ES2387985T3 - Anticuerpos quiméricos y humanizados de integrina alfa 5 beta 1 que modulan la angiogénesis - Google Patents

Abstract

Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5ß1, que comprende: - una región de cadena pesada variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 25, 28, y 31 según se define respectivamente en las figuras 10, 11, y 13; y - una región de cadena ligera variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 26 y 32, según se definen en las figuras 10 y 13, respectivamente

Description

Anticuerpos quiméricos y humanizados de integrina alfa 5 beta 1 que modulan la angiogénesis

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención proporciona anticuerpos quiméricos y humanizados que reconocen específicamente la integrina α5β1, así como procedimientos de utilización de los anticuerpos para reducir o inhibir la angiogénesis en un tejido. También se proporcionan procedimientos para la determinación de dosis terapéuticamente aceptables de los anticuerpos y composiciones farmacéuticas que los incluyen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La angiogénesis es el proceso mediante el cual se crean nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis, también denominada neovascularización, suele acontecer durante la embriogénesis y el desarrollo, y se produce en organismos plenamente desarrollados durante la curación de las heridas y el desarrollo placentario. La angiogénesis también tiene lugar en diversas condiciones patológicas, incluyendo: enfermedades oculares, tales como la retinopatía diabética y la degeneración macular causada por neovascularización; enfermedades asociadas a la inflamación de los tejidos, como la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria intestinal; y el cáncer, cuando la formación de vasos sanguíneos en los tumores en crecimiento aporta oxígeno y nutrientes a las células tumorales, además de facilitar una ruta a través de la cual se puede propagar por todo el cuerpo la metástasis de las células tumorales. Teniendo en cuenta que son millones las personas que en el mundo se ven afectadas por estas enfermedades, se han realizado considerables esfuerzos por comprender los mecanismos que participan en el angiogénesis, con el fin de desarrollar procedimientos para detectar e inhibir dicha angiogénesis no deseada.

[0003] La angiogénesis se produce en respuesta a los estímulos de uno o más factores de crecimiento conocidos, pudiendo también implicar a otros factores no identificados. Las células endoteliales, que son las células con las que se encuentran revestidos los vasos sanguíneos maduros, no suelen proliferar. Sin embargo, en respuesta a un estímulo apropiado, las células endoteliales se activan y comienzan a proliferar y a emigrar hacia tejidos no vascularizados, para formar nuevos vasos sanguíneos. En ciertos casos, las células madre se activan para diferenciarse en células endoteliales, que forman nuevos vasos sanguíneos.

[0004] Los vasos sanguíneos se encuentran rodeados por una matriz extracelular. Además de los estímulos provocados por los factores de crecimiento, la angiogénesis depende de la interacción de las células endoteliales con la matriz extracelular, así como de la interacción consigo mismas. La activación de las células endoteliales motivada por factores de crecimiento, y la emigración hacia, y la interacción con la matriz extracelular y con ellas mismas depende de los receptores de la superficie celular expresados por las células endoteliales. Estos receptores de la superficie celular, que incluyen receptores del factor de crecimiento e integrinas, interactúan específicamente con moléculas concretas.

[0005] En condiciones patológicas, tales como la degeneración macular provocada por la edad y la retinopatía diabética, la menor disponibilidad de oxígeno en la retina tiene como consecuencia una condición de hipoxia que estimula la secreción de factores de crecimiento angiogénicos, tales como los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Esta secreción induce una migración y una proliferación anormales de células endoteliales en los tejidos oculares. Esto tiene como resultado una vascularización de los tejidos oculares, pudiendo dar lugar a cicatrización corneal, desprendimiento de retina y acumulación de líquidos en la coroides, que pueden afectar negativamente a la visión y provocar la ceguera.

[0006] La angiogénesis también se asocia al avance y la exacerbación de enfermedades inflamatorias, incluyendo soriasis, artritis reumatoide, osteoartritis y enfermedades intestinales inflamatorias, tales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Por ejemplo, en el caso de la artritis inflamatoria, el aflujo de linfocitos al área que rodea las articulaciones estimula la angiogénesis en el revestimiento sinovial. Este aumento de la vasculatura proporciona un medio para que se produzca un mayor aflujo de linfocitos, lo que facilita la destrucción del cartílago y el hueso en la articulación. La vascularización angiogénica que se produce en la enfermedad intestinal inflamatoria tiene como resultado un efecto similar en el vientre.

[0007] El crecimiento de los capilares para formar placas arteroescleróticas en las arterias coronarias representa otra condición patológica asociada a la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento. Un exceso de flujo sanguíneo en las placas neovascularizadas puede provocar su rotura, así como hemorragias de las placas llenas de sangre, al liberar los coágulos sanguíneos, lo que puede provocar trombosis coronaria.

[0008] El papel de la angiogénesis en enfermedades tan diversas como el cáncer, las enfermedades oculares y las enfermedades inflamatorias ha hecho que se intentase identificar procedimientos para inhibir específicamente la angiogénesis como medio para el tratamiento de estas enfermedades. En el caso de los pacientes de cáncer estos procedimientos de tratamiento pueden aportar ventajas sustanciales en comparación con los procedimientos actualmente utilizados, tales como la quimioterapia, que no sólo matarán o inutilizarán las células tumorales objetivo, sino también las células de proliferación normal del paciente, tales como las células sanguíneas, las células epiteliales, y las células que revisten el lumen intestinal. Dichas muertes indiscriminadas por parte de los agentes quimioterapéuticos tienen como resultado una serie de efectos secundarios que, en el mejor de los casos, resultan incómodos, y que con frecuencia pueden conllevar una inaceptable morbilidad o mortalidad de los pacientes. De hecho, los efectos secundarios no deseados asociados a las terapias contra el cáncer suelen limitar el tratamiento que pueden recibir los pacientes. El documento US 2002/172675 describe un anticuerpo monoclonal murino de integrina alfa 5 humana.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0009] La presente invención proporciona anticuerpos quiméricos y humanizados de uso terapéutico dirigidos contra la integrina α5β1; procedimientos para la purificación de dichos anticuerpos, y procedimientos para su utilización en unas condiciones de tratamiento que comprenden una angiogénesis de los tejidos no deseable.

[0010] En una realización, la invención incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido de un anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1, que comprende más de las secuencias de aminoácidos seleccionados de entre el grupo con los números de identificación de secuencia (SEQ ID NOS): 25-26, 28, 31-32. Más preferiblemente, el ácido nucleico codifica un polipéptido de un anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1, que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 25-26, 28, 31-32. El péptido codificado por este ácido nucleico puede ser un anticuerpo de cadena sencilla o Fab, además de un Fab o anticuerpo que comprende diversos péptidos unidos mediante enlaces de disulfuro.

[0011] La invención incluye también un polipéptido que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 25-26, 28, 31-32. Más preferiblemente, el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 25-26, 28, 31-32. Estos péptidos incluyen anticuerpos quiméricos, humanos y humanizados, y fragmentos Fab.

[0012] En una realización preferida, la invención incluye un anticuerpo quimérico de integrina anti-α5β1 que comprende la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácido de cadena ligera SEQ ID NO: 26.

[0013] En una realización preferida adicional, la invención incluye un fragmento Fab obtenido a partir del anticuerpo quimérico de integrina anti-α5β1 que comprende la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácido de cadena ligera SEQ ID NO: 26. En una realización especialmente preferida, el fragmento Fab comprende la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 28 y la secuencia de aminoácido de cadena ligera SEQ ID NO: 26.

[0014] En una realización preferida adicional, la invención incluye un anticuerpo humanizado obtenido a partir del anticuerpo quimérico de la integrina anti-α5β1 que comprende la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácido de cadena ligera SEQ ID NO: 26. En una realización especialmente preferida, el fragmento Fab comprende la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 28 y la secuencia de aminoácido de cadena ligera SEQ ID NO: 26.

[0015] En otra realización, la invención incluye un vector de expresión que comprende uno o más de los ácidos nucleicos seleccionados de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 23, 24, 27, 29, 30.

[0016] En otra realización, la invención incluye un vector de expresión que comprende uno o más de los ácidos nucleicos seleccionados de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS: 23, 24, 27, 29, 30.

[0017] En otra realización, la invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos quiméricos o humanizados de la integrina anti-α5β1 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, estas composiciones pueden contener agentes que mejoran la absorción o localización del componente terapéutico, disminuyen la inflamación o aportan de otra forma alivio localizado.

[0018] En un aspecto de esta realización, la composición farmacéutica comprende una crema de uso tópico que se aplica directamente sobre el tejido lesionado. En otro aspecto, la composición farmacéutica es una solución que se aplica mediante cuentagotas directamente en el ojo lesionado. En otro aspecto adicional, se trata de un producto farmacéutico inyectable y que puede aplicarse sistemáticamente para el tratamiento del tejido lesionado en uno o en ambos ojos del paciente, o para inhibir la neoangiogénesis de los tejidos tumorales.

[0019] En otra realización, la invención incluye procedimientos para el control de la vascularización de los tejidos lesionados. Estos procedimientos comprenden la aplicación de una o más dosis de un anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 en los tejidos lesionados, cuando la lesión del tejido puede ser el resultado de daños físicos o químicos, o de una enfermedad.

[0020] También se describe adicionalmente un procedimiento para administrar un anticuerpo terapéutico mediante la aplicación del anticuerpo terapéutico a un tejido lesionado. El tejido lesionado responde a la lesión aumentando su flujo sanguíneo mediante neovascularización, y el anticuerpo terapéutico inhibe dicha neovascularización. En un aspecto, el procedimiento incluye la inyección intravítrea de anticuerpos terapéuticos en un ojo lesionado o lastimado de un paciente con ambos ojos afectados; la inyección intravítrea en un ojo es suficiente para el tratamiento de ambos ojos.

[0021] La aplicación describe un proceso para la purificación de anticuerpos de la integrina anti-α5β1. El procedimiento comprende la absorción del anticuerpo en una matriz de afinidad del anticuerpo, ligada a un sustrato, y la liberación del anticuerpo de la matriz de afinidad del anticuerpo ligada al sustrato utilizando una solución de liberación con un pH de entre 3.0 y 5.5. El proceso puede comprender adicionalmente la recuperación del anticuerpo purificado.

[0022] En algunos aspectos de este proceso de purificación, la solución de liberación tiene un pH de entre aproximadamente 3.3 a aproximadamente 5.5. En otros aspectos, el pH de la solución de liberación oscila entre 3.5 y aproximadamente 5.5. Otros aspectos adicionales comprenden una solución de liberación con un pH de entre 3.5 y

4.2. Otros aspectos adicionales comprenden soluciones de liberación con unos pH que oscilan entre 4.2 y alrededor de 5.5.

[0023] La solicitud describe igualmente un procedimiento para evaluación de los efectos fisiológicos (por ejemplo, las propiedades anti-angiogénicad) modulados por un anticuerpo humanizado de integrina anti-α5β1, que incluye al mismo tiempo anticuerpos y fragmentos Fab. Este procedimiento comprende el facilitar una muestra viable de tejido, que sea capaz de una regeneración vascular; crear en el tejido viable unas lesiones que basten para generar neovascularización coroidal; la aplicación de una o más dosis de un anticuerpo humanizado de integrina anti-α5β1 al tejido viable; y la supervisión de la re-vascularización del tejido viable sometido a la dosis. En la realización preferida, el procedimiento de evaluación incluye el tejido ocular como tejido viable. En algunas realizaciones, se utiliza la mácula del ojo. También se contemplan procedimientos de evaluación en los que el tejido ocular utilizado es el de un primate vivo (por ejemplo, un mono cinomólogo).

[0024] El procedimiento de evaluación comprende la inyección de un anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 por vía intra-vítrea. En un aspecto de la invención, cuando se encuentran lesionados los dos ojos del paciente, la inyección de los anticuerpos en un ojo da como resultado el que los anticuerpos entren en contacto con el tejido lesionado presente en ambos ojos.

[0025] Otro aspecto del procedimiento de evaluación de los efectos fisiológicos comprende la generación de lesiones por contacto del tejido viable con una luz láser. La potencia de esta luz láser puede variar entre 300 y 700 miliwatios, y el tiempo de exposición no es superior a 0.1 segundos, y preferiblemente inferior a 0.05 segundos, y más preferiblemente inferior a aproximadamente 0.01 segundos. Las lesiones deberían tener unas dimensiones inferiores a 100 µm, más preferiblemente de entre 50 y 100 µm de diámetro, y más preferiblemente de entre 75 y 25

μm de diámetro.

[0026] Algunos aspectos del procedimiento incluyen una etapa de monitorización que comprende la fotografía periódica de las lesiones tratadas mediante la aplicación de una o más dosis de un anticuerpo humanizado de integrina anti-α5β1. En otros aspectos, la etapa de monitorización incluye adicionalmente el examen oftalmológico indirecto de la cámara posterior del ojo, y el examen biomicroscópico del segmento anterior del ojo. En otro aspecto, el procedimiento comprende una etapa de monitorización que incluye la inyección por vía intravenosa de un tinte a base de fluoresceína, y el examen del tejido visible mediante angiografía fluoresceínica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0027] La figura 1 describe las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOS: 1-12) correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) de un anticuerpo murino de integrina anti-α5β1 (IIA1) y cinco anticuerpos humanizados obtenidos a partir del original murino (1.0 - 5.0)

[0028] La figura 2 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOS: 1-12) que pone de relieve las sustituciones de secuencia en los cinco anticuerpos humanizados con respecto al original murino (IIA1).

[0029] La figura 3 muestra: (A) la secuencia de ácido nucleico VH IIA1 (SEQ ID NO: 13) y la secuencia del aminoácido (SEQ ID NO: 1); (B) la secuencia de ácido nucleico VL IIA1 (SEQ ID NO: 14) y la secuencia del aminoácido (SEQ ID NO: 7).

[0030] La figura 4 muestra: (A) la secuencia del ácido nucleico VH del anticuerpo 200-4 (SEQ ID NO: 15) y la secuencia del aminoácido (SEQ ID NO: 16); (B) la secuencia del ácido nucleico del anticuerpo 200-4 VL (SEQ ID NO: 17) y la secuencia del aminoácido (SEQ ID NO: 18).

[0031] La figura 5 muestra: (A) la secuencia del ácido nucleico VH M200 (SEQ ID NO: 19) y la secuencia del aminoácido (SEQ ID NO: 20); (B) la secuencia del ácido nucleico VL M200 (SEQ ID NO: 21) y la secuencia del aminoácido (SEQ ID NO: 22).

[0032] La figura 6 muestra el constructo del plásmido p200-M-H para la expresión de la cadena pesada M200.

[0033] La figura 7 muestra el constructo del plásmido p200-M-L para la expresión de la cadena ligera M200.

[0034] La figura 8 muestra el plásmido único p200-M para la expresión de las cadenas ligera y pesada M200.

[0035] La figura 9 muestra las secuencias completas del ADN de la cadena pesada y de la cadena ligera M200 (SEQ ID NOS: 23-24).

[0036] La figura 10 muestra las secuencias completas de aminoácidos M200 de cadena pesada y cadena ligera (SEQ ID NOS: 25-26).

[0037] La figura 11 muestra las secuencias completas de aminoácidos y ADN F200 de cadena pesada (SEQ ID NOS: 27-28).

[0038] La figura 12 muestra las secuencias completas del ADN de cadena pesada y cadena ligera de huM200 (SEQ ID NOS: 29-30).

[0039] La figura 13 muestra las secuencias completas de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de huM200 (SEQ ID NOS: 31-32).

[0040] La figura 14 muestra los resultados de M200 como un potente inhibidor del crecimiento de las células endoteliales, que incluye las propiedades antiproliferativas de un mAb anti-VEGF, HuMV833.

[0041] La figura 15 muestra unos resultados que demuestran que el M200 inhibe el crecimiento celular inducido por VEGF y la inhibición de la actividad del M200 a través de un mAbs anti-idiotipo.

