ES2393930T3 - Cepa de TALAROMYCES EMERSONII y usos de la misma - Google Patents

Abstract

Una cepa termofila de Ta/aromyces emersonii, con el ND de deposito IMI 393751 o un mutante de la misma con un intervalo de temperatura de crecimiento de 30 a 90 'C yque secrete de forma activa enzimas a temperaturas por encima de 55 'C.

Description

Cepa de Ta/aromyces emersonii y usos de la misma

Introducci6n��

La presente invencion se refiere a una cepa de Ta/aromyces emersonii y a enzimas y a sistemas enzimaticos que

5 pueden aislarse de la misma, para su uso en el medio ambiente y tratamiento de residuos, produccion y procesamiento quimico y bioquimico, procedimientos biotecnologicos, en kits de ensayo o de diagnostico, prebioticos y simbioticos, productos sanitarios, alimentos y bebidas nuevos y funcionales produccion de tensioactivos, aplicaciones agricolas y horticolas.

En la actualidad Europa se enfrenta a una crisis en cuanto al tratamiento de residuos produciendose 2.000 millones

10 de toneladas de residuos cada ano. Muchos de estos residuos son organicos, derivados de materiales vegetales (biomasa), son ricos en carbohidratos (azucares) y por lo tanto representan un recurso valioso cuando se descomponen en sus azucares componentes. Otros tipos de residuos, tales como los residuos de frutas, se pudren y plantean un riesgo ambiental. Estos residuos generalmente se combinan con pienso porcino para extraer algun valor de ellos, sin embargo, se consideran residuos de bajo coste.

15 La biomasa representa una materia prima muy variada y variable, sin embargo es la materia prima energetica mas renovable de la tierra. Si se aprovechase, podria proporcionar una alternativa sostenible a las reservas de combustibles fosiles cada vez mas agotadas. Existe un interes global en convertir la reserva energetica de la biomasa en formas de energia utilizables. Aunque un importante centro de atencion ha sido la produccion de biocombustibles, tales como el bioetanol, para fines de transporte, tambien se han identificado mercados para co

20 productos valiosos generados durante la produccion de biocombustibles (por ejemplo CO2, restos ricos en lignina, materias primas quimicas). En la actualidad, en los Estados Unidos, anualmente se producen aproximadamente

11.360 millones de litros de etanol a partir del maiz, principalmente para su uso en el sector del combustible para transportes. Esto representa solo aproximadamente el 1% del consumo total de combustible de motor, y se preve que en el ano 2010, la produccion de bioetanol aumentara mas de 7 veces, e incluira otros sustratos de biomasa 25 tales como restos lenosos. Si los restos lenosos derivan de fuentes de "residuos" rapidamente renovables generalmente consideradas "maleza" o broza, puede derivarse un valor considerable tanto en cuanto a los costes del procedimiento, como en el cumplimiento de dianas de produccion y problemas ambientales locales. Las ventajas del bioetanol como una alternativa limpia y ecologica al petroleo y a otros combustibles fosiles son obvias. La adopcion global del bioetanol como un combustible de motor principal compensaria muchos de los problemas de

30 contaminacion del aire que son una caracteristica de las areas urbanas densamente pobladas. Los coches modernos pueden adaptarse facilmente para funcionar con mezclas de etanol/gasolina ("gasohol") y se dispone de nuevos motores que, como unica fuente de combustible, pueden utilizar etanol puro.

La biomasa vegetal, incluyendo especies de coniferas, es rica en carbohidratos complejos (polisacaridos) que pueden descomponerse por medios quimicos o enzimaticos en azucares fermentables sencillos. Por ejemplo, las 35 maderas blandas tales como las de picea Sitka y pino contienen (% en peso seco) aproximadamente 41-43% de celulosa (un polimero de unidades de glucosas unidas por β-1,4), 20-30% de hemicelulosa (una mezcla de polisacaridos que contienen manosa, galactosa, xilosa y arabinosa) y 25-30% de lignina, un polimero polifenolico no carbohidrato de alto valor calorifico. Por lo tanto, aproximadamente el 65-70% del peso seco de los restos lenosos son carbohidratos complejos que pueden usarse para proporcionar materias primas ricas en azucares para

40 fermentacion a bioetanol.

