ES2392172T3 - Bacterias del ácido láctico como cepas probióticas y composiciones que contienen las mismas - Google Patents

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Abstract

Cepa de bacterias del ácido láctico que pertenece a la especie Lactobacillus gasseri que se selecciona de: - L. gasseri KS 120.1, depositado el 4 de junio de 2004 en la CNCM del Instituto Pasteur con número de registro CNCM I-3218, y - L. gasseri KS 124.3, depositado el 4 de junio de 2004 en la CNCM del Instituto Pasteur con número de registro CNCM I-3220.

Description

Bacterias del ácido láctico como cepas probióticas y composiciones que contienen las mismas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere al uso de nuevas cepas de bacterias probióticas en el tratamiento de dolencias infecciosas provocadas por diversos patógenos en mamíferos, más específicamente la prevención y/o el tratamiento de infecciones genitourinarias y/o gastrointestinales en seres humanos.
Antecedentes de la invención
Las infecciones genitourinarias siguen siendo un problema común, particularmente en la población femenina. Se reconoce la adherencia bacteriana al epitelio genitourinario como un mecanismo importante en el inicio y la patogenia de infecciones de las vías urinarias (UTI, urinary tract infection) y, en particular, de infecciones vaginales. Los patógenos genitourinarios se originan predominantemente en el tracto intestinal y colonizan inicialmente la región peruretral y ascienden al interior de la vejiga, dando como resultado bacteriuria sintomática o asintomática. Alternativamente, estas bacterias invaden y luego colonizan la vagina provocando allí diversos tipos de infecciones vaginales sintomáticas así como asintomáticas. Por tanto, dependiendo de factores del huésped y factores de virulencia bacteriana, los organismos pueden ascender adicionalmente y dar lugar a pielonefritis, respectivamente infecciones ascendentes del aparato genital en mujeres. Los patógenos genitourinarios expresan características de virulencia que les permite resistir los mecanismos de defensa del huésped eficaces normalmente.
El uso de bacterias de la flora autóctona, tales como lactobacilos, para no permitir que los patógenos genitourinarios colonicen el aparato genitourinario es un concepto establecido estudiado de manera bastante extensa desde hace años (véanse, por ejemplo, el documento EP 0 956 858, Cadieux et al. - Lactobacillus strains and vaginal ecology -Jama. 287:1940-41 / 2002; Butler BC, Beakley JW. Bacterial flora in vaginitis. Am J Obstet Gynaecol 1960;78:432-40, Eschenbach DA, Davick PR, Williams BL, Klebanoff SJ, Young-Smith K, Critchlow CM et al. Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis. J Clin Microbiol 1989; 27:251-6, Sobel JD, Cook RL, Redondo-Lopez V. Lactobacilli: a role in controlling the vaginal microflora? en Horowitz BJ, Mardh P-A, eds. Vaginitis and Vaginosis, págs. 47-53. Nueva York: Wiley-Liss, 1991, Lauritzen C, Graf F, Mucha M. Restoration of the physiological vaginal environment with Doederlein bacteria and estriol. Frauenarzt 1984; 4).
Por otro lado, las infecciones gastrointestinales siguen siendo un problema común en la población humana. Se ha reconocido la adherencia bacteriana al epitelio gastrointestinal como un mecanismo importante en el inicio y la patogenia de infecciones del tracto gastrointestinal (IGI). Muchos patógenos gastrointestinales que colonizan el tracto intestinal pueden, dependiendo de factores del huésped y factores de virulencia bacteriana, expresar características de virulencia que les permite resistir los mecanismos de defensa del huésped eficaces normalmente.
El uso de bacterias que se originan a partir de la microflora autóctona, como por ejemplo lactobacilos, para no permitir que los patógenos colonicen el tracto gastrointestinal es un concepto que se ha estudiado de manera bastante extensa (véase, por ejemplo, Alain Servin en “Antagonist activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens - FEMS Microbiology Reviews 2004 -en impresión, disponible en línea: http://www.sciencedirect.com/science). Algunas de las cepas de bacterias del ácido láctico mencionadas en la bibliografía anterior se han destacado por su efecto en el tracto gastrointestinal y se han propuesto como posibles agentes activos adecuados para tratar diversas dolencias o trastornos provocados por patógenos, por ejemplo, diarrea.
El objetivo principal de una terapia con agentes bacterianos debe ser prevenir el sobrecrecimiento de patógenos hasta un momento en que pueda reestablecerse la microflora vaginal o intestinal normal. Además, la terapia probiótica se considera “natural” y sin efectos secundarios en contraposición a tratamientos químicos o antibióticos convencionales.
Dentro de ese contexto, se ha observado de manera sorprendente que cepas de bacterias del ácido láctico representativas de la flora vaginal humana sana que mostraron eficacia en el tratamiento de infecciones genitourinarias (véase la solicitud de patente internacional PCT/EP2004/011980 presentada el 22.10.04 por Medinova AG, CH-Zúrich) también actuaron y en consecuencia son útiles en el tratamiento profiláctico o terapéutico de infecciones intestinales o trastornos iniciados por patógenos gastrointestinales.
Actualmente, a pesar de los progresos que ya se han realizado con relación al conocimiento íntimo de cepas de bacterias del ácido láctico (BAL), sus propiedades y su uso potencial en el área probiótica, todavía sigue habiendo una necesidad de proponer bacterias más convenientes y más eficaces, concretamente cepas de bacterias probióticas para la comunidad médica.
El fin de esta invención es proporcionar probióticos nuevos y útiles particularmente eficaces en el tratamiento de trastornos provocados por diversos patógenos, concretamente infecciones o enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal en mamíferos, especialmente seres humanos, respectivamente del aparato genitourinario en mujeres, o en la restauración de una flora genitourinaria o intestinal equilibrada y sana tras, por ejemplo, tratamientos médicos intensos como los realizados con antibióticos o agentes quimioterápicos.
La invención
Como un primer objeto, la invención proporciona cepas de bacterias del ácido láctico según la reivindicación 1.
La invención también se refiere a composiciones probióticas según la reivindicación 2.
Aparecerán objetos adicionales y más específicos de esta invención a lo largo del transcurso de la descripción a continuación en el presente documento.
Descripción detallada de la invención
Las cepas de bacterias probióticas usadas dentro del marco de esta invención se han seleccionado en primer lugar por su capacidad para adherirse a células epiteliales tales como Caco-2 o HeLa de cuello uterino que se eligieron como modelos. La adhesión celular es, en efecto, una característica de selección que es un requisito esencial ya que condiciona la capacidad de dichas cepas para colonizar tejidos epiteliales, por ejemplo el del tracto genitourinario, y luego competir con, inhibir o no permitir la adhesión de patógenos de tal ubicación específica.
Estas cepas muestran además una resistencia significativa, es decir, una tasa de supervivencia cuando se exponen al entorno gástrico altamente ácido y una resistencia de realmente buena a excelente cuando se exponen también a enzimas como pepsina y pancreatina; estas propiedades garantizan la supervivencia necesaria de las cepas seleccionadas en toda su progresión dentro del tracto gastrointestinal.
Dichos probióticos se han seleccionado además por su capacidad adicional para inhibir la adhesión, el crecimiento e incluso la supervivencia de patógenos, concretamente patógenos genitourinarios y gastrointestinales de células epiteliales. Los patógenos Gram-negativos o Gram-positivos tales como los mencionados más adelante en el presente documento son representativos de los que se ven afectados significativamente por los probióticos de esta invención en cuanto a la adhesión, el crecimiento o la actividad patógena: especies de Salmonella, como S. enterica serovar Typhimurium, E. coli, especies de Streptococcus, por ejemplo S. agalactiae, especies de Staphylococcus como
S. aureus, especies de Gardnerella, por ejemplo G. vaginalis, especies de Prevotella, por ejemplo P. bivia; esta enumeración no es por supuesto, exhaustiva.
