ES2385842T3

ES2385842T3 - Vacuna mejorada contra la gripe

Info

Publication number: ES2385842T3
Application number: ES06821622T
Authority: ES
Inventors: Ruth Arnon; Tamar Ben-Yedidia
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2005-12-06
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2026-12-06
Also published as: AU2006322907A1; US7914797B2; EP1968632A1; AU2006322907B2; PT1968632E; ATE552846T1; CA2632483C; WO2007066334A9; DK1968632T3; WO2007066334A1; CA2632483A1; EP1968632B1; US20090304730A1

Abstract

Una vacuna que comprende los epítopos peptídicos del virus de la gripe: M1 2-12 (SEC ID Nº: 25 o 26); HA 91-108 (SEC ID Nº: 48); HA 307-319 (SEC ID Nº: 57); NP 335-350 (SEC ID Nº: 67); NP 380-393 (SEC ID Nº: 68); y HA354-372 (SEC ID Nº: 80).

Description

Vacuna mejorada contra la gripe

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere en líneas generales a vacunas contra la gripe para el uso humano y veterinario. En particular, la presente invención proporciona una vacuna que puede suscitar protección intercepas y a largo plazo que comprende una pluralidad de proteínas quiméricas que comprenden los siguientes epítopos peptídicos del virus de la gripe: un epítopo de linfocitos B y CTL (M1 2-12; SEC ID Nº: 25 o 26); un epítopo de linfocitos B (HA 91-108; SEC ID Nº: 48); y un epítopo de auxiliar T (HA 307-319; SEC ID Nº:57); dos epítopos de CTL (NP 335-350; SEC ID Nº: 67, y NP 380-393; SEC ID Nº: 68); y un epítopo de linfocitos B adicional (HA 354-372; SEC ID Nº: 80).

Antecedentes de la invención

La gripe

[0002] La gripe es una enfermedad ocasionada por virus de tres subtipos principales, la gripe A, B y C, que se clasifica de acuerdo con sus determinantes antigénicos. El virión de la gripe consiste en un genoma de ARN monocatenario estrechamente asociado con una nucleoproteína (NP) y envuelto por una envuelta de lipoproteína revestida por proteína de la matriz (M1) y lleva dos antígenos principales de glicoproteína de la superficie, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). Las glicoproteínas HA y NA son sumamente susceptibles a cambios; por ejemplo, hay 16 clases inmunitarias de HA y 9 clases de NA diferentes que proporcionan la base para los diferentes subtipos del virus de la gripe como H1N1 o H3N2. El virus de la gripe A tiene una glicoproteína transmembrana adicional, M2, que está muy conservada entre los diferentes subtipos de HN. El gen M2 codifica una proteína que tiene 96 -97 aminoácidos que se expresa como un tetrámero sobre la superficie celular del virión. Se compone aproximadamente de 24 aminoácidos extracelulares, aproximadamente 19 aminoácidos transmembrana y aproximadamente 54 restos citoplásmicos (Lamb et al, 1985).

[0003] Los virus de la gripe A y B son las causas más comunes de gripe en humanos. La gripe tiene un impacto enorme sobre la salud pública con graves implicaciones económicas además de los problemas de salud devastadores, que incluyen morbosidad e incluso mortalidad. La infección puede ser leve, moderada o grave, variando desde asintomática hasta infección leve de las vías respiratorias superiores y traqueobronquitis a una neumonía viral, grave, ocasionalmente letal.

[0004] Los virus de la gripe tienen dos características inmunológicas importantes que presentan una exposición a preparaciones de vacuna. La primera concierne a cambios genéticos que se producen en las glicoproteínas de la superficie cada pocos años, que se denomina “deriva antigénica”. Este cambio antigénico produce virus que eluden la resistencia suscitada por las vacunas existentes. La segunda característica de gran preocupación para la salud pública es que los virus de la gripe, en particular el virus de la gripe A, pueden intercambiar y combinar material genético. Este proceso, conocido como “cambio antigénico”, da como resultado nuevas cepas diferentes de los dos virus parentales, que pueden ser cepas pandémicas letales. La gripe aviar es un virus de la gripe A que ha cruzado la barrera de las especies desde aves a mamíferos, incluyendo seres humanos.

Gripe aviar

[0005] Las mayoría de las cepas de la gripe aviar (AI, siglas en inglés) se clasifican como gripe aviar poco patógena (LPAI, siglas en inglés) y ocasionan escasos síntomas clínicos en aves infectadas. En cambio, las cepas de la gripe aviar altamente patógena (HPAI, siglas en inglés) ocasionan una enfermedad grave y extremadamente contagiosa y la muerte entre las aves infectadas.

[0006] Los seres humanos normalmente no están afectados por la gripe aviar, sin embargo, las epidemias de la gripe aviar altamente patógena (HPAI) recientemente observada en aves de corral en Asia aumenta las oportunidades de exposición e infección para el ser humano. Se han descrito casos graves en el pasado y durante las epidemias actuales en Asia. Recientemente brotes altamente patógenos han sido ocasionados por virus de la gripe A de los subtipos H5 y H7. De los 15 subtipos del virus de gripe aviar, el H5N1 es de particular preocupación dado que muta rápidamente y tiene una propensión documentada para adquirir genes de virus que infectan a otras especies de animales. Su capacidad para ocasionar enfermedades en seres humanos está actualmente bien documentada. Las aves que sobreviven a la infección excretan el virus durante al menos 10 años, por vía oral y en las heces, por lo tanto facilitando mayor propagación en los mercados de aves de corral vivas y por aves migratorias.

[0007] La epidemia de la HPAI, ocasionada por el subtipo H5N1, que comenzó a mediados de Diciembre del 2003 en determinados países de Asia se ha propagado y plantea una preocupación para la salud pública. La propagación de la infección en las aves aumenta las oportunidades para la infección directa en seres humanos. Si a lo largo del tiempo más humanos comienzan a infectarse, aumenta también la probabilidad de que los seres humanos, si actualmente están infectados con cepas de gripe humana y aviar, pudieran servir como hospedadores para la emergencia de un nuevo subtipo con suficientes genes de la gripe humana que se transmitan fácilmente de una persona a otra. Tal evento marcaría el inicio de una pandemia gripal.

[0008] La propagación de la AI entre aves se produce principalmente por contacto directo entre aves sanas y aves infectadas, y por contacto indirecto con equipo y materiales contaminados. El virus se excreta a través de las heces de las aves infectadas y a través de secreciones desde los orificios nasales, boca y ojos.

[0009] El contacto con material fecal infectado es el modo de transmisión más habitual de un ave a otra. Los patos salvajes a menudo introducen virus poco patógenos en bandadas domesticas criadas en libertad o en corrales al aire libre a través de contaminación fecal. Dentro de una instalación de aves de corral, la transferencia de virus HPAI entre aves también puede producirse mediante secreciones transmitidas por el aire. La propagación de la gripe aviar entre dependencias de aves de corral casi siempre sigue el movimiento de personal y de equipo contaminado. La transferencia de huevos es también un posible medio de transmisión de AI.

Antígenos del virus de la gripe y producción de vacunas

[0010] La inmunización contra el virus de la gripe está limitada por la variación antigénica del virus y por la restricción de la infección a las membranas mucosas respiratorias. Las vacunas de la gripe actualmente disponibles se basan en virus inactivos completos, o en determinantes antigénicos, de las proteínas de superficie. La HA es un fuerte inmunógeno y es el antígeno más significativo definiendo la especificidad serológica de las diferentes cepas de virus.

[0011] La molécula de HA (75-80 kD) comprende una pluralidad de determinantes antigénicos, muchos de los cuales se encuentran en regiones que experimentan cambios de secuencia en diferentes cepas (determinantes específicos de cepas) y otros en regiones que están conservadas en muchas moléculas de HA (determinantes comunes). Debido a estos cambios, las vacunas gripales necesitan modificarse al menos cada pocos años.

[0012] En la técnica se conocen muchos antígenos gripales, y vacunas preparadas a partir de los mismos. La Patente de Estados Unidos 4.474.757 desvela una vacuna contra infecciones del virus de la gripe que consiste en un péptido sintético correspondiente a un fragmento antigénico de HA unido a un transportador macromolecular adecuado, tal como polímeros de aminoácidos o toxoide tetánico.

[0013] La publicación internacional PCT WO 93/20846 de algunos de los inventores de la presente invención explica una vacuna recombinante sintética contra una pluralidad de diferentes cepas de virus de la gripe que comprende al menos una proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de la flagelina y al menos una secuencia de aminoácidos de un epítopo de HA o NP del virus de la gripe, o un agregado de dicha proteína quimérica. Siguiendo esta estrategia, se descubrió una vacuna antigripal recombinante sintética basada en tres epítopos que era altamente eficaz en ratones. Las vacunas ilustradas con ejemplos incluyen quimeras de flagelina que comprenden el epítopo de HA 91-108, un epítopo de linfocitos B de la HA que se conserva en todas las cepas H3 y suscita anticuerpos neutralizantes antigripales, junto con uno o dos epítopos NP de auxiliares T o CTL (NP 55 69 y NP 147 -158, respectivamente) que induce respuestas inmunitarias restringidas al MHC. Se consideró que una vacuna que comprendía una combinación de las tres quimeras mencionadas anteriormente ofrecía la mejor protección contra una infección viral.

[0014] La publicación de solicitud PCT WO 00/32228 de algunos de los inventores de la presente invención explica una vacuna gripal basada en péptidos sintéticos humanos que comprende al menos cuatro epítopos del virus de la gripe, siendo dichos epítopos del virus de la gripe reactivos con células humanas, comprendiendo dichos epítopos:

(i): Un epítopo de hemaglutinina (HA) para linfocitos B; (ii) un epítopo de hemaglutinina (HA) o de nucleoproteína (NP) para auxiliares T que puede unirse a muchas moléculas de HLA; (iii) al menos dos epítopos de proteína de matriz (M) o de nucleoproteína (NP) para linfocitos citotóxicos (CTL) que están restringidos a las moléculas de HLA más prevalentes en diferentes poblaciones humanas, en particular etnias

: o grupos raciales específicos. Los epítopos peptídicos de la gripe pueden expresarse como flagelina de Salmonella recombinante. Esta vacuna requiere la preparación engorrosa de al menos cuatro polipéptidos quiméricos.

[0015] La publicación de solicitud PCT WO 2004/080403 y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0223976 proporcionan una vacuna contra enfermedades ocasionadas por infección con el virus de la gripe y métodos de vacunación. Cada vacuna comprende una pluralidad de péptidos derivados de las proteínas M2 y/o HA de virus de la gripe, conjugados químicamente con una proteína transportadora. La conjugación es entre un extremo del péptido y un sitio reactivo de la proteína transportadora en la que la proteína transportadora se selecciona del complejo de proteína de membrana externa de Neisseria meningitidis, toxoide tetánico, antígeno de superficie de hepatitis B o antígeno de núcleo, hemocianina de lapa californiana, proteína capsidial de rotavirus y la proteína L1 de VLP del papilomavirus bovino o humano. Esta descripción requiere una pluralidad de epítopos peptídicos de M2 o de HA unidos de manera covalente a la superficie externa de una proteína transportadora y nunca sugiere ni explica ninguna vacuna que comprenda un polipéptido quimérico.

[0016] La publicación de solicitud PCT WO 99/07839 se refiere a antígenos gripales para su uso en vacunas en las que las vacunas comprenden un producto de fusión de al menos la parte extracelular de M2 y un transportador de presentación. El fragmento M2 se fusionó al extremo amino de la proteína transportadora para conservar un extremo N libre del dominio M2 y de esta manera imitar la estructura de tipo silvestre de la proteína M2. Adicionalmente esa invención se ilustra con un ejemplo por medio de una proteína de fusión M2 en la que la parte extracelular intacta del fragmento M2 está fusionada al extremo N de la proteína núcleo del virus de la hepatitis B para imitar la estructura de tipo silvestre de la proteína M2 en partículas virales y en células infectadas, en el que el extremo N libre se extiende en el entorno extracelular. Esta solicitud nunca explica ni sugiere ningún epítopo M2 aislado que esté restringido conformacionalmente.

[0017] La publicación de solicitud de Patente Internacional Nº WO 99/07839 explica una parte extracelular inmunogénica de una proteína de membrana M2 de un virus de la gripe A fusionada a un transportador de presentación, que puede seleccionarse del extremo amino de la proteína núcleo del virus de la Hepatitis B humana, tercer fragmento d de proteínas del complemento (C3d), el fragmento C de la toxina tetánica o partículas Ty de levaduras. Se mencionan otros transportadores de presentación no peptídicos, pero esa invención se ilustra solo con ejemplos por productos de fusión genéticos.