Los hongos representan una de las formas de vida microbianas mas importantes que descomponen tales materiales. Ta/aromyces emersonii es un hongo aerobio termofilo encontrado de forma natural en montones de compost y en otros ecosistemas que degradan materiales ricos en biomasa. La estabilidad termica es una caracteristica tipica de muchos de los sistemas enzimaticos de Ta/aromyces emersonii aislados hasta ahora. Considerada una especie de

45 "pudricion blanda", que puede dirigirse a todas las partes del material vegetal, este euascomiceto produce amplios sistemas enzimaticos modificadores de carbohidratos, incluyendo enzimas celuloliticas, hemiceluloliticas, pectinoliticas y amiloliticas, asi como una serie de actividades oxidasa/oxido reductasa y proteolitica. Por lo tanto Ta/aromyces emersonii puede acceder a sustratos de crecimiento complejos encontrados en su habitat natural.

McCarthy y col. (2005) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 32: 125-134 desvelan una comparacion de cepas de

50 Ta/aromyces emersonii productoras de beta-glucanasa mutantes por UV y de tipo silvestre con potencial en aplicaciones de elaboracion de cerveza. Moloney y col. (1983) Enzyme Microb. Technol. 5: 260-264 desvelan el aislamiento de mutantes CBS 814.70 de Ta/aromyces emersonii con actividad celulasa potenciada. Maheswari y col. (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 461-488 desvelan que la temperatura de crecimiento optima y maxima para Ta/aromyces emersonii es respectivamente de 40-45 y 55 DC.

55 Las Publicaciones PCT Nos WO 01/70998 y WO 02/24926 desvelan el aislamiento de celulasas de Ta/aromyces emersonii y en particular celulasas que tienen actividad β-glucanasa y xilanasa. La desventaja de estas enzimas es que solamente pueden dirigirse a un tipo (o a un numero limitado) de un constituyente (o constituyentes) de un sustrato. Por lo tanto para metabolizar un sustrato determinado es necesario identificar los componentes de ese

2 5

sustrato, producir polipeptidos que tengan actividad enzimatica adecuada para metabolizar estos componentes, producir una cantidad necesaria del polipeptido por procedimientos rutinarios, tales como, tecnicas recombinantes, modificar los polipeptidos, si fuese necesario, para modificar la termoestabilidad o el pH optimo, por ejemplo, de las enzimas, expresar el polipeptido y usar la enzima resultante para dirigir a ese constituyente de ese sustrato. Estos procedimientos son muy costosos y requieren mucho tiempo.

Ademas, estos procedimientos no tienen en cuenta el que algunas enzimas pueden mostrar mas de una actividad o, cuando se usan en combinacion con otra enzima, pueden tener eficacia modificada. Por lo tanto estos procedimientos podrian conducir a la sobreproduccion de enzimas que no se requieren conduciendo tambien por lo tanto a costes de gasto y tiempo excesivos. Existe por lo tanto la necesidad de disponer de enzimas y sistemas enzimaticos aislados de Ta/aromyces emersonii y un procedimiento para aislar tales enzimas y sistemas enzimaticos que supere las desventajas anteriormente mencionadas.

Tambien existe la necesidad de composiciones enzimaticas optimizadas, particularmente composiciones enzimaticas termoestables, para generar "jarabes" ricos en azucares fermentables, para su uso en proyectos de biomasa a bioetanol. Puesto que los sustratos de biomasa o materias primas diana para la produccion de bioetanol pueden variar de flujos de residuos (por ejemplo VFCW y OFMSW (Fraccion Vegetal de Residuos Recogidos y Fraccion Organica de Residuos Solidos Municipales) a cultivos agricolas (por ejemplo, maiz, remolacha azucarera, hierbas, etc.) a biomasa lenosa, la consecucion de la preparacion enzimatica correcta, a un coste de procedimiento bajo, para obtener maximo rendimiento de azucares fermentables es un reto significativo. Durante muchos anos, el coste de las enzimas usadas en la conversion de biomasa antes de la produccion de bioetanol por fermentacion microbiana ha sido un factor negativo importante. Es por lo tanto un objeto producir preparaciones enzimaticas de bajo coste para estos fines.