Las cepas de bacterias probióticas usadas según la presente invención también tienen la capacidad para inhibir la internalización de patógenos, concretamente patógenos Gram-negativos o Gram-positivos genitourinarios o gastrointestinales dentro de células epiteliales. Las BAL más eficaces dentro de ese marco son las que expresan altas cantidades tanto de peróxido de hidrógeno (H2O2) como de ácido láctico in situ cuando ambos factores actúan sinérgicamente. Estas últimas han demostrado ser en efecto, altamente eficaces frente a patógenos genitourinarios anaerobios como, por ejemplo, especies de Gardnerella y Prevotella.
Las cepas de bacterias probióticas anteriores, eventualmente, muestran una característica importante adicional, es decir la capacidad para modular la respuesta inmunitaria de células inmunocompetentes, por ejemplo células de la membrana mucosa gastrointestinal, en otras palabras la capacidad para iniciar, estimular o reforzar la respuesta inmunitaria de dichas células cuando se infectan por patógenos o bien Gram-negativos o bien Gram-positivos como los mencionados anteriormente en el presente documento, por ejemplo E. coli. patógena genitourinaria. Debido a sus características específicas, dichas cepas de BAL tienen por consiguiente la capacidad para inhibir el síndrome inflamatorio de células inmunocompetentes cuando se exponen a contaminación por patógenos.
De manera bastante interesante, esa característica específica realiza la modulación de la respuesta inmunitaria a la que se hizo referencia anteriormente en el presente documento usando dos rutas distintas, es decir mediante la inducción de citocinas o bien proinflamatorias o bien antiinflamatorias como IL 10, respectivamente, IL 12, TNF o IFN. Se ha observado adicionalmente que algunas cepas de BAL de esta invención muestran un alto potencial de inducción de IFN , concretamente L. acidophilus KS 116.1 y L. gasseri KS 124.3, una característica que favorece el uso de las mismas como agentes antiinfecciosos.
Esa especificidad de cepa proporciona, por consiguiente, al experto en la técnica la posibilidad de seleccionar la cepa o combinación de cepas más apropiada para realizar el tratamiento médico que se prevé.
Las cepas de bacterias del ácido láctico de la presente invención se seleccionan de:
-
L. gasseri KS 120.1, depositado el 4 de junio de 2004 en la CNCM del Instituto Pasteur con número de registro CNCM I-3218, y
-
L. gasseri KS 124.3, depositado el 4 de junio de 2004 en la CNCM del Instituto Pasteur con número de registro CNCM I-3220.
Estas cepas también son representativas de la microflora vaginal humana sana.
Otras cepas dadas a conocer:
L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482): Gram-positivo -negativo para catalasa -negativo para oxidasa producción de ácido láctico de 10,5 g/l - producción de H2O2 de 10 mg/l
Prueba API 50 CHI: positivo para GAL, GLU, FRU, MNE, NAG, ESC, SAL, CEL, MAL, SAC, TRE y GEN
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, RIB, DXYL, LXYL, ADO, MDX, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, AMY, ARB, LAC, MEL, INU, MLZ, RAF, AMD, GLYG, XLT, TUR, LYX, TAG, DFUC, LFUC, DARL, LARL, GNT, 2KG y 5KG
L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218): Gram-positivo - negativo para catalasa -negativo para oxidasa producción de ácido láctico de 10,6 g/l - producción de H2O2 de 1 mg/l
Prueba API 50 CHI: positivo para GAL, GLU, FRU, MNE, AMY, ESC, SAL, CEL, MAL, LAC, SAC, TRE y AMD
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, RIB, DXYL, LXYL, ADO, MDX, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, NAG, ARB, MEL, INU, MLZ, RAF, GLYG, XLT, GEN, TUR, LYX, TAG, DFUC, LFUC, DARL, LARL, GNT, 2KG y 5KG
L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220): Gram-positivo - negativo para catalasa -negativo para oxidasa producción de ácido láctico de 17,0 g/l - producción de H2O2 de 20 mg/l
Prueba API 50 CHI: positivo para: GAL, GLU, FRU, MNE, NAG, ESC, SAL, MAL, SAC y TRE - variable para: RIB, AMD, GEN y 5KG
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, DXYL, LXYL, ADO, MDX, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, AMY, ARB, CEL, LAC, MEL, INU, MLZ, RAF, GLYG, XLT, TUR, LYX, TAG, DFUC, LFUC, DARL, LARL, GNT y 2KG
L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483): Gram-positivo - negativo para catalasa – positivo para oxidasa -producción de ácido láctico de 9,6 g/l - producción de H2O2 de 2 mg/l
Prueba API 50 CHI: positivo para GAL, FRU, MNE, NAG, ESC, SAL, MAL y SAC
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, RIB, DXYL, LXYL, ADO, MDX, GAL, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, AMY, ARB, CEL, LAC, MEL, TRE, INU, MLZ, RAF, AMD, GLYG, XLT, GEN, TUR, LYX, TAG, DFUC, LFUC, DARL, LARL, GNT, 2KG y 5KG
L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217): Gram-positivo -negativo para catalasa - negativo para oxidasa producción de ácido láctico de 7,4 g/l - producción de H2O2 de 20 mg/l
Prueba API 50 CHI: positivo para GLU, FRU, MNE, NAG, AMY, ESC, SAL, CEL, MAL, MEL, SAC, GEN y TAG
-
variable para: RIB
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, DXYL, LXYL, ADO, MDX, GAL, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, ARB, LAC, TRE, INU, MLZ, RAF, AMD, GLYG, XLT, TUR, LYX, DFUC, LFUC, DARL, LARL, GNT, 2KG y 5KG
L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484): Gram-positivo -negativo para catalasa – positivo para oxidasa -producción de ácido láctico de 10,3 g/l - producción de H2O2 negativa
Prueba API 50 CHI: positivo para GAL, GLU, FRU, MNE, NAG, ESC, MAL, LAC, SAC y AMD
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, RIB, DXYL, LXYL, ADO, MDX, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, AMY, ARB, SAL, CEL, MEL, TRE, INU, MLZ, RAF, GLYG, XLT, GEN, TUR, LYX, TAG, DFUC, LFUC, DARL, LARL, GNT, 2KG y 5KG
L. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219): Gram-positivo -negativo para catalasa - negativo para oxidasa producción de ácido láctico de 10,6 g/l - producción de H2O2 de 1 mg/l
Prueba API 50 CHI: positivo para: GAL, GLU, FRU, MNE, AMY, ARB, ESC, SAL, CEL, MAL, SAC y AMD variable para: RIB, NAG, LAC, RAF y LFUC
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, DXYL, LXYL, ADO, MDX, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, MEL, TRE, INU, MLZ, GLYG, XLT, GEN, TUR, LYX, TAG, DFUC, DARL, LARL, GNT, 2KG y 5KG
L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-34857): Gram-positivo -negativo para catalasa -negativo para oxidasa producción de ácido láctico de 8,5 g/l - producción de H2O2 de 10 mg/l
Prueba API 50 CHI: positivo para: GLU, MNE, NAG, ESC, MAL y SAC - variable para RIB y 5KG
negativo para: KON, GLY, ERY, DARA, LARA, DXYL, LXYL, ADO, MDX, GAL, FRU, SBE, RHA, DUL, INO, MAN, SOR, MDM, MDG, AMY, ARB, SAL, CEL, LAC, MEL, TRE, INU, MLZ, RAF, AMD, GLYG, XLT, GEN, TUR, LYX, TAG, DFUC, LFUC, DARL, LARL, GNT y 2KG
L. crispatus KS 127.1 (CNCM I-3486): Gram-positivo - negativo para catalasa - positivo para oxidasa producción de ácido láctico de 16,7 g/l - producción de H2O2 negativa
Prueba API 50 CHI: positivo para RIB, GAL, GLU, FRU, MNE, MAN, SOR, NAG, AMY, ESC, SAL, CEL, MAL LAC, SAC, TRE, MLZ, AMD, GLYG, GEN, TAG y GNT - variable para GLY y DXYL
negativo para: KON, ERY, DARA, LARA, LXYL, ADO, MDX, SBE, RHA, DUL, INO, MDM, MDG, ARB, MEL, INU, MLZ, RAF, XLT, TUR, LYX, DFUC, LFUC, DARL, LARL, 2KG y 5KG
L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360): Gram-positivo - producción de ácido láctico de 10,45 g/kg - producción de H2O2 de 1 mg/l
Prueba API 50 CHI - positivo para: GAL, GLU, FRU, MNE, AMY, ARB, ESC, SAL, CEL, MAL, LAC, SAC, TRE y AMD
negativo para: RIB, MAN, GLY, SOR, KON, ERY, MLZ, DARA, LARA, LXYL, ADO, MDX, SBE, RHA, DUL, INO, MDM, MDG, MEL, INU, RAF, TAG, GNT, XLT, TUR, LYX, DFUC, LFUC, DARL, LARL, 2KG y 5KG
Estas cepas se han registrado debidamente en el Instituto Pasteur, París (Francia) según el Tratado de Budapest.
