ES2386131B1 - Procedimiento directo de deteccion especifica del viroide peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y rt-pcr a tiempo real y kit para su deteccion. - Google Patents
Procedimiento directo de deteccion especifica del viroide peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y rt-pcr a tiempo real y kit para su deteccion. Download PDFInfo
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Abstract
Se detalla un procedimiento de preparación, conservación y análisis de muestras de material vegetal para diagnóstico y detección mediante amplificación molecular basada en RT-PCR a tiempo real. El procedimiento se ha aplicado a detección de Peach latent mosaic viroid. Las muestras son inmovilizadas en soportes de papel o nylon, mediante impresión de tejidos o de sus secciones o absorbidas en papel o nylon cuando se trata de muestras líquidas. Las muestras inmovilizadas, pueden ser conservadas a temperatura ambiente. El protocolo de análisis comienza por la extracción de dianas del soporte con agua destilada, octoxinol o tampón glicina y posterior análisis por RT-PCR a tiempo real. Se detallan las secuencias de nucleótidos de iniciadores de amplificación molecular y sonda TaqMan, en que se basa el kit de detección.
Description
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona en general con la detección de material genético (secuencias de ácidos nucleicos) mediante el empleo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real, y en particular con la preparación previa de las muestras y su conservación, antes de realizar RT-PCR cuantitativa a tiempo real. El procedimiento comprende la inmovilización directa, conservación y extracción de las dianas de interés para su amplificación molecular por RT-PCR a tiempo real. La invención, por tanto, se relaciona con: 1) un procedimiento de preparación directa de muestras mediante inmovilización en membranas de papel o nylon por impresión o escachado de material vegetal, 2) un procedimiento para analizar extractos brutos de muestras de material vegetal
o RNA purificado, inmovilizado en soportes sólidos, 3) un método de conservación de las membranas conteniendo muestras de cualquier tipo, 4) un sistema de extracción de dianas sin purificación de ácidos nucleicos y 5) unas secuencias de nucleótidos de iniciadores y sondas TaqMan específicas, para el diagnóstico y detección universal de Peach latent mosaic viro id (PLMV d), de cualquier origen o huésped, mediante un kit basado en todo lo anterior.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La patente ES 2 110 916 de 25 de mayo de 1996, de la cual fue solicitante el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) e inventores Mariano Cambra
1O
Curr.
Curro
Microbio!.
Microbiol.
Pathol.128,Patho1.128,
1.l. SEF-SEF-
149-183).
149-183).
evolutivas propias. El tamaño de los viroides oscila entre 246 y 399 nucleótidos, correspondientes respectivamente al viroide del "Cadang-cadang" (Coconut cadangcadang viro id, CCCV d) del cocotero y al viroide del moteado clorótico del crisantemo (Chrysanthemun chlorotic mottle viroid, CChMVd) (Flores et al., 2003. In: Viroids. CSIRO Publishing, Collingwood. 224-227).
PLMVd pertenece al género Pelamoviroid dentro de la familia Avsunviroidae (Flores et al., 2000. Viroids. In: Virus Taxonomy, 7th report of the Intemational Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press. San Diego, CA). Produce enfermedades económicamente importantes ya que afecta la calidad de fruto provocando decoloraciones y malformaciones en frutos de melocotonero. El viroide está presente en la mayoría de países productores de frutales de hueso. Una detallada descripción de sus síntomas y características moleculares ha sido publicada por Flores et al., 1990. (Research in Virology 141, 109-118) y Cambra et al., 20008. (Viruses and Viroids ofPeach Trees. In: The Peach, Botany, Productions and uses. CAB Intemational, London).
