ES2392080T3

ES2392080T3 - Haces de hélices superenrolladas de lipopéptido y partículas pseudovíricas sintéticas

Info

Publication number: ES2392080T3
Application number: ES07856406T
Authority: ES
Inventors: Francesca Boato; Annabelle Freund; Arin Ghasparian; Kerstin MÖHLE; John A. Robinson; Richard M. Thomas
Original assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Priority date: 2006-12-09
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2012-12-04
Anticipated expiration: 2027-12-06
Also published as: CY1113173T1; PT2121732E; PL2121732T3; CA2672052C; US20100015173A1; AU2007327829A1; CA2672052A1; JP5276598B2; US8450284B2; EP2121732A1; SI2121732T1; AU2007327829B2; JP2010512308A; DK2121732T3; WO2008068017A1; EP2121732B1

Abstract

Bloque constructivo de lipopéptido que consiste de una cadena peptídica de entre 21 y 80 residuos aminoácidos, que comprende un dominio superenrollado unido covalentemente a una fracción lípido que comprende dos o tres cadenas hidrocarbilo largas y opcionalmente unido a un antígeno.

Description

Haces de helices superenrolladas de lipopeptido y particulas pseudoviricas sinteticas

Campo de la invencion La invencion se refiere a bloques constructivos de lipopeptido que comprenden un dominio superenrollado y opcionalmente un antigeno, los cuales se agregan formando haces de lipopeptidos helicoidales y particulas pseudoviricas sinteticas. Las particulas pseudoviricas sinteticas que portan antigenos resultan utiles como vacunas.

Antecedentes de la invencion Es bien conocido que los peptidos y proteinas de pequeno tamano habitualmente solo son pobremente inmunogenicos. Los adyuvantes toxicos, tales como el bien conocido adyuvante completo de Freund, han sido

ampliamente utilizados para inducir respuestas inmunologicas contra vacunas de subunidades en animales, aunque muchas no pueden utilizarse en el ser humano debido a sus efectos secundarios toxicos. La situacion ideal seria evitar por completo la utilizacion de adyuvantes externos, pero esto tipicamente resulta en respuestas inmunologicas pobres. Sin embargo, el sistema inmunologico (humano) genera respuestas inmunologicas robustas contra patogenos que expresan estructuras antigenicas repetidas sobre una superficie, por ejemplo las superficies de un

virus [Zinkernagel R., Science 171:173-178, 1996]. Los liposomas han sido intensamente investigados durante los ultimos 30 anos como portadores para productos farmaceuticos, entre ellos farmacos, acidos nucleicos y biofarmacos, y son bien conocidas las aplicaciones de los mismos, por ejemplo los vehiculos de administracion para antigenos, acidos nucleicos y farmacos. Las propiedades

de los liposomas pueden alterarse mediante el acoplamiento de peptidos o proteinas a la superficie de los mismos con el fin de reconocer receptores especificos, creando sistemas conocidos como proteoliposomas. Tambien se han incorporado peptidos y proteinas en liposomas con el fin de generar respuestas inmunologicas [Leserman L., J. Liposome Res. 14:175-189, 2004; Frisch B. et al., Methods Enzymol. 373:51-73, 2003]. El conjugado de peptidos con lipidos facilita su insercion en los liposomas, con el lipido anclado en la membrana bicapa, permitiendo de esta

manera el reconocimiento del peptido por parte de anticuerpos en la superficie del liposoma. Una de las desventajas de los liposomas como vehiculo general de administracion es su inestabilidad in vivo, debido a su rapida eliminacion de la sangre y la captura por parte de las celulas del sistema reticuloendotelial [Torchilin V.P., Nat. Rev. Drug Discov. 4:145-160, 2005].

Las potenciales ventajas de la utilizacion de particulas pseudoviricas, compuestas de virus naturales o modificados geneticamente y las quimeras, incluyendo fagos o componentes viricos naturales o modificados geneticamente, tales como las proteinas de capside, las proteinas de superficie y las glucoproteinas, o fragmentos de los mismos, en el diseno de las vacunas, han sido reconocidas desde hace ya cierto tiempo [Felnerova D. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 15:518-529, 2004; Garcea R.L. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 15:513

517, 2004; Doan L.

. et al., Rev. Med. Virol. 15:75-88, 2005]. La produccion de dichas particulas pseudoviricas utiliza los procesos viricos naturales de autoensamblaje. Pueden aprovecharse las estructuras nucleares autoensamblantes naturales de muchos virus utilizando tecnologia de ADN recombinante para expresar uno o mas antigenos sobre la superficie de dichas particulas. Estas particulas pseudoviricas no son accesibles mediante sintesis quimica debido a su gran tamano y complejidad estructural. Las solicitudes de patente WO n°

98/014564 y n° 00/035479 se refieren a "particulas pseudoviricas sinteticas", aunque las particulas a las que se hace referencia en ellas se basan en particulas viricas naturales o modificadas geneticamente, o a componentes de las mismas, construidas mediante metodos de ADN recombinante y basados en celulas, no materiales producidos mediante sintesis quimica. La patente WO n° 00/32227 describe la utilizacion de particulas nucleares de origen natural o no natural a la que se unen antigenos de modo ordenado y repetitivo, ejemplificadas por la

utilizacion del virus recombinante Sindbis. Tambien se han realizado esfuerzos considerables para disenar peptidos y proteinas autoensamblantes para aplicaciones nanotecnologicas. Se han producido morfologias a escala nanometrica basadas en peptidos anfifilicos de diseno [Lowik D.W.P.M. et al., Chem. Soc. Rev. 33:234-245, 2004], incluyendo las presentan estructuras

secundarias de cadenas �, laminas � y helices a] [Rajagopal K. et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 14:480-486, 2004; Tu

R.S.et al., Adv. Drug Deliv. Revs. 56:1537-1563, 2004]. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de la utilizacion de lipopeptidos para preparar materiales compuestos nanoestructurados en el trabajo de Stupp y colaboradores [Behanna H.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 127:1193-1200, 2005]. Anteriormente se ha demostrado el autoensamblaje de un peptido anfifilo en nanofibras [Hartgerink J.D. et al., Science 294:1684-1688, 2001].

Uno de los problemas principales durante el diseno de vacunas efectivas basadas en antigenos sinteticos ha sido su baja inmunogenicidad. Las moleculas sinteticas relativamente pequenas tienden a ser poco inmunogenicas. Un enfoque para superar dicha baja inmunogenicidad es conjugar covalentemente el antigeno sintetico con un portador, tal como una proteina como la toxina tetanica o la hemocianina de lapa americana (KLH) [Herrington D.A. et al.,

Nature 328:257-259, 1987]. Sin embargo, el conjugado todavia debe administrarse en el animal conjuntamente con un adyuvante (por ejemplo alum o adyuvante de Freund) para inducir una respuesta inmunologica fuerte. Se han descrito otros metodos para producir constructos multiepitopo que incorporan epitopos de celulas B y de celulas T (revisados en [Jackson D.C. et al., Vaccine 18:355-361, 1999].

Los analogos sinteticos de lipopeptidos bacterianos han recibido mucha atencion en la investigacion sobre vacunas, por sus efectos adyuvantes y como portadores para peptidos antigenicos [Ghielmetti M. et al., Immunobiology 210:211-215, 2005]. Es conocido que los lipidos y lipopeptidos pueden actuar como adyuvantes de inmunogenos peptidicos que de otra manera serian debiles [Jung G. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 10:872, 1985; Martinon F. et al.,

J. Immunol. 149:3416, 1992]. Se ha informado de muchos constructos lipopeptidos, en los que un lipido con efectos adyuvantes conocidos se acopla con un peptido para generar candidatos a vacunas autoadyuvantes. Han sido particularmente bien estudiados la tripalmitoil-S-gliceril-cisteina (N-palmitoil-S-(2,3-bis-(O-palmitoiloxi)-propil)cisteinilo o Pam3Cys) y la dipalmitoil-S-gliceril-cisteina (2,3-bis-(O-palmitoiloxi)-propil)-cisteinilo o Pam2Cys) [Ghielmetti M. et al., Immunobiology 210:211-215, 2005]. Dichas fracciones lipidicas se encuentran en componentes lipoproteina de las membranas interna y externa de las bacterias Gram-negativas. Los lipopeptidos sinteticos que portan dichos u otros residuos S-gliceril-cisteina diacilados o triacilados en el extremo N-terminal se ha demostrado que son ligandos especificos de receptores de tipo Toll [Reutter F. et al., J. Pept. Res. 65:375-383, 2005; Buwitt-Beckmann U. et al., Eur. J. Immunol. 35:1-8, 2005]. Ademas, la conjugacion de peptidos antigenicos con Pam3Cys o Pam2Cys se ha aplicado al diseno de candidatos a vacuna sintetica autoadyuvante [Bessler W.G. et al., Int. J. Immunopharmac. 19:547-550, 1998; Loleit M. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371:967-975, 1990; Muller C.P. et al., Clin. Exp. Immunol. 78:499-504, 1989]. La solicitud de patente WO n° 98/07752 describe la utilizacion para el direccionamiento de farmacos, de lipopeptidos en los que la parte peptido puede ser una secuencia de tipo colageno capaz de inducir la formacion de estructuras de triple helice.

Recientemente han aparecido varias revisiones sobre el diseno de helices superenrolladas [Woolfson D.N., Adv. Prot. Chem. 70:79-112, 2005], incluyendo un volumen de Advances in Protein Chemistry dedicado a las helices superenrolladas, el colageno y los elastomeros [Parry D.A.D. et al., Advances in Protein Chemistry 70, 2005]. Muchos virus y microbios naturales contienen secuencias peptidicas con estructura de helice superenrollada dentro de sus propias proteinas de superficie (por ejemplo la hemaglutinina del virus Influenza o gp41 del virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) o la glucoproteina F del virus sincitial respiratorio (VSR)).

Descripcion resumida de la invencion

La invencion se refiere a bloques constructivos de lipopeptido (BLC) que consisten de una cadena peptidica (CP) que comprende un dominio de helice superenrollada, unido covalentemente a una fraccion lipido (FL) que comprende dos o tres cadenas hidrocarbilo largas y opcionalmente unido a un antigeno (A); haces de helices de lipopeptido (HHL) que comprenden dos, tres, cuatro o cinco bloques constructivos de lipopeptido (LBB), estando determinado el numero de bloques constructivos por las propiedades del dominio de helice superenrollada en la cadena peptidica de los bloques constructivos lipopepticos (LBB) y particulas pseudoviricas sinteticas (SVLP) que comprenden un gran numero de haces de lipopeptidos helicoidales (HLB) y que presentan una estructura esferica o esferoide con un nucleo lipidico y una superficie externa peptidica.

La invencion se refiere ademas a procedimientos de produccion de bloques constructivos de lipopeptido (LBB), haces de lipopeptidos helicoidales (HLB) y particulas pseudoviricas sinteticas (SVLP); a la utilizacion de bloques constructivos de lipopeptido (LBB) y a particulas pseudoviricas sinteticas (SVLP) que portan antigenos, en la preparacion de vacunas; y a metodos de vacunacion que utilizan dichas vacunas. De manera similar, la invencion se refiere a preparaciones farmaceuticas que contiene particulas pseudoviricas que portan antigenos.

Las diversas composiciones de la invencion resultan utiles para inducir respuestas inmunologicas para la prevencion

o tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones, incluyendo enfermedades infecciosas, alergias, cancer, adiccion a farmacos, envenenamiento y generalmente para inducir eficientemente las respuestas inmunologicas especificas de antigeno.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Representaci6n esquematica de los componentes y ensamblaje de una CP de SVLP, comprendiendo la cadena peptidica un dominio superenrollado; FL, fraccion lipido; A, antigeno; LBB, bloque constructivo de lipopeptido; HLB, haz de lipopeptido helicoidal (se muestra un trimero); SVLP, particula pseudovirica sintetica (con antigenos).

Figura 2: Representaci6n esquematica de motivos heptadas presentes en peptidos superenrollados

A: Heptada. a, b, c, d, e, f, g: residuos a-aminoacidos (todos (L) o todos (D)). a y d (mostrados con una flecha) son a-aminoacidos hidrofobicos. 3 a 8 motivos heptada representan un tipico peptido superenrollado.

B: Ensamblaje en un trimero que muestra las interacciones de los residuos hidrofobicos a y d.

Figura 3: Perfil representativo del equilibrio de sedimentaci6n de agregados de lipopeptido 4. Panel inferior: A231, absorbancia en 231 nm. Puntos de datos para 5.000, 7.500 y 10.000 rpm. La concentracion de lipopeptido era de 24 !M en fosfato sodico 0,01 M, pH 7,4, que contenia cloruro sodico 0,09 M (PBS). Panel superior: fDO, diferencia de densidades opticas. Residuales del ajuste global de 18 datos a 24 y 48 !M y con 3 velocidades de rotor.

Figura 4: Experimentos de velocidad de sedimentaci6n para agregados de lipopeptido 4 a diferentes concentraciones c(s): distribuci6n del coeficiente de sedimentaci6n aparente. Todas las distribuciones (para 10, 30, 50, 75, 100 y 150 !M) se encontraban centradas entre 9,5 y 10 S.

Figura 5: Modelo informatico de SVLP SVLP formado a partir de lipoproteina 4 compuesta de 24 subunidades (HLB). Cada HLB (mostrados a la derecha) esta formado de tres copias del lipopeptido 4, proporcionando una superhelice trimerica.

Figura 6: Espectros de CD de agregados de lipopeptido 4 y peptido 5 A, longitud de onda en nm; e, elipticidad por residuo medio, en grados.cm2/dmol.lipopeptide 4 (20 fM) and peptide 5 (50 fM) en PBS a pH 7,4

Figura 7: Espectros de emisi6n de pireno-3-carboxialdehfdo (PYCHO) de agregados de lipopeptido 4 A, longitud de onda, en nm; I437, intensidad de fluorescencia a 437 nm (unidades arbitrarias). Las diferentes curvas corresponden a tampon (PBS) y las concentraciones de lipopeptido 4: 80, 100, 200, 400, 600, 800 y 1.000 nM.

Figura 8: Concentraciones micelares crfticas de agregados de lipopeptido 4. Los datos de fluorescencia se analizaron para determinar las concentraciones micelares criticas (CMC). Los datos se expresan como I437 / I466 frente a la concentracion de lipopeptido 4 (nM). La insercion muestra como se determinaria la CMC bajo condiciones ideales.

Figura 9: Analisis de distribuci6n NICOMP ponderado por numero de las mediciones de DLS para agregados de lipopeptido 4.

Solucion 1,1 mM de lipopeptido 4 en tampon TRIS a pH 7,4 y 20°C. El diametro medio de las particulas formadas era de aproximadamente 17 nm.

Figura 10: Micrograffas electr6nicas de tinci6n negativa de agregados de lipopeptido 4. SVLP formadas por el lipopeptido 4 en tampon TRIS, pH 7,4. Barra de escala a la izquierda, 20 nm; barra de escala a la derecha, 50 nm (ampliacion). Pueden apreciarse claramente la forma de estrella de las particulas de 15 a 20 nm y la elevada homogeneidad de la muestra.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion comprende bloques constructivos de lipopeptido (LBB) que consisten de:

-: una cadena peptidica (PC) que comprende un dominio superenrollado, unido covalentemente a:

-: una fraccion lipido (FL) que comprende tres, o preferentemente dos, cadenas hidrocarbilo largas, y opcionalmente unido a:

-: un antigeno (A).

La cadena peptidica (CP) comprende dominios superenrollados. Dichos dominios superenrollados se asocian en un haz helicoidal definido, por ejemplo en un haz dimerico, trimerico, tetramerico, pentamerico, hexamerico o heptamerico. El peptido puede contener entre 12 y 120 residuos aminoacidos, preferentemente entre 21 y 80 residuos aminoacidos. Los dominios superenrollados contienen multiples motivos repetidos en tandem, que, como peptidos autonomos carentes de lipidos, presentan la propiedad de autoensamblarse en un haz helicoidal superenrollado paralelo. La cadena peptidica (CP) debe multimerizarse para formar un haz helicoidal superenrollado paralelo de estado de oligomerizacion definido (por ejemplo dimero, trimero, tetramero, pentamero, hexamero o heptamero, en particular dimero, trimero, tetramero o pentamero). Las secuencias peptidicas preferentes son secuencias no humanas, para evitar el riesgo de trastornos autoinmunologicos al aplicarse en la vacunacion de seres humanos.

La cadena peptidica puede comprender ademas un motivo de secuencia de aminoacidos que incluye uno o mas epitopos de celulas T ayudantes y/o filas de residuos polares que estimulan la solubilidad del bloque constructivo de lipopeptido (LBB) en agua.

La fraccion lipido (FL) contiene un anclaje lipidico con dos o tres, preferentemente dos, cadenas hidrocarbilo largas y una estructura que combina dichas cadenas hidrocarbilo y la conecta a la cadena peptidica (CP), directamente o mediante un conector. Son fracciones lipido preferentes los fosfolipidos que contienen dos o tres, preferentemente dos, cadenas hidrocarbilo extendidas.

La expresion "hidrocarbilo largo" se refiere a un grupo alquilo o alquenilo lineal de por lo menos 7 atomos de carbono, por ejemplo alquilo o alquenilo lineal que consiste de entre 8 y 50 atomos de C, preferentemente de entre 8 y 25 atomos de C. Los alquenilo preferentemente presentan uno, dos o tres dobles enlaces en la cadena, cada uno con una geometria E o Z, tal como se encuentra habitualmente en los acidos grasos y alcoholes grasos naturales. Tambien se encuentran incluidos en la definicion de "hidrocarbilo largo" los alquilos o alquenilos ramificados, por ejemplo alquilos que portan un sustituyente metilo o etilo en el segundo o tercer atomo de carbono contado desde el

5 final de la cadena, tal como, por ejemplo, 2-etil-hexilo.

.

en la que R1 y R2 son hidrocarbilos largos o hidrocarbil-C=O largo e Y es H o COOH.

en la que R1, R2 y R3 son hidrocarbilos largos o R 1 y R2 son hidrocarbil-C=O largo y R3 es H o acetilo,

en las que R1 y R2 son hidrocarbil-C=O largo y n es 1, 2, 3 o 4,

15 en las que R1 y R2 son hidrocarbilos largos, es O o NH, y n es 1, 2, 3 o 4, o

en las que R1 y R2 son hidrocarbilos largos.

