ES2393016T3 - Método para la detección y cuantificación de mycobacterium avium subespecie para tuberculosis basándose en reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real - Google Patents

Método para la detección y cuantificación de mycobacterium avium subespecie para tuberculosis basándose en reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real Download PDF

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Abstract

Método para la detección y cuantificación de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis mediantedos reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real competitivas, cada una con su propio control deamplificación interno, que se caracteriza por el hecho de que la detección y cuantificación deMycobacterium avium subespecie paratuberculosis se realiza mediante dos sistemas de reacciones encadena de la polimerasa en tiempo real independientes, que detectan dos locus específicos paraMycobacterium avium subespecie paratuberculosis: IS900 y F57, respectivamente, usando cebadores ysondas de hidrolización que tienen las siguientes secuencias.

Description

Método para la detección y cuantificación de mycobacterium avium subespecie paratuberculosis basándose en reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.
Area tecnica
La invención se refiere a un método de detección y cuantificación de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real). Específicamente, son dos sistemas de PCR en tiempo real independientes, que detectan dos locus IS900 y F57, respectivamente específicos para MAP.
Estado presente de la tecnica
MAP es una bacteria parásita intracelular, que es el agente causante de una enfermedad inflamatoria crónica de los intestinos de los rumiantes denominada paratuberculosis o enfermedad de Johne. Los animales infectados padecen diarrea crónica y pérdida de peso gradual. La paratuberculosis en rumiantes se caracteriza por un tiempo de incubación largo y una amplia variabilidad individual en las fases preclínica y clínica del desarrollo de la enfermedad (Ayele et al., 2001).
En rumiantes, MAP se propaga sobre todo a través de las heces, el esperma y la leche. MAP está presente en la leche y los productos lácteos pueden convertirse en vectores posibles de MAP para el hombre y por tanto son importantes desde un aspecto de seguridad alimentaria (Grant, 2006). Las micobacterias son relativamente resistentes a diferentes temperaturas y se han detectado mediante cultivo en leche pasteurizada a 71 y 72ºC (Ayele et al., 2005).
MAP se considera como uno de los posibles agentes causantes de la enfermedad de Crohn en seres humanos, que también se manifiesta mediante enfermedad inflamatoria del tubo digestivo (Chamberlin et al., 2001; Bull et al., 2003). La etiología exacta de esta enfermedad sigue estando poco clara; sin embargo, se ha aceptado actualmente el modelo de enfermedad autoinmunitaria. Este modelo no supone la presencia de MAP vivo en el organismo del paciente. Este puede ser el motivo por el que no se encontró MAP mediante cultivo en varios pacientes con enfermedad de Crohn, sino que sólo se detectaron los locus específicos mencionados a continuación (Baksh et al., 2004). Partiendo de este aspecto, los niños y los pacientes inmunocomprometidos son los grupos en mayor riesgo (Chamberlin et al., 2001; Hruska et al., 2005).
Las infecciones por MAP se diagnostican en la actualidad mediante varios métodos microbiológicos, inmunológicos y moleculares. La detección en cultivo del agente causante de la paratuberculosis se considera como el “método de referencia” en la actualidad. El crecimiento in vitro a largo plazo de MAP (al menos de 2 a 3 meses) es una desventaja de este método relativamente fiable. Métodos serológicos indirectos basados en la detección de anticuerpos contra el agente causante de la paratuberculosis específicamente en la sangre son específicos y su sensibilidad es baja (Lombard et al., 2006). A menudo se obtienen resultados falsos negativos o reaccionan de manera cruzada con anticuerpos de micobacterias genéticamente relacionadas del entorno. Estos resultados deben confirmarse mediante detección directa de MAP.
Entre los métodos biológicos moleculares, se usan actualmente varios sistemas basados en PCR convencional o “anidada” para la detección directa del agente causante de la paratuberculosis. Dos locus específicos para MAP son los más comúnmente usados para la detección. Se encuentran de doce a 18 copias de la secuencia de inserción IS900 (X16293; Green et al., 1989) en el genoma de MAP (Bull et al., 2000) y se considera como el “método de referencia” para la detección de MAP por medio de PCR. Sólo está presente una copia del elemento genético F57 (X70277) en el genoma de MAP (Poupart et al., 1993). No obstante, es necesaria la confirmación de los resultados obtenidos mediante PCR, especialmente si se usa para diagnóstico rutinario. Habitualmente, es necesario usar hibridación de ácidos nucleicos con sondas específicas, lo que sin embargo hace que el procedimiento completo sea más exigente y que pueda aplicarse sólo para fines experimentales.
