ES2385148A1 - Superficie inmunosensora para la detección directa de benzoilecgonina mediante resonancia de plasmón superficial. - Google Patents

Superficie inmunosensora para la detección directa de benzoilecgonina mediante resonancia de plasmón superficial. Download PDF

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ES2385148A1 ES201031937A ES201031937A ES2385148A1 ES 2385148 A1 ES2385148 A1 ES 2385148A1 ES 201031937 A ES201031937 A ES 201031937A ES 201031937 A ES201031937 A ES 201031937A ES 2385148 A1 ES2385148 A1 ES 2385148A1
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Abstract

Superficie inmunosensora para la detección directa de benzoilecgonina mediante resonancia de plasmón superficial.En la presente invención se proporciona una nueva superficie inmunosensora que permite la detección directa, en tiempo real de benzoilecgonina, el principal metabolito de cocaína. La detección de benzoilecgonina se realiza mediante resonancia de plasmón superficial. Además, se proporcionan dos métodos alternativos de análisis de los datos de SPR recogidos para determinar la concentración de benzoilecgonina.

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS
    N.º solicitud: 201031937
    ESPAÑA
    Fecha de presentación de la solicitud: 23.12.2010
    Fecha de prioridad:
    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
    51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional
    DOCUMENTOS RELEVANTES
    Categoría
    Documentos citados Reivindicaciones afectadas
    Y
    GUARDADO-CALVO, P., MUÑOZ, E.M., LLAMAS-SAIZ, L. et al. Crystallographic Structure of Porcine Adenovirus Type 4 Fiber Head and Galectin Domains. Journal of Virology. Octubre 2010. Vol 84, Nº 20, páginas 10558-10568. ISSN 1098-5514, en especial “Materials and Methods" y páginas10565-10566. 1-18
    Y
    SANLES-SOBRIDO, M., RODRIGUEZ-LORENZO, L., LORENZO-ABALDE, S. et al. Label-free SERS detection of relevant bioanalytes on silver-coated carbon nanotubes: The case of cocaine. Nanoscale. 13.08.2009. Vol 1, Nº 1 páginas 153-158. ISSN 2040-3372, en especial páginas 156 y 157. 1-18
    A
    US 2005058850 A1 (TOSHIAKI, K., TOSHIHIDE, E.) 21.07.2005 1-18
    A
    US 20030113939 A1 (GAUGLITZ, G., BRECHT, A., PIEHLER, J.) 19.06.2003 1-18
    A
    JOHNSON, B., LÖFAS, S., LINDQUIST, G. Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran-Modified Gold surface for Biospecific Interaction Analysis in Surface Plasmon Resonance Sensors. Analytical Biochemestry. 01.11.1991, Vol 198, Nº 2, páginas 268-277. ISSN 0003-2697, todo el documento. 1-18
    A
    JP2005189062 (FUJI FOTO FILM CO LTD) 14.07.2005, (resumen) Base de datos WPI Thomson Scientific, Londres [en línea] Recuperado de: EPOQUE. Nº de acceso 2005-525097 [54]. 1-18
    A
    SPR sensor chips and disc. Xantec bioanalytics. [en línea]. 14.09.2007. [recuperado el 30.06.2007]. Recuperado de internet: URL<http://web.archive.org/web/20070914202516/http://www.xantec.com/new/index.php?content=7 &sub=8&haupt=6, todo el documento. 1-7
    A
    MULLETT, W.M., LAI, E.P.C., YEUNG, J.M. Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays. Methods. Septiembre 2000. Vol 22, Nº 1, páginas 77-91, todo el documento. 1-18
    A
    INDYK, H. E. Optical Biosensors: Making sense of interactions. Chemistry in New Zealand. Julio 2006. Páginas 42-46. 1-18
    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
    Fecha de realización del informe 30.06.2011
    Examinador A. Barrios de la Fuente Página 1/6
    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
    Nº de solicitud: 201031937
    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD
    G01N33/543 (2006.01) G01N21/17 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N
    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES,EPODOC,WPI,MEDLINE,NPL,XPESP,EMBASE,BIOSIS
    Informe del Estado de la Técnica Página 2/6
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201031937
    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 30.06.2011
    Declaración
    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
    Reivindicaciones 1-18 Reivindicaciones SI NO
    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-18 SI NO
    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).
    Base de la Opinión.-
    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.
    Informe del Estado de la Técnica Página 3/6
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201031937
    1. Documentos considerados.-
    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.
