ES2387593T3 - Inhibidores de la señalización de TGF-R para el tratamiento de enfermedades del SNC - Google Patents

Inhibidores de la señalización de TGF-R para el tratamiento de enfermedades del SNC Download PDF

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Abstract

Oligonucleótidos antisentido seleccionado de la SEC ID NO 3 y secuencias alargadas de SEC ID NO.3 que puede ser representado por la fórmula general siguiente: 5'-XCAGCCCCCGACCCATGZ-3' en donde X se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos:y en donde Z se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos: y en donde X y Z juntos no comprenden más de 34 nucleobases en donde dichos oligonucleótidos son capaces de hibridizarse suficientemente con la región que abarca el inicio de la traducción del marco de lectura abierto delgen que codifica TGF-Rii y las sales y los isómeros ópticos de dicha secuencia.

Description

Inhibidores de la señalización de TGF-R para el tratamiento de enfermedades del SNC.
[0001] La presente invención se refiere al uso de oligonucleótidos para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento de una enfermedad, en donde la neurogénesis y/o la neuroregeneración tiene un efecto beneficioso, en particular una enfermedad neurodegenerativa como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson incluyendo atrofía multisistema, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, demencia de cuerpos de Lewy, esclerosis amiotrópica lateral y otros enfermedades de las neuronas motoras, enfermedad de Huntington, atrofías espinocerebelosas, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob y otras enfermedades graves de priones, demencia frontemporal incluyendo la enfermedad Pick, la demencia compleja del SIDA, la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, una enfermedad cerebrovascular tal como la demencia vascular, infarto, heridas traumáticas del cerebro y de la médula espinal, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, depresión y esquizofrenia, y enfermedades de desarrollo tales como el síndrome de Down.
[0002] Hay muchos enfermedades neurodegenerativas graves que tienen un impacto grave socio-económico en las sociedades modernas, por ejemplo, enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer, trastornos del desarrollo con demencia (tal como el síndrome de Down), la enfermedad de Parkinson, la demencia de cuerpos de Lewy, demencia frontemporal, la enfermedad Pick, esclerosis amiotrófica lateral, atrofías espinocerebelosas, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la demencia compleja del SIDA, demencia vascular, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, atrofía multisistema, la enfermedad de Huntington, infarto, herida traumática del cerebro, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, depresión, esquizofrenia y esclerosis múltiple. Normalmente, las causas patofisiológicas son defectos genéticos, epigenéticos o adquiridos, que frecuentemente resultan en una formación de agregados o acumulación de células muertas o rotas que últimamente llevan a un disfuncionamiento continuo y finalmente a la muerte de neuronas o de células gliales y la desintegración estructural. Células microglias y macrófagos perivasculares de reposo se atraen y se activan, intentando quitar las células y el tejido rotos y muertos. Eso puede ocurrir durante un périodo de tiempo muy corto, como en el caso de la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, o durante décadas, como por ejemplo en la enfermedad de Parkinson o la esclerosis múltiple. La población de células de microgliales/macrófagos libera un número de citoquinas inflamatorias hacia adentro la matriz extracelular y ésas se van o hacia adentro pequeñas vénulas, o al espacio LCE. Desgraciadamente, la neurogénesis y la neuroregeneración que podrían influir ventajosamente en el curso clínico de estas enfermedades arriba descritas (a pesar de sus mecanismos individuales patofisiológicos específicos) se suprimen por mecanismos no conocidos hasta el presente día. Así, el problema técnica en que se basa la presente invención es de proporcionar medios apropiados para tratar o impedir enfermedades neurodegenerativos o al menos síntomas asociados con dichas enfermedades en que se trata de influir en la supresión de la neurogénesis y de la neuroregeneración.
[0003] La solución de dicho problema téchnico se alcanza en que se proporcionan las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Es conocido que la familia de las proteínas TGF-beta, es decir, el TGF-beta1, el TGF-beta2 y el TGF-beta3 con sus receptores específicos de la superfície de la célula, el TGF RI, TGF RII, TGF RIII influye en múltiples aspectos decisivos del desarrollo de órganos embrionales y principalmente en el desarrollo mesenquimal / neuroectodérmico de órganos. Dichas proteínas hacen posible la diferenciación de células madres embrionarias en células precursoras neuronales y tienen un efecto neuroprotectivo para neuronas maduras heridas. Además es conocido que tienen impacto muy grave en la diferenciación de células hematopoéticas madres, que controlan la proliferación y también la diferenciación. Durante los experimentos que llevaron a la presente invención, se encontró que TGF-R, es decir, TGF RI y TGF RII, es un factor decisivo que influye en la supresión de la neurogénesis y la neuroregeneración y, por consiguiente, un compuesto que es capaz de influir en la actividad biológica de TGF R o TGF RII es útil para el tratamiento / la prevención de enfermedades neurodegenerativas y/o enfermedades neuroinflamatorias.
[0004] Para resumir, se puede constatar lo siguiente como resultado de los experimentos que llevaron a la presente invención:
1.
Se descubrió un circuito fisiológico regulatorio que influye en el nivel de regeneración efectiva del sistema nervioso central mediante células precursoras/madres, aunque por supuesto ya se habían conocido los compuestos individuales (TGF-ß, TGF-RII, compartimiento de líquido cerebroespinal, líquido endolinfático, vítreo, células precursoras neuronales, etc.) Este circuito – con la molécula de destino decisiva de TGF-RII que está expresado en la pared ventricular – es responsable para la neuroregeneración perjudicada en la mayoría de las patologías del SNC.
2.
Es interesante que la regulación no se efectua por la sangre, los linfáticos, o la matriz extracelular, pero al contrario por compartimientos de líquidos (líquido cerebroespinal, etc.) que tienen contacto directo con células neuronales y sus células precursores o madres.
3.
Se descubrió que un circuito fisiológicamente inhibitorio para neoformación neuronal/oligodendroglial o astrocítico es un punto de partida ideal para estrategías para reparar daños en el SNC,
aplicable de manera abrumadora para casi toda patología destructiva en el sistema nervioso. A partir de conocimientos previos en cuanto a TGF-ß, se intentó más aumentar que bajar (ver 5) el funcionamiento de TGF-ß para aumentar sus actividades conocidas neuroprotectivas o inmunosupresivas en el SNC. aquí postulamos bajar su efecto inhibidor sobre neoformación de células madres mediante bloquear la señaliazción de TGF-RII en la pared ventricular.
4.
Aunque durante largo tiempo se había supuesto que que procesos inflamatarios desempeñaban un papel significativo en la neurodegeneración y aunque parece que una cantidad relativamente larga de datos apoya esta idea, el circuito patrón ahora se divulgará que orquestra todos los subcircuitos regulatorios individuales, es decir, citoquinas (IL-1, IL-6,IL-12) y otros.
5.
Adicionalmente, se podría mencionar que Nature ha introducido en prioridad la neuroprotección y un SNC inmunoprivilegiado antes de la neuroregeneración: hasta ahora, se ha podido demostrar que el SNC inmunoprivilegiado y altamente protegido (protegido en especial contra ataques inmunes y apoptosis neuronal), que es en parte significativa debido al sistema de TGF-ß, tiene deficiencias en la neuroregeneración debido a exactamente este privilegio y debido a la misma molécula TGF-ß. El concepto evolucionista parece hablar en favor de la neuroprotección aguda de un SNC altamente complejo y su más complejo funcionamiento; en este contexto, neuroregeneración individual parece ser menos importante para la evolución que la neuroprotección del individuo.
El circuito regulatorio
[0005] Desde el punto de vista fisiológico, la neurogénesis del cerebro permite una reparación/sustitución de células neuronales, oligodendrogliales o astrocíticos que no funcionan bien o que están envejecidas mediante células precursoras respectivas. La neurogénesis para reparación en el cerebro se regula por el sistema de TGF-ß-TGF-R (en especial TGF RII, pero también TGF RI), mediante el fluído cerebroespinal; los orquestradores principales son células micogliales/macrófagos de linaje que producen el TGF-ß y que lo secretan por espacio extracelular hacia adentro el compartimiento del LCE (así como dentro de vitreo, endolimfáticos), y células precursoras /células madres neuronales, que reciben esta señal por el LCE (así como hacia adentro vitreo, endolimfáticos) mediante TGF-RII o TGF-RI altamente expresado sobre sus estructuras supferficiales, o un revestimiento ependimal con receptores idénticos. En la mayoría de la patología del SNC, la neurogénesis está gravemente afectada o no funciona bien. La regulación de la neurogénesis se ajusta, normalmente suprimida (!) por la activación de células microgliales/macrófagos desde el SNC, que occurre en el contexto de toda patología específica de enfermedad. Células microgliales activadas/macrófagos suprimen por esta vía – LCE a zona subventricular/otras zonas neurogénicas – la regeneración de la parénquima del cerebro neurodegenerativo, agudamente y crónicamente inflamatorio, hipóxico, aterosclerótico o envejecido. Se afecta no sólo la diferenciación neuronal, pero también linajes de células oligodendrogliales y astrocíticas. Todas las moléculas que influyen en este circuito para mejorar la regeneración neuronal/oligodenroglial/astrocítica se reclaman como tratamiento. Métodos para diagnóstica, profilaxis, prevención o prognosis de una patología del SNC que aplican este circuito son también muy importantes, posiblemente para cntrolar los efectos de una intervención terapéutica.
Breve Descripción de las ilustraciones
[0006]
Fig. 1: TGF-beta1 inhibe la proliferación de células madres y precursoras neurales de roedores adultos
A) Cultivos de células madres y precursoras neurales (CMN) de roedores adultos se trataron con diferentes concentraciones (0, 5, 10, 50 ng/ml) de TGF-beta1 recombinante humano durante 7 días. En el día 7, células viables se contaron por medio de un ensayo de Trypan Blue en un hemocitómetro. Los datos se indican como números medios de células ± SD (standard desviation, desviación estandár) a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado. B) muestra el efecto de TGF-beta1 sobre células precursoras neurales humanas fetales.
Fig. 2: El efecto de TGF-beta1 sobre CMNes es reversible
Cultivos de células madres y precursoras neurales de roedores adultos se trataron con 10 ng/ml de TGFbeta recombinante humano durante 7 días. En el día 7, las células se disociaron, se las contó por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus y células previamente tratadas se sembraron otra vez en con o sin 10 ng/ml de TGF-beta1. Este procedimiento se hizo todas las 7 días. Los datos se indican como números medios de células ± SD a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado.
Fig. 3: Anticuerpos contra TGF-betaRII pueden reducir efectos de TGF-beta1 sobre células madres neurales de rodeores adultos
durante 7 días en la presencia o la ausencia de anticuerpo de anti-TGF-bet células viables se contaron por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro. Los datos se indican como números medios de células ± SD a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado.
Fig. 4: TGF-RII soluble inhibe la supresión inducida por TGF-ß1 de la proliferación de CMNes
Cultivos de CMNes de roedores adultos se trataron con 10 ng/ml de TGF-beta1 recombinante humano durante 7 días en la presencia o la ausencia de anti-TGF-betaRII soluble (500 ng/ml). En el día 7, células viables se contaron por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro. Los datos se indican como números medios de células ± SD a partir de tres experimentos que se hicieron por triplicado.
Figura 5:
Células que expresan TGF-ßRII pueden aislarse mediante utilización de técnicas de selección de células
CMNes de rodeores adultos se prepararon como ya se ha descrito en el ejemplo 1. Células que expresaron TGF-bRII se purificaban mediante la utilización de anticuerpos contra TGF-bRII. A eso de un 20% de CMNes expresan el receptor y esta población de células puede enriquecerse mediante este enfoque.
Fig. 6: Oligonucleótidos antisentido contra TGF-βRII inhiben la regulación hacia abajo inducida por TGF-β1 de proliferación in vitro de células adultas madres y precursoras neurales.
Se mostró que la inhibición inducida por TGF-β1 de la proliferación de células madres y precursoras neurales se bloquea completamente y específicamente debido al tratamiento antisentido.
Fig. 7: Tratamiento in vivo con oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII salva el bloqueo inducido por TGF-β1 de proliferación de células en el cerebro adulto.
La figura 7 demuestra la regulación hacia abajo inducida por el TGF-β1 de la proliferación de células en la convolución del hípocampo dentado (figura 7A) y en la zona subventricular (figura 7B). Tratamiento con oligonucléótidos sin sentido no bloqueó este efecto, mientras que tratamiento con oligonucleótidos antisentido bloqueó el efecto de TGF-β1 (figura 7°A y B)
Fig. 8: Tratamiento in vivo de oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII impide el bloqueo inducido por TGF-β1 de proliferación de células en el cerebro adulto.
La figura 8 demuestra que la regulación hacia abajo inducida por el TGF-β1 de proliferación de células en la circonvolución dentada del hípocampo (figura 8A°) y en la zona subventricular (figura 8B) puede impedirse por tratamiento previo con oligonucleótidos antisentido de TGF-βRII.
[0007] En las enfermedades arriba descritas, células microgliales, y posiblemente macrófagos perivasculares en reposo son atraídas desde agregaciones de proteínas, células muertas y rotas, inflamación, respuesta inflamatoria en aterosclerosis o muerte de células asociada con un traumatismo agudo/hipoxía. Este puede ser un proceso agudo, subagudo o crónico. Durante el proceso de activación, la población activada de células microgliales (incluyendo macrófagos de la pared del vaso o de otras fuentes) libera una cantidad de citoquinas inflamatorias hacia adentro la matriz extracelular y ésos se van hacia adentro pequeñas vénulas, o directamente al espacio LCE. Estas citoquinas alcanzarán el compartimiento LCE y serán disponibles inmediatamente en todos los lugares que son rodeados con LCE en cierta medida. Entre estas citoquinas se cuenta TGF-beta. Se demostró (Monje, M. L.,
H. Toda, et al. (2003). "Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis." Science 302 (5651) : 17601765) que la neuroinflamación inhibe la neurogénesis y que un bloqueo inflamatorio con indometacina, una fármaco corriente no esteroídeo anti-inflamatorio, restablece la neurogénesis después de inflamación inducida por endotoxinas y aumenta la neurogénesis después de irradiación cranial.
[0008] No obstante, el arte anterior no divulga TGF-beta como el principal regulador que regula hacia abajo la neurogénesis o neuroreparación después de herida o bajo condiciones patológicas. Al contrario, el arte anterior consideraba TGF-beta como un agente neuroprotectivo que impide la muerte celular de neuronas heridas o lesionadas, y intenaba regular hacia arriba TGF-beta en condiciones de enfermedad del SNC.
[0009] Zhang et al. (Zhang, J. M., R. Hoffmann, et al. (1997). "Mitogenic and antiproliferative signals for neural crest cells and the neurogenic action of TGF-beta1." Dev. Dyn. 208(3) 375-386.) demuestran que TGF-beta tiene un efecto sobre células en desarrollo de la cresta neural de codornices . Aquí, la proliferación inducida por TGF-beta de células neurales pluripotentes de cresta (y/o sus derivados inmediatos) y de células melanogénicas correspondientes, causando una disminución del tamaño de la colonia. Adicionalmente y en contrario a la presente invención, la neurogénesis aumentó considerablemente en la presencia de TGF-beta. El número por colonia de células adrenérgicas y precursoras de neuronas sensoriales aumentaron en colonias positivas de neuroblastos tratadas con TGF-beta.
[0010] TGF-betas tienen papeles importantes en el crecimiento y la diferenciación de células, el desarrollo de órganos, la formación de la matriz, las funciones de la reparación de heridas y funciones inmunes. Mientras que TGF-beta es una sustancia poderosa para la inhibición de crecimiento de muchos tipos de células, estimula la proliferación de fibroblastos y de osteoblastos. También, es un estimulador poderoso de producción extracelular de matriz por fibroblastos y osteoblastos, inhibe la degradación de matriz y regula hacia arriba receptores para la interacción de la matriz. TGF-beta1 ha sido implicado como un factor clave causativo en la patogenesis de la fibrosis del hígado y por lo menos un mediador decisivo de los efectos beneficiosos y perjudiciales de la ciclosporina A sobre el sistema inmune y el riñón. Adicionalmente, se ha mostrado que diferentes enfermedades progresivas crónicas del riñón en seres humanos y modelos experimentales están asociadas con la estimulación del sistema de TGF-beta.
[0011] TGF-beta1 regula hacia abajo quinasas G1 y G2 dependientes del ciclina y ciclinas en cuanto a la actividad de quinasa así como a la cantidad de proteína. TGF-beta1 también inhibe la fosforilación del producto del gen pRb supresor del tumor retinoblastoma en residuos múltiples de serina y de treonina en células mieloides humanas de leucemia. El pRB subfosforilado se asocia con el factor de transcripción E2F-4 en fase G1, mientras que el pRb fosforilado principalmente se enlaza a E2F-1 y E2F-3. Como TGF-beta1 regula hacia arriba el p130 (miembro de la familia pRb) /formación del complejo E2F-4 y regula hacia abajo p107 (miembro de la familia pRb)/ formación del complejo E2F-4, con níveles de E2F-4 que permanecen constantes, estos resultados proponen que E2F-4 es cambiado de p107 a pRb y p130 cuando células salen del ciclo de células y se frenan en G1 por la acción del TGFbetaI. El “inhibidor cdk” p27 es un regulador positivo así como negativo del control del ciclo celular mediado por TGF-betaI. Aunque se dice que el TGF-beta1 es un inhibidor eligido de células primitivas hematopoyéticas madres normales, el TGF-beta inhibe linajes de células de leucemia mieloide primitivas así como más diferenciadas. La actividad neuroprotectivo, su papel en el desarrollo neural y su papel en la modulación de respuestas inmunes del TGF-beta1 se consideró más importante. Se ha mostrado en un número de estudios que TGF-beta1 es neuroprotectivo in vitro e in vivo. Estudios de agonistas han demostrado que TGF-beta1 reduce la muerte de células neuronales y la extensión de infarto que sigue la occlusión media de arterias cerebrales (middle cerebral artery occlusion; MCAO), mientras que al revés, estudios de antagonistas han mostrado que la muerte de células neuronales y la extensión del infarto después de MCAO son más aumentadas y así han indicado que TGF-beta1 desempeña un papel neuroprotectivo en la isquemia cerebral. Trabajos recientes con la sobrexpresión de TGFbeta1 por adenovirus in vivo en ratones además ha implicado un papel neuroprotectivo para TGF-beta1 en la isquemia cerebral, como lo ha demostrado una reducción de la muerte de células neuronales, la extensión de infarto y las consecuencias neurológicas. Adicionalmente estudios numerosos in vitro han documentado la capacidad neuroprotectivo de TGF-beta1 en neuronas de una variedad de especies, incluyendo ratas, ratones, pollos y seres humanos. De interés significativo, TGF-beta1 se ha mostrado ser protectivo contra una gran variedad de agentes/insultos que inducen la muerte, incluyendo hipoxía/isquemia, excitotoxicidad de glutamato, daño amiloide, oxidativo y virus de la inmunodeficiencia humana. El efecto neuroprotectivo de TGF-beta1 se ha relacionado con su capacidad de mantener el potencial de la membrana mitocondrial, de estabilizar la homeostasia de Ca2+, de aumenatar la expresión de las proteínas anti-apoptóticos de Bcl-2 y de Bcl-xl, de inhibir la activación de la caspasa-3 y de inducir el inhibidor-1 del activador plasminógeno. Estudios con células madres embrionarias han demostrado una célula madre neural primitiva como un compuesto de especificación de linaje neural que es negativamente regulada por señalización relacionada con TGF-beta. Expresión endógena de TGF-alpha, otro miembro de la familia de TGF, ha mostrado que regula positivamente la neurogénesis de adultos. TGF-alpha es necesario para la proliferación completa de células progenitores presentes en la subependima y la producción completa de precursores neuronales que migran hacia el bulbo olfatorio. En ratones KO de TGF-alpha, la proliferación de estas células progenitoras también es disminuido con la edad, debido a la prolongación del ciclo celular. Envejecimiento o la ausencia de TGF-alpha endógeno no afecta los números de células madres neurales aisladas in vitro en la presencia de factor de crecimiento epidermal.
[0012] El uso de TGF-beta para la inmunomodulación en seres humanos está gravemente limitado por razón de su toxicidad, incluyendo estimulación excesiva de producción de matriz, nefrotoxicidad y otros efectos detrimentales. TGF-beta tiene potencial oncogénico y ha sido implicado en glomerulopatías, fibrosis pulmonar, esclerodermia y en el síndrome crónico del injerto contra el huespéd. Adicionalmente, mientras TGFbeta es una citoquina inmunosupresiva muy poderosa, múltiples líneas de evidencia indican que una estimulación crónica de la expresión de TGF-beta – relacionado con enfermedades o en modelos de animales transgénicos – puede paradójicamente llevar a o aumentar la inflamación autoinmune.