20 La fraccion lipido contiene por lo menos dos cadenas hidrocarbilo largos, tales como las que se encuentran en los acidos grasos, por ejemplo tal como en Z1 a Z8. Una fraccion lipido preferente es un fosfolipido de entre diversos tipos, por ejemplo de formula Z1 o Z2, que presenta cadenas alquilo o alquenilo unidas mediante ester o eter, tales como un enantiomero de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina o analogos aquirales, tales como 1,3dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamina. Una fraccion lipido preferente es un residuo tripalmitoil-S-glicerilcisteinilo o

5 dipalmitoil-S-glicerilcisteinilo (tipo Z3) o fracciones lipidos de los tipos Z4 a Z8. Resultan mas preferentes las fracciones lipido indicadas en los Ejemplos.

La cadena peptidica (CP) se encuentra unida covalentemente a la fraccion lipido (FL) en un extremo o en una posicion proxima a un extremo, es decir, el extremo N-terminal o el extremo C-terminal, preferentemente el extremo

10 N-terminal. La fraccion lipido puede unirse directamente (1) o mediante un conector (2 o 3), en la que L se refiere a un conector y es O o NH.

Resultara evidente para el experto en la materia, que existe una gran diversidad de conectores y estrategias de acoplamiento adecuados, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, los conectores basados en derivados de acido 15 dicarboxilico, conectores que contienen una o multiples unidades de etilenglicol, residuos aminoacidos (incluyendo a-aminoacidos, -aminoacidos, y-aminoacidos y o-aminoacidos, etc.) o unidades sacaridas (de carbohidrato), o que contienen anillos herociclicos. Son conectores particulares los conectores L1 a L10, en los que n se encuentra comprendido entre 1 y 20 y m se encuentra comprendido entre 1 y 20, mostrados con el grupo funcional conector

Resultan mas preferentes los conectores indicados en los Ejemplos.

La expresion "proximo a un extremo" tal como se interpreta en el presente contexto se refiere a que la fraccion lipido se encuentra unida al primer, segundo, tercer, cuarto o quinto aminoacido contado desde el extremo N-terminal o Cterminal, respectivamente, del peptido. La fraccion lipido puede unirse al esqueleto de la estructura peptidica o a la cadena lateral de uno de dichos aminoacidos proximos al extremo.

"Antigenos" tal como se define en la presente invencion son moleculas capaces de ser ligadas por un anticuerpo. El antigeno puede comprender un peptido, una proteina o un mimetico de epitopo que presenta uno o mas epitopos de celula B que deben utilizarse para inducir una respuesta inmunologica humoral especifica de antigeno en un animal. Alternativamente, el antigeno puede comprender un hapteno o un carbohidrato. Los antigenos peptidicos y proteicos adecuados comprenden hasta 150 aminoacidos y entre ellos se incluyen los glucopeptidos y las glucoproteinas. Las secuencias peptidicas y proteicas pueden seleccionarse para inducir una respuesta inmunologica, por ejemplo contra una o mas variedades de agente infeccioso. Dichos antigenos son bien conocidos de la tecnica. Un mimetico de epitopo es una molecula que imita un epitopo peptidico o carbohidrato natural, incluyendo compuestos peptidicos que contienen uno o mas aminoacidos no naturales, por ejemplo D-aminoacidos, �-aminoacidos, y-aminoacidos, oaminoacidos o £-aminoacidos, y otros conocidos en la tecnica de los mimeticos de epitopo. Resultan preferentes los peptidomimeticos restringidos conformacionalmente, que se encuentran fijos en una conformacion de tipo proteico. "Haptenos" se refiere a compuestos organicos con un peso molecular inferior a 3.000, que no inducen respuestas inmunologicas humorales por si mismos, pero que inducen una respuesta inmunologica tras su union a un portador. Entre los haptenos ejemplares se incluyen los farmacos, hormonas, toxinas y carbohidratos.

Resultan preferentes los antigenos indicados en los Ejemplos.

El antigeno se encuentra unido covalentemente en el otro extremo, o en una posicion proxima al mismo, de la cadena peptidica, en donde "otro" se refiere al extremo del peptido que no porta la fraccion lipido. En el caso de que la fraccion lipido se encuentra conectada al extremo N-terminal del peptido o en una posicion proxima al extremo, el antigeno se encuentra unido al extremo C-terminal o en una posicion proxima al extremo. En el caso de que la fraccion lipido se encuentra conectada al extremo C-terminal del peptido, el antigeno se encuentra unido al extremo N-terminal o en una posicion proxima al extremo.

Pueden conjugarse uno o mas antigenos al dominio superenrollado de la cadena peptidica (CP), por ejemplo mediante una o mas de las cadenas laterales de aminoacidos en el peptido superenrollado (por ejemplo lisina o cisteina) o al extremo de la cadena peptidica. El antigeno porta un grupo funcional adecuado para la conjugacion con un grupo funcional en una de las cadenas laterales o en el extremo de la cadena peptidica. Resultan preferentes los antigenos reconocidos por un receptor de celula B, o por un hapteno, para inducir respuestas inmunologicas basadas en anticuerpos y especificas de antigeno.

Los "dominios superenrollados" se disenan mediante cuidadosa seleccion de las secuencias de aminoacidos apropiadas que forman un haz paralelo a-helicoidal termodinamicamente estable de helices mediante autoasociacion espontanea.

Un dominio superenrollado incluye peptidos basados en repeticiones en tandem de secuencias heptadas canonicas formando a-helices anfipaticas dextrogiras, que despues se ensamblan formando haces helicoidales con superhelices levogiras. Tambien se encuentran incluidos los peptidos construidos a partir de repeticiones no canonicas y no basadas en heptadas, que forman helices superenrolladas que no son necesariamente levogiras o ni siquiera superhelices normales.

Las helices superenrolladas canonicas se encuentran ampliamente presentes en peptidos y proteinas biologicamente activos naturales, y tambien han sido disenadas de novo. Se ha determinado un conjunto de reglas para el diseno de peptidos helicoidales superenrollados que adoptan haces helicoidales con un estado de oligomerizacion, topologia y estabilidad definidos (por ejemplo dimero, trimero, tetramero, pentamero, hexamero o heptamero). Estas reglas permiten a los disenadores construir una secuencia peptidica compatible con una estructura diana dada. Resulta mas importante que las secuencias de los peptidos helicoidales superenrollados canonicos contengan un motivo de siete residuos caracteristico que tipicamente se repite 3 a 10 veces. Las posiciones dentro de un motivo heptada tradicionalmente se expresan como abcdefg, encontrandose mayoritariamente (aunque no exclusivamente) residuos hidrofobicos en los sitios a y d, y generalmente residuos polares favorecedores de helices en otros sitios. Los motivos heptada en tandem a lo largo de una cadena peptidica presentan una separacion media entre los residuos a y d que les permite encontrarse situados en una cara de la a-helice. En el caso de que dos o mas helices se empaqueten conjuntamente en un haz superenrollado, las caras hidrofobicas de las helices se asocian y envuelven entre si con el fin maximizar los contactos entre las superficies hidrofobicas (figura 2). El tipo de residuo que puede encontrarse en cada posicion dentro de una repeticion de heptada influira sobre la estabilidad y estado de oligomerizacion del haz helicoidal. En general, en los sitios a y d mayoritariamente se utilizan residuos hidrofobicos (Ala, Ile, Leu, Met y Val) o cadenas laterales hidrofobicas aromaticas (Phe, Trp y Tyr). Los sitios restantes, b, c, e, f y g, tienden a ser mas permisivos que los sitios a y d, aunque resultan favorecidos los residuos polares y favorecedores de helice (Ala, Glu, Lys y Gln). La eleccion de residuos en los sitios a y d puede influir sobre el estado de oligomerizacion de la helice superenrollada (es decir, dimero frente a trimero). De esta manera, los dimeros resultan favorecidos en el caso de que se encuentren residuos no de ramificacion (por ejemplo Leu) en las posiciones d; en estos sitios, los residuos con ramificacion (Val

e Ile) resultan desfavorables a la formacion de dimeros. Por otra parte, en los dimeros, resultan preferentes los residuos con ramificacion (Ile y Val) en los sitios a. Otra regla es que a=d=Ile o Leu favorece la formacion de trimeros, lo que resulta util para disenar helices superenrolladas que forman especificamente trimeros paralelos. Dichas reglas y otras reglas de diseno se comentan en mayor detalle en [Woolfson D.N., Adv. Prot. Chem. 70:79-112, 2005].

El motivo heptada codifica a-helices anfipaticas que se oligomerizan a partir de sus caras hidrofobicas (figura 2). El dominio superenrollado incluye por lo menos tres motivos repetidos heptadas en tandem. El numero superior de repeticiones heptadas en cada cadena influira sobre la estabilidad del haz helicoidal. Se encuentra limitado principalmente por la viabilidad de la sintesis quimica de peptidos largos, aunque resultan preferentes las secuencias que contienen mas de tres repeticiones heptadas (por ejemplo cuatro, cinco, seis, siete u ocho repeticiones heptadas). Los Ejemplos, comentados posteriormente, forman helices superenrolladas a-helicoidales trimericas (ver tambien la figura 1), aunque la invencion se refiere de manera similar a dominios superenrollados dimericos, tetramericos, pentamericos, hexamericos y heptamericos.

Los dominios superenrollados segun la invencion pueden presentar unidades repetidas mas largas, por ejemplo repeticiones de 11 residuos y repeticiones de 15 residuos, tales como las presentes en las helices superenrolladas naturales. De esta manera, los haces helicoidales requeridos para la formacion de estructuras de agregados tambien aparecer al utilizar motivos superenrollados con periodicidades diferentes de siete. Las helices superenrolladas con periodicidades no habituales tambien resultan posibles. En muchas helices superenrolladas naturales, el patron ininterrumpido de repeticiones de heptadas puede contener diversas discontinuidades. Dos discontinuidades habituales son inserciones de un residuo en el patron de heptadas, asi como las inserciones de tres o cuatro residuos. Por ejemplo, se observa la insercion de un residuo en la helice superenrollada trimerica de la hemaglutinina del virus Influenza. Otras helices superenrolladas naturales muestran una periodicidad diferente de siete, por ejemplo la periodicidad regular de 11 residuos (denominada endecadas) observada en la proteina de capa superficial tetrabrachion de Staphylothermus marinus.

Otros ejemplos de secuencias peptidicas superenrolladas presentes naturalmente en las proteinas de cubierta virica son los motivos superenrollados que forman haces helicoidales trimericos en la proteina de cubierta gp41 de VIH-1 y la glucoproteina F del VSR. Estos dominios superenrollados se encuentran incluidos en la definicion de dominio superenrollado segun la invencion.

Los peptidos helicoidales superenrollados preferentes deben contener entre 3 y 8 motivos heptadas unidos en tandem. Los motivos heptadas dentro de la helice superenrollada pueden presentar secuencias identicas (tal como en el lipopeptido 8) o cada una de ellas puede presentar una secuencia diferente (tal como en los lipopeptidos 6 y 7). En todos los casos, las siete posiciones de los siete residuos aminoacidos dentro de un motivo heptada se designan con las letras: a, b, c, d, e, f y g. Por lo tanto, el peptido helicoidal superenrollado comprende una secuencia de aminoacidos que presenta las posiciones (abcdefg)3-8.

Resultan preferentes las secuencias peptidicas helicoidales superenrolladas que contienen entre 3 y 8 motivos heptadas unidos en tandem, en las que las posiciones a y d en cada motivo heptada (abcdefg) contienen aaminoacidos pertenecientes al Grupo 1 y/o al Grupo 2 tal como se define posteriormente en la presente memoria. Ademas, no pueden resultar ocupadas mas de dos de todas las posiciones a y d por cualquier residuo aminoacido perteneciente al Grupo 3, y no puede resultar ocupada mas de una de entre la totalidad de posiciones a y d por cualquier residuo aminoacido perteneciente al Grupo 4 o al Grupo 5 o por glicina. Ademas, en las posiciones b, c, e, f y g, los a-aminoacidos pertenecientes a los Grupos 3, 4 y 5 resultan preferentes, aunque estan permitidos los aminoacidos pertenecientes a los Grupos 1 y 2, con la adicion de que no mas de una de dichas posiciones dentro de un motivo heptada cualquiera puede ser glicina y ninguno puede ser prolina.

El Grupo 1 comprende los residuos a-aminoacido con cadenas laterales hidrofobicas R1 de tamano pequeno a medio.

Un residuo hidrofobico R1 se refiere a una cadena lateral de aminoacidos que no presenta carga a pH fisiologico y que resulta repelido por una solucion acuosa. Estas cadenas laterales generalmente no contienen grupos donantes de enlaces de hidrogeno, tales como amidas primarias y secundarias, aminas primarias y secundarias y las sales protonadas correspondientes de las mismas, tioles, alcoholes, ureas o tioureas. Sin embargo, pueden contener grupos aceptores de enlaces de hidrogeno, tales como eteres, tioeteres, esteres, amidas terciarias o aminas terciarias. Entre los aminoacidos codificados geneticamente en dicho grupo se incluyen alanina, isoleucina, leucina, metionina y valina.

Son residuos hidrofobicos R1 particulares, alquilo inferior, alquenilo inferior, -(CH2)a(CHR2)bOR3, -(CH2)a(CHR2)bSR3, -(CHR2)OR3, -(CH2)aSR3, -(CH2)aR4, o -CH(CF3)2; en los que R2 es alquilo inferior, R3 es alquilo inferior, R4 es ciclohexilo, ciclopentilo o ciclobutilo, a es 1 a 4, y b es 0 o 1.

5 .

Un residuo aminoacido aromatico se refiere a un aminoacido hidrofobico que presenta una cadena lateral R5 que contiene por lo menos un anillo que presenta un sistema de electrones n(pi) aromatico conjugado. Ademas, puede 10 contener grupos hidrofobicos adicionales, tales como alquilo inferior, arilo o halogeno, grupos donantes de enlaces de hidrogeno, tales como aminas primarias y secundarias, y las sales protonadas correspondientes de las mismas, amidas primarias y secundarias, alcoholes y grupos aceptores de enlaces de hidrogeno, tales como eteres, tioeteres, esteres, amidas terciarias o aminas terciarias. Entre los aminoacidos aromaticos codificados geneticamente se incluyen fenilalanina y tirosina. Un residuo aminoacido heteroaromatico se refiere a un aminoacido 15 hidrofobico que presenta una cadena lateral R5 que contiene por lo menos un anillo que presenta un sistema pi aromatico conjugado que incorpora por lo menos un heteroatomo, tal como O, S y N. Ademas, dichos residuos pueden contener grupos donantes de enlaces de hidrogeno, tales como amidas primarias y secundarias, aminas primarias y secundarias, y las sales protonadas correspondientes de las mismas, alcoholes y grupos aceptores de enlaces de hidrogeno, tales como eteres, tioeteres, esteres, amidas terciarias o aminas terciarias. Entre los

20 aminoacidos heteroaromaticos codificados geneticamente se incluyen triptofano e histidina.

Son cadenas laterales aromaticas o heteroaromaticas R5 particulares, -(CH2)aR6, -(CH2)cO(CH2)dR6, (CH2)cS(CH2)dR6, o -(CH2)cNR7(CH2)dR6; en las que R7 es H, alquilo inferior, arilo o aril-alquilo inferior, R6 es fenilo opcionalmente sustituido de formula -C6R8R9R10R11R12 o un grupo arilo o heteroarilo de una de las formulas H1 a 25 H14.

en las que cada uno de R8, R9, R10, R11 y R12es, independientemente, H, F, Br, Cl, I, NO2, CF3, NR7R14, N7COR14, 30 alquilo inferior, arilo o OR7; R13es H, Cl, Br, I, NO2, alquilo inferior o arilo; R14 es H, alquilo inferior o arilo; a es 1 a 4; c es 1 o 2; y d es 0 a 4

El Grupo 3 comprende aminoacidos que contienen cadenas laterales con residuos polares no cargados R15.

Un residuo polar no cargado R15 se refiere a una cadena lateral hidrofilica que no presenta carga a pH fisiologico y que no resulta repelido por soluciones acuosas. Dichas cadenas laterales tipicamente contienen grupos donantes de enlaces de hidrogeno, tales como amidas primarias y secundarias, aminas primarias y secundarias, tioles y alcoholes. Estos grupos pueden formar redes de enlaces de hidrogeno con las moleculas de agua. Ademas, tambien pueden contener grupos aceptores de enlaces de hidrogeno, tales como eteres, tioeteres, esteres, amidas terciarias

o aminas terciarias. Entre los aminoacidos no cargados polares geneticamente codificados se incluyen asparagina, cisteina, glutamina, serina y treonina.

Son residuos no cargados polares particulares, -(CH2)d(CHR16)bOR17, -(CH2)d(CHR16)bSR17, -(CH2)aCONR17R18 o (CH2)aCOOR19, en los que R16 es alquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior, -(CH2)aOR17, -(CH2)aNR17R18, (CH2)aNR17R18, o -(CH2)aCOOR19; R17 y R18 son, independientemente, H, alquilo inferior, arilo o arilo-alquilo inferior, o R17 y R18 conjuntamente son -(CH2)e-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, o -(CH2)2-NR17-(CH2)2-; R19 es alquilo inferior, arilo o ariloalquilo inferior, y en los que a, b y d presentan los significados indicados anteriormente y e es 2 a 6.

El Grupo 4 comprende aminoacidos que contienen cadenas laterales con residuos cationicos polares y derivados acilados de los mismos, tales como residuos derivados de acilamino y residuos derivados de urea R20.

Las cadenas laterales cationicas polares R20 se refieren a una cadena lateral basica, que se encuentra protonada a pH fisiologico. Entre los aminoacidos cationicos polares codificados geneticamente se incluyen arginina, lisina e histidina. La citrulina es un ejemplo de un residuo aminoacido derivado de urea.