[0042] La figura 16 muestra una serie de resultados que muestran: (A), muerte celular inducida por M200 visualizada mediante tinción con anexina; (B) cuantificación de las células teñidas con anexina mediante citometría de caudal.

[0043] La figura 17 muestra una serie de resultados que muestran que M200 provoca una mayor muerte celular en células HUVEC proliferantes frente a senescentes.

[0044] La figura 18 muestra los resultados del ensayo in vitro de formación de tubos para la inhibición de la angiogénesis mediante F200.

[0045] La figura 19 muestra imágenes de angiografía fluoresceínica de lesiones inducidas por láser en ojos de primates, a los 20 días de su tratamiento con (A) una solución de control (rituxan) y (B) M200.

[0046] La figura 20 muestra imágenes de angiografía fluoresceínica de lesiones inducidas por láser en los ojos izquierdo y derecho de un primate individualizado, a los 13 días de su tratamiento con (A) una solución de control (ojo izquierdo) y (B) M200 (ojo derecho).

[0047] La figura 21 muestra imágenes de angiografía fluoresceínica de lesiones inducidas por láser en los ojos izquierdo y derecho de un primate individualizado, a los 20 días de su tratamiento con (A) una solución de control (ojo izquierdo) y (B) M200 (ojo derecho).

[0048] La figura 22 muestra imágenes de angiografía fluoresceínica de lesiones inducidas por láser en los ojos izquierdo y derecho de un primate individualizado, a los 27 días de su tratamiento con (A) una solución de control (ojo izquierdo) y (B) M200 (ojo derecho).

[0049] La figura 23 muestra imágenes de angiografía fluoresceínica de lesiones inducidas por láser en los ojos izquierdo y derecho de un primate individualizado, a los 13 días de su tratamiento con (A) una solución de control (ojo izquierdo) y (B) F200 (ojo derecho).

[0050] La figura 24 muestra imágenes de angiografía fluoresceínica de lesiones inducidas por láser en los ojos izquierdo y derecho de un primate individualizado, a los 20 días de su tratamiento con (A) una solución de control (ojo izquierdo) y (B) F200 (ojo derecho).

[0051] La figura 25 muestra imágenes de angiografía fluoresceínica de lesiones inducidas por láser en los ojos izquierdo y derecho de un primate individualizado, a los 27 días de su tratamiento con (A) una solución de control (ojo izquierdo) y (B) F200 (ojo derecho).

[0052] La figura 26 muestra los resultados de un ensayo competitivo ELISA de enlaces en el que se comparan las afinidades de enlace del anticuerpo murino IIA1, el anticuerpo quimérico M200 (200-4 EOS), y dos versiones humanizadas del M200: huM200-G4 y huM200-g2m3G.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Definiciones

[0053] A menos que se definan en otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado que normalmente entiende una persona versada en la materia a la que se refiere la presente invención. Las siguientes referencias proporcionan a cualquier experto en la materia una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology y Molecular Biology (2ª Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science y Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Tal y como se utilizan en este documento, los siguientes términos tendrán los significados que se les asignan, a menos que se especifique en otro sentido.

[0054] Tal y como se utiliza en el presente documento, “anticuerpo” incluye la referencia a una molécula de

inmunoglobulina inmunológicamente reactiva a un antígeno específico, e incluye tanto anticuerpos monoclonales como policlonales. El término también incluye formas genéticamente modificadas, tales como los anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). El término “anticuerpo' también incluye formas de enlaces de antígeno de anticuerpos, incluyendo fragmentos con capacidad de enlace de antígeno (por ejemplo, Fab', F(ab')2, Fab, Fv y rIgG). Véase igualmente, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Véase también, por ejemplo, Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998). El término también se refiere a fragmentos Fv recombinantes de cadena sencilla (scFv). El término anticuerpo también incluye moléculas bivalentes

o biespecíficas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. Las moléculas bivalentes y biespecíficas se describen, por ejemplo, en Kostelny et al. (1992) J Immunol 148:1547, Pack y Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Hollinger et al., 1993, supra, Gruber et al. (1994) J Immunol: 5368, Zhu et al. (1997) Proteína Sci 6:781, Hu et al. (1996) Cancer Res. 56:3055, Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026, y McCartney, et al. (1995) Proteína Eng. 8:301.

[0055] Puede generarse un anticuerpo inmunológicamente reactivo con un antígeno específico mediante procedimientos recombinantes como la selección de librerías de anticuerpos recombinantes en vectores del fago o similares, véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); y Vaughan et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996), o mediante la inmunización de un animal con el antígeno o con un ADN que codifique el antígeno.

[0056] Por lo general, una inmunoglobulina posee una cadena pesada y una cadena ligera. Cada una de las cadenas ligera y pesada contiene una región constante y una región variable (las regiones también se denominan

“dominios”). Las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas contienen cuatro regiones “marco” interrumpidas por tres regiones hipervariables, también denominadas “regiones de determinación de la complementariedad” o “CDRs”. Se ha definido la extensión de las regiones marco y las CDRs. Las secuencias de las regiones marco de

diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, que es la combinación de las regiones marco de las cadenas constituyentes ligeras y pesadas, sirve para situar y alinear las CDRs en el espacio tridimensional.

[0057] Las CDRs son responsables primordialmente de realizar la unión de un antígeno a un epítope. Las CDRs de cada cadena suelen denominarse normalmente CDR1, CDR2, y CDR3, numerándose secuencialmente a partir del extremo N-terminal, y también se identifican típicamente mediante la cadena en la que se encuentra situada la CDR concreta. De este modo, una CDR3 VH se encuentra situada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se ha hallado, mientras que una CDR1 VL es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se halla situada.

[0058] Las referencias a “VH” se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo las cadenas pesadas de un fragmento Fv, scFv o Fab. Las referencias a “VL” incluyen la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo la cadena ligera de una Fv, scFv, dsFv o Fab.

[0059] La frase “Fv de cadena sencilla” o “scFv” se refiere a un anticuerpo en el que los dominios variables de la

cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo tradicional de dos cadenas se han unido para formar una cadena. Normalmente, se inserta un péptido enlazador entre las dos cadenas para permitir que se doblen adecuadamente y crear un punto de enlace activo.

[0060] Un “anticuerpo quimérico” es una molécula de inmunoglobulina en la cual (a) la región constante, o una

porción de la misma, se ve alterada, sustituida o intercambiada de forma que el punto de enlace del antígeno (región variable) está enlazado a una región constante de una clase, función efector y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se ve alterada, sustituida o intercambiada por una región variable con una especificidad de antígeno diferente o alterada.

[0061] Un “anticuerpo humanizado” es una molécula de inmunoglobulina que contiene una secuencia mínima obtenida de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos procedentes de una región de determinación complementaria (CDR) del receptor se sustituyen por residuos procedentes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata o conejo, que posea la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos marco Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias marco o CDR importadas. Por lo general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente de dos dominios variables, en los que todas o la práctica totalidad de las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana, y todas o la práctica totalidad de las regiones marco (FR) se corresponden con las de una secuencia de consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, en condiciones óptimas, también comprenderá al menos una porción de una región de inmunoglobulina constante (Fc), y normalmente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). La humanización puede conseguirse esencialmente a través del procedimiento de Winter y sus colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las CDRs o secuencias CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente LT.S. Nº 4.816.567), en los que una parte sustancialmente inferior a un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la correspondiente secuencia procedente de una especie no humana.

[0062] El “epítope” o “determinante antigénico” hace referencia al lugar de un antígeno al que se une un anticuerpo. Los epítopes pueden formarse tanto a través de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el pliegue terciario de una proteína. Los epítopes formados a partir de aminoácidos contiguos suelen retenerse al exponerse a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopes formados mediante pliegue terciario suelen perderse cuando se tratan con disolventes desnaturalizados. Por lo general, un epítope contiene al menos 3, y más normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial singular. Entre los procedimientos utilizados para determinar la conformación espacial de los epítopes se encuentran, por ejemplo, la cristalografía por rayos x y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Véanse, por ejemplo, Protocolos de Mapeado de Epítopes en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

[0063] “Anticuerpo de integrina anti-α5β1 sensible al pH” se refiere a anticuerpos que reconocen específicamente la integrina α5β1, y se precipitan de la solución cuando se someten a inmunopurificación utilizando integrina α5β1 como ligando, con un pH neutro o básico. Los anticuerpos de la integrina anti-α5β1 sensibles al pH incluyen normalmente dos o más secuencias CDR seleccionadas independientemente de cualquiera de las secuencias VH o VL mostradas en la figura 1.

[0064] “Angiogénesis” y “neoangiogénesis” se refieren a la formación de nuevos vasos sanguíneos, normalmente en respuesta a una agresión, lesión o enfermedad. A los efectos de esta solicitud, el término “lesión,” y las variantes

gramaticales del mismo, incluye lesiones, enfermedades u otros acontecimientos que provocan una respuesta del tejido que incluye la angiogénesis. La angiogénesis también tiene lugar en la formación de tumores y en la metástasis, y durante la embriogénesis, el crecimiento y el desarrollo de los animales superiores.

[0065] Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o

secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son el mismo (es decir, una identidad del 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o superior en una región especificada, cuando se compara y alinea para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación o región designada) medido utilizando unos algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros predefinidos que se describen a continuación,

o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, la página web de NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.govBLAST/ o similares). En ese caso, se dice que dichas secuencias son “sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere, o puede aplicarse, al complemento de una secuencia de

comprobación. Esta definición también se refiere o se puede aplicar al complemento de una secuencia de comprobación. La definición incluye también secuencias con fragmentos eliminados y/o añadidos, así como aquellas que tienen sustituciones, y las que se producen de forma natural, por ejemplo, las variantes polimórficas o alélicas, y las variantes artificiales. Tal y como se describe seguidamente, los algoritmos preferidos pueden tener en cuenta las carencias y similares. Preferiblemente se da una identidad en una región cuya longitud es de al menos aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos, o más preferiblemente, en una región cuya longitud es de 50-100 aminoácidos o nucleótidos.

[0066] Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de comprobación. Cuando se utiliza un algoritmo de comprobación de secuencia, se introducen en un ordenador las secuencias de comprobación y de referencia, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si fuese necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de la secuencia. Preferiblemente pueden utilizarse los parámetros predeterminados del programa, si bien pueden designarse unos parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia de las secuencias de comprobación con respecto a la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa.

[0067] Una “ventana de comparación”, tal y como se utiliza en el presente documento, incluye las referencias a un

segmento de una de las diversas posiciones contiguas seleccionadas entre el grupo que normalmente consiste de 20 a 600, por lo general de unas 50 a unas 200, y más habitualmente de unas 100 a unas 150, en las que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas, una vez que las dos secuencias se han alineado de forma óptima. Los procedimientos de alineación de secuencias para proceder a su comparación se conocen perfectamente en la técnica. La alineación óptima de las secuencias, para proceder a su comparación, puede ser llevada a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), a través del procedimiento de búsqueda de similitudes de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA, en el paquete de software de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante la alineación manual y la inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. Suplemento 1995)).

[0068] Entre los ejemplos preferidos de algoritmos adecuados para la determinación de la identidad de la secuencia de porcentaje y la similitud de la secuencia destacan los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). BLAST y BLAST 2.0 se utilizan, con los parámetros que aquí se describen, para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia correspondiente a los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software utilizado para la realización de los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar la identificación de pares de secuencias con una elevada puntuación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas con una longitud W en la secuencia de consulta, y que coincidan con, o satisfagan, un umbral de puntuación positivo T al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra de vecindario (Altschul et al., supra). Estas coincidencias con la palabra de vecindario inicial actúan como semilla para iniciar búsquedas a fin de encontrar HSPs de mayor longitud que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, siempre que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, por ejemplo, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación positiva obtenida para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación negativa obtenida para residuos no coincidentes; siempre < 0). En el caso de las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuaciones para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabras en ambas direcciones se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada se aleja en una cantidad X del máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada cae a cero o por debajo de este nivel, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cada una de la secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. En el caso de las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) unas alineaciones (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas.

[0069] El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de las similitudes existentes entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma menor (P(N)), que proporciona un indicio de la probabilidad por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos sucedería por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01 y más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001. Los valores de registro pueden ser grandes números negativos, por ejemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 40, 70, 90, 110, 150, 170, etc.

[0070] Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta desde el punto de vista inmunológico una reactividad cruzada con los anticuerpos que reaccionan contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe seguidamente. De este modo, un polipéptido, por lo general, suele ser sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos se diferencian tan sólo por las sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones restrictivas, como se describe más adelante. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que pueden utilizarse los mismos imprimadores para amplificar las secuencias.

[0071] Los términos “aislado”, “purificado” o “biológicamente puro” se refieren a aquel material que está

sustancialmente o esencialmente exento de los componentes que lo acompañan cuando se encuentra en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad suelen determinarse recurriendo a técnicas de química analítica, como la electroforesis con gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína o ácido nucleico que sea la especie predominante presente en una preparación se encuentra sustancialmente purificado. Concretamente, un ácido nucleico aislado se separa algunos marcos de lectura abiertos que flanquean de forma natural al gen y codifican proteínas diferentes de la proteína codificada por el gen. El término “purificado”, en algunas realizaciones, quiere decir que un ácido nucleico o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Preferiblemente, significa que el ácido nucleico o proteína es puro al menos en un 85%, y más preferiblemente, puro en al menos un 95%, y más preferiblemente, puro en al menos un 99%. “Purificar” o “purificación”, en otras realizaciones, significa eliminar al menos un contaminante de la composición que va a purificarse. En este sentido, la purificación no requiere que el componente purificado sea homogéneo, por ejemplo, 100% puro.

[0072] Los términos “polipéptido,” “péptido” y “proteína” se utilizan indistintamente en este documento, y se refieren

a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos son de aplicación a los polímeros de aminoácido en los que uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial del correspondiente aminoácido natural, así como a polímeros de aminoácido naturales, los que contienen residuos modificados y los polímeros de aminoácidos no naturales.

[0073] El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos

y miméticos de aminoácidos que funcionan de forma similar a la de los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos que poseen la misma estructura química básica que los aminoácidos naturales, por ejemplo, un

carbono α unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina,

norleucina, metionina-sulfóxido, metionina metil sulfonio. Dichos análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras moleculares de péptidos modificados, pero conservan la misma estructura química básica de un aminoácido natural. Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que poseen una estructura diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de forma similar a la de un aminoácido natural.

[0074] En el presente documento se puede hacer referencia a los aminoácidos denominándolos por sus símbolos de tres letras normalmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Igualmente, puede hacerse referencia a los nucleótidos a través de sus códigos de una sola letra normalmente aceptados.

[0075] “Variantes modificadas de forma conservadora”, se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. En lo que respecta a las secuencias específicas de ácidos nucleicos, variantes modificadas de forma conservadora se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, a las secuencias esencialmente idénticas o asociadas, por ejemplo, las secuencias naturalmente contiguas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican la mayoría de las proteínas. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos ellos el aminoácido alanina. De este modo, en cada una de las posiciones en las que una alanina está especificada con un codón, el codón se puede alterar para pasar a ser otro de los codones correspondientes descritos sin que se altere el polipéptido codificado. Dichas variaciones del ácido nucleico se denominan “variaciones silenciosas”, que constituyen una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada una de las secuencias de ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe variaciones silenciosas del ácido nucleico. Cualquier persona versada en la materia reconocerá que, en ciertos contextos, todos los codones de un ácido nucleico (a excepción de AUG, que normalmente es el único codón de la metiotina, y TGG, que normalmente es el único codón del triptófano) pueden modificarse para obtener una molécula funcionalmente idéntica. De este modo, y con frecuencia, las variaciones silentes de un ácido nucleico que codifica un polipéptido se encuentran implícitas en una secuencia descrita con respecto al producto de la expresión, pero no con respecto a las secuencias de sondeo reales.