[0013] La solicitud de Patente Internacional WO 03000656 A se refiere a compuestos antisentido para modular la expresión del TGF-beta receptor II. La WO 03000656 A divulga oligonucleótidos que hibridizan con la región que engloba el inicio de la traslación del marco de lectura abierto del gen que codifica el TGF-RII . Pero dichos oligonucleótidos no fueron suficientes para inhibir la traslación del ARNm complementario.
[0014] Es creciente la evidencia que las propiedades poderosas de TGF-beta como un regulador negativo de respuestas inmunes de células T desempeñan un papel clave en la patofisiológica de una variedad de patologías del SNC. Por esa razón, esta citoquina se considera como un péptido relacionado con heridas y como un objetivo posible de intervención terapéutica. La neuroinflamación y la patología microglial son asociadas con muchas enfermedades neurológicas. Aquí, las más clásicas enfermedades son claramente enfermedades neuroinmunológicas tales como la esclerosis múltiple. Pero también incluye enfermedades de cognición en las que principalmente pérdidas de memoria ocurren, tales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia de cuerpos de Lewy, demencia compleja del SIDA, demencia vascular, o menos principalmente, tales como enfermedad de Pick, parálisis progresiva supranuclear, degeneración corticobasal, y la enfermedad de Creutzfeld-Jakob.
Adicionalmente, programas inflamatorios son activados después de lesiones agudas tales como infarto, heridas traumáticas del cerebro y espinales. En diferentes modelos animales para la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, una activación de microglia y una regulación hacia arriba de TGF-beta1 han sido reportados (Baker, C. A., Z. Y. Lu, et al. (1999). “Activación microglial varia en diferentes modelos de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob.” J Virol 73(6): 5089-5097).
Entre los cientas de enfermedades neurodegenerativas diferentes, más atención se ha prestado sólamente a un puñado de éstas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis amiotrópica lateral. Vale mencionar que los mismos procesos neurodegenerativos pueden afectar diferentes regiones del cerebro, lo que resulta en el hecho de que una enfermedad definida parece muy diferente desde un punto de vista sintomático. Enfermedades neurodegenerativos del sistema nervioso central (SNC) pueden clasificar según enfermedades de la corteza cerebral (enfermedad de Alzheimer), de los ganglios basales (enfermedad de Parkinson), del tronco cerebral y del cerebelo o de la médula espinal (esclerosis amiotrópica lateral).
[0015] Ejemplos de neurodegeneración y de enfermedades neurodegenerativas son : la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), variante nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD), la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofía multisistema, demencia, demencia frontemporal, enfermedades de neuronas motoras, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs), esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, trastornos autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (MS), lesiones isquémicas /hipóxicas agudas, infarto, traumatismo del SNC, traumatismo de la cabeza, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger, (Leucoaraiosis), degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil tremor/ataxia (FXTAS), Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP), degeneración estriadonigral (SND), degeneración olivopontocerebeloso (OPCD), síndrome de Shy Drager (SDS).
Influir en los níveles de TGF-beta1
Regulación hacia arriba de TGF-beta1 y sus efectos
[0016] Muchos estudios intentaron aumentar los níveles de TGF-beta para fines neuroprotectivos o inmunoreguladores. Estudios de agonistas han demostrado que TGF-beta1 reduce la muerte de células neuronales y la extensión de infarto siguiendo la occlusión media de arterias cerebrales (middle cerebral artery occlusion; MCAO), mientras que al revés, estudios de antagonistas han mostrado que la muerte de células neuronales y la extensión del infarto después de MCAO están más aumentadas y así se ha supuesto que TGF-beta1 desempeña un papel importante en la isquemia cerebral. Trabajos recientes con la sobrexpresión de TGF-beta1 mediada por adenovirus in vivo en ratones además ha implicado un papel neuroprotectivo para TGF-beta1 en la isquemia cerebral, como lo ha demostrado una reducción de la muerte de células neuronales, de la extensión de infarto y de las consecuencias neurológicas. Adicionalmente numerosos estudios in vitro han documentado la capacidad neuroprotectiva de TGF-beta1 en neuronas de una variedad de especies, incluyendo ratas, ratones, pollos y seres humanos. De interés significativo, se ha mostrado que TGF-beta1 es protectivo contra una gran variedad de agentes/insultos que inducen la muerte, incluyendo hipoxía/isquemia, excitotoxicidad de glutamato, daño betaamiloide, oxidativo y virus de la inmunodeficiencia humana. El efecto neuroprotectivo de TGF-beta1 se ha relacionado con su capacidad de mantener el potencial de la membrana mitocondrial, de estabilizar la homeostasia de Ca2+, de aumentar la expresión de las proteínas anti-apoptóticos Bcl-2 y Bcl-xl, de inhibir la activación de la caspasa-3 y de inducir el inhibidor-1 del activador plasminógeno.
[0017] El uso de TGF-beta para la inmunomodulación en seres humanos está gravemente limitada por razón de su toxicidad, incluyendo estimulación excesiva de producción de matriz, nefrotoxicidad y otros efectos detrimentales. TGF-beta tiene potencial oncogénico y ha sido implicado en inglomerulopatías, fibrosis pulmonar, esclerodermia y en el síndrome crónico del injerto contra el huespéd. Adicionalmente, mientras que TGFbeta es una citoquina inmunosupresiva muy poderosa, múltiples líneas de evidencia indican que una estimulación crónica de la expresión de TGF-beta – relacionado con enfermedades o en modelos de animales transgénicos – pueden paradójicamente llevar a o aumentar la inflamación autoinmune.
[0018] Nuestras conclusions principales son que el mismo TGF-ß cuyos efectos neuroprotectivos sobre el SNC arriba mencionado se han descrito, es la mólecula principal reguladora negativa de la reparación de células madres del SNC en fisiología y en casi toda patología del SNC : TGF-ß – producido por células microgliales (sea a níveles fisiológicos bajos o a níveles más altos como respuesta a una enfermedad), penetra a través de la matriz intercelular hacia adentro el líquido cerebroespinal. Aquí, puede interagir libremente y directamente con TGF-RII y TGF-RI altamente regulados y expresados sobre la población de células precursoras/madres del SNC en la zona subependimal de la capa de células que contiene progenitores o posiblemente otras zonas de neoformación de células madres del SNC. Las consecuencias consisten en una regulación negativa, resultando en una neoformación baja de células madres en el caso de níveles altas de TGF-ß del LCE y viceversa. Fuera de lo común y más sorprendemente, el nível extremamente alto de la expresión y de la actividad de TGF-RII está localizado en el
sitio de la proliferación de células precursoras/madres, en nuestros experimentos, la ZSV (zona subventricular, SVZ, subventricular zone) o el hipocampo. Fuera de lo común es también la transmisión de la señal a través de una solución de tampón, así como por ejemplo el líquido cerebroespinal (LCE). Por esa razón, es un circulo regulatorio completo, donde regulación fisiológica y patológica son muy similares, pero sólamente varian en cuanto a la 5 intensidad (en otras palabras: el nivel de TGF-ß en el LCE, y el nivel de la expresión de TGF-R en las células de destino). El fenotipo individual de la patología de una enfermedad se caracteriza por cambios muy diversos, así como deficiencias genéticas (por ejemplo sinucleínopatias, dismutasa superóxida, mutaciones, trastornos de repetición de trinucleótidos) o traumatismo, hipoxia, enfermedades vasculares o inflamación o envejecimiento del SNC. El ejecutor de la patología de las enfermedas, sin embargo, siempre es el TGF-ß producido por una población de células microgliales/macrófagos: Por un lado, es neuroprotectivo y inmunosupresivo, ayuda a frenar el daño inflamatorio agudo de la parencima y la pérdida neuronal posiblemente causada por la patología de la enfermedad. Indirectamente – como una cabeza de Jano – la misma molécula impide la reparación del daño en el SNC por sus propias células madres/precursoras en que influye en el bucle de TGF-ß - TGF-R en el nivel de células precursoras o madres, por lo que considerablemente suprime la proliferación de células madres. En este caso, como células
15 madres no se deberían considerar sólamente las células derivadas de células precursoras desde adentro del SNC, sino también se deberían considerar las células precursoras/madres que intentan invadir la parencima del SNC desde los vasos, respectivamente la médula ósea. Esto también quiere decir que mediante disminución de los níveles de TGF-ß en la parencima, los efectos neuroprotectivos/inmunosupresivos sobre el SNC se destrozarían, lo que llevaría a un daño grave y agudo por causa de inflamación y/ apoptosis directa neuronal.
[0019] Una intervención local en el nivel de TGF-R por esa razón parece ser la única vía para alcanzar una intervención estable en favor de la reparación que no pone en peligro los efectos beneficiales de TGF-ß para el cerebro. Así, la presente invención se refiere a oligonucleótidos influyendo en la actividad biológica de TGF-beta1 sobre el acervo de células precursoras/madres que expresa el TGF-R. Dichos oligonucleótidos o formulaciones farmacéuticas que incluyen por lo menos un de dichos oligonucleótidos son útiles para la
25 diagnosis/profilaxis/prevención o el tratamiento de una enfermedad, en donde la neurogénesis o neuroregeneración tiene un efecto beneficioso. También son útiles en la prevención terapéutica (por ejemplo después de un infarto o una herida de la cabeza) – como mostrado en experimentos – antes de que los mecanismos abajo descritos sean efectivos.
[0020] El término de “influir” como utilizado aquí quiere decir modular, preferiblemente reducir o eliminar, la actividad
biológica de TGF-R y/o TGF-RII o su expresión. La modulación de la actividad biológica puede alcanzarse por interacción directa o enlace de un compuesto de TGF-R, preferiblemente, TGF-RII o por interacción indirecta, por ejemplo, por interacción con un compuesto que está asociado con la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-RII. Compuestos apropiados que actuan como agentes que apuntan TGF-betaRI, RII-RIII, -RIII, o su transducción de señales para influir en este circuito regulatorio con el objetivo de mejorar la neuroregeneración o de aumentar el
35 reclutamiento de células neuronales/hematopoéticos madres o precursoras hacia el SNC, incluyendo todos tipos de trasplante local o sistémico (por ejemplo propagación ex vivo, células alogénicas) se enumerarán aquí abajo :
(a)
Plásmidos, vectores o virus naturales/sintéticos/mutados, olignonucléotidos de diferentes tipos de modificación (por ejemplo PTO, LNA, 2’F-ANA, complejos de proteínas-nucleótidos, ARNi, ARNip o micro miRNA, metilmetoxi-, fosforoamidatados, ANP, morfolino, fosforoamidato, ciclohexen (CeNA), gapmers, ribozimas, aptameros,CpG-óligos, ADN-zimas, riboswitches, o lípidos, o lípidos que contienen moléculas,
(b)
péptidos, complejos de péptidos, incluyendo todos tipos de enlazadores,
(c)
moléculas pequeñas, modificadores de vehículos o caveoli,
(d)
modificadores del aparato de golgi,
(e)
anticuerpos y sus derivados, en especial quimeras, fragmentos Fab, fragmentos Fc, o
45 (f) portadores, liposomas, nanopartículas, complejos, o cualquier sistema de entrega que contiene los constructos arriba mencionados, pueden utilizarse para apuntar el circuito arriba mencionado para restaurar
o mejorar la neuroregeneración.
[0021] Sin embargo, entre los agentes arriba mencionados, más se prefieren oligonucleótidos antisentido, por que influyen en la formación de TGF-R o TGF-RII y en una fase muy temprana. Las ventajas principales de estas moléculas son su especificidad en cuanto al destino extremamente alta, combinada con su tolerancia sistémica y local extremamente buena; son muy apropiadas para una aplicación local hacia adentro del SNC, sea hacia adentro de la parecima o el espacio LCE. Adicionalmente, son muy estables y así pueden aplicarse fácilmente con un sistema implantado de bomba. También debe mencionarse su rentabilidad.
Así, realizacions preferidas de la presente invención, el compuesto útil para influir en la expresión del gene que 55 codifica TGF-R o TGF-RII, es un oligonucleótido antisentido.
[0022] La generación de oligonucleótidos apropriados incluye la determinación de un sitio o de sitios dentro del gen TGF-R o TGF-RII para interacción antisentido que debe tener lugar de mode que el efecto deseado, por ejemplo, la inhibición de la expression de la proteína, pueda resultar. Un sitio preferido intragénico es (a) la región alrededor del codón de la iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierta (ORF, open regarding frame)
del gen o (b) la región del ARNm que es un “bulto” o un “bucle”, es decir, no forma parte de una estructura
secundaria. Cuando se han identificado un o más sitios de destino, oligonucleótidos se eligen que son complementarios al destino de manera suficiente para alcanzar el efecto deseado, es decir, que hibridizan suficientemente bien y con específidad suficiente.
[0023] Así la presente invención se refiere a oligonucleótidos antisentido que tienen una subsecuencia del NIS 1 o del número de identificación de secuencia 2 o del NIS 94 o del NIS 95 o del NIS 96 que comprende 8 a 50 nucleobases y miméticos de éstos. Dichos oligonucleótidos representan una parte del NIS 1 o 2 o del NIS 94 a 96 con 8 a 50 bases nucleótidas. Además oligonucleótidos que comprenden 8 a 50 nuleobases no deben tener una subsecuencia exacta del NIS 1 o 2 o NIS 94 a 96. Es suficiente si los oligonucleótidos antisentido sean por lo menos idénticos a un 80%, preferiblemente a un 84%, más preferiblement a un 88%, y más preferiblemente a un 92% a una subsecuencia que se puede encontrar en una de NIS 1 o 2 o NIS 94 o 95 o 96. Oligonucleótidos preferidos tienen una secuencia que es por lo menos idéntica a un 80% a una subsecuencia del NIS 1 o 2 o 94 o 96 que comprende 8 a 50 nucleobases, en donde dicha secuencia es capaz de hibridizarse de manera suficiente con la región alrededor del codón de la iniciación o de la terminación de la traducción del marco de lectura abierto del gen codificando el TGF-R o TGF-RII, o una región del ARNm codificando TGF-R o TGF-RII que es un "bucle" o un "bulto" y que no es parte de una estructura secundaria. Esto quiere decir que estos oligonucleótidos antisentido tienen una secuencia que es por lo menos complementaria a un 80% a la region correspondiente del gen que codifica TGF-R o TGF-RII, o preferiblemente tienen una secuencia que es por lo menos a un 80% complementaria con (a) la región alrededor del codón de la iniciación o de la terminación de la traducción del marco de lectura abierta del gene que codifica TGF-R o TGF-RII, o (b) la región del mARN que codifica TGF-R o TGF-RII, que es un “bulto” o un “bucle”, es decir, no forma parte de una estructura secundaria.
[0024] Se prefieren oligunucleótidos antisentido de 8 a 50, preferiblemente 15 a 25 nucleobases, que son capaces de hibridizar suficientemente con la región alrededor del codón de la iniciacón o de la terminación de la traducción del marco de lectura abierto del gene que codifica TGF-R o TGF-RII, o una región de la ARNm que codifica TGF-R o TGF-RII que es un “bulto” o un “bucle” y que no es parte de una estructura secundaria.
[0025] Se prefieren las siguientes secuencias alargadas del NIS 3 que pueden representarse por la siguiente fórmula general:
5'-XCAGCCCCCGACCCATGZ-3'
en donde X se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos:
ACAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, AGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, ACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, ATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, TGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, TGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GCAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, CAGCGGCCACAGGCCCCTGAG, AGCGGCCACAGGCCCCTGAG, GCGGCCACAGGCCCCTGAG, CGGCCACAGGCCCCTGAG, GGCCACAGGCCCCTGAG, GCCACAGGCCCCTGAG, CCACAGGCCCCTGAG, CACAGGCCCCTGAG, ACAGGCCCCTGAG, CAGGCCCCTGAG, AGGCCCCTGAG, GGCCCCTGAG, GCCCCTGAG, CCCCTGAG, CCCTGAG, CCTGAG, CTGAG, TGAG, GAG, AG, G,
y en donde Z se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos:
GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGCC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAGC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGAG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCGA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACCG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGACC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGAC, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAGA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATAG, GCAGACCCCGCTGCTCGTCATA, GCAGACCCCGCTGCTCGTCAT, GCAGACCCCGCTGCTCGTCA, GCAGACCCCGCTGCTCGTC, GCAGACCCCGCTGCTCGT, GCAGACCCCGCTGCTCG, GCAGACCCCGCTGCTC, GCAGACCCCGCTGCT, GCAGACCCCGCTGC, GCAGACCCCGCTG, GCAGACCCCGCT, GCAGACCCCGC, GCAGACCCCG, GCAGACCCC, GCAGACCC, GCAGACC, GCAGAC, GCAGA, GCAG, GCA, GC, G,
y en donde X y Z juntos no comprenden más de 34 nucleobases y miméticos de las mismas.
[0026] Más se prefieren las siguientes secuencias de oligonucleótidos y variantes o miméticos de éstas:
NIS 3: 5'-CAGCCCCCGACCCATG-3'
NIS 29: 5'-CAGCCCCCGACCCATGGCAGACCC-3'
NIS 30:
5'-CAGCCCCCGACCCATGGCAGACC-3'
NIS 31:
5'-CAGCCCCCGACCCATGGCAGAC-3'
NIS 32:
5'-CAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3'
NIS 33:
5'-CAGCCCCCGACCCATGGCAG-3'
NIS 34:
5'-CAGCCCCCGACCCATGGCA-3'
NIS 35:
5'-CAGCCCCCGACCCATGGC-3'
NIS 36:
5'-CAGCCCCCGACCCATGG-3'
NIS 37:
5'-GCAGCCCCCGACCCATGGCAGACC-3'
NIS 38:
5'-GCAGCCCCCGACCCATGGCAGAC-3'
NIS 39:
5'-GCAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3'
NIS 40:
5'-GCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3'
NIS 41:
5'-GCAGCCCCCGACCCATGGCA-3'
NIS 42:
5'-GCAGCCCCCGACCCATGGC-3'
NIS 43:
5'-GCAGCCCCCGACCCATGG-3'
NIS 44:
5'-GCAGCCCCCGACCCATG-3'
NIS 45:
5'-AGCAGCCCCCGACCCATGGCAGAC-3'
NIS 46:
5'-AGCAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3'
NIS 47:
5'-AGCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3'
NIS 48:
5'-AGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3'
NIS 49:
5'-AGCAGCCCCCGACCCATGGC-3'
NIS 50:
5'-AGCAGCCCCCGACCCATGG-3'
NIS 51:
5'-AGCAGCCCCCGACCCATG-3'
NIS 52:
5'-GAGCAGCCCCCGACCCATGGCAGA-3'
NIS 53:
5'-GAGCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3'
NIS 54:
5'-GAGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3'
NIS 55:
5'-GAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3'
NIS 56:
5'-GAGCAGCCCCCGACCCATGG-3'
NIS 57:
5'-GAGCAGCCCCCGACCCATG-3'
NIS 58:
5'-TGAGCAGCCCCCGACCCATGGCAG-3'
NIS 59:
5'-TGAGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3'
NIS 60:
5'-TGAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3'
NIS 61:
5'-TGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3'
NIS 62:
5'-TGAGCAGCCCCCGACCCATG-3'
NIS 63:
5'-CTGAGCAGCCCCCGACCCATGGCA-3'
NIS 64:
5'-CTGAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3'
NIS 65:
5'-CTGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3'
NIS 66:
5'-CTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3'
NIS 67: 5'-CCTGAGCAGCCCCCGACCCATGGC-3' NIS 68: 5'-CCTGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 69: 5'-CCTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3' NIS 70: 5'-CCCTGAGCAGCCCCCGACCCATGG-3'
5 NIS 71: 5'-CCCTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3' NIS 72: 5'-CCCCTGAGCAGCCCCCGACCCATG-3'
[0027] Aún más se prefieren las siguientes secuencias de oligonucleótidos así como variantes y miméticos de éstas : NIS 34: 5'-CAGCCCCCGACCCATGGCA-3' NIS 35: 5'-CAGCCCCCGACCCATGGC-3'
10 NIS 36: 5'-CAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 41: 5'-GCAGCCCCCGACCCATGGCA-3' NIS 42: 5'-GCAGCCCCCGACCCATGGC-3' NIS 43: 5'-GCAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 44: 5'-GCAGCCCCCGACCCATG-3'
15 NIS 49: 5'-AGCAGCCCCCGACCCATGGC-3' NIS 50: 5'-AGCAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 51: 5'-AGCAGCCCCCGACCCATG-3' NIS 56: 5'-GAGCAGCCCCCGACCCATGG-3' NIS 57: 5'-GAGCAGCCCCCGACCCATG-3'
20 NIS 62: 5'-TGAGCAGCCCCCGACCCATG-3' [0028] No son incluidos en el ámbito de las reivindicaciones de la presente sustancia las dos siguientes secuencias
conocidas : 5'-GATCTTGACTGCCACTGTCTC-3' (J. Clin. Endocrinology & Metabolism 2003, 88(10), 4967-4976) y 5'-CATGGCAGCCCCCGTC-3' (Developmental Biology 1996, 180, 242 – 257). [0029] Particularmente se prefiere la secuencia NIS 3: 5'-CAGCCCCCGACCCATG-3'.