Son residuos cationicos polares particulares y derivados acilados de los mismos R20, -(CH2)aNR17R18, -(CH2)aN=C (NR21R22)NR17R18, -(CH2)aNR21C(=NR22)NR17R18, -(CH2)aNR21COR19, o -(CH2)aNR21CONR17R18; en los que R21 es H

o alquilo inferior y R22 es H o alquilo inferior; y R17, R18 y R19 presentan los significados indicados anteriormente y a es 1 a 4

El Grupo 5 comprende aminoacidos que contienen cadenas laterales con residuos anionicos polares R23.

"Polar anionico" se refiere a una cadena lateral acida R23, que se encuentra desprotonada a pH fisiologico. Entre los aminoacidos anionicos polares codificados geneticamente se incluyen el acido aspartico y el acido glutamico. Un residuo cationico polar particular R23 es -(CH2)aCOOH, en el que a es 1 a 4.

El alquilo inferior es alquilo C1-7, preferentemente alquilo C1-4, en particular metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo

o isobutilo. El arilo presenta 5 a 10 atomos de carbono y preferentemente es fenilo o naftilo.

Resultan mas preferentes las secuencias peptidicas superenrolladas que contienen entre 3 y 8 motivos heptadas unidos en tandem, en las que cada motivo heptada (abcdefg) puede presentar una de las secuencias siguientes:

1xx1xxx(referida respectivamente a las posiciones abcdefg); 1xx2xxx(referida respectivamente a las posiciones abcdefg); 2xx1xxx(referida respectivamente a las posiciones abcdefg); o 2xx2xxx(referida respectivamente a las posiciones abcdefg);

en las que '1' es un aminoacido codificado geneticamente del Grupo 1, '2' es un aminoacido codificado geneticamente del Grupo 2, y en las que x es un aminoacido codificado geneticamente de los Grupos 1, 2, 3, 4 o 5 o glicina.

Resultan todavia mas preferentes las secuencias peptidicas superenrolladas identificadas en los peptidos yproteinas naturales, aunque excluyendo las de origen humano. Estas son, por ejemplo, helices superenrolladas identificadas en proteinas viricas y bacterianas, incluyendo las siguientes:

de la hemaglutinina del virus Influenza (SEC ID n° 5): GSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKCG ; del virus de la inmunodeficiencia humana (SEC ID n° 6): SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLGDCG ; del virus de la inmunodeficiencia bovina (SEC ID n° 7): GGERVVQNVSYIAQTQDQFTHLFRNINNRLNVLHHRVSYLEYVEEIRQKQVFFGCG ; del virus de la inmunodeficiencia felina (SEC ID n° 8): GGATHQETIEKVTEALKINNLRLVTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQELGCG ; del virus de la anemia infecciosa equina (SEC ID n° 9): GGNHTFEVENSTLNGMDLIERQIKILYAMILQTHARVQLLKERQQVEETFNLIGCG ; del virus de la inmunodeficiencia del simio (SEC ID n° 10): GGAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAGCG ; del virus de la encefalitis y artritis caprina (SEC ID n° 11): GGSYTKAAVQTLANATAAQQDVLEATYAMVQHVAKGVRILEARVARVEAGCG ; del virus Visna (SEC ID n° 12): GGSLANATAAQQNVLEATYAMVQHVAKGIRILEARVARVEAIIDRMMVYQELDCG ; del virus parainfluenza tipo 3 humano (SEC ID n° 13): GGEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNKEIVGCG ; del virus para influenza tipo 1 humano (SEC ID n° 14): GGEAREARKDIALIKDSIIKTHNSVELIQRGIGEQIIALKTLQDFVNNEIRGCG ; del virus parainfluenza tipo 2 humano (SEC ID n° 15): GGKANANAAAINNLASSIQSTNKAVSDVITASRTIATAVQAIQDHINGAIVNGCG ; del virus parainfluenza tipo 4a humano (SEC ID n° 16): GGKAQENAKLILTLKKAATETNEAVRDLANSNKIVVKMISAIQNQINTIIQGCG ; del virus parainfluenza tipo 4b humano (SEC ID n° 17): GGKAQENAQLILTLKKAAKETNDAVRDLTKSNKIVARMISAIQNQINTIIQGCG ; del virus del sarampion (SEC ID n° 18): GGSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQSGQEMILAVQGVQDYINNELIGCG ; del virus de la parotiditis (SEC ID n° 19): GGAQTNARAIAAMKNSIQATNRAVFEVKEGTQQLAIAVQAIQDHINTIMNTQLNNMSCG ; del virus sincitial respiratorio bovino (SEC ID n° 20): GGAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKEGCG ; del virus ebola (SEC ID n° 21): GGANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGCG ; del virus Marburg (SEC ID n° 22): GGANQTAKSLELLLRVTTEERTFSLINRHAIDFLLTRVVGGTCKVLGCG ; del virus del sarcoma de Rous (SEC ID n° 23): GGANLTTSLLGDLLDDVTSIRHAVLQNRAAIDFLLLAHGHGCG ; de Staphylothermus marinus (SEC ID n° 24): GSIINETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLEMIINDNVSTILASIGCG ; del coronavirus SARS (SEC ID n° 25): GGNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDWNQNAQALNTLVKQLSSNFG CG; del dominio DUF16 de MPN010 de Mycoplasma pneumoniae (SEC ID n° 26): GGTKTEFKEFOTVVMESFAVQNQNIDAQGEQIKELQVEQKAQGKTLQLILEALQGINKRL DNLESCG ; una helice superenrollada heptamerica (SEC ID n° 27): GGKVKQLADAVEELASANYHLANAVARLAKAVGERGCG ; una helice superenrollada trimerica (SEC ID n° 28): GGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIAKMEKASSVFNWNSKKKC ; o una helice superenrollada tetramerica (SEC ID n° 29): KLKQIEDKLEEILSKLYHIENELAKIEKKLAKMEKASSVFNVVKKC.

Resultan mas preferentes las secuencias de peptido superenrollado indicadas en los Ejemplos.

En el diseno del bloque constructivo de lipopeptido, opcionalmente pueden anadirse residuos adicionales, no incluyendo dichas repeticiones heptadas, en cualquiera de los dos extremos, N-terminal y C-terminal, o en ambos extremos de la cadena peptidica superenrollada. Estos residuos adicionales pueden actuar, por ejemplo, como conector entre la region (superenrollada) de repeticion heptada y la fraccion lipido y/o el antigeno opcionalmente unido. Estos residuos adicionales tambien pueden incluir secuencias de aminoacidos que comprenden epitopos de celulas T ayudantes.

La sintesis de los bloques constructivos de lipopeptido (LBB) puede utilizar metodos de sintesis peptidica y procedimientos de acoplamiento, los cuales son bien conocidos en el presente campo de la quimica sintetica. Tipicamente se utilizo la sintesis peptidica en fase solida para ensamblar la cadena peptidica. La fraccion lipido puede acoplarse a un conector, proporcionando un intermediario conector de lipido. El conector de lipido seguidamente puede anadirse mediante metodos estandares de acoplamiento a, por ejemplo, el extremo N-terminal libre del peptido todavia unido a la resina. Finalmente, el tratamiento con acido trifluoroacetico (TFA) corta el lipopeptido totalmente ensamblado de la resina y elimina todos los grupos protectores de cadena lateral estandares.

Puede acoplarse directamente una fraccion dipalmitoil-S-glicerilcisteinilo (Z3) al extremo N-terminal de la cadena peptidica sin un conector. En el caso de las fracciones lipido de tipo Z4, un aminoacido convenientemente protegido con Fmoc, tal como acido bis-Fmoc-2,4-diaminobutirico, puede anadirse al extremo N-terminal de la cadena en la etapa final de ensamblaje. Tras la eliminacion de los grupos protectores (Fmoc), los dos grupos amino libres pueden acilarse con un derivado de acido graso apropiado. El producto lipopeptido se forma tras el corte de la resina con TFA. Pueden utilizarse similares estrategias sinteticas bien establecidas para preparar bloques constructivos de lipopeptido que contienen otras fracciones lipido.

Puede utilizarse una diversidad de procedimientos de acoplamiento o conjugacion para unir antigenos a la cadena peptidica, que son bien conocidos por el experto en la materia. De esta manera, pueden acoplarse grupos amino libres en las cadenas laterales de aminoacidos en la cadena peptidica de los LBB con esteres reactivos en el antigeno (por ejemplo esteres de N-hidroxisuccinimida preparados a partir de acidos carboxilicos); los tioles en la cadena peptidica pueden acoplarse a grupos maleimida en el antigeno; pueden incorporarse azidas en las cadenas laterales de los residuos aminoacidos en la cadena peptidica y acoplarse con antigenos que contienen grupos acetileno utilizando reacciones de cicloadicion catalizadas por cobre, y pueden acoplarse otros nucleofilos (por ejemplo los grupos hidrazino, hidroxilamino y vic-aminotiol) en el peptido con electrofilos (por ejemplo aldehidos, cetonas y esteres activos) en el antigeno. Resultara evidente que resulta posible, en principio, invertir las posiciones de los dos grupos reactivos en cadena peptidica y antigeno con el fin de conseguir el acoplamiento selectivo.

Se describen posteriormente ejemplos de sintesis de lipopeptidos que ilustran dichos metodos.

Los bloques constructivos de lipopeptido (LBB) tal como se definen en la presente memoria se autoensamblan formando haces de lipopeptido helicoidales (HLB) y finalmente particulas pseudoviricas sinteticas (SVLP). El proceso de autoensamblaje en solucion acuosa incluye la rapida oligomerizacion de los dominios superenrollados en el LBB, formando un haz superenrollado paralelo de a-helices de estado de oligomerizacion definido, denominado haz de lipopeptidos helicoidales (HLB). En consecuencia, las fracciones lipido unidas a las cadenas peptidicas dentro de cada HLB tambien se agregan en un extremo del haz. Ademas, de esta manera se presentan multiples copias del antigeno sobre la superficie del HLB, es decir, el otro extremo, no lipofilico, del HLB El proceso de autoensamblaje puede continuar, resultando en la formacion de particulas pseudoviricas sinteticas (SVLP) (ver la figura 1). El proceso esta controlado por la autoasociacion de las colas lipidicas unidas a cada bloque constructivo, que seguidamente ocupan el nucleo lipidico central de la SVLP. De esta manera, las cadenas peptidicas en cada haz helicoidal se encuentran orientadas hacia el exterior, hacia el solvente. El tamano y composicion del bloque constructivo de lipopeptido determina de esta manera el tamano y forma finales de los ensamblajes (SVLP), los diametros de los cuales tipicamente son del orden de los nanometros (10 a 30 nm). Las SVLP representan una nueva plataforma de nanoparticulas para la exposicion multivalente de antigenos y para su transporte a celulas inmunocompetentes y receptores.

Las particulas pseudoviricas sinteticas (SVLP) segun la invencion estan compuestas de componentes proteicos y lipidicos, tal como los virus reales, que presentan dimensiones fisicas similares a las de algunos virus de tamano pequeno, presentan un nucleo lipidico y una superficie externa basada en proteinas/peptidos, aunque son totalmente de origen sintetico, es decir, se producen mediante sintesis quimica partiendo de bloques constructivos de lipopeptido (LBB) sin utilizar metodos basados en celulas. No son virus reales debido a que no presentan ningun componente acido nucleico y de esta manera no pueden replicarse.

En el caso de que se unan antigenos a los bloques constructivos de lipopeptido (LBB), la elevada densidad superficial resultante de antigenos sobre los HLB y SVLP, y tambien su estructura molecular, hace que estos materiales sinteticos resulten atractivos para aplicaciones en el campo de la administracion de vacunas. La presencia de multiples copias del antigeno sobre la superficie de la SVLP incrementa la afinidad de los receptores de celulas B para el antigeno a traves de un efecto de avidez, y facilita la incorporacion y presentacion de la particula o de sus componentes por parte de celulas inmunocompetentes. Las HLB y SVLP pueden considerarse, por lo tanto, portadores macromoleculares, o vehiculos de administracion, para los antigenos, para el proposito de generar respuestas inmunologicas eficientes contra el antigeno en un animal. Resulta de especial importancia que la utilizacion de HLB y SVLP como vehiculos de administracion para los antigenos permite la generacion de respuestas inmunologicas (de anticuerpos) eficientes en un animal sin utilizar (coinyectar) adyuvantes potencialmente daninos.

Una combinacion unica de propiedades hace que dichos HLB y SVLP resulten ideales para inducir respuestas inmunologicas eficientes en un animal y por lo tanto para aplicaciones en el descubrimiento de vacunas. Las respuestas de celulas B son iniciadas por la interaccion de receptores de celula B especificos sobre las celulas B diana con antigenos, y en particular por la agregacion de multiples receptores de celulas B sobre la superficie de las celulas B mediante la union de antigenos multivalentes. La presencia de multiples copias del antigeno sobre la superficie de una particula ensamblada resulta importante para incrementar la afinidad de los receptores mediante un efecto de avidez, y para crear agregados de receptores de celulas B unidos a antigenos sobre la superficie celular. La capacidad del peptido superenrollado de formar haces helicoidales de estado de oligomerizacion definido se aprovecha para permitir la exposicion multivalente del antigeno unido covalentemente. Puede conjugarse con los LBB monomericos un antigeno disenado para interactuar con receptores de celula B especificos sobre las celulas B diana, tales como haptenos, peptidos, proteinas u otros mimeticos de epitopo. Tras el autoensamblaje en un HLB y una SVLP, los antigenos se presentan en multiples copias sobre la superficie del ensamblaje oligomerico (ver la figura 1).

Las secuencias superenrolladas viricas y microbianas pueden contener epitopos de celulas T ayudantes. Estas pueden aprovecharse tambien en la presente invencion, ya que el peptido portador superenrollado, al ser un componente del LBB, puede derivarse de secuencias naturales que contienen epitopos de celulas T ayudantes. Alternativamente, pueden incorporarse o unirse epitopos de celulas T a secuencias superenrolladas de diseno o naturales.

El LBB monomerico contiene una fraccion lipido. Otro proposito del lipido es facilitar la presentacion del epitopo a las celulas B, ya que es conocido que los antigenos asociados a membranas resultan particularmente efectivos en la activacion de las celulas B y en la induccion de la activacion de las celulas T controlada por las celulas B. La elevada concentracion local de fracciones lipido presente en el interior de los HLB y SVLP facilita la interaccion del ensamblaje con las membranas e induce la presentacion de los antigenos a las celulas B. La parte lipido del LBB puede derivarse de fracciones lipidicas de origen bacteriano, tales como los bien conocidos lipopeptidos ligandos de receptores de tipo Toll Una caracteristica de los lipopeptidos autoensamblantes incorporados en los LBB es que pueden comprender componentes que incrementan la activacion de las celulas B, asi como un mecanismo para la exposicion multivalente del antigeno. Ciertamente los HLB y SVLP son capaces de inducir fuertes respuestas inmunologicas basadas en anticuerpos, y ello comporta la ventaja adicional de que puede evitarse la utilizacion de adyuvantes toxicos durante las inmunizaciones.

Es una caracteristica general de las moleculas surfactantes de tipo detergente que presentan un grupo de cabeza polar y una cola lipidica hidrofobica no polar, que forman agregados termodinamicamente estables tales como micelas y vesiculas en solucion acuosa, con las regiones hidrofobicas extendidas agrupadas en el nucleo micelar, secuestradas lejos del contacto con el agua, mientras que los grupos de cabeza polares interactuan con el solvente. Sin embargo, los HLB y las SVLP de la presente invencion no son simplemente micelas. Su estructura molecular se mantiene mediante una exclusiva combinacion de fuerzas no covalentes, es decir, las fuerzas que controlan el ensamblaje del dominio peptidico superenrollado en un haz helicoidal, conjuntamente con las fuerzas hidrofobicas que controlan el secuestro de las colas lipidicas en el interior de la particula.

Las concentraciones a las que empiezan a formar micelas, correspondientes a la concentracion maxima a la que existe monomero libre en solucion, es la concentracion micelar critica, o mas generalmente, la concentracion critica de agregacion. La concentracion micelar critica proporciona una medida de la estabilidad termodinamica de las micelas. El valor de la concentracion micelar critica depende de la estructura de las partes hidrofobica e hidrofilica de la molecula anfifilica y de factores externos como la temperatura y la composicion del solvente. Una concentracion micelar critica baja indica una micela estable a una concentracion de surfactante baja, lo que resulta importante en aplicaciones biologicas, en las que la actividad deseada (por ejemplo el direccionamiento y transporte a celulas) depende de la conservacion de la estructura de tipo micelar incluso despues de una dilucion total elevada. Las SVLP segun la invencion siguen siendo termodinamicamente estables en la region nanomolar baja, indicando que resultan ideales para los fines de la administracion de vacunas. La elevada estabilidad resulta de la estructura molecular unica de las SVLP. Ademas, pueden generarse SVLP con distribucion de tamanos y formas relativamente homogeneas.

Las SVLP segun la invencion no son como los liposomas, que presentan una estructura de membrana bicapa que circunda a una solucion acuosa en el nucleo. Las SVLP son mas estables in vivo que los liposomas, ya que no exponen grandes areas de membrana lipidica al exterior acuoso.

En contraste con las particulas pseudoviricas de la tecnica anterior, las HLB y SVLP de la invencion son artificiales y todos sus componentes se producen mediante sintesis quimica, evitando de esta manera la utilizacion de materiales que deben fabricarse mediante metodos biologicos. Aunque las particulas pseudoviricas se denominan "sinteticas", estas particulas se basan en particulas viricas naturales o modificadas geneticamente, o componentes de las mismas, construidas mediante metodos de ADN recombinante y basados en celulas, no materiales producidos mediante sintesis quimica. El diseno y composicion de las SVLP de la invencion tambien es bastante diferente de los de otros ensamblajes de nanoparticulas, por ejemplo los basados en agregados de oro, puntos cuanticos, dendrimeros, proteinas recombinantes y liposomas.