[0018] Slepushkin et al. (1995) describen protección de ratones contra exposición a la gripe A por vacunación con una proteína M2 recombinante expresada en baculovirus y administrada con adyuvante de Freund.

[0019] La publicación de solicitud PCT Nº WO 98/23735 desvela una vacuna gripal para inducir una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células contra un antígeno en un mamífero que comprende un producto de fusión de un antígeno gripal y una proteína de estrés o una proteína de choque térmico como un transportador. El antígeno gripal se selecciona de hemaglutinina, nucleoproteína, neuraminidasa, M1, M2, PB1, PB2, PA y una combinación de los mismos. No existe ninguna explicación ni sugerencia de una vacuna que combine un epítopo de M con un epítopo de HA.

[0020] Zou, et al. (2005) explican el péptido M2 6-13 extracelular y sugieren que esta secuencia puede ser útil en la preparación de una vacuna contra la gripe. Liu, et al (2005) desvelan epítopos específicos de hospedadores dentro de las secuencias M2 extracelulares, que pueden ser útiles para la preparación de una vacuna gripal bivalente. Los epítopos en cuestión incluyen la secuencia de M2 10-20 común para la gripe humana, aviar y porcina.

[0021] La publicación de solicitud PCT Nº WO 94/26903 se refiere a péptidos de proteína de matriz de la gripe humana que pueden unirse a moléculas humanas del MHC de Clase I. Esta invención proporciona epítopos peptídicos candidatos que pueden unirse al surco de moléculas del MHC de clase I, identificados usando el antígeno que procesa la línea celular defectuosa 174.CEM T2 (T2). No existe ninguna explicación ni sugerencia de una vacuna que comprenda una combinación del epítopo peptídico de M con un epítopo peptídico de HA.

[0022] Levi R. et al. ("Synthetic recombinant influenza vaccine induces efficient long-term immunity and crossstrainprotection", Vaccine, Butterworth Scientific. Guildford, GB, Vol. 14, No. 1, enero 1996, págs. 85-92) desvelan una vacuna contra la gripe basada en péptidos sintéticos que comprende una mezcla de tres epítopos seleccionados de un epítopo de HA de linfocitos B, un epítopo de NP de auxiliares T y un epítopo de CTL. Levi et al. No mencionan epítopos de matriz ni de gripe B.

[0023] Chen Z. et al. ("Enhanced protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with both hemagglutinin-and neuraminidase-expressing DNAs", Vaccine Butterworth Scientific. Guildford, GB, Vol. 17, No. 7-8, febrero 1999, págs. 653-659) describen vacunas de ADN que codifican las proteínas de longitud completa de HA, NA, y M1. No se especifican péptidos más cortos.

[0024] El documento WO 02/00885 A2 se refiere a partículas similares al virus de la gripe que comprenden las proteínas HA, NA, M1 y M2. Dicha solicitud no desvela ningún péptido corto.

[0025] Jeon S.H. et al., (" Intranasal immunization with synthetic recombinant vaccine containing multiple epitopes of influenza virus", Vaccine, Butterworth Scientific. Guildford, GB, Vol. 20, No. 21-22, junio 2002, págs. 2772-2780) se refieren a inmunización intranasal con una vacuna gripal recombinante sintética que contiene epítopos múltiples del virus de la gripe. Jeon et al., no describen epítopos de M1 ni epítopos de la gripe de tipo B.

[0026] El documento de Ben-Yedidia et al. ("Towards an epitope-based human vaccine for influenza", Human Vaccines, Vol. 1, No. 3, mayo 2005, páginas 95-101) es una publicación de revisión sobre vacunas humanas para la gripe basadas péptidos. En su interior no se mencionan epítopos de la proteína de matriz.

[0027] Sería muy ventajoso tener una vacuna para la gripe que pudiese administrarse una vez y que otorgase protección durante varios años o incluso durante toda la vida proporcionando protección cruzada contra nuevas cepas de virus.

[0028] Sigue existiendo una necesidad no satisfecha de una vacuna útil que suscite una respuesta inmunitaria contra una amplia gama de subtipos de la gripe que proporcione protección intercepas y a largo plazo, que sea tanto rentable como fácil de producir, que pueda administrarse de diversas formas y que sea útil para la inmunización en animales y en seres humanos.

Sumario de la invención

[0029] La presente invención proporciona una vacuna contra la gripe que suscita protección ínter subtipos y a largo plazo contra infección con virus de la gripe A y gripe B, incluyendo los serotipos de la gripe aviar. Se suscita una fuerte respuesta inmunitaria inesperada contra el virus de la gripe A o B por una vacuna que comprende proteínas quiméricas que comprenden al menos un epítopo peptídico de la proteína de matriz (M) de la gripe A y al menos un epítopo peptídico de hemaglutinina (HA) de la gripe A o B. Una vacuna que comprende una combinación de un epítopo de M y un epítopo de HA supera los inconvenientes de las vacunas conocidas que incluyen la necesidad de incluir epítopos que estén restringidos a moléculas de HLA asociadas con diferentes poblaciones raciales o étnicas. La vacuna de la presente invención suscita eficacia interracial y las poblaciones asiáticas y africanas reaccionan así como las caucasianas.

[0030] Adicionalmente, se suscita una sorprendente respuesta inmunitaria eficaz contra el virus de la gripe A o B mediante una vacuna que comprende una proteína quimérica que comprende un epítopo peptídico de M2 y una secuencia de aminoácidos de flagelina en la que el epítopo peptídico de M2 está incluido dentro de la secuencia polipeptídica de la flagelina. Este descubrimiento es inesperado en vista de que hasta ahora se conocen proteínas de fusión y conjugados de M2 que comprenden al menos la región extracelular completa de M2 e imitan la conformación del dominio extracelular completo de la proteína M2.

[0031] En un aspecto, la presente invención proporciona una vacuna para la inmunización de un sujeto que comprende una pluralidad de proteínas quiméricas que comprenden los epítopos peptídicos del virus de la gripe:

M1 2-12 (SEC ID de Nº: 25 o 26);

HA 91-108 (SEC ID Nº: 48);

HA 307-319 (SEC ID Nº: 57);

NP 335-350 (SEC ID Nº: 67);

NP 380-393 (SEC ID Nº: 68); y

HA 354-372 (SEC ID Nº: 80).

[0032] De acuerdo con una realización la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante o un excipiente.

[0033] De acuerdo con otra realización, para la administración, la vacuna se fórmula mediante una modalidad seleccionada del grupo que consiste en administración intraperitoneal, subcutánea, intranasal, intramuscular, oral, tópica y transdérmica.

[0034] De acuerdo con otro aspecto, la vacuna es para usar en un método para suscitar una respuesta inmunitaria y conferir protección contra el virus gripal en un sujeto. Preferentemente, la respuesta inmunitaria se suscita contra la gripe aviar, la gripe de tipo A, la gripe de tipo B o una de sus combinaciones.

[0035] De acuerdo con otro aspecto de la presente invención la vacuna se usa para la preparación de un agente farmacéutico para suscitar una respuesta inmunitaria y conferir protección contra el virus de la gripe en un sujeto.

[0036] En algunas realizaciones la vacuna protege contra la gripe A, incluyendo la gripe aviar. En otras realizaciones la vacuna comprende un epítopo de la gripe B y suscita protección contra la gripe B. En otra realización la vacuna comprende epítopos peptídicos que suscitan protección tanto para el virus de la gripe A como para el de la gripe B.

[0037] Las vías de administración de la vacuna incluyen, pero sin limitación, la administración intraperitoneal, subcutánea, intranasal, intramuscular, oral, tópica y transdérmica. Las vías de administración preferidas incluyen la administración oral, intranasal (IN) e intramuscular (IM). En una realización, la vacuna se fórmula para administración intranasal. En otra realización la vacuna se fórmula para administración intramuscular.

[0038] Debe entenderse explícitamente que las composiciones conocidas deben excluirse de la presente invención.

[0039] Otras realizaciones y el alcance de aplicabilidad completo de la presente invención resultarán obvios a partir de la descripción detallada proporcionada en lo sucesivo en el presente documento. Sin embargo, debe entenderse que aunque la descripción detallada y los ejemplos específicos indiquen realizaciones preferidas de la presente invención, se ofrecen solo a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones, dentro del espíritu y el alcance de la invención, resultarán obvios para los expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de la Figuras

[0040]

La Figura 1 presenta un gráfico que muestra la secreción de interferón gamma (IFNγ) de linfocitos incubados con el péptido respectivo después de la segunda y tercera inmunización de ratones transgénicos (TG) HHD/HLA A2.

Las Figuras 2A -2C muestran la lisis de células diana por células NK (de las siglas en inglés Natural Killer, linfocitos citolíticos naturales) derivadas de ratones inmunizados con epítopos individuales o combinaciones después de la segunda (2A) y tercera inmunización (2B). Incluso después de la segunda inmunización, las células NK de los ratones inmunizados con la combinación de 6 epítopos (hexa-vacuna 1) fueron capaces de realizar la lisis de las células diana más eficazmente que las células de ratones vacunados con los flagelos nativos (2C). La lisis específica se determinó a diferentes proporciones de E:D.

Las Figuras 3A y 3B muestran los resultados de la inmunización de ratones C57B1/6 con la Hexa-vacuna 2, que consiste en flagelos recombinantes que comprenden los epítopos peptídicos de HA 91-108, HA 354-372, HA 307-319, NP 335-350, NP 380-393 y M2 1-18. El suero se sometió a ensayo después de tres inmunizaciones y se determinó la especificidad del anticuerpo (Ab o Ig) contra el virus de la gripe H3N2 completo (3A) y contra el péptido M2 1-18 específico (3B).

La Figura 4 muestra la unión de epítopos peptídicos a HLA-A2 en linfocitos T2: se observó una unión alta y dependiente de la dosis por el péptido M1 3-11. Otros péptidos sometidos a ensayo, NP 336-344, NP 380-388 y HA 307-319, también mostraron capacidad de unión, que no fue dependiente de la dosis.

Las Figuras 5A-5C muestran la protección de anticuerpos suscitada por los epítopos peptídicos recombinantes. Se obtuvo una elevación significativa en el titulo de anticuerpos (Ab), específica para cada epítopo con los epítopos M1 2-12, NP 335-350 y HA 91-108 en ratones inmunizados solo con el epítopo de interés.

La Figura 6 muestra la respuesta inmune humoral a la dosis obtenida después de la vacunación de los ratones con Hexa-vacuna1.

La Figura 7 muestra la respuesta inmune humoral contra flagelos después de administración intranasal e intramuscular de la Hexa-vacuna1.

La Figura 8 muestra los resultados de titulación de virus. Después de tres vacunaciones con la Hexavacuna1, los ratones se infectaron con una dosis sub-letal del virus de la gripe de la cepa H3N2 (A/Texas/1/77). Los pulmones de los ratones se extirparon 5 días después para titulación de la carga viral. La titulación se realizó en huevos fertilizados.

La Figura 9 presenta el titulo IgE en el experimento de dosificación y en el experimento para evaluar la respuesta celular.

La Figura 10 muestra la concentración de IgE (ng/ml) en sueros de ratones transgénicos HHD inmunizados por vía intranasal (IN) con flagelos recombinantes que expresan epítopos gripales.

La Figura 11 muestra el factor de aumento del título de IgG contra 3 cepas diferentes de la gripe en sueros de conejos NZW inmunizados por vía intranasal tres veces con flagelos recombinantes que expresan seis epítopos gripales (Hexa-vacuna2).

La Figura 12 representa datos farmacocinéticos. Después de 15 minutos, se observó la concentración máxima en suero de la Hexa-vacuna1 (Tmax). Treinta minutos después de la dosificación, se obtuvo la mitad (T 1/2) de la cantidad de exposición total. Después de 12 horas la proteína no pudo detectarse.

Descripción detallada de la invención

[0041] La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que una vacuna que comprende al menos un epítopo peptídico de M y al menos un epítopo peptídico de HA es capaz suscitar inmunidad protectora intercepas y a largo plazo contra la gripe.

Definiciones

[0042] Por comodidad, en el presente documento se describen determinados términos empleados en la memoria descriptiva, en los ejemplos y en las reivindicaciones.

[0043] La expresión “presentación de antígenos” significa la expresión de antígenos sobre la superficie de una célula en asociación con moléculas de animales del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o de clase II (MHC-I

o MHC-II) o con el HLA-I y HLAII de seres humanos.

[0044] El término “inmunogenicidad” o “inmunogénico” se refiere a la capacidad de una sustancia para estimular o suscitar una respuesta inmunitaria. La inmunogenicidad se mide, por ejemplo, determinando la presencia de anticuerpos específicos para la sustancia. La presencia de anticuerpos se detecta por métodos conocidos en la técnica, usando, por ejemplo, un ensayo ELISA.