25 [0030] Por consiguiente, la presente invención se refiere también a secuencias que son muy relacionadas con cualquiera de NIS 3 o NIS 93. A dichas secuencias se las denominará « variantes » aquí. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser modificados de múltiples maneras diferentes. Modificaciones dentro de la cadena principal (backbone) son posibles y se refieren a oligonucleótidos en donde los átomos fósforos son parcialmente o completamente sustituidos por otros átomos en su cadena principal internucleósida . Oligonucleótidos modificados
30 preferidos incluyen por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriéster, aminoalquil fosfotriésteres, metil, etil y C3–C10–alquil fosfonatos incluyendo 3’-alquilen y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamitdatos incluyendo 3’-amino-fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3’-5’ normales, análogos 2’-5’enlazados de éstos, y los que tienen polaridad invertida, en donde las parejas adyacentes de unidades de
35 nucleósidos están enlazadas 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. Diferentes sales, sales mezcladas y ácidos libres de los mismos también son incluidos.
[0031] También se prefieren variants de NIS 3 a NIS 93 en donde en el extremo terminal 3’ y/o en el extremo terminal 5’ se añaden 1, 2, 3, 4, o 5 otras nucleobases. Tales otras nucleobases son preferiblemente las cinco nucleobases en las NIS 1, 2, 94 o 96 que se añaden directamente delante de o detrás de las secuencias respectivas.
40 Además, dichas variantes pueden tener 1, 2, 3, o 4 cambios de nucleobases, es decir, dentro de dichas variantes preferidas, un, dos, tres o cuatro nucleótidos pueden ser sustituidos por otra nucleobase. Se debería poner enfásis en el hecho de que estas variantes pueden también contener cualquier de las modificaciones de la cadena prinicpal
o de la base o del grupo azúcar divulgadas aquí, tales como cadenas principales de fosforotionato.
[0032] Cadenas principales modificadas de oligonucleótidos preferidas que no incluyen un átomo fósforo tienen 45 estructuras que se forman por enlaces internucleósidos de alquilos de cadena corta o de cicloalquil, de enlaces internucleósidos de heteroátomos y alquil o cicloalquil. Se incluyen las que tienen enlaces morfolino (formados en
parte desde el grupo de azúcar del nucleósido); cadenas principales de siloxano, cadenas principales de sulfuro, de sulfóxido y de sulfona; cadenas principales de formacetil y tioformacetil; cadenas principales de metileno formacetil y de tioformacetil, estructuras que contienen alqueno, estructuras de sulfamato; estructuras de metilenoimino y metilenohidrazino; estructuras de sulfonato y de sulfonamido; estructuras de amidas, mezclas de los tipos arriba mencionados de estructuras y otras estructuras en las que se mezclan partes de compuestos de N, O, S, P, y CH2.
[0033] Otras realizaciones preferidas de la presente invención comprenden oligonucleótidos con estructuras de fosforotioato o heteroátomos, y en particular con –CH2–NH–O–CH2–, –CH2–N(CH3)–O–CH2– (conocidas como un metileno (metilimino) o estructuras MMI), –CH2–O–N(CH3)–CH2–, –CH2–N(CH3)–N(CH3)–CH2– y –O–N(CH3)–CH2–CH2– (en donde la cadena principal natural de fosfodiéster está representada como O–P–O–CH2– ). También oligonucleótidos que tienen grupos de morfolino en su cadena principal o que tienen una cadena principal de morfolino o que tienen una cadena principal de aminoalquilamido se prefieren (véase más abajo). Oligonucleótidos pueden también tener miméticos de azúcar tales como grupos de ciclobutil en vez del azúcar de pentofuranosil.Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas
[0034] B se refiere al grupo de la base tal como el grupo de purina o de pirimidina que pueden ser derivatizados.
Otra modificación de los oligonucleótidos de la presente invención implica el proceso de enlazar de manera química a los oligonucleótidos un o más grupos o conjugados que aumentan la actividad, la distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Oligonucleótidos modificados pueden también contener un o más grupos de azúcar sustituidos o modificados. Oligonucleótidos preferidos comprenden un de los siguientes grupos en la posición 2’: – OH, –F, –O-alquil, –S-alquil, –N-alquil, –O-alquenil, –S-alquenil, –N-alquenil, –O-alquinil, –S-alquinil, –N-alquinil, –O-alquil–O-alquil, en donde el alquil, alquenil y alquinil pueden ser C1 a C10 alquil sustituido o no sustituido o C2 a C10 alquenil y C2 a C10 alquinil. Un grupo de azúcar modificado particularmente preferido es un grupo de azúcar de 2’-O-metoxietil (2'–OCH2CH2OCH3, también conocido como 2’O-(2-metoxietoxi) o 2’-MOE) y 2’-dimetilaminooxietoxi tal como O(CH2)2ON(CH3) (conocido como 2’-DMAOE). También se prefieren particularmente O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, O(CH2)nON[(CH2)n CH3], en donde n y m cada uno son independientemente del otro números enteros de 1 a 10. Otras modificaciones preferidas incluyen 2’-metoxi, 2’-aminopropoxi y 2’-fluoro. Oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los grupos siguientes en la posición 2’: –OCH3, –OC2H5, –OC3H7, –O–cyclo-C3H5, – OCH(CH3)2, –OC(CH3)3, –OC4H9,
OCH2 –NO2, –F, –Cl, –Br, –I, –N3, –CN, –OCN, –NCO, – SCN, –NCS, –COCH3, –COC2H5, –COC3H7, –CO–ciclo-C3H5, –COCH(CH3)2,
–SH, –SCH3, –SC2H5, – SC3H7, –S–ciclo-C3H5, –SOCH3, –SOC2H5, –SOC3H7, –SO–cyclo-C3H5, –SO2CH3, –SO2C2H5, –SO2C3H7, – SO2–ciclo-C3H5, –NH2, –NHCH3, –NHC2H5, –NHC3H7, –NH–ciclo-C3H5, –N(CH 3)2, –N(C2H 5)2, –N(C 3H7)2, –N(ciclo-C3H 5)2, –N[CH(CH 3)2]2 C2H5, C3H 7, CH(CH3)2, C4H9, CH2 CH(CH3)2, CH(CH3) C2H5, C(CH3)3, C5H11, CH(CH3)–C3H7, –CH2–CH(CH3)–C2H5, –CH(CH3)– CH(CH3)2, –C(CH3)2–C2H5, –CH2–C(CH3)3, –CH(C2H5)2, –C2H4–CH(CH3)2, C6H13, –C3H6–CH(CH3)2, –C2H4–CH(CH3)–C2H5, –CH(CH3)–C4H9, –CH2–CH(CH3)–C3H7, –C2H4–C(CH3)3, –CH(CH3)–CH2–CH(CH3)2, – CH(CH3)–CH(CH3)–C2H5, –CH2–CH(CH3)–CH(CH3)2, –CH2–C(CH3)2–C2H5, –C(CH3)2–C3H7, –C(CH3)2– CH(CH3)2, –CH(CH3)–C(CH3)3, C7–C10 alquil, C1–C10 alquil sustituido, alquilaril, arilalquil, O–C1–C10 alquil, O-arilalquil, heterocicloalquil, heterocicloalquil, amnoalquilamino, polialquilamino, silil sustituido, un grupo que se separa del ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de los oligonucleótidos, o sustituyentes que tienen propiedades similares. También se prefieren las deoxinucleobases (deoxy nucleobases).
[0035] Modificaciones similares también pueden hacerse en otras posiciones en el nucleótido, particularmente en la posición 3’ del azúcar en el nucleótido terminal o en oligonucleótidos 2’-5’ -enlazados en la posición 5’ del nucleótido
5’-terminal. [0036] Modificaciones preferidas pueden representarse por el siguiente fragmento de estructura:
en donde
R representa cualquiera de los sustituyentes arriba mencionados para posición 2’ y especialmente –H, –F, –OH, – NH2, –OCH3, –OCH2CH2OCH3, X y X’ son independientemente el uno del otro –O–, –NH–, –S–, –CH2–, e
15 Y representa –O-, –S-, –N(CH3)2, –OCH3, –SCH3.
[0037] Además, oligonucléotidos puramente diastereoméricos o miméticos o variantes de los mismos son preferidos.
En especial se prefieren Sp-y Rp-diastereomeros:
O
O
20 OR OR
O
O
O
Rp diastereomer Sp diastereomer
[0038] Más se prefieren las secuencias NIS 3, 29-32 y 34-72, y en especial NIS 3, en donde una o más modificaciones que son divulgadas aquí están presentes. Se prefieren los fracciones de fosforotioato en la cadena principal o cadenas principales completas de fosforotioato y dentro de dichos fosforotioatos se prefieren los
30 diastereomeros Rp y Sp.
[0039] Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención puede también incluir sustituciones de nucleobases. Las nucleobases son las cuatros bases estándar, la adenina (A), la timina (T), la guanina (G) y la citosina (C). Nucleobases modificados incluyen otras nucleobases sintéticos y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquil de adenina y guanina, 235 propil y otros derivados alquil de adenina y guanina, uracilo (U), 6-carboxiuracilo, N6-metil-adenina, 5-halouracilo, 5halocitosina, 5-propinil uracilo, 5-propinil citosina, 6-azo uracilo, 6-azo citosina, 6-azo timina, 5-uracilo (seudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo-, 8-amino-, 8-tiol-, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otros adeninas y guaninas 8-sustituidos ; 5-halo- en particular 5-bromo-, 5-trifluorometil- y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina ; 7-metiladenina, 8azaguanina, 8-azaadenina, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, 3-deazaguanina y 3-deazaadenina, 2-thiouracilo, 2
40 tiotimina y 2-tiocitosina etc., en donde las sustituciones 5-metilcitosina se prefieren como estás modificaciones han mostrado que aumentan la estabilidad de ácido nucléico y de la hélice doble.
[0040] “Oligonucleótido” se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucléico (ARN) o de ácido
desoxirribonucléico (ADN) o miméticos o variantes de éstos. Este término incluye oligonucleótidos que se componen de nucleobases que ocurren naturalmente, azúcares y enlaces internucleósidos (de la cadena principal) 45 así como oligonucleótidos que tienen fracciones que no ocurren naturalmente que funcionan de manera similar. A
estos oligonucleótidos modificados o sustituidos se las prefiere a las formas naturales a causa de propiedades deseables tales como, por ejemplo, absorbción celular aumentada, afinidad aumentada para apuntar el ácido nucléico y estabilidad aumentada en la presencia de nucleasas. Mientras oligonucleótidos antisentido son formas preferidas del compuesto antisentido, la presente invención comprende otros compuestos antisentido oligoméricos, incluyendo pero no limitado a miméticos oligonucleótidos tales como arriba descritos. Los compuestos antisentido según esta invención comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleóbases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleósidos enlazados),preferiblemente 9 – 42, 10 – 36, 11 – 32, 12 – 30, 13 – 28, 14 – 26, y más preferiblemente 15 – 25 nucleóbases.
[0041] En particular, compuestos antisentido preferido son oligonucleótidos antisentido, aún más preferible son los que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleóbases.
[0042] Compuestos antisentido incluyen ribozimas, secuencias guía externa (EGS, external guide sequences), oligonucleótidos (oligozimas), y otros ARNs cortos catalíticos o oligonucleótidos catalíticos que hibridizan con el ácido nucléico de destino y inhiben su expresión.
[0043] El término de “sales” se refiere a sales fisiológicamente y/o farmaceúticamente aceptables de los
compuestos, en especial los oligonucleótidos antisentido de la presente invención. Sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se forman con bases inorgánicas son bases. Ejemplos para bases orgánicas y inorgánicas apropiadas son bases derivadas de iones de metales, por ejemplo aluminio, iones de metales alcalinos tales como sodio o potasio, iones de metales alcalinotérreo tales como calcio o magnesio, o un ion de una sal amina, hidróxidos, carbonatos o bicarbonatos de alcalinos o alcalinotérreos. Ejemplos incluyen LiOH, NaOH, KOH, NH4OH acuoso, carbonato potásico, amoníaco y bicarbonato sódico, sal de amonio, aminas primarias, secundarias y terciarias, tales como por ejemplo hidróxido de tetraalquilamonio, alquilaminas inferiores tales como metilamina, tbutilamina, procaína, atanolamina, arilalquilaminas tales como dibenzilamina y N,N-dibenziletilenodiamina, alquilpiperidinas inferiores tales como N-etilpiperidina, cicloalquilaminas tales como ciclohexilamina o diciclohexilamina, morfolina, glucamina, N-metil- y N,N-dimetilglucamina, 1-adamantylamina, benzatina, o sales derivadas de aminoáciods tales como arginina, lisina, ornitina, o amidas de aminoácidos originalmente neutras o ácidos, cloroprocaína, colina, procaína o otros.
[0044] Los compuestos de la invención que son básicos pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos orgánicos y inorgánicos. Ejemplos de ácidos apropiados para tal formación de sales mediante adición de sales son el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico , ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido salicílico, ácido p-aminosalicílico, ácido málico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido sulfónico, ácido fosfónico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido hidroximaléico, ácido pirúvico, ácido fenilacético, ácido benzóico, ácido p-aminobenzóico, ácido p-hidroxibenzóico, ácido metanosulfónico, etanosulfónico, ácido nitroso , ácido hidroxietanosulfónico, ácido etilenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftilsulfónico, ácido sulfanílico, ácido camforsulfónico, ácido china, ácido mandélico, ácido o-metilmandélico, ácido de hidrógeno benzenosulfónico, ácido pícrico, ácido adípico, ácido D-o-toliltartárico, ácido tartrónico, ácido α-toluico, ácido (o, m, p)-toluico, ácido sulfónico de naftilamina y otros ácidos minerales y carboxílicos bien conocidos a los expertos en la técnica. Las sales se preparan de la siguiente manera: se contacta la forma de base libre con una cantidad suficiente del ácido deseado para producir una sal según la manera conocida.
[0045] Las formas de base libre pueden regenerarse mediante tratamiento de la sal con una solución básica acuosa diluida apropiada tal como un hidróxido sódico diluido acuoso, carbonato potásico, bicarbonato de amoníaco y de sodio. Las formas de bases libres son diferentes sus sales correspondientes en cuanto a propiedades físicas particulares, tal como solubilidad en disolventes polares, pero las sales son por lo más equivalentes a sus formas correspondientes de bases libres para conseguir los fines de esta invención.
[0046] Como alternativa, la composición farmaceútica de la invención contiene un vector que permite transcribir un oligonucleótido antisentido de la invención, por ejemplo dentro de un huésped mamífero. Preferiblemente, tal vector es un vector que es útil para terapía génica. Vectores preferidos útiles para terapía génica son vectores virales, por ejemplo adenovirus, baculovirus, virus herpes, virus vaccinia, o más preferiblemente un virus ARN tal como un retrovirus. Aún más preferiblemente, el vectro retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Ejemplos de tales vectores retrovirales que pueden utilizarse en la presente invención son: Virus de leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus de sarcoma murina de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV) y virus de sarcoma de Rous (RSV). Más preferiblemente, un vector retroviral no humano de primates se utiliza, tal como virus de leucemia de mono de gibón (GaLV), que puede utilizarse en un campo más extenso de huéspedes en comparación con vectores murinos. Como retroviruses recombinantes son defectivos, es necesario que haya algo para producir partículas infecciosas. Eso puede consistir en la utilización de líneas de células coadyuvantes que contienen plásmidos que codifican todas los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias regulatorias dentro del LTR. Líneas de células adyuvantes apropiadas son bien conocidos a los expertos en la técnica. Dichos vectores pueden adicionalmente contener un gen que codifica un marcador de manera que se pueden identificar las células transducidas. Además, los vectores retrovirales pueden ser modificados de tal modo que son específicos de sus destinos. Esto puede lograrse por ejemplo mediante introducción de un polinucleótido que codifica un azúcar, de un glicolípido o una proteína, preferiblemente un anticuerpo. Los expertos en la técnica conocen otros métodos para generar vectores específicos de sus destinos. Otros vectores apropiados y métodos para la terapía génica in vitro o in vivo están descritos en la literatura y están conocidos por los expertos en la técnica, véase por ejemplo WO 94/29469 o WO 97/00957. Para que la expresión sólamente se realice en el órgano de destino, por ejemplo del tejido del cerebro, las secuencias ADN para la transcripción de los oligonucleótidos antisentido pueden ser enlazadas con un promotor específico del tejido respectivo y utilizadas para la terapía génica.
[0047] En el seno de una estructura de oligonucleótidos, a los grupos de fosfotato se los refiere normalmente como formando la cadena principal internucleósida del oligonucleótido. El enlace normal o cadena principal de ARN y ADN es un enlace 3’ a 5’ fosfodiéster. Ejemplos específicos de compuestos o variantes antisentido preferidos útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Oligonucleótidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen oligonucleótidos que tienen un átomo fósforo en la cadena principal y los que no tienen un átomo fósforo en la cadena principal. Cadenas principales de oligonucleótidos modificados que pueden resultar en una estabilidad aumentada son conocidos al experto en la técnica, tal modificación preferiblemente es un enlace fosforotionato o la sustitución de un o más grupos de fósfato (grupos de ácido fosfórico) por un grupo de fosfonato (ácido fosfónico) o por un grupo de sulfato (ácido sulfúrico) o por un grupo de sulfonato (ácido sulfónico) o por un sulfóxido. Un mimético de oligonucleótido preferido es un mimético de oligonucléotido que ha demostrado sus propiedades excelentes de hibridización y al que se refiere como ácido nucléico peptídico (ANP) En compuestos ANP, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido está sustituida por una cadena principal que contiene amidas, en particular por una cadena principal de aminoetilglicina. A las nucleobases se las retiene y se las enlaza directamente o indirectamente a átomos de aza nitrógeno de la porción de amida de la cadena principal (véase por ejemplo Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500.)
[0048] En el contexto de esta invención, el término de “hibridización” significa enlaces por puentes de hidrógeno, que pueden ser enlaces por puentes de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o enlaces revertidos de hidrógeno de Hoogsteen, entre bases complementarias de nucleósidos y nucleótidos. El término "complementario" como se lo utiliza aquí se refiere a la capacidad para formar parejas exactas entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición particular de un oligonucleótido es capaz de formar enlaces por puentes de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, el oligonucleótido y la ADN o ARN se consideran complementarios el uno al otro en esta posición. Los oligonucleótidos y el ADN o ARN son complementarios los unos a los otros cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula está ocupado por nucleótidos que pueden formar enlaces por puentes de hidrógeno los unos con los otros. De esa manera, "específicamente hibridizable" y “complementario” son términos que se utilizan para indicar un nivel suficiente de complementaridad o una formación exacta de parejas, de manera que hay formación específica de enlaces entre los oligonucleótidos y el destino ADN o ARN. Está conocido en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no debe ser complementario a un 100% con la secuencia de su ácido nucléico de destino para ser específicamente hibridizable Un compuesto antisentido es específicamente hibridizable cuando la formacíon de enlace del compuesto con la molécula de ADN o ARN de destino influye en la función normal del ADN
o ARN de destino de tal manera que causa una pérdida de utilidad, y hay un nivel suficiente de complementaridad para impedir formación de enlaces no específica de compuestos antisentido con secuencias que no son las secuencias de destino bajo condiciones en las que formación específica de enlaces se desea, es decir, en el caso de tratamiento terapéutico.
[0049] Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica el proceso de enlazar de manera química con los oligonucleótidos un o más grupos o conjugados que aumentan la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Tales grupos incluyen grupos lípidos tales como un grupo de colesterol, ácido cólico, un tioéter, hexil-S-tritiltiol, a tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o residuos undecil, un fosfolípido tal como dihexadecil-rac-glicero o trietilamonio-1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3H-fosfonato, una cadena de poliamino o de polietilenglicol, o ácido acético de adamantina, un grupo de palmitil o un grupo de octadecilamino
o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido “quiméricos” o “quimeras” en el contexto de esta invención son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, en donde toda región se compone de una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen por lo menos una región en donde el oligonucleótido está modificado de manera que transmite al oligonucleótido una resistencia a la degradación por nucleasa, captación celular aumentada, y/o afinidad aumentada para formar enlaces del ácido nucléico de destino. Una región adicional del oligonucleótido puede servir de sustrato para enzimas capaces para desdoblar ARN, ADN o híbridos de ARN, ADN. A título de ejemplo, RNasa H es una endonucleasa celular que desdobla la cadena de ARN de una doble hélice de ARN:ADN. Activación de la RNasa H, por esa razón, resulta en el desdoblamiento del destino de ARN, aumentando mucho la eficacia de la inhibición de la expresión de génes que presenta el olignucleótido. Por consiguiente, resultados comparables pueden obtenerse frecuentemente con oligonucleótidos más cortos cuando se utilizan oligonucleótidos quiméricos, comparado con fosforotioato deoxioligonucleótidos que hibridizan con la misma región de destino. Compuestos quiméricos antisentido de la invención pueden formarse como estructuras de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados y/o oligonucleótidos miméticos como arriba descritos. A tales compuestos se les denomina en la técnica con el término de híbridos o gapmers.
