ES2385772T3

ES2385772T3 - Anticuerpos específicos para la hepcidina humana

Info

Publication number: ES2385772T3
Application number: ES08835406T
Authority: ES
Inventors: Sophie Vaulont; Hugues Gascan; Josy Froger
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2007-10-02
Filing date: 2008-10-02
Publication date: 2012-07-31
Anticipated expiration: 2028-10-02
Also published as: JP2010539969A; EP2200647A1; WO2009044284A1; US20100285027A1; ATE553778T1; CN101903044A; EP2200647B1; CA2701694A1; US8487081B2

Abstract

Una proteína de unión a antígeno caracterizada porque es capaz de unir hepcidina-25 humana, y porque comprende la VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de la cadena pesada y la VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo AN-LP1 producidas por el hibridoma CNCM I-3794 y codificadas por las SEQ ID NOs 2- 4 y 6-8, respectivamente.

Description

Anticuerpos especificos para la hepcidina humana

La presente invenci6n se refiere a anticuerpos o fragmentos de estos que reconocen la forma madura de la hepcidina humana y a su uso para tratar y diagnosticar enfermedades asociadas con la hepcidina.

5 El hierro es un elemento esencial que se requiere para el crecimiento y supervivencia de casi todos los organismos. Por lo tanto, las alteraciones en el metabolismo del hierro se han implicado en varias enfermedades significativas de mamiferos, incluyendo, pero no limitadas a anemia por deficiencia de hierro, hemosiderosis o la enfermedad de sobrecarga de hierro hemocromatosis (PIETRANGELO, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 282, G403-14, 2002; ANDREWS, Annu Rev Genomics Hum Genet, 1, 75-98, 2000; PHILPOTT, Hepatology, 35, 993-1001, 2002;

10 ANDERSON y POWELL, Int J Hematol, 76, 203-7, 2002; BEUTLER et al., Drug Metab Dispos, 29, 495-9, 2001).

La deficiencia de hierro es el trastorno nutricional mas comun en el mundo. Hasta 4-5 billones de personas (es decir, 65-80% de la poblaci6n mundial) puede ser deficiente en hierro y 2 billones de personas (mas del 30% de la poblaci6n mundial, la mayor parte ninos y mujeres con edad de tener ninos) son anemicos, debido principalmente a deficiencia de hierro. La deficiencia de hierro afecta a mas gente que ninguna otra afecci6n, constituyendo una

15 afecci6n de salud publica de proporciones epidemicas.

En los mamiferos, el equilibrio del hierro esta regulado principalmente al nivel de la absorci6n duodenal del hierro de la dieta. Despues de la absorci6n, el hierro ferrico se carga en apo-transferrina en la circulaci6n y se transporta a los tejidos, incluyendo los precursores eritroides, donde es captado por endocitosis mediada por el receptor de la transferrina. Los macr6fagos reticuloendoteliales juegan un papel principal en el reciclado del hierro de la 20 degradaci6n de la hemoglobina de los eritrocitos senescentes, mientras los hepatocitos contienen la mayor parte del almacenamiento del hierro del organismo en polimeros de ferritina. Existe un mecanismo de retroalimentaci6n que aumenta la absorci6n del hierro en individuos que son deficientes en hierro, mientras la absorci6n del hierro se reduce en personas con sobrecarga de hierro. En la hemocromatosis hereditaria (HH), sin embargo, este mecanismo regulador parece que esta alterado; a pesar de una sobrecarga de hierro, cantidades elevadas de hierro se 25 absorben de la dieta y da lugar a la acumulaci6n de hierro en exceso en 6rganos internos, lo que resulta en la disfunci6n y fallo organico. El mecanismo molecular por el que el intestino responde a las alteraciones de los requerimientos de hierro del cuerpo no se entiende bien. En este contexto se ha mostrado que la hepcidina, un peptido de mamiferos identificado recientemente (KRAUSE et al., FEBS Lett, 480, 147-50, 2000; PARK et al., J Biol Chem, 276, 7806-10, 2001), es un componente de senalizaci6n clave que regula la homeostasis del hierro

30 (NICOLAS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99, 4596-601, 2002).

La hepcidina regula la homeostasis del hierro uniendose al exportador de hierro celular ferroportina y causando su internalizaci6n y degradaci6n (NEMETH et al., Science, 306, 2090-3, 2004). La consecuencia de la degradaci6n de la ferroportina es la retenci6n del hierro en las celulas y asi una disminuci6n del hierro circulante. Por este mecanismo, la hepcidina disminuye el flujo de salida del hierro desde los tejidos exportadores de hierro en el plasma

35 y asi reduce la absorci6n del hierro de la dieta, liberaci6n del hierro reciclado de los macr6fagos, liberaci6n del hierro almacenado en los hepatocitos y transferencia del hierro a traves de la placenta.