[0076] En lo que se refiere a las secuencias de aminoácidos, cualquier persona versada en la materia se dará cuenta de que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína que altere, añada o elimine un solo aminoácido o un reducido porcentaje de aminoácidos de la secuencia modificada es una “variante modificada de forma conservadora' cuando la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos con una funcionalidad similar son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de forma conservadora deben añadirse, pero de forma no excluyente, a las variantes polimórficas, a los homólogos interespecies y a los alelos de la invención. Las sustituciones típicamente conservadoras de un productopor otro incluyen, por ejemplo, 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteínas (1984)).

[0077] Una “etiqueta” o un “grupo detectable” es una composición detectable a través de medios físicos

espectroscópicos, bioquímicos, fotoquímicos, inmunoquímicos, químicos o de otro tipo. Por ejemplo, las etiquetas más útiles incluyen tintes fluorescentes, reactivos con gran densidad de electrones, enzimas (por ejemplo, las normalmente utilizadas en un test ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas u otras entidades que puedan convertirse en detectables, por ejemplo, mediante la incorporación de una radioetiqueta en el péptido o utilizarse para detectar anticuerpos específicamente reactivos al péptido. El radioisótopo puede ser, por ejemplo 3Η,14C, 32P, 3SS, or 125I.

[0078] En algunos casos, sobre todo cuando se utilizan anticuerpos de la integrina anti -α5β1, los radioisótopos se utilizan como grupos tóxicos, como se describe seguidamente. Las etiquetas pueden incorporarse a los anticuerpos en cualquier posición. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo a la etiqueta, incluyendo los procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem.,

30:407 (1982). La vida útil de los péptidos radioetiquetados o de las composiciones de anticuerpos radioetiquetadas puede ampliarse añadiendo sustancias que estabilicen el péptido o anticuerpo radioetiquetado y lo protejan frente a la degradación. Puede utilizarse cualquier sustancia o combinación de sustancias que estabilice el péptido o anticuerpo radioetiquetado, incluyendo las sustancias que se describen en la patente estadounidense Nº. 5.961.955.

[0079] “Matriz de afinidad del anticuerpo” se refiere a cualquier material capaz de unirse preferencialmente a un anticuerpo. Entre los materiales de la matriz de afinidad del anticuerpo se incluyen los polipéptidos, polisacáridos, ácidos grasos, lípidos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, o conjugados de los mismos (por ejemplo, glicoproteínas, lipoproteínas, glicolípidos). En determinados casos, los materiales de la matriz de afinidad del anticuerpo pueden consistir en una estructura macromolecular, como un complejo multiproteínico, una membrana biológica o un virus. Otros ejemplos de la matriz de afinidad del anticuerpo incluyen la proteína A, la proteína G, las lectinas y los receptores Fc.

[0080] “Proteína A” se refiere a un receptor de superficie altamente estable producido por el Staphylococcus aureus, que es capaz de unirse a la porción Fc de las inmunoglobulinas, especialmente las IgGs, a partir de un elevado número de especies (Boyle, M. D. P. y K. J. Reis. Bacterial Fc Receptors. Biotechnology 5:697-703 (1987).). Una molécula de proteína A puede unirse simultáneamente a 2 moléculas de IgG (Sjáquist, J., Meloun, B. y Hjelm, H. Protein A isolated from Staphylococcus aureus after digestion with lysostaphin. Eur J Biochem 29: 572-578 (1972)).

[0081] “Proteína G” se refiere a proteína asociada a la superficie de la célula obtenida del streptococcus, que se une

a la IgG con gran afinidad. Posee tres ámbitos de enlace IgG altamente homólogos. (Véase Lian, et al. 1992. Journal of Mol. Biol. 228:1219-1234 y Derrick y Wigley. 1994. Journal of Mol. Biol. 243:906-918.)

[0082] El término “recombinante”, cuando se utiliza haciendo referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico,

proteína, o vector, indica que dicha célula, ácido nucleico, proteína o vector, se han modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteína o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se ha obtenido a partir de una célula modificada de esta forma. De este modo, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos que en otras condiciones se expresarían de forma anormal, estarían infraexpresados o no estarían

expresados en absoluto. Mediante el término “ácido nucleico recombinante” se denomina en este documento al

ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, mediante la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, utilizando polimerasas y endonucleasas, en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza. De este modo, se consigue un enlace funcional de las diferentes secuencias. Así pues, un ácido nucleico aislado, en forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro ligando moléculas de ADN que normalmente no están unidas, se consideran ambos recombinantes a los efectos de esta invención. Se entiende que una vez que se ha obtenido un ácido nucleico recombinante y se ha reintroducido en una célula u organismo anfitrión, se replicará de forma no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula anfitriona, en lugar de las manipulaciones in vitro; no obstante, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma no recombinante, aunque se repliquen posteriormente de forma no recombinante, deben seguir siendo considerados recombinantes a los efectos de la

invención. Del mismo modo, una “proteína recombinante” es una proteína obtenida utilizando técnicas

recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante, como se ha indicado anteriormente.

[0083] El término “heterólogo” cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido

nucleico comprende dos o más subsecuencias que normalmente no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce normalmente de forma recombinante, con dos o más secuencias, por ejemplo, a partir de genes no relacionados configurados para obtener un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor procedente de una fuente y una región de codificación procedente de otra fuente. Del mismo modo, una proteína heteróloga hará referencia frecuentemente a dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

[0084] Un “promotor” se define como una matriz de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la

transcripción de un ácido nucleico. Tal y como se utiliza en este documento, un promotor incluye las necesarias secuencias de ácido nucleico que se encuentran cerca del emplazamiento inicial de la transcripción, como, en el caso de un promotor del tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos distales favorecedores o represores, que pueden encontrarse a varios miles de pares de base del

emplazamiento inicial de la transcripción. Un promotor “constitutivo” es un promotor que se encuentra activo en la mayoría de condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor “inducible” es un promotor que se encuentra activo bajo regulación medioambiental o de desarrollo. El término “unido operativamente” se refiere a un enlace

funcional entre una secuencia de control de expresión del ácido nucleico (como un promotor, o matriz de emplazamientos de unión del factor de transmisión) y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

[0085] Un “vector de expresión” es un constructo de ácido nucleico, generado de forma recombinante o sintética,

con una serie de elementos especificados de ácido nucleico que permiten la trascripción de un ácido nucleico específico en una célula anfitriona. El vector de expresión puede formar parte de un plásmido, de un virus o de un fragmento de ácido nucleico. Normalmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que se transcribe operativamente enlazado a un promotor.

[0086] La frase “se une específicamente (o selectivamente)” a un anticuerpo o “es específicamente (o selectivamente) inmunoreactivo con” cuando se hace referencia a una proteína o péptido, se refiere a una reacción

de unión que es determinante de la presencia de la proteína, en una población heterogénea de proteínas y otros elementos biológicos. De este modo, en las condiciones designadas del inmunoensayo, los anticuerpos especificados se unen a unas secuencias de proteína específicas al menos dos veces en segundo plano, y más normalmente, más de 10 a 100 veces en segundo plano.

[0087] La unión específica a un anticuerpo en dichas condiciones requiere un anticuerpo seleccionado por su especificidad para una proteína concreta. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales que reaccionan a una proteína específica, variantes polimórficas, alelos, ortólogos y variantes modificadas de forma conservadora, variantes empalmadas, o porciones de la misma, pueden seleccionarse de forma que tan sólo se obtengan aquellos anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos a la integrina α5β1 y no a otras proteínas. Esta selección puede conseguirse sustrayendo anticuerpos que presentan una reactividad cruzada con otras moléculas. Pueden utilizarse diversos inmunoensayos para la selección de anticuerpos que sean específicamente inmunorreactivos a una proteína específica. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida se utilizan habitualmente para seleccionar anticuerpos que sean específicamente inmunorreactivos a una proteína (véase, por ejemplo, en Harlow & Lane, Anticuerpos, A Laboratory Manual (1988) una descripción de los formatos y condiciones del inmunoensayo que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica).

[0088] “Células cancerosas”, células “transformadas” o “transformación” en cultivos de tejidos, se refieren a cambios fenotípicos espontáneos o inducidos que no implican necesariamente el consumo de nuevo material genético. Aunque la transformación puede deberse a la infección con un virus transformante y la incorporación de un nuevo ADN genómico, o la absorción de un ADN exógeno, también puede producirse espontáneamente o como consecuencia de la exposición a un carcinógeno, produciéndose la mutación de un gen endógeno. La transformación se asocia a cambios del fenotipo, como la inmortalización de las células, aberraciones en el control del crecimiento, cambios no morfológicos y/o malignidad (véase Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)).

II. Introducción

[0089] La presente invención proporciona anticuerpos quiméricos y humanizados que reconocen específicamente la integrina anti-α5β1. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los nuevos anticuerpos, y procedimientos mejorados para el tratamiento de enfermedades y lesiones de los tejidos exacerbadas por la angiogénesis.

[0090] Los anticuerpos quiméricos y humanizados de la invención tienen una semivida más larga, y son menos antigénicos cuando se administran a un ser humano que las formas existentes. La mejora se muestra en forma de diagrama en la figura 2, y supone la alteración del marco y de las regiones constantes de anticuerpos de la integrina anti-α5β1 (IIA1) murina para “humanizarlos”.

[0091] Por lo general, los anticuerpos humanizados tienen al menos tres ventajas potenciales para su utilización en terapias humanas. En primer lugar, interactúan mejor con el sistema inmune humano, por ejemplo, para destruir las células objetivo de forma más eficiente mediante la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). En segundo lugar, el sistema inmune humano no debería reconocer el anticuerpo como extraño. En tercer lugar, la semivida en la circulación humana será similar a la de los anticuerpos naturales, permitiendo la administración de dosis más pequeñas y menos frecuentes.

[0092] Estructuralmente, los anticuerpos humanizados tiene generalmente regiones constantes y de marco (FR) con origen humano, y regiones de dominio complementario (CDRs) originadas en el anticuerpo del animal a partir del cual se ha criado el anticuerpo de la integrina anti-α5β1.

[0093] Estructuralmente, los anticuerpos quiméricos tienen generalmente regiones de cadena variable originadas en el anticuerpo del animal en el que se ha criado el anticuerpo de la integrina anti-α5β1, y regiones de cadena constante de origen humano.

[0094] A nivel funcional, los anticuerpos quiméricos y humanizados de la integrina anti-α5β1 reconocen específicamente la α5β1, e impiden que la integrina α5β1 interactúe con su receptor.

[0095] En el presente documento se proporcionan diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos quiméricos y humanizados de la integrina antí-α5β1. Los anticuerpos “humanizados” suelen ser anticuerpos monoclonales quiméricos o mutantes procedentes de ratones, ratas, hámsters, conejos u otras especies, que incluyen dominios de regiones humanas constantes y/o variables o cambios específicos. Las técnicas para la generación de anticuerpos “humanizados” y “quiméricos” de la integrina anti-α5β1 son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden encontrarse en las referencias y las patentes que se citan en este documento.

III. Preparación de anticuerpos quiméricos y humanizados de la integrina anti-α5β1 recombinantes, y fragmentos Fab derivados de los mismos

[0096] Los anticuerpos de la presente invención se preparan inmunizando a un animal con integrina α5β1, o con un péptido derivado de la misma, para inducir la producción del anticuerpo de la integrina anti-α5β1. A continuación se aísla el tejido linfoide que expresa los anticuerpos y se purifican los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de la integrina anti-α5β1. Los ácidos nucleicos purificados se manipulan en forma recombinante (de acuerdo con un serie de procedimientos bien conocidos en la técnica) para crear ácidos nucleicos que codifican anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena sencilla, Fab o Fab2 que reconocen

específicamente la integrina α5β1.

[0097] Los ácidos nucleicos manipulados en forma recombinante se utilizan a continuación para crear células que produzcan anticuerpos de integrina anti-α5β1. Estas células producen anticuerpos monoclonales que inhiben o impiden que la integrina α5β1 se una a su receptor, lo que tiene como consecuencia la inhibición de la angiogénesis

en los tejidos susceptibles.

A. Producción de células que producen anticuerpos de integrina anti-α51β1 y ácidos nucleicos que los codifican

[0098] A fin de preparar anticuerpos recombinantes quiméricos y humanizados de la integrina anti-α5β1, en primer lugar debe aislarse el ácido nucleico que codifica anticuerpos no humanos de la integrina anti-α5β1. Esto se realiza típicamente inmunizando a un animal, por ejemplo un ratón, con integrina α5β1 preparada o con un péptido

ántigénico obtenido de la misma. Normalmente se inmuniza dos veces a los ratones por vía intraperitoneal con aproximadamente 50 microgramos de anticuerpo proteínico por ratón. El suero procedente de los ratones inmunizados puede someterse a pruebas de detección de la actividad de los anticuerpos mediante inmunohistología

o inmunocitología en cualquier sistema anfitrión que exprese dicho polipéptido, así como mediante ELISA con el polipéptido expresado. En lo que respecta a la inmunohistología, los anticuerpos activos de la presente invención pueden identificarse utilizando una inmunoglobulina anti-murina conjugada con biotina seguido de avidinaperoxidasa y y un sustrato cromogénico de peroxidasa. Las preparaciones de estos reactivos están disponibles comercialmente; por ejemplo, a través de Zymed Corp., de San Francisco, California. Los ratones cuyos sueros contengan anticuerpos activos detectables conforme a la invención podrán ser sacrificados al cabo de tres días y extraerse sus bazos para su fusión y para la producción de hibridoma. Los sobrenadantes positivos de dichos hibridomas pueden identificarse mediante pruebas bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante análisis Western blot.

[0099] Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de anticuerpo deseadas podrán aislarse entonces, por ejemplo, utilizando mRNA de hibridoma o mRNA esplénico como plantilla para la amplificación PCR de los genes de cadenas pesadas y ligeras [Huse, et al., Science 246:1276 (1989)]. Los ácidos nucleicos para la producción de anticuerpos e intracuerpos pueden obtenerse a partir de hibridomas murinos monoclonales utilizando esta técnica [Richardson J. H., et al., Proc Natl Acad Sci USA 92:3137-3141 (1995); Biocca S., et al., Biochem and Biophys Res Comm, 197:422-427 (1993) Mhashilkar, A. M., et al., EMBO J 14:1542-1551 (1995)]. Estos hibridomas aportan una fuente fiable de reactivos bien caracterizados para la construcción de anticuerpos, y resultan especialmente útiles una vez que se han caracterizado su reactividad al epítope y su afinidad. El aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células aisladas se describe más detenidamente en Clackson, T., et al., Nature 352:624-628 (1991) (bazo) y en Portolano, S., et al., supra; Barbas, C. F., et al., supra; Marks, J. D., et al., supra; Barbas, C. F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:.7978-7982 (1991) (linfocitos sanguíneos periféricos humanos).

B. Creación de anticuerpos recombinantes

[0100] Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son moléculas quiméricas de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de enlace de antígenos) que contienen una secuencia mínima obtenida a partir de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos que forman una región determinadora complementaria (CDR) del receptor son sustituidos por residuos procedentes de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata o un conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En ciertos casos, los residuos del marco Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas. Por lo general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos un dominio variable, y normalmente, de dos, en los cuales la totalidad o la práctica totalidad de las regiones CDR corresponde a las de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o la práctica totalidad de las regiones FR son las de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. En circunstancias óptimas, el anticuerpo humanizado también incluirá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

[0101] Los procedimientos para la generación de anticuerpos humanizados se conocen perfectamente en la técnica y se describen en profundidad en otras obras. Véase, por ejemplo, Queen et al., patentes estadounidenses Nos: 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 6.180.370. Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando diversas técnicas conocidas en el sector, por ejemplo, los injertos CDR (EP 239,400; publicación PCT WO 91/09967; patentes estadounidenses Nos. 5.225.539; 5.530.101 y 5.585.089), chapado o revestimiento superficial (EP 592.106; BP 519.596; Padlan, Mol. Immunol., 28:489-498 (1991); Studnicka et al., Prot. Eng. 7:805-814 (1994); Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973 (1994), y transposiciones en cadena (patente estadounidense No. 5.565.332).

