ES2387637T3 - Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3 - Google Patents

Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3 Download PDF

Info

Publication number
ES2387637T3
ES2387637T3 ES09783067T ES09783067T ES2387637T3 ES 2387637 T3 ES2387637 T3 ES 2387637T3 ES 09783067 T ES09783067 T ES 09783067T ES 09783067 T ES09783067 T ES 09783067T ES 2387637 T3 ES2387637 T3 ES 2387637T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
vfpc
virus
domain
mutant
infection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09783067T
Other languages
English (en)
Inventor
Heinz-Jurgen Thiel
Hans Tillmann Ruemenapf
Manuela Heimann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intervet International BV
Original Assignee
Intervet International BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intervet International BV filed Critical Intervet International BV
Application granted granted Critical
Publication of ES2387637T3 publication Critical patent/ES2387637T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Pestivirus mutante, caracterizado porque el virus tiene una mutacion en el gen que codifica la proteina denucleo, haciendo que el virus no pueda expresar una proteina de nucleo funcional, caracterizandose el virus5 adicionalmente porque contiene una o mas mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3que compensan la falta de una proteina de nucleo funcional

Description

Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3
La presente invención se refiere a pestivirus mutantes y a vacunas que contienen dichos virus. Los pestivirus causan enfermedades económicamente importantes en los animales en todo el mundo. El género pestivirus, dentro de la familia Flaviviridae, comprende al menos tres especies: virus de la diarrea vírica bovina (VDVB), virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) y virus de la enfermedad de Borna (VEB) ovina. Se ha descrito la presencia de un cuarto grupo separado de pestivirus que comprende cepas aisladas de ganado vacuno y ovejas, y ahora se acepta generalmente para referirse a esta especie adicional como VDVB-2; por consiguiente, las cepas de VDVB clásico se llaman VDVB-1.
El VFPC produce fiebre porcina clásica en cerdos. La fiebre porcina clásica es una enfermedad de los cerdos altamente contagiosa y algunas veces mortal y puede producir considerables pérdidas económicas.
Los animales pueden protegerse contra el VFPC por vacunación; sin embargo, las vacunas vivas inactivadas o modificadas convencionales tienen desventajas en lo referente a la seguridad, además de la eficacia. Por tanto, deben desarrollarse tipos mejorados de vacunas.
El virus de la diarrea vírica bovina (VDVB) es una causa de enfermedad congénita y entérica con un amplio intervalo de manifestaciones clínicas. La enfermedad se describió por primera vez como una enfermedad transmisible de ganado vacuno con una alta morbilidad y baja mortalidad. El ganado vacuno afectado mostró temperatura elevada, diarrea y tos. La afección se llamó diarrea vírica bovina. Hoy en día, el VDVB se considera que es un patógeno importante de ganado vacuno con un impacto económico mundial. El patrón clínico de infección por el VDVB dentro de un rebaño y, por consiguiente, su impacto sobre la producción, dependen de la interacción de varios factores, que incluyen la cepa del virus, edad del ganado vacuno, inmunidad en el rebaño e interacción de factores estresantes. VDVB-1 y VDVB-2 producen ambos infecciones agudas en ganado vacuno (diarrea, fiebre, síndrome hemorrágico), además de (si la infección se produce durante el embarazo) aborto, malformación del feto e infección persistente de los terneros.
El genoma de los pestivirus consiste en una única cadena de (+)ARN y contiene un único marco de lectura abierto (ORF) grande, flanqueado por una 5' UTR y una 3' UTR. El ORF codifica una poliproteína precursora grande que da lugar a 11 a 12 productos de escisión. El ORF se procesa en las diversas proteínas víricas por proteasas celulares, además de víricas. Las proteínas víricas en el ORF están dispuestas en el orden: NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Los viriones de pestivirus consisten en cuatro proteínas estructurales, la proteína de núcleo pequeña positivamente cargada (C), que se supone que junto con el genoma del ARN forma una estructura de nucleocápside, y tres proteínas de la envuelta glicosiladas (Erns, E1, E2). La actividad neutralizante se demostró predominantemente para anticuerpos específicos para E2.
Los requisitos mínimos para la replicación de pestivirus se investigaron, por ejemplo, creando genomas de pestivirus defectuosos que carecían de secuencias génicas para las proteínas estructurales. Se encontró que los genomas de VFPC defectuosos todavía se replicaban y podían encapsidarse en partículas víricas cuando se introdujeron en células SK-6 junto con ARN de A187-CAT auxiliar (Moser y col., J. Virol., 7787-7794, 1999). Se había descrito un genoma de VDVB autónomamente replicante, pero defectuoso, que carecía de los genes que codifican C, Erns, E1, E2, p7 y NS2 (Behrens y col., J. Virol., 72, 2364-2372, 1998). Los mutantes de deleción C y E1 complementados en trans de otro pestivirus, VDVB, se describieron por Beer y col. en el documento WO04/016794.
Para VFPC se ha demostrado que los mutantes muestran atenuación vírica. Por ejemplo, Risatti y col., Virology 364, 371-382, 2007, describe mutantes de VFPC con sustituciones en la región E2 que mostraron un fenotipo atenuado. Maurer y col., Vaccine, 23(25), 3318-28, 2005 también describen mutantes de E2 del VFPC que carecen de todo o parte del gen E2 que mostró protección parcial contra la exposición letal a VFPC altamente virulento. Meyers y col., Journal of Virology, 73(12), 10224-10235, 1999, describen mutantes de VFPC con mutaciones en el gen que codifica la proteína Erns que conducen a mutaciones. Los mutantes de deleción Erns complementados en trans de VFPC se describieron por Wildjojoatmodjo y col., J. Virol., 74(7), 2973-80, 2000.