Las preparaciones enzimaticas derivan de fuentes fungicas termofilas, generalmente consideradas seguras (GRAS), mientras que las enzimas fungicas en uso hasta ahora en aplicaciones de bioetanol comerciales y de investigacion son principalmente de fuentes mesofilas (por ejemplo Trichoderma sp. G/ioc/adium sp., Aspergi//us sp. y Penici//ium sp.).

Tambien existe la necesidad de preparaciones enzimaticas que actuen a temperaturas de reaccion mas elevadas, es decir, las enzimas termoestables permiten tiempos de reaccion/etapas de tratamiento enzimatico mas cortos, permiten la pasteurizacion simultanea del hidrolizado, dan como resultado una hidrolisis/sacarificacion global significativa, tienen un potencial para reducir la carga enzimatica y/o un potencial para reciclar la preparacion enzimatica, todo lo cual puede servir para reducir costes asociados con el uso de estas enzimas.

Decaaraci6n�d� �aa�invenci6n

La presente invencion se refiere a una cepa de Ta/aromyces emersonii que se deposito en el Instituto Micologico Internacional (CABI Bioscience Reino Unido) el 2 de noviembre de 2005 con el numero IMI 393751.

La ventaja de usar Ta/aromyces emersonii como la fuente enzimatica es que es un microorganismo "generalmente considerado seguro" (GRAS) y tiene un largo historial de uso en los sectores alimentario, de bebidas, de piensos agricolas y farmaceutico.

La ventaja de esta nueva cepa de Ta/aromyces emersonii es que las enzimas derivadas de la misma tienen una actividad optima a temperaturas entre 54 DC y 85 DC, manteniendo algunas enzimas actividad a temperaturas de hasta 95 DC. Estas enzimas conservaran por lo tanto la actividad incluso cuando se deseen o se requieran temperaturas de procesamiento altas, por ejemplo, produccion de materias primas ricas en azucares para produccion bioquimica, biofarmaceutica, quimica o de biocombustibles (etanol y metano), en la que las temperaturas de reaccion de 65-90 DC facilitan velocidades de reaccion simultaneas mas altas, conversion de sustrato mas rapida y pasteurizacion simultanea de materias primas, lo que mejora el potencial de almacenamiento y transporte. Adicionalmente, ya que con estas enzimas pueden usarse temperaturas mas altas, cada procedimiento tiene un tiempo de reaccion mas corto de modo que hay un ahorro tanto de tiempo como de costes. Una ventaja adicional es que si la temperatura es suficientemente alta, se producira pasteurizacion destruyendo cualquier microorganismo no deseable que no pueda soportar tales temperaturas altas. Adicionalmente se ha mostrado que las enzimas purificadas a partir de esta cepa tienen una vida util mas larga.

La cepa de la invencion puede proporcionar un sistema enzimatico que comprende una celobiohidrolasa I o una celobiohidrolasa II o una mezcla de las mismas, una β-glucosidasa 1, una xilanasa y una endo-β-(1,3)4-glucanasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar este microorganismo para la bioconversion de plantas

o materiales derivados de plantas, tales como materiales de plantas virgenes de origen terrestre y marino, y flujos de residuos de los mismos, incluyendo restos de cafe, te, fermentacion de cerveza y bebidas, fruta y pieles/peladuras de fruta, peladuras de verduras, procesamiento de alimentos y hosteleria, residuos de hojas/horticolas, residuos florales, cereales y restos de procesamiento de cereales, otros residuos agricolas y de jardineria, residuos de produccion y tiendas de panaderia, productos de papel tales como revistas en color satinadas y periodicos en color, periodicos en blanco y negro, papel blanco, en color y reciclado, papel marron, bolsas de papel, cartulina y carton, tazas y platos de papel, panuelos de papel, toallitas, celofan y Sellotape® (cinta adhesiva), envases biodegradables,

3 5

residuos hospitalarios ricos en celulosa, tales como, vendas, papeles, toallitas, vendajes, mascaras, textiles tales como pijamas y toallas y para uso posterior en la produccion de biocombustible (bioetanol y biogas).

La cepa de la invencion puede producir un sistema enzimatico que comprende una celobiohidrolasa I o una celobiohidrolasa II o una mezcla de las mismas, una β-glucosidasa 1, una xilanasa y una endo-β-(1,3)4-glucanasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en la produccion de materias primas ricas en monosacaridos a partir de restos vegetales para la generacion de productos de alto valor, por ejemplo antibioticos, antibioticos y antivirales, carotenoides, antioxidantes, disolventes y otros compuestos quimicos y bioquimicos, incluyendo ingredientes de uso alimentario, aditivos para cosmeticos, oligosacaridos y glicopeptidos para investigacion y glicomica funcional.