La hepcidina es un peptido pequeno rico en cisteina producido principalmente en el higado. Esta molecula regula la absorci6n del hierro en el intestino e inhibe la liberaci6n del hierro de los macr6fagos. La hepcidina se aisl6 inicialmente de plasma y orina humanos como un peptido de 25 aminoacidos (aa) que presentaba una actividad 40 antimicrobiana (KRAUSE et al., FEBS Lett, 480, 147-50, 2000; PARK et al., J Biol Chem, 276, 7806-10, 2001). Los ADNc de hepcidina que codifican un precursor de 83 aa en ratones y un precursor de 84 aa en rata y ser humano, incluyendo un peptido senal putativo de 24 aa, se identificaron posteriormente buscando genes especificos del higado que estuvieran regulados por el hierro (PIGEON et al., J Biol Chem, 276, 7811-9, 2001). La hepcidina humana se expresa como un prepropeptido de 84 aminoacidos que se procesa en el amino terminal en un precursor 45 de 60 residuos de aminoacidos (prohepcidina) de aproximadamente 10 kDa, que se procesa adicionalmente en un peptido maduro de 25 aminoacidos (hepcidina-25) de aproximadamente 3 kDa. Ademas de la forma de 25 aminoacidos, tambien se detectaron formas de 20 y 22 aminoacidos truncadas en el N-terminal en orina (PARK et al., J Biol Chem, 276, 7806-10, 2001). Sin embargo, estas variantes truncadas en N no parecen tener una funci6n reguladora del hierro (RIVERA et al., Blood, 106, 2196-9, 2005; NEMETH et al., Blood, 107, 328-33, 2006). De

50 acuerdo con esto, se admite generalmente que la hepcidina-25 es la forma bioactiva que es responsable principalmente del efecto hipoferremico de la hepcidina.

La hepcidina es un regulador central de la homeostasis del hierro. La deficiencia en hepcidina juega un papel central en la mayor parte de los trastornos de sobrecarga de hierro y tambien se ha mostrado que el exceso de hepcidina esta implicado en varias formas de anemia. Por ejemplo, Nicolas G, et al (2002) mostraron que la sobreexpresi6n de 55 hepcidina resultaba en anemia grave en ratones transgenicos (NICOLAS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99, 4596601, 2002). Un estudio reciente indic6 que la hepcidina es un mediador clave de anemia de inflamaci6n (NEMETH et al., Blood, 101, 2461-3, 2003). Ademas, una concentraci6n anormalmente alta de hepcidina se ha indicado en anemia con diferentes etiologias, tales como anemia asociada con enfermedad renal (TOMOSUGI et al., Blood, 108,

1381-7, 2006), anemia asociada con sepsis grave (KEMNA et al., Blood, 106, 3268-70, 2005), anemia asociada con la enfermedad de Crohn (SEMRIN et al., Inflamm Bowel Dis, 12, 1101-6, 2006) y anemia refractaria a hierro asociada con adenomas hepaticos (WEINSTEIN et al., Blood, 100, 3776-81, 2002).

Debido a la implicaci6n de la hepcidina en trastornos de homeostasis del hierro, se han propuesto varios ensayos para su detecci6n y cuantificaci6n en plasma u orina con vistas al diagn6stico y monitorizaci6n de estos trastornos.

Sin embargo, el desarrollo de reactivos inmunoquimicos se ha visto dificultado por la falta de disponibilidad de anticuerpos anti-hepcidina. Se ha descrito un ensayo inmunoquimico usando anticuerpos de conejo policlonales antihepcidina (NEMETH et al., Blood, 101, 2461-3, 2003) pero este s6lo permite cuantificar la hepcidina en orina y no en plasma. Tambien se han descrito antisueros de conejo producidos frente a los aa 28-47 (EG(1)-HepN y EG(2)-HepN) y los aa 70-84 (EG(1)-HepC) de prohepcidina (solicitud PCT WO 2004N058044; (KULAKSIZ et al., Gut, 53, 735-43, 2004). Estos antisueros detectaron prohepcidina en suero humano; sin embargo, ninguno de ellos reconoci6 la hepcidina-25 bioactiva.

US 2007N224186 describe anticuerpos monoclonales producidos en ratones frente al peptido que abarca los residuos 74-81 de la pro-hepcidina humana.

Hasta ahora, no se ha descrito ningun anticuerpo capaz de reconocer la hepcidina-25 en suero y los unicos ensayos disponibles para la determinaci6n de hepcidina-25 en suero se basan en espectrometria de masas (TOMOSUGI et al., Blood, 108, 1381-7, 2006) (MURPHY et al., Blood, 110, 1048-54, 2007).

Ademas, los anticuerpos que actuan como antagonistas de la hepcidina, es decir capaces de inhibir la uni6n de la hepcidina a ferroportina y la posterior internalizaci6n y degradaci6n de la ferroportina, serian utiles en el tratamiento de afecciones que resultan de un exceso de hepcidina.

Asi, los anticuerpos que reconocen la hepcidina-25 y que permiten su determinaci6n en suero y que ademas son capaces de inhibir la uni6n de la hepcidina a la ferroportina parecen altamente deseables.

Los inventores han tenido ahora exito en la obtenci6n de dicho anticuerpo.

Este anticuerpo monoclonal, designado de aqui en adelante en la presente memoria "AN-LP1" es producido por el hibridoma depositado segun los terminos del Tratado de Budapest, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia), el 14 de agosto, 2007, con el numero de dep6sito I-3794.