La presente invención proporciona mutantes de pestivirus que tienen una deleción en el gen que codifica la proteína de núcleo, haciendo que el virus no pueda expresar una proteína de núcleo funcional, en los que el virus se caracteriza adicionalmente porque contiene una o más mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 que compensan la falta de una proteína de núcleo funcional.
Preferentemente, el pestivirus mutante según la presente invención es un virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) o un virus de la diarrea vírica bovina (VDVB).
La mutación en la región del gen que codifica la proteína de núcleo es tal que no puede expresar proteína de núcleo funcional. Esto puede lograrse delecionando el gen que codifica la proteína de núcleo por completo o en parte.
La secuencia señal en el extremo C de la proteína de núcleo es esencial para otro procesamiento de la poliproteína en la dirección 3'. Por tanto, en la deleción (de parte) del gen de núcleo debe tenerse cuidado de que se retengan las secuencias señal de translocalización para Erns.
La secuencia de translocalización es un estiramiento de 18 aminoácidos localizado entre los aminoácidos 250 y 267, precediendo el sitio de escisión antes del extremo N de la proteína Erns de VFPC (Ala-267/Glu-268). (Rümenapf y col., J. Virol., 65(2), 589-597, 1991; Rümenapf y col., J. Virol., 67(6), 3288-3294, 1993). Para VDVB, el sitio de escisión antes del extremo N de la proteína Erns es Gly-270/Glu-271.
La longitud exacta de las secuencias necesarias para el procesamiento en la dirección 3' puede variar por cepa o tipo de célula. Por ejemplo, para VFPC, la secuencia codificante de núcleo puede delecionarse del aminoácido 169248 (p619), fusionándose así el extremo C de Npro hasta los aminoácidos del extremo C de la proteína de núcleo que constituyen la señal de translocalización para Erns (CPLWVTSC168/LEKALLAWAVITILLYQPVAA267/ENIT). Para VDVB, la secuencia codificante de núcleo puede delecionarse a partir del aminoácido 169-251, fusionándose así el extremo C de Npro hasta los aminoácidos del extremo C de la proteína de núcleo que constituyen la señal de translocalización para Erns de VDVB (CPLWVSSC168/LEKALLAWAIIALVFFQVTMG270/ENIT). La deleción de gran parte del gen de núcleo permitió la replicación del ARN después de la transfección, pero no se produjo progenie de virus infecciosos.
Con la presente invención se ha encontrado que la ausencia de un gen que codifica una proteína de núcleo funcional puede compensarse por mutaciones en la región NS3 del genoma vírico.
La introducción de estas mutaciones en una copia de ADNc de pestivirus en la que se delecionó el gen de núcleo (como se ha descrito anteriormente) permitió la recuperación de virus infecciosos.
Las mutaciones en la región NS3 se agrupan en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3, más específicamente dentro de los 100 aminoácidos del dominio del extremo C.
Para VFPC se identificaron siete mutaciones independientes en el dominio del extremo C del dominio helicasa de la región de la región NS3 (aminoácidos 2160 -2260).
Los virus de FPC mutantes preferidos según la invención tienen una o más mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3, seleccionados del grupo que consiste en Asn2177Tyr, Glu2160 Gly, Pro2185Thr/Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr y Asn2256Asp.
La introducción de la mutación Asn2177Tyr en el núcleo de VFPC Δ (p619) y la electroporación del ARNc condujo a la sorprendente liberación de partículas de virus infecciosos viables. El ARN genómico apareció ligeramente reducido en tamaño en análisis de transferencia Northern y partículas de virus concentradas no contuvieron proteína de núcleo. Los títulos de virus alcanzaron hasta 5x105 uff/ml en células SK6 y, por tanto, fueron aproximadamente 10 veces menores que los títulos de p447 wt. A continuación, las otras mutaciones Glu2160 Gly, Pro2185Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr y Asn2256Asp se introdujeron en el núcleo de VFPC Δ (p619) dando lugar a p1033 (Ala2185), p1034 (Thr2200), p1035 (Lys2189), p1036 (Asp2256), p1037 (Gly2160) y p1038 (Asp2256). En todos los casos, el virus se recuperó después de la electroporación de los transcritos de SP6 respectivos, pero la viabilidad se diferenció significativamente (análisis de curvas de crecimiento). El más viable fue el genoma que contenía el intercambio Asn2177Tyr.
Por tanto, lo más preferido es un VFPC mutante según la invención en el que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 comprenda la mutación Asn2177Tyr.
Para estudiar si estas mutaciones tienen un efecto aditivo se combinaron los mutantes de compensación más fuertes. Para mutaciones dobles, Asn2177Tyr se combinó con Glu2160 Gly, Pro2185Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr y Asn2256Asp. Las mutaciones triples contuvieron Asn2177Tyr, junto con Pro2185Ala y Pro2200Thr, Pro2185Ala y Gln2189Lys, Gln2189Lys y Pro2200Thr y Glu2160 Gly y Gln2189Lys. Todas las combinaciones probadas mostraron una variabilidad reducida en comparación con las mutaciones individuales, que indican que la adición de mutación posibilitante mejora NS3 en la compensación del núcleo.
