ES2386803T3

ES2386803T3 - Fragmentos proteicos poliepitópicos de las proteinas E6 y E7 de HPV , su obtencion y sus utilizaciones particularmente en vacunación

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Publication number: ES2386803T3
Application number: ES00938875T
Authority: ES
Inventors: Jeannine Choppin; Isabelle Bourgault Villada; Jean-Gérard Guillet; Francine Connan; Estelle Ferries
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1999-06-03
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2012-08-31
Anticipated expiration: 2020-05-31
Also published as: EP1181314B1; ATE448244T1; US7288258B2; EP2267132A3; EP1183368A2; US20080248044A1; FR2794370B1; CA2375627A1; AU5229400A; EP1183368B1; ES2509901T3; EP1181314A1; DE60043299D1; US20050033025A1; US6783763B1; FR2794370A1; CA2375602A1; AU5411000A; EP2267132B1; EP2267132A2

Abstract

Utilización de fragmentos poliepitópicos que contienen 6 epítopos de la proteína E6 de HPV, elegidos entre aquellos queincluyen:- el fragmento que contiene 6 epítopos delimitados por 5 los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 62, o en lasposiciones 46 y 67 de la secuencia peptídica de la proteína E6, este último fragmento estando caracterizado por lasecuencia peptídica siguiente:(46)RREVYDF AFRDLCIVYRDGNPY(67)dicho fragmento conteniendo los péptidos, cada péptido ligándose de manera estable a una al menos de lasmoléculas HLA de tipo A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los siguientes:- (46)RREVYDFAFR(55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,- (49)VYDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,- (50)YDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,- (52)FAFRDLCIV(60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7;- (54)FRDLCIVYR(62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,- (59)IVYRDGNPY(67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11y las secuencias peptídicas derivadas de los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados,- por sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos, de los fragmentos anteriormente mencionados, y/o- por modificación de al menos un enlace peptídico -CO-NH- de la cadena peptídica de los fragmentos anteriormente mencionados, particularmente por introducción de un enlace del tipo retro, o retro-inverso, y/o- por sustitución de al menos un aminoácido de la cadena peptídica de la secuencia o del fragmento anteriormentemencionado, por un aminoácido no proteinogénico, dichas secuencias derivadas conteniendo los péptidos opseudopéptidos, cada péptido ligándose específicamente a la o a las mismas moléculas del CMH que aquellasligándose a los péptidos contenidos en los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados de los cuales éstasderivan, para la preparación de un medicamento o vacuna destinado a la prevención o al tratamiento de patologíasligadas a la infección de individuos por los papillomavirus humanos; tales como las neoplasias cervicalesintraepiteliales (CIN), el cáncer invasivo del cuello del útero, las neoplasias vulvares intraepiteliales (VIN).

Description

Fragmentos proteicos poliepitópicos de las proteínas E6 y E7 de HPV, su obtención y sus utilizaciones particularmente en vacunación

[0001] La presente invención se refiere a fragmentos proteicos poliepitópicos, tales como aquellos de la proteína E6 de los papillomavirus humanos, su procedimiento de obtención, y sus utilizaciones, particularmente en el ámbito de la vacunación terapéutica o preventiva.

[0002] La invención tiene de una forma más particular como objetivo la utilización de fragmentos poliepitópicos de una proteína determinada para la preparación de medicamentos destinados a la prevención o al tratamiento de patologías en las cuales dicha proteína se reconoce por el sistema inmunitario celular.

[0003] Ventajosamente, dichos fragmentos poliepitópicos son tales que su aminoácido N-terminal corresponde al aminoácido N-terminal del epítopo situado en sentido ascendente de uno o varios otros epítopos de una región poliepitópica de dicha proteína, y su aminoácido C-terminal corresponde al aminoácido C-terminal del epítopo situado en sentido descendente del o de los epítopos anteriormente mencionados de dicha región poliepitópica.

[0004] De este modo, los fragmentos proteicos poliepitópicos anteriormente mencionados de la presente invención corresponden ventajosamente a las regiones poliepitópicas de una proteína determinada, a saber a las regiones que contienen varios epítopos reconocidos por las células T en asociación con las diferentes moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), dichas regiones estando seleccionadas entre aquellas que tienen la característica de ser degradadas in vitro en péptidos más cortos a través de proteasomas, como el proteasoma 20S, cuando el fragmento proteico testado se pone en presencia de dicho proteasoma, particularmente según el método detallado siguiente. El fragmento proteico (aproximadamente 75 1g cuando se trata de un polipéptido de aproximadamente 30 aminoácidos) se incuba a 37°C con aproximadamente 151g de proteasoma 20S (Calbiochem Ref 539150, La Jolla, CA, EEUU) en 500 1l del tampón siguiente: 20 mM de Tris-HCl pH8, 0,5 mM EDTA. Alícuotas de 50 1l son tomadas después del tiempo de incubación de 24 y 48 horas, y se analizan por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Los productos de digestión de los proteasomas se separan por RP-HPLC (Perkin Elmer) utilizando una columna C18 y un gradiente de acetonitrilo (de 0 a 100 % que contiene 0,1 % de ácido trifluoroacético, en 90 mn, índice de elución 0,8 ml/mn). Los productos de división se detectan a 214 nm por un detector de absorción (759A, Applied Biosystems).

[0005] Ventajosamente las regiones poliepitópicas definidas arriba poseen la característica de contener aminoácidos hidrófobos.

[0006] Los diferentes epítopos de la región poliepitópica de la proteína determinada, y delimitando los fragmentos proteicos poliepitópicos, son ventajosamente seleccionados entre los péptidos;

-: ligándose a una molécula determinada del CMH, particularmente a una molécula de tipo HLA determinado, y esto hasta concentraciones de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-10 M en péptido para unas concentraciones de aproximadamente 10-7 M en molécula HLA, particularmente en las condiciones descritas más adelante,

-: y formando un complejo estable con esta molécula del CMH, a saber particularmente un complejo en el cual dicho péptido queda ligado a dicha molécula durante al menos aproximadamente 3 horas a 37°C.

[0007] A título de ilustración, los epítopos anteriormente mencionados de la invención son seleccionados entre los péptidos susceptibles:

-: por una parte de asociarse con las moléculas del CMH, particularmente por puesta en marcha del método siguiente: . incubación (particularmente durante aproximadamente 2 horas a 25°C, luego aproximadamente 15 horas a 4°C) del péptido en presencia de moléculas del CMH, provenientes de la lisis de células humanas o animales, o purificadas particularmente por cromatografía de afinidad a partir de líneas celulares humanas o animales, . atrapamiento de los complejos formados en el momento de la etapa precedente en un soporte sólido recubierto de un primer anticuerpo, particularmente monoclonal, reconociendo específicamente las moléculas del CMH en su conformación dependiente de su enlace a dicho péptido, . adición sobre el soporte sólido precedente de un segundo anticuerpo marcado, particularmente por acoplamiento a un marcador radioactivo, enzimático o fluorescente, dicho anticuerpo marcado reconociendo específicamente sea las cadenas pesadas del CMH en su conformación dependiente de su enlace al péptido, sea la cadena ligera del CMH o la �2microglobulina ligándose específicamente a las diferentes cadenas pesadas del CMH en su conformación mencionada, . detección, después de enjuague del soporte sólido, de la eventual presencia del segundo anticuerpo marcado que ha quedado fijado sobre el soporte sólido, demostrando un efecto de asociación entre las moléculas del CMH y el péptido estudiado,

-: y, por otra parte, de formar un complejo con dichas moléculas del CMH, cuya estabilidad se puede evaluar por puesta en marcha de un método de seguimiento en el tiempo del enlace establecido entre el péptido y las moléculas del CMH, este

método siendo ventajosamente efectuado según un protocolo idéntico al método precedente, pero en el cual la etapa de incubación del péptido en presencia de las moléculas del CMH sobre el soporte sólido recubierto de dicho primer anticuerpo, es precedido por una etapa previa de eliminación del péptido libre susceptible de estar presente en el medio reactivo, particularmente por enjuague del soporte sólido, dicha etapa de incubación siendo efectuada (ventajosamente a una temperatura de 37°C) durante tiempos variables de 1h, 3h, 5h, 24h y 48h.

[0008] Como se ha mencionado más arriba, los epítopos de la invención deben ser reconocidos por las células T en asociación con las moléculas del CMH y asociarse a estas últimas, particularmente en el marco de la puesta en marcha de la prueba de reconocimiento descrita arriba. Esta asociación puede ser débil (detectable a concentraciones en análogos peptídicos del orden de 10-4 a 10-5 M), intermedia (detectable a concentraciones en análogos peptídicos del orden de 10-6 a 10-7 M), o fuerte (detectable a concentraciones en análogos peptídicos del orden de 10-8 a 10-9 M). Los péptidos asociados a las moléculas del CMH en el marco de la presente invención son de preferencia susceptibles de ligarse durante al menos aproximadamente 3 horas en dichas moléculas del CMH.

[0009] La invención tiene más particularmente como objeto los epítopos (de nuevo designados péptidos más arriba y a continuación) tal como se han descrito arriba y caracterizados por el hecho de que son seleccionados entre aquellos susceptibles:

-: de inducir in vitro la citólisis a través de linfocitos T citotóxicos, de células diana que presentan en su superficie el péptido anteriormente mencionado asociado a las moléculas del CMH, dichos linfocitos T citotóxicos estando ventajosamente tomados en un paciente padeciendo una patología en la cual está implicado el péptido estudiado,

-: y de inducir in vitro la secreción de citoquinas (o interleuquinas) por los linfocitos T citotóxicos anteriormente mencionados, particularmente IL-2, IL-4 o el interferón y.

[0010] Llegado el caso, los epítopos anteriormente mencionados son elegidos entre aquellos capaces de inducir in vitro la aparición y el crecimiento de linfocitos T citotóxicos a partir de células humanas o animales, particularmente a partir de células mononucleadas provenientes de la sangre periférica (PBMC), en presencia de factores necesarios para el crecimiento y la diferenciación de las células T citotóxicas.

[0011] Los fragmentos proteicos poliepitópicos de la invención están aún más caracterizados por el hecho de que son susceptibles de contener los epítopos CD4 reconocidos por las células T auxiliares en asociación con las moléculas del CMH de clase II, esta propiedad favoreciendo la inducción y el mantenimiento de las células T CD8+ reconociendo los epítopos comprendidos en dichos fragmentos.

[0012] La presente invención se ilustra con ayuda de la figura 1 representando la secuencia peptídica de la proteína E6 de la cepa 16 de los papillomavirus humanos (HPV 16), así como los fragmentos poliepitópicos de la invención, y los epítopos dentro de estos fragmentos.

[0013] La invención tiene de una forma más particular como objetivo los fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 de HPV, y de una forma más particular aquellos de la proteína E6 representada en la figura 1, o por la SEC ID NO: 2, de HPV 16, caracterizados por el hecho de que comprenden una secuencia peptídica de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos, esta secuencia peptídica conteniendo las secuencias en aminoácidos de al menos 3 epítopos diferentes, y de preferencia de al menos 4 epítopos diferentes que se ligan de manera estable a las moléculas HLA de tipo idéntico o diferente, cuando estos epítopos se obtienen por degradación enzimática de dicha secuencia peptídica, particularmente en el proteasoma, de modo que al menos 4 moléculas de HLA de diferentes tipos, y de preferencia al menos 5 moléculas de HLA de diferentes tipos, se ligan a estos epítopos, estas 4 o 5 moléculas de HLA estando elegidas entre aquellas de tipo A1, A2, A3, A11, A24, A29, B7, B8, B18, B27, B35, B44, B51, y B62.

[0014] Ventajosamente, los fragmentos poliepitópicos según la invención son tales que el número de aminoácidos de su secuencia peptídica es superior o igual a 17, e inferior o igual a 30.

[0015] La invención se refiere de una forma más particular a los fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 de HPV definidos arriba, caracterizados por el hecho de que comprenden una secuencia peptídica de aproximadamente 15 a 30 aminoácidos, esta secuencia peptídica conteniendo las secuencias en aminoácidos de al menos 6 epítopos diferentes que se ligan de manera estable a las moléculas de HLA de tipo idéntico o diferente, cuando estos epítopos se obtienen por degradación enzimática de dicha secuencia peptídica, particularmente en el proteasoma, de modo que al menos 6 moléculas de HLA de diferentes tipos, y de preferencia al menos 7 moléculas de HLA de diferentes tipos se ligan a estos epítopos, estas 6 o 7 moléculas de HLA estando elegidas entre aquellas de tipo A1, A2, A3; A11; A24; A29, B7, B8; B18; B27; B35; B44, y B51.

[0016] Ventajosamente, los fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 según la invención, son tales que el número de aminoácidos de su secuencia peptídica es superior o igual a 20 (de preferencia superior o igual a 22), e inferior o igual a 30.

[0017] Ventajosamente de nuevo, los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados de la proteína E6 de HPV, se caracterizan por el hecho de que comprenden todos un epítopo que se liga a la molécula de HLA de tipo B35, un epítopo que se liga a la molécula de HLA de tipo B44, y un epítopo que se liga a la molécula de HLA de tipo B51.

[0018] La invención se refiere igualmente al fragmento poliepitópico de la proteína E6 de HPV como se define más arriba, caracterizado por el hecho que corresponde al fragmento de 17 aminoácidos delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 62, o al fragmento de 22 aminoácidos delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 67 de la secuencia peptídica de la proteína E6 de HPV, este último fragmento estando caracterizado por la secuencia peptídica SEC ID NO: 6 siguiente:

(46)RREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY(67)

dicho fragmento que contiene 6 epítopos que se ligan de manera estable a al menos una de las 10 moléculas de HLA de los tipos sucesivos: A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los sucesivos:

-: (46)RREVYDFAFR(55) se ligan de manera estable a las moléculas de HLA de tipo B27,

-: (49)VYDFAFRDL(57) se ligan de manera estable a las moléculas de HLA de tipo A24,

-: (50)YDFAFRDL(57) se ligan de manera estable a las moléculas de HLA de tipo A29, o B44,

-: (52)FAFRDLCIV(60) se ligan de manera estable a las moléculas de HLA de tipo A2, B35, B51, o B7,

-: (54)FRDLCIVYR(62) se ligan de manera estable a las moléculas de HLA de tipo A3, o A11,

-: (59)IVYRDGNPY(67) se ligan de manera estable a las moléculas de HLA de tipo A3, o A11.

[0019] La invención se refiere a igualmente las secuencias peptídicas derivadas de los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados de la proteína E6 (particularmente;

-: por sustitución, y/o supresión, y/o adición de uno o varios aminoácidos, de los fragmentos anteriormente mencionados, y/o

-: por modificación de al menos un enlace peptídico -CO-NH- de la cadena peptídica de los fragmentos anteriormente mencionados, particularmente por introducción de un enlace del tipo retro, o retro-inverso, y/o

-: por sustitución de al menos un aminoácido de la cadena peptídica de la secuencia o del fragmento anteriormente mencionado, por un aminoácido no proteinogénico, dichas secuencias derivadas conteniendo los péptidos o pseudopéptidos se ligan específicamente a la o a las mismas moléculas del CMH que aquellas que se ligan a los péptidos contenidos en los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados de los cuales derivan.

[0020] Por secuencia derivada por introducción de un enlace retro-inverso, se debe entender todo análogo peptídico de un fragmento anteriormente mencionado, dicho análogo estando constituido de una cadena peptídica en la cual uno al menos de los residuos por una parte se liga con al menos un residuo vecino por un enlace -NH-CO-, y por otra parte, es de quiralidad opuesta a aquella de este mismo residuo de aminoacilo en la cadena peptídica del péptido padre (a saber del fragmento anteriormente mencionado del cual ésta deriva).

[0021] Por secuencia derivada por introducción de un enlace retro, se debe entender todo análogo peptídico de un fragmento anteriormente mencionado, dicho análogo estando constituido de una cadena peptídica en la cual uno al menos de los residuos, se liga con al menos un residuo vecino por un enlace -NH-CO-, la quiralidad de la totalidad de los residuos de aminoacilos implicados en al menos un enlace -NH-CO- estando conservada respecto a los residuos correspondientes de la cadena peptídica del péptido padre.

[0022] Es evidente que los enlaces -CO-NH- y -NH-CO- se deben tener en cuenta en lo que precede, en el sentido de la cadena peptídica madre que va desde la extremidad aminoterminal (N-terminal) hacia la extremidad carboxiterminal (Cterminal).

[0023] Por "aminoácido proteinogénico", se entiende, en lo que precede, todo aminoácido incluido en la constitución de una proteína o de un péptido natural.

[0024] Por "aminoácido no proteinogénico", se entiende por oposición a la definición precedente, todo aminoácido no incluido en la constitución de una proteína o de un péptido natural. Se entiende de una forma más particular por "aminoácido no proteinogénico", todo aminoácido cuyo carbono que lleva la cadena lateral R, a saber el grupo -CHR-, situado entre -COy -NH- en la cadena peptídica natural, se reemplaza por un motivo no incluido en la constitución de una proteína o de un péptido natural.

[0025] La invención tiene de una forma más particular como objetivo las secuencias derivadas tal como se describe arriba, caracterizadas por el hecho de que uno al menos de los enlaces peptídicos -CO-NH- de la cadena peptídica del péptido padre se reemplaza por un enlace diferente del enlace -CO-NH-, dicho enlace diferente estando particularmente elegido

entre los siguientes:

-: CH2-NH-(metileno amino); -CH2-CH2-(carba); -CO-CH2-(cetometileno); -CH2O (metileno-oxi); -CHOH-CH2-(hidroxietileno); -CHOH-CHOH-(di-hidroxietileno); -CH=CH-(E o Z olefina); -CHCN-NH-(cianometileno amino); -S-CH2-(tiometileno); -CH2-S-(metileno tio); -CS-NH-(tioamida); -PO2-NH-(fosfonamida); -CHOH-(hidroximetileno);

(úrea);

(oxirano);

(tetrazol);

-CH2-CO-NH: ( -homologación);

-CHOH-CH2-NH: (hidroxietileno amino);

-CO-NH-NH: (hidrazino).

[0026] La invención tiene igualmente como objetivo las secuencias nucleótidas codificando para un fragmento poliepitópico de la proteína E6, o para una secuencia peptídica derivada, tal como se define arriba, dichas secuencias nucleótidas provenientes de la secuencia SEC ID NO: 1 codificando para la proteína E6.

[0027] Por ello, la invención tiene de una forma más particular como objetivo la secuencia nucleótida definida más abajo,

-: la secuencia SEC ID NO: 5, codificando para el fragmento poliepitópico SEC ID NO: 6 anteriormente mencionado de la proteína E6,

[0028] La invención tiene igualmente como objetivo todo vector, particularmente plásmido, cósmido o fago, que contiene al menos una secuencia nucleótida mencionada colocada bajo el control de los elementos necesarios para la transcripción de dicha secuencia, particularmente bajo el control de un promotor y de un terminador de transcripción.

[0029] La invención se refiere igualmente a las células huéspedes, particularmente bacterias, virus, levaduras, células eucariotas, transformadas con ayuda de un vector anteriormente mencionado según la invención, de manera que integre de manera estable en su genoma o que mantenga de manera estable en su citoplasma, al menos una secuencia nucleótida según la invención.

[0030] La invención se refiere igualmente a todo vector que incluye uno o varios fragmentos poliepitópicos y/o una o varias secuencias peptídicas derivadas tal como se define arriba, o todo vector que incluye una o varias secuencias nucleótidas anteriormente mencionadas, dichos vectores estando elegidos entre aquellos capaces de asegurar una protección de dichos fragmentos o secuencias nucleótidas en el organismo y/o su penetración en las células del organismo.

[0031] En el caso de la utilización de fragmentos poliepitópicos y/o de secuencias peptídicas derivadas anteriormente mencionadas, tales vectores son elegidos entre los ácidos grasos (en el marco de la preparación de lipopéptidos), los liposomas etc.

[0032] Por ello, la invención tiene de una forma más particular como objetivo todo lipopéptido caracterizado por el hecho de que comprende:

-: una parte peptídica que incluye uno o varios fragmentos proteicos poliepitópicos elegidos entre aquellos definidos arriba, o toda secuencia peptídica derivada de dichos fragmentos tal y como está definido arriba,

-: y una o varias partes lipófilas, ventajosamente elegidas entre aquellas que incluyen:

* una cadena hidrocarbonada en C4 a C20, saturada o insaturada, lineal o ramificada, * o un grupo esteroide, en su caso ligado a la cadena hidrocarbonada mencionada,

5 dichas partes lipófilas estando eventualmente asociadas a un corto péptido vector (para formar de este modo motivos lipopeptídicos vectores) incluyendo una o varias funciones ionizadas con pH fisiológico, y una función que permite la fijación covalente de dicha cadena hidrocarbonada y/o de dicho grupo esteroide.

[0033] Por parte lipófila, en lo que precede y en lo que sigue, se entiende toda molécula lipófila, insoluble en agua, que permite, cuando ésta se liga a la parte peptídica definida arriba, un paso intracelular pasivo del lipopéptido obtenido, gracias a las propiedades hidrófobas de dicha molécula. Ventajosamente el lipopéptido resultante del enlace de la parte lipófila a la parte peptídica, es soluble en agua.

[0034] De preferencia, la cadena hidrocarbonada de las partes lipófilas, se elige entre aquellas de:

-: el ácido palmítico,

-: el ácido oleico,

-: el ácido linoléico,

-: el ácido linolénico.

[0035] De preferencia igualmente, el grupo esteroide de la o de las partes lipófilas, es elegido entre los derivados del colesterol como el ácido colest-5-enil-3-oxi acético, o el ácido colest-5-enil-3-oxicarbónico.

[0036] La invención tiene de una forma más particular como objetivo todo lipopéptido como se describe arriba, caracterizado por el hecho de que la o las partes lipófilas se ligan de manera covalente a uno o varios aminoácidos de la parte peptídica.

[0037] Ventajosamente, la o las partes lipófilas se ligan de manera covalente a la función aNH2 o ENH2 de una lisina situada en posición N-terminal o C-terminal de la parte peptídica, o a la función tiol de una cisteína, o a toda función amino, alcohol o tiol eventualmente añadida al péptido con un espaciador sencillo.

[0038] Por ello, la invención tiene de una forma más particular como objetivo todo lipopéptido como se define arriba, en el cual la o las partes lipófilas se representan por un grupo Na-acetil-Lisina NE (palmitoil) (de nuevo designado por la abreviatura Ac-K(Pam)).

[0039] La presente invención tiene igualmente como objetivo, micelas o microagregados de uno o varios lipopéptidos diferentes definidos arriba.

[0040] Ventajosamente, dichas micelas o microagregados tienen un tamaño inferior a aproximadamente 11m.

[0041] De preferencia, las micelas o microagregados según la invención, son tales que obtenidos por dispersión de dichos lipopéptidos en una solución de ácido acético concentrada a aproximadamente 80%, o cualquier otro solvente capaz de asegurar una dispersión molecular de los lipopéptidos en solución.

[0042] En el caso de la utilización de secuencias nucleótidas definidas arriba según la invención, los vectores anteriormente mencionados son elegidos entre los virus, particularmente los retrovirus, los adenovirus y los virus asociados (AAV Adeno Associated Virus).

[0043] La invención tiene igualmente como objetivo los anticuerpos dirigidos contra los fragmentos proteicos poliepitópicos o los epítopos o sus secuencias peptídicas derivadas (o análogos) tal como se define arriba, dichos anticuerpos siendo tales como se obtiene por inmunización de un animal con al menos uno de los complejos anteriormente mencionados, dichos anticuerpos siendo susceptibles de formar un complejo con estos fragmentos poliepitópicos o estos epítopos o sus análogos.

[0044] Los anticuerpos según la invención son los anticuerpos policlonales o monoclonales.

[0045] Los anticuerpos policlonales anteriormente mencionados se obtienen por inmunización de un animal con al menos un fragmento proteico poliepitópico o un epítopo o un análogo según la invención, seguido de la recuperación de los anticuerpos buscados en forma purificada, por extracción del suero de dicho animal, y separación de dichos anticuerpos de los otros componentes del suero, particularmente por cromatografía de afinidad sobre una columna sobre la cual se fija un antígeno específicamente reconocido por los anticuerpos, particularmente un fragmento proteico poliepitópico o un epítopo o un análogo según la invención.

[0046] Los anticuerpos monoclonales según la invención pueden ser obtenidos por la técnica de los hibridomas cuyo principio general se recuerda a continuación.

[0047] En primer lugar, se inmuniza un animal, habitualmente un ratón, (o células en cultivo en el marco de inmunizaciones in vitro) con un fragmento proteico poliepitópico o un epítopo o un análogo según la invención, contra los cuales los linfocitos B del animal son entonces capaces de producir los anticuerpos. Estos linfocitos productores de anticuerpos son a continuación fusionados con células mielomatosas "inmortales" (particularmente murinas) para dar lugar a los hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células obtenida de este modo, se efectúa entonces una selección de las células capaces de producir unos anticuerpos particulares y de multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma es multiplicado bajo la forma de clones, cada uno conduciendo a la producción de unos anticuerpos monoclonales cuyas propiedades de reconocimiento frente al fragmento proteico poliepitópico o epítopo o análogo de la invención podrán ser testadas por ejemplo en ELISA, por inmunotransferencia en una o dos dimensiones, en inmunofluorescencia, o con ayuda de un biocaptador. Los anticuerpos monoclonales seleccionados de este modo, son después purificados particularmente según la técnica de cromatografía de afinidad descrita arriba.

[0048] La invención se refiere igualmente a la utilización de uno o varios anticuerpos anteriormente mencionados para la puesta en marcha de un método de diagnóstico in vitro de las patologías anteriormente mencionadas.

[0049] Por ello la invención tiene igualmente como objetivo estuches o kits que incluyen dichos anticuerpos, para la puesta en marcha de un método de diagnóstico tal y como se define arriba.

[0050] La invención se refiere igualmente a las composiciones farmacéuticas, o vacunas, caracterizadas por el hecho de que comprenden:

* a)

-: al menos un fragmento poliepitópico de la proteína E6 como se define arriba,

-: y/o al menos una secuencia peptídica derivada de este fragmento, tal y como se define arriba,

-: y/o al menos un vector apropiado, particularmente de los lipopéptidos y/o micelas definidas arriba, que contiene al menos un fragmento poliepitópico anteriormente mencionado de la proteína E6, y/o al menos una secuencia derivada mencionada de estos fragmentos, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable, dicho fragmento proteico poliepitópico y/o su secuencia derivada estando en su caso asociados a uno o varios otros epítopos exógenos reconocidos por células T auxiliares (de nuevo designadas epítopos CD4 o T helper), dichos epítopos estando elegidos particularmente entre los siguientes: . el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 830 y 846 de la secuencia peptídica de la toxina tetánica, dicho fragmento respondiendo a la fórmula siguiente: QYIKANSKFIGITELKK, . la hemaglutinina (Prevost-Blondel et aL, 1995, J. Virol., 62; n°12, págs. 8046-8055), . el epítopo PADRE (Alexander et al., 1994, Immunity, 1, 751).

* o b)

-: al menos una secuencia nucleótida tal y como se define arriba, codificando para un fragmento poliepitópico anteriormente mencionado de la proteína E6,

-: y/o al menos una secuencia nucleótida codificando para una secuencia peptídica derivada de este fragmento, tal y como se define arriba, las secuencias nucleótidas anteriormente mencionadas que pueden ser utilizadas desnudas, como minigenes,

-: y/o al menos un vector apropiado anteriormente mencionado, elegido particularmente entre los virus tal como se define más arriba, conteniendo al menos una secuencia nucleótida mencionada, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable,

* o c)

-: anticuerpos definidos arriba, dirigidos contra un fragmento poliepitópico de la proteína E6, y/o contra una secuencia peptídica derivada de estos fragmentos, tal como se define arriba, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable.

[0051] Ventajosamente las composiciones farmacéuticas, o vacunas, anteriormente mencionadas, se presentan bajo una forma administrable por vía subcutánea, particularmente a razón de varias inyecciones (ventajosamente 3 inyecciones) de aproximadamente 500 1g del fragmento poliepitópico en forma lipopeptídica, con aproximadamente un mes de intervalo.

[0052] La invención tiene de una forma más particular como objetivo la utilización de fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 definidos arriba, o de secuencias peptídicas derivadas anteriormente mencionadas, o de secuencias nucleótidas definidas más arriba, o de anticuerpos anteriormente mencionados, o de lipopéptidos definidos arriba, para la preparación de un medicamento o vacuna destinado a la prevención o al tratamiento de patologías ligadas a la infección de individuos por los papillomavirus humanos, tales como las neoplasias cervicales intraepiteliales (CIN), el cáncer invasivo del cuello del útero, las neoplasias vulvares intraepiteliales (VIN).

[0053] La invención se refiere a igualmente los péptidos o epítopos de la proteína E6 de HPV elegidos entre los siguientes:

-: (46)RREVYDFAFR(55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

-(49)VYDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

-: (50)YDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, B44,

-: (52)FAFRDLCIV(60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51,

-: (54)FRDLCIVYR(62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, A11,

-: (59)IVYRDGNPY(67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, A11,

[0054] La invención se refiere igualmente a las secuencias peptídicas derivadas de los péptidos anteriormente mencionados, dichas secuencias derivadas, o análogos, siendo tal como se define arriba en el marco de las secuencias derivadas de los fragmentos proteicos poliepitópicos anteriormente mencionados.

[0055] La invención tiene igualmente como objetivo las secuencias nucleótidas que codifican para los péptidos de la proteína E6 anteriormente mencionada, a saber:

-: la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 136 y 165 de la secuencia SEQ ID NO: 1, codificando para (46)RREVYDFAFR(55),

-: la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 145 y 171 de la secuencia SEC ID NO: 1, codificando para (49)VYDFAFRDL(57), que codifica para (49)VYDFAFRDL(57)

-: la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 148 y 171 de la secuencia SEC ID NO: 1, codificando para (50)YDFAFRDL(57),

-: la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 154 y 180 de la secuencia SEQ ID NO: 1, codificando para (52)FAFRDLCIV(60),

-: la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 160 y 186 de la secuencia SEC ID NO: 1, codificando para (54)FRDLCIVYR(62),

-: la secuencia delimitada por los nucleótidos situados en las posiciones 175 y 201 de la secuencia SEC ID NO: 1, codificando para (59)IVYRDGNPY(67),

[0056] La invención tiene igualmente como objetivo todo procedimiento de preparación de fragmentos poliepitópicos, de epítopos sencillos (péptidos anteriormente mencionados), o de secuencias derivadas, por síntesis peptídica tradicional en fase líquida o en fase sólida.

[0057] En una variante, los fragmentos poliepitópicos, epítopos sencillos, o secuencias peptídicas derivadas, tal como se define arriba según la invención, pueden ser obtenidos en forma de polipéptidos recombinantes por transformación de células huéspedes apropiadas tal como se define arriba con ayuda de vectores que contienen una secuencia nucleótida recombinante tal y como se define arriba según la invención, y recuperación, en su caso después de la purificación, del polipéptido recombinante codificado por dicha secuencia nucleótida y producido por las células huéspedes anteriormente mencionadas.

LISTA DE SECUENCIAS

[0058]

<110> BIOVECTOR THERAPEUTICS INSERM

<120> FRAGMENTOS PROTEICOS POLIEPITÓPICOS DE LA PROTEÍNA E6 O E7 DE HPV, SU OBTENCIÓN Y SUS UTILIZACIONES PARTICULARMENTE EN VACUNACIÓN

<130> WOB EPIT 2

<140>

<141>

<150> FR 9907012

<151> 1999-06-03

<160> 18

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 477

<212> ADN

<213> Papillomavirus humano

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (477)

<400> 1

<210> 2

<213> Papillomavirus humano

<400> 2

10 <210> 3

<211> 90

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E6 de HPV y secuencia peptídica correspondiente

<220> 20 <221> CDS

<222> (1) .. (90)

<400> 3

<210> 4

<211> 30

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

10 <400> 4

<210> 5

<211> 66

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E6 de HPV y secuencia peptídica

correspondiente 20

<220>

<221> CDS

<2.22> (1) .. (66)

25 <400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

35 <400> 6

<210> 7

<211> 87

<212> AD:

<213> Secuencia artificial

<220>

5 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E6 de HPV y secuencia peptídica correspondiente

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(87)

<400> 7

<210> 8 15 <211> 29

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E6 de HPV y secuencia peptídica 20 correspondiente

<400> 8

<210> 9 25 <211> 66

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

30 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E6 de HPV y secuencia peptídica correspondiente

<220>

<221>: CDS 35 <222> (1)..(66)

<400> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 10

<210> 11

<213> Papillomavirus humano

<220>

<221>: CDS 15 <222> (1)..(297)

<400> 11

<212> PRT

<213> Papillomavirus humano

<400> 12

<210> 13

<211> 69

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E7 de HPV y secuencia peptídica

correspondiente 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(69)

15 <400> 13

<210> 14

<211> 23

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E7 de HPV y secuencia peptídica correspondiente

25 <400> 14

<210> 15

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

5 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E7 de HPV y secuencia peptídica correspondiente

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (51)

<400> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E7 de HPV y secuencia peptídica 20 correspondiente

<400> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

30 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E7 de HPV y secuencia peptídica correspondiente

<220>

<221> CDS 35 <222> (1) .. (57)

<400> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de la secuencia que codifica para E7 de HPV y secuencia peptídica 45 correspondiente

<400> 18

Claims

REIVINDICACIONES

1. Utilización de fragmentos poliepitópicos que contienen 6 epítopos de la proteína E6 de HPV, elegidos entre aquellos que incluyen:

- el fragmento que contiene 6 epítopos delimitados por los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 62, o en las posiciones 46 y 67 de la secuencia peptídica de la proteína E6, este último fragmento estando caracterizado por la secuencia peptídica siguiente:

(46)RREVYDF AFRDLCIVYRDGNPY(67) dicho fragmento conteniendo los péptidos, cada péptido ligándose de manera estable a una al menos de las moléculas HLA de tipo A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los siguientes:

-

(46)RREVYDFAFR(55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

-

(49)VYDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

-

(50)YDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,

-

(52)FAFRDLCIV(60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7;

-

(54)FRDLCIVYR(62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,

-

(59)IVYRDGNPY(67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11 y las secuencias peptídicas derivadas de los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados,

-

por sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos, de los fragmentos anteriormente mencionados, y/o

-

por modificación de al menos un enlace peptídico -CO-NH- de la cadena peptídica de los fragmentos anteriormente mencionados, particularmente por introducción de un enlace del tipo retro, o retro-inverso, y/o

-

por sustitución de al menos un aminoácido de la cadena peptídica de la secuencia o del fragmento anteriormente mencionado, por un aminoácido no proteinogénico, dichas secuencias derivadas conteniendo los péptidos o pseudopéptidos, cada péptido ligándose específicamente a la o a las mismas moléculas del CMH que aquellas ligándose a los péptidos contenidos en los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados de los cuales éstas derivan, para la preparación de un medicamento o vacuna destinado a la prevención o al tratamiento de patologías ligadas a la infección de individuos por los papillomavirus humanos; tales como las neoplasias cervicales intraepiteliales (CIN), el cáncer invasivo del cuello del útero, las neoplasias vulvares intraepiteliales (VIN).
2.

Utilización de fragmentos poliepitópicos según la reivindicación 1 caracterizada por el hecho de que el número de aminoácidos de la secuencia peptídica de dichos fragmentos es superior o igual a 17 e inferior o igual a 30.
3.

Utilización de fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 de HPV según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por el hecho de que dicho fragmento contiene 6 epítopos, cada epítopo ligándose de manera estable a una al menos de las 10 moléculas HLA de los tipos sucesivos: A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los sucesivos:

-

(46)RREVYDFAFR(55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

-

(49)VYDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

-

(50)YDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,

-

(52)FAFRDLCIV(60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7;

-

(54)FRDLCIVYR(62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,

-

(59)IVYRDGNPY(67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11.
4. Fragmentos poliepitópicos que contienen 6 epítopos de la proteína E6 de HPV, elegidos entre aquellos que incluyen:

-

el fragmento que contiene 6 epítopos delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 46 y 62, o en las posiciones 46 y 67 de la secuencia peptídica de la proteína E6, este último fragmento estando caracterizado por la secuencia peptídica siguiente:

(46)RREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY(67) dicho fragmento conteniendo los péptidos, cada péptido ligándose de manera estable a una al menos de las moléculas HLA de tipo A2, A3, A11, A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, y

-

las secuencias peptídicas derivadas de los fragmentos poliepitópicos anteriormente mencionados,

-

por sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos, de los fragmentos anteriormente mencionados, y/o

-

por modificación de al menos un enlace peptídico -CO-NH- de la cadena peptídica de los fragmentos anteriormente mencionados, particularmente por introducción de un enlace del tipo retro, o retro-inverso, y/o

-

por sustitución de al menos un aminoácido de la cadena peptídica de la secuencia o del fragmento anteriormente mencionado, por un aminoácido no proteinogénico, dichas secuencias derivadas conteniendo los péptidos o pseudopéptidos ligándose específicamente a la o a las mismas moléculas del CMH que aquellas ligándose a los péptidos contenidos en los fragmentos poliepitópicos mencionados arriba de los cuales éstas derivan.
5.

Fragmentos poliepitópicos según la reivindicación 4 caracterizados por el hecho de que el número de aminoácidos de la secuencia peptídica de dichos fragmentos es superior o igual a 17 e inferior o igual a 30.
6.

Fragmentos poliepitópicos de la proteína E6 de HPV según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, dicho fragmento conteniendo 6 epítopos, cada epítopo ligándose de manera estable a una al menos de las 10 moléculas HLA de los tipos siguientes: A2, A3, A11; A24, A29, B7, B27, B35, B44, o B51, dichos epítopos siendo los siguientes:

-

(46)RREVYDFAFR(55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

-

(49)VYDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A24,

-

(50)YDF AFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, o B44,

-

(52)FAFRDLCIV(60) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A2, B35, B51, o B7,

-

(54)FRDLCIVYR(62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11,

-

(59)IVYRDGNPY(67) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, o A11.
7.

Secuencias nucleótidas que codifican para un fragmento poliepitópico o para una secuencia peptídica derivada según la reivindicación 4.
8.

Anticuerpos, policlonales o monoclonales, dirigidos contra un fragmento poliepitópico o contra una secuencia peptídica derivada según la reivindicación 4.
9.

Composición farmacéutica, o vacuna, caracterizada por el hecho de que comprende: a)

-

al menos un fragmento poliepitópico de la proteína E6 definido en la reivindicación 4,

-

y/o al menos una secuencia peptídica derivada de este fragmento, tal y como se define en la reivindicación 4,

-

y/o al menos un vector apropiado, particularmente de los lipopéptidos y/o micelas, que contiene al menos un fragmento poliepitópico anteriormente mencionado de la proteína E6, y/o al menos una secuencia derivada mencionada de estos fragmentos, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable, dicho fragmento proteico poliepitópico y/o su secuencia derivada estando en su caso asociados a uno o varios otros epítopos exógenos reconocidos a través de células T auxiliares, tales como el fragmento peptídico delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 830 y 846 de la secuencia peptídica de la toxina tetánica, la hemaglutinina, o el epítopo PADRE,

o b)

-

al menos una secuencia nucleótida según la reivindicación 7, codificando para un fragmento poliepitópico anteriormente mencionado de la proteína E6,

-

y/o al menos una secuencia nucleótida codificando para una secuencia peptídica derivada de este fragmento, tal y como está definido arriba,

-

y/o al menos un vector apropiado anteriormente mencionado, elegido particularmente entre el virus, que contiene al menos una secuencia nucleótida mencionada, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable,

o c)

-

anticuerpos según la reivindicación 8, dirigidos contra un fragmento poliepitópico de la proteína E6, y/o contra una secuencia peptídica derivada de estos fragmentos, tal como se define arriba.
10. Epítopos de la proteína E6 de HPV elegidos entre los siguientes:

-

(46)RREVYDFAFR(55) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo B27,

-

(50)YDFAFRDL(57) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A29, B44,

-

(54)FRDLCIVYR(62) ligándose de manera estable a las moléculas HLA de tipo A3, A11.