Los métodos de detección de viroides se basan principalmente en técnicas biológicas, bioquímicas, moleculares o en combinación de las mismas. Los viroides no posen envoltorio proteico, haciendo imposible el uso de métodos inmunológicos utilizados normalmente para la detección de virus. Las pruebas biológicas son únicamente utilizadas para detección de CEV d y otros viroides de los cítricos. Los métodos bioquímicos se basan en la realización de electroforesis secuencial en geles de poliacrilamida (sPAGE) (Semancik y Harper. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4429-4433) que permite distinguir los viroides presentes en un aislado por su movilidad electroforética. Para la detección molecular es importante considerar que el material genético de los viroides es RNA de cadena sencilla, circular y fuertemente estructurado. Entre los métodos moleculares de detección de viroides figura la hibridación molecular con sondas radiactivas
o marcadas con digoxigenina (Flores. 1988. Proc. 10th Conf. Int. Org. Citrus Virol., IOCV, 192-196; Podleckis et al., 1993. J. Virol. Methods 43, 147-158). Una interesante versión de la hibridación molecular combinada con la realización de impresiones de material vegetal fue descrita por Palacio-Bielsa et al. (1999). Eur. J. Plant Pathol. 105, 897-903. En este método se combinan técnicas biológicas de amplificación de la población de viroides en huéspedes apropiados previa a la realización de impresiones de secciones de tejido vegetal en membranas y su posterior hibridación con sondas específicas. También se ha descrito un
- sistema de hibridación "northem" con sondas marcadas con digoxigenina que permite
- detectar viroides en extractos de muestras de campo (Murcia et al., 2009. Mol. Cell Probes
- 23, 95-1 02). No obstante, todos estos métodos moleculares o híbridos poseen escasa
- sensibilidad y frecuentemente son muy laboriosos limitando el número de muestras que
- 5
- pueden ser procesadas por operario y día. La puesta a punto de la RT-PCR y su aplicación
- a la detección de viroides ha permitido incrementar la sensibilidad, aunque la detección
- rutinaria mediante esta técnica no se ha popularizado por problemas de inhibiciones que
- inducen falsos negativos y amplificaciones inespecíficas (Gamsey et al., 2002. Proc. 15th
- Conf. Int. Org. Citrus Virol., IOCV, 219-229). Además, la RT-PCR convencional posee
- 1O
- altos riesgos de contaminación (falsos positivos) (Olmos et al., 2007. In: Molecular
- diagnostic methods for plant viruses. CABI Press, London. 227-249; López et al., 2009).
- La aplicación de R T-PCR a tiempo real a la detección de viroides está en su etapa inicial,
- de hecho únicamente se han publicado tres trabajos, del mismo grupo de investigación,
- aplicados a PSTVd (Boonham et al., 2004. J. Virol. Methods 116, 139-146; OEPPIEPPO,
- 15
- 2004, y Monger et al., 2010. J. Virol. Methods doi: 10.1016/j.jviromet.2010.07.002). Para
- el método propuesto se utiliza RNA purificado que complica y encarece el coste de la
- detección y limita el número de muestras procesables diariamente por un operario.
- La presente invención proporciona un procedimiento de preparación de
- muestras de frutales de hueso para su uso directo, mediante un kit basado en R T-PCR a
- 20
- tiempo real, su conservación por largos periodos antes del análisis o como controles y su
- análisis directo tras una sencilla extracción de las dianas del viroide PLMV d directamente
- inmovilizadas en soportes sólidos.
- DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
- 25
- Así pues, en un pnmer aspecto, la presente invención proporciOna un
- procedimiento de preparación de dianas para R T-PCR a tiempo real, su conservación y su
- extracción para análisis mediante R T-PCR a tiempo real utilizando los iniciadores
- identificados como PLMV df, PLMV dr y PLMV dp para detección de PLMV d.
- 30
- El término "diana para RT-PCR" en el sentido utilizado en esta descripción, se
- refiere a fragmentos de ácidos nucleicos (ARN) desnudos o situados dentro de células de
- vegetales.