Aunque no fueron evidentes diferencias físicas o fenotípicas para el VFPC wt parental, el núcleo de VFPC Δ fue altamente atenuado en el huésped natural. Por tanto, los virus mutantes según la invención son adecuados para su uso en vacunas para proteger cerdos contra infección por el VFPC.
Para VDVB se identificaron ocho mutaciones independientes en el dominio del extremo C del dominio helicasa de la región de la región NS3 (aminoácidos 2169 -2269).
Los virus de DVB mutantes preferidos según la invención tienen una o más mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3, seleccionados del grupo que consiste en Glu2189Lys, Leu2190Pro, Thr2191Ala, Asp2192 Glu, Pro2194Leu, Tyr2204His, Asn2265Tyr, Asn2265Asp.
El más preferido es un VDVB mutante según la invención en el que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 comprende la mutación Asp2192 Glu, Tyr2204His, Asn2265Tyr o Asn2265Asp.
La proteína de núcleo es evidentemente no esencial para la formación de partículas infecciosas. Evidentemente, C no se requiere para el ensamblaje de pestivirus, pero proporciona otras funciones. Su función es compensada por mutaciones en el dominio helicasa de NS3. La secuencia exacta de los aminoácidos residuales de la proteína de núcleo que cubren la señal de translocalización (LEKALLAWAVITILLYQPVAA268) para Erns de VFPC o (LEKALLAWAIIALVFFQVTMG270) para Erns de VDVB (englobando la secuencia la distancia entre el extremo C de Npro y el extremo N de Erns) no se requiere para la formación de partículas de virus infecciosas en tanto que se mantenga la translocalización de Erns. La secuencia señal de una glicoproteína sin relacionar puede sustituir funcionalmente la secuencia auténtica. Es viable una construcción en la que los aminoácidos residuales del núcleo han sido enteramente sustituidos por una señal de translocalización CD46 del extremo N (CD46 sólo sirve como un ejemplo para una proteína celular translocalizada). Si se introdujo el dominio transmembrana de CD46 bovino (SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA), el virus viable se recuperó alcanzando títulos de 2 x104 uff/ml.
La propagación de pestivirus en ausencia del núcleo abre la oportunidad a una vacuna de marcador de pestivirus. Puede esperarse que los anticuerpos dirigidos contra la proteína de núcleo estén presentes en los sueros de animales que han vencido una infección con pestivirus. El núcleo es inmunogénico y se expresa en cantidades significativas.
Una vacuna que contiene partículas víricas infecciosas según la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable es asimismo parte de la presente invención.
EJEMPLOS:
Ejemplo 1: Construcciones de deleción de núcleo
Para probar la hipótesis de que las sustituciones en NS3 compensan una proteína de núcleo inutilizada, los cambios de nucleótidos se introdujeron en un ADNc de VFPC infeccioso en que la secuencia codificante del núcleo (aa 169 248 (SDDGASG -KPPESRKKL) se delecionó (p619). Por tanto, el extremo C de Npro está fusionado con los aminoácidos del extremo C del núcleo que constituye la señal de translocalización para Erns (CPLWVTSC168/LEKALLAWAVITILLYQPVAA267/ENIT). La deleción de la mayoría del gen de núcleo permitió la replicación del ARN después de la transfección, pero no se produjo progenie de virus infeccioso. La introducción de la mutación Asn2177Tyr en el núcleo de VFPC Δ y la electroporación del ARN condujo a la sorprendente liberación de partículas de virus infecciosas viables. El ARN genómico apareció ligeramente reducido en tamaño en el análisis de transferencia Northern y partículas de virus concentradas no contuvieron proteína de núcleo. Los títulos de virus alcanzaron hasta 5x105 uff/ml en células SK6 y, por tanto, fueron aproximadamente 10 veces menores que los títulos de p447 wt. A continuación, las otras mutaciones GlU2160 Gly, Pro2185Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr y Asn2256Asp se introdujeron en el núcleo de VFPC Δ (p619) dando lugar a p1033 (Ala2185), p1034 (Thr2200), p1035 (Lys2189), p1036 (Asp2256), p1037 (Gly2160) y p1038 (Asp2256). En todos los casos, el virus se recuperó después de la electroporación de los transcritos de SP6 respectivos, pero la viabilidad se diferenció significativamente. El más viable fue el genoma que contenía el intercambio Asn2177Tyr (“VFPC 1017 Core Δ” mutante). LA proteína de núcleo es evidentemente no esencial para la formación de partículas infecciosas. Su función es compensada por mutaciones en el dominio helicasa de NS3.
