ES2392751T3 - Compuestos relacionados con la histidina para identificar y bloquear los canales iónicos beta-amiloides - Google Patents

Compuestos relacionados con la histidina para identificar y bloquear los canales iónicos beta-amiloides Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende un compuesto que tiene la fórmula: en las que Ac es un grupo acetilo.

Description

Compuestos relacionados con la histidina para identificar y bloquear los canales iónicos beta-amiloides
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de y depende de la fecha de presentación de la solicitud de patente estadounidense provisional n.º 61/037.857, presentada el 19 de marzo de 2008, y la solicitud estadounidense provisional n.º 61/155.960, presentada el 27 de febrero de 2009.
Antecedentes
Las placas amiloides, que parecen estar principalmente compuestas de péptidos beta-amiloides (A�), se encuentran en la enfermedad de Alzheimer, algunas variantes de la demencia con cuerpos de Lewy y en la miositis de los cuerpos de inclusión. También se han encontrado agregados de A� revistiendo los vasos sanguíneos cerebrales en la angiopatía amiloide cerebral. El péptido A� se produce mediante la proteolisis de un péptido precursor �-amiloide unido a la membrana de mayor tamaño (Haass y Selkoe, 1993).
La enfermedad más conocida en la que participan las placas amiloides es la enfermedad de Alzheimer (EA), una enfermedad cerebral progresiva irreversible que va destruyendo lentamente la memoria y la capacidad de pensar. La EA es la causa más común de demencia entre ancianos, pero no forma parte del envejecimiento normal. La EA comienza en una región del cerebro que afecta a la memoria reciente y luego se va extendiendo gradualmente a otras partes del cerebro. El daño en el cerebro puede comenzar 10-20 años antes de la aparición de cualquier signo obvio de olvido. A medida que las células nerviosas del cerebro van muriendo, las regiones afectadas comienzan a contraerse. En la última fase de la EA, el daño se ha extendido por todo el cerebro. Según el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de Estados Unidos, actualmente, hay de 2,4 a 4,5 millones de estadounidenses con la EA. Las proyecciones con las tendencias de población actuales sugieren un aumento significativo del número de estadounidenses con EA. A no ser que se descubran tratamientos más eficaces, este aumento de los pacientes de EA no sólo afectará a sus familias, sino que también supondrá un gasto económico significativo para la sociedad.
Aunque sigue sin alcanzarse un consenso sobre los mecanismos principales que provocan daño neuronal en la EA, hay numerosos informes que han asociado la citotoxicidad de los péptidos A� con la neurodegeneración observada en determinadas zonas del cerebro de los pacientes con EA (Yankner, 1996; Yankner, 2000; Hardy y Higgens, 1992, Hardy y Selkoe, 2002). Se ha observado que la adición de nuevos agregados de A� a cultivos celulares genera un aumento de la concentración del calcio intracelular potencialmente tóxico (Mattson et al., 1992; Kawahara et al., 2000; Zhu et al., 2000; Demuro et al., 2005; Simakova y Arispe, 2006). Años de investigación apoyan el concepto de que las alteraciones de la homeostasis del calcio intracelular pueden desempeñar un papel patológico en la neurodegeneración asociada con la EA (Mattson et al., 1993; Kawahara, 2004; LaFerla, 2002; Smith et al., 2005).
El mecanismo propuesto originariamente sobre el aumento del calcio intracelular inducido por el péptido A� se basa en la formación de un canal de A� independiente sensible a la trometamina y al aluminio (Arispe et al., 1993). Este canal de A�, que permite la entrada de iones de calcio extracelular a la célula (Arispe et al., 1994; Aripse et al., 2007), ha sido confirmado en una variedad de membranas por muchos investigadores durante la década pasada (Kawahara et al., 1997; Rhee et al., 1998; Lin et al., 1999; Kourie et al., 2001; Kagan et al., 2002), se ha observado con microscopía de fuerza atómica (Quist et al., 2005; Lai et al., 2007) y se ha sometido a modelización teórica (Durrell et al., 1994; Jang et al., 2007; Jang et al., 2008). La asimetría de uno de los modelos (Durrell et al., 1994) explica el descubrimiento de que el cinc se une preferentemente y bloquea únicamente un lado del canal de A� (Arispe et al., 1996). Con frecuencia, se ha demostrado en estudios de diferentes metaloproteasas, así como en la molécula A�, que los sitios ricos en Histidina (His) y los residuos iónicos están asociados con la unión del Zn2+ (Chakrabarti, 1990; Perlman y Rosner, 1994; Becker y Roth, 1993; Miura et al., 2000; Yang et al., 2000). Debido a la naturaleza química única del residuo de His, éste tiene una fuerte afinidad por los metales. Los residuos de His actúan como ligandos hacia un centro metálico (Mukherjee y Bagchi, 2006), uniendo los grupos imidazol de las cadenas laterales de los residuos de His (Yang et al., 2000). En los modelos teóricos de Durell et al. (1994), los cálculos de mínima energía para los canales de A� de tamaño completo, sumergidos en un medio lipídico, sitúan los anillos de His13 y de His14 de la molécula A� alrededor de la entrada del poro putativo. Para probar esta predicción para el algoritmo de modelización, recientemente, se ha observado que los fragmentos peptídicos de A� que contienen los dos residuos de His13 e His14 vecinos bloquean eficazmente la actividad del canal de A� en bicapas lipídicas planares (Arispe et al., 2007; Aripse, 2004; Diaz et al., 2006). Cuando la diada His-His se sustituye con residuos que no son propensos a interactuar con los residuos de His, los péptidos derivados de A� pierden su eficacia tanto para bloquear el canal de A� como para evitar la citotoxicidad del péptido A� (Diaz et al., 2006). Además, la metilación de las cadenas laterales de imidazol de los residuos de His del péptido derivado de A� evita la formación de puentes de His y además suprime la neurotoxicidad del péptido A� (Tickler et al., 2005).
Aunque se han hecho progresos en la evaluación de los péptidos derivados de A� que pueden bloquear el canal de A� y prevenir la citotoxicidad del péptido A�, estos péptidos representan fragmentos del polipéptido A� y, por tanto, presentan posibles limitaciones como moléculas terapéuticas, entre las que se incluyen posibles interacciones con otras moléculas naturales, tales como el precursor proteico �-amiloide, y la resistencia a traspasar ciertas barreras naturales tales como la barrera hematoencefálica.
Resumen
La presente revelación proporciona composiciones y su uso para tratar o prevenir enfermedades en las que participan los canales iónicos de A� tales como la EA. Como norma general, las composiciones y su uso alargan la vida de una 5 célula viva afectando a los canales de A� de la membrana celular. Las composiciones y su uso pueden prevenir la formación de los canales de A� o pueden afectar a la funcionalidad de los mismos. Como se revela en la presente memoria, los compuestos con una capacidad de coordinación de la histidina, tales como Ni2+, imidazol, histidina y los compuestos relacionados con la histidina, interfieren con las corrientes y la citotoxicidad de los canales de A�. Estudios previos han demostrado que los fragmentos polipeptídicos de la molécula A tienen la capacidad de interferir con las
10 corrientes y la citotoxicidad de los canales de A . Sin embargo, la presente invención proporciona composiciones que comprenden compuestos con una capacidad de coordinación de la histidina distintos de los fragmentos polipeptídicos de la molécula A� que tienen la fórmula:
denominado en lo sucesivo “NAHIS02” o
denominado en lo sucesivo “HAHIS04”,
en las que Ac es un grupo acetilo.
En términos generales, la presente revelación proporciona composiciones, su uso y procedimientos de tratamiento de al menos una célula con al menos un compuesto que tenga una capacidad de coordinación de la histidina, previniendo, 20 reduciendo y eliminando de ese modo el daño causado por los canales de A . Las composiciones, su uso y los procedimientos se pueden poner en práctica in vivo bien como terapia para tratar una enfermedad o un trastorno en el que participen los canales de A� o como un procedimiento profiláctico para prevenir la formación y/o el funcionamiento de los canales de A�. Asimismo, el procedimiento se puede poner en práctica in vitro para detectar los efectos de los canales de A� sobre las células o para detectar los efectos de combinar los compuestos con capacidad de
25 coordinación de la histidina con otros compuestos o fármacos en células. Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende un compuesto de fórmula:
denominado en lo sucesivo “NAHIS01”,
denominado en lo sucesivo “NAHIS02” o
5 denominado en lo sucesivo “NAHIS04”,
en las que Ac es un grupo metilo.
En la presente memoria, se describen y/o reivindican composiciones que comprenden un compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina que provocan un cambio en el flujo de corriente a través de un canal de A . En ciertas realizaciones, una composición comprende una cantidad suficiente de al menos un compuesto que tiene
10 una capacidad de coordinación de la histidina para producir un cambio detectable en el flujo de corriente a través de un canal de A�. Así pues, cuando se usan en procedimientos de tratamiento, las composiciones comprenden al menos un compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina en una cantidad eficaz para producir un cambio detectable en el flujo de corriente en al menos un canal de A� en una célula de un sujeto.
En la presente memoria, se describen y/o reivindican composiciones que comprenden un compuesto que tiene una
15 capacidad de coordinación de la histidina que reduce la toxicidad inducida por A en una célula. En ciertas realizaciones, una composición comprende una cantidad suficiente de al menos un compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina para producir una reducción detectable en la toxicidad inducida por A en una célula. Este aspecto se puede usar en procedimientos de tratamiento, mediante los que las composiciones comprendan al menos un compuesto que tenga una capacidad de coordinación de la histidina en una cantidad eficaz
20 para reducir la toxicidad inducida por A� en una célula de un sujeto. También se contempla una composición que comprende un compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina para su uso en terapia.
En la presente memoria, se describen y/o reivindican composiciones que comprenden un compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina que evita la formación de canales de A�. Este aspecto se puede usar en procedimientos de prevención de una enfermedad, mediante los que las composiciones comprenden al menos un
25 compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina en una cantidad eficaz para prevenir la formación de al menos un canal de A en una célula de un sujeto.
En realizaciones, las sustancias se proporcionan en una cantidad suficiente para proporcionar una o más dosis a un sujeto. Otros determinados aspectos proporcionan el uso en la preparación de composiciones para un uso médico tales como composiciones farmacéuticas o terapéuticas. Las composiciones pueden comprender un compuesto que
30 tenga una capacidad de coordinación de la histidina que afecte a la actividad de A junto con una o más sustancias que comúnmente sean sustancias tolerables biológicamente, en tanto en cuanto se puedan exponer a células vivas a sus concentraciones útiles sin matar a las células. En realizaciones, las otras sustancias son sustancias farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto descrito en la presente memoria, se proporciona un recipiente, recipiente que comprende uno o más compuestos que tienen una capacidad de coordinación de la histidina que provoca un cambio, tal como una disminución, en el flujo de corriente a través de un canal de A y/o en la toxicidad inducida por A� en una célula. El compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina también puede evitar la formación de al menos un canal de A�. En general, cuando se diseña para el tratamiento in vivo de un sujeto, el recipiente contiene una cantidad suficiente del compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina para proporcionar al menos una dosis al sujeto. En algunas realizaciones, se proporcionan kits que comprenden uno o más recipientes.