[0045] Los epítopos de la gripe pueden clasificarse como de tipo linfocito B, de tipo linfocito T o de tipo linfocito B y linfocito T, dependiendo del tipo de respuesta inmunitaria que susciten. La definición de epítopo peptídico de linfocito B o linfocito T no es inequívoco; por ejemplo, un epítopo peptídico puede inducir la producción de anticuerpos pero al mismo tiempo que el epítopo puede poseer una secuencia que permita la unión a la molécula HLA humana, haciéndola accesible a los CTL, por tanto una clasificación doble de linfocito T y linfocito B para ese epítopo particular. Los “CTL”, “linfocitos T citolíticos” o “linfocitos T citotóxicos” son grupo de linfocitos T diferenciados que reconocen y producen la lisis de células diana que llevan un antígeno extraño especifico que actúa en defensa contra infección viral y células cancerosas. Los “linfocitos T auxiliares” o “Th” es cualquiera de los linfocitos T que cuando se estimulan por un antígeno especifico liberan citocinas que promueven la activación y función de linfocitos B y linfocitos T citolíticos .

[0046] La expresión “flagelina recombinante” se refiere a un polipéptido de flagelina que comprende un epítopo peptídico incluido dentro de su secuencia. Una flagelina recombinante se diferencia de una proteína de fusión clásica en que el péptido o la proteína se va a expresarse en una proteína de fusión se fusiona a una proteína transportadora en su extremo N o C, dejando el otro extremo libre y conformacionalmente irreprimido.

[0047] “Secuencia de aminoácidos”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de oligopéptidos, péptidos, polipéptidos, o de proteína, y a fragmentos de los mismos y a moléculas sintéticas o de origen natural.

[0048] “Gripe aviar” o "AI" (de las siglas en ingles Avian Influenza) se refiere al virus de la gripe aviar que infecta aves, incluyendo aves domésticas y salvajes. Los virus de la gripe aviar conocidos pertenecen a los subtipos de virus H5, H7 y H9. El virus de la gripe aviar puede pertenecer al tipo poco patógeno (LPAI) o altamente patógeno (HPAI) y puede o no haber experimentado cambios antigénicos. Se ha demostrado que determinadas cepas de la gripe aviar, incluyendo H5N1, H7N3, H7N7 y H9N2, infectan mamíferos, incluyendo seres humanos.

Epítopos peptídico útiles en la preparación de una vacuna

[0049] Los epítopos peptídicos derivados de proteínas de la gripe son útiles en la preparación de las composiciones de la presente invención. Una de las composiciones descritas incluye al menos un epítopo peptídico derivado de proteínas M1 o M2 de la gripe A en combinación con un epítopo peptídico de HA de la gripe A o gripe B. Debe observarse que los epítopos peptídicos indicados en el presente documento se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos. Las proteínas del virus de la gripe varían entre aislados, proporcionando por lo tanto secuencias variantes múltiples para cada proteína de la gripe.

[0050] La proteína de matriz M1 es un componente estructural principal de las partículas del virus de la gripe y forma una capa interna de la envuelta derivada de células lipídicas. Dentro del virión y en células infectadas en fases tardías de la replicación del virus, la proteína M1 se asocia con las ribonucleoproteínas virales (vRNP), que están compuestas de moléculas de ARN viral, copias múltiples de la NP y las tres subunidades de la polimerasa viral que contiene los extremos de los ARN virales. El dominio N terminal de M1 se refiere al aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 20 de la proteína M1.

[0051] La proteína de matriz M2 es un canal iónico de hidrógeno que da como resultado la disociación del complejo matriz y nucleoproteína dentro de las vacuolas. Este canal iónico libera el genoma posibilitando que el ARN viral entre en el núcleo de la célula infectada e inicie la replicación viral. Las sustancias terapéuticas contra la gripe, tales como amantadina y rimantadina actúan bloqueando la actividad de M2. La gripe B tiene una proteína homologa conocida como NB; aunque no existe similitud de secuencia ambas son proteínas transmembrana y pueden compartir funciones similares. El dominio extracelular de la proteína M2, que es una proteína transmembrana del virus de la gripe A, es casi invariable en todas las cepas de la gripe A. El dominio N terminal de M2 se refiere a la secuencia de aminoácidos N terminal del dominio transmembrana.

[0052] La Tabla 1 proporciona una lista ejemplar de epítopos peptídicos de M1 y M2 que pueden seleccionarse para la preparación de proteínas quiméricas.

Tabla 1. Epítopos peptídicos de M1 y M2

Tipo de epítopo*: Posición del epítopo Secuencia de aminoácidos Secuencia de nucleótidos Nº de acceso del NCBI

M2 6-9: EVET (SEC ID Nº: 1) GAAGTGGAAACC (SEC ID Nº: 81) ABJ15715.1

auxiliar T: M2 1-15 MSLLTEVETHTRNG W (SEC ID Nº: 2) ATGAGCCTGCTGACC GAAGTGGAAACCCAC ACCAGGAATGGGTGG (SEC ID Nº: 82) ABJ15715.1

M2 10-18: PIRNEWGCR (SEC ID Nº: 3) CCGATTCGTAACGAA TGGGGTTGTCGT (SEC ID Nº: 83) ABD59884

M2 8-15: ETPIRNEWGC (SEC ID Nº: 4) GAAACCCCGATTCGT AACGAATGGGGTTGT CGT (SEC ID Nº: 84) ABD59884

M2 10-20: PIRNEWGCRCN (SEC ID Nº: 5) GAAACCCCGATTCGT AACGAATGGGGTTGT CGTGGTTGTCGT (SEC ID Nº: 85) ABD59884

CTL: M2 3-11 LLTEVETPI (SEC ID Nº: 6) CTGCTGACCGAAGTGG AAACCCCGATT (SEC ID Nº: 86) ABD59884

CTL: M2 2-10 SLLTEVETP (SEC ID Nº: 7) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCG (SEC ID Nº: 87) ABD59884

CTL: M2 2-11 SLLTEVETPI (SEC ID Nº: 8) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCGATT (SEC ID Nº: 88) ABD59884

CTL: M2 4-11 LTEVETPLT (SEC ID Nº: 9) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGCTGACC (SEC ID Nº: 89) ABD59884

auxiliar T: M2 1-15 MSLLTEVETPIRNE W (SEC ID Nº: 10) ATGAGCCTGCTGACCG AAGTGGAAACCCCGAT TCGCAACGAATGG (SEC ID Nº: 90) ABD59884

auxiliar T: M2 1-18 MSLLTEVETPIRNE WGCR (SEQ ID NO:11) ATGAGCCTGCTGACCG AAGTGGAAACCCCGAT TCGCAACGAATGGGGC TGCCGC (SEC ID Nº: 91) ABD59884

auxiliar T: M2 1-15 MSLLTEVETLTKNG W (SEC ID Nº: 12) ATGAGCCTGCTGACCG AAGTGGAAACCCTGAC CAAAAACGGCTGG (SEC ID Nº: 92) AAK49250

auxiliar T: M2 1-15 MSLLTEVETLTRNG W (SEC ID Nº: 13) ATGAGCCTGCTGACCG AAGTGGAAACCCTGAC CCGCAACGGCTGG (SEC ID Nº: 93) ABI85097

CTL: M2 4-12 LTEVETPIR (SEC ID Nº: 14) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGATTCGC (SEC ID Nº: 94) ABD59884

CTL: M2 4-13 LTEVETPIRN (SEC ID Nº: 15) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGATTCGCAAC (SEC ID Nº: 95)• ABD59884

CTL: M2 6-14 EVETPIRNE (SEC ID Nº: 16) GAAGTGGAAACCCCGA TTCGCAACGAA (SEC ID Nº: 96) ABD59884

CTL: M2 6-15 EVETPIRNEW(SEC ID Nº: 17) GAAGTGGAAACCCCGA TTCGCAACGAATGG (SEC ID Nº: 97) ABD59884

CTL: M2 4-14 LTEVETPIRNE (SEC ID Nº: 18) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGATTCGCAACGA A(SEC ID Nº: 98) ABD59884

auxiliar T: M2 4-18 LTEVETPIRNEWGC (SEC ID Nº: 19) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGATTCGCAACGA ATGGGGCTGCCGC (SEQ ID NO:99) ABD59884

linfocito B: M2 6-13 EVETPIRN (SEC ID Nº: 20) GAAGTGGAAACC CCGATTCGTAAC (SEC ID Nº: 100) ABD59900

linfocito B: M2 1-18 MSLLTEVETPTRNE WECR (SEC ID Nº: 21) ATGAGCCTGCTGACCG AAGTGGAAACCCCGAC CCGCAACGAATGGGAA TGCCGC (SEQ ID NO:101) BAD89348

linfocito B: M2 2-24 SLLTEVETPTRNEW ECRCS DSSD (SEC ID Nº: 22) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCGACCCG CAACGAATGGGAATGC CGCTGCAGCGATAGCA GCGAT (SEC ID Nº: 102) BAD89348

linfocito B: M2 2-24 SLLTEVETPIRNEW GCRCN DSSD (SEC ID Nº: 23) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCGATTCG CAACGAATGGGGCTGC CGCTGCAACGATAGCA GCGAT (SEC ID Nº: 103) ABD59884

linfocito B: M2 7-15 VETPIRNEW (SEC ID Nº: 24) GTGGAAACCCCGATT CGTAACGAATGG (SEQ ID NO:104) ABD59884

linfocito B: M1 2-12 SLLTEVETYVL (SEC ID Nº: 25) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCTATGTGCT T(SEQ ID NO:105) AAO52904

CTL: M1 2-12 SLLTEVETYVP (SEC ID Nº: 26) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCTATGTGCC G(SEC ID Nº: 106) AAO33507

CTL: M1 3-11 LLTEVETYV (SEC ID Nº: 27) CTGCTGACCGAAGTGG AAACCTATGTG (SEC ID Nº: 107) AAO33507

CTL: M1 13-21 SIVPSGPL (SEC ID Nº: 28) AGCATTGTGCCGAGCG GCCCGCTG (SEC ID Nº: 108) ABD59901

CTL: M1 17-31 SGPLKAEIAQRLED (SEC ID Nº: 29) AGCGGCCCGCTGAAAG CGGAAATTGCGCAGCG CCTGGAAGATGTG (SEC ID Nº: 109) ABD59901

CTL: M1 18-29 GPLKAEIAQRLE (SEC ID Nº: 30) GGCCCGCTGAAAGCGG AAATTGCGCAGCGCCT GGAA (SEC ID Nº: 110) ABD59901

CTL: M1 27-35 RLEDVFAGK (SEC ID Nº: 31) CGCCTGGAAGATGTGT TTGCGGGCAAA (SEC ID Nº: 111) ABD59901

CTL: M1 41-51 ALMEWLKTRPI (SEC ID Nº: 32) GCGCTGATGGAATGGC TGAAAACCCGCCCG (SEC ID Nº: 112) ABD59901

CTL: M150-59 PILSPLTKGI (SEC ID Nº: 33) CCGATTCTGAGCCCGC TGACCAAAGGCATT (SEC ID Nº: 113) ABD59901

CTL: M1 51-59 ILSPLTKGI (SEC ID Nº: 34) ATTCTGAGCCCGCTGA CCAAAGGCATT (SEC ID Nº: 114) ABD59901

CTL: M1 55-73 LTKGILGFVFTLTV PSERG (SEC ID Nº: 35) CTGACCAAAGGCATTC TGGGCTTTGTGTTTAC CCTGACCGTGCCGAGC GAACGCGGC (SEC ID Nº: 115) ABD59901

CTL: M1 56-68 TKGILGFVFTLTV (SEC ID Nº: 36) ACCAAAGGCATTCTGG GCTTTGTGTTTACCCT GACCGTG (SEC ID Nº: 116) ABD59901

CTL: M1 57-68 KGILGFVFTLTV (SEC ID Nº: 37) AAAGGCATTCTGGGCT TTGTGTTTACCCTGAC CGTG (SEQ ID NO:117) ABD59901

CTL: M1 58-66 GILGFVFTL (SEC ID Nº: 38) GGCATTCTGGGCTTTG TGTTTACCCTG (SEQ ID NO:118) ABD59901

CTL: M1 60-68 LGFVFTLTV (SEC ID Nº: 39) CTGGGCTTTGTGTTTA CCCTGACCGTG (SEQ ID NO:119) ABD59901

CTL: M1 59-67 ILGFVFTLT(SEC ID Nº: 40) ATTCTGGGCTTTGTGT TTACCCTGACC (SEC ID Nº: 120) ABD59901

CTL: M1 128-135 ASCMGLIY (SEC ID Nº: 41) GCGAGCTGCATGGGCC TGATTTAT (SEC ID Nº: 121) ABD59901

CTL: M1 134-142 RMGAVTTEV (SEC ID Nº: 42) CGCATGGGCGCGGTGA CCACCGAAGTG (SEC ID Nº: 122) ABD59901

CTL: M1 145-155 GLVCATCEQIA (SEC ID Nº: 43) GGCCTGGTGTGCGCGA CCTGCGAACAGATTGC G(SEQ ID NO:123) ABD59901

CTL: M1 164-172 QMVATTNPL (SEC ID Nº: 44) CAGATGGTGGCGACCA CCAACCCGCTG (SEC ID Nº: 124) ABD59901

CTL: M1 164-173 QMVATTNPLI (SEC ID Nº: 45) CAGATGGTGGCGACCA CCAACCCGCTGATT (SEC ID Nº: 125) ABD59901

CTL: M1 178-187 RMVLASTTAK(SEC ID Nº: 46) CGCATGGTGCTGGCGA GCACCACCGCGAAA (SEC ID Nº: 126) ABD59901

CTL: M1 232-240 DLLENLQTY (SEC ID Nº: 47) GATCTGCTGGAAAACC TGCAGACCTAT (SEC ID Nº: 127) ABD59901

[0053] La nucleoproteína (NP) es uno de los grupos de antígenos específicos, que se distingue entre los virus de la gripe A, B y C. A diferencia de la HA, la NP se conserva altamente, conservándose el 94 % en todos los virus de la gripe A. Los anticuerpos específicos de la NP del virus de la gripe A no tienen actividad neutralizante contra el virus, pero la NP es una diana importante para los linfocitos T citotóxicos (CTL) que reaccionan en cruzado con todos los virus de tipo A (Townsend, 1984). Los CTL reconocen péptidos sintéticos cortos correspondientes a regiones lineales de la molécula de NP de la gripe.