Para evaluar si la compensación de un núcleo ausente por mutaciones en NS3 también se aplica a VDVB, la secuencia codificante del núcleo del clon de ADNc de VDVB NCP7 (número de acceso GeneBank AF220247) se eliminó por PCR en un subclon que contenía el fragmento XhoI/BglII (nt 222 -2335) usando cebadores BVT86 (GCAGCTTGAAACCCATAGGGGGCAG) y Core268 (CTAGAGAAAGCCCTATTGGCCTG). La deleción se verificó por secuenciación y se introdujo en el clon de ADNc de longitud completa por ligación de un fragmento XhoI/NcoI (nt 222 -4671). El plásmido de longitud completa resultante que carece de núcleo (p1026) codificó el Npro precedente a la secuencia señal para Erns análoga al núcleo de VFPC Δ (p619). Los transcritos de p1026 fueron replicativos en células MDBK, pero no se observó virus infeccioso. La introducción de sustituciones Pro2194Ala, Pro2209Tyr y Asn2265Asp en NCP7ΔC permitió el rescate de títulos de virus infecciosos de aproximadamente 103 uff/ml cuando se titularon en células MDBK. Un NCP7ΔC modificado que se manipuló para la propagación en células SK6 porcinas reveló la compensación del núcleo en Tyr2204His, Asn2265Tyr, Asn2265Asp, Pro2194Leu, Gln2198Lys y Leu2199Pro. NCP7 que carece de virus de la proteína de núcleo se rescató de células SK6 con títulos significativos (Asn2265Tyr: 3,3x105, Tyr2204His: 2x104 y Asp2192 Glu: 1,5x104 uff/ml).
Basándose en una copia infecciosa de VDVB C86, un virus VDVB de tipo 1 regular que crecía bien en células MDBK, se generó un mutante de deleción del núcleo como se ha descrito anteriormente y se introdujo el análogo de mutación para Asn2265Asp (Asn2433Asp). El virus con un título de 5x104 uff se recuperó después de la transfección en células SK6.
La proteína de núcleo derivada del dominio transmembrana puede sustituirse funcionalmente con una secuencia celular huésped
Para excluir una importancia funcional de los aminoácidos residuales que cubren la señal de translocalización (LEKALLAWAVITILLYQPVAA268) para Erns, la secuencia que engloba la distancia entre el extremo C de Npro y el extremo N de Erns se sustituyó en el núcleo de VFPC Δ N2177Y (p1017) con el dominio transmembrana de CD46 bovino (SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA). Los transcritos de SP6 de los ADNc respectivos (p1246) se transfectaron en células SK6. El virus viable se recuperó alcanzando títulos de 2 x104 uff/ml.
Material y procedimientos
Células y virus
Las células SK6 se propagaron en placas de plástico en DMEM que contenían 10% de suero bovino fetal y aminoácidos no esenciales en una estufa de incubación con 5% de CO2. Las células se fraccionaron cada tres días. Todos los virus VFPC se derivan de la cepa de VFPC no cp Alfort-p447 (Gallei y col., J. Virol., 79(4), 2440-2448, 2005).
Electroporación:
2 μg del transcrito SP6 se electroporaron en 5x106 células SK6. Para este fin, células SK6 (confluencia del 90%) se tripsinaron, se lavaron dos veces en PBS (Ca++ y Mg++) mezclado con el transcrito en un volumen total de 310 μl y se sometieron a electroporación (Biorad Genepulser, 0,18 KV y 0,95 μFd) en cubetas con una rendija de 2 mm. Las células se recuperaron de la cubeta y se sembraron en placas de plástico de 35 mm en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal.
Preparación de ARN y síntesis de ADNc:
Células SK6 infectadas con virus rescatados se lavaron y el ARN se preparó usando el kit Rneasy (Quiagen) como se recomendó por el fabricante. 2 μg de ARN se sometieron a transcripción inversa usando diferentes cebadores dependiendo de la localización real de interés. La PCR se realizó con cebadores adecuados y se subclonaron en el vector pGEM-T (Promega).
Ejemplo 2: Experimento en animales
Se llevó a cabo un experimento en animales con el fin de caracterizar la virulencia del mutante del virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) “VFPC 1017 Core Δ” bajo condiciones experimentales.
Objetivo:
El objetivo principal de este experimento fue investigar si el mutante de VFPC “VFPC 1017 Core Δ” muestra atenuación en comparación con la cepa parental “VFPC Alfort p447”. El uso de cerdos centinela permitió investigar en líneas generales la liberación y la transmisión del virus.
Como se demostró la atenuación, los cerdos restantes se expusieron el 2 de enero a la cepa de VFPC altamente patógena Koslov.
Experimento en animales:
Parte 1 -Infección
Se compraron seis cerdos destetados de una granja de cerdos comercial el 16 de octubre de 2006 y se dispusieron en la unidad de alta contención del Instituto de virología. Los animales se dividieron al azar en dos grupos de tres cerdos cada uno. Todos los animales se marcaron individualmente con números y marcas en las orejas.
Los dos grupos (grupo 1: animales con números 75-77; grupo 2: animales con números 78-80) se mantuvieron bajo condiciones de alta contención (presión del aire negativa de 100 Pa) en establos separados sin ningún contacto entre sí durante todo el experimento. Los animales se alimentaron una vez al día. Se suministró agua a voluntad. Los animales estaban clínicamente sanos al principio del ensayo.
Antes de empezar el experimento se recogieron muestras de sangre de todos los animales y se investigaron para la presencia de anticuerpos neutralizantes para pestivirus (VFPC, virus de la enfermedad de Borna (VEB) y virus de la diarrea vírica bovina (VDVB) por ensayos de neutralización.
Después de un periodo de adaptación al nuevo entorno, dos cerdos de cada grupo se infectaron intramuscularmente con aprox. 107 TCID50 de VFPC1017 (grupo 1) y VFPC Alfort p447 (grupo 2), respectivamente. Los cerdos centinela (uno por grupo) se sacaron de los grupos durante al menos 12 h después de la inoculación. Después de este periodo se pusieron de nuevo en los grupos respectivos.
