ES2393302T3 - Detección, identificación y diferenciación de la especie serratia utilizando la región intergénica - Google Patents

Abstract

Un conjunto de dos sondas polinucleótidicas, comprendiendo cada sonda de 5 a 50 nucleótidos, hibridando dichas sondas específicamente a un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente en los indicadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN donde T es reemplazada por U, su forma complementaria, en donde no hay más de 25 nucleótidos entre dichas sondas, para la detección y/o identificación de la especie serratia.

Description

Detección, identificación y diferenciación de la especie Serratia utilizando la región intergénica.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a nuevas secuencias de ácido nucleico, derivadas de la región de espacio intergénico (conocida por its, por sus siglas en inglés), entre los genes de ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) 16S y 23S, para ser usada para la detección y/o identificación específica de la especies de Serratia, en particular de Serratia marcescens, Serratia ficaria, y/o Serratia fonticola.

La presente divulgación se refiere también a un procedimiento para la detección y/o identificación específica de las especies de Serratia, en particular de Serratia marcescens, Serratia ficaria, y/o Serratia fonticola usando nuevas secuencias de ácido nucleico derivadas de la región its.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El género Serratia, de la familia de las Enterobactericeae, consiste de 11 especies: Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, grupo Serratia liquefaciens (S. liquefaciens s.s., S. grimesii y S. proteamaculans), Serratia marcescens, Serratia odorífera, Serratia plymuthica, Serratia quinivorans y Serratia rubidaea.

Los miembros del género Serratia se encuentran en el agua y en el suelo y en hojas, frutas, vegetales, setas, musgos e insectos. La única especie de Serratia que ha sido habitualmente asociada con la enfermedad humana es la

S. marcescens. La mayoría de las otras especies de Serratia han sido aisladas de humanos, donde están usualmente presentes de forma transitoria y pueden provocar infecciones oportunistas. Solamente la S. entomophila no ha sido hasta ahora aislada en humanos.

Las zonas más comunes para la infección por Serratia incluyen las vías urinarias, las vías respiratorias y el sistema circulatorio. La infección del sistema nervioso central se produce principalmente con posterioridad a la neurocirugía. La Serratia es un organismo virulento. Cuando entra en el sistema circulatorio, libera endotoxinas y provoca fiebre, choque séptico, trombocitopenia, y coagulación intravascular diseminada. La mortalidad por bacteriemia Serratia es alta. La Serratia es resistente, de forma natural, a algunos antibióticos y puede hacerse rápidamente resistente a otros antibióticos debido a la producción de enzimas.

La transmisión mórbida de Serratia tiene lugar a menudo con origen en las manos contaminadas de profesionales sanitarios. Otra fuente de infección de Serratia viene constituida por los equipos contaminados. Las infecciones de las vías urinarias están casi siempre asociadas con sondas permanentes. Las infecciones de las vías respiratorias son comunes en pacientes que residen en lugares ventilados de forma mecánica. Si una persona es colonizada con Serratia, se infectan fácilmente debido a dispositivos penetrantes, cirugía y gravedad de la enfermedad.

Actualmente, las especies de Serratia son identificadas y diferenciadas por procedimientos basados en cultivos y análisis bioquímicos fenotípicos.

Crecen bien en medios enriquecidos (por ejemplo, agar sangre) en una temperatura de entre 35 a 37º C. Son fermentadores no lácticos y son móviles. Las especies de Serratia producen desoxirribonucleasa extracelular a 25º C y gelatinasa a 22º C. Elaboran lipasa y son resistentes a la colistina, la ampicilina y la cefalotina. Estas propiedades son específicas de Serratia y no son características de cualquier otra Enterobactericeae. Durante muchos años se diferenciaba S. marcescens de otras bacterias entéricas debido a su pigmentación roja característica. Sin embargo, no todos los organismos de S. marcescens producen el pigmento rojo característico conocido como prodigiosina. Las diferentes especies de Serratia pueden ser diferenciadas del S. marcescens por las reacciones de decarboxilación y de fermentación.

J. Kur et al. ((1995) Acta Microbiologica Polonica 44 (3/4): 219-225) describen la amplificación de las zonas intergénicas 16S – 23S de ADNr de los organismos de S. marcescens y su fragmentación por el uso de una nucleasa de restricción. Ni las regiones intergénicas ni sus fragmentos han sido divulgados. No se ha demostrado la diferenciación de S. marcescens de otras especies de Serratia por la aplicación de este procedimiento.

Desde un punto de vista de seguridad sanitaria, S. marcescens despierta un gran interés debido al incremento de número de casos, su virulencia y su cada vez mayor resistencia a los antibióticos. Un ensayo de para una rápida y específica identificación será, en consecuencia, la base para una administración antimicrobiana más adecuada de las infecciones provocadas por este organismo.

RESUMEN

Es objeto de la presente divulgación el proporcionar nuevas secuencias de ácido nucleico derivados del ITS de las especies de Serratia, que pueden ser usados para la detección y/o identificación de las especies de Serratia, en concreto de S. marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola.

Se pone a disposición, así, una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en los números de identificación secuencial 1 a 57, su forma complementaria, la forma de ARN de los mismos en donde T es sustituida por U, y homólogos.

El uso de dichas moléculas de ácido nucleico y de fragmentos de las mismas para la detección y/o identificación de la especie Serratia es también objeto de la presente divulgación. Será evidente para el experto en la materia que las secuencias de ARNt que codifican glutamina, isoleucina y alanina no son adecuadas para dicha detección y/o identificación.

Un aspecto se relaciona con nuevos polinucleótidos para su uso como sondas y/o partidores, para la detección y/o identificación de las especies de Serratia, en concreto de Serratia marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola.

La presente divulgación proporciona así una molécula aislada de ácido nucleico que se hibrida de forma específica para una secuencia objetivo que comprenda o consista de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en los números de identificación secuencial 12 a 57, su forma complementaria, la forma de ARN de los mismos en donde T es sustituida por U, secuencias homólogas de los mismos y fragmentos de los mismos, para la detección y/o identificación de la especie Serratia.

Otro aspecto se relaciona con conjuntos de sondas para la detección y/o identificación de la especie Serratia, en concreto de Serratia marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola, en una muestra.

Otro aspecto se refiere a los partidores que permiten la ampliación específica de la región intergénica de ARNr 16S-23S de la especie Serratia, en concreto de Serratia marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola.

Otro objetivo es una composición que contenga cualquiera de las nuevas secuencias de la invención, o cualquiera de los nuevos conjuntos de sondas y/o partidores de la invención, o una combinación de los mismos.

Otro objeto es un equipo, en el que se usen dichas sondas y/o partidores para la detección y/o identificación de la especie Serratia, en concreto de Serratia marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola.

Otro objeto es un rápida y fiable procedimiento de hibridación para la detección y/o identificación de la especie Serratia, en concreto de Serratia marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola.

Otro objeto es un procedimiento de hibridación basado en PCR en tiempo real para la detección y/o identificación de la especie Serratia, en concreto de Serratia marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola.

LEYENDAS DE LAS TABLAS

Tabla 1: Amplificación y programa de curva de fusión utilizados en los ejemplos.

Tabla 2: Diferentes combinaciones de la sondas de hibridación analizadas.

Tabla 3: Lista de microorganismos analizados para la especificidad de la combinación de la sondas de hibridación representadas por los IDENTIFICADORES SECUENCIALES 26 y 44.

Tabla 4: lista de los IDENTIFICADORES SECUENCIALES 1 a 59.

Las IDENTIFICACIONES DE SECUENCIA de esta tabla se derivan de los siguientes organismos:

IDENTIFICADOR SECUENCIAL

ORGANISMO IDENTIFICADO R SECUENCIAL ORGANISMO

1

S. marcescens (glu) 31 S. marcescens (glu)

2

S. marcescens (glu) 32 S. marcescens (glu)

3

S. marcescens (ile-ala) 33 SERRATIA (glu + ile-ala)

4

S. marcescens (ile-ala) 34 S. marcescens (ile-ala)

5

S. marcescens (ile-ala) 35 S. marcescens (ile-ala)

6

S. ficaria (glu) 36 S. marcescens (glu + ile

7

S. ficaria (ile-ala) 37 ala)

8

S. fonticola (glu) 38 S. marcescens (glu + ile

9

S. fonticola (glu) 39 ala)

10

S. fonticola (ile-ala) 40 SERRATIA (glu + ile-ala)

11

S. fonticola (ile-ala) 41 SERRATIA (glu + ile-ala)

12

SERRATIA (glu + ile-ala) 42 S. marcescens (glu + ile

13

SERRATIA (glu + ile-ala) 43 ala)

14

SERRATIA (glu) 44 S. marcescens (glu + ile

15

SERRATIA (ile-ala) 45 ala)

16

SERRATIA (glu + ile-ala) 46 S. marcescens (glu + ile

17

SERRATIA (ile-ala) 47 ala)

18

SERRATIA (ile-ala) 48 S. marcescens (glu + ile

19

SERRATIA (ile-ala) 49 ala)

20

SERRATIA (ile-ala) 50 S. marcescens (glu + ile

21

SERRATIA (ile-ala) 51 ala)

22

SERRATIA (ile-ala) 52 S. marcescens (glu + ile

23

SERRATIA (ile-ala) 53 ala)

24

SERRATIA (ile-ala) 54 S. marcescens (glu + ile

25

SERRATIA (ile-ala) 55 ala)

26

SERRATIA (glu + ile-ala) 56 SERRATIA (glu + ile-ala)

27

SERRATIA (ile-ala) 57 SERRATIA (glu + ile-ala)

28

S. marcescens (ile-ala) 58 S. marcescens (glu + ile

29

S. marcescens (ile-ala) 59 ala)

30

S. marcescens (glu) S. marcescens (glu) S. marcescens (glu) S. marcescens (glu) S. marcescens (ile-ala) S. marcescens (ile-ala) S. marcescens (ile-ala) S. marcescens (ile-ala) S. marcescens (ile-ala) SERRATIA SERRATIA

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

5 Las siguientes definiciones sirven para ilustrar los términos y expresiones usados en las diferentes realizaciones de la presente invención tal como se presentan infra.