Los inventores han clonado y secuenciado el dominio variable (VL) de la cadena ligera y el dominio variable (VH) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal AN-LP1. Los limites de las secuencias que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo se han obtenido, clasicamente, mediante el alineamiento de estas secuencias VH y VL frente a la base de datos de referencia IMGT (LEFRANC et al., Nucl. Acids Res., 33, Database issue D593-597, 2005), usando el programa de software IMGTNV-QUEST (GIUDICELLI et al., Nucl. Acids Res., 32, Web Server issue W435-440, 2004). Estas secuencias se describen a continuaci6n en la Tabla 1 (para la cadena pesada) y en la Tabla 2 (para la cadena ligera).

Un objeto de la presente invenci6n es una proteina de uni6n a antigeno caracterizada porque es capaz de unir la hepcidina-25 humana y porque comprende la VH-CDR3 de la cadena pesada y la VL-CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo AN-LP1,

5 la VH-CDR1 de la cadena pesada y la VL-CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo AN-LP1, y la VH-CDR2 de la cadena pesada y la VL-CDR2 de la cadena ligera del anticuerpo AN-LP1. La VH-CDR3 y la VL-CDR3 de AN-LP1 estan codificadas respectivamente por SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 8. La

VH-CDR1 y la VL-CDR1 de AN-LP1 estan codificadas respectivamente por SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6. La VH-CDR2 y la VL-CDR2 de AN-LP1 estan codificadas respectivamente por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7. 10 Las proteinas de uni6n a antigeno de la invenci6n engloban en particular: a) el anticuerpo monoclonal AN-LP1 producido por el hibridoma CNCM I-3794; b) los fragmentos de uni6n a antigeno del anticuerpo AN-LP1; c) los anticuerpos quimericos o humanizados obtenidos de AN-LP1; d) los fragmentos de uni6n a antigeno de los anticuerpos c) anteriores. 15 A no ser que se especifique otra cosa, el termino "hepcidina-25" en la presente memoria se refiere al polipeptido de hepcidina humano que tiene la secuencia siguiente: DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT (SEQ ID NO: 9).

Las CDR (regiones determinantes de la complementariedad) de un anticuerpo son las partes de los dominios variables que estan implicadas en la especificidad del reconocimiento del antigeno. Cada cadena ligera y pesada de una inmunoglobulina tiene tres CDR, designadas VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 y VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, respectivamente.

Los fragmentos de uni6n a antigeno de un anticuerpo contienen los dominios variables que comprenden las CDR de dicho anticuerpo. Los fragmentos de uni6n a antigeno basicos incluyen Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2.

Los fragmentos Fv consisten en los dominios VL y VH de un anticuerpo asociados conjuntamente por interacciones hidrof6bicas; en los fragmentos dsFv, el heterodimero VH::VL esta estabilizado por un puente disulfuro; en los fragmentos scFv, los dominios VL y VH estan conectados entre si mediante un conector peptidico flexible formando asi una proteina de cadena unica. Los fragmentos Fab se pueden obtener por digesti6n con papaina de un anticuerpo; comprenden la cadena L completa y aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena H, unidos entre si mediante un enlace disulfuro. El fragmento F(ab')2 puede producirse por digesti6n con pepsina de un anticuerpo; comprende dos fragmentos Fab y adicionalmente una parte de la regi6n bisagra de la molecula de inmunoglobulina. Los fragmentos Fab' se pueden obtener a partir de los fragmentos F(ab')2 cortando un enlace disulfuro en la regi6n bisagra. Los fragmentos F(ab')2 son divalentes, es decir, comprenden dos sitios de uni6n a antigeno, como la molecula de inmunoglobulina nativa; por otra parte, los fragmentos Fv, dsFv, scFv, Fab y Fab' son monovalentes, es decir, comprenden un unico sitio de uni6n a antigeno.

Estos fragmentos de uni6n a antigeno basicos pueden combinarse entre si para obtener fragmentos de uni6n a antigeno multivalentes, tales como fragmentos divalentes, trivalentes o tetravalentes. Estos fragmentos de uni6n a antigeno multivalentes tambien son parte de la presente invenci6n.

El termino "anticuerpo quimerico" en la presente memoria se refiere a un anticuerpo modificado por ingenieria que tiene los dominios variables del anticuerpo monoclonal del que se obtiene y que tiene los dominios constantes de otro anticuerpo, preferiblemente de un anticuerpo humano.

El termino "anticuerpo humanizado" en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que se ha modificado por ingenieria con el fin de reducir su inmunogenicidad, a la vez que retiene su especificidad de uni6n a antigeno reemplazando tanto como es posible de las secuencias murinas por sus equivalentes humanos. En los dominios variables, estos reemplazos de secuencias tienen generalmente como diana las regiones marco (FR), es decir, las secuencias de aminoacidos interpuestas entre las CDR. Sin embargo, algunos metodos para humanizar anticuerpos implican reemplazos de secuencias en las CDR 1 y 2.

Los anticuerpos quimericos y humanizados de la invenci6n pueden pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. Preferiblemente, perteneceran a una subclase de la clase IgG tal como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Segun una realizaci6n preferida de una proteina de uni6n a antigeno de la invenci6n, esta es capaz de inhibir la uni6n de hepcidina a ferroportina, inhibiendo de esta manera la degradaci6n de la ferroportina.