[0054] La hemaglutinina (HA) es una glicoproteína trimérica incluida en la envuelta del virus de la gripe. Es responsable de la adhesión y penetración del virus en la célula hospedadora. Los anticuerpos contra la HA neutralizan la infectividad viral. Las variaciones antigénicas de esta molécula son las responsables de brotes gripales frecuentes y del escaso control de infección por inmunización (Ada y Jones, 1986).

[0055] La ARN polimerasa del virus de la gripe es un heterocomplejo compuesto por tres proteínas de polimerasa (P), PB1, PB2 y PA, presentes en una proporción 1:1:1. Su función en la virulencia de la gripe no se ha aclarado por completo. En la siguiente Tabla 2 del presente documento pueden encontrarse ejemplos no limitantes de epítopos peptídicos de HA, NP y PB.

Tabla 2: epítopos peptídicos de HA, NP y PB

Tipo de epítopo *: Posición del epítopo Secuencia de aminoácidos Secuencia de nucleótidos Nº de acceso del NCBI

Linfocito B: HA 91-108 SKAYSNCYPYDVPD YASL (SEC ID Nº: 48) AGCAAAGCTTACAGCAAC TGTTACCCTTAT GATGTGCCGGATTAT GCCTCCCTT (SEC ID Nº: 128) AAM82562

Linfocito B: HA 91-108 SKAFSNCYPYDVPD YASL (SEC ID Nº: 49) AGCAAAGCGTTTAGCAAC TGCTATCCGTATGATGTG CCGGATTATGCGAGCCTG (SEC ID Nº: 129) GAC81017

Linfocito B: HA 107-124 STAYSNCYPYDVPD YASL (SEC ID Nº: 50) AGCACCGCGTATAGCAAC TGCTATCCGTATGATGTG CCGGATTATGCGAGCCTG (SEC ID Nº: 13 0) ABD59854 (de A/TS/ 3286/0 3 (H3N2)

Linfocito B: HA166-175 (HA 150-159 cepa A/PR/8) WLTEKEGSYP (SEC ID Nº: 50) TGGCTGACGGAGAAG GAGGGCTCATACCCA (SEC ID Nº: 131) ABD77675

auxiliar T: HA 306-324 PKYVKQNTLKLATG MRNVP (SEC ID Nº: 52) CCCAAGTATGTTAAGCAA AACACTCTGAAGTTGGCA ACAGGGATGCGGAATGTA CCAGAGAAACAAACTAGA GGC(SEC ID Nº: 132) AAL62329

CTL: HA 521-531 GVKLESMGIYQ (SEC ID Nº: 53) GGCGTGAAACTGGAAAGC ATGGGCATTTATCAG (SEC ID Nº: 133) ABJ09518

CTL: HA 518-528 EISGVKLESMG (SEC ID Nº: 54) GAAATTTCCGGCGTGAAA CTGGAAAGCATGGGC (SEC ID Nº: 134) ABJ09518

CTL: HA 458-467 NVKNLYEKVK (SEC ID Nº: 55) AACGTGAAAAACCTGTAT GAAAAAGTGAAA (SEC ID Nº: 135) ABD77675

auxiliar T: HA 128-145 KVKILPKDRWTQHT TTGG (SEC ID Nº: 56) AAAGTGAAAATTCTGCCG AAAGATCGCTGGACCCAG CATACCACCACCGGCGGC (SEC ID Nº: 136) AAO46269

auxiliar T: HA307-319 (HA 306-318) PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO:57) CCCAAGTATGTTAAGCAA AACACTCTGAAGTTGGCA ACA(SEC ID Nº: 137 AAL62329

auxiliar T: NP 91-99 KTGGPIYRR (SEC ID Nº: 58) AAAACTGGAGGACCT ATATACAGGAGAGG (SEQ ID NO:138) BAA99400

CTL: NP 44-52 CTELKLSDY (SEC ID Nº: 59) TGCACCGAACTGAAACTG AGCGATTAT (SEC ID Nº: 139) BAA99400

CTL: NP 82-95 HPSAGKDPKKTGGP(SEC ID Nº: 60) CATCCGAGCGCGGGCAAA GATCCGAAAAAAACCGGC GGCCCG (SEC ID Nº: 140) BAA99400

CTL: NP 82-94 HPSAGKDPKKTGG (SEC ID Nº: 61) CATCCGAGCGCGGGCAAA GATCCGAAAAAAACCGGC GGC(SEC ID Nº: 141) BAA99400

auxiliar T: NP 206-229 FWRGENGRKTRSAY ERMCNILKGK (SEC ID Nº: 62) TTTTGGCGCGGCGAAAAC GGCCGCAAAACCCGCAGC GCGTATGAACGCATGTGC AACATTCTGAAAGGCAAA (SEC ID Nº: 142) ABD59868

CTL: NP 265-273 ILRGSVAHK (SEC ID Nº: 63) ATTCTGCGCGGCAGCGTG GCGCATAAA (SEC ID Nº: 143) BAA99400

CTL: NP 305-313 KLLQNSQVY (SEC ID Nº: 64) AAACTGCTGCAGAACAGC CAGGTGTAT (SEC ID Nº: 144) ABD59868

CTL: NP 335-349 SAAFEDLRVLSFIR G (SEC ID Nº: 65) AGCGCGGCGTTTGAAGAT CTGCGCGTGCTGAGCTTT ATTCGCGGC (SEC ID Nº: 145) ABD35694

CTL: NP 335-350 SAAFEDLRVSSFIR GT (SEC ID Nº: 66) AGCGCGGCGTTTGAAGAT CTGCGCGTGAGCAGCTTT ATTCGCGGCACC (SEC ID Nº: 146) ABK34765

CTL: NP 335-350 SAAFEDLRVLSFIR GY (SEC ID NO:67) AGCGCGGCGTTTGAAGAT CTGCGCGTGCTGAGCTTT ATTCGCGGCTAT (SEC ID Nº: 147) ABD35694

CTL: NP 380-393 ELRSRYWAIRTRSG (SEC ID Nº: 68) GAACTGCGCAGCCGCTAT TGGGCGATTCGCACCCGC AGCGGC (SEC ID Nº: 148) ABK34765

CTL: NP 380-388 ELRSRYWAI (SEC ID Nº: 69) GAACTGCGCAGCCGCTAT TGGGCGATT (SEC ID Nº:149) ABK34765

CTL: NP 383-391 SRYWAIRTR (SEC ID Nº: 70) AGCCGCTATTGGGCGATT CGCACCCGC (SEC ID Nº:150) BAA99400

CTL: NP 384-394 YWAIRTRSGG (SEC ID Nº: 71) TATTGGGCGATTCGCACC CGCAGCGGCGGC (SEC ID Nº: 151 BAA99400

CTL: NP 382-390 SRYWAIRTR (SEC ID Nº: 72) AGCCGCTATTGGGCGATT CGCACCCGC (SEC ID Nº:152) BAA99400

CTL: NP 418-426 LPFDKPTIM (SEC ID Nº: 73) CTGCCGTTTGATAAACCG ACCATTATG (SEC ID Nº: 153) BAA99400

CTL: PB1 591-599 VSDGGPNLY (SEC ID Nº: 74) GTGAGCGATGGCGGCCCG AACCTGTAT (SEC ID Nº:154) ABK34974

CTL: PB1 571-579 RRSFELKKL (SEC ID Nº: 75) CGCCGCAGCTTTGAACTG AAAAAACTG (SEC ID Nº:155) ABK34974

CTL: PB2 368-376 RRATAILRK (SEC ID Nº: 76) CGCCGCGCGACCGCGATT CTGCGCAAA (SEC ID Nº:156) ABK34762

[0056] En algunos ejemplos la vacuna comprende un epítopo peptídico derivado de la gripe B. En la Tabla 3 se muestran ejemplos no limitantes de epítopos peptídicos de la gripe B.

Tabla 3: epítopos peptídicos de la gripe B

CTL: NP 30-38 (gripe B) RPIIRPATL (SEC ID Nº: 77) CGCCCGATTATTCGCCC GGCGACCCTG (SEC ID Nº:157) ABF21293

CTL: NP 263-271 (gripe B) ADRGLLRDI (SEC ID Nº: 78) GCAGATAGAGGGCTA TTGAGAGACATC (SEC ID Nº:158) ABF21293

auxiliar T: HA 308-320 (gripe B) PYYTGEHAKAIGN(SEC ID Nº: 79) CCGTATTATACCGGCGA ACATGCGAAAGCGATTG GCAAC (SEC ID Nº:159) ABI84095

B: HA 354-372 (gripe B) PAKLLKERGFFGAI AGFLE (SEC ID Nº: 80) CCGGCGAAACTGCTGAA AGAACGCGGCTTTTTTG GCGCGATTGCGGGCTTT CTGGAA (SEC ID Nº:160) ABI83926

* Cada péptido puede pertenecer a uno o a más tipos de epítopos. Por ejemplo un péptido que suscita una respuesta contra linfocitos B puede también suscitar una respuesta contra linfocitos T (auxiliares T y/o CTL).

Ácidos nucleicos

[0057] También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican un vector, tal como un vector de expresión, que comprende los epítopos de la gripe y una célula hospedadora que comprende un vector que comprende un epítopo de la gripe útil en la preparación de una vacuna sintética de la invención.

[0058] Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un péptido puede obtenerse a partir de su fuente natural, por ejemplo, como una parte de un gen. Una molécula de ácido nucleico también producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química. Las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias de ácido nucleico natural y sus homólogos, que comprenden, pero sin limitación, variantes alélicas naturales y secuencias de ácido nucleico modificadas en las que los nucleótidos se han insertado, delecionado, sustituido y/o invertido de tal manera que tales modificaciones no interfieren sustancialmente con la capacidad de la molécula de ácido nucleico para codificar una flagelina funcional.

[0059] Una secuencia de polinucleótidos o de oligonucleótidos puede deducirse a partir del código genético de una proteína, sin embargo, la degeneración del código debe tenerse en cuenta y las secuencias de ácido nucleótido también incluyen secuencias, que son degeneradas como un resultado del código genético, cuyas secuencias puede determinar fácilmente un experto habitual en la materia.

[0060] Las expresiones “ácido nucleico” y “polinucleótido”, como se usan en el presente documento, se refieren a un oligonucleótido, polinucleótido o nucleótido y a fragmentos o a partes de los mismos, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que puede ser mono-o bi-catenario y representar la cadena con sentido o antisentido. Debe entenderse que la expresión incluye, como equivalentes, análogos de ARN o de ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos, y, según sea aplicable a la realización que se está describiendo.

[0061] El término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 6 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos, preferentemente aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos y más preferentemente aproximadamente de 20 a 25 nucleótidos, que puede usarse en amplificación por PCR o en un ensayo de hibridación o en una micromatriz. Como se usa en el presente documento, oligonucleótido es sustancialmente equivalente a los términos "amplímeros", "cebadores", "oligómeros", y "sondas", como normalmente se define en la técnica. Los oligonucleótidos que codifican los epítopos peptídicos específicos, útiles en la preparación de la vacuna de la presente invención, se proporcionan en las Tablas 1-3 anteriores del presente documento.