La presente revelación también proporciona procedimientos para tratar individuos que están padeciendo o pueden ser susceptibles a una enfermedad o un trastorno en los que participen los canales de A . En ciertas realizaciones, los procedimientos comprenden administrar a un individuo (usado indistintamente en la presente memoria con “sujeto” y “paciente”) una cantidad de una composición que comprende un compuesto que tiene capacidad de coordinación de la histidina suficiente para reducir, eliminar o prevenir el daño en células, tejidos u órganos del individuo que está causado por la actividad del canal de A . En una realización, la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer. En otra realización, la enfermedad o el trastorno es demencia con cuerpos de Lewy, miositis por cuerpos de inclusión o angiopatía amiloide cerebral. También se contempla una composición que comprende un compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina según lo descrito en la presente memoria para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, miositis por cuerpos de inclusión o angiopatía amiloide cerebral.
En otro aspecto más, la revelación proporciona procedimientos para reducir la toxicidad inducida por A en una célula. Esto puede implicar la administración a una célula que haya sido expuesta a la proteína A de una cantidad de una composición que comprenda un compuesto que tenga una capacidad de coordinación de la histidina que sea suficiente para reducir la toxicidad inducida por A en la célula.
En otro aspecto más, se proporcionan procedimientos para cambiar el flujo de corriente a través de un canal de A en una célula, tal como en la membrana plasmática de la célula. Este procedimiento puede comprender administrar a la célula una cantidad de la composición que comprenda un compuesto que tenga una capacidad de coordinación de la histidina suficiente para reducir el flujo de actual a través del canal de A en la membrana plasmática de la célula.
En un aspecto diferente, se proporcionan procedimientos para prevenir la formación de canales de A . El procedimiento puede comprender administrar a la célula una cantidad de la composición que comprenda un compuesto que tenga una capacidad de coordinación de la histidina suficiente para prevenir la formación completa de al menos un canal de A�. Este procedimiento se puede usar para prevenir ciertas enfermedades o trastornos que se caractericen por la presencia de canales de A�.
En un aspecto final, la revelación proporciona procedimientos para identificar canales de A . Este procedimiento puede comprender administrar a la célula una cantidad de la composición que comprenda un compuesto que tenga una capacidad de coordinación de la histidina suficiente para detectar la presencia de al menos un canal de A . Este procedimiento se puede usar para identificar ciertas enfermedades o trastornos que se caractericen por la presencia de canales de A�.
Breve descripción de las figuras
Las figuras anexas, que forman parte de la presente memoria, ilustran varias realizaciones de la invención y, junto con la descripción que figura por escrito, sirven para explicar diversos principios de la invención.
La Figura 1 representa las estructuras químicas de los compuestos relacionados con la histidina NAHIS01, NAHIS02 y NAHIS04, cada uno de los cuales está amidado en el terminal carboxilo y acetilado en el terminal amino. NAHIS01, NAHIS02 y NAHIS04 se denominan ARISPHIS01, ARISPHIS02 y ARISPHIS04, respectivamente, en la solicitud provisional estadounidense n.º 61/037.857.
La Figura 2 ilustra que el níquel y el imidazol bloquean irreversiblemente el canal iónico de A unido a la membrana. (A y C) Actividad eléctrica a través de la bicapa lipídica con los canales de A incorporados registrada antes (control) y en presencia bien de Ni2+ (A) o de imidazol (C). El potencial eléctrico de la membrana del experimento se mantuvo a nivel cero. B y D representan los histogramas de amplitud de la corriente de la actividad del canal a partir de las trazas de corriente de A y C. Cinco picos de corriente principales de 0,8; 3,2; 5,2; 7,5 y 10 pA caracterizan la actividad del canal de A�. Ambos compuestos suprimen rápidamente los picos de corriente más frecuentes.
La Figura 3 muestra que la eficacia de His para bloquear el canal de A se mejora colocando un casquete en sus terminales amino y carboxilo. (A y C) Actividad eléctrica de dos bicapas lipídicas con los canales de A incorporados, registrada antes (control) y exponiendo el canal de A a diversas concentraciones de His sin modificar libre de terminales amino y carboxilo, y una His modificada, NAHIS01, con los grupos carboxilo y amino amidados y acetilados. Los canales de A� se expusieron a cada concentración de compuestos bloqueadores durante periodos de 2 min. Los aumentos de la concentración de la His sin modificar sólo afectan a los picos de corriente de 5,8 y 4,2 pA, correspondientes a una mayor conductancia del canal. NAHIS01 es más eficaz reduciendo todos los picos de corriente a concentraciones mucho menores que la His sin modificar. B y D presentan histogramas de distribución de la amplitud de los picos de corriente iónica registrados mientras se exponía el canal de A a cada concentración de His y NAHIS01, respectivamente.
La Figura 4 representa que la eficacia de bloqueo del canal de A de los compuestos relacionados con la His aumenta con el número de cadenas laterales de imidazol. (A y C) Actividad eléctrica desde dos bicapas lipídicas con los canales de A� incorporados registrada antes (control) y mientras se exponían los canales de A a dos compuestos que poseían dos (NAHIS02) y cuatro (NAHIS04) cadenas laterales de imizadol, respectivamente. Los registros de corriente muestran la actividad del canal en diversos momentos tras exponer los canales a dos concentraciones de los compuestos bloqueadores. Tras bloquear completamente el canal de A , se invirtió la acción de bloqueo de NAHIS02 al lavar la cámara experimental del bloqueador. El bloqueo producido por NAHIS04 resultó ser irreversible. B y D presentan los histogramas de distribución de la amplitud de los picos de corriente iónica registrados mientras se exponía el canal de A a diversas concentraciones de NAHIS02 y NAHIS04, respectivamente. A una concentración de 16,66IM ambos compuestos retiraron todos los picos de corriente. Sin embargo, NAHIS04 produjo un bloqueo completo más rápidamente.
La Figura 5 ilustra el transcurso en el tiempo de carga iónica conducida por canales de A incorporados a la membrana que muestra el efecto de los bloqueadores del canal de A . (A) Los registros de corriente muestran el transcurso en el tiempo de la actividad de los canales de A incorporados a las bicapas lipídicas planares antes y después de la adición del bloqueador del canal de A� NAHIS02 (registro superior) y NAHIS02-(n-Met) (registro inferior). La concentración de NAHIS02-(n-Met) se fue aumentando gradualmente como se indica en los puntos temporales señalizados con las flechas. NAHIS02-(n-Met) no afectó a la actividad de los canales de A incluso a una concentración cuatro veces superior. (B) La cantidad de carga conducida por los canales de A incorporados a las bicapas antes y después de la adición de imidazol, Ni2+ e His a concentraciones de 41,5IM (gráfica de la izquierda) y NAHIS01, NAHIS02, NAHIS02-(n-Met) y NAHIS04 a una concentración de 16,6IM (gráfica de la derecha). La corriente iónica que fluía a través de la membrana se integró en intervalos de tiempo consecutivos de 8 min de duración. La eficacia para detener la actividad de los canales de A� aumenta a medida que aumenta el número de cadenas laterales de imidazol de los compuestos bloqueadores. pC: picoculombios.
La Figura 6 muestra la protección de las células de la citotoxicidad de A por parte de los compuestos que coordinan y se asocian con los canales de A�. Se observó la viabilidad de células PC12S (A y B) y neuronas corticales (C y D) y del hipocampo (E y F) tras 3 días de incubación en presencia de péptido A (5IM) y de péptido A� (5IM) más Ni2+, imidazol o His. Los resultados del análisis del XTT se expresan como un porcentaje de la citotoxicidad (A, C y E). El LDH liberado por las células en los medios se expresa como un porcentaje de la protección de las células (B, D y F). El imidazol y Ni2+ protegen completamente las células contra la citotoxicidad de A�, pero el Ni2+ mostró una toxicidad dependiente de las células a concentraciones elevadas. His tuvo un mal rendimiento en la protección de las células contra la toxicidad de A .
La Figura 7 representa la protección de las células contra la citotoxicidad de A por parte de los compuestos relacionados con His que establecen una interacción aromática con los canales de A . Se observó la viabilidad de células PC12S (A y B) y neuronas corticales (C y D) y del hipocampo (E y F) tras 3 días de incubación en presencia de péptido A (5μM) y de péptido A� (5μM) más NAHIS01, NAHIS02, NAHIS02-(n-Met) y NAHIS04. Los resultados del análisis de XTT se expresan como un porcentaje de la citotoxicidad (A, C y E). El LDH liberado por las células en los medios se expresa como un porcentaje de la protección de las células (B, D y F). El nivel de protección para todos estos compuestos correspondió al número de cadenas laterales de imidazol reactivas. NAHIS02 y NAHIS04 protegió completamente las células contra A�. NAHIS02-(n-Met) fue muy deficiente en la protección contra la citotoxicidad provocada por el péptido A�.
La Figura 8 representa la protección de las células PC12 contra la citotoxicidad de A bien mediante NA4, NA7 o NAHIS04 (Figura 8A) y la concentración necesaria para lograr una protección del 50% de las células (CE50. Figura 8B).
La Figura 9 ilustra el transcurso en el tiempo del cambio del calcio libre intracelular en 6 células PC12 cargadas con fura-2AM seleccionadas antes y después de la adición bien de A (7,66IM) y A� + NAHIS02 (Figura 9A) o A� + NAHIS02-n-Met (Figura 9B).
La Figura 10 muestra la protección de las células PC12 contra la citotoxicidad de A tras la adición bien de NAHIS02 o de NAHIS02-n-Met. INSERTAR INFORMACIÓN DE LAS FIGURAS A-F
La Figura 11 representa el cambio del calcio libre intracelular en las células PC12 antes (Figura 11A) y después de la adición del péptido A� a los medios que contienen diferentes concentraciones de NAHIS04 (Figura 11B: 0,83IM; Figura 11C: 1,66IM; Figura 11D: 3,32IM; Figura 11E: 4,98IM; Figura 11F: 6,64IM).
La Figura 12 ilustra un mecanismo propuesto para el bloqueo de los canales iónicos de A por parte de los compuestos relacionados con la His. En la Figura 12A se muestran los agregados oligoméricos de las unidades de A que forman un canal iónico, en a Figura 12B se muestra una unidad de A y en a Figura 12C se muestra el bloqueo del canal iónico de A� por parte de los compuestos relacionados con la His.
La Figura 13 muestra la protección de las células PC12 contra la citotoxicidad de A tras la adición bien de NA4 con casquete (que tiene un terminal carboxilo amidado y un terminal amino acetilado), NA4 (con los terminales sin modificar) o NAHIS04.
Descripción detallada
A continuación, se hará referencia detalladamente a diversas realizaciones ejemplares, cuyos ejemplos se ilustran en las figuras anexas. La siguiente descripción detallada se proporciona para dar detalles sobre ciertas realizaciones y no debería entenderse como una limitación del alcance completo de la invención.
En términos generales, la presente revelación proporciona procedimientos, compuestos y composiciones para reducir la toxicidad inducida por A de una célula, cambiando el flujo de corriente a través de un canal de proteína A y/o evitando la formación de canales de proteínas A . Los procedimientos, los compuestos y las composiciones revelados en la presente memoria también tienen uso en la prevención de enfermedades o trastornos causados por la toxicidad inducida por A de una célula tales como la EA. Por tanto, tienen usos tanto in vivo como in vitro.
