ES2389934T3

ES2389934T3 - Semillas

Info

Publication number: ES2389934T3
Application number: ES05717926T
Authority: ES
Inventors: Roderick Scott
Original assignee: University of Bath
Current assignee: University of Bath
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2005-03-07
Publication date: 2012-11-05
Anticipated expiration: 2025-03-07
Also published as: EP1723244A2; AU2011201954B2; WO2005085453A2; AR048027A1; US9534228B2; CA2558084C; WO2005085453A3; US20080052793A1; AU2011201954A1; CA2558084A1; AU2005219644A1; EP1723244B1; US20120159671A1

Abstract

Un procedimiento para modificar proliferación celular en los integumentos y/o revestimientos de semilla de unaplanta que comprende modular la expresión del gen mnt en la planta o material de propagación de planta.

Description

Semillas

Campo de la invención

La presente invención se refiere particularmente, aunque no exclusivamente, a procedimientos para modificar características tales como tamaño de semillas en plantas, especialmente plantas con flor, y a plantas y material de planta reproducible producido por los procedimientos. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico para su uso en tales procedimientos, así como a plantas modificadas y material de planta reproducible en sí mismo.

Antecedentes de la invención

La industria de las semillas puede dividirse en dos sectores comerciales de alto valor: semillas para cultivos de campo tales como maíz, semillas de aceite, remolacha azucarera y cereales, y semillas para verduras y flores. La mejora científica de plantas de cultivo ha pasado por una sucesión de innovaciones que conducen al desarrollo de variedades híbridas de muchos cultivos y, más recientemente, a la introducción de cultivos genéticamente mejorados. El mercado de las semillas comerciales a nivel mundial se valora en aproximadamente 30.000 millones de dólares (Federación Internacional de Semillas).

1. Importancia del tamaño de las semillas

El rendimiento en plantas de cultivo en las que la semilla es el producto cosechado se define habitualmente como peso de semilla cosechada por unidad de área (Duvick, 1992). En consecuencia, el peso de las semillas individuales se considera un determinante principal del rendimiento. El aumento del tamaño de semillas es deseable debido a que puede aumentar el rendimiento total (Reynolds y col., 2001). También hay pruebas de que el tamaño de semillas (peso) se correlaciona positivamente con varios componentes de la “calidad de las semillas” tales como el porcentaje de germinación (Schaal, 1980; Alexander y Wulff, 1985; Guberac y col, 1998); tiempo hasta la aparición (Winn, 1985; Wulff, 1986); durabilidad (supervivencia en condiciones de crecimiento adversas) (Krannitz y col, 1991; Manga y Yadav, 1995); y tasa de crecimiento (Marshall, 1986). La calidad de la semilla es un factor importante en el coste de producción de lotes de semillas comerciales puesto que estas deben ensayarse antes de su venta. En consecuencia, el aumento del peso de semilla total, incluso sin aumentos de rendimientos de semillas totales, puede tener beneficios económicos a través de mejoras en la calidad de la semilla. Por el contrario, la reducción del tamaño de las semillas también puede ser deseable en algunas circunstancias, por ejemplo facilitando la captación de agua requerida para germinación (Harper y col., 1970), o en plantas cultivadas por su fruto.

La modificación del tamaño de las semillas probablemente también mejore el rendimiento a través del aumento del “potencial de sumidero” de la semilla (es decir su capacidad para requerir nutrientes del parental de semilla), o el aumento del periodo en el que la semilla actúa como un sumidero fuerte. Está bien establecido que los requisitos de órganos sumidero tales como semillas tienen un control significativo sobre la tasa de fotosíntesis y el movimiento de los fotoasimilados desde la fuente a los tejidos sumidero (Patrick y Offler, 1995; Paul y Foyer, 2001). En el trigo, el parental de semilla puede proporcionar más nutrientes de lo que son capaces de requerir las semillas en desarrollo durante los primeros 15-20 días después de la polinización (Austin, 1980). Por lo tanto modificaciones que permitan a las semillas extraer nutrientes más temprano en el desarrollo, por ejemplo acelerando el crecimiento de las semillas, permitirá que las semillas capturen recursos que de otro modo se perderían. También se ha propuesto un “equilibrio de fuente-sumidero mejorado que permita requisitos de sumidero más altos durante engrosamiento del grano” como un procedimiento para aumentar el rendimiento en trigo (Reynolds y col., 2001).

2. Composición de semillas

Las semillas maduras de plantas con flor consisten en tres componentes: el revestimiento de la semilla, que es de origen exclusivamente materno; y los dos productos de fertilización, embrión y endospermo, que tienen contribuciones genéticas maternas y paternas. Las semillas se desarrollan a partir de óvulos fertilizados. El desarrollo de los óvulos se ha descrito para muchas especies (Bouman, 1984), incluyendo Arabidopsis thaliana (Robinson-Beers y col., 1992; Schneitz y col., 1995). Las estructuras principales del óvulo maduro son: el saco embrionario, que contiene las células reproductoras femeninas (ovocito y célula central); la nucela, que rodea el saco embrionario al menos parcialmente; y los integumentos interior y exterior, que envuelven el saco embrionario y la nucela. Después de fertilización el embrión y el endospermo nutritivo se desarrollan dentro del saco embrionario mientras que los integumentos se diferencian al revestimiento de la semilla, que se expande para acomodar el endospermo y el embrión crecientes.

La mayoría de las plantas monocotiledóneas, por ejemplo cereales incluyendo maíz, trigo, arroz y cebada (véase Esau, 1965), producen semillas albuminosas, es decir, en la madurez contienen un embrión pequeño y un endospermo relativamente grande. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, por ejemplo Brassica napus, (colza), soja, cacahuete, Phaseolus vulgaris (por ejemplo alubia, judía blanca, frijol negro), Vicia faba (haba), Pisum sativum (guisante), Cicer aeietinum (garbanzo) y Lens culinaris (lenteja), producen semillas exalbuminosas, es decir, las semillas maduras carecen de endospermo. En tales semillas el embrión es grande y generalmente llena la mayor

parte del volumen de la semilla, y representa el peso casi completo de la semilla. En semillas exalbuminosas el endospermo es de naturaleza efímera y alcanza la madurez cuando el embrión es pequeño y altamente inmaduro (habitualmente etapa corazón/torpedo). El desarrollo embrionario habitualmente depende de la presencia del endospermo, que en general se acepta que actúa como una fuente de nutrición para el embrión.

3. Control del tamaño de las semillas

El control de tamaño de las semillas puede verse desde la perspectiva de (1) “desarrollo”, el alcance de la división y expansión celular en uno o más componentes de semilla (por ejemplo Reddy y Daynard, 1983; Swank y col, 1987; Scott y col., 1998; Garcia y col., 2003) o (2) “metabolismo”, actividad metabólica y transporte de nutrientes dentro de la semilla y entre la semilla y el parental de semilla (por ejemplo Weber y col., 1996, 1997). El desarrollo y el metabolismo son interdependientes: por ejemplo, la actividad invertasa (implicada en el transporte de hexosa) en el límite de los tejidos maternos y endospermo o saco embrionario se requiere para proliferación de endospermo en maíz (Cheng y col., 1996), y la alta actividad invertasa se correlaciona con aumento del número de células en el revestimiento de semilla de habas (Weber y col., 1996), embriones de leguminosas (Weber y col., 1997) y endospermo de cebada (Weschke y col., 2003). Las presentes investigaciones de los inventores se centran en los aspectos del desarrollo de control de tamaño de las semillas, aunque puede asumirse que también se correlacionarán cambios en la división celular/expansión en la semilla con cambios en la actividad metabólica y el flujo de nutrientes.

3a. Crecimiento de semillas conducido por endospermo

Varios estudios muestran una correlación entre el crecimiento del endospermo y el tamaño final de las semillas, por ejemplo en maíz (Lin, 1984; Jones y col., 1996), e incluso en la dicotiledónea Arabidopsis thaliana, que tiene un endospermo efímero (Scott y col., 1998; Garcia y col., 2003). El trabajo en el laboratorio de los inventores ha mostrado que la sobreproliferación del endospermo conduce a semillas grandes con embriones grandes, mientras que la inhibición de la proliferación del endospermo produce semillas pequeñas con embriones pequeños. Los inventores han manipulado la proliferación del endospermo y el tamaño de las semillas usando una diversidad de procedimientos, incluyendo modificaciones de la relación de cromosomas heredados paternos y maternos en el endospermo, estado de metilación de citosina de los parentales que contribuyen a la semilla y uso de la mutación fis3/fie (Scott y col., 1998; Adams y col., 2000; Vinkenoog y col., 2000). En estos experimentos los inventores han considerado que los cambios resultantes del crecimiento de las semillas están “conducidos por endospermo”, y los efectos sobre el embrión y el revestimiento de semillas son indirectos. Algunos de los experimentos de los inventores excluyeron específicamente un efecto directo sobre el crecimiento del revestimiento de las semillas debido a que el parental de la semilla era de tipo silvestre y solo se modificaron directamente los productos de fertilización: por ejemplo, en el caso de parentales de semilla diploide de tipo silvestre cruzados con parentales de polen tetraploide, que producen semillas grandes (Scott y col., 1998), o parentales de semillas de tipo silvestre cruzados con parentales de polen hipometilados por una construcción antisentido ADN METILTRANSFERASA 1, que produce semillas pequeñas (Adams y col., 2000). De forma similar, Garcia y col. (2003) describieron los mutantes haiku de Arabidopsis thaliana, que producen semillas pequeñas debido a la detención temprana de la proliferación del endospermo. Los autores también observaron una insuficiencia de la elongación celular después de fertilización en los integumentos de mutantes haiku, y concluyeron que este era un efecto indirecto del crecimiento limitado del endospermo.

3b Papel del revestimiento en el establecimiento del tamaño de las semillas

Alonso-Blanco y col. (1999) investigaron el tamaño de las semillas en plantas de tipo silvestre de dos accesos de Arabidopsis thaliana, Cvi y Ler: las semillas de la primera pesan 80% más que las semillas de la segunda y son 20% de longitud. En ambos accesos, los autores descubrieron que “el crecimiento del endospermo y el revestimiento de la semilla precedía al crecimiento del embrión, determinando la longitud final global del embrión y la semilla”. Descubrieron que la capa exterior del revestimiento de semilla madura tiene más células en Cvi que Ler, pero no investigaron ni comentaron sobre si estas células extra se formaron antes o después de la fertilización. Además, la inspección de los autores de óvulos no fertilizados maduros mostró que los óvulos en Ler eran ligeramente más largos que en Cvi, y por lo tanto los autores concluyeron que “las diferencias de tamaño de los óvulos no podían explicar la variación de tamaño de las semillas de Ler/Cvi finales”. Su conclusión principal global fue que “el tamaño mayor de semillas Cvi en comparación con Ler se debe principalmente al crecimiento más rápido y prolongado de los integumentos y del endospermo” (es decir después de fertilización); no abordaron la cuestión de si este crecimiento estaba conducido por los integumentos o por el endospermo. Los autores sugirieron que el número y tamaño de células finales en el revestimiento de semilla “puede determinarse durante el desarrollo del óvulo”, pero de forma significativa no hubo ninguna sugerencia de que un número mayor de células de integumento antes de la fertilización fuera responsable de un tamaño de semillas final mayor.

Garcia y col. (2005) examinaron cruces entre plantas mutantes o transgénicas de Arabidopsis que producen semillas pequeñas debido a la inhibición del crecimiento del endospermo o del crecimiento del integumento/revestimiento de semilla. Estos autores propusieron un modelo en el que el tamaño de las semillas se determina por una interacción recíproca entre el crecimiento del endospermo y elongación de células de integumento/revestimiento de la semilla. También informaron de que los genotipos con menos células en el integumento compensan aumentando la

elongación celular. Los autores concluyeron que “el número de células final en el integumento [revestimiento de semillas] se equilibra por elongación celular y no influye en el tamaño de la semilla”.

Jofuku y col. (2005) y Ohto y col. (2005) notificaron que las mutaciones en el gen APETALA2 (AP2) aumentan el tamaño de las semillas; Jofuku y col. (2005) también descubrieron que la supresión de la actividad de AP2 a través de cosupresión antisentido o sentido tenía el mismo efecto. Las semillas mutantes para ap2 tienen anomalías de revestimiento de semilla incluyendo células de integumento exterior grandes e irregulares, falta de mucílago e hipersensibilidad a decoloración; y se descubrió que el aumento del tamaño de las semillas era un efecto principalmente (Jofuku y col., 2005) o completamente (Ohto y col., 2005) materno. Sin embargo, ningún artículo investigó ninguna posible correlación entre (1) tamaño de las semillas y (2) número de células o cualquier otro aspecto de la morfología del integumento/revestimiento de semilla en mutantes de ap2 o transgénicos.

Weber y col. (1996) compararon el crecimiento del revestimiento de semillas en genotipos con semillas grandes y pequeñas de Vicia faba (haba). Descubrieron que los genotipos de semillas grandes contenían más células en el revestimiento de semillas a los 9 días después de la polinización, pero los números de células en los dos genotipos eran similares a los cuatro días después de polinización. Por lo tanto el número de células en los integumentos antes de fertilización no podía ser un factor en el tamaño de semillas final.

4. Publicaciones de patente relevantes

(i) Fischer y Mizukami (2003), ’Methods for altering organ mass in plants’, Solicitud de Patente de Estados Unidos 20030159180

Las mutaciones en el gen AINTEGUMENTA (ANT) de Arabidopsis thaliana evitan la formación de los integumentos (Klucher y col., 1996; Baker y col., 1997). Mizukami y Fischer (2000) describen el fenotipo de plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen ANT de tipo silvestre bajo el control del promotor 35S constitutivo. La expresión ectópica de ANT aumenta el tamaño de muchos órganos vegetales incluyendo semillas, además de provocar esterilidad masculina a través de insuficiencia de dehiscencia de las anteras. La mayoría de las plantas transgénicas también son estériles femeninas “debido a proliferación anormalmente prolongada de las células nucelares de la chalaza”. Sin embargo sobreexpresantes débiles pudieron generar semillas después de polinización manual con polen de tipo silvestre. “El fruto agrandado 35S::ANT incluyó semillas T2 que eran mayores de lo normal (no mostrado en la solicitud), debido a embriones agrandados”. El tamaño de óvulos no polinizados, y el número o tamaño de células en los integumentos/revestimiento de semillas, no se investigaron ni analizaron. El tamaño de semilla grande de las semillas 35S::ANT se atribuyó solamente al tamaño de la nucela y el embrión. La solicitud de patente de Estados Unidos Nº 20030159180 describe usos de un polipéptido de ANT modificado para alterar el tamaño de órganos vegetales incluyendo semillas. Se notificó que las plantas transgénicas tenían diversos grados de fertilidad que no se correlacionaban con tamaño de los órganos. No hubo investigación del efecto de expresar el polipéptido de ANT modificado en el crecimiento de integumento o revestimiento de semillas.

(ii) Jofuku y Okamuro (2001), ’Methods for improving seeds’, patente de Estados Unidos 6.329.567

Las mutaciones en el gen APETALA2 (AP2) aumenta el tamaño de las semillas (Okamuro y Jofuku, 1997). Las mutaciones tienen un efecto materno en el tamaño de las semillas pero el único fenotipo descrito para el integumento/revestimiento de semillas en mutantes ap2 es que las células de la capa exterior del revestimiento de semillas están agrandadas con una forma irregular, junto con algunas otras anomalías morfológicas (Jofuku y col., 1994). La patente de Estados Unidos Nº 6.329.567 describe procedimientos para modular la masa de las semillas usando transgenes AP2, pero esta patente no evalúa ningún efecto de los transgenes en los integumentos o el revestimiento de las semillas.

(iii) Lepiniec y col. (2003), ’Regulating nucleic acid for expressing a polynucleotide of interest specifically in the endothelium of a plant seed and uses thereof’, documento WO 03/012106 A2

El gen BANYULS (BAN) se expresa exclusivamente en la capa interior del integumento interior (esta capa también se denomina el endotelio) en desarrollo temprano de las semillas (etapa preglobular) (Devic y col., 1999). La solicitud de patente internacional WO 03/012106 A2 describe el uso del promotor de BAN para dirigir la expresión de diversos genes específicamente en la testa (la capa de revestimiento de semilla derivada del integumento interior). Los autores proponen usos tales como modificar la composición de taninos o fibras, o el equilibrio hormonal, pero no se presentaron o describieron casetes de expresión relevantes. También se propuso la modificación del tamaño de las semillas pero solamente en el contexto de reducción o ablación de semillas en cultivos de frutas. Se mostró que una construcción de promotor BAN::BARNASA producía ablación del endotelio.

(iv) Zinselmeier y col. (2000), ’Regulated expression of genes in plant seeds’, documento WO00/63401

La presente solicitud de patente se relaciona con la expresión de genes tales como ipt que “afectan metabólicamente a los niveles eficaces de citoquininas en semillas vegetales, así como en el tejido materno del que surgen tales semillas, incluyendo mazorcas en desarrollo, inflorescencias femeninas, ovarios, florecillas femeninas, aleurona, pedicelo y regiones formadoras de pedicelo”, y a plantas transgénicas con niveles potenciados de citoquinina que muestran “tamaño de semillas mejorado, reducción del aborto de grano del extremo, aumento de la

formación de semillas durante condiciones ambientales desfavorables, y estabilidad del rendimiento”. Un promotor de la nucela (la nucela es el tejido materno que rodea el saco embrionario e incluido dentro de los integumentos) está entre los sugeridos para dirigir los casetes de expresión, pero los integumentos no se mencionan específicamente en la solicitud de patente, ni se describe ningún casete de expresión específico de tejido materno. La divulgación de esta solicitud de patente se ocupa particularmente del maíz.