Los animales de ambos grupos se monitorizaron diariamente para síntomas clínicos y temperatura corporal. Las temperaturas corporales que superaron 40ºC se registraron como fiebre. Durante el transcurso del experimento, los animales que mostraron síntomas clínicos que ya no eran tolerables por motivos de bienestar animal se sacrificaron. Se realizaron las autopsias de todos los animales y se registraron.
Se tomaron muestras de sangre (sangre nativa y sangre anticoagulada con EDTA) de todos los animales en los días 0, 2, 4, 7, 10, 14, 21 y 28 después de la infección. Se tomaron muestras adicionales en el día de la eutanasia. Las muestras de sangre nativas se centrifugaron a 1500 rpm durante 15 min a temperatura ambiente (Labofuge 400R, Heraeus, Alemania) para obtener suero. Entonces, el suero se dividió en alícuotas adecuadas de 0,5 a 2 ml y se guardó a -80ºC hasta la posterior prueba.
Parte II -Exposición
Los cerdos que quedaron después de la parte de infección (parte I) se expusieron intranasalmente (71º día después de la infección) a 104,5 de TCID50 de la cepa de VFPC altamente patógena Koslov. Se tomaron muestras de sangre en los días 0, 3, 6 después de la exposición y en el día de la eutanasia del cerdo respectivo.
Exámenes de laboratorio
Recuentos de leucocitos
Se contaron manualmente los leucocitos de sangre en EDTA usando la cámara de recuento según Neubauer (mejorada) después de la lisis de eritrocitos con ácido acético (2%). La sangre en EDTA se extrajo en una pipeta de dilución de sangre según Thoma hasta la marca de 0,5. Entonces se añadió ácido acético (2%) hasta la marca 11 y la dilución de muestra se agitó suavemente durante aprox. 60 s. Después de cargar la dilución en una cámara de recuento, los leucocitos se contaron en los campos de recuento de leucocitos bajo microscopio óptico. El valor correcto se calculó según las especificaciones de la cámara. Los valores inferiores a 10 g/l se registraron como leucopenia.
Los recuentos de leucocitos se realizaron en los días 0, 2, 4, 7, 10, 14, 21 y 28 después de la infección.
Ensayo de neutralización de anticuerpo ligado a peroxidasa
Los ensayos de neutralización de anticuerpo ligado a peroxidasa (NPLA) se realizaron según el “Manual de diagnóstico” de la Comisión europea (Decisión de la comisión 2002/106 de 1 de febrero de 2002) y la parte técnica adjunta utilizando los siguientes virus para la detección de anticuerpos contra el VFPC y VDVB/pestivirus, respectivamente:
•
VDVB NADL
•
Cepa de referencia VFPC “Alfort 187“ (FPC 902)
•
VFPC Alfort p447 (la cepa parental)
•
VFPC Koslov (cepa de exposición)
•
VFPC Diepholz (FPC0104)
Los NPLA para la detección de anticuerpos contra el VDVB se llevaron a cabo en células de riñón de ternero fetal primarias, mientras que los NPLA para la detección de anticuerpos contra el VFPC se llevaron a cabo en células de riñón porcino permanentes (SK 6). Los títulos de anticuerpos se expresan como la inversa de la mayor dilución en suero inicial que previno la replicación del virus en el 50% de dos pocillos duplicados. Estas diluciones de neutralización del 50% (DN50) se calcularon usando el procedimiento de KÄRBER.
Los NPLA para la detección de anticuerpos contra el VFPC se llevaron a cabo en los días 0, 10, 14, 21 y 28 días después de la infección (VFPC Alfort p447 y FPC0902). Adicionalmente se investigaron muestras tomadas en los días 0, 3 y 6 después de la exposición, y en los días de la eutanasia (VFPC Alfort p447 y FPC0902). Las muestras tomadas después de la exposición se sometieron a un NPLA usando VFPC Koslov y también FPC0104. Los NPLA para la detección de anticuerpos neutralizantes contra el VDVB se realizaron antes de empezar el experimento.
Enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) de anticuerpos
Además de los NPLA, las muestras de suero recogidas en los días 0, 14, 21 y 28 después de la infección y de los días de eutanasia se sometieron a un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) de anticuerpos comercialmente disponible para la detección de anticuerpos dirigidos contra el VFPC. Todas las pruebas se realizaron exactamente como se describe en las instrucciones del fabricante.
Se usó el siguiente kit de prueba de ELISA:
• HerdChek CSFV, Idexx Laboratories, Wörrstadt, Alemania
Aislamiento de virus
5 El aislamiento de virus de preparaciones de leucocitos se realizó durante dos pases en líneas celulares de riñón porcino permanente SK6 y Rie 5-1 según el Manual de diagnóstico de la EU (Decisión de la comisión 2002/106/CE). El marcado inmune indirecto se hizo con el anticuerpo monoclonal específico para pestivirus BVD/C16 (Peters y col., 1986) y un conjugado ligado a peroxidasa específico para especie comercial (RAMPO, Dako).
10 ELISA de antígeno
Además del aislamiento de virus, un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) de antígeno comercialmente disponible se realizó exactamente como se describe en las instrucciones del fabricante. Las muestras tomadas en los días 0, 4, 7 y 10 se sometieron a análisis.