El péptido o la proteína A tratada en la presente memoria interactúan con células tales como neuronas para generar un aumento de las concentraciones de calcio intracelular. El canal de A , el canal iónico de A� o el canal de proteína A� se refiere a un canal independiente que se forma mediante agregados oligoméricos del péptido A� (SEC ID N.º 1) y que conduce el calcio a la célula. El canal se encuentra habitualmente en la bicapa lipídica de la membrana plasmática de las células. Las composiciones y los procedimientos revelados en la presente memoria se pueden usar para detectar la presencia, el desarrollo o el posible desarrollo de una enfermedad o un trastorno mediante la detección de la presencia de canales de A�, agregados de proteína A�, placas amiloides u otras estructuras compuestas de proteína A�.
En vistas del alcance de las células, las enfermedades y los trastornos descritos en la presente memoria, ha de reconocerse que se contemplan todas las células en las que se encuentre un canal de proteína A . Asimismo, se contemplan todas las enfermedades y los trastornos en los que se pueda descubrir la participación de un canal de proteína A�. Por ejemplo, la enfermedad o el trastorno puede ser, pero sin limitación, la enfermedad de Alzheimer, algunas variantes de la demencia con cuerpos de Lewy, miositis de cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral. Por consiguiente, en un aspecto, la revelación proporciona un procedimiento para detectar la presencia, el desarrollo o el posible desarrollo de una enfermedad o un trastorno mediante la detección de la presencia de canales de A� en una célula o placas amiloides o fibrillas en tejido.
Por lo tanto, la revelación proporciona composiciones que comprenden compuestos que tienen una capacidad de coordinación de la histidina, tales como Ni2+, imidazol, histidina y compuestos relacionados con la histidina, que se pueden usar para tratar una enfermedad o un trastorno. La expresión "capacidad de coordinación de la histidina" se refiere a la capacidad de un compuesto para interactuar con los residuos de histidina del canal de A , y se puede medir usando los ensayos conocidos en la técnica y/o revelados en los ejemplos de la presente solicitud, entre los que se incluyen, por ejemplo, la capacidad para reducir la actividad de los canales mediados por A tal como la corriente, la entrada de calcio y la citotoxicidad. Los compuestos con capacidad de coordinación de la histidina incluyen histidinas con cadenas laterales de imidazol reactivas. El imidazol tiene una estructura de resonancia que lo convierte en un excelente nucleófilo. Por lo tanto, el imidazol tiene tendencia a interactuar con otros residuos cargados, especialmente, con residuos de His. En ciertas realizaciones, se aíslan los compuestos que tienen una capacidad de coordinación de la histidina.
En la presente memoria, se describe una composición que comprende un polipéptido que tiene al menos 2, pero no más de 10 residuos de aminoácido, en el que al menos 2, pero no más de 4 de esos residuos de aminoácido son histidina, en la que el polipéptido no es un fragmento de proteína A y en la que la proteína A tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 1. También se describe un polipéptido que no tiene más de 6, 7, 8 ó 9 residuos de aminoácido, no más de 4 residuos de histidina y/o no más de 2 residuos histidina. En una realización de la invención reivindicada, el polipéptido consiste en 4 residuos de histidina o consiste en 2 residuos de histidina. A efectos de la presente revelación, los términos proteína, polipéptido y péptido se usan indistintamente. En ciertas realizaciones, se aísla el polipéptido. Como se usa en la presente memoria, “aislado”, cuando se usa para describir los diversos compuestos o polipéptidos, significa un compuesto o un polipéptido que se ha separado y/o recuperado de uno o más componentes de su entorno natural.
Se prevén modificaciones del polipéptido o del péptido que lo hagan más adecuado para un uso in vivo. Por ejemplo, el polipéptido o el péptido se pueden modificar químicamente mediante procedimientos conocidos en la técnica. Estas modificaciones pueden provocar una menor degradación proteolítica, un aumento de la biodisponibilidad, una mejor permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica, etc. Como ejemplo, la modificación química del polipéptido tal como la metilación del nitrógeno del enlace de tipo amida puede mejorar la estabilidad del polipéptido. Como otro ejemplo, se puede colocar un casquete en los extremos del/de los residuo/s de histidina para evitar las interacciones de los extremos con otros grupos reactivos encontrados en el canal de A�. Por ejemplo, se puede acetilar el terminal amino del polipéptido o del péptido y se puede amidar el terminal carboxilo del polipéptido o del péptido. También se puede colocar un casquete en el terminal de los péptidos mediante metilación, biotinilación u usando otros grupos protectores tales como 9H-(f)luoren-9-il(m)et(o)xi(c)arbonilo (Fmoc). Estas modificaciones también se pueden realizar a fragmentos polipeptídicos de A� para mejorar la capacidad de los fragmentos para bloquear el canal de A y/o reducir la concentración necesaria para bloquear el canal de A .
Otros determinados aspectos de la invención proporcionan el uso en la preparación de composiciones para un uso médico tales como composiciones farmacéuticas o terapéuticas. Las composiciones pueden comprender compuestos que tengan una capacidad de coordinación de la histidina, tales como los polipéptidos descritos en la presente memoria, junto con una o más sustancias diferentes que sean, por lo común, sustancias tolerables biológicamente en tanto en cuanto se puedan exponer a células vivas sin matar a las células. En realizaciones, las composiciones pueden comprender células, tejidos, proteínas, ácidos nucleicos u otras moléculas pequeñas o complejas encontradas comúnmente en muestras biológicas. Las composiciones también pueden comprender algunos o todos los reactivos, compuestos, marcadores, etc. usados en uno o más de los diversos análisis mencionados en la presente memoria. En realizaciones, las composiciones comprenden una o más sustancias que son farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente memoria, una “sustancia farmacéuticamente aceptable” es aquélla que no es tóxica para la célula con la que se pone en contacto a la concentración a la que se pone en contacto con la célula. La sustancia farmacéuticamente aceptable puede ser, por tanto, tóxica al nivel presente en la composición, pero tras su administración a un sujeto, diluirse hasta un nivel seguro. Por tanto, la expresión pretende incluir, pero sin limitación, disolventes, cubiertas, agentes antibacterianos y antifúngicos, y cualquier otro ingrediente que sea biológicamente tolerable. Los ejemplos de dichas sustancias incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina, albúmina de suero humano, azúcares, sales, lípidos, fármacos, vehículos, aromatizantes, cargas, aglutinantes, gomas, colorantes, tampones, detergentes, compuestos biológicamente activos y similares. En una realización preferida, las composiciones comprenden vehículos farmacéuticos que son útiles en la preparación de formulaciones farmacéuticas tales como tensioactivos, polietilenglicol, ácidos grasos, liposomas, solutos que vuelven la sustancia isotónica con la sangre y similares. El uso de dichas sustancias farmacéuticamente activas es ampliamente conocido en la técnica. Preferente y particularmente para las composiciones destinadas a un uso in vivo, la composición es estéril o se ha esterilizado. La esterilización se puede realizar mediante cualquier técnica adecuada. En una realización, la composición es una composición criodesecada (liofilizada) que sólo requiere la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso.
Las composiciones reveladas en la presente memoria pueden provocar un cambio detectable en el flujo de corriente a través de un canal de AP y/o reducir la toxicidad inducida por A en una célula. Los análisis que miden las conductancias eléctricas se pueden emplear para determinar el flujo de corriente y los análisis para medir la muerte celular se pueden emplear para medir la reducción de la toxicidad inducida por A . En los siguientes ejemplos, se describe un ejemplo de análisis in vitro para medir los cambios de la corriente eléctrica. Los ejemplos de los análisis para medir la muerte celular incluyen un análisis colorimétrico y un análisis de la lactato deshidrogenasa, según lo descrito en la presente memoria. Los análisis para determinar la presencia de canales iónicos de A y/o placas amiloides o fibrillas incluyen, por ejemplo, inmunorreactividad de A , espectroscopía de difusión de luz, espectoscopía de dicroísmo circular, microscopía electrónica y examen del tejido cerebral. En la técnica, se conocen ampliamente otros análisis, bien para un uso in vitro o in vivo.
Otro aspecto descrito en la presente memoria proporciona un recipiente que comprende uno o más compuestos que tienen una capacidad de coordinación de la histidina, tales como los polipéptidos descritos en la presente memoria, que provocan un cambio en el flujo de corriente a través de un canal de A y/o reducen la toxicidad inducida por A� en una célula. El recipiente también puede comprender uno o más compuestos que tengan una capacidad de coordinación de la histidina, tales como los polipéptidos descritos en la presente memoria, que eviten la formación de canales de A� . En general, cuando se diseña para el tratamiento in vivo de un sujeto, el recipiente contiene una cantidad suficiente de sustancia para proporcionar al menos una dosis al sujeto. Cuando se diseñan para un uso in vitro, el recipiente comúnmente contiene al menos los suficiente de al menos una sustancia para realizar un análisis según lo descrito en la presente memoria. En ciertas realizaciones descritas en la presente memoria, el recipiente se proporciona en un envase con uno o más recipientes distintos y/o con uno o más artículos de fabricación o dispositivos que tengan uso en la administración de sustancias a sujetos (p. ej., jeringas, agujas, hisopos antisépticos) o para poner en práctica los procedimientos de la invención in vitro.
La presente revelación también proporciona kits. En general, los kits comprenden una cantidad sufriente de al menos un compuesto que tiene una capacidad de coordinación de la histidina, tal como los polipéptidos descritos en la presente memoria, para producir un cambio en el flujo de corriente que pasa a través de un canal de A y/o reducir la toxicidad inducida por A� en una célula. Los kits también pueden comprender uno o más compuestos que tengan una capacidad de coordinación de la histidina, tales como los polipéptidos descritos en la presente memoria, que eviten la formación de canales de A . Comúnmente, el compuesto se suministrará en uno o más recipientes, conteniendo cada recipiente una cantidad sufriente del compuesto para al menos una dosis del paciente. Los kits pueden comprender otros componentes tales como algunos o todos los componentes necesarios para poner en práctica el procedimiento descrito en la presente memoria. Los kits pueden contener una jeringa para administrar una dosis de la sustancia. Los kits también pueden comprender filtros para realizar una esterilización antes de la administración. Asimismo, pueden contener agua estéril, o tampón para rehidratar o reconstituir la sustancia seca antes de su administración a un paciente. En realizaciones descritas en la presente memoria, se proporcionan múltiples dosis del compuesto en el kit, bien todas en un solo recipiente (p. ej., un vial) o se distribuyen entre dos o más recipientes. Preferentemente, el kit y sus contenidos son estériles o se han esterilizado.
En general, una dosis de aproximadamente 0,01 ng a aproximadamente 1 g, tal como de aproximadamente 0,05 ng, 0,1 ng, 0,5 ng, 1 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1 Ig, 5 Ig, 10 Ig, 50 Ig, 100 Ig, 500 Ig o 1 g por administración debería ser eficaz para proporcionar el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Por supuesto, las cantidades de la inyección o la infusión tenderán a estar en el límite inferior del intervalo, mientras que las cantidades de la administración oral tenderán a estar en el límite superior. Los resultados in vitro sugieren que las cantidades IM son óptimas, pero por supuesto, estas cantidades variarán en función de la especie del sujeto y de la razón de la administración.