Los LBB de la invencion se disenan de manera que el dominio superenrollado en el lipopeptido se asocie en un haz helicoidal definido (por ejemplo haces dimericos, trimericos, tetramericos, pentamericos, hexamericos o heptamericos de helices). Esta asociacion conduce a la formacion de los HLB. Los haces de lipopeptidos helicoidales (HLB) resultantes (por ejemplo se muestra un trimero en la figura 1) se autoensamblan formando una particula pseudovirica sintetica (SVLP) (ensamblaje macromolecular) con dimensiones en la escala nanometrica. En el caso de que se unan antigenos (en forma de peptidos, proteinas, peptidomimeticos, carbohidratos o haptenos) al LBB, se presentan multiples copias sobre la superficie del HLB y la SVLP.

Las secuencias peptidicas basadas en autoproteinas (es decir, proteinas humanas) no resultan adecuadas, ya que pueden producirse enfermedades autoinmunologicas cronicas debido a reacciones inmunologicas contra las (auto)proteinas humanas (por ejemplo el sindrome de Goodpasture, una enfermedad autoinmunologica humana causada por el desarrollo de anticuerpos contra el colageno).

La invencion se refiere ademas a una preparacion farmaceutica que comprende una particula pseudovirica sintetica que porta antigenos tal como se describe en la presente memoria. Se consideran preparaciones farmaceuticas para la administracion enterica, tales como la administracion nasal, bucal, rectal u oral, y para la administracion parenteral, tales como la administracion intravenosa, intramuscular o subcutanea, en animales de sangre caliente, especialmente el ser humano. Resultan particularmente preferentes las preparaciones para la administracion parenteral. Las preparaciones comprenden la particula pseudovirica sintetica que porta antigenos solos o, preferentemente, conjuntamente con un portador farmaceuticamente aceptable. La dosis del ingrediente activo depende de la vacunacion pretendida y de la especie, edad, peso y condicion individual, de los datos farmacocineticos individuales y del modo de administracion.

Las preparaciones farmaceuticas comprenden entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10% de ingrediente activo. Las formas de dosificacion unitaria para la administracion parenteral son, por ejemplo, ampollas o viales, por ejemplo viales que contienen entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 1,0 g de particulas pseudoviricas sinteticas portadoras de antigenos.

Resulta preferente la utilizacion de soluciones de particulas pseudoviricas sinteticas portadoras de antigenos y tambien suspensiones o dispersiones, especialmente soluciones, dispersiones o suspensiones acuosas isotonicas, que, por ejemplo en el caso de composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o conjuntamente con un portador, por ejemplo manitol, pueden prepararse antes de su utilizacion. Las preparaciones farmaceuticas pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservantes, estabilizadores, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizadores, sales para regular la presion osmotica y/o tampones, y se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo mediante procesos convencionales de disolucion y liofilizacion. Dichas soluciones o suspensiones pueden comprender agentes reguladores de la viscosidad.

Para la administracion parenteral, las soluciones acuosas de la particula pseudovirica sintetica portadora de antigenos o las suspensiones acuosas para inyeccion que contienen sustancias reguladoras de la viscosidad y, si se desea, estabilizadores, resultan especialmente adecuadas. Las particulas pseudoviricas sinteticas portadoras de antigenos, opcionalmente con excipientes, tambien pueden encontrarse en forma de un liofilizado y pueden prepararse en una solucion antes de la administracion parenteral mediante la adicion de solventes adecuados.

La invencion se refiere ademas a la utilizacion de una particula pseudovirica sintetica portadora de antigenos tal como se describe en la presente memoria a modo de vacuna. Estas vacunas resultan utiles para inducir respuestas inmunologicas para la prevencion o tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones, incluyendo enfermedades infecciosas, alergias, cancer, adiccion a farmacos, envenenamiento y generalmente para inducir eficientemente respuestas inmunologicas especificas de antigeno.

La invencion se refiere ademas a un metodo de vacunacion en el que se administra una cantidad inmunogenicamente efectiva de una particula pseudovirica sintetica portadora de antigenos tal como se describe en la presente memoria, en un paciente que lo necesita.

Ejemplos

Abreviaturas:

DCM, diclorometano (CH2Cl2);

DIEA, diisopropiletilamina;

Boc, t-butoxicarbonilo;

DMF, N,N-dimetilformamida;

EDT, etanoditiol;

Fmoc, 9-fluorenilmetoxicarbonilo;

HATU, hexafluorofosfato de 2-(1H-9-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio;

HBTU, hexafluorofosfato de 2-[1H-benzotriazol-1-il]-1,1,3,3-tetrametiluronio;

HOBt, N-hidroxibenzotriazol; Pbf, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo; NMP, N-metilpirrolidona; MBHA, metilbenzhidrilamina PyBOP, hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)-tripirrolidinofosfonio; t.a., temperatura ambiente; TIS, triisopropilsilano (iPr3SiH); Trt, tritilo; TFA, acido trifluoroacetico; tR, tiempo de retencion.

Ejemplo 1: lipopeptido 4

La secuencia primaria de SEC ID n° 1 del peptido superenrollado 5 en este lipopeptido se deriva mayoritariamente de la glucoproteina F del VSR [Lawless-Delmedico M.K. et al., Biochemistry 39:11684-11695, 2000]. Este peptido superenrollado contiene cinco repeticiones heptadas. Se han anadido residuos Gly adicionales en el extremo Nterminal a modo de espaciador, conjuntamente con un conector derivado de acido succinico para unir el extremo Nterminal del peptido a un fosfolipido, proporcionando de esta manera el lipopeptido 4.

La sintesis de la cadena peptidica se llevo a cabo sobre una resina MBHA-amida de Rink utilizando una reaccion estandar de Fmoc. Tras completar el ensamblaje de la cadena, se unio la unidad de fosfolipido-conector (1,3dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamido-succinato (PE-succ-OH)) al extremo N-terminal libre del peptido sobre la resina. A continuacion, se corto el fosfolipido de la resina y se eliminaron los grupos protectores de cadena lateral mediante tratamiento con TFA/triisopropilsilano/H2O. Tras la purificacion mediante HPLC de fase inversa, el producto se caracterizo mediante HPLC analitica de fase inversa y EM por electropulverizacion (m calc.: 6238,4; m/z obs. 1560,8 para (M+4H)4+).

El 1,3-dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamido-succinato (PE-succ-OH) puede prepararse facilmente mediante reaccion de 1,3-dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamina (Bachem) con anhidrido succinico en presencia de una base, tal como trietilamina.

a) Peptido 5. Se sintetizo la cadena peptidica sobre resina de amida de Rin-MBHA (Novabiochem) en un sintetizador de peptidos ABI 433A utilizando la reaccion de Fmoc. Los aminoacidos utilizados fueron Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Asn (Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, FmocHis(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, FmocTyr(tBu)-OH y Fmoc-Val-OH. Se cargo la resina (500 mg, 0,4 mmoles/g) con Fmoc-Gln(Trt)-OH utilizando HBTU (3 eq.), HOBt (3 eq.) y DIEA (8 eq.) en DMF (5 ml). Las aminas libres no reaccionadas se acetilaron utilizando solucion de adicion de caperuza de Ac2O (Ac2O (0,5 M), DIEA (0,125 M) y HOBt (0,015 M) en NMP; 2x15 ml durante 30 minutos). Las uniones se llevaron a cabo utilizando un exceso de 5 veces (1 mmol) de cada aminoacido. Tras completar el ensamblaje de la cadena peptidica, esta se corto de la resina y se desprotegio con TFA/iPr3SiH/H2O (95:2,5:2,5) (9 ml) durante 3 horas a t.a. Tras la filtracion y concentracion al vacio, el peptido se precipito con Et2O frio (20 ml), se centrifugo y se decanto (se repitio 3 veces).La purificacion del producto crudo mediante HPLC analitica (columna C18: Vydac 218TP54; 10 !m, 300 A, 4,6 x 250 mm; gradiente: 5% a 100% de acetonitrilo en agua + TFA al 0,1%, en 20 minutos a 1 ml/min; tR=16 min) proporciono el peptido 5 (rendimiento del 10%) en forma de polvos blancos. RP-HPLC analitica (columna C18: Vydac 218TP54; 10 !m, 300 A, 4,6 x 250 mm; gradiente: 10% a 60& de acetonitrilo en agua + TFA al 0,1%, en 35 minutos a 1 ml/min): tR = 26 min. EM-ESI (MeOH/H2O (1:1) + HCOOH al 0,1%; modo de iones positivos; m/z): 1822,8 [M+3H]3+, 1367,3 [M+4H]4+, 1094,2 [M+5H]5+, 911,9 [M+6H]6+(PM calc. : 5465,4 g/mol).

b) Lipopeptido 4. El ensamblaje de la cadena peptidica lineal sobre la resina se llevo a cabo tal como se ha descrito anteriormente para el peptido 5. Tras completar el ensamblaje de la cadena peptidica, se union el succinato de 1,3-dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamido (PE-succ-OH) al extremo N-terminal sobre la resina. Se anadio a la resina peptidilo (80 !moles) una solucion de PE-succ-OH (190 mg, 240 !moles, 3 eq.), HATU (92 mg, 240 !moles, 3 eq.), HOAt (33 mg, 240 !moles, 3 eq.) y DIEA (110 !l, 640 !moles, 8 eq.) en DMF (5 ml), previamente preparada. La mezcla de reaccion se hizo girar durante la noche a t.a. Se realizo un seguimiento del progreso de la union mediante la prueba de Kaiser. Tras completar la union, la resina se filtro y se lavo con DMF (3x5 ml), DCM (3x5 ml) y MeOH (3x5 ml). A continuacion, se corto el lipopeptido de la resina y se desprotegio con TFA/TIS/H2O (95:2,5:2,5) (27 ml) durante 3 horas a t.a. Tras la filtracion y concentracion al vacio, el peptido se precipito con Et2O frio (20 ml), se centrifugo y se decanto (se repitio 3 veces). La purificacion del producto crudo mediante HPLC semipreparativa (columna C4: Vydac 214TP1010; 10 !m. 300 A, 10 x 250 mm; gradiente de acetonitrilo al 30-100% en agua + TFA al 0,1%, en 15 min a 5 ml/min; tR = 14,4 min) proporciono el lipopeptido 4 en forma de polvos blancos. HPLC analitica (columna C4: Vydac 214TP104; 10 !m, 300 A, 4,6 x 250 mm; gradiente: 10% a 100% de acetonitrilo en agua + TFA al 0,1%, en 30 minutos a 1 ml/min): tR = 23,3 min. EM-ESI (MeOH/H2O (1:1) + HCOOH al 0,1%; modo de iones positivos; m/z): 2081,4 [M+3H]3+, 1560,8 [M+4H]4+, 1248,9 [M+5H]5+, 1040,9 [M+6H]6+(PM calc. 6238,4 g/mol). £276= 1511 M-1cm-1.

c) Estudios bioffsicos sobre el lipopeptido 4. Una caracteristica clave de la presente invencion es que el lipopeptido, que resulta accesible mediante sintesis, puede ensamblarse espontaneamente en un ensamblaje macromolecular de estructura definida y con el tamano de una nanoparticula pseudovirica. El lipopeptido 4 puede disolverse en solucion acuosa tamponada bajo agitacion y seguidamente pueden investigarse las propiedades de la solucion de SVLP. Para demostrar que dichos lipopeptidos pueden formar las SVLP, las particulas surgidas del lipopeptido 4 se han caracterizado mediante diversas tecnicas biofisicas y se describen en la presente memoria a fin de ilustrar el principio. Los experimentos de ultracentrifugacion en el equilibrio de sedimentacion con el lipopeptido 4 indicaron que las particulas presentaban una masa aparente en el intervalo de 400 kD (figura 3). Se recogieron datos por triplicado a tres velocidades del rotor, 5.000, 7.500 y 10.000 rpm, y a tres concentraciones, 24, 48 y 240 !M, para el analisis. Los datos a las dos concentraciones mas bajas de lipopeptido se ajustaban bien a un modelo que suponia la presencia de una unica especie ideal con una masa molar aparente de 451.820 ± 9.670 g·mol-1. La inclusion de los datos a la concentracion mas alta (240 !M) resulto en una masa aparente de 431.170 ± 14.160 g·mol-1, aunque la calidad del ajuste se deterioro, particularmente en proximidad a la base de la celda de centrifugacion. La desviacion del ajuste respecto de los datos experimentales, sin embargo, no presentaba la forma que tipicamente se produce con la aparicion de material agregado, aunque podria representar la falta de un ajuste ideal a la concentracion mas alta. Tambien se llevaron a cabo experimentos de velocidad de sedimentacion y se analizaron en terminos de las distribuciones de los coeficientes aparentes de sedimentacion, g(s*) [Stafford W.F., Anal. Biochem. 203:295-301, 1992], Is-g*(s) y c(s) [Schuck, P., Biophys. J. 78:1606-1619, 2000]. A pesar de los diferentes enfoques, todos los metodos proporcionaron distribuciones relativamente anchas centradas en -10 S. En intento de reconciliar los datos de equilibrio y velocidad y de investigar la distribucion de tamanos en mayor detalle, se utilizo el modelaje con la ecuacion de Lamm, segun la implementacion realizada por el software Sedfit [Schuck P., Biophys. J. 78:1606-1619, 2000]; se muestran los perfiles de c(s) tipicos en la figura 4. Todas las distribuciones se encuentran centradas entre 9,5 y 10 S, aunque aparentemente existe una leve cola en el lado de bajos valores de S a concentracion baja, posiblemente debida a artefactos. No se observo ninguna mejora estadisticamente significativa al someter a ensayo otros modelos que incluian especies discretas no interactuantes. La inspeccion de los valores individuales de s no mostro ninguna dependencia aparente de la concentracion y el ajuste global de los datos, seguido de una simulacion de Montecarlo proporciono un valor de s20,w=9,837 ± 4,4·10-3 S. La naturaleza quimica del fosfolipido y el numero aparente de monomeros incluidos en el estado asociado principal (-72) sugiere que, dentro del intervalo de concentraciones analizado, el lipopeptido forma estructuras de tipo micelar y se propone un modelo en el que aproximadamente 24 subunidades, compuestas cada una de un lipopeptido superenrollado trimerico, interactuan formando un nucleo lipidico compacto decorado por cadenas peptidicas superenrolladas. El tamano resultante de particula concuerda con los datos de ultracentrifugacion. Tambien se propone que los peptidos se encuentran optimamente distribuidos en el espacio. Con el fin de visualizar esta particula esferica, se genero un modelo informatico, que se muestra en la figura 5. Muestra que las colas hidrofobicas se aglomeran en el centro y las helices superenrolladas trimericas se extiende como espigas hacia la solucion, en el exterior. Aunque podrian ser posibles otras geometrias aparte de una esfera perfecta, el modelo aparentemente refleja bien el comportamiento del material en solucion diluida bajo condiciones estandares. Con el fin de investigar la conformacion del peptido mediante dicroismo circular (DC), se analizo el peptido 5, que presenta la misma secuencia peptidica que el lipopeptido 4 pero que no presenta el fosfolipido ni el conector. Tal como se esperaba en este tipo de sistema, el peptido mostraba un espectro de DC que dependia tanto de la temperatura como de la concentracion. Era altamente a-helicoidal a 1°C y la transicion de desnaturalizacion termica mostraba un punto medio de -40°C a una concentracion de peptido de 35 !M. Se ha demostrado anteriormente que un peptido con una secuencia similar a la del peptido 5 forma una superhelice trimerica en equilibrio con el monomero en solucion acuosa diluida [Lawless-Delmedico M.K. et al., Biochemistry 39:11684-11695, 2000]. El peptido 5 difiere de dicho peptido en que presenta dos residuos adicionales de glicina N-terminal y un extremo N-terminal libre. Sin embargo, el espectro de DC del UV lejano (figura 6) a temperatura ambiente era similar para ambos peptidos. Cualesquiera diferencias menores probablemente se deben a la simple adicion de una estructura aperiodica contiguamente a los residuos adicionales de glicina y/o cualquier perturbacion estructural adicional potencialmente inducida por los mismos. El espectro es caracteristico de un equilibrio helice aleatoria/a-helice y el analisis espectral utilizando el programa CONTIN [Provencher S.W., Comp. Phys. Comm. 27:229-242, 1982] proporciona valores de 33%, 25% y 42% para una ahelice, una lamina � y una estructura aperiodica, respectivamente. La adicion de una fraccion fosfolipido al peptido 5, formando el lipopeptido 4, provoca cambios marcados en el espectro de DC (figura 6) y el contenido de helices se eleva a -100%, segun el ajuste realizado por CONTIN. Las contribuciones directas de la fraccion fosfolipido al espectro se ignoraron y probablemente son reducidas. El incremento del contenido de helices indica que la situacion del equilibrio observada en el peptido solo se ha desplazado hacia el estado mas estructurado, que se ha producido una reorganizacion hacia un estado diferente aunque altamente estructurado, o una combinacion de los dos. A la luz de los resultados hidrodinamicos, informados anteriormente, aparentemente resulta probable que se de este ultimo caso, ya que explicaria la presencia de especies relativamente pequenas coexistentes con agregados de mucho mayor tamano y probablemente formando un nuevo sistema en equilibrio. La concentracion micelar critica (CMC) se investigo utilizando la sonda fluorescente pireno-3-carboxialdehido (PYCHO). Las propiedades fluorescentes de la sonda son sensibles a la polaridad del solvente, y de esta manera la sonda muestra un comportamiento fluorescente diferente en un medio micelar hidrofobico en comparacion con su comportamiento en un medio acuoso. El pigmento se disuelve preferentemente en el interior hidrofobico de la micela, y su intensidad de fluorescencia es mas alta y el maximo de emision se encuentra desplazado a una longitud de onda mas larga en comparacion con un ambiente acuoso. Los espectros de emision del pigmento en presencia del lipopeptido 4 mostraron un pico principal a 466 nm y un pico menor a 437 nm, mientras que se observo el comportamiento inverso en ausencia de micelas (figura 7). Se investigo la CMC mediante la medicion de la dependencia de la concentracion de los cambios de fluorescencia [Wilhelm M. et al., Macromol. 24:1033-1040, 1991; Astafieva I. et al., Macromol. 26:7339-7352, 1993], y se encontro que era < 20 nM. Sin embargo, la sensibilidad y fiabilidad del metodo era muy buena para sistemas micelares con valores de CMC elevados, pero aparentemente era insatisfactoria para determinar con precision los valores de CMC inferiores a 20 nM. De esta manera, las caracteristicas de los espectros de fluorescencia de PYCHO en este sistema mostraron unicamente pequenos desplazamientos de pico a concentraciones bajas (figura 7). Se midieron los espectros de emision a 12 diluciones del lipopeptido en el intervalo de 1 !M a 3 nM y los datos se graficaron como la proporcion entre las intensidades de emision, I437/I466, frente a la concentracion. A partir de los resultados (figura 8), resulta evidente que no se alcanza la region de meseta esperada a concentraciones de peptido inferiores a la CMC. A concentraciones mas altas (400 nM a 1 !M), se observa el inicio de la meseta, en donde el incremento de la concentracion de monomero simplemente conduce a la formacion de nuevos oligomeros. Por lo tanto, los cambios en los espectros de fluorescencia de PYCHO indican que se forma un oligomero y que la CMC es muy baja (< 20 nM). Se calculo el diametro medio de las SVLP derivadas de este lipopeptido a partir de las mediciones de dispersion luminica dinamica (DLS) utilizando un analisis de la distribucion ponderado segun el numero basado en un modelo matematico para particulas esfericas. Los datos son consistentes con un diametro medio de aproximadamente 17 nm (figura 9). Tambien se midio el tamano de particula mediante DLS a 40°C, en el que la distribucion de tamanos de particula se hizo ligeramente mas estrecha, indicando posiblemente una distribucion de tamanos mas homogenea a temperaturas fisiologicas (datos no mostrados). Se utilizo la microscopia electronica para visualizar las SVLP de lipopeptido. La tincion negativa de una solucion 3 !M del lipopeptido 4 en tampon TRIS a pH 7,4 se utilizo para registrar las micrografias electronicas de transmision. Las particulas presentan una apariencia circular y con forma de estrella (figura 10). No resulta posible determinar si lo anterior refleja una forma global subyacente esferica o de tipo discoidal a partir de las micrografias electronicas, pero cualquiera de las dos estructuras seria indicativa de un sistema de tipo micelar. Las particulas presentaban un diametro medio de 17 nm, con una distribucion de tamanos de aproximadamente ±5 nm en torno a la poblacion principal, dependiendo del metodo utilizado para evaluar las micrografias. La elevada homogeneidad de tanto el tamano como la forma de la muestra era notable. Tambien pudo observarse en las micrografias un numero reducido de ensamblajes de mayor tamano, con diametros de entre 25 y 40 nm. Lo anterior podria ser un artefacto de la tecnica utilizada, ya que las particulas podrian haberse adsorbido al soporte en multiples capas. Sin embargo, la microscopia electronica muestra inequivocamente la formacion de particulas estrelladas estables a escala nanometrica de forma y dimensiones regulares. La forma estrellada de las particulas sugiere una organizacion de los monomeros de lipopeptido con las cadenas de fosfolipido apuntando al centro de la particula (formando un nucleo hidrofobico) y las cadenas peptidicas hidrofilicas apuntando hacia el exterior, tal como se ilustra en la figura 5.

d) Secci6n experimental: estudios bioffsicos sobre el lipopeptido 4.

Determinaci6n del fosfato

El ensayo se adapto a partir de [Ames B.N., Methods Enzymol. 8:115-118, 1966] y se utilizo para determinar la concentracion de las soluciones de lipopeptido utilizadas en los experimentos siguientes mediante estimacion del fosfato total presente en la fraccion fosfolipido. Materiales utilizados: Bloque calefactor capaz de calentamiento a 250°C (por ejemplo el controlador programable 630 de Tecon); probetas de vidrio borosilicato resistentes a la

60 x7 mm) y un bano de agua a 45°C.
׎ temperaturaparael analisiselemental(

Se preparo con exactitud una solucion de fosfato 1 mM a partir de KH2PO4 (solucion estandar, 1 !l=1 nmol de fosfato). Se anadieron alicuotas (habitualmente de 10 a 80 !l, dependiendo del contenido estimado de fosfato en la muestra) de la solucion estandar a una serie de tubos limpios con el fin de construir una curva de calibracion. Las muestras y los estandares de calibracion se secaron en el bloque calefactor (100°C a 120°C) y, ya secos, se anadieron 70 !l de H2SO4/HClO4 (1:1) a cada tubo y los tubos se calentaron a una temperatura de entre 230°C y 250°C durante 15 a 30 minutos.

Se preparo una solucion de acido ascorbico al 0,835%/molibdato amonico al 0,2% de la manera siguiente: se prepararon soluciones de acido ascorbico (al 10% p/v) y molibdato amonico (al 2,5% p/v) en H2O doblemente destilada. Inmediatamente antes de la utilizacion se mezclaron entre si 1,67 ml y 1,60 ml de las soluciones de acido ascorbico y molibdato amonico, respectivamente, y se ajusto el volumen a 20 ml (suficiente para 12 muestras).

Tras 15 a 30 minutos a una temperatura de entre 230°C y 250°C, las muestras se enfriaron hasta la t.a., se anadieron 1,6 ml de la solucion de ensayo bajo agitacion y seguidamente las muestras se incubaron durante 30 minutos a 45°C. Un tubo sin muestra o con fosfato estandar se trato identicamente en todo el procedimiento con el fin de proporcionar un blanco. Inmediatamente despues de la incubacion, se midio la absorbancia a 820 nm de cada muestra en una celda de 1 cm. Se interpolo la concentracion de la muestra a partir de la curva estandar.

Ultracentrifugaci6n analftica

Se llevaron a cabo experimentos convencionales de equilibrio de sedimentacion y velocidad de sedimentacion utilizando una ultracentrifuga analitica Beckman L-A dotada de un rotor AN60Ti. Se utilizaron tanto celdas de doble sector y de 6 canales rellenadas de carbon Epon y fluorocarbono FC-43 para proporcionar un falso fondo, segun resulte apropiado. Se configuro una diversidad de velocidades del rotor, adecuadas para el experimento particular, y todas las mediciones se llevaron a cabo a 20°C. Los experimentos se llevaron a cabo a varias concentraciones de lipopeptido y se utilizaron en todo el procedimiento tampones de Tris 10 mM, pH 7,4, que contenia cloruro sodico 90 mM o de fosfato sodico 10 mM, pH 7,4, que contenia cloruro sodico 90 mM. En los analisis del equilibrio de sedimentacion se recogieron datos radiales a un espaciado de 0,001 cm y se promediaron por lo menos 10 barridos para cada dato. Se captaron tres de dichos datos para cada velocidad y concentracion. Se confirmo el equilibrio mediante superposicion de los datos recogidos a intervalos de tiempo adecuados. Los datos de velocidad de sedimentacion se captaron a un espaciado radial de 0,005 cm con un intervalo entre barridos de entre 2 y 4 minutos. Se utilizo el principio de aditividad para calcular separadamente el volumen especifico parcial aparente de las fracciones lipido (v20=0,934 cm3g-1) y peptido (v20=0,726 cm3g-1) a partir de sus contribuciones de grupo [Cohn E.J. et al., en: Proteins, amino acids and peptides as ions and dipolar ions, Hafner publishers, New York, 1943, paginas 370 a 381; Hoeiland H., Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology, Springer-Verlag, Berlin, 1986, paginas 17 a 44; Traube I., Ann. Chem. Liebigs 265:27, 1891; Laue T.M., Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Royal Society of Chemistry publishers, Cambridge, 1992]. Se aproximo el volumen especifico parcial del lipopeptido 4 (v20=0,781 cm3g-1) como el promedio ponderado segun la masa de los valores de los dos componentes. Se calcularon las densidades de tampon a partir de las tablas estandares [Laue T.M., Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Royal Society of Chemistry publishers, Cambridge, 1992]. Se utilizaron los paquetes informaticos Sedfit y Sedphat [Schuck P., Biophys. J. 78:1606-1619, 2000] para el analisis de los datos de velocidad, mientras que se utilizo el programa Ultrascan para analizar los datos de equilibrio de sedimentacion [Demeler B., UltraScan 5.0, 2001].

Espectroscopfa de dicrofsmo circular

Se midieron los espectros de dicroismos circular (DC) del ultravioleta lejano a t.a. utilizando un espectropolarimetro Jasco J-715 y una cubeta de cuarzo de 0,1 cm de camino optico. Se prepararon solucion de peptido 5 (50 !M) y solucion de lipopeptido 4 (35,7 !M) en tampon TRIS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 90 mM, pH 7,4) y se determinaron las concentraciones mediante analisis de fosfatos o de aminoacidos, segun resultase apropiado. Se utilizaron velocidades de barrido de entre 10 y 100 nm/min, tiempos de respuesta de 1 a 2 segundos y un ancho de banda espectral de 1 nm y los espectros se recogieron a una resolucion minima de 0,5 nm. Tras restar el blanco, se expresaron los valores espectrales como elipticidad residual media [grad. cm2/dmol] y se ignoro la fraccion lipido en el calculo del peso molecular medio de residuo.

Se midieron los espectros de DC de las muestras de baja concentracion de lipopeptido 4 (2 a 40 !M) a 20°C con un espectropolarimetro Jasco J810 utilizando una cubeta de cuarzo de 1 cm de camino optico. Se prepararon soluciones de lipopeptido en PBS (Na2HPO4 10 mM, NaCl 90 mM, pH 7,4) y se determinaron las concentraciones mediante analisis de fosfatos. Se utilizaron velocidades de barrido de 10 nm/min, tiempos de respuesta de 4 segundos y un ancho de banda espectral de 2 nm y los espectros se recogieron a una resolucion minima de 0,5 nm. Se elaboraron los datos tal como se ha indicado anteriormente.

Fluorescencia: concentraci6n micelar crftica (CMC)

Se utilizo la sonda fluorescente pireno-3-carboxialdehido (PYCHO) para la determinacion de la concentracion micelar critica (CMC) [Turro N.J., Macromolecules 17:2123-2126, 1984; Ananthapadmanabhan K.P. et al., Langmuir 1:352-355, 1985]. Se obtuvieron los espectros de fluorescencia en un espectrometro de luminiscencia LS55 de Perkin Elmer. Los espectros de emision del pireno-3-carboxialdehido se midieron entre 400 y 550 nm a 20°C. Se obtuvieron mediante excitacion de las muestras a 380 nm con una velocidad de barrido de 300 nm/min, anchura de rendija de excitacion de 4 nm y anchura de rendija de emision de 9 nm, se acumulo cada barrido cuatro veces y se calculo el promedio. Se prepararon soluciones de lipopeptido 4 utilizando HBS, pH 7,4 (Hepes 10 mM, NaCl 90 mM) previamente saturadas con PYCHO (concentracion de la solucion <10-6 M). Se midieron los espectros de fluorescencia a 12 concentraciones de peptido, de entre 1 !M y 5 nM, y se determinaron las concentraciones de las muestras utilizando el ensayo de fosfatos. Se prepararon concentraciones de lipopeptido en el intervalo bajo de nM (50 nM a 3 nM) utilizando una dilucion 1/10 de la solucion saturada de PYCHO en tampon HBS. Los datos se analizaron con software Origin (v7.0) y se grafico la proporcion relativa de intensidades I437/I466 de los espectros de emision frente a la concentracion de muestra con el fin de extrapolar el valor de CMC.

Dispersi6n lumfnica dinamica (DLS)

Se llevaron a cabo mediciones de dispersion luminica en un clasificador de tamanos submicrometricos NICOMP (modelo 370). Se prepararon soluciones de lipopeptido 4 en tampon TRIS (10 mM, NaCl 90 mM, pH 7,4) y se determinaron las concentraciones de las muestras mediante analisis de fosfatos. Se filtro una solucion 1,1 mM de lipopeptido 4 a traves de un filtro Millipore de 0,45 !m, que rindio una muestra de 1,05 mM. Se llevaron a cabo mediciones de dispersion luminica con dicha solucion a 20°C, 30°C y 37°C. Las mediciones a 20°C se llevaron a cabo en los tiempos t=0, 20 y 90 minutos, a 30°C y a 37°C en los tiempos t=0 y 90 minutos. La elaboracion de los datos se llevo a cabo utilizando un modelo de ajuste multicomponente NICOMP bajo la suposicion de la presencia de particulas esfericas ideales.

Microscopfa electr6nica

Se utilizaron rejillas de cobre de malla 400 recubiertas de carbono, convertidas en hidrofilicas en plasma de oxigeno, para un analisis estructural preliminar mediante microscopia electronica de transmision (MET). Se aplico una gota pequena de solucion de lipopeptido 4 (4 !M en tampon TRIS, pH 7,4) al soporte de C hidrofilico y tras 20 segundos se elimino la mayor parte de la solucion de manera que solo quedase una capa muy fina sobre la rejilla. A continuacion se lavo la rejilla tocando la superficie con una gota de agua. Se elimino el exceso de agua con un filtro y la rejilla se tino inmediatamente tocando la superficie con una gota de acetato de uranilo acuoso al 2%. Tras eliminar la solucion de tincion la rejilla se dejo secar. Se registraron micrografias en un microscopio electronico Zeiss EM 912 (Zeiss AG, Oberkochen, BRD) utilizando una camara CCD de barrido lento 1 k x 1 k (Proscan, Munich, BRD).

Ejemplo 2: lipopeptido 6

El lipopeptido 6 es identico al 4 excepto en que se ha anadido una Cys adicional en el extremo C-terminal de SEC ID n° 1. La cadena lateral de esta Cys puede utilizarse para conjugar el lipopeptido a un antigeno.

Se sintetizo el peptido 53-mero en una resina de amida de Rink-MBHA utilizando la reaccion del Fmoc, tal como anteriormente para el peptido 5, tambien con Fmoc-Cys(Trt)-OH. Tras completarse la sintesis, se trato una muestra de la resina con TFA. A continuacion se analizo el producto mediante HPLC de fase inversa en una columna C18 (Zorbax Eclipse DB-C18; 4,6 mm x250 mm, 5 !m, 80 A) utilizando un gradiente de 5% a 50% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 18 minutos y despues hasta 100% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 4 minutos. Tiempo de retencion=19,6 minutos. EM-ESI: (m/z): 1393,2 [M+4H]4+; 1115,0 [M+5H] 5+; 929,1 [M+6H]6+ 796,8 [M+7H]7+ (Mmeas = 5569,6 ± 0,01%; Mcalc,= 5569,6). Debido a que el peptido lineal correcto se encontraba presente sobre la resina, se union el fosfolipido 1,3-dipalmitoil-glicero-2-fosfoetanolamido-succinato (PE-succ-OH) al extremo N-terminal del peptido unido a resina restante utilizando PyBOP (3 eq.) y DIEA (8 eq.) en DMF:CH2Cl2 (2:1) a t.a. durante 16 horas. Se confirmo que se habia completado la union por una prueba de Kaiser negativa. El conjugado resultante unido a resina finalmente se corto de la misma y se desprotegio utilizando TFA/H2O/TIS/EDT 92,5:2,5:2,5:2,5 durante 3 horas. Se concentro la fase TFA al vacio y despues el lipopeptido desprotegido crudo se precipito mediante la adicion de iPr2O frio. Tras la centrifugacion, el pellet se lavo dos veces con iPr2O y se seco bajo alto vacio. El producto se disolvio en H2O/MeCN/DMF 4:4:2 y se purifico mediante HPLC de fase inversa en una columna semipreparativa C4 (InterchromUP5WC4-25M; 10 mm x 250 mm, 10 !m, 300 A) utilizando un gradiente de 50% a 100% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 15 minutos. Las fracciones que contenian el producto se liofilizaron, proporcionando el conjugado 6. El conjugado 6 se analizo mediante HPLC de fase inversa en una columna analitica C4 (Interchrom UP5WC4-25QS; 4,6 mm x 250 mm, 10 !m, 300 A) utilizando un gradiente de 50% a 100% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 20 minutos: pureza > 98%. tR = 17,2 min. EM-ESI (modo positivo) (m/z): 1587,7 [M+4H]4+; 1269,6 [M+5H]5+; 1058,3 [M+6H]6+; 907,0 [M+7H]7+(Mmeas= 6342,9 ± 0,01%; Mcalc,= 6342,6).

Ejemplo 3: lipopeptido 7

La parte peptido (SEC ID n° 2) de esta molecula contiene una secuencia repeticion heptada superenrollada de diseno fusionada con una secuencia superenrollada natural obtenida de la proteina gp41 del VIH-1 cepa JR-FL. Por lo tanto, la secuencia superenrollada es en parte natural y en parte de diseno. Ademas, se ha anadido el dipeptido -SG-al extremo N-terminal para que actue como espaciador corto antes del lipido, y al extremo C-terminal se ha unido el dipeptido -CG- de manera que el grupo tiol en el residuo Cys pueda utilizarse para la conjugacion con un antigeno.

El peptido se ensamblo utilizando HBTU/HOBt/DIEA para la activacion y resina de cloruro de 2-clorotritilo (0,34 mmoles/g, 500 mg) cargada con Fmoc-Gly. Los aminoacidos utilizados fueron Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH y Fmoc-Val-OH. Se utilizo un exceso de seis veces de aminoacidos Fmoc y 8 equivalentes de DIEA. Tras cada ciclo de union, se anadio una caperuza a los grupos amino libres restantes con Ac2O/HOBt/DIEA. Tras el ensamblaje y la eliminacion del grupo Fmoc terminal, la resina se lavo con DMF (5x6 ml), i-PrOH (5x6 ml) y n-hexano (4x6 ml) y se seco. Para la union de la fraccion lipido, la resina (957 mg) se hincho durante 30 minutos en CH2Cl2. Se anadio una solucion de Fmoc-Cys((RS)-2,3-di(palmitoiloxi)-propil)-OH (Fmoc-Pam2Cys-OH, 174 mg), PyBOP (101 mg) y HOBt (26 mg) en CH2Cl2/DMF 2:1 (3,5 ml), seguido de DIEA (1,6 equiv.). La mezcla se agito suavemente durante 18 horas en un agitador a t.a. La resina se lavo con CH2Cl2 (5x6 ml) y DMF (5x6 ml). Se elimino el grupo protector Fmoc mediante tratamiento con piperidina al 20% (v/v) en DMF (6x2 ml durante 2 minutos). Se realizo un seguimiento de la desproteccion mediante absorcion de UV a 301 nm. La resina se lavo con DMF (5x10 ml), i-PrOH (5x6 ml) y n-hexano (4x6 ml) y CH2Cl2 (2x6 ml). La resina peptidilo se trato con TFA al 0,6% en CH2Cl2 (4x4,5 ml durante 2 minutos), seguido de un lavado con CH2Cl2. Se agruparon los filtrados y se evaporaron bajo presion reducida. A continuacion, se eliminaron los grupos protectores de cadena lateral mediante tratamiento con TFA/EDT/tioanisol/fenol/H2O/TIS 69:10:10:5:3,5:1 (9,85 ml) bajo agitacion suave durante 2 horas a t.a. El peptido desprotegido se precipito en iPr2O preenfriado a -20°C y se lavo 3x con iPr2O (15 ml). Se dejo que el precipitado se secase al aire durante la noche y el lipopeptido superenrollado se purifico mediante RP-HPLC en una columna preparativa C4 (Interchrom) utilizando un gradiente de 30% a 100% de MeCN en H2O (+TFA al 0,1%) durante 28 minutos. Rendimiento: 45 mg. RP-HPLC (columna C4 Interchrom, 50% a 100% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 12,5 minutos): pureza > 97 %, tR = 11,92 min. EM-CL: columna C8, 30% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos: tR = 5,47 minutos; m/z = 1342,5 [M+5H]5+, 1118,9 [M+6H]6+, 959,3 [M+7H]7+, 893,4 [M+8H]8+, 746,6 [M+9H]9+. MALDI-TOF: m/z calculado para C308H532N76O82S3: 6704,9; m/z observado: 6704,7 [M]+.

Ejemplo 4: lipopeptido 8

El lipopeptido 8 contiene una helice superenrollada de diseno (SEC ID n° 3) unida mediante un conector corto en el extremo N-terminal a un fosfolipido.

El peptido (SEC ID n° 3) se ensamblo utilizando una reaccion de Fmoc y HBTU/HOBt/DIEA para la activacion y resina de cloruro de 2-clorotritilo (0,42 mmoles/g, 595 mg, a escala de 0,25 mmoles). Los aminoacidos utilizados fueron Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH y Fmoc-Cys(Trt)-OH. Se utilizo un exceso de cuatro veces de aminoacidos protegidos con Fmoc y 6 equivalentes de DIEA. Tras cada ciclo de union, se anadio una caperuza a los grupos amino libres restantes con Ac2O/HOBt/DIEA. Tras el ensamblaje de la cadena peptidica y la eliminacion del grupo Fmoc terminal, la resina se lavo con DMF (5x6 ml), i-PrOH (5x6 ml) y n-hexano (4x6 ml) y se seco al vacio. Para unir la fraccion lipido, la resina (250 mg) se hincho durante 30 minutos en DCM. Se anadio una solucion de PE-succ-OH (113 mg), PyBOP (66 mg) y HOBt (17 mg) en DCM/DMF 1:2 (4,5 ml), seguido de DIEA (31 !l, 300 !moles, 6,0 equiv.). La mezcla se agito suavemente durante 16 horas en un agitador a t.a. La

resina se lavo con DMF (5x6 ml) y DCM (2x6 ml). La resina peptidilo se trato con TFA al 0,6% en DCM (4x4,5 ml durante 2 minutos), seguido de un lavado con DCM. Se agruparon los filtrados y se evaporaron bajo presion reducida. A continuacion, se eliminaron los grupos protectores de cadena lateral mediante tratamiento con TFA/EDT/tioanisol/H2O/TIS 75:10:10:4:1 (10 ml) bajo agitacion suave durante 2 horas a t.a. El peptido desprotegido se precipito con iPr2O preenfriado a -20°C y se lavo 3x con iPr2O. Se purifico el lipopeptido 8 mediante HPLC de fase inversa en una columna preparativa C4 (Interchrom) utilizando un gradiente de 30% a 100% de MeCN en H2O (+TFA al 0,1%) durante 28 minutos. Rendimiento: 15 mg. RP-HPLC (columna C4 Interchrom, 50% a 100% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 12,5 minutos): pureza > 96 %, tR = 12,54 min. EM-CL: m/z calculado para C267H474N57O79PS: 5810,0; m/z observado: 1453,3 [M+4H]4+, 1162,5 [M+5H]5+.

Ejemplo 5: antigeno V3SS que porta un grupo 4-maleimidobutiril-hidrazinoglicinilo, 12

El peptido con puente disulfuro denominado V3SS se obtiene en gran parte del denominado bucle V3 de la glucoproteina gp120 del VIH-1. Esta secuencia (SEC ID n° 4) representa el denominado determinante neutralizador principal de gp120, y ha sido investigado extensamente como un candidato potencial a vacuna para el VIH-1 [Huang C.-C. et al., Science 310:1025-1028, 310; Pantophlet R. et al., Annu. Rev. Immuno. 24:739-769, 2006]. El peptido con puente disulfuro V3WW es, por lo tanto, un mimetico de epitopo del bucle V3 en gp120.

En el extremo N-terminal de V3SS (SEC ID n° 4) se ha anadido un residuo hidrazinoglicina (Z), de manera que puede utilizarse el grupo hidrazino nucleofilico para unir el peptido al LBB. La cadena peptidica se ensamblo en resina de cloruro de 2-clorotritilo utilizando metodos de fase solida estandares y la reaccion de Fmoc. Se anadio al extremo N-terminal un residuo hidrazinoglicina protegido con tri-Boc. Tras el corte de la resina y la desproteccion completa, se introdujo el enlace disulfuro mediante oxidacion al aire. Finalmente, se hizo reaccionar regioespecificamente el conector N-hidroxisuccinimidil-4-maleimidobutirato (HMB) con el grupo hidrazino en el extremo N-terminal, proporcionando el producto 12.

Se sintetizo el peptido lineal Z-NCRKSIHIGPGRAFYTTGCG (Z anadido a SEC ID n° 4), en el que Z se refiere a -NHNHCH2CO-en un sintetizador de peptidos ABI 433A de Applied Biosystems utilizando la reaccion de Fmoc estandar y resina de cloruro de 2-clorotritilo. Tras la carga con Fmoc-Gly-OH, para la sintesis se utilizaron los aminoacidos con proteccion de las cadenas laterales siguientes: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, FmocSer(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH y Fmoc-Tyr(tBu)-OH. Como residuo N-terminal se unio hidrazinoglicina protegida con Boc mediante tratamiento de la resina con una solucion de tri-Boc-acido hidrazinoacetico (3 eq.), PyBOP (3 eq.) y DIEA (8 eq.) en DMF (5 ml) durante 3 horas. A continuacion se filtro la resina y se lavo con DMF (5x) y despues con CH2Cl2 (5x). Se corto el peptido de la resina y se desprotegio mediante tratamiento de la resina con TFA/H2O/iPr3SiH/etanoditiol 92,5:2,5:2,5:2,5 (15 ml) durante 2,5 horas. Se elimino la resina mediante filtracion y tras la concentracion del filtrado al vacio, el peptido lineal desprotegido crudo se precipito mediante adicion de iPr2O frio. Tras la centrifugacion, el pellet se lavo dos veces con iPr2O y se seco bajo alto vacio, proporcionando un solido blanco. El producto se purifico mediante HPLC de fase inversa en una columna C18 (Zorbax Eclipse DB-C18; 21,2 mm x 250 mm, 7 !m, 80 A) utilizando un gradiente de 10% a 50% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 16 minutos, proporcionando el peptido lineal puro en la forma ditiol reducida. Este peptido se analizo mediante HPLC de fase inversa (columna analitica C18 ZorbaxEclipse DB-C18, 4,6 mm x 250 mm, 5 !m, 80 A) utilizando un gradiente de 5% a 50% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 20 minutos: pureza > 98%. tR = 14,2 min. MALDI-TOF (m/z): 2211,2 [M+1 H]1+(Mmeas.= 2210,2 ± 0,01%; Mcalc.= 2210,4).

Para la oxidacion (formacion de puentes disulfuro), se agito una solucion de peptido lineal (20 mg) en H2O (20 ml) al aire a t.a. durante 48 horas. El peptido con puentes disulfuro correspondiente se purifico directamente mediante HPLC de fase inversa en una columna preparativa C18 (ZorbaxEclipse DB-C18, 21,2 mm x 250 mm, 7 !m, 80 A) utilizando un gradiente de 12% a 40% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 16 minutos, proporcionando 15 mg de peptido oxidado. El peptido oxidado (con puente disulfuro) se analizo mediante HPLC de fase inversa (columna analitica C18 ZorbaxEclipse DB-C18, 4,6 mm x 250 mm, 5 !m, 80 A) utilizando un gradiente de 5% a 50% de acetonitriloen agua (+TFA al 0,1%) durante 20 minutos: pureza > 98%. tR = 14,2 min. MALDI-TOF (m/z): 2209,0 [M+1H]1+(Mmeas.= 2208,0 ± 0,01%; Mcalc.= 2208,4).

El peptido con puente disulfuro (30 mg) en H2O (30 ml) se disolvio en H2O (3 ml) y se ajusto el pH a 6 utilizando NaOH (0,2 N). A lo anterior se anadio una solucion de N-hidroxi-succinimidil-4-maleimidobutirato (HMB) (3 eq., 11 mg) en THF (450 !l) y la mezcla de reaccion se agito a t.a. durante 2 horas. A continuacion, la solucion se diluyo con H2O/TFA al 0,1% (2 ml) y el producto se purifico mediante HPLC de fase inversa en una columna preparativa C18 (Zorbax DB-C18, 21,2 mm x 250 mm, 7 !m, 80 A) utilizando un gradiente de 10% a 50% de MeCN en agua (+TFA

al 0,1%) durante 16 minutos, proporcionando 21 mg de peptido 12. El peptido 12 se analizo mediante HPLC de fase inversa en una columna C18 (Zorbax Eclipse DB-C18, 4,6 mm x 250 mm, 5 !m, 80 A) utilizando un gradiente de 5% a 50% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 20 minutos. pureza > 98%. tR = 14,7 min. MALDI-TOF (m/z): 2374,3 [M+1H]1+(Mmeas.= 2373,3 ± 0,01%; Mcalc.= 2373,4).

Ejemplo 6: antigeno LY-CH portador de un grupo 4-maleimidobutirilo, LY-CH-HMB

Tal como en el Ejemplo 5, se unio el conector HMB a una molecula organica pequena hapteno: el pigmento amarillo denominado amarillo Lucifer-CH (LY-CH), proporcionando el conjugado LY-CH-HMB.

Se disolvio amarillo Lucifer-CH (LY-CH) (Fluka, Buchs, Suiza, 12,5 mg) en H2O/CH3CN (1 ml, 4:1) y se ajusto el pH de la solucion a 6,5 con NaOH 0,2 N. A esta solucion se anadio una solucion de N-hidroxisuccinimidil-4maleimidobutirato (HMB) (15 mg, 2 eq.) en THF (400 !l) y la mezcla de reaccion se agito a t.a. durante 6 horas. Tras la dilucion con H2O/TFA al 0,1% (2 ml), el producto se purifico directamente mediante HPLC de fase inversa en una columna preparativa C18 (Zorbax, 21 mm x 250 mm, 10 !m, 120 A) utilizando un gradiente de 5% a 50% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 15 minutos, proporcionando 9,6 mg de LY-CH-HMB en forma de solido amarillo. EM-ESI (m/z): 608,0 [M-H]-, 630,9 [M+Na-2H] (modo de iones negativos).

Ejemplo 7: conjugado LBB6-12.

Se disolvio el peptido 12 (Ejemplo 5, 5,9 mg) en H2O/CH3OH 4:1 (750 !l) y se ajusto el pH de la solucion a 6,5 con NaOH (0,2 N). A lo anterior se anadio una solucion de lipopeptido 6 (Ejemplo 2, 6,6 mg) en H2O/CH3OH 1:1 (800 !l) y la mezcla de reaccion se agito bajo una atmosfera inerte a t.a. durante 2 horas. Tras diluir con H2O/TFA al 0,1% (2 ml), el producto se purifico directamente mediante HPLC de fase inversa en una columna semipreparativa C4 (Interchrom UP5WC4-25M, 10mm x 250 mm, 10 !m, 300 A) utilizando un gradiente de 50% a 100% de MeCN en agua (+TFA al 0,1%) durante 15 minutos, proporcionando 4 mg de LBB6-12. El conjugado se analizo mediante HPLC de fase inversa en una columna analitica C4 (Interchrom UP5WC4-25QS, 4,6 mm x 250 mm, 10 !m, 300 A) utilizando un gradiente de 50% a 100% de acetonitrilo en agua (+TFA al 0,1%) durante 20 minutos. pureza > 98%. tR = 15,4 min. MALDI-TOF (m/z): 8717,4 [M+1H]1+(Mmeas.= 8716,4 ± 0,01%; Mcalc.= 8716,3).

Ejemplo 8: conjugado LBB6-LY-CH

A una solucion bajo agitacion de lipopeptido 6 (Ejemplo 2, 1,1 mg, 177 nmoles) en H2O/MeCN/TFE 1:4:1 (600 !l) se anadio gota a gota una solucion de LY-CH-HMB (Ejemplo 6, 440 !g) en H2O/MeCN 1:1 (400 !l). Se ajusto cuidadosamente el pH a 6,3 con NaOH 0,01 N y la mezcla se agito vigorosamente a t.a. durante 2 horas. Debido a que el lipopeptido 6 y el conjugado de amarillo Lucifer presentan igual tiempo de retencion en columnas de RP-HPLC C4 y C8 para una diversidad de gradientes de H2O/MeCN, se realizo un seguimiento de la reaccion a partir de la desaparicion del lipopeptido 6 mediante EM-ESI. Tras completarse la reaccion, la suspension se diluyo mediante la adicion de TFA al 0,1% (500 !l) y el aducto se separo del exceso de LY-CH-HMB mediante HPLC de fase inversa semipreparativa en una columna C4 (Interchrom UP5WC4-25M, 10 mm x 250 mm, 10 !m, tamano de poro de 300 A, A=H2O + TFA al 0,1%, B=MeCN + TFA al 0,1%, 50% a 100% de B en 16,5 minutos). El conjugado LBB6-LY-CH eluyo como un pico estrecho con tR=13,38 minutos. Rendimiento: 1,0 mg (82%). El producto se analizo mediante HPLC de fase inversa en una columna analitica C4 (Interchrom, 4,6 mm x 250 mm, 10 !m, 300 A) y mediante CL-EM (Zorbax C8, fuente de iones, detector). RP-HPLC analitica (columna C4, A=H2O+TFA al 0,1%, B=MeCN+TFA al 0,1%, 50% a 100% de B en 13 minutos): Pureza: > 95%. tR = 13,0 minutos. CL-EM (columna C8, A = H2O + HCOOH, B MeCN + HCOOH, 30% a 100% de B en 10 minutos): tiempo de retencion=7,73 minutos. m/z: 1392,4 [M+5H]5+, 1160,3 [M+6H]6+, 994,3 [M + 7 H]7+(m/z calculado para C307H514N74, O99PS3Li: 1392,2 [M+5H]5+, 1160,3 [M+6H]6+, 994,7 [M + 7 H]7+).

Ejemplo 9: conjugado LBB7-12

A una solucion bajo agitacion de lipopeptido 7 (Ejemplo 3, 3,5 mg) en MeCN/H2O/TFE 4:1:1 (1,2 ml) se anadio una solucion de 12 (Ejemplo 5, 3,7 mg) en MeCN/H2O 1:1 (400 !l). Se ajusto cuidadosamente el pH a 6,0 con NaOH 0,1

N. La mezcla se agito durante 2 horas a t.a. Tras completar la reaccion (detectado mediante CL-EM utilizando una columna C8), el conjugado LBB7-12 se purifico directamente mediante RP-HPLC semipreparativa en una columna C4 (Interchrom) utilizando un gradiente de 30% a 100% de MeCN en H2O (+TFA al 0,1%) durante 17 minutos.

Rendimiento: 4,1 mg (87%). RP-HPLC (columna C4, 50% a 100% de MeCN e H2O (TFA al 0,1%) durante 12,5 minutos): pureza > 97%, tiempo de retencion = 10,72 min. CL-EM (columna C8, 30% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR = 5,53 minutos; m/z = 1010,4 [M+9H]9+, 909,8 [M+10H]10+, 827,2 [M+11H]11+, 758,3 [M+12H]12+, 700,0 [M+13H]13+. MALDI-TOF: m/z calculado para C409H685N109O112S5: 9082,0; m/z observado: 9082,8 [M], 2+4542,1 [M].

Ejemplo 10: conjugado LBB7-LY-CH

La sintesis y purificacion de LBB7-LY-CH se llevaron a cabo tal como se ha descrito para LBB7-12 en el Ejemplo 9, utilizando el lipopeptido 7 (3,0 mg) y LY-CH-HMB (Ejemplo 6, 1,1 mg). Rendimiento: 2,8 mg (86 %). RP-HPLC (Interchrom columna C4, 50% a 100% de MeCN e H2O (TFA al 0,1%) durante 12,5 minutos): pureza > 96%, tR = 11,91 min. EM-CL: columna C8, 66% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 5 minutos: tR = 2,7 minutos, m/z = 1464,9 [M+5H]5+ 1220,7 [M+6H]6+, 1046,5 [M+7H], 915,9 [M+8H]8+. MALDI-TOF: m/z calculado para C329H549N82O94S5Li: 7324,8; m/z observado: 7336,6 [M-Li+Na]+, 7320,4 2+[M]+, 3660,0 [M].

Ejemplo 11: inmunizaciones

Una importante aplicacion de los HLB y SVLP es la administracion de componentes de vacuna en el sistema inmunologico para elevar las respuestas inmunologicas. Con la inmunizacion de los animales con HLB o SVLP cargados con antigeno, deben inducirse respuestas inmunologicas eficientes especificas de antigeno. Para demostrar que lo anterior resulta posible, se inmunizaron conejos con LBB6-12, LBB6-LY-CH, LBB7-12 y LBB7-LY-CH. Ademas, se sometieron a ensayo los primeros tres conjugados con y sin adyuvante completo/incompleto de Freund. Los estudios de DLS indican que cada conjugado formo HLB o SVLP mediante autoensamblaje espontaneo en solucion acuosa.

Se inmunizaron los conejos (en grupos de dos) con 150 !g cada uno de un conjugado reconstituido y equilibrado, durante por lo menos 1 hora a t.a. en 400 !l de PBS (fosfato sodico 10 mM, NaCl 154 mM, pH 7,2) o con adyuvante de Freund (adyuvante completo de Freund (FA) para las inmunizaciones primarias y con adyuvante incompleto de Freund (FIA) para las inmunizaciones de refuerzo). Las inmunizaciones se llevaron a cabo los dias 0, 28 y 56. Se recogieron sueros los dias 14, 38 y 66. Los sueros se analizaron mediante ensayo de inmunosorcion ligada a enzima (ELISA) con el fin de detectar los anticuerpos que se unian a los conjugados utilizados para las inmunizaciones. Se muestran los resultados en la Tabla 1.

Tabla 1. Inmunogenicidad de los conjugados.

Se muestran los titulos log10(punto de valoracion) alcanzados tras una (1°) dos (2°) y tres (3°) inmunizaciones con cada conjugado, cada una en dos conejos (a y b). Las muestras de suero preinmunes no mostraban reactividad significativa con el inmunogeno correspondiente. Por Ejemplo, un titulo log10(punto de valoracion) de 5,00 corresponde a un titulo de 100.000.

log10 (titulos de punto de valoracion)b)

Conejo 1° 2° 3°

Conjugado utilizadoa)

LBB6-12 + FA(FIA): 1a 3,51 4,41 5,01

LBB6-12 + FA(FIA): 1b < 1,70 4,51 5,41

LBB6-12: 2a 3,51 5,01 5,01

LBB6-12: 2b 2,00 3,81 4,71

LBB6-LY-CH + FA(FIA): 3a 4,11 5,11 5,71

LBB6-LY-CH + FA(FIA): 3b 3,51 4,41 5,31

LBB6-LY-CH: 4a 3,90 5,11 5,71

LBB6-LY-CH: 4b 4,20 5,11 5,40

LBB7-12 + FA(FIA): 5a 2,30 3,20 3,51

LBB7-12 + FA(FIA): 5b 2,90 3,81 4,11

LBB7-12: 6a 3,81 4,41 4,41

LBB7-12: 6b 3,51 4,11 4,11

LBB7-LY-CH: 7a 2,90 4,41 4,41

LBB7-LY-CH: 7b <1,70 3,51 4,11

a)+ FA(FIA), con adyuvante completo de Freund (primario) y adyuvante incompleto de Freund (refuerzos)b) Los titulos de punto de valoracion de las inmunizaciones primaria (1°), primer refuerzo (2°) y segundo refuerzo (3°) se definen como la ultima dilucion reciproca para la que la absorbancia de UV era superior a dos veces el valor correspondiente al suero preinmune.

Tal como puede observarse en la Tabla 1, todos los conjugados indujeron niveles elevados de anticuerpos tras la segunda inmunizacion de refuerzo. Ya era detectable una respuesta en la mayoria de antisueros primarios (titulos comprendidos entre 1:100 y 1:15.000) y el incremento mas acusado de titulos de anticuerpo se observo tras la segunda inmunizacion, mientras que se observo un menor incremento entre la segunda y tercera inmunizaciones. Tambien resulto evidente que los titulos de anticuerpo alcanzados sin utilizacion de adyuvantes eran tan altos, o mas altos, que los alcanzados utilizando adyuvante de Freund. Lo anterior demuestra que pueden conseguirse buenas respuestas inmunologicas sin utilizar un adyuvante.

Tambien se analizo mediante ELISA la especificidad de cada respuesta inmunologica especifica de hapteno (Tabla 2). En este analisis se midio la capacidad de los anticuerpos inducidos por cada conjugado de reaccionar cruzadamente con el mismo antigeno unido a un LBB diferente. Los resultados demostraron que una parte significativa de la respuesta inmunologica se dirigia contra el antigeno unido a cada LBB.

Tabla 2. Especificidad de las respuestas inmunologicas especificas de hapteno. Se sometieron a ensayo los anticuerpos generados contra cada inmunogeno para la reaccion cruzada con cada antigeno mediante ELISA. Se muestran los titulos log10(punto de valoracion) alcanzados tras una (1°), dos (2°) y tres (3°) inmunizaciones con cada conjugado, cada una en dos conejos (a y b).

Titulos de punto de valoracion(log10)b)

1° 2° 3°Inmunogenoa) Conejo Antigeno

LBB6-12+ FA 1a LBB7-12 3,20 4,71 4,71 (FIA) LBB6-12+ FA 1b LBB7-12 <1,70 5,11 5,41 (FIA) LBB6-12 2a LBB7-12 3,60 5,11 5,41 LBB6-12 2b LBB7-12 <1,70 3,81 4,11 LBB7-12+ FA 5a LBB6-12 <1,70 2,30 2,30 (FIA) LBB7-12+ FA 5b LBB6-12 <1,70 3,51 3,81 (FIA) LBB7-12 6a LBB6-12 <1,70 2,30 4,41 LBB7-12 6b LBB6-12 <1,70 <1,70 <1,70 LBB6-LY-3a LBB7-LY-CH 3,20 4,71 5,01 CH+FA(FIA) LBB6-LY-3b LBB7-LY-CH 2,90 3,81 4,41 CH+FA(FIA) LBB6-LY-CH 4a LBB7-LY-CH 4,51 5,11 5,41 LBB6-LY-CH 4b LBB7-LY-CH 4,20 5,71 5,71

LBB7-LY-CH 7a LBB6-LY-CH 2,90 5,01 5,01 LBB7-LY-CH 7b LBB6-LY-CH <1,70 4,71 5,01

a) FA(FIA), con adyuvante completo de Freund (primario) y adyuvante incompleto de Freund (refuerzos) b) Los titulos de punto de valoracion de las inmunizaciones primaria (1°), primer refuerzo (2°) y segundo refuerzo (3°) se definen como la ultima dilucion reciproca para la que la absorbancia de UV era superior a dos veces el valor correspondiente a la dilucion de suero preinmune.

Se recubrieron durante la noche placas de microtitulacion ELISA (Nunc Immunoplates Polysorb F96) con una solucion 5 !g/ml de cada antigeno en PBS. A continuacion, los pocillos se lavaron con PBS que contenia Tween 20 al 0,05% (PBST) y se bloquearon con PBS que contenia leche desnatada en polvo al 5% durante 1 hora a t.a. Tras el bloqueo, los pocillos se lavaron tres veces con PBST y se incubaron con diluciones en serie de suero de conejo en PBS que contenia Tween 20 al 0,05% y leche desnatada en polvo al 5% (MPBST) durante 2,5 horas a t.a., seguido de tres lavados con PBST. A continuacion, las placas se incubaron con anticuerpo IgG de raton anticonejo conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma), diluido 1:20.000 en MPBST, durante 1 hora a t.a., se lavaron nuevamente tres veces con PBST y se incubaron en la oscuridad con una solucion 1 mg/ml de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) en tampon de sustrato (tampon de carbonato sodico 50 mM, MgCl2 1 mM, pH 9,6) a t.a. Se leyo la absorbancia tras un tiempo apropiado a 405 nm utilizando un lector de microplacas Bio-Rad modelo 3550.

Ejemplo 12: lipopeptido 9

El presente ejemplo se basa en el motivo repeticion heptada IEKKIEA del lipopeptido 8 del Ejemplo 4, aunque incluye ademas un epitopo de celula T ayudante universal correctamente fusionado [descrito en: Sinigaglia, F. et al., Nature 336:778-780, 1988], asi como residuos adicionales en el extremo C-terminal para mejorar la solubilidad y la estabilidad, y para permitir la conjugacion de un antigeno.

Se sintetizo el peptido lineal GGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIAKMEKASSVFNVVNSKKKCa-NH2 (SEC ID n° 28, en el que se ha anadido una D-alanina-amida indicada como "a-NH2" en el extremo C-terminal) en un sintetizador de peptidos ABI 433A de Applied Biosystems utilizando una reaccion estandar de Fmoc y resina de amida de Rink-MBHA. Tras cargar la resina en primer lugar con Fmoc-D-alanina utilizando HBTU, HOBt y DIEA para la activacion, el peptido se ensamblo utilizando, en la secuencia correcta, los aminoacidos protegidos siguientes: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu (tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH y Fmoc-Val-OH. Tras cada ciclo de union, los grupos amino libres restantes se acetilaron utilizando Ac2O/HOBt/DIEA. Tras completar el ensamblaje de la cadena y la eliminacion del grupo protector Fmoc terminal, la resina se lavo con DMF (5x6 ml), CH2Cl2 (5x6 ml) y MeOH (5x6 ml) y se seco al vacio sobre pellets de KOH. Para la union de la fraccion lipido, la resina (325 mg) se hincho en CH2Cl2 (6 ml) durante 45 minutos. Se anadio una solucion de PE-Succ-OH (120 mg, 150 !moles), PyBOP (78 mg, 150 !moles), HOBt (20 mg, 150 mmoles) y DIEA (100 !l, 0,6 mmoles) en CH2Cl2/DMF 1:2 (4,5 ml). Se agito la mezcla durante 20 horas. La resina se filtro y se lavo con DMF (5x6 ml), CH2Cl2 (5x6 ml) y MeOH (5x6 ml) y se seco al vacio sobre pellets de KOH. Para el corte y eliminacion de los grupos protectores de cadenas laterales, la resina se trato con TFA/tioanisol/EDT/H2O/TIS 75:10:10:4:1 (10 ml) bajo agitacion durante 2,5 horas. Se filtro la resina y el peptido se precipito con iPr2O (preenfriado a -20°C) y se lavo con iPr2O (3x25 ml). Se dejo que el precipitado se secase al aire durante la noche y el lipopeptido se purifico mediante RP-HPLC de fase inversa en una columna preparativa C4 (Interchrom) utilizando un gradiente de 30% a 100% de MeCN en H2O (+TFA al 0,1%) durante 28 minutos. Rendimiento: 37 mg. HPLC de fase inversa analitica (Interchrom columna C4, 25% a 100% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 25 minutos): pureza > 96%, tR = 22,10 min. CL-EM (columna Zorbax C8, 30% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR = 5,32 minutos; EM-ESI m/z = 990,3 [M+7H]7+, 866,6 [M+8H]8+, 770,2 [M+9H]9+, 693,3 [M+10H]10+. MALDI-TOF: m/z calculado para C315H557N74O90PS2: 6916,3; m/z observado: 6916,8 [M+H]+.

Ejemplo 13: lipopeptido 10

El presente ejemplo utiliza la misma secuencia peptidica que el Ejemplo 12, aunque contiene un grupo de cabeza lipido basado en Pam2-cisteina (Cys((RS)-2,3-di(palmitoiloxi)-propilo)) en lugar de uno basado en un fosfolipido.

Se sintetizo el peptido lineal en un sintetizador de peptidos ABI 433A de Applied Biosystems utilizando una reaccion estandar de Fmoc y resina de amida de Rink-MBHA tal como se ha indicado anteriormente para el lipopeptido 9. Para la union de la fraccion lipido al extremo N-terminal de la cadena peptidica, la resina (280 mg) se hincho en CH2Cl2 (6 ml) durante 30 minutos. Se anadio una solucion de Fmoc-Cys((RS)-2,3-di(palmitoiloxi)-propil)-OH (134 mg, 150 !moles), PyBOP (78 mg, 150 !moles), HOBt (20 mg, 150 !moles) y DIEA (100 !l, 0,6 mmoles) en CH2Cl2/DMF 2:1 (4,5 ml). La mezcla se agito durante 20 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro y se lavo con DMF (5x6 ml) y CH2Cl2 (5x6 ml). Para eliminar el grupo protector Fmoc, la resina se trato con piperidina al 20% (v/v) en DMF (5x4,5 ml durante 2 minutos). Tras la completa eliminacion del grupo protector Fmoc, la resina se lavo con DMF (5x6 ml), CH2Cl2 (5x6 ml) y MeOH (5x6 ml) y se seco al vacio sobre pellets de KOH. Para el corte y eliminacion de los grupos protectores de cadenas laterales, la resina se trato con TFA/tioanisol/EDT/H2O/TIS

75:10:10:4:1 (10 ml) bajo agitacion durante 2,5 horas. El lipopeptido se precipito y se purifico tal como se ha indicado para el lipopeptido 9. Rendimiento: 45 mg. HPLC de fase inversa analitica (Interchrom columna C4, 25% a 100% de

MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 25 minutos): pureza > 96%, tR = 22,71 min. CL-EM (columna Zorbax C8, 30% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR = 4,87 min.; EM-ESI m/z = 851,1 [M+8H]8+; 756,9 [M+9H]9+; 681,3 [M+10H]10+; 618,1 [M+11H]11+. MALDI-TOF: m/z calculado para C315H557N74O90PS2: 6796,4; m/z observado: 6798,2 [M+H]+.

Ejemplo 14: antigeno portador de un grupo y-maleimidobutirilo, GMB-L21

La secuencia peptidica se obtuvo principalmente de la region de repeticion NPNA de la proteina circunsporozoito (CS) del parasito del paludismo Plasmodium falciparum, que ha sido extensamente investigado por su potencial como candidato para vacuna contra el paludismo [Herrington D.A. et al., Nature 328:257-259, 1987]. Se anadio una D-alanina-amida adicional (indicada "a-NH2") en el extremo C-terminal para mejorar la estabilidad. Se anadio el grupo y-maleimidobutirilo (GMB) para permitir la conjugacion con un residuo de cisteina en el lipopeptido 9 o en el lipopeptido 10.

Se sintetizo el peptido lineal NPNANPNANPNANPNANPNAa-NH2 (SEC ID n° 30 con una D-alanina-amida adicional anadida en el extremo C-terminal) en un sintetizador de peptidos ABI 433A de Applied Biosystems utilizando una reaccion estandar de Fmoc y resina de amida de Rink-MBHA (carga: 0,69 mmoles/g, 362 mg) y HBTU/HOBt/DIEA para la activacion. Los aminoacidos utilizados fueron Fmoc-Ala-OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-Asn(Mtt)-OH y FmocPro-OH. Tras completar el ensamblaje de la cadena y la eliminacion del grupo protector Fmoc terminal, la resina se lavo con DMF (5x6 ml), DCM (5x6 ml) y MeOH (5x6 ml) y se seco al vacio sobre pellets de KOH. Se corto el peptido y se eliminaron los grupos protectores de las cadenas laterales mediante tratamiento con TFA/TIS/H2O 95:2,5:2,5 (10 ml) durante 4 horas. El peptido se precipito con iPr2O preenfriado a -20°C y se lavo con iPr2O (3x25 ml). El precipitado se seco al vacio y se purifico el peptido mediante HPLC de fase inversa en una columna preparativa C18 (Zorbax) utilizando un gradiente de 10% a 30% de MeCN en H2O (+TFA al 0,1%) durante 28 minutos. Rendimiento: 162 mg. HPLC de fase inversa analitica (Interchrom columna C4, 5% a 30% de MeCN en H2O (TFA al 0,1 %) durante 21 minutos): pureza > 95%, tR = 8,77 min. CL-EM (columna Zorbax C8, 5% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR = 3,61 min.; EM-ESI m/z = 691,6 [M+3H]3+. MALDI-TOF: m/z calculado para C83H127N31O32: 2071,1; m/z observado: 2069,9 [M+H]+.

Para unir el conector GMB al peptido, se anadio gota agota una solucion de ester de 4-maleimidobutiril-Nhidroxisuccinimida (N-succinimidil-4-maleimido-butirato, 14,0 mg, 49,2 !moles, 6 equiv.) en THF (0,5 ml) a una solucion bajo agitacion de peptido (17,0 mg, 8,2 !moles) en NH4OAc 5 mM, pH 6,5 (0,5 ml). La mezcla se sometio a agitacion durante 2 horas a 4°C, se liofilizo y el producto GMB-L21 se purifico mediante HPLC de fase inversa en una columna preparativa C18 (Zorbax) utilizando un gradiente de 10% a 40% de MeCN en H2O (+TFA al 0,1%) durante 20 minutos. Rendimiento: 10,4 mg. HPLC de fase inversa analitica (Zorbax columna C18, 5% a 30% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 25 minutos): pureza > 95%, tR = 13,02 min. CL-EM (columna Zorbax C18, 5% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR = 3,15 min.; EM-ESI m/z = 746,5 [M+3H]3+.

Se unio el mismo antigeno que en el Ejemplo 14 basado en la region de repeticion NPNA de la proteina CS a un grupo 3-maleimido-propionilo y un grupo espaciador basado en un polietilenglicol [O-(2-aminoetil)-O'-(2carboxietil)heptaetilenglicol]. El grupo maleimido permite la conjugacion con un residuo cisteina en los bloques constructivos de lipopeptido.

Se sintetizo el mismo peptido lineal que en el Ejemplo 14 tal como se ha indicado anteriormente. Para unir el conector maleimido, se anadio una solucion del peptido (10,0 mg, 4,8 !moles) en NH4OAc 5 mM, pH 6,5 (0,5 ml) a O-[N-(3-maleimidopropionil)-2-aminoetil]-O'-[3-(N-succinimidiloxi)-3-oxopropil]-heptaetilenglicol (5,0 mg, 7,2 !moles, 1,5 equiv.) en THF (0,5 ml). Rendimiento: 7,2 mg. HPLC de fase inversa analitica (Interchrom columna C4, 5% a 30% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 21 minutos): pureza > 98%, tR = 14,27 min. CL-EM (columna Zorbax C18, 5% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR = 4,31 min.; EM-ESI m/z = 882,9 [M+3H]3+.