(v) Scott (2002), ’Modified plants’, documento WO/0109299

La presente solicitud de patente se refiere a procedimientos para controlar el tamaño del endospermo y desarrollo a través del uso de un gen de ADN METILTRANSFERASA 1 antisentido que reduce la mutilación de citosina. Como se describe en el documento WO01/09299, y en la Sección 3a, anterior, la modificación del estado de metilación de citosina de la semilla o parental de polen altera el tamaño de la semilla alterando la tasa y alcance de la proliferación del endospermo. Por lo tanto la divulgación de la presente solicitud de patente se refiere exclusivamente a crecimiento de semillas “conducida por endospermo”.

En resumen, los documentos de la técnica anterior no incluyen un entendimiento de que la alteración del tamaño de los integumentos específicamente a través de aumento del número de células antes de fertilización pudiera afectar al tamaño de las semillas después de fertilización. Un pequeño número de artículos publicados y solicitudes de patente comentan una posible relación entre el tamaño del revestimiento de semilla y el tamaño de la semilla pero no realizan una conexión entre (1) el crecimiento del integumento antes de la fertilización y (2) tamaño de la semilla final.

5. Crecimiento de semillas conducido por integumento

Los inventores se sorprendieron por lo tanto al descubrir en su laboratorio un mutante, denominado el mutante mnt1, que produce semillas más grandes a través de un efecto primario en los integumentos. Específicamente, los inventores observaron que la cavidad de la semilla (es decir el espacio dentro del saco embrionario después de la fertilización) es más larga de lo normal dando al embrión más espacio para crecer como resultado de un aumento del número de células en el integumento. Esto fue particularmente sorprendente a la vista de la investigación anterior mencionada en la Sección 3 a anterior que indicaba que los cambios en el crecimiento de las semillas eran “conducidos por endospermo”. También fue sorprendente a la vista del trabajo de Alonso-Blanco y col (1999) mencionado en la sección 3b anterior que no sugería que un aumento del número de células de integumentos condujera a un aumento del tamaño de las semillas; y también a la vista del trabajo de Weber y col 1999 que descubrieron números similares de células en el revestimiento de semillas en genotipos de semillas grandes y pequeñas de haba poco después de la fertilización; y también a la vista del trabajo de Garcia y col. (2005) que reivindicaron que “el número final de células en el integumento [revestimiento de semillas] se equilibra por elongación celular y no influye en el tamaño de la semilla”; y también a la vista del trabajo de Jofuku y col. (2005) y Ohto y col. (2005) que descubrieron un efecto materno de la mutación ap2 en el tamaño de las semillas pero no informaron de una correlación entre el número de células en los integumentos o en el revestimiento de semillas y el tamaño de la semilla final.

6. Aumento del diámetro del tallo en mutantes de mnt-1

El aumento del diámetro del tallo también es deseable en agricultura, puesto que puede conducir a un aumento de la biomasa vegetal, que a su vez puede aumentar el rendimiento (Reynolds y col., 2001). El aumento del diámetro del tallo y la biomasa también son deseables en ciertos cultivos tales como árboles y verduras. Los tallos más gruesos también son deseables debido a que este rasgo aumenta la resistencia a la caída por efecto del viento o la lluvia, un problema grave que reduce los rendimientos en los cultivos incluyendo cereales (Zuber y col., 1999), soja (Board, 2001) y colza (Miliuviene y col., 2004). Un aspecto adicional del fenotipo de mutante mnt-1 es el diámetro aumentado de los tallos.

Definiciones

Las siguientes definiciones no limitantes de términos usados en la presente memoria descriptiva se proporcionan como explicación.

“Función” cuando se usa en relación con un gen abarca tanto el funcionamiento de ese gen a un nivel molecular como los efectos corriente abajo de la expresión del gen que pueden dar como resultado cambios fenotípicos.

“Secuencia de ácido nucleico”: se refiere a un polímero mono o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leído desde el extremo 5’ al 3’, incluyendo ADN cromosómico, plásmidos, polímeros infecciosos de ADN o ARN y ADN o ARN que realiza un papel principalmente estructural.

“Ortólogos”: se refiere a genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes hallados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias proteicas codificadas tienen un alto porcentaje de identidad y/o similitud de secuencia. Las funciones de los ortólogos están con frecuencia altamente conservadas entre las especies.

“Homólogo”: Un gen (o proteína) con una secuencia de nucleótidos (o aminoácidos) similar a otro gen (o proteína) en la misma u otra especie.

“Promotor”: una región o secuencia localizada corriente arriba y/o corriente abajo desde el inicio de transcripción implicada en el reconocimiento y unión de ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción.

“Promotor vegetal” se refiere a un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales.

“Unido operativamente” se refiere a una unión funcional entre un promotor y una secuencia de ADN, en la que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN. En general, “unido operativamente” significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en la misma fase de lectura.

“Planta”: incluye plantas completas, partes de plantas y material de propagación de plantas incluyendo: estructuras y/u órganos vegetativos de brotes (por ejemplo hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos florales (por ejemplo brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras), óvulos (incluyendo ovocito y células centrales), semillas (incluyendo cigoto, embrión, endospermo y revestimiento de semilla), fruto (por ejemplo, el ovario maduro), plántulas, tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental), células (por ejemplo, células de guarda, ovocitos, tricomas y similares) y su descendencia.

“Célula vegetal”: incluye células obtenidas de o halladas en semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas así como plantas completas. La expresión “células vegetales” también incluye células modificadas, tales como protoplastos, obtenidas de los tejidos anteriormente mencionados.

“Tipo silvestre” en el contexto de una planta o material vegetal que se ha modificado de alguna manera se refiere a una planta comparable que no se ha modificado de ese modo y cultivada o producida en condiciones similares. Para una planta dada puede ser el genotipo o fenotipo que se encuentra en la naturaleza o en material de laboratorio convencional. Las referencias en la presente memoria descriptiva a cambios relativos en las características de plantas o material vegetal son relativos a tipo silvestre.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para modificar la proliferación celular en una planta que comprende modular la expresión del gen mnt en la planta o material de propagación de planta, por lo que la proliferación celular, dentro de los integumentos y/o revestimientos de semillas de la planta, se modifica. La proliferación celular en otras partes de la planta también puede modificarse. Por ejemplo, en el tallo de la planta.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para modificar proliferación celular en una planta que comprende la etapa de transformar una planta o un material de propagación de plantas con una molécula de ácido nucleico que comprenda al menos una secuencia reguladora, típicamente una secuencia promotora, capaz de dirigir la expresión dentro de los integumentos y/o revestimiento de semilla de al menos una secuencia de ácido nucleico derivada del gen mnt, cuyo producto de expresión o transcripción es capaz de modular directa o indirectamente la proliferación celular, por lo que, tras la expresión de esa secuencia, se modifica la proliferación celular. Preferentemente, el tamaño global de los integumentos/revestimiento de semilla en la planta se modifica. Esto puede ser útil cuando se produce un producto en el integumento/revestimiento de semilla. En algunas realizaciones, esto se consigue sin afectar al crecimiento o desarrollo de ninguna parte de la planta distinta de la semilla.

Es deseable que la función de un gen o producto génico que promueve la división celular se potencie o que se inhiba la función de un gen o producto génico que reprima la división celular. La división celular en los integumentos/revestimiento de semillas puede aumentarse dando como resultado una semilla más grande en comparación con el tipo silvestre. Esto puede ser ventajoso debido a que pueden conseguirse aumentos del tamaño de la semilla que son deseables como se ha mencionado anteriormente. La semilla puede ser al menos 15% o 25% más grande que el tipo silvestre. Más específicamente, la semilla puede ser al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 150%, o incluso 200% más pesada que el tipo silvestre. El número de células en los integumentos/revestimiento de semilla de la planta puede aumentarse en comparación con el tipo silvestre. El número de células en los integumentos/revestimiento de semilla de la planta puede aumentarse en al menos 30%, o 50%, en comparación con el tipo silvestre.

El diámetro del tallo de la planta puede ser mayor, por ejemplo al menos 10% mayor, que el tipo silvestre. Preferentemente, el diámetro del tallo de la planta es al menos 20% mayor que el tipo silvestre. Esto puede ser ventajoso como se ha analizado anteriormente.

La longitud de los sépalos de la planta puede ser suficientemente mayor que el tipo silvestre para inhibir la apertura de la flor. Por ejemplo, la longitud del sépalo puede ser al menos 20%, o al menos 50% mayor que el tipo silvestre.

Igualmente, el procedimiento permite la producción de semillas más pequeñas que también pueden ser ventajosas como se ha mencionado anteriormente y, en otra realización, se inhibe la función de un gen o producto génico que promueve la división celular o se potencia la función de un producto génico que reprime la división celular. La división celular en los integumentos/revestimiento de semilla puede reducirse dando como resultado una semilla más pequeña en comparación con el tipo silvestre. La semilla puede ser al menos 5% más pequeña que el tipo silvestre, preferentemente 25% o más. El número de células en los integumentos/revestimiento de semilla puede reducirse en comparación con el tipo silvestre. En particular el número de células en los integumentos/revestimiento de semilla puede reducirse en al menos 30%, o 50%, en comparación con el tipo silvestre.

La función de un gen que modula la proliferación celular puede potenciarse en comparación con el tipo silvestre. La transcripción del gen se activa. La activación de la transcripción da como resultado niveles aumentados de ARNm y/o proteína codificada por el gen. Típicamente, los niveles de ARNm pueden aumentarse en al menos 20%. Por ejemplo, los niveles de ARNm pueden aumentarse en 50% o 75% o más.

Un promotor vegetal puede unirse operativamente a una región codificante del gen en la orientación sentido. La función del gen puede modularse uniendo operativamente un promotor vegetal con un fragmento de ácido nucleico del gen para formar una molécula de ácido nucleico recombinante de modo que se transcribirá una hebra antisentido de ARN.

La función de un gen puede modularse introduciendo un fragmento de ácido nucleico del gen en un vector apropiado de modo que el ARN bicatenario se transcriba cuando se dirige por un promotor vegetal unido operativamente. Pueden producirse niveles reducidos de ARNm y/o proteína codificada por copias endógenas del gen. Pueden reducirse los niveles de ARNm y proteína codificada por homólogos del gen.

La función del gen puede modularse uniendo operativamente un promotor vegetal con un alelo “dominante negativo” del gen, que interfiere con la función del producto génico.

La planta puede ser monocotiledónea, y es preferentemente una planta de cultivo. Por ejemplo, la planta puede ser Triticum spp. (trigo), Oryza sativa (arroz), Zea mays (maíz), Hordeum spp. (cebada), Secale cereale (centeno), Sorghum bicolor (sorgo) o Pennisetum glaucum (mijo perla). Como alternativa la planta es dicotiledónea. Por ejemplo, la planta es Brassica napus (colza) o cualquier otra especie de Brassica usada para producir semillas de aceite (por ejemplo, Brassica carinata), Glycine max (soja), Arachis hypogaea (cacahuete), Helianthus annuus (girasol), Phaseolus vulgaris (por ejemplo alubia, judía blanca, frijol negro), Vicia faba (haba), Pisum sativum (guisante), Cicer arietinum (garbanzo), Lens culinaris (lenteja) o Linum usitatissimum (lino).

El desarrollo del integumento y el revestimiento de semilla es similar en todas las especies examinadas en la familia Brassicaceae (Bouman, 1975), a la que pertenece la Arabidopsis thaliana. En Brassica napus, una planta de cultivo cercanamente relacionada con Arabidopsis thaliana, el revestimiento de semilla también es muy similar en estructura (Wan y col., 2002). Por lo tanto las modificaciones que afectan al crecimiento y desarrollo de integumentos/revestimiento de semillas en Arabidopsis thaliana debería poder aplicarse directamente a miembros de las Brassicaceae, incluyendo Brassica napus.

Las semillas maduras de monocotiledóneas tales como cereales tienen una estructura definida. Sin embargo los óvulos de cereales tienen similitudes fundamentales con óvulos de Arabidopsis thaliana y otras dicotiledóneas, que también consisten en integumentos que incluyen una nucela y saco embrionario. En el arroz, por ejemplo, el integumento interior incluye el óvulo antes de la fertilización, y su crecimiento precede al del endospermo y el embrión, como en Arabidopsis thaliana (Lopez-Dee y col., 1999). Por lo tanto la modificación del crecimiento de los integumentos/revestimiento de semilla también puede ser eficaz en la alteración del crecimiento de semilla global en cultivos de cereales. Específicamente en el arroz una modificación del crecimiento de los integumentos interiores puede ser útil en la modificación del tamaño de la semilla.

Es notable que el gen INO, que en Arabidopsis thaliana se expresa en el integumento exterior y se requiere para su crecimiento (Villanueva y col., 1999), se ha identificado en Nymphaea alba (nenúfar), en el que también se expresa en los integumentos (Yamada y col., 2003). Puesto que las Nymphaeaceae son eudicotiledóneas basales, que son ancestrales tanto de dicotiledóneas como de monocotiledóneas, esto sugiere que los patrones de expresión y secuencia de al menos algunos genes de integumento se conservarán incluso entre grupos relacionados de forma distante de plantas con flor.

La presente invención es complementaria de la invención desvelada en el documento WO01/09299. Las modificaciones de crecimiento de semillas conducido por endospermos y conducido por integumento pueden combinarse para un efecto aún mayor. En algunas situaciones puede preferirse crecimiento de semillas conducido por integumento solamente, puesto que solamente requiere modificación del parental de la semilla, mientras que el crecimiento de endospermo se determina por contribuciones tanto maternas como paternas.

Cuando la secuencia reguladora es un promotor, la secuencia promotora puede ser constitutiva, dirigiendo la expresión génica en la mayoría o todas las células de la planta. Un ejemplo de un promotor constitutivo que puede usarse en algunas realizaciones de la invención es el promotor 35S, derivado del gen que codifica la subunidad 35S de la proteína de revestimiento de Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV). Como alternativa, la secuencia promotora

puede ser específica, dirigiendo la expresión exclusivamente o principalmente en un órgano, tejido o tipo celular de la planta. Puede usarse una diversidad de promotores vegetales en la invención para dirigir la expresión exclusiva o principalmente en los integumentos o revestimiento se semilla. Los promotores vegetales adecuados incluyen los obtenidos de plantas, virus de plantas y bacterias que comprenden genes expresados en células vegetales, tales como Agrobacterium o Rhizobium. Algunas realizaciones usan promotores expresados en los integumentos antes de la fertilización. Estos incluyen pero sin restricción los promotores de los siguientes genes: INO (Villanueva y col., 1999; At1g23420, Nº de acceso AF195047) y BEL1 (Reiser y col., 1995; At5g41410; Nº de acceso NM_123506). Otras realizaciones usan promotores expresados en el revestimiento de semilla después de la fertilización. Estos incluyen pero sin limitación los promotores de los siguientes genes: BAN (Devic y col., 1999; At1g61720, Nº de acceso AF092912), TT1 (Sagasser y col., 2002), TT2 (Nesi y col., 2001; At5g35550; Nº de acceso NM_122946), TT8 (Nesi y col., 2000; At4g09820, Nº de acceso AJ277509), TT12 (Debeaujon y col., 2001; At3g59030, Nº de acceso AJ294464), y TT16 (Nesi y col., 2002; At5g23260; Nº de acceso NM_203094). Un promotor preferido para flores que puede usarse es el promotor del gen LFY (Weigel y col., 1992; At5g61850, Nº de acceso NM_125579), que puede usarse para obtener efectos específicos de flor deseados tales como reducciones de la apertura de la flor. Cuando se debe introducir un promotor en una planta, se usará típicamente una secuencia de nucleótidos que contiene promotor de hasta 2000 pb.

Se contempla el uso de otras secuencias reguladoras distintas de un promotor para dirigir la expresión dentro de los integumentos y/o revestimiento de semillas. Un ejemplo es un intrón que dirige expresión específica de tejido (véase por ejemplo Deyholos y Sieburth, 2000).

Existen varios genes conocidos o que se sospecha que están implicados en la modulación de la proliferación celular, directa o indirectamente. Tales genes incluyen los genes implicados en la respuesta hormonal, biosíntesis, traslocación u otros aspectos de la acción hormonal. Estos incluyen pero sin restricción MNT (como se usa en la invención), IPT1 (Takei y col., 2001; At1g68460, Nº de acceso AB062607), y ARGOS (Hu y col., 2003; At3g59900, Nº de acceso AY305869). También se incluyen genes del ciclo celular principales (Vandepoele y col., 2002), tales como CYCD3;1 (anteriormente Cycδ3; Soni y col., 1995; Vandepoele y col., 2002; At4g34160, Nº de acceso X83371) y CYCB1;1 (anteriormente Cyc1aAt; Ferreira y col., 1994; Vandepoele y col., 2002; At4g37490, Nº de acceso NM_119913). Los factores de transcripción implicados en la regulación del grado o tasa de proliferación celular, tales como ANT (Klucher y col., 1996; At4g37750, Nº de acceso NM_119937) también pueden estar implicados en la modulación de la proliferación celular.