La presente revelación también proporciona procedimientos de uso de las composiciones descritas en la presente memoria. En un aspecto, se proporciona un procedimiento para reducir la toxicidad inducida por A� en una célula, procedimiento que comprende administrar a una célula que se haya expuesto a la proteína A una cantidad de una composición revelada en la presente memoria suficiente para reducir la toxicidad inducida por A en la célula. En una realización, la composición comprende un polipéptido que tiene al menos 2, pero no más de 6-10 residuos de aminoácido, en el que al menos 2, pero no más de 4 de esos residuos de aminoácido son histidina, en la que el polipéptido no es un fragmento de proteína A y en la que la proteína A� tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 1. En otra realización, la composición comprende un polipéptido que consiste en cuatro residuos de histidina. En otra realización más, la composición comprende un péptido que consiste en dos residuos de histidina. La expresión “reducción de la toxicidad inducida por A� en una célula” pretende significar que las composiciones protegen la célula del daño o de más daño causado por los canales de A , habitualmente, en la membrana plasmática de la célula.
En otro aspecto descrito en la presente memoria, se proporciona un procedimiento para reducir el flujo de corriente a través de un canal de A� en la membrana plasmática de una célula, procedimiento que puede comprender administrar a la célula una cantidad de una composición revelada en la presente memoria suficiente para reducir el flujo de corriente a través del canal de A en la membrana plasmática de la célula. En una realización, la composición comprende un polipéptido que tiene al menos 2, pero no más de 6-10 residuos de aminoácido, en el que al menos 2, pero no más de 4 de esos residuos de aminoácido son histidina, en la que el polipéptido no es un fragmento de proteína A� y en la que la proteína A� tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 1. En otra realización, la composición comprende un polipéptido que consiste en cuatro residuos de histidina. En otra realización más, la composición comprende un péptido que consiste en dos residuos de histidina.
En otro aspecto más, las composiciones reveladas en la presente memoria se pueden usar en procedimientos para el tratamiento de individuos que padezcan o que puedan ser susceptibles a una enfermedad o un trastorno en el que participen los canales de A�. En general, dichos procedimientos comprenden administrar a un individuo una cantidad de una composición que tiene capacidad de coordinación de la histidina suficiente para reducir, eliminar o prevenir el daño celular, tisular u orgánico provocado por la actividad del canal de A . Más específicamente, la revelación proporciona un procedimiento para tratar un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno asociado con la formación del canal de A , que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición revelada en la presente memoria suficiente para reducir la toxicidad inducida por A en un sujeto. En una realización, la composición comprende un polipéptido que tiene al menos 2, pero no más de 6-10 residuos de aminoácido, en el que al menos 2, pero no más de 4 de esos residuos de aminoácido son histidina, en la que el polipéptido no es un fragmento de proteína A� y en la que la proteína A� tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 1. En otra realización, la composición comprende un polipéptido que consiste en cuatro residuos de histidina. En otra realización más, la composición comprende un péptido que consiste en dos residuos de histidina. También se contemplan estas composiciones para su uso en terapia en general, así como, más específicamente, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, miositis por cuerpos de inclusión o angiopatía amiloide cerebral.
Administrar o poner en contacto significa cualquier acción que ponga en contacto al menos un compuesto de la composición con al menos una célula. Así pues, puede comprender exponer la/s célula/s a composiciones de la invención en una cantidad suficiente para producir el contacto de al menos un compuesto con capacidad de coordinación de la histidina con al menos una célula. Los procedimientos se pueden poner en práctica in vivo, en cuyo caso "poner en contacto" significa exponer al menos una célula de un sujeto a al menos un compuesto de una composición de la invención. En general, la cantidad de composición de la invención para poner en contacto con la célula es de aproximadamente 0,1 ng a aproximadamente 1 g, tal como de aproximadamente 0,05 ng, 0,1 ng, 0,5 ng, 1 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1 μg, 5 μg, 10 μg, 50 μg, 100 μg, 500 μg o 1 g.
Según los procedimientos descritos en la presente memoria o el uso reivindicado, el sujeto, individuo o paciente puede ser cualquier organismo al que se administre el tratamiento. De este modo, el sujeto puede ser un ser humano u otro mamífero, incluyendo, pero sin limitación, un roedor (por ejemplo, ratón, rata, conejo), un canino (por ejemplo, un perro), un felino (por ejemplo, un gato), un equino (por ejemplo, un caballo), un ovino (por ejemplo, una oveja), un porcino (por ejemplo, un cerdo) o un bovino (por ejemplo, una vaca o un novillo). El sujeto puede ser cualquier otro animal tal como un ave, reptil, anfibio o cualquier otro animal de compañía o agrícola.
El procedimiento se puede poner en práctica in vivo bien como un procedimiento terapéutico para tratar una enfermedad o un trastorno en el que estén implicados los canales de A o como un procedimiento profiláctico para prevenir la formación y/o el funcionamiento de los canales de A . Cuando el procedimiento es un procedimiento de tratamiento (es decir, un procedimiento terapéutico), la cantidad es una cantidad que sea eficaz para reducir o eliminar un efecto citotóxico asociado con los canales de A� en las células del sujeto. El sujeto, individuo o paciente puede ser cualquiera que tenga una necesidad inmediata o evidente, o se sospeche que la tenga, del tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con los canales de A . En dichas situaciones, cuando es evidente o se sospecha de la existencia de una afección preexistente relacionada con el daño celular, tisular u orgánico debido a los canales de A�, el procedimiento es un procedimiento terapéutico. Por ejemplo, si un sujeto tiene síntomas de la enfermedad de Alzheimer, puede ser beneficioso tratar al sujeto con las composiciones reveladas en la presente memoria para detener el progreso de la enfermedad.
Además, según los procedimientos revelados, el sujeto, individuo o paciente puede se aquél que no necesite ni se sospeche que necesite el tratamiento de una enfermedad o trastorno preexistente. En dichas situaciones, el procedimiento es un procedimiento profiláctico. Los procedimientos profilácticos son útiles en situaciones en las que el paciente tiene una tendencia a desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con los canales de A . Así pues, los presentes procedimientos son útiles no sólo para el tratamiento de pacientes con una enfermedad o trastorno, sino también para tratar pacientes que son sospechosos de tener una predisposición a una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, si se ha observado que la familia de un sujeto tiene tendencia a padecer una cierta enfermedad, el sujeto puede recibir las composiciones de la invención para evitar o reducir los efectos de esa enfermedad. Por lo tanto, la revelación proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto sospechoso de tener una predisposición a una enfermedad o trastorno que comprende administrar al sujeto una cantidad de la composición descrita en la presente memoria suficiente para prevenir la toxicidad inducida por A� al sujeto.
Los procedimientos revelados en la presente memoria comprenden generalmente poner en contacto al menos una célula con al menos una sustancia que tenga capacidad de coordinación de la histidina, tal como los polipéptidos descritos en la presente memoria. Por tanto, los procedimientos se pueden poner en práctica in vitro, in vivo y ex vivo. Por consiguiente, se pueden poner en práctica, por ejemplo, como un procedimiento de investigación para identificar compuestos o para determinar los efectos de los compuestos y de las concentraciones de los compuestos, como un procedimiento terapéutico para tratar una enfermedad o trastorno en el que estén implicados los canales de A y como un procedimiento para prevenir una enfermedad o un trastorno. En las realizaciones en las que el procedimiento es un procedimiento de tratamiento, puede ser un procedimiento para la terapia (por ejemplo, un procedimiento terapéutico) en el que la cantidad administrada sea una cantidad eficaz para reducir o eliminar una enfermedad o trastorno. En las realizaciones en las que el procedimiento es un procedimiento de prevención, la cantidad es una cantidad suficiente para evitar que se produzca la enfermedad o el trastorno, o suficiente para reducir la gravedad de la enfermedad o del trastorno si se produce o para detener el progreso de la enfermedad.
Los procedimientos también se pueden poner en práctica in vitro. Por ejemplo, la etapa de administrar a al menos una célula al menos un compuesto que tenga capacidad de coordinación de la histidina, tal como los polipéptidos descritos en la presente memoria, se puede producir en una placa de Petri, un tubo de ensayo, un tuvo IV o cualquier otro recipiente aplicable para el contacto. Cuando se pone en práctica in vitro, puede ser un procedimiento para identificar los parámetros que sean útiles en las pautas de tratamiento in vivo. El procedimiento se puede poner en práctica para estudiar los efectos sobre las células de las combinaciones de las composiciones reveladas en la presente memoria con fármacos. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden combinar con otros fármacos conocidos usados para una enfermedad tal como la enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos in vitro también pueden comprender el uso de las composiciones para observar los efectos sobre las células de interrumpir los canales de A�
o para observar los cambios en la expresión proteica, la morfología celular o cualquier otra característica de interés de las células.
Como se usa en la presente memoria, una “cantidad suficiente” es una cantidad de una sustancia (por ejemplo, un fármaco o un compuesto) que produzca una disminución en al menos una característica detectable de una enfermedad o un trastorno. Por ejemplo, puede reducir el flujo de corriente a través de un canal de A . También puede reducir la toxicidad inducida por A� en una célula. Además puede prevenir la formación de canales de A . Los expertos en la técnica pueden prever otras características de inmediato y, por tanto, no es necesario enumerarlas en la presente memoria. Se puede administrar una cantidad sufriente de una sustancia en una o más administraciones en una o más dosis. Una cantidad suficiente para producir un cambio detectable, tal como una disminución detectable, es comúnmente una cantidad que proporcione un cambio relevante en los niveles de la característica de interés. En algunos casos, el cambio es un cambio sustancial tal como una disminución sustancial del flujo de corriente a través de un canal de A o una disminución sustancial de la toxicidad inducida por A� en una célula. Es posible medir los cambios con respecto a células control sin tratar o cualquier control negativo apropiado.
En realizaciones, el procedimiento de tratamiento comprende administrar a un sujeto al menos un compuesto que tenga una capacidad de coordinación de la histidina, tal como los polipéptidos descritos en la presente memoria, que afecte a los canales de A implicados en una enfermedad o trastorno, siendo el/los compuesto/s administrado/s en una cantidad suficiente para reducir o eliminar la enfermedad o el trastorno. Como con otros procedimientos de tratamiento descritos en la presente memoria, es posible repetir la acción de administrar una o más veces para alcanzar el efecto deseado. Así pues, cada dosis o dosificación de una sustancia, etc. no necesita proporcionar una cantidad sufriente del compuesto, etc. para alcanzar el objetivo deseado, sino que, en cambio, la dosis acumulada puede, en realizaciones, proporcionar la cantidad suficiente para conseguir el objetivo deseado.