La capacidad de inhibir la uni6n de hepcidina a ferroportina puede ensayarse facilmente usando, por ejemplo, un ensayo in vitrr que usa celulas que expresan ferroportina en su superficie. En presencia de hepcidina, la ferroportina se internaliza y degrada. En presencia de un inhibidor de la uni6n de hepcidina a ferroportina, la internalizaci6n y degradaci6n de la ferroportina se reducen o suprimen. La evaluaci6n del nivel de ferroportina permite determinar las propiedades inhibidoras.

Las proteinas de uni6n a antigeno segun la invenci6n pueden obtenerse por tecnicas convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de uni6n a antigeno como Fv, Fab o F(ab')2, pueden obtenerse por digesti6n enzimatica del anticuerpo completo.

Estos fragmentos asi como otros fragmentos de uni6n a antigeno monovalentes y multivalentes, y los anticuerpos quimericos o humanizados, tambien pueden prepararse por tecnicas de ingenieria genetica clasicas, tales como las descritas por SAMBROOK et al. [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)].

Los polinucle6tidos que codifican las regiones variables del anticuerpo AN-LP1 o las CDR de este, pueden obtenerse, por ejemplo, clonando dichas regiones de una biblioteca de ADNc del hibridoma CNCM I-3794. Tambien pueden prepararse, completamente o parcialmente, por sintesis de acido nucleico, tomando como base las secuencias de nucle6tidos proporcionadas en la presente memoria.

Los metodos para preparar fragmentos de uni6n a antigeno recombinantes, o anticuerpos quimericos combinando las regiones variables de un anticuerpo con conectores apropiados, o con las regiones constantes de otro anticuerpo, son muy conocidos en si mismos.

Los metodos para humanizar anticuerpos tambien son muy conocidos en la tecnica y se describen por ejemplo por ROUTLEDGE et al. ["Reshaping antibodies for therapy", en Protein Engineering of Antibody Molecules for

Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, 13-44, Academic Titles, Nottingham, Inglaterra (1993)] o por ROGUSKA et al. Protein Engineering, 9(10), 895-904, (1996)]. Estos metodos tambien pueden aplicarse a fragmentos de uni6n a antigeno, tales como scFv.

Como ejemplo, el metodo conocido como "modificaci6n de superficie" consiste en reemplazar el conjunto de residuos de la superficie en los marcos de la regi6n variable de un anticuerpo no humano con un conjunto humano de residuos de la superficie, mientras que el metodo conocido como injerto de CDR consiste en transferir las CDR de un anticuerpo no humano a las regiones marco de un anticuerpo humano. El injerto de CDR se completa generalmente por la optimizaci6n del marco, que consiste en el reemplazo de algunos residuos del marco humano, con el fin de optimizar la afinidad de uni6n.

La etapa de optimizaci6n del marco se ha simplificado recientemente por el uso de bibliotecas combinatorias (ROSOK et al. J. Biol. Chem. 271, 22611-22618, 1996; BACA et al. J. Biol. Chem. 272, 10678-10684, 1997).

Otra estrategia reciente para la humanizaci6n de anticuerpos conserva s6lo las secuencias CDR3 no humanas originales de la cadena ligera y pesada mientras que la secuencia restante se selecciona de bibliotecas de gen V humano parental (RADER et al., Prrc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8910-8915, 1998).

Un contenido de la presente invenci6n es tambien cualquier polinucle6tido que codifica una proteina de uni6n a antigeno de la invenci6n que comprende las CDR del anticuerpo AN-LP1 y tambien cualquier vector recombinante, en particular cualquier vector de expresi6n, que comprende dicho polinucle6tido.

Un contenido de la presente invenci6n es tambien cualquier celula que expresa una proteina de uni6n a antigeno segun la invenci6n que comprende las CDR del anticuerpo AN-LP1. Esto engloba en particular el hibridoma CNCM I3794 y tambien cualquier celula huesped geneticamente transformada con un polinucle6tido de la invenci6n.

Los polinucle6tidos de la invenci6n pueden comprender ventajosamente, ademas de una secuencia que codifica una proteina de uni6n a antigeno segun la invenci6n, una secuencia que codifica un peptido senal que permita la secreci6n de dicha proteina. Tambien pueden comprender una o mas secuencias que codifican uno o mas peptidos marcadores para detectar, yNo facilitar la purificaci6n de, dicha proteina.

Los vectores de expresi6n segun la invenci6n comprenden al menos una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina de uni6n a antigeno segun la invenci6n, asociada con elementos para controlar la transcripci6n y traducci6n que son activos en la celula huesped elegida. Hay una amplia variedad de vectores huesped, conocidos en si mismos, que pueden usarse para construir vectores de expresi6n segun la invenci6n; la elecci6n de un vector apropiado depende principalmente de la celula huesped que se pretende usar.

Las celulas huesped que pueden usarse en el contexto de la presente invenci6n pueden ser celulas procariotas o eucariotas. Los ejemplos de celulas huesped eucariotas incluyen bacterias tales como E. crli. Entre las celulas eucariotas que pueden usarse, se hara menci6n en particular a celulas de plantas (en el caso de planticuerpos), celulas de levadura, tales como Saccharrmyces, Kluyverrmyces, o Pichia pastrris, celulas de insecto, tales como celulas de Drrsrphila o Sprdrptera, y celulas de mamifero tales como celulas HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, Heck 293, COS, etc.

La construcci6n de vectores de expresi6n segun la invenci6n y la transformaci6n de las celulas huesped pueden realizarse por tecnicas convencionales de biologia molecular.