15 Se usó el siguiente kit de prueba de ELISA:
• CHEKIT HCV-Antigen, antiguo Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Suiza
20 Resultados
Parte I -Infección
Signos clínicos y temperatura (véase la Figura 1)
25 Durante la parte de infección del experimento, sólo el animal 76 mostró una ligera fiebre en el día ocho después de la infección (40,1ºC). Las temperaturas subfebriles de 40,0ºC se registraron para los animales 75 y 76 en el día 14 después de la infección.
30 A diferencia, todos los animales del grupo 2 desarrollaron fiebre. El animal 78 mostró temperaturas febriles en los días ocho y nueve después de la infección, y del día 13 después de la infección hasta el final del experimento en el día 28. El animal 79 mostró fiebre en el día 9 después de la infección, y del día 14 hasta el final del experimento. Las temperaturas febriles se registraron para el animal 80 en los días siete, nueve, diez y desde el día 13 hasta el día 20 después de la infección. En el día 21, el animal 80 mostró una temperatura corporal de 35,6ºC.
35 Aunque los animales del grupo 1 (75-77) no desarrollaron ningún signo clínico indicativo de una infección por VFPC durante la primera parte del experimento, todos los animales del grupo 2 (78-80) desarrollaron síntomas clínicos distintos. La gravedad de los signos clínicos varió entre los animales. El animal 76 se sacrificó sin relacionar con la infección de FPC en el día 44 después de la infección debido a cojera grave.
40 Durante el transcurso del experimento, el animal 78 desarrolló diarrea grave, conjuntivitis, anorexia, lesiones de la piel y ataxia. El animal se sacrificó en el día 28 después de la infección. El animal 79 sólo desarrolló ligeros síntomas no característicos que incluyeron apetito reducido y una ligera diarrea. El animal se sacrificó en el día 28 después de la infección. El animal 80 desarrolló síntomas graves que incluyeron signos gastrointestinales y respiratorios,
45 anorexia, matidez y lesiones de la piel. El animal se sacrificó moribundo en el día 21 después de la infección.
Recuentos de leucocitos (Figura 2)
En general, los animales del grupo 1 no mostraron leucopenia. Sin embargo, los animales 75 y 77 mostraron valores 50 inferiores 10 g/l en el día 20 después de la infección. En el mismo día, el animal 76 sólo mostró 10,3 g/l.
Todos los animales del grupo 2 desarrollaron una leucopenia grave tras la infección por VFPC Alfort p447. En el animal 78, la leucopenia empezó en el día 4 después de la infección, y sólo se registraron 0,45 g/l en el día de la eutanasia. El cerdo centinela 79 mostró valores leucopénicos en los días 21 y 28 después de la infección, y un valor
55 límite de 10,6 g/l ya en el día 14 después de la infección. El animal 80 mostró leucopenia grave empezando en el día 4 después de la infección. El valor terminal fue 1,4 g/l en el día 21 después de la infección.
Patología
60 Los animales del grupo 1 no se sacrificaron durante la parte de infección del experimento.
Los animales del grupo 2 mostraron signos patológicos variables. El animal 78 mostró dermatitis difusa, ganglios linfáticos hinchados y hemorrágicos en el intestino y el tracto respiratorio, atrofia del timo, bronconeumonía, gastritis ulcerativa, enteritis catarral, pielonefritis y sangrados petequiales en la corteza de los riñones. El animal 79 mostró 65 una ligera atrofia del timo, ganglios linfáticos ligeramente hinchados en el intestino y el tracto respiratorio, neumonía
(lóbulos craneales), gastritis ulcerativa, enteritis catarral grave y cistitis. El animal 80 mostró sangrados petequiales del cutis y subcutis (acra, abdomen), ganglios linfáticos profundamente alargados, edematosos y hemorrágicos (sistémicos), atrofia del timo grave, sangrados petequiales en las meninges, bazo, epiglotis, tráquea, estómago, pared intestinal, válvula ileocecal, vejiga, hígado, vesícula biliar y los riñones. Además, el animal 80 mostró una neumonía catarral-purulenta, hemorragias extensivas bajo el endocardio y dentro del músculo del corazón, gastritis hemorrágica grave, estreñimiento y una grave nefritis intestinal.
Detección de anticuerpos
Ensayo de neutralización de anticuerpo ligado a peroxidasa (NPLA)
Todos los animales fueron negativos para anticuerpos contra el VDVB/pestivirus antes del experimento. Todas las muestras tomadas en el día 0 dieron resultados negativos (DN50 <5) con las dos cepas de VFPC usadas en NPLA (FPC0902 y Alfort p447).
Usando la cepa de VFPC Alfort p447, los animales del grupo 1 mostraron resultados positivos empezando en el día 14 después de la infección (animal 75). En detalle, el animal 75 mostró un título de anticuerpos de DN50 7,5 en el día 14 después de la infección que aumentó después a DN50 316. El animal 76 mostró resultados positivos en los días 21 y 28 después de la infección alcanzando un título de anticuerpos de DN50 158,5. El animal centinela 77 no desarrolló ningún título de anticuerpos.
Usando FPC0902, sólo el animal 76 mostró un bajo título de anticuerpos de DN50 7,5 en el día 28 después de la infección. Los animales del grupo 2 siguieron siendo negativos (ND50 <5) para anticuerpos contra el VFPC en todo los NPLA realizados durante todo el experimento.