Según la presente invención, y debido a su actividad antipatógenos específica, las cepas de bacterias probióticas mencionadas anteriormente en el presente documento pueden usarse ventajosamente para prevenir o tratar infecciones genitourinarias en mujeres y/o infecciones gastrointestinales en seres humanos, más específicamente seres humanos, y para prevenir o inhibir la colonización y/o el crecimiento de patógenos en el entorno o aparato genitourinario de mujeres y en el entorno y tracto gastrointestinal de seres humanos también.
Además, dichas cepas de bacterias probióticas pueden usarse de una forma bastante eficaz para mantener o restaurar una flora genitourinaria y/o gastrointestinal sana en seres humanos, especialmente seres humanos, en particular tras tratamientos médicos intensos como los realizados con antibióticos.
Los tratamientos terapéuticos o profilácticos correspondientes se realizan administrando una cantidad eficaz de la cepa o cepas seleccionadas de esta invención en combinación con un sistema de suministro, soporte o vehículo adecuado, en caso de ser necesario de calidad alimentaria, que se ha diseñado para ello. El término “tratamiento terapéutico” usado dentro de ese contexto se refiere principalmente a un tratamiento combinado en el que los pacientes se han sometido en primer lugar a la administración de productos químicos o antibióticos relativamente “agresivos” y cuando la administración de probióticos convenientes se produce entonces una vez que se ha completado la erradicación de patógenos y se ha detenido la administración de antibióticos. El término “adecuado(a)” pretende definir un sistema de suministro que mantiene intactas todas las propiedades de las cepas de bacterias probióticas que se usan para realizar los tratamientos anteriores.
Las composiciones probióticas según esta invención pueden comprender además prebióticos o factores de crecimiento de BAL habituales, por ejemplo factores de crecimiento naturales especializados como leche desnatada en polvo (MSK). Dichas composiciones están preferiblemente en forma de un producto alimenticio o una bebida, una composición alimenticia o de bebida como, por ejemplo, los diseñadas para nutrición clínica, un adyuvante o complemento alimenticio o de bebida diseñado para consumo o bien humano o bien animal.
Las bebidas o productos alimenticios lácteos como leches fermentadas, quesos frescos o yogures o sus equivalentes secados o liofilizados representan sistemas de suministro adecuados. Como, por ejemplo adyuvante o complemento alimenticio, demostraron ser bastante convenientes la leche en polvo o matrices de derivados lácteos cargados con los probióticos seleccionados. Si alguna vez es necesario, dichas matrices en polvo pueden envasarse además como, por ejemplo, cápsulas de celulosa o gelatina, cápsulas de gel o comprimidos.
Dichas composiciones probióticas pueden comprender además una o varias cepas de bacterias del ácido láctico, es decir probióticas o no, de la técnica anterior también y aditivos adicionales como estabilizadores de pH, estabilizadores de viscosidad, conservantes, antioxidantes, colorantes o aromas.
Las composiciones a las que se hizo referencia anteriormente en el presente documento pueden contener los microorganismos probióticos seleccionados en cantidades que pueden oscilar entre aproximadamente 106 ufc (unidades formadoras de colonias) y aproximadamente 1011 ufc por g o dosis o unidad, preferiblemente en una forma que mantiene su viabilidad y su especificidad intactas, por ejemplo en forma encapsulada o liofilizada. Los detalles primordiales de dichas composiciones así como su dosificación dependerán, eventualmente, de la aplicación específica para la que se pretenden, la edad o el estado de salud de los pacientes o la persona que va(n) a tratarse, la naturaleza de la contaminación por patógenos o el beneficio esperado a partir de la administración preventiva de los probióticos. Está dentro de la experiencia y las capacidades actuales de la comunidad médica o nutricional ajustar todos los parámetros relevantes.
5 En comparación con cepas de referencia conocidas anteriores (véanse los ejemplos a continuación) las cepas de bacterias probióticas seleccionadas dentro del marco de la presente invención han mostrado una actividad antipatógenos o bien similar o bien incluso mayor dependiendo del modelo experimental que se haya seleccionado para ello.
Los siguientes ejemplos ilustran sólo algunas de las realizaciones de esta invención y así no pretenden 10 constituir ninguna limitación ni restricción de la misma.
Ejemplos
Materiales y métodos
Cepa sometida a prueba
Código
jensenii 109
KS 109
crispatus 116.1
KS 116.1
jensenii 119.1
KS 119.1
gasseri 120.1
KS 120.1 (*)
jensenii 121.1
KS 121.1
jensenii 122.1
KS 122.1
gasseri 124.3
KS 124.3 (*)
gasseri 126.2
KS 126.2
jensenii 129.1
KS 129.1
L. jensenii 130.1
KS 130.1
helveticus 300
KS 300
acidophilus 400
KS 400
* Cepas de bacterias del ácido láctico según la presente invención.
15 La cepa de lactobacilos de adherencia de control es L. casei rhamnosus cepa GG (n.º de registro ATCC 53103), L. rhamnosus cepa GR-1 (n.º de registro ATCC 55826) y L. fermentum cepa RC-14 (n.º de registro ATCC 55845).
se hicieron crecer todas las cepas de lactobacilos en caldo De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostic, Beauvais, Francia) durante 18 h a 37ºC.
20 Patógenos bacterianos. Salmonella enterica serovar Typhimurium cepa SL 1344 fue una donación de B.A.D. Stocker (Stanford, California). Se hicieron crecer las bacterias durante la noche durante 18 h a 37ºC en caldo Luria (Difco Laboratories).