Hay varios métodos publicados para la detección de MAP en diferentes materiales disponibles (McKenna et al., 2004; Vasnick et al, 2004; Tasara et al., 2005) que usan las secuencias de IS900 y F57 como dianas para la detección de MAP. Estos sistemas se basan en la PCR convencional o anidada y se requiere que tales enfoques tengan una clase de control externo de la especificidad de producto de PCR. Puede realizarse por ejemplo mediante hibridación con una sonda específica o mediante secuenciación y/o análisis de PCR-RFLP, que requiere mucho tiempo y gastos adicionales (Rodriguez Lazaro et al., 2005).
Se ha empleado recientemente el método de PCR en tiempo real para la detección y posible cuantificación de MAP en material biológico (Kim et al., 2002; O’Mahony y Hill, 2002; Herthnek y Bolske, 2006). Se basa en la visualización de los productos de PCR por medio de tinciones fluorescentes. Sus beneficios son una alta especificidad y sensibilidad. Hasta donde se sabe, se han usado dos estrategias de marcaje fluorescente: (1) incorporación de la tinción fluorescente específica de ADNbc SYBR Green a los productos de PCR recién formados o (2)
oligonucleótidos cortos (sondas de hibridación) que se marcan con tinciones fluorescentes y se encuentran en las zonas amplificadas por los cebadores. Además de los cebadores, garantizan la “especificidad secundaria” en PCR en tiempo real.
El primer enfoque permite la detección de la presencia de MAP en el material analizado y la determinación de la especificidad del producto de PCR sólo según la longitud del producto de PCR basándose en la curva de desnaturalización. Naturalmente, esta evaluación de la especificidad no es específica de secuencia y depende sobre todo del porcentaje de nucleótidos diferentes presentes en el producto de PCR resultante (O’Mahony y Hill, 2002; Rawa y Stanker, 2005). Por tanto, es necesario usar hibridación adicional en la comprobación de la especificidad de secuencia, cuando no puede aplicarse el control de amplificación interno (CAI). Actualmente, el uso de un CAI es necesario para fines de diagnóstico, porque representa la única herramienta para diferenciar las muestras falsas negativas de las verdaderamente negativas. Siempre que la secuencia del segmento amplificado sea única para MAP, el segundo enfoque permite el análisis cualitativo y cuantitativo sin ninguna necesidad de confirmación de la especificidad adicional.
Los tipos de sondas más frecuentemente usados para la detección de MAP son: (1) sonda de hidrolización y (2) sondas de FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia).
Cuando se usan sondas de hidrolización, se digieren mediante la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa durante la amplificación y se libera el fluoróforo. Su ventaja es que pueden aplicarse con cualquier instrumento de PCR en tiempo real disponible. Por otro lado, las sondas de FRET se basan en la hibridación simultánea de dos sondas: una de ellas porta un fluoróforo en su extremo 3’ (donador) y la segunda está marcada con otro fluoróforo (aceptor) en el extremo 5’. La emisión de energía del donador la acepta el aceptor y se mide la longitud de onda de este último. La sonda de FRET puede aplicarse sólo a instrumentos de Roche Diagnostics (O’Mahony y Hill, 2004; Tasara y Stephan, 2005). El uso de cualquier sonda marcada con un fluoróforo diferente que la sonda para la secuencia diana permite la coamplificación de CAI en una reacción de PCR en tiempo real (Rodriguez Lazaro et al., 2005; Brey et al., 2006).
Objeto de la invenci6n
Las desventajas mencionadas anteriormente se eliminan mediante el método de detección y cuantificación de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) mediante dos reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real competitivas (PCR) cada con su propio control de amplificación interno, que se caracteriza por el hecho de que la detección y cuantificación de MAP se realiza mediante dos sistemas de PCR en tiempo real independientes, que detectan dos locus específicos para MAP: IS900 y F57, respectivamente usando cebadores y sondas de hidrolización con las siguientes secuencias:
cebadores para F57
F57qPCRF GCCCATTTCATCGATACCC
F57qPCRR GTACCGAATGTTGTTGTCAC,
la sonda para F57
F57qPCRTM FAM - CAATTCTCAGCTGCAACTCGAACACAC - BHQ,
cebadores para IS900
IS900qPCRF GATGGCCGAAGGAGATTG
IS900qPCRR CACAACCACCTCCGTAACC,
la sonda para IS900
IS900qPCRTM FAM - ATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGT - BHQ,
en el que la sonda para los controles de amplificación internos tiene la siguiente secuencia
IACqPCRTM Cy5 - GGCTCTTCTATGTTCTGACCTTGTTGGA - BHQ.
El método realizado usando los cebadores y sondas enumerados anteriormente se caracteriza adicionalmente por el hecho de que la evaluación de MAP se realiza en cualquier muestra de origen animal, por ejemplo de animales de granja, en muestras clínicas de pacientes humanos, muestras de origen vegetal, muestras del medio ambiente, particularmente fertilizantes, tierra y heno, muestras de hallazgos arqueológicos o muestras de alimentos y piensos.