Un casete de expresión puede usarse para potenciar o inhibir la función de un gen que modula la proliferación celular. Un procedimiento para potenciar la función es activar la transcripción del gen, dando como resultado niveles aumentados de ARNm y proteína codificada por el gen. Esto se consigue uniendo un promotor vegetal a la región codificante del gen (con o sin intrones) en la orientación sentido.

La inhibición parcial o completa de la función génica para conseguir características deseables en plantas tales como fertilidad puede conseguirse u “obtenerse por ingeniería genética” de varias maneras. Un procedimiento, que usa “tecnología antisentido”, es unir un promotor vegetal con un segmento de ácido nucleico del gen deseado de modo que se transcriba la hebra antisentido de ARN (véase por ejemplo Branen y col., 2003; Choi y col., 2003). Otro procedimiento, que usa “tecnología ARNi”, es unir un promotor vegetal con un segmento de ácido nucleico del gen deseado y colocar el ácido nucleico recombinante resultante en un vector apropiado de modo que se transcriba ARN bicatenario (Wang y Waterhouse, 2001). Ambas de estas técnicas pueden dar como resultado niveles reducidos de ARNm y proteína codificada por las copias endógenas del gen. Por ejemplo, los niveles de ARNm pueden reducirse en al menos 20%, preferentemente en al menos 50%, para conseguir semillas convenientemente grandes sin comprometer la fertilidad en comparación con el tipo silvestre. Un fragmento de ácido nucleico para tecnología antisentido o de ARNi también puede designarse para reducir los niveles de ARNm y proteína codificada por homólogos u ortólogos del gen. Un tercer procedimiento para inhibir la función génica es unir un promotor vegetal con un alelo “dominante negativo” del gen, que interfiere negativamente con la función del producto génico (véase por ejemplo Hemerly y col., 1995; Nahm y col., 2003). En caso de inhibición de genes (por ejemplo, por antisentido,

o el uso de tecnología ARNi) se reconocerá que la secuencia polinucleotídica insertada no necesita ser idéntica, sino que puede ser solamente “sustancialmente idéntica” a una secuencia del gen del que deriva. La inhibición de la función génica puede conseguirse por reducción de expresión del gen a través de un bucle de retroalimentación que actúe sobre esa expresión.

Como alternativa, la secuencia de ácido nucleico es una forma mutante de un gen codificante de factor de respuesta a auxina, o una construcción que inhibe la expresión o función de un factor de respuesta a auxina. El gen de factor de respuesta a auxina puede ser MNT en el caso de Arabidopsis thaliana o sus ortólogos en otra especie. Por ejemplo, en el caso de Brassica napus el gen puede ser BnARF2 como se usa en el Ejemplo 2 posterior. En el caso de arroz el gen puede ser OsARF2. El fenotipo mutante de mnt-1 muestra que la función de tipo silvestre del gen MNT es para reprimir la división celular en los integumentos. Por lo tanto la inhibición de la expresión o función de MNT endógeno puede dar como resultado mayores integumentos y una semilla más grande. Como alternativa, la potenciación de la expresión o función de MNT puede dar como resultado una semilla más pequeña. En algunas situaciones, la sobreexpresión del gen de MNT puede, de hecho, dar como resultado un tamaño de semilla más grande posiblemente debido a un bucle de retroalimentación en la expresión del gen de MNT.

La división celular en los integumentos/revestimiento de semilla puede aumentar, dando como resultado una semilla mayor en comparación con el tipo silvestre. Esto puede conseguirse potenciando la función de un gen o producto génico que promueva la división celular, o inhibiendo la función de un gen o producto génico que reprima la división celular. La división celular en los integumentos/revestimiento de semilla también puede reducirse, dando como resultado una semilla más pequeña. Esto puede conseguirse potenciando la función de un gen o producto génico que reprima la división celular o inhibiendo la función de un gen o producto génico que promueva la división celular. En estas realizaciones el gen o producto génico es MNT o un ortólogo de MNT.

Una planta puede modificarse adicionalmente para mantener características deseables que pueden haberse perdido de otro modo como resultado de la etapa de transformación. Por ejemplo, la característica deseable puede ser fertilidad.

La planta puede modificarse por ingeniería genética o cultivarse adicionalmente para mantener o introducir características deseables. Por ejemplo, la planta puede cultivarse de modo que sea heterocigota para el gen modulado que modifica directa o indirectamente la proliferación celular. En particular, los inventores han descubierto que las plantas heterocigotas para la mutación mnt tienen flores normales y fertilidad normal, pero que sus semillas son sistemáticamente significativamente más pesadas que el tipo silvestre (típicamente aproximadamente 10-20%), aunque no tan pesadas como las semillas de los mutantes homocigotos de mnt. En otras palabras, si la función de MNT se reduce en aproximadamente 50% en lugar de suprimirse completamente, las plantas producen semillas más pesadas deseables sin comprometer la fertilidad. Por ejemplo, las plantas pueden modificarse por ingeniería genética como se ha descrito anteriormente para reducir los niveles de proteína/ARNm para el gen de proliferación celular.

Por ejemplo, en realizaciones adicionales de la invención, la función de MNT se restaura a pétalos y estambres de un mutante MNT de modo que las semillas tengan el fenotipo mutante mnt-1 agrandado pero la fertilidad no se altere. Esto puede conseguirse uniendo operativamente el promotor de un gen que dirige la expresión en pétalos y estambres pero no carpelos (que contienen los óvulos), tales como AP3 (Jack y col., 1992), con el gen de MNT de tipo silvestre. En diferentes especies, pueden proporcionarse genes de tipo silvestre diferentes. En otras realizaciones, la función de MNT puede restaurarse a sépalos y pétalos de un mutante de mnt de modo que las semillas tengan el fenotipo mutante mnt-1 agrandado pero la fertilidad no se altere. Esto puede conseguirse uniendo operativamente el promotor de un gen que dirige la expresión en sépalos y pétalos pero no carpelos, tales como AP1 (Mandel y col., 1992), con el gen de MNT de tipo silvestre. En diferentes especies, pueden proporcionarse genes de tipo silvestre diferentes.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para modificar la proliferación celular en una planta que comprende la etapa de modular la respuesta de la planta a una auxina por lo que el número de células global de los integumentos/revestimiento de semilla de la planta se modifica. La respuesta a una auxina puede modificarse alterando la expresión de un factor de respuesta a auxina. Preferentemente, el factor de respuesta a auxina es ARF2. La función de un gen que codifica el factor de respuesta a auxina puede modularse de modo que afecte a la función del factor. En el caso de Arabidopsis thaliana, el gen puede ser MNT. En el caso de Brassica napus el gen puede ser BnARF2. En el caso de arroz el gen puede ser OsARF2. Pueden usarse ortólogos de estos genes en otras especies.

Más preferentemente, la función de un gen que codifica factor de respuesta a auxina endógeno se modula por ejemplo por tecnología de ARNi como se ha descrito anteriormente. Más preferentemente, la función de ese gen en los integumentos/revestimiento de semilla se ve afectada.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para modificar la función del gen de MNT en una planta de modo que las semillas se agranden pero características tales como la apertura de la flor y/o fertilidad, preferentemente tanto apertura de la flor como fertilidad, no se alteren. Las semillas pueden ser al menos 10% o 20% más grandes que el tipo silvestre. Esto puede conseguirse cultivando una planta que sea heterocigota para una mutación en el gen de MNT o un ortólogo de ese gen en otra especie.

En otra realización la planta tiene una mutación de pérdida de función parcial en el gen MNT o un ortólogo en otra especie. En otra realización, el nivel del ARN de ese gen y proteína se reduce en una planta de tipo silvestre en 30%, 40%, 50% o 60%, por ejemplo uniendo operativamente un promotor, tal como el promotor 35S constitutivo, con un fragmento de ácido nucleico del gen para formar una molécula de ácido nucleico recombinante de modo que se transcriba una hebra antisentido de ARN; o con fragmentos de ácido nucleico del gen en un vector apropiado de modo que se transcriba ARN bicatenario.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para modificar la proliferación celular en una planta que comprende la etapa de transformar una planta o material de propagación de planta con una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia reguladora, típicamente una secuencia promotora, capaz de dirigir la expresión dentro del tallo de al menos una secuencia de ácido nucleico cuyo producto de transcripción o expresión es capaz de modular directa o indirectamente al proliferación celular, por lo que, tras la expresión de esa secuencia, se modifica la proliferación celular. Preferentemente, el tamaño global de los tallos en la planta se modifica. El tallo puede ser al menos 10%, 20%, 30% o 40% mayor en diámetro que el tipo

silvestre. En una realización de la invención, la función de MNT, o la de un ortólogo, se inhibe al menos parcialmente en el tallo, por ejemplo uniendo operativamente un promotor tal como el promotor 35S constitutivo con un fragmento de ácido nucleico del gen MNT u ortólogo de MNT para formar una molécula de ácido nucleico recombinante de modo que se transcriba una hebra antisentido de ARN; o con fragmentos de ácido nucleico del gen de MNT u ortólogo de MNT en un vector apropiado de modo que se transcriba ARN bicatenario.

En otra realización de la invención, el gen de MNT o un ortólogo del mismo se restaura a flores de un mutante de mnt de modo que los tallos tengan el fenotipo mutante de mnt-1 agrandado pero la fertilidad no se altere. Esto puede conseguirse por ejemplo uniendo operativamente el promotor de un gen que dirija la expresión en flores pero no en tallos, tal como LEAFY (LFY) (Weigel y col., 1992; At5g61850, Nº de acceso NM_125579), con el gen de MNT de tipo silvestre. En especies diferentes, pueden proporcionarse genes de tipo silvestre diferentes.

Breve descripción de los dibujos

Se describirán ahora realizaciones de acuerdo con la invención, solamente como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos Figuras 1 a 25 en las que:

Figura 1A Parte superior: Microfotografías confocal de semillas con embriones en etapa globular de parentales de semilla de mnt-1 (izquierda) y tipo silvestre (derecha); Parte inferior: Semillas maduras y embriones de mutantes de mnt-1 y plantas de tipo silvestre, fotografiados a la misma escala;

La Figura 1B es una representación de dispersión de número de semillas en cada vaina producido por mutantes de mnt-1 frente a peso de semilla medio en esa vaina, después de polinizaciones controladas;

La Figura 1C muestra semillas de plantas de tipo silvestre y mnt-1 polinizadas manualmente, y cruces recíprocos entre ellas, fotografiadas a la misma escala;

La Figura 2A muestra microfotografías ópticas de óvulos no fertilizados maduros, etapa 3-VI (representado como en Schneitz y col., 1995), de plantas de tipo silvestre (izquierda) y mnt-1 (derecha);

La Figura 2B muestra gráficos que muestran el número de células, longitud total y longitud de célula media para varias capas de integumento en óvulos de etapa 3-VI mnt-1 y de tipo silvestre. (La anchura también se muestra para la capa iil’).

La Figura 3 muestra microfotografías de endospermo de la chalaza en semillas en desarrollo de Arabidopsis thaliana, todas a la misma escala. La semilla de mnt-1 es un ejemplo de crecimiento conducido por integumento mientras que la semilla 2x X 6x proporciona un ejemplo del crecimiento conducido por endospermo.

La Figura 4A muestra microfotografías de semillas de Arabidopsis thaliana que ilustran crecimiento de semillas conducido por endospermo ilustrado por cruces de interploidía en el acceso C24 de Arabidopsis thaliana (véase también Scott y col., 1998);

La Figura 4B muestra microfotografías que ilustran el crecimiento de semillas conducido por integumento ilustrado por el mutante mnt-1 en el acceso de Columbia de Arabidopsis thaliana;

La Figura 4C es una microfotografía de una semilla que ilustra la hipótesis de “bolsa grande”;

La Figura 5A-C es una fotografía que ilustra una comparación de fenotipo floral y tamaño de semilla en Col-3 de tipo silvestre (5A), mutantes mnt-1 (5B), y un mutante de inserción de Salk (línea de Salk 108995) homocigoto para una inserción en el gen de ARF2 (5C);

La Figura 5D es una fotografía de un gel que muestra puntuación basada en PCR de segregantes para la inserción de ADN T en la línea de Salk 108995;

La Figura 5E es una fotografía de un gel que muestra puntuación de presencia de la inserción (parte superior) y presencia de homocigotos (parte inferior) en la descendencia F1 del cruce entre un parental de semilla mutante homocigoto mnt-1 y el parental de polen homocigoto Salk 108995. Toda la descendencia F1 tiene una copia sencilla de la inserción;

La Figura 5F es una fotografía que ilustra el fenotipo floral y de semilla en una planta híbrida F1 resultante de un cruce entre un mutante mnt-1 homocigoto y un mutante de inserción Salk homocigoto (línea de Salk 108995);

La Figura 6 es un alineamiento de ADNc de MNT de tipo silvestre y mnt-1 mutante de inicio a parada de la traducción;

La Figura 7 es un alineamiento de proteínas predichas de MNT de tipo silvestre y mnt-1 mutante;

La Figura 8 es un alineamiento de ADNc de MNT de Arabidopsis thaliana con su ortólogo en Brassica napus, BnARF2;

La Figura 9 es un alineamiento de proteína predicha de MNT de Arabidopsis thaliana con sus ortólogos Brassica napus (colza) (BnARF2) y Oryza sativa (arroz) (OsARF2);

La Figura 10 ilustra los vectores BJ60, BJ40, pFGC5941, pART7, y BJ36 usados para la estrategias de clonación descritas en los siguientes ejemplos;

La Figura 11 ilustra una estrategia de clonación para construir vectores indicadores (Ejemplo 3). En esta y las siguientes figuras solo se muestran en los diagramas sitios de restricción significativos para la estrategia;

La Figura 12 es una microfotografía de una semilla de etapa globular de una planta que contiene la construcción TT12::uidA ensayada con respecto a expresión de GUS; la capa interior del integumento interior está teñida (flecha);

La Figura 13 A ilustra una estrategia de clonación para construir un vector de ARNi para reducir de forma constitutiva la expresión de MNT (Ejemplo 4);

La Figura 13B es una serie de fotografías que ilustran los fenotipos de inflorescencia y tallo (parte superior) y tamaños y pesos de semillas (parte inferior) de líneas transformadas de forma independiente que contienen el casete de expresión de ARNi 35S::MNT comparado con un control de tipo silvestre. Las inflorescencias y tallos se fotografiaron a la misma escala y las semillas se fotografiaron a la misma escala;

La Figura 14 ilustra una estrategia de clonación para construir un vector de ARNi para reducir constitutivamente la expresión de BnARF2 (Ejemplo 5);

La Figura 15 ilustra una estrategia de clonación para construir vectores de ARNi para reducir la expresión de MNT principalmente en los integumentos/revestimiento de semilla (Ejemplo 6);

La Figura 16 ilustra una estrategia de clonación para construir vectores de ARNi para reducir la expresión de BnARF2 principalmente en los integumentos/revestimiento de semilla (Ejemplo 7);

La Figura 17A ilustra una estrategia de clonación para construir vectores para expresión constitutiva de MNT (Ejemplo 8) o BnARF2 (Ejemplo 9);

La Figura 17B es una serie de fotografías que ilustran tamaños y pesos de semillas de líneas transformadas de forma independiente que contienen el casete de expresión 35S::MNT comparados con un control de tipo silvestre. Las semillas se fotografiaron a la misma escala;

La Figura 18 ilustra una estrategia de clonación para construir vectores para expresión de MNT en los integumentos/revestimiento de semilla (Ejemplo 10);

La Figura 19 ilustra una estrategia de clonación para construir vectores para expresión de BnARF2 en los integumentos/revestimiento de semilla (Ejemplo 11);

La Figura 20 ilustra una estrategia de clonación para construir vectores para expresión de genes que promueven la división celular en los integumentos/revestimiento de semilla (Ejemplo 12, 13);

La Figura 21A es una serie de fotografías que ilustran tamaños y pesos de semillas de transformantes primarios individuales que contienen casetes de expresión diseñados para aumentar el tamaño de la semilla (TT8::CYCD3;1 y TT8::IPT1) en comparación con controles (TT8::uidA). Los datos se toman de la Tabla 2A. Las semillas se fotografiaron a la misma escala;

La Figura 21B es una serie de fotografías que ilustran tamaños y pesos de semillas de plantas transformadas que contienen casetes de expresión diseñados para aumentar el tamaño de semilla en comparación con controles de tipo silvestre. Los datos se toman de la Tabla 2B. Las semillas se fotografiaron a la misma escala;

La Figura 22 ilustra una estrategia de clonación para construir un vector para expresión de MNT en pétalos y estambres (Ejemplo 14);

La Figura 23 ilustra una estrategia de clonación para construir un vector para expresión de MNT en sépalos y pétalos (Ejemplo 15);

La Figura 24A muestra una planta Col-3 de tipo silvestre (izquierda) y mnt-1 (derecha), que ilustra el fenotipo del tallo;

La Figura 24B muestra secciones transversales del tallo de inflorescencia entre los nodos 2 y 3 contando

desde la base de un tipo silvestre de una planta de tipo silvestre (parte superior) y mnt-1 (parte inferior). Cada par de imágenes (aumento bajo, izquierda; aumento alto, derecha) se fotografía a la misma escala; y

La Figura 25 ilustra una estrategia de clonación para construir un vector para expresión de MNT en flores (Ejemplo 18).

Descripción de realizaciones preferidas

Se describirán ahora procedimientos y productos de acuerdo con la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que no deberían interpretarse como limitantes en ningún modo de la invención.