[0102] Se han descrito diversos procedimientos para la obtención de anticuerpos quiméricos recombinantes. Puede recurrirse a la redisposición controlada de los dominios del anticuerpo a través de enlaces de proteína disulfuro para formar anticuerpos quiméricos (Konieczny et al., Haematologia, 14(1):95-99,1981). También se puede utilizar la tecnología del ADN recombinante para construir fusiones de genes entre secuencias de ADN que codifiquen dominios variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos murinos. Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81(21): 6851-6855, 1984; Morrison, Science 229:1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214-221 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); patentes estadounidenses Nos. 5.807.715; 4.916.567; y 4.816.397.

[0103] Las secuencias de ADN que codifican las porciones de enlace del antígeno o las regiones de determinación de la complementariedad (CDR's) de los anticuerpos monoclonales murinos pueden injertarse, a través de medios moleculares, en las secuencias de ADN que codifican los marcos de las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos humanos (Jones et al., Nature, 321(6069):522-525,1986.; Riechmann et al., Nature, 332(6162):323-327, 1988.). Los

productos recombinantes expresados se denominan anticuerpos “reformados” o anticuerpos humanizados, y

comprenden el marco de un anticuerpo humano de cadena ligera o pesada y las porciones de reconocimiento del antígeno, o CDRs, de un anticuerpo monoclonal murino.

[0104] Otro procedimiento para la producción de anticuerpos humanizados se describe en la patente estadounidense Nº 5.639.641. El procedimiento aporta, mediante restauración de la superficie, anticuerpos de roedor humanizados con una eficacia terapéutica mejorada, debido a la presentación de una superficie humana en la región variable. En este procedimiento: (1) los alineamientos de posición de un grupo de regiones variables de anticuerpo de cadena ligera y pesada se generan para conseguir un conjunto de posiciones de superficies expuestas de marcos de región variable de cadenas ligera y pesada, donde las posiciones de alineamiento de todas las regiones variables son idénticas al menos en un 98%; (2) se define un conjunto de residuos de aminoácido de superficie expuesta de marcos de región variable de cadenas ligera y pesada para un anticuerpo de roedor (o un fragmento del mismo); (3) se identifica una serie de residuos de aminoácido de superficies expuestas de marcos de región variable de cadenas ligera y pesada que sea lo más parecida posible a la serie de residuos de aminoácidos de roedor de superficie expuesta; (4) el conjunto de residuos de aminoácido de superficie expuesta de marco de región variable de cadena pesada y ligera definida en la etapa (2) se sustituye por el conjunto de serie de residuos de aminoácido de superficies expuestas de marcos de región variable de cadenas ligera y pesada identificado en laetapa (3), a excepción de los residuos de aminoácido que se encuentran en un radio de 5 Å de cualquier átomo de cualquier residuo de las regiones de determinación de la complementariedad del anticuerpo del roedor; y (5) se produce el anticuerpo humanizado de roedor con especificidad de enlace.

[0105] Un procedimiento similar de fabricación de anticuerpos humanizados es el que se describe en las patentes estadounidenses Nos. 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Estos procedimientos conllevan la producción de inmunoglobulinas humanizadas que contiene una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDR's) y posibles aminoácidos adicionales procedentes de una inmunoglobulina donante, y una región marco de una inmunoglobulina humana que la haya aceptado. Cada una de las cadenas de inmunoglobulina humanizada suele comprender, además de las CDR's, aminoácidos procedentes del marco de la inmunoglobulina donante que sean capaces de interactuar con las CDR's para llevar a cabo la afinidad de unión, como uno o más aminoácidos situados inmediatamente adyacentes a una CDR de la inmunoglobulina donante, o aquellos que se encuentran auna distancia inferior a unos 3 Å, de acuerdo con la predicción de modelado molecular. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas pueden designarse utilizando cualquiera, una combinación o la totalidad de los diversos criterios de posición que se describen en las patentes estadounidenses Nos. 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Al combinarse en un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas tienen sustancialmente un carácter de no-anticuerpo en humanos y conservan sustancialmente la misma afinidad que la inmunoglobulina donante en relación con el antígeno original.

[0106] Un procedimiento adicional para la producción de anticuerpos humanizados se describe en las patentes estadounidenses Nos. 5.565.332 y 5.733.743. Este procedimiento combina el concepto de humanización de los anticuerpos con las librerías de fagómidos, que también se describen en detalle en el presente documento. En términos generales, el procedimiento utiliza secuencias procedentes del emplazamiento de enlace del antígeno de un anticuerpo o población de anticuerpos dirigidos contra el antígeno de interés. De este modo, para un único anticuerpo de roedor, pueden combinarse secuencias que comprenden una parte del emplazamiento de unión del antígeno del anticuerpo con los diversos repertorios de secuencias de anticuerpos humanos que, en combinación, pueden crear un completo emplazamiento de unión del antígeno.

[0107] Los emplazamientos de unión del antígeno creados mediante este proceso difieren de los creados mediante injerto de una CDR en que tan sólo la porción de secuencia del anticuerpo de roedor original tiene posibilidades de establecer contacto con el antígeno de una forma similar. Es probable que las secuencias humanas seleccionadas difieran en términos de secuencia para establecer contactos con el antígeno de una forma similar. Es probable que las secuencias humanas seleccionadas difieran en secuencia y establezcan contactos alternativos con el antígeno en comparación con los del emplazamiento de unión original. No obstante, las limitaciones impuestas por la unión de la porción de la secuencia original con el antígeno y las formas del antígeno, y sus emplazamientos de unión del antígeno, es probable que guíen los nuevos contactos de las secuencias humanas a la misma región o epítope del

antígeno. Por lo tanto, este proceso se ha denominado “selección marcada por epítope” (BIS).

[0108] Comenzando a partir de un anticuerpo animal, un proceso tiene como resultado la selección de anticuerpos que son en parte anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos pueden tener una secuencias suficientemente similares a los anticuerpos humanos que van a utilizarse directamente en la terapia o tras la alteración de unos cuantos residuos clave. Las diferencias de secuencia entre el componente de roedor del anticuerpo seleccionado con las secuencias humanas podría reducirse al mínimo mediante la sustitución de dichos residuos que presentan diferencias por los residuos de secuencias humanas, por ejemplo, mediante mutagénesis de los residuos individuales dirigida al emplazamiento, o mediante injerto de CDR de bucles completos. No obstante, también pueden crearse anticuerpos con secuencias completamente humanas. Por lo tanto, la selección BIS ofrece un procedimiento de producción de anticuerpos parcialmente humanos o completamente humanos que se unen al mismo epítope que los anticuerpos animales o parcialmente humanos, respectivamente. En EIS, los repertorios de fragmentos de anticuerpo pueden visualizarse en la superficie de la fase filamentosa y los genes que codifican fragmentos con actividades de enlace de antígeno seleccionarse mediante el enlace del fago al antígeno.

[0109] En las patentes estadounidenses Nos. 5.750.078; 5.502.167; 5,705.154; 5.770.403; 5.698.417; 5.693.493; 5.558.864; 4.935.496; y 4.816.567 se describen procedimientos adicionales para la humanización de anticuerpos contemplados para su utilización con la presente invención.

[0110] Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense Nº 4.946.778) pueden adaptarse para la obtención de anticuerpos de cadena sencilla humanizados de la integrina

α5β1.

C. Expresión de anticuerpos quiméricos o humanizados recombinantes

[0111] El anticuerpo resultante puede expresarse a través de uno o más vectores que comprendan ácidos nucleicos que codifiquen el anticuerpo.

[0112] Preferiblemente, los segmentos de ácido nucleico que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo se encuentran en una sola unidad de trascripción, con traducción de uno de los ácidos nucleicos de codificación que se encuentran bajo el control de una control secuencia IRES. Los vectores incluyen conjugados químicos como los descritos en WO 93/64701, que tienen la estructura objetivo (por ejemplo un ligando a un receptor de superficie celular), y una fracción de fijación del ácido nucleico (por ejemplo polilisina), un vector viral (por ejemplo un vector viral de ADN o ARN), proteínas de fusión como la descrita en PCT/US 95/02140 (WO 95/22618) que es una proteína que contiene una fracción objetivo (por ejemplo un anticuerpo específico de una célula diana) y una fracción de fijación del ácido nucleico (por ejemplo una protamina), plásmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.

[0113] Los vectores preferidos incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen el virus de la leucemia murina de Moloney. Se prefieren los vectores virales de ADN.Estos vectores incluyen vectores pox, como los vectores ortopox o avipox, vectores del virus del herpes, como un vector del virus del herpes simplex I (HSV) [Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87: 1149 (1990)], Adenovirus Vectors [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)] y Adeno-associated Virus Vectors [Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994)].

[0114] Los vectores víricos Pox introducen el gen en el citoplasma de la célula. Los vectores de virus Avipox ofrecen tan sólo una expresión a corto plazo del ácido nucleico. Los vectores de adenovirus, los vectores víricos adeno-asociados y los vectores del virus del herpes simplex (HSV) son los preferidos para la introducción del ácido nucleico en las células neurales. El vector del adenovirus tiene una expresión a más corto plazo (en torno a 2 meses) que el virus adeno-asociado (en torno a 4 meses), que a su vez es más reducido que el de los vectores HSV. El vector concreto seleccionado dependerá de la célula diana, y de la enfermedad que está tratándose. La introducción puede llevarse a cabo mediante técnicas estándar, por ejemplo infección, transfección, transducción o transformación. Entre los ejemplos de los modos de transferencia de genes se incluyen, por ejemplo, el ADN desnudo, precipitación de CaPO4, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplasto, lipofección microinyección celular y vectores virales.

[0115] El vector puede utilizarse para dirigirse esencialmente a cualquier célula diana deseada, como un glioma. Por ejemplo, puede utilizarse la inyección estereotáxica para dirigir los vectores (por ejemplo adenovirus, HSV) hacia el emplazamiento deseado. Adicionalmente, las partículas pueden introducirse mediante infusión intracerebroventricular (icv) utilizando un sistema de infusión a base de mini-bomba, como un sistema de Infusión de SynchroMed. Un procedimiento basado en la circulación en bruto, denominado convección, también ha demostrado ser eficaz a la hora de enviar grandes moléculas a áreas ampliadas del cerebro, y puede resultar útil a la hora de enviar el vector a la célula diana (Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)). Entre otros de los procedimientos que pueden utilizarse se encuentran los catéteres, la inyección intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutánea, y la vía oral u otras vías de administración.

D. Aislamiento y caracterización de los anticuerpos recombinantes

[0116] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpos” incluye anticuerpos policlonales,

anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales, y fragmentos de enlace a antígenos, como F(ab')2 y fragmentos Fab proteolíticos. También se incluyen los anticuerpos intactos genéticamente modificados, o los fragmentos, como los anticuerpos quiméricos, los fragmentos Fv los anticuerpos de cadena sencilla y similares, así como los péptidos y polipéptidos sintéticos de enlace de antígeno. Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse injertando únicamente CDRs no humanas en regiones humanas constantes y de marco, o mediante la incorporación de la totalidad de los dominios variables no humanos (opcionalmente,

“envolviéndolos” con una superficie similar a la humana, mediante la sustitución de los residuos expuestos, con lo que el resultado será un anticuerpo “recubierto”). En ciertos casos, los anticuerpos humanizados pueden conservar residuos no humanos en los dominios de marco de la región variable, a fin de mejorar las características de enlace adecuadas. Mediante la humanización de los anticuerpos, puede aumentarse su semivida biológica, reduciéndose el potencial de que se produzcan reacciones inmunes adversas al administrarse a seres humanos. Entre las técnicas alternativas para la generación o selección de anticuerpos útiles para el presente documento, se incluye la exposición in vitro de los linfocitos a una proteína o péptido de la integrina α5β1, y la selección de librerías de visualización de anticuerpo en fagos o vectores similares (por ejemplo, mediante la utilización de una proteína o péptido de integrina α5β1 inmovilizada o etiquetada).

E. Purificación por afinidad

[0117] La purificación por afinidad de un grupo de anticuerpos o sueros facilita al médico un reactivo más uniforme. Los procedimientos de enriquecimiento de anticuerpos de integrina α5β1 que utilizan matrices de afinidad del anticuerpo para formar una columna de afinidad son bien conocidos en la técnica, y están disponibles en el comercio (AntibodyShop, co Statens Serum Institut, Artillerivej 5, Bldg. P2, DK-2300 Copenhagen S). De forma resumida, se fija una matriz de afinidad de un anticuerpo a un soporte de afinidad (Véase, por ejemplo; CNBR Sepharose (R), Pharmacia Biotech). A continuación se hace pasar una mezcla que contiene anticuerpos a través de la matriz de afinidad, a la cual se enlazan los anticuerpos. Los anticuerpos enlazados se liberan mediante una serie de técnicas conocidas por todos aquellos que están familiarizados con la técnica, obteniéndose un conjunto de anticuerpos concentrados. El grupo enriquecido de anticuerpos puede utilizarse seguidamente para llevar a cabo estudios inmunológicos adicionales, algunos de los cuales se describen en este documento a modo de ejemplo. Aunque las matrices de afinidad de anticuerpos utilizadas para aislar los anticuerpos de la presente invención no están diseñadas para reconocer específicamente los anticuerpos de integrina α5β1 de la presente invención, ello no limita la utilidad de las matrices de afinidad a la hora de purificar los anticuerpos, ya que los anticuerpos se expresan como proteínas recombinantes en sistemas que son monoclonales por naturaleza.

[0118] Los anticuerpos de la integrina α5β1 aislados pueden utilizarse en inmunoensayo competitivo de enlaces como el descrito anteriormente, para la comparación de una segunda proteína, de la que se piensa que tal vez sea una variante de una integrina α5β1. Para efectuar dicha comparación, cada una de las dos proteínas se somete a pruebas a una gran variedad de concentraciones, y se determina la cantidad de cada proteína que se precisa para inhibir el 50% de los enlaces de los antisueros con la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína que se precisa para inhibir el 50% de los enlaces en inferior a 10 veces la cantidad de integrina α5β1 necesaria para inhibir un 50% de los enlaces, se dice que la segunda proteína enlaza específicamente los anticuerpos generados con integrina α5β1.

E. Purificación del Anticuerpo sensible al pH.

[0119] Algunos de los anticuerpos de la presente invención mostraron una tendencia a precipitarse cuando purificaban por afinidad a un pH neutro o básico. Para abordar este asunto, otro aspecto de la invención se refiere a un proceso para la purificación de anticuerpos sensibles al pH, incluyendo los anticuerpos que comprenden las secuencias de aminoácidos indicadas en las figuras 1 a 5, 10, 11 y 13 y anticuerpos quiméricos que incluyen la región variable murina o que presentan una identidad de secuencias del 80% o más con la región variable murina, o que presentan una identidad de secuencia del 80% o más con las regiones CDR de los anticuerpos incluidos en las figuras 1 a 5. El proceso comprende generalmente la realización de una cromatografía de afinidad para el anticuerpo utilizando una columna cromatográfica, por ejemplo una columna de intercambio iónico, que contenga la matriz de afinidad del anticuerpo enlazado, seguido de una elusión del anticuerpo a un pH de, o a partir de 3.0 a aproximadamente 5.5, preferiblemente de entre 3.3 a 5.5, y más preferiblemente de entre 3.5 a aproximadamente 4.2 o entre aproximadamente 4.2 y aproximadamente 5.5. Los valores inferiores de pH comprendidos en este rango son más adecuados para la purificación a pequeña escala, mientras que un pH de aproximadamente 4.2 o superior se considera más adecuado para operaciones a una escala mayor. Mediante la realización del proceso de purificación dentro de este rango se obtiene un producto con poca o ninguna agregación, y más preferiblemente, esencialmente sin agregación.