[0050] En especial, la presente invención se refiere al uso de los oligonucleótidos divulgados aquí o variantes o miméticos de ellos para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, neurotraumatismo, enfermedades neurovasculares y neuroinflamatorios incluyendo enfermedades postinfecciosos. El término “enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias” se refiere a la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), variación nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD), la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofía multisistema, demencia, demencia frontemporal, enfermdedas de neuronas motoras, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs), esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, trastornos autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (EM), lesiones agudas isquémicas/hipóxicas, infarto, traumatismo del SNC, traumatismo de la cabeza, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger, leucoaraiosis, degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil frágil-tremor/ataxia, Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP), degeneración estriadonigral (SND), degeneración olivopontocerebeloso (OPCD), síndrome de Shy Drager (SDS).
[0051] De manera más general, la presente invención se refiere al uso de los oligonucleótidos aquí divulgados o variantes o miméticos de ellos para tratar enfermedades asociadas con la señalización regulada hacia arriba o aumentada de TGF-R and/or TGF-RII, por ejemplo mediante níveles aumentados de TGF-beta. Los oligonucleótidos antisentido así inhiben la expresión de TGF-R y/o TGF-RII. En lugar de los oligonucleótidos, o en combinación con los oligonucleótidos, compuestos antisentido pueden ser utilizados. Compuestos antisentido se refieren a vectores aquí divulgados que permiten transcribir un olignucleótido antisentido o a ribozimas, ribozimas, guía externa (EGS, external guide sequences), oligonucleótidos (oligozimas), y otros ARNs cortos catalíticos o oligonucleótidos catalíticos que hibridizan con el ácido nucléico de destino que codifica TGF-R o TGF-RII. Dichos compuestos antisentido inhiben la expresión de TGF-R o TGF-RII. De esa manera, la cantidad de TGF-R y/o TGF-RII presente durante un estado de enfermedad se reduce en estos casos.
[0052] Los oligonucleótidos antisentido y los compuestos antisentido aquí divulgados son útiles para la regeneración y un reconexión funcional de vías neurales dañadas y para el tratamiento de diferentes enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias.
[0053] En otra realización preferida de la presente invención, el compuesto útil para influir en la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-RII es un compuesto que reduce o inhibe el enlazamiento de TGF-ß1 con su receptor. Ejemplos preferidos de tales compuestos son anticuerpos (neutralizantes) dirigidos contra un receptor TGF-ß; véase Lin et al., 1992, preferiblemente el receptor TGF-ß II. El término “anticuerpo” preferiblemente se refiere a anticuerpos que se componen esencialmente de anticuerpos monoclonales combinados con diferentes especificaciones epitópicas, así como preparaciones diferentes de anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales se producen a partir de un antígeno que contiene por ejemplo un fragmento de TGF-R o TGF-RII o un receptor correspondiente mediante métodos bien conocidos a los expertos en la técnica. El término “anticuerpo” (Ab) como utilizado aquí o “anticuerpo monoclonal” (Mab) debe incluir moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab’)2) que son capaces para enlazarse de manera específica con una proteína. Fragmentos Fab y F(ab’)2 no tienen el fragmento Fc de un anticuerpo intacto, salen de la circulación más rapidamente y pueden tener menos enlaces no específicos que un anticuerpo intacto. (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).
[0054] La presente invención también se refiere a un método para identificar un compuesto que influye en (a) la actividad biológica de TGF-R y/o TGF-RII o de la expresión de TGF-R y/o de TGF-RII o (b) de la señalización de TGF-ß1/TGF-R, que comprende los siguientes pasos:
(a)
incubar un compuesto candidato con un sistema de prueba que comprende TGF-ß1 y células precursoras neuronales, y
(b)
ensayar la expresión de receptores activos de TGF o la proliferación de las células precursoras neuronales; en donde
(c)
una abolición de (i) la supresión de expresión de receptores TGF activos o (iii) supresión de la proliferación de las células precursoras neuronales en comparación con el sistema de prueba en ausencia de dicho compuesto de prueba indica la presencia de un compuesto candidato que tiene las propiedades deseadas.
[0055] Ejemplos de tales moléculas candidatos incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas, (por ejemplo, receptores) o pequeñas moléculas. Tales moléculas pueden ser diseñadas de manera racional mediante utilización de técnicas conocidas. Preferiblemente, dichos sistemas de pruebas que se utilizan para la selección comprenden sustancias de propiedades similares químicas y/o físicas, más preferiblemente, dichas sustancias son idénticas. Los compuestos que pueden preparse y identificarse según una utilización de la presente invención pueden ser bancos de expresión, por ejemplo bancos de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucléicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, ligandos, hormonas, peptidomiméticos, ANPs u otros. Más recientemente, WO 98/25146 describió otros métodos para la selección de bancos de complejos para compuestos que tienen una propiedad deseada, en especial, la capacidad de servir de agonista de, para ligarse a, o para servir de antagonista de un polipéptido o su receptor celular. Los complejos en tales banocs comprenden un compuesto bajo prueba, una marcación que registra al menos un paso en la síntesis del compuesto, y un teter (tether) susceptible de ser modificado por una molécula informadora. Modificación del teter se usa para marcar que un complejo contiene un compuesto que tiene una propiedad deseada. La marcación puede decodificarse para revelar por lo menos un paso en la síntesis de tal compuesto. Otros métodos para identificar compuestos que reaccionan con TGF-R y/o TGF-RII según la invención o moléculas de ácidos nucléicos que codifican tales moléculas son, por ejemplo la selección in vitro con el sistema de selección por fagos, así como ensayos de filtro mediante enlaces o la medida en tiempo real de la interacción, por ejemplo el aparato BIAcore (Pharmacia).
[0056] También está bien conocido al experto en la técnica el hecho de que es posible diseñar, sintetizar y evaluar miméticos de compuestos orgánicos pequeños que, por ejemplo pueden cumplir la función de sustrato o ligando a un receptor TGF-ß. Por ejemplo ha sido descrito que miméticos D-glucosa de hapalosina exponen eficiencia similar como la halpalosina en que en una proteína asociada con la asistencia en antagnonizar la formación de resistencia de drogas múltiples en citotoxicidad véase Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987. El gen que codificado TGF-ß1 or TGF-R pueden también servir de destino para seleccionar inhibidores. Inhibidores pueden comprender, por ejemplo, proteínas que se enlazan con la ARNm del gene que codifica TGF-R, preferiblemente TGF-RII, así destabilizando conformación nativa del mARN y dificultando la transcripción y/o la traducción. Además, métodos se describen en la literatura para identificar moléculas tales como un fragmento de ARN que imitan la estructura de una molécula definida o indefinida de ARN con la que un compuesto se enlaza dentro de una célula, lo que resulta en el retraso del crecimiento de las células o la muerte de células, véase por ejemplo WO 98/18947 y referencias allí citadas. Estas moléculas de ácido nucléico pueden utilizarse para identificar compuestos no conocidos de interés farmaceútico y para identificar destinos de ARN no conocidos para uso en el tratamiento de la enfermedad. Estos métodos y composiciones pueden ser utilizados para identificar compuestos que son útiles en reducir níveles de expresión de TGF-ß1 y/o del receptor correspondiente/de los receptores correspondientes. Los compuestos que pueden analizarse y identificarse según el método de la invención pueden ser bancos de expresión, por ejemplo bancos de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucléicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, ligandos, hormonas, peptidomiméticos, ANPs u otros (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 7 (1994), 193-198 y referencias arriba citadas). Además, genes que codifican un regulador putativo de TGF-ß1 y/o que ejecutan sus efectos aguas arriba o abajo de TGF-P1 pueden ser identificados mediante utilización de por ejemplo, inserción mutagénesis, utilizando por ejemplo vectores que apuntan genes particulares conocidos en el arte. Dichos compuestos pueden también ser derivados funcionales o análogos de inhibidores conocidos. Tales compuestos útiles pueden por ejemplo ser factores de transacción (transaction factors) que se enlazan con TGF-R o TGF-RII o secuencias regulatorios del gen que lo codifica. Identificación de factores de transacción puede efectuarse mediante utilización de métodos estandár en el arte. Para determinar si una proteína se enlaza con la proteína misma o secuencias regulatorias, análises estandár Gelshift pueden efectuarse. Para identificar un factor de transacción que se enlaza con la proteína o secuencia regulatoria, la proteína o secuencia regulatoria pueden utilizarse como un reactivo de afinidad en métodos de proteína estandár de purificación, o como una prueba para seleccionar una banco de expresión. La identificación de moléculas de ácido nucléico que codifican polipéptidos que reaccionan con TGF-R or TGF-RII pueden alcanzarse, por ejemplo, como descrito para GF-ß1 en Scofield (Science 274 (1996), 2063- 2065) mediante el uso de los llamados “sistemas de dos híbridos" de levadura. En este sistema, TGF-ß1 está enlazado con el dominio que enlaza el ADN del factor GAL4 de transcripción. Una cepa de levadura que expresa este polipéptido de fusión y que comprende un gen informador lacZ que está controlado por un promotor apropiado, que está reconocida por el factor GAL4 de transcripción, es transformada por un banco de ADNcs que van a expresar proteínas de plantas o peptídos de ellos que son fusionados con un dominio de activación. De ese modo, si un péptido codificado por un de los ADNcs es capaz de reaccionar con el péptido de fusión que comprende un péptido de, por ejemplo TGF-R o TGF-RII, el complejo será capaz de dirigir la expresión del gen informador. De ese modo, por ejemplo TGF-R or TGF-RII y el gen que codifica cada receptor puede ser utilizado para identificar péptidos y proteínas que reaccionan con TGF-R or TGF-RII. Es obvio al experto en la técnica que este sistema y sistemas similares entonces pueden utilizarse para la identificación de inhibidores. Finalmente, la presente invención se refiere al uso de un compuesto que se identifica mediante el método arriba descrito para la preparació de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, en donde la neurogénesis o la neuroregeneración tienen un efecto beneficioso. El ejemplo abajo descrito describe la invención en más detalles.
[0057] La presente invención también se refiere a métodos para identificar los efectos del tratamiento o de la prevención/profilaxis en la población de células madres/precursoras inducidos por la modulacíon del sistema TGF-R
o TGF-RII. Esto puede ser especialmente útil para establecer un tratamiento exitoso en el paciente individual que permite por ejemplo una dosis individualizada. Los métodos diagnósticos comprenden
(a)
aplicación sistémica de anticuerpos específicos dirigidos contra TGF-R or TGF-RII y marcados con núclidos específicos para diagnóstica nuclear medical (lodina, tecnecio, flúor 18) o con sales de gadolinio, perfluorocarburos u otros productos tierras raras / compuestos paramagnéticos / partículas de hierro para uso en la formación de imágenes por resonancia magnética. En este contexto, puede ser necesario abrir duranto corto tiempo la barrera hematoencefálica en la capa subependimal, en caso de que no haya relación señal a ruido suficiente, aunque esta región es altamente vascularizada, y que el contraste puede ser suficiente para visualización con una máquina 3Tesla, abrir la barrera hetamoencefálica puede apoyar adicionalmente este proceso . Esto puede ser realizado o con soluciones híperosmolares (por ejemplo glicerol) o con VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor).
(b)
aplicación sistémica de oligonucleótidos (las mismas moléculas que arriba mencionadas) que son específicos para TGF-R o TGF-RII: Ellos se marcarían como sigue:
Gd o 111In - DTPH (5`XXXXXXXXXXXXXXXXX3`-Biotin) - (SA- o OX 26, 8D3 o Ak-HIR) (en donde Gd se utiliza para MRI, 111In se usa para radiodiagnóstica, OX 26 se usa para experimentos de ratones y apunta los receptores de transferrina, 8D3 es un anticuerpo de receptor de ratón antitransferrina de rata, AK-HIR es un anticuerpo que está dirigido al receptor de insulina humana). Estos compuestos sólamente hibridizarían y señalarían en las células que tienen el ARNm activo para TGF-R o TGF-RII. DTPH se utiliza como un agente que forma quelato, el Ak-HIR utiliza el receptor de insulina para trasladar el oligonucleótido a través de las diferentes barreras, en el caso de los anticuerpos de los receptores de transferrina, el último se utiliza para la traslación transmembranal. Hay una estabilidad de hibridación diferencial en las células en las que un gran número de mARN es disponible y por esa razón, una señal mucho más fuerte puede detectarse (Susuki T, Schlachetzki F, et al. J. Nucl. Med. 45: 1766-1775, 2004, Susuki T, Zhang Y, Zhang Y-f, Schlachetzki F, Pardridge et al., Mol. Imaging 2005, 3, 356-363).
(c) aplicación sistémica de oligonucleótidos (las mismas moléculas que arriba mencionadas) que son específicos para Doublecortin (DCX) con marcación idéntica a la marcación en (b) (véase WO 2004067751)
[0058] Preferiblemente, en una composición farmacéutica, tal compuesto como está arriba descrito se combina con un portador faramacéuticamente aceptable. “Farmacéuticamente aceptable” debe comprender todo portador que no influye en la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para el huésped al que se lo adminstra. Ejemplos de portadores farmacéuticos apropiados son bien conocidos en el arte y incluyen soluciones salinas de tampón fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, diferentes tipos de productos humectantes, soluciones estériles etc... Tales portadores pueden formularse mediante métodos comunes y el compuesto activo puede administrarse al sujeto en una dosis efectiva. Una “dosis efectiva” significa una cantidad del ingrediente activo que es suficiente para influir el curso y la gravedad de la enfermedad, lo que lleva a la reducción o la remisión de tal patología. Una "dosis efectiva" para tratar y/o impedir estas enfermedades o trastornos puede determinarse mediante utilización de métodos conocidos al experto en la técnica. Administración de composiciones apropiados pueden efectuarse por vías diferentes, por ejemplo mediante administración intravenoso, intraperetoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradermal. La vía de administración, por supuesto, depende del típo de terapía y del típo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. Además, los compuestos de la presente invención pueden ser mezclados y adminstrados juntos con lipósomas, agentes que forman complejos, moléculas que apuntan receptores, solventes, agentes conservadores y/o diluyentes.
[0059] Se prefieren preparaciones farmacéuticas en forma de soluciones de infusiones o matrices sólidas para liberación continuo del agente activo, en especial para liberación de por lo menos un oligonucleótido antisentido o variantes o miméticos de los mismos. Más se prefieren preparaciones farmacéuticas en forma de soluciones o mátrices sólidas apropiadas para adminstración local hacia adentro el cerebro.
[0060] El régimen de dosis será determinado por el médico tratante y otros factores clínicos. Como se sabe bien en los artes medicales, dosificaciones para un paciente dependen de muchos factors, incluyendo la talla del paciente, la superficie del cuerpo, la edad, el sexo, el compuesto particular que tiene que ser administrado, el tiempo y la vía de la administración, el típo de terapía, salud general y otras drogas que se administran al mismo tiempo.
[0061] La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas que comprenden por lo menos un oligonucleótido, variantes o miméticos de ellos, como arriba revelado. En vez de o adicionalmente al por lo menos un oligonucleótido antisentido, por lo menos un compuesto antisentido podría estar presente. Compuestos antisentido se refieren a vectores que permiten transcribir un olignucleótido antisentido, en especial un de los oligonucleótidos antisentido aquí divulgados o a ribozimas, secuencias guía externa (EGS, external guide sequences), oligonucleótidos (oligozimas), y ARNs cortos catalíticos u oligonucleótidos catalíticos que hibridizan con el ácidos nucléico de destino que codifica TGF-R o TGF-RII. Dicho compuesto antisentido inhibe la expresión de TGF-R o TGF-RII y preferiblemente es capaz de reducir respectivamente la cantidad de TGF-R o TGF-RII que se forma.
[0062] En una realización preferida de la presente invención, la enfermedad que puede impedirse y/o tratarse es una enfermedad neuroinflamatoria del SNC, una isquemia aguda o lesión traumática/hipoxica del cerebro. Ejemplos preferidos de enfermedades neuroregenerativos o neuroinflamatorios son la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), variación nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD), la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofía multisistema, demencia, demencia frontemporal, enfermedades de neuronas motoras, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs), esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial y meningoencefalitis viral (prevención de depresión postinflamatoria de proliferación de células madres) trastornos autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (EM), lesiones isquémicas/hípoxicas agudas , traumatismo del SNC, traumatismo de la cabeza, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger, Leuoaraiosis, demencia relacionada con el SIDA,, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil frágil-tremor/ataxia, Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP), degeneración estriadonigral (SND), degeneración olivopontocerebeloso (OPCD), síndrome de Shy Drager (SDS), degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear. También reducción de neoformación de células madres debido a la edad puede contar entre dichas enfermedades.
Ejemplos
Ejemplo 1
TGF-betaTGF-ß1 inhibe la proliferación de células madres y precursoras neurales de roedores
[0063] Se matan ratones femeninas adultas (diferentes cepas) o ratas Fischer-344 (3-4 meses; Charles River, Alemania), se extraen los cerebros y las médulas espinales y se los pone en 4°C DPBS (PAN, Alemania) con 4.5 gm/l de glucosa (Merck, Alemania) (DPBS/glu). Meninges y vasos sanguíneos sobreyacentes se extraen. Zonas de hipocampo y ependimales inlcuyendo zonas subependimales y subventriculares de la pared lateral del ventrículo lateral (SVZ, subventricular zone) se extraen de manera aséptica. El tejido disecado se traslada a DPBS/glu fresco, se lava por una vez, se lo pone en platillos de Petri, y se lo disocia de manera mecánica. La suspensión de células se lava en DPBS/glu para enjuagar sangre excedente y se la resuspende en solución PPD que contiene 0.01% de papaína ((Worthington Biochemicals, Inglaterra), 0.1% dispasa II (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 0,01% Dnasa I (Worthington Biochemicals), y 12.4 mM MgSO4 en HBSS (PAN) sin Mg2/Ca2 (PAA, Alemania) y se la lava durante 30 a 40 minutos a temperatura ambiental. La suspensión de células es triturada cada 10 minutos. Células disociadas se recogen y se resuspenden en medio DMEM/F12 sin suero que contiene 2 mM de L-glutamina y 0.1 gm/l de penicilina/streptomicina y lavado tres veces con trituración exacta. Entonces, la suspensión de células singulares se resuspende en medio NB (Gibco BRL, Alemania) enriquecida con B27 (Gibco BRL) (NB/B27), 2 mM de L-glutamina (PAN), 0.1 gm/l penicillin/streptomycin (PAN), 2 g/ml de heparina (Sigma, Taufkirchen, Alemania), 20 ng/ml de bFGF-2 (R&D Systems, Alemania), y 20 ng/ml de EGF (R&D Systems, Alemania). Células viables se cuentan por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro. Células se siembran en cajas T-25 para el cultivo de microbios y a los cultivos se los mantiene a 37°C dentro de un incubador con un 5% de CO2. Células singulares empiezan a formar esferas durante 5 a 7 días de cultivo de suspensión y continuan creciendo en masa y número durante los próximas semanas. La mitad del medio se cambia cada 7 días. Células de los números (passage numbers) 3 a 20 se usan para los experimentos (Wachs, F. P., S. Couillard-Despres, et al., Lab Invest 2003, 83(7), 949-962). Los cultivos de células madres y precursoras neurales se denominan CMNes. Para el proceso de disociación, el medio de cultivo que contiene neuroésferas adentro se recoge en un tubo de centrífuga de 15 ml y se lo centifuga a 120 frc (rcf, relative centrifugal force, fuerza relativa de centrifugación) durante 5 minutos. El granulado es resuspendido en 200 µl de Accutase (Innovative Cell Technologies Inc., distribuido por PAA) y triturado aproximadamte 10 veces mediante utilización de una pipeta. Entonces, la suspensión de células es incubada a 37°C durante 10 minutos. Esferas disociadas son trituradas otra vez y resuspendidas en 800 µl de medio de NB/B27. Células disociadas se centrifugan a 120 frc durante 5 minutos y son resuspendidas en medio de NB/B27. Una parte aliquota se cuenta por medio de un ensayo de exclusión de Trypan Blue en un hemocitómetro para determinar la cantidad de células viables. Células (105) se ponen en placa en cajas T75 para el cultivo de microbios para el paso de largo plazo en medio de NB/B27 (10 ml de medio de cultivo por caja). Las células obtenidas después de tratamiento de Accutase de neuroesferas primarias proliferan y producen neuroesferas secundarias. Neuroesferas secundarias son pasadas 7 a 9 días después de poner en placa células de neuroesferas primarias. Similar a cultivos primarios y neuroesferas primarias, células singulares obtenidas después de disociación de neuroesfereas secundarias proliferan y producen neuroesferas terciarias (Wachs, F. P., S. Couillard-Despres, et al., Lab Invest 2003, 83(7), 949-962). 104 CMNs se siembran en placa de 12 pocillos en medio de NB/B27 en un volumen de 1 ml y crecen durante 7 días. 2 horas, 3 días y 6 días después de sembrar, las células son estimuladas mediante adición de diferentes concentraciones (0, 2,5, 5, 10, y 100 ng/ml) de factor de crecimiento transformador ß1 (TGF-ß1) (R&D Systems, Alemania). En el día 7, los cultivos se disocian por el uso de
Accutase™ y células viables se cuentan mediante un ensayo de exclusión de Trypan Blus en un hemocitómetro.