Los kits para la detección y el diagnóstico de MAP con el método según la invención son también parte del objeto de la invención; se caracterizan por el contenido de todas las sondas y cebadores oligonucleotídicos, que se usan para realizar el método según la invención.
El método según la invención se refiere a dos sistemas de PCR en tiempo real independientes para la detección y cuantificación de MAP en material biológico. Se basan en la amplificación de locus específicos de MAP. El primero se basa en la amplificación de la secuencia de inserción IS900 y el segundo en la amplificación del elemento genético F57. Cada muestra se analiza mediante ambos sistemas. La ventaja es que la positividad de cada muestra se confirma mediante dos reacciones independientes y por tanto se excluye el riesgo de posible falsa positividad. La PCR en tiempo real de IS900 es más sensible; sin embargo, no permite la cuantificación exacta de MAP en las muestras analizadas. Por otro lado, sólo está presente una única copia del elemento genético F57 en el genoma de MAP y por tanto es adecuado para la cuantificación precisa de células de MAP en muestras.
Ambos sistemas de PCR en tiempo real se basan en el uso de sondas de hidrolización marcadas con FAM (6carboxifluoresceína) y por tanto pueden usarse para todos los instrumentos de PCR en tiempo real disponibles sin la necesidad de confirmación de la especificidad adicional.
Ambos sistemas incluyen su propio CAI de plásmido que se basa en PCR competitiva (la secuencia de los cebadores para la secuencia diana IS900 o F57 es idéntica con CAI correspondientes). El uso de sólo un conjunto de cebadores para la amplificación de dos productos de PCR en una reacción de PCR en tiempo real reduce el riesgo de formación de productos de PCR no específicos y la consecuente disminución de la eficacia de la técnica de PCR en el análisis de muestras reales. Las secuencias internas de ambos CAI son idénticas y eso permite el uso de sólo una sonda marcada con Cy5 para CAI en ambos sistemas de PCR. El uso de sólo un conjunto de cebadores para cada reacción de PCR en tiempo real y una sonda para CAI reduce los costes financieros totales de productos químicos necesarios para el análisis.
El protocolo de análisis es idéntico para ambos sistemas de PCR en tiempo real. Es una ventaja en el caso de que se procesen pocas muestras. En un experimento, las mismas muestras pueden analizarse simultáneamente mediante ambos sistemas de PCR en tiempo real, y por tanto los costes financieros y el tiempo necesario para el análisis se reducen notablemente.
Los patrones para ambos sistemas de PCR en tiempo real se prepararon clonando los productos de PCR para IS900 y F57 en un vector de plásmido. Se diluyó el ADN de plásmido aislado en el intervalo entre 1x105 y 1x100 copias de plásmido por 1 !l de reacción. Se amplificó la serie de dilución apropiada en cada experimento. Se usó como control positivo de la amplificación y fuente de datos para la construcción de la curva de calibración y de ese modo para la determinación de la eficacia de PCR del gradiente de plásmidos calculada según la ecuación de la curva de regresión. Se usó la curva de calibración para la cuantificación exacta de MAP en muestras desconocidas.
El método según la invención, basado en la amplificación de dos locus específicos para MAP usando PCR en tiempo real, se ha optimizado para el diagnóstico rutinario de MAP en diferentes tipos de material biológico. La principal ventaja es el uso universal (es posible su aplicación en diferentes laboratorios y diferentes instrumentos sin necesidad de modificaciones adicionales), no exige mucho tiempo y los bajos costes se combinan con alta especificidad; sensibilidad y reproducibilidad.
Los siguientes ejemplos de realización del método según la invención documentarán el método.
Ejemplos de realizaci6n del metodo
Ejemplo 1
El método según la invención consiste en varias etapas:
Material de ADN. Se usaron moldes de ADN de 17 especies bacterianas y 4 de mamífero para la confirmación de la especificidad de los sistemas de PCR en tiempo real desarrollados (tabla 1).
Se usaron muestras de leche de 71 vacas de un rebaño infectado por paratuberculosis para someter a prueba el aislamiento del ADN y los sistemas de PCR en tiempo real desarrollados. Al comienzo del ordeño, se recogieron las primeras eyecciones de leche de cada vaca (las primeras 3 a 4 eyecciones de cada una de las tetillas que se desechan habitualmente) en un recipiente de plástico desechable estéril con una capacidad en volumen de 200 ml. Se pusieron las muestras de leche en cajas de refrigeración y se enviaron a los laboratorios donde se almacenaron a 4ºC y se procesaron en el plazo de 3 días. Se procesaron dos muestras independientes de cada momento de muestreo: se usó una para el aislamiento del ADN y la otra como muestra de reserva para el caso de que el aislamiento del ADN o la PCR en tiempo real fallasen.