Escherichia coli cepas IH11128 y 7372 de adherencia difusa uropatógenas, y la cepa C1845 diarrogénica fueron donaciones de B. Nowicki (Universidad de Texas, Galvestone) y S. Moseley (Universidad de Seattle). La cepa
25 7372 porta el alelo papG de clase II, el gen hly (hemolisina) y el operón Dr. La cepa IH11128 porta el operón Dr. La cepa C1845 porta el operón Daa. Se mantuvieron todas las cepas bacterianas sobre placas con LB y antes de la infección, se hicieron crecer las bacterias en caldo LB a 37ºC durante 18 h.
La cepa de Staphylococcus aureus era de la Colección de Cultivos Pasteur (París). Se hicieron crecer las bacterias durante la noche a 37ºC en caldo TSA (Difco Laboratories).
30 Las cepas de Streptococcus agalactiae DSM 2134, Gardnerella vaginalis DSM 4944, Prevotella bivia Cl-1 (DSM 20514) y Candida albicans DSM 1386 procedían de Medinova Ltd, Zúrich, Suiza). La cepa de Staphylococcus aureus procedía de la Colección de Cultivos Pasteur (París). Se hicieron crecer las bacterias durante la noche a 37ºC en caldo TSA (Difco Laboratories). Se hizo crecer la cepa de Streptococcus agalactiae durante la noche a 37ºC en caldo BHI (Difco Laboratories).
Se hizo crecer la cepa de Candida albicans durante la noche a 37ºC en caldo Sabouraud. Se hizo crecer Gardnerella vaginalis sobre placas de agar Gardnerella adquirido de BioMérieux France.
Se suspendieron las bacterias en disolución tamponada de cloruro de sodio-peptona pH 7,0 hasta aproximadamente 106 unidades formadoras de colonias (UFC/ml). Se extendieron 500 l o las suspensiones preparadas sobre la placa de agar. Se secaron las placas inoculadas en condiciones de flujo de aire laminar estéril. Entonces se incubaron las placas de agar en condiciones anaerobias usando un recipiente anaerobio sellado (Becton Dickinson, EE.UU.) a 37ºC durante 36 h como máximo. Antes de su uso, se subcultivó la cepa de Gardnerella vaginalis en BHI complementado con extracto de levadura, maltosa y suero de caballo, en condiciones anaerobias usando un recipiente anaerobio sellado a 37ºC durante 36 h como máximo.
Antes de su uso, se centrifugaron los cultivos bacterianos a 5,500 x g durante 5 min. a 4ºC. Se desechó el medio de cultivo y se lavaron las bacterias una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS.
Líneas y cultivos celulares. Se cultivaron células HeLa de cuello uterino humanas a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO2-95% de aire en RPMI 1640 con L-glutamina (Life Technologies) complementado con suero de ternero fetal (FCS; Boehringer, Mannheim, Alemania) al 10% inactivado con calor (30 min., 56ºC). Se usaron las células para ensayos de infección antes de la confluencia, es decir, tras 5 días en cultivo.
La línea celular intestinal humana usada fue el clon TC7 (Caco-2/TC7), establecido a partir de la línea celular Caco-2 parental. Se hicieron crecer las células de manera rutinaria en medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (glucosa 25 mM) (Invitrogen, Cergy, Francia), complementado con suero de ternero fetal (Invitrogene) al 15% inactivado con calor (30 min., 56ºC) y aminoácidos no esenciales al 1% (Invitrogene) tal como se describió previamente. Para fines de mantenimiento, se sometieron a pases las células semanalmente usando tripsina al 0,02% en PBS libre de Ca2+Mg2+ que contenía EDTA 3 mM. Se llevaron a cabo los experimentos y el mantenimiento de las células a 37ºC en una atmósfera del 10% de CO2/90% de aire. Se cambió diariamente el medio de cultivo. Se usaron las células después de la confluencia tras 15 días de cultivo (células completamente diferenciadas) para ensayo de infección de S. enterica serovar Typhimurium.
Ensayos de adhesión. Se examinó la adhesión de cepas de lactobacilos sobre células HeLa de cuello uterino y células Caco-2/TC7 intestinales según las siguientes etapas: se lavaron las monocapas celulares dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para cada ensayo de adhesión, se mezclaron 0,5 ml de la suspensión de Lactobacillus (bacterias con sobrenadante de cultivo de caldo agotado) con DMEM (0,5 ml), y luego se añadieron a cada pocillo de la placa de cultivo tisular (24 pocillos) que luego se incubó a 37ºC en el 10% de CO2/90% de aire. Las concentraciones finales de las bacterias examinadas fueron de 1 x 108, 2 x 108, 1 x 109 y 2 x 109 bacterias por ml. Tras incubación durante 1 h, se lavaron las monocapas cinco veces con PBS estéril, se fijaron con metanol, se tiñeron con tinción de Gram, y luego se examinaron microscópicamente en inmersión con aceite. Se llevó a cabo por duplicado cada ensayo de adhesión con células de tres pases sucesivos. Para cada ensayo, se determinó el número de bacterias adherentes en 20 zonas microscópicas aleatorias (puntuación de adhesión: de 0 a 5). Además, se determinó el nivel de lactobacilos adherentes viables mediante la determinación cuantitativa de bacterias asociadas con las monocapas celulares infectadas. Tras haberse infectado, se lavaron las células dos veces con PBS estéril y se lisaron con H2O esterilizada. Se sembraron en placa diluciones apropiadas sobre agar de tripticasa y soja (TSA) para determinar el número de bacterias asociadas con células viables mediante recuentos de colonias bacterianas.
Se llevó a cabo cada ensayo de asociación de células al menos por triplicado, con tres pases de células sucesivos. Se expresaron los resultados como UFC/ml de bacterias asociadas con células.
Actividad frente al crecimiento de patógenos. Se inoculó un medio de cultivo que contenía MRS (5 ml) y medio de cultivo de patógeno específico (5 ml) con 0,1 ml de un patógeno cultivado y 0,1 ml de cepa de Lactobacillus cultivada. El control era un medio de cultivo inoculado con 0,1 ml de un patógeno cultivado y 0,1 ml de MRS no cultivado ajustado a pH 4,5. En puntos de tiempo indicados, se retiraron alícuotas, se diluyeron en serie y se sembraron en placa sobre agar de tripticasa y soja para determinar recuentos de colonias bacterianas de patógeno. Se llevó a cabo cada ensayo al menos por triplicado. Se expresaron los resultados como UFC/ml.
Actividad frente a la viabilidad de patógenos. Se realizaron ensayos de recuento de colonias incubando 108 UFC/ml de patógeno (0,5 ml) con el cultivo de lactobacilos (108 UFC/ml, 0,5 ml) a 37ºC. El control era MRS no cultivado ajustado a pH 4,5. Inicialmente y en intervalos predeterminados, se retiraron alícuotas, se diluyeron en serie y se sembraron en placa sobre agar de tripticasa y soja para determinar recuentos de colonias bacterianas de patógeno. Se llevó a cabo cada ensayo al menos por triplicado. Se expresaron los resultados como UFC/ml.
Inhibición de la adhesión de E. coli uropatógena sobre células HeLa epiteliales. Para la infección de monocapas celulares, se cultivaron patógenos a 37ºC durante 18 h en medios de cultivo apropiados tal como se describió anteriormente. Antes de la infección, se lavaron dos veces con PBS las monocapas celulares, preparadas en placas de cultivo tisular TPP de veinticuatro pocillos (ATGC, París, Francia). Se suspendieron las bacterias infecciosas en el medio de cultivo y se añadió un total de 0,5 ml de DMEM + 0,25 ml de patógeno de cultivo (1 x 108 UFC/ml) + 0,25 ml de cultivo de lactobacilos (1,5 x 109 UFC/ml) a cada pocillo de la placa de cultivo tisular. Se incubaron las placas a 37ºC en el 10% de CO2/90% de aire para diferente tiempo de infección tal como se indica y luego se lavaron tres veces con PBS estéril y se lisaron con H2O esterilizada. Se sembraron en placa diluciones apropiadas sobre agar de tripticasa y soja para determinar el número de bacterias asociadas con células viables mediante recuentos de colonias bacterianas. Se llevó a cabo cada ensayo por triplicado con tres pases sucesivos de células HeLa.