TGF-ß1 in vitro inhibe la proliferación de células madres y precursoras adultas neurales de una manera que depende de la dosis (figura 1A).
Un efecto similar se observó en células neurales humanas fetales. El tratamiento con 50 ng/ml de TGF-b1 redució la proliferación de células a aproximadamente un 50% de los controles durante 7 días (figura 1B).
Ejemplo 2
El efecto de TGF-ß1 sobre células madres y precursoras neurales es reversible
[0064] Para determinar si la inhibición de crecimiento inducida por TGF-ß1 es un efecto reversible, CMNs se estimulan con 10 ng/ml de TGF-ß1 durante 7 días siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 1. Después de disociación, células viables se cuentan por medio de un ensayo de de exclusión deTrypan Blue en un hemocitometro y 104 CMNs estimuladas por el factor de crecimiento se resiembran y se cultivan con o sin 10 ng/ml de TGF-ß1 según el protocolo descrito en el ejemplo 1. Este proceso de disociar/contar/resembrar se efectua cada 7 días. Como mostrado en las figuras 2, después de 3 semanas de cultivo, la tasa de proliferación de células inicialmente tratadas con TGF-ß1 ahora crecidas sin TGF-ß1 se normaliza en comparación con células antes no tratadas. Esto indica que el efecto de TGF-ß1 sobre células neurales madres y precursoras es reversible. Incubación a largo plazo con TGF-ß1 no reduce más la proliferación de células.
Ejemplo 3
Anticuerpos contra TGF-betaRII pueden reducir efectos de TGF-ß1 sobre células madres neurales de rodeores adultos
[0065] Neuroesferas no estimuladas que tienen siete días de edad de números bajos se disocian mediante el uso de
Accutase™ como descrito en el ejemplo 1. La suspensión obtenida que contiene un solo típo de células se utilizó
para análisis de bloqueo. CMNs de rodeores adultos se sembraron en una densidad de 104 células en placa de 12 pocillos en medio de NB/B27 en un volumen de 1 ml. 2 horas después de sembrar y 1 hora antes de la estimulación con 10 ng/ml de TGF-ß1, diferentes concentraciones de anticuerpos neutralizantes anti-TGF-ßRII (R&D Systems, Alemania) se añadieron al medio de cultivo. 3 días y 6 días después de sembrar, a las células se las estimula otra vez mediante adición de anticuerpos de anti-TGF-ßRII y TGF-ß1, similar al proceso que se efectua en el día 1. En el día 7, los cultivos se disocian por uso de Accutase™ y células viables se cuentan mediante un ensayo de exclusión de Trypan Blue en un hemocitómetro. Es interesante que la adición de los anticuerpos anti-TGF-ßRII ellos mismos reduce la proliferación de CMNs. Anticuerpos contra TGF-ßRII sólamente parcialmente son capaces de inhibir efectos inducidos por TGF-ß1 incluso en las concentraciones utilizadas más altas (10 µg/ml) (figura 3).
Ejemplo 4
TGF-RII soluble inhibe completamente la supresión de proliferación de CMNs inducida por TGF-ß1
[0066] Según el protocolo del fabricante (R&D Systems, Alemania), una secuencia ADN que codifica el residuo de 159 aminoácidos del dominio extracelular de TGF-ßRII humano (Lin et al., Cell 1992, 68(4), 775-785) fue fusionada con la región Fc de IgG1 humano y la proteína quimérica fue expresada en una línea de células mieloma de ratón NSO. Neuroesferas no estimuladas que tienen siete días de edad de números bajos se disocian mediante el uso de Accutase™ como descrito en el ejemplo 1. La suspensión obtenida que contenía un solo típo de células se utilizó para análisis de bloqueo. CMNs de rodeores adultos se sembraron en una densidad de 104 células en placa de 12 pocillos en medio de NB/B27 en un volumen de 1 ml. 2 horas después de sembrar y 1 hora antes de la estimulación con 10 ng/ml de TGF-ß1, diferentes concentraciones de TGF-ßsRII bioactivo soluble humano recombinante/Quimera Fc (R&D Systems, Alemania) anticuerpos neutralizantes anti-TGF-ßRII (R&D Systems, Alemania) se añadieron en el medio de cultivo. 3 días y 6 días después de sembrar, a las células se las estimula otra vez mediante adición de anticuerpos de TGF-ßsRII/ Quimera Fc y TGF-ß1 similar al proceso que se efectua en el día 1. En el día 7, los cultivos se disocian por uso de Accutase™ y células viables se cuentan mediante un ensayo de exclusión de Trypan Blue en un hemocitómetro. Es interesante que la adición del TGF-ßsRII/Quimera Fc es capaz de bloquear completamente efectos inducidos por TGF-ß1 en una manera que depende de la dosis (datos no mostrados). Está claro que la abolición de TGF-ß1 activo en el sobrenadante mediante administración previa de un TGFßsRII/Quimera Fc soluble recombinante humano (TGF-ßRII soluble) completamente bloquea la supresión de crecimiento inducida por TGF-ß1 de células adultas madres y precursoras neurales (figura 4).
Ejemplo 5
Células que expresan TGF-ßRII pueden aislarse mediante utilización de técnicas de selección de células
[0067] Métodos comunes no permiten aislación rápida y fiable y purificación de células neurales madres y precursoras. Para investigar la posibilidad de aislar poblaciones de células neurales madres y precursoras puras basado en la expresión de marcadores de superficie definidos, aislamos células neurales madres y precursoras debido a la expresión de TGF-ßRII por medio de técnicas diferentes. Es posible aislar células neurales madres y precursoras que expresan TGF-ßRII por medio de dos técnicas. i) selección por medio de SCAF (Separación de células activada por fluorescencia FACS-sorting) (datos no mostrados), y ii) selección por medio de separación magnética de células (MACS-sorting). Células disociadas madres y precursoras neurales adultas se incuban con 10 µg/ml de anticuerpos primarios contra TGF-RII (R&D Systems, Alemania) durante 20 minutos a temperatura ambiental. Después de un paso de lavado con PBS, las células se incuban con el anticuerpo secundario conejo anti-cabra PE (1:500) (Dianova). Después de un paso de lavado con PBS, anticuerpos terciarios se añaden a las células contra PE conectado a granulos paramagnéticos según los protocolos de fabricante (Miltenyi Biotech, Alemania). La suspensión de células se separa magnéticamente usando el sistema MACS según el protocolo de fabricante (Miltenyi Biotech, Alemania) y células negativas y positivas después de la separación se cuentan y se cultivan (figura 5). Aproximadamente un 20% de todos los tipos de células presentaron un resultado positivo para TGF-ßRII.
Ejemplo 6
Oligonucleótidos antisentido contra TGF- gulación hacia abajo inducida por la proliferación in vitro de células adultas madres y precursoras neurales.
[0068] Las células se prepararon, se disociaron y se pusieron en placa como descrito en el ejemplo 1. Después, a las células se las incubó durante 1 semana con o sin 10ng/ml de TGFantisentido 5’ – cagcccccgacccatg – 3’ (NIS 3), oligonucleótido antisentido 5’ – catgggtcgggggctg – 3’, o sin sentido 5’ – catccccggacccgtg – 3’. A los oligonucleótidos se los modificó con fosfotioatos y se cambió diariamente el medio con oligonucleótidos. Es importante que que la inhibición inducida por TGF-β1 de proliferación de células madres y precursoras neurales se bloqueo completamente y específicamente por el tratamiento antisentido (NIS 3) (figura 6).
Ejemplo 7
Tratamiento in vivo de oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII salva el bloqueo inducido por la proliferación de células en el cerebro adulto.
[0069] Este ejemplo demuestra i) el efecto de la infusión de TGF-β1 en la proliferación de células madres y progenitores neurales in vivo y ii) el hecho de que este efecto se salva mediante tratamiento con oligonucleótidos antisentido TGFβRII. Por esa razón, el siguiente experimento se realizó:
TGF-β1 se infundió por vía intraventricular durante dos semanas seguido por una co-infusión de TGF-β1 con oligonucleótidos. Experimentos animales se efectuaron según el European Communities Council Directive del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC). Cánulas de acero inoxidable conectados con minibombas osmóticas (Model 2001, Alza, Stadt, Land) se implantaron dentro de dos ratas Fischer-344 de 2 meses de edad (n=24) para infusión intracerebroventricular como se ha descrito. Los animales recibieron o TGF-β1 recombinante (500 ng/ml presente en la bomba) o fluído cerebroespinal artificial (LCEa) como control (n=8 cada uno) en una dosificación de 0.5 µl/hr durante dos semanas. Después de la segunda semana, las bombas se cambiaron y LCEa, TGF-β1 (500 ng/ml presente en la bomba), oTGF-β1 (500 ng/ml presente en la bomba) se infusieron hacia adentro de los ventrículos durante los dos siguientes semanas. Los oligonucleótidos fueron como descritos en el ejemplo 6. En el día 27, los animales recibieron una inyección intraperitóneal singular de 200 mg/kg de bromodeoxiuridina (BrdU). Un día más tarde, a los animales se les perfundió por inyección intracardial con paraformaldehído 4%. El tejido se trató para inmunodetección cromógena o epifluorescente en 40 µm de secciones sagitales como se ha descrito. Análises de epifluorescencia se efectuó mediante el uso de un microscopio Leica (Leica Mikroskopie und Systeme GmbH,
Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara digital Spot™(Diagnostic Instrument Inc, Sterling Heights, EEUU) o un
microscopio confocal por barrido laser (Leica TCS-NT, Bensheim, Alemania).BrdU 1:250 (Oxford Biotechnology, Oxford, RU). Anticuerpos secundarios fueron: burro rata conjugado con fluoresceína (FITC), rodamina X (RHOX), CY5 o biotina 1:500 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, EEUU). Para contar, un procedimiento sistemático y aleatorio se utilizó. Células positivas BrdU se contaron en el seno de tres marcos de 50µm x 50µm por sección situados en la parte más baja, media, más alta de la zona subventricular (ZSV). Perfiles positivos que pasaron el plano focal más alto (plano de exclusión) o los límites laterales de exclusión del marco para contar no se contaron. Las cuentas totales de perfiles positivos se multiplicaron por la relación del volumen de referencia al volumen de selección para obtener el número estimado de células positivas para BrdU de cada estructura. Todas las extrapolaciones se calcularon en cuanto a un hemisferio cerebral y deberían doblarse para representar los valores totales del cerebro. Los datos se presentan como valores medios ± desviaciones estándares (DE). Análises estadísticas se efectuaron mediante el uso de la comparación del test t para muestras apareadas bilaterales de estudiantes (unpaired, two-sided t-test comparison –Student’s t-test) entre los grupos tratados con TGF-β1 y los grupos de control (StatView Software, Cary, NC, EEUU). El nivel de significado se determinó a p < 0.05.
La figura 7 demuestra la regulación hacia abajo inducida por el TGF-β1 de proliferación de células en la convolución dentada del hípocampo (figura 7°) y en la zona subventricular (figura 7B). Tratamiento con oligonucleótidos sin sentido no bloqueó este efecto. Al contrario, tratamiento con oligonucleótidos sin sentido (NIS 3) bloqueó el efecto de TGF-β1(figura 7A y B)
Ejemplo 8
Tratamiento in vivo de oligonucleótidos antisentido específicos de TGF-RII previene el bloqueo inducido por TGF-β1 de la proliferación de células en el cerebro adulto.
[0070] Este ejemplo demuestra que un tratamiento con oligonucleótidos antisentido contra TGF-βRII puede impedir la regulación hacia abajo de la proliferación de células inducida por TGF-β1 en el cerebro adulto.
[0071] Oligonucleótidos se infundieron por vía intraventricular durante una semana seguido por una co-infusión de TGF-β1 con oligonucleótidos. Experimentos animales se efectuaron según el European Communities Council Directive del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC). Cánulas de acero inoxidable conectados con minibombas osmóticas (Model 2001, Alza, Stadt, Land) se implantaron dentro de dos ratas Fischer-344 de 2 meses de edad (n=24) para infusión intracerbroventricular como se ha descrito. Los animales recibieron o oligonucleótidos de fosfotioatos (concentration de 1,64 mM presente en la bomba) o un aLCE durante la primera semana, y un TGF-β1 (500 ng/ml presente en la bomba), o una co-infusión de TGF-β1 (500 ng/ml presente en la bomba) y oligonucleótidos fosfotioatos (concentration de 1,64 mM presente en la bomba) durante la segunda y tercera semana. Oligonucleótidos se describieron en el ejemplo 6. En el día 20, los animales recibieron una inyección intraperitóneal singular de 20 mg/kg de bromodeoxiuridina (BrdU). Un día más tarde, a los animales se les perfundió por inyección intracardial con paraformaldehído 4%. El tejido se trató y se analizó como descrito en la figura 7. La figura 8 demuestra que la regulación hacia abajo inducida por el TGF-β1 de proliferación de células en la convolución del hípocampo dentado (figura 8A°) y en la zona subventricular (figura 8B) puede prevenirse por tratamiento previo con
un tratamiento con oligonucleótidos antisentido de TGF-βRII (NIS 3). Ejemplo 9
Formulación farmaceútica que comprende por lo menos un olignucleótido antisentido [0072] Tres formulaciones representativas acuosas de los oligonucleótidos antisentido:
1.
en LCEa 148,0 mM de NaCl, 3,0 mM de KCl, 1,4 mM de CaCl2, 0,8 mM de MgCl2, 1,5 mM de Na2HPO4, 0,2 mM de NaH2PO4, pH 7.4, 100 µg/ml de albúmina de suero de rata, 50 µg/ml de gentamicina
2.
en 0,9% de NaCl
3.