La invencion proporciona una cepa termofila de Ta/aromyces emersonii, que tiene un intervalo de temperatura de crecimiento de 30 a 90 DC, con un intervalo optimo de 30 a 55 DC y que produce de forma activa enzimas a temperaturas por encima de 55 DC. La cepa de Ta/aromyces emersonii se deposito con el numero de deposito IMI 393751. La invencion se refiere a un mutante de la misma que tambien codifica enzimas termoestables, una enzima producida por la cepa que conserva actividad a temperaturas por encima de 55 DC. La enzima puede seleccionarse del grupo que consiste en enzimas modificadoras de carbohidratos, enzimas proteoliticas, oxidasas y oxidoreductasas.

La cepa de la invencion puede producir una composicion enzimatica que comprende una celobiohidrolasa I o una celobiohidrolasa II o una mezcla de las mismas, una β-glucosidasa 1, una xilanasa y una endo-β-(1,3)4-glucanasa. La composicion enzimatica puede comprender del 0,5 al 90% de celobiohidrolasa I o de una celobiohidrolasa II o una mezcla de las mismas, del 0,1 al 33% de β-glucosidasa 1, del 0,6 al 89% de xilanasa y del 0,4 al 68% de endoβ-(1,3)4-glucanasa.

La cepa de la invencion tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (10-30%), CBHII (1015%), β-(1,3)4-glucanasa (20-45%), β-glucosidasa (2-15%) y xilanasa (18-55%). La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: β-xilosidasa, a-glucuronidasa, exoxilanasa, α-L-arabinofuranosidasa, enzimas pectinoliticas, hemicelulasas, enzimas modificadoras de almidon, oxidoreductasa oxidasa y esterasas; y proteasas.

La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar este microorganismo en el procesamiento y reciclado de madera de construccion, madera y productos derivados de la madera. Es eficaz contra materiales lenosos altamente lignificados, y es resistente a posibles moleculas inhibidoras presentes en restos lenosos y materiales procesados (por ejemplo extractivos, resinas, productos de descomposicion de lignina, derivado de hidroxifurfural y furfural).

La cepa de la invencion tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (15-30%), CBH II (1040%), β(1,3)4-glucanasa (15-40%), β-glucosidasa (2-15%), xilanasa (15-30%) y 1-8% de β-xilosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: exoxilanasa; α-glucuronidasa; α-Larabinofuranosidasa; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogolacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa oxidasa y esterasas. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en procesamiento y reciclado textil. La cepa de la invencion tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (5-55%), CBH II (8-50%), β(1,3)4-glucanasa (10-30%), β-glucosidasa (0.5-30%), xilanasa (5-30%) y β-xilosidasa (0,1-10%). La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-Larabinofuranosidasa; α-glucuronidasa; otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas seleccionadas, esterasas; proteasa; y oxidasas. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar este sistema de cepa en la sacarificacion de residuos de papel.

La cepa de la invencion tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (2-10%), CBH II (210%), β(1,3)4-glucanasa (10-45%), β-glucosidasa (5-10%) y Xilanasa (1-30%). La composicion puede comprender adicionalmente una o mas de las siguientes: N-acetilglucosaminidasa; quitinasa; β(1,3)6-glucanasa; β-xilosidasa, αglucuronidasa; α-L-arabinofuranosidasa; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en estrategias antifungicas, de biocontrol y de control de lodo en los sectores medioambiental, medico y de la construccion (por ejemplo combate de la podredumbre seca), y en la industria de la pulpa y el papel (por ejemplo control de lodo).