    Documento
    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
    D01
    GUARDADO-CALVO, P., MUÑOZ, E.M., LLAMAS-SAIZ, L. et al. Crystallographic Structure of Porcine Adenovirus Type 4 Fiber Head and Galectin Domains. Journal of Virology. Octubre 2010. Vol 84, Nº 20, páginas 10558-10568. ISSN 1098-5514, en especial “Materials and methods" y páginas10565-10566. Octubre 2010
    D02
    SANLES-SOBRIDO, M., RODRIGUEZ-LORENZO, L., LORENZO-ABALDE, S. et al. Label-free SERS detection of relevant bioanalytes on silver-coated carbon nanotubes: The case of cocaine. Nanoscale. 13.08.2009. Vol 1, Nº 1 páginas 153-158. ISSN 2040-3372, en especial páginas 156 y 157. 13.08.2009
    D03
    US 2005058850 A1 (TOSHIAKI, K., TOSHIHIDE, E.) 21.07.2005, todo el documento. 21.07.2005
    D04
    US 20030113939 A1 (GAUGLITZ, G., BRECHT, A., PIEHLER, J.) 19.06.2003 19.06.2003
    D05
    JOHNSON, B., LÖFAS, S., LINDQUIST, G. Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran-Modified Gold surface for Biospecific Interaction Analysis in Surface Plasmon Resonance Sensors. Analytical Biochemestry. 01.11.1991. Vol 198, Nº 2, páginas 268- 277. ISSN 0003-2697, todo el documento. 01.11.1991
    D06
    JP2005189062 (FUJI FOTO FILM CO LTD) 14.07.2005, (resumen) Base de datos WPI Thomson Scientific, Londres [en línea] Recuperado de: EPOQUE. Nº de acceso 2005-525097 [54]. 14.07.2005
    D07
    SPR sensor chips and disc. Xantec bioanalytics. [en línea]. 14.09.2007. [recuperado el 30.06.2007]. Recuperado de internet: URL< http://web.archive.org/web/20070914202516/ http://www.xantec.com/new/ index.php?content=7&sub=8& haupt=6, todo el documento 14.09.2007
    D08
    MULLETT, W.M., LAI, E.P.C., YEUNG, J.M. Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays. Methods. Septiembre 2000. Vol 22, Nº 1, páginas 77-91, todo el documento. Septiembre 2009
    D09
    INDYK, H. E. Optical Biosensors: Making sense of interactions. Chemistry in New Zealand. Julio 2006. Páginas 42-46. Julio 2006
  2. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración
    La presente solicitud tiene por objeto una superficie inmunosensora que comprende un soporte recubierto por una capa metálica a la que se une un polímero que inmoviliza al menos un anticuerpo anti-benzoilecgonina (Reivindicación 1) o entre dos y seis anticuerpos que presentan diferente afinidad por la benzoilecgonina (Reivindicación 2). El anticuerpo inmovilizado sobre la superficie es un anticuerpo monoclonal (Reivindicación 3). Los anticuerpos se unen al polímero mediante enlaces covalente tipo amida o tipo carbonilo-hidrazina (Reivindicación 4). El polímero del soporte se selecciona entre polímeros policarboxilados y policarboxilados modificados (Reivindicación 5), y presenta una capacidad de inmovilización de anticuerpos anti-benzoilecgonina comprendida entre 730 pg/mm2 y 73000pg/mm2 (Reivindicación 6).
    Informe del Estado de la Técnica Página 4/6
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201031937
    Es además objeto de la presente solicitud un inmunosensor que comprende la superficie inmunosensora descrita en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un transductor basado en el fenómeno de resonancia del plasmón superficial-SPR (Reivindicación 7). Así mismo, también es objeto de esta solicitud un aparato que contiene el inmunosensor descrito en la reivindicación 7 y un dispositivo que acondiciona la señal recibida durante la etapa de asociación o disociación (Reivindicación 8). Dicho aparato comprende un dispositivo para realizar el cálculo (Reivindicación 9), está miniaturizado y es portátil (reivindicación 10).
    Son también objeto de esta solicitud un kit (Reivindicación 11) y un aparato portátil (Reivindicación 12) que comprende la superficie inmunosensora.
    También se reivindica en esta solicitud un método de detección de benzoilecgonina que comprende la puesta en contacto de la muestra con la superficie inmunosensora y la detección de la señal de SPR durante la etapa de asociación y disociación (Reivindicación 13) y un método de cuantificación de benzoilecgonina que comprende detectar la benzoilecgonina durante la etapa de asociación (Reivindicación 14) o disociación (Reivindicación 15) e interpolar la señal obtenida en la recta de calibrado.