[0120] La cromatografía de afinidad es un medio conocido en la técnica para aislar o purificar una sustancia, como un anticuerpo u otra macromolécula biológicamente activa. En general, esto se logra haciendo pasar una solución que contiene el anticuerpo a través de una columna de cromatografía que contiene uno o más ligandos que se enlazan específicamente al anticuerpo inmovilizado en la columna. Dichos grupos pueden extraer el anticuerpo de la solución a través de reacciones de afinidad del ligando. Una vez logrado este fin, el anticuerpo puede recuperarse de la columna mediante elución.

[0121] Por lo tanto, este aspecto de la invención comprende un procedimiento para la purificación de anticuerpos de la integrina anti-α5β1 utilizando una matriz de afinidad del anticuerpo ligada a un sustrato, en el que la mejora comprende la elución de los anticuerpos de la matriz de afinidad el anticuerpo ligada al sustrato utilizando una solución de elución con un pH que oscila entre 3,0 y aproximadamente 5,5.

[0122] Más concretamente, este aspecto de la invención comprende un procedimiento para la purificación de anticuerpos de la integrina anti-α5β1 que comprende: (a) la absorción del anticuerpo en la matriz de afinidad del anticuerpo ligada a un sustrato; y (b) la elución del anticuerpo a partir de la matriz de afinidad del anticuerpo ligada al sustrato utilizando una solución de elución con un pH de entre 3,0 a 5,5. En algunas realizaciones, el proceso también incluye la etapa de (c) recuperación del anticuerpo purificado.

[0123] No obstante, cuando el anticuerpo debe purificarse o tratarse adicionalmente, puede que en este punto no se precise una etapa de recuperación específica.

[0124] El proceso de purificación implica la absorción de los anticuerpos por la matriz de afinidad del anticuerpo ligada a un sustrato. Pueden utilizarse diversos tipos de matriz de afinidad del anticuerpo. El único requisito es que la molécula de la matriz de afinidad posea la capacidad de unirse al anticuerpo que ha de purificarse. Por ejemplo, se pueden utilizar la matriz de afinidad del anticuerpo aislada a partir de fuentes naturales, la matriz de afinidad del anticuerpo producida mediante técnicas de ADN recombinante, las formas modificadas de las matrices de afinidad de los anticuerpos, o fragmentos de dichos materiales que retengan la capacidad de unión para el anticuerpo en cuestión.

Entre los ejemplos de materiales que pueden utilizarse para las matrices de afinidad de los anticuerpos se encuentran los polipéptidos, polisacáridos, ácidos grasos, lípidos, aptámeros del ácido nucleico, glicoproteínas, lipoproteínas, glicolípidos, complejos multiproteínicos, una membrana biológica, virus, proteína A, proteína G, lectinas y receptores de Fc.

[0125] La matriz de afinidad del anticuerpo se une a una fase sólida o soporte mediante una interacción general (por ejemplo, mediante enlace de intercambio iónico no específico, mediante interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas), o mediante una interacción específica (por ejemplo, la interacción antígeno-anticuerpo), o mediante enlace covalente entre el ligando y la fase sólida. Alternativamente, puede añadirse a la fase sólida un compuesto intermedio o espaciador, pudiendo entonces inmovilizarse la matriz de afinidad del anticuerpo en la fase sólida, añadiendo la matroz de afinidad al separador. El propio separador puede ser un ligando (es decir, un segundo ligando) que tenga una afinidad de unión específica para la matriz de afinidad del anticuerpo libre.

[0126] La matriz de afinidad del anticuerpo puede añadirse a diversos sustratos o soportes. Normalmente, se utilizan resinas de intercambio iónico o de acoplamiento (por ejemplo, activadas por CNBr) con este fin. Los anticuerpos pueden adsorberse en la matriz de afinidad del anticuerpo enlazada al sustrato utilizando diversos procedimientos. Preferiblemente, se utiliza un procedimiento de columna, y los anticuerpos se adsorben a la columna utilizando una solución tampón preparada con un tampón adecuado. Los tampones y condiciones de funcionamiento más habituales son bien conocidos en la técnica.

[0127] Los anticuerpos pueden eluírse a partir de la matriz de afinidad del anticuerpo unida al sustrato utilizando procedimientos convencionales, por ejemplo, la elución de los anticuerpos de la columna utilizando una solución tampón. Para reducir al mínimo la precipitación, los anticuerpos de integrina anti-α5β1 sensibles al pH se elúen con una solución tampón que comprende glicina 0.1 M a un pH de 3.5. Para reducir al mínimo la degradación y/o la desnaturalización, la temperatura de la solución tampón se mantiene preferiblemente por debajo de 10° C, y más preferiblemente a una temperatura de 4° C o inferior. Por estas mismas razones, el período durante el cual los anticuerpos se encuentran expuestos a un pH ácido, deberían reducirse al mínimo. Esto se consigue, por ejemplo, añadiendo una cantidad predeterminada de una solución básica a la solución con el anticuerpo eluído. Preferiblemente, esta solución básica es una solución tampón, más preferiblemente una solución tampón básica volátil, y más preferiblemente una solución de amoniaco.

[0128] La elusión de los anticuerpos a partir de la matriz de afinidad del anticuerpo ligada al sustrato puede comprobarse mediante diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, si se utilizan procedimientos de columna, las fracciones pueden recogerse en las columnas. Y la presencia de la proteína determinarse midiendo la absorción de las fracciones. Si se purifican anticuerpos con una especificidad conocida, la presencia de los anticuerpos en las fracciones recogidas a partir de las columnas puede medirse mediante técnicas de inmunoensayo, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA) o inmunoensayo enzimático (EIA).

[0129] El proceso de la presente invención puede llevarse a cabo a cualquier temperatura conveniente que no degrade sustancialmente el anticuerpo que está purificándose, o que afecte negativamente a la matriz de afinidad del anticuerpo ligada a un sustrato. Preferiblemente, la temperatura utilizada es la temperatura ambiente. Los anticuerpos eluídos a partir de la columna de la matriz de afinidad del anticuerpo pueden recuperarse, si así se desea, utilizando diversos procedimientos conocidos en la técnica.

G. Comprobación de la avidez

[0130] La comprobación de la avidez permite a una persona versada en la materia identificar anticuerpos reconociendo especialmente uno o más epítopes de integrina α5β1. Los anticuerpos se definen como especialmente proclives a formar enlaces si: 1) presentan un nivel umbral de actividad de enlace, y/o 2) no presentan una significativa reactividad cruzada con las moléculas de polipéptidos relacionadas. En primer lugar, los anticuerpos del

presente documento se unen específicamente si se unen a un polipéptido, peptido o epítope de la integrina α5β1

con una afinidad de enlace (Ka) de 106 mol-1 o superior, preferiblemente de 107 mol-1 o superior, más preferiblemente de 106 mol-1 o superior, y más preferiblemente de 109 mol-1 o superior. La afinidad para formar enlaces de un anticuerpo puede ser determinada con facilidad por cualquier persona versada en la materia, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949), o mediante resonancia de plasmones superficiales utilizando BlAcore.

[0131] En segundo lugar, los anticuerpos se unen específicamente si no muestran una reactividad cruzada significativa con los polipéptidos relacionados. Los anticuerpos no presentan una importante reactividad cruzada con las moléculas de polipéptido afines, por ejemplo, si detectan un polipéptido de integrina α5β1 pero no polipétidos afines conocidos utilizando un análisis estándar Western blot (Ausubel et al., ibid.). Entre los ejemplos de los polipéptidos afines conocidos se encuentran los ortólogos, las proteínas procedentes de la misma especie que son miembros de la familia integrina de las proteínas, los polipéptidos mostrados en alineación en la figura 1,

polipéptidos mutantes de la integrina α5β1, y similares. Además, los anticuerpos pueden “compararse con” polipéptidos afines conocidos para aislar una población que se una específicamente a la integrina α5β1. Por ejemplo, los anticuerpos cultivados en polipéptidos de la integrina α5β1 humana se adsorben con los polipéptidos afines adheridos a la matriz insoluble; los anticuerpos específicos de los polipéptidos de integrina α5β1 humana

fluirán a través de la matriz bajo unas condiciones de tampón adecuadas. Dicha comparación permite aislar los anticuerpos monoclonales y policlonales que no presentan reactividad cruzada con polipéptidos estrechamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley y Sons, Inc., 1995). El filtrado y aislamiento de anticuerpos específicos es bien conocido en la técnica (véase, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles y Practice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984). Entre los ejemplos más representativos de dichos ensayos se encuentran: inmunoelectrofóresis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayo dot blot o Western blot, ensayo de inhibición o competición, y ensayo sándwich. Puede encontrarse una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo en Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7th ed. 1991).

IV. Procedimientos para la medición de la eficacia en la modulación de la angiogénesis

[0132] La presente invención facilita procedimientos para la evaluación de los efectos fisiológicos modulados por un anticuerpo humanizado de integrina anti-α5β1. Para empezar, estos procedimientos permiten el filtrado de las composiciones que contienen los anticuerpos de la presente invención a fin de determinar una dosis terapéutica efectiva y segura. Durante el tratamiento, algunos de estos procedimientos pueden aplicarse a fin de supervisar el progreso y modular la dosis para conseguir un efecto clínico óptimo.

[0133] Los procedimientos comprenden la facilitación de un tejido viable que sea compatible con el análisis o el tratamiento, es decir, un tejido que, al lesionarse, incluyendo la inmortalización, se ve sometido a unos eventos de neovascularización coroidal no deseables, los cuales, en caso de inhibirse o impedirse, mejorarían la prognosis del paciente y/o la curación del tejido lesionado. Entre los tejidos más habituales que pueden ser sometidos a tratamiento o estudio se incluyen los tumores, y los tejidos oculares, y concretamente, la mácula del ojo. El término “tumor” se utiliza ampliamente en este documento para referirse a cualquier crecimiento nuevo y patológico de tejido. A los efectos de la presente invención, un tumor se caracteriza en parte por la angiogénesis. Un tumor puede ser benigno, por ejemplo, un hemangioma, glioma, teratoma, y similares, o maligno, por ejemplo, un carcinoma, sarcoma, glioblastoma, astrocitoma, neuroblastoma, retinoblastoma, y similares. El término “tumor” se utiliza en general para referirse a un tumor benigno o maligno, y el término “cáncer” se utiliza en general para referirse a un

tumor maligno, que puede ser o no metastático, Los tumores malignos que pueden diagnosticarse utilizando un procedimiento de la invención incluyen, por ejemplo, carcinomas como el cáncer de pulmón, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer cervical, el cáncer de páncreas, el cáncer de colon y el cáncer de ovarios; y sarcomas como el osteosarcoma y el sarcoma de Kaposi, siempre que el tumor se caracterice, al menos parcialmente, por la angiogénesis asociada a la expresión de α5β1 por parte de los vasos sanguíneos de nueva formación. Para su estudio, estos tejidos pueden aislarse mediante procedimientos conocidos y fuentes fácilmente disponibles para aquellas personas versadas en la materia.

[0134] Al utilizar un tejido viable para comprobar la eficacia de los anticuerpos terapéuticos de la presente invención, el tejido debe lesionarse en primer lugar para crear lesiones y fomentar la neovascularización corodial. La lesión puede conseguirse mediante cualquier medio apropiado, incluyendo medios mecánicos, químicos o biológicos. Entre los ejemplos de medios mecánicos se incluye la aplicación de agentes a los tejidos para provocar necrosis, apoptosis, o pérdidas del contacto entre una célula y otra. Los medios biológicos incluyen el tratamiento con agentes infecciosos, como virus, bacterias o priones. Un procedimiento preferido para la creación de lesiones es mediante la utilización de un láser. Puede utilizarse cualquier láser que sea capaz de lesionar el tejido, siendo los láser preferidos los de gas CO2, prefiriéndose un fotrocoagulador láser OcuLight GL (532 nm) de IRIS Medical® con adaptador de lámpara portátil. Otras fuentes láser también resultan adecuadas, siempre que puedan generar luz láser entre 300 y 700 mvatios, y lesiones de menos de 200µm, preferiblemente de menos de 100 µm, más preferiblemente de entre 50 y 100 µm de diámetro, y más preferiblemente de entre 75 y 251 µm de diámetro. Normalmente, la luz láser se aplica al tejido durante una fracción de segundo. Normalmente, durante menos de 0,5 segundos, más preferiblemente durante menos de 0,1 segundos, y más preferiblemente durante menos de 0,05 segundos.

[0135] El anticuerpo aplicado es un anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1. Más preferiblemente, el anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS.: 25, 28 y 31 y una región variable de cadena ligera seleccionada independientemente entre el grupo consistente en las SEQ ID NOS.: 26 y 32.

[0136] Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse a través de diversas vías, por ejemplo, por vía intravenosa u oral, o directamente en la región que va a tratarse, por ejemplo, directamente en un tumor neoplásico, a través de un colirio ocular, cuando la situación patológica afecta al ojo, o intrasinovialmente, cuando la enfermedad afecta a una articulación.

[0137] La cantidad de anticuerpo terapéutico que se administra a un individuo dependerá en parte de que el agente se administre con fines diagnósticos o terapéuticos. Los procedimientos para la determinación de una cantidad efectiva de un agente para su administración con fines diagnósticos o terapéuticos son bien conocidos en la técnica, e incluyen ensayos clínicos de fase I, fase II y fase III.

[0138] Utilizando los procedimientos de la presente invención, pueden determinarse las cantidades efectivas, por ejemplo, mediante escalonamientos de la dosis en los pacientes individuales, y observando el progreso en función de la inhibición angiogénica.

[0139] La cantidad total del fármaco que puede administrarse a un paciente como monodosis. Bien mediante bolos o por infusión a lo largo de un período de tiempo relativamente breve, o puede administrarse utilizando un protocolo de tratamiento fraccionado, en el que las dosis múltiples se administran a lo largo de un período de tiempo más prolongado. Como se ha observado anteriormente, cualquier persona versada en la materia debería saber que la concentración de un agente específico requerido para proporcionar una cantidad efectiva a una región o regiones de angiogénesis asociadas a la expresión de la integrina anti-α5β1 en un paciente depende de muchos factores, incluyendo la edad y el estado de salud del paciente, así como la vía de administración, el número de tratamientos a administrar, y el tipo de fármaco. Teniendo en cuenta estos factores, el técnico versado en la materia ajustaría la dosis específica para obtener una cantidad efectiva para interferir eficazmente con el enlace específico de la

integrina α5β1 con su ligando, permitiendo de este modo la reducción o limitación de la angiogénesis.

[0140] Otro de los aspectos de la presente invención consiste en la supervisión de los avances clínicamente relevantes. La supervisión puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Entre los procedimientos preferidos se incluyen la microscopía, las Resonancia Magnética Nuclear y los Rayos X. En el caso de los tejidos oculares, puede recurrirse al examen por examen oftalmoscópico indirecto de la cámara posterior del ojo y examen biomicroscópico del segmento anterior del ojo. Un procedimiento preferido para la supervisión del alcance de la neovascularización coroidal es el tintado intravenoso con fluoresceína y el examen de los tejidos viables mediante angiografía por fluoresceína.

[0141] Un procedimiento preferido de comparación de la efectividad de anticuerpos de la integrina anti-a561 en la inhibición o prevención de la neo-angiogénesis consiste en la creación de lesiones en la retina de un animal, en la aplicación de anticuerpos de la integrina anti-a561 en las lesiones, y en la ulterior supervisión del avance de la neoangiogénesis en los tejidos dañados, en comparación con unos experimentos de control adecuados. Este procedimiento se comenta en mayor detalle en el ejemplo 6 a continuación. Estos estudios han llevado al descubrimiento sorprendente de que la aplicación de anticuerpos de la integrina anti-a561 en un ojo de un paciente tiene como resultado el tratamiento de las lesiones de ambos ojos del paciente. Se ha sugerido que los vasos sanguíneos de nueva formación en los tejidos lesionados tienen “fugas”, con el resultado de que los anticuerpos aplicados a un ojo acceden al sistema sanguíneo sistémico, que los transporta al otro ojo. Este resultado hace que sea indiferente si se utilizan para el tratamiento anticuerpos completos o fragmentos Fab, Estos resultados indican un nuevo procedimiento de tratamiento de las lesiones oculares mediante la administración sistemática de anticuerpos terapéuticos de la integrina anti-a561 de la presente invención, por ejemplo mediante inyección intravenosa.

V. Usos terapéuticos

[0142] Una realización adicional de la invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos terapéuticos que se describen en el presente documento. Estas composiciones pueden contener agentes que mejoran la absorción o localización del componente terapéutico, reducir la inflamación o aportar otros tipos de alivio localizado.

[0143] Los anticuerpos de la presente invención y que resultan útiles para la reducción o inhibición de la angiogénesis asociada a la expresión de la integrina α5β1, o una composición farmacéutica que contenga los anticuerpos, se pueden utilizar para el tratamiento de cualquier condición patológica que se caracterice, al menos parcialmente, por la angiogénesis. Cualquier persona versada en la materia debería saber que el agente puede administrarse por diversas vías, incluyendo, por ejemplo, por vía oral o parenteral, incluyendo por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraorbital, intracapsular, intrasinovial, intraperitoneal, intracisternal o mediante su absorción pasiva o facilitada a través de la piel, utilizando, por ejemplo, un parche dérmico iontoforesis transdérmica. Asimismo, los anticuerpos pueden administrarse mediante inyección, intubado, supositorio, por vía oral o tópica, pudiendo esta última ser pasiva, por ejemplo, mediante la aplicación directa de un ungüento o polvo que contenga los anticuerpos, o activa, por ejemplo, utilizando un spray o inhalador nasal. Los anticuerpos también pueden administrarse como un spray tópico, si se desea, en cuyo caso, un componente de la composición es un propelente adecuado. También puede incorporarse la composición farmacéutica, si así se desea, a liposomas, microesferas u otras matrices poliméricas (Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Fla. 1984). Los liposomas, por ejemplo, que consisten en fosfolípidos u otros lípidos son no tóxicos, resultan fisiológicamente aceptables y metabolizan los portadores, que son relativamente sencillos de fabricar y administrar.

[0144] La angiogénesis asociada con la expresión de la integrina α5β1 puede tener lugar a nivel local, por ejemplo, en la retina de un paciente que sufra retinopatía diabética, o puede producirse de forma más sistemática, por ejemplo, en un paciente que sufra artritis reumatoide o una neoplasia metastática maligna. Dado que las regiones de la angiogénesis pueden estar localizadas o estar sistemáticamente más dispersas, una persona versada en la materia seleccionaría una vía específica o procedimiento de administración de los anticuerpos terapéuticos de la presente invención, basados en parte en este factor.

[0145] Por ejemplo, en el caso de un paciente que sufra retinopatía diabética, cuando la angiogénesis asociada a la expresión de la integrina α5β1 se encuentra localizada en la retina, el agente puede formularse en una composición farmacéutica que resulte cómoda para su utilización como colirio, que pueda administrarse directamente en el ojo, a diferencia de un paciente que sufra un carcinoma con metástasis, en cuyo caso el agente es una composición farmacéutica que puede administrarse por vía intravenosa, oral o mediante cualquier otro procedimiento que sirva para distribuir sistemáticamente en agente. De este modo, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse a través de diversas rutas, por ejemplo, por vía intravenosa, oral, o directamente en la región a tratar, por ejemplo, directamente en un tumor neoplásico; mediante un colirio, cuando la condición patológica afecta al ojo;

o por vía intrasinovial, cuando la condición afecta a una articulación.

[0146] Un anticuerpo terapéutico se administra en una cantidad efectiva, que es una cantidad suficiente para interferir con el enlace específico de una integrina α5β1con su ligando específico en un paciente. En general, se administra un antagonista del agente en una dosis de aproximadamente entre 0.0001 y 100 mg/kg de peso corporal, aunque estas dosis variarán en función de la aplicación. En función de los resultados de las pruebas de eficacia comentadas anteriormente, un técnico debería ser capaz de determinar una gama efectiva de dosis para un tratamiento dado. Los cálculos de la cantidad a administrar pueden ajustarse en consecuencia, por ejemplo, cuando el agente se administre a nivel local.

[0147] Un procedimiento preferido de administración de los anticuerpos de la presente invención es mediante inyección, bien por vía intradérmica, intravenosa o directamente en la articulación o tejido que ha sufrido una lesión. Por ejemplo, cuando el tejido de la retina ha resultado dañado, los anticuerpos terapéuticos de la presente invención pueden inyectarse por vía intravítrea en en el ojo afectado. Un resultado sorprendente de la presente invención es que el tratamiento aplicado en un ojo conlleva efectos clínicamente beneficiosos en ambos ojos (suponiendo que

ambos ojos estén lesionados). Parece que los vasos sanguíneos de nueva formación tienen “fugas”, lo que permite

que los anticuerpos aplicados al primer ojo pasen al caudal sanguíneo, a través del cual son transportados al segundo ojo. Cuando se aplica de esta forma en el ojo, la dosis es preferiblemente inferior a 5µM, más preferiblemente de entre 0.5 y 2µM, y más preferiblemente de entre 0.1 y 1.01 µM. En los casos indicados, el tratamiento puede adoptar la forma de dosis múltiples, administradas en un área o a lo largo de un período de tiempo. Todas las dosis en un formato múltiple pueden ser idénticas, o pueden determinarse y aplicarse independientemente. Este resultado también ha llevado a un procedimiento adicional para el tratamiento de las lesiones con neoagiogenesis asociada, comprendiendo la aplicación sistémica de de una cantidad efectiva de un anticuerpo terapéutico (por ejemplo, mediante inyección intravenosa) que inhibe o impide la neoangiogénesis de un tejido lesionado.

EJEMPLOS

[0148] Como puede apreciarse en lo anteriormente revelado, la presente invención tiene una amplia gama de aplicaciones. Por ello, los siguientes ejemplos se ofrecen con fines ilustrativos, y no se pretende interpretarlos en modo alguno como una limitación de la invención. Las personas versadas en la materia reconocerán inmediatamente una serie de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para obtener unos resultados esencialmente similares.

EJEMPLO 1 - Construcción de una quimera M200 a partir de la integrina murina IlA1 Anti-α5β1

[0149] Este ejemplo describe la construcción del anticuerpo quimérico M200.

A. Secuencias de ADN iniciales de los dominios IIA1 y 200-4 VH y VL

[0150] Los dominios variables pesado (VH) y ligero (VL) del anticuerpo de la integrina anti-humana α5β1, el IIA1 (Pharmingen, San Diego CA) se clonaron a partir del cADN del hibridoma IIA1 y se secuenciaron como parte de la construcción inicial del anticuerpo 200-4. La Figura 3 muestra las secuencias de cADN de los dominios VH IIA1 (SEQ ID NO: 13) y VL (SEQ ID NO: 14). Durante la construcción del anticuerpo quimérico 200-4 de ratón/humano IgG4 a partir del IIA1, se introdujeron emplazamientos silentes de restricción Xhol (CTCGAG) (SEQ ID NO: 33) en las 4 regiones marco de IIA1 VH y VL. Las secuencias de ADN 200-4 VH (SEQ ID NO: 15) y VL (SEQ ID NO: 17) que contenían estos emplazamientos Xhol silentes, como las encontradas en los constructor de expresión DEF38 IIA1/humano G4 quimera y NEF5 IIA1/K quimera, se muestran en la Figura 4. Estas secuencias 200-4 VH y VL se utilizaron como punto de partida para las posteriores manipulaciones de ADN recombinante.

B. Diseño de los mini-exones M200 VH y VL

[0151] Los dominios 200-4 VH y VL en los plásmidos de expresión DEF38 IIA1/humano G4 quimera y NEF5 IIA1/K quimera se fusionan directamente con sus dominios constantes adyacentes a través de los emplazamientos silentes Xhol, sin que intervengan los intrones. Para que estos dominios variables sean compatibles con los vectores de expresión del anticuerpo deseados basándose en el ADN genómico, fue necesario diseñar 'mini-exones' que recreasen llos puntos de empalme del enlace en los extremos 3' de la región de codificación variable. Las comparaciones de secuencias revelaron que las regiones VH y VL de IIA1 utilizaron los segmentos murinos JH4 y JK1, respectivamente; por tanto, los mini-exones se diseñaron para recrear los emplazamientos de empalme del donante JH4 y JK1 murinos naturales tras el último aminoácido de los dominios VH y VL. Además, se eliminaron los emplazamientos Xhol, restaurando las 4 secuencias marco encontradas en el hibridoma original IIA1. Los miniexones se flanquearon con emplazamientos de restricción: emplazamientos Xbal 5' y 3' (TCTAGA) (SEQ ID NO: 34) para el mini-exón VH, y 5' Mlul (ACGCGT) (SEQ ID NO: 35) y 3' Xbal (TCTAGA) (SEQ ID NO: 34) para el miniexón VL.

[0152] En ocasiones, los dominios variables de anticuerpos recombinantes contienen emplazamientos de empalme mRNA alternativos no deseados, que pueden dar lugar a especies con empalmes mRNA alternativos. En teoría, dichos emplazamientos podrían existir en el dominio variable murino, pero tan sólo pasan a ser activos en el contexto de una célula de expresión heterogénea y/o nuevos emplazamientos receptores procedentes de regiones constantes quiméricas. Al aprovechar la degeneración del codón para eliminar los posibles emplazamientos de empalme alternativos dejando sin cambios la secuencia de aminoácido codificada, se puede eliminar este empalme alternativo no deseado. Para detectar cualquier posible punto de empalme alternativo en los mini-exones M200 VH y VL, se analizaron los diseños iniciales con un programa de predicción de emplazamientos de empalme del Centro de Análisis de Secuencias Biológicas de la Universidad Técnica de Dinamarca (http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/). Para ambos mini-exones 200-M, se identificaron los emplazamientos de empalme donantes correctos; no obstante, se detectaron posibles emplazamientos donante alternativos potenciales en el CDR3 del mini-exón VH y en el CDR1 del mini-exón VL. Para eliminar la posibilidad de que se utilicen estos emplazamientos de empalme, se realizaron cambios silentes de la pareja básica en el diseño de los mini-exones. En el caso del diseño VH, se efectuó un cambio silente del codón GGT a GGA en la glicina 100 (numeración de Kabat); en el caso del diseño VL se efectuó un cambio silente del codón GTA a GTC en valina 29. En ambos casos, estos estos cambios silentes eliminaron la posible señal del donante del empalme secundario en los genes V.

[0153] En la figura 5 se muestran los diseños finales de los mini-exones M200 VH y VL (SEQ ID NOS: 19, 21), que contienen los emplazamientos de restricción de flanqueo y los emplazamientos de empalme de donante murino, habiéndose eliminado los emplazamientos 200-4 Xhol, y los posibles emplazamientos de empalme alternativos del donante.

C. Construcción del mini-exón M200 VH y del plásmido p200-M-H

[0154] El mini-exón diseñado para el M200 VH mostrado en la figura 5A se construyó mediante mutagénesis basada en PCR utilizando como punto de partida el plásmido de expresión 200-4 DEF38 IIAI/humano G4 quimera. En forma resumida, la región 200-4 VH se amplificó a partir de DEF38 IIA1/humano G4 uimera utilizando los imprimadores #110 (5 -TTTTCTAGACCACCATGGCTGTCCTGGGGCTGCTT - 3') (SEQ ID NO: 36), que ablanda el extremo 5' de la secuencia de señal 200-4 VH y anexa una secuencia Kozak y un emplazamiento Xbal, y el imprimador #104 (5 -TTTTCTAGAGGTTGTGAGGAC TCACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT - 3') (SEQ ID NO: 37) que ablanda el extremo 3' de 200-4 VH y anexa un emplazamiento Xbal. El fragmento 469 bp PCR se clonó en vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) y se confirmó mediante secuenciado del ADN para generar el plásmido p200M-VH-2.1. Este plásmido intermedio se utilizó entonces en una segunda reacción mutagénética del PCR para eliminar el posible emplazamiento de empalme aberrante de CDR3 y añadir un emplazamiento de empalme donante murino JH4 donor en el extremo 3' de la región de codificación VH. Se diseñaron dos imprimadores complementarios, #111 (5'-TGGAACTTACTACGGAATGACTA CGACGGGG -3') (SEQ ID NO: 38) y #112 (5'-CCCCGTCGTAGTCATTCCGTAGTAAGTTCCA -3') (SEQ ID NO: 39) para dirigir un cambio de codón GGT a GGA en la glicina 100 (numeración de Kabat) en la CDR3 del M200 VH. Los imprimadores #110 y #112 se utilizaron en una reacción PCR para generar un fragmento 395 bp a partir del extremo 5' del mini-exón M200 VH, y una reacción PCR independiente con los imprimadores #111 y #113 (5'-TTTTCTAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3') (SEQ ID NO: 40) generó un fragmento 101 bp a partir del extremo 3' del mini-exón M200 VH. Los dos productos PCR se purificaron con gel en una solución al 1,5% de agarosa con bajo punto de fusión combinándose y uniéndose en una reacción final PCR utilizando los imprimadores #110 y #113. El producto final PCR 465 bp se purificó, se digirió con Xbal, y se clonó en el vector tratado con fosfatasa alcalina procedente de la gamba pHuHCg4.D. El plásmido final, el p200-M-H (figura 6) se sometió a secuenciado de ADN para garantizar la secuencia correcta para el mini-exón 200-M VH entre los emplazamientos Xbal y verificar la correcta orientación del inserto Xbal-Xbal.

D. Construcción del mini-exón M200 VL y del plásmido p200-M-L

[0155] El mini-exón diseñado para el M200 VL mostrado en la figura 5B se construyó mediante mutagénesis basada en PCR utilizando como punto de partida el plásmido de expresión 200-4 NEF5 IIA1/K. La región VL se amplificó a partir de NEFS-IIA1-K utilizando los imprimadores #101 (5'-TTTACGCGTCC ACCATGGATTTTCAGGTGCAGATT - 3') (SEQ ID NO: 41) que ablandan el extremo 5' de la secuencia de señal y añade una secuencia Kozak y un emplazamiento Mlul, y el imprimador #102 (5'- TTTTCTAGATTAGGAAAG TGCACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC -3') (SEQ ID NO: 42) que ablanda el extremo 3' del 200-4 VL y añade un emplazamiento Xbal site. El fragmento PCR 432 bp se clonó en el vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) y se confirmó mediante secuenciado del ADN para generar el plásmido p200M-VL-3.3. Este plásmido intermedio se utilizó entonces en una segunda reacción mutagénética del PCR para eliminar el posible emplazamiento de empalme aberrante de CDR1 y añadir un emplazamiento de empalme donante murino JK1 en el extremo 3' de la región de codificación VL. Se diseñaron dos imprimadores complementarios, #114 (5-TGCCAGTTCAAGTGTCAG'TTCCAATTACTTG-3') (SEQ ID NO: 43) y #115 (5' -CAAGTAATTGGAACTGACACTTGA ACTGGCA-3') (SEQ ID NO: 44) para dirigir un cambio de codón GTA a GTC en la valina 29 (numeración de Kabat) en la CDR1 del dominio VL. Los imprimadores #101 y #115 se utilizaron en una reacción PCR para generar un fragmento 182 bp a partir del extremo 5' del mini-exón VL, y una reacción independiente PCR con los imprimadores #114 y #116 (5-TTTTCTAGACTTTGGATTCTACTTAC GTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3') (SEQ ID NO: 45) generó un fragmento 280 bp a partir del extremo 3' del miniexón VL. Los dos productos PCR se purificaron con gel en una solución al 1.5% de agarosa con bajo punto de fusión combinándose y uniéndose en una reacción final PCR utilizando los imprimadores #101 y #116. El producto final 431 bp PCR se purificó, se digirió con Mlul y Xbal, y se clonó en un vector de expresión de cadena ligera digerido con Mlul- y Xbal- pHuHCcg4.D. El plásmido final, p200-M-L (figura 7) se sometió a secuenciado de ADN para garantizar la secuencia correcta para el mini-exón VL entre los emplazamientos Mlul y Xbal.