[0062] Como se usa en el presente documento, son condiciones altamente rigurosas aquellas que permiten una divergencia de secuencia de hasta aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 25 %, preferentemente hasta aproximadamente el 5% a aproximadamente el 15 %. Sin limitación, los ejemplos de condiciones altamente rigurosas (-10 ºC por debajo de la Tm del hibrido calculada) usan como la solución de lavado de 0,1 X SSC (citrato en solución salina convencional) y SDS al 0,5 % a la Ti (temperatura de incubación) apropiada por debajo de la Tm del hibrido calculada. La máxima rigurosidad de la condiciones se debe principalmente a las condiciones del lavado, particularmente si las condiciones de hibridación usadas son aquellas que permiten que se formen híbridos menos estables junto con híbridos estables. Las condiciones de lavado a mayor rigurosidad eliminan después los híbridos menos estables. Una condición de hibridación común que puede usarse con las condiciones de lavado de altamente a moderadamente rigurosas, descritas anteriormente, es la hibridación en una solución de 6 X SSC (o 6 X SSPE), 5 X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 100 mg/ml a una Ti apropiada. (Véase, en líneas generales, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press (1989) para condiciones adecuadas de alta rigurosidad).

[0063] Las condiciones de rigurosidad son una función de la temperatura usada en el experimento y lavados de hibridación, la molaridad de los cationes monovalentes en una solución de hibridación y en la solución (o soluciones) de lavado y el porcentaje de formamida en la solución de hibridación. En general, la sensibilidad mediante hibridación con una sonda se ve afectada por la cantidad y actividad específica de la sonda, la cantidad del ácido nucleico diana, la detectabilidad de la sonda, la tasa de hibridación y la desnaturalización de la hibridación. La tasa de hibridación está maximizada a una Ti de aproximadamente 20 ºC -25 ºC por debajo de la Tm para híbridos de ADN: ADN y aproximadamente 10 ºC -15 ºC por debajo de la Tm para híbridos de ADN: ARN. También puede maximizarse mediante una fuerza iónica de aproximadamente 1,5 M de Na+. La tasa es directamente proporcional a la longitud del dúplex e inversamente proporcional al grado de desapareamiento.

[0064] La especificidad en cuanto a la hibridación, sin embargo, es una función de la diferencia en cuanto a la estabilidad entre el hibrido deseado y los híbridos de “fondo”. La estabilidad del hibrido es una función de la longitud del dúplex, de la composición de bases, de la fuerza iónica, del desapareamiento y de agentes desestabilizantes (si hubiese alguno). La Tm de un hibrido perfecto puede calcularse para híbridos de ADN: ADN usando la ecuación de Meinkoth et al (1984).

Moléculas quiméricas o recombinantes

[0065] Una “proteína quimérica”, “polipéptido quimérico” o "proteína recombinante" se usan indistintamente y se refieren a un epítopo peptídico de la gripe unido operativamente a un polipéptido distinto del polipéptido a partir del cual derivó el epítopo peptídico. Los epítopos peptídicos de la presente invención pueden prepararse por expresión en un vector de expresión como una proteína quimérica. Los expertos en la materia conocen métodos para producir una proteína quimérica o recombinante que comprenda un epítopo peptídico de la gripe. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un epítopo peptídico de la gripe puede insertarse en un vector de expresión para la preparación de una construcción de polinucleótidos para la propagación y expresión en células hospedadoras.

[0066] En un ejemplo no limitante, el polipéptido quimérico descrito incluye quimeras de un epítopo peptídico de la gripe con uno o más de los siguientes polipéptidos: flagelina, toxina colérica, toxina tetánica, ovo albúmina, proteína de choque térmico de la tuberculosis, toxoide diftérico, proteína G del virus sincitial respiratorio, proteína de membrana externa de Neisseria meningitides, nucleoproteína (N) del virus de la estomatitis vesicular, glicoproteína

(G) del virus de la estomatitis vesicular, proteína rica en glutamato del antígeno Plasmodium falciparum, proteína 3 de la superficie del merozoíto o proteína de envuelta (E) de virus.

[0067] La expresión “vector recombinante” y “vector de expresión recombinante” como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ADN, por ejemplo, un plásmido, flagelina o virus, que contiene secuencias de ácido nucleico deseadas y apropiadas necesarias para la expresión de los epítopos peptídicos recombinantes para la expresión en una célula hospedadora particular. Como se usa en el presente documento “unido operativamente” se refiere a una unión funcional de al menos dos secuencias. Unido operativamente incluye la unión entre un promotor y una segunda secuencia, por ejemplo un ácido nucleico de la presente invención, en el que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia.

[0068] El vector de expresión puede proporcionar las regiones reguladoras necesarias para la transcripción del epítopo peptídico. La naturaleza exacta de las regiones reguladoras necesarias para la expresión de genes puede variar entre vectores y células hospedadoras. Generalmente, se requiere un promotor que sea capaz de unir la RNA polimerasa y promover la transcripción de una secuencia de ácido nucleico asociada operativamente. Las regiones reguladoras pueden incluir las secuencias 5’ no-codificantes implicadas con el inicio de la transcripción y traducción, tales como la caja TATA, secuencia de terminación, secuencia CAAT y similares. La región 3’ no codificante para la secuencia codificante puede contener secuencias reguladoras de terminación transcripcional, tales como terminadores y sitios de poliadenilación. También puede proporcionarse un codón de inicio de la traducción (ATG).

[0069] Para clonar las secuencias de ácido nucleico en el sitio de clonación de un vector, durante la síntesis de los ácidos nucleicos, enlazadores o adaptadores proporcionan sitios de restricción compatibles apropiados. Por ejemplo, un sitio enzimático de restricción deseado puede introducirse en un fragmento de ADN por amplificación del ADN mediante el uso de PCR con cebadores que contienen el sitio de enzimático de restricción deseado.

[0070] Una construcción de expresión que comprenda una secuencia epitópica peptídica asociada operativamente con regiones reguladoras puede introducirse directamente en células hospedadoras apropiadas para la expresión y producción de los epítopos peptídicos como tal o como proteínas de fusión recombinantes. Los vectores de expresión que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cósmidos, fagos, fagémidos, flagelina o virus modificados. Típicamente, tales vectores de expresión comprenden un origen de replicación funcional para la propagación del vector en una célula hospedadora apropiada, uno o más sitios de restricción endonucleasa para la inserción de la secuencia génica deseada, y uno o más marcadores de selección.

[0071] Después, la construcción de polinucleótidos recombinante que comprende el vector de expresión y un epítopo peptídico debe transferirse dentro de una célula hospedadora bacteriana en la que pueda replicarse y expresarse. Esto puede conseguirse por métodos conocidos en la técnica. El vector de expresión se usa con una célula hospedadora procariota o eucariota compatible que puede derivar de bacterias, levaduras, insectos, mamíferos y seres humanos.

[0072] Un vector de expresión particularmente preferido es un vector de flagelina. Un ejemplo no limitante de un vector de expresión de flagelina se describe en el documento US 6.130.082, incorporado en el presente documento por referencia. También son adecuados otros vectores de expresión que incluyan un gen de flagelina, por ejemplo un gen fliC de Salmonella. Las células hospedadoras que expresan la flagelina recombinante pueden formularse como vacunas vivas.

[0073] Una alternativa para la producción de epítopos peptídicos por técnicas recombinantes es la síntesis peptídica mediante el uso de un sintetizador peptídico. En la técnica pueden usarse síntesis peptídicas convencionales u otros protocolos sintéticos.

Formulación de la vacuna

[0074] La vacuna puede formularse para la administración en uno de muchos modos diferentes. De acuerdo con una realización de la invención, la vacuna se administra por vía intranasal. La composición intranasal puede formularse, por ejemplo, en forma líquida, como gotas nasales, pulverización o ser adecuada para la inhalación, como un polvo, crema o emulsión. La composición puede contener una diversidad de aditivos tales como adyuvantes, excipientes, estabilizantes, tampones o conservantes. Para una aplicación sencilla, la composición de vacuna se suministra preferentemente en un recipiente apropiado para la distribución de la flagelina recombinante en forma de gotas nasales o un aerosol. En determinadas realizaciones preferidas la vacuna se formula para administración mucosa, en particular administración nasal (Arnon, 2001; Ben-Yedidia, 1999).

[0075] En otra realización de la invención, la administración es oral y la vacuna puede presentarse, por ejemplo, en forma de un comprimido o incluirse en una capsula de gelatina o una microcápsula.

[0076] En otra realización más, la vacuna se formula para administración parenteral. En algunas realizaciones la vacuna se formula para inoculación masiva, por ejemplo, para usar con un inyector a presión o un cartucho de un solo uso.

[0077] La formulación de estas modalidades es en general conocida por los expertos en la materia.

[0078] Los liposomas proporcionan otro sistema de administración para la administración y presentación del antígeno. Los liposomas son vesículas bicapa compuestas de fosfolípidos y otros esteroles que rodean un centro típicamente acuoso en el que los antígenos y otros productos pueden encapsularse. La estructura del liposoma es muy versátil con muchos tipos de tamaño que varían de nanómetros a micrómetros, desde aproximadamente 25 nm a aproximadamente 500 µm. Se ha observado que los liposomas son eficaces para la administración de agentes terapéuticos a superficies dérmicas y mucosas. Adicionalmente, los liposomas pueden modificarse para una administración diana, por ejemplo, incorporando anticuerpos específicos en la membrana de la superficie, o alterarse para encapsular bacterias, virus o parásitos. El tiempo de supervivencia promedio de la estructura del liposoma intacto puede prolongarse con la inclusión de determinados polímeros, por ejemplo, polietilen glicol, que permite la liberación prolongada in vivo.

[0079] Las micropartículas y nanopartículas emplean pequeñas esferas biodegradables que actúan como depósitos para la administración de vacunas. La principal ventaja que poseen las microesferas poliméricas sobre otros adyuvantes con efecto de tipo depósito, es que son extremadamente inocuas y han sido autorizadas por la FDA (administración de alimentos y medicamentos) en los Estados Unidos para su uso en medicina humana como suturas adecuadas y para su uso como un sistema de administración de fármacos biodegradable (Langer, 1990). Las tasas de hidrólisis de copolímeros se caracterizan muy bien, lo que a su vez permite la fabricación de micropartículas con liberación antigénica prolongada durante periodos de tiempo prolongados (O’Hagen, et al., 1993).

[0080] La administración parenteral de micropartículas suscita inmunidad de larga duración, especialmente si incorporan características de liberación prolongadas. La tasa de liberación puede modularse mediante la mezcla de polímeros y sus pesos moleculares relativos, que se hidrolizarán en diferentes periodos de tiempo. Sin desear ligarse a teoría alguna, la formulación de partículas de diferente tamaño (1 µm a 200 µm) también puede contribuir a respuestas inmunológicas de larga duración ya que las partículas grandes deben degradarse en partículas más pequeñas antes de estar disponibles para la captación por los macrófagos. De esta manera, podría desarrollarse una vacuna de una sola inyección integrando diversos tamaños de partículas, prolongando por tanto la presentación del antígeno y beneficiando enormemente a los productores pecuarios.

[0081] En algunas aplicaciones, en la formulación de la vacuna puede incluirse un adyuvante o excipiente. La elección del adyuvante se determinará en parte por el modo de administración de la vacuna. Por ejemplo, la vacunación no inyectada conducida a un mejor cumplimiento global y a menores costes globales. Un modo de administración preferido es la administración intranasal. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes intranasales incluyen polvo de chitosán, microesferas de PLA y PLG, QS-21, nanopartículas de fosfato de calcio (CAP) y mCTA/LTB (toxina colérica mutante E112K con la subunidad B pentamérica de la enterotoxina termolábil).

Uso terapéutico de las vacunas

[0082] Las vacunas de la presente invención están destinadas para el uso en seres humanos y en animales, incluyendo ganado, aves de corral y animales domésticos, para la prevención o atenuación de la enfermedad de la gripe A y B.

[0083] Para ilustrar más completamente algunas realizaciones de la invención se presentan los siguientes ejemplos. Sin embargo, de ningún modo deben considerarse como limitantes del amplio alcance de la presente invención. Un experto en la materia puede diseñar fácilmente muchas variaciones y modificaciones de los principios descritos en el presente documento sin alejarse del alcance de la invención.

Ejemplos

[0084] ABREVIATURAS: Ab: anticuerpos; CTL: linfocitos T citotóxicos; EID: dosis infecciosa de huevos; HA: Hemaglutinina; UHA: Unidades de Hemaglutinación; NP: Nucleoproteína; PMBC: células mononucleares de sangre periférica; Th: auxiliar T; IN o i.n.: intranasal; IP: intraperitoneal; IM o i.m.: intramuscular; NK: linfocitos citolíticos naturales; proporción E: D: proporción de efector:diana.