Los términos “intergénica” e “its” (siglas en inglés de “espacio intergénico”) son términos abreviados, refiriéndose ambos a la región entre ARNr 16S y 23S o entre los genes de ARNr 16S y 23S.

10 El término “sonda” hace referencia a un oligonucleótido o polinucleótido de cadena simple, que tiene una secuencia que es lo suficientemente complementaria para hibridar una secuencia objeto.

Una secuencia objeto, en el contexto de la presente invención, es una secuencia que ha de ser detectada y 15 que comprende cualquier molécula de ácido nucleico representada por cualquiera de los identificadores secuenciales 1 a 11, su forma complementaria, ARN de la misma, y homólogos o fragmentos de la misma.

Una secuencia objeto puede ser, o bien ADN genómico o ARN precursor, o versiones amplificadas de los mismos.

20 Preferiblemente, las sondas descritas son homólogas al complemento exacto de la secuencia objeto en alrededor de 80 % ó más, más preferiblemente alrededor de 85 % ó más, aún más preferiblemente en alrededor del 90 % ó más, y más preferiblemente todavía en alrededor del 95 % o más.

Las sondas descritas pueden estar formadas por clonación de plásmidos recombinantes que contengan inserciones que incluyan las correspondientes secuencias nucleótidas, si es necesario por la adhesión de las últimas desde los plásmidos clonados utilizando las nucleasas adecuadas y recuperándolas, por ejemplo, con fraccionamiento acorde al peso molecular.

Las sondas descritas pueden ser también sintetizadas químicamente, por ejemplo, por el procedimiento de fosfo – triester.

El término ácidos nucleicos “complementarios”, usado aquí, significa que las secuencias de ácido nucleico pueden formar, entre sí, una hélice doble perfecta en par de bases. Si, por toda esta solicitud de patente, se ha mencionado una forma complementaria en relación con una secuencia y su ARN, entonces quiere decirse la forma complementaria de tanto la secuencia como el ARN de la misma.

Los términos “ácido polinucleico”, “ácido nucleico” y “polinucleótido” se corresponden, o bien con ADNc de doble cadena o de cadena sencilla o ADN o ARN genómicos, que contenga al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40 ó 50 nucleótidos contiguos. Un ácido polinucleico que sea de menos de 100 nucléotidos de longitud es aludido, con frecuencia, como un “oligonucleótido”. Los números de nucleótidos mencionados en esta solicitud de patente tienen que ser considerados como indicativos de un intervalo de más o menos 2 en el mismo significado que el término “alrededor de”.

Pueden contener también nucleótidos modificados tales como inosina o nucléotidos que contengan grupos modificados que no alteren sustancialmente sus características de hibridación.

Las moléculas de ácido nucleico descritas se representan siempre del extremo 5’ al extremo 3’, pero pueden ser usadas de cualquier forma, por ejemplo en su forma de doble cadena o de cadena sencilla (cualquiera de las dos cadenas), su forma de ADN o ARN (donde T es sustituida por U), modificada o no.

El término “vecino más próximo” alude al taxón del que se conoce o espera que sea el más próximamente relacionado en términos de homología de ADN y que tiene que ser diferenciado del organismo de interés.

La expresión “hibridación específica de taxón” o “sonda específica de taxón” significa que la sonda sólo se hibrida al ADN o ARN del taxón para el cual fue diseñada no al ADN o ARN de otros taxones.

El término taxón puede referirse a un género completo o un sub-grupo dentro de un género, una especie o incluso subtipo dentro de una especie (subespecies, serotipos, sequevares, biovares, etc.).

El término “amplificación específica” o “partidores específicos” hace referencia al hecho de que dichos partidores solamente amplifican la región intergénica de los organismos para los cuales fueron diseñados, y no de otros organismos.

El término “sonda específica” hace referencia a sondas que solamente se hibridan con la región relevante del organismo para el cual fueron diseñadas, y no con la región correspondiente de otros organismos, ni con cualquier otra región.

El término “sonda específica intergénica” se refiere a sondas que solamente hibridan con la región intergénica

del organismo para el que fueron diseñadas, y no con regiones intergénicas de otros organismos.

El término “sensitividad” hace referencia al número de negativos falsos: esto es, si 1 de las 100 cadenas para ser detectadas es pasada por alto, el análisis muestra una sensitividad de (100-1/100)%= 99%.

El término “especificidad” hace referencia al número de positivos falsos: esto es, si de 100 cadenas detectadas, 2 aparentan pertenecer a organismos para los cuales no está diseñado el análisis, la especificidad del análisis es (1002/100)%=98%.

Los oligonucleótidos o polinucleótidos seleccionados como “preferenciales” muestran una sensitividad y especificidad de más de 80%, preferiblemente más de 90% y más preferiblemente de más de 95%.

El término “soporte sólido” puede hacer referencia a cualquier sustrato al cual puede ser acoplada una sonda de polinucleótido, siempre que la sonda mantenga sus características de hibridación y siempre que el nivel de fondo de hibridación permanezca bajo. Generalmente, el sustrato sólido será una placa de microtitulación, una membrana (por ejemplo, nylon o nitrocelulosa) o una microesfera (cuenta), sin limitación a estos ejemplos. Previamente a la aplicación a la membrana o fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico con objeto de facilitar la fijación o mejor la eficiencia de hibridación. Tales modificaciones pueden abarcar seguimiento de homopolímeros, acoplamiento con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH2, grupos SH, grupos carboxílicos o acoplamiento con biotinas, haptenos o proteínas.

El término “marcado” hace referencia al uso de ácidos nucleicos marcados. El marcado puede ser llevado a cabo por el uso de nucleótidos marcados incorporados durante la fase de polimerización de la amplificación tal como se describe por Saiki et al. ((1998) Science 239:487-491) o Bej et al. ((1990) Mol Cell Probes 4:353-365), o por el uso de partidores marcados, o por cualquier otro procedimiento conocido por el experto en la materia. La naturaleza del marcado puede ser isotópica (32P, 31S, etc.) o no isotópica (biotina, digoxigenina, tinte fluorescente, enzima, etc.).

El término “señal” hace referencia a una serie de ondas electromagnéticas (por ejemplo, fluorescencia), o cambios en la corriente eléctrica que transportan información. La señal puede ser directamente visible, o puede ser hecha visible y/o interpretable por diferentes medios o dispositivos.

La “muestra” puede ser cualquier material biológico. Este material biológico puede ser tomado, o bien directamente del ser humano infectado, o después del cultivo o enriquecimiento, o de comida, del medio ambiente, etc.

El material biológico puede ser, por ejemplo, cualquier clase de expectoración, lavados bronquiales, sangre, tejido de la piel, biopsias, material de cultivo de linfocitos en sangre, colonias, etc. Dichas muestras pueden ser preparadas o extraídas de acuerdo con cualquiera de los procedimientos conocidos en el estado de la técnica.

La especie de Serratia que es clínicamente relevante en el sentido de la presente invención es Serratia marcescens.

Las diferentes especies de Serratia muestran dos tipos diferentes de región intergénica basándose en el tipo de gen de ARNt insertado en la región intergénica, ARNtglu o ARNtile-ala. Además, para cada tipo de región intergénica y para cada especie de Serratia, pueden ser distinguidos diferentes conjuntos o grupos.

Por ejemplo, de tres cadenas de S. marcescens que tengan relación con el primer tipo de región intergénica, esto es, con inserción de ARNtglu, podrían ser definidos dos grupos diferentes, representados, respectivamente, por los indicadores secuenciales 3 a 5.

La presente divulgación proporciona nuevas moléculas de ácido nucleico para detectar y/o identificar todas las especies de Serratia, o cada especie de Serratia, o cualquier combinación de al menos dos especies de Serratia.

Una secuencia ITS como la aquí descrita comprende o consiste de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, su forma complementaria, el ARN de los mismos donde T es reemplazado por U, y cualquier secuencia homóloga de aquéllos.

Las secuencias homólogas encontradas en el ITS de cualquier especie de Serratia, también aludidas aquí

como “homólogos”, constituyen también un objeto de la presente divulgación. El grado de homología relativo a la

secuencia en su conjunto es mayor que 95%.

En la estructura de esta divulgación los “homólogos” son, entonces, secuencias homólogas a cualquiera de los identificadores secuenciales 1 a 11 o a cualquier fragmento de los mismos de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 nucleótidos, localizados en la región ITS de cualquier especie de Serratia y adecuados para la detección y/o identificación de especies de Serratia.

Los identificadores secuenciales 1 a 5 se derivan de S. marcescens, los identificadores secuenciales 6 y 7 de derivan de S. ficaria, y los identificadores secuenciales 8 a 11, de S. fonticola.