Los siguientes vectores se usan en los ejemplos:

pGEMT (Promega, Southampton, Reino Unido) BJ36, BJ40, BJ60 (regalo de Bart Janssen, Horticultural & Food Research Institute of New Zealand) pART7 (Gleave, 1992) pFGC5941 (Cambia, Canberra, Australia; ChromDB, http://www.chromdb.org/plasmids)

Los protocolos de transformación de plantas se basan en Clough y Bent (1998) para Arabidopsis thaliana y Moloney y col. (1989) para Brassica.

Se llevan a cabo predicciones de proteínas y alineamientos de secuencia con el software GeneDoc versión 2.6.001 (Nicholas y Nicholas, 1997).

A. Identificación del mutante mnt-1

Los inventores identificaron el mutante, megaintegumenta-1 (mnt-1), en una exploración de semillas grandes producidas por una población de Arabidopsis thaliana mutadas con EMS (etilmetanosulfonato) en el acceso Col-3. Las semillas maduras producidas por un homocigoto parental de semilla para la mutación mnt-1 son mayores y más puntiagudas que el tipo silvestre, con células extra en el revestimiento de semilla, y contienen embriones más grandes (Figura 1A). Específicamente, la Figura 1A muestra que los mutantes mnt-1 producen semillas más grandes con más células en el revestimiento de semilla (los recuentos son para ii1, la capa exterior del integumento interior).

Las semillas recogidas de plantas mutantes mnt-1 autopolinizadas son de hasta dos veces el peso de semillas Col-3 de tipo silvestre (Tabla 1A).

Tabla 1A Pesos de semillas en g de cruces de mnt-1 y Col-3 w.t., autopolinización, todas las silicuas se dejan en la planta

mnt auto: w.t. auto

27,1 (n=60): 14,4 (n=178)

27,9 (106): 15,8 (75)

29,7 (127)

Media: 28,2 15,1

Intervalo: 27,1 a 29,7 14,4 a 15,8

Error típico: 0,8 1,4

n = número de semillas pesadas de cada planta

Sin embargo, las plantas mutantes mnt-1 son autoestériles hasta tarde en el desarrollo debido a anomalías florales (véase posteriormente), planteando la posibilidad de que el mutante produzca semillas grandes debido a que hay pocas semillas que requieran recursos maternos. Por lo tanto los inventores también realizaron polinizaciones controladas en las que solo se permitió que tres silicuas (vainas de semillas) produjeran semilla por planta, tanto para mnt-1 como para tipo silvestre (Tabla 1B).

Tabla 1B Pesos de semillas en g de cruces de mnt-1 y w.t. Col-3, polinizaciones manuales, 3 silicuas por planta

mnt X mnt: mnt X w.t. w.t. X mnt w.t. X w.t.

31,1 (n=32): 30,4 (n=36) 30,5 (n=20) 30,6 (n=34)

37,7 (37): 32,6 (22) 28,2 (30) 29,7 (34)

31,4 (37): 37,4 (43) 28,2 (32) 22, 1 (49)

39 (20): 31,8 (17) 27,1 (46) 31,5 (31)

33,7 (50): 34,4 (33) 26,5 (44) 29,6 (28)

40,5 (22): 36 (50) 28 (44) 26,9 (53)

38,3 (9): 37,1 (49) 30,3 (44) 30,2 (61)

39,1 (11): 38 (24) 31,7 (48)

37,2 (25): 21,2 (32)

35,2 (24)

35,7 (43)

39 (31)

38,3 (64)

34 (23)

36,1 (33)

35,1 (54)

Media: 36,3 34,7 28,4 28,7

Intervalo: 31,1 a 40,5 31,8 a 38,0 26,5 a 30,5 22,1 a 31,7

Error típico: 0,7 1,0 0,6 1,3

n = número de semillas en silicua ensayo de t [mnt X mnt] frente a [w.t. X w.t.]: P < 0,000, significativo ensayo de t [nmt X mnt] frente a [mnt X w.t.]: P> 0,2, no significativo ensayo de t [w.t. X w.t.] frente a [w.t. X mnt] : P > 0,9, no significativo

Este tratamiento aumentó el peso medio de semillas de tipo silvestre en 90% y semillas mnt-1 en 29%, lo que indica

5 que un número bajo de semillas es un componente de tamaño de semilla grande en mutantes de mnt-1 pero que la mutación mnt-1 también tiene un efecto significativo. En promedio las semillas mnt-1 pesaron 26% más que el tipo silvestre cuando solamente tres silicuas por planta produjeron semilla; la diferencia en peso fue significativa a P<0,000. Los inventores también investigaron si la baja producción de semillas ocasional dentro de silicuas de mnt-1 individuales podría aumentar el peso de las semillas; sin embargo una representación de dispersión (Figura 1B) del

10 peso de semilla medio de cada vaina frente al número de semillas por vaina después de polinizaciones controladas en mnt-1 (datos de la Tabla 1B) no muestra correlación.

Los inventores también compararon el peso de semillas producidas por heterocigotos de mnt con el peso de semillas producidas por plantas de tipo silvestre (Tabla 1C). Los inventores generaron los heterocigotos a través de cruces en ambas direcciones, es decir [w.t. X mnt-1] (designado [wXm]) y [mnt-1 X w.t.] (designado [mXw]). Los inventores

15 descubrieron que los pesos de las semillas de plantas heterocigotas w.t. y mnt-1 eran significativamente diferentes (ensayo de t, Ho w.t. = mnt-1 heterocigoto, P=0,0002).

Tabla 1C Pesos de semillas en g de plantas heterocigotas mnt-1 y Col-3 w.t., autopolinización, todas las silicuas se dejan en la planta

w.t.: mnt heterocigoto

Planta 1: 17,1 (n=35) 19,4 (n=44) [wXm]

Planta 2: 16,5 (37) 20,8 (60)

Planta 3: 16,4 (49) 19,3 (50)

Planta 4: 16,2 (50) 18,8 (50)

Planta 5: 16,3 (45) 19,5 (46)

Planta 6: 16,2 (40) 20,0 (62)

Planta 7: 15,3 (52) 19,3 (44)

Planta 8: 16,6 (42) 18,4 (59)

Planta 9: 17,5 (54) 18,7 (45)

Planta 10: 17,9 (56) 18,3 (57)

Planta 11: 16,2 (64) [mXw]

Planta 12: 17,7 (67)

Planta 13: 20,0 (42)

Planta 14: 17,3 (42)

Planta 15: 18,3 (75)

Planta 16: 17,1 (45)

Planta 17: 17,0 (67)

Planta 18: 17,7 (49)

Planta 19: 18,3 (54)

Planta 20: 16,6 (40)

Media: 16,6 (460) 18,4 (1062)

Intervalo: 15,3 a 17,9 16,2 a 20,8

Error típico: 0,2 0,3

Los inventores también realizaron dos experimentos adicionales para comparar los pesos de semilla de (a) plantas

5 de tipo silvestre, (b) homocigotos de mnt-1, y (c) heterocigotos de mnt-1 en condiciones de polinización restringida. En el primer experimento, se polinizaron seis silicuas en el brote primario y todas las otras silicuas en el brote primario se retiraron; pero se permitió que todos los brotes secundarios se autopolinizaran (Tabla 1D). En el segundo experimento, solo se polinizaron seis silicuas en el brote primario y todas las otras silicuas en la planta se retiraron (Tabla 1E). En ambos experimentos los inventores llevaron a cabo polinizaciones manuales en seis silicuas

10 por planta para permitir que las plantas mutantes homocigotas mnt-1 jóvenes produjeran semillas.

Tabla 1D Pesos de semillas en g de plantas w.t. Col-3, mnt-1 homocigotas y mnt-1 heterocigotas, 6 silicuas polinizadas en brote primario, se permitió que los brotes secundarios autopolinizaran

w.t.: nmt homocigoto mnt heterocigoto

Planta 1: 24,7 (n=289) 35,5 (178) 31,0 (n=237) [wXm]

Planta 2: 24,6 (336) 34,5 (217) 28,7 (275)

Planta 3: 24,4 (337) 36,9 (224) 29,8 (140)

Planta 4: 23,9 (223) 37,8 (227) 30,7 (195)

Planta 5: 25,8 (135) 37,4 (149) 29,3 (260)

Planta 6: 29,2 (109) [mXw]

Planta 7: 29,6 (307)

Planta 8: 29,0 (198)

Planta 9: 26,8 (346)

Planta 10: 27,6 (341)

Peso de semilla medio: 24,7 (1320) 36,4 (995) 29,2 (2408)

Intervalo: 23,9 a 25,8 34,5 a 37,8 26,8 a 31,0

Error típico: 0,3 0,6 1,3

n = número de semillas pesadas de cada planta ensayo de t: H0 w.t. = mnt-1 homocigoto, P <0,0000, la diferencia es significativa ensayo de t: H0 w.t. = mnt-1 heterocigoto, P <0,0000, la diferencia es significativa

Tabla 1E Pesos de semillas en g de plantas w.t. Col-3, mnt-1 homocigotas y mnt-1 heterocigotas, 6 silicuas polinizadas en brote primario, los brotes secundarios retirados

w.t.: mnt homocigoto mnt heterocigoto

Planta 1: 33,0 (n=307) 38,7 (n=274) 37,1 (n=53) [wXm]

Planta 2: 32,2 (222) 37,5 (221) 35,1 (300)

Planta 3: 35,1 (74) 41,1 (226) 37,7 (347)

Planta 4: 35,0 (252) 41,0 (302) 35,6 (110)

Planta 5: 34,8 (230) 38,5 (205) 38,1 (195)

Planta 6: 40,9 (193) [mXw]

Planta 7: 37,8 (245)

Planta 8: 36,7 (280)

Planta 9: 38,1 (210)

Planta 10: 39,9 (222)

Peso de semilla medio: 34,0 (1085) 39,4 (1228) 37,7 (2155)

Intervalo: 23,2 a 35,1 37,5 a 41,1 35,1 a 40,9

50 (continuación)

w.t.: mnt homocigoto mnt heterocigoto

Error típico: 0,6 0,7 1,8

n = número de semillas pesadas de cada planta ensayo de t: H0 w.t. = mnt-1 homocigoto, P = 0,0004, la diferencia es significativa ensayo de t: H0 w.t. = mnt-1 heterocigoto, P = 0,0013, la diferencia es significativa

Los homocigotos de mnt-1 y heterocigotos de mnt-1 produjeron semillas más pesadas que las plantas de tipo silvestre en ambos experimentos, y la diferencia en peso fue significativa en todos los casos a P < 0,002. Cuando se permitió que brotes secundarios produjeran semilla, las semillas de los homocigotos de mnt-1 eran de media 47% más pesados que las semillas de plantas de tipo silvestre, y las semillas de heterocigotos mnt-1 eran de media 18% más pesadas que las semillas de plantas de tipo silvestre. Cuando se retiraron los brotes secundarios, de modo que solamente seis silicuas producían semilla en cada planta independientemente del genotipo, las semillas de homocigotos de mnt-1 pesaron 16% más que el tipo silvestre, y las semillas de heterocigoto de mnt-1 pesaron 11% más que el tipo silvestre.

La mutación mnt-1 tiene un efecto materno en el tamaño de las semillas. Es decir, un parental de semilla mutante homocigota mnt-1 produce semillas grandes independientemente de si se ha polinizado por una planta mnt-1 o de tipo silvestre, mientras que un parental de tipo silvestre produce semillas normales incluso si se ha polinizado por una planta mnt-1 (Figura 1 C). En la Figura 1C las semillas producidas por parentales de semilla mnt-1 se muestran en la parte superior y las semillas de parentales de semilla de tipo silvestre están debajo. H = los productos de fertilización (embrión y endospermo) son heterocigotos para la mutación mnt-1. Esto muestra que el tamaño de semilla en los mutantes mnt-1 depende del genotipo del parental de semilla, no los productos de fertilización. Esto también se muestra por la falta de una diferencia significativa entre pesos de semilla de semillas [mnt-1 X mnt-1] y [mnt-1 X w.t], y entre [w.t. X w.t.] y [w.t. X mnt-1] (Tabla 1B).

La diferencia principal entre semillas mnt-1 y de tipo silvestre es que las semillas mutantes contienen más células en el revestimiento de semilla. La comparación del desarrollo del óvulo en plantas mnt-1 y de tipo silvestre muestra que los óvulos mnt-1 son de tamaño y morfología normal hasta que están cerca de la madurez, momento en el cual se observa que los integumentos tanto interiores como exteriores de óvulos mnt-1 son significativamente más largos que en tipo silvestre, principalmente debido a un número significativamente mayor de células (Figura 2). En relación con los resultados representados en la Figura 2, en Arabidopsis thaliana y otros miembros de las Brasicáceas la mayor parte de la expansión y división celular se produce en los integumentos en el lado abaxial del óvulo (marcado en el óvulo de tipo silvestre en la Figura 2A). De forma similar, la nucela en el arroz está envuelta por integumento interior abaxial (Lopez-Dee y col., 1999). En Arabidopsis, ii1, ii1’, e ii2 son las tres capas celulares del integumento interior y oi1 y oi2 son las dos capas del integumento exterior. Las células de la capa ii1’, que no abarca completamente el saco embrionario, se expanden significativamente en anchura después de fertilización como parte del crecimiento de las semillas (Beeckman y col., 2000). Los óvulos mnt-1 tienen integumentos más largos con células extra y en algunos casos una capa extra (flecha), así como una cavidad de semilla más grande (Figura 2A). C = la “zona curvada” del integumento exterior abaxial (la región superpuesta ii1’; Beeckman y col., 2000), M = la “zona micropilar”, regiones delimitadas con barras negras (Figura 2A). Las mediciones mostradas en la Figura 2B se tomaron para los integumentos abaxiales solamente. Las capas ii1’, ii1, y la zona curvada de oi2 son más largas en óvulos mutantes mnt-1, casi exclusivamente debido a mayor número de células. La longitud celular media es mayor en la zona micropilar de óvulos mnt-1 pero más pequeña o no significativamente diferente en la zona curvada oi2 y las otras capas de integumento medidas. No existe diferencia en la anchura media entre células mnt-1 y de tipo silvestre de la capa ii1’.

El endospermo periférico en semillas mutantes mnt-1 también genera más núcleos que en semillas de tipo silvestre. El número medio de núcleos de endospermo periférico en semillas mnt-1 en la etapa de corazón es 1150, en comparación con 550 para una semilla Col-3 de tipo silvestre en una etapa comparable; véase Scott y col. (1998) para una descripción de morfología del endospermo y el procedimiento de recuento. Sin embargo, los inventores consideran que hay dos diferencias cruciales entre semillas mutantes mnt-1 y semillas grandes que muestran crecimiento conducido por endospermo. En primer lugar, la región de la chalaza del endospermo, que se agranda en gran medida en semillas conducidas por endospermo (por ejemplo semillas de cruces de interploidía que generan exceso paterno, cruces en los que el ADN del parental de semilla está hipometilado, o mutantes fis), es de tamaño aproximadamente normal en mutantes mnt-1 (aunque la forma picuda del polo de la chalaza de semillas mnt-1 da como resultado un endospermo de chalaza más largo y más estrecho) (Figura 3). Los inventores midieron el área de sección transversal máxima del quiste de chalaza más nódulos en 6 DAP, una etapa en la que son evidentes diferencias entre endospermos de tipo silvestre y paternalizados (Scott y col., 1998). Las áreas medias fueron de 2690 μm2 (± e.t.m. 328) para semillas de tipo silvestre (n=4) y 2537 μm2 (± 416) para semillas mnt-1 (n=5), y no hubo diferencia significativa entre los endospermos mutantes y de tipo silvestre (ensayo de t, H0 w.t. = mnt-1, P=0,79). En segundo lugar, la diferencia de tamaño entre semillas mnt-1 y de tipo silvestre sigue a partir de diferencias existentes

antes de la fertilización, es decir antes de que se haya creado el endospermo. La sobreproliferación de endospermo periférico puede seguir desde el volumen de semilla mayor creado por integumentos/revestimiento de semilla agrandados.

B. La hipótesis de “bolsa grande”

Los inventores observan que las semillas con endospermos alargados y semillas con revestimientos de semilla grandes tienen una características en común: la cavidad de la semilla (es decir el espacio dentro del saco embrionario después de la fertilización) es mayor de lo normal, dando al embrión más espacio para crecer (Figura 4A, 4B). Específicamente, el crecimiento de semillas conducido por endospermo se ilustra por cruces de interploidía en el acceso C24 de Arabidopsis thaliana (véase también Scott y col., 1998). Como se muestra en la Figura 4A genomas paternos extra producen semillas con una cavidad grande (parte superior izquierda, cruce 2x X 6x), y en última instancia semillas grandes con embriones grandes (cruce 2x X 4x, parte inferior izquierda). Por el contrario, los genomas maternos extra generan semillas con cavidades pequeñas (parte superior derecha, cruce 6x X 2x), y en última instancia semillas pequeñas con embriones pequeños (cruce 4x X 2x, parte inferior derecha). El cruce de control 2x X 2x se muestra en el medio.

Por el contrario en crecimiento de semillas conducido por integumento como se ilustra en la Figura 4B las semillas también tienen una cavidad de semilla grande (parte superior izquierda) en comparación con tipo silvestre (parte superior derecha). Las semillas maduras y los embriones se comparan debajo.

Esto conduce a la hipótesis de “bolsa grande” de los inventores, que indica que el tamaño de semilla y en última instancia del embrión se establece por el tamaño de la cavidad de la semilla, que puede controlarse por varios factores incluyendo el alcance de la proliferación del endospermo y alcance de la proliferación de integumento/revestimiento de semilla (Figura 4C).

Se ha establecido bien en la bibliografía que después de fertilización en Arabidopsis thaliana no hay división adicional en el revestimiento de semilla, y el crecimiento se produce solamente por expansión celular (Léon-Kloosterziel y col., 1994; Beeckman y col., 2000; Windsor y col., 2000). Obviamente las semillas con endospermos grandes también deben tener revestimientos de semilla grandes; sin embargo, en este caso, el revestimiento de semilla crece por expansión celular después de fertilización. En semillas en las que el revestimiento de semilla grande se considera la causa principal de agrandamiento de semilla (crecimiento de semilla conducido por integumento), el integumento/revestimiento de semilla contiene células extra, como se observa en mutantes mnt-1.

C. Aspectos adicionales del fenotipo mutante mnt-1

La mutación mnt-1 afecta a la morfología floral así como al tamaño de la semilla. La mayoría de las flores no se abren, esto se asocia con una desviación de la relación normal de longitud de sépalo y pétalo, de modo que los pétalos son más cortos que los sépalos. Específicamente, los sépalos mutantes mnt son aproximadamente 60% más largos que los de tipo silvestre. Esta desviación se debe principalmente a crecimiento excesivo de los sépalos causado por división celular extra, aunque en algunas condiciones los pétalos tampoco se expanden de forma normal. Esta característica puede ser comercialmente útiles en algunas especies de cultivo. Un aumento más pequeño de la longitud de los sépalos puede ser suficiente para evitar que la flor se abra permitiendo al mismo tiempo autofertilización. Adicionalmente, el polen se desprende de las anteras a los laterales del carpelo en lugar del estigma. Esto se asocia con crecimiento excesivo del gineceo causado por división celular extra, aunque en algunas condiciones los filamentos del estambre no se extienden de forma normal.

Los fenotipos florales dan como resultado esterilidad de las plantas a no ser que se lleve a cabo polinización manual (los homocigotos mnt-1 son fértiles femeninos, y el polen que completa el desarrollo también es fértil). Sin embargo las pocas flores producidas por mutantes mnt-1 parecen de tipo silvestre y estas son autofértiles.

La frecuencia de germinación de las semillas mnt-1 es normal y las plántulas son vigorosas.

Los mutantes mnt-1 tienen tallos de inflorescencia grueso en comparación con plantas de tipo silvestre (Figura 24). Una comparación de los tallos de inflorescencia primarios muestran que los tallos mnt-1 tienen un diámetro un 20% mayor que el tipo silvestre (diámetros medios mnt-1, 1,59 mm ± e.t.m. 0,04; w.t., 1,32 mm ± 0,06; n=6 para cada uno). Las secciones transversales (Figura 24B) muestran que las células son de tamaño normal en tallos mutantes mnt-1 pero se forman muchas más células.

D. Caracterización molecular del gen MNT de tipo silvestre y alelo mutante mnt-1

i) Secuencia MNT de tipo silvestre

Los inventores mapearon el locus MNT en una región de 60,9 kb del cromosoma 5 que se anotó por The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org) que contenía 17 genes. Las líneas de inserción de ADN T con inserciones en estos genes generados por El Laboratorio de Análisis Genómico del Instituto Salk (SIGNAL) (Alonso y col., 2003) (http://sig-nal.salk.edu) se obtuvieron del Centro de Almacenaje de Arabidopsis de Nottingham (NASC) (http://nasc.nott.ac.uk). La línea de Salk Nº 108995 (Nº de almacenaje de NASC N608995),

con una inserción en la región codificante del gen de FACTOR DE RESPUESTA A AUXINA 2 (ARF2), incluían un homocigoto vegetal para la inserción con un fenotipo similar a mutantes mnt-1, incluyendo flores cerradas y semillas grandes (Figura 5A-C). La puntuación genotípica de segregantes de la familia Salk 108995, incluyendo un heterocigoto y el homocigoto, se muestra en la Figura 5D. Específicamente la Figura 5D Parte superior: Puntuación con respecto a presencia de una inserción en el gen ARF2. Los cebadores usados fueron 5’ TGG TTC ACG TAG TGG GCC ATC G 3’, y 5’ GAG TGG GTG GAG TGT GTT TG 3’. Los carriles M y O muestran presencia de la inserción. Parte inferior: Puntuación para mutaciones de inserción homocigotas. Los cebadores usados fueron 5’GAG TGG GTG GAG TGT GTT TG 3’ y 5’ AGT TGG TTT TCG TTT GAG CAT 3’. Las condiciones de PCR se establecen de modo que el gen se amplifique solamente si no hay inserción: por lo tanto los productos de PCR se amplificarán a partir de ADN extraído de plantas de tipo silvestre y también las hemicigotas para la inserción, pero no plantas homocigotas. El carril M no muestra amplificación, lo que indica que esta planta es homocigota para la inserción. Se realizó un ensayo de alelismo cruzando un homocigoto de parental de semilla para la mutación mnt-1 con el homocigoto de Salk 108995 como parental de polen. La resistencia a F1 fue hemicigota para la inserción (Figura 5E) y tenía el fenotipo mutante mnt-1 (Figura 5F), confirmando que MNT es el gen ARF2.

MNT/ARF2 se denominará MNT en el resto de este documento. El gen MNT = At5g62000, Nº de acceso NM_125593. El ADN genómico para MNT, incluyendo la región codificante más 4371 bases de 5’ y 525 bases de región flanqueante 3’, se muestra en SEC ID Nº: 1. SEC ID Nº: 2 es el ADNc completo y SEC ID Nº: 3, la proteína predicha.

Los ARF forman parte del sistema para responder a auxina, una hormona que se sabe que está implicada en muchos procesos de desarrollo de plantas incluyendo división y expansión celular (Stals y Inzé, 2001; Leyser, 2002). Los ARF son factores de transcripción que en general no están inducidos por la auxina en sí mismos sino que regulan la expresión de genes inducibles por auxina, tales como miembros de la clase Aux/IAA (Liscum y Reed, 2002). Se ha mostrado que los ARF se unen a Elementos de Respuesta a Auxina (ARE) que contienen el motivo TGTCTC en los promotores de genes inducibles por auxina (Ulmasov y col., 1999a). Veintidós ARF que se ha predicho que son funcionales se han anotado en el genoma de Arabidopsis thaliana (Hagen y Guilfoyle, 2002). Los ARF contienen dos dominios conservados, un dominio de unión a ADN N terminal y un dominio de dimerización C terminal, y una región media variable. Un ARF puede activar o reprimir la transcripción de sus dianas y se cree que esto depende de la secuencia de la región media (Ulmasov y col., 1999b). Las pruebas hasta la fecha sugieren que ARF2 es probablemente un represor (Tiwari y col., 2003).

ii) Secuencia mnt-1 mutante

Los inventores secuenciaron la región codificante de ADN genómico del alelo mnt-1 más 4371 bases de las regiones flanqueantes 5’ y 525 bases de las 3’ (esta secuencia genómica se muestra en SEC ID Nº: 4). Un cambio de base sencilla con respecto a la secuencia de Col-3 de tipo silvestre, de G a A, se identificó en la posición 665 desde el inicio de la traducción, al final del intrón 3. Se predijo que esto afectaría al corte y empalme cambiando el sitio de corte y empalme 3’ conservado (Brown y Simpson, 1998) de la secuencia AG consenso a AA. Los inventores secuenciaron las primeras 837 bases del ADNc de mnt-1 desde el inicio de la traducción y confirmaron que se suprimieron cuatro bases del inicio del exón 4. El ADNc de mnt-1 desde el inicio de la traducción a la parada, que consistía en las 837 bases directamente secuenciadas más el resto de la región codificante de ADNc como se predice a partir del ADN genómico de mnt-1 secuenciado, se muestra en la SEC ID Nº: 5. Las secuencias de ADNc de MNT de tipo silvestre y mnt-1 mutante se alinean en la Figura 6.

La proteína mnt-1 predicha (SEC ID Nº: 6) tiene un desplazamiento de fase desde la posición de aminoácidos 123 y un codón de parada temprano en la posición 167. Las secuencias proteicas predichas de MNT de tipo silvestre y mnt-1 mutante se alinean en la Figura 7. El desplazamiento de fase y codón de parada temprano están ambos dentro del dominio de unión a ADN y por lo tanto el alelo de mnt-1 probablemente cause una pérdida completa de la función de MNT.

Ejemplo 1

Valor de mutantes mnt en el entendimiento y modificación del crecimiento de integumentos/revestimiento de semilla.

El fenotipo de semilla mutante mnt demuestra que hay una correlación entre el tamaño de los integumentos antes de la fertilización y el tamaño de la semilla madura en Arabidopsis thaliana (Figuras 1, 2). Debido a las similitudes en estructura de semilla entre grupos relacionados incluso de forma distante de plantas con flor, esto conduce a la expectativa de que la modificación del tamaño de integumento/revestimiento de semilla en otra especie, y ciertamente miembros de las Brasicáceas tales como Brassica napus, también dará como resultado cambios del tamaño de la semilla.

El conocimiento de los inventores del fenotipo mutante y mnt y la secuencia génica de MNT puede aprovecharse en otras especies a través de TILLING (“Dirección a las lesiones locales inducidas en genomas”). En esta técnica de genética inversa, las poblaciones mutadas químicamente se exploran con respecto a presencia de una mutación puntual en una secuencia de ácido nucleico de interés; esto puede hacerse como un procedimiento de alto

rendimiento y es aplicable a muchas especies (Till y col., 2003). Por ejemplo, TILLING podría aplicarse a los ortólogos de Brassica napus o arroz de MNT para modificar el tamaño de semilla en estas especies de cultivo.

El conocimiento de los inventores de que los heterocigotos mnt-1 son autofértiles y producen semillas mayores que plantas de tipo silvestre muestra que una planta con función MNT reducida (como en un heterocigoto para una mutación de MNT o en una planta que se ha modificado genéticamente de alguna forma para conseguir el mismo efecto que el cultivo convencional) producirá provechosamente semillas grandes sin pérdida de fertilidad.

Ejemplo 2 Modificación de la expresión de ortólogos de MNT en otras especies.

El conocimiento de la secuencia de MNT en Arabidopsis thaliana también permite a los inventores buscar ortólogos en especies de cultivo como una primera etapa necesaria en la modificación dirigida de la expresión del gen en estas especies.

Como ejemplo, los inventores amplificaron el ortólogo de Brassica napus potencial (BnARF2) de MNT usando cebadores (SEC ID Nº: 7, 8) basándose en la secuencia de MNT y en la secuencia de Brassica oleracea públicamente disponible. El ADNc de BnARF2 se amplificó a partir de ARN total aislado a partir de plántulas de Brassica napus variedad Westar. El ADNc de BnARF2 de inicio de la traducción a parada se muestra en SEC ID Nº: 9 y se alinea con ADNc de MNT de Arabidopsis thaliana en la Figura 8. La proteína predicha BnARF2 (SEC ID Nº: 10) tiene 85% de identidad con MNT de Arabidopsis thaliana.

Una familia de ARF también se ha caracterizado en arroz y uno de estos, OsARF2 (nº de acceso AB071293), se considera que es el ortólogo de ARF2 de Arabidopsis thaliana (Sato y col., 2001). La Figura 9 muestra un alineamiento de las secuencias proteicas predichas de MNT (ARF2 de Arabidopsis thaliana), BnARF2 y OsARF2.

Los ortólogos de MNT pueden determinarse para otras especies usando técnicas similares.

Ejemplo 3

Construcción, transformación y análisis de vectores indicadores para mostrar donde se expresan promotores de integumento/revestimiento de semilla en Arabidopsis thaliana.

Esto es para ensayar qué promotores son adecuados para dirigir expresión específica o preferida de integumento/revestimiento de semilla de ácidos nucleicos tales como construcciones de ARNi o antisentido MNT u otros genes que modifican la proliferación celular.

Se muestran diagramas de los vectores BJ60, BJ40, pFGC5941, pART7 y BJ36 usados en las estrategias de clonación descritas en este y los siguientes ejemplos en la Figura 10.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 11.

3a Construcción de vectores indicadores

3a(i) TT8

Se construye un vector indicador basado en el promotor del gen TT8 (Nesi y col., 2000; At4g09820, nº de acceso AJ277509) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor TT8 por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen TT8 usando los cebadores TT8F y TT8R que introducen un sitio NdeI y un PstI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR de TT8 respectivamente.

El fragmento de PCR de TT8 tiene una cola de A y se liga en pGEMT, después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ60, 5’ con el indicador uidA que incluye una señal terminadora, formando el vector TT8-BJ60.

3a(ii) TT12

Se construye un vector indicador basado en el promotor del gen TT12 (Debeaujon y col., 2000; At3g59O30, nº de acceso AJ294464) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor TT12 por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen TT12 usando los cebadores TT12F y TT12R que introducen un sitio NdeI y un PstI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR de TT12, respectivamente.

El fragmento de PCR TT12 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ60, 5’ del gen indicador uidA formando TT12-BJ60.

3b Construcción de vectores binarios y transformación en Arabidopsis thaliana

Se escinden casetes indicadores con NotI de los siguientes vectores:

TT8-BJ60 TT12-BJ60

y se ligan en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando los siguientes vectores para transformación:

TT8-uidA-BJ40 TT12-uidA-BJ40

Los vectores binarios se transforman en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis thaliana.

3c Análisis de patrones de expresión

El gen uidA codifica β-glucuronidasa (GUS), que se ensaya usando protocolos convencionales (por ejemplo Jefferson, 1987). Para la Figura 12 (posterior) se usó el siguiente ensayo. Las semillas se diseccionaron de silicuas en tampón de tinción de GUS (Tris-HCl 100 mM pH 7,2, NaCl 50 mM, Triton-X-100 0,1%, ácido 5-bromo-4-cloro-3indolil-beta-D-glucorónico 2 mM (X-Gluc), K3Fe(CN6)2 mM, K4Fe(CN)6 2 mM) y se incubaron durante una noche a 37 ºC.

La Figura 12 muestra una semilla en etapa globular de una planta que contiene la construcción TT12::uidA ensayada con respecto a expresión de GUS; la capa interior del integumento interior está teñida (flecha), lo que indica actividad del fragmento promotor de TT12 en ese integumentos.

Ejemplo 4

Construcción y transformación de un casete de ARNi que reduce la expresión de MNT en Arabidopsis thaliana, incluyendo reducción de la expresión en los integumentos/revestimiento de semilla.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 13A.

4a Construcción de casete de ARNi

Se construye un vector de ARNi basado en el gen MNT (véase anteriormente) como se describe posteriormente. Un fragmento de 0,57 kb del ADNc de MNT (“MNTi”) se amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana usando los cebadores FARF2i y RARF2inew que introducen sitios XbaI y AscI en el extremo 5’ del fragmento de PCR MNTi, y sitios BamHI y SwaI en el extremo 3’ del fragmento de PCR.

El fragmento de PCR MNTi tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con AscI y SwaI y se liga en los sitios AscI y Swal del vector de ARNi pFGC5941 3’ del promotor 35S y 5’ del intrón CHSA, que sitúa el fragmento en orientación directa. Esto forma el vector 35S-MNTi-pFGC5941. El fragmento de PCR MNTi se escinde después

5 de pGEMT con BamHI y XbaI y se liga en los sitios BamHI y XbaI del vector 35S-MNTi-pFGC5941, 3’ del intrón CHSA y 5’ de la señal terminadora ocs, que sitúa el fragmento en orientación inversa. Esto forma el vector 35SMNTi-inv MNTi-pFGC5941.

4b Transformación en Arabidopsis thaliana

Se transforma vector 35S-MNTi-inv MNTi-pFGC5941 en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis 10 thaliana.

4c Análisis de pesos de semillas en plantas transformadas con el vector de ARNi 35S::MNT

Las plantas de tipo silvestre transformadas con el vector de ARNi 35S::MNT descrito en el Ejemplo 4a, b tienen el fenotipo mutante mnt, incluyendo flores cerradas durante la mayor parte del ciclo de vida de la planta (Figura 13B parte superior izquierda), tallos de inflorescencia con diámetro aumentado (Figura 13B parte superior derecha), y

15 semillas grandes (Figura 13B, parte inferior). Las semillas de cuatro líneas transformadas de forma independiente, junto con plantas de tipo silvestre crecidas en las mismas condiciones, se muestra en la Figura 13B (parte inferior). El peso medio de estas cuatro líneas fue de 35,3 μg, en comparación con 13,8 μg para el control de tipo silvestre.

Ejemplo 5

Construcción y transformación de un casete de ARNi que reduce la expresión de BnARF2 en Brassica 20 napus, incluyendo expresión reducida en los integumentos/revestimiento de semilla.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 14.

5a Construcción de casete de ARNi

Se construye un vector de ARNi basado en el gen BnARF2 (Ejemplo 2, anteriormente) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 0,56 kb del ADNc de BnARF2 (BnARF2i) por PCR de ADNc de

25 Brassica napus usando los cebadores FBnARF2i y RBnARF2i que introducen sitios XbaI y AscI en el extremo 5’ del fragmento de PCR BnARF2i y sitios BamHI y SwaI en el extremo 3’ del fragmento de PCR.

El fragmento de PCR BnARF2i tiene cola de A y se liga en pGEMT y después se escinde con AscI y SwaI y se liga en los sitios AscI y Swal del vector de ARNi pFGC5941 3’ del promotor 35S y 5’ del intrón CHSA usando las enzimas 5

AscI y SwaI, que sitúa el fragmento en orientación directa. Esto forma el vector 35S-BnARF2i-pFGC5941. El fragmento de PCR BnARF2i se escinde después de pGEMT con BamHI y XbaI y se liga en los sitios BamHI y XbaI del vector 35S-BnARF2i-pFGC5941, 3’ del intrón CHSA y 5’ del terminador ocs, que sitúa el fragmento en orientación inversa. Esto forma el vector 35S-BnARF2i-inv BnARF2i-pFGC5941.

5b Transformación

El vector 35S-BnARF2i-inv BnARF2i-pFGC5941 se transforma en Agrobacterium tumefaciens y después en Brassica napus.

Ejemplo 6

Construcción y transformación de casetes de ARNi que reducen la expresión de MNT principalmente en los integumentos/revestimiento de semilla de Arabidopsis thaliana.

Esto es específicamente para fenocopiar el efecto de semilla grande de mutaciones mnt sin otros efectos en el crecimiento, desarrollo o fertilidad de las plantas.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 15.

6a Construcción de vectores de ARNi que contienen un promotor de integumento/revestimiento de semilla

6a(i) TT8

Un vector de ARNi en el que el promotor TT8 (Nesi y col., 2000; At4g09820, nº de acceso AJ277509) conduce a la repetición invertida de un fragmento de ácido nucleico de MNT (véase Ejemplo 4, anterior) se construye como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor TT8 por PCR de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen TT8 usando los cebadores TT8 EcoRI F y TT8 NcoI R que introducen un sitio EcoRI y NcoI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR TT8 respectivamente.

El fragmento de PCR TT8 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con EcoRI y NcoI y se intercambia con el promotor 35S en el vector 35S-MNT-inv MNTi-pFGC5941 (Ejemplo 4, anterior), formando el vector TT8-MNT-inv MNTi-pFGC5941.

6a(ii) INO

Se construye un vector de ARNi en el que promotor INO (Villanueva y col., 1999; At1g23420, nº de acceso AF195047) conduce una repetición invertida de un fragmento de ácido nucleico de MNT (véase Ejemplo 4, anterior) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,5 kb incluyendo el promotor INO por PCR de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen INO usando los cebadores FINOi y RINOi que introducen un sitio EcoRI y un NcoI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR de INO respectivamente.

El fragmento de PCR INO tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con EcoRI y NcoI y se intercambia con el promotor 35S en el vector 35S-MNT-inv MNTi-pFGC5941 (Ejemplo 4, anterior), formando el vector INO-MNT-inv MNTi-pFGC5941.

6b Transformación en Arabidopsis thaliana

Los vectores TT8-MNT-inv MNTi-pFGC5941 y INO-MNT-inv MNTi-pFGC5941 se transforman en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis thaliana.

Ejemplo 7

Construcción y transformación de casetes de ARNi que reducen la expresión de BnARF2 principalmente en los integumentos/revestimiento de semilla de Brassica napus.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 16.

7a Construcción de vectores de ARNi que contienen un promotor de integumento/revestimiento de semilla

7a(i) TT8

Se construye un vector de ARNi en el que el promotor TT8 (Nesi y col., 2000; At4g09820, nº de acceso AJ277509) conduce una repetición invertida de un fragmento de ácido nucleico de BnARF2 (véase Ejemplo 5, anterior) como se describe posteriormente. Se amplifica un promotor de 1,7 kb incluyendo el promotor TT8 con engarces EcoRI y NcoI por PCR de ADN genómico de Arabidopsis thaliana como se describe en el Ejemplo 6a(i) anterior.

El fragmento de PCR TT8 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con EcoRI y NcoI y se intercambia con el promotor 35S en el vector 35S-BnARF2-inv BnARF2i-pFGC5941 (Ejemplo 5, anterior), formando el vector TT8-BnARF2-inv BnARF2i-pFGC5941.

7a(ii) INO

Se construye un vector de ARNi en el que el promotor INO (Villanueva y col., 1999; At1g23420, nº de acceso ARF195047) conduce una repetición invertida de un fragmento de ácido nucleico de BnARF2 (véase Ejemplo 5, anterior) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,5 kb incluyendo el promotor INO con engarces EcoRI y NocI por PCR de ADN genómico de Arabidopsis thaliana como se describe en el Ejemplo 6a(ii) anterior.

El fragmento de PCR INO tiene cola A y se liga en pGEMT, y después se escinde con EcoRI y NcoI y se intercambia con el promotor 35S en el vector 35S-BnARF2-inv BnARF2i-pFGC5941 (Ejemplo 5, anterior), formando el vector INO-BnARF2-inv BnARF2i-pFGC5941.

7b Transformación en Brassica napus

Los vectores TT8-BnARF2-inv BnARF2i-pFGC5941 e INO-BnARF2-inv BnARF2i-pFGCS941 se transforman en Agrobacterium tumefaciens y después en Brassica napus.

Ejemplo 8

Construcción y transformación de un vector de expresión que aumenta la expresión de MNT en Arabidopsis thaliana, incluyendo expresión aumentada en los integumentos/revestimiento de semilla.

Esto es para producir una planta con tamaño de semilla alterado. La estrategia de clonación se muestra en la Figura 17.

8a Construcción de un vector para expresión constitutiva de MNT

Se describe posteriormente la construcción de un vector de expresión con el promotor 35S de CaMV que conduce el gen MNT. El ADNc de MNT incluyendo el inicio y parada de la traducción se amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana usando el cebador 35S Xho new y 35S Bam new que introduce un sitio XhoI y un BamHI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR MNT respectivamente.

El fragmento de PCR MNT tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI de pART7, 3’ del promotor 35S y 5’ del terminador ocs, formando el vector 35S-MNT-pART7. 5

8b Construcción de vectores binarios y transformación, en Arabidopsis thaliana

El casete de expresión 35S::MNT (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de 35S-MNT-pART7 con NotI y se liga en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector 35S-MNT-BJ40. El vector binario se transforma en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis thaliana.

8c Análisis de pesos de semillas en plantas transformadas con el casete 35S::MNT. Las plantas de tipo silvestre transformadas con el casete 35S::MNT descritas en el Ejemplo 8a, b tienen el fenotipo mutante mnt, incluyendo flores cerradas durante la mayor parte del ciclo de vida de la planta (Figura 17B, parte superior) y semillas grandes. Las semillas de tres líneas transformadas de forma independiente, junto con plantas de tipo silvestre crecidas en las mismas condiciones, se muestran en la Figura 17B, en el medio. El peso medio global para estas tres líneas fue de 25,5 μg, en comparación con 15,0 μg para el control de tipo silvestre. La expresión de MNT/ARF2 se ensayó en plantas transformadas y de tipo silvestre por RT-PCR semicuantitativa (Figura 17B, parte inferior) usando RT-PCR múltiple con los cebadores RTARF2-F (5’- GAGTGGGTGGAGTGTGTTTG-3’) y RTARF2-R (5’-AGTTGGTTTTCGTTTGAGCAT-3’), y cebadores de control para el gen GAPC, GAPC-F (5’-CACTTGAAGGGTGGTGCCAAG-3’) y GAPC-R (5’-CCTGTTGTCGCCAAC-GAAGTC-3’). La PCR se inició con cebadores RTARF2 y se procesó durante 4 ciclos a una temperatura de hibridación de 55 ºC, tiempo de extensión 2 minutos. Se añadieron cebadores GAPC a cada mezcla de reacción y la reacción se procesó durante 22 ciclos adicionales. Esto mostró que las plantas transformadas con el casete 35S::MNT no tenía niveles menores de expresión de MNT que las plantas de tipo silvestre; por lo tanto el fenotipo mutante no se debía a cosupresión. Por lo tanto la expresión constitutiva del gen de MNT (tal como se consigue bajo el control del promotor 35S) proporciona un procedimiento adicional para producir semillas grandes.

Ejemplo 9

Construcción y transformación de un casete de expresión que aumenta la expresión de BnARF2 en Brassica napus, incluyendo expresión aumentada en los integumentos/revestimiento de semilla.

Esto también es para producir una planta con tamaño de semilla alterado.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 17.

9a Construcción de un vector para expresión constitutiva de BnARF2

Se describe construcción de un vector de expresión con el promotor 35S de CaMV que conduce el gen BnARF2 posteriormente. El ADNc de BnARF2 de inicio a parada de la traducción se amplifica por PCR a partir de ADNc de Brassica napus usando los cebadores BnARF2 XhoI F y BnARF2 BamHI R que introducen un sitio XhoI y un BamHI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR BnARF2 respectivamente.

El fragmento de PCR BnARF2 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI de pART7, 3’ del promotor 35S y 5’ del terminador ocs, formando el vector 35S-BnARF2pART7.

9b Construcción de vectores binarios y transformación en Brassica napus

El casete de expresión 35S::BnARF2 (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de 35S-BnARF2-pART7 con NotI y se clona en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector 35S-BnARF2-BJ403.

El vector binario se transforma en Agrobacterium tumefaciens y después en Brassica napus. La expresión constitutiva del gen BnARF2 (tal como se consigue bajo el control del promotor 35Sr) proporciona un procedimiento adicional para producir semillas grandes.

Ejemplo 10

Construcción y transformación de casetes de expresión que aumentan la expresión de MNT principalmente en los integumentos/revestimiento de semilla de Arabidopsis thaliana.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 18.

10a Construcción de vectores de expresión que contienen un promotor de integumento/revestimiento de semilla

10a(i) TT8

Se construye un vector de expresión basado en el promotor TT8 (Nesi y col., 2000; At4g09820, nº de acceso AJ277509) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor TT8 con engarces NdeI y PstI por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana como se describe en el Ejemplo 3a(i) anterior. El fragmento de PCR TT8 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ3 6, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT8-BJ36.

10a(ii) INO

Se construye un vector de expresión basado en el promotor del gen INO (Villanueva y col., 1999; At1g23420, nº de acceso AF195047) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,5 kb incluyendo el promotor INO por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen INO usando los cebadores INOF e INOR que introducen un sitio NdeI y un PstI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR INO respectivamente.

El fragmento de PCR INO tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector INO-BJ36.

10b Construcción de vectores de expresión que contienen un casete de expresión promotor::MNT El ADNc de MNT con engarces XhoI y BamHI se amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana y se liga en pGEMT como se describe en el Ejemplo 8a, anterior.

10b(i) TT8-MNT

El fragmento de PCR MNT se escinde de pGEMT con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI del vector TT8-BJ36, 3’ del promotor TT8, formando el vector TT8-MNT-BJ36. 10b(ii) INO-MNT El fragmento de PCR MNT se escinde de pGEMT con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI del vector

INO-BJ36, 3’ del promotor INO, formando el vector INO-MNT-BJ36. 10c Construcción de vectores binarios y transformación 10c(i) TT8-MNT El casete de expresión TT8::MNT (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de TT8-MNT-BJ36 con NotI y se

clona en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector TT8-MNT-BJ40. 10c(ii) INO-MNT El casete de expresión INO::MNT (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de INO-MNT-BJ36 con NotI y se

clona en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector INO-MNT-BJ40. Los vectores binarios TT8-MNT-BJ40 e INO-MNT-BJ40 se transforman en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis thaliana.

Ejemplo 11

Construcción y transformación de vectores de expresión que aumentan la expresión de BnARF2 principalmente en los integumentos/revestimiento de semilla de Brassica napus.

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 19.

11a Construcción de vectores de expresión que contienen un promotor de integumento/revestimiento de semilla

11a(i) TT8

Se construye un vector de expresión basado en el promotor del gen TT8 (Nesi y col., 2000; At4g09820, nº de acceso AJ277509) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor TT8 por PCR de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen TT8 usando los cebadores TT8F y TT8 MluI R que introducen un sitio NdeI y un MluI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR TT8 respectivamente.

Un fragmento de PCR TT8 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y MluI y se liga en los sitios NdeI y Mlui de BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT8 (NdeI MluI)-BJ36.

11a(ii) INO

Se construye un vector de expresión basado en el promotor del gen INO (Villanueva y col., 1999; At1g23420, nº de acceso AF195047) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,5 kb incluyendo el promotor INO por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen INO usando los cebadores INOF e INO Mlul R que introducen un sitio NdeI y un MluI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR INO respectivamente.

El fragmento de PCR INO tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y MluI y se liga en los sitios NdeI y MluI de BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector INO (NdeI MluI)-BJ36.

11b Construcción de vectores de expresión que contienen un casete de expresión promotor::BnARF2 El ADNc de BnARF2 con engarces XhoI y BamHI se amplifica por PCR a partir de ADNc de Brassica napus y se liga en pGEMT como se ha descrito en el Ejemplo 9a, anterior.

11b(i) TT8

El fragmento de PCR BnARF2 se escinde de pGEMT con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI del vector TT8 (NdeI MluI)-BJ36, 3’ del promotor TT8, formando el vector TT8-BnARF2-BJ36. 11b(ii) INO El fragmento de PCR BnARF2 se escinde de pGEMT con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI del

vector INO (NdeI MluI)-BJ36, 3’ del promotor INO, formando el vector INO-BnARF2-BJ36. 11c Construcción de vectores binarios y transformación 11c(i) TT8 El casete de expresión TT8-BnARF2 (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de TT8-BnARF2-BJ36 con

NotI y se liga en los sitios de NotI del vector binario BJ40, formando el vector TT8-BnARF2-BJ40. 11c(ii) INO El casete de expresión INO-BnARF2 (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de INO-BnARF2-BJ36 con

NotI y se liga en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector INO-BnARF2-BJ40.

Los vectores binarios TT8-BnARF2-BJ40 y INO-BnARF2-BJ40 se transforman en Agrobacterium tumefaciens y después en Brassica napus.

Ejemplo 12

Construcción, transformación y análisis de vectores de expresión que aumentan la expresión de un gen que promueve la división celular en los integumentos/revestimiento de semilla de Arabidopsis thaliana

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 20.

12a Construcción de vectores de expresión que contienen un promotor de integumento/revestimiento de semilla

12a(i) TT8

Se construye un vector de expresión basado en el promotor TT8 (Nesi y col., 2000; At4g09820, nº de acceso AJ277509) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor TT8 con engarces NdeI y PstI por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana como se describe en el Ejemplo 3a(i), anterior. El fragmento de PCR de TT8 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT8-BJ36.

12a(ii) TT12

Se construye un vector de expresión basado en el promotor TT12 (Debeaujon y col., 2000; At3g59030, nº de acceso AJ294464) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor TT12 con engarces NdeI y PstI por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana como se describe en el Ejemplo 3a(ii), anterior. El fragmento de PCR TT12 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT12-BJ36.

12a(iii) INO

Se construye un vector de expresión basado en el promotor INO (Villanueva y col., 1999; At1g23420, nº de acceso AF195047) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,5 kb incluyendo el promotor INO con engarces NdeI y PstI por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana como se describe en el Ejemplo 10a(ii), anterior. Un fragmento de PCR INO tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector INO-BJ36.

12a(iv) BAN

Se construye un vector de expresión basado en el promotor del gen BAN (Devic y col., 1999; At1g61720, nº de acceso AF092912) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 0,4 kb incluyendo el promotor BAN por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen BAN usando los cebadores BANF y BANR que introducen un sitio NdeI y uno PstI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR BAN respectivamente.

El fragmento de PCR BAN tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI de BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector BAN-BJ36.

12b Construcción de casetes de expresión que contienen un promotor de integumento/revestimiento de semilla que conduce un gen que promueve la división celular

12b(i) Promotor::CYCD3;1

Se describe posteriormente la construcción de vectores de expresión con un promotor de integumento/revestimiento de semilla que conduce el gen CYCD3;1. El ADNc de CYCD3;1 (anteriormente Cycδ83; Soni y col., 1995; Vandepoele y col., 2002; At4g34160, nº de acceso X83371) se amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana usando los cebadores CYCD3F y CYCD3R que introducen un sitio SmaI y un BamHI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR CYCD3;1 respectivamente.

El fragmento de PCR CYCD3;1 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con SmaI y BamHI y se liga en los sitios SmaI y BamHI de los siguientes vectores:

5 Vector TT8-BJ36, 3’ del promotor TT8 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT8-CYCD3;1-BJ36 Vector TT12-BJ36, 3’ del promotor TT12 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT12CYCD3;1-BJ36 Vector INO-BJ36, 3’ del promotor INO y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector INO-CYCD3;1

10 BJ36 Vector BAN-BJ36, 3’ del promotor BAN y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector BAN-CYCD3;1-BJ36

12b(ii) Promotor::IPT1

Se describe posteriormente la construcción de vectores de expresión con un promotor de integumento/revestimiento

15 de semilla que conduce al gen IPT1. El gen IPT1 (Takei y col., 2001; At1g68460, nº de acceso AB062607) se amplifica por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana (el gen IPTI no contiene intrones) usando los cebadores IPT1F e IPT1R que introducen un sitio SmaI y un BamHI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR IPT1 respectivamente.

20 El fragmento de PCR IPT1 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con SmaI y BamHI y se liga en los sitios SmaI y BamHI de los siguientes vectores:

Vector TT8-BJ36, 3’ del promotor TT8 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT8-IPT1-BJ36 Vector TT12-BJ36, 3’ del promotor TT12 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT12-IPT1-BJ36

25 Vector INO-BJ36, 3’ del promotor INO y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector INO-IPT1-BJ36 Vector BAN-BJ36, 3’ del promotor BAN y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector BAN-IPT1-BJ36

12b(iii) Promotor::ANT

Se describe posteriormente la construcción de vectores de expresión con un promotor de integumento/revestimiento de semilla que conduce el gen ANT. El gen ANT (Klucher y col., 1996; At4g37750, nº de acceso NM_119937) se 30 amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana usando los cebadores ANTF y ANTR que introducen un sitio SmaI y un BamHI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR ANT respectivamente.

El fragmento de PCR ANT tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con SmaI y BamHI y se liga en los sitios SmaI y BamHI de los siguientes vectores:

Vector TT8-BJ36, 3’ del promotor TT8 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT8-ANT-BJ36 Vector TT12-BJ36, 3’ del promotor TT12 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT12-ANT-BJ36 Vector INO-BJ36, 3’ del promotor INO y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector INO-ANT-BJ36 Vector BAN-BJ36, 3’ del promotor BAN y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector BAN-ANT-BJ36

12b(iv) Promotor::CYCB1;1

Se describe posteriormente la construcción de vectores de expresión con un promotor de integumento/revestimiento de semilla que conduce al gen CYCB1;1. El gen CYCB1;1 (anteriormente CyclαAt; Ferreira y col., 1994; Vandepoele y col., 2002; At4g37490, nº de acceso NM_119913) se amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana usando los cebadores CYCB1F y CYCB1R que introducen un sitio SmaI y un BamHI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR CYCB1;1 respectivamente.

El fragmento de PCR CYCB1;1 tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con SmaI y BamHI y se liga en los sitios SmaI y BamHI de los siguientes vectores:

Vector TT8-BJ36, 3’ del promotor TT8 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT8-CYCB1;1-

BJ36

Vector TT12-BJ36, 3’ del promotor TT12 y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector TT12

CYCB1;1-BJ36

Vector INO-BJ36, 3’ del promotor INO y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector INO-CYCB1;1-

BJ36

Vector BAN-BJ36, 3’ del promotor BAN y 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector BAN-CYCB1;1-

BJ36

12c Construcción de vectores binarios y transformación en Arabidopsis thaliana

Se escinden casetes de expresión (incluyendo el terminador ocs) con NotI a partir de los siguientes vectores TT8-CYCD3;1-BJ36 TT8-IPT1-BJ36 TT8-ANT-BJ36 TT8-CYCB1;1-BJ36 TT12-CYCD3;1-BJ36 TT12-IPT1-BJ36 TT12-ANT-BJ36 TT12-CYCB1;1-BJ36 INO-CYCD3;1-BJ36 INO-IPT1-BJ36 INO-ANT-BJ36 INO-CYCB1;1-BJ36 BAN-CYCD3;1-BJ36 BAN-IPT1-BJ36

BAN-ANT-BJ36 BAN-CYCB1;1-BJ36 y se ligan en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando los siguientes vectores para transformación:

TT8-CYCD3;1-BJ40 TT8-IPT1-BJ40 TT8-ANT-BJ40 TT8-CYCB1;1-BJ40 TT12-CYCD3;1-BJ40 TT12-IPT1-BJ40 TT12-ANT-BJ40 TT12-CYCB1;1-BJ40 INO-CYCD3;1-BJ40 INO-IPT1-BJ40 INO-ANT-BJ40 INO-CYCB1;1-BJ40 BAN-CYCD3;1-BJ40 BAN-IPT1-BJ40 BAN-ANT-BJ40 BAN-CYCB1;1-BJ40

12d Análisis de pesos de semillas en transformantes

Se muestran resultados de algunos transformantes primarios usando el promotor TT8 en la Tabla 2A y Figura 21A. El histograma muestra que las semillas de plantas TT8::CYCD3;1 y TT8::IPT1 tienen una distribución más amplia y pico más alto de pesos que los controles. Las líneas TT8::uidA se usaron como controles, puesto que no se descubrió que la expresión del gen uidA afectara al crecimiento y desarrollo de la planta. Las plantas TT8::CYCD3;1 individuales produjeron semillas hasta 97% más pesadas que los controles, con un aumento medio sobre 27 líneas de 37%. Las plantas TT8::IPT1 produjeron semillas hasta 107% más pesadas, con un aumento medio sobre 24 líneas de 28%. Los pesos medios de las semillas TT8::CYCD3;1 y TT8::IPT1 se compararon con los controles usando ensayos de t y se descubrió que eran significativamente diferentes de los controles con P<0,000. Debería observarse que algunas de las líneas TT8::IPT1, incluyendo la línea de mayor peso, también tenían un fenotipo vegetativo que incluía enanismo, hojas serradas, y fertilidad extremadamente baja, probablemente debido a que el promotor TT8 conduce la expresión vegetativa de IPT1 en algunas líneas. Sin embargo las líneas con desarrollo vegetativo normal también produjeron semillas grandes. Es probable que la expresión vegetativa de TT8 pudiera prevenirse si se requiere por la técnica de disección del promotor (por ejemplo Chandrasekharan y col., 2003).

Tabla 2A Pesos de semillas en transformantes primarios individuales de familias TT8::GUS (control), TT8::CYCD3;1 y TT8::IPT1

TT8::GUS (controles): TT8::CYCD3;1 TT8::IPT1

17,0 μg (n=52): 19,0 μg (n=77) 21,8 μg (n=45)

14,2 (79): 21,6 (61) 15,6 (62)

14,7 (51): 22,5 (52) 23,4 (68)

13,9 (47): 17,9 (52) 20,9 (95)

14,7 (66): 17,5 (63) 11,2 (58)

15,1 (43): 16,9 (89) 19,3 (89)

14,2 (50): 16,6 (54) *19,9 (119)

14,8 (61): 18,6 (57) 17,9 (64)

13,9 (54): 17,7 (56)

24,3 (64): 18,6 (54)

21,9 (57): 13,2 (48)

29,2 (49): 17,6 (72)

(continuación)

TT8::GUS (controles): TT8::CYCD3;1 TT8::IPT1

18,2 (49): 20,8 (66)

17,0 (72): *30,6 (43)

23,0 (45): 14,0 (61)

18,6 (56): 19,5 (64)

28,1 (56): 20,5 (47)

20,1 (47): 18,8 (68)

17,8 (47): 15,8 (65)

18,8 (58): 22,1 (47)

26,1 (55): 14,2 (47)

16,4 (55): 19,6 (49)

24,6 (56): 17,3 (50)

19,5 (49): *26,7 (51)

16,1 (51)

25,8 (58)

18,0 (62)

*plantas con fertilidad muy baja

Media: 14,8 20,3 19,0

Intervalo: 13,9 a 17,0 13,9 a 29,2 11,2 a 30,6

Error típico: 0,3 0,8 0,9

ensayo de t para control frente a TT8::CYCD3;1 y TT8:IPT1, P < 0,000, significativo

Se muestran resultados adicionales de plantas transformadas con vectores de expresión para aumentar el tamaño de la semilla en la Tabla 2B y la Figura 21B. Para estos experimentos, los inventores seleccionaron líneas resistentes a kanamicina con semillas pesadas y confirmaron la presencia del vector de expresión usando PCR. 5 Para dos de las líneas posteriores los inventores pesaron semillas producidas por plantas T3, confirmando la heredabilidad del rasgo de semilla grande. En la Tabla 2B, se muestran los pesos de controles (en este caso los controles fueron Col-0 de tipo silvestre) junto con transformantes en los que los controles y transformantes se dejaron crecer juntos. Las semillas BAN::CYCD3;1 fueron 35% más pesadas que los controles cultivados en las mismas condiciones, y las semillas INO::ANT fueron 53% más pesadas. Las semillas INO::ANT también fueron

10 deformes (Figura 21 B), lo que sugiere que el casete de expresión afecta de hecho a desarrollo del revestimiento de semilla.

Tabla 2B Pesos de semillas de plantas transformadas con casetes de expresión para aumentar el tamaño de la semilla

transformante: w.t. Col-3 (controles)

BAN::CYCD3;1 (semillas de plantas T2): 23,9 μg 17,7 μg

INO::ANT(T2): 23,1 15,1

INO::IPT1 (T3): 26,4

TT8::CYCD3;1 (T3): 23,2

Ejemplo 13

Construcción, transformación y análisis de vectores de expresión que aumentan la expresión de un gen que promueve la división celular en los integumentos/revestimiento de semilla de Brassica napus

Los vectores binarios descritos en el Ejemplo 12c (anterior) se transforman en Brassica napus.

Ejemplo 14

Construcción de un vector de expresión que contiene un promotor específico de pétalo y estambre que conduce MNT y transformación en mutantes mnt

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 22.

14a Construcción de un vector de expresión basado en el promotor AP3

Se construye un vector de expresión basado en el promotor del gen AP3 (Jack y col., 1992; At3g54340, nº de acceso AY142590) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1 kb incluyendo el promotor AP3 por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen AP3 usando los cebadores AP3F y AP3R que introducen un sitio NdeI y un PstI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR AP3 respectivamente.

El fragmento de PCR AP3 tiene cola de A y se liga con pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI del vector BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector AP3-BJ36.

14b Construcción de un vector de expresión que contienen un casete de expresión AP3::MNT

El ADNc de MNT con engarces XhoI y BamHI se amplifica por PCR de Arabidopsis thaliana y se liga en pGEMT como se describe en el Ejemplo 8a, anterior. El fragmento de PCR MNT se escinde con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI del vector AP3-BJ36, 3’ del promotor AP3 y 5’ del terminador ocs, formando el vector AP3-MNT-BJ36.

14c Construcción de vectores binarios y transformación en Arabidopsis thaliana

El casete de expresión AP3::MNT (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de AP3-MNT-BJ36 con NotI y se clona en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector AP3-MNT-BJ40. El vector binario se transforma en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis thaliana.

Ejemplo 15

Construcción de un vector de expresión que contiene un promotor específico de sépalos y pétalos que conduce MNT y transformación en mutantes mnt

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 23.

15a Construcción de un vector de expresión basado en el promotor AP1

Se construye un vector de expresión basado en el promotor del gen AP1 (Mandel y col., 1992; At1g69120, nº de acceso NM_105581) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 1,7 kb incluyendo el promotor AP1 por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana 5’ del inicio de la traducción del gen AP1 usando los cebadores AP1F y AP1R que introducen un sitio NdeI y un PstI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR AP3 respectivamente.

El fragmento de PCR AP1 tiene cola de A y se liga con pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI del vector BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector AP1-BJ36.

15b Construcción de un vector de expresión que contiene un casete de expresión AP1::MNT

El ADNc de MNT con engarces XhoI y BamHI se amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana y se liga en pGEMT como se describe en el Ejemplo 8a, anterior. El fragmento de PCR MNT se escinde con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI del vector AP1-BJ36, 3’ del promotor AP1 y 5’ del terminador ocs, formando el vector AP1-MNT-BJ36.

15c Construcción de vector binario y transformación en Arabidopsis thaliana

El casete de expresión AP1::MNT (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de AP1-MNT-BJ36 con NotI y se clona en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector AP1-MNT-BJ40. El vector binario se transforma en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis thaliana.

Ejemplo 16 Valor de mutantes mnt en el entendimiento y modificación del crecimiento del tallo de inflorescencia

Los mutantes mnt-1 tienen tallos de inflorescencia gruesos en comparación con las plantas de tipo silvestre. El diámetro aumentado de tallos de mnt-1 está causado por divisiones celulares extra (Figura 24B). Por lo tanto se espera que el grosor del tallo pueda aumentar en otras especies por alteración de la expresión de un ortólogo de MNT y de este modo aumentar el número de células en el tallo.

Ejemplo 17

Construcción de un casete de ARNi que reduce la expresión de MNT en Arabidopsis thaliana, incluyendo expresión reducida en el tallo.

La estrategia de clonación y transformación se describe en el Ejemplo 4. La estrategia de clonación se muestra en la Figura 13A. Las plantas transformadas tienen un diámetro de tallo aumentado con respecto al tipo silvestre (diámetro de tallo de inflorescencia medio entre los nodos 2 y 3: w.t., 1,293 ± e.t.m. 0,4 mm, n=13; ARNi 35S::MNT, 1,419 ± 0,4, n=14; el ensayo de t de dos colas muestra que los diámetros de los tallos de w.t. y ARNi 35S::MNT son significativamente diferentes a P<0,05). El fenotipo del tallo de plantas transformadas en comparación con plantas de tipo silvestre se muestra en la Figura 13B.

Ejemplo 18

Construcción de un vector de expresión que contiene un promotor preferido de flores que conducen MNT y transformación en mutantes mnt

La estrategia de clonación se muestra en la Figura 25.

18a Construcción de un vector de expresión basado en el promotor LFY

Se construye un vector de expresión basado en el promotor del gen LFY (Weigel y col., 1992; At5g61850, nº de acceso NM_125579) como se describe posteriormente. Se amplifica un fragmento de 2,1 kb incluyendo el promotor LFY por PCR a partir de ADN genómico de Arabidopsis thaliana del inicio de la traducción del gen LFY usando los cebadores LFYF y LFYR que introducen un sitio NdeI y un PstI en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de PCR AP3 respectivamente.

El fragmento de PCR LFY tiene cola de A y se liga en pGEMT, y después se escinde con NdeI y PstI y se liga en los sitios NdeI y PstI del vector BJ36, 5’ de la señal terminadora ocs, formando el vector LFY-BJ36.

18b Construcción de un vector de expresión que contiene un casete de expresión LFY::MNT

El ADNc de MNT con engarces XhoI y BamHI se amplifica por PCR a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana y se liga en pGEMT como se describe en el Ejemplo 8a, anterior. El fragmento de PCR MNT se escinde con XhoI y BamHI y se liga en los sitios XhoI y BamHI del vector LFY-BJ36, 3’ del promotor LFY, y 5’ del terminador ocs, formando el vector AP1-LFY-BJ36.

18c Construcción de vector binario y transformación en Arabidopsis thaliana

El casete de expresión LFY::MNT (incluyendo la señal terminadora ocs) se escinde de AP1-LFY-BJ36 con NotI y se clona en los sitios NotI del vector binario BJ40, formando el vector AP1-LFY-BJ40.

El vector binario se transforma en Agrobacterium tumefaciens y después en Arabidopsis thaliana.

SEC ID Nº

1 ADN genómico de MNT w.t Col-0 2 ADNc de MNT w.t.Col-0 3 Proteína predicha de MNT w.t. Col-0 4 ADN genómico de mnt-1 Col-3 5 ADNc de mnt-1 Col-3, inicio a parada de la traducción 6 proteína predicha mnt-1 Col-3 7 cebador F para amplificar ADNc de ARF2 de Brassica napus 8 cebador R para amplificar ADNc de ARF2 de Brassica napus 9 ADNc de BnARF2, inicio a parada de la traducción 10 proteína predicha de BnARF2 11 cebador F para promotor TT8 con engarce NdeI 12 cebador R para promotor TT8 con engarce PstI 13 cebador F para promotor TT12 con engarce NdeI 14 cebador R para promotor TT12 con engarce PstI 15 cebador F para fragmento de ARNi de MNT con engarces Xbal y AscI 16 cebador R para fragmento de ARNi de MNT con engarces BamHI y SawI 17 cebador F para fragmento de ARNi de BnARF2 con engarces XbaI y AscI 18 cebador R para fragmento de ARNi de BnARF2 con engarces BamHI y SwaI 19 cebador F para promotor TT8 con engarce EcoRI 20 cebador R para promotor TT8 con engarce NcoI 21 cebador F para promotor INO con engarce EcoRI 22 cebador R para promotor INO con engarce NcoI 23 cebador F para ADNc de MNT con engarce XhoI 24 cebador R para ADNc de MNT con engarce BamHI 25 cebador F para ADNc de BnARF2 con engarce XhoI 26 cebador R con ADNc de BnARF2 con engarce BamHI 27 cebador F para promotor INO con engarce NdeI 28 cebador R para promotor INO con engarce PstI 29 cebador R para promotor TT8 con engarce Mlul 30 cebador R para promotor INO con engarce MIuI 31 cebador F para promotor BAN con engarce NdeI 32 cebador R para promotor BAN con engarce PstI 33 cebador F para ADNc de CYCD3;1 con engarce SmaI 34 cebador R para ADNc de CYCD3;1 con engarce BamHI 35 cebador F para ADNc de IPT1 con engarce SmaI 36 cebador R para ADNc de IPT1 con engarce BamHI 37 cebador F para ADNc de ANT con engarce SmaI 38 cebador R para ADNc de ANT con engarce BamHI 39 cebador F para ADNc de CYCB1;1 con engarce SmaI 40 cebador R para ADNc de CYCB1;1 con engarce BamHI 41 cebador F para promotor AP3 con engarce NdeI 42 cebador R para promotor AP3 con engarce PstI 43 cebador F para promotor AP1 con engarce NdeI 44 cebador R para promotor AP1 con engarce PstI 45 cebador F para promotor LFY con engarce NdeI 46 cebador R para promotor LFY con engarce PstI

SEC ID Nº: 1

ADN genómico de MNT de tipo silvestre, Col-0

SEC ID Nº: 2

ADNc completo de MNT de tipo silvestre Col-0

SEC ID Nº: 3

Proteína predicha de MNT de tipo silvestre Col-0

SEC ID Nº: 4

ADN genómico de mnt-1 Col-3

SEC ID Nº: 5

ADNc mnt-1, de inicio a parada de la traducción

SEC ID Nº: 6

Proteína predicha de mnt-1 Col-3

5 SEC ID Nº: 7 Cebador directo para amplificar ARF2 de Brassica napus 5’ ATGGCGAGTTCGGAGGTTT 3’

SEC ID Nº: 8

Cebador inverso para amplificar ARF2 de Brassica napus 10 5’ TGGACAATGAAGGATTTGATG 3’

SEC ID Nº: 9

ADNc de BnARF2, de inicio a parada de la traducción

SEC ID Nº: 10

Proteína predicha de BnARF2

Referencias

Adams, S., Vinkenoog, R., Spielman, M., Dickinson, H. G., y Scott, R. J. (2000). Parental imprinting in Arabidopsis thaliana requires DNA methylation. Development 127, 2493-2502. 5 Alexander, H. M. y Wulff, R. D. (1985). Experimental ecological genetics in Plantago X. The effects of maternal

temperature on seed and seedling characters in P. lanceolata. Journal of Ecology 73, 271-282. Austin, R. B. (1980). Physiological limitations to cereal yields and ways of rescuing them by breeding. In opportunities for increasing crop yields (ed. R. G. Hurd, P. V. Biscoe, y C. Dennis), pp. 3-20. Pitman, Londres.