EJEMPLO1. Síntesis de péptidos y de flagelina recombinante.

[0085] Los epítopos pueden expresarse como flagelos recombinantes, en el que cada flagelo comprende uno o más epítopos peptídicos. Como alternativa, los epítopos peptídicos pueden expresarse en un vector de expresión como una proteína de fusión multimérica que comprende dos o más epítopos peptídicos.

[0086] La flagelina recombinante se sintetiza por métodos de biología molecular conocidos en la técnica. En resumen: se preparó un vector de expresión de flagelos que comprendía un marcador de antibióticos. Los oligonucleótidos sintetizados se insertaron en el sitio EcoRV del plásmido y se transfectaron en células competentes de E. coli. Se seleccionaron colonias que contenían el plásmido recombinante por sondeo con un oligonucleótido radiomarcado. Los plásmidos de colonias positivas se purificaron y la orientación del inserto se determinó usando análisis de restricción. Los plásmidos deseados se usaron para transformar células competentes de Salmonella typhimurium LB5000 (una modificación competente, negativa restrictiva no flagelada) y después se transfirieron a una cepa de Salmonella dublin SL5928 (un mutante Aro A) para una vacuna viva negativa a flagelina, por transducción usando el fago int. P22HT105/1. La cepa de S. dublin transformada se seleccionó por la resistencia a la kanamicina, movilidad al microscopio óptico y crecimiento en placas de agar LB semisólido, complementado con caldo nutritivo Oxoid nº 2. Los clones seleccionados se cultivaron durante una noche en 2 litros de medio y la flagelina se purificó por escisión ácida. El producto resultante es un agregado de la flagelina y puede usarse como tal para una vacuna.

[0087] La flagelina recombinante no pretende limitarse por la elección de la secuencia de flagelina. En algunas realizaciones la flagelina tiene el gen H1-d de Salmonella muenchen con el número de acceso X03395 para la flagelina de fase 1-d (ATCC 8388).

EJEMPLO 2: Respuesta de ratones quiméricos contra el virus de la gripe completamente inactivado.

[0088] Para evaluar la respuesta inmunogénica suscitada por la vacuna de la presente invención se usaron quimeras de ser humano-ratón. Para establecer la idoneidad de la quimera de ser humano/ratón por radiación, para evaluar la vacuna basada en péptidos, se evaluó su respuesta inmunitaria contra el virus de la gripe purificado inactivo. Los ratones se inmunizaron por vía i. p. con 50 µg del virus el día del trasplante de PBMC, seguido de una exposición viral subletal con la cepa A/Texas/ 1/77 de la gripe, 14 días después de la inmunización. La vacunación de la quimera de ser humano/ratón por radiación con la vacuna del virus completamente inactivado, sin ningún adyuvante, indujo la producción de anticuerpos específicos, el título de los anticuerpos en suero fue significativamente más alto (2,4 veces) en la quimera inmunizada en comparación con el grupo control. Además, esta vacunación redujo notablemente la infección viral posterior. El título del virus en los pulmones después de la exposición fue significativamente más bajo (2,7 órdenes de magnitud) en la quimera inmunizada en comparación con el grupo control.

[0089] Este experimento demuestra la idoneidad de la quimera de ser humano/ratón por radiación, para evaluar la respuesta anti-gripal después de inmunización.

EJEMPLO 3. Análisis FACS de ratones inmunizados para evaluar el implante de PBMC humanas en la quimera de ser humano/BALB.

[0090] El éxito del implante de las células humanas en quimeras de ser humano/ratón se demostró en un experimento preliminar que demostraba que la mayoría de los linfocitos en el peritoneo (50–80 %) y en los pulmones de los ratones (30-60 %) eran de origen humano. Para la evaluación del implante de células humanas en la quimera de ser humano/ratón, la presencia de células humanas en los ratones implantados se analizó por FACS.

EJEMPLO 4. Eliminación del virus de los pulmones después de exposición subletal.

[0091] La infección de la gripe es una infección respiratoria; por tanto, una respuesta inmunitaria local inducida por una administración intranasal de la vacuna puede ser más eficaz que la administración parenteral. La pauta de inmunización se modificó para adaptarla a la inmunización intranasal.

[0092] Por vía intranasal (i.n.) se inmunizaron ratones (6-8 por grupo en 7 experimentos repetidos) 10-12 días después del trasplante de PBMC, como se describe en los Métodos. Diez días después, se expusieron por vía i. n. a 10-4 UHA en 50 µl de líquido alantoico de la cepa viva A/Texas/1/77 u otra cepa del virus de la gripe. Cinco días después se sacrificaron y sus pulmones se extirparon para determinar la titulación del virus. La producción de anticuerpos humanos en estos ratones se evaluó tanto en el suero (antes de la exposición) como en los pulmones (después de la exposición).

[0093] Además del experimento de exposición a infección subletal, se examinó la capacidad de la vacuna para proteger a la quimera de ser humano/ratón de una dosis letal del virus de la gripe.

EJEMPLO 5. Protección de infección con diferentes cepas de la gripe.

[0094] Uno de los principales problemas con las vacunas de la gripe actualmente disponibles es que solo son eficaces contra las cepas incluidas en la vacuna. Por lo tanto, es de interés examinar la capacidad de la flagelina recombinante que comprende epítopos de la gripe para proteger a ratones de diferentes subtipos de la gripe. El epítopo peptídico de M, que se expresa en la flagelina, puede conservarse en todos los subtipos H3 de la gripe, mientras que los epítopos de linfocitos T son de regiones de la hemaglutinina y nucleoproteína altamente conservadas en otros subtipos también. En otros ejemplos el epítopo peptídico de M se conserva en todas la cepas H9 o H5. En la primera etapa, se demuestra que los anticuerpos de conejo contra estos epítopos pueden de hecho reconocerse y reaccionar en ELISA con diferentes cepas de la gripe incluyendo A/Texas/1/77, A/Aichi/68, A/PR/8/34 y A/Japonesa/57. Para someter a ensayo adicionalmente el potencial de esos epítopos para conferir protección cruzada en seres humanos, se inmunizaron quimeras de ser humano/ratón por radiación (8 ratones por grupo) por vía i. n. con la flagelina recombinante. Su resistencia a diferentes exposiciones de cepas de la gripe se detectó 7 días después y se comparó con la de los ratones no trasplantados que se inmunizaron con la misma mezcla de flagelos. Las cepas de la gripe usadas para infección fueron: A/Texas/1/77 (H3N2), A/Japonesa/57 (H2N2) y A/PR/8/34 (H1N1). También se sometieron a ensayo otras cepas.

EJEMPLO 6: Ensayo de respuesta de CTL.

[0095] Después de la inmunización con la vacuna de la presente invención, los bazos de los animales se extirparon y se incubaron, durante 5 días más, con el péptido que representaba el epítopo en cuestión (por ejemplo NP 335350 o M2 1-18). En una placa distinta se incubaron células diana singénicas carentes de TAP (con la misma tipificación que HLA A2.1, por ejemplo: células RMA) con el mismo péptido y con S35-Metionina. Los esplenocitos activados se incubaron con las células diana y después del reconocimiento del péptido, los atacarán y liberaran metionina. Recuentos de alta radiactividad indican un nivel alto de linfocitos CTL activos.

EJEMPLO 7: Ensayos de anticuerpos en suero y de neutralización de anticuerpos.

[0096] Se inmunizaron ratones, cobayas o conejos con la mezcla de la flagelina recombinante, 14 días después de la inmunización, se extrajeron muestras de sangre y se separó el suero. Estos sueros se emplearon para detectar la especificidad de los anticuerpos, por ejemplo por ELISA o transferencia de western, además, es posible determinar su tipo, es decir, IgG1, o IgG2a o IgG2c etc. En homogeneizados de pulmón pudo detectarse IgA, lo que indica una respuesta inmunitaria en la mucosa.

[0097] Ensayo de neutralización: células MDCK (riñón canino Madin-Darby) se infectaron con el virus de la gripe, como se determina por recuentos en placa o por MTT (un tipo de tinción para determinar la viabilidad), seguido de incubación del virus con suero de animales inmunizados; los anticuerpos se unen al virus e impiden la infección de las células MDCK. Un número de placas reducido o una viabilidad aumentada de las células indican la especificidad de los anticuerpos y su capacidad para impedir/reducir la infección.

EJEMPLO 8: Inmunogenicidad de epítopos individuales.

[0098] Se inmunizaron ratones transgénicos HHD/HLA A2 con flagelos que expresaban cada epítopo (Fla-91, Fla335, Fla-380, Fla-M1 2-12) o con una mezcla de 6 epítopos (Hexa-vacuna 1: Fla-91, Fla-335, Fla-380, Fla-M1 2-12, Fla-354 y Fla-307). Fla-91 se refiere a flagelos que comprenden el epítopo de HA 91-108; Fla-335 se refiere a flagelos que comprenden el epítopo de NP 335-350; Fla-380 se refiere a flagelos que comprenden el epítopo de NP 380-393; Fla-M1 2-12 se refiere a flagelos que expresan el epítopo de M1 2-12; Fla-354 se refiere a flagelos que expresan el epítopo de HA 354-372 (gripe B); Fla-307 se refiere a flagelos que expresan el epítopo de HA 307-319.

[0099] Las células se incubaron con el péptido respectivo y las células de los ratones inmunizados con la Hexavacuna se incubaron con los 4 péptidos HA91, NP335, NP380, M1 2-12. En la siguiente Tabla 4 del presente documento pueden encontrarse los datos de las secuencias epitópicas peptídicas, identificadores de secuencia y de homología de cepas.

Tabla 4: Listado de epítopos peptídicos de la Hexa-vacuna1

Tipo de epítopo: Secuencia epitópica Homología en cepas de la gripe

auxiliares T: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT (SEC ID Nº: 57) H3N2

CTL: NP335-350 SAAFEDLRVLSFIRGY (SEC ID Nº:67) H1N2, H2N2, H3N2, H9N2.

CTL: NP 380-393 ELRSRYWAIRTRSG (SEC ID Nº:68) H1N1, H1N2, H2N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N9, H6N1, H6N2, H6N9, H7N7, H9N2, H9N2, H11N1, H11N8, H11N9, H14N5.

Linfocito B: HA91-108 SKAYSNCYPYDVPDYASL (SEC ID Nº: 48) H3N2

Linfocito B y CTL: M1 2-12 SLLTEVETYVP (SEC ID Nº: 26) H1N1, H3N2, H4N6, H5N1, H5N2, H5N3, H6N1, H7N3, H9N2,

Célula B (gripe B): HA 354-372 PAKLLKERGFFGAIAGFLE (SEC ID Nº: 80) B/Hong Kong/330/2001; B/Beijing/1/87; B/ Singapur/222/79; B/Oregón/5/80; B/ Shandong/7/97; B/Memphis/13/03; B/Los Ángeles/1/02; B/Nebraska/1/01; B/Hong Kong/548/2000; B/Hong Kong/156/99; B/ Viena/1/99; B/Lee/40 y otras.

Inmunogeneicidad en modelo de "ratón transgénico HHD".

[0100] Se seleccionaron epítopos CTL para determinar su unión a moléculas HLA-A2. Para estudiar respuestas restringidas a HLA, se emplearon ratones D b-/-β2 microglobulina (β2m) anulados, transgénicos para una HLA A2.1/D b-/-recombinante. Se empleó la cadena sencilla de la ones

β2 microglobulina (ratones HHD). Estos rat combinan transgénesis de HLA clásica con destrucción selectiva de H-2 murina y muestran solo respuestas restringidas para HLA-A2.1. Estos ratones sirven como un modelo animal para la búsqueda de sistemas que implican inmunidad celular tales como cáncer, autoinmunidad y temas de vacunación.

[0101] La respuesta celular que contribuye a la eliminación de los virus implica mecanismos mediados por citocinas. La implicación de citocinas en la respuesta inmunitaria creada por la vacuna recombinante se estudió en el modelo de ratones transgénicos HHD.

[0102] En este estudio, se administraron tres veces, por vía subcutánea, flagelos que expresaban diversos epítopos peptídicos en PBS, emulsionados en adyuvante de Freund. Al grupo control se le administró PBS emulsionado en adyuvante de Freund.

[0103] Ensayos celulares: los esplenocitos de estos ratones se incubaron en presencia de los péptidos sintéticos correspondientes al epítopo anterior. La secreción de IFN-γ por las células en respuesta a la estimulación con los péptidos se controló por ELISA.

[0104] La Figura 1 muestra la secreción de IFN gamma medida a partir de linfocitos incubados con el péptido respectivo después de la segunda y tercera inmunización.