Se ponen a disposición nuevas moléculas de ácido nucleico derivadas del ITS para la detección de cualquier especie de Serratia, solucionando los problemas generados por una variabilidad muy elevada debida al hecho de que hay diferentes tipos de ITS en relación con el ARNt insertado, comprendiendo cada tipo diferentes grupos.

Realmente, se ha descubierto que las nuevas moléculas de ácido nucleico consistentes de los identificadores secuenciales 17, 18, 19, 20, 33, 38, 39 y 57 se encuentran en los diferentes grupos de un tipo particular de región intergénica de cada especie de Serratia analizada, especialmente las especie de Serratia que son clínicamente relevantes.

Estos polinucléotidos específicos, cualesquiera fragmentos de los mismos de al menos 10, 15, 20, 25, 30 y, preferiblemente, alrededor de 20 nucleótidos (18, 19, 20, 21, ó 22), la forma de ARN de los mismos y la forma complementaria de los mismos, también conocidos como polinucléotidos genoespecíficos son, entonces, regiones específicas del ITS que pueden ser usadas para diseñar partidores y/o sondas para la detección de cualquiera o de todas las especies de Serratia, en concreto de las especies de Serratia que son clínicamente relevantes.

Se ponen a disposición nuevos polinucleótidos para su uso como sondas y/o partidores para la detección y/o identificación de uno, dos o más especies de Serratia.

En otras palabras, un objeto de la presente invención se relaciona con nuevos polinucléotidos para su uso como sondas y/o partidores, que se hibridan con las secuencias objeto de la divulgación para la detección y/o identificación de uno, dos o más especies de Serratia.

En concreto, es objeto de la invención una molécula aislada de ácido nucleico que se hibrida específicamente a una secuencia objeto que comprende o consiste de un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de identificadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN donde T es sustituida por U, la forma complementaria del mismo, cualesquiera homólogos del mismo, y fragmentos de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200 ó 300 nucleótidos contiguos del mismo.

Las sondas polinucleotídicas preferidas están entre alrededor de 5 a alrededor de 50 bases de longitud, más preferiblemente de alrededor de 10 a alrededor de 25 nucléotidos y son lo suficientemente homólogas a la secuencia objeto.

Pueden ser usados como sondas polinucleótidos de identificadores secuenciales 12 a 57 o cualesquiera de sus homólogos, su forma complementaria o su forma de ARN.

Los partidores preferidos son polinucleótidos de ADN de cadena sencilla capaces de actuar como un punto de inicio para la síntesis de la secuencia objeto. La longitud y la secuencia de un partidor debe ser tal que permita iniciar la síntesis de los productos de extensión.

Preferiblemente, un partidor es de alrededor de 5 a alrededor de 50 nucleótidos de largo, preferiblemente de alrededor de 15 a alrededor de 25. Su longitud y secuencia específicos se eligen dependiendo de las condiciones tales como la temperatura y fuerza iónica.

Los partidores amplifican las secuencias objeto. En otras palabras, los partidores amplifican una molécula de ácido nucleico que comprenda cualesquiera de los indicadores secuenciales 1 a 11, su cadena complementaria y/u homólogos.

Pueden usarse los partidores universales ubicados en las zonas contiguas de la región intergénica del ARNr, esto es, en el gen 16S y en el gen 23S. Si están presentes especies de Serratia en la muestra, en el producto de amplificación, la/s secuencia/s objeto comprenderán, entonces, una molécula de ácido nucleico que consista en cualesquiera de los identificadores secuenciales 1 a 11 y/u homólogos.

Preferiblemente, la/s secuencia/s objeto consiste/n de cualesquiera moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo consistente de los indicadores secuenciales 1 a 11 y/u homólogos, flanqueados por no más de alrededor de 40 a alrededor de 50 nucleótidos de los genes 16S y 23S de ARNr, respectivamente.

El hecho de que los partidores de amplificación no tengan que ajustarse exactamente con la secuencia de plantilla correspondiente para garantizar una correcta amplificación está ampliamente documentado en la literatura (Kwok et al. (1990) Nucl Acids Rres. 18:999).

El procedimiento de amplificación utilizado puede ser, o bien reacción en cadena de polimerasa (conocida por sus siglas en inglés, PCR; Saiki et al., ((1988), Science 239:487-491), reacción en cadena de ligasa (conocida por sus siglas en inglés, LCR; Landgren et al., ((1988), Science 241:1077-1080), Wu & Wallace, ((1989) Genomics 4:560-569); Barany, ((1991), Proc Natl Acad Sci. USA 88:189-193), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (conocida por sus siglas en inglés, NASBA; Guatelli et al., ((1990), Proc Natl Acad Sci. USA 87:1874-1878), Compton ((1991), Nature 350:91-92) sistema de amplificación basado en transcripción (conocida por sus siglas en inglés, TAS; Kwoh et al., (1989) Porc Natl Acad Sci. US 86:1173-1177), amplificación de desplazamiento de cadena (conocida por sus siglas en inglés, SDA; Duck, ((1990) Biotechniques 9:142-147); Walker et al., ((1992) Proc Natl Acad Sci. USA 89:392-396) o amplificación por medio de replicasa de QB (Lizardi et al., ((1988)Bio/Technology 6:1197-1202), Lomeli et al., ((1989) Clin Chem 35:1826-1831) o cualquier otro procedimiento del estado de la técnica adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico.

Los polinucleótidos preferidos para su uso como partidores o como sondas, o para diseñar ulteriores partidores y sondas para su uso en procedimientos de la divulgación, se representan por los indicadores secuenciales 12 a 57.

Los polinucleótidos pueden diferir en cuanto a su secuencia de alguno de los polinucleótidos representados por los identificadores secuenciales 12 a 57, bien por adición o eliminación de cualquiera de sus extremidades respectivas de uno o varios nucleótidos, o por cambio de uno o más nucleótidos dentro de dichas secuencias, o una combinación de ambos, siempre que los equivalentes entonces obtenidos se hibriden aún con la secuencia objeto. Dichos polinucléotidos equivalentes comparten al menos un 80 % de homología, preferiblemente más del 85 %, más preferiblemente más del 90 % de homología, y más preferiblemente más del 95 % de homología con los polinucleótidos no modificados correspondientes.

Al usar un equivalente de un polinucleótido, puede ser necesario modificar las condiciones de hibridación para obtener la misma especificidad que el polinucléotido no modificado correspondiente.

Como consecuencia, será también necesario modificar de forma acorde la secuencia de otros polinucleótidos cuando dichos polinucléotidos van a ser usados en conjunto bajo las mismas condiciones de hibridación. Estas modificaciones pueden hacerse de acuerdo a principios como los descritos en Hames, B., y Higgins, S. (Editores): Nucleic acid hybridation. Practical approach, IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985.

Los polinucleótidos partidores y/o sondas de la divulgación pueden comprender también nucléotidos análogos tal es fosforotioatos (Matsukura et al., ((1987) Proc Natl Acad Sci. USA 84(21): 7706-7710), alquilofosforotioatos (Miller et al., ((1979), Biochemistry 18(23):5134-5143) o ácidos nucleicos péptidos (Nielsen et al., ((1991) Science 254 (5037):1497-1500); Nielsen et al., ((1993) Nucl Acids Res. 21(2):197-200) o pueden contener agentes de intercalación (Asseline et al., ((1984) Proc Natl Acad Sci. USA 81(11):3297-3301), etc.

Los partidores o sondas modificados exigen adaptaciones con respecto a las condiciones bajo las cuales se usan, con objeto de obtener la especificidad y sensitividad exigidas. Sin embargo, los resultados de la hibridación deberían permanecer sustancialmente idénticos a los obtenidos con los polinucleótidos no modificados.

La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa con objeto de influenciar algunas características tales como la cinética de hibridación, reversibilidad de la formación híbrida, estabilidad biológica de las moléculas polinucleotídicas, etc.

Las sondas y partidores de la divulgación se usan en procedimientos, que son también objeto de la presente divulgación, para la detección e/o identificación de las especies de Serratia, en concreto de Serratia marcescens, Serratia ficaria y/o Serratia fonticola.

La detección y/o identificación de las secuencias objeto puede ser llevada a cabo por el uso de un procedimiento de electroforesis, un procedimiento de hibridación o un procedimiento de secuenciación.

Un procedimiento de la divulgación para la detección de una o más especies de Serratia en una muestra comprende las siguientes etapas:

-

Primero, y necesariamente, los ácidos nucleicos presentes en la muestra son puestos a disposición para la amplificación y/o hibridación.

-

En segundo lugar, y también si es necesario, los ácidos nucleicos, caso de estar presentes, son amplificados co uno u otro sistema de amplificación objeto. Usualmente, es necesaria la amplificación para fortalecer la señal de hibridación subsiguiente. Sin embargo, para algunas muestras, o para algunos sistemas altamente sensitivos de amplificación de señal, podría no ser necesaria la amplificación.

-

En tercer lugar, los ácidos nucleicos presentes en la muestra o el producto amplificado resultante son contactados con sondas, y se permite así la hibridación.

-

Finalmente, los híbridos se detectan usando un sistema de detección conveniente y compatible. Puede deducirse la presencia o ausencia de una, dos o más especies de Serratia de la/s señal/es o modelo/s de hibridación observada/os.