en H20
Lista de Secuencias [0073]
NIS: 1
Factor de tranformación de crecimiento Homo sapiens, receptor beta II (70/80kDa) secuencia antisendtido completa
Derivado de AY675319 1 CAGCCACACT GTCTTTAACT CTCAGCCCAC CCACACTGAG GAGGGTGCCT AGAGGTTCTA 61 TTTCCAAACC TTTGCATGTA TCTTAAAAAT CTCAATAAAA TGAGACCTTC CACCATCCAA 121 ACAGAGCTGA TATTCTCACT ACCAGTCCCT CTCTAATATT CCTATTTGGC TGAAAATAAG 181 TAGCTTCAAA AAGTTTTAAA AAAGAGATTA CTTGCAGCAT TAACACTTCT TTGTTGATTA 241 ACAAGTTTCC TATGGAGTTT TAAAGCTCAT ACTTTGTTCT TGTCCTTGTG GACACAAATT 301 TTCTAACTGC AAATGGGACC TTTGTGTCCC ACATTCAAAT CCTCTCTAGT AATTTCTGCA 361 AAGGTTGAGA AGGCTGGCAT GATGGAGAGA ACGGTAACCA TGAGGAAAGC TTCTTGGAGT 421 AAAGCACTCC TCTCTCCAAT GCAGAGGGTA AAACTATTAA CATATAAGCA AAAGAAACTT 481 GGGCTAACTG AGACCCTTAA AGGAGTTCCC CTTTAGTCCA ATAAAAGGCC AACTTCAAAT 541 CTTAACACCA GATAAGGTAG TCAAAATCAT ATTATATACC CAGAGAATGA CTGCTTGAAT 601 GGACATTTCT TACAAGGGAC CTTGGTTAGG TGCAGATTTA ATTCCTAGAC TGGGGTCCAG 661 GTAGGCAGTG GAAAGAGCTA ATGTTTACAG TGAGAAGTGA GGCAGCTTTG TAAGTGTCTC 721 CACACCTTCA CATTTTGTGA ACGTGGACTG GAGATAACTG AAAACCATCT GCTATCCTTA 781 CCTGGGGATC CAGATTTTCC TGCAAAATCT CCAAATATTT ATAAAGTGGC TTCACTTTTT 841 GAAACGCTGT GCTGACCAAA CAAAACATAT GTTTAGAGTG CCTGAGGTCA TAGTCCTGAC 901 AATGATAGTA TTGTGTAGTT GAAATCCTCT TCATCAGGCC AAACTGTGCT TGAGCAATCA 961 GGAGCCCAGA AAGATGGAAC CCATTGGTGT TTGTATAGAA AACTAGAAAA TCAAGTCAAG 1021 TGTAATGAAA AAGTAAACAC GATAAAGCCT AGAGTGAGAA TTTGCTCCTT TTTAGAAAAG 1081 GATGAAGGCT GGGAGCAGAG AATAGTAACA TAAGTGCAGG GGAAAGATGA AAAAAAGAAC 1141 AATTTTTCAT TAGTAGATGG TGGGGCAATC GCATGGATGG GGACATCTGT TCTGATTTTT 1201 CTGCAACCCA TGAAGGTAAA AAGTGGGGTT CAAAACATTC AAGGTATTAA AGATGGGGTA 1261 GAGTTTCTAA ACTAGGTTGA GGGAGAGTTT CTAAACTAGC CCCCCAGATT TGGGGCTTGG 1321 AGCTTAAATG AAAAGTCCAG GAGAAATAAG GGCACACAGG AACCCCGGGA ACACTGGTCC
1381 TCAAACAGTG CCACTGTACT TAGTTCCATG GCCAGAAGAG AAGTGCTAGG CAGGGAATGA 1441 TTATTTTGCA AAAGCAAGTG CAATGTGGTC ATAGCTGGCT GTGAGACATG GAGCCTCTTT 1501 CCTCATGCAA AGTTCACTGT TTTACAGTCA GAGAACCACT GCATGTGTGA TTGTCAAATG 1561 CTAATGCTGT CATGGGTCCC TTCCTTCTCT GCTTGGTTCT GGAGTTCTCC AATAAAACCA 1621 ATTTCCTGGG AATATTTGAT GTTTTTCCTT GTCTCTTTTC AAGGTATGGC TATATATATA 1681 GAGCTATAGA CATATATAGA TATATATATA TATATATAAA ACATAGCTAT TCATATTTAT 1741 ATACAGGCAT TAATAAAGTG CAAATGTTAT TGGCTATTGT AAAAATCAAT CTCATTTCCT 1801 GAGGAAGTGC TAACACAGCT TATCCTATGA CAATGTCAAA GGCATAGAAT GCTCTATGTC 1861 ACCCACTCCC TGCTGCTGTT GTTTCTGCTT ATCCCCACAG CTTACAGGGA GGGGAGTGAC 1921 CCCCTTGGTT TTCCAGGAAG CATCAGTTCA GGGGCAGCTT CCTGCTGCCT CTGTTCTTTG 1981 GTGAGAGGGG CAGCCTCTTT GGACATGGCC CAGCCTGCCC CAGAAGAGCT ATTTGGTAGT 2041 GTTTAGGGAG CCGTCTTCAG GAATCTTCTC CTCCGAGCAG CTCCTCCCCG AGAGCCTGTC 2101 CAGATGCTCC AGCTCACTGA AGCGTTCTGC CACACACTGG GCTGTGAGAC GGGCCTCTGG 2161 GTCGTGGTCC CAGCACTCAG TCAACGTCTC ACACACCATC TGGATGCCCT GTAGCGGGAA 2221 AGAGATCCAA AGGGCACCAT GAGTTGGTGG GCTCCGCGGA AGGCAAGGTG GCCTGCTGAC 2281 CTTGTTGCTA TAGTGAGTGC AAGCAGGGTC CAAAAGTGCC TGTGCATTTA ACATGTGCTG 2341 ACTGAGTGCC TGCTGCTGCA GGCCAGCCAG TTCCATGTGG AAAGGGTGGT GGGGGGTTTG 2401 TGCTGGTGGC AGCTGTGCTC AAAACCTACC ATACTTTTTG GCTCTGGTGC TATCTGATCA 2461 CAATAGGTCC TGACAGCACA ATGATCCTCT GCTGGGCTTC TGGGGTACAC TAACACTCCC 2521 AACACCTGAA AATTCCCCAT GTAGTGGCCC TTAATATCAT TTCAACACCT TTCTATTTAG 2581 AGAAGTTCTC GCTTCACAGC AAAATTGAGT GGAAAGTACA GAGAGTTTTC ACAAAACCCC 2641 TTCCCCATAA AGGCACAGCC TTCTCCACCT TGACATCATG CATGCATCTA TGAGGTACAT 2701 TTGTTATAAC TGATGAACTA ACACTGACGT ATCATTATCA ATCAAATTCA TAGTTTACAT 2761 TAGGGTTCAC TCTTGGTGTT GTATATTCCA GGGGTTTTGA CAAATGTATA ATGACATGTA 2821 TCTACCATTA TAGTATCATG CGGAATAGTT TCTCTGCCCC TCAAATTCCC TGCATTCCAC 2881 TTATTCATCC CTCCCTCCAT TCCCCTAAAT TTCTGGCAGC CACTGATTTT GTACTGTCTC 2941 TGTAGTTTTT GCCTTTTCCA GAGTGTCATA TAGTTGGGTC ATATACACTG TTCTATTTTA 3001 ACAGGGCTGA TTACCCCCGT CAGAATTGTA TGCAGGCATT AGCATGGTTT CATTTTCTAT 3061 AGGCCACACA TTTTGTAGAG TGATTCAGTA GCAGCTTCTA CGAGCTGCCA AGGATGACCT 3121 CTGGGATGCT CCATTCCTCT CCAACAACAT TGGGTTGAAC CCTGTGAAAC AGCTGCCTAT 3181 GTGGGTCAGG CATGCTTAAC TCTATGCCAT TTCCTAGGGT TCACCCTAAC CGAATCAAGC 3241 TCCCATCCAA GGAGACCATC CAGGAGATCC TGCCCAGGAA GGTGGCAAGA GTTTTCTCTC 3301 ACTGGCTTAA TTTTTATTTT GCATTGCAAA TATTTTTGTT ATCATTTCAA ATCCTTTTTG 3361 GAAATAAAGC AGGCAGGAGT TAAGTAAATG GTCTGATAGG TGGAAATAGA GTGTGCTCCT 3421 CCCAATTGTA AGATCAACAT TGCTAATGGG ATCCCTCACA CAGGTGGCTG GGAGTGGGAT 3481 GGATAAATCT CAAAACTACC TGGGAGAGCT GGCACTTTTT CTACTTGTTT TCTAATACCA 3541 ACAACTTTCC AAACACACCT AGGAGCCTAT CTCTCCCTCC CCACCCGATG AGTTCATGAT 3601 GTTAAATTAA TTGCATAATT CACCTAATTG ACAGTATTGA CAGATGGCCC TGTTAAGAGT 3661 AGAGTGCTAT TGTTGGTACA CAAGTAACAT TTATTTTATT CTGGCACTGT AATTACAGGC 3721 AGTAAATTAA ATTAAATATT AAGCATTAAC TTGAAATCAA TAGGGCAACA AATCTCATTA 3781 TGAGAAAAAA TGTATTATGC AAATTCTTTT CAGAATTTTA TCATCATGAA TAATGGCTTC 3841 ATTACGAGAA CTATACAGCA GAGGAGGCAA CAGAGTTTGA AAGAAACATA ACACTCCAGC 3901 ACATTCTGAT TTCAGAATTT ATGCAAAATA TTCTTACAGT TTTAGTGTCA AAGAGGATTT 3961 GCTCAAAACT CCAGAGAAGC CTGTGACCCA CCACAGCCTG GTTCCCCCTC GCCAACCTCC 4021 TCGGACTTTA TTAAGGTCTG TCTGCTGAAG TGGCTCTGGG CCAGGACTGG CACAGACCAG 4081 ACTTCCTGCT CCATTTGTCT TCCCGATTGT GCCTGATTTG TTGTTTCTGT TTCTTATCTG 4141 AATTTGCCTT GCCCTTAGGG AAACCAACAA CTTAGCCTCG GCCTTCATGG TTGAGGGAAT 4201 TCATCCAAAA GAGGCAATAA AAGGTTTTAG TCAGTAGAAA GAACAGTCTT CTCAGTGAGA 4261 TAGGGCCACA CTGTTCTCTC TCATTCTTCA CTAAGGGCTC CTTCCTGGGT GTGTCAGACA 4321 TATAGCTGGT TCTGACTCAC TCACAACCTA TCGTTTTCTT TTTTCTCTGA CCATTGCCCT 4381 CATCAAAGTG CCCCCAAACA AACAATTTGG ATCAGCCTCT TTATGAGTCC AGAATGACTG 4441 CCCTGCTATG GACAGCCTTA GCTAGCATTT CTTAACAAGG AAAAATAAGA GGCCATTAGG 4501 ATGTTCCCAA CAGACAGATT TCTCGTTCCT TCCAGGGCAT TCTCCTCTTC TTTGCTTTCC 4561 TTAATTCCAG AGTGAGGAGT CGGTCTCCTC TTTCCCACGC GTGCTCACTC AGGCCTCTCC 4621 CAAGTCTGTG AGCACAGCCT GCAAACACCT GTACACAGCC TTCTGCATGC CACAGTCACT 4681 TCTCACTACA GCTGCCTGAC AAACCCTGCT TGTTTTGCAT CTGCTAAGTA TTTCCTTATG 4741 GAGCTGAAGA TTCCCAGAAG AAAACATTTG GAATCCAGAG GGAATCAAAT ATAAACTCCT 4801 GACGTGAAGG CCCAGGAGTA AGTAGCAGAG GCTGCAAACA AAATGTTTTA ACCCAGGACC 4861 AAGGGGGCTT GGAAAATGTG GCAAATGTCC TCCGAATGGC TATTTGTGAA CTCTCAGAGT 4921 ACATATCAGC TGGTTGGAGC CTATAATAAT TGGGTTATCC ACTGTATTGA AATTTGCTTT 4981 ATAAACAAAA TTTAACAGGG CCATAGAACA CAATGGGACC TTCCCTCAGA TTTAAGCTCA 5041 ATATTCCAGA ATTCTCTGCC ACCTAAGAGG CAACTTGGTT GAATCTTACT GACCTTTGTA 5101 AACACTCACT CCTTACCTGG TGGTTGAGCC AGAAGCTGGG AATTTCTGGT CGCCCTCGAT 5161 CTCTCAACAC GTTGTCCTTC ATGCTTTCGA CACAGGGGTG CTCCCGCACC TTGGAACCAA 5221 ATGGAGGCTC ATAATCTTTT ACTTCTGTGA AGAAAGCCAG CAAACACAGG GTCACTGAGA 5281 ATGGCATGTG CAGCCAAAGG AAATGAGCAT GGTGAGATGC CTGGCTGGGG AGCATGAAGC 5341 ACTAAGTAAC AAATACATAC GTAATTACTC TAAGAGCAAA TTTTAATAAT AATGGCTAAG 5401 ATAAGAAGGA AGGAGTGGTT GGGGAAGGGC TAGAGAAGTA TTCAATAAAT GATTGTTGAG 5461 TACTTAAAAT GTGCTAGGTG TTATGCTGGG GGACACAGTG GACAACAAGA TAGAGAGGGT 5521 CACGGAGCTT AGGTTTTAAC ACAGGCATTT TCTACAGGGG GATATTGCAG CAAAAGGGTG 5581 AAACTGGTTC TTGGGAAGTG GAAAAATCTT ATGTATTACA ATGGTTTGTG AGCCTCCAAA 5641 GGCCCAGAGT ATACAAAGAG ATTTAAAATG TGGTATTAAA TTTCATGTAG GTATTGAGGC 5701 ATAAAAAGGA ATGAAACTCT GGCACATGCT ACAACATGGA TGAATCTTGA AGACATTATG 5761 CTAAGTGAAA TAAGCCAGAC ACAAAAGGAC AAATATTGTA TCATTCCACT TGTATGAAGT 5821 ACCTTGTACA GGTATATTCA GAGACAGTAT AATGGTGGTT GTCCAGGGGG CAACCTGGGA 5881 GGAAAGGGTA GGAAAAGTTA TCCTTTAAGG GGTAAAGAAT TTCAGTTGAG CAAATTTCAG 5941 TACAGAAAAA TGAATAATGG TGATGGTTGT AGAGCACTGC GAAGGTACTT AATGCCAGTA 6001 AACTGTACAC TTAAAAATGG TTAAGATGGT ACATTTTATA TTATGCCTAT TTTGCTACAG 6061 AAAAACATCA TGGAGAGTAG TGTTTAGAAA AAAAGTTGTC TACAGGCCAG GTGCTGTGGC 6121 TCATGTGTGT AATCCCAGCA CTTTAGGAGG CTGAAGGAGG ATATCTTGAC TCCGGGAGTT 6181 TGAGACCAAC CTGGGCAACA TAGCGAGATC CTCTATCTAT ACAAAATAAA AAACAAAACA 6241 AGCAAACAAA AAAAGTTGTT TAAAAAGGCT CCTTACGATA TCACTGATTT TAAAAAAGGT 6301 TGAGAAATGC TGTTTTAGTG GGAAGACAGA GGGGACAGAT TAACAACATC AACAAAATTT 6361 TAAAACGATA ATTTTCCTCT GATGGTATAT TCAATAAAGA AAATGATAAA GGAGGAGGTA 6421 ACCCTTCACC GGGGCCTCAG GCTTCAACTA AGGTCAAATT CTTTATAAAA ACTTCCTTGA 6481 ACATCCTTAG GGTCAATCTT GGTTAGATAT CCTGGGCAGG GCTCTATTCG TGCATATACC 6541 ATATTTTATT TAATATATTC ACCTGCTTAT TTTTCTCACC TAACTGGACT GTGAGCATTT 6601 GGGTGCAAGT TGAGTCCCTT TCTCATTCTT GTATTCTTGG TGCCAATTGC AAGGGTCTCC 6661 CATGCCAACA GGCTGTCAAC AAATGCTTTG TTGAGTGAGT GAATGAATGA ATGAATGAAT 6721 GAATCTTAGA TTCTCTCCAA AGTGGCAGTG CATAAACTCT GGCCAAACAT TAAAACAAAA 6781 CACCAATTTA AATGAGCAGA TTAATATAGT GTAAACAGAG CACAGGACAC TTAAAAAGAT 6841 AGAAAACATC CCAGTACTAA AACATGCCTG GGCTGAAAGG AGAGATTGGG CTGGATTCAA 6901 CACTGTTCTC CAAAGTAAGT AGGATCTTTG GCCTTTAGCT TCAAAATAAT CTTATTTAAT 6961 GAGTAAAACT TTCAATACAT TTGCACTTCT AGGTAACGAA TTGAAGAAGC TTTCATGGCA 7021 AGATGACATT TTGAAAAGGG ACGGCTTGTT TTTGTTCTTT GTTCATTTGC TTTTTTCCCC 7081 TTTTCCAGAA CTCTACTTGA ATATTTATCT TTTTCAGCTT CACCAAATAG TAGAGCTGCC 7141 AGGATATTTT CTTTTTTATA GTTTTAAATA CAGGGGAATT TGGGATGAAG GCCTCCCATC 7201 ACATTAAGAC AAACCACAAA CTATCCTCCT GTGTGTCATG CTTTTTGCCT CAAAGGACCC 7261 AAGCATTTAA TCCACATTGC TCTTGGGTGA GATCTGAATT GTGATTTGCA TAGCATTTAT 7321 ACTCTTATTT TTTTCTTTCA TTCCTTATCT TCAACCAGAC TGTAAATGCC TAAGGCACAA 7381 GGCAGTGGCT GAATTTGGTG TCTTTCACTT ATCTGCTCAG TGCCTAAAAT CGTGCCTTAT 7441 ACGTAGTAAG AATTTAATAA ATATGAGTTC GGTTGAATTC AAGCAAAAGA GAAAACTGAG 7501 AATCAGATCT GGTTCCCAGT AAGTGTTTAC TCTCATGTAC TTCTTCTCTT CTATAAAATG 7561 AATATACTGA ACTGAGCTAC CTCCATGTTC CTCTTCAGAT TTATCTTGTA ATCCAATCTA 7621 ATCAAATATG ATGCCCCCTT GGTACCATAC CTTGAGATAT ATGTACTACC ATATAATAGT 7681 AAAGGATAGG ATTTGTATAT GATATAAATT GTTCCTTAGA TAAGGTACAG TCCACAGACC 7741 TTCCATCTTC AATTGTTTTG GCTTATGTAG CAGCTGCAGT TGGTGCCTGC CAAGGTCCCC 7801 TTGACCAAGC TAGGGCCAGC AGCCTACAGC TGCCACAGGT GTTGGCTCAT AAGGGCTCAC 7861 ACCTTCACCC TTTTCTGGGG GATTGTCCTT GGCCAATGGG AGTTGCCTAT CCTAGAGATT 7921 CGTGGACATG ACCGCCTTAC TCTCAGAGGC AGCGTATAGC CGATGACAAA TTAATGTTGA 7981 AGTTTAACAG TCCAATTCTC TTGGCTCTTG GTGGGTAACT ATGGTGCAAT TCACACTCTC 8041 CAGAGCTTCC AGTGAGATCA AGCTGAGGTT AGACCTCTCT TGAAATACAA GTTCACTTAA
8101 CTCCTTCCAT GCCTCTTCCT GCTTCTCTTA CTTCCTTCTC ATGAGAGCTT ATCCTCAATA
8161 AATCATTGCA CAAAAGTGTG TCAGACTCCA CTTCTAGTAA AGCTGGCCCA ACACAGCCGC
8221 CAAGGAAGTG CTTTCTCCTC TCTCCCTAGG CCTTTGTCTC AGTGAATCTG CACAATCTGA
8281 CTGTAGCTGC AAAGCTACCC TGGGGAAGCC TTGATGTAGC CCCTTCTTGT GAAGGTGAAA
8341 TTACTAAACC AGGAAGAACA TTCTGAATCT CACATTGTAT TACCGTTACT CTGATGAAAC
8401 TCCTTTACCT TTCTAGAAAG CTTTCATGCT TTTTCCTTTC TACCAAGCAT TTCAGAGAGT
8461 TCTTTCTCCT CTGACTATCA ACAACAATCC CTATACTCAT GGTCAGAAGT GACAGAGGAG
8521 GACATGACCA ACATCAGAGG AGGAAAATGT TGGGATCAGA ATAAACCCCA GCTGTCAATC
8581 TCATGGCTGA TAGTCCTTGA GAACAAAGAC AAAGTCTTTG TCCTTGAGAC TATAAACGCA
8641 GAGCCAATTC ATTCCAAGTC CTAATCTTCC TAGTTACAAA CACTACACAA TTTATTGTAA
8701 TTTTTTTTAT AGGTACTCTG TGGATCAAAG CAAGTTTCCA TGGGGAATGA GAGAAGATGG
8761 CATTGGGCAT ATTTTTACTT AAAGAAAAAT TAATGAATGC TATTTTAGAA AGGAAGACAA
8821 AGGCAATAAT CCCTTCCCAA AACAAACAGA CTTATAAATA GGTTACTTCC TACTTTTCCT
8881 AAAATCTTGG AAAGTTGTGA GACTCCCTAA TATTCCCAAG GGATACAAGG CCTGCTTCCC
8941 ATCTTCGACT TATGGGTAAT TTCACAAGGA AGGGAGGTCA CGGGTAGTCT GAAAGGTGCT
9001 GGCAAAAGGA CTGGCTCCTT GTGCCCCACT GGGAGAATTT ATGACTCTTC TGCCTCCTCC
9061 TAAGCTTAAA ATAGACAAGT CTGGGGAGGG AGGATCATCA TTTGACCTAA ACTGTCATAC
9121 TCTAATCCTT TAATATTAGT TTTTCAGATT AGGAGTACGG ATGGGGATCT GCAGTGTGTG
9181 CATGATTTAG GCTGACCTTT CTTTAACTTC TGAAAAATGT CCTATTTATG TAACATAGAT
9241 TTTCCAAAAC AGCTAAATGC ATGTTTGCTT TTTTCTTTCT AATTATGGAT TTTTGCAATT
9301 CTTCTTTCTT TACCCTTCTC TCTCATTTTG GACATCCTAC TCCCAACCTC CATTTTTTTT
9361 TTTCTCATGC CCTGCAATGT GTAGGAAGAT GGTTTAATGT TTGGCAGTGT GTATACATGT
9421 GCCTCTCAGT TAACATCTTT GATATTCAAT TGCAGCGATC AGGCAACATT GCTCATTTTT
9481 CCTACTATGG CCATTAAGGC AATGCCATTC TCAGGGCCTC CATTAGGACT TGTAGGATGA
9541 CCATGTAACA TGGAGGCCAG TCCCTCCTGG AGGGCATTTC TTAATTGCTC CTCAGTTCTA
9601 AGTGTCCCTC AGAATGCCTC AGATATTTGC TTTGACTCAG CAGAAGAAGG GAAGATCGTG
9661 GCCAGAGATA GCCTGAACCC TGCGAGAGGA GGTTAGAAAG CAGAAAGCCC TCTGCCAGCC
9721 AGGTGGGTAC CAATGGTCGT TCCTAGGATG AGACCTCATG TAACAGAGCC CAGGCAGTCC
9781 TGGGGAACTG GACAGAGCTG GTGATTGGCA ACAAGTTGAT GGCCTGAGAC CTTTGACACT
9841 CCCAACTTTT TCCCCAGGGT TTCAGGCAGC TGGAGACTGG GATGTTTAAT CCACTTTGGC
9901 AAAATCTTTG GGTCCAAACT GTGTATCTTA TTTATTTTTC ATGATGGTGC TTAAAATATT