- El procedimiento comprende las siguientes etapas:
- i) Inmovilización de las dianas para RT-PCR a tiempo real de secciones impresas o de
- escachados de muestras de tejidos de vegetales que las contienen (Figura 1) o de sus
- 5
- extractos brutos;
- ii) Conservación de las dianas inmovilizadas en soportes sólidos conteniendo muestras de
- cualquier tipo;
- iii) Extracción de las dianas para posterior análisis por RT-PCR a tiempo real;
- iv) Análisis de las muestras mediante RT-PCR utilizando los iniciadores y las sondas
- 1 O
- específicas identificadas y descritas en esta invención.
- Para efectuar la inmovilización o fijación de las dianas para RT-PCR a tiempo
- real a partir de muestras vegetales o artrópodos que las contienen: secciones o la zona de
- escisión tras arrancado manual de órganos de vegetales (hojas enteras enrolladas, pedicelo
- de hojas, pedúnculo de frutos, frutos, partes de flores, brotes, tallos, corteza de raíces) se
- 15
- ponen en contacto con un soporte apropiado, bajo condiciones adecuadas y durante un
- periodo de tiempo suficiente como para que la diana para RT-PCR a tiempo real quede
- retenida sobre dicho soporte. El soporte adecuado para llevar a cabo esta etapa puede ser
- una membrana de nylon o de cualquier tipo de papel convencional, preferentemente
- Whatman 3MM por su alta capacidad de absorción de líquidos y su bajo coste. En este caso
- 20
- concreto, se ha utilizado membranas de nylon para la detección de PLMV d aunque se
- puede utilizar cualquier otro papel convencional o membranas de nitrocelulosa o de éster
- de nitrocelulosa. Las muestras pueden ser sólidas, por ejemplo, secciones frescas de tejidos
- de vegetales o tejidos de vegetales directamente escachados, o muestras líquidas, como por
- ejemplo, extractos de vegetales o ácidos nucleicos previamente purificados. Cuando la
- 25
- muestra es sólida, por ejemplo, una sección fresca de tejido de vegetal, su inmovilización
- en el soporte se realiza por impresión o escachado, es decir, presionando la muestra
- firmemente sobre el soporte durante un corto periodo de tiempo (unos segundos). En el
- caso de muestras líquidas, unos 5 microlitros del extracto bruto o de la solución purificada
- de ácidos nucleicos, se depositan directamente en el soporte quedando así retenidas por
- 30
- absorción. La operación de fijación de muestras se puede realizar directamente en
- membranas en condiciones de campo o laboratorio o en secciones de unos 5 mm2
- previamente introducidas en tubos tipo Eppendorf o en pocillos de microplacas de 96
pocillos tipo ELISA. Esta última modalidad es la más apropiada para extractos y muestras líquidas por facilitar su depósito directamente en el contenedor en el que se realizará la extracción de las dianas.
Las dianas retenidas en el soporte sólido, impresionadas, escachadas o absorbidas (membrana o trozos de la misma contenidos en tubos Eppendorf o placas ELISA) pueden ser procesadas directamente o bien pueden ser conservadas en condiciones de poca humedad y preferentemente en la oscuridad durante un período de tiempo de al menos dos años, sin que se produzca una pérdida de sensibilidad en la detección por R TPCR a tiempo real. Para ello, las membranas conteniendo las dianas se introducen en un sobre de papel para garantizar la obscuridad, se conservan a temperatura ambiente o a 4°C en un contenedor hermético con desecante tipo silicagel o cloruro de calcio. Otra modalidad consiste en introducir el sobre conteniendo las membranas con las muestras inmovilizadas en una bolsa de plástico apta para realizar vacío y efectuarlo mediante un simple aparato de vacío alimentario.
La conservación de tubos Eppendorf o placas ELISA con secciOnes de membranas impresas o absorbidas con líquidos se realiza cerrando los tubos y/o sellando las placas y manteniendo las muestras inmovilizadas en obscuridad y a temperatura ambiente en un lugar de ambiente seco.