La acción de administrar el/los compuesto/s puede ser cualquier acción que proporcione el/los compuesto/s al cuerpo del sujeto, de manera que pueda funcionar para el objetivo deseado. Los compuestos, etc. se pueden administrar por cualquier vía, en cualquier cantidad adecuada y mediante cualquier pauta de dosificación adecuada. Por lo tanto, los compuestos se pueden administrar, por ejemplo, oralmente, en forma de píldora, cápsula, comprimido oblongo, polvo, líquido, gel, bálsamo, crema, pastilla, comprimido o cualquier otro vehículo de administración oral adecuado. Los compuestos también se pueden administrar, por ejemplo, en forma inyectable o infusible tal como un líquido adecuado para inyección o infusión intravenosa, o inyección directamente en una zona corporal, subcutáneamente e intramuscularmente. Alternativamente, los compuestos se pueden formular, por ejemplo, para que sean absorbidos a través de las membranas mucosas o la piel, pudiendo estar, por tanto, en forma de bálsamo, crema, gel o similar para una administración tópica, intranasal, sublingual, intrarrectal o intravaginal. Las cantidades que se administren variarán en función de la vía de administración. Cualquier experto en la técnica es capaz de determinar la cantidad apropiada del compuesto que se vaya a administrar a un sujeto en necesidad del mismo en base a los principios farmacológicos ampliamente conocidos. Las cantidades, y el número y la frecuencia de las repeticiones de las administraciones se pueden ajustar según principios de medicina ampliamente conocidos, tras una o más administraciones o dosis, teniendo en cuenta tanto los efectos beneficiosos como los efectos perjudiciales (por ejemplo, efectos secundarios) del/de los compuesto/s en el paciente.
En un aspecto final, los presentes compuestos y las composiciones que comprenden los mismos se pueden usar en procedimientos para identificar canales de A �. Debido a que las composiciones descritas y/o reivindicadas en la presente memoria interactúan con los canales de A� mediante la formación de complejos de coordinación con los residuos de His de las subunidades de A� del canal de A , las composiciones se pueden usar para identificar la presencia de canales de A . Los compuestos de la composición se pueden marcar, poner en contacto con una célula que se crea que contiene canales de proteína A y detectarse los canales de proteína A mediante inmunodetección, fluorescencia y cualquier otro sistema de marcaje conocido en la técnica. Por lo tanto, la revelación proporciona un procedimiento para identificar la presencia de al menos un canal de A que comprende poner en contacto una muestra biológica con una composición que comprende un compuesto que tiene capacidad de coordinación de la histidina, tal como los polipéptidos descritos en la presente memoria, en una cantidad suficiente para detectar la presencia de al menos un canal de A� en la muestra biológica. En una realización, la composición comprende un polipéptido que tiene al menos 2, pero no más de 6-10 residuos de aminoácido, en el que al menos 2, pero no más de 4 de esos residuos de aminoácido son histidina, en la que el polipéptido no es un fragmento de proteína A y en la que la proteína A tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 1. En otra realización, la composición comprende un polipéptido que consiste en cuatro residuos de histidina. En otra realización más, la composición comprende un péptido que consiste en dos residuos de histidina. En ciertas realizaciones, la muestra biológica comprende células o tejido.
Será evidente para los expertos en la técnica que es posible hacer diversas modificaciones y variaciones en la práctica de la presente invención. Hay otras realizaciones de la invención que serán evidentes para los expertos en la técnica teniendo en cuenta la memoria y la práctica de la invención. Se pretende que la memoria y los ejemplos se consideren únicamente ilustrativos, estando el verdadero alcance de la invención indicado por las siguientes reivindicaciones.
Ejemplos
La invención se explicará más detalladamente mediante los siguientes ejemplos, que pretenden ser puramente ejemplares de la invención y no deberían considerarse de ningún modo como restrictivos de la misma.
Ejemplo 1: El Ni2+ y el imidazol pueden bloquear eficazmente los canales de A incorporados en membranas artificiales
La descripción ejemplar detallada que se presenta a continuación y, particularmente, los experimentos y datos, se basaron en los materiales y procedimientos que se revelan en el presente ejemplo, a no ser que se indique lo contrario.
Metodología de la bicapa lipídica planar: se preparó una suspensión de palmitoiloleoil-fosfatidilserina y palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina, (Avanti, Alabaster, AL) 1:1, en r-decano. Se aplicó esta suspensión a un orificio de aproximadamente 100-120 Im de diámetro con una película de Teflón separando dos compartimentos de 1,2 ml de volumen cada uno. Las soluciones iónicas de los compartimentos contenían concentraciones asimétricas de CsCl (200 cis/50 trans mM) y simétricas de CaCl2 0,5mM y K-HEPES 5mM, pH 7. Se conectaron eléctricamente los dos compartimentos iónicos a la entrada de un amplificador de pinza de tensión. Se registró la corriente con un amplificador de pinza de parche, y se almacenaron los datos en una memoria de disco de un ordenador. Se llevó a cabo un análisis en desconexión de la actividad del canal con el paquete informático pClamp (Axon Instruments, Foster City, CA). La incorporación del péptido A a la bicapa se obtuvo mediante la adición de una alícuota de suspensión de proteoliposoma (liposoma de A ) a la solución del lado cis de la cámara de la bicapa lipídica planar y agitación.
Preparación de los proteoliposomas: se prepararon liposomas mediante la hidratación de palmitoiloleil-fosfatidilserina secada al aire (10 mg) con aspartato de potasio 1M, pH 7,0 (1 ml) seguida del tratamiento de ultrasonidos en agua durante 5 min. Se mezcló la suspensión de liposomas (50 Il) con una solución acuosa madre de péptido A� (1 mg/ml, obtenido en Bachem, Torrance, CA y en AnaSpec, San Jose, CA), tras lo que se sometió a ultrasonidos.
Materiales y compuestos relacionados con His: se adquirieron NiCl2, imidazol y L-histidina en Sigma-Aldrich (St.
Lous, MO). Los compuestos relacionados con la histidina NAHIS01 (Ac-His-CONH2), NAHIS02 (Ac-His-His-CONH2) y NAHIS04 (Ac-His-His-His-His-CONH2; SEC ID N.º 2), que contienen uno, dos y cuatro residuos de His, respectivamente, se sintetizaron en forma de amida y se colocó un casquete en el terminal amino con anhídrido acético. NAHIS02-(n-Met) (Ac-His-n-Met-His-n-Met-CONH2) se sintetizó combinando Fmoc-His(3-Me)-OH (Fmoc-His(n-Me)-OH, Bachem, CA, EE.UU.), que posee el grupo imidazol metilado en la posición n.
En base al modelo teórico propuesto por Durell et al. (1994), se forma la región porosa predicha del canal de A de estructura hidrófila compuesta por los residuos 1-16. La estructura formada mediante un polímero radial de cuatro a seis subunidades de A� predice que los anillos de los residuos de His rodean y forman la trayectoria para que los iones pasen a través del poro. El trabajo anterior (Diaz et al., 2006; Tickler et al., 2005) ha mostrado que los péptidos A pueden bloquear los canales de A�. Como todos los péptidos A� poseen en su secuencia los dos residuos de His vecinales que se han modelado como revestimiento de la entrada en el poro, es posible que esos compuestos de capacidad coordinadora de la His conocida interactúen en la boca del poro. Esta interacción bloqueará la entrada al poro de A y, por consiguiente, afectará al flujo de corriente que pasa a través del canal de A . Por lo tanto, se estudió la interacción de diversos compuestos de capacidad coordinadora de His conocida con los canales de A incorporados en bicapas lipídicas planares. No se aplicó ninguna diferencia del potencial de membrana a las bicapas lipídicas para evitar cualquier efecto perturbador que pudiera tener el potencial de membrana sobre la actividad del canal y en las configuraciones del canal.
La Figura 1 ilustra la estructura química de varios compuestos relacionados con la His. La His es un aminoácido aromático que contiene un anillo de imidazol heteroaromático disponible para la interacción. Para estudiar la contribución del anillo de imidazol en la interacción de la His con el canal iónico de A , se ha investigado la eficacia del bloqueo del canal de una His con casquete terminal modificada en la que el imidazol es el único grupo disponible para la interacción (NAHIS01), dos grupos de His con casquete terminal modificados que poseen un total de dos cadenas laterales de imidazol (NAHIS02) y cuatro grupos de His con casquete terminal modificados que poseen un total de cuatro cadenas laterales de imidazol (NAHIS04; SEC ID N.º 2).
Los experimentos representados en la Figura 2A muestran que cuando se incorpora en una bicapa lipídica, el canal de A� funciona entre múltiples niveles de conductancia. Un canal es responsable de los múltiples niveles de conductancia y cada canal incorporado puede mostrar un patrón diferente de transiciones de conductancia, como se ha descrito en otros documentos (Arispe et al., 1993; Arispe, 2004). El inserto de la Figura 2A muestra que se pueden observar diferentes saltos de corriente a diferentes niveles, 1,46, 2,92, 5,03, 10,17 pA. La adición de Ni2+, que se coordina con el imidazol con una alta afinidad, y del imidazol, que tiene preferencia por tener una interacción interplanar con otros residuos aromáticos, bloquea la actividad de la corriente de los canales de A incorporados a las bicapas lipídicas. Tras aparecer estable durante varios minutos la corriente iónica que pasa a través de los canales de A incorporados, se añadió bien Ni2+ o imidazol a la cámara experimental. Los registros de corriente de la figura muestran 8 segundos de actividad desde los canales de A�, mantenidos a potencial de membrana cero, antes (control) y varios segundos después de exponer los canales bien a Ni2+ (Figura 2A) o a imidazol (Figura 2C). La actividad del canal se redujo lentamente hasta un nivel no detectable, lo que sugiere un bloqueo completo del canal. El bloqueo tanto por parte de Ni2+ (no mostrado) como por el imidazol (registro inferior de la Figura 2C) fue irreversible, pues los canales permanecieron completamente bloqueados tras lavar la cámara. Se elaboraron histogramas de amplitud de las corrientes durante los mismos intervalos de tiempo de la actividad del canal antes y a diferentes momentos después de la adición de los compuestos de prueba, y se muestran en las gráficas de la derecha, Figura 2, B y D. Los histogramas muestran que tanto el Ni2+ como el imidazol son eficaces suprimiendo rápidamente el número de observaciones de los valores de corriente máxima más frecuentes (0,8; 3,2; 5,2; 7,5 y 10 pA).
El bloqueo altamente eficaz de los canales de A� observado en los experimentos de la presente invención tras la aplicación bien de níquel (Ni2+) o de imidazol refuerza la hipótesis de que la His de las subunidades de A de los canales de A� son los residuos participantes. La información recogida en el Banco de Datos de Proteínas revela que entre los residuos aromáticos, se pueden encontrar His en diversos entornos químicos en estructuras proteicas, a veces, comportándose como un residuo aromático o como un ligando de metales y, en otras ocasiones, formando puentes salinos con grupos ácidos (Bhattacharyya et al., 2003). La interacción entre His y Ni2+ es tan fuerte que la etiqueta de His es la etiqueta más usada a nivel mundial en la purificación preparativa de proteínas. La cromatografía de afinidad de metales inmovilizados, que se usa para purificar proteínas marcadas con His, aprovecha capacidad de His para unirse a iones de metales de transición quelados, demostrando el Ni2+ ser, en general, mejor para los iones de metales. La interacción competitiva es el procedimiento más comúnmente usado para recuperar fracciones de proteínas purificadas. El imidazol interactúa competitivamente con los iones de Ni2+ inmovilizados para invertir la unión de la proteína.