[0105] Los linfocitos activados secretaron IFN-γ en respuesta a la incubación con los péptidos correspondientes. El grupo inmunizado con la Hexa-vacuna 1, que contenía la mezcla de 6 flagelos recombinantes, se incubó por separado con una mezcla de los 4 epítopos celulares sometidos a ensayo. Después de la tercera inmunización, la secreción de IFN-γ de estas células era significativamente elevada (los niveles de IFN secretados por las células incubadas con medio, estaban por debajo del nivel de detección del ensayo de 2pg/ml). El IFN gamma secretado de linfocitos no activados (controles negativos-cultivados en medio sin péptido) fue <0,004 ng/ml.

[0106] La lisis de NK (linfocitos citolíticos naturales) contribuye a la respuesta antiviral. Se sabe que las células virales infectadas son más sensibles a la lisis que las células no infectadas. Se especula que el reconocimiento de células diana por linfocitos citolíticos naturales es más 'especifico' que lo que se pensaba anteriormente. Se ha demostrado una similitud en el motivo del péptido entre aglutinantes HLA A2 y aglutinantes HLA-G (expresado linfocitos citolíticos naturales).

[0107] Por lo tanto, además del mecanismo no especifico de la activación de NK, los péptidos específicos para HLA-A2 pueden suscitar una elevación específica adicional de la actividad de NK (lisis).

[0108] Ensayos con linfocitos T citotóxicos (CTL): se inmunizaron ratones HHD/HLA A2.1 con la Hexa-vacuna 1 en PBS. No se demostró la lisis directa de células diana por linfocitos CD8+, sin embargo, se obtuvo una lisis marcada de células Yac-1 que son sensibles a lisis por NK. La lisis por NK se encontró después de la segunda inmunización y también fue elevada después de la tercera inmunización. Debe observarse que los niveles de línea basal de la activación NK en ratones sin tratar son aproximadamente nulos.

[0109] Las Figuras 2A -2C muestran la lisis de células diana por NK derivados de ratones vacunados después de la segunda y tercera inmunización. Se presenta el porcentaje de lisis de las dianas YAC-1 por linfocitos NK después de la segunda y tercera inmunización. Linfocitos de bazo de ratones inmunizados se sensibilizaron con los péptidos incluidos en los flagelos recombinantes durante 5 días y después se incubaron con células YAC-1 marcadas con35S-Met. La lisis específica se determinó a proporciones E: D diferentes. Los datos (% de lisis por linfocitos NK de cada grupo) se presentan como veces de activación en comparación con la lisis de grupo inmunizado con flagelos nativos. Después de la segunda inmunización, los linfocitos NK de los ratones inmunizados con la combinación de 6 epítopos (Hexa-vacuna 1) fueron capaces de realizar la lisis de las células diana más eficazmente que las células de los ratones vacunados con los flagelos nativos. Las Figuras 2A y 2B muestran la lisis por linfocitos NK de epítopos peptídicos recombinantes individuales o una combinación de tres epítopos recombinantes (Fla-NP335, Fla-NP380, Fla-Ml 2-12).

[01110 Después de tres inmunizaciones, las células de los ratones inmunizados con M1 2-12 mostraron una elevación significativa en su capacidad para destruir células diana. El epítopo peptídico M1 2-12 es por lo tanto un epítopo peptídico útil en la preparación de la vacuna de la presente invención.

[0111] Las Figuras 3A y 3B muestran los resultados de inmunización de ratones C57B1/6 con la Hexa-vacuna 1, que consiste en flagelos con 6 epítopos de la gripe (HA 91-108, HA 354-372, HA 307-319, NP 335-350, NP 380-393 y M2 1-18).

[0112] El suero se retiró después de una pauta de 3 inmunizaciones y se determinó la especificidad de Ab contra el virus de la gripe H3N2 completo (Figura 3A) y contra el péptido M2 1-18 especifico (Figura 3B).

[0113] La unión de epítopos y estabilización de HLA-A2 en T2 humano (deficiente para transportadores TAP y por lo tanto expresan cantidades bajas o inestables de moléculas HLA-A2.1, Después de la unión de péptidos, se expresaron niveles estables y altos de HLA-A2 en la superficie celular). Se incubaron linfocitos T2 con diversas concentraciones de péptidos en medio asérico durante una noche y se tiñeron con anticuerpos monoclonales específicos. La estabilización de las moléculas HLA-A2 se detectó por citometría de flujo.

[0114] La Figura 4 muestra la unión de péptidos a HLA-A2 en linfocitos T2: se observó unión alta y dependiente de la dosis por el péptido M1 3-11. Otros péptidos sometidos a ensayo, NP 336-344, NP 380-388 y HA 307-319, mostraron alguna capacidad de unión baja que no era dependiente de la dosis. NP 380-393 se conoce como especifico para la molécula HLA B8 y no se esperaba que se uniese a HLA A2. El péptido HA 91-108 que es más largo que el surco de HLA, mostró capacidad de unión solo a la mayor concentración (100 µM), debido probablemente al motivo de HLA en el lado N-terminal. La unión mínima y no dependiente de la dosis se demostró a concentraciones más bajas.

[0115] Además de las respuestas celulares, los sueros de ratones después de la tercera inmunización se compararon con los sueros pre-inmunes para anticuerpos específicos contra los epítopos:

[0116] Las Figuras 5A-5C muestran que los epítopos peptídicos recombinantes suscitan protección contra anticuerpos. Una elevación significativa en el titulo de Ab, especifica para el epítopo se obtuvo con los epítopos NP 335-350 (5A), M1 2-12 (5B) y HA 91-108 (5C) en ratones inmunizados con el único epítopo de interés (200mg/ratón, IM).

Conclusiones

[0117] Los resultados de este estudio indican que la inmunización con la flagelina recombinante que contiene epítopos de linfocitos T específicos da como resultado el reconocimiento específico y respuestas celulares de tipo TH1, como se muestra por secreción de IFN-γ por linfocitos de los ratones vacunados en respuesta a estimulación in-vitro con los péptidos sintéticos respectivos. Adicionalmente, la unión especifica de los epítopos investigados a células diana que expresan HLA A2 así como la lisis especifica de estas células, cargadas con el epítopo, por linfocitos NK indican respuesta celular a la Hexa-vacuna 1 en ratones transgénicos HHD.

EJEMPLO 9: estudio de optimización de la dosis.

[0118] Este estudio se diseñó para seleccionar la dosis óptima del epítopo basado en la Hexa-vacuna, vacuna,

antigripal, que es la dosis más eficaz que confiere una respuesta inmunitaria suficiente medida por diversos ensayos inmunológicos. La realización de este estudio con la Hexa-vacuna evaluó la eficacia de la vacuna evaluando la respuesta humoral y titulación del virus en los pulmones después de una pauta de tres inmunizaciones e infección.

Diseño del estudio [0119] Ratones HHD/HLA A2.1 se inmunizaron 3 veces por vía IN e IM con 240, 80, 24 o 8 µg de Hexa-vacuna 1, que consistía en epítopos de la gripe dentro de flagelos bacterianos en PBS (véase la Tabla 5 para grupos e identificación). Se extrajo sangre para la evaluación de la respuesta humoral suscitada en los ratones vacunados. Los ratones se infectaron con el virus de la gripe H3N2 y la titulación viral en sus pulmones sirvió como una correlación para determinar la eficacia.

Tabla 5: grupos de estudio e identificaciones

Grupo Nº.: Tratamiento Vía

A: 8 µg IN

B: 24 µg IN

C: 80 µg IN

D: 240 µg IN

E: flagelos (Control) 240 µg IN

F: 8 µg IM

G: 24 µg IM

H: 80 µg IM

I: 240 µg IM

J: Flagelos (Control)240 µg IM

Respuesta inmunitaria humoral

[0120] Los aumentos de dosis de la Hexa-vacuna 1 que contenían 8-240 µg de todos epítopos combinados indujeron una respuesta humoral específica contra el virus H3N2. La respuesta en los grupos inmunizados con la dosis más alta fue significativamente superior que la de la línea basal. El cambio de titulo entre sueros preinmunizados e inmunizados se muestra en la Figura 6, que corresponde a los grupos en la Tabla 5. Una elevación significativa sobre el nivel pre-inmune (p < 0,05) y sobre los grupos de control E y J que se inmunizaron con los flagelos nativos (IN o IM respectivamente) en cuanto a reconocimiento especifico del virus de la gripe H3N2 se observó en los grupos D e I que se inmunizaron con 240 µg de la Hexa-vacuna 1 IN o IM, respectivamente.

Respuesta humoral: Reconocimiento especifico de flagelos

[0121] La respuesta humoral también se dirige hacia el transportador de flagelos. En la figura 7 se muestra se muestra el titulo en suero de los anticuerpos.

[0122] La Figura 7 muestra la respuesta humoral contra flagelos después de administración IN o IM de la Hexavacuna 1. En los grupos inmunizados por vía IN (barras en el lado izquierdo); hubo una respuesta de aumento de dosis en la que se encontró mayor producción de Ab cuando se proporcionó la dosis más alta (IN 240 µg). En los grupos administrados por vía IM (barras en el lado derecho) se observó de manera similar una respuesta alta en todas las dosis que variaban de 8 µg -240 µg /ratón. En ambos vías, las respuestas de los flagelos nativos es mucho más alta; esto puede deberse a cambios estructurales causados por la adición de epítopos extraños que pueden influenciar su inmunogenicidad.

Titulación de virus

[0123] Después de una pauta de 3 vacunaciones, los ratones se infectaron con una dosis subletal de la cepa H3N2 del virus de la gripe (A/Texas/1/77). Los pulmones de los ratones se extrajeron 5 días después para determinar la titulación de la carga viral en ellos. La titulación se realizó en huevos fertilizados (Figura 8). La carga viral en los grupos inmunizados con la Hexa-vacuna 1 (240 µg) es comparable en ambas vías IM e IN y es significativamente inferior (p < 0,05) que el titulo en los grupos control. Esto demuestra que la Hexa-vacuna 1 es eficaz y proporciona protección contra la infección viral.

Conclusiones

[0124] Anticuerpos contra virus (H3N2): fueron significativamente superiores en el grupo inmunizado con las dosis más altas tanto IM como IN, pero no en los grupos inmunizados con dosis inferiores, demostrando una respuesta de aumento de la dosis.

[0125] Eliminación del virus: en los grupos inmunizados IN e IM se encontró un titulo de virus más bajo, mientras que en animales inmunizados con dosis más bajas se detectaron títulos virales más altos.

[0126] Estos datos indican que existe una correlación entre la dosis y respuesta, en la que solo las dosis más altas conducen a una protección significativa.

[0127] Como se describe a continuación, no se advirtió pérdida de peso significativa, anomalías conductuales ni síntomas de alergia (elevación de IgE);

EJEMPLO 10: Respuesta de IgE después de inmunización

[0128] Para la evaluación de la posible respuesta alérgica al producto de la presente invención, los niveles de IgE se midieron en todos los experimentos principales realizados en ratones después de inmunización con diferentes combinaciones de epítopos o con flagelos nativos. En los diversos estudios, los ratones se inmunizaron IN o IM con los flagelos recombinantes, la IgE total en el suero se midió mediante un kit comercial de detección de IgE murina.

[0129] Los títulos más bajos de < 20 ng/ml se encontraron en los animales inmunizados similares al nivel normal en los ratones no inmunizados.

[0130] La Figura 9 presenta la concentración de IgE (ng/ml) en el experimento de dosificación y en el experimento para evaluar la respuesta celular. En ambas, los títulos de IgE el día 0 y después de la tercera inmunización fueron similares.

[0131] Los ratones se inmunizaron por vía IN o IM con la Hexa-vacuna 1 a dosis en aumento, desde 8 µg-240 µg /ratón. Los sueros de estos ratones se sometieron a ensayo para determinar la IgE total.

[0132] La Figura 10 representa la concentración de IgE en sueros de ratones transgénicos (TG) HHD inmunizados por vía IN con flagelos recombinantes que expresaban epítopos de la gripe.

Conclusiones

[0133] En las muestras de sueros de ratones inmunizados con flagelos recombinantes, se detectaron niveles bajos de IgE. El intervalo normal para IgE en plasma se estableció entre 19 y 200 ng/ml usando animales de tipo silvestre. Los títulos obtenidos en los animales inmunizados no superaron 20 ng/ml y por lo tanto, la Hexa-vacuna no induce respuestas alérgicas.

EJEMPLO 11: evaluación de la Hexa-vacuna 2 en conejos.

[0134] En este estudio, a los conejos se les administró por vía IN e IM el producto de vacuna en un entorno controlado en una instalación para animales certificada libre de patógenos específicos (SPF). Después de una pauta de 3 vacunaciones, se extrajeron muestras de sangre y especimenes del sitio de administración y se extrajeron órganos principales y se sometieron a análisis histopatológico.