Análisis. Se expresan los resultados como medias error estándar con respecto a la media. Para comparaciones
estadísticas, se realizó la prueba de la t de Student.
RESULTADOS
Ejemplo 1
1. Capacidad de adhesión de L. jensenii KS 119.1 y KS 130.1, L. crispatus KS 116.1 y L. gasseri KS 124.3 sobre células HeLa y Caco-2/TC7.
Se determinó el nivel de adhesión de las cepas anteriores después de que se inoculasen las células con cuatro concentraciones de lactobacilos (5 x 107; 1 x 108; 5 x 108; 1 x 109 UFC/pocillo). Generalmente, se observó una adhesión dependiente de la concentración.
En células HeLa de cuello uterino, los niveles de adhesión observados muestran que todas las cepas sometidas a prueba son adherentes. Las cepas de L. jensenii KS 119.1 y KS 130.1 parecían ser las mejores cepas adherentes (7,5 log de UFC/ml en 5 x 108 UFC/pocillo) en comparación con las cepas de adherencia de control, cepas de L. casei rhamnosus GG y L. rhamnosus GR1.
En células Caco-2/TC7 intestinales, los niveles de adhesión observados muestran que todas las cepas Medinova son adherentes. Las cepas L. crispatus KS 116.1, L. jensenii 119.1, 129.1 y KS 130.1, L. gasseri 124.3 parecían ser las mejores cepas adherentes (7,5-8 log de UFC/ml en 5 x 108 UFC/pocillo) en comparación con las cepas de adherencia de control, cepas L. casei rhamnosus GG y L. rhamnosus GR1.
Tal como se observó mediante microscopía electrónica de barrido, todas las “cepas de lactobacilos de la invención” parecían ser adherentes en contacto próximo con las células HeLa y Caco-2/TC7.
Basándose en sus propiedades de adherencia, se han seleccionado L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii 119.1 para los siguientes estudios de actividades antibacterianas frente a patógenos genitourinarios e intestinales.
2. Actividad de KS 116.1 y KS 119.1 sobre el crecimiento de patógenos genitourinarios e intestinales.
Se ha examinado si las cepas mencionadas anteriormente son activas sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, E. coli uropatógena y diarrogénica, y Salmonella enterica serovar Typhimurium diarrogénica. Se midió el crecimiento de patógenos a las 5, 8, 18 y 24 h.
Para Staphylococcus aureus, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control inhibían el crecimiento de bacterias. De manera similar, L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii 119.1 inhibían el crecimiento de Staphylococcus aureus y mostraban una disminución en el número de bacterias viables. Cuando se compararon las actividades de cepas de lactobacilos, L. jensenii 119.1 parecía ser la cepa más activa.
Para E. coli cepas IH11128 y 7372 uropatógenas, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control inhibían el crecimiento de las bacterias. De manera similar, L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii KS 119.1 inhibían el crecimiento de E. coli. Cuando se compararon las actividades de cepas de lactobacilos, L. jensenii 119.1 parecía ser la cepa más activa.
Para E. coli cepa C1845 diarrogénica, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control inhibían el crecimiento de las bacterias. De manera similar, L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii KS 119.1 inhibían el crecimiento de E. coli. Cuando se compararon las actividades de cepas de lactobacilos, se encontró la misma actividad para todas las cepas de lactobacilos examinadas.
Para S. enterica serovar Typhimurium cepa SL1344 diarrogénica, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control inhibían el crecimiento de las bacterias. De manera similar, L. jensenii 119.1 inhibía el crecimiento de S. enterica serovar Typhimurium. Cuando se compararon las actividades de cepas de lactobacilos, se encontró la misma actividad para L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control y L. jensenii KS
119.1. Por el contrario, L. crispatus KS 116.1 mostró una actividad inferior.
Para Candida albicans no se encontró actividad para L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, ni para L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii KS 119.1.
3. Actividad de destrucción de KS 116.1 y KS 119.1 frente a patógenos genitourinarios e intestinales.
Se ha examinado si dichos lactobacilos son activos sobre la viabilidad de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, E. coli uropatógena y diarrogénica, y Salmonella enterica serovar Typhimurium diarrogénica. Se midió el efecto sobre la viabilidad de patógenos a las 2, 3 y 4 h.
Para Staphylococcus aureus, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, y L. jensenii
119.1 disminuyeron en 2 log la viabilidad de las bacterias. Por el contrario, L. crispatus KS 116.1 no mostró actividad.
Para Streptococcus agalactiae, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, y L. jensenii
119.1 y L. crispatus KS 116.1 no mostraron actividad.
Para E. coli cepas IH11128 y 7372 uropatógenas, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control mostraron 4 log de disminución en la viabilidad de las bacterias. L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii 119.1 no fueron activos mostrando sólo un log de disminución en la viabilidad de las bacterias.
Para E. coli cepa C1845 diarrogénica, tanto L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, como L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii 119.1 mostraron una baja actividad sobre la viabilidad de las bacterias C1845 (2 log de disminución).
Para S. enterica serovar Typhimurium cepa SL1344 diarrogénica, tanto L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, como L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii 119.1 mostraron una gran actividad disminuyendo la viabilidad de las bacterias SL1344 (5 log de disminución).
Para Gardnerella vaginalis, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, y L. fermentum cepa RC-14, y L. jensenii 119.1 disminuyeron en 2 log la viabilidad de Gardnerella. Por el contrario, L. crispatus KS
116.1 no mostró actividad.
Para Candida albicans no se encontró actividad para L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, ni para L. crispatus KS 116.1 y L. jensenii KS 119.1.
4. Inhibición de la adhesión de la cepa de E. coli cepa IH11128 uropatógena sobre células HeLa por KS 116.1 y KS 119.1.
Se ha examinado si dichos lactobacilos pueden inhibir la adhesión de E. coli cepa IH11128 uropatógena sobre células HeLa. Se midió el efecto de L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, y L. jensenii 119.1 y L. crispatus KS 116.1 a tres concentraciones: 1 x 108, 5 x 108 y 1 x 109 bacterias por pocillo.
Se encontró del 30 al 40% de inhibición de la adhesión de IH11128 a una concentración de 1 x 108 bacterias por pocillo para L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control. A esta concentración, L. jensenii KS
119.1 y L. crispatus KS 116.1 eran inactivos. La inhibición de la adhesión de IH11128 fue eficaz a una concentración de 5 x 108 bacterias por pocillo para L. jensenii 119.1 y L. crispatus KS 116.1 y se observó una inhibición similar a las obtenidas con L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control. Se observó un alto de nivel de inhibición de la adhesión de IH11128 similar con L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control, y L. jensenii KS
119.1 y L. crispatus KS 116.1 a la concentración de 1 x 109 bacterias por pocillo.
Ejemplo 2
1. Actividad de L. gasseri KS 124.3, L. helveticus KS 300 y L. acidophilus KS 400 sobre el crecimiento de patógenos genitourinarios e intestinales.
Se ha examinado si las cepas a las que se hizo referencia anteriormente en el presente documento son activas frente al crecimiento de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Candida albicans y E. coli cepas IH11128 y 7372 uropatógenas y diarrogénicas. Se midió el crecimiento de patógenos a los 5, 8, 18 y 24 h.