Para la etapa de amplificación, pueden usarse los partidores ubicados en las zonas contiguas conservadas (gen 16S y 23S) de la región intergénica del ARNr, también llamados partidores universales. La pareja de partidores representada por los identificadores secuenciales 58 y 59 son ejemplos de partidores universales.

Para algunas aplicaciones, puede ser apropiado amplificar no todas las bacterias presentes en la muestra sino de uno o varios géneros, o una o varias especies de Serratia.

En el último supuesto, esto puede ser conseguido por el uso de partidores específicos de género o partidores específicos de especies derivados de la región de ITS de especies de Serratia.

En concreto, un procedimiento de la divulgación para la detección y/o identificación de las especies de Serratia en una muestra comprende las etapas de:

(i)

Opcionalmente, aislar y/o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra;

(ii)

Opcionalmente, amplificar la/s región/es intergénica/s de ARNr 16S-23S o, al menos, una de las secuencias objeto o un/os fragmento/s de las mismas, con al menos un par de cebadores adecuado;

(iii) Contactar los ácidos polinucléotidos con al menos una sonda polinucléotida que hibrida con al menos una de las secuencias objeto seleccionadas del grupo consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, sus homólogos, su forma de ARN donde T es reemplazado por U, su forma complementaria y sus fragmentos;

(iv)

Detectar los híbridos formados, e

(v)

Interpretar la/s señal/es obtenida/s e inferir la presencia de las especies de Serratia y/o identificar las especies de Serratia en la muestra.

Un fragmento, como se mencionó por ejemplo en la amplificación de la etapa de hibridación de cualquiera de los procedimientos de la divulgación, puede comprender o consistir de alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300 nucléotidos contiguos de una molécula de ácido nucleico de la divulgación.

Preferiblemente, las sondas de la divulgación hibridan bajo condiciones de alta dificultad.

Bajo condiciones de alta dificultad, sólo se forman híbridos complementarios de ácido nucleico. De forma acorde, la dificultad de las condiciones de ensayo determina la cantidad de complementariedad que se necesita entre dos cadenas de ácido nucleico que forman un híbrido. Se escoge la dificultad para maximizar la diferencia de estabilidad entre el híbrido formado con el ácido nucleico objeto y el ácido nucleico no objeto.

En cualquier caso, las condiciones de hibridación apropiadas son elegidas de tal manera que la señal de hibridación obtenida cuando un polinucléotido de la divulgación hibrida específicamente con una secuencia objeto es diferente de la señal obtenida cuando dicho polinucléotido se hibrida con una secuencia objeto de una forma no específica.

En la práctica, las diferentes señales pueden ser visualizadas, por ejemplo, cuando su intensidad es dos, cinco, diez o más veces más fuerte con una hibridación específica con el objeto, en comparación con la hibridación no específica con la secuencia objeto. El sistema de ensayo de sonda linear (conocido por LiPA, por sus siglas en inglés) es un buen ejemplo al respecto.

Las diferentes señales pueden ser también visualizadas cuando se dibujan diferentes picos en un análisis de curva de fusión, por ejemplo, cuando se usa una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (conocida por PCR por sus siglas en inglés) en tiempo real.

En una realización, una técnica muy conveniente y ventajosa para la detección de secuencias objeto que, posiblemente, estén presentes en la muestra, es la técnica PCR en tiempo real.

Hay diferentes formatos para la detección de ADN amplificado que pueden ser usados en la estructura de la presente invención, especialmente las sondas TaqMan®, sondas de balizas moleculares (u oligobalizas), “Scorpions”, o sondas de hibridación de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (conocida por FRET, por sus siglas en inglés).

En cuanto a las sondas TaqMan®, una sonda de hibridación de cadena simple es marcada con dos componentes. Cuando el primer componente, el llamado fluoróforo o fluorocromo, es excitado con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere al segundo componente, el llamado desactivador fluorescente, de acuerdo con el principio de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. Durante la etapa de alineamiento o unión del partidor de la reacción en cadena de la polimerasa, la sonda de hibridación se enlaza al ADN objeto es degradada por la actividad exonucleasa 5’-3’ de la polimerasa, por ejemplo Polimerasa Taq, durante la fase de elongación. Como resultado, el componente fluorescente excitado y el desactivador fluorescente están distanciados entre sí y, así, puede ser medida una emisión de fluorescencia del primer componente (EPB 0543 942 y US 5.210.015).

En cuanto a sondas de oligobalizas, las sondas están también marcadas con un primer componente con un desactivador fluorescente, estando preferentemente ubicados los marcadores en extremos diferentes de una sonda al menos parcialmente autocomplementaria. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes están espacialmente adosados. Después de la hibridación con los ácidos nucleicos objeto, ambos componentes se separan entre sí de tal forma que, tras la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, puedea ser medida la emisión de fluorescencia del primer componente (US 5.118.801).

En cuanto las “Escorpiones”, tenemos que, en una sola molécula, se contienen una sonda y un partidor. De forma similar al sistema de oligobalizas, cada sonda está marcada con un primer componente y con un desactivador fluorescente, estando ubicados los marcadores en diferentes extremos de una sonda al menos parcialmente autocomplementaria. Un partidor está enlazado con cada sonda por la intermediación de un tapón de PCR que impide que la estructura secundaria se abra en ausencia de la secuencia objeto específica (Whitcombe, D. et al., (1999) Nature Biotechnology 17:804-807; Thelwell, N. et al., (2000) Nucleic Acids Research vol. 28, No 19: 3752-3761; Svanvik et al., Analytical Biochemistry 287:179-182 (2000)).

El formato de análisis de las sondas de hibridación de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) es especialmente útil para todo tipo de ensayos de hibridación homogénea (Matthews, J.A., y Kricka, L.J. (1988) Anal Biochem 169:1-25). Se caracteriza por dos sondas de hibridación de cadena simple que se usan de forma simultánea y son complementarios a lugares adyacentes de la misma cadena de un ácido nucleico objeto (amplificado). Ambas sondas están marcadas con componentes fluorescentes diferentes. Cuando son excitadas con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia de tal forma que una emisión de fluorescencia del segundo componente puede ser solamente medida cuando ambas sondas de hibridación enlazan con posiciones adyacentes de la molécula objeto que ha de ser detectada.

Cuando se alinean con la secuencia objeto, las sondas de hibridación deben estar situadas muy próximas entre sí, en una disposición de pies a cabeza. Habitualmente, el hueco entre el extremo 3’ marcado de la primera sonda y el extremo 5’ marcado de la segunda sonda es tan pequeño como sea posible, y, principalmente, consiste de entre 0 a 25 pares de base, y, preferiblemente, de 1 a alrededor de 5 pares de base. Esto permite una proximidad entre el componente donante FRET y el componente aceptante FRET, que es, generalmente, de entre 10-100 Angström.

De forma alternativa a la monitorización del incremento en la fluorescencia del compuesto aceptante, es posible monitorizar la disminución de fluorescencia del compuesto donante FRET como una medición cuantitativa del acontecimiento de la hibridación.

Entre todos los formatos de detección conocidos en el estado de la técnica de PCR en tiempo real, se ha comprobado que el formato de sonda de hibridación FRET es altamente sensitivo, exacto y fiable (WO 97/46707; WO/46712; WO 97/46714). Además, el diseño de las secuencias adecuadas de sonda de hibridación FRET puede, algunas veces, estar limitado por las especiales características de la secuencia objeto de ácido nucleico que ha de ser detectada.

Como alternativa al uso de dos sondas de hibridación FRET, es también posible usar un cebador con marca fluorescente y sólo una sonda de polinucleótido marcada (Bernard, P.S., et al., (1998) Anal. Biochem. 255:101-7). A este respecto, se puede elegir de forma arbitraria, que el cebador esté marcado o bien con el donante FRET o bien con el aceptante FRET.

La fluorescencia puede medirse durante la etapa de elongación, generando curvas de amplificación de las que, dependiendo de los cebadores y/o sondas utilizados, de su Tm y de las condiciones de hibridación, es posible inferir la presencia de las especies de Serratia que han de ser detectadas o inferior qué/cuáles especie/s de Serratia está/n presente/s.

Las sondas de hibridación FRET (o sondas FRET) pueden ser también usadas para análisis de curva de fusión (WO 97/46707; WO/46712; WO 97/46714). En tal ensayo, el ácido nucleico objeto es primeramente amplificado en una reacción PCR ordinaria con cebadores de amplificación adecuados. Las sondas de hibridación pueden estar ya presentes durante la reacción de amplificación o ser añadidas subsiguientemente. Tras completar la reacción de PCR, la temperatura de la muestra es incrementada consecutivamente. La fluorescencia se detecta en cuanto la sonda de hibridación está ligada al ADN objeto. Al llegar a la temperatura de fusión, la sonda de hibridación es liberada de su objeto, y la señal fluorescente pasa a disminuir, de forma inmediata, hasta alcanzar el nivel previo. Esta disminución es monitorizada con una estructura adecuada de fluorescencia/temperatura-tiempo de tal forma que pueda ser calculado lo negativo de una primera función derivativa. El valor de temperatura correspondiente al máximo conseguido de dicha función es tomado entonces como la temperatura de fusión determinada de dicho par de sondas de hibridación FRET.

