ES2384940T3 - Inmunoquinasas - Google Patents

Abstract

Complejo endogeno soluble sintetico formado a partir de por lo menos un componente A y de por lo menos uncomponente B que se acoplan quimicamente o se fusionan geneticamente el uno al otro, de manera que elcomponente A comprende anticuerpos como dominio de union para las estructuras de superficie extracelulares quese internalizan tras la union del componente A de dicho complejo, y quinasas que promueven la muerte, queconsisten en la proteina quinasa asociada a la muerte (DAP-quinasa, DAPk) o la quinasa del factor 2 de elongacioneucariota (eEF-2k) como componente B, que tiene una actividad quinasa catalitica constitutiva y realiza labiosintesis/senalizacion celular que incluye la muerte celular despues de la internalizacion.

Description

Inmunoquinasas

5 La presente invención se refiere a un complejo endógeno soluble sintético formado a partir de por lo menos un componente A y de por lo menos un componente B, de manera que el componente A comprende un dominio de unión para las estructuras de superficie extracelulares que se internalizan tras la unión del componente A de dicho complejo, y el componente B tiene una actividad quinasa catalítica constitutiva y realiza la biosíntesis/señalización celular que incluye la muerte celular después de la internalización a través de la fosforilación. La presente invención se refiere también a ácidos nucleicos y/o a vectores que codifican para tal complejo. La presente invención proporciona además un método para influir en el crecimiento celular y/o en la fisiología de las células a las que han sido dirigidos dicho complejo, dichos ácidos nucleicos o dichos vectores. La invención se refiere adicionalmente a células o líneas celulares u organismos no humanos, tales como plantas, que incluyen algas y/o microorganismos, que incluyen levaduras y hongos, que producen el complejo de la presente invención. La presente invención tiene

15 que ver también con un kit que comprende dicho complejo, dichos ácidos nucleicos, dichos vectores y/o dichas células. La presente invención se refiere al uso de dicho complejo, dichos ácidos nucleicos o vectores, dichas células o dicho kit para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades proliferativas, las alergias, las enfermedades autoinmunes y/o la inflamación crónica. La presente invención se refiere adicionalmente al uso de dicho complejo, dichos ácidos nucleicos o vectores, dichas células y/o dicho kit para la modulación selectiva de las vías de señalización celular, a fin de realizar la expresión génica, y/o la viabilidad de la célula diana de una manera terapéutica. La invención se refiere adicionalmente a un medicamento que comprende dicho complejo, dichos ácidos nucleicos, dichos vectores, dichas células o dichos organismos. Además, los complejos, ácidos nucleicos, vectores, células y kits de la presente invención pueden utilizarse en ensayos diagnósticos, analíticos y de pronóstico de quinasas.

Antecedentes de la invención

Los medicamentos actualmente disponibles para las enfermedades proliferativas, tales como los agentes quimioterapéuticos, tienen la desventaja de inducir efectos secundarios considerables debido a su relativa falta de especificidad. Se ha intentado moderar éstos mediante diversos conceptos terapéuticos. Un enfoque potencial es el uso de agentes inmunoterapéuticos para aumentar la especificidad de la medicación. Este enfoque ha resultado especialmente útil para el tratamiento de tumores.

Un tipo de agente inmunoterapéutico son las inmunotoxinas. Una inmunotoxina comprende un anticuerpo

35 monoclonal (AcMo) o un fragmento de anticuerpo recombinante con una afinidad específica para los marcadores de superficie de las células diana, que se acopla a un reactivo citotóxico. Los agentes citotóxicos se seleccionan de entre toxinas o elementos radiactivos. Un agente inmunoterapéutico en el que el agente citotóxico es un elemento radiactivo se denomina radioinmunoconjugado. Se han utilizado inmunotoxinas e radioinmunoconjugados para el tratamiento del cáncer.

Otro tipo de agente inmunoterapéutico son los anti-inmunoconjugados. Un anti-inmunoconjugado comprende una estructura relevante para la patogénesis o un fragmento del mismo, que se acopla a un componente de la toxina. Los anti-inmunoconjugados se utilizan para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, las reacciones tisulares o las alergias.

45 Cuando se utilizaban AcMo anti células B marcados radiactivamente con los linfomas celulares, pudieron observarse regresiones tumorales e incluso regresiones completas (1). Por el contrario, los resultados con AcMo frente a los tumores sólidos fueron bastante decepcionantes. Parece ser que el tamaño relativamente grande de las ITs utilizadas en estos estudios interfería con su capacidad de penetración tumoral, y las convertían en agentes terapéuticos ineficaces. La baja tasa de penetración tumoral planteaba un reto especial para los tumores pobremente vascularizados. A fin de obtener una mejor penetración tumoral y tisular y en general mejores propiedades de difusión, se miniaturizaron las ITs. Se especulaba también que estas ITs más pequeñas serían menos inmunogénicas debido al tamaño reducido de los determinantes antigénicos (2). Por lo tanto se conjugaron fragmentos de anticuerpos escindidos proteolíticamente (miniaturizados) con las funciones efectoras anteriormente

55 mencionadas (elementos radiactivos o toxinas).

Las técnicas mejoradas de clonación permitieron preparar ITs completamente recombinantes: las regiones codificadoras de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de las inmunoglobulinas, amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa, se unen entre sí mediante un conector sintético (por ejemplo, (Gly4Ser)3) (SEC ID Nº: 7). A continuación, el fragmento monocatenario de genes de región variable (scFv) resultante se fusiona genéticamente a una región codificadora de una enzima catalíticamente activa que incluye polipéptidos o proteínas citotóxicamente activas (3).

Las citotoxinas peptídicas, que han sido principalmente utilizadas hasta la fecha y por lo tanto las mejor

65 caracterizadas, son las toxinas bacterianas toxina de la difteria (DT), exotoxina A de Pseudomonas, (PE) y el derivado de plantas ricina A (4). El mecanismo de la actividad citotóxica es básicamente el mismo en todas estas toxinas a pesar de sus diferentes antecedentes evolutivos. El dominio catalítico inhibe la biosíntesis de proteínas mediante la modificación directa del factor de elongación 2 (EF-2), que es importante para la traducción, o mediante la inactivación del sitio de unión a EF-2 en la subunidad 28S del ARNr de los ribosomas.

5 En la mayoría de las construcciones empleadas hasta la fecha, la aplicación sistémica de inmunotoxinas da como resultado efectos secundarios más o menos graves. Además del síndrome de "fuga vascular", también se produce trombocitopenia, hemólisis, insuficiencia renal y náuseas, dependiendo de la construcción empleada y de la dosis aplicada (4). También se observó daño hepático dependiente de la dosis (5). Además de los efectos secundarios documentados, la inmunogenicidad de las construcciones es uno de los problemas clave de la inmunoterapia. Esto se aplica, en concreto, a la defensa humoral frente a los dominios catalíticos empleados, tales como ricina (HARA), PE, o DT (2). Teóricamente, todas las estructuras no humanas pueden provocar una respuesta inmunológica. Por lo tanto, la administración repetida de inmunotoxinas e inmunoconjugados es limitada. Una consecuencia lógica de estos problemas es el desarrollo de inmunotoxinas humanas.

15 Hasta la fecha, las toxinas humanas utilizadas en las inmunotoxinas se han seleccionado en la mayoría de los casos de las ribonucleasas (6). Ya que las RNasas humanas están presentes en los fluidos extracelulares, el plasma y los tejidos, se consideran menos inmunogénicas cuando se utilizan en inmunotoxinas. La angiogenina (ANG), una proteína de 14 kDa que tiene una homología de secuencia del 64% con la RNasa A, se aisló por primera vez a partir de un medio acondicionado para células tumorales, donde se descubrió debido a su capacidad para inducir la angiogénesis (7). Se demostró que la actividad RNasa específica del ARNt de la angiogenina tiene potencial citotóxico. De conformidad con ello, las inmunotoxinas químicamente conjugadas presentaban posteriormente una actividad tóxica específica de célula. Para evaluar la eficacia de las inmunotoxinas basadas en ANG, se construyeron diferentes conformaciones de ANG con, por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el ligando CD30, y se sometieron con éxito a ensayo in vitro (8). Otro miembro de la superfamilia de las RNasa es la

25 neurotoxina derivada de eosinófilo (EDN). Para la EDN, que tiene un tamaño de 18,4 kDa, hasta la fecha sólo se ha descrito la neurotoxicidad directa. En base a la potencia documentada, se han construido diferentes inmunotoxinas basadas en EDN y se han sometido a ensayo con éxito in vitro (9).

Muy recientemente se ha demostrado que las proteasas como la granzima B o derivados de la misma pueden cumplir de manera eficaz la función efectora de las inmunotoxinas (WO-A-01/80880).

La fosforilación de proteínas es uno de los mecanismos más importantes mediante el cual las señales extracelulares se transforman en respuestas biológicas en las células. La activación de proteínas quinasas es el modo más común de transducción de señales en los sistemas biológicos. Los tres componentes básicos de los sistemas de 35 fosforilación son: 1) fosfoproteínas que modifican sus propiedades por fosforilación y desfosforilación, 2) las proteínas quinasas que transfieren un grupo fosfato a partir de sustratos donantes, como el ATP y el GTP, a los residuos de serina, treonina, tirosina o histidina; y 3) las proteínas fosfatasas que desfosforilan proteínas fosforiladas, restableciendo así el sistema de fosforilación de proteínas concreto a su fase basal. Las proteínas quinasas eucariotas (ePK) representan la mayor superfamilia de proteínas homólogas implicadas en la regulación de las vías de señalización intracelular. Estas quinasas fosforilan los residuos de aminoácidos (aa) situados en los bucles o vueltas de sus sustratos. Para regular las vías de transducción de señales, existen aproximadamente 2.000 quinasas y 500 proteínas fosfatasas codificadas dentro del genoma humano (10). Un gran número de estas quinasas son codificadas por oncogenes y genes supresores tumorales. Se conocen las estructuras primarias de cientos de estas enzimas, y todas contienen un núcleo catalítico conservado de aproximadamente 250 a 300

45 residuos de aa. Se han descubierto características estructurales conservadas del dominio catalítico desde levaduras, organismos eucariotas inferiores hasta mamíferos. El dominio catalítico de un dominio quinasa se divide adicionalmente en 12 subdominios más pequeños, definidos como regiones no interrumpidas por inserciones de gran tamaño y que contienen residuos de aa característicos altamente conservados. El subdominio I-IV, situado en el extremo amino-terminal del dominio catalítico, está implicado en el anclaje y en la orientación del nucleótido ATP. Los subdominios VI-IX forman una estructura lobular grande en el extremo carboxilo-terminal del dominio catalítico y están implicados en la unión de sustratos y en la catalización de la reacción de transferencia de fosfato. El patrón de los residuos de aa descubierto dentro del subdominio VIB (motivo HRD), VIII (motivo A/SPE), y IX (motivo DXWXXG (SEC ID Nº 9) está altamente conservado entre las diferentes proteínas quinasas.