Diseño de cebadores y sondas. Se diseñaron cebadores y sondas para la secuencia de inserción IS900 (X16293) y el fragmento F57 (X70277) mediante el programa Primer3: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi,
(tabla 2).
Preparación de patrones de plásmidos. Para la preparación de patrones de plásmidos para PCR en tiempo real de IS900 y F57, se amplificaron los productos de PCR de IS900 y F57 mediante PCR convencional usando el kit HotStar PCR Master Mix (Qiagen, Hilden, Alemania), 10 pmol de cebadores IS900qPCRF e IS900QPCRR o F57qPCRF y F57qPCRR y 2 !l de suspensión de MAP lisado (cepa de colección CAPM 6381; Colección de Microorganismos Patógenos de Animales, Brno; http: //www.vri.cz/labs/patogen/default.htm) en un volumen total de 20 !l. Se realizó la amplificación por PCR en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95ºC durante 15 min., seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 20 s, apareamiento a 60ºC durante 30 s, extensión a 72ºC durante 1 min. y extensión final a 72ºC durante 5 min. Sin purificación adicional, se clonaron los productos de PCR obtenidos en el vector pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
Se purificaron los plásmidos que contenían los insertos IS900 (Tuor) y F57 (Beren) usando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemania), se eluyeron en 200 !l de tampón TE (Amresco, Inc, Solon, EE.UU.) y se secuenciaron para la confirmación de la secuencia correcta del inserto. Se evaluaron la concentración exacta del ADN de plásmido y la pureza por triplicado en el espectrofotómetro BioPhotometer (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Se usó el valor de concentración media en el trabajo posterior con ADN de plásmido. Simultáneamente, se comprobó visualmente la calidad del ADN de plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa. Para aumentar la estabilidad de los plásmidos en el tampón TE durante el almacenamiento a -20ºC y para disminuir su pérdida durante el manejo posterior, se añadieron 10 !g de ADN de esperma de pez (Serva, Heidelberg, Alemania). La concentración resultante de ADN de esperma de pez era de 50 ng/!l.
Preparación de controles de amplificación internos. CAI para PCR en tiempo real de IS900 y F57 se basan en el principio de PCR competitiva. Se han fusionado cebadores “directos” e “inversos” de IS900 y F57 en los extremos 3’ con oligonucleótidos cortos (TGTTAGAGAGG y ACTCTAAACCCAA) del gen de patata StTS1 (trehalosa sintasa 1 de Solanum tuberosum; AF483209). Se prepararon ambos productos de PCR a partir de ADN de patata según el protocolo de PCR mencionado anteriormente usando la temperatura de apareamiento reducida hasta 50ºC. Posteriormente, se procesaron de manera idéntica a los patrones de plásmidos para IS900 y F57. Se almacenaron los plásmidos de CAI para IS900 (Idril) y F57 (Luthien) en tampón TE (Amresco, Solon, EE.UU.) a -20ºC antes de su uso adicional.
PCR en tiempo real de IS900 y F57. Se optimizaron las condiciones para la PCR en tiempo real de IS900 y F57 hasta que se determinaron la mejor concentración de cebadores y sondas, concentración de CAI, concentración de MgCl2 y condiciones del protocolo de PCR. La mezcla de reacción de PCR optimizada para ambos sistemas de PCR en tiempo real consistía en 1x DyNAmo Probe qPCR Kit (Finnzyme, Espoo, Finlandia), 10 pmol de cebadores IS900qPCRF e IS900QPCRR o F57qPCRF y F57qPCRR (concentración final 0,5 !M), 1 pmol de sondas IS900qPCRTM o F57qPCRTM marcadas con FAM (concentración final 0,05 !M), 4 pmol de sonda marcada con Cy5 para IACIACQPCRTM (concentración final 0,2 !M), 0,2 U de uracilo ADN glicosilasa (Sigma, St. Louis, EE.UU.), 50 copias de plásmido Luthien o Idril y 5 !l de molde de ADN en un volumen total de 20 !l.
La amplificación y detección de la fluorescencia, que era idéntica para ambos sistemas de PCR en tiempo real, se realizó en el instrumento LightCycler 480 (Roche Molecular Diagnostic, Alemania) en placas de PCR de 96 pocillos en las siguientes condiciones: 37ºC durante 10 min., seguido por desnaturalización inicial a 95ºC durante 15 min. y 47 ciclos a 95ºC durante 5 s y 60ºC durante 40 s (exploración de fluorescencia). Se realizó el análisis posterior usando el análisis de puntos Fit en el software para LightCycler 480 (versión 1.2.0.0625).