9961 TTTATTTTGG AAAATGCATG TGATTAAAAC TATGAAATGA CTAAACAAAT ATGTATAAAG 10021 AAATGTAAAT CTCTCCCCAA CTCCTAACCA CTGTTTCTTT CACAAAAGTG GCTTAGGTGG 10081 AATAGTGAGA TTAAAAGTGA TTAAAATTTT TCCCTTATTA CTTGCAAATG AGCACTTCTC 10141 AATCAATTTT TTATAAAAGC CCAGATGTTT TGCCCTCAAT TCATTGGGAA TAAAGGCTTT 10201 GGTAAAATAC AGTAGAAATG AATTACAAGA AAAATGAATC CCACTTGAGT GTTGTGGCAA 10261 CATCAAACTG CTATTAAAGG CACAAAACAC ATCTTGGTTT CTGTCCTTAT ATTGCAAATC 10321 TGTAACAGAG AGTTTGAGGA CCAGCACCTG CCAAAGACCA CACTTGGAGC AACATTGCCC 10381 TAAATGCTTC TTAAGGAATG TGAGATGCAT TTTGACACAG GAAAAAAGAG CACAAGTTAT 10441 TAAACATATT TTAAGGGTTT CAAATGAGTC AGACAAAGAA TATTGAAAAG GTCTTCAGAG 10501 ACGGGATCCA ACATCCTCAT TTTACAGTTG AGAAAACTGA GGCCCAAATA GTACACTGGA 10561 TTCCAGGAAG AGCATTTAGA ATTGTGCACT TTATTACTGT TACTCTGAAG AAATTTGCCT 10621 TTGCCTTTTT AGGAAGCTTT CATGCTTGCT CATCTCTGCC AAGCATTGCA GAGATTTCTC 10681 CCCTAACCAG AGCAAGTACA GCTGGGGCAG TCCCTGGTAT GAACATGCCC TTCCCAAATG 10741 TGACAAGTGT GTCCCTCCCT GCCTTGATGG GGCCCTCCTC AGCATACAAC CTTGAGAAGG 10801 GGAACCTTAT GGGATCTGCT GGGTGGTTGT TATTTGTAAT TTCTAAGCCA GCTATGCAAA 10861 AAAACAATTA CAAAGAGCAG CCCTCTCCTT AGCTGGTATT ATTTACCCAC ATTAAACCCA 10921 AACACTTGTC CTTTCTGGGT TTAGGGAAGT AGATGTGACT GGTGGTGGAG GTGAGGTAAG 10981 GATGAGAATC TCATTTTAGC TACAGGCATC AGATTGGGGC ATAGTTGGCA ATAGAATTAA 11041 TGCAGTTCCT CTTTGCACAT TTGATCAAAT GATGCTTGAC CTTGGGCCTC TCTCTTGTGA 11101 AGAACTGCAT AAAAAGCAAG TTCAGGAGTG TGTGGGCTGA GTCCAGAGAA AATGTTACAC 11161 CTGGCTAACC TATAACAAGA ACCACCTTTT TAAAAAAAAT TGGAATTGCC TCTAAGAGAA 11221 AAAGCGAAGG CTTAGAGAGT ATGACTGAGT TTAGCACTTC AAAAGTGGAA GAGCTAACAA 11281 TATGCATTGT AAGTATTATT TGTTGTTTTT GCCCTGACTC CTTTAAAAAG TAGATATGAG 11341 GACTTAGAAA AGAGATGCCA AGAGTTTGTG CCTCACTTCC TATATCCACA AAATAAGAAT 11401 AGTCACATAT GCCCCCTACA ATTATTCAGT GTGATGCTGC AGGGCCAGCT GCACCGCCAC 11461 CTCCCAACCC CATTGCACTG GCTCTTCCGG TTAGGCTGGC CCAACTCCAG GAGGAACAGG 11521 CAGAAGGGCT GGAGTGAACC CTCCCAGCTC GGCCTGGAGC AGCCCTCCAG CAAACTGATG 11581 GGAATTGGAA AGATAAAACA CCCAGCTTCC TTTGAGTCAG GTGGTATGAC ACTGAGGTGT 11641 GTGTTCTGCT CGTAGTTATA CTCCAGTTGC CCATGGTGGT AACCCACTTG ATAAGATATC 11701 CTTTACTGGT TTCCTTCCCT TTCCTGACTC ATTTCCTCAT TCTCTTACTG GCATTTCCTG 11761 CAATCTCTTC CCAAATAAAC TACTAGTACT CAAATTCTTG TTCCAGGGTT GGAGGCACTC 11821 CACCCAAGAC ATATGCCTAC ACAGCAGAAT TAGTTCATCA AACCAAGTCT TTGTCTCACC 11881 CTCAGACTGT TTCTGAAGCC AGACAGACGG GGCTGAACAC CTCAGAATTT CCCTGAGTGC 11941 CTCAAACGGC ATCTTTTCTA AAAAACCTCT TTATTTCACT GCTTGAGAAC GACTTTCTCT 12001 TACTTCCATC TCCCTCCCGC CACCTCTCTC TGCAGTCTTT TCACTGATGG AAGCCACCCG 12061 CAACCGCCCG GCCCTCGCAG CTTCTTTTAA TTTGTCTCAA AAGGCTCTTA AGAGAAAACT 12121 ACGCTTGCCT GTCTCTTCCC AGTTCCACAA CCCTCAGAGG GCAGGTCTCT GGGACAGCAA 12181 TGGTATTCCT CGGAAAGTCA GCATCTGGTG CACAGCTGCT GTTTTGACTG TAGTCCCAAT 12241 GTAACAGGGC AGCAAAGTTG TTGATGGTTT TCCCCAAAGC AGTACCCCCG AGTTTTCATA 12301 TCTGCTTTCC AGACTGTGCT CCCTTGAAAT CCAGGAAAAT GAAGCGTTTC AATCCTGGTC 12361 TCTCCTCAGC CGTCTCTCCA ACGCCTCCTT TTTTTCTGTC TCTTTCTTCC CCCAGCCCCT 12421 TCCCTTTCTT TTTGGTTCAT TTGCACTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTCAT CTCACAAGGC 12481 TGCAGCAACT TGACAATACA CTAAGGAGCC CTTCTTGGAG TTGTGTTGCT CCTCATTAAA 12541 TACTTGTTCA GCTGGCTGCT ACGTGTCAGC TTCTATTCAA AGGCCTAAAT GCTAGGGATG 12601 TGGAAGTCAG TGTGCTTGCA GGCCAGTTTG GCTGGGGATG ACGAGAGTAT TTTGCCTGCT 12661 GTGTTCACCA AAGGGGGCCC TGAACAGGAC CGCCTTCACC CGCCTTCACC CGCCTTCCAC 12721 ACAACACACA AACACTTGTA TGAACACCAA ACAGACTGAA AGCCTGGGAC AGAGATTTCT 12781 TTGTAAAAGA GAAGCCATCT CCAGTTCTGT CCTTGCTGAA TGGCGATTTC ATGAAGCTTT 12841 TTCTCCTTTT TCGTAGAACA GTAACACACC AATCACCTCC TCTTGTCTTG TTCTTACTTC 12901 AAACAATTCT GAAAGATTTG TTTTCTTTTT TTTTTCTTTT GTATTCTTTC AGAGGATTAA 12961 AATGTCTGAA ATGACAGCCT CTTTCATTAT CTATCCCCCA AGTCTATTTT TCTTTCTAAA 13021 ATCATCCCAC CCACCCCACC CAACTCCAAC ATTATATTAC ATAATCTCTT TGTTCATTAC 13081 CTGTCCCTAA AATACTGGCT CTTCACTAGA CTTCCTGTCT CTCAAAGAAA GACACTGCTT 13141 TTTAAACTGC TGTATCCCTG GCATTTTAAA CAATGCCTGC GACACAATAG GTACTCAATA 13201 AATACTTTTT GAGTGAATGA ATGAATAAAT ATATCTTTAG GGAAATAAAG ATAAAACAGT 13261 TATCTCAAAT TTTAAGGTAT 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ATTTCTACCC AACATCTCTG CAAAGGAATG TTGCTGCTGC AGATCCACCC CCAACATGGG 79741 AAGGCCCAAG GCAAGTGAGC AAATAGAGGC CCATGTACCA TAAGTCAAAA CATTTAAAGT 79801 TACAAATCAA GCTAGCAAAC TGCTCAATAA AATAGGTGTT ATCCTTCTAC CTAGACTGAC 79861 AAATATATCT TTTCAATGTC TTGGAAGACC AGGTACAACT TTAGAACTCC TACAATGTTC 79921 ATAGTCCTTC CACAGAAATG GGTGGTTTAA AGAGAGACAT CATCCTGAGC CCTGGTAATC 79981 AATTTGCCTT CCTCCCCCCT GCCTGCTCCA TCCTACATCA AGAGGGGCCT TGTGATATGT 80041 GGACACCCAA GCTCGCTCTC TGTCTCTCTC TCTCTTTCTC TCTCTCTCTC TCTCTCTCTC 80101 TCACATACAG ACACACACAC ACACAGAGCT ATCCCTTAAA CAACCCTCGT GCAGAGATTG 80161 CACAACCAGT AGCAATGACA GCCTTCAGGA AGATGGCTTC AAGGATCCAT GCAAACTGCA 80221 GATACCAGTT CAGGGCCTTC TGGACAGCGA ATGTGGGTTC CCACATAACC AAATCATGGT 80281 CTAAAAATGA AAAGAGAGTA AGACTGGAAG GCCCAAAAGT CACCTCACCC CATAGGCATG 80341 GCTCTGACCA GAGAAGAATG ACAGCAGAGT ACCATCTAAG GCCCAGGACA GAGGCCAGTT 80401 GTGTTCATAT ACTAGGTCTA TATTTTAGTT GTAGAGCTGA AAAAAATTGG AGGAAAATAT 80461 TCCCTCAGAA AAGAGAAGAA AAAAAAAAAA AAAAAAGAGC TGCATGTCTT GACCTTTCCC 80521 AGATAGAATC TCCCCAGTCA TAGGTACGGG CCCTGAAGCT AAATCTCATC TAATAATGAT 80581 AGCTTCAAAC CTACAAACAA AACACAGATG CTAGGGAACC CTTAAGAGTC TAAGCAGGAG 80641 GCCATAAGTA GACTAAACTG ACTACACCCA AGAGGATAGT TGCTACTTGT TGGGTGCTAA 80701 GACCTAGAAA GCTGACTGTG GCAAGTAAAA GGCAGAAGTA CTCCTGATGT AATGGGTGAG 80761 GAAGAGAATC TTAACCTCCT ATAAGTTTTC AAATTGTCCC CTTCAAAAGT CAAACTGTCC 80821 CCTTCTTCTT TGTTATGTTG GATAAAGTCG GCTCTTCTTG CCCTCATCAG CAGTTGTACA 80881 CGATTGTACA CAAATGATTG TCCTACACAC TCAAAATTTG GGGTTTACAA TACACATCTT 80941 TGCAAATGGG GTATGTCCAA CTGCTATAAG TGGCCAAACC ACAGGTCACC CACCATGAGT 81001 CCTACCACTA AGACACCATT GTCAAACTGT GGGCTGTAGA GTTTCCTTAT GCAAAGAAAC 81061 TCTGCCTTAT CTTGATTTTC TGTGGTACAA ATGTAGTCAG GAAGGAGGCA GATAATGCAA 81121 GCAAACCAAA TCAATTAAAT CAGGAGCACT GAACTGATGA CATTAGATGG TAAGCTTCCC 81181 CTCTCTCAAA TCTGATATCC ATTCACCCCT CTTCAGCCTC CCTCCCAACA CACGCATACA 81241 CACATAGAGA CCACACGAAA GAACCTAGCA GCATGCAAGC ACAAGAAGCT TGGGCCACAC 81301 ACTCATACAT GCACCCAGGC AAAACTCCAG AGAGACCCTG 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ACAGGCTACA CAGCCAGTAC ATGGCAAGTG GGTCTGGAAC 83041 CCAGGACGGC CTGATTCCAA AGTTTATACC CTACACTCTT CTACCACCAG CCTATCCTCA 83101 AAGAGAGCAC TAAATGAACG CATTGGGTCC ATCATGCTGG CTATGGAATG GAGAATGCAA 83161 TTAAAGGCTG CCCAACTGGG GCTCCGTGAC AAGGCAGGGA TAGGAAAGAG ACAACAAATT 83221 GATTCAAAAA TACATTCAAT GGGACCTAGA AGGAAACATT CAACATGCAC ATCCTCCTAG 83281 TGCATACAAC AACAAAAAAA AATGAGGCTT TTGAAAATGA GGTGTAGAAA ATAAAACACC 83341 AGTATTCCAT AATGCTTTCA AATATAAACA GTTAAAACAC GTATCCTTTT CTTTACTTAT 83401 AACATGCTCC CAGCTGTTAA ATTCAATGGC AAAGACCAGG TCTGTCTTAT TCATCTGAGA 83461 TGGTATCCCA GGTCTGAGCA TCCTGCCTGG CAAGAGATAC TCAATAAATA TGGTTGAAAA 83521 GGTAGAAGAA AAAATGCCCA GTTTTTGCAA TGATATCAGA GGTGCCTTAT TGATCCAGAG 83581 TTAAAAACTA ACCTTACTGA AAAAATTAAA AAGTCATGTT CATAACTGAG TAGAAAACAT 83641 GTAGTAGTTA TGTTGACTAC ATAGACAACA GTCATCATTA GGGAATGCTA CATTGAAAAG 83701 AAGGCAATGA GTTCAAAATG TGATTAGTAT TTTGTATAAA TCATAACTCA TTAAAAATAA 83761 GATGTTGAGT GGCCTAAAGG TGGAAATGTG TTTTTATGAG GCGGAAAAAA AGCACGAGTA 83821 GACTGAAGAT CAGATTTGGG GCCTAATGAT GTCTAGTCTC TTACCCTGAC AAAATAAGCA 83881 GGTTATTAAA GTGATGTGAA GAACCTGATC ACTATGACAC TTTTACAAAT TCTTTGTCCT 83941 CAATAAGAAT CTATCTACTT CCAGGAACCT GAAAAGTCAT ATTTTTCAGA CCTGAAGAGT 84001 TATTGTGCAC TTTACAGTTT TCCCCAAAAG AGTCATTTCT TAATTTTGAT CATTTAGGAA 84061 GAGTGAATCT ATTAAGTCAA AAACGAAGAA AAAAAAACTT TCTATTTCTT AGTGAAATTT 84121 GTTCTTTTAT TTAAATCCTT TGCATACTAC TAAACAGAAG TACAGAAGCT ACTAAACAGA 84181 AGACAGATTT TTGGGCCTTT TTAGGTGACG TAAAAGGAGC TTGTTGTTTA TTAAACAATC 84241 TCATTACCTG ATATATTATC TTGCATTAAG ATATTTTGAA AAAATGTTTT CAGTTTACCA 84301 ATTACGTTAG AGAAATTCTG AAACTATTTA CTTACATGAA AAATTAAAAT GTAAGTAGAA 84361 TTAGGTTTCT CGTCTTCAAT ATATCTGTCT TCAACCATTG GCCAACTTTG AAAATTTAAT 84421 TTGAATCAAA TGAATACAAA TTCAAAATGA TTCATTAATT CAACCATTTT GAAACTTCAG 84481 TTCTATAAAA ATATGAAATC TGTGGGCCTT GTAAAACTGT CTAAATACCC AAATAAAAAG 84541 CCACCACGTT TTTAAGCTAA TTGTTTAAAA GTGTGTATAT TGATGAAATG AAAGTGACTC 84601 GTGAACTATT GGGTCTGGAA TTTGCAAATC ATAAACCTTA TCCTTGTAAA CAGAACCTAA 84661 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GGCCGCCTTC AGATAACCAA 86341 CTTCTCAAAC TTCCCTTTCC GGGGGTGGGG GCTCGCCTCG AACGCGGCCA ACACAACGCC 86401 TTTCCTGCTC GCACAAAGGG GACCAAACGT GCCCCGCGCC CCTTGCAACT GAACTTTCCT 86461 TCTCTTTTTC AAGAAAAACT CACAATCCCT GCAGCTACGG GAGTCGGGCT GCGTGAGTGT 86521 CGCGGGGGAA ACTTTCCTCG TTTCCGCCCG GGGGCCGGGT TGCCGGGCCC GACTGTCAAG 86581 CGCAGCGGAG AGGCGGGGAC CCCAGGAAGA CCCCCGGCGC CCCGCCGAGC CCGGGCTGGG 86641 GACCACTCAC CCGACTTCTG AACGTGCGGT GGGATCGTGC TGGCGATACG CGTCCACAGG 86701 ACGATGTGCA GCGGCCACAG GCCCCTGAGC AGCCCCCGAC CCATGGCAGA CCCCGCTGCT 86761 CGTCATAGAC CGAGCCCCCA GCGCAGCGGA CGGCGCCTTC CCGGACCCCT GGCTGCGCCT 86821 CCGCGCCGCG CCCTCTCCGG ACCCCGCGCC GGGCCGGCAG CGCAGATGTG CGGGCCAGAT 86881 GTGGCGCCCG CTCGCCAGCC AGGAGGGGGC CTGGAGGCCG GCGAGGCGCG GGGAGGCCCC 86941 CGGCGGCCGA GGGAAGCTGC ACAGGAGTCC GGCTCCTGTC CCGAGCGGGT GCACGCGCGG 87001 GGGTGTCGTC GCTCCGTGCG CGCGAGTGAC TCACTCAACT TCAACTCAGC GCTGCGGGGG 87061 AAACAGGAAA CTCCTCGCCA ACAGCTGGGC AGGACCTCTC TCCGCCCGAG AGCCTTCTCC 87121 CTCTCCTCGA CGTCCAGCCC CTAGCTCTCT CGTAGCTGCC AATCATGTTT CCTAGACCAG 87181 CCCCTCCGAG AGCTTTGGCC GACTTTCAGC TGCCCCTCAC CGCCCTCCCA CACCACTCAG 87241 GAGTTCCTCG CTCCAAGTAT TTACTCAAGA ATGACTAAGT GCACACAGTT CACAAAGTAA 87301 CAACAGAAAA CGTCCACGTT TTCCCTAGTA GATCAGAACA TCTGCCGCCT CCCCTCAGCT 87361 TTCTTCAGAT TGCTCCTAGG TGCTTTAGAG ATGCGTTTTC AAATTGCAAG TTGAGATCCA 87421 GGAGTGAATA CTCCAATCTA TTGAGTCGCG AGCACATTTC TTTCCCAAAT AAAATAGTAA 87481 CGGTAAATTC TACTTCATTA AATTTGTGCT TCAGTTGTGT CTATATGCAT GTATGTATGT 87541 GCATACACTG TCAAGTTGTA AAATGTTTTT CTTTAGGTCG AAGTCTAGAG GTTTTTCTCA 87601 AGTTTTAATG TACATATTGA TCACCTGGAA ATCTTATTTA AAAATGCAGA TTCTAATTCA 87661 GTAGGTCTAG GAGGCAGGCA GAGATTCTGC ATTTCTAATG AGCACCTGGA TAGAGCGTCC 87721 CATTTTGCAC CGCCTCTTCC CGGGACTGAG TCAGTGAGTA ATTGTAAATG ATCACCTATC 87781 ACGAAGTGAT AGTGGTGGGA AATGTAATTT TCAGAATGTA TAGAGTATAG CAGAAACTGT 87841 AAAATTAAAA GTGGGTTGGG AGTCACCTGA ATGCTTGTGC TTTTATTCCC TTAATGCAGG 87901 TGAAGAAAGA GAATACTTAC CCTCTCATGT GCAAACGGGG TAACATGGGA GCAGAACAGC 87961 ATAAACTTTC AAATTTCCTT TCTTGCTAGG GCAACCAGAT TTGCCCAAGA CATTCCTGGT 88021 GTACATGTTT TGTAGTTTAA ATATTAATAG AACCCCCTTT CTCTTTCAGA TATGTCCTGA 88081 TTGGATAATA AACTATGTGA TCAACCTACT TCCCACTCTC AAAGATATGA TTCTGTACAG 88141 CCCTCTGGTC AGTAGATCTT CTAGCAATTC ATTTAATGAA TTCCTTTACC TGAGAGGAAG 88201 ATTGCAGAGG CAAGGGTTTG TGCCAGGGTC TCCAGGGAAT AAAGGTAAAT AGCCCTCCCC 88261 CAAACCCAAC TCCCAAATCT TTCCTGTCAT TCTAAGTGTT CATTTGCTTC ATCCTGGAAT 88321 TTTAACTCAT GCTCCACCTA GCACCCAAGC TGCCTCTGGA TGTTTTGCCA CTTCCCAGTA 88381 CTCATGTTGA AGATGCAGAA AGTGCAGTGA AATCAGGAGG GCTAGGCATC TTCTTTCCCA 88441 CCAATTAATT GCCTTGCCAA AGCTGGAGTG ACTTTGTCAA TGGAGGAAGA TTGAGTTCCA 88501 AATCTTCTCC CTATTCCCTC TTCTGCCACC AGCCCATGCC ACTGCCATGG CTTGTGTAGG 88561 AGTCTCCCAG GAGTCACCCT CAGCCACGGC CGTTCTGGGC TCTTTCACTC AGTTTCTCAA 88621 ACGAGAGCTG AATTCAGCTT TTCAAAATAC AAAACTAGTT ATACCAACCC TCTGATTAAA 88681 ATCATTTAAT GGCTTCCCAC TGCTCTTGAG ATAAAGAGAA GATAAAAACC AGATCCTTGA 88741 ACGTGTCTTC AAGCCTCCAA CTCTCCCGTA AACTTTCATT TGGCTTCTCC TTGCTTACTG 88801 AAAGCCTTCT CCAAATTTCG TGAATATGCC TCTGTAATCC TCCTACCCTT TATGCTTAGA 88861 GCCTTCCCCA GTGTGGACTT CCTTCCTCTG ACCTTTTTTT CTTCACCCAG CCAACTCCTG 88921 GTCTTCGTGG ATTGAATCAT AACTTCTTTG ATGGGCAAGC TTTCCCTCAC CTCCATGAGT 88981 AGATCTTGTA TTACACGTTC TCTTGGCACC ATAT
NIS: 2
Factor de tranformación de crecimiento Homo sapiens, receptor beta II (70/80kDa) secuencia antisentido
Derivado de BC040499 1 tttttttttt ttttttctag gaatgggaac aggaggcagg atgctcacct gagtattttg 61 ctttattcaa tctaataaac attttattta tgtaaaagac aaacaatgca tagaataaaa 121 ataagtgctt gagacttttg atataaaaag agtatatagc attcacattc ctattttaat 181 acatgagtac agctgaagtg ttccataaaa gaataaaact ttccctttat gtatagtagt 241 gaaaaaagtc agtattttta ggaactacag aatgttattc cttggtcttt tttcttgaat 301 aagaaaaaaa aacataaaca aaacaagcca cagtatcctc tgacactaca ttccagttta 361 tgctgataac ccagaagtga gaatactctt gaatcttgaa tatctcatga atggaccagt 421 attctagaaa ctcaccacta gaggtcaatg ggcaacagct attgggatgg tatcagcatg 481 ccctacggtg caagtggaat ttctaggcgc ctctatgcta ctgcagccac actgtcttta 541 actctcagcc cacccacact gaggagggtg cctagaggtt ctatttccaa acctttgcat 601 gtatcttaaa aatctcaata aaatgagacc ttccaccatc caaacagagc tgatattctc 661 actaccagtc cctctctaat attcctattt ggctgaaaat aagtagcttc aaaaagtttt 721 aaaaaagaga ttacttgcag cattaacact tctttgttga ttaacaagtt tcctatggag 781 ttttaaagct catactttgt tcttgtcctt gtggacacaa attttctaac tgcaaatggg 841 acctttgtgt cccacattca aatcctctct agtaatttct gcaaaggttg agaaggctgg 901 catgatggag agaacggtaa ccatgaggaa agcttcttgg agtaaagcac tcctctctcc
961 aatgcagagg gtaaaactat taacatataa gcaaaagaaa cttgggctaa ctgagaccct 1021 taaaggagtt cccctttagt ccaataaaag gccaacttca aatcttaaca ccagataagg 1081 tagtcaaaat catattatat acccagagaa tgactgcttg aatggacatt tcttacaagg 1141 gaccttggtt aggtgcagat ttaattccta gactgggtcc aggtaggcag tggaaagagc 1201 taatgtttac agtgagaagt gaggcagctt tgtaagtgtc tccacacctt cacattttgt 1261 gaacgtggac tggagataac tgaaaaccat ctgctatcct tacctgggga tccagatttt 1321 cctgcaaaat ctccaaatat ttataaagtg gcttcacttt ttgaaacgct gtgctgacca 1381 aacaaaacat atgtttagag tgcctgaggt catagtcctg acaatgatag tattgtgtag 1441 ttgaaatcct cttcatcagg ccaaactgtg cttgagcaat caggagccca gaaagatgga 1501 acccattggt gtttgtatag aaaactagaa aatcaagtca agtgtaatga aaaagtaaac 1561 acgataaagc ctagagtgag aatttgctcc tttttagaaa aggatgaagg ctgggagcag 1621 agaatagtaa cataagtgca ggggaaagat gaaaaaaaga acaatttttc attagtagat 1681 ggtggggcaa tcgcatggat ggggacatct gttctgattt ttctgcaacc catgaaggta 1741 aaaagtgggg ttcaaaacat tcaaggtatt aaagatgggg tagagtttct aaactaggtt 1801 gagggagagt ttctaaacta gccccccaga tttggggctt ggagcttaaa tgaaaagtcc 1861 aggagaaata agggcacaca ggaaccccgg gaacactggt cctcaaacag tgccactgta 1921 cttagttcca tggccagaag agaagtgcta ggcagggaat gattattttg caaaagcaag 1981 tgcaatgtgg tcatagctgg ctgtgagaca tggagcctct ttcctcatgc aaagttcact 2041 gttttacagt cagagaacca ctgcatgtgt gattgtcaaa tgctaatgct gtcatgggtc 2101 ccttccttct ctgcttggtt ctggagttct ccaataaaac caatttcctg ggaatatttg 2161 atgtttttcc ttgtctcttt tcaaggtatg gctatatata tagagctata gacatatata 2221 gatatatata tatatatata aaacatagct attcatattt atatacaggc attaataaag 2281 tgcaaatgtt attggctatt gtaaaaatca atctcatttc ctgaggaagt gctaacacag 2341 cttatcctat gacaatgtca aaggcataga atgctctatg tcacccactc cctgctgctg 2401 ttgtttctgc ttatccccac agcttacagg gaggggagtg acccccttgg ttttccagga 2461 agcatcagtt caggggcagc ttcctgctgc ctctgttctt tggtgagagg gcagcctctt 2521 tggacatggc ccagcctgcc ccagaagagc tatttggtag tgtttaggga gccgtcttca 2581 ggaatcttct cctccgagca gctcctcccc gagagcctgt ccagatgctc cagctcactg 2641 aagcgttctg ccacacactg ggctgtgaga cgggcctctg ggtcgtggtc ccagcactca 2701 gtcaacgtct cacacaccat ctggatgccc tggtggttga gccagaagct gggaatttct 2761 ggtcgccctc gatctctcaa cacgttgtcc ttcatgcttt cgacacaggg gtgctcccgc 2821 accttggaac caaatggagg ctcataatct tttacttctc ccactgcatt acagcgagat 2881 gtcatttccc agagcaccag agccatggag tagacatcgg tctgcttgaa ggactcaaca 2941 ttctccaaat tcatcctgga ttctaggact tctggagcca tgtatcttgc agttcccacc 3001 tgcccactgt tagccaggtc atccacagac agagtagggt ccagacgcag ggaaagccca 3061 aagtcacaca ggcagcaggt taggtcgttc ttcacgagga tattggagct cttgaggtcc 3121 ctgtgcacga tgggcatctt gggcctccca catggagtgt gatcactgtg gaggtgagca 3181 atcccccggg cgagggagct gcccagcttg cgcaggtcct cccagctgat gacatgccgc 3241 gtcaggtact actgtaggtt gcccttggcg tggaaggcgg tgatcagcca gtattgtttc 3301 cccaactccg tcttccgctc ctcagccgtc aggaactgga gtatgttctc atgcttcaga 3361 ttgatgtctg agaagatgtc cttctctgtc ttccaagagg catactcctc atagggaaag 3421 atcttgactg ccactgtctc aaactgctct gaagtgttct gcttcagctt ggccttatag 3481 acctcagcaa agcgaccttt ccccaccagg gtgtccagct caatgggcag cagctctgtg 3541 ttgtggttga tgttgttggc acacgtggag ctgatgtcag agcggtcatc ttccaggatg 3601 atggcacagt gctcgctgaa ctccatgagc ttccgcgtct tgccggtttc ccaggttgaa 3661 ctcagcttct gctgccggtt aacgcggtag cagtagaaga tgatgatgac agatatggca 3721 actcccagtg gtggcaggag gctgatgcct gtcacttgaa atatgactag caacaagtca 3781 ggattgctgg tgttatattc ttctgagaag atgatgttgt cattgcactc atcagagcta 3841 caggaacaca tgaagaaagt ctcaccaggc tttttttttt ccttcataat gcactttgga 3901 gaagcagcat cttccagaat aaagtcatgg taggggagct tggggtcatg gcaaactgtc 3961 tctagtgtta tgttctcgtc attctttctc catacagcca cacagacttc ctgtggcttc 4021 tcacagatgg aggtgatgct gcagttgctc atgcaggatt tctggttgtc acaggtggaa 4081 aatctcacat cacaaaattt acacagttgt ggaaacttga ctgcaccgtt gttgtcagtg 4141 actatcatgt cgttattaac cgacttctga acgtgcggtg ggatcgtgct ggcgatacgc 4201 gtccacagga cgatgtgcag cggccacagg cccctgagca gcccccgacc catggcagac 4261 cccgctgctc gtcatagacc gagcccccag cgcagcggac ggcgccttcc cggacccctg 4321 gctgcgcctc cgcgccgcgc cctctccgga ccccgcgccg ggccggcagc gcagatgtgc 4381 gggccagatg tggcgcccgc tcgccagcca ggagggggcc tggaggccgg cgaggcgcgg 4441 ggaggccccc ggcggccgag ggaagctgca caggagtccg gctcctgtcc cgagcgggtg 4501 cacgcgcggg ggtgtcgtcg ctccgtgcgc gcgagtgact cactcaactt caactcagcg 4561 ctgcggggga aacaggaaac tcctcgccaa cagctgggca ggacctctct ccgcccgaga 4621 gccttctccc tctcca