A excepción del níquel, los compuestos encontrados en la presente investigación como eficaces para el bloqueo de los canales de A� fueron residuos aromáticos que contenían el anillo de imidazol heteroaromático. Como resto heteroaromático, el imidazol puede interactuar con otros grupos aromáticos y no polares, pues puede existir en forma neutra o cargada positivamente al pH fisiológico. Además, el imidazol puede formar los enlaces de hidrógeno más conspicuos con residuos polares o residuos cargados (tanto negativos como positivos) (Scheiner et al., 2002; Saha et al., 2005). En función del estado de protonación, el imidazol también puede participar en los puentes salinos con los grupos ácidos. Por estas razones, se espera la posibilidad del establecimiento de interacciones eficaces entre los compuestos que contienen imidazol que bloquean los canales de A� y los residuos de His6, His13, His14, Glu22 y Lys28 cargados de las subunidades de A� del canal de A�. Sin embargo, entre los residuos cargados de la secuencia de las subunidades de A�, His es el único residuo aromático y el candidato más propenso a portar las interacciones geométricas cara a cara preferidas con el imidazol (Bhattacharyya et al., 2003). El imidazol es un anillo planar de cinco miembros que consiste en un electrón n del átomo =N-, uno de cada átomo de carbono, y dos del nitrógeno de NH. Esta estructura de resonancia convierte al imidazol en un excelente nucleófilo que sería atraído hacia una forma completa o parcialmente cargada positivamente de la His de las subunidades de A de los canales de A�. Por lo tanto, la propensión del imidazol a interactuar con los residuos de His supera ampliamente la propensión de interactuar con otros residuos cargados, tales como Lys o Glu, de la subunidad de A� (Bhattacharyya et al., 2003; Saha et al., 2005; Chakrabarti y Bhattacharyya, 2007).
En el caso de los compuestos relacionados con His en los que se ha analizado el bloqueo del canal de A , se observó un aumento notable en la eficacia del bloqueo, porque los compuestos bloqueadores poseen más cadenas laterales de imidazol reactivas disponibles. Por el contrario, NAHIS02, que se comportó como un bloqueador muy eficiente, no sólo perdió su capacidad para bloquear los canales de A , sino que además se volvió ineficaz en la protección contra la citotoxicidad de A� al perturbarse las cadenas laterales de imidazol mediante metilación. Un gran número de estudios ha tratado el tema de la interacción aromática-aromática en proteínas. La amplia mayoría de los agentes medicinales contienen sustituyentes aromáticos y su reconocimiento diferencial por parte de proteínas tiende a verse facilitado por las interacciones no covalentes en las que participan residuos aromáticos (Gilman et al., 1993). Entre los residuos aromáticos, His es el más propenso a interactuar con grupos planares, y forma una clase diferente separada del resto de tipos de residuos (Saha et al., 2005; Chakrabarti y Bhattacharyya, 2007).
Ejemplo 2: NAHIS01 es más eficaz en el bloque del canal que His sin modificar
Para estudiar la contribución del anillo de imidazol en la interacción de la His con el canal iónico de A�, se ha investigado la eficacia en el bloqueo del canal de una His con casquete terminal modificada (NAHIS01), comparándola con la eficacia en el bloqueo de la His libre de terminales amino y carboxilo sin modificar. La His con casquete terminal, con el grupo carboxilo y amino amidado y acetilado respectivamente, dejaría la cadena lateral de imidazol como el único grupo disponible para la interacción con otros grupos reactivos del canal de A�.
La actividad de la corriente desde los canales de A� ilustrada en la Figura 3 indica que tanto NAHIS01 de His sin modificar como de His modificada afecta a los picos de corriente iónica de un canal de A que está incorporado a una bicapa lipídica. Los registros de corriente de la Figura 3, A y C, y los histogramas de amplitud de la corriente de la Figura 3, B y D, muestran que la His sin modificar reduce levemente la actividad del canal de A y es relativamente ineficaz en la producción de un bloqueo completo irreversible de los canales de A . Los picos de corriente iónica correspondientes a una mayor conductancia de los canales (5,8 y 4,2 pA) se bloquean de una manera dependiente de la concentración, pero los picos de corriente más bajos permanecen inalterables a la concentración de His más elevada. Como se muestra en la Figura 3, C y D, aunque el NAHIS01 de His modificada no funciona como un bloqueador completo de los canales, redujo de manera más eficaz la actividad del canal de A a concentraciones más bajas.
Este ejemplo muestra que la eficacia para bloquear el canal de A por parte del aminoácido His se mejora cuando los extremos libres de His se modifican por amidación y acetilación de los grupos carboxilo y amino respectivamente. Esta modificación, además de volver al péptido resistente a la degradación por las proteasas, reduce la reactividad inespecífica del péptido. La interpretación de los presentes inventores sobre la mejora de la eficacia del bloqueo de NAHIS01 en comparación con la His libre de extremos es que en la His sin modificar, además de la cadena lateral de imidazol, los extremos libres aumentan la posibilidad de His para interactuar inespecíficamente con cualquier otro residuo reactivo presente en las subunidades de A del canal de A�. Por lo tanto, las interacciones inespecíficas con otras regiones de A� reducen la probabilidad de interacciones específicas con His que forman la trayectoria de conductancia iónica del canal de A . Cuando se coloca un casquete los extremos de His y no pueden reaccionar químicamente, como ocurre en el caso de NAHIS01, la reactividad de His se restringe a la interacción específica que se puede establecer por parte de su cadena lateral de imidazol. Así pues, aumentará la probabilidad de las interacciones aromáticas entre el imidazol excepcionalmente nucleófilo de la His con casquetes terminales y la cadena lateral de imidazol de la His que participa en el canal de A . Se cree que el aumento de eficacia de NAHIS01 con casquetes terminales en comparación con la His libre de extremos como bloqueador de los canales de A prueba además el concepto de que la interacción aromática entre las cadenas laterales de imidazol contribuye al bloqueo de los canales de A�.
Ejemplo 3: La eficacia de bloqueo del canal de A de los compuestos relacionados con la His aumenta con el número de cadenas laterales de imidazol
En los experimentos anteriores, se ha demostrado que NAHIS01, en el que el imidazol es el único grupo disponible para la interacción, es muy eficaz en el bloqueo del canal iónico de A . Se ha estudiado la capacidad de dos compuestos relacionados con His, NAHIS02 y NAHIS04, para bloquear los canales de A�. NAHIS02 y NAHIS04 también están compuestos de histidinas con casquete terminal con el grupo carboxilo y amino de las histidinas terminales amidado y acetilado respectivamente. Esto dejaría dos (NAHIS02) y cuatro (NAHIS04) cadenas laterales de imidazol como los únicos grupos disponibles para la interacción con otros grupos reactivos en el canal de A .
En la Figura 4, se ilustran los registros de corriente y los histogramas de la amplitud de la corriente de los canales de A� antes y después de la exposición a los dos compuestos relacionados con His. Durante el registro de la corriente, se mantuvo la bicapa a un potencial de membrana cero. Los registros de la corriente de la Figura 4, A y C, muestran que ambos compuestos bloquean eficazmente las múltiples conductancias presentadas por los canales de A�. Sin embargo, una de las observaciones que se pueden distinguir es una aparente afinidad más elevada por NAHIS04 para el canal que permaneció completamente bloqueado tras lavar la cámara. El registro de corriente más baja de la Figura 4C muestra que NAHIS04, que posee cuatro cadenas laterales de imidazol, es el más eficaz en el bloqueo irreversible de la actividad de los canales de A�. El registro de corriente inferior de la Figura 4A muestra cierta recuperación de la actividad del canal tras retirar mediante lavado el NAHIS02. No se observó ningún efecto del potencial de membrana en la capacidad de bloqueo de estos compuestos (no mostrado). Los presentes inventores ya han publicado que el nivel del potencial de membrana no tiene efecto en la capacidad de compuestos relacionados con His similares para bloquear el canal de A� (Arispe, 2004). Los histogramas de amplitud de la corriente de la Figura 4, B y D, muestran una reducción gradual del número de picos de corriente tras exponer los canales de A a cualquiera de estos compuestos relacionados con His. Los resultados revelan que el número de cadenas laterales de imidazol de los compuestos bloqueadores tiene una influencia sustancial en su eficacia para bloquear la conductancia de los canales de A�. El experimento ilustrado en la Figura 4C muestra que NAHIS04 (16,66IM), que posee cuatro cadenas laterales de imidazol, redujo la actividad de los canales de A� a aberturas ocasionales de los canales sólo 20 s después de la adición. Por el contrario, la misma concentración de NAHIS02, que posee dos grupos imidazol, requiere varios minutos para producir niveles similares de bloqueo del canal.
La contribución de las cadenas laterales de imidazol de los compuestos relacionados con His para bloquear la actividad de los canales de A� se verificó con los experimentos mostrados en la Figura 5. En estos experimentos, se estudió la eficacia de los compuestos coordinadores de His y relacionados con His en términos del tiempo necesario para bloquear las corrientes de los canales de A . El registro de corriente superior de la Figura 5A muestra el transcurso en el tiempo de la actividad del canal de A antes y después de la adición del bloqueador de canales NAHIS02. El registro de la corriente inferior muestra la actividad de los canales a partir de un experimento similar en el que se añadieron concentraciones crecientes de un NAHIS02 modificado, NAHIS02-(n-Met). NAHIS02-(n-Met) es un NAHIS02 modificado en el que las cadenas laterales de imidazol están metiladas. El NAHIS02 sin modificar, a 16,66IM, bloquea totalmente la actividad de los canales de A en menos de tres minutos. Por el contrario, NAHIS02-(n-Met) es incapaz de bloquear la actividad de los canales de A� incluso a una concentración cuatro veces superior, lo que indica que la metilación de los grupos imidazol reduce la afinidad de NAHIS02 por la molécula A y, por consiguiente, la capacidad para bloquear el canal de A �. Cuando los canales de A� se incorporan a membranas artificiales, forman sistemas de múltiples conductancias. Esto se manifiesta por una conductancia frecuentemente fluctuante entre niveles específicos. Para evaluar comparativamente la fuerza de bloqueo de los compuestos de prueba en términos del tiempo que necesitan para detener la actividad de los canales de A , se realizaron experimentos similares a los mostrados en la Figura 5A con cada uno de los compuestos de prueba. Los resultados se analizaron mediante un procedimiento alternativo que cuantifica la corriente iónica total que fluye a través del canal de A� incorporado a la membrana lipídica artificial en cualquier momento dado. Para este propósito, se integró la corriente iónica total que fluía a través de la membrana y se calculó la media de la cantidad de carga conducida en intervalos de tiempo consecutivos de 8 ms de duración. La integración se inició cuando el canal incorporado hubo alcanzado una actividad estable y también tras la adición de los compuestos de prueba. La gráfica de la izquierda de la Figura 5B muestra que el imidazol es sumamente eficaz en bloquear de manera inmediata (30 s) el flujo de cargas iónicas, al contrario que His, que actuó muy lentamente y casi no tuvo capacidad de bloqueo del canal. Los iones de Ni2+, como también se muestran en la Figura 2A, bloquearon completamente el canal de A en unos cuantos segundos (120 s). La gráfica de la derecha de la Figura 5B muestra que la eficacia para detener la actividad del canal de A� de los compuestos relacionados con His parece aumentar a medida que aumenta el número de cadenas laterales de imidazol del compuesto relacionado con His. Por tanto, NAHIS04, que tiene cuatro cadenas laterales de imidazol, reduce el flujo de cargas iónicas a través de la membrana en un 50% en 15 s. Este efecto reductor es ocho veces más rápido en comparación con los 125 s que necesita NAHIS02, que tiene dos cadenas laterales de imidazol, para alcanzar el mismo nivel de reducción. Por el contrario, NAHIS01, que sólo tiene una cadena lateral de imidazol, no evita por completo el flujo de las cargas iónicas y NAHIS02-(n-Met), del que se retira la reactividad del imidazol mediante metilación, no mostró capacidad de bloqueo.