Especificidad de la PCR en tiempo real de IS900 y F57. Se realizaron experimentos de PCR en tiempo real con suspensiones bacterianas lisadas y aislamiento de ADN de la sangre periférica de mamíferos seleccionados para comprobar la especificidad de los cebadores y sondas diseñados para la PCR en tiempo real de IS900 y F57 (tabla 1). Se resuspendió una colonia bacteriana en 20 !l de agua destilada y se desnaturalizó en un bloque caliente a 100ºC durante 20 min. Posteriormente, se centrifugó la suspensión producida a 14000 g durante 10 min. y se usó el sobrenadante como molde de ADN para experimentos de PCR en tiempo real. Se aisló ADN de mamífero de sangre periférica usando el kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante.
Sensibilidad y reproducibilidad de la PCR en tiempo real de IS900 y F57. Se evaluó la sensibilidad de los sistemas de PCR en tiempo real de IS900 y F57 mediante la serie de dilución decimal de los plásmidos Tuor y Beren. Se diluyeron ambos gradientes de plásmidos en el intervalo entre 105 y 100 copias/!l con tampón TE (Amresco, Inc, Solon, EE.UU.) que contenía ADN de esperma de pez 50 ng/!l (Serva, Heidelberg, Alemania) y 10 copias/!l de los plásmidos Luthien e Idril. Se usaron los gradientes de plásmidos preparados para detecciones cuantitativas o como control positivo en PCR en tiempo real y para el cálculo de la eficacia de la amplificación del gradiente de plásmidos en el experimento de PCR actual. Por tanto, se amplificó un gradiente de plásmidos apropiado en cada experimento de PCR en tiempo real. Se determinó la reproducibilidad realizando 20 detecciones repetidas independientes con diluciones recién preparadas de gradiente de plásmidos.
Aislamiento de ADN total a partir de leche. Se centrifugó el volumen de 50 ml inicial de leche fresca a 4211 g (RCF) durante 45 min. en una centrífuga Hermle Z 383 K (Hermle, Gosheim, Alemania). Se desechó la mayoría del sobrenadante y la nata. Se resuspendió el sedimento en el sobrenadante restante y se transfirió a otro tubo de 2 ml. Posteriormente, se centrifugaron las muestras a 14000 g (RCF) durante 10 min. Se ajustó el volumen en cada tubo de prueba a 400 !l. Se almacenaron tales “muestras preprocesadas” a -80ºC antes de su uso. Se aisló el ADN total de la leche según el protocolo modificado del kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Tras una incubación de 5 min., se eluyó el ADN en 50 !l de tampón TE precalentado (Amresco, Inc, Solon, EE.UU.). Se realizó la elución dos veces. El aislamiento dio como resultado la obtención de 100 !l de ADN total a partir de la leche en tampón TE que contenía ADN de esperma de pez portador en una concentración de 50 ng/!l. Según los parámetros del procedimiento de aislamiento del ADN, se realizó el cálculo del número de células de MAP por 1 ml de volumen de leche inicial tal como sigue: se dividió el número de copias de F57 obtenido en la PCR en tiempo real entre 2 = número de células de MAP en 1 ml de volumen de leche inicial. En el caso de PCR en tiempo real de IS900, el cálculo era idéntico y además se dividió el número obtenido entre dieciocho (1 célula de MAP no contiene más de 18 copias de IS900; Bull et al., 2000).
Medidas para la prevención de la contaminación cruzada. Debido al hecho de que la PCR en tiempo real es altamente sensible, tenían que observarse estrictamente las medidas para la prevención de la contaminación cruzada. Se realizaron el aislamiento del ADN, la preparación de las mezclas para la PCR en tiempo real y la adición del molde de ADN en salas separadas con sobrepresión de aire. Se lavaron todas las herramientas y pipetas con DNA-Exitus (AppliChem, Darmstadt, Alemania) antes de su uso. Sólo se usaron puntas de filtro. Se incluyó un control negativo del aislamiento (agua) que permite la monitorización de la posible contaminación de los materiales de plástico y productos químicos usados en cada ronda de aislamiento de ADN. Se comprobaron los materiales de plástico y productos químicos para la PCR en tiempo real para detectar contaminación por medio del control de PCR negativo (agua en vez de molde de ADN), que se incluyó en cada experimento de PCR en tiempo real.
Análisis estadístico. Se calcularon los valores de puntos de cruce obtenidos mediante la PCR en tiempo real de IS900 y F57 por número real de copias según las curvas patrón apropiadas. Se agruparon los valores calculados a partir de los gradientes de los plásmidos Tuor y Beren y se compararon entre sí usando el programa InStat (GraphPad, San Diego, EE.UU.). Se sometieron a prueba los datos para determinar la homogeneidad de la varianza mediante la prueba de Kolmogorov y Smirnov y la varianza mediante la prueba de la T de Student. Se sometieron a prueba los grupos de datos para determinar la normalidad de la división y la varianza por medio de una prueba de variabilidad, es decir, la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de la T, respectivamente. Las diferencias a P < 0,05 se consideraron significativas. Se calculó el coeficiente de variabilidad (CV) con el objetivo de mediar la precisión del aislamiento del DNA y la posterior PCR en tiempo real. Para la indicación de la varianza de valores calculados respectivos, se determinó el intervalo de confianza del 95%.