Enzimoinmunoanálisis de adsorción de anticuerpos (Ab-ELISA)
Aunque el animal 75 mostró un primer resultado dudoso en el día 21 después de la infección y fue positivo en el día 28 después de la infección, el animal 76 mostró un resultado dudoso en el día 14 después de la infección y resultados positivos en los días 21 y 28 después de la infección. El animal 77 siguió siendo negativo.
Los animales 78 y 79 mostraron resultados negativos durante todo el ensayo, mientras que el animal 80 mostró un resultado dudoso en el día de la eutanasia (21 días después de la infección).
Aislamiento de virus
Los animales del grupo 1 mostraron resultados negativos durante toda la parte de infección del ensayo en tanto las células SK6 como Rie 5-1.
El animal 78 mostró resultados positivos en los días cuatro, siete, diez (investigado sólo en las células SK6) y 14 después de la infección en células SK6 y Rie 5-1, respectivamente. Además, se logró un resultado positivo para este cerdo en el día dos después de la infección en células Rie 5-1. El cerdo centinela, animal 79, siguió siendo negativo en ambas líneas celulares. En células SK 6, el animal 80 mostró resultados positivos en los días siete, diez y 14 después de la infección. También se encontraron resultados positivos en células Rie 5-1 en los días siete y 14 (el día diez no se probó debido a la falta de material de muestra).
Enzimoinmunoanálisis de adsorción de antígeno (Ag-ELISA)
El Ag-ELISA siguió siendo negativo para todos los animales del grupo 1 y para los animales 78 y 79 del grupo 2. Sólo el animal 80 mostró un resultado positivo en el día 10 después de la infección.
Parte II -Exposición
Signos clínicos y temperatura corporal
Los cerdos que quedaron después de la parte de infección, animales 75 y 77, se expusieron a la cepa de VFPC altamente patógena Koslov en el día 71 después de la infección.
El animal 75 no desarrolló temperaturas febriles ni ningún signo clínico tras la exposición a infección y se sacrificó en el día 16 después de la exposición.
El animal 77 desarrolló fiebre en el día tres después de la exposición que persistió hasta la eutanasia. El animal se sacrificó moribundo en el día ocho después de la exposición que muestra graves síntomas neurológicos.
Patología Antes de la exposición, el animal 76 se sacrificó debido a cojera grave. Este animal no mostró ninguna lesión patológica indicativa de FPC. Sólo mostró una ligera neumonía de los lóbulos craneales. Además de una ligera neumonía de los lóbulos craneales y una ligera gastritis ulcerativa, el animal 75 no mostró signos patológicos. El animal 77 mostró ganglios linfáticos hinchados parcialmente hemorrágicos, neumonía catarral, ascitis, gastritis
5 ulcerativa ligera, congestiones hepáticas, edema de la vesícula biliar y nefritis intestinal.
Detección de anticuerpos
Después de la infección por exposición, el animal 75 mostró un título de anticuerpos contra el virus de exposición de 10 DN50 160 (día 16 después de la exposición) y un título de >640 contra FPC0104. El animal 77 siguió siendo negativo.
Resumen y conclusiones
15 • El mutante de VFPC “VFPC 1017 Core Δ” mostró prácticamente atenuación completa en comparación con la cepa parental “VFPC Alfort p447”
• A diferencia de los animales del grupo 2, no pudo detectarse virus en el aislamiento de virus en diferentes líneas celulares para animales del grupo 1.
• Excepto para el cerdo centinela, los animales del grupo 1 desarrollaron anticuerpos neutralizantes tras la 20 infección con VFPC 1017 Core Δ.
•
El cerdo centinela del grupo 1 no mostró ningún resultado positivo tanto en la detección de anticuerpos como de antígeno. Por tanto, la liberación y la transmisión del mutante del virus es lo más improbable.
•
La ausencia de signos clínicos tras la infección por exposición a una cepa de VFPC altamente patógena
demostró protección completa del animal previamente infectado con VFPC 1017 Core Δ. 25 • El cerdo centinela mostró un desarrollo de FPC aguda-letal tras la infección por exposición con VFPC Koslov

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Pestivirus mutante, caracterizado porque el virus tiene una mutación en el gen que codifica la proteína de núcleo, haciendo que el virus no pueda expresar una proteína de núcleo funcional, caracterizándose el virus
    5 adicionalmente porque contiene una o más mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 que compensan la falta de una proteína de núcleo funcional.
  2. 2. Pestivirus mutante según la reivindicación 1, caracterizado por que el pestivirus es virus de la fiebre
    porcina clásica (VFPC). 10
  3. 3. VFPC mutante según la reivindicación 2, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 se selecciona del grupo que consiste en Asn2177Tyr, Glu2160 Gly, Pro2185Thr/Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr y Asn2256Asp.
    15 4. VFPC mutante según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 comprende la mutación Asn2177Tyr.
  4. 5. Pestivirus mutante según la reivindicación 1, caracterizado por que el pestivirus es virus de la diarrea
    vírica bovina (VDVB). 20
  5. 6. VDVB mutante según la reivindicación 5, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 se selecciona del grupo que consiste en Glu2189Lys, Leu2190Pro, Thr2191Ala, Asp2192 Glu, Pro2194Leu, Tyr2204His, Asn2265Tyr, Asn2265Asp.
