgaag 300 atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc tgtaatgttg gcggtgcagg 360 aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg cctcaccttt 420 cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg ccaaaccttg 480 taccggaggt gatcgatctt acctgccacg aggctggctt tccacccagt gacgacgagg 540 atgaagaggg tgaggagttt gtgttagatt atgtggagca ccccgggcac ggttgcaggt 600 cttgtcatta tcaccggagg aatacggggg acccagatat tatgtgttcg ctttgctata 660 tgaggacctg tggcatgttt gtctacagta agtgaaaatt atgggcagtg ggtgatagag 720 tggtgggttt ggtgtggtaa tttttttttt aatttttaca gttttgtggt ttaaagaatt 780 ttgtattgtg atttttttaa aaggtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga 840 accggagcct gcaagaccta cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc 900 gacatcacct gtgtctagag aatgcaatag tagtacggat agctgtgact ccggtccttc 960 taacacacct cctgagatac acccggtggt cccgctgtgc cccattaaac cagttgccgt 1020
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gcaacctttg gacttgagct gtaaacgccc caggccataa ggtgtaaacc tgtgattgcg 1140
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ccctnggact gaagctggcg ttttcaatta tagtcaggng gatcctctag aactagtgct 60
agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 120
tcccccgntg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 180
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgggtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 240
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aggcctcgct agccacgcgt gcagcttgtc ttgtctgtac agtggtaagt cctggccttg 360 cctttgtggc aaatacaacc cccttgaatt gcttggccct tctcagcatt gcctaatatt 420
agggaggact cctgtaaagc tcactggtta gaagatcaag acacttgggc ctggttctgc 480
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aaagaggctg ttctgggtca tccctccagg cctgtccagc cctggcactc tgtgagtcgg 600
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cncccggntg aagctggcgt ttattnttat agtcaggggg atcctctaga actagtgatc 60 aggtaccgga ggcctcgcta gccacgcgtg cagcttggtc ttggtctgta cagtggtaag 120 tcctggcctt gcctttgtgg caaatacaac ccccttgaat tgcttggccc ttctcagcat 180 tgcctaatat tagggaggac tcctgtaaag ctcactggtt agaagatcaa gacacttggg 240 cctggttctg cccctggggg tcattgggta attccttgca gtctccaggc ctcacttgcc 300 ctctgaacaa gaaagaggct gttctgggtc atccctccag gcctgtccag ccctggcact 360 ctgtgagtcg gtttaggcag cagccccgga acagatgagg caggcagggt tgggacgttt 420 ggtcaggaca gcccaccgca aaaagaggag gaaagaaatg aaagacagag acagctttgg 480 ctatgggaga aggaggangg ccggggg 507
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador sintetizado químicamente
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador sintetizado químicamente
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<212> ADN
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador pAd-sense
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador pAd-antisense
<400> 47 acggtgttgt taggttctca ttctgttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 60 atgtctggat ctcgaggtcg actcagttag cctcccccat ctcccgggca aacgtgcgcg 120 ccaggtcgca gatcgtcggt atggagccgg gggtggtgac gtgggtctgg accatcccgg 180 aggtaagttg cagcagggcg tcccggcagc cggcgggcga ttggtcgtaa tccaggataa 240 agacgtgcat gggacggagg cgtttggcca agacgtccaa ggcccaggca aacacgttgt 300 acaggtcgcc gttgggggcc agcaactcgg gggcccgaaa cagggtaaat aacgtgtccc 360
cgatatgggg tcgtgggccc gcgttgctct ggggctcggc accctggggc ggcacggccg 420 tccccgaaag ctgtccccaa tcctcccgcc acgacccgcc gccctgcaga taccgcaccg 480 tattggcaag cagcccgtaa acgcggcgaa tcgcggccag catagccagg tcaagccgct 540 cgccggggcg ctggcgtttg gccaggcggt cgatgtgtct gtcctccgga agggccccca 600 acacgatgtt tgtgccgggc aaggtcggcg ggatgagggc cacgaacgcc agcacggcct 660 ggggggtcat gctgcccata aggtatcgcg cggccgggta gcacaggagg gcggcgatgg 720 gatggcggtc gaagatggag ggtgagggcc ggggggcggg gcatgtgagc tcccagcctc 780 ccccccgata tgaggagcca gaacggcgtc ggtcacggca taaggcatgc ccattgttat 840 ctgggcgctt gtcattacca ccgcccgcgt ccccggccga tatctcaacc ctgatcgagg 900 cggatgtatg gtggtggtgt agaattgttt cgacgaattt gtctctcgcg aaagaggccc 960 cccca 965