[0135] Los grupos del estudio consistían en tres inmunizaciones que comparaban la Hexa-vacuna 2 (6 epítopos: HA91-108, HA307-319, HA 354-372, NP 335-350, NP 380-393, M1 2-12) con PBS:

Vía IN: Hexa-vacuna2 100 µg y 50 µg /50 µl /conejo

Vía IM: Hexa-vacuna2 600 µg y 300 µg /500 µl /conejo

[0136] No se observó mortalidad ni morbilidad en ninguno de los grupos. Los resultados Histopatológicos (2 semanas después de la inmunización) mostraron:

Intranasal: Sin toxicidad en los órganos examinados. Intramuscular: Sin toxicidad en los órganos examinados. Un animal presentó infiltrado histolítico mínimo focal en el sitio de inyección.

Conclusiones

[0137] Seguridad: Se encontró que la Hexa-vacuna 2 era inocua y tolerable en conejos. Respuesta humoral: El titulo de Ab específico para diferentes cepas de la gripe se registró en algunos de los conejos. Debe observarse que se encontraron distintas respuestas entre conejos individuales. La Figura 10 describe el factor de aumento en el titulo de anticuerpos en comparación con el titulo pre inmune en los conejos respondedores. No se excluyó a los conejos no respondedores.

[0138] Figura 11: Factor de aumento del titulo de IgG para 3 cepas diferentes de la gripe en suero de conejos NZW inmunizados 3 veces por vía IN con flagelos recombinantes que expresaban 6 epítopos de la gripe.

EJEMPLO 12: Farmacocinética

[0139] Los estudios farmacocinéticos revelaron que el punto máximo de la vacuna en suero se obtuvo a los 15 minutos y se eliminó a las 12 horas. En un estudio paralelo con la vacuna formulada con adyuvante (Alum), la concentración máxima en suero se alcanzó después de 30 minutos y la vacuna se eliminó del suero después de 24 horas (datos no mostrados). Además se calcularon los valores Cmax, Tmax y ABC como se describe a continuación.

Diseño del estudio

[0140] El estudio consistió en 10 grupos de 3 machos y 3 hembras por grupo a los que se les administró una sola dosis de de 50 µg de flagelo recombinante/animal. A los animales se les extrajo la sangre a 10 puntos de tiempo predeterminados de 5, 10, 30 minutos y 1, 2, 4, 8, 12, 24 horas.

Análisis farmacocinético

[0141] El cálculo de las características farmacocinéticas se basó en el tiempo de muestreo de sangre real [h] (relativo al tiempo de administración del tratamiento correspondiente) redondeado a dos dígitos decimales y los tiempos previos a la dosis negativos se establecieron a cero. Se usó la muestra antes de la administración para el cálculo de las características.

[0142] Para el cálculo de los parámetros farmacocinéticos se aplicaron las siguientes reglas:

[0143] Los valores de concentración de flagelina en suero en los puntos de tiempo en el tiempo de retraso entre el tiempo cero y la primera concentración cuantificable se consideraron como cero. La evaluación de la biodisponibilidad relativa se realizó para los parámetros diana primarios ABC y Cmax.

[0144] Los valores logarítmicos transformados de los parámetros diana primarios se sometieron a un análisis de modelo de varianza (ANOVA) con los efectos: secuencia, sujetos dentro de la secuencia, periodo y tratamiento. El efecto de secuencia se sometió a ensayo usando la media cuadrática de sujetos dentro de la secuencia del ANOVA como un término de error. Los otros efectos se sometieron a ensayo contra el error residual (error cuadrático medio) del ANOVA. Basándose en el ANOVA se calcularon los intervalos de confianza del 90 % para el ensayo de proporciones de tratamiento *100/referencia [%].

[0145] Para los parámetros diana primarios se proporcionó el ensayo de proporciones de tratamiento individual* 100/referencia [%] Para la frecuencia de Tmax se dibujaron tablas por tratamiento basándose en el tiempo nominal de los valores Tmax.

[0146] La Figura 12 representa la concentración en suero de proteína. La concentración en suero máxima 3,925 ng/ml (Cmax) de la Hexa-vacuna se observó después de 15 minutos (Tmax). La mitad (T1/2) de la cantidad de exposición total se obtuvo 30 minutos después de la dosis. El área bajo la curva del tiempo con respecto a la concentración de suero de 15,027 ng/ml indica la exposición total corporal a lo largo del tiempo a la Hexa-vacuna. No se detectaron rastros de proteína después de 12 h.

Conclusiones

[0147] Al final del estudio farmacocinético se obtuvo una curva de concentración típica con un aumento pronunciado de la curva entre los 5 y 15 minutos y una pendiente moderada hasta las 12 horas. El nivel de concentración máximo (Cmax = 3,925 ng/ml) se observó después de 15 minutos. No pudieron detectarse trazas de proteína en el suero 12 horas después de la post-dosificación. La vacuna basada en flagelina se eliminará totalmente del suero a las 12 horas.

Seguridad del epítopo.

[0148] Los epítopos conservados seleccionados utilizados en la Hexa-vacuna comprenden epítopos que son restrictivos para la mayoría de las moléculas HLA prevalentes en seres humanos. Los epítopos seleccionados son restrictivos para la estructura viral y no son compartidos por ninguna proteína humana por lo tanto no es probable que induzcan una reacción autoinmunitaria.

Referencias

[0149]

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Listado de secuencias

[0150]

<110>Yeda Research and Develoment Co. Ltd. at the Weizmann Institute of Science BEN-YEDIDIA, Tamar ARNON, Ruth

<120> VACUNA MEJORA CONTRA LA GRIPE

<130> BNDVX/001 PCT

<140> PCT/IL2006/

<141>

<150> 60/742.574

<151>

<150> 60/742.530

<151>

<160> 162

<170> PatentIn versión 3.3

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<212> ADN

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<212> ADN

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<212> ADN

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<400> 105 agcctgctga ccgaagtgga aacctatgtg ctt 33

<210> 106

<211> 33

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 106 agcctgctga ccgaagtgga aacctatgtg ccg 33

<210> 107

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 107 ctgctgaccg aagtggaaac ctatgtg 27

<210> 108

<211> 24

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 108 agcattgtgc cgagcggccc gctg 24

<210> 109

<211> 45

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 109 agcggcccgc tgaaagcgga aattgcgcag cgcctggaag atgtg 45

<210> 110

<211> 36

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 110 ggcccgctga aagcggaaat tgcgcagcgc ctggaa 36

<210> 111

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 111 cgcctggaag atgtgtttgc gggcaaa 27

<210> 112

<211> 30

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 112 gcgctgatgg aatggctgaa aacccgcccg 30

<210> 113

<211> 30

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 113 ccgattctga gcccgctgac caaaggcatt 30

<210> 114

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 114 attctgagcc cgctgaccaa aggcatt 27

<210> 115

<211> 57

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 115 ctgaccaaag gcattctggg ctttgtgttt accctgaccg tgccgagcga acgcggc

<210> 116

<211> 39

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 116 accaaaggca ttctgggctt tgtgtttacc ctgaccgtg 39

<210> 117

<211> 36

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 117 aaaggcattc tgggctttgt gtttaccctg accgtg 36

<210> 118

<211> 27

<212> ADN <213> GRIPE

<400> 118 ggcattctgg gctttgtgtt taccctg: 27

<210> 119 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 119 ctgggctttg tgtttaccct gaccgtg: 27

<210> 120 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 120 attctgggct ttgtgtttac cctgacc: 27

<210> 121 <211> 24 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 121 gcgagctgca tgggcctgat ttat: 24

<210> 122 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 122 cgcatgggcg cggtgaccac cgaagtg: 27

<210> 123 <211> 33 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 123 ggcctggtgt gcgcgacctg cgaacagatt gcg: 33

<210> 124 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 124 cagatggtgg cgaccaccaa cccgctg: 27

<210> 125 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 125 cagatggtgg cgaccaccaa cccgctgatt: 30

<210> 126 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 126 cgcatggtgc tggcgagcac caccgcgaaa: 30

<210> 127 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 127 gatctgctgg aaaacctgca gacctat: 27

<210> 128 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 128 agcaaagctt acagcaactg ttacccttat gatgtgccgg attatgcctc cctt: 54

<210> 129 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 129 agcaaagcgt ttagcaactg ctatccgtat gatgtgccgg attatgcgag cctg: 54

<210> 130 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 130 agcaccgcgt atagcaactg ctatccgtat gatgtgccgg attatgcgag cctg: 54

<210> 131 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 131 tggctgacgg agaaggaggg ctcataccca: 30

<210> 132 <211> 75 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 132

<400>: 133 ggcgtgaaac tggaaagcat gggcatttat cag 33

<210> 133

<211> 33

<212> ADN

<213> GRIPE

<210> 134

<211> 33

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 134 gaaatttccg gcgtgaaact ggaaagcatg ggc 33

<210> 135

<211> 30

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 135 aacgtgaaaa acctgtatga aaaagtgaaa 30

<210> 136

<211> 54

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 136 aaagtgaaaa ttctgccgaa agatcgctgg acccagcata ccaccaccgg cggc

<210> 137

<211> 39

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 137 ccgaaatatg tgaaacagaa caccctgaaa ctggcgacc 39

<210> 138

<211> 39

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 138 ccgaaatatg tgaaacagaa caccctgaaa ctggcgacc 39

<210> 139

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 139 tgcaccgaac tgaaactgag cgattat 27

<210> 140

<211> 42

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 140 catccgagcg cgggcaaaga tccgaaaaaa accggcggcc cg

<210> 141

<211> 39

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 141 catccgagcg cgggcaaaga tccgaaaaaa accggcggc 39

<210> 142

<211> 72

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 142

<210> 143 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 143 attctgcgcg gcagcgtggc gcataaa: 27

<210> 144 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 144 aaactgctgc agaacagcca ggtgtat: 27

<210> 145 <211> 45 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 145 agcgcggcgt ttgaagatct gcgcgtgctg agctttattc gcggc: 45

<210> 146 <211> 48 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 146 agcgcggcgt ttgaagatct gcgcgtgagc agctttattc gcggcacc: 48

<210> 147 <211> 48 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 147 agcgcggcgt ttgaagatct gcgcgtgctg agctttattc gcggctat: 48

<210> 148 <211> 42 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 148 gaactgcgca gccgctattg ggcgattcgc acccgcagcg gc: 42

<210> 149 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE

<400> 149 gaactgcgca gccgctattg ggcgatt: 27

<210> 150 <211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 150 agccgctatt gggcgattcg cacccgc 27

<210> 151

<211> 30

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 151 tattgggcga ttcgcacccg cagcggcggc 30

<210> 152

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 152 agccgctatt gggcgattcg cacccgc 27

<210> 153

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 153 ctgccgtttg ataaaccgac cattatg 27

<210> 154

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 154 gtgagcgatg gcggcccgaa cctgtat 27

<210> 155

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 155 cgccgcagct ttgaactgaa aaaactg 27

<210> 156

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 156 cgccgcgcga ccgcgattct gcgcaaa 27

<210> 157

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 157 cgcccgatta ttcgcccggc gaccctg 27

<210> 158

<211> 27

<212> ADN

<213> GRIPE <400> 158 gcagatagag ggctattgag agacatc 27

<210> 159

<211> 39

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 159 ccgtattata ccggcgaaca tgcgaaagcg attggcaac 39

<210> 160

<211> 57

<212> ADN

<213> GRIPE

<400> 160 ccggcgaaac tgctgaaaga acgcggcttt tttggcgcga ttgcgggctt tctggaa 57

<210> 161

<211> 509

<212> PRT

<213> salmonella muenchen

<400> 161

<210> 162

<211> 1530

<212> ADN

<213> salmonella muenchen

<400> 162

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna que comprende los epítopos peptídicos del virus de la gripe: M1 2-12 (SEC ID Nº: 25 o 26); HA 91

108 (SEC ID Nº: 48); HA 307-319 (SEC ID Nº: 57); NP 335-350 (SEC ID Nº: 67); NP 380-393 (SEC ID Nº: 68); y HA 5 354-372 (SEC ID Nº: 80).
2.

La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un adyuvante o un excipiente.
3.

La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, formulada para la administración por una modalidad selecciona del

10 grupo que consiste en administración intraperitoneal, subcutánea, intranasal, intramuscular, oral, tópica y transdérmica.
4. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para suscitar

una respuesta inmunitaria y conferir protección contra el virus de la gripe en un sujeto. 15
5. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la respuesta inmunitaria se suscita contra la gripe aviar, la gripe de tipo A, la gripe de tipo B o una de sus combinaciones.
6. El uso de la vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un agente 20 farmacéutico para suscitar una respuesta inmunitaria y conferir protección contra el virus de la gripe en un sujeto.