ES2388227B2 - Procedimiento para la identificación de especies de mejillón del género mytilus. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la identificación de espacios de mejillón del género Mytilu. El procedimiento de la invención permite diferenciar los mejillones del género Mytilus por el patrón electroforético observado en un gel de poliacrilamida tras la amplificación por PCR de un fragmento de la región que codifica la proteína polifenólica del pie empleando ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y la amplificación por PCR se lleva a cabo con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.#El trío de cebadores degenerados a utilizar con el procedimiento de la presente invención son aquellos que se identifican con las siguientes secuencias: Myti-A 5?-CATCWTACAAASCTATTAAgACAAC; Myti-B 5'-TgCTggATAACTTggCTTTg, Myti-C 5'-ggTTTATATgTTgggggATAAgTAg, siendo S equivalente a C o a G y W equivalente a T o a A.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACiÓN DE ESPECIES DE MEJILLÓN
DEL GÉNERO MYTILUS
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación de especies de mejillón del género Mytilus, siendo de aplicación en la industria alimentaria para la detección y autentificación de especies de mejillón.
Más en particular, la presente invención se refiere a un procedimiento sencillo para identificar especies de mejillón del género Mytilus, más específicamente de las especies M. californianus, M. coruscus, M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus, así como para la identificación de las combinaciones híbridas de cada una de estas especies, basándose el procedimiento en el análisis de la secuencia de gen que codifica la proteína polifenólica del pie del mejillón. Para lo cual, se emplea ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y se lleva a cabo una amplificación por PCR con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.
Tradicionalmente, la identificación de especies en productos de la pesca y de la acuicultura se ha fundamentado en el análisis de las características morfológicas de tales productos, características que a menudo muestran gran plasticidad debido a que están sujetas a influencias ambientales.
En el caso de los moluscos bivalvos y en concreto de los mejillones, la información morfológica proviene en buena parte de las conchas, por lo que, en productos manufacturados o procesados, la identificación se ve muy dificultada
o incluso impedida por la pérdida de las mismas, lo que posibilita la aparición de fraudes respecto a la sustitución de unas especies por otras de menor valor.
La explotación de mejillones en países extracomunitarios se ha visto incrementada enormemente en los últimos años y con ella se han multiplicado las importaciones de mejillón de las especies del género Mytilus distintas de Mytilus galloprovincialis (especie producida en España), pero de elevada similitud morfológica: M. californianus, M. edulis, M. trossulus, M. chilensis y M. coruscus. Todo ello ha generado la necesidad de desarrollar técnicas y procedimientos que permitan la identificación unívoca de las especies comercializadas para garantizar el cumplimiento de las normativas de comercialización vigente y evitar fraudes al consumidor.
Ante esta necesidad, en los últimos años, en los productos de la pesca y de la acuicultura, se han empezado a aplicar métodos que se fundamentan en el estudio del ADN, ya que, a diferencia de lo que ocurre con otras biomoléculas como las proteínas, el ADN es una molécula más resistente a la degradación cuando se aplican tratamientos fisicoquímicos durante el procesado (calor, presión, etc.); se encuentra presente en todos los tejidos de los organismos y no muestra una expresión diferencial según el estadía de desarrollo del organismo (Martínez, 1. y col., 2005. FAO, Fisheries Technical Paper. N° 455: 73p).
Los métodos para la identificación de especies basados en ADN generalmente hacen uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante el diseño de cebadores apropiados se pueden amplificar directamente tramos de ADN que muestran variantes de longitud o bien se pueden amplificar series diferentes de fragmentos. En otros casos, el producto amplificado puede analizarse por diversos métodos para detectar polimorfismos. Entre éstos se incluye la secuenciación, la digestión con enzimas de restricción o el análisis SSCP (polimorfismo conformacional de cadena sencilla). No obstante, a la hora de aplicar cualquier técnica molecular debe tenerse en cuenta que el ADN extraído de productos manufacturados a menudo no excede el tamaño de unos pocos cientos de pares de bases.