Un contenido de la invenci6n es tambien un metodo para producir una proteina de uni6n a antigeno segun la invenci6n, caracterizado porque comprende cultivar al menos una celula segun la invenci6n, y recuperar dicha proteina de dicho cultivo.

Si la proteina se secreta, puede recuperarse directamente del medio de cultivo; si no, se realizara la lisis celular previamente.

La proteina puede purificarse entonces del medio de cultivo o del lisado celular, por procedimientos convencionales, conocidos en si mismos para los expertos en la tecnica, por ejemplo por precipitaci6n fraccionada, en particular precipitaci6n con sulfato de amonio, electroforesis, filtraci6n en gel, cromatografia de afinidad, etc.

Si se desea, las proteinas de uni6n a antigeno de la invenci6n pueden modificarse adicionalmente con el fin, por ejemplo, de facilitar su detecci6n, facilitar su administraci6n in vivo, o aumentar sus propiedades terapeuticas. Como ejemplos no limitativos, pueden marcarse con una molecula o sustancia detectable, tal como una molecula fluorescente, una molecula radiactiva, un marcador de spin para formaci6n de imagenes de resonancia magnetica nuclear (RMN), o cualesquiera otros marcadores conocidos en la tecnica, tambien pueden acoplarse con moleculas, tales como polietilen glicol, que prolongan su vida media en el plasma.

Un anticuerpo de la invenci6n puede marcarse con una molecula radiactiva por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, las moleculas radiactivas incluyen, pero no estan limitadas a, atomos radiactivos para estudios

escintigraficos tales como I123, I124, In111, Re186, Re188. Los anticuerpos de la invenci6n tambien pueden marcarse con (tambien conocido como formaci6n de imagenes de resonancia magnetica, rmi), tales como yodo-123, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitr6geno-15, oxigeno-17, gadolinio, manganeso, o hierro.

Las proteinas de uni6n a antigeno de la invenci6n pueden usarse para diagnosticar enfermedades relacionadas con la hepcidina.

En particular, pueden usarse para detectar hepcidina, yNo evaluar su cantidad en una muestra biol6gica, en particular muestras de sangre, orina, fluido amni6tico, o biopsias de 6rganos. Por lo tanto, pueden usarse para diagnosticar todas las enfermedades asociadas con niveles anormales de hepcidina, ya esten asociados con exceso de hepcidina o deficiencia de hepcidina.

Un objeto de la invenci6n es un metodo para detectar hepcidina, yNo evaluar su cantidad en una muestra biol6gica, en particular una muestra de suero o plasma, de un sujeto humano, en el que dicho metodo comprende poner en contacto dicha muestra con una proteina de uni6n a antigeno de la invenci6n bajo condiciones que permitan la formaci6n de un complejo inmune entre la hepcidina y dicha proteina de uni6n a antigeno, y detectar o medir el complejo inmune formado.

El complejo inmune formado puede detectarse o medirse por varios metodos usando tecnicas estandar, incluyendo, como ejemplos no limitativos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) u otros inmunoensayos de fase s6lida, radioinmunoensayo, electroforesis, inmunofluorescencia o transferencia Western.

Un objeto adicional de la invenci6n es un metodo para diagnosticar una enfermedad asociada con niveles anormales de hepcidina, en el que dicho metodo comprende evaluar la cantidad de hepcidina, como se ha indicado anteriormente, en una muestra biol6gica de un sujeto que se va a ensayar, y comparar la cantidad determinada con un valor control de hepcidina en un sujeto normal.

El metodo de la invenci6n puede usarse para diagnosticar enfermedades asociadas con niveles excesivos de hepcidina, tales como anemia de enfermedad cr6nica, anemia de cancer, y anemia de insuficiencia renal asi como para diagnosticar enfermedades asociadas con niveles insuficientes de hepcidina, tales como anemias congenitas cr6nicas o anemia deficiente de hierro (hemorragia cr6nica, gastritis ulcerosa...) o con una deficiencia relativa o completa de hepcidina tal como hemocromatosis hereditaria.

La invenci6n tambien proporciona kits que comprenden una proteina de uni6n a antigeno de la invenci6n, asociada con uno o mas dispositivos yNo reactivos para llevar a cabo un inmunoensayo. Por ejemplo, los kits de la invenci6n pueden contener una proteina de uni6n a antigeno de la invenci6n acoplada a un soporte s6lido, por ejemplo, una placa de cultivo tisular o lechos (por ejemplo, lechos de sefarosa) y reactivos para llevar a cabo un inmunoensayo.

Las proteinas de uni6n a antigeno de la invenci6n, capaces de inhibir la uni6n de hepcidina a ferroportina, tambien pueden usarse como medicamentos. Son utiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con un exceso de hepcidina, en particular anemia de cancer, anemia de insuficiencia renal y anemia de enfermedad cr6nica. La anemia de enfermedad cr6nica, tambien conocida como anemia de inflamaci6n, es asimismo la anemia mas frecuente en pacientes hospitalizados. Esta anemia normocitica a microcitica de leve a moderada se encuentra con una frecuencia entre 8% y 95% en pacientes que padecen enfermedades que estan asociadas con la activaci6n inmune cr6nica, tal como trastornos autoinmunes incluyendo artritis reumatoide y malignidades e infecciones cr6nicas incluyendo VIH.