La cepa de la invencion tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBHI (1-20%), CBH II (128%), β(1,3)4-glucanasa (15-40%), β-glucosidasa (2-15%), xilanasa (18-55%), β-xilosidasa (0,1-10%) y α-Larabinofuranosidasa (0,5-5,0%). La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes; αglucuronidasa; actividad modificadora de almidon; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/ oxidasa y esterasas; proteasa; exoxilanasa; otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas, acido fenolico y acetil(xilan)esterasas; proteasa; y actividades oxidasa modificadoras de lignina. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en aplicaciones horticolas, por ejemplo, para la produccion de nuevos

4 5

compuestos bioactivos para la promocion del crecimiento y la resistencia a enfermedades. Por ejemplo esta cepa puede usarse para la liberacion de glicosidos flavonoides bioactivos, para la produccion de oligogalacturonidos de materiales ricos en pectina, xiloglucooligosacaridos de xiloglucanos, galactooligosacaridos de galactanos, xilooligosacaridos sustituidos de xilanos vegetales o 1,3-glucooligosacaridos (laminarialoligosacaridos) de β-glucano de la pared celular fungica, o laminarano de algas, para promover el crecimiento en plantas, activacion de mecanismos de respuesta de defensa de plantas frente a patogenos vegetales y aumentar la resistencia a enfermedades, puesto que algunos de estos oligosacaridos (por ejemplo, los laminariloligosacaridos) pueden iniciar y mediar en las propiedades bioactivas que son antifungicas, antibacterianas y antinematodos.

La cepa de la invencion tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (5-30%), CBHII (115%), β(1,3)4-glucanasa (10-40%), β-glucosidasa (2-15%), xilanasa (18-48%), 0,1-20% de β-xilosidasa, 1-10%, αglucuronidasa y 0,1-5,0 % de α-L-arabinofuranosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: exoxilanasa; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa oxidasa y esterasas y proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en la produccion de piensos para animales para potenciar la digestibilidad de los piensos basados en cereales. Esta cepa degrada los componentes fibrosos de los piensos basados en cereales a oligosacaridos y monosacaridos (azucares sencillos), alguno de los cuales se absorben en el intestino y se metabolizan. La cepa tambien produce oligosacaridos 'prebioticos' (por ejemplo, glucooligosacaridos de enlace mixto de β-glucanos de cereales no celulosicos) que refuerzan el crecimiento de bacterias prebioticas, y pueden liberar antioxidantes, por ejemplo, acido ferulico, y producir oligosacaridos (glucurono-xilooligosacaridos sustituidos de xilanos del cereal) que tienen un efecto antibacteriano en especies de la microflora intestinal que se sabe que producen moleculas carcinogenicas (por ejemplo fenoles, aminas, etc.).

La cepa de la invencion tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (0,5-10%), CBH II (0,5-10%), β (1,3) 4-glucanasa (15-43%), β-glucosidasa (2-10%), xilanasa (30-88%), 0,1-2,0% de β-xilosidasa, 0,13,0% de α-glucuronidasa, 0,1-4,0% de α-L-arabinofuranosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: enzimas pectonoliticas; actividad modificada del almidon; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en la produccion de piensos basados en cereal que contienen bajo contenido en pentosa para animales monogastricos con digestibilidad mejorada y bajo contenido en β-glucano no celulosico. Los β-glucanos no celulosicos y los arabinoxilanos de los cereales tienen una alta capacidad para unirse al agua y generar soluciones altamente viscosas. Los animales monogastricos (por ejemplo cerdos y aves de corral) no pueden degradar estos carbohidratos, que alteran la captacion y biodisponibilidad de nutrientes importantes, aumentan la difusion de enzimas digestivas, alteran la mezcla adecuada de contenidos intestinales y actuan como una barrera fisica para la degradacion de las proteinas y almidon presentes en estos piensos. En general, estos polisacaridos pueden conducir a caracteristicas malas de rendimiento de crecimiento. La cepa en la presente invencion puede catalizar la degradacion de arabinoxilanos de cereales y β-glucanos no celulosicos para producir oligosacaridos (principalmente DP3-10), algunos de los cuales tienen posibles propiedades probioticas, sin la liberacion de azucares de pentosa (arabinosa y xilosa), que los animales monogastricos metabolizan mal y que pueden tener efectos antinutricionales. Se proporciona un procedimiento para usar cereales alternativos como piensos, por ejemplo, sorgo y maiz.