En el caso de los mejillones, y en concreto de los pertenecientes al género Mytilus, el primer estudio diseñado para la búsqueda de marcadores moleculares para la identificación de las especies M. e dulis , M. galloprovincalis y
M. trossulus fue desarrollado por Inoue y col. (1995), que estudiaron la variabilidad de la proteína polifenólica del pie y diseñaron cebadores que producen fragmentos de ADN especie-específicos. En los años posteriores se realizaron diversos estudios en productos frescos que incluyeron más especies del género (Freire y coL, 2007. En: Genética y genómica en acuicultura, 115154).
No obstante y a pesar de la gran importancia comercial que tiene el mejillón, existen pocos trabajos en los que se haya estudiado la identificación de todas estas especies en productos procesados o manufacturados. En 2006, Santaclara y col. aplicaron los cebadores diseñados por Inoue y col. (1995) Me15 y Me16-en la diferenciación de M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus. En una primera etapa, los autores diferencian M. edulis y M. trossulus mediante un análisis de polimorfismo de longitud de un fragmento del gen que codifica la proteína polifenólica del pie y, en un paso posterior, diferencian M. galloprovincialis y M. chilensis mediante un análisis PCR-RFLP empleando la enzima de restricción Aci l.
La Patente ES 2 255 343, "Anticuerpos monoclonales de ratón y su aplicación en la identificación específica de larvas en O del mejillón Mytilus galloprovincialis", describe la obtención de dos hibridomas (HYB-M36.5 e HYBM22.8) productores de los anticuerpos monoclonales de ratón M36.5 y M22.8 a partir de ratones Balb/C inmunizados con larvas de mejillón de dos días de vida (en O) de la especie Mytilus galloprovincialis.
Sería por tanto deseable disponer de una técnica rápida, sencilla y fiable que permita identificar las distintas especies que se agrupan dentro del género Mytilus, tanto en producto fresco como en procesado y/o manufacturado.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es poner a disposición un procedimiento sencillo para identificar especies de mejillón del género Mytilus, más específicamente de las especies M. californianus, M. coruscus, M. chilensis,
M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus, así como para la identificación de
las combinaciones híbridas de cada una de estas especies, basándose el procedimiento en el análisis de la secuencia de gen que codifica la proteína polifenólica del pie del mejillón.
Para ello, se emplea ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y se lleva a cabo una amplificación por PCR con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.
Una de las novedades más desatacadas del procedimiento de la invención frente a los anteriormente descritos radica en el empleo simultáneo de tres cebadores nuevos para la amplificación con PCR de una región codificante del gen de la proteína polifenólica del pie.
Descripción de la invención
El objeto de la presente invención es poner a disposición un procedimiento sencillo para identificar especies de mejillón del género Mytilus, en concreto M. californianus, M. coruscus, M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus, así como para la identificación de las combinaciones híbridas de cada una de estas especies, donde el procedimiento se basa en el análisis de la secuencia de gen que codifica la proteína polifenólica del pie del mejillón mediante la utilización simultánea de tres nuevos cebadores nuevos para la amplificación con PCR de una región codificante del gen de la proteína polifenólica del pie.
Para ello, se emplea ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y la amplificación por PCR se lleva a cabo con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.
El procedimiento de la invención permite diferenciar los mejillones del género Mytilus por el patrón electroforético observado en un gel de poliacrilamida tras la amplificación por PCR de un fragmento de la región que codifica la proteína polifenólica del pie. Para ello, se emplea AON extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados y la amplificación por PCR se lleva a cabo con el mismo trío de cebadores en las seis especies, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.
El trío de cebadores degenerados a utilizar con el procedimiento de la presente invención son aquellos que se identifican con las siguientes secuencias:
Cebador 1: Myti-A 5'-CATCwrACAAASCTATTAAgACAAC (SEO ID NO 1);
Cebador 2: Myti-B 5'-TgCTggATAACTTggCTTTg (SEQ ID NO 2);
Cebador 3: Myti-C 5'-ggTTTATATgTTgggggATAAgTAg (SEO ID N03);
siendo S equivalente a C o a G y W equivalente a T o a A.