    25 7. VDVB mutante según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 comprende la mutación Asp2192 Glu, Tyr2204His, Asn2265Tyr, o Asn2265Asp.
  6. 8. Una vacuna caracterizada por que comprende un pestivirus mutante según cualquiera de las
    reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 30
ES09783067T 2008-09-17 2009-09-16 Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3 Active ES2387637T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08164496 2008-09-17
EP08164496 2008-09-17
PCT/EP2009/061989 WO2010031783A1 (en) 2008-09-17 2009-09-16 Mutant pestivirus with mutations in core gene and ns3 region

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2387637T3 true ES2387637T3 (es) 2012-09-27

Family

ID=40336636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09783067T Active ES2387637T3 (es) 2008-09-17 2009-09-16 Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20110229520A1 (es)
EP (1) EP2324112B1 (es)
JP (1) JP2012502641A (es)
CN (1) CN102159705B (es)
AR (1) AR073594A1 (es)
AU (1) AU2009294654A1 (es)
BR (1) BRPI0919168A2 (es)
ES (1) ES2387637T3 (es)
MX (1) MX2011002870A (es)
RU (1) RU2483106C2 (es)
WO (1) WO2010031783A1 (es)
ZA (1) ZA201101666B (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517260A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白ns3优势区的融合蛋白及其重组表达方法与应用
BR112015003785A2 (pt) * 2012-08-29 2017-08-08 Intervet Int Bv vírus, vacina, teste de diagnóstico para distinguir mamíferos vacinados com uma vacina, e, uso de um teste de diagnóstico
RU2689143C1 (ru) * 2013-12-19 2019-05-24 Интервет Интернэшнл Б.В. Усовершенствованный диагностический тест для csfv антител

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2531776A1 (fr) * 1982-08-13 1984-02-17 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif de determination sans contact de la rugosite d'une surface
US7049428B1 (en) * 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
EP0982402A1 (en) * 1998-08-14 2000-03-01 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Pestivirus vaccination
US6326137B1 (en) * 1999-06-25 2001-12-04 Schering Corporation Hepatitis C virus protease-dependent chimeric pestivirus
US7332170B1 (en) * 2005-12-23 2008-02-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Classical swine fever virus virulence determinant and a novel classical swine fever vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201101666B (en) 2011-11-30
EP2324112A1 (en) 2011-05-25
EP2324112B1 (en) 2012-05-30
WO2010031783A1 (en) 2010-03-25
JP2012502641A (ja) 2012-02-02
AU2009294654A1 (en) 2010-03-25
RU2011114984A (ru) 2012-10-27
MX2011002870A (es) 2011-04-26
RU2483106C2 (ru) 2013-05-27
CN102159705B (zh) 2013-02-13
AR073594A1 (es) 2010-11-17
US20110229520A1 (en) 2011-09-22
BRPI0919168A2 (pt) 2015-12-08
CN102159705A (zh) 2011-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6712268B2 (ja) コロナウイルス
ES2940691T3 (es) Variante de virus PRRS, clon de ADNc de virus PRRS europeo y usos de los mismos
PT1951882E (pt) Ácidos nucleicos codificadores de vacinas do vírus do síndrome reprodutor e respiratório porcino (prrsv)
ES2757927T3 (es) Virus de la peste porcina clásica (VPPC) recombinante que comprende sustituciones en el epítopo TAV de la proteína E2
KR20190021334A (ko) 감염성 기관지염 바이러스에 대한 백신
Zhang et al. Construction and immunological evaluation of recombinant Newcastle disease virus vaccines expressing highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP3/GP5 proteins in pigs
US9878030B2 (en) BVDV vaccine
ES2387637T3 (es) Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3
SK18232000A3 (sk) Živá vakcína, pestivírus, bvdv pestivírus, nukleová kyselina, bvdv nukleová kyselina, spôsob oslabenia pestivírusov, spôsob výroby vakcíny, farmaceutický prostriedok s jej obsahom a jej použitie
JP5775665B2 (ja) ワクチン用ペスチウイルス変異体
Ridpath Bovine viral diarrhea virus
JP4664072B2 (ja) Ｃ及び／又はｅ１タンパク質を発現しないペスチウイルスのレプリコン及びワクチンに使用できる前記レプリコンを含む感染性ウイルス粒子
Li et al. Co-expression of the C-terminal domain of Yersinia enterocolitica invasin enhances the efficacy of classical swine-fever-vectored vaccine based on human adenovirus
ES2650622T3 (es) Vacunas que contienen variantes genéticas de parvovirus canino
ES2508916T3 (es) Mutante del Virus de la Diarrea Viral Bovina para uso en una vacuna
CN119139464A (zh) 一种重组非洲猪瘟弱毒疫苗及其制备方法和应用
Alkheraif Type 2 Bovine Viral Diarrhea Virus Npro Suppresses Type I Inteferon Pathway Signaling in Bovine Cells and Augments Bovine Respiratory Syncytal Virus Replication
Dräger Safety and efficacy of a novel live marker vaccine against Classical swine fever virus
Porntippa Nawagitgul Characterization of a variant of transmissible gastroenteritis virus (TGEV)
Kennedy Amplification, cloning, sequencing, and expression of the putative gene encoding the major envelope protein of a noncytopathic strain of bovine viral diarrhea virus
Abd El et al. Ruminant pestiviruses genetic diversity: The key to detection and control