Resultados
Optimización de la PCR en tiempo real de IS900 y F57. Se determinó la cantidad óptima de copias de los plásmidos Luthien o Idril, que garantiza una coamplificación óptima con la secuencia diana, mediante titulación de 5 x 103, 5 x 102, 5 x 101 y 5 x 100 de cada copia de CAI con respecto a reacción de PCR y gradiente de plásmidos apropiado. Los resultados eran idénticos para ambos sistemas de PCR en tiempo real. Se encontró que 5 x 101 copias del plásmido Idril o Luthien por reacción (valores de punto de cruce entre 35 y 36) no afectaban a la amplificación de gradiente de plásmidos apropiado incluso en las concentraciones más bajas y proporcionaron una señal lo suficientemente fuerte que podía distinguirse del fondo.
En la siguiente etapa, se investigó el efecto del ADN de esperma de pez no específico presente en un molde sobre la amplificación de una molécula diana durante la PCR en tiempo real. Se diluyeron plásmidos Idril y Luthien (10 copias/ml) en tampón TE que contenía 0, 10, 30, 50, 70, 90, 100 y 200 ng/!l de ADN de esperma de pez y se usaron como diluyentes para la preparación de gradientes de plásmidos Tuor y Beren. Por tanto, se analizaron los moldes preparados mediante PCR en tiempo real basada en IS900 o F57 por triplicado.
Los valores de “puntos de cruce” de ambos gradientes no se vieron afectados incluso por la presencia de 100 ng/!l (500 ng por reacción de PCR) de ADN no específico. La concentración de 200 ng/!l inhibió significativamente ambos sistemas de PCR en tiempo real. Para otros experimentos, se usó la concentración de 50 ng/!l.
Especificidad de la PCR en tiempo real de IS900 y F57. Se sometieron a prueba ambos sistemas de PCR en tiempo real para determinar la capacidad para distinguir selectivamente ADN de MAP de otros lisados bacterianos y ADN de mamífero (tabla 1). No se amplificó ADN bacteriano ni de mamífero excepto MAP mediante la PCR en tiempo real de
o bien F57 o bien IS900 y todas las muestras negativas mostraron una clara señal para CAI. Se eligieron especies de mamífero como las fuentes más probables de antecedentes de ADN para los sistemas de PCR en tiempo real desarrollados.
Sensibilidad de la PCR en tiempo real de IS900 y F57. Mediante ambos sistemas de PCR en tiempo real, puede detectarse una copia de plásmido Beren o Tuor por 1 ml (5 copias por reacción) en las 20 réplicas (tabla 3, figura 1).
La comparación de los conjuntos de datos calculados para F57 e IS900 usando la prueba de la T no mostró una diferencia significativa (P > 0,1) entre los mismos.
Aislamiento de ADN a partir de muestras de campo de leche. Se usaron ambos sistemas de PCR en tiempo real desarrollados para la detección y cuantificación de MAP en 71 muestras de leche de un rebaño de vacas infectadas con paratuberculosis (tabla 4). Se etiquetaron las muestras de leche recogidas con códigos, se aisló el ADN a partir de las mismas y se realizaron los análisis mediante PCR en tiempo real de IS900 y F57. Las muestras que eran ligeramente positivas para IS900 y negativas para F57 se consideraron positivas. Se analizó cada muestra de campo por duplicado y se consideró positiva sólo en el caso de que ambos duplicados fuesen positivos; de lo contrario se repitió el aislamiento del ADN y se realizaron ambas PCR en tiempo real usando la muestra de reserva.
La proporción entre los números de copias de IS900 y F57 calculados se presentan en la tabla 4. Los números de copias de IS900 eran siempre superiores que F57 en todas las muestras con resultados simultáneamente positivos a partir de la PCR en tiempo real de IS900 y F57 y se detectó la razón de 12 con respecto a 18:1 en casi todas las muestras. El número de copias no era superior a 50 en todas las muestras en las que sólo se detectó IS900; que correspondían a aproximadamente 3 células de MAP.