Cuando el cebador Myti-A está marcado en 5' con fluorescencia, la visualización de los fragmentos se realiza mediante el empleo de un equipo de secuenciación de AON.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Aplicación del protocolo PCR a seis especies de mejillón con los
cebadores Myti-A, Myti-B Y Myti-C y electroforesis en gel de
poliacrilamida al 10% (columna 1 y 2-Mytilus califomianus; 3 y 4
M. coruscus, 5 y 6-M. edulis, 7 y 8-M. trossulus, 9 y 10-M. chilensis, 11 y 12-M. galloprovincialis, M-marcadores de peso molecular gradual de 100 pares de bases (pb) desde 100 pb hasta
2.000 pb).
Figura 2: Patrón de bandas analizadas mediante secuenciador obtenidas mediante el empleo del trío de cebadores Myti-A, Myti-B Y Myti-C uno de ellos marcado con fluorescencia (Cy5).
Ejemplo de realización de la invención
El procedimiento sencillo para identificar las especies de mejillón del género Mytilus, M. califomianus, M. coruscus, M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus, así como para la identificación de las combinaciones híbridas de cada una de estas especies, se basa en el análisis de la secuencia de gen que codifica la proteína polifenólica del pie del mejillón empleando ADN extraído de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados, llevándose a cabo una amplificación por PCR, con el mismo trío de cebadores simultáneamente en las seis especies, de una región codificante del gen de la proteína polifenólica del pie, generando distintos patrones de bandas específicos para cada una de las especies.
1) Extracción de ADN
Para la extracción del ADN de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados de las especies de mejillón Mytilus califomianus, M. coruscus, M. chilensis, M. edulis, M. galloprovincialis y
M. trossulus se sigue el método descrito en Fernández-Tajes y col. (2007, Aquaculture Research, Vol. 38: 1205-1212.) con ciertas modificaciones.
Se pesan entre 30 y 50 mg de tejido de muestra procedente de ejemplares vivos, conservados en etanol, congelados, envasados en conserva o procesados en un tubo Eppendorf estéril de 1,5 mI. Se añaden al tubo 450 ~I de Tampón de lisis (1 M Tris-Base, 0,2M EDTA, 2,5% N-Lauryl-sarcosine) y 5 ~I de Proteinasa K (20 mg/ml) y se incuba a 60°C durante una noche. Transcurrido este tiempo se añaden 4 ~I de RNAsa (2mg/ml) y se incuba durante 1 h a 37°C. A continuación se añade un volumen de 150 ~I de acetato de amonio (3M pH 6,0) Y se mezcla por vortex, centrifugando a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos.
El sobrenadante se transfiere entonces a otro tubo Eppendorf estéril, al que se añaden 400 !JI de una solución fenal-cloroformo-alcohol isoamílico
(25:24: 1). Tras lavado durante 5 minutos en noria, se vuelve a centrifugar a
13.000 r.p.m. durante 5 minutos y se transfiere el sobrenadante a otro tubo Eppendorf estéril. A este sobrenadante se añade un volumen de isopropanol frío que se corresponde con el 80% de su volumen y se procede a mezclar por inmersión del tubo, centrifugando a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos. Entonces se elimina el sobrenadante y se añaden 400 !JI de etanol 70° frío. Tras lavado durante una hora en noria, se centrifuga a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos y se elimina el sobrenadante. Por último, se seca el AON así obtenido y se resuspende en 100 !JI de agua estéril.