Las mutaciones de punto o polimorfismos dentro del ácido nucleico objeto resultan en una complementariedad menor al 100% entre el ácido nucleico objeto y las sondas FRET, resultando así en una temperatura de fusión reducida. Esto permite una detección de una serie de variantes secuenciales por medio de hibridación de sondas FRET, con lo que, subsiguientemente, diferentes miembros de dicha serie pueden diferenciarse por medio de la realización de análisis de curva de fusión.

En lugar de sondas de hibridación FRET, pueden utilizarse oligobalizas, de forma alternativa, para el análisis de curva de fusión.

Con la disponibilidad de análisis de curva de fusión PCR en tiempo real y PCR en tiempo real homogéneo, se hizo posible la diferenciación de determinados tipos de especies o cepas usando o bien tintes que enlazan ADN de doble cadena tales como SybrGreen®I, o, alternativamente, sondas de hibridación específicamente diseñadas que hibridan diferentes, pero similares, secuencias objeto.

En el primer caso, ha de ser determinada la temperatura de fusión del producto PCR generado de doble cadena. Sin embargo, este procedimiento tiene sólo aplicaciones limitadas, en cuanto las pequeñas diferencias no pueden ser monitorizadas de forma eficiente, porque las variaciones menores de secuencia solamente resultan en sutiles diferencias de temperatura de fusión.

De forma alternativa, las sondas de hibridación pueden ser usadas de tal forma que la temperatura de fusión de la sonda / híbrido de ácido nucleico objeto esté siendo determinada.

Ha diferentes plataformas PCR en tiempo real que pueden ser utilizadas, tales como los equipos ABI/Prism®, y, en concreto, el dispositivo LightCycler®, todos ellos basados en el mismo principio consistente en la medición de la emisión de luz, monitorización continuada del punto máximo de emisión durante el ciclo de fusión, determinación y visualización de las temperaturas (puntos máximos de fusión) a las que las sondas marcadas se despegan de los productos de amplificación. Los datos del punto máximo de fusión son característicos de una secuencia concreta [sonda:objeto] porque los desfases entre sonda y objeto afectan a la cinética de la fusión, produciendo diferentes puntos máximos de fusión para cada especie de interés.

La plataforma LightCycler® ofrece muchas ventajas y, en concreto, una ganancia de tiempo y el posible uso de variados sistemas de detección de sonda fluorescente específica de secuencia, como sondas de hibridación, sondas TaqMan®, oligobalizas, sondas “Scorpion” y bi – sondas (SybrGreen®).

En un procedimiento preferido de la presente divulgación, se usa el sistema de sonda de hibridación, consistente en dos sondas de polinucleótido adyacentes derivadas de las secuencias objeto de la invención, en una orientación de pies a cabeza, separadas por unos pocos nucleótidos, generalmente de 0 a 25, preferiblemente de alrededor de 1 a alrededor de 5. Una de las sondas está marcada en su extremo 3’ por un tinte donante, la otra está marcada con una molécula aceptante en su extremo 5’, y está bloqueada en fosfato en el extremo 3’ (para impedir su actuación como cebador). El tinte donante es, generalmente, fluorosceina y la molécula aceptante es, generalmente LC Rojo 610, 640, 670 ó 705.

La detección de una secuencia objeto de la divulgación puede ser conseguida también por una cadena PCR marcada interna y una sonda de detección ubicada en la cadena opuesta. La señal es dependiente de la aproximación espacial de los tintes, y es dependiente de la cantidad del objeto.

Cuando ambas sondas son hibridadas con su secuencia objeto, la luz emitida por el donante se transmite al fluóroforo aceptante por Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés), y la fluorescencia emitida (610, 640, 670 ó 705 nm) puede ser detectada. La intensidad de la fluorescencia emitida se incrementa en paralelo al ADN objeto, producto de la amplificación.

Las sondas LightCycler® ofrecen la ventaja sobre las sondas TaqMan® de no necesitar hidrólisis y, en consecuencia, ninguna extensión adicional de los tiempos de PCR (alineación-elongación<12 segundos). Es posible, por tanto, aprovechar el ciclo térmico de alta velocidad de LightCycler®, y completar el programa PCR en sólo 45 minutos.

Y las generaciones recientes de plataformas PCR en tiempo real son capaces de monitorizar varias sondas en una reacción única, permitiendo la detección y/o identificación o diferentes Serratia, en el nivel de especies y/o la distinción de las diferentes regiones intergénicas de Serratia.

Además, se ha mostrado que los procedimientos diseñados para la tecnología TaqMan® pueden ser fácilmente convertidos a tecnología de sondas de hibridación con resultados equivalentes (Haematologica vol. 85 (12) pp. 12481254, Diciembre 2000).

En consecuencia, otro objeto de la divulgación es el referido a series de, al menos, dos sondas polinucleótidas, también conocidas como sondas de hibridación, hibridando ambas sondas a la misma secuencia objeto, adyacentes entre sí, con no más de 25 nucleótidos entre dichas sondas, preferiblemente con no más de 10 nucleótidos, en concreto con no más de 5 nucleótidos.

Cuando hay dos sondas, una está marcada con fluoróforo aceptante y la otra con un donante, de tal manera que en la hibridación de las dos sondas con la secuencia objeto, los fluoróforos donante y aceptante están distanciados de entre 0 a 25 nucleótidos entre sí, y, preferiblemente, de 0 a 5 nucleótidos entre sí.

Cuando hay más de dos sondas, al menos una está marcada con un fluoróforo aceptante y las otras con un donante (o viceversa) de tal forma que, al hibridarse las sondas con la secuencia objeto, los fluoróforos donante y aceptante están distanciados entre 0 a 25 nucleótidos entre sí, y, preferiblemente, de 0 a 5 nucleótidos entre sí.

Para detectar y/o identificar las especies de Serratia, en concreto las especies de Serratia que son relevantes desde un punto de vista clínico, puede ser usado un conjunto de al menos dos sondas polinucleótidas, hibridando dichas sondas con al menos una de las secuencias objeto seleccionadas del grupo consistente en los indicadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN en donde T es reemplazado por U, su forma complementaria, y homólogos, no habiendo más de 25 nucleótidos, preferiblemente no más de 5 nucleótidos, entre dichas sondas.

Un conjunto de sondas puede consistir también en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más sondas, pero, preferentemente, consiste en de 2 a 5 sondas.

Las series de sondas relacionadas en la Tabla 2 y sus homólogos son las series preferidas de la divulgación.

Pueden ser también usadas series de tres polinucleótidos, dos para su uso como cebador, la otra para uso como sonda. Entonces, uno de dichos cebadores y dicha sonda hibridan a al menos una de las secuencias objeto seleccionadas del grupo consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN donde T es reemplazado por U, su forma complementaria, y homólogos, no habiendo más de 25 nucleótidos, preferiblemente no más de 5 nucleótidos, entre dicho cebador y dicha sonda.

Las series de al menos dos polinucleótidos de la divulgación se usan en procedimientos para la detección y/o identificación de las especies de Serratia, en concreto de S. marcescens, S. ficaria y/o S. fonticola.

Un procedimiento de la presente divulgación para la detección y/o identificación de las especies de Serratia, en concreto de S. marcescens, S. ficaria y/o S. fonticola, comprende las fases de:

(i)

Opcionalmente, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos polinucleicos en la muestra

(ii)

Amplificar la región intergénica de ARNr 16S-23S, o, al menos, una secuencia objeto, o un fragmento de la misma, con al menos una pareja adecuada de cebadores;

(iii) Contactar los ácidos polinucleicos con al menos una serie de al menos dos sondas de hibridación que hibridan a al menos una secuencia objeto seleccionada del grupo consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN en la que T es reemplazado por U, su forma complementaria, algunos homólogos, o un fragmento de al menos 10, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma;

(iv)

Detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v)

Inferir la presencia de las especies de Serratia, o identificar las especies de Serratia en la muestra de

las señales de hibridación diferencial obtenidas en la fase (iv). Por ejemplo, una serie de dos sondas utilizadas en la etapa de hibridación pueden ser cualquier combinación de la sonda de hibridación representada por el identificador secuencial 26 con algunas de las sondas de hibridación representadas por los indicadores secuenciales 44 y 45, o sus homólogos.

La sonda de hibridación representada por el indicador secuencial 26 puede ser fluoresceína marcada y los otros pueden ser o bien LCR610, LCR640, LCR670 ó LCR705 marcadas.

Una de las ventajas del sistema de sondas de hibridación reside en el hecho de que permite la detección de variaciones secuenciales, incluyendo mutaciones, polimorfismos y otras especies de ácido nucleico variantes, basándose en el siguiente concepto molecular: una de las sondas de hibridación es una “sonda de anclaje”, enlazando firmemente, mientras que la “sonda sensora” adyacente abarca la zona de la variación secuencial. Durante la fusión del producto final de PCR, la alteración secuencial es detectada como un cambio en la temperatura de fusión (conocida por Tm, por sus siglas en inglés) de la sonda sensora.

Por ejemplo, si la muestra contiene solamente identificador secuencial 1, el uso de sondas de hibridación que hibridan específicamente dicho identificador secuencial 1, generaría un único punto máximo de fusión. Si hay un homólogo en la muestra, el uso de las mismas dos sondas de hibridación generaría dos puntos máximos, en cuanto hay al menos una sonda base mal emparejada que, generalmente, produce un cambio de temperatura fácilmente observable.