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<212> ADN
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<223> Cebador sintetizado químicamente
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<212> ADN
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<210> 51
<211> 842
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<222> (159)..(159)
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<222> (795)..(795)
<223> n is a, c, g, or t
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tccnngtaat cagnnagcng ctannaaggg tttgtcnnna gggatcctct agaactagtg 60
ntcaggtacc ggaggcctcg ctagccacgc gtgcagcttg tcttgtctgt acagtggtaa 120
gtcctggcct tgcctttgtg gcaaatacaa cccccttgna attgcttggc ccttctcagc 180
attgcctaat attagggagg actcctgtaa agctcactgg ttagaagatc aaggacactt 240
gggcctggtt ctgcccctgg gggtcattgg gtaattcctt gcagtctcca ggcctcactt 300
gccctctgaa caagaaagag gctgttctgg gtcatccctc caggcctgtc cagccctggc 360
actctgtgga gtcggtttag gcagcagccc cgggaacaga tgaggcaggc agggttggga 420
cgtttggtca ggacagccca ccgcaaaaag aggaggaaag aaatgaaaga cagagacagc 480
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ggggtggagg ggagatagac ccagcccaga gctctgagtg gtttcctgtt gcctgtctct 600
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acctaccctt cacgnaactg tatgatttag acgtgacggg cccccgaaga tcccaacgag 840
ga 842
<210> 52
<211> 851
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador pAd-antisense, secuencia parcial del virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
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<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(65)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)..(130)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (393)..(393)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (539)..(539)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 52 aaaangacgn cngnaagcnc taaggggcna attncaaagg gnatcttatc atgtctggat 60 ctcgnaggct cggactgcct aaggtaaagn acgtactggc ggnatcgaat ccgcgggata 120 tctgctaagn atccaaacat tatctcaccc tttattaaac ttacatcaac tcattcagca 180 aacaaaggcg ttaaccacac acgcaatcac aggctttaca ccttatggcc tggggcgttt 240 acagctcaag tccaaaggtt gcccaggctc gttaagcaag tcctcgatac attccacagc 300 ctggcgacgc ccaccaactc tcacggcaac tggtttaatg gggcacagcg ggaccaccgg 360 gtgtatctca ggaggtgtgt tagaaggacc ggnagtcaca gctatccgta ctactattgc 420 attctctaga cacaggtgat gtcgggcgtc tcaggatagc aggcgccatt ttaggacggc 480 gggtaggtct tgcaggctcc ggttctggct cgggctcagg ctcaggttca gacacaggna 540 ccctttaaaa aaatcacaat acaaaattct ttaaaccaca aaactgtaaa aattaaaaaa 600 aaaattacca caccaaaccc accactctat cacccactgc ccataatttt cacttactgt 660 agacaaacat gccacaggtc ctcatatagc aaagcgaaca cataatatct gggtcccccg 720 tattcctccg ggtgataatg gacaagacct gcaaccgtgg cccggggtgc tccacataaa 780 tctaacacaa actcctcacc ctcttcatcc tcgtcgtcac tgggtggaaa gccagccctc 840 gtggcaggta a 851
<210> 53
<211> 854
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador pAd-sense, secuencia parcial del virus
<400> 53
aaaaagaacc ttttaatgcg cgctcggtcg cgttttatta ttatagtcag ggggatcctc 60 tagaactagt gctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc 120 tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 180 ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgggt aggtgtcatt ctattctggg 240 gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 300 ggatggtacc ggaggcctcg ctagccacgc gtgcagcttg tcttgtctgt acagtggtaa 360 gtcctggcct tgcctttgtg gcaaatacaa cccccttgaa ttgcttggcc cttctcagca 420 ttgcctaata ttagggagga ctcctgtaaa gctcactggt tagaagatca agacacttgg 480 gcctggttct gcccctgggg gtcattgggt aattccttgc agtctccagg cctcacttgc 540 cctctgaaca agaaagaggc tgttctgggt catccctcca ggcctgtcca gccctggcac 600 tctgtgagtc ggtttaggca gcagccccgg aacagatgag gcaggcaggg ttgggacgtt 660 tggtcaggac agcccaccgc aaaaagagga ggaaagaaat gaaagacaga gacagctttg 720 gctatgggag aaggaggagg ccgggggaaa ggaggagaca ggaggaggag ggaccacggg 780 gtggaggggg agatagaccc agccagagct cctgagtgtt tcctgttggc ctgtctctaa 840 acccccctcc caca 854