La invenci6n proporciona asi un metodo para tratar anemia en un paciente que lo necesita, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de una proteina de uni6n a antigeno de la invenci6n, capaz de inhibir la uni6n de hepcidina a ferroportina.

Las afecciones que se pueden tratar con las proteinas de uni6n a antigeno de la presente invenci6n incluyen por ejemplo anemia de enfermedad cr6nica, anemia asociada con una disminuci6n o perdida de funci6n renal (fallo renal cr6nico), anemia asociada con terapia mielosupresora, tal como farmacos quimioterapeuticos o anti-virales (tales como AZT), anemia asociada con la progresi6n de canceres no mieloides, anemia asociada con infecciones virales (tales como VIH), anemia en pacientes con enfermedad de Crohn, anemia con activaci6n inmune cr6nica, anemia del anciano y anemia de lesi6n termal.

La invenci6n tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una proteina de uni6n a antigeno de la invenci6n. Las proteinas de uni6n a antigeno de la invenci6n pueden administrarse por si mismas, o mezcladas con vehiculos o excipientes farmaceuticamente aceptables. Pueden usarse sistemicamente o localmente. Una via preferida de administraci6n es la via parenteral, incluyendo por ejemplo inyecciones intramusculares, subcutaneas, intravenosas o intraperitoneales. La via oral tambien puede usarse, siempre que el medicamento este en una forma adecuada para administraci6n oral, capaz de proteger el principio activo de las enzimas gastricas e intestinales.

La presente invenci6n se ilustrara adicionalmente por la descripci6n adicional que sigue, que se refiere a ejemplos que describen el anticuerpo monoclonal AN -LP1. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan s6lo como ilustraci6n de la invenci6n y no constituyen de ninguna forma una limitaci6n de esta.

EJEMPLO�1:�PRODUCCION�Y�CARACTERIZACION�DEL�ANTICUERPO�ANTI-HEPCIDINA�AN-LP1:

Las propiedades de uni6n a hepcidina de AN-LP1 producido por el hibridoma CNCM I-3794 se ensayaron por ELISA. Hepcidina-25 humana sintetica se recubri6 en cajas de 96 pocillos, con una concentraci6n de 1-10 microgramosNml en tamp6n carbonato 100 mM, pH 9,5. Una parte de los pocillos se recubre con un peptido irrelevante (PELAPVSSNLKYTLDC, SEQ ID NO: 10) para poder determinar el componente especifico de la senal medida. Despues de una noche de contacto, los pocillos se lavan 3 veces con una disoluci6n de PBSN0,05%Ntween 20 y se saturan con una disoluci6n de 0,1 M Tris 20%, sacarosa pH 7,8. Los sueros de rat6n se anaden en duplicados, con diluciones seriadas de 10 veces. Despues de una incubaci6n de 6 h, los pocillos se lavaron tres veces con una disoluci6n de PBS 0,05%, tween 20 y se anadi6 anticuerpo anti-rat6n acoplado con peroxidasa (Biosource) diluido a 1N5.000 en PBS, 0,1% BSA, 0,01% Tween 20 durante 1h30-2h adicionales. La uni6n del anticuerpo se revel6 usando ABTS [acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulf6nico] como sustrato, y la lectura se realiz6 a 405 nm.

Los resultados se ilustran por la Figura 1. Muestran que AN-LP1 se une especificamente a hepcidina-25 humana recubierta en los pocillos y que no se une al peptido control.

Las celulas del hibridoma CNCM I-3794, que producen el anticuerpo, se usaron para la producci6n de ascitis del anticuerpo AN-LP1. Los ratones se trataron con una inyecci6n I.P. de 0,5 ml de pristano, 8 dias antes de la inyecci6n de 107 celulas de hibridoma. Dos semanas despues, se extrajo el fluido de ascitis y el anticuerpo se purific6 por la tecnica de precipitaci6n secuencial con acido caprilico. El acido caprilico precipita las proteinas con un peso molecular menor de 100-120 kDa. El precipitado se sediment6 por centrifugaci6n, y las inmunoglobulinas presentes en el sobrenadante se precipitaron usando sulfato de amonio a una concentraci6n final del 45% (pNv). Estas dos precipitaciones sucesivas hacen posible obtener, empezando a partir de 2 ratones, 30 miligramos de anticuerpo purificado.

La inmunoglobulina AN-LP1 secretada es una IgG1 Kappa. Los resultados del analisis por SDS-PAGE se presentan en la Figura 2. Estos resultados muestran que AN-LP1 presenta las caracteristicas convencionales de IgG (cadena pesada 50 kDa, cadena ligera 25 kDa).

Se realizaron experimentos adicionales con el fin de caracterizar mejor el anticuerpo.

1-Anllisis de transferencia en mancha:

Se usaron muestras de hepcidina humana sintetica (100 a 500 ng) o hepcidina de rat6n sintetica (500 ng) (Peptide International, Louisville, KY, EEUU) o de 10 a 40 μl de suero de un paciente con una enfermedad inflamatoria, o de un voluntario sano. En un experimento, una muestra de hepcidina humana sintetica (500 ng) se trat6 con tamp6n Laemmli. Las muestras se pusieron en gotas directamente en la membrana de nitrocelulosa y se dej6 que se secara toda la noche. Los sitios no especificos se bloquearon empapando la membrana en leche desnatada al 5% en TBS-T (1 h, a temperatura ambiente).