Límite experimental de la detección de MAP en leche. Tras el cálculo de los números de copias obtenidos a partir de la PCR en tiempo real por volumen inicial de leche, se determinó el límite experimental de detección: 1 célula de MAP por 2 ml de leche para la PCR en tiempo real de IS900 y 2 células de MAP por 1 ml de leche para la PCR en tiempo real de F57. Puede suponerse que de hecho ningún sistema de detección es perfecto. A pesar de todas las precauciones, los sitios diana pueden perderse durante el manejo de una muestra debido a o bien fragmentación del ADN durante el aislamiento o bien adhesión al material de plástico consumible. Por tanto, debe esperarse una probabilidad inferior de detección en bajas concentraciones. El ADN extraído a partir de una material complejo talcomo leche puede contener trazas de sustancias inhibidoras. Éstas no se reflejarán en la amplificación de CAI, pero pueden inhibir las bajas concentraciones de sitios diana (Herthnek y Bolske, 2006).
Aplicabilidad para la industria
Este método de detección y cuantificación de MAP está destinado sobre todo para diagnóstico rutinario. Está diseñado para la cuantificación de MAP en cualquier material biológico. El requisito previo de su uso satisfactorio es el aislamiento de ADN de alta calidad a partir de una matriz dada. Los sistemas de PCR en tiempo real desarrollados se sometieron a prueba en condiciones prácticas sobre muestras de ADN aisladas de leche, que puede ser la fuente primaria de transmisión de MAP al hombre.
El método mencionado anteriormente comprende el protocolo de PCR en tiempo real con sondas de hidrólisis y CAI, incluyendo la composición de mezcla de PCR y las proporciones de diferentes componentes, el protocolo de PCR, el análisis de los datos obtenidos y la cuantificación de MAP en muestras.
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Tabla 1
Lista de especies bacterianas y de mamífero sometidas a prueba mediante PCR en tiempo real de IS900 y F57 con control de amplificación interno correspondiente
Especie Fuente IS900 F57
M. avium subsp. CAPMa 6381 + + paratuberculosis
M. avium subsp. muestra de campo (oso), CR + + paratuberculosis
M. avium subsp. muestra de campo (gamo), CR + + paratuberculosis
M. avium subsp. muestra de campo (heces), CR + + paratuberculosis
M. avium subsp. muestra de campo (muflón), CR + + paratuberculosis
M. avium subsp. muestra de campo (ganado), CR + + paratuberculosis
M. avium subsp. avium CAPM 5889 --
M. avium subsp. avium muestra de campo (conejo), CR --
M. avium subsp. hominisuis muestra de campo (cerdo), CR --
M. avium subsp. hominisuis aislado clínico (hombre), CR --
M. gordonae ATCCb 12478 --
M. cansasii ATCC 12478 --
M. scrofulaceum ATCC 19981 --
M. szulgai ATCC 35799 --
M. intracellulare CAPM 5627 --Escherichia coli células competentes (Invitrogen) --Salmonella enterica serovar CAPM 5438 --Typhimurium Oveja (Ovis aries) ADN de aislado clínico, CR --Cabra (Capra hircus) ADN de aislado clínico, CR --Ganado (Bos taurus) ADN de aislado clínico, CR --Hombre (Homo sapiens aislado clínico, CR --sapiens) aColección de Microorganismos Patógenos de AnimalesbColección Americana de Cultivos Tipo
Tabla �
Secuencia de las sondas y los cebadores usadosa
Longitud del producto Nombre delde PCR (pb) plásmido patrón
Gen diana Nombre Tipo Secuencia 5’ Localización
IS900qPCRF Directo GATGGCCGAAGGAGATTG 422 - 440
IS900 IS900qPCRR Inverso CACAACCACCTCCGTAACC 568 - 549 145 Tuor IS900qPCRTM Sonda FAM - ATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGT - BHQ 508 -534 F57qPCRF Directo GCCCATTTCATCGATACCC 94 - 111 F57qPCRR Inverso GTACCGAATGTTGTTGTCAC 238 - 220
Sonda
158 - 182 F57 F57qPCRTM 147 Beren
IAC IACqPCRTM Sonda IS900 152 LuthienF57 154 Idril
a Todos los cebadores y sondas se sintetizaron en VBC Biotech (Viena, Austria).