Dependiendo del formato de las sondas utilizadas para la detección de los productos de la amplificación, sobre los polinucleótidos seleccionados (o diseñados), sobre su Tm y sobre las condiciones de hibridación, la fluorescencia puede ser medida durante la fase de amplificación, generando entonces curvas de amplificación, o después de la fase de amplificación, para una análisis de curva de fusión, generando curvas de fusión.

Así, la/s señal/es obtenida/s puede/n ser visualizada/s en forma de curvas de amplificación o en forma de curvas de fusión, de lo que es posible inferir la presencia de especies de Serratia, e/o inferir cuál/es de las especies de Serratia está/n presente/s.

Un procedimiento para la detección y/o identificación de las especies de Serratia en una muestra comprende también las fases de:

(i)

Opcionalmente, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos polinucleicos en la muestra

(ii)

Amplificar al menos una secuencia objeto seleccionadas del grupo consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN en la que T es reemplazado por U, su forma complementaria, algunos homólogos, o un fragmento de al menos 10, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma, con una pareja de cebadores una de las cuales está marcada;

(iii) Contactar los ácidos polinucleicos con al menos una sonda de hibridación que hibrida, adyacente a dicho cebador marcado con menos de 25 nucleótidos entre medias, con dicha(s) secuencia(s) objeto,

(iv)

Detectar los híbridos formados, e

(v)

Inferir la presencia de las especies de Serratia, o identificar las especies de Serratia en la muestra de

las señales obtenidas en la fase (iv). Un procedimiento de la divulgación usando el sistema de sondas de hibridación, puede ser adaptado para la detección e identificación de una o varias especies de Serratia, permitiendo su distinción de otras especies de Serratia.

En concreto, un procedimiento de la divulgación que use el sistema de sondas de hibridación, puede ser adaptado para la detección e identificación de Serratia marcescens, permitiendo su distinción de otras especies de Serratia.

Entonces, en la etapa de amplificación, los cebadores adecuados son pares de cebadores que específicamente amplifican la/s secuencia/s objeto seleccionada/s de un grupo consistente en los identificadores secuenciales 1 a 5, su forma de ARN donde T es reemplazada por U, su forma complementaria y homólogos.

En la fase de hibridación, la sonda de hibridación deberían hibridar específicamente, por ejemplo, a alguno de los identificadores secuenciales 12 a 14, 21 a 23, 26, 27 a 32, 40 a 46, 49 y 50 a 56 o a su forma de ARN en donde T es reemplazado por U, o con su forma complementaria.

Por tanto, las cepas de S. marcescens y S. ficaria pueden ser inequívocamente distinguidas de todos los demás organismos examinados por análisis de curva de fusión.

No se obtuvieron señales relevantes con especies no de Serratia y con ADN genómico humano.

Una serie preferida de dos sondas de hibridación consiste en el identificador secuencial 26 u homólogos y en el identificador secuencial 44 ó 45 u homólogos.

Esta serie de sondas de hibridación consistentes en el identificador secuencial 26 y 44 ó 45 es apta para detectar Serratia marcescens con una alta sensibilidad.

Cada polinucleótido relacionado en la Tabla 4, correspondiente a los identificadores secuencias de 12 a 57 y cualquiera de sus homólogos, pueden ser usados en cualesquiera procedimientos de la presente divulgación como un cebador y/o como una sonda, solos o en combinación.

Una segunda realización también basada en un procedimiento de hibridación es la técnica del Ensayo de Sonda Lineal. El Ensayo de Sonda Lineal (conocido por LiPA, por sus siglas en inglés) es un formato de hibridación inversa (Salki et al., (1989), Proc Natl Acad Sci U.S.A. 16:6230-4) usando tiras de membranas sobre las cuales pueden ser convenientemente aplicadas, como líneas paralelas, varias sondas de polinucleótidos (incluyendo polinucleótidos de control negativo o positivo).

La técnica LlPA, como se describe por Stuyver et al. ((1993), J Gen Virol. 74 (Pt 6):1093-102) y en EPB 0637342, proporciona un análisis de hibridación rápido y fácil de usar. Los resultados pueden ser leídos en las 4 horas después del inicio de la amplificación. Después de la amplificación, durante la cual, generalmente, se incorpora una marca no isotópica al producto amplificado, y de la desnaturalización alcalina, el producto amplificado entra en contacto con las sondas sobre la membrana y la hibridación se lleva a cabo durante de alrededor de 1 a 1,5 horas. En consecuencia, los híbridos que se forman son detectados por un procedimiento enzimático resultando un precipitado visual púrpura – marrón. El formato LiPA es completamente compatible con dispositivos de escaneo disponibles en el mercado, produciendo así una interpretación automática de los posibles resultados. Todas estas ventajas hacen al formato LiPA adecuado para su aplicación en una disposición rutinaria.

El formato LiPA es una herramienta ventajosa para la detección y/o identificación de patógenos al nivel de las especies pero también a niveles taxonómicos más elevados o más bajos. Por ejemplo, las configuraciones de sonda sobre las tiras de LiPA pueden ser seleccionadas de tal forma que puedan detectar el género completo de Serratia o puedan identificar especies en el género (por ejemplo, S. marcescens, S. ficaria y/o S. fonticola, etc.) o pueden, en algunos casos, incluso detectar subtipos dentro de una especie.

La capacidad para generar simultáneamente resultados de hibridación con un gran número de sondas es otra ventaja de la tecnología LiPA. En muchos casos, la cantidad de información que puede ser conseguida por una combinación concreta de sonda supera ampliamente la cantidad de datos obtenidos por el uso de ensayos de sonda singular. En consecuencia, la selección de las sondas sobre la tira de membrana es de la mayor importancia en cuanto una serie optimizada de sondas generará el máximo de información posible.

Estas sondas pueden ser aplicadas a tiras de membranas en diferentes ubicaciones y el resultado se interpreta como positivo si al menos una de estas sondas es positiva. De forma alternativa, estas sondas pueden ser aplicadas como una mezcla en la misma ubicación, reduciendo, por tanto, el número de líneas sobre una tira. Esta reducción puede ser conveniente con objeto de hacer la tira más concisa o ser apta para aumentar el número total de sondas en una tira.

Otra posibilidad es el uso de sondas redundantes, que pueden simplificar considerablemente los procesos de fabricación de las tiras de LiPA.

Por razón de las propiedades mencionadas supra, el sistema LiPA puede ser considerado como un formato eficiente para un procedimiento de hibridación en el que varios organismos necesitan ser simultáneamente detectados en una muestra.

Sin embargo, debería ser claro que cualquier otro análisis de hibridación, en el que se usen diferentes sondas bajo las mismas condiciones de hibridación y lavado, puede ser utilizado para los procedimientos de detección y/o selección mencionados supra. Por ejemplo, puede ser posible la inmovilización de ácido nucleico objeto con un soporte sólido, y el uso de mezclas de diferentes sondas, todas marcadas de forma diferente, resultando en una señal de detección diferente para cada una de las sondas hibridada con el objeto. Y hoy en día están disponibles muchos soportes diferentes.

Como ejemplo, el procedimiento a seguir para la detección de una o más especies de Serratia en una muestra usando el formato LiPA es subrayado infra:

-

Primeramente, y si es necesario, los ácidos nucleicos presentes en la muestran son puestos a disposición para su amplificación y/o hibridación.

-

Opcionalmente, los ácidos nucleicos son amplificados con uno u otro sistema de amplificación objeto. Generalmente, se necesita la amplificación para reforzar la señal subsiguiente de hibridación.

-

En tercer lugar, y de forma eventual, después de una etapa de desnaturalización, los ácidos nucleicos presentes en la muestra o el producto amplificado resultante entran en contacto con tiras de LiPA sobre las que son inmovilizadas una o más sondas, que permiten la detección de los organismos de interés, permitiéndose que tenga lugar la hibridación.

-

Finalmente, de forma eventual, tras haber llevado a cabo una fase de lavado, los híbridos son detectados usando un sistema de detección conveniente y compatible. De la/s señal/es o forma/s de hibridación observadas, puede deducirse la presencia o ausencia de uno o varios organismos explorados en dicha muestra biológica concreta.

Pueden ser usados los cebadores universales ubicados en las zonas de flanco conservadas de la zona intergénica de ARNr, esto es, en el gen 16S y el gen 23S.

Para algunas aplicaciones puede ser apropiado amplificar no diferentes bacterias presentes en la muestra sino, más en concreto, especies de Serratia.

Un procedimiento de la divulgación para la detección y/o identificación de especies de Serratia en una muestra, comprende las etapas de:

(i)

Si es necesario, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos polinucleicos en la muestra

(ii)

Si es necesario, amplificar la región intergénica de ARNr 16S-23S, o una parte de la misma con al menos una pareja adecuada de cebadores;

(iii) Contactar los ácidos polinucleicos con al menos una sonda que hibride con la secuencia objeto consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, o su forma de ARN en la que T es reemplazado por U, su forma complementaria, algunos homólogos, o un fragmento de al menos 10, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma;

(iv)

Detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v)

Detección y/o identificación del/ de los microorganismo(s) presente(s) en la muestra de las señales de hibridación diferencial obtenidas en la fase (iv).

La parte del ITS mencionada en la fase de amplificación, es un polinucleótido que comprende la secuencia objeto, o la propia secuencia objeto, consistiendo la secuencia objeto de cualquiera de los identificadores secuenciales 1 a 11, o de su forma de ARN en la que T es reemplazado por U, o su forma complementaria, o cualesquiera homólogos, o de un fragmento de al menos 10, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma.