E. Combinación de plásmidos p200-M-H y p200-M-L para obtener el plásmido de expresión final p200-M

[0156] Para expresar M200 a partir de un solo plásmido, se digirieron p200-M-H y p200-M-L con EcoRI, y el fragmento EcoRI que transportaba la totalidad del gen de cadena pesada IgG4 procedente del p200-M-H se ligó en un p200-M-L EcoRI-linealizado Para generar el plásmido p200-M (figura 8). Se realizó una preparación a gran escala de plásmido libre de endotoxinas de p200-M a partir de 2.5 litros de cultivo de E. coli utilizando el Kit Endotoxin-Free Plasmid Maxi-prep (Qiagen). La estructura se verificó mediante mapeado de enzimas de restricción con las enzimas BamHI, Xbal, y Fspl. La región completa de codificación para M200 VH, VL, C y Cy4 se verificó mediante secuenciado del ADN. Las secuencias de ADN correspondientes a las cadenas completas M200 pesada (SEQ ID NO: 23) y M200 ligera (SEQ ID NO: 24) se muestran en la figura 9. Las correspondientes secuencias de aminoácido para las cadenas completas M200 pesada (SEQ ID NO: 25) y M200 ligera (SEQ ID NO: 26) se muestran en la figura

10.

EJEMPLO 2 – Generación de un fragmento Fab F200 a partir de M200

[0157] Este ejemplo describe la realización de un fragmento Fab F200.

[0158] Los fragmentos Fab se generan a partir de un material de partida M200 IgG mediante digestión enzimática. El IgG de partida es una solución tampón intercambiada en 20 mM de fosfato sódico, 20 mM de N-acetil cisterna de pH

7.0. Se añade enzima de papaína soluble, y se hace girar la mezcla a 37°C durante 45 horas. Ras la digestión, se hace pasar la mezcla por una columna de proteína A para eliminar los fragmentos Fc y se elimina el material IgG no digerido. Se añadió tetrationato sódico hasta obtener 10 mM y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Por último, esta preparación se intercambió en una solución tampón de 20 mM de fosfato sódico, 100 mM de cloruro sódico, pH 7.4, para obtener la solución F200.

[0159] Dado que se trata de un fragmento Fab, el ADN de cadena ligera F200 y la secuencia de los aminoácidos son los mismos que los de la cadena ligera M200. Las secuencias completas de ADN de cadena pesada F200 (SEQ ID NO: 27) y de aminoácido (SEQ ID NO: 28) se muestran en la figura 11.

EJEMPLO 3 – inhibición in vitro de la proliferación endotelial mediante M200

[0160] Este ejemplo describe el efecto del anticuerpo M200 sobre la proliferación endotelial. El M200 es un

anticuerpo monoclonal de bloqueo funcional altamente específico que actúa contra la integrina α5β1.

[0161] Se sembraron células HUVEC en 96 placas pocillo con una densidad de 5000 células/pocillo en presencia de diversos anticuerpos (M100, M200, anti-VEGF o IgG de control) a las concentraciones que se muestran en la figura

14. Las placas se trataron previamente con 10 µg/mL de fibronectina o poly-L-lisina (PLL) al 0.1% y se bloqueó con un 2% de BSA desnaturalizada por calor. Las células se cultivaron en un medio definido y libre de suero que contenía aproximadamente 2ng/ml de VEGF, bFGF o ambos. Cuatro días después de la colocación en las placas, se evaluó la viabilidad celular total utilizando la prueba de la sal de tetrazolio, MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5bromuro de difenil-tetrazolio+++) (véase por ejemplo Wasserman & Twentyman, Use of a colorimetric microtiter (MTT) assay in determining the radiosensitivity of cells from murine solid tumors,” Int J Radiat Oncol Biol Phys. 15(3):699-702 (1988); Romijn, JC, Verkoelen, CF, Schroeder, FH, “Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions y assessment of hormone-stimulated growth and druginduced cytostatic and cytotoxic effects”, Prostate 12(1): 99-110 (1988)) Se recopilaron los datos de fondo y se normalizó hasta obtener una solución de control libre de anticuerpo. Todos los puntos de datos se recopilaron por triplicado y los datos que se muestran son representativos de tres experimentos individuales.

[0162] Como se muestra en la figura 14, se inhibió el crecimiento de las células HUVEC mediante M200 de una forma dependiente de la dosis, tanto en PLL y en la fibronectina (0.40 nM; inhibición máxima del 80%), mientras que la solución de control IgG carecía de efecto alguno. Asimismo, el M100 (el anticuerpo de ratón a partir del cual se obtiene el M200) muestra idéntica capacidad de inhibición del crecimiento celular.

[0163] Lo que es importante, como se muestra en la figura 14, es que el bloqueo de función de elevada afinidad anti-VEGF mAb, HuMV833 (K0 = 5.84 x 10-11 nM), ejerció una inhibición significativamente inferior sobre el crecimiento de las células HUVEC en todas las condiciones de prueba (45 nM; inhibición máxima del 40%). El tratamiento conjunto de las células con M200 y HuMV833 no tuvo como resultado una mayor respuesta inhibitoria.

[0164] Para los datos mostrados en la figura 15A, se incluyó una mayor concentración de VEGF (50 ng/ml) en el ensayo de proliferación de las células HUVEC en fibronectina, como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la figura 15A, la proliferación de células HUVEC en fibronectina estimulada por VEGF resulta inhibida por el M200 en una medida similar a la del HuMV833. De este modo, los efectos citostáticos medidados por el M200-son evidentes incluso a niveles elevados, y estimulantes del crecimiento, de VEGF (50 ng/ml).

[0165] Se cultivaron dos anticuerpos de alta afinidad contra la región del idiotipo del M200 y se determinó que bloqueaban el enlace del M200 con la integrina α5β1. Los dos mAbs anti-idiotipo (10 µg/ml) se incluyeron en el ensayo de proliferación de células HUVEC descrito anteriormente, evaluándose su efecto sobre la inhibición dependiente del M200 del crecimiento de las células HUVEC. Ambos mAbs son capaces de inhibir la capacidad de un M200 (1 µg/ml) para inhibir la proliferación de células HUVEC. Como se muestra en 15B, la actividad inhibitoria del M200 se invirtió por completo mediante el anti-idiotipo mAbs a M200.

[0166] En su conjunto, estos resultados sugieren que el anticuerpo M200 inhibe la proliferación de células HUVEC a través de un mecanismo que solapa el del anticuerpo anti-VEGF HuMV833 pero que sin embargo también es distinto en diversos aspectos.

EJEMPLO 4 – Efecto del M200 sobre la Supervivencia de Células Endoteliales

[0167] Este ejemplo describe el efecto del anticuerpo M200 sobre la supervivencia de las células endoteliales.

[0168] Los anticuerpos que reaccionan ante ciertas integrinas son capaces de inducir la muerte celular in vitro e in vivo. Recientemente, se demostró que un mAb de bloqueo de la función α5β1 promovía la apoptosis en células humanas endoteliales cultivadas, medida mediante tinción con anexina V clivaje mediante caspasa-3 fragmentación del ADN (Kim, et al., 2002).

[0169] Una tinción similar con anexina V se llevó a cabo en las células HUVEC cultivadas con exposición a M200 o HuMV833. Las células HUVEC cultivadas en un medio libre de suero (que contenga VEGF y bFGF, excepto en los casos indicados) se trataron en presencia de M200 (10 µg/ml), HuMV833 (10µg/ml) o estaurosporina (5 µM; control positivo). La muerte celular se evaluó mediante tinción con Anexina V-alexa488 (verde), y Hoechst 33258 (azul), seguido de microscopía de fluorescencia. (las imágenes de microscopía de fluorescencia mostradas en la figura 16A). Paralelamente, la muerte celular fue seguida de citometría de caudal a las 16 horas del depósito en la placa (figura 16B).

[0170] Como se muestra en las figuras 16A y 16B, las células tratadas con M200 mostraron una mayor tinción con 5 anexina V mientras que las tratadas con HuMV833 no lo hicieron. De este modo, el M200, al contrario que el HuMV833, parece promover la muerte celular en las células endoteliales.

[0171] Además, se comparó el efecto del M200 para las células senescentes y proliferantes. Se depositaron células HUVEC en una placa, permitiéndose que proliferasen en presencia de suero y factores de crecimiento (panel medio), que creciesen hasta la confluencia (panel izquierdo) o privándolas de suero y factores de crecimiento tras el

10 crecimiento de la fase logarítmica (panel derecho). En cada caso, las células se dejaron sin tratar (control) o se incubaron con M200 (10 µg/ml) o estaurosporina (5 µM) durante 16 horas, tiñéndose con Anexina V-alexa488.

[0172] Como se muestra en la figura 17, el M200 indujo la muerte celular en las células HUVEC en fase de división, pero no en las HUVEC llevadas a la senescencia por inhibición de contacto o retirada del factor de crecimiento. Estos resultados sugieren que el M200 promueve selectivamente la muerte celular en células endoteliales en

15 proliferación.

EJEMPLO 5 – inhibición de la formación de tubos In vitro por el F200

[0173] Este ejemplo describe un ensayo de formación de tubos que demuestra la inhibición in vitro de la angiogénesis por el F200. Las células HUVECs se mezclaron como una única suspensión celular en un coágulo de fibrina (preparado a partir de fibrinogen y a-thrombin) junto con suero humano y una mezcla de factores de 20 crecimiento (el ensayo de la figura 18A incluía medios complementados con 0.01 mg/ml de rTGF-α y 0.1mg/m1 de VEGF y HGF; el ensayo de la Figura 18B incluía medios complementados con 0.1mg/m1 de VEGF únicamente; y el ensayo de la figura 18C incluía medios complementados con 0.1 mg/ml de bFGF solamente). Se añadió el anticuerpo de prueba a los medios, a las concentraciones indicadas. A lo largo de un período de 96 horas, las células HUVECs de una sola célula comenzaron a migrar, a establecer contacto con otras células y con la matriz, a

25 formar cordones y, por último, estructuras tubulares tridimensionales. El alcance de la formación de tubos se cuantificó al cabo de 6 días mediante fijación con formaldehído al 4% y tinción con Alexa488—faloidina. Como muestran las imágenes y gráficos de fluorescencia media mostrados en la figura 18, la formación de tubos resultó inhibida significativamente por la presencia de F200. La inhibición en la formación de tubos se observó en presencia de los factores de crecimiento, VEGF, HGF y una mezcla de ambos con rTGFα.

30 EJEMPLO 6 – Inhibición In vivo de la Neovascularización coroidal en ojos de Primates mediante M200 y F200

[0174] Este ejemplo describe el efecto del M200 y el Fab F200 sobre el desarrollo vascular tras la lesión mediante láser de las máculas de los ojos de los primates. La literatura de referencia, que describe estudios de la Neovascularización coroidal en modelos animales incluye: S. Ryan, The Development of an Experimental Model of Subretinal Neovascularización in Disciform Macular Degeneration,” Transactions of the American Ophthalmological

35 Society 77: 707-745 (1979); S.J. Ryan, “Subretinal Neovascularización: Natural History of an Experimental Model,” Archives of Ophthalmology 100: 1804-1809 (1982); M.J. Tolentino et al., “Angiography of Fluoresceinated Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Anticuerpo and Dextrans in Experimental Choroidal Neovascularización,” Archives of Ophthalmology 118: 78-84 (2000).

A. Diseño experimental

40 [0175] Se asignó un total de 8 monos a los grupos de tratamiento, como se muestra en la tabla siguiente.

Grupo

N Elemento de prueba (ojo izquierdo) Elemento de prueba (ojo derecho)

1

2 Sin tratar Tampón (50 μl)

2

2

M200 (1 μM; 50μL) M200 (1 μM; 50μL)

3

2 F200 (1 μM; 50μL) F200 (1 μM; 50μL)

4

1 Control (Rituxan 1 μM; 50μL) M200 (1 μM; 50μL)

5

1 Control (Rituxan 1 μM; 50μL)) F200 (1 μM; 50μL)

[0176] El M200 y el F200 se administraron en una solución tampón de transporte. El Rituxan se utilizó como dosis de control. La Neovascularización coroidal (CNV) se indujo el día 1 mediante tratamiento por láser de la mácula de 45 ambos ojos de cada animal, como se describe seguidamente. Se administró a todos los animales unas dosis con

M200, F200, o la solución de Control de acuerdo con las indicaciones de la tabla, una vez a la semana durante 4 semanas. El primer día de dosificación se denominó Día 1. Se evaluaron los cambios experimentados por los animales en términos de síntomas clínicos, peso corporal y otros parámetros, utilizando técnicas estándar. Todos los animales se sometieron a eutanasia el día 28.

5 B. Inducción por láser de la neovascularización coroidal (CNV)

[0177] Los animales ayunaron durante la noche anterior al tratamiento con láser y la dosificación. Se sedó a los animales con ketamina HCI (por vía intramuscular, hasta que se produjo el efecto) seguido de una combinación de ketamina intravenosa y diazepam (hasta que se produjo el efecto) para el tratamiento por láser y el procedimiento de dosificación.

10 [0178] Se indujo la neovascularización coroidal (CNV) mediante tratamiento por láser de las máculas de ambos ojos. Las lesiones se causaron en la mácula siguiendo un patrón de rejilla de nueve puntos estándar con un fotocoagulador láser [OcuLight GL (532 nm) Laser Photo-coagulator con un adaptador portátil IRIS Medical® Portable Slit Lamp Adaptor]. Los puntos láser realizados en el ojo derecho fueron un reflejo de los realizados en el ojo izquierdo. Los parámetros láser aproximados fueron los siguientes: tamaño de punto: 50 a 100 µm; potencia del

15 láser: 300-700 milivatios; tiempo de exposición: 0,1 segundo. Los parámetros de cada animal se registraron el día en que se realizó el tratamiento láser. Se tomaron fotografías utilizando una cámara retinal TRC-50EX y/o una lámpara de hendidura SL-4ED con una cámara digital con CCD.

C. Dosificación

[0179] Se efectuó una inyección intravítrea de inmunoglobulina (ensayo) o del artículo de control en cada ojo. La

20 inyección se efectuó el día 1 inmediatamente después del tratamiento por láser. Antes de administrar la dosis, se instiló un agente midriático (tropicamida al 1%) en cada ojo. Los ojos se lavaron con una solución antiséptica diluida (solución de Betadine al 5% o equivalente), y se eliminó el antiséptico por lavado con solución salina estéril al 0.9% (o equivalente) y se instilaron dos gotas de un anestésico tópico (proparacaína o equivalente) en el ojo. Se insertó un espéculo de párpado para mantener los párpados abiertos durante el procedimiento, y se retrajo el globo ocular.