No se desarrolló actividad frente a Streptococcus agalactiae y Candida albicans por L. gasseri KS 124.3, L. helveticus KS 300 ni L. acidophilus KS 400 así como tampoco por las cepas GR-1 y RC-14 de control.
Con respecto a Staphylococcus aureus, L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum cepa RC-14 de control inhibieron eficazmente el crecimiento de las bacterias. De manera similar, L. gasseri KS 124.3, L. helveticus KS 300 y L. acidophilus KS 400 inhibieron el crecimiento de Staphylococcus aureus y mostraron una disminución en el número de bacterias viables. Cuando se compararon las actividades de cepas de lactobacilos, L. helveticus KS 300 parecía ser la cepa más activa.
Para E. coli cepas IH11128 uropatógenas, las cepas de control L. rhamnosus GR-1 y L. fermentum RC-14 inhibieron eficazmente el crecimiento de las bacterias. De manera similar, L. helveticus KS 300 inhibió eficazmente el crecimiento de E. coli. Cuando se compararon las actividades de cepas de lactobacilos, pareció haber una actividad inferior para L. gasseri KS 124.3 y L. acidophilus KS 400.
Para E. coli cepa 7372 uropatógena, tanto las cepas de control de L. rhamnosus GR-1 como las cepas de L. fermentum RC-14 inhibieron el crecimiento de bacterias. De manera similar L. helveticus KS 300 inhibió el crecimiento de dichas bacterias mientras que L. acidophilus KS 400, sin embargo, fue activo sólo a las 25 horas.
2. Actividad de destrucción de KS 124.3, KS 300 y KS 400 frente a patógenos genitourinarios e intestinales.
Se ha examinado si dichos lactobacilos son activos sobre la viabilidad de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Candida albicans, E. coli IH11128 y 7372 uropatógenas, E. coli C1845 diarrogénica y Gardnerella vaginalis. Se midió el efecto sobre la viabilidad de patógenos a las 2, 3 y 4 h.
Para Staphylococcus aureus, las cepas de control L. rhamnosus GR-1 y L. fermentum RC-14, y L. gasseri KS 124.3, L. helveticus KS 300 y L. acidophilus KS 400 disminuyeron en 2-3 log la viabilidad de las bacterias.
Con respecto a Streptococcus agalactiae y Candida albicans, las dos cepas de control y L. gasseri KS 124.3, L. helveticus KS 300 y L. acidophilus KS 400 no mostraron actividad.
Para E. coli cepas IH11128 uropatógenas, las cepas de control L. rhamnosus cepa GR-1 y L. fermentum RC-14 y L. helveticus KS 300 también mostraron 3 log de disminución en la viabilidad de las bacterias. L. acidophilus KS 400 y
L. gasseri KS 124.3 no fueron activos.
Con respecto a E. coli cepas 7372 uropatógenas, las cepas de control mostraron 2 log de disminución en la viabilidad de las bacterias. L. helveticus KS 300 mostró 3 log de disminución mientras que L. acidophilus KS 400 y L. gasseri KS 124.3 no fueron activos en las mismas condiciones.
Para Gardnerella vaginalis, ambas cepas de control, L. acidophilus KS 400 y L. gasseri KS 124.3 mostraron 3 log de disminución en la viabilidad de las bacterias. Se observó una actividad rápida y eficaz para L. helveticus KS 300, superior a la encontrada para las cepas de control anteriores.
Para E. coli cepa C1845 diarrogénica, ambas cepas de control L. rhamnosus GR-1 y L. fermentum RC-14 destruyeron las bacterias mostrando una disminución de 3 log en la viabilidad de la misma. Se observó un efecto similar para L. gasseri KS 124.3 mientras que no se detectó actividad con respecto a L. acidophilus KS 400. L. helveticus KS 300 muestra una destrucción que es definitivamente superior que la observada para las cepas de control anteriores.
Ejemplo 3
1. Actividad de destrucción de L. jensenii KS 121.1 y KS 122.1, L. gasseri KS 120.1 y L. helveticus KS 300 frente a patógenos genitourinarios e intestinales.
Se ha examinado si dichas cepas de lactobacilo son activas sobre la viabilidad de Streptococcus agalactiae, Candida albicans, E. coli IH11128 uropatógena, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia y Salmonella enterica Typhimurium. Se midió el efecto sobre la viabilidad de patógenos a las 4 h de contacto.
Con respecto a tanto Streptococcus agalactiae como Candida albicans ninguno de los lactobacilos sometidos a prueba mostró actividad.
Para E. coli cepas IH11128 uropatógenas, L. jensenii KS 121.1 y KS 122.1 no mostraron actividad mientras que, por el contrario, L. gasseri KS 120.1 disminuyó eficazmente (4 log) la viabilidad de E. coli en condiciones sin agitación. L. helveticus KS 300 y la cepa de control L. fermentum RC-1 disminuyeron 2 log la viabilidad de E. coli en condiciones sin agitación sólo.
Con respecto a Gardnerella vaginalis, tanto L. jensenii KS 121.1 como KS 122.1 no mostraron actividad. Por el contrario, L. gasseri KS 120.1 disminuyó eficazmente (6 log) la viabilidad de Gardnerella vaginalis en condiciones sin agitación; L. helveticus KS 300 mostró una eficacia similar (4 log de disminución) también en condiciones sin agitación, mientras que la cepa de control mostró 3 log de disminución sólo.
Para Prevotella bivia, L. gasseri KS 120.1, L. jensenii 122.1, L. helveticus KS 300 y la cepa de control L. fermentum RC-14 disminuyeron la viabilidad de las bacterias en 2 log, en condiciones sin agitación. L. jensenii KS 121.1 que fue altamente activo frente a Prevotella bivia en condiciones sin agitación había perdido su actividad cuando se sometió a prueba en condiciones con agitación.
Con respecto a Salmonella Typhimurium, L. gasseri KS 120.1 (3 log), L. jensenii KS 121.1 y KS 122.1, L. helveticus KS 300 y la cepa de control L. fermentum RC-14 fueron bastante activos (6 log de disminución) en condiciones sin agitación. L. gasseri KS 120.1 siguió siendo activo incluso en condiciones con agitación.
2. Actividad de KS 120, KS 121.1, KS 122.1 y KS 300 sobre el crecimiento de Gardnerella vaginalis y Prevotella bivia
Se han realizado las pruebas en condiciones tanto con agitación como sin agitación.
En condiciones sin agitación L. jensenii KS 121.1 y KS 122.1 inhibieron el crecimiento de Gardnerella vaginalis mientras que L. gasseri 120.1, L. helveticus y la cepa de control L. fermentum RC-14 inhibieron dicha actividad en un nivel todavía superior.
En condiciones con agitación, L. jensenii KS 121.1 y KS 122.1 y L. helveticus también habían perdido su actividad, mientras que L. gasseri 120.1 sigue siendo activo (2 log de disminución) frente a Gardneralla vaginalis.
En condiciones tanto con agitación como sin agitación, L. gasseri KS 120.1, L. jenseinii KS 121.1 y KS 122.1, L. helveticus KS 300 y la cepa de control inhibieron el crecimiento de Prevotella bivia a un nivel alto.
3. Inhibición de la adhesión de Gardnerella vaginalis y Prevotella bivia sobre células HeLa KS 120.1, KS 121.1 y KS 300
Se midió el efecto de L. gasseri KS 120.1, L. helveticus KS 300 de las cepas de control L. fermentum RC-14 así como L. casei rhamnosus GG a la concentración de 1 x 109 bacterias por pocillo.