Preferentemente, la presente divulgación proporciona un procedimiento como el descrito supra, en el que se detectan simultáneamente al menos dos microorganismos. En un procedimiento preferido de la invención, en la etapa (iii) del procedimiento como se describe supra, se usa una serie de al menos dos sondas. Tal serie de sondas como la descrita en la etapa (iii) comprende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más sondas de la invención.

Las sondas preferidas son polinucleótidos de identificadores secuenciales 12 a 57, o de su forma de ARN en la que T es reemplazado por U, o su forma complementaria, o cualesquiera homólogos, o de un fragmento de al menos 10, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma.

La presente divulgación también pone a disposición un procedimiento como el descrito supra, en el que las sondas especificadas en la etapa (iii) se combinan con al menos una sonda de otro microorganismo, preferentemente también de la zona intergénica de ARNr 16S-23S, permitiendo la detección simultánea de diferentes bacterias patogénicas susceptibles de estar presente en la misma muestra.

Las sondas preferidas están diseñadas conseguir una realización óptima bajo las mismas condiciones de hibridación de tal forma que pueden ser usadas en series para la hibridación simultánea; esto incrementa de forma elevada la utilidad de estas sondas y resulta en una significativa ventaja en tiempo y trabajo.

Un equipo que contenga alguno de los polinucleótidos de la presente divulgación es también objeto de la misma.

Un equipo de la divulgación comprende los siguientes componentes:

-

Al menos un polinucleótido que hibride con la secuencia objeto consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, su ARN en la que T es reemplazado por U, su forma complementaria, o algunos de sus homólogos, o un fragmento de al menos 10, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma, para la detección e identificación de las especies de Serratia;

-

Un amortiguador de hibridación, o los componentes necesarios para su producción.

Un equipo preferido comprende

-

Al menos una serie de dos sondas de hibridación, adyacentes entre sí, con menos de 25 nucleótidos, preferiblemente menos de 5 nucleótidos, que hibride con la secuencia objeto consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, su ARN en la que T es reemplazado por U, su forma complementaria,

o algunos de sus homólogos, o un fragmento de al menos 10, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma, para la detección e identificación de las especies de Serratia;

-

Un amortiguador de hibridación, o los componentes necesarios para su producción.

En conclusión, usando el ITS Serratia como objeto, es posible diseñar sondas para su uso en diferentes procedimientos de detección y/o identificación.

Con el procedimiento PCR en tiempo real, por un lado es posible detectar e identificar el género Serratia – en concreto, S. marcescens, S. ficaria, y S. fonticola – usando una única sonda de hibridación que genera un único punto máximo de fusión en el sistema LightCycler® (ejemplo 4).

Por otro lado, una señal específica de la especie puede ser obtenida por la presencia de un punto máximo de fusión específico para una o más especies concretas (S. marcescens y S. ficaria en el ejemplo 3), o por la presencia de un punto máximo a una temperatura que es específica para una serie concreta (ver otra Serratia spp. en el ejemplo 3).

También puede usarse como un procedimiento para la detección e identificación de la especie Serratia (ejemplo 5), la secuenciación de la región ITS completa y su comparación con una secuencia de referencia como la dada aquí.

La descripción precedente o los ejemplos que siguen no deberían considerarse como limitadores de la invención a las realizaciones específicamente divulgadas aquí.

EJEMPLOS

Para los ejemplos descritos infra, la región intergénica (ITS) 16S-23S fue amplificada usando cebadores diseñados en zonas conservadas del ARNr 16s y ARNr 23S, respectivamente.

Ejemplo 1: protocolo LightCycler®

El ADN fue preparado de acuerdo con procedimientos normalizados, y fueron usados alrededor de 104 equivalentes genómicos como objeto para amplificación.

Una muestra era marcada como positiva si estaban presentes para la misma una curva de cuantificación y un punto máximo de fusión.

Las sondas fueron diseñadas para funcionar como sondas de hibridación en el LightCycler® v1.2 (software v4) permitiendo una detección PCR de fluorescencia en tiempo real.

Una sonda de hibridación fue marcada en su extremo 3’ con un tinte de fluoresceína, mientras que la sonda de hibridación vecina fue marcada en su extremo 5’ con un tinte LC-rojo 640 ó LC-rojo 705.

Siguiendo las instrucciones del fabricante del equipo “LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes” (catálogo nº 3003248 ó nº 2239272):

-

Puede ser usado cualquier material de muestra apto para PCR en términos de pureza, concentración, y ausencia de inhibidores;

-

Los cebadores deberían estar en concentraciones finales de entre 0,3 a 1 µM cada uno de ellos;

-Las sondas de hibridación en una concentración final de 0,2 µM cada una de ellas o cada par; 5 -La concentración de MgCl2 debería ser optimizada, y puede variar de 1 a 5mM;

-

Debería llevarse un doble control.

Las condiciones de amplificación y fusión se describen de aquí en adelante. Se usó la versión 4 del software LC. Los ajustes de cuantificación fueron F2/tras F1 (muestras). Para el ajuste de línea de base se utilizó el modo aritmético. El 10 cálculo del punto de cruce (Ct) se basó en el segundo máximo derivativo. EL procedimiento de cálculo para el punto máximo de fusión fue polinómico. La zona máxima fue utilizada para calcular la temperatura de fusión.

Tabla 1: programa de curva de fusión y amplificación:

Temp.(ºC)

Tiempo Inclinación (ºC/seg.) Modo de adquisición

Desnaturalización

95 95 50 72 10 min. 10 seg. 15 seg. 30 seg. 20 20 20 20 Ninguno Ninguno UNICO Ninguno

45x

Ciclos

Fusión

95 40 80 60 seg. 60 seg. 0 seg. 20 20 0.1 Ninguno Ninguno CONTINUO

Enfriamiento

30 0 seg. 20 Ninguno

Ejemplo 2: Diferentes conjuntos de sondas de hibridación

En este ejemplo, una sonda de hibridación fue marcada en su extremo 3’ con un tinte de fluoresceína, mientras que la sonda de hibridación vecina fue marcada en su extremo 5’ con tinte LC-Rojo 640 ó LC-Rojo 705.

Se aplicó el mismo protocolo LightCycler® que el descrito en el ejemplo 1.

Fueron evaluadas diferentes combinaciones de sondas usando el ADN genómico de las especies de Serratia y de otras bacterias clínicamente relevantes. Los primeros criterios de selección para combinaciones de sondas preferidas

25 fueron: calidad de la señal fluorescente que tuviera como resultado curvas de cuantificación y puntos máximos de fusión nic; detección de especies de Serratia marcescens y/o de Serratia en general en el mismo tiempo de fusión y falta de reacción cruzada con otras bacterias.

Identificadores secuenciales de fluoresceína marcada

Identificadores secuenciales LC-roja marcada Objetivo de diseño Cepas detectadas/cepas analizadas Preferido/más preferido

S. marcescens

S. ficaria Serratia spp. Otras bacterias

12

27 S. marcescens específico 1/1 - - - +

13

28 S. marcescens específico 9/9 1/1 2/4 - +

13

29 S. marcescens específico 16/16 1/1 - - +

14

30 S. marcescens específico 11/20 0/1 1/4 - (+)

14

31 S. marcescens específico 12/21 0/1 1/4 - (+)

14

32 S. marcescens específico 21/21 0/1 1/4 - (+)

15

33 Género Serratia 9/9 - - - +

16

34 Género Serratia 9/9 - - - +

16

35 Género Serratia 9/9 - - - +

17

36 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

17

37 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

17

38 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

18

36 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

18

37 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

18

38 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

19

36 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

19

37 Género Serratia 42/42 1/1 1/1 ++

19

38 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

Identificadores secuenciales de fluoresceína marcada

Identifica dores secuenci ales LCroja marcada Objetivo de diseño Cepas detectadas/cepas analizadas Preferido/ más preferido

S. marcescens

S. ficaria Serratia spp. Otras bacterias

17

33 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

18

33 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

19

33 Género Serratia 4/4 1/1 1/1 - +

19

39 Género Serratia 1/1 1/1 2/2 0/1 +

20

37 Género Serratia 42/42 1/1 4/4 0/1 ++

20

39 Género Serratia 7/7 1/1 2/2 0/1 +

24

47 Género Serratia 1/1 1/1 2/2 0/1 +

25

47 Género Serratia 7/7 1/1 2/2 0/1 +

25

48 Género Serratia 42/42 1/1 4/4 0/1 ++

21

40 S. marcescens específico 7/7 1/1 2/2 - (+)

21

41 S. marcescens específico 7/7 1/1 1/2* - ++

21

44 S. marcescens específico 1/1 1/1 2/2* - +

21

49 S. marcescens específico 11/11 1/1 2/2* - ++

22

40 S. marcescens específico 11/11 1/1 2/2 - (+)

22

41 S. marcescens específico 11/11 1/1 2/2* - ++

22

44 S. marcescens específico 24/24 1/1 4/4* 0/28 ++

22

46 S. marcescens específico 1/1 1/1 2/2* - +

Identificadores secuenciales de fluoresceína marcada

Identific adores secuenc iales LC-roja marcad a Objetivo de diseño Cepas detectadas/cepas analizadas Preferido/ más preferido

S. marcescens

S. ficaria Serratia spp. Otras bacterias

22

49 S. marcescens específico 7/7 1/1 1/2* - ++

23

42 S. marcescens específico 6/6 1/1 2/2* - ++

23

43 S. marcescens específico 6/6 1/1 2/2* - ++

23

44 S. marcescens específico 1/1 1/1 2/2* - +

23

46 S. marcescens específico 1/1 1/1 2/2* - +

13

46 S. marcescens específico 1/1 1/1 2/2* - +

26

44 S. marcescens específico 42/42 1/1 4/4* 0/56 ++

26

45 S. marcescens específico 42/42 1/1 4/4* 0/56 ++

26

46 S. marcescens específico 1/1 1/1 2/2* 0/1 +

26

49 S. marcescens específico 1/1 1/1 2/2* 0/1 +

*detectado por punto máximo con temperatura de fusión más baja

Ejemplo 3: Sondas de hibridación para distinguir S. marcescens y S. ficaria de otras especies de Serratia

Se usaron las sondas de hibridación representadas por los identificadores secuenciales 26 y 44 en un protocolo LightCycler® como el descrito en el ejemplo 1. El primero (identificador secuencial 26) fue marcado con fluoresceína y el segundo (identificador secuencial 44) fue marcado con LC-Rojo 640.