Alonso, J. M. y col. (2003) Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301, 653-657.

10 Alonso-Blanco, C., Blankestijn-De Vries, H., Hanhart, C. J., y Koornneef, M. (1999). Natural allelic variation at seed size loci in relation to other life history traits of Arabidopsis thaliana. PNAS USA 96, 4710-4717. Baker, S. C., Robinson-Beers, K., Villanueva, J. M., Gaiser, J. C., y Gasser, C. S. (1997). Interactions among

genes regulating ovule developing in Arabidopsis thaliana. Genetics 145, 1109-24. Board, J. (2001). Reduced lodging for soybean in low plant population is related to light quality. Crop Science 41, 15 379-384.

Beeckman, T., De Rycke, R., Viane, R., y Inzé, D. (2000). Histological study of seed coat development in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Research 113, 139-148. Bouman, F. (1975). Integument initiation and testa development in some Cruciferae. Botanical Journal of the

Linnean Society 70, 213-229. 20 Bouman, F. (1984). The ovule. In Embryology of angiosperms (ed. B. M. Johri), pp.123-157. Springer, Berlín.

Branen, J. K., Shintani, D. K., y Engeseth, N. J. (2003). Expression of antisense acyl carrier protein-4 reduces lipid content in Arabidopsis leaf tissue. Plant Physiology 132, 748-756. Brown, J. W. S. y Simpson, C. G. (1998). Splice site selection in plant pre-mRNA splicing. Annual Review of

Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49, 77-95. 25 Chandrasekharan, M. B., Bishop, K. J., y Hall, T. C. (2003). Module-specific regulation of the β-phaseolin

promoter during embryogenesis. Plant Journal 33, 853-866.

Cheng, W.-H., Taliercio, E. W., y Chourey, P. S. (1996). The Miniaturel seed locus of maize encodes a cell wall invertase required for normal development of endosperm and maternal cells in the pedicel. Plant Cell 8, 971-983.

Choi, D. S., Lee, Y., Cho, H. T. y Kende, H. (2003). Regulation of expansin gene expression affects growth and development in transgenic rice plants. Plant Cell 15, 1386-1398.

Clough, S. J. y Bent, A. F. (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal 16, 735-743.

Debeaujon, I., Peeters, A. J. M., Léon-Kloosterziel, K. M., y Koornneef, M. (2001). The TRANSPARENT TESTA12 gene of Arabidopsis encodes a multidrug secondary transporter-like protein required for flavonoid sequestration in vacuoles of the seed coat endothelium. Plant Cell 13, 853-871.

Devic, M., Guilleminot, J., Debeaujon, I., Bechtold, N., Bensaude, E., Koornneef, M., Pelletier, G., y Delseny, M. (1999). The BANYULS gene encodes a DFR-Like protein and is a marker of early seed coat development. Plant Journal 19, 387-398.

Doyholos, M. K., y Sieburth, L. E. (2000). Separable whorl-specific expression and negative regulation by enhancer elements within the AGAMOUS second intron. Plant Cell 12, 1799-1810.

Duvick, D. N. (1992) Genetic contributions to advances in yield of United States maize. Maydica 37, 69-79.

Esau (1965) Plant Anatomy (2ª Edición) Wiyley N.Y.

Ferreira, P. C. G., Hemerly, A. S., de Almeida Engler, J., Van Montagu, M., Engler, G., y Inzé, D. (1994). Developmental expression of the Arabidopsis cyclin gene cyclAt. Plant Cell 6, 1763-1774.

Garcia, D., Saingery, V., Chambrier, P., Mayer, U., Jürgens, G., y Berger, F. (2003). Arabidopsis haiku mutants reveal new controls of seed size by endosperm. Plant Physiology 131, 1661-1670.

Garcia, D., Fitz Gerald, J. N., y Berger, F. (2005). Maternal control of integument cell elongation and zygotic control of endosperm growth are coordinated to determine seed size in Arabidopsis. Plant Cell 17, 52-60.

Gleave, A. P. (1992). A versatile binary vector system with a T-DNA organisational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome. Plant Molecular Biology 20, 1203-1207.

Goto, K. y Meyerowitz, E. M. (1994). Function and regulation of the Arabidopsis floral homeotic gene PISTILLATA. Genes and Development 8, 1548-1560.

Guberac, V., Martinic, J. y Maric, S. (1998). Influence of seed size on germinability, germ length, root length and grain yield in spring oat. Bodenkultur 49, 13-18.

Hagen, G. y Guilfoyle, T. (2002). Auxin-responsive gene expression: genes, promoters and regulatory factors. Plant Molecular Biology 49, 373-385.

Harper, J. L., Lovell, P. H., y Moore, K. G. (1970). The shapes and sizes of seeds. Annual Review of Ecology and Systematics 1, 327-356.

Hemerly, A., de Almeida Engler, J., Bergounioux, C., Van Montagu, M., Engler, G., Inzé, D., y Ferreira, P. (1995). Dominant negative mutants of the CDC2 kinase uncouple cell division from interative plant development. EMBO Journal 14, 3925-3936.

Hu, Y., Xie, Q., y Chua, N.-H. (2003). The Arabidopsis auxin-inducible gene ARGOS controls lateral organ size. Plant Cell 15, 1951-1961.

Jack, T., Brockman, L. L., y Meyerowitz, E. M. (1992). The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens. Cell 68, 683-697.

Jefferson, R. A. (1987). Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405.

Jofuku, K. D., Omidyar, P. K., Gee, Z., y Okamuro, J. K. (2005). Control of seed mass and seed yield by the floral homeotic gene APETALA2. PNAS 102, 3117-3122.

Jones, R. J., Schreiber, B. M. N., y Roessler, J. A. (1996). Kernel sink capacity in maize: genotypic and maternal regulation. Crop Science 36, 301-306.

Klucher, K. M., Chow, H., Reiser, L., y Fischer, R. L. (1996). The AINTEGUMENTA gene of Arabidopsis required

for ovule and female gametophyte development is related to the floral homeotic gene APETALA2. Plant Cell 8, 137-53.

Krannitz, P. G., Aarssen, L. W., y Dow, J. M. (1991). The effect of genetically based differences in seed size on seedling survival in Arabidopsis thaliana (Brassicaceae). American Journal of Botany 78, 446-450.

Leyser, O. (2002). Molecular genetics of auxin signaling. Annual Review of Plant Biology 53, 377-398.

Liscum, E. y Reed, J. W. (2002). Genetics of Aux/IAA and ARF action in plant growth and development. Plant Molecular Biology 49, 387-400.

Lopez-Dee, Z. P., Wittich, P., Pé, M. E., Rigola, D., del Buono, I., Sari Gorla, M., Kater, M. M., y Colombo, L. (1999). OsMADS13, a novel rice MADS-box gene expressed during ovule development. Developmental Genetics 25, 237-244.

Mandel, A. M., Gustafson-Brown, C., Savidge, B., y Yanofsky, M. F. (1992). Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA1. Nature 360, 273-277.

Manga y Yadav (1995). Effect of seed size on developmental traits and ability to tolerate drought in pearl-millet. Journal of Arid Environments 29, 169-172.

Marshall, D. L. (1986). Effect of seed size on seedling success in three species of Sesbania (Fabaceae). American Journal of Botany 73, 457-464.

Miliuviene, L., Novickiene, L., Gaveliene, V., Brazauskiene, I., y Pakalniskyte, L. (2004). Possibilities to use growth regulators in winter oilseed rape growing technology. 1. The effect of retardant analogues on oilseed rape growth. Agronomy Research 2, 207-215.

Moloney, M. M., Walker, J. M., y Sharma, K. K. (1989) Plant Cell Reports 8, 238-242.

Nahm, M. Y., Kim, S. W., Yun, D. J., Lee, S. Y., Cho, M. J., y Bahk, J. D. (2003). Molecular and biochemical analysis of OsRAB7, a rice Rab7 homolog. Plant and Cell Physiology 44, 1341-1349.

Nesi, N., Debeaujon, I., Jond, C., Pelletier, G., Caboche, M., y Lepiniec, L. (2000). The TT8 gene encodes a basic helix-loop-helix domain protein required for expression of DFR and BAN genes in Arabidopsis siliques. Plant Cell 12, 1863-1878.

Nesi, N., Jond, C., Debeaujon, I., Caboche, M., y Lepiniec, L. (2001). The Arabidopsis TT2 gene encodes an R2R3 MYB domain protein that acts as a key determinant for proanthocyanidin accumulation in developing seed. Plant Cell 13, 2099-2114.

Nesi, N., Debeaujon, I., Jond, C., Stewart, A. J., Jenkins, G. I., Caboche, M., y Lepiniec. L. (2002). The TRANSPARENT TESTA16 locus encodes the ARABIDOPSIS BSISTER MADS domain protein and is required for proper development and pigmentation of the seed coat. Plant Cell 14, 2463-2479.

Nicholas, K. B. y Nicholas, H. B., Jr. (1997). GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. http://www.psc.edu/biomed/genedoc

Ohto, M., Fischer, R. L., Goldberg, R. B., Nakamura, K., y Harada, J. J. (2005). Control of seed mass by APETALA2. PNAS 102, 3123-3128.

Patrick, J. W. y Offler, C. E. (1995). Poist-sieve element transport of sucrose in developing seeds. Australian Journal of Plant Physiology 22, 681-702.

Paul, M. J. y Foyer, C. H. (2001). Sink regulation of photosynthesis. Journal of Experimental Botany 52, 13831400.

Resier, L., Modrusan, Z., Margossian, L., Samach, A., Ohad, N., Haughn, G. W., y Fischer, R. L. (1995). The BELL1 gene encodes a homeodomain protein involved in pattern formation in the Arabidopsis ovule primordium. Cell 83, 735-742.

Reynolds, M. P., Skovmand, B., Trethowan, R. M., Singh, R. P., y van Ginkel, M. (2001)-Applying physiological strategies to wheat breeding. Research highlights of the CIMMYT wheat program 1999-2000, http://www.cimmyt.cgiar.org

Robinson-Beers, K., Pruitt, R. E., y Gasser, C. S. (1992). Ovule development in wild-type Arabidopsis and two female-sterile mutants. Plant Cell 4, 1237-1249.

Sagasser, M., Lu, G.-H., Hahlbrock, K., y Weisshaar, B. (2002).A. thaliana TRANSPARENT TESTA 1 is involved in seed coat development and defines the WIP subfamily of plant zinc finger proteins. Genes and Development

16, 138-149.

Sato, Y., Nishimura, A., Ito, M., Ashikari, M., Hirano, H.-Y., y Matsuoka, M. (2001). Auxin response factor family in rice. Genes Genet. Syst. 76, 373-380.

Schaal, B A. (1980). Reproductive capacity and seed size in Lupinus texensis. American Journal of Botany 67, 703-709.

Schneitz, K., Hülskamp, M., y Pruitt, R. E. (1995). Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant Journal 7, 731-749.

Scott, R. J, Spielman, M., Bailey, J., y Dickinson, H. G. (1998) Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development 125, 3329-3341.

Soni, R., Carmichael, J. P., Shah, Z. H., y Murray, J. A. H. (1995). A family of cyclin D homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interaction motif. Plant Cell 7, 85-103.

Stals, H. y Inzé, D. (2001). When plant cells decide to divide. Trends in Plant Science 6, 359-364.

Swank, J. C., Egli, D. B., y Pfeiffer, T. W. (1987). Seed growth characteristics of soybean genotypes differing in duration of seed fill. Crop Science 1, 85-89.

Takei, K., Sakakibara, H., y Sugiyama, T. (2001). Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry 276, 2640526410.

Till, B. J. y col. (2003). Large-scale discovery of induced point mutations with high-throughput TILLING. Genome Research 13, 524 -530.

Tiwari, S. B., Hagen, G., y Guilfoyle, T. J. (2003). The roles of auxin response factor domains in auxinresponsive transcription. Plant Cell 15, 533-543.

Ulmasov, T., Hagen, G., y Guilfoyle, T. J. (1999a). Dimerization and DNA binding of auxin response factors. Plant Journal 19, 309-319.

Ulmasov, T., Hagen, G., y Guilfoyle, T. J. (1999b). Activation and repression of transcription by auxin-response factors. PNAS USA 96, 5844-5849.

Vandepoele, K., Raes, J., De Veylder, L., Rouzé, P., Rombauts, S., y Inzé, D. (2002). Genome-wide analysis of core cell cycle genes in Arabidopsis. Plant Cell 14, 1-16.

Villanueva, J. M., Broadhvest, J., Hauser, B. A., Meister, R. J., Schneitz, K., y Gasser, C. S. (1999). INNER NO OUTER regulates abaxial-adaxial patterning in Arabidopsis ovules. Genes and Development 13, 3160-3169.

Vinkenoog, R., Spielman, M., Adams, S., Fischer, R. L., y Dickinson, H. G. (2000). Hypomethylation promotes autonomous endosperm development and rescues post-fertilization lethality in fie mutants. Plant Cell 12, 22712282.

Wan, L., Xia, Q., Qui, X., y Selvaraj, G. (2002). Early stages of seed development in Brassica napus: a seed coat-specific cysteine proteinase associated with programmed cell death of the inner integument. Plant Journal 30,1-10.

Wang, M.-B. y Waterhouse, P. M. (2001). Application of gene silencing in plants. Current Opinion in Plant Biology 5, 146-150.

Weber, H., Borisjuk, L., y Wobus, U. (1996). Controlling seed development and seed size in Vicia faba: a role for seed coat-associated invertases and carbohydrate state. Plant Journal 10, 823-824.

Weber, H., Borisjuk, Ljudmilla, y Wobus, U. (1997). Sugar import and metabolism during seed development. Trends in Plant Science 2, 169-174.

Weigel, D., Alvarez, J., Smyth, D. R., Yanofksy, M. F., y Meyerowitz, E. M. (1992). LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis. Cell 69, 843-859.

Weschke, W., Panitz, R., Gubatz, S., Wang, Q., Radchuk, R., Weber, H., y Wobus, U. (2003). The role of invertases and hexose transporters in controlling sugar ratios in maternal and filial tissues of barley caryopses during early development. Plant Journal 33, 395-411.

Winn, A. A. (1985). Effects of seed size and microsite on seedling emergence of Prunella vulgaris in four habitats. Journal of Ecology 73, 831-840.

Wulff, R. D. (1986). Seed size variation in Desmondium paniculatum II. Effects on seedling growth and physiological performance. Journal of Ecology 74, 99-114.

Yamada, T., Ito, M., y Kato, M. (2003). Expression pattern of INNER NO OUTER homologue in Nymphaea (water lily family, Nymphaeaceae). Development Genes and Evolution 213, 510-513.

Zuber, U. Winzeler, H., Messmer, M. M., Keller, M., Keller, B., Schmid, J. E., y Stamp, P. (1999). Morphological traits associated with lodging resistance of spring wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agronomy and Crop Science 182, 17-24.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para modificar proliferación celular en los integumentos y/o revestimientos de semilla de una planta que comprende modular la expresión del gen mnt en la planta o material de propagación de planta.
2.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el tamaño global en los integumentos/revestimiento de semilla en la planta se modifica.
3.

Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 en el que la expresión de mnt se inhibe.
4.

Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación 1 a 3 en el que la división celular en los integumentos/revestimiento de semilla aumenta dando como resultado una semilla mayor en comparación con tipo silvestre.
5.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la semilla es al menos 5% más pesada que el tipo silvestre.
6.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el diámetro del tallo de la planta modificada o transformada es al menos 10% mayor que el tipo silvestre.
7.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la longitud de los sépalos de la planta es suficientemente mayor que el tipo silvestre para inhibir la apertura de la flor.
8.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el número de células en los integumentos/revestimiento de semilla de la planta aumenta en comparación con el tipo silvestre.
9.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que la expresión de mnt está potenciada.
10.

Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que la expresión del gen mnt se modula transformando la planta o material de propagación de planta con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia reguladora.
11.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia reguladora incluye un promotor.
12.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el promotor es el promotor del gen INO o BEL1, el promotor 35S o un promotor del gen BAN TT1, TT2, TT8, TT12 o TT16.
13.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la secuencia de ácido nucleico comprende o deriva de MNT de tipo silvestre o una forma mutante de mnt.
14.

Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la planta se ha modificado para mantener su fertilidad.
15.

Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la función de MNT de tipo silvestre se restaura a pétalos y estambres de la planta o una planta mutante mnt de modo que las semillas tengan un fenotipo modificado pero de modo que la fertilidad no se altere.