    Por último, esta solicitud también reivindica el uso de la superficie inmunosensora para la detección directa de benzoilecgonina (reivindicación 16) en tiempo real (reivindicación 17) en disoluciones acuosas reguladoras, en fluido oral o en mezcla de las mismas (reivindicación 18).
    El documento D01 tiene por objeto un estudio sobre el Adenovirus Porcino tipo 4. Más concretamente se estudia la estructura de la cabeza de la fibra proteica y de los dominios galectina. Entre los experimentos que se llevan a cabo, se estudia mediante resonancia de plasmón superficial la capacidad de unión del dominio galectina a carbohidratos.
    El documento D02 divulga un estudio para detectar y cuantificar benzoilecgonina mediante espectroscopía Raman de superficie mejorada (SERS).
    El documento D03 divulga un biosensor que comprende una superficie metálica o una película metálica cubierta por un polímero policarboxilado hidrofóbico (polimetil metacrilato) para su uso en resonancia de plasmón superficial. Sobre este soporte se inmovilizan diferentes proteínas, tales como el anticuerpo anti IL-8 o la enzima tripsina. (ver ejemplos)
    El documento D04 divulga un biosensor para la detección de reacciones de afinidad bioquímicas, por medio de técnicas ópticas. La superficie inmunosensora consta de una capa de metal o de óxido metálico sobre la que se une un polímero (polietilenglicol). Sobre este soporte se fijan diferentes proteínas, entre ellas la región Fab del anticuerpo anti-simazina. (ver ejemplos).
    El documento D05 tiene por objeto un estudio relativo a la inmovilización de proteínas sobre una superficie biosensora para el análisis de interacciones bioespecíficas mediante resonancia de plasmón superficial. Se describe la inmovilización de proteínas por enlace covalente tipo amida sobre una superficie biosensora que comprende una capa metálica y un polímero policarboxilado (carboximetil dextrano). Entre las proteínas inmovilizadas se encuentran por ejemplo, la proteína A de Staphylococcus aureus que interacciona específicamente con anticuerpos policlonales IgG (páginas 275-276) o bien anticuerpos tales como anti a-ferroproteina o IgG1 y anti �2-micro-globulina o IgG (ver tabla 1).
    El documento D06 tiene por objeto un biosensor para su uso resonancia de plasmón superficial. La superficie biosensora comprende una superficie metálica o una película metálica a la que se une un polímero que contiene estireno. Entre sus posibles aplicaciones se señalan su uso para detectar la interaccion entre biomoleculas, como reacciones inmunes o para medir o detectar sustancias, entre las que menciona la cocaína.
    El documento D07 contiene información relativa a las diferentes superficies biosensoras ofertadas por una casa comercial. Incluye un listado de las diferentes superficies biosensoras disponibles, entre las que se encuentran las superficies basadas en matrices poliméricas, denominadas hidrogeles 3D. Se señala que este tipo de superficies permiten una inmovilización del ligando con una amplificación significativa de la señal y que se utilizan para la detección y determinaciones de concentración. También se menciona la existencia de hidrogeles 3D con densidad de carga negativa reducida para evitar interacciones no específicas (hidrogeles HC).
    El documento D08 tiene por objeto una revisión de las técnicas de inmunoensayo llevadas a cabo por resonancia de plasmón superficial.
    El documento D09 hace referencia a los biosensores ópticos, concretamente para SPR y sus diferentes aplicaciones.
    NOVEDAD (Art.6 Ley 11/86)
    Las reivindicaciones de la 1-18 son nuevas, en el sentido del artículo 6 de la Ley de patentes 11/86.
    Informe del Estado de la Técnica Página 5/6
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201031937
    ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 8 Ley 11/86)
    Reivindicaciones 1-6:
    El documento D01 se considera el estado de la técnica más próximo a la invención. D01 divulga una superficie biosensora que comprende un soporte recubierto por una capa metálica a la que se une un polímero policarboxilado. Sobre este polímero se inmoviliza por enlace covalente, bien el dominio galectina de la fibra proteica de la cápside del Adenovirus porcino tipo 4 o bien otra proteína, concretamente neutravidina. Para llevar a cabo la inmovilización, se activa la superficie con N-hidroxisuccinamida 0,05 M y con N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carboamida 0,2 M, y posteriormente se inyecta el dominio galectina o neutravidina en una disolución reguladora de acetato sódico 0,01 M.( Ver “Materials and methods”). Una vez preparadas las superficies biosensoras, se analiza mediante SPR la interacción del dominio galectina con carbohidratos (página 10565).