Los anticuerpos primarios (anticuerpo AN-LP1, o anticuerpo irrelevante HPC4 dirigido frente al epitopo EDQVDPRLIDGK (SEQ ID NO: 11) de la proteina C humana) se anadieron a una diluci6n de 1:200 de una disoluci6n de 6 mgNml. La incubaci6n se realiz6 durante 2 h a temperatura ambiente o toda la noche a +40C.

Despues de 3 lavados con TBS-T, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano (1:5.000) durante 1 h a temperatura ambiente.

Las senales se visualizaron por quimioluminiscencia usando un reactivo ECL, seguido de autorradiografia.

Los resultados se presentan en la Figura 3. Estos resultados muestran:

-: que el revelado de hepcidina con el anticuerpo AN-LP1 es especifico (sin senal con el anticuerpo irrelevante HPC4)

-: que el revelado de hepcidina con el anticuerpo AN-LP1 requiere la estructura nativa del peptido (sin senal cuando la muestra se trata con Laemmli)

-: que el anticuerpo AN-LP1 no reacciona de manera cruzada con la hepcidina-25 murina;

-: que la hepcidina de suero de las muestras humanas se reconoce bien por el anticuerpo AN-LP1.

2-Anllisis por�transferencia�Western

Las muestras de hepcidina humana o de rat6n sintetica (Peptide International) se separaron en un gel Tricina Novex® al 16% en condiciones no reductoras y la transferencia se realiz6 en membrana PVDF durante 1 h a temperatura ambiente. Los sitios no especificos se bloquearon empapando la membrana en leche desnatada al 5% en TBS-T (2 h, temperatura ambiente).

La incubaci6n con el anticuerpo primario (anticuerpo AN-LP1, 6 mgNml, diluido a 1:100) se realiz6 toda la noche a +40C.

Despues de 3 lavados con TBS-T, la membrana se incub6 con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano (1:5.000) durante 1 h a temperatura ambiente.

La senal se visualiz6 por quimioluminiscencia usando un reactivo ECL, seguido de autorradiografia.

Los resultados se presentan en la Figura 4. Estos resultados muestran que el anticuerpo AN-LP1 es eficaz para detectar la hepcidina humana en analisis de Transferencia Western revelando un producto del tamano correcto (aproximadamente 3 kDa para el peptido de 25 AA) y una banda adicional que corresponde lo mas probablemente a dimeros de hepcidina. Por el contrario, no se observ6 ninguna senal para la hepcidina de rat6n, lo que confirma los resultados de los analisis de transferencia en mancha.

3-�Inmunohistouummica:

La inmunoquimica se realiz6 en higado humano incluido en parafina. El anticuerpo AN-LP1 se us6 a una diluci6n

1:50 toda la noche a +40C. Despues de incubar con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano, las secciones se revelaron con diaminobencidina.

Los resultados se presentan en la Figura 5. Estos resultados muestran que el anticuerpo AN-LP1 es eficaz para revelar hepcidina en biopsias de higado humanas.

EJEMPLO�2:�PROPIEDADES FUNCIONALES DEL ANTICUERPO AN-LP1:

Se desarroll6 un ensayo de cribado para la actividad biol6gica de la hepcidina. Este ensayo se basa en la capacidad de la hepcidina de degradar el exportador de hierro, ferroportina. Consiste en incubar macr6fagos (linea celular murina J774), que expresan ferroportina, en presencia de hepcidina durante unas pocas horas. Si la hepcidina es biol6gicamente activa, se unira a ferroportina e inducira su degradaci6n.

Mas especificamente:

Las celulas J774 se trataron toda la noche con 200 μM de hierro-NTA para inducir la producci6n de ferroportina. Se anadieron al cultivo celular hepcidina-25 sintetica (100 nM) sola o unida a KLH (200 nM) o un peptido irrelevante unido a KLH (100 nM). Un cultivo sin peptido anadido se us6 como control.

Despues de incubar durante 5 h a 370C, las celulas se lavaron y se lisaron. Se prepararon extractos de membrana y se analizaron por transferencia Western con anticuerpos anti-ferroportina. Los resultados se presentan en la Figura 6 A (Carril 1: control).

Estos resultados muestran que la hepcidina sola o unida a KLH induce la degradaci6n de la ferroportina, mientras que el peptido irrelevante no tiene efecto.

El mismo experimento se repiti6 con hepcidina-25 sintetica (100 nM) preincubada durante 1 hora a 370C con 3 6 30 μg de AN-LP1 o el anticuerpo irrelevante HPC4, antes de la adici6n al cultivo celular.

Los resultados se ilustran por las Figuras 6B (hepcidina preincubada con el anticuerpo irrelevante HPC4) y 6C (hepcidina preincubada con el anticuerpo AN-LP1) y 6D (efecto de concentraciones crecientes de AN-LP1).

Estos resultados muestran que mientras la hepcidina induce normalmente la degradaci6n de la ferroportina en presencia del anticuerpo irrelevante, la uni6n del anticuerpo AN-LP1 a hepcidina neutraliza su acci6n, evitando asi la internalizaci6n y la degradaci6n de la ferroportina.