Tabla �
Evaluación del gradiente de plásmido Beren y Tuor mediante el método de PCR en tiempo real
Gradiente de plásmido CPa Número real de copiasb IC c
Designación Número de Media SO f Media SO CV g Superior Inferior Razónd Eficacia media de PCRe copias por reacción de PCR
500000 20,05 0,07 516915 94880 18,36 557495 476335 20/20 50000 23,63 0,41 47441 6177 13,02 50083 44799 20/20 Tuor (PCR en tiempo real de IS900) 5000 26,91 0,47 5424 1139 21,00 5911 4937 20/20 94,18%
500 30,37 0,51 548 119 21,73 599 498 20/20 50 34,19 0,51 44 14 31,65 50 38 20/20 5 37,31 0,61 6 1 23,13 6 5 20/20 500000 20,09 0,16 479470 62799 13,10 506329 452611 20/20 50000 23,52 0,34 50009 7180 14,36 53080 46938 20/20 500026,84 0,37 5641118621,03 61485134 20/20
Beren (PCR en tiempo real de F57) 93,23%
500 30,45 0,43 525 98 18,74 567 483 20/20
50 34,11 0,61 48 15 30,62 54 42 20/20 5 37,48 0,64 5 1 23,03 6 5 20/20 a CP – El valor de “punto de cruce”b Se realizó el cálculo a partir de CP según la ecuación de regresión para el experimento respectivo y las medias, se calcularon posteriormente SO y CV c IS – Intervalo de fiabilidad del 95% experimentald Muestras positivas/total de muestrase Calculado a partir del coeficiente de regresión mediof SO – Desviación estándarg CV – Coeficiente de variación
Tabla 4
Detección de MAP en leche de vaca (las primeras eyecciones de todas las tetillas) de un rebaño de vacas infectadas con paratuberculosis
IS900+ y F57+ IS900+ y F57-
Vaca n.º. IS900a F57a Vaca n.º IS900a F57a Número de
Número de
MAPc
MAPb
1 3710 5 1 520 <2 2 59858 29 2 220 <2 3 129 5 3 190 <2 4 304 2 4 160 <2 5 4 3 2 5 3 0 <2 6 346 3 6 130 <2 7 67974 37 7 1 0 <2 8 5310 5 8 4 0 <2 9 104 2 9 160 <2 10373 2 106 0 <2 11305 3 119 0 <2 12495 3 123 0 <2 131606 3 13140 <2 143997 4 14300 <2 15 6 4 2 15360 <2 16 340 <2 17 240 <2 18 210 <2 19 450 <2 20 250 <2 21 470 <2 22 6 0 <2
a Número medio de copias de un duplicado por reacción de PCR b Número de células de MAP por 1 ml de volumen de leche inicial. Calculado a partir de la cantidad de células de MAP detectadas mediante la PCR en tiempo real de F57 (número de copias de F57 obtenidas a partir de la PCR en tiempo real dividido entre 2 = número de células de MAP por 1 ml de volumen de leche inicial). c Número de células de MAP por 1 ml de volumen de leche inicial. Calculado a partir de la cantidad de células de MAP detectadas mediante la PCR en tiempo real de IS900 (número de copias de IS900 obtenidas a partir de la PCR en tiempo real dividido entre 36 = número de células de MAP por 1 ml de volumen de leche inicial).

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para la detección y cuantificación de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis mediante dos reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real competitivas, cada una con su propio control de amplificación interno, que se caracteriza por el hecho de que la detección y cuantificación de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis se realiza mediante dos sistemas de reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real independientes, que detectan dos locus específicos para Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis: IS900 y F57, respectivamente, usando cebadores y sondas de hidrolización que tienen las siguientes secuencias
    cebadores para F57
    F57qPCRF GCCCATTTCATCGATACCC F57qPCRR GTACCGAATGTTGTTGTCAC,
    la sonda para F57
    F57qPCRTM FAM - CAATTCTCAGCTGCAACTCGAACACAC- BHQ,
    cebadores para IS900
    IS900qPCRF GATGGCCGAAGGAGATTG IS900qPCRR CACAACCACCTCCGTAACC,
    la sonda para IS900
    IS900qPCRTM FAM- ATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGT - BHQ,
    en el que la sonda para el control de amplificación interno tiene la siguiente secuencia
    IACqPCRTM Cy5 - GGCTCTTCTATGTTCTGACCTTGTTGGA- BHQ.
  2. 2.
    Método según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que se detecta y cuantifica Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en cualquier muestra de origen animal, en muestras clínicas de pacientes humanos, en muestras de origen vegetal, en muestras del entorno, especialmente de fertilizantes, tierra y heno, en muestras de hallazgos arqueológicos o en muestras de alimentos y piensos.
  3. 3.
    Kit para la detección y el diagnóstico de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis según el método de la reivindicación 1, que comprende todos los siguientes cebadores y sondas, cada de los cuales consiste en la secuencia definida a continuación:
    cebadores para F57
    F57qPCRF GCCCATTTCATCGATACCC F57qPCRR GTACCGAATGTTGTTGTCAC,
    la sonda para F57
    F57qPCRTM FAM - CAATTCTCAGCTGCAACTCGAACACAC- BHQ,
    cebadores para IS900
    IS900qPCRF GATGGCCGAAGGAGATTG IS900qPCRR CACAACCACCTCCGTAACC,
    la sonda para IS900
    IS900qPCRTM FAM - ATTGGATCGCTGTGTAAGGACACGT - BHQ,
    y la sonda para el control de amplificación interno
    IACqPCRTM Cy5 - GGCTCTTCTATGTTCTGACCTTGTTGGA- BHQ.
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