1) Amplificación mediante PCR del fragmento de AON que codifica para la proteína polifenólica del pie en los mejillones
Para la amplificación PCR del fragmento de AON que codifica para la proteína polifenólica del pie se emplea un único trío de cebadores a una concentración 0,2 !JM:
Cebador 1: Myti-A 5'-CATCWTACAAASCTATTAAgACAAC (SEO ID NO 1)
Cebador 2: Myti-B 5'-TgCTggATAACTTggCTTTg (SEO ID NO 2),
Cebador 3: Myti-C 5'-ggTTTATATgTTgggggATAAgTAg (SEO ID NO 3),
siendo S equivalente a C o a G y W equivalente a T o a A.
La amplificación por PCR se realiza en un volumen final de 25 !JI, conteniendo 25 ng de AON, 2,5 !JI de buffer10X (con el magnesio incluido), dNTP 200 !JM, 0,2 !JM de cada cebador, 1 U de la enzima Taq polimerasa. El protocolo de la PCR se ejecutará de acuerdo con el siguiente procedimiento: desnaturalización inicial de 4 minutos a 95°C, seguida de 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos, con un paso final de elongación de 72°C durante 10 minutos.
Los resultados de estos pasos de procedimiento 1) Y 2) se muestran en la figura 1.
3) Electroforesis en gel de poliacrilamida para la separación de los fragmentos amplificados
A continuación se lleva a cabo la electroforesis de los productos de la PCR sobre un gel de poliacrilamida al 10%. Los fragmentos amplificados se visualizan tras tinción con bromuro de etidio bajo iluminación con luz ultravioleta.
Una variante de este método, en la que se evita el empleo de bromuro de etidio, consiste en emplear para la PCR uno de los cebadores marcados con fluorescencia de tal forma que la visualización de los fragmentos amplificados y sometidos a electroforesis se realiza mediante un secuenciador de ADN. En el presente procedimiento, cuando el cebador Myti-A está marcado en 5' con fluorescencia, la visualización de los fragmentos se realiza mediante el empleo de un equipo de secuenciación de ADN.
Como resultado de la aplicación del procedimiento de la presente invención se obtiene el patrón de bandas mostrado en la figura 2, analizadas mediante secuenciador, obtenidas mediante el empleo del trío de cebadores Myti-A, Myti-B Y Myti-C, uno de ellos marcado con fluorescencia (Cy5).
Las distintas especies de mejillón se distinguen por el distinto patrón de bandas amplificadas, a modo de código de barras específico para cada especie. Las diferencias de tamaño de los fragmentos amplificados son apreciables en un gel de poliacrilamida al 10%. El procedimiento desarrollado no depende del ciclo vital de los organismos y es válido para productos frescos, procesados y manufacturados.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Procedimiento para la identificación de especies de mejillón del género
    Mytilus que comprende etapas de extracción de ADN, amplificación de la
    región que codifica para la proteína polifenólica del pie mediante PCR,
    5
    análisis de los productos amplificados y visualización de los productos
    digeridos caracterizado porque en
    la etapa de amplificación de la de la
    región que codifica para la proteína polifenólica del pie mediante PCR se
    utiliza el siguiente trío de cebadores degenerados identificados con
    las
    secuencias: Cebador 1 Myti-A de SEa ID NO 1, Cebador 2 Myti-B DE
    10
    SEa ID NO 2 Y Cebador 3 Myti-C se SEa ID NO 3.
  2. 2.
    Procedimiento para la identificación de especies de mejillón del género
    Mytilus según la reivindicación 1 caracterizado
    porque para la PCR se
    emplea el cebador Myti-A marcado en 5' con fluorescencia de tal forma
    que
    la visualización de los fragmentos amplificados y sometidos a
    15
    electroforesis se realiza mediante un secuenciador de ADN.
  3. 3.
    Procedimiento para la identificación de especies de mejillón del género
    Mytilus según la reivindicación 1, caracterizado porque las especies de
    mejillón identificadas son Mytilus californianus, Myfilus coruscus, Mytilus
    chilensis, Myfilus edulis, Myfilus galloprovincialis y Mytilus frossulus, así
    20
    como combinaciones híbridas de cada una de estas especies.
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