Ejemplo 4: La protección de las células contra la citotoxicidad de A� es más eficaz al aumentar el número de grupos imidazol del bloqueador del canal de A�
Cultivo de células: se cultivaron células PC12, obtenidas de un feocromocitoma de rata transplantable (ATCC n.º
CRL 1721) en el medio de la ATCC recomendado. Se cultivaron cultivos primarios de neuronas de hipocampo y corticales de cerebros de rata P18-P21 en medio neurobasal/B27 (GIBCO). Para la preparación de las neuronas, se anestesiaron ratas preñadas, que luego fueron matadas para extraer los fetos. Para evitar el dolor, los animales fueron anestesiados según las recomendaciones del Informe de la Asociación Estadounidense de Medicina Veterinaria sobre Eutanasia del 2000. Se diseccionaron los cerebros de los fetos y se prepararon los cultivos de las células neuronales según un protocolo previamente descrito (Simakova y Arispe, 2006).
Análisis de la viabilidad celular: se evaluó el porcentaje de las células protegidas contra la muerte celular inducida por A� mediante diversos tratamientos por medio de un análisis de XTT colorométrico (Kit de proliferación celular II, Roche, Mannheim, Alemania). También se midió directamente la citotoxicidad mediante la liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH) desde el citosol en los medios (Kit de detección de la citotoxicidad (LDH), Roche, Mannheim, Alemania).
Los presentes inventores han demostrado previamente que es posible prevenir la citotoxicidad de A cuando se incuban células en medios que contienen bloqueadores de los canales de A (Simakova y Arispe, 2006; Arispe et al., 2007; Tickler et al., 2005). Como el Ni2+, el imidazol, la histidina y los compuestos relacionados con His afectan, en diferentes grados, a los canales de A� incorporados a membranas artificiales, se examinó la capacidad y la fuerza relativa de estos compuestos para proteger las células de la muerte celular inducida por el péptido A�. La viabilidadcelular se examinó mediante dos análisis diferentes. Éstos fueron el análisis de XTT colorimétrico, que cuantifica las células metabolitamente activas, y el análisis que mide la liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH) desde el citosol en los medios, que evalúa la integridad de la membrana celular. Las gráficas de la Figura 6 muestran la viabilidad de células PC12 (A y B), y de neuronas corticales (C y D) y del hipocampo (E y F) observada tras tres días de incubación en presencia de péptido A (5μM) y de péptido A� (5μM) más Ni2+, imidazol o histidina. Las gráficas de la izquierda (A, C y E) muestran los resultados del análisis de XTT expresados como un porcentaje de la citotoxicidad, y las gráficas de la derecha (B, D y F) muestran los resultados de las mediciones de la LDH liberada por las células en los medios expresados como un porcentaje de la protección de las células. El rendimiento del imidazol, del Ni2+ y de la His para mantener la viabilidad celular y proteger las células de la muerte celular inducida por el péptido A� guarda una gran correlación con lo que cabría esperar por sus efectos mostrados sobre la corriente iónica que fluye a través de los canales de A incorporados a las membranas artificiales. Se descubrió que el imidazol y el Ni2+ protegen completamente las células frente a la citotoxicidad de A�, pero el Ni2+ mostró una toxicidad dependiente de las células a concentraciones elevadas. Por otro lado, His, que redujo suavemente la actividad de los canales de A , tuvo un mal rendimiento en la protección de las células contra la toxicidad de A .
Las gráficas de la Figura 7 muestran la viabilidad de células PC12 (A y B), y de neuronas corticales (C y D) y del hipocampo (E y F) observada tras tres días de incubación en presencia de péptido A (5μM) y de péptido A� (5μM) más los compuestos relacionados con His NAHIS01, NAHIS02, NAHIS02-(n-Met) o NAHIS04. Las gráficas de la izquierda (A, C y E) muestran los resultados del análisis de XTT como el porcentaje de la citotoxicidad, y las gráficas de la derecha (B, D y F) muestran los resultados de las medidas de la liberación de LDH en los medios como un porcentaje de la protección de las células. El rendimiento de los compuestos relacionados con His para proteger a las células de la muerte celular inducida por el péptido A� también guarda una gran correlación con lo que cabría esperar por sus efectos mostrados sobre la corriente iónica que fluye a través de los canales de A� incorporados a las membranas artificiales. NAHIS02 y NAHIS04 protegió completamente los tres tipos de células diferentes contra A�. NAHIS01, que no bloqueó completamente los canales de A en las membranas artificiales (véase la Figura 4) mostró una protección parcial. El nivel de protección para todos estos compuestos guardó correlación con el número de cadenas laterales de imidazol de estos compuestos. Por ejemplo, la concentración necesaria para conseguir una protección del 50% (concentración eficaz máxima media, CE50) para los tres tipos diferentes de células para los compuestos NAHIS02 y NAHIS04 resultó estar siempre por debajo de 1IM. La CE50 para el imidazol fue de entre 2 y 3IM (véase la Figura 7). El compuesto NAHIS02-(n-Met) fue muy ineficaz en la protección contra la citotoxicidad del péptido A�. La leve protección observada con este compuesto dependía del tipo de célula y siempre se estabilizó a concentraciones mucho más altas que las observadas con la forma desmetilada. La metilación completa de NAHIS02-(n-Met) nunca se alcanza durante el procedimiento de síntesis. Por lo tanto, se espera que los resultados puedan mostrar una protección leve. Sin embargo, la pérdida de protección sugiere con firmeza que la metilación está afectando al sitio de la molécula que interactúa con el canal de A�.
Los ejemplos descritos en la presente memoria muestran que el bloqueo de los canales de A protege a las células contra la citotoxicidad de A�. La eficacia de los compuestos coordinadores de His para proteger a las células de la citotoxicidad de A� se analizó en tres tipos diferentes de células. En otros estudios, la conservación de la viabilidad de las células observada en los casos en los que se usaron bloqueadores de los canales de A específicos en combinación con A� confirmó la participación de los canales de A� en la citotoxicidad de A� (Diaz et al., 2006; Simakova y Arispe, 2006). Los compuestos con los que se observó un bloqueo total de los canales de A incorporados a membranas artificiales también se encontraron ineficaces en la conservación de la viabilidad celular durante la exposición al péptido A tóxico. Se obtuvieron resultados de tres tipos de células diferentes mediante la aplicación de dos análisis de viabilidad diferentes. Se ha demostrado que la interacción entre los péptidos A� y la membrana de la superficie celular está seguida de la activación de una cascada de señalización intracelular que conduce a la muerte de las células mediante apoptosis (Loo et al., 1993). El descubrimiento de que los bloqueadores de los canales de A evitan completamente la muerte celular corrobora la formación de canales iónicos de A� como la etapa inicial en los cambios asociados con la apoptosis inducida por A (Simakova y Arispe, 2006), y sugiere que la formación de los canales es el mecanismo principal mediante el cual el A ejerce su toxicidad. Además, los datos mostrados en la presente memoria confirman que la exposición de las células a A da como resultado la formación de agregados de A oligoméricos que ensamblan los canales de A cuando interactúan con la membrana de la superficie celular. Esta es la primera etapa de la cascada de señalización que conduce a la muerte celular. Los resultados de la aplicación de los análisis de viabilidad sobre los tres tipos diferentes de células muestran que la eficacia de los compuestos relacionados con His para proteger a las células contra la citotoxicidad de A� guarda correlación con la intensidad de las interacciones con los residuos de His en el canal de A . Mediante el aumento del número de cadenas laterales de imidazol reactivas en el compuesto bloqueador, también se aumentó la capacidad de bloqueo de los canales de A activos incorporados a las membranas de las células. Los resultados de la presente invención obtenidos en las células cultivadas demostraron que la eficacia de bloqueo de los bloqueadores de los canales de A relacionados con la His se mejoró hasta valores de CE50 inferiores a los niveles micromolares, como ocurrió para los bloqueadores NAHIS02 y NAHIS04. Esto representa una mejora considerable en comparación con el efecto bloqueador obtenido con los bloqueadores de canales de A� previamente publicados (Arispe, 2004; Arispe et al., 2007; Diaz et al., 2006).
Ejemplo 5: NAHIS04 es más eficaz en la protección de células contra la citotoxidad de A� que NA4 y NA7
Estudios previos han demostrado que los fragmentos peptídicos nativos del polipéptido A , NA4 (SEC ID N.º 3) y NA7 (SEC ID N.º 4) pueden bloquear la actividad de los canales de A� y proteger las células contra la citotoxicidad de A�. En este ejemplo, NAHIS04, compuesto por histidinas con casquetes terminales, se comparó con NA4 y NA7, ambos de los cuales carecían de casquete y no tenían histidinas modificadas. Se examinó la viabilidad celular usando el análisis que mide la liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH) desde el citosol en los medios, que evalúa la integridad de la membrana celular. La Figura 8A muestra la viabilidad de las células PC12 observada tras tres días de incubación en presencia de NA4, NA7 o NAHIS04. El compuesto relacionado con His con las histidinas modificadas, NAHIS04, mostró una mejor protección de las células. La concentración necesitó que la protección del 50% (concentración eficaz máxima media, CE50) para NAHIS04 fuera menor de 1IM (gráfica B). También fue entre 2-3 veces mayor que la CE50 bien para NA4 o para NA7. Este ejemplo muestra que NAHIS04 es capaz de proteger las células contra la citotoxicidad inducida por A� a concentraciones mucho menores que bien NA4 o NA7.
Ejemplo 6: NAHIS02 pierde la capacidad de bloquear el aumento del calcio intracelular inducido por A y proteger las células contra A� tras la metilación del imidazol de sus residuos de histidina.
Mediciones del calcio libre intracelular: se sembraron células sobre placas de cubierta de vidrio revestidas de poli-L-lisina y se cargaron con sonda sensible al calcio FURA-2AM 2IM (Molecular Probes) en tampón de incubación (NaCl 135mM, KCl 5mM, CaCl2 2,5mM, MgCl2 1,2mM; glucosa 10mM, HEPES 10mM, pH 7,4). Tras 30 min de periodo de carga, se trataron las células con A (7,66IM). Se observó el transcurso en el tiempo de los cambios en la emisión de FURA-2AM usando un microscopio invertido con contraste de fases/epifluorescencia dotado de una cámara CCD integradora de bajo nivel luminoso + ensamblaje microfotométrico (InCy I/P-2 Imaging & Photometry System, Intracellular Imaging INC).