55 Las proteínas quinasas eucariotas constituyen una gran superfamilia de proteínas homólogas (11). Un esquema de clasificación se basa en una filogenia del dominio catalítico, que revela las familias de enzimas que tienen especificidades de sustrato y modos de regulación relacionados de acuerdo con el esquema de Hanks y Hunter (12). La mayoría de las proteínas quinasas contienen un dominio catalítico conservado que pertenece a la superfamilia de las proteínas quinasas eucariotas (ePK) (todas las demás proteínas quinasas se clasifican como proteínas quinasas atípicas (aPKs)). Las ePKs se dividen en siete grupos principales, y se subdividen en familias y subfamilias, en base a la secuencia de sus dominios:

Las proteínas quinasas atípicas (aPK) carecen de similitud de secuencia con los dominios ePK, pero tampoco tienen actividad de proteína quinasa, o una clara homología con las aPKs con actividad proteína 65 quinasa. Todas las familias aPK son pequeñas, teniendo varias de ellas un solo miembro en los vertebrados. No se han encontrado en invertebrados. Una serie de informes han demostrado que las

quinasas de esta subfamilia desempeñan un papel crítico en las vías de señalización que controlan el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular. Recientemente, varios investigadores han identificado una serie de proteínas que interactúan con la aPKC y su caracterización está ayudando a desentrañar los mecanismos de acción y las funciones de estas

5 quinasas. Recientemente, se ha identificado una nueva familia de aPKs denominada alfa quinasas que no tienen ninguna homología con la superfamilia de las proteínas serina/treonina/tirosina quinasas (13). Las alfa quinasas difieren de las proteínas serina/treonina/tirosina quinasas en que fosforilan un residuo de aa treonina situado en la región alfa helicoidal del sustrato.

EL calcio libre es un mensajero secundario importante en todos los tipos de células. Un mecanismo por el que los iones calcio ejercen sus efectos es mediante la unión a una proteína de 17 kDa, la calmodulina (CaM). La unión de cuatro iones calcio a la calmodulina cambia su conformación y promueve su interacción con una serie de otras proteínas, que incluyen varias clases de proteínas quinasas que son activadas por el complejo calcio/CaM (14). La clasificación de las proteínas quinasas dependientes de calcio/CaM se basa en su especificidad por el sustrato.

15 Algunas de estas enzimas tienen un solo sustrato, y se denominan proteínas quinasas dependientes de calcio/CaM "especializadas", mientras que otras tienen una amplia especificidad de sustrato y se denominan quinasas "multifuncionales". Las proteínas quinasas dependientes de calcio/CaM especializadas comprenden tres enzimas. La quinasa fosforilasa, la quinasa de cadena ligera de miosina y la quinasa del factor 2 de elongación eucariota. Las proteínas quinasas dependientes de calcio/CaM multifuncionales comprenden cuatro enzimas denominadas quinasas CAM-I, II, IV y proteínas serina/treonina quinasas proapoptóticas asociadas a la muerte.

Uno de los mediadores positivos de la apoptosis es la DAP-quinasa (DAPk) (15). La DAPk es una serina/treonina quinasa regulada por calcio/CaM proapoptótica con actividad supresora tumoral. DAPk es frecuentemente inactivada por la metilación del promotor en el cáncer humano. Su expresión se pierde con frecuencia en el carcinoma humano 25 y en las neoplasias de células T/(NK) en banda, en algunos casos en asociación con fases más agresivas de la enfermedad (16). Muy recientemente, se ha demostrado, que no se podía detectar ninguna expresión de DAPk en las líneas celulares de carcinoma de pulmón altamente metastásico, mientras que los homólogos poco metastásicos fueron positivos para DAPk. Recientemente se han identificado cuatro quinasas adicionales que tienen una homología significativa en su dominio catalítico para DAPk. ZIP(Dlk) quinasa y DRP-1, también denominadas DAPk2, son los miembros de la familia más cercanos, ya que sus dominios catalíticos comparten aproximadamente el 80% de identidad con los de DAPk. Dos proteínas relacionadas con DAPk más distantes son DRAK1 y DRAK2. Tanto las funciones proapoptóticas como las supresoras tumorales de DAPk dependen de su actividad catalítica quinasa. El segmento regulador para CaM de DAPk posee un efecto autoinhibidor sobre la actividad catalítica, y se libera mediante la unión a CaM activada por Ca2+. Consecuentemente, la supresión de este segmento del mutante 35 DAPk-∆CAM generaba una quinasa constitutivamente activa ("quinasa súper citolítica"), que presentaba fosforilación del sustrato independiente de CaM in vitro y promovía la actividad apoptótica in vivo (17). La quinasa del factor 2 de elongación eucariota (eEF-2k) pertenece a las alfa quinasas y es distinta de la familia principal de las proteínas quinasas con las que no comparte similitud de secuencias (18). La actividad del factor 2 de elongación eucariota (eEF-2) es crucial para la etapa de elongación de la traducción del ARNm. La actividad del eEF-2 se regulada mediante fosforilación. Para ser activo, el eEF-2 debe estar desfosforilado, ya que la fosforilación en la Thr-56 y 58 produce la inactivación, dando como resultando la terminación de la traducción del ARNm. La fosforilación de eEF-2 en la Thr-56 y 58 por la eEF-2k dependiente de calcio/CaM altamente específica da como resultado la inactivación de eEF-2 y, por tanto, puede regular la velocidad global de la síntesis de proteínas en la fase de elongación en las células animales. La eEF-2k es a su vez regulada tanto positiva como negativamente por la fosforilación en por lo

45 menos cinco residuos diferentes de serina, probablemente mediada por siete proteínas quinasas o más. Muy recientemente, se ha demostrado que una mutación puntual en la Ser-499, eEF-2K S499D, transforma la quinasa en una forma constitutivamente activa (19).

La fosforilación de proteínas está implicada en procesos celulares como la proliferación, la diferenciación, la secreción, la invasión, la angiogénesis, la metástasis y la apoptosis. Las proteínas quinasas y las fosfatasas desempeñan un papel clave en la regulación de estos procesos. Los cambios en el nivel, el emplazamiento subcelular y la actividad de las quinasas y de las fosfatasas tienen consecuencias sobre el mantenimiento de la homeostasis celular y la función celular normal. La disfunción en las actividades de las proteínas quinasas puede ocasionar graves estados patológicos. En el cáncer, así como en otras enfermedades proliferativas, la

55 supervivencia, la diferenciación y la proliferación celular desregulada son con frecuencia el resultado de la fosforilación anormal de las proteínas.

La identificación de los papeles clave de las proteínas quinasas en las enfermedades proliferativas ha conducido a grandes esfuerzos para desarrollar inhibidores de las quinasas para el tratamiento de una amplia variedad de cánceres. Se han seleccionado muchas proteínas tirosina y serina/treonina quinasas diferentes como candidatas para las actividades de descubrimiento de fármacos en la investigación de la inflamación y del cáncer, ya sea en su sobreexpresión y/o en la disfunción de un órgano o tejido en concreto, o a través de su asociación en la desregulación de las vías del ciclo celular/la transducción señales. Hasta la fecha, más de 30 dianas diferentes para la tirosina quinasa se encuentran bajo evaluación en los proyectos de descubrimiento de fármacos en oncología. Se

65 han desarrollado inhibidores químicos (moléculas orgánicas, inhibidores peptídicos), oligonucleótidos antisentido y anticuerpos selectivos para las quinasas que se dirigen contra las quinasas intracelulares.

Sin embargo, el desarrollo era lento y estaba asociado a problemas, principalmente debido a la toxicidad asociada, atribuida a la escasa selectividad de estos compuestos. Los inhibidores de las proteínas quinasas se unen principalmente al sitio activo de la enzima, en competencia con el ATP+, y todavía es cuestionable si tales inhibidores pueden utilizarse para el tratamiento a largo plazo de enfermedades crónicas, tales como la artritis

5 reumatoide.

De forma similar, las inmunotoxinas del estado de la técnica tales como las inmunotoxinas recombinantes o enlazadas químicamente o que comprenden ribonucleasas, todavía se asocian al problema de la toxicidad no específica. Este problema reduce la eficacia de las composiciones que comprenden dichas inmunotoxinas, y limita

10 su utilidad como agentes terapéuticos.

Muy recientemente, se desarrollaron diferentes proteínas quiméricas de quinasas fusionadas a distintos ligandos: A) Se construyeron proteínas de fusión quinasa-ligando para influir en el comportamiento de las células T después de la transfección (US-A-5.670.324): después de la transformación de las células T con un vector que codifica para una 15 fusión CD4-quinasa quimérica, las moléculas quiméricas unidas a membrana expresadas pueden utilizarse para identificar fármacos que bloquean la activación de las células T o disminuyen el nivel de autoantígenos. B) También se construyeron receptores quiméricos basados en quinasa para redirigir las células efectoras inmunológicas. Las células efectoras inmunológicas humanas transformadas con un vector que codifica para una proteína de fusión ligando-quinasa unida a la membrana puede ser capaz de dirigirse específicamente contra las células a través de su 20 ligando extracelular y puede iniciar la citolisis de las células diana mediante la actividad de la quinasa fusionada que desencadena la activación de las células efectoras inmunológicas (US 2002/0176851 A1). C) Se fusionaron quinasas dependientes de ciclina (CDKs), en concreto la quinasa Myt-1 humana y derivados de la misma a la región constante de las moléculas de inmunoglobulina, lo que puede mejorar las propiedades farmacocinéticas y simplificar la expresión y la purificación de Myt-1 (US 5.935.835). D) Se construyeron otras proteínas de fusión basadas en

25 quinasa, en concreto las proteínas de fusión scFv-quinasa para la identificación indirecta de las interacciones proteína-proteína dentro de las células vivas después de su transformación con dos vectores diferentes (US 2002/0151684 A1).