Para la extracción de las dianas previamente fijadas en el soporte, para análisis por RT-PCR a tiempo real, se introducen secciones recortadas del soporte conteniendo las dianas en contenedores adecuados, tubos Eppendorf por ejemplo. En este caso y en el caso de haber dispensado líquido en secciones de membranas ya introducidas en tubos o microplacas E LISA, se realizará el siguiente tratamiento: 1) Dispensar 100 micro litros de agua destilada o tampón glicina 0.1 M o bien del detergente no iónico octoxinol (Tritón X100 Merck) para cubrir la sección de soporte contenida en el tubo o pocillo de microplaca, 2) Calentar a 100° C durante 10 minutos en un termobloque o al baño María. Esta operación se puede obviar en análisis de rutina, 3) Realizar agitación durante 5 segundos para asegurar el contacto del agente extractor de las dianas caliente, y 4) Realizar un pulso de centrifugación (unas 6.000 rpm en unos 5 segundos).
A continuación, con las dianas solubilizadas se procede a realizar la amplificación por RT-PCR a tiempo real de la manera que se detalla para cada uno de los agentes fitopatógenos descritos en los ejemplos.
Mediante el procedimiento desarrollado en esta invención se evita, en primer lugar, la necesidad de preparar extractos de material vegetal y purificar ácidos nucleicos, y en segundo lugar, con este procedimiento se logra una inmovilización eficiente y duradera
5 de las dianas para su posterior análisis por RT-PCR a tiempo real. Además, el protocolo diseñado permite la realización sencilla y rutinaria de numerosos análisis de forma rápida y con la alta precisión de la técnica molecular utilizada.
10 Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un dibujo en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
15 La figura 1.-Muestra impresiones de secciones de brotes de material vegetal ligeramente superpuestos (de 1 a 5 en la parte superior y de 6 a 1 O en la parte inferior) en membrana de papel Whatman 3MM.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1a.-Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, caracterizado porque comprende las etapas de: i) Inmovilización de las dianas para RT-PCR a tiempo real de muestras vegetales, en un soporte sólido, y ii) Extracción de las dianas para RT-PCR a tiempo real con agua destilada o un agente capaz de solubilizar dichas dianas.2a.-Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación P, caracterizado porque en la conservación de las dianas inmovilizadas permite largos periodos de almacenamiento y su envío por correo para posterior análisis por RT-PCR a tiempo real.3a.-Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque se emplea para analizar sistemáticamente por RT-PCR a tiempo real, dianas inmovilizadas y conservadas en tubos Eppendorf o en pocillos de placas ELISA.4a.-Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación 1\ caracterizado porque utiliza como iniciador directo para la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PLMV d la secuencia (SEQ ID N° 1) de 22 nucleótidos (posición 141-163) de la secuencia de Peach latent mosaic viroid (GenBank n° GI291165198), denominada PLMV df.sa.-Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque utiliza como iniciador reverso para la amplificación por R T-PCR a tiempo real del viroide PLMV d la secuencia (SEQ ID N° 2) de 18 nucleótidos (complementaria a la posición 199-216) de la secuencia de Peach latent mosaic viroid (GenBank no GI291165198), denominada PLMVdr.6a.-Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicación la, caracterizado porque utiliza como sonda en la amplificación por RT-PCR a tiempo real del viroide PLMVd la secuencia (SEQ ID N° 3) de 20 nucleótidos (posición 173-192) de la secuencia de Peach Latent mosaic viroid (GenBank no GI291165198), denominada PLMVdp.7a__ Procedimiento directo de detección específica de Peach latent mosaic viroid mediante dianas inmovilizadas y RT-PCR a tiempo real, según reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de dichas secuencias para la fabricación de un kit completo de diagnóstico, detección, identificación o caracterización de PLMV d u otros del género Avsunviroidae.
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