EJEMPLO 3: AFINIDAD DE LA INTERACCION HEPCIDINAIAN-LP1

Inmovilizacion de los ligandos en las superficies de sensores

Para estimar la constante de afinidad de AN-LP1 y las interacciones anticuerpo-antigeno, se realizaron medidas de resonancia de plasm6n superficial (SPR) con un instrumento BIAcore 2000 usando chips CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Piscataway, NJ). El mAb AN-LP1, diluido a 2 μgNml en tamp6n maleato 5 mM (pH 5,75), se inmoviliz6 en los chips CM5 por acoplamiento amina.

Ensayos de union y anllisis de los datos

La hepcidina se diluy6 en tamp6n de corrida HBS-EP (0,01 M HEPES pH 7,4; 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA y 0,005% polisorbato 20). El analito se inyect6 en 3 min, inyecciones de 60 μLNmin, y la disociaci6n se monitoriz6 durante 10 min. Se generaron Ab de superficie por una inyecci6n de 30 s a 1 min de glicina-HCl 10 mM pH 2. Las constantes de la velocidad cinetica se determinaron con anticuerpos purificados. Se inyect6 hepcidina concentrada (0,39 nM a 12,5 nM) sobre la superficie del chip a una velocidad de 60 μLNmin para recoger datos de uni6n. Los analisis de los datos se realizaron con el software BIAevaluation 3.0.

Los resultados se muestran en la Figura 7. La concentraci6n de hepcidina se indica para cada curva (Blk=blanco).

La constante de afinidad (Kd) de AN-LP1 es de 9,9 x E-11 M.

LISTA DE SECUENCIAS

5: �110� INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) VAULONT, Sophie GASCAN, Hugues FROGER, Josy

�120�: PROTE�NAS DE UNI�N A ANT�GENO-QUE TIENEN ESPECIFICIDAD PARA HEPCIDINA HUMANA

10: �130� MJPNmad-F598N101-WO

�150� �151�: EP 07 291 196.9 2007-10-02

15: �160� 11

�170�: PatentIn versi6n 3.3

20: �210� �211��212��213� 1 383 DNA Mus musculus

�400�: 1

�210� 2 �211� 24 �212� DNA

30 �213� ��

�400� 2 ggattcactt tcagtagata tagc 24

35 �210� 3 �211� 24 �212� DNA �213� Mus musculus

40 �400� 3 attagtgatg gtggtggtag cacc 24

�210� 4 �211� 36 45 �212� DNA �213� Mus musculus

�400� 4 gtaagacatg cgcgattaga gggatacttc gatgtc 36 50 �210� 5

�211� 651 �212� DNA �213� Mus musculus

�400� 5

10: �210� 6 �211� 30 �212� DNA �213� Mus musculus

15 20: �400� 6 gaaagtgttg ataattatgg caatagtttt �210� 7 �211� 9 �212� DNA �213� Mus musculus �400� 7 cgtgcatcc 30 9

25: �210� 8 �211� 24 �212� DNA �213� Mus musculus

30: �400� 8 cagcaaagta atgaggatcc gacg 24

35: �210� 9 �211� 25 �212� PRT �213� Homo sapiens

�400� 9

�210� 10

5 �211� 16

�212� PRT

�213� Homo sapiens

�400� 10 10

�210� 11 �211� 12 15 �212� PRT �213� Homo sapiens

�400� 11

Claims

REIvINDICACIONES

1. Una proteina de uni6n a antigeno caracterizada porque es capaz de unir hepcidina-25 humana, y porque comprende la VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de la cadena pesada y la VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo AN-LP1 producidas por el hibridoma CNCM I-3794 y codificadas por las SEQ ID NOs 2

5 4 y 6-8, respectivamente.
2. Una proteina de uni6n a antigeno segun la reivindicaci6n 1, caracterizada porque se selecciona entre: a) el anticuerpo monoclonal AN-LP1 producido por el hibridoma CNCM I-3794; b) los fragmentos de uni6n a antigeno del anticuerpo AN-LP1; c) los anticuerpos quimericos o humanizados obtenidos de AN-LP1;

10 d) los fragmentos de uni6n a antigeno de los anticuerpos c) anteriores.
3.

Una proteina de uni6n a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque es capaz de inhibir la uni6n de hepcidina a ferroportina.
4.

Un polinucle6tido que codifica una proteina de uni6n a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5.

Un vector de expresi6n que comprende un polinucle6tido de la reivindicaci6n 4.

15 6. Una celula que expresa una proteina de uni6n a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7.

Una celula de la reivindicaci6n 6, que es el hibridoma CNCM I-3794.
8.

Una celula de la reivindicaci6n 6, que es una celula huesped transformada con un vector de expresi6n de la reivindicaci6n 5.
9.

Un metodo para preparar una proteina de uni6n a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

20 caracterizado porque comprende cultivar al menos una celula segun se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y recuperar dicha proteina de dicho cultivo.
10. El uso de una proteina de uni6n a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para detectar hepcidina en una muestra biol6gica.
11. El uso de una proteina de uni6n a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el diagn6stico in 25 vitro de una enfermedad asociada con niveles anormales de hepcidina.
12. Una proteina de uni6n a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso como un medicamento.

Dif��Resp.