Ejemplo 16: conjugado LBB9-GMB-L21

lipopeptido (LBB) 9. A modo de peptido (mimetico de epitopo) se utilizo la molecula GMB-L21, que se unio al residuo Cys en el lipopeptido 9.Para unir el peptido GMB-L21 al lipopeptido 9, se anadio gota a gota una solucion de lipopeptido 9 (6,9 mg, 1,0 !mol) en H2O/MeCN 1:1 (0,5 ml) a una solucion bajo agitacion de GMB-L21 en H2O/MeCN

1:1 (1 ml, 2,7 mg, 1,2 !moles, 1,2 equiv.). Se ajusto cuidadosamente el pH a 6,5 utilizando NaOH 0,1 N y la mezcla se agito durante 3 horas. Tras completar la reaccion de union, la mezcla se diluyo con H2O que contenia TFA al 0,1% (2 ml) y el conjugado se purifico mediante HPLC de fase inversa en una columna semipreparativa C4 (Interchrom) utilizando un gradiente de 50% a 100% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 17 minutos. Rendimiento: 7,1 mg. HPLC de fase inversa analitica (Interchrom columna C4, 25% a 100% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 25 minutos): pureza > 97%, tR = 19,90 min. CL-EM (columna Zorbax C8, 5% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR=4,83 minutos; ESI-MS m/z= 1310,2 [M+7H]7+; 1145,9 [M+8H]8+; 1019,0 [M+9H]9+; 917,3 [M+10H]10+; 833,8 [M+11H]11+; 764,2 [M+12H]12+. MALDI-TOF: m/z calculado para C409H691N106O125PS2: 9152,6; m/z observado: 9152,8 [M+H].

Se analizaron las propiedades de autoensamblaje de dicho conjugado de lipopeptido mediante dispersion luminica dinamica (DLS), que mostro que las SVLP se formaban nuevamente en solucion acuosa tamponada. La distribucion de tamanos de particula era monomodal y altamente monodispersa, lo que sugiere particulas altamente ordenadas con un diametro de aproximadamente 20 nm, que son estables bajo condiciones fisiologicas. Las particulas tambien eran estables a temperaturas mas altas (por ejemplo 37°C).

Ejemplo 17: conjugado LBB9-PEO8-L21

El presente ejemplo ilustra ademas como puede unirse un peptido u otro mimetico de epitopo al bloque constructivo de lipopeptido (LBB) 9. A modo de peptido (mimetico de epitopo) se utilizo la molecula PEO8-L21, que se unio al residuo Cys en el lipopeptido 9.

La union y purificacion se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente para LBB9-GMB-L21 utilizando el lipopeptido 9 (6,0 mg, 0,9 !moles) y PEO8-L21 (4,5 mg, 1,7 !moles, 2 equiv.). Rendimiento: 7,2 mg. HPLC de fase inversa analitica (Interchrom columna C4, 25% a 100% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 25 minutos): pureza > 95 %, tR = 19,82 min. CL-EM (columna Zorbax C8, 5% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR=4,93 minutos; EM-ESI m/z = 1366,0 [M+7H]1196,9 [M+8H]8+; 1064,0 [M+9H]9+; 957,8 [M+10H]10+. MALDI-TOF: m/z calculado para C424H727N108O133PS2: 9561,1; m/z observado: 9561,8 [M+H]+.

Se analizaron las propiedades de autoensamblaje de dicho conjugado de lipopeptido mediante dispersion luminica dinamica (DLS), que mostro que las SVLP se formaban nuevamente en solucion acuosa tamponada. La distribucion de tamanos de particula era monomodal y altamente monodispersa, lo que sugiere particulas altamente ordenadas con un diametro de aproximadamente 24 nm, que son estables bajo condiciones fisiologicas. Las particulas tambien eran estables a temperaturas mas altas (por ejemplo 37°C).

Ejemplo 18: conjugado LBB10-GMB-L21

El presente ejemplo ilustra como puede unirse un peptido u otro mimetico de epitopo al bloque constructivo de lipopeptido (LBB) 10. A modo de peptido (mimetico de epitopo) se utilizo la molecula GMB-L21, que se unio al

10 residuo Cys en el lipopeptido 10.

La union y purificacion se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente para LBB9-GMB-L21 utilizando el lipopeptido 10 (6,8 mg, 1,0 !mol) y GMB-L21 (2,7 mg, 1,2 !moles, 1,2 equiv.). Rendimiento: 7,4 mg. HPLC de fase inversa analitica (Interchrom columna C4, 25% a 100% de MeCN en H2O (TFA al 0,1%) durante 25 minutos): pureza

15 > 97%, tR = 19,64 min. CL-EM (columna Zorbax C8, 5% a 100% de MeCN en H2O (+HCOOH al 0,1%) durante 10 minutos): tR=4,81 minutos; EM-ESI m/z= 1130,9 [M+8H]8+; 1005,7 [M+9H]9+; 905,3 [M+10H]10+; 822,7 [M+11H]11+; 754,4 [M+12H]12+. MALDI-TOF: m/z calculado para C403H686N106O120S3: 9032,6; m/z observado: 9032,2 [M+H]+.

Se analizaron las propiedades de autoensamblaje de dicho conjugado de lipopeptido mediante dispersion luminica

20 dinamica (DLS), que mostro que las SVLP se formaban nuevamente en solucion acuosa tamponada. La distribucion de tamanos de particula era monomodal y altamente monodispersa, lo que sugiere particulas altamente ordenadas con un diametro de aproximadamente 20 nm, que son estables bajo condiciones fisiologicas. Las particulas tambien eran estables a temperaturas mas altas (por ejemplo 37°C).

25 Ejemplo 19: immunizaciones con LBB9-GMB-L21, LBB9-PE08-L21 y LBB10-GMB-L21

El presente ejemplo demuestra que los conjugados indicados anteriormente son altamente inmunogenicos al inyectarlos en animales, e inducen fuertes respuestas inmunologicas humorales. Las inmunizaciones se llevaron a cabo tal como se ha indicado en el Ejemplo 11.

30 De esta manera, tal como anteriormente, se inmunizaron s.c. conejos New Zealand White (grupos de dos) con 150 !g de lipopeptido (LBB9-PEO8-L21 o LBB10-GMB-L21) formulados en PBS, pH 7,4 (400 !l). Las inmunizaciones se llevaron a cabo los dias 0, 28 y 56. Se llevaron a cabo extracciones de sangre los dias 0, 14, 38 y 66. Los sueros se analizaron mediante ELISA para las respuestas de IgG. La Tabla 3 resume los titulos de punto de valoracion

35 alcanzados. No se utilizaron adyuvantes en estas inmunizaciones.

Ademas, se ha demostrado mediante ensayos de inmunofluorescencia que los sueros de los animales inmunizados contienen un titulo elevado (>10.000) de anticuerpos que se unen a la proteina CS en esporozoitos de Plasmodium falciparum, mostrando de esta manera que una parte importante de la respuesta inmunologica frente a estos

40 constructos se dirige al peptido antigenico que contiene los motivos de repeticion NPNA.

Tabla 3. Inmunogenicidad de los conjugados. Se muestran los titulos log10(punto de valoracion) alcanzados tras una (1°), dos (2°) y tres (3°) inmunizaciones con cada conjugado, cada una en dos conejos (a y b). Las muestras de suero preinmune no mostraron reactividad significativa frente al inmunogeno correspondiente. Por ejemplo, un titulo log10(punto de valoracion) de 5,00 corresponde a un titulo de 100.000.

log10 (titulos de punto de valoracion)b)

Conejo 1° 2° 3°

Conjugado utilizadoa)

LBB9-PEO8-L21: 1a 3,13 3,82 4,82

LBB9-PEO8-L21: 1b 4,44 5,11 5,05

LBB10-GMB-L21: 3a 1,70 4,55 4,88

LBB10-GMB-L21: 3b 3,59 3,76 4,39

a) no se utilizaron adyuvantes

b) Los titulos de punto de valoracion de las inmunizaciones primaria (1°), primer refuerzo (2°) y segundo refuerzo (3°) se definen como la ultima dilucion reciproca para la que la absorbancia de UV era superior a dos veces el valor correspondiente al suero preinmune.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Zurich 5 <120> Haces de helices superenrolladas de lipopeptido y particulas pseudoviricas sinteticas

<130> P

<150> EP06025497 10 <151> 2006-12-09

<160> 30

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 52

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> derivado de la glucoproteina F del VSR

<400> 1

<210> 2

<211>: 53 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> repeticiones heptadas y proteina derivada de gp41 del VIH-1 JR-FL

<400> 2

<210> 3

<211>: 44 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> helice superenrollada de diseno de novo

<400> 3

15 <210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> derivada del bucle V3 de la glucoproteina gp120 del VIH-1

<400> 4

<210> 5

<211> 52

<212>: PRT 30 <213> virus Influenza

<400> 5

<210> 6

<211> 46

<212> PRT

<213> virus de la inmunodeficiencia humana

<400> 6

10

<210> 7

<211> 56

<212> PRT

<213> virus de la inmunodeficiencia bovina

15

<400> 7

20

<210> 8

<211> 56

<212> PRT

<213> virus de la inmunodeficiencia felina

25

<400> 8

<210> 9

<211> 56

<212> PRT

<213> virus de la anemia infecciosa equina

<400> 9

<210> 10

<211> 58

<212>: PRT 15 <213> virus de la inmunodeficiencia del simio

<400> 10

20 <210> 11

<211> 52

<212> PRT

<213> virus de la encefalitis-artritis caprina

<400> 114

<210> 12

<211> 55 <212> PRT 10 <213> virus Visna

<400> 12

<210> 13

<211> 54

<212> PRT

<213> virus parainfluenza tipo 3 humano

<400> 13 <210> 14

<211> 54

<212> PRT

<213> virus parainfluenza tipo 1 humano

<400> 14

10 <210> 15

<211> 55

<212> PRT

<213> virus parainfluenza tipo 2 humano

15 <400> 15

<210>: 16 20 <211> 54

<212> PRT

<213> virus parainfluenza tipo 4a humano

<400> 16

<210> 17

<211> 54

<212> PRT

<213> virus parainfluenza tipo 4b humano

<400> 17

<210> 18

<211> 53

<212> PRT

<213> virus del sarampion

<400> 18

<210>: 19 20 <211> 59

25 10

<212> PRT

<213> virus de la parotiditis

<400> 19

<210> 20

<211> 55

<212> PRT

<213> virus sincitial respiratorio bovino

<400> 20

10 <210> 21

<211> 48

<212> PRT

<213> virus ebola

15 <400> 21

<210> 22

<211> 48 20 <212> PRT

<213> virus Marburg

<400> 22

<210> 23

<211> 43

<212> PRT

<213> virus del sarcoma de Rous

<400> 23

10 <210> 24

<211> 55

<212> PRT

<213> Staphylothermus marinus

15 <400> 24

<210> 25

<211> 62

<212> PRT

<213> coronavirus SARS

<400> 25

<210> 26

<211> 67

<212> PRT

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 26

5

<210> 27

<211> 38

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> helice superenrollada heptamerica

<400> 27

<210> 28

<211> 54

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> helice superenrollada trimerica

<400> 28

<210> 29

<211> 46

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> helice superenrollada tetramerica

<400> 29

<210> 30

<211> 20

<212> PRT

<213> Plasmodium falciparum

<400> 30

Claims

REIVINDICACIONES

1. Bloque constructivo de lipopeptido que consiste de una cadena peptidica de entre 21 y 80 residuos

aminoacidos, que comprende un dominio superenrollado unido covalentemente a una fraccion lipido que 5 comprende dos o tres cadenas hidrocarbilo largas y opcionalmente unido a un antigeno.
2.

Bloque constructivo de lipopeptido segun la reivindicacion 1, en el que la cadena peptidica comprende un dominio superenrollado que consiste de tres a ocho motivos heptadas.
3.

Bloque constructivo de lipopeptido segun la reivindicacion 1, en el que la cadena peptidica comprende un dominio superenrollado que forma dimeros, trimeros, tetrameros, pentameros, hexameros o heptameros.

10 4. Bloque constructivo de lipopeptido segun la reivindicacion 2, en el que, en el dominio superenrollado las posiciones a y d en cada motivo heptada (abcdefg) comprenden a-aminoacidos con cadenas laterales hidrofobicas de tamano pequeno a intermedio y/o cadenas laterales aromaticas o heteroaromaticas; en cero, una o dos de todas las posiciones a y d, un aminoacido con un residuo no cargado polar y en cero o una de todas las posiciones a y d un aminoacido con un residuo cationico polar o un derivado acilado del mismo, o con

15 un residuo anionico polar, o glicina.
5. Bloque constructivo de lipopeptido segun la reivindicacion 4, en el que la cadena lateral hidrofobica de tamano pequeno a intermedio es R1, en la que R1 es alquilo inferior, alquenilo inferior, -(CH2)a(CHR2)bOR3, (CH2)a(CHR2)bSR3, -(CHR2)OR3, -(CH2)aSR3, -(CH2)aR4 o -CH(CF3)2; en el que R2 es alquilo inferior, R3 es alquilo inferior, R4 es ciclohexilo, ciclopentilo o ciclobutilo, a es 1 a 4, y b es 0 o 1,

20 la cadena lateral aromatica o heteroaromatica es R5, en la que R5 es -(CH2)aR6, -(CH2)cO(CH2)dR6, (CH2)cS(CH2)dR6, o -(CH2)cNR7(CH2)dR6; en las que R7 es H, alquilo inferior, arilo o aril-alquilo inferior, R6 es fenilo opcionalmente sustituido de formula -C6R8R9R10R11R12 o un grupo arilo o heteroarilo de una de las formulas H1 a H14,

30 35 40

6. en la que cada uno de R8, R9, R10, R11 y R12 es, independientemente, H, F, Br, Cl, I, NO2, CF3, NR7R14 , N7COR14, alquilo inferior, arilo o OR7; R13 es H, Cl, Br, I, NO2, alquilo inferior o arilo; R14 es H, alquilo inferior o arilo; a es 1 a 4; c es 1 o 2; y d es 0 a 4; el residuo no cargado polar es R15, en el que R15 es (CH2)d(CHR16)bOR17, -(CH2)d(CHR16)bSR17, -(CH2)aCONR17R18 o -(CH2)aCOOR19; en el que R16 es alquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior, -(CH2)aOR17, -(CH2)aNR17R18, -(CH2)aNR17R18 o -(CH2)aCOOR19; R17 y R18 son, independientemente, H, alquilo inferior, arilo, o arilo-alquilo inferior, o R17 y R18 conjuntamente son -(CH2)e-, -(CH2)2-O-(CH2)2-o -(CH2)2-NR17-(CH2)2-; R19 es alquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior; y en el que a, b y d presentan los significados definidos anteriormente y e es 2 a 6; el residuo cationico polar o un derivado acilado del mismo es R20 , en el que R20 es -(CH2)aNR17R18 , -(CH2)aN=C (NR21R22)NR17R18 , -(CH2)aNR21C(=NR22)NR17R18, -(CH2)aNR21COR19 o -(CH2)aNR21CONR17R18; en el que R21 es H o alquilo inferior y R22 es H o alquilo inferior; y R17, R18 y R19 presentan los mismos significados que los definidos anteriormente y a es 1 a 4; y el residuo anionico polar es R23 , en el que R23 es -(CH2)aCOOH, en el que a es 1 a 4. Bloque constructivo de lipopeptido segun la reivindicacion 4, en el que:

los a-aminoacidos con cadena lateral hidrofobica de tamano pequeno a intermedio son la alanina, la isoleucina,

la leucina, la metionina y la valina,

los a-aminoacidos con cadena lateral aromatica o heteroaromatica son la fenilalanina, la tirosina, el triptofano y

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la histidina, los a-aminoacidos con un residuo no cargado polar son la asparagina, la cisteina, la glutamina, la serina y la

treonina, los a-aminoacidos con residuo cationico polar son la arginina, la lisina y la histidina, y los a-aminoacidos con un residuo anionico polar son el acido aspartico y el acido glutamico.
7. Bloque constructivo de lipopeptido segun la reivindicacion 1, en el que la cadena peptidica comprende un 5 peptido de SEC ID n° 1 a n° 29.
8. Bloque constructivo de lipopeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la fraccion lipido es una de entre los tipos Z1 a Z8,

en el que R1 y R2 son hidrocarbilos largos o hidrocarbil-C=O largo e Y es H o COOH.

en el que R1, R2 y R3 son hidrocarbilos largos o R1 y R2 son hidrocarbil-C=O largo y R3 es H o acetilo,

en el que R1 y R2 son hidrocarbil-C=O largo y n es 1, 2, 3 o 4,

en el que R1 y R2 son hidrocarbilos largos, es O o NH, y n es 1, 2, 3 o 4, o

en el que R1 y R2 son hidrocarbilos largos, y en el que el hidrocarbilo largo es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que consiste de entre 8 y 25 atomos de carbono y opcionalmente uno, dos o tres dobles enlaces en la cadena.

5 9. Bloque constructivo de lipopeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cadena peptidica CP se encuentra unida covalentemente a la fraccion lipido FL en el extremo N-terminal o en el extremo Cterminal o en una posicion proxima a cualquiera de los mismos.
10. Bloque constructivo de lipopeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cadena peptidica

CP se encuentra unida covalentemente a la fraccion lipido FL en el extremo N-terminal o en el extremo C10 terminal o mediante un conector tal como en la formula (2) o (3),

en el que L es un conector L1 a L10,

en el que es O o NH, m esta comprendido entre 1 y 20 y n esta comprendido entre 1 y 20.
11. Bloque constructivo de lipopeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que un antigeno seleccionado de entre un peptido, una proteina, un mimetico de epitopo, un carbohidrato o un hapteno se une covalentemente en el otro extremo de la cadena peptidica o en una posicion proxima al mismo.

20 12. Haces de lipopeptido helicoidal que comprenden dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete bloques constructivos de lipopeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13.

Particulas pseudoviricas sinteticas que consiste de haces de lipopeptido helicoidal segun la reivindicacion 12.
14.

Preparacion farmaceutica que comprende un haz de lipopeptidos helicoidales y/o una particula pseudovirica sintetica segun las reivindicaciones 12 y 13 portadores de antigenos.
15.

Preparacion farmaceutica segun la reivindicacion 14, en la que el antigeno se deriva de la proteina circunsporozoito (CS) del parasito del paludismo Plasmodium falciparum.
16.

Utilizacion de un haz de lipopeptidos helicoidales y/o una particula pseudovirica sintetica segun la reivindicacion 13 portador de antigenos a modo de vacuna.

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