En el documento US-A-6.015.556 se describe un compuesto que comprende una parte específica de célula diana,

30 tal como un anticuerpo específico frente a los antígenos de células tumorales, y una parte de inactivación, tal como una enzima, capaz de convertir una sustancia que en su estado nativo es capaz de inhibir el efecto de un agente citotóxico en una sustancia que tiene menor efecto frente a dicho agente citotóxico. La acción prolongada de un agente citotóxico en los sitios del tumor es por tanto posible al tiempo que se protegen los tejidos normales de los efectos del agente citotóxico.

35 De acuerdo con el resumen de la Experimental Cell Research, Volumen 256, Número 1, abril de 2000, págs. 34-41

(8) Cross T.G. describe que la apoptosis es un proceso intrínseco presente en todas las células, puede ser regulado por factores extrínsecos, que incluyen hormonas, factores de crecimiento, receptores de superficie celular, y el estrés celular. Las acciones de los factores proapoptóticos y antiapoptóticos se ven con frecuencia influidas por la 40 modulación del estado de fosforilación de los elementos clave del proceso de apoptosis. Este artículo se centra en el papel de las proteínas quinasas en la apoptosis. La apoptosis es un proceso de varias etapas y las proteínas quinasas han estado implicadas tanto en la fase de inducción de la apoptosis aguas arriba como en la fase de ejecución aguas abajo, como dianas directas para las caspasas. Debido a las limitaciones de espacio de esta revisión no es posible analizar todas las quinasas implicadas en el proceso de apoptosis y los investigadores se han 45 centrado en el presente documento en el papel de las proteínas serina/treonina quinasas. Las quinasas de esta familia que se han propuesto para desempeñar un papel en la apoptosis son la familia de las proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK), específicamente p42/44ERK, MAPK p38 y c-Jun quinasa N-terminal (JNK), la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (PKA), la proteína quinasa B (PKB), o Akt y la proteína quinasa C (PKC). Los investigadores también han considerado brevemente el potencial para la regulación de estas quinasas

50 mediante las proteínas tirosina quinasas, tales como c-abl.

Ninguna de estas fusiones quinasa está disponible como proteína soluble que permita su uso como inmunotoxina humana.

55 Sorprendentemente, se descubrió que los problemas anteriormente mencionados pueden solucionarse mediante complejos endógenos solubles que comprenden fragmento(s) de anticuerpo(s) específicos de célula que se une(n) a quinasa(s) constantemente y catalíticamente activa(s) que desarrollan una actividad citotóxica/reguladora tras la internalización del complejo. Sorprendentemente, los complejos de la presente invención resultan superiores a las inmunotoxinas del estado de la técnica por tener una mayor especificidad al combinar la unión específica a una

60 célula diana con la actividad catalítica constitutiva específica dentro de la célula diana, una inmunogenicidad reducida, una actividad mejorada y ser resistentes a la inactivación no específica, y resultan por lo tanto menos propensas a la reducción de la actividad.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un complejo sintético de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5. La presente invención también describe un complejo sintético formado a partir de por lo menos un componente A y de por lo 5 menos un componente B, de manera que el componente A comprende un dominio de unión para las estructuras de superficie extracelulares que se internalizan tras la unión del componente A de dicho complejo, y el componente B tiene una actividad quinasa catalítica constitutiva, dicho complejo es soluble y ocasiona la muerte celular después de la internalización. El componente A se selecciona del grupo de estructuras de unión activa que consisten en anticuerpos o sus derivados o fragmentos de los mismos, y/o moléculas químicas tales como carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, péptidos, vitaminas, etc., y/o moléculas pequeñas de hasta 100 átomos con actividad de unión al receptor, tales como ligandos, en concreto iones individuales, moléculas peptídicas, moléculas no peptídicas, etc., y/o proteínas de unión a los carbohidratos de la superficie celular y sus ligandos tales como lectinas, en concreto calnexinas, lectinas de tipo o, lectinas de tipo l, lectinas de tipo m, lectinas de tipo p, lectinas de tipo r, galectinas y sus derivados, y/o moléculas de unión a receptores tales como los ligandos naturales para los antígenos de 15 diferenciación (CD), como CD30, CD40, etc., citocinas tales como quimiocinas, factores estimuladores de colonias, citocinas de tipo 1, citocinas de tipo 2, interferones, interleucinas, linfocinas, monocinas, etc., y/o moléculas de adhesión que incluyen sus derivados y mutantes, y/o derivados o combinaciones de cualquiera de las estructuras de unión activa anteriormente enumeradas, que se unen a antígenos CD, receptores de citocinas, receptores hormonales, receptores del factor de crecimiento, bombas de iones, proteínas formadoras de canales. El componente A también puede seleccionarse de entre el grupo de estructuras de unión pasiva que consisten en alérgenos, alérgenos peptídicos, alérgenos recombinantes, anticuerpos idiotípicos de alérgeno, estructuras que provocan la respuesta autoinmune, estructuras que inducen el rechazo de tejidos, regiones constantes de las inmunoglobulinas y sus derivados, mutantes o combinaciones de los mismos. En la presente invención se describe que el complejo es dirigido por su componente A hasta una célula diana que comprende una pareja de unión para 25 las estructuras de unión de A anteriormente enumeradas. En una forma de realización adicional el componente A del complejo tiene una valencia superior al comprender dos o más estructuras de unión idénticas y/o diferentes. El complejo descrito también comprende un componente B que es por lo menos una quinasa seleccionada de entre los tres tipos siguientes de quinasas: 1, la superfamilia de las proteínas quinasas eucariotas (ePK), 2, la superfamilia de las proteínas histidina quinasas (HPK) ó 3, la superfamilia de las proteínas quinasas atípicas (APK). En una forma de realización adicional el componente B es una quinasa humana o una quinasa no humana. Una descripción adicional de la invención es un complejo en el que la ePK se selecciona del grupo de quinasas que promueven la muerte reguladas por calcio/calmodulina (CaM), que consisten en la proteína quinasa asociada a la muerte (DAP quinasa, DAPk), la proteína quinasa 1 relacionada con la DAP quinasa (DRP-1), también denominada DAR quinasa 2 (DAPk2), la proteína quinasa que interactúa con la quinasa de tipo DAP/cremallera (Dlk/ZIP quinasa), también 35 denominada DAP quinasa 3 (DAPK3) y las familias de las quinasas inductoras de apoptosis relacionadas con la DAP quinasa (DRAK1 Y DRAK2), la familia del grupo de proteínas similares a las quinasas que promueven la muerte (CAMKL) reguladas por calcio/calmodulina (CaM), que consiste en por lo menos 49 subfamilias, la subunidad catalítica alfa 1 activada por AMP de la proteína quinasa (PRKAA1), la subunidad catalítica alfa 2 activada por AMP de la proteína quinasa (PRKAA2), BRSK1 y BRSK2, el homólogo del punto de control de CHK1 (CHEK1), la quinasa asociada a Neu regulada positivamente por hormonas (HUNK), la serina/treonina quinasa 11 (síndrome de Peutz-Jeghers) (STK11), las quinasas que regulan la afinidad por MAP/microtúbulos (MARK) 1-4, MARKps 01-30, ortólogo probable de la quinasa de cremallera de leucina embrionaria materna (KIAA0175), serina/treonina quinasa que contiene un dominio PAS (PASK), NIM1, QIK y SNRK, la familia del grupo de las proteínas quinasas que interactúan con el receptor del dominio de muerte (RIP quinasa), que consiste en por lo menos seis subfamilias, RIP 45 quinasa 1, RIP quinasa 2, RIP quinasa 3 y RIP quinasa 4, dominio de repetición de anquirina 3 (ANKRD3) y SqK288, la familia del grupo de las CaM quinasas multifuncionales, que consiste en las CaM quinasas I, II, que incluye las quinasas reguladoras de la afinidad por los microtúbulos (MARK) y las proteínas similares a las quinasas 1 reguladoras de la afinidad por los microtúbulos (MARKL1), la subfamilias de quinasas CaM quinasa IV y CaM quinasa, el grupo de CaM quinasas especializadas, que consiste en la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), la fosforilasa quinasa y la CaM quinasa III (eEF-2k), la familia del grupo de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK), que consiste en las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), las proteínas c-Jun quinasas NH2-terminal (JNK), las subfamilias de las quinasas p38 y quinasas similares a nemo (NLK), la familia del grupo de quinasas dependientes de ciclina (CDK), que consiste en las subfamilias, quinasa relacionada con el ciclo celular (CCRK), ciclo de división celular 2 (CDC2), quinasas dependientes de ciclina (CDK) 1-11, proteína quinasa 55 PCTAIRE (PCTK) 1-3, proteína quinasa PFTAIRE (PFTK) 1-2, y 1 similar a la 2 del ciclo de división celular (proteínas PITSLRE), la familia del grupo de la quinasa 3 alfa del factor 2 de iniciación de la traducción eucariota (EIF2AK3), también denominado (PEK), que consiste en la subfamilia de las proteínas quinasas dependiente de ARN bicatenario (dsRNA) inducible por interferón (PKR). Una forma de realización adicional de la presente invención se refiere a un complejo en el que la proteína histidina quinasa se selecciona de entre una de las once familias HPK 1-11. Una forma de realización adicional de la presente invención es un complejo en el que la aPK se selecciona de entre la familia de las proteínas alfa quinasas, que consiste en las subfamilias de la quinasa del factor 2 de elongación eucariota (eEF-2k), la quinasa de cadena pesada de miosina (MHC quinasa), la quinasas alfa 1 del factor 2 de iniciación de la traducción eucariota (E2K1) y las quinasas asociadas a canales (Chak1 y Chak2), la familia del grupo de las s/t quinasas activadas por Fas (FASTK), que consiste en la subfamilia FASTK, la familia del grupo de la 65 proteína tirosina quinasa 9 (A6), que consiste en las subfamilias A6 y similares a la proteína tirosina quinasa 9 (A6r), la familia del grupo de las proteínas quinasas activadas por p21 (PAK), que consiste en las tres isoformas altamente conservadas: alfa PAK (PAK1), beta PAK (PAK3) y gamma PAK (PAK2, PAKI), la familia del grupo de las quinasas asociadas al receptor de la interleucina 1 (IL-1) (IRAK), que consiste en las subfamilias IRAK-1, IRAK-2, IRAK-3 e IRAK-4, o derivados, mutantes o combinaciones de las mismas. Se han seleccionado estas quinasas debido a que mantienen su actividad en un complejo soluble. Se describe adicionalmente un complejo en el que la actividad 5 quinasa del componente B activa o inactiva directamente los componentes de las vías de regulación celular a través de la fosforilación, la acetilación, la metilación, la prenilación, y la sulfatación, que modifican la función, la expresión génica, o la viabilidad de una célula diana, de manera que un célula diana se define por la capacidad del componente A de unirse a la célula. Preferentemente, el componente B activa o inactiva componentes de las vías de regulación celular, a través de la fosforilación. De acuerdo con la invención el componente B del complejo es DAPK2