La cepa L. fermentum RC-14 de control y L. jensenii KS 121.1 disminuyeron en 2 log el nivel de adhesión de Gardnerella vaginalis sobre las células sometidas a prueba. L. gasseri KS 120.1 y L. helveticus KS 300 disminuyeron dicha adhesión en 4 log.
L. jensenii KS 121.1 disminuyó la adhesión de Prevotella bivia en 1 log sólo, mientras que L. gasseri KS 120.1,
L. helveticus KS 300 así como la cepa de control RC-14 disminuyeron dicha adhesión en 2 log.
4. Inhibición de la adhesión e internalización de la cepa de E. coli cepa IH11128 uropatógena sobre células HeLa mediante KS 120.1, KS 121.1 y KS 300
Una estrategia usada habitualmente por patógenos extraintestinales como E. coli para eludir el mecanismo de defensa del huésped es establecer un reservorio local dentro de células epiteliales (M. A. Muvlea en Eschrichia coli. Cell Microbiol. 4, 257-271 - 2002) y la entrada a la célula por la cepa IH11128 parece ser un mecanismo eficaz para promover la persistencia prolongada de estos patógenos en las vías urinarias.
Se examinó el efecto de L. gasseri KS 120.1, L. helveticus KS 300 y de las cepas de control RC-14 y cepa GG con respecto a E. coli. uropatógena anterior: L. jensenii 121.1 disminuyó en 2 log el nivel de E. coli internalizada viable, mientras que L. gasseri 120.1, L. helveticus y ambas cepas de control mostraron una disminución de 4 log de la E. coli internalizada.
Ejemplo 4 Determinación de la resistencia a pepsina (% de supervivencia a T0 + X min)
4.1 Se hicieron crecer las cepas de BAL seleccionadas para este experimento en 10 ml de caldo MRS a 37ºC durante 24 horas tras lo cual se centrifugó el cultivo celular durante 5 min. a 4000 rpm. Se lavó 3 veces el sedimento así obtenido en un tampón de PBS (pH 7) y se suspendió posteriormente en 1 ml de dicho tampón de PBS.
4.2 Se añadieron 200 l de la suspensión celular anterior a una serie de 4 tubos de ensayo que contenían
cada uno 1 ml de una disolución de pepsina filtrada a pH 2 y 300 l de NaCl acuoso. Inmediatamente tras la inoculación
(T0), se preparó una serie de dilución de 10 veces de 100 l de suspensión celular del tubo nº 1 usando una disolución
de Ringer y posteriormente se sembraron en placa sobre agar MR para su incubación a 37ºC durante 24 horas. También se realizó el mismo procedimiento con respecto a cada uno de los tubos restantes, a T + 20, T + 40 y T + 60 min., respectivamente. Se notifican recuentos de bacterias correspondientes (UFC) en la tabla I a continuación:
Tabla I
Cepa 5 min. 20 min. 40 min. 60 min.
KS 116.1 81 70 0 0 KS 400 76 42 5 0 KS 119.1 67 0 0 0 KS 121.1 97 232 187 222 KS 120.1 79 128 161 189 KS 124.3 100 16 2 0 KS 300 75 75 45 4
Se observa que las cepas L. jensenii KS 121.1 y L. crispatus KS 120.1 son particularmente resistentes a 10 pepsina, incluso tras un periodo prolongado.
Ejemplo 5 Determinación de la resistencia a pancreatina (% de supervivencia a To + X min)
5.1 Se hicieron crecer las cepas de BAL seleccionadas para este experimento en 10 ml de caldo MRS a 37ºC durante 24 horas tras lo cual se centrifugó el cultivo celular durante 5 min. a 4000 rpm. Se lavó 3 veces el sedimento así obtenido en un tampón de PBS (pH 7) y se suspendió posteriormente en 1 ml de dicho tampón de PBS.
15 5.2 Se añadieron 200 l de la suspensión celular anterior a una serie de 5 tubos de ensayo que contenían cada uno 1 ml de una disolución de pancreatina porcina al 0,1% a pH 8 y 300 l de NaCl acuoso. Inmediatamente tras la inoculación (T0), se preparó una serie de dilución de 10 veces de 100 l de suspensión celular del tubo n.º 1 usando una disolución de Ringer y posteriormente se sembraron en placa sobre agar MR para su incubación a 37ºC durante 24 horas. También se realizó el mismo procedimiento con respecto a cada uno de los tubos restantes, a T + 20, T + 40, T +
20 60 y T + 120 min., respectivamente. Se notifican recuentos de bacterias correspondientes (UFC) en la tabla la tabla II a continuación:
Tabla II
Cepa 5 min. 20 min. 40 min. 60 min. 120 min.
KS 116.1 152 135 185 181 175 KS 400 107 160 127 93 206 KS 119.1 78 113 140 160 151 KS 121.1 65 48 63 110 55 KS 120.1 181 167 119 129 116 KS 124.3 50 88 119 129 116 KS 300 71 80 86 93 71
Se observa que las cepas L. acidophilus KS 116.1 y KS 400, así como L. jensenii KS 119.1, L. crispatus 120.1 25 y KS 124.3, pero en un menor grado, son particularmente resistentes a pancreatina. De manera bastante interesante, L. crispatus KS 120.1 es resistente tanto a pepsina como a pancreatina.
Ejemplo 6 Modulación de la respuesta inmunitaria (ensayo in vivo usando PMBC humanas)
Se han sometido a prueba las siguientes cepas en las condiciones fijadas a continuación en el presente documento con respecto a su capacidad para inducir o modular o afectar a una respuesta inmunitaria, más específicamente su capacidad para inducir la secreción de citocinas y similares: L. crispatus KS 116.1, L. jensenii 119.1,
L. jensenii KS 121.1 y KS 122.1, L. gasseri KS 120.1, L. gasseri KS 124.3, L. helveticus KS 300 y L. acidophilus KS 400.
Se realizó la detección de la inducción de citocinas por medio de una prueba para la estimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas. Entre las citocinas inducidas durante estas pruebas, están las interleucinas 10 y 12 (IL10 e IL 12), -interferón ( -IFN) y factor de necrosis tumoral
Procedimientos experimentales
Preparación de PMBC: Se diluyó sangre humana fresca obtenida de sujetos sanos (cuatro donantes) a una razón de
1:2 con PBS-Ca (GIBCO) y se purificó en un gradiente de Ficoll (GIBCO). Tras centrifugación a 400 x g durante 30 min. a 20°C, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) formaron una capa anular de interfase en el suero. Se aspiraron las PMBC cuidadosamente, se suspendieron hasta un volumen final de 50 ml usando PBD-Ca y se lavaron tres veces en el mismo tampón con etapas de centrifugación a 350 X g durante 10 min. a 20°C.
Se resuspendieron las PMBC usando medio RPMI completo (GIBCOP),m complementado con L-glutamina al 10 % p/v (GIBCO) y gentamicina (150 g/ml) (GIBCO). Se contaron las PBMC bajo el microscopio y se ajustaron a una concentración de 2x106 células/ml y se distribuyeron (en alícuotas de 1 ml) en placas de cultivo de 24 pocillos (Corning, Inc.).
Preparación de bacterias: se lavaron cultivos de BAL durante la noche dos veces con tampón de PBS, pH 7,2 antes de resuspenderse en PBS a una concentración de 2x109 ufc/ml.