La cepa de la invencion puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (3-15%), CBH-II (3-15%), (1,3) 4-glucanasa (25-45%), α-glucosidasa (2-15%), xilanasa (18-55%), 0,5-7,0% β-xilosidasa, 0,5-10% de αglucuronidasa y 0,1-5,0% de α-L-arabinofuronosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: exoxilanasa; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; otras amicelulasas, incluyendo galactosidasa; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en la produccion de piensos funcionales con potencial bioactivo para su uso en el cuidado de la salud humana y veterinaria. Esta cepa puede producir oligosacaridos bioactivos a partir de materias primas con estado GRAS para su uso en el cuidado de la salud animal (animales de compania y de mayor tamano), incluyendo βglucooligosacaridos inmunoestimuladores de plantas y hongos terrestres y marinos, xilooligosacaridos con propiedades prebioticas y antimicrobianas de plantas terrestres y marinas, quitooligosacaridos con promocion del crecimiento, potencial antimicrobiano y antiviral de paredes celulares fungicas y de crustaceos, y compuestos fenolicos con potencial antioxidante.

La cepa de la invencion puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (1-15%), CBHII (1-15%), β (1,3) 4-glucanasa (10-45%), α-glucosidasa (2-10%), xilanasa (1-55%), 0,5-12% de β-xilosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa, α-L- arabinofuronosidasa; β (1,3) 6glucanasa; N-acetilglucosaminidasa; quirinasa, enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en la produccion de productos lacteos o dieteticos especializados, por ejemplo, productos alimenticios y formulaciones de bebidas para cuidados sanitarios geriatricos e infantiles. Por ejemplo, esta cepa puede usarse para la produccion de productos alimenticios facilmente digeribles, ricos en prebioticos, para la nutricion geriatrica e infantil, y tambien para la produccion de productos sin lactosa para

5 5

individuos con galactosemia o para los que son intolerantes a la lactosa.

La cepa de la invencion puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (1-10%), CBH II (5-15%), β (1,3) 4-glucanasa (15-40%), α-glucosidasa (2-30%), xilanasa (15-55%), 1-12% de β-xilosidasa, 1-8% de αglucuronidasa y 0,5-5,0% de α-L-arabinofuronosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa en los sectores de la panaderia y confiteria, y en la formulacion de nuevos productos de panaderia de comida sana. La cepa es adecuada para la utilizacion de nuevas materias primas/cereales, tales como, centeno, maiz y sorgo. La cepa puede aumentar el volumen de la barra de pan y potenciar la caducidad modificando selectivamente los componentes de arabinoxilano de las harinas de cereales, generar oligosacaridos prebioticos e inmunoestimuladores y efectuar la liberacion de moleculas antioxidantes (por ejemplo acidos ferulico y cumarico), y modificar la textura, aroma y propiedades sensoriales de los productos de panaderia y confiteria.

La cepa tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (1-20%), CBH II (140%), (1-40%), β (1,3) 4-glucanasa (15-45%), α-glucosidasa (2-30%), xilanasa (10-55%), 0,5-10% de β-xilosidasa, 0,1-5% de α-Larabinofuranosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: β (1,3) 6-glucanasa; N-acetilglucosaminidasa; quitinasa α-glucuronidasa; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; proteasa. Se proporciona un procedimiento para usar esta cepa en la generacion de compuestos precursores de sabor, aroma y sensoriales en la industria alimenticia liberando monosacaridos y disacaridos que pueden fermentarse en una diversidad de productos incluyendo acido citrico, vainillina, etc., liberando glicoconjugados aromaticos (precursores del aroma) de frutas/pulpas de fruta (por ejemplo, alcoholes aromaticos glicosilados encontrados en diversas frutas, incluyendo melon, asi como, geraniol, limoneno, etc.), peptidos con sabores salado, amargo y dulce, aminoacidos para la transformacion en edulcorantes (por ejemplo, fenilalanina) y moleculas fenolicas (acidos cinamicos, glicosidos flavonoides tales como quercetin-3-Oramnosido), que tienen propiedades de sabor, aroma o sensoriales o son precursores de tales productos, por ejemplo, ramnosa, que pueden bioconvertirse a furaneol, una molecula con sabor a fresa. Ademas, algunas de estas moleculas, tales como los glicosidos flavonoides tienen actividad antioxidante y antimicrobiana (anti-protozooaria).

La cepa tambien puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), β (1,3) 4glucanasa (10-45%), β-glucosidasa (2-30%), xilanasa (1-55%), 0,5-12% de β-xilosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-L-arabinofuronosidasa; β (1,3) 6-glucanasa; Nacetilglucosaminidasa; quitinasa α-glucuