ES2387329T3 - Composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para usar en un procedimiento de tratar un trastorno que se caracteriza por unaexcesiva formación de vasos sanguíneos, en la que la composición comprende una molécula capaz de regularpor disminución un nivel y/o la actividad de LOR-1, en la que la molécula se selecciona de.(a) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a, y al menos inhibir parcialmente la actividadde, LOR-1;(b) un oligonucleótido sintético que hibrida con ADN bicatenario del gen LOR-1;(c) un oligonucleótido antisentido o análogo del mismo que impide la transcripción del ARNm de LOR-1,impide la traducción de ARNm de LOR-1, conduce a la escisión enzimática de un híbrido con ARNm de LOR-1 o conduce a la interferencia con el correcto corte y empalme del ARNm de LOR-1;(d) una ribozima que inhibe la expresión de LOR-1 mediante escisión del ARNm de LOR-1;(e) un oligonucleótido de ARN que activa los mecanismos del ARN de interferencia (ARNi), en el que losmecanismos del ARNi regulan por disminución de la expresión de LOR-1; y(f) una construcción de ácido nucleico que expresa el oligonucleótido antisentido de (c).

Description

Composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y procedimientos útiles para modular la angiogénesis.

En un adulto, la formación de nuevos vasos sanguíneos en tejidos normales o enfermos está regulada por dos procesos, a saber, la vasculogénesis (la transformación de arteriolas preexistentes en pequeñas arterias musculares) y la angiogénesis, el brote de vasos sanguíneos existentes (que se produce en el embrión y en el adulto).

El proceso de la angiogénesis está regulado por estímulos biomecánicos y bioquímicos. Los factores angiogénicos, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) son liberados por células vasculares, macrófagos y vasos sanguíneos que rodean las células. Estos factores angiogénicos activan proteasas específicas que están implicadas en la degradación de la membrana basal. Como resultado de esta degradación, las células vasculares migran y proliferan de modo que conducen a la formación de un nuevo vaso sanguíneo. Las células periendoteliales, tal como los pericitos en los capilares, las células de músculo liso en los vasos más grandes y los miocitos cardíacos en el corazón son reclutadas para proporcionar funciones de mantenimiento y moduladoras al vaso en formación.

El establecimiento y el remodelado de los vasos sanguíneos están controlados por las señales paracrinas, muchas de las cuales están mediadas por los ligandos proteicos que modulan la actividad de los receptores transmembrana de tirosina quinasa. Entre estas moléculas se encuentran el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus familias de receptores (VEGFR-1, VEGFR-2, neuropilina-1 y neuropilina-2), angiopoyetinas 1-4 (Ang-1, Ang-2 etc.) y sus respectivos receptores (Tie-1 y Tie-2), el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento transformante � (TGF-�).

El crecimiento de tumores sólidos está limitado por la disponibilidad de nutrientes y de oxígeno. Cuando las células dentro de los tumores sólidos comienzan a producir factores angiogénicos o cuando los niveles de inhibidores de la angiogénesis disminuyen, se altera el equilibrio entre las influencias antiangiogénicas y angiogénicas, lo que inicia el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir del lecho vascular existente en el tumor. Este acontecimiento en la progresión tumoral se conoce como desplazamiento angiogénico (1,2). Se había demostrado que los inhibidores de la angiogénesis tumoral son capaces de inhibir completamente el crecimiento tumoral en ratones (3,4) y también inhiben la metástasis tumoral, un proceso que depende del estrecho contacto entre la vasculatura y las células tumorales (5). También se ha demostrado que la angiogénesis desempeña un papel importante en la progresión del cáncer de mama (6-9).

Dicho hallazgo ha urgido el uso de factores antiangiogénicos conocidos en la terapia del cáncer de mama (10-12) y una búsqueda de nuevos inhibidores de la angiogénesis.

Durante la última década se han aislado varios inhibidores nuevos de la angiogénesis, incluidos los inhibidores de la señalización del VEGF (13) e inhibidores de los procesos que conducen a la maduración y estabilización de nuevos vasos sanguíneos. Los anticuerpos anti-integrina se han usado como inhibidores de la maduración de los vasos sanguíneos (14, 15).

Aunque actualmente existen comercialmente varios fármacos anti-angiogénicos, los mecanismos anti-angiogénicos de la mayoría de estos fármacos (p. ej., angiostatina y endostatina) todavía no están claros (16, 17).

Dado que la angiogénesis la pueden iniciar numerosos factores angiogénicos (posiblemente compensatorios), es la razón por la cual los factores antiangiogénicos dirigidos a procesos más tarde en la respuesta angiogénica, tal como la maduración del vaso o una combinación de factores antiangiogénicos, sería lo más eficaz para detener la formación del vaso.

El factor 4 plaquetario (PF4) es una proteína antiangiogénica que normalmente se secuestra en las plaquetas (1820). El PF4 inhibe la angiogénesis usando mecanismos mal definidos (21-24). Anteriormente se especuló que el PF4 se une a los proteoglicanos heparán-sulfato de superficie celular y, de este modo, inhibe la actividad de los factores de crecimiento angiogénicos tal como el factor de crecimiento básico de fibroblastos (24).

Reduciendo la presente invención a la práctica y buscando factores o dianas antiangiogénicos alternativos, los presentes inventores han descubierto una nueva proteína de unión a PF4 que participa en la modulación de la angiogénesis.

Como ha demostrado el presente estudio, esta proteína, que en el presente documento se denomina LOR-1, se expresa mucho en células endoteliales cultivadas además de en otras células de vasos sanguíneos. Además, los niveles de expresión de LOR-1 se pueden correlacionar con las propiedades metastásicas de las líneas celulares derivadas de cáncer de mama, lo que indica que LOR-1 puede desempeñar papeles adicionales en la progresión del tumor además de un papel en la angiogénesis.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica útil para tratar un trastorno que se caracteriza por una excesiva formación de vasos sanguíneos, en la que la composición comprende una molécula capaz de regular por disminución un nivel y/o la actividad de LOR-1, como se define en las reivindicaciones.

De acuerdo con características adicionales de la invención que se describen más adelante, la molécula es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse a, y al menos parcialmente inhibir la actividad de, el al menos un polipéptido.

De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones descritas preferidas, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está dirigido contra al menos una porción del polipéptido establecido en la SEC ID Nº 2.

De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones descritas preferidas, la molécula es un polinucleótido capaz de regular por disminución la expresión de al menos un tipo de lisil oxidasa.

De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones descritas preferidas, el polinucleótido es al menos parcialmente complementario al polinucleótido establecido en las SEC ID Nº 1, 4, 5 o 7.

De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones descritas preferidas, el polipéptido que se va a regular por disminución tiene una homología de al menos 75 % con el polipéptidos establecidos en la SEC ID Nº 2.

La presente invención aborda con éxito las limitaciones de las configuraciones conocidas actualmente proporcionando composiciones farmacéuticas y procedimientos que se pueden usar para tratar trastornos caracterizados por una excesiva formación de vasos sanguíneos.

Breve descripción de las figuras

En el presente documento se describe la invención únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Con referencia específica a las figuras con detalle, se subraya que los rasgos concretos mostrados son únicamente como ejemplo y para los fines de la discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y más fácilmente entendible de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto no se pretende mostrar detalles estructurales de la invención con mayor detalle de lo necesario para una comprensión fundamental de la invención, poniendo de manifiesto para los expertos en la técnica la descripción, tomada con las figuras, el modo como se pueden abordar en la práctica varias formas de la invención.

En las figuras:

La FIG. 1 ilustra el análisis SDS-PAGE de extractos de células endoteliales aórticas porcinas (células PAE) que se transfeccionaron con un vector solo (calle 1) o con un vector que contiene el ADNc de LOR-1 (calle 3) y están marcadas metabólicamente con 35Smetionina. Los extractos de las células transfeccionadas con el vector (calle 2) de las células transfeccionadas con ADNc de LOR-1 (calle 4) o de células endoteliales de la vena umbilical marcada con 35Smetionina (HUVEC) (calle 5) se purificaron en una columna de afinidad con PF4. Una banda que corresponde en tamaño con la banda original observada en HUVEC es evidente (comparar las calles 4 y 5); esta banda está ausente en los extractos de células transfeccionadas con vector. La FIG. 2 ilustra la expresión diferencial de LOR-1 en células derivadas de cáncer de mama de diferente potencial metastásico. El potencial metastásico de las células aumenta de izquierda a derecha y se correlaciona con el incremento de la expresión del ARNm de LOR-1. Los resultados corresponden al análisis de transferencia Northern de la expresión del ARNm de LOR-1. Los datos sobre el potencial metastático relativo de las líneas celulares procedían de la literatura. La FIG. 3 ilustra la expresión de LOR-1 recombinante en células de cáncer de mama MCF-7 (calle 1). Las células MCF7 transfeccionadas con vector (Calle 2) y dos clones de MCF-7 que expresan LOR-1 recombinante (calle 3, clon 12, calle 4, clon 22) se cultivaron durante dos días en medio sin suero. El medio de un número igual de células se recolectó, se concentró por 30 usando Centricon™ y alícuotas de 1011 se sometieron a electroforesis usando un gel de SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y la proteína LOR-1 se identificó usando un anticuerpo dirigido contra el extremo C de LOR-1. Se usó un anticuerpo secundario acoplado a fosfatasa alcalina y tinción con NBT-BICP para detectar el anticuerpo primario unido. La FIG. 4 ilustra el tamaño del tumor correlacionado con la expresión de LOR-1. Las células MCF-7 parentales (par),las células MCF-7 transfeccionadas con el vector pCDNA3 solo (vec) y dos células MCDF-7 que expresan LOR-1 recombinante (clones 12 y 24) se depositaron bajo la piel de ratones con deficiencias inmunitaria (107/sitio de la inyección) junto con una pastilla de liberación lenta de estrógenos. Para cada tipo de célula implantado se usaron seis animales. El área de los tumores se midió cada pocos días. Las barras representan la desviación estándar de la media. Las FIG. 5a-b ilustran la inmunotinción anti-factor-8 de tumores generados por las células MCF-7 transfeccioandas con el vector de expresión solo (Figura 5a) o con un vector de expresión que contiene el ADNc de LOR-1 (Figura 5b). Se realizó contratinción con hematoxilina-eosina (azul). La invasión de los vasos sanguíneos en la masa tumoral es más abundante en tumores que expresan LOR1 (Figura 5b) en comparación con los tumores generados por las células control que no expresan LOR-1 (Figura 5a). Las FIG. 6a-d ilustran secciones de hígado de pacientes con enfermedad de Wilson (Figuras 6c-d) y pacientes normales (Figuras 6a-b) usando sondas sentido de LOR-1 (Figuras 6a, 6c) y sondas antisentido (Figuras 6b, 6d). La FIG. 7 ilustra los resultados de una hibridación in sito de una cantidad entera usando una sonda de ADNc de LOR-1 y un embrión de pollo de 4 días. Se observa una fuerte expresión de ARNm de LOR-1 en vasos sanguíneos amnióticos (flecha). La FIG. 8 ilustra la alineación de secuencia de varias lisil oxidasas, incluida la LOR-1.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y procedimientos que se pueden usar para disminuir la angiogénesis. Específicamente, la presente invención se puede usar para suprimir el crecimiento tumoral y la metástasis, además de para tratar trastornos tales como, por ejemplo, artritis, retinopatía diabética, soriasis y vasculitis.

Los principios y operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a las figuras y descripciones adjuntas.

Antes de explicar al menos una realización de la invención con detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de la construcción y la disposición de los componentes indicados en la descripción siguiente o ilustrados en las figuras descritas en la sección Ejemplos. La invención puede abarcar otras realizaciones o se puede practicar o llevar a cabo de varias formas. Asimismo, debe entenderse que las expresiones y la terminología empleadas en el presente documento se usan con una finalidad descriptiva y no deben considerarse limitantes.

Como se describe en la sección Ejemplos más adelante, la presente invención ha descubierto una nueva proteína constituyente del proceso angiogénico.

Esta proteína, que se denomina LOR-1 (SEC ID Nº 2) en el presente documento pertenece a la familia de enzimas de las lisil oxidasas, que catalizan la formación de enlaces covalentes entre residuos de lisina sobre colágeno adyacente o fibrillas de elastina. La familia de las lisil oxidasas incluye cuatro genes (27, 28, 32, 33), cuyas secuencias proteicas se presentan en las SEC ID Nº 3, 6, 8 y 9. En la Figura 8 se presenta una comparación de homologías entre varios miembros de la familia de las lisil oxidasas, que se describe adicionalmente en la sección Ejemplos más adelante.

Cada miembro de la familia de enzimas de las lisil oxidasas incluye un dominio de lisil-oxidasa altamente conservado cuya actividad depende considerablemente de la presencia de cobre.

Cabe destacar que en estudios de la técnica anterior se ha demostrado que la retirada de cobre de los tejidos tumorales conduce a la inhibición de la angiogénesis (30, 34). Esto además corrobora el papel de la familia de enzimas de las lisil oxidasas en la angiogénesis, ya que, posiblemente, la eliminación del cobre conduce a la inhibición de las lisil oxidasas.

Los ensayos de unión de PF4-LOR-1 presentados en el presente documento proporcionan respaldo adicional de la actividad angiogénica. Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, el PF4 es un inhibidor de la angiogénesis. Como tal, la actividad antiangiogénica exhibida por PF4 puede efectuarse a través de la inhibición de LOR-1, que, como se demuestra en la sección Ejemplos más adelante, se expresa considerablemente en las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos.

Por tanto, se proporciona un procedimiento de modular la angiogénesis.

El procedimiento se efectúa administrando en el tejido de mamífero una molécula capaz de modificar un nivel tisular y/o la actividad de al menos un tipo de lisil oxidasa para modular de este modo la angiogénesis en el tejido de mamíferos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “nivel tisular” se refiere al nivel de proteína lisil oxidasa presente en forma activa en el tejido en un punto de tiempo dado. Los niveles de proteína vienen determinados por factores tales como, las tasas de transcripción y/o traducción, el tiempo de recambio del ARN o la proteína y/o la localización de la proteína dentro de la célula. Como tal, cualquier molécula que efectúe cualquiera de estos factores puede modificar el nivel tisular a la lisil oxidasa.

Como se usa en el presente documento, el término “actividad” se refiere a una actividad enzimática de la lisil oxidasa. Una molécula que puede modificar la actividad enzimática puede alterar, directa o indirectamente, la especificidad del sustrato de la enzima o la actividad del sitio catalítico de la misma.

Existen numerosos ejemplos de moléculas que puede modificar específicamente el nivel tisular y/o la actividad de una lisil oxidasa. Dichas moléculas se pueden clasificar en “reguladores por aumento” o “reguladores por disminución” de la lisil oxidasa.

Reguladores por disminución

Un anticuerpo (policlonal, monoclonal o monoespecífico) o una porción de anticuerpo (p. ej., fragmento Fab) dirigida a al menos una porción de una lisil oxidasa (p. ej., región que abarca el sitio catalítico) se puede usar para inhibir específicamente la actividad lisil oxidasa cuando se introduce en el tejido de mamífero, como tal, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo dirigido a una lisil oxidasa se puede usar para suprimir o detener la formación de vasos sanguíneos.

En la técnica se conocen numerosos ejemplos de inhibidores de anticuerpos, incluidos inhibidores de la angiogénesis dirigidos a los factores angiogénico (14, 15).

Como se describe más adelante, se puede usar varios abordajes antisentido o de ribozimas para reducir o anular la transcripción o la traducción de una lisil oxidasa.

Una molécula antisentido que se puede usar con la presente invención incluye un polinucleótido o un análogo de polinucleótido de al menos 10 bases, preferentemente entre 10 y 15, más preferentemente entre 50 y 20 bases, lo más preferentemente al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 22, al menos 25, al menos 30

o al menos 40 bases, que puede hibridar in vivo, en condiciones fisiológicas, con una porción de una hebra polinucleotídica que codifica un polipéptido con una homología de al menos 50 % con las SEC ID Nº 1, 4, 5 o 7 o con una homología de al menos 75 % con una porción en el extremo N del mismo según se determine usando el software BestFit del paquete para el análisis de la secuencia Wisconsin, usando el algoritmo de Smith y Waterman, en que la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2.

Los oligonucleótidos antisentido usados en le presente invención se pueden expresar a partir de una construcción de ácido nucleico administrada en el tejido, en cuyo caso preferentemente se usan promotores inducibles de modo que la expresión de antisentido se pueda encender o apagar o, como alternativa, dichos oligonucleótidos se pueden sintetizar químicamente y administrar directamente en el tejido, como parte de, por ejemplo, una composición farmacéutica.

La capacidad de sintetizar químicamente oligonucleótidos y análogos de los mismos que tienen una secuencia predeterminada seleccionada ofrece medios para modular por disminución la expresión génica. Se pueden considerar tres tipos de estrategias de modulación de la expresión génica.

A nivel de transcripción, los oligonucleótidos antisentido o sentido o análogos que se unen al ADN genómico mediante desplazamiento de hebra o la formación de una triple hélice pueden impedir la transcripción. A nivel del tránscrito, los oligonucleótidos antisentido o análogos que se unen a las moléculas de ARN diana conducen a la escisión enzimática del híbrido mediante la RNasa H intracelular. En este caso, hibridando con el ARN objetivo, los oligonucleótidos o análogos oligonucleotídicos proporcionan un híbrido dúplex reconocido y destruido por la enzima RNasa H. Como alternativa, dicha formación de híbridos puede conducir a interferencias con el corte y empalme correcto. Como resultado, en ambos casos, el número de transcritos intactos del ARNm diana listos para traducir se reduce o elimina. A nivel de traducción, los oligonucleótidos antisentido o análogos que se unen a las moléculas de ARNm diana impiden, mediante hidrancia estérica, uniendo los factores de traducción esenciales (ribosomas) al ARNm diana, un fenómeno conocido en la técnica como cese de la hibridación, lo que inactiva la traducción de dichos ARNm.

En varios estudios de la técnica se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido pueden ser eficaces in vivo. Por ejemplo, se han usado moléculas antisentido para detener la proliferación de células hematopoyéticas (58), el crecimiento (59) o la entrada en la fase S del ciclo celular (60) y para impedir las respuestas medidas por receptor (61).

Se deben tener en cuenta varias consideraciones al diseñar los oligonucleótidos antisentido. Para una inhibición eficiente in vivo de la expresión génica usando oligonucleótidos antisentido o análogos, los oligonucleótidos o análogos deben cumplir los siguientes requisitos (i) suficiente especificidad en la unión a la secuencia diana; (ii) solubilidad en agua; (iii) estabilidad contra las nucleadas intra y extracelulares; (iv) capacidad de penetración a través de la membrana celular y (v) cuando se usa para tratar un organismo, toxicidad baja.

Los oligonucleótidos no modificados son, normalmente, poco prácticos para usar como secuencias antisentido, ya que tienen semividas cortas in vivo durante las cuales se degradan rápidamente por acción de las nucleasas. Además, son difíciles de preparar en cantidades superiores a miligramos. Adicionalmente, dichos oligonucleótidos atraviesan mal la membrana celular.

Por tanto, es evidente que, con el fin de cumplir todos los requisitos indicados anteriormente, los análogos nucleotídicos tienen que concebirse de un modo adecuado.

Por ejemplo, los problemas que surgen en relación con el reconocimiento del ADN bicatenario (ADNds) a través de la formación de la triple hélice se han disminuido mediante una inteligente unión química de “retrodesplazamiento”, de modo que una secuencia de polipurina en una hebra se reconoce y, mediante “retrodesplazamiento” se puede reconocer una secuencia de homopurina en la otra hebra. Asimismo, se ha obtenido una buena formación de hélice usando bases artificiales, de modo que se mejoran las condiciones de unión con respecto a la fuerza iónica y el pH.

Además, con el fin de mejorar la semivida así como una penetración de la membrana se han realizado un gran número de variaciones en las estructuras polinucleotídicas, aunque con poco éxito.

Los oligonucleótidos se pueden modificar en la base, el azúcar o el resto fosfato. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, el uso de metilfosfonatos, monotiofosfatos, ditiofosfatos, fosforoamidatos, ésteres fosfato, fosforotioatos con puente, fosforoamidatos con puente, metilenfosfonatos con puente, análogos defosfointernucleotídicos con puentes de siloxano, puentes de carbonato, puentes de éster de carboximetilo, puentes de carbonato, puentes de éster de carboximetilo, puentes de acetamida, puentes de carbamato, puentes de tioéter, puentes sulfoxi, puentes sulfona, varios ADN de “plástico”, puentes anoméricos y derivados de borano (62).

La solicitud de patente internacional WO 89/12060 divulga varios bloques estructurales para sintetizar análogos oligonucleotídicos, así como análogos oligonucleotídicos formados uniendo dichos bloques estructurales en una secuencia definida. Los bloques estructurales pueden ser “rígidos” (es decir, que contienen una estructura en anillo)

o “flexibles” (es decir, carecen de una estructura en anillo). En ambos casos, los bloques estructurales contienen un grupo hidroxi y un grupo mercapto, a través de los cuales se dice que los bloques estructurales se unen para formar análogos oligonucleotídicos. El resto de unión en los análogos oligonucleotídicos se selecciona del grupo constituido por sulfuro (-S), sulfóxido (-SO-) y sulfota (-SO2-).

La solicitud de patente internacional WO 92/20702 describe un oligonucleótido acíclico que incluye una estructura peptídica sobre la cual cualquier nucleobase o análogo químicos seleccionados toma forma de cuerdas y sirven como caracteres de codificación como lo son en el ADN o ARN natural. Estos nuevos compuestos, conocidos como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) no solo son más estables en las células que sus homólogos naturales sino que también se unen a ADN y ARN natural de 50 a 100 veces más fuertemente que los ácidos nucleicos adheridos. Los oligómeros de PNA se pueden sintetizar a partir de cuatro monómeros protegidos que contienen timina, citosina, adenina y guanina mediante síntesis peptídica de Merrifield en fase sólida. Con el fin de incrementar la solubilidad en agua y de impedir la agregación se introduce un grupo lisina amida en la región C-terminal.

Por tanto, la tecnología antisentido requiere apareamiento del ARN mensajero con un oligonucleótido para formar una doble hélice que inhibe la traducción. El concepto de la terapia génica mediada por antisentido ya se introdujo en 1978 para la terapia del cáncer. Este enfoque se basó en ciertos genes que son cruciales en la división y crecimiento celular de las células de cáncer. Los fragmentos sintéticos de ADN de la sustancia genética pueden alcanzar este objetivo. Dichas moléculas se unen a las moléculas del gen diana en el ARN de las células tumorales, de modo que se inhibe la traducción de los genes y se obtiene un crecimiento disfuncional de estas células. También se han propuesto otros mecanismos. Estas estrategias se han usado con algún éxito en el tratamiento de cánceres, así como de otras enfermedades, incluidas enfermedades víricas y otras enfermedades infecciosas.

Normalmente, los oligonucleótidos antisentido se sintetizan en longitudes de 13-30 nucleótidos. La vida de las moléculas oligonucleotídicas en sangre es bastante corta. Por tanto, tienen que modificarse químicamente para impedir la destrucción mediante nucleadas ubicuas presentes en el cuerpo. Los fosforotioatos son una modificación muy usada en los ensayos clínicos en curso con oligonucleótidos antisentido. Una nueva generación de moléculas antisentido consiste en oligonucleótidos antisentido híbridos con una porción central de ADN sintético mientras que cuatro bases en cada extremo se han modificado con 2'-O-metilribosa para simular el ARN. En estudios preclínicos en animales de laboratorio, dichos compuestos han demostrado mayor estabilidad al metabolismo en los tejidos corporales y un mejor perfil de seguridad en comparación con los fosforotioatos no modificados de primera generación. También se han analizado docenas de análogos nucleotídicos en la tecnología antisentido.

Los oligonucleótidos de ARN también se pueden usar para inhibición antisentido, ya que forman un dúplex de ARN-ARN estable con la diana, lo que sugiere una inhibición eficiente. No obstante, debido a su baja estabilidad, los oligonucleótidos de ARN normalmente se expresan dentro de las células usando vectores diseñados a este fin. Este enfoque se ve favorecido cuando se intenta apuntar a un ARNm que codifica una proteína abundante y duradera.

Los oligonucleótidos de ARN también se pueden diseñar para activar los mecanismos de interferencia de ARN dentro de la célula (ARNi). Los oligonucleótidos adecuados para este fin deben tener una longitud y un área de complementación definidas (63).

En publicaciones científicas recientes se ha validado la eficacia de los compuestos antisentido en modelos animales de hepatitis, cánceres, restenosis de las arterias coronarias y otras enfermedades. Recientemente la FDA ha aprobado el primer fármaco antisentido. El fármaco, Fomivirsen, desarrollado por Isis, está indicado para el tratamiento local del citomegalovirus en pacientes con SIDA que son intolerantes o tienen una contraindicación a otros tratamientos para la retinitis por CMV o que habían respondido de forma insuficiente a tratamientos previos para la retinitis por CMV (Pharmacotherapy News Network).

Actualmente hay varios compuestos antisentido en ensayos clínicos en EE.UU. Estos incluyen antivirales administrados localmente, terapéuticas sistémicas para el cáncer. Las terapéuticas antisentido tienen el potencial de tratar muchas enfermedades potencialmente mortales con una serie de ventajas sobre los fármacos tradicionales. Los fármacos tradicionales intervienen después de que se forme una proteína causante de la enfermedad. No obstante, las terapéuticas antisentido bloquean la transcripción/traducción del ARNm e intervienen antes de que se forme una proteína y, ya que las terapéuticas antisentido están dirigidas a un ARNm específico, deberían ser más eficaces con menos efectos secundarios que la terapia actual inhibidora de proteínas.

Una segunda opción para alterar la expresión génica a nivel de la transcripción usa oligonucleótidos sintéticos capaces de hibridar con el ADN bicatenario. Se forma una triple hélice. Dichos oligonucleótidos pueden impedir la unión de los factores de transcripción al promotor del gen y, por tanto, inhibir la transcripción. Como alternativa, pueden impedir el desenrrollamiento del dúplex y, por tanto, la transcripción de los genes dentro de la estructura de la triple hélice.

Las ribozimas también se pueden usar como reguladores por disminución. Las ribozimas se usan cada vez más para la inhibición específica de secuencia de la expresión génica mediante la escisión de los ARNm que codifican las proteínas de interés. La posibilidad de diseñar ribozimas para escindir cualquier ARN diana específico las ha convertido en herramientas valiosas en aplicaciones de investigación básica y terapéuticas. En el área terapéutica se han explotado las ribozimas para dirigirse a ARN virales en enfermedades infecciosas, oncogenes dominantes en cánceres y mutaciones somáticas específicas en trastornos genéticos. De un modo más importante, varios protocolos para terapia génica con ribozimas para pacientes de VIH ya están en los ensayos de Fase 1 (67). Más recientemente se han usado ribozimas para investigación con animales transgénicos, validación de dianas génicas y descubrimiento de vías. Varias ribozimas están en diversas etapas de ensayos clínicos. ANGIOZYME fue la primera ribozima sintetizada químicamente en estudiarse en ensayos clínicos con humanos. ANGIOZYME inhibe específicamente la formación del VEGF-r (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular), un componente clave en la vía de la angiogénesis. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., así como otras empresas, han demostrado la importancia de las terapéuticas antiangiogénesis en modelos animales. HEPTAZYME, una ribozima diseñada para destruir de forma selectiva el ARN del virus de la hepatitis C (VHC), se encontró eficaz en la disminución del ARN viral de la hepatitis C en ensayos de cultivo celular (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated).

Los reguladores por disminución descritos en el presente documento anteriormente serían particularmente útiles para inhibir la angiogénesis en tejido tumoral. Se ha demostrado que el PF4, una proteína de unión de la lisil oxidasa que inhibe la angiogénesis en tejido tumoral se acumula específicamente en vasos sanguíneos tumorales recién formados (vasos angiogénicos), pero no en vasos sanguíneos establecidos (31, 35).

Los vasos sanguíneos angiogénicos recién formados son más permeables a las proteínas que los vasos sanguíneos establecidos porque el principal inductor de la angiogénesis en muchas enfermedades angiogénicas es VEGF, un factor de crecimiento que también funciona como un potente factor de permeabilización de vasos sanguíneos (VPF) (13). Por tanto, los vasos sanguíneos asociados con tumores están en un estado permanente de hiperpermeabilidad debido a la alteración de la regulación de la sobreexpresión de VEGF (36,37) y, como tal, una molécula reguladora por disminución usada mediante el procedimiento de la presente invención sería capaz de extravasarse de forma eficiente de los vasos sanguíneos tumorales pero con mucha menos eficiencia de los vasos sanguíneos estabilizados normales.

Con el fin de modular la angiogénesis, las moléculas reguladoras por disminución usadas en la presente invención se pueden administrar al individuo per se o en una composición farmacéutica, en la que se mezclan con vehículos o excipientes adecuados.

Como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos, tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. La finalidad de una composición farmacéutica es facilitar la administración/dirigir de un compuesto a un mamífero.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ingredientes activos” se refiere a la preparación responsable del efecto biológico, es decir las moléculas reguladoras por aumento/reguladoras por disminución usadas por la presente invención.

En lo sucesivo en el presente documento, las expresiones “vehículo fisiológicamente aceptable” y “vehículo farmacéuticamente aceptable” se usan de forma intercambiable para hacer referencia a un vehículo, tal como, por ejemplo, un liposoma, un virus, una micela o una proteína o un diluyente que no produzca irritación significativa en el mamífero y no anule la actividad biológica y las propiedades del ingrediente activo. En estas expresiones se incluye un adyuvante.

En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. Ejemplos, sin limitaciones, de excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas de formulación y administración de composiciones se pueden encontrar en la última edición de Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosa, transnasal, intestinal o parenteral, incluidas inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

Para inyección, los ingredientes activos de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina tamponada fisiológicamente. Para la administración transmucosa, en la formulación se usan agentes de penetración adecuados para atravesar la barrera. Tales agentes de penetración se conocen generalmente en la técnica.

Para administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando el ingrediente activo con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular el ingrediente activo de la invención como comprimidos, píldoras, pastillas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral se pueden fabricar usando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir las sustancias auxiliares adecuadas, si se desea, para obtener núcleos de comprimidos o núcleos de grageas. Excipientes adecuados son, en concreto, cargas, tales como azúcares, incluidas lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.

Los núcleos de pastillas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este fin, se pueden usar soluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas duras fabricadas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener ingredientes activos mezclados con una carga, tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los ingredientes activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deberán estar en dosis adecuadas para la vía de administración específica.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formulados de forma convencional.

Las preparaciones descritas en el presente documento se pueden formular para administración parenteral, por ejemplo mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en monodosis en, por ejemplo, ampollas o en envases multidosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma hidrosoluble. Adicionalmente se pueden preparar suspensiones de los ingredientes activos como suspensiones oleosas o a base de agua para inyección adecuadas. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo, triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados para aumentar la solubilidad de los ingredientes activos y permitir la preparación de soluciones muy concentradas.

Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituir con un vehículo adecuado, por ejemplo una solución a base de agua apirógena estéril, antes de usar.

La preparación de la invención también se puede formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito previsto.

La composición farmacéutica puede formar una parte de un artículo de fabricación, que también incluye un material de envasado para contener la composición farmacéutica y un folleto que proporciona indicaciones de uso para la composición farmacéutica,

Por tanto, la presente divulgación proporciona un procedimiento y composiciones farmacéuticas útiles para modular la angiogénesis.

Dicha actividad de modulación se puede usar para tratar la artritis (38,39), la retinopatía diabética (40), la psoriasis (41,42) y la vasculitis (43,44).

Como tal, la administración de secuencias que codifican lisil oxidasas o de polipéptidos se puede usar para corregir algunas de las manifestaciones de estas enfermedades.

Además, las evidencias presentadas en la sección Ejemplos que indican que LOR-1 puede expresarse más en las líneas celulares metastásicas que en las líneas celulares no metastásicas (Figura 3), sugieren que se pueden usar niveles de expresión de LOR-1 como herramienta diagnóstica para determinar la malignidad de las células cancerosas y, por tanto, para determinar qué régimen de tratamiento debería usarse.

Otros objetos, ventajas y características nuevas de la presente invención serán obvias para los expertos en la técnica a partir del análisis de los ejemplos siguientes que no se pretende que sean limitantes. Adicionalmente, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invención que se han indicado anteriormente en el presente documento y según se reivindica en la sección Reivindicaciones más adelante encuentra respaldo experimental en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

A continuación se hace referencia a los ejemplos siguientes, que, junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de un modo no limitante.

En general, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio usados en la presente invención incluyen técnicas de ADN moleculares, bioquímicos, microbiológicos y recombinantes. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la literatura. Véase, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y col., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson y col., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren y col. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como se indican en las patentes de EE.UU. nº 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y col. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8ª Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la patente y la literatura científica, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y col., "Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos los cuales se incorporan por referencia y se indican completamente en el presente documento. Otras referencias generales se proporcionan a lo largo del presente documento. Se cree que los procedimientos en el mismo son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para comodidad del lector.

Ejemplo 1

El papel de LOR1 en la angiogénesis

Se realizó un estudio en un esfuerzo para confirmar y caracterizar adicionalmente el papel de la LOR-1 en la angiogénesis.

Materiales y procedimientos

El factor 4 de plaquetas recombinante humano (PF4, Número de Acceso en GenBank M20901) producido en bacterias y mezclado de nuevo fue suministrado por el Dr. Maione of Repligen Corp. (Boston, EE.UU.). Las pastillas de liberación lenta de estrógenos se obtuvieron en Innovative Research of America, Sarasota, FL, EE.UU.

Construcción del vector de expresión de LOR-1, transfección en células MCF7 y expresión: El ADNc de LOR-1 (SEC ID Nº 1) se clonó en un vector de expresión pCDNA3.1-hygro (Invitrogen Inc., EE.UU.) bajo el control de un promotor de CMV. Los clones de las células que expresan LOR-1 se seleccionaron usando higromicina y se analizó la expresión de LOR-1 usando el antisuero policlonal descrito más adelante.

Construcción de las columnas de afinidad para el factor 4 de plaquetas y purificación de LOR-1 en dichas columnas: El PF4 se acopló a sefarosa usando una modificación del procedimiento de Miron y Wilchek (51) como se ha descrito previamente para el factor de crecimiento endotelial vascular (52). Se recogió medio acondicionado sin suero de células MCF-7 marcadas con 35S-metionina que sobreexpresa LOR-1. El medio acondicionado se pasó por la columna dos veces. La columna se lavó con solución salina tamponada con fosfato (NaCl 300 mM, pH-7,2) y se eluyó con PBS (que contiene NaCl 2M).

Experimentos con ratones atímicos: Células MCF-7 modificadas o parentales (107 células por animal) se implantaron bajo la piel de ratones atímicos. Se implantó una pastilla de liberación lenta de estrógenos a 1 cm de lo descrito anteriormente (53). Los tumores se midieron periódicamente tras lo cual se extrajeron los tumores de al menos 1 cm de tamaño y se analizaron inmunohistológicamente usando un anticuerpo comercial dirigido contra un antígeno de tipo factor 8 que sirvió como marcador específico para las células endoteliales.

Hibridación in situ: Los fragmentos que abarcan los nucleótidos 922-1564 de LOR-1, los nucleótidos 976-1391 de LOL, los nucleótidos 400-950 de LO y los nucleótidos 1061-1590 de LOR-2 (numerados desde el codón ATG de estas secuencias) se subclonaron cada uno de forma independiente en los vectores Bluescript SK y KS (Stratagene). Se usó un kit de marcaje de ARNc DIG de Boehringer-Mannheim para transcribir las sondas de ARNc sentido (s) y antisentido (as) marcadas con digoxigenina del promotor de T7 de las construcciones Bluescript. La hibridación y la posterior detección de las sondas hibridadas se llevó a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente (54).

Antisueros policlonales anti-LOR-1: Los antisueros generados inyectando un péptido recombinante que contiene los 200 aminoácidos del extremo C de LOR-1 (aminoácidos 540-744 de la SEC ID Nº 2) en conejos hembra. El suero se recogió 10 días después de cada inyección y una fracción de inmunoglobulina se purificó usando una columna de afinidad de sefarosa proteína A (Pharmacia).

Resultados

Purificación de LOR-1: Se usó una columna de afinidad de PF4 para detectar proteínas de células endoteliales que interaccionen específicamente con PF4.

Se detectaron dos proteínas de unión a PF4 en medio acondicionado de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), mientras que no se detectaron proteínas de unión a PF4 en extractos de detergente de células endoteliales.

Dos litros de medio acondicionado permitieron una purificación parcial de una de estas proteínas de unión que eluyó de la columna a concentraciones de sales relativamente altas (NaCl 0,4 -0,5 M).

Se realizó orificación adicional de esta proteína usando cromatografía de líquidos de alta presión de fase inversa y cromatografía en SDS/PAGE. La proteína de unión a PF4 no se unió a heparina ni era un proteoglucano de heparánsulfato ya que la digestión con heparinasa no pudo cambiar su movilidad en los experimentos de SDS/PAGE.

La secuenciación parcial y la comparación de bases de datos revelaron que la proteína de unión a PF4 de la presente invención (LOR-1) pertenece a una familia de proteínas que contienen un dominio similar a la lisil oxidasa (28,29). Las lisil oxidasas son enzimas dependientes de cobre que participan en la síntesis de la matriz extracelular catalizando la formación de enlaces covalentes entre lisinas de fibras de colágeno o de elastina adyacentes.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de LOR-1 (deducida a partir de la secuencia de ADNc aislado) mostró un alto grado de identidad con WS9-14, una proteína sobreexpresada en fibroblastos senescentes, e varios tipos de células adherentes (pero o en las células no adherentes) y en fibroblastos, en los que se correlacionó con los niveles de expresión de pro-colágeno I-a1, además de ser inducida por el TGF-e inhibida por ésteres de forbol y ácido retinoico (27).

Papel de LOR-1 en el desarrollo del tumor: La LOR-1 recombinante se expresó en células PAE unidas específicamente con la columna de afinidad de PF4 (Figura 1). Dado que LOR-1 es un miembro de la familia de LO, se postuló la hipótesis de que participa e la formación de MEC durante la angiogénesis. Además, también se postuló la hipótesis de que el PF4 suprime o inhibe la actividad proangiogénica de LOR-1, de modo que inhibe las etapas posteriores de la formación de vasos sanguíneos y, como resultado, limita el crecimiento del tumor.

Expresión de LOR-1: La hibridación in situ demostró que LOR-1 se expresa en una amplia variedad de tejidos y tipos celulares, incluidos fibroblastos, adipocitos, células nerviosas, células endoteliales y varias células epiteliales. Varios tipos de células, tales como los hepatocitos hepáticos, no expresaron LOR-1; de los 4 miembros de la familia LO analizados (todos excepto para LoxC), LOR-1 fue la única que se expresó en células endoteliales de los vasos sanguíneos.

LOR-1 y cáncer: Como se muestra en la Figura 2, en el presente documento se demostró una correlación directa entre los niveles de expresión de LOR-1 y las propiedades metastásicas de las líneas celulares derivadas de cáncer de mama.

Dado que las células epiteliales que revisten los conductos galactóforos del tejido de mama normal (de los que surgen la mayoría de los tumores de mama) expresan grandes cantidades de LOR-1, es posible que las líneas menos metastásicas perdieran expresión de LOR-1 en lugar de ganarla.

Para corroborar su papel en la metástasis, el ADNc de LOR-1 se expresó en líneas celulares MCF-7 derivadas de cáncer de mama no metastásico que normalmente no expresan LOR-1. La expresión de LOR-1 se analizó usando anticuerpos policlonales de conejo generados como se ha descrito anteriormente (Figura 3).

Una línea celular control que se transfeccionó con un vector de expresión vacío y una línea celular MCF-7 que expresa LOR-1 se implantaron bajo la piel de ratones con deficiencias inmunitarias junto con una pastilla de liberación lenta de estrógenos, como se ha descrito anteriormente. Los estrógenos se añadieron porque el desarrollo de tumores a partir de esta línea celular no metastásica depende de estrógenos (55).

La velocidad de desarrollo del tumor en ratones se monitorizó de forma continua (Figura 4); los tumores de 1 cm de tamaño se extirparon y se sometieron a análisis histológico como se ha descrito anteriormente. Es interesante el hecho de que la velocidad del desarrollo tumoral variaba entra las dos líneas celulares, en las que algunos tumores exhibieron un crecimiento más lento en MCF-7 que expresan LOR-1 y otros exhiben un crecimiento más lento en las células control.

Con el fin de superar los problemas del nivel de expresión, el ADNc de LOR-1 se introdujo bajo el control de un promotor inducido por tetraciclina (el sistema TET-off). Dicha construcción permitirá determinar de forma concluyente su la menor velocidad de crecimiento tumoral observada en las células que expresan LOR esta de hecho causada por LOR-1.

Los tumores que expresan cantidades grandes de LOR-1 se cortaron y se tiñeron con un anticuerpo dirigido contra el antígeno similar al factor 8, un marcador específico de células endoteliales. E tejido tumoral control se tiñó predominantemente en la cápsula alrededor del tumor, mientras que en los tumores de expresión de LOR-1 se observó una pronunciada tinción en las regiones internas del tejido tumoral (Figura 5a y Figura 5b respectivamente).

Papel de LOR-1 en la enfermedad de Gilson y en otras enfermedades hepáticas crónicas: El tejido hepático normal y enfermo se sondó con sondas de LOR-1 sentido (Figuras 6a y 6c) y antisentido (Figuras 6b y 6d). Los tejidos hepáticos normales expresan niveles muy bajos de LOR-1 (Figura 6b). No obstante, los tejidos hepáticos fibróticos como los observados en la enfermedad de Wilson exhiben un fuerte incremento de la expresión de LOR-1 en hepatocitos (Figuras 6d).

Expresión de LOR-1 en embriones de pollo: La Figura 7 ilustra expresión de LOR-1 de ARNm de LOR-1 en vasos sanguíneos de un embrión de pollo en desarrollo. La hibridación in situ de toda la cantidad de embriones de pollo de 4 días de edad reveló expresión de ARNm de LOR-1 en vasos sanguíneos localizados en el amnios (flecha).

La familia de las lisil oxidasas: Una comparación de la homología entre cinco miembros de la familia de las lisil oxidasas, que incluye la subfamilia LO y LOL y la subfamilia LOR-1 y LOR-2 reveló una fuerte homología en la porción C-terminal, que incluye el motivo de la lisil oxidasa conservado. LOR-1 y LOR-1 se caracterizaron por tiras largas en N-terminal que no se encuentran en LO y LOL.

REFERENCIAS CITADAS

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5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Neufeld, Gera Gengrinovitch, Stela akiri , Gal Vadaz, Zehava

10 <120> COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y PROCEDIMIENTOS ÚTILES PARA MODULAR LA ANGIOGÉNESIS

<130> 01/22064

<150> US 60/223,739

<151> 2000-08-08 15 <160> 9

<170> PatentIn versión 3.

<210> 1

<211> 2325

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 774

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 757

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 2262

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 1725

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 574

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 1254

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

10 <210> 8

<211> 417

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 752

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica para usar en un procedimiento de tratar un trastorno que se caracteriza por una excesiva formación de vasos sanguíneos, en la que la composición comprende una molécula capaz de regular por disminución un nivel y/o la actividad de LOR-1, en la que la molécula se selecciona de.

   (a)

   un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a, y al menos inhibir parcialmente la actividad de, LOR-1;

   (b)

   un oligonucleótido sintético que hibrida con ADN bicatenario del gen LOR-1;

   (c)

   un oligonucleótido antisentido o análogo del mismo que impide la transcripción del ARNm de LOR-1, impide la traducción de ARNm de LOR-1, conduce a la escisión enzimática de un híbrido con ARNm de LOR1 o conduce a la interferencia con el correcto corte y empalme del ARNm de LOR-1;

   (d)

   una ribozima que inhibe la expresión de LOR-1 mediante escisión del ARNm de LOR-1;

   (e)

   un oligonucleótido de ARN que activa los mecanismos del ARN de interferencia (ARNi), en el que los mecanismos del ARNi regulan por disminución de la expresión de LOR-1; y

   (f)

   una construcción de ácido nucleico que expresa el oligonucleótido antisentido de (c).

2. 2.

   La composición de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo está dirigido contra al menos una porción del polipéptido establecido en las SEC ID Nº 2.

3. 3.

   Una composición farmacéutica para usar en un procedimiento de tratar un trastorno que se caracteriza por una excesiva formación de vasos sanguíneos, en la que la composición comprende una molécula capaz de regular por disminución un nivel y/o la actividad de lisil oxidasa de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 75 % con el polipéptido establecido en la SEC ID Nº 2, en la que la molécula se selecciona de:

   (a)

   un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de unirse a, y al menos inhibir parcialmente la actividad de, LOR-1;

   (b)

   un oligonucleótido sintético que hibride con ADN bicatenario del gen LOR-1;

   (c)

   un oligonucleótido antisentido o análogo del mismo que impide la transcripción del ARNm de LOR-1, impide la traducción de ARNm de LOR-1, conduce a la escisión enzimática de un híbrido con ARNm de LOR1 o conduce a la interferencia con el correcto corte y empalme del ARNm de LOR-1;

   (d)

   una ribozima que inhibe la expresión de LOR-1 mediante escisión del ARNm de LOR-1;

   (e)

   un oligonucleótido de ARN que activa los mecanismos del ARN de interferencia (ARNi), en el que los mecanismos del ARNi regulan por disminución la expresión de LOR-1; y

   (f)

   una construcción de ácido nucleico que expresa el oligonucleótido antisentido de (c).

4. 4.

   La composición de la reivindicación 3, en la que dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo está dirigido contra al menos una porción del polipéptido establecido en las SEC ID Nº 2.