25 La aguja de la jeringa de la dosis se pasó a través de la esclerótica y la pars plana aproximadamente a 4 mm por detrás del limbus. La aguja se orientó por detrás de la lente hacia la membrana vítrea media. El artículo del ensayo se inyectó lentamente en el vítreo. Se utilizaron fórceps para sujetar la conjuntiva que rodeaba la jeringuilla con anterioridad a la retirada de la aguja. La conjuntiva se mantuvo sujeta con los fórceps durante un corto período con posterioridad a la retirada de la aguja. A continuación se retiró el espéculo de párpado. Inmediatamente después de

30 la dosis se examinaron los ojos con un oftalmoscopio indirecto para identificar cualquier problema visible tras la dosis. Puede dispensarse un antibiótico tópico en cada ojo (Tobrex® o equivalente) para impedir la infección inmediatamente después de la dosis y un día después de la dosis. Los animales se devolvieron a sus jaulas cuando se recuperaron suficientemente de la anestesia.

[0180] La dosificación se realizó con carácter semanal siguiendo la programación de la siguiente tabla:

Grupo Nº

Número de animales (M/H) Artículo de prueba (ojo izquierdo) Nivel de dosis Artículo de prueba (ojo derecho) Nivel de dosis Volumen de la dosis (μL/ojo)

1

1/1 Ninguno N/A Tampón 0 50

2

1/1 M200 300µg M200 300µg 50

3

1/1 F200 100µg F200 100µg 50

4

1/0 Control 100µg M200 300µg 50

5

1/0 Control 100µg F200 100µg 50

[0181] Los niveles de dosis expresados en gramos se refieren a cada ojo. Suponiendo un volumen medio por ojo de 2ml, la dosis por ojo fue de ~150µg/ml M200 y ~50µg/m1 F200. En ambos casos, la concentración molare de M200 o F200 era de 11 µM.

D. Control de la inhibición de la angiogénesis

40 [0182] Se recurrió a la oftalmoscopia indirecta para examinar la cámara posterior, y la biomicroscopía para examinar el segmento anterior del ojo. La evaluación numérica de los ojos se hizo de acuerdo con los procedimientos estándar (Robert B. Hackett y T.O. McDonald. 1996, Dermatotoxicology. 5th Edition. Ed. By F.B. Marzulli y H.I. Maibach. Hemisphere Publishing Corp., Washington, D.C).

[0183] La angiografía por fluoresceína se llevó a cabo con anterioridad a la formación de la lesión y a los 5, 12, 19 y

45 26 días con posterioridad a las lesiones y el tratamiento inicial. Puede administrarse una combinación de ketamina y diazepam (aproximadamente 10 mg/kg de ketamina y 0.5 mg/kg de diazepam, por vía intravenosa). Se utilizaron espéculos de párpado para retraer los párpados. Con anterioridad a la administración de la tinción de fluoresceína, se colocó a cada uno de los animales en una silla oftalmológica que mantiene la posición de la cabeza durante la fotografía. Se tomaron las fotografías utilizando una cámara de fondo de ojo (Cámara Retina TRC-50EX). Las imágenes se capturaron utilizando el sistema TOPCON IMAGEnetTM. La tinción de fluoresceína (10% fluoresceína de sodio, aproximadamente 0.1 ml/kg) se inyectó a través de una vena cefálica o de la safena. Se tomaron fotos, en color y en blanco y negro, a diversos intervalos con posterioridad a la inyección de la tinción, incluyendo la fase arterial, la fase arteriovenosa temprana y diversas fases arteriovenosas tardías para supervisar las fugas de fluoresceína asociadas a las lesiones CNV. Las imágenes no modificadas pueden transferirse a discos compactos para su almacenamiento y transporte.

[0184] Asimismo, los ojos pueden fotografiarse (Cámara Retina TRC-50EX y/o Lámpara de hendidura SL-4ED, con cámara digital CCD). Los animales pueden estar ligeramente sedados con ketamina HCI con anterioridad a este procedimiento, y se instilaron unas gotas de una solución midriática (normalmente, tropicamida al 1%) en cada ojo para facilitar el examen.

E. Resultados

[0185] El análisis de las imágenes de la angiografía por fluoresceína generadas utilizando estos grupos indica claramente la presencia de lesiones CNV los días 13 y 20. La CNV persistió hasta el día 28 en los grupos de control (por ejemplo grupos 1, 4 (ojo izquierdo) y 5 (ojo izquierdo)). Por el contrario, la CNV se redujo significativamente los ojos tratados con M200 y F200 (por ejemplo, grupos 2, 3, 4 (ojo derecho) y 5 (ojo derecho)). Como se muestra en la figura 19, el día 20, un ojo tratado con M200 mostraba pocos síntomas de CNV en comparación con un ojo tratado solamente con el producto de control.

[0186] Las figuras 20 a 25 muestran el efecto de M200 y F200 sobre la CNV en el ojo derecho de un mono frente al efecto de la solución de control en el ojo izquierdo del mismo mono los días 13, 20 y 27. Puede observarse una importante reducción de la CNV en los ojos del paciente tratado con M200 o F200, comparado con los ojos no tratados. La reducción relativa de la CNV parece ser superior en los individuos tratados con F200. No obstante, se cree que esta aparente diferencia se debe a la fuga del M200 a través del flujo sanguíneo en dirección al ojo no tratado del paciente. Es decir, el tratamiento con M200 del ojo derecho del paciente también inhibe la CNV en el ojo izquierdo, con el resultado de una diferencia menos aparente entre los dos ojos. Por el contrario, con el M200 no se producen fugas hacia el ojo no tratado, con lo que se aprecia una diferencia mucho mayor en la inhibición de la CNV entre los dos ojos del paciente.

EJEMPLO 7 – Afinidad de unión de M200, F200 y las Variantes Humanizadas

A. Análisis cinéticos por resonancia de plasmón superficial

[0187] Las afinidades entre AAB1/B2Fc y IIA1, M200 o F200 se analizaron utilizando BlAcore 3000 y 2000 (BlAcore, Suecia). IIA1, M200 o F200 se inmovilizaron en el chip Pioneer F1 utilizando el kit estándar de acoplamiento de aminas (BlAcore). La resonancia del plasmón superficial se midió a un caudal de 50µl/min a 24° C. La inyección de AAB1/B2Fc (fase de asociación) tiene lugar a lo largo de 180 segundos. La disociación se supervisó posteriormente a lo largo de tres horas. La cinética de los enlaces se calculó a partir de los datos adquiridos a cinco concentraciones diferentes del analito (320nM, 160nM, 80nM, 40nM, 20nM), utilizando el programa de evaluación BlA. Se aplicó una doble referencia para eliminar las respuestas de la superficie de referencia y del producto de control exclusivamente de tipo tampón. KD se obtuvo ajustando simultáneamente las fases de asociación y disociación del sensograma a partir de las series de concentraciones de analito. En el caso de M200 se determinó que KD era de 0.367 ± 0.132 nM. Para F200 se determinó que KD era de 0.332 ± 0.065 nM.

B. Afinidad de HuM200 mediante ensayo competitivo ELISA

[0188] Pueden llevarse a cabo pruebas competitivas de enlaces ELISA para determinar la afinidad de enlace del HuM200 con respecto a IIA1 y M200.

[0189] Los pocillos de 96 placas de pocillo ELISA (Placa Nunc-Immuno MaxiSorp, NalgeNunc, Naperville, IL) se revistieron con 100 µl de 1.0 µg/ml de la proteína de fusión recombinante soluble integrina α5β1-Fc recombinante humana en una solución tampón 0.2 M de carbonato-bicarbonato de sodio (pH 9.4) durante una noche a 4° C. Después de lavarla con una solución tampón de lavado, (PBS con un 0.1% de Tween 20), los pocillos se bloquearon con 200 µl de la solución tampón de bloqueo Superblock Blocking Buffer (Pierce) durante 30 min y a continuación se lavaron con la solución de lavado Wash Buffer. Se aplicó una mezcla de anticuerpo biotinilado murino IIA1 (0.1 µg/ensayo) y de anticuerpo competidor (duplicados de series de 3 disoluciones dfe anticuerpos competidores, comenzando por 5 mg/ml) en una solución tampón ELISA (PBS con un 1% de BSA y 0,1% de Tween 20) a las placas ELISA para obtener un volumen final de 100 µl por pocillo. Las placas ELISA se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, y los pocillos se lavaron con Wash Buffer. Posteriormente se aplicó a cada pocillo 100 µl de streptadivina 1/1,000-diluida y HRP-conjugada (Pierce, Rockford, IL) en la solución tampón ELISA. Tras incubar durante 0,5 horas a temperatura ambiente y lavarse con Wash Buffer, añadiéndose a cada pocillo 100 µl de sustrato TMB. Se leyó la absorbencia a 450 nm, utilizando un lector de microplacas VERSAmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). La concentración final del competidor en la reacción se trazó frente a la absorbencia a 450 nm.

[0190] HuM200 comprende las secuencias de aminoácido de cadena ligera y cadena pesada mostradas en la figura 13 (SEQ ID NOS: 31 y 32). HuM200 (también denominado HuM200-G4) incluye una región constante de un IgG4. Una segunda versión humanizada del M200, HuM200-g2m3G incluye los mismos dominios variables que HuM200 pero incluye una región constante de IgG2.

[0191] Como se aprecia en la figura 26, las dos versiones humanizadas del anticuerpo M200, HuM200-G4 y HuM200-g2m3G presentan una curva de afinidad de unión casi idéntica a la de M200. Además, HuM200-G4 y HuM200-g2m3G tiene unos valores IC50 de 131.8 µg/ml y 102.8 µg/ml, respectivamente. Estos valores son comparables a los observados para M200 (106.3 µg/ml), y ligeramente superiores a los de IIA1 (79.1 µg/ml).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1, que comprende:

   -

   una región de cadena pesada variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 25, 28, y 31 según se define respectivamente en las figuras 10, 11, y 13; y

   -

   una región de cadena ligera variable con una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 26 y 32, según se definen en las figuras 10 y 13, respectivamente.

2. 2.

   Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde la región de cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO: 25 según se define en la figura 10 y la región de cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO: 26 según se define en la figura 10.

3. 3.

   Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde la región de cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO: 28 según se define en la figura 11 y la región de cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO: 26 según se define en la figura 10.

4. 4.

   Anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde la región de cadena pesada variable comprende la SEQ ID NO: 31 según se define en la figura 13 y la región de cadena ligera variable comprende la SEQ ID NO: 32 según se define en la figura 13.

5. 5.

   Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la integrina anti-α5β1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. 6.

   Composición farmacéutica según la reivindicación 5 para su utilización en el tratamiento de la neovascularización coroidal, la retinopatía diabética, la artritis reumatoide y los tumores neoplásicos.

7. 7.

   Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para las utilizaciones indicadas en la reivindicación 6, donde el tumor neoplásico se selecciona entre el grupo formado por los tumores benignos y los tumores malignos.

8. 8.

   Composición farmacéutica según la reivindicación 7 para las utilizaciones indicadas en la reivindicación 7, donde el tumor benigno se selecciona de entre el grupo formado por el hemangioma, el glioma y el teratoma.

9. 9.

   Composición farmacéutica según la reivindicación 7 para las utilizaciones indicadas en la reivindicación 7, donde el tumor maligno se selecciona de entre el grupo formado por el carcinoma, el sarcoma, el glioblastoma, el astrocitoma, el neuroblastoma y el retinoblastoma.

10. 10.

    Composición farmacéutica según las reivindicaciones 6 y 7 para las utilizaciones indicadas en las reivindicaciones 6 y 7, donde la composición ha de administrarse mediante inyección intravenosa.

11. 11.

    Composición farmacéutica según la reivindicación 6 para su utilización en el tratamiento de la neovascularización coroidal y la retinopatía diabética, donde la composición ha de administrarse mediante inyección intravítrea.

12. 12.

    Composición farmacéutica según la reivindicación 5 para su utilización en el tratamiento de la neovascularización coroidal de la mácula del ojo.

13. 13.

    Ácido nucleico que codifica un polipéptido que codifica las secuencias de aminoácidos de cadenas ligera y pesada del anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, comprendiendo dicho polipéptido secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 25, 26, 28, 31 y 32, donde el polipéptido comprende las SEQ ID NOs: 26 y 28, SEQ ID NOs: 25 y 26 o SEQ ID NOs: 31 y 32, donde las SEQ ID NOs: 25 y 26 se definen en la figura 10, la SEQ ID NO: 28 se define en la figura 11, y las SEQ ID NOs: 31 y 32 se definen respectivamente en la figura 13.

14. 14.

    Vector de expresión que comprende los ácidos nucleicos que codifican las regiones de cadena pesada y ligera del anticuerpo quimérico o humanizado de integrina anti-α5β1 conforme a la reivindicación 1, donde las secuencias se seleccionan entre los grupos consistentes en las SEQ ID NOs: 23, 24, 27, 29 y 30, y las SEQ ID NOs: 23 y 24 como se definen en la figura 9, la SEQ ID NO: 27 como se define en la figura 11, y las SEQ ID NOs: 29 y 30 como se definen en la figura 12, respectivamente.

15. 15.

    Célula transformada mediante el vector de expresión conforme a la reivindicación 14.

    Figura 1

    Figura 2

    A: Secuencias IIA1 VH

    B: Secuencias IIA1 VL

    Figura 3 A: Secuencias del anticuerpo 200-4 VH

    B: Secuencias del anticuerpo 200-4 VL

    Figura 4 A: Secuencias del M200 VH

    B: Secuencias del M200 VL

    Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8

    SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA PESADA DEL M200 (SEQ ID NO.: 23)

    SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA LIGERA DEL M200 (SEQ ID NO.: 24)

    Figura 9

    SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA PESADA DEL M200 (SEQ ID NO.: 25)

    SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA LIGERA DEL M200 (SEQ ID NO.: 26)

    Figura10

    SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA PESADA DEL F200 (SEQ ID NO.: 27)

    SECUENCIA SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA PESADA DEL F200 (SEQ ID NO.: 28)

    Figura 11

    SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA PESADA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 29)

    SECUENCIA COMPLETA DEL ADN DE CADENA LIGERA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 30)

    Figura 12

    SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA PESADA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 31)

    SECUENCIA COMPLETA DEL AMINOÁCIDO DE CADENA LIGERA DEL huM200 (SEQ ID NO.: 32)

    Figura 13

    Definido: VEGF únicamente

    Definido: bFGF únicamente

    Definido: VEGF + bFGF

    Figura 14

    fibronectina poli-L-lisina

    A.

    Visualización de células positivas de Anexina V por inmunofluorescencia

    A.

    Cuantificación de células positivas de Anexina V por citometría de flujo

    Modelo de angiogénesis in Vitro con células HUVEC

    Fluorescenc ia media

    Fluorescencia media

    Fluorescenc ia media

    Tratamientos

    Tratamientos

    Tratamientos

    Control F200Control F200Control F200(EOS 200-4Fab) (EOS 200-4Fab) (EOS 200-4Fab)

    Se añadA.en rTGFα, VEGA y HGF B. Se añade tan sólo VEGF C. Se añade tan sólo HGF

    Figura 18

    A. Control (rituxano)

    B. Tratado con M200

    Día 20

    Día 20

    Figura 19

    A. Control (ojo izquierdo)

    B. M200 (Ojo derecho)

    Día 13

    Día 13

    Figura 20

    A. Control (ojo izquierdo)

    B. M200 (Ojo derecho)

    Día 20

    Día 20

    Figura 21

    A. Control (ojo izquierdo)

    B. M200 (Ojo derecho)

    Día 27

    Día 27

    Figura 22

    A. Control (ojo izquierdo)

    B. F200 (Ojo derecho)

    Día 13

    Día 13

    Figura 23

    A. Control (ojo izquierdo)

    B. F200 (Ojo derecho)

    Día 20

    Día 20

    Figura 24

    A. Control (ojo izquierdo)

    B. F200 (Ojo derecho)

    Día 27

    Día 20

    Figura 25

    Ensayo Elisa Competitivo 112103 Figura 26

    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

    La lista de referencias citada por el solicitante lo es solamente para utilidad del lector, no formando parte de los documentos de patente europeos. Aún cuando las referencias han sido cuidadosamente recopiladas, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.

    Documentos de patente citado en la descripción

    •

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