<210> 54
<211> 840
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador pAd-antisense, secuencia parcial del virus
<400> 54 ttcccatttt taaccttatg tccttgattg ttgattcact ctcatgttct atctgtctgg 60 tctcgaggcg cttaaaaaac tcccccatct cccgggcaaa cgtgcgcgcc cctgccgcaa 120
atcgtcggta tggagccggg ggtggtgacg tgggtctgga ccatcccgga ggtaagttgc 180 agcagggcgt cccggcagcc ggcgggcgat tggtcgtaat ccaggataaa gacgtgcatg 240 ggacggaggc gtttggccaa gacgtccaag gcccaggcaa acacgttgta caggtcgccg 300 ttgggggcca gcaactcggg ggcccgaaac agggtaaata acgtgtcccc gatatggggt 360 cgtgggcccg cgttgctctg gggctcggca ccctggggcg gcacggccgt ccccgaaagc 420 tgtccccaat cctcccgcca cgacccgccg ccctgcagat accgcaccgt attggcaagc 480 agcccgtaaa cgcggcgaat cgcggccagc atagccaggt caagccgctc gccggggcgc 540 tggcgtttgg ccaggcggtc gatgtgtctg tcctccggaa gggcccccaa cacgatgttt 600 gtgccgggca aggtcggcgg gatgagggcc acgaacgcca gcacggcctg gggggtcatg 660 ctgcccataa ggtatcgcgc ggccggggta gcacaggagg gcggcgatgg ggatggcggt 720 cgaagatgag ggtgagggcc ggggggcggg gcatgtgagc tcccagcctc ccccccgatt 780 tgaggagcca gaacggcgtc gggtcacggc taaggcatgc ccattggtaa tcggggccct 840
<210> 55
<211> 833
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador pAd-sense, secuencia parcial del virus
<400> 55 cctggcatct ttttgaaagt cggatcttgt cgcgtttatt attatagtca gggggatcct 60 ctagaactag tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 120 ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 180 tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctggg taggtgtcat tctattctgg 240 ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 300 gggatggtac cggaggcctc gctagccacg cgtgcagctt gtcttgtctg tacagtggta 360
agtcctggcc ttgcctttgt ggcaaataca acccccttga attgcttggc ccttctcagc 420 attgcctaat attagggagg actcctgtaa agctcactgg ttagaagatc aagacacttg 480 ggcctggttc tgcccctggg ggtcattggg taattccttg cagtctccag gcctcacttg 540 ccctctgaac aagaaagagg ctgttctggg tcatccctcc aggcctgtcc agccctggca 600 ctctgtgagt cggtttaggc agcagccccg gaacagatga ggcaggcagg gttgggacgt 660 ttggtcagga cagcccaccg caaaaagagg aggaaagaaa tgaaagacag agacagcttt 720 ggctatggga gaaggaggag gccgggggaa ggaggagaca ggaggaggag ggaccacggg 780 gtggagggga gatagaccca gcccagagct ctgagtggtt tcctgtttgc ctg 833
<210> 56
<211> 816
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia obtenida con el cebador pAd-antisense, secuencia parcial del virus
<400> 56 cctcatcccc taacgcatcc gcctctgaat gtgatgtcca actcatcatg tatcttatca 60 tgtctggatc tcgcggtctc cccctgtgct ggcggccgct ttacttgtac agctcgtcca 120 tgtttgagag tgatcccggc ggcggtcacg aactccagca ggaccatgtg atcgcgcttc 180 tcgttggggt ctttgctcag ggcggactgg gtgctcaggt agtggttgtc gggcagcagc 240 acggggccgt cgccgatggg ggtgttctgc tggtagtggt cggcgagctg cacgctgccg 300 tcctcgatgt tgtggcggat cttgaagttc accttgatgc cgttcttctg cttgtcggcc 360 atgatataga cgttgtggct gttgtagttg tactccagct tgtgccccag gatgttgccg 420 tcctccttga agtcgatgcc cttcagctcg atgcggttca ccagggtgtc gccctcgaac 480 ttcacctcgg cgcgggtctt gtagttgccg tcgtccttga agaagatggt gcgctcctgg 540 acgtagcctt cgggcatggc ggacttgaag aagtcgtgct gcttcatgtg gtcggggtag 600 cggctgaagc actgcacgcc gtaggtcagg gtggtcacga gggtgggcca gggcacgggc 660
agcttgccgg tggtgcagat gaacttcagg gtcagcttgc cgtaggtggc atcgccctcg 720 ccctcgccgg acacgctgaa cttgtggccg tttacgtcgc cgtccagctc gacagggatg 780 10 ggcaccaccc cggtgaacag ctcctcgccc ttgctc 816
Claims (19)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un ADN aislado que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO 1.
-
- 2.
- El ADN aislado de la reivindicación 1, en donde la secuencia promotora está operablemente ligada a un gen heterólogo.
-
- 3.
- El ADN aislado de la reivindicación 1, que además comprende un segundo promotor de ácido nucleico.
-
- 4.
- El ADN aislado de la reivindicación 3, que además comprende una secuencia reguladora seleccionada de una secuencia de respuesta a radiación, una secuencia de respuesta a hipoxia o una secuencia de respuesta a radicales libres.
-
- 5.
- El ADN aislado de la reivindicación 2, en donde el gen heterólogo es un gen terapéutico.
-
- 6.
- El ADN aislado de la reivindicación 2, en donde el gen heterólogo está seleccionado a partir del grupo que consiste de: un gen de E1A, un gen suicida, la región E3 del genoma adenoviral y un gen que codifica una interleuquina.
-
- 7.
- Un vector de expresión que comprende el ADN aislado de la reivindicación 1 y un gen heterólogo operablemente ligado al mismo.
-
- 8.
- El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde el vector es un plásmido o un vector viral.
-
- 9.
- El vector de expresión de la reivindicación 8, en donde el vector viral es un adenovirus recombinante.
-
- 10.
- El vector de expresión de la reivindicación 8, en donde el vector viral es un Adenovirus Oncolítico de Replicación Condicionada.
-
- 11.
- El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde el gen heterólogo es un gen terapéutico.
-
- 12.
- El vector de expresión de la reivindicación 11, en donde el gen heterólogo es un gen de la proteína E1A.
-
- 13.
- El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde el gen heterólogo es un gen suicida.
-
- 14.
- El vector de expresión de la reivindicación 13, en donde el gen suicida es el gen de timidina quinasa de un virus de herpes (hsvTK).
-
- 15.
- El vector de expresión de la reivindicación 7, que además comprende una región E3 del genoma adenoviral.
-
- 16.
- Un método ex-vivo para expresar ADN foráneo en una célula huésped, comprendiendo el método introducir dentro de la célula huésped el vector de expresión de la reivindicación 7.
-
- 17.
- Una composición farmacéutica que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7 en un portador farmacéuticamente adecuado.
-
- 18.
- El uso de una composición farmacéutica de la reivindicación 17 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un paciente que sufre del mismo.
-
- 19.
- Un vector de expresión que comprende un promotor de ácido nucleico que tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO 1 de acuerdo a la reivindicación 1.
Exon 1Inter-GGA+1 +70GGA GGATATA-like INR1 INR2box 2 box 1- -
- 12/-7 -1/+6 +18/+24
FIG. 1Expresión relativa de ARNm de SPARCLíneas celulares FIG. 2Exon 1- -1175
- -513 -120 +1 +28+24 +70+35
- box 2
- box 1 -12/-7 -1/+6 +29/+33+18/+24 Exon 1
- -
- 12/-7 -1/+6 +18/+24 +29/+33
FIG. 3Inducción con respecto a pGL3-Basic Inducción con respecto a pGL3-Basic550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0- -
- 1175/+71
A375N-1175/+35MeL-Les- -
- 1175/+28
Mel888- -
- 513/+71
MelJ- -
- 513/+35
FIG. 4 ASpdel F512SB2- -
- 513/+28
T84- -
- 513/+24
- -
- 120/+71-120/+35-120/+28SpdelpGL3 prompGL3-Basic
LoVoBAECWI-38 VAU87HeLaT-47DFIG. 4 B67 68 6972 73 74 75 76 77 78 79 80 81REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓNEsta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.Literatura diferente de patentes citada en la descripción82 83
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