Metodología de la bicapa lipídica planar y preparación de los proteoliposomas: los experimentos se realizaron según lo descrito anteriormente a excepción de que la suspensión de palmitoiloleil-fosfatidilserina y palmitoiloleil-fosfatidiletanolamina se aplicó en un orificio de aproximadamente 80-100 Im de diámetro con una película de Teflón separando dos compartimentos. Además, se mezcló la suspensión de liposomas (50 μl) con una solución acuosa madre de péptido A� 40 (1 mg/ml, obtenido en Invitrogen, Carlsbad, CA).
Citotoxicidad de AI: se midió la viabilidad de las células PC12 tras su exposición a A� 40 durante 24 h usando un análisis de XTT colorimétrico (kit de proliferación celular II, Roche, Mannheim, Alemania). Se usó la liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH) desde el citosol en los medios para publicar la integridad de la membrana celular (Kit de detección de la citotoxicidad-LDH, Roche, Mannheim, Alemania).
Para determinar si los grupos imidazol de los residuos de histidina eran responsables de la capacidad de los compuestos relacionados con His para proteger las células frente a la citotoxicidad de A , se tomaron mediciones del calcio libre intracelular antes y después de la adición bien de NAHIS02 (grupos imidazol desmetilados) o NAHIS02-(n-Met) (grupos imidazol metilados). Se realizó un experimento de 15 minutos de duración del cambio del calcio libre intracelular es seis células PC12 cargadas con FURA-2AM antes y después de la adición de A (7,66IM) y A� + compuesto relacionado con His (16,66IM). La Figura 9 muestra que el compuesto NAHIS02 tiene la capacidad de bloquear el aumento del calcio intracelular inducido por A (gráfica A), mientras que NAHIS02-(n-Met) ha perdido esta capacidad. Por lo tanto, este resultado sugiere que la capacidad de los compuestos relacionados con His para proteger las células frente a la citotoxicidad de A se debe a los grupos imidazol de los residuos de histidina.
Para dar más validez a estos resultados, se determinó la viabilidad celular en presencia bien de NAHIS02 o de NAHIS02-(n-Met) usando el análisis de LDH para evaluar la integridad de la membrana celular. La Figura 10 muestra que NAHIS02-(n-Met) no protegió las células contra A� como se observa para NAHIS02.
Ejemplo 7: Bloqueo de la dependencia de la concentración de la respuesta del calcio intracelular inducida por A por parte del bloqueador de canales de A� NAHIS04
Los experimentos de este Ejemplo se realizaron para determinar si había un bloqueo de la dependencia de la concentración de la respuesta del calcio intracelular inducida por A por parte de NAHIS04. Se observó cómo transcurrió en el tiempo el cambio del calcio libre intracelular en células PC12 cargadas con FURA-2AM antes y después de la adición de A� (7,66IM) a medios que contenían diferentes concentraciones de NAHIS04. La Figura 11 ilustra que la concentración del bloqueador del canal de A es importante y que la concentración más eficaz de NAHIS04 para el bloqueo tuvo lugar a > 5IM.
Ejemplo 8: Mecanismo propuesto para el bloqueo de los canales iónicos de A por parte de los compuestos relacionados con la His
La estructura anular de tipo canal de los oligómeros A , como se ha observado mediante microscopía electrónica, (Lashuel et al., 2002) y mediante microscopía de fuerza atómica (MFA) (Quist et al., 2005; Lal et al, 2007) sugiere que para formar un canal de A�, las subunidades de A� se ensamblan en una estructura transmembrana polimérica. En base a esta estructura, se ha diseñado una serie de modelos teóricos para crear las diferentes formas en las que los oligómeros de A se ensamblan formando los canales iónicos cuando se incorporan a una membrana lipídica (Durrell et al., 1994; Jang et al., 2007; Jang et al., 2008). Los modelos desarrollados más recientemente, que ilustran la estructura fragmentada del canal de A en una topología anular, siguieron simulaciones dinámicas moleculares basadas en los datos de resonancia magnética nuclear de los oligómeros y el uso del motivo en forma de U (filamento-vuelta-filamento) universal para A 17-42 truncado (Jang et al, 2007; Jang et al., 2008). Aunque estos modelos no incluyen los 16 primeros residuos de las subunidades de A , que contienen los residuos de His, las cadenas laterales cargadas negativamente de Glu22 se disponen circularmente en el poro, induciendo a un anillo catiónico mediante la unión de cationes tales como Mg2+, Ca2+, K- y Zn2+ (Jang et al., 2007; Jang et al., 2008). Los primeros modelos se desarrollaron en base a cálculos de mínima energía y suponen que los canales se forman a partir de un ensamblaje de subunidades de A dispuestas simétricamente alrededor del eje de un poro revestido de una disposición anfipática de residuos de carga alterna. En este caso, los modelos resultantes presentan anillos de residuos de His13 y His14 de la molécula A� en torno a la entrada del poro putativo (Durrell et al., 1994). Si no están protonados todos las His, esta disposición anular modelizará poros con una carga negativa neta para explicar la selectividad catiónica de los canales de A�. Los modelos teóricos para A� 17-42 truncado incluyen los residuos cargados Glu22 y Lys28 de la subunidad de A�. El modelo antiguo sobre motivos energéticos para A 1-40 de longitud completa incluye la adición de los residuos His6, His13 y His14 cargados. Aunque la simulación dinámica molecular reproduce satisfactoriamente las dimensiones, las formas y la organización de las subunidades de los canales de A� observadas con MFA (Quist et al., 2005; Lal et al., 2007), los resultados obtenidos mediante el uso de bloqueadores de los canales de A� que contienen His se podrían explicar mejor mediante un modelo que representara la subunidad de A de longitud completa. Dicho modelo debe incluir residuos de His además de los residuos cargados de Glu22 y Lys28. Hay ejemplos del extremo amino de la cadena lateral de Lys y la cadena lateral ácida de Glu que interactúan con residuos de His. Sin embargo, His prefiere interactuar en la orientación apilada cara a cara con los anillos de His (Bhattacharyya et al., 2003; Saha et al., 2005). Se especula que esto puede proporcionar estabilidad al ensamblaje de las subunidades de A� en una estructura de canales transmembrana poliméricos. A este respecto, la interrupción de esta interacción His-His puede evitar el funcionamiento de los canales de A . Experimentos recientes demostraron que la perturbación del puente de hidrógeno de las cadenas laterales de imidazol de los residuos de His de A� mediante metilación selectiva evita la formación de puentes de His y suprime la neurotoxicidad de A� (Tickler et al., 2005).
La adición de los compuestos de capacidad de coordinación de His conocida, tales como Ni2+, imidazol, His y una serie de compuestos relacionados con His, al canal de A incorporado a membranas demuestra que los residuos de His ubicados en la ramificación N-terminal de la secuencia del péptido A son esenciales para formar la estructura funcional que constituye el filtro de selectividad y la trayectoria de los iones del canal de A�. Para alcanzar la característica funcional de los canales de A , los modelos teóricos, construidos para crear las diferentes formas en las que los oligómeros de A se ensamblan para formar canales iónicos, tienen que incluir el segmento del péptido A que contiene los residuos de His cargados.
La Figura 12 ilustra el mecanismo propuesto para el bloqueo de los canales iónicos de A por parte de los compuestos relacionados con la His tratados en la presente memoria. La gráfica A ilustra los agregados oligoméricos de las unidades de A que forman un canal iónico en la membrana celular. La gráfica B muestra una unidad de A con His13 y His14 marcados. La gráfica C representa el bloqueo del canal iónico mediante las interacciones entre los grupos imidazol de His o los compuestos relacionados con His.
Ejemplo 9: La colocación de un casquete en los extremos carboxilo y amino libres de NA4 mejora su eficacia en el bloqueo del canal de A�
En el Ejemplo 5, se observó que NA4 no fue tan eficaz en el bloqueo del canal de A como NAHIS04, que tenía los extremos carboxilo y amino de sus residuos His modificados (Figura 8). En este ejemplo, se volvió a comparar NA4 con NAHIS04, así como con una versión modificada de NA4, NA4mod, con residuos de His con casquete terminal. Como ocurre con otros residuos de His con casquete terminal, NA4mod tenía el grupo carboxilo y amino de sus residuos de His amidado y acetilado respectivamente, dejando las cadenas laterales de imidazol como los únicos grupos disponibles para la interacción con otros grupos reactivos del canal de A . Como se muestra en la Figura 13 en un análisis de la viabilidad celular, la colocación de un casquete en los extremos carboxilo y amino libres de NA4 mejora significativamente su eficacia en el bloqueo del canal de A . De hecho, el porcentaje de protección es similar a la protección mostrada por NAHIS04, que también tiene residuos de His con casquete terminal.
Los resultados descritos en la presente investigación demuestran que los compuestos coordinadores de His y relacionados con His pueden bloquear eficazmente los canales de A� incorporados a membranas artificiales y que también pueden evitar completamente la citotoxicidad de A� producida mediante la incorporación de canales de A a la membrana de la superficie celular. Por lo tanto, estos datos se interpretan para reforzar la hipótesis de que los residuos de His de la secuencia del canal de A están en la trayectoria del flujo iónico y contribuyen a definir la selectividad del canal iónico. Además, los datos confirman la contribución del canal de A a la citotoxicidad de A .
Los resultados de la investigación presentados en la presente memoria indican que el bloqueo de los canales de A por parte de compuestos con una capacidad de coordinación de la His conocida, tales como Ni2+ e imidazol, se produce mediante la interacción con los residuos de His ubicados en la trayectoria de los iones del canal de A . Esta conclusión se refuerza mediante el aumento de la eficacia de bloqueo observado tras aumentar el número de cadenas laterales reactivas de imidazol en los compuestos relacionados con His. Además, se ha observado que la perturbación del enlace de las cadenas laterales de imidazol mediante la metilación selectiva, que evita la interacción interplanar del imidazol con los residuos aromáticos de His, suprime la actividad de la corriente y la neurotoxicidad de los canales de
A�.
Referencias
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Listado de secuencias
SEC ID N.º1 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
SEC ID N.º 2 [NAHIS04] Ac-HHHH-CONH2
SEC ID N.º 3 [NA4] SGYEVHH
SEC ID N.º 4 [NA7] EVHHQKL
SEC ID N.º 5 [NA4 modificado] Ac-SGYEVHH-CONH2

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición que comprende un compuesto que tiene la fórmula:
    en las que Ac es un grupo acetilo.
  2. 2.
    La composición de la reivindicación 1, en la que el compuesto tiene la fórmula:
  3. 3.
    La composición de la reivindicación 1, en la que el compuesto tiene la fórmula:
  4. 4. Una composición para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, composición que comprende un 10 compuesto de fórmula:
    en las que Ac es un grupo acetilo.
  5. 5.
    La composición para el uso de la reivindicación 4, en la que el compuesto tiene la fórmula:
  6. 6.
    La composición para el uso de la reivindicación 4, en la que el compuesto tiene la fórmula:
  7. 7.
    La composición para el uso de la reivindicación 4, en la que el compuesto tiene la fórmula:
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