    La diferencia principal entre la superficie inmunosensora objeto de las reivindicaciones 1-6 con D01 radica en que la proteína que se inmoviliza sobre el soporte no es un anticuerpo anti-benzoilecgonina.
    D02 divulga un método óptico de detección de cocaína que se basa en la detección de benzoilecgonina. Para ello se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales anti-benzoilecgonina que se fijan sobre nanotubos de carbono recubiertos con plata (Ver página 157).
    El soporte y el anticuerpo monoclonal anti-benzoilecgonina utilizado para la fabricación de la superficie inmunosensora descrita en el ejemplo de la presente solicitud, son idénticos a los anticipados por los documentos D01 y D02 respectivamente, siendo estos además de carácter comercial. Este tipo de soportes que comprenden una capa metálica a la que se une un polímero policarboxilado, se comercializan y utilizan frecuentemente en el estado de la técnica para fijar proteínas, entre estas, anticuerpos o antígenos que permitan su uso como superficies inmunosensoras (ver documentos D03, D04 y D05). Por estos motivos, un experto en la materia, sin el ejercicio de la actividad inventiva, utilizaría un soporte que comprendiese una capa metálica a la que se une un polímero policarboxilado, como por ejemplo, el anticipado por D01, para inmovilizar anticuerpos, entre estos, anticuerpos antibenzoilecgonina como los anticipados en D02. Teniendo en cuenta además que no se deduce de la descripción que haya sido necesario superar ninguna dificultad técnica para llevar a cabo la inmovilización de los anticuerpos sobre el soporte puesto que se recurre a métodos de inmovilización conocidos (ver D01, D03, D04), se considera que el objeto de las reivindicaciones 1,3-6 no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia.
    En lo que respecta al objeto de la reivindicación 2, la fijación sobre el soporte de anticuerpos anti-benzoilecgonina con diferentes afinidades por benzoilecgonina, se considera que no responde más que a una mera opción de diseño de la superficie inmunosensora y por lo tanto no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia.
    Reivindicaciones 7-12:
    Puesto que la superficie inmunosensora objeto de las reivindicaciones 1-6 se considera que no implica actividad inventiva para un experto en la materia, el inmunosensor y el aparato objeto de las reivindicaciones 8-10 que comprenden dicha superficie, se consideran que no implican actividad inventiva, dado que el resto de los elementos que contienen (transductor para SPR, dispositivo para acondicionar la señal y dispositivo para realizar el cálculo), son elementos ampliamente conocidos en el estado de la técnica.
    De la misma forma, el kit y aparato objeto de las reivindicaciones 11 y 12 se consideran que no implican actividad inventiva para un experto en la materia.
    Reivindicaciones 13-15:
    Dado que se considera que la superficie inmunosensora objeto de las reivindicaciones 1-6 no implica actividad inventiva, el método de detección objeto de la reivindicación 13 que se basa en el uso de dicha superficie, se considera igualmente que no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia. Poner en contacto la muestra con la superficie inmunosensora resulta obvio y por otro lado, la técnica SPR se centra en detectar los cambios que se producen en la señal cuando el analito objeto de la detección se une o se separa del elemento de reconocimiento fijado sobre el soporte.
    En lo que respecta al método de cuantificación objeto de las reivindicaciones 14 y 15, se considera que este método se reduce básicamente al método de detección objeto de la reivindicación 13, dado que la etapa iv y vi se limitan simplemente a la interpretación de los resultados obtenidos tras la etapa de detección. En cualquier caso, el uso de curvas de calibración para interpretar las señales obtenidas tras la detección, resulta rutinario en el estado de la técnica no solamente en métodos de detección basados en SPR. (ver D07, página 43)
    Reivindicaciones 16-18:
    En lo que respecta a las reivindicaciones 16 y 17, y por el mismo motivo anteriormente señalado, el uso de la superficie inmunosensora según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la detección directa y en tiempo real de benzoilecgonina se considera igualmente que no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia. Por último y en lo que respecta a la reivindicación 18, es conocido en el estado de la técnica que la benzoilecgonina se expresa en la saliva (ver D02, página 153) y de hecho ya se conocen en el estado de la técnica métodos de detección de cocaína donde la muestra es saliva, por lo que se considera de la misma forma, que la reivindicación 18 no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia
    En conclusión y en base a lo expuesto se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-18 no implicaría actividad inventiva para un experto en la materia en el sentido del artículo 8.1 de la Ley de patentes 11/86.
    Informe del Estado de la Técnica Página 6/6
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