Incubación de PMBC: a partir de estas suspensiones, se transfirieron 10 l en pocillos de las placas con PMBC que se incubaron a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO2 /95% de aire. Tras una incubación de 24 horas, se aspiró el sobrenadante, se centrifugó a 2000 rpm y se retiró el sobrenadante y se almacenó a -200ºC. El control consistía en tampón libre de bacterias.
Cuantificación de citocinas: se determinaron los niveles de expresión de citocinas mediante ensayos de ELISA (“ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas“). Se recubrieron placas de ELISA con anticuerpo anti-citocina (procedimiento durante la noche) y se bloqueó el anticuerpo con PBS/BSA al 1%. Se preparó un patrón apropiado con concentraciones conocidas de citocinas, recubriendo el intervalo de detección de 15,62 a 2000 pg/ml (se incubó durante la noche).
Se realizó la detección y cuantificación de anticuerpo anti-citocina con la reacción de estreptavidina sobre el sustrato (TMB de Pharmigen). Se usaron los kits comerciales de Pharmigen según la descripción del fabricante. Se determinaron cuatro citocinas: las citocinas proinflamatorias/Th 1, TNF , IFN , IL 12 y la citocina antiinflamatoria/Th 2, IL 10.
Tabla III IL 10 TNF IFN IL10/EL12
Control
31,25 31,25 31,25 31,25 1
KS 120.1 KS 121.1 KS 116.1 KS 400 KS 300 KS 119.1 KS 124.3
1228,67 2297,87 2856,26 3177,49 2290,47 307,13 2969,02 176,32 47,66 167,6 103,85 59,7 198,47 660,98 17698,83 14180,66 33569,91 26799 18703,66 6693,3 31307,71 3513,36 897,65 7209,33 6949,13 10047,75 9192,74 16985,56 6,96840971 48,2138061 17,0540573 30,5969186 38,3663317 1,54748829 4,49184544
Observaciones - un alto nivel de inducción de TNF
para todas las cepas de BAL sometidas a prueba
13
- un nivel relativamente bajo de INF con respecto a L. jensenii KS 121.1
-
el mayor potencial de inducción de IL10 con respecto a L. crispatus KS 116.1 y KS 400
- al contrario que las dos cepas de L. jensenii, las dos cepas de L. gasseri han mostrado un perfil similar, especialmente cuando se considera las razones en IL10/ IL12 y en TNF /INF .
Dentro del marco de pruebas anterior, está claro que el perfil de inducción de citocinas es específico de la cepa. Ejemplo 7 Determinación de la actividad antiinflamatoria (prueba in vivo usando un modelo animal)
Se ha adaptado un modelo agudo de ratones a partir de Camoglio et al. (véase Eur. J. Immunol. 2000) en el que se han alimentado los animales desde el día -5 hasta el día +2 con cepas de bacterias del ácido láctico seleccionadas, a una tasa de 108 bacterias por ratón al día. Entonces se inyectó TNBS en el día cero, a una tasa de 120 mg/kg de ratones con el fin de inducir colitis aguda y se sacrificaron los animales en el día +2 y eventualmente se sometieron a puntuación tanto macroscópica (puntuación de Wallace - tabla IV) como histológica (puntuación de Ameho
-
tabla V).
Estas tablas muestran claramente que las cepas de bacterias del ácido láctico seleccionadas muestran un efecto antiinflamatorio significativo en comparación con cepas de referencia.
Ejemplo 8: Composición probiótica para administración local
8.1 Cápsulas vaginales
Se cultivaron muestras de las cepas de BAL de esta invención (véase anteriormente) durante mín. 24 horas en condiciones similares a las mencionadas anteriormente en el presente documento. Se aislaron las cepas cultivadas, se lavaron y se liofilizaron individualmente, se suspendieron individualmente en una mezcla en polvo de lactosa/MSK y se dividieron eventualmente en dosis unitarias que contenían cada una de ellas aproximadamente 108 - 109 ufc (unidades formadoras de colonias).
Luego se vertieron dichas dosis unitarias en cápsulas vaginales de gelatina que comprendían cada una de ellas aproximadamente 108 - 109 ufc de las cepas de BAL seleccionadas de esta invención.
8.2 Supositorios vaginales
Se prepararon supositorios vaginales blandos usando los siguientes componentes:
-
disolución tamponada de ácido láctico
-
lactosa
-
PEG 4000
-
PEG 600
Se añadió entonces la cantidad adecuada de las cepas de BAL liofilizadas seleccionadas de esta invención a dosis unitarias para proporcionar supositorios vaginales que comprendían cada uno aproximadamente 108 - 109 ufc.
Ejemplo 9: Composición para administración oral
9.1 Complemento alimenticio
Se prepararon cápsulas de celulosa comestibles (hidroxipropilmetilcelulosa) que comprendían cada una aproximadamente 108 - 109 ufc de las cepas de BAL seleccionadas de esta invención usando carga que comprendía los siguientes componentes:
-
yogur en polvo deshidratado
-
dextrosa anhidra
-
almidón de patata
-
celulosa microcristalina
-
cepa de BAL liofilizada seleccionada.
9.2 Producto de leche fermentada (yogur)
Se prepararon raciones de un denominado “yogur natural ligero” (“Yogurt Natural Light”) usando el siguiente procedimiento: a un lote de leche con el 1,5% de grasa normalizada se le añadió el 3% de leche desnatada en polvo (MSK) y entonces se pasteurizó el conjunto a 90ºC durante 30 minutos. Se añadieron el 1% en volumen de cultivos
5 iniciadores comerciales de L. bulgaricus y S. thermophilus a la leche pasteurizada; luego se agitó el conjunto suavemente a temperatura ambiente, se dispuso en envases de 100 ml que se incubaron todos eventualmente a 40ºC durante aproximadamente 4 horas para lograr el pH deseado.
Luego se añadieron porciones de cepas de BAL liofilizadas seleccionadas de esta invención a los recipientes de yogur en una cantidad tal como para tener aproximadamente 108 - 109 ufc por ml de recipiente de yogur y se llevó a 10 cabo una incubación adicional durante aproximadamente 30 min. hasta que se lograse un pH de aproximadamente 4,5
a 4,7. Estas raciones de yogur pueden almacenarse a 4ºC antes de su consumo.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Cepa de bacterias del ácido láctico que pertenece a la especie Lactobacillus gasseri que se selecciona de:
    -
    L. gasseri KS 120.1, depositado el 4 de junio de 2004 en la CNCM del Instituto Pasteur con número de registro CNCM I-3218, y
    5 -L. gasseri KS 124.3, depositado el 4 de junio de 2004 en la CNCM del Instituto Pasteur con número de registro CNCM I-3220.
  2. 2. Composición probiótica que comprende una cantidad eficaz de al menos una cepa de bacterias del ácido láctico según la reivindicación 1 en combinación con un sistema de administración adecuado.
  3. 3. Composición según la reivindicación 2, en la que dicho sistema de suministro adecuado comprende además 10 factores de crecimiento de bacterias del ácido láctico (BAL) y/o componentes prebióticos.
  4. 4.
    Composición según la reivindicación 2 ó 3, en la que el sistema de suministro adecuado se indica para administración local, concretamente intrauretral, vaginal o anal.
  5. 5.
    Composición según la reivindicación 2 ó 3, en la que el sistema de suministro adecuado se indica para administración oral.
    15 6. Composición según la reivindicación 5, en la que el sistema de suministro adecuado es un producto alimenticio
    o una bebida, una composición alimenticia o de bebida, un adyuvante o complemento alimenticio o de bebida dedicado al consumo humano.
  6. 7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, para su uso en la prevención o el tratamiento de infecciones genitourinarias en mujeres y/o infecciones gastrointestinales en seres humanos.
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