NIS : 3 CAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial NIS : 4 GCTGATGCCTGTCACTTGAA ADN Secuencia artificial NIS : 5 GCCATGGAGTAGACATCGGT ADN Secuencia artificial NIS : 6 GCAACAGCTATTGGGATGGT ADN Secuencia artificial NIS : 7 GTGCAGGGGAAAGATGAAAA ADN Secuencia artificial NIS : 8 GTATCAGCATGCCCTACGGT ADN Secuencia artificial NIS : 9 GGATCCAGATTTTCCTGCAA ADN Secuencia artificial NIS : 10 GGAGAAGCAGCATCTTCCAG ADN Secuencia artificial NIS : 11 GAGCTCTTGAGGTCCCTGTG ADN Secuencia artificial NIS : 12 GAGACCTTCCACCATCCAAA ADN Secuencia artificial NIS : 13 TAGCTGGCTGTGAGACATGG ADN Secuencia artificial NIS : 14 TTTTGAAACGCTGTGCTGAC ADN Secuencia artificial NIS : 15 TCAGCCAGTATTGTTTCCCC ADN Secuencia artificial NIS : 16 TCACACAGGCAGCAGGTTAG ADN Secuencia artificial NIS : 17 TCAGGAATCTTCTCCTCCGA ADN Secuencia artificial NIS : 18 TGGTAGTGTTTAGGGAGCCG ADN Secuencia artificial NIS : 19 TATCCCCACAGCTTACAGGG ADN Secuencia artificial NIS : 20 AGCCTCTTTCCTCATGCAAA ADN Secuencia artificial NIS : 21 ATGTCATTTCCCAGAGCACC ADN Secuencia artificial NIS : 22 AGGAATCTTCTCCTCCGAGC ADN Secuencia artificial NIS: 23 AGCCATGGAGTAGACATCGG ADN Secuencia artificial NIS: 24 ATGCTACTGCAGCCACACTG ADN Secuencia artificial NIS: 25 CCTTCTCTGCTTGGTTCTGG ADN Secuencia artificial NIS: 26 CCAGGAGAAATAAGGGCACA ADN Secuencia artificial NIS: 27 CAGCAGCTCTGTGTTGTGGT ADN Secuencia artificial NIS: 28 CCCACTGTTAGCCAGGTCAT ADN Secuencia artificial NIS: 29 CAGCCCCCGACCCATGGCAGACCC ADN Secuencia artificial NIS: 30 CAGCCCCCGACCCATGGCAGACC ADN Secuencia artificial NIS: 31 CAGCCCCCGACCCATGGCAGAC ADN Secuencia artificial NIS: 32 CAGCCCCCGACCCATGGCAGA ADN Secuencia artificial NIS: 33 CAGCCCCCGACCCATGGCAG ADN Secuencia artifical NIS: 34 CAGCCCCCGACCCATGGCA ADN Secuencia artifical NIS: 35 CAGCCCCCGACCCATGGC ADN Secuencia artifical NIS: 36 CAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artifical NIS: 37 GCAGCCCCCGACCCATGGCAGACC ADN Secuencia artifical NIS: 38 GCAGCCCCCGACCCATGGCAGAC ADN Secuencia artifical NIS: 39 GCAGCCCCCGACCCATGGCAGA ADN Secuencia artifical NIS: 40 GCAGCCCCCGACCCATGGCAG ADN Secuencia artifical NIS: 41 GCAGCCCCCGACCCATGGCA ADN Secuencia artifical NIS: 42 GCAGCCCCCGACCCATGGC ADN Secuencia artifical NIS: 43 GCAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artificial NIS: 44 GCAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial NIS: 45 AGCAGCCCCCGACCCATGGCAGAC ADN Secuencia artificial NIS: 46 AGCAGCCCCCGACCCATGGCAGA ADN Secuencia artificial NIS: 47 AGCAGCCCCCGACCCATGGCAG ADN Secuencia artificial NIS: 48 AGCAGCCCCCGACCCATGGCA ADN Secuencia artificial NIS: 49 AGCAGCCCCCGACCCATGGC ADN Secuencia artificial NIS: 50 AGCAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artificial NIS: 51 AGCAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial NIS: 52 GAGCAGCCCCCGACCCATGGCAGA ADN Secuencia artificial NIS: 53 GAGCAGCCCCCGACCCATGGCAG ADN Secuencia artificial NIS: 54 GAGCAGCCCCCGACCCATGGCA ADN Secuencia artificial NIS: 55 GAGCAGCCCCCGACCCATGGC ADN Secuencia artificial NIS: 56 GAGCAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artificial NIS: 57 GAGCAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial NIS: 58 TGAGCAGCCCCCGACCCATGGCAG ADN Secuencia artificial NIS: 59 TGAGCAGCCCCCGACCCATGGCA ADN Secuencia artificial NIS: 60 TGAGCAGCCCCCGACCCATGGC ADN Secuencia artificial NIS: 61 TGAGCAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artificial NIS: 62 TGAGCAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial NIS: 63 CTGAGCAGCCCCCGACCCATGGCA ADN Secuencia artificial NIS: 64 CTGAGCAGCCCCCGACCCATGGC ADN Secuencia artificial NIS: 65 CTGAGCAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artificial NIS: 66 CTGAGCAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial NIS: 67 CCTGAGCAGCCCCCGACCCATGGC ADN Secuencia artificial NIS: 68 CCTGAGCAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artificial NIS: 69 CCTGAGCAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial NIS: 70 CCCTGAGCAGCCCCCGACCCATGG ADN Secuencia artificial NIS: 71 CCCTGAGCAGCCCCCGACCCATG ADN
5 Secuencia artificial NIS: 72 CCCCTGAGCAGCCCCCGACCCATG ADN Secuencia artificial

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Oligonucleótidos antisentido seleccionado de la SEC ID NO 3 y secuencias alargadas de SEC ID NO.3 que puede ser representado por la fórmula general siguiente:
    5'-XCAGCCCCCGACCCATGZ-3' en donde X se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos:
    y en donde Z se elige del grupo que comprende los siguientes oligonucleótidos:
    y en donde X y Z juntos no comprenden más de 34 nucleobases
    en donde dichos oligonucleótidos son capaces de hibridizarse suficientemente con la región que abarca el inicio de la traducción del marco de lectura abierto delgen que codifica TGF-Rii y las sales y los isómeros ópticos de dicha secuencia.
  2. 2.
    Oligonucleótidos antisentido , seleccionado de la SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 29 a 32 y SEQ ID NO 34 A SEQ ID NO 72, en donde dichos oligonecleótidos son capaces de hibridarse suficientemente con la región que abarca el inicio de la traducción del marco de lectura abierto del gen que codifica TGF-RII y en donde estos oligonucleótidos son dirigidos contra la región de iniciación de la traducción de TFG-RII y las sales y los isómeros ópticos de dicha secuencia.
  3. 3.
    Oligonucleótidos antisentido según la reivindicación 2, seleccionados de:
    NIS 3: 5’-CAGCCCCCGACCCATG-3’
    NIS 34: 5’-CAGCCCCCGACCCATGGCA-3’
    NIS 35: 5’-CAGCCCCCGACCCATGGC-3’
    5 NIS 36: 5’-CAGCCCCCGACCCATGG-3’
    NIS 41: 5’-GCAGCCCCCGACCCATGGCA-3’
    NIS 42: 5’-GCAGCCCCCGACCCATGGC-3’
    NIS 43: 5’-GCAGCCCCCGACCCATGG-3’
    NIS 44: 5’-GCAGCCCCCGACCCATG-3’
    10 NIS 49: 5’-AGCAGCCCCCGACCCATGGC-3’
    NIS 50: 5’-AGCAGCCCCCGACCCATGG-3’
    NIS 51: 5’-AGCAGCCCCCGACCCATG-3’
    NIS 56: 5’-GAGCAGCCCCCGACCCATGG-3’
    NIS 57: 5’-GAGCAGCCCCCGACCCATG-3’
    15 NIS 62: 5’-TGAGCAGCCCCCGACCCATG-3’
  4. 4. Preparación farmacéutica que comprende por lo menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 – 3 así como sales y sus isómeros ópticos o al menos un compuesto antisentido elegido del grupo que comprende un vector que permite transcribir un oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 e inhibir el TGF-RII expresión junto con al menos un vehículo, excipiente o
    20 diluyentes farmaceúticamente aceptables.
  5. 5.
    Preparación farmacéutica según la reivindicación 4, en donde la preparación farmacéutica es una solución de infusión o una matriz sólida para la liberación continua del ingrediente activo.
  6. 6.
    Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 4 o 5, en donde la preparación farmacéutica es
    apropiada para una administración local en el cerebro. 25
  7. 7. Uso de al menos un oligonucleótido que tiene una secuencia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde dicha secuencia es capaz de hibridarse suficientemente con la región que comprende el inicio de la traducción del marco de lectura abierto del gen que codifica TGF-RII y las sales y los isómeros ópticos de dicha secuencia para la fabricación de un medicamento para promover la regeneración exitosa y la reconexión funcional de las vías nerviosas dañadas.
    30 8. Uso de un compuesto antisentido al menos uno que se elige del grupo que comprende un vector que permite transcribir un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 7 el TGF-RII e inhíbir su expresión o una formulación farmacéutica que comprende al menos un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 7 para la fabricación de un medicamento promover una regeneración exitosa y reconexión funcional de vías neuronales perjudicadas.
    35 9. El uso de al menos un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 7 o al menos un compuesto antisentido seleccionado del grupo que comprende un vector que permite transcribir un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 8 e inhibir el TGF-RII expresión o una formulación farmacéutica que comprende al menos un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 7 para la fabricación de un medicamento para la profilaxis, la prevención y el tratamiento terapéutico de enfermedades neurodegenerativas, traumático / postraumático, 40 vasculares / hipóxico, neuroinflamatoria postinfecciosa y trastornos del sistema nervioso central, así como
    disminuciones inducidas por la edad con respecto a la neoformación de células madres neuronales.
  8. 10.
    Uso según la reivindicación 9 para la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión de TGF-RII en enfermedades asociadas con un máximo de su actividad o mejorar los níveles de TGF-RII .
  9. 11.
    Uso según la reivindicación 9 o 10 en donde las enfermedades asociados con níveles del TGF-RII arriba
    45 regulados o elevados o los trastornos neurodegenerativos y neuroinflamotorios se eligen del grupo que comprende : La enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), variante nueva de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (nvCJD), la enfermedad de Hallervorden Spatz, la enfermedad de Huntington, atrofía multisistema, demencia, demencia frontemporal u otras enfermedades de neuronas motoras, esclerosis amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal, atrofias espinocerebelares (SCAs), esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacterial, meningoencefalitis viral, trastornos autoinmunes del SNC, esclerosis múltiple (MS), lesiones agudas isquémicas/hipóxicas, infarto, traumatismo de la médula espinal y del SNC, traumatismo de la cabeza y espinal, arterioesclerosis, aterosclerosis, demencia microangiopática, la enfermedad de Binswanger (Leuoaraiosis), degeneración retinal, degeneración coclear, degeneración macular, sordera coclear, demencia relacionada con el SIDA, retinitis pigmentosa, síndrome de X frágil tremor/ataxia (FXTAS), Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP), degeneración estriadonigral (SND), degeneración olivopontocerebeloso (OPCD), síndrome de Shy Drager (SDS), deficiencias de la memoria debidas a la edadd, trastornos del neurodesarrollo asociados con demencia, síndrome de Down, sinucleinopatías, mutaciones de dismutasa de superóxido, enfermedades de repetición de trinucleótido, traumatismo, hipoxía, enfermedades vasculares, inflamaciones vasculares, envejecimiento del SNC
  10. 12.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 9 para la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad de TGF-ß en enfermedades asociadas con un máximo regulado o el incremento de los niveles de TGF-ß1.
  11. 13.
    Uso según la reivindicación 9 ó 12, en el que las enfermedades asociadas con hasta reguladas o mejorado los niveles de TGF-p o los trastornos neurodegenerativos y trastornos neuroinflamatorios se seleccionan del grupo que comprende: de Alzheimer enfermedades, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt Jakob (ECJ), la nueva variante de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (nvECJ), Hallervorden Spatz, enfermedad de Huntington, la atrofia multisistémica, demencia, demencia Frontemporal, u otros trastornos de la neurona motora, esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal, Espinocerebelosas Atrofias (SCA), esquizofrenia, trastornos afectivos, depresión mayor, meningoencefalitis, meningoencefalitis bacteriana, meningoencefalitis viral, sistema nervioso central trastornos autoinmunes, esclerosis múltiple (EM), isquémico agudo / hipóxico lesiones, accidente cerebrovascular, SNC y el trauma de la médula espinal, la cabeza y traumatismo vertebral, arteriosclerosis, aterosclerosis, microangiopáticas demencia, enfermedad de Binswanger (leucoaraiosis), degeneración de la retina, degeneración coclear, degeneración macular, la sordera coclear, demencia relacionada al SIDA, la retinitis pigmentosa, X frágil asociada a temblor / ataxia (FXTAS), la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la degeneración estriatonigral (SND), olivopontocerebellear la degeneración (Oficina del Defensor Público), el síndrome de Shy Drager (SDS), la edad que dependen de los déficit de memoria, trastornos del desarrollo neurológico asociados con la demencia, síndrome de Down, sinucleinopatías, mutaciones superóxido dismutasa, repetición de transtornos trinucleótidos, traumas, enfermedades vasculares, la hipoxia, las inflamaciones vasculares, envejecimiento del SNC.
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