10 Se aplicó el mismo protocolo LightCycler® descrito en el ejemplo 1, y la muestra usada contenía una de las cepas de S. marcescens. Se observó un punto máximo de fusión específico de 58ºC.

La sensibilidad de esta sonda de hibridación fue evaluada utilizando 42 cepas de S. marcescens (10 originarias de Europa Occidental, 10 del Reino Unido, 10 del Sur de Europa, 10 de los Estados Unidos, y 2 de Japón). Todas las 15 cepas de S. marcescens tenían una curva de cuantificación visible con valores de cruce que variaban de entre 20.6 a

31.0.

Se observó un punto de fusión de 58ºC (STDEVA 0.29º C) para las cepas de S. marcescens analizadas, mostrando una sensibilidad de 100% para S. marcescens con esta serie de sondas de hibridación.

Con objeto de analizar su especificidad, fueron analizadas otras especies de Serratia y sus vecinos próximos. Las cepas de S. marcescens no pueden ser distinguidas de S, ficaria con esta serie de sondas de hibridación, resultando en un mismo punto máximo de fusión de 58º C para estas últimas especies. Debería hacerse notar que la relevancia clínica de S. ficaria es muy baja, y que esta especie se encuentra raramente en muestras clínicas. Las otras

5 especies de Serratia tuvieron un punto máximo de fusión en el margen de 55º C a 56º C, y, por tanto, podrían diferenciarse de S. marcescens. Especies íntimamente relacionadas, como Yersinia pseudotuberculosis e Y. enterocolitica tuvieron puntos máximos de fusión más bajos, en el margen de 46º C a 47º C.

Además de estas especies de Serratia y parientes próximos, fue analizado un conjunto grande de otros 10 organismos (ver Tabla 3) y fue realizado un experimento adicional con ADN humano. Ni el ADN humano ni los microorganismos analizados dieron ninguna curva de cuantificación ni ningún punto máximo de fusión.

Tabla 3: lista de microorganismos analizados por especificidad

Acinetobacter baumannii

Bartonella henselae

Aspergillus fumigatus

Bordetella pertussis

Candida albicans

Borrelis burgdorferi

Candida glabrata

Brukholderia cepacia

Candida krusei

Campylobacter jejuni

Candidia paravsilosis

Cardiobacterium hominis

Candida tropicalis

Citrobacter freundii

Enterobacter aerogenes

Clostridium perfringens

Enterobacter cloacae

Corynebacterium jeikeium

Enterococcus faecalis

Cryptococcus neoformans

Enterococcus faecium

Gemella haemolysans

Escherichia coli

Histoplasma capsulatum

Klebsiella oxytoca

Haemophilus influenzae

Klebsiella pneumoniae

Legionella pneumophila

Pseudomonas aeruginosa

Listeria monocytogenes

Proteus mirabilis

Moraxella (Branhamella) catarrhalis

Staphylococcus aureus

Morganella morganii

Staphylococcus epidermidis

Mycobacterium fortuitum

Staphylococcus haemolyticus

Mycobacterium tuberculosis

Stenotrophomonas maltophilia

Mycoplasma pneumoniae

Streptococcus sanguinis, Grupo “Sanguinis”

Neisseria meningtidis

Streptococcus agalactiae

Pantoea aggomerans

Streptococcus penumoniae

Peptostreptococcus magnus

Streptococcus pyogenes

Porphyromonas gingivalis

Actinobacillus actinonucetemcomitans

Prevotella denticola

Aeromonas hydrophila

Propionibacterium acnes

Bacillus cereus

Salmonella entérica v. enteridis

Bacterioides fragilis

Ejemplo 4: Sondas de hibridación para las especies de Serratia

Fueron analizadas cinco muestras conteniendo una cepa de S. marcescens, una de S. ficaria, una de S. 5 fonticola, una de S. grimessi y una de S. proteamaculans, respectivamente.

Las sondas de hibridación representadas por los identificadores secuenciales 20 y 37 fueron usadas en un protocolo LightCycler® como se describe en el ejemplo 1

10 Cada cepa generó una curva de cuantificación y se observó un punto de fusión a 56º C.

Otros géneros estrechamente relacionados, como las especies Yersinia no generaron ninguna curva de cuantificación ni punto máximo de fusión, indicando que el conjunto de hibridación utilizado es específico para Serratia spp.

Ejemplo 5: Detección e identificación de Serratia spp. por determinación de secuencia de nucleótido ITS

Se recibió una muestra sin una clara indicación de la especie de Serratia que se suponía que contendría.

La región intergénica de las especies a determinar fue amplificada usando cebadores universales ubicados en la región 16S y 23S.

Los amplicones fueron clonados en el vector pGEM-T (Promega) y las secuencias de nucleótido de ITS fueron 25 derivadas de acuerdo con la química de terminación de cadena de dideóxido utilizando cebadores ubicados en el vector plásmico.

Fueron encontradas regiones intergénicas conteniendoe tRNAglu y tRNAile-ala .

30 Estas secuencias ITS fueron remitidas a análisis secuencial, y, comparadas con las otras regiones intergénicas ya secuenciadas.

La secuencia de nucleótido de la región intergénica tRNAglu de la muestra a identificar difirió en 6 pares de base de 403 (98,5 % de homologías) al ser comparada con la secuencia nucleótida consensual de la región intergénica de la 35 región intergénica tRNAglu de la cepa-tipo para S. marcescens representada por el identificador secuencial 2.

La secuencia de nucleótido de la región intergénica tRNAile-ala de la muestra a identificar difirió en 18 pares de base de 471 (96,2 % de homologías) al ser comparada con la secuencia nucleótida consensual de la región intergénica de la región intergénica tRNAile-ala de S. marcescens representada por el identificador secuencial 4.

A la vista del algo grado de homología, se podría inferir que la muestra contenía S. marcescens.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un conjunto de dos sondas polinucleótidicas, comprendiendo cada sonda de 5 a 50 nucleótidos, hibridando dichas sondas específicamente a un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente en los indicadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN donde T es reemplazada por U, su forma complementaria, en donde no hay más de 25 nucleótidos entre dichas sondas, para la detección y/o identificación de la especie serratia.

2. 2.

   Un conjunto de al menos dos sondas polinucleotídicas de acuerdo con la reivindicación 1, siendo seleccionadas dichas sondas del grupo consistente de los identificadores secuenciales 12 a 57.

3. 3.

   Un conjunto de tres sondas polinucleotídicas, comprendiendo cada sonda de 5 a 50 nucleótidos, hibridando dichas sondas, específicamente, a un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de los identificadores secuenciales 1 a 11, su forma de ARN en donde T es reemplazado por U, su forma complementaria, en donde no hay más de 25 nucleótidos entre dichas sondas, para la detección y/o identificación de la especie Serratia.

4. 4.

   Una composición que comprenda al menos una serie de sondas polinucleotídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. 5.

   Un procedimiento para la detección de la especie Serratia que use al menos un conjunto de sondas polinucleotídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. 6.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 para la detección y/o identificación de la especie Serratia en una muestra, que comprenda las fases de:

   (i)

   Opcionalmente, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos polinucleicos en la muestra;

   (ii)

   Opcionalmente, amplificar la(s) región(es) intergénica(s) 16S-23S, o la(s) secuencia(s) objeto que comprenda(n) cualesquiera molécula(s) de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con al menos un par cebador adecuado;

   (iii) Contactar los ácidos polinucleicos con al menos una serie de sondas polinucleotídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 – 3 que hibridan con la(s) secuencia(s) objeto adyacente(s) entre sí con menos de 25 nucleótidos entre ellas,

   (iv)

   Detectar los híbridos formados, y

   (v)

   Interpretar la(s) señal(es) obtenida(s) e inferir la presencia de la especie Serratia y/o identificar la especie Serratia en la muestra

7. 7.

   Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6 en donde las dos sondas polinucleotídicas consisten de alguna combinación de polinucleótidos de los identificadores secuenciales 12 a 49.

8. 8.

   Un equipo para la detección y/o identificación de la especie Serratia comprendiendo los siguientes componentes:

   -

   Una serie de sondas polinucleotídicas descritas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

   -

   Un amortiguador de hibridación, o los componentes necesarios para producir dicho amortiguador.