o EF-2K. Esas dos quinasas resultaron ser especialmente eficaces en un complejo de acuerdo con la presente invención. Una ventaja adicional de la DAPK2 es la existencia de un mutante constitutivo activo de dicha enzima que es especialmente adecuado para el complejo de la presente invención. Las DAPKs se encuentran con frecuencia inactivadas en las células tumorales humanas. El complejo de la presente invención que comprende una DAPK de este tipo resulta por tanto especialmente útil, ya que permite la reintroducción de una DAPK activa dentro de, por 15 ejemplo, un tumor. Un complejo que comprende eEF-2k como componente B tiene la ventaja de que será activo en cualquier célula humana, ya que eEF-2k es ubicuo. Un derivado de esas quinasas se define como una quinasa constitutivamente activa que ha acumulado por lo menos una mutación y/o modificación, es decir, una deleción, una sustitución, un intercambio de dominio, etc. Las mutaciones preferentes son cambios conservativos de aminoácidos, y las modificaciones preferentes son fosforilaciones, acetilaciones, metilaciones, etc. Una forma de realización adicional de la presente invención es un complejo que comprende uno o más componentes complementarios S que regulan la biosíntesis de proteínas a nivel de la transcripción y/o de la traducción, y/o permite la purificación y/o la detección del complejo o de su componentes, y/o facilita la translocación de por lo menos el componente B en la célula diana y la separación intracelular en la misma, y/o la activación del componente B. Una forma de realización adicional de la presente invención es un complejo en el que los componentes se acoplan químicamente y/o se 25 fusionan genéticamente el uno al otro. Una forma de realización adicional son los complejos genéticamente fusionados denominados L-DARk2-Ki-4-III/T (SEC ID Nº: 2), Ki-4-DAPk2-II/G (SEC ID Nº: 4) y Ki-4(scFv)-eEF-2K (SEC ID Nº: 6), codificados por las moléculas de ADN correspondientes con las SEC ID Nos 1, 3 y 5, respectivamente. Una forma de realización adicional de la presente invención son una molécula de ácido nucleico que codifica para dicho complejo o para componentes individuales del mismo para la preparación de tal complejo, y/o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico. La presente invención se refiere también a las células y a los organismos no humanos que sintetizan complejos completos o componentes individuales de los mismos después de haber sido transformada o transfectada con moléculas de ácidos nucleicos que codifican para tales complejos de la presente invención, o a sistemas de traducción in vitro que sintetizan complejos completos o componentes individuales de los mismos. Son también formas de realización adicionales descritas un organismo y/o 35 una célula transformada o transfectada con la molécula de ácido nucleico o el vector que codifica dicho complejo o componentes del mismo, de manera que dicho organismo sea un procariota, tal como E. coli, B. subtilis, S. carnosus, S. coelicolor, y/o Marinococcus sp., o un eucariota inferior, tal como Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp. y/o P. pastoris, o un eucariota superior no humano tal como una planta y/o un animal, y la célula sea una célula de mamífero primaria o cultivada, tal como una célula humana recién aisladas o una línea celular eucariota, tal como CHO, Cos o 293. Se describe adicionalmente un método para influir en el crecimiento y/o en la fisiología de las células transfectadas o transformadas con la molécula de ácido nucleico o el vector que codifica dicho complejo, cultivando las células en condiciones que favorezcan la actividad del complejo. Se describe adicionalmente un kit que comprende el complejo y/o la molécula de ácido nucleico y/o el vector, y/o las células y/o los procariotas y/o los eucariotas inferiores transfectados o transformados con dichas moléculas de ácido nucleico 45 de la presente invención. Se describe adicionalmente el uso del complejo, y/o de las moléculas de ácidos nucleicos, y/o de los vectores, y/o de las células y/o de los procariotas y/o de los eucariotas inferiores transfectados o transformados con dicha molécula de ácido nucleico y/o del kit para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como las enfermedades proliferativas cancerosas o no cancerosas, las alergias, las enfermedades autoinmunes y/o la inflamación crónica. Una forma de realización adicional es un medicamento que comprende el complejo de la invención de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12. También se describen las moléculas de ácidos nucleicos y/o los vectores y/o las células u organismos que sintetizan el complejo de la presente invención, para el tratamiento de las enfermedades proliferativas, tales como las enfermedades proliferativas cancerosas o no cancerosas, las alergias, las reacciones autoinmunes, las reacciones inflamatorias crónicas o las reacciones por rechazo de tejidos. Una forma de realización adicional es el uso ex vivo, in vivo o in

55 vitro del complejo, y/o de la molécula de ácido nucleico y/o del vector, y/o de las células y/o de los organismos que sintetizan el complejo y/o del kit, para la modulación selectiva de las vías de señalización celular. Una forma de realización adicional es el uso del complejo, y/o de la molécula de ácido nucleico y/o del vector, y/o de las células y/o de los organismos que sintetizan el complejo y/o del kit para los ensayos diagnósticos, analíticos y/o de pronóstico de quinasas, y/o para el desarrollo de tales ensayos. Una forma de realización adicional es el uso del complejo de la invención para el tratamiento de las enfermedades proliferativas, tales como las enfermedades proliferativas cancerosas o no cancerosas, las alergias, las enfermedades autoinmunes, y/o la inflamación crónica.

Breve descripción de los dibujos

65 Figura 1: Clonación de pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G (SEC ID Nº 1), pMS-(Ki-4-DAFk2)-II/G (SEC ID Nº 3) y pMT-Ki-4(scFv)-eEF-2K (SEC ID Nº 5). Calle 1-3, amplificación por PCR de DAPk2 y derivados del mismo.

Calle 4, amplificación por PCR de eEF-2K y derivados del mismo. (M, escalera de ADN; C, control negativo).

Figura 2: Estructura esquemática de los casetes de expresión eucariota pMS-(L-DAPkk2-Ki-4)-III/G (SEC ID

5 Nº 1), pMS (Ki-4-DAPk2)-II/G (SEC ID Nº 3) y la región codificadora del módulo de expresión procariota pMT-Ki-4(scFv)-eEF-2K. Leyendas: hCMV = promotor/potenciador del citomegalovirus humano; Ig-k-L = secuencia líder de la cadena kappa de la inmunoglobulina; M/H = epítopo c-Myc (EQKLISEEDL (SEC ID Nº: 8)) y marcador hexa-histidina; IVS/IRES = secuencia de intervención/sitio interno de entrada al ribosomas; EGFP = proteína verde (green) fluorescente potenciada (enhanced), T7-lac = promotor del operador de la lactosa del bacteriófago T7; pelB = secuencia líder/señal de la pectato liasa B bacteriana de Erwinia carotovora EC; His10 = marcador deca-histidina ; VH = cadena pesada (heavy) variable de la inmunoglobulina; VL = cadena ligera variable de la inmunoglobulina, (G4S)3 = conector (Glicina x 4 -serina) x 3; ATG = codón de iniciación de la traducción; Stop = codón de terminación de la traducción; DAPk2 = proteína quinasa asociada a la muerte (death) 2/DRP-1; eEF-2K = quinasa (kinase) del factor 2 de

15 elongación eucariota; Ki-4 = fragmento variable monocatenario (scfv) derivado de inmunoglobulina anti CD30.

Figura 3: Propiedades de unión de las inmunoquinasas anti-CD30 recombinantes. Unión de pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G (SEC ID Nº 2) a las células positivas para CD30 por citometría de flujo. Las células se tiñeron con inmunoquinasa purificada (B) o con PBS como control negativo (A).

Figura 4: Inhibición del crecimiento de líneas celulares positivas para CD30 derivadas de Hodgkin después de la incubación con pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G como se documenta mediante ensayos de viabilidad celular. Las células L-540Cy se trataron con diferentes diluciones de inmunoquinasa anti-CD30 recombinante, y se

25 midió su capacidad para metabolizar el XTT a una sal de formazán soluble en agua como la absorbancia a 450 y 650 nm. Las mediciones se realizaron por triplicado. Los resultados se presentan como porcentaje de las células control no tratadas con respecto al control positivo tratado con Zeocina.

Figura 5: Secuencia de ácidos nucleicos del marco de lectura abierto (ORF) de la construcción pMS-(L-DAPk2'-Ki-4)-III/G.

Figura 6: Secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto (ORF) de la construcción pMS-(L-DAPk2'-Ki-4)-III/G.

35 Figura 7: Secuencia de ácidos nucleicos del ORF de la construcción pMS-(L-DAPk2'-Ki-4)-II/G.

Figura 8: Secuencia de aminoácidos del ORF de la construcción pMS-(L-DAPk2'-Ki-4)-II/G.

Figura 9: Secuencia de ácidos nucleicos del ORF de la construcción pMT-Ki4(scFv)-eEF-2K.

Figura 10: Secuencia de aminoácidos del ORF de la construcción pMT-Ki4(scFv)-eEF-2K.

Figura 11: Secuencia de aminoácidos del conector sintético.

45 Figura 12: Secuencia de aminoácidos del epítopo c-Myc.

Figura 13: Motivo en el dominio IX de las quinasas.

Descripción detallada de la invención

El complejo de acuerdo con la invención es un complejo heterólogo recombinante que comprende por lo menos dos dominios, es decir, un dominio efector y por lo menos un dominio de unión específico de célula. El complejo de acuerdo con la invención es utilizable para el diagnóstico y la terapia de enfermedades.

55 La invención descrita en el presente documento se inspira en las solicitudes de patente en trámite y en los trabajos publicados con anterioridad. A modo de ejemplo, tales trabajos consisten en artículos científicos, patentes o solicitudes de patente en trámite. Todas estas publicaciones y solicitudes, citadas anteriormente o más adelante se incorporan en el presente documento por referencia.

Definiciones

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunotoxina" se refiere a moléculas quiméricas en las que un anticuerpo monoclonal de unión a células o fragmentos del mismo se acopla químicamente o se fusiona genéticamente a toxinas o a sus subunidades. La parte de toxina de la inmunotoxina puede derivarse de diversas 65 fuentes, tales como plantas, animales, microorganismos superiores e inferiores tales como bacterias y hongos y, en concreto si la toxina es una enzima catalítica, la enzima puede ser de origen humano. La toxina también puede ser

un fármaco sintético. Las inmunotoxinas así como sus construcciones se han revisado anteriormente y son conocidas para el experto en la materia.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoquinasa" se refiere a moléculas quiméricas en la

5 que un anticuerpo monoclonal de unión a células o a fragmentos de las mismas se acopla o se fusiona a quinasas o a sus subunidades que albergan la actividad quinasa. El término inmunoquinasa es un sinónimo del complejo de la presente invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "componente A" del complejo representa la estructura de unión activa del complejo de la presente invención. El componente A se selecciona del grupo de estructuras de unión activa que consiste en anticuerpos, péptidos sintéticos tales como scFv, mimotopos. También se describen como ligandos moléculas químicas tales como carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, péptidos, vitaminas, etc., y/o moléculas pequeñas con hasta 100 átomos con actividad de unión al receptor, en concreto átomos individuales, moléculas peptídicas y moléculas no peptídicas, etc., y/o proteínas de unión a carbohidratos de la superficie celular y 15 sus ligandos tales como lectinas, en concreto calnexinas, lectinas de tipo o, lectinas de tipo l, lectinas de tipo m, lectinas de tipo p, lectinas de tipo r, galectinas y su derivados, y/o moléculas de unión a receptores tales como ligandos naturales para los antígenos de diferenciación (CD), como CD30, CD40, etc., citocinas, tales como quimiocinas, factores estimuladores de colonias, citocinas de tipo 1, citocinas de tipo 2, interferones , interleucinas, linfocinas, monocinas, etc., y/o moléculas de adhesión que incluyen sus derivados y mutantes, y/o derivados o combinaciones de cualquiera de las estructuras de unión activa anteriormente mencionadas, que se unen a antígenos CD, receptores de citocinas, receptores hormonales, receptores del factor de crecimiento, bombas de iones, proteínas formadoras de canales. Se describe que el componente A también puede seleccionarse del grupo de estructuras de unión pasiva que consisten en alérgenos, alérgenos peptídicos, alérgenos recombinantes, anticuerpos idiotípicos de alérgeno, estructuras que provocan la respuesta autoinmune, estructuras que inducen el

25 rechazo de tejidos, regiones constantes de las inmunoglobulinas y sus derivados, mutantes o combinaciones de los mismos. Puede generarse un componente A con una valencia mayor combinando por lo menos dos estructuras de unión idénticas o diferentes seleccionadas de entre los grupos anteriormente mencionados.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, y fragmentos de los mismos, tales como Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos que conservan la función de unión al antígeno y la especificidad del anticuerpo parental.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de

35 anticuerpos que tiene una población homogénea de anticuerpos. La expresión no se limita con respecto a las especies o a la fuente del anticuerpo, ni pretende estar limitada por la manera en que se hace. La expresión abarca inmunoglobulinas enteras así como fragmentos tales como Fab, F(ab’)2, Fv, y otros que conservan la función de unión al antígeno y la especificidad del anticuerpo. En la presente invención pueden utilizarse anticuerpos monoclonales de cualquier especie de mamífero, sin embargo, en la práctica, los anticuerpos serán por lo general de origen murino o de rata debido a la disponibilidad de las líneas celulares murinas o de rata para su uso en la fabricación de los hibridomas o líneas celulares híbridas requeridas para producir los anticuerpos monoclonales.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpos humanos" significa que las regiones marco de una inmunoglobulina se derivan de las secuencias de inmunoglobulinas humanas.

45 Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "fragmentos de anticuerpos monocatenarios" (scFv) se refiere a anticuerpos preparados determinando los dominios de unión (cadenas pesada y ligera) de un anticuerpo de unión, y suministrando un resto de unión, que permite conservar la función de unión. Esto forma, en esencia, un anticuerpo radicalmente abreviado, que tiene solamente esa parte del dominio variable necesaria para la unión al antígeno. La determinación y la construcción de anticuerpos monocatenarios se describe en la patente

U.S. N° 4.946.778 de Ladner et al.

El "componente B" descrito por la presente invención representa el resto "quinasa diana" de la inmunoquinasa de la presente invención y puede seleccionarse de entre cualquier quinasa conocida en la técnica. En la actualidad, en las 55 bases de datos públicas se encuentran disponibles para el análisis más de 5.000 secuencias similares a las de las quinasas de diversas especies. El genoma humano parece codificar para 510 proteínas quinasas además de muchos genes de proteínas pseudoquinasas, y éstos se han subclasificado en más de 57 familias. Es muy posible que haya otras proteínas quinasas que estén aún por identificar (http://www.kinexus.ca/kinases.htm). Sin embargo, tal como se describe, el componente B se elige de entre las siguientes tres clases de quinasas, todas ellas conocidas por ser activas en los seres humanos y por conservar su actividad quinasa en un complejo soluble, 1. la superfamilia de las proteínas quinasas eucariotas (ePK), 2. la superfamilia de las proteínas histidina quinasas (HPK), ó 3. la superfamilia de las proteínas quinasas atípicas (aPK). De acuerdo con la invención el componente B se elige de entre la superfamilia de las ePK, a saber, de entre el grupo de las quinasas que promueven la muerte reguladas por calcio/calmodulina (CaM), que consiste en la proteína quinasa asociada a la muerte (DAP quinasa, DAPk), la 65 proteína quinasa 1 relacionada con la proteína quinasa DAP (DRP 1), también denominada DAP quinasa 2 (DAPk2). También se describen la proteína quinasa que interactúa con la quinasa de tipo DAP/cremallera (Dlk/ZIP quinasa), también denominada DAP quinasa 3 (DAPK3) y las familias de las quinasas inductoras de apoptosis relacionadas con la DAP quinasa (DRAK1 Y DRAK2), la familia del grupo de proteínas similares a las quinasas que promueven la muerte (CAMKL) reguladas por calcio/calmodulina (CaM), que consiste en por lo menos 49 subfamilias, la subunidad catalítica alfa 1 activada por AMP de la proteína quinasa (PRKAA1), la subunidad catalítica alfa 2 activada por AMP 5 de la proteína quinasa (PRKAA2), BRSK1 y BRSK2, el homólogo del punto de control de CHK1 (CHEK1), la quinasa asociada a Neu regulada positivamente por hormonas (HUNK), la serina/treonina quinasa 11 (síndrome de Peutz-Jeghers) (STK11), la quinasa que regula la afinidad por MAP/microtúbulos (MARK) 1-4, MARKps 01-30, ortólogo probable de la quinasa de cremallera de leucina embrionaria materna (KIAA0175), serina/treonina quinasa que contiene un dominio PAS (PASK), NIM1, QIK y SNRK, la familia del grupo de las proteínas quinasas que interactúan con el receptor del dominio de muerte (RIP quinasa), que consiste en por lo menos seis subfamilias, RIP quinasa 1, RIP quinasa 2, RIP quinasa 3 y RIP quinasa 4, dominio de repetición de anquirina 3 (ANKRD3) y SqK288, la familia del grupo de las CaM quinasas multifuncionales, que consiste en las CaM quinasas I, II, que incluye las quinasas reguladoras de la afinidad por los microtúbulos (MARK) y las proteínas similares a las quinasas 1 reguladoras de la afinidad por los microtúbulos (MARKL1), la subfamilias de quinasas CaM quinasa IV y CaM 15 quinasa, el grupo de CaM quinasas especializadas, que consiste en la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), la fosforilasa quinasa. La CaM quinasa III (eEF-2k) también es una forma de realización del componente B de la invención. Se describe adicionalmente la familia del grupo de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK), que consiste en las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), las proteínas c-Jun quinasas NH2-terminal (JNK), las subfamilias de las quinasas p38 y quinasas similares a nemo (NLK), la familia del grupo de quinasas dependientes de ciclina (CDK), que consiste en las subfamilias, quinasa relacionada con el ciclo celular (CCRK), ciclo de división celular 2 (CDC2), quinasas dependientes de ciclina (CDK) 1-11, proteína quinasa PCTAIRE (PCTK) 1-3, proteína quinasa PFTAIRE (PFTK) 1-2, y 1 similar a la 2 del ciclo de división celular (proteínas PITSLRE), la familia del grupo de la quinasa 3 alfa del factor 2 de iniciación de la traducción eucariota (EIF2AK3), también denominado (PEK), que consiste en la subfamilia de las proteínas quinasas dependientes de ARN bicatenario 25 (dsRNA) inducibles por interferón (PKR). También se describe el componente B seleccionado de la superfamilia HPK, es decir seleccionado del grupo de por lo menos once familias HPK 1-11. De acuerdo con la invención el componente B se elige de entre la superfamilia de las aPK, es decir la quinasa del factor 2 de elongación eucariota (eEF-2k). También se describen las subfamilias de la quinasa de cadena pesada de miosina (MHC quinasa), la alfa quinasa 1 del factor 2 de iniciación de la traducción en eucariotas (E2K1) y las quinasas asociadas a canales (Chak1 y Chak2), la familia del grupo de s/t quinasas activadas por Fas (FASTK), que consiste en la subfamilia FASTK, la familia del grupo de la proteína tirosina quinasa 9 (A6), que consiste en las subfamilias A6 y similares a la proteína tirosina quinasa 9 (A6r), la familia del grupo de las proteínas quinasas activadas por p21 (PAK), que consiste en las tres isoformas altamente conservadas: alfa PAK (PAK1), beta PAK (PAK3) y gamma PAK (PAK2, PAKI), la familia del grupo de las quinasas asociadas al receptor de la interleucina 1 (IL-1) (IRAK), que consiste en las subfamilias

35 IRAK-1, IRAK-2, IRAK-3 e IRAK-4.

La expresión "célula diana" o "tejido diana" se refiere a células o tejidos que llevan una estructura de superficie extracelular a la que el componente A del complejo se une activa o pasivamente. Las células diana y los tejidos diana son por tanto células y tejidos a los que puede unirse el componente A del complejo. Las células diana y los tejidos diana se caracterizan adicionalmente por su capacidad para internalizar el complejo de acuerdo con la presente invención tras la unión del componente A.

El término "soluble" se refiere a la capacidad del complejo para permanecer en solución cuando se expresa de manera recombinante, en concreto durante la purificación de las proteínas, lo que permite altos rendimientos. El

45 término "soluble" se refiere también al estado del complejo en los sistemas de fluidos dentro de un organismo, hasta que se une específicamente a la célula/al tejido diana. El término también se refiere al estado del complejo dentro de la célula tras la liberación desde cualquier tipo de vesículas de incorporación.

El término "endógeno" se refiere a la localización del complejo en el entorno/ambiente de una célula/un tejido diana dado.

El término sintético se refiere a un complejo hecho por el ser humano, que no se encuentra en la naturaleza. El término también comprende el significado de "recombinante".

55 El término "recombinante" se refiere a la preparación de moléculas, en concreto, la unión covalente de moléculas de diferentes fuentes, mediante cualquiera de los métodos conocidos de la biología molecular. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "recombinante" se refiere en concreto a la fusión de la parte de anticuerpo a la parte de toxina mediante cualquiera de los métodos conocidos de la biología molecular, tal como a través de la producción de anticuerpos monocatenarios. La molécula de ADN recombinante que codifica la proteína de fusión recombinante que comprende la parte de anticuerpo y la parte de toxina se expresan de manera recombinante. La inmunotoxina recombinante producida de esta manera puede aislarse mediante cualquier técnica adecuada conocida en el campo de la tecnología de expresión del ADN recombinante para este propósito.

El término "derivado" se refiere a una proteína mutada o modificada que ha conservado su actividad que le

65 caracteriza, es decir, la actividad de unión o la actividad quinasa. Son especialmente preferentes los derivados constitutivamente activos. El término derivado comprende las proteínas que llevan por lo menos una deleción, adición, sustitución de aminoácidos, un intercambio de un solo dominio o por lo menos una modificación de por lo menos un aminoácido. Son preferentes los derivados que llevan 20 de tales cambios, son más preferentes aquellos con 10 de tales cambios y los más preferentes son aquellos con 1 a 5 de tales cambios. Las modificaciones que pueden producirse, son la fosforilación, la acetilación, la metilación, la prenilación y la sulfatación.

5 Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" comprende formas de ADN y ARN de un plásmido, un cósmido, un fago, fagémido, derivados de los mismos, o un virus. Un vector comprende secuencias de control y secuencias codificadoras.

La expresión "expresión de genes recombinantes que codifican el complejo recombinante", en el que el complejo recombinante es un polipéptido de fusión de resto de toxina-anticuerpo monocatenario, también denominado inmunoquinasa recombinante, se refiere a la transformación y/o la transfección de una célula hospedadora con un ácido nucleico o un vector que codifica dicho complejo, y el cultivo de dichas células hospedadoras seleccionadas del grupo de bacterias, tales como E. coli, y/o en levaduras, tales como en S. cerevisiae, y/o en líneas celulares

15 establecidas de insectos o mamíferos, tales como células CHO, COS, BHK, 293T y MDCK, y/o en células primarias, tales como células humanas, células de vertebrados no humanos, y/o en células de invertebrados tales como células de insectos, y la síntesis y la traducción del ARNm correspondiente, que da lugar finalmente a la proteína recombinante, el complejo recombinante. En mayor detalle, la expresión "expresión de genes recombinantes que codifican el complejo recombinante", comprende las siguientes etapas:

Transformación de un hospedador celular apropiado con un vector recombinante, en el que se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión bajo el control de los elementos reguladores apropiados, en concreto un promotor reconocido por las polimerasas del hospedador celular. En el caso de un hospedador procariota, un sitio de unión al ribosoma (RBS) apropiado también precede a

25 la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión, lo que permite la traducción en dicho hospedador celular. En el caso de un hospedador eucariota puede proporcionarse cualquier pre/pro secuencia o secuencia señal artificial, o puede emplearse la secuencia señal natural. El hospedador celular transformado se cultiva en condiciones que permiten la expresión de dicho inserto.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "citolisis de las células que expresan el antígeno" se refiere a la inhibición de la síntesis de proteínas o la inducción de la apoptosis, que da como resultado la eliminación

o la muerte de estas células.

La expresión "componentes complementarios S", se refiere a un componente adicional del complejo que comprende

35 A y B. El componente complementario S aporta características y propiedades al complejo que permiten una preparación eficaz y/o que modifican la eficacia del complejo:

− la regulación inducible de la transcripción/traducción (por ejemplo, promotores inducibles), − el control de la biosíntesis de proteínas (por ejemplo, secuencias líder); − la purificación/detección del complejo o de sus componentes (por ejemplo, los marcador His, los marcadores de

afinidad); − la translocación de los agentes apoptóticos en las células diana (por ejemplo, el dominio translocación, las secuencias anfipáticas), − la activación/separación intracelular del componente B (progranzima B sintética, secuencias anfipáticas).

45 De esta manera, el componente S se selecciona del grupo de promotores inducibles, secuencias líder, marcadores de afinidad, marcadores His, dominio de translocación, secuencias anfipáticas y progranzima B sintética. La invención también se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, tales como ADN y/o ARN, o vectores, que codifican para el complejo de la presente invención o para los componentes individuales para preparar el complejo. La viabilidad de la expresión de los ácidos nucleicos que codifican un complejo recombinante en células eucariotas de origen humano se documenta con éxito en el presente documento, así como la viabilidad del uso del complejo como agente de apoptosis específico en las células eucariotas de origen humano. Esto sugiere la idoneidad de los ácidos nucleicos que codifican para un complejo de acuerdo con la invención también para los enfoques genoterapéuticos en líneas no germinales. Una persona experta en la materia es capaz de reconocer los diversos aspectos y

55 posibilidades de las intervenciones genoterapéuticas en relación a las diversas enfermedades a tratar. Además de la aplicación local de vectores relativamente no específicos (por ejemplo, lípidos catiónicos, vectores no virales, adenovirales y retrovirales), una aplicación sistémica con vectores específicos para células diana modificados también será posible en el futuro próximo. Los complejos y las moléculas de ácidos nucleicos y/o los vectores que codifican para los complejos de la presente invención, se utilizan para la preparación de medicamentos para intervenciones genoterapéuticas en líneas no germinales, para la aplicación local o sistémica. Una alternativa interesante a la aplicación sistémica es la transfección ex vivo bien dirigida de poblaciones definidas de células y su retorno al organismo, o el uso de poblaciones definidas de células transfectadas ex vivo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades asociadas con estas poblaciones de células.

65 También se reivindican células o sistemas de traducción in vitro, que sintetizan complejos completos de acuerdo con la invención o componentes individuales de los mismos, después de la transformación y/o la transfección con, o la adición de, los vectores o las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.

5 Las células o los organismos de acuerdo con la invención son de origen procariota, especialmente de E. coli, B. subtilis, S. carnosus, S. coelicolor, Marinococcus sp., o de origen eucariota, especialmente de Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp., P. pastoris, células de mamíferos primarias o cultivadas, líneas celulares eucariotas (por ejemplo, CHO, Cos ó 293) o plantas (por ejemplo, N. tabacum).

10 La invención también se refiere a medicamentos que comprenden el complejo de acuerdo con la presente invención. Por lo general, los complejos de acuerdo con la invención se administran en formas de dosificación fisiológicamente aceptables. Estas incluyen, por ejemplo, Tris, NaCl, tampones fosfato y todos los sistemas tampón aprobados, que incluyen especialmente los sistemas tampón, que se caracterizan por la adición de estabilizadores de proteínas aprobados. La administración se lleva a cabo, en concreto, por vía parenteral, intravenosa, subcutánea,

15 intramuscular, intratumoral, administraciones transnasales, y mediante aplicación transmucosa. La dosificación de los complejos de acuerdo con la invención a administrar debe establecerse para cada aplicación en cada enfermedad a ser recién tratada mediante estudios clínicos de fase I (estudios de escalonamiento de dosis).

Los ácidos nucleicos o vectores, que codifican para un complejo de acuerdo con la invención, se administran

20 ventajosamente en formas de dosificación fisiológicamente aceptables. Estas incluyen, por ejemplo, Tris, NaCl, tampones de fosfato y todos los sistemas tampón aprobados, que incluyen especialmente los sistemas tampón, que se caracterizan por la adición de estabilizadores aprobados para ácidos los nucleicos y/o los vectores a utilizar. La administración se realiza, en concreto, por vía parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratumoral, administraciones transnasales, y mediante aplicación transmucosa.

25 El complejo de acuerdo con la invención, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican para las mismas y/o las células o los sistemas de traducción in vitro pueden utilizarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades tumorales, las alergias, las enfermedades autoinmunes y las reacciones inflamatorias crónicas/agudas.

Resultados

Después de la construcción de tres tipos de complejos recombinantes (inmunoquinasas), los primeros resultados obtenidos demostraron su calidad superior con respecto a la especificidad de unión así como a la citotoxicidad.

35 Construcción y expresión de un complejo recombinante (inmunoquinasa)

Se clonó direccionalmente ADN de DAPk2’ amplificado por PCR (Fig. 1) en el vector de expresión eucariota pMS-(L-ANG-Ki-4)-III/G resistente a la ampicilina que contenía una secuencia líder Igk (L) en el extremo N-terminal, 40 Ki-4(scFv) (componente A) y un epítopo Myc-y His-Tag en tándem en el extremo C-terminal de el casete de expresión (Fig. 2). Se verificó el éxito de la clonación mediante análisis de la secuencia de ADN. Tres días después de la transfección de células 293T, se detectó el complejo recombinante esperado de tamaño apropiado (inmunoquinasa) pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G (Mr ~ 66.000) mediante análisis de transferencia Western de las minipreparaciones de proteínas. Las células del productor transfectado se cultivaron adicionalmente bajo presión de 45 selección con Zeocina en matraces de cultivo con medio y se utilizaron para la producción a mayor escala del complejo recombinante (inmunoquinasa) pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G. En condiciones de cultivo normales, se purificaron entre 0,1 y 0,5 μg de la proteína recombinante a partir de 1 ml de sobrenadante del cultivo celular mediante un procedimiento de purificación de Ni-NTA de una sola etapa. Se secretó el complejo recombinante intacto (inmunoquinasa) en el sobrenadante de las células 293T transfectadas, tal como se visualizó por

50 inmunotransferencia utilizando anticuerpo monoclonal de ratón anti-penta-His.

Se clonó direccionalmente ADN de eEF-2K que codificaba el componente B (Fig. 1, 4a-e) en el vector de expresión procariota pBM-Ki-4(scFv) resistente a la kanamicina derivado de pET que contenía un operador lac inducible por IPTG, un péptido señal pelB seguido de un marcador His10 escindible por enteroquinasa, y Ki-4-(scFv) (componente 55 A) (Fig. 2). Se verificó el éxito de la clonación de la construcción del complejo recombinante pMT-Ki-4 (scFv)-eEF-2K mediante análisis de la secuencia de ADN. Después de la transformación, se cultivaron clones de E. coli BL21 StarTM (DE3) recombinante en condiciones de estrés osmótico en presencia de solutos compatibles. El complejo recombinante (inmunoquinasa) se dirigió al espacio periplásmico y la proteína funcional pMT-Ki-4(scFv)-eEF-2K (Mr ~ 113.000) se purificó directamente por combinación de IMAC y SEC hasta una pureza > 90%. Se preparó

60 rutinariamente por lo menos 1 mg de proteína pMT-Ki-4(scFv)-eEF-2K purificada a partir de 1 litro de cultivos bacterianos en agitación. El complejo recombinante intacto (inmunoquinasa) se secretó al compartimiento periplásmico, tal como se visualizó por inmunotransferencia utilizando anticuerpo monoclonal de ratón anti-penta-His.

65 Propiedades de unión de los complejos recombinantes (inmunoquinasas)

La fusión de las regiones codificadoras Ki-4(scFv), el componente A del complejo, a las secuencias codificadoras de la quinasa, el componente B del complejo, no influyó en la actividad de unión del formato de anticuerpo VH/VL del

5 componente A. El componente A confería especificidad frente a la molécula CD30. El complejo recombinante purificado (inmunoquinasa) que comprende el componente A anti-CD30 siempre se unía a la línea celular derivada de Hodgkin L540Cy según se midió por citometría de flujo (Fig. 3)

Actividad citotóxica in vitro

Para caracterizar la actividad citotóxica del complejo recombinante que comprendía anti-CD30 (como componente A) y quinasas (componente B) in vitro, se evaluó la proliferación de las diferentes células diana después de la incubación con diferentes cantidades de los complejos recombinantes (inmunoquinasas) pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G y pMT-Ki-4(scFv)-eEF-2K, respectivamente. La inhibición del crecimiento de las líneas celulares positivas para CD30

15 L540Cy y HL60 se documento mediante un ensayo colorimétrico basado en XTT. Se observaron efectos tóxicos sólo frente a células positivas para CD30 con una mediana calculada IC50 de entre 4 y 35 ng/ml en las células L540Cy (Fig. 4). Las líneas celulares Ramos negativas para CD30 y 8701-BC no se vieron influidas por concentraciones de inmunoquinasa recombinante de hasta 10 μg/ml. Por tanto, el componente A (scFv anti-CD30) del complejo confería especificidad al complejo recombinante, limitando los efectos citotóxicos del dominio quinasa a las células diana seleccionadas.

Ejemplos

Cepas bacterianas, oligonucleótidos, y plásmidos

25 Se utilizó E. coli XL1-blue (supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyr A46 thi relA1 IacF'[PRO AB+ laclq lacZ ?M15 Tn10 (tetr)]) para la propagación de los plásmidos, y E. coli BL21 Star™ (DE3) (F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm rne 131 DE3) como hospedador para la síntesis de inmunoquinasas recombinantes. Se sintetizaron oligonucleótidos sintéticos mediante MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). El vector de expresión bacteriano PBM-Ki-4 se deriva del plásmido pET27b (Novagen, Madison, EE.UU.), y se utiliza para la expresión de la fusión C-terminal de los dominios NotI/BlpI quinasa para el scFv anti-CD30 (Klimka , A. et al., 1999). Los vectores de expresión eucariotas pMSKAngII y pMSLAngKIII se derivan del plásmido pSecTag (Invitrogen, San Diego, EE.UU.) y se utilizan para la fusión N-terminal o C-terminal de los dominios XbaI/Blpl quinasa para Ki-4 (scFv) (Stöcker, M. al., 2003). Los plásmidos se prepararon mediante el método de lisis alcalina y se purificaron utilizando kits de preparación de plásmidos de

35 Qiagen (Hilden, Alemania). Los fragmentos de restricción o los productos de la PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa horizontal y se extrajeron con QlAquick (Qiagen). Todos los procedimientos de clonación estándar se llevaron a cabo como describen Sam Brook, J. et al., 1989.

Cultivo celular

Todas las líneas celulares, que incluyen las líneas celulares positivas para CD30 L540Cy (Kapp, U. et al., 1992) y HL-60 (Thepen, T. Utrecht, Países Bajos), las líneas celulares Ramos negativas para CD30 (ATCC, VA, EE.UU.) y 8701-BC (Minafra, S. et al., 1989) y la línea celular 293T productora (ATCC) se cultivaron en un medio complejo (RPMI 1640) complementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (v/v), 50 μg/ml de penicilina,

45 100 μg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Todas las células se cultivaron a 37°C en atmósfera de aire con CO2 al 5%. Para la selección de las células transfectadas, se añadió Zeocina (Invitrogen) a una concentración final de 100 μg/ml.

Construcción y expresión de los complejos recombinantes (inmunoquinasas)

Clonación y expresión de pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G (SEC ID Nº 1) y pMS-(Ki-4-DAPk2)-II/G (SEC ID Nº 3)

Para la construcción de un vector que codifica un complejo recombinante con fusiones DAP-quinasa 2 (DAPk2) N-terminales o C-terminales, se amplificó DAPk2 por PCR para introducir los sitios de restricción XbaI y BlpI.

55 Después de la digestión con XbaI/BlpI, se clonó el producto de la PCR en el vector de expresión eucariota pMS-(L-ANG-Ki-4)-III/G y pMS-(Ki-4-ANG)-II/G respectivamente, digerido con las mismas enzimas de restricción. Las construcciones recombinantes resultantes pMS-(L-DAPk2-Ki-4)-III/G (SEC ID Nº 1) y pMS-(Ki-4-DAPk2)-II/G (SEC ID Nº: 3) que codificaban las proteínas inmunoquinasas L-DAPk2-Ki-4-MH (SEC ID Nº 2) y L-Ki-4-DAPk2-MH (SEC ID Nº 4) se verificaron mediante análisis de secuencias. Después de la transformación mediada por TransFast (Promega, Mannhein, Alemania) en células 293T, la inmunoquinasa recombinante se expresó como describen Stöcker M. et al., 2003. En resumen, se han utilizado un μg de ADN de plásmido y 3 μg de TransFast de acuerdo con el protocolo del fabricante para placas de cultivo celular de 12 pocillos. La eficacia de la transfección fue de entre el 75% y el 95% determinada mediante recuento de células verdes fluorescentes. Tres días después de la transfección inicial, se analizaron los sobrenadantes de los cultivos celulares en busca de proteína recombinante.

65 Posteriormente, las células transfectadas se transfirieron a matraces de cultivo celular de tamaño medio (Nunc; 85m2) y se cultivaron en medio complejo RPMI complementado con 100 μg/ml de Zeocina. Los clones de una a dos

semanas transfectados productivamente eran de color verde fluorescente y por lo tanto pudieron detectarse por microscopía de fluorescencia. Las poblaciones de células transfectadas se establecieron por subcultivo de estos clones. Se llevaron a cabo las purificaciones de las proteínas marcadas con His mediante el método de afinidad por los metales Ni-NTA (Hochuli, V., 1989, Porath, J. y col., 1975) (Qiagen). La purificación de proteínas siguió un 5 protocolo modificado para la purificación de la proteína nativa de Qiagen (The Expressionist 07/97). Para la minipreparación de proteínas, se complementaron 900 μl de sobrenadante del cultivo celular aclarado por centrifugación con 300 μL de tampón de incubación 4x (200 mM de NaH2PO4, pH 8,0; 1,2M de NaCl; 40 mM de imidazol) y 30 μl de Ni-NTA al 50%. Tras 1 hora de incubación, se sedimentó la resina de Ni-NTA por centrifugación. Después de lavar el sedimento dos veces en 175 μl de tampón de incubación 1x, se eluyó la proteína unida con 10 30 μl de tampón de elución (50 mM de NaH2PO4, pH 8,0; NaCl 1,2 M y 40 mM de imidazol) y 30 μl de Ni-NTA al 50%. Tras 1 hora de incubación, se sedimentó la resina de Ni-NTA por centrifugación. Después de lavar el sedimento dos veces en 175 μl de tampón de incubación 1x, la proteína unida se eluyó con 30 μl de tampón de elución (50 mM de NaH2PO4, pH 8,0; 300 mM de NaCl; 250 mM de imidazol) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se realizó la purificación a mayor escala de las proteínas expresadas eucarióticamente hasta 500 ml de

15 sobrenadante del cultivo celular en una estación de trabajo BioLogic (Bio-Rad, EE.UU.). Los sobrenadantes del cultivo celular se cargaron en una columna de Ni-NTA y la elución siguiente de las proteínas marcadas con His se hizo bajo las condiciones que se han descrito anteriormente.

Clonación y expresión de pMT-Ki-4(scFv)-eEF-2K

20 Se amplificó por PCR la quinasa del factor 2 de elongación eucariota (EEF-2k) para introducir los sitios de restricción NotI y BlpI. Después de la digestión con NotI/BlpI, se clonó el fragmento amplificado por PCR en el vector de expresión bacteriano PBM-Ki-4, digerido con las mismas enzimas de restricción. Se verificó la construcción recombinante resultante pMT-Ki-4(scFv)-eEF-2K (SEC ID Nº: 5) mediante análisis de secuencias de ADN. Después

25 de la transformación en BL21 Star™ (DE3), la inmunoquinasa Ki-4(scFv)-eEF-2K (SEC ID Nº 6) se expresó periplásmicamente bajo estrés osmótico en presencia de solutos compatibles como describen Barth, S. et al. 2000. En resumen, las bacterias transformadas se recogieron 15 horas después de la inducción con IPTG. El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de sonicación (75 mM de Tris/HCl (pH 8), 300 mM de NaCl, 1 cápsula de inhibidores de la proteasa/50 ml (Complete™, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 5 mM de DTT, 10 mM de

30 EDTA, glicerol al 10% (v/v)) a 4°C y se sonicó 6 veces durante 30 segundos a 200 W. La fusión de proteínas m22(scFv)-ETA’ se enriqueció mediante IMAC (cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados) utilizando una sefarosa quelante de níquel-nitroacético (Qiagen) y SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) con columnas Bio-Prep SE-100/17 (Biorad, München, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína recombinante se eluyó con PBS (pH 7,4) y NaCl 1 M, se analizó mediante electroforesis en gel de

35 dodecilsulfato de sodio/poliacrilamida (SDS-PAGE), se cuantificó por densitometría (densitómetro de imágenes SG-700; Biorad) después de la tinción de Coomassie en comparación con los estándares BSA y se verificó mediante ensayos de Bradford (BioRad).

Análisis SDS-PAGE y transferencia de Western

40 Se realizaron el SDS-PAGE, la tinción de Coomassie, y la transferencia de Western como describen Barth, S. et al., 1998. En resumen, las inmunoquinasas recombinantes marcadas con His se detectaron mediante AcMo de ratón anti-penta-His (Qiagen). El anticuerpo unido se detectó mediante AcMo de burro anti IgG de ratón conjugado con rábano (Dianova, Hamburgo, Alemania), seguido de mediada por ECL (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania),

45 reacción de quimioluminiscencia y exposición a película de rayos X apropiada (Roche, Penzberg, Alemania) o AcMo anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co., Deisenhofen, Alemania) y una solución de Tris-HCl (pH 8,0) y 0,2 mg/ml de naftol-AS-Bi-fosfato (Sigma Chemical Co.) complementado con 1 mg/ml de Fast-Red (Serva, Heidelberg, Alemania).

50 ELISA de membrana celular (CM)

La actividad de unión de los complejos recombinantes (inmunoquinasas) se determinó mediante ELISA-CM utilizando membranas activas biológicas de células tumorales como han descrito recientemente Tur, MK. et al., 2003. En resumen, se recubrieron placas ELISA Maxisorp (Nalge Nunc International, Roskilde, Dinamarca) con

55 100 μl (~ 0,9 mg de proteína/ml) de fracciones de membrana recién preparadas de células L540Cy/HL60 positivas para CD30 y Ramos/8701-BC como control en tampón bicarbonato 0,02 M, pH 9,6, durante toda la noche a 4°C. Las placas se lavaron cinco veces con PBS (pH 7,4) que contenía Tween 20 al 0,2% (TPBS) y se bloquearon con 200 μl de BSA al 2% en PBS. Después incubarse durante toda la noche a 4°C, se lavaron las placas cinco veces con TPBS y 1-10 μg/ml de inmunoquinasas recombinantes diluidas con 0,5% de BSA (p/v) y se añadió Tween 20 al 0,05% (v/v)

60 en PBS a las placas y se incubaron a temperatura ambiente (23°C) durante 1 hora. Se añadió el conjugado IgG anti His marcado con peroxidasa (Qiagen) diluido con BSA al 0,5% y Tween 20 al 0,05% en PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos unidos se visualizaron después de la adición de 100 μl de solución 2',2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) (Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Alemania) midiendo la extinción a 415 nm con un lector de ELISA (MWG Biotech).

Análisis por citometría de flujo

Se evaluó la actividad de unión a las células de los complejos recombinantes (inmunoquinasas) expresados en E. coli BL21 Star™ (DE3) utilizando un instrumento de citometría de flujo FACSCalibur y el software CellQuest (Becton 5 Dickinson, Heidelberg, Alemania). Las células se tiñeron con proteína recombinante como se ha descrito (25). En resumen, se recogieron diez mil eventos para cada muestra, y los análisis de las células intactas se realizaron utilizando ventanas de análisis adecuadas para excluir los agregados y los residuos celulares. Se incubaron 5 x 105 células durante 1 hora sobre hielo con 50 μl de extracto de proteína bacteriana a una concentración de 30-40 μg/ml

o 100 μl de la inmunoquinasa que contenía sobrenadantes respectivamente. Las células se lavaron con tampón PBS que contenía de BSA al 0,2% en p/v y azida de sodio al 0,05% en p/v (PBA) y a continuación se incubaron durante 30 minutos con AcMo anti-penta-His (Qiagen) diluido 1:2 en tampón de PBA. Las células se lavaron y se incubaron con IgG de cabra anti-ratón marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Dako Diagnostica, Hamburgo, Alemania) durante 1 hora a 4°C. Después de un lavado final, las células se trataron con 2 μl 6,25 mg/ml de yoduro de propidio y posteriormente se analizaron en un FACScalibur (Becton Dickison, Heidelberg, Alemania).

15 Ensayo colorimétrico de proliferación celular

Se determinó el efecto citotóxico de los complejos recombinantes (inmunoquinasas) sobre las células diana por medición de la metabolización de la sal amarilla de tetrazolio (XTT) a un colorante de formazano naranja soluble en agua como publicaron Barth, S. et al. 2000. Se distribuyeron diversas diluciones de la inmunoquinasa recombinante en alícuotas de 100 μl en placas de 96 pocillos. Se añadieron de dos a cuatro x 104 células diana en alícuotas de 100 μl de medio completo y se incubaron las placas durante 48 horas a 37°C. Después, los cultivos celulares se pulsaron con 100 μl de medio de cultivo fresco complementado con XTT/PMS (concentraciones finales de 0,3 mg y 0,383 ng, respectivamente) durante 4 horas. Las absorbancias espectrofotométricas de las muestras se midieron a

25 450 y 650 nm (longitud de onda de referencia) con un lector de ELISA (MWG Biotech). La concentración requerida para lograr una reducción del 50% de la síntesis de proteínas (IC50) con respecto a las células control no tratadas y a los controles positivos tratados con Triton X al 1% se calculó gráficamente a través de diagramas de generados en Excel. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Complejo endógeno soluble sintético formado a partir de por lo menos un componente A y de por lo menos un componente B que se acoplan químicamente o se fusionan genéticamente el uno al otro, de manera que el

   5 componente A comprende anticuerpos como dominio de unión para las estructuras de superficie extracelulares que se internalizan tras la unión del componente A de dicho complejo, y quinasas que promueven la muerte, que consisten en la proteína quinasa asociada a la muerte (DAP-quinasa, DAPk) o la quinasa del factor 2 de elongación eucariota (eEF-2k) como componente B, que tiene una actividad quinasa catalítica constitutiva y realiza la biosíntesis/señalización celular que incluye la muerte celular después de la internalización.
2. 2. Complejo según la reivindicación 1, en el que los anticuerpos son anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos que conservan la función de unión al antígeno y la especificidad del anticuerpo parental.

   15 3. Complejo según la reivindicación 1 ó 2, de manera que el componente B comprende DAP-quinasa 2 (DAPk2).
3. 4. Complejo según las reivindicaciones 1 a 3, que comprende uno o más componentes complementarios S que regulan la biosíntesis de proteínas a nivel de la transcripción y/o de la traducción, y/o permiten la purificación y/o la detección del complejo, y/o facilitan la translocación de por lo menos el componente B en la célula diana, y la

   20 activación y/o la separación intracelular del componente B, de manera que el componente S se selecciona del grupo de los promotores inducibles, las secuencias líder, los marcadores de afinidad, los marcadores His, un dominio de translocación, las secuencias anfipáticas y una progranzima B sintética.
4. 5. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene las secuencias de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID 25 Nº:4 y lSEC IDNº:6.
5. 6. Molécula de ácido nucleico que codifica para el complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o para los componentes individuales del mismo para la preparación de tal complejo, y/o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico.
6. 7. Célula u organismo no humano después de haber sido transformado o transfectado con el vector o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, y/o un sistema de traducción in vitro que sintetiza el complejo completo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o los componentes individuales del mismo.

   35 8. Organismo o célula según la reivindicación 7, de manera que el organismo sea un procariota, o un eucariota inferior, un eucariota superior no humano, y la célula sea una célula de mamífero primaria o cultivada, tal como una célula humana recién aislada excepto las células embrionarias humanas, o una línea celular eucariota.
7. 9. Uso de un complejo endógeno soluble sintético formado a partir de por lo menos un componente A y de por lo

   40 menos un componente B, de manera que el componente A comprende anticuerpos como dominio de unión para las estructuras de superficie extracelulares que se internalizan tras la unión del componente A de dicho complejo, y quinasas que promueven la muerte, que consisten en la proteína quinasa asociada a la muerte (DAP-quinasa, DAPk) o la quinasa del factor 2 de elongación eucariota (eEF-2k) como componente B, que tiene una actividad quinasa catalítica constitutiva y que realiza la biosíntesis/señalización celular que incluye la muerte celular después

   45 de la internalización, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades proliferativas, tales como las enfermedades proliferativas cancerosas o no cancerosas, las alergias, las enfermedades autoinmunes, y/o la inflamación crónica.
8. 10. Uso según la reivindicación 9 en el que los anticuerpos son anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales,

   50 anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos que conservan la función de unión al antígeno y la especificidad del anticuerpo parental.
9. 11. Medicamento que comprende un complejo endógeno soluble sintético formado a partir de por lo menos un componente A y d por lo menos un componente B, de manera que el componente A comprende anticuerpos como

   55 dominio de unión para las estructuras de superficie extracelulares que se internalizan tras la unión del componente A de dicho complejo, y quinasas que promueven la muerte, que consisten en la proteína quinasa asociada a la muerte (DAP-quinasa, DAPk) o la quinasa del factor 2 de elongación eucariota (eEF-2k) como componente B, que tiene una actividad quinasa catalítica constitutiva y que realiza la biosíntesis/señalización celular que incluye la muerte celular después de la internalización.
10. 12. Medicamento según la reivindicación 11 en el que los anticuerpos son anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos que conservan la función de unión al antígeno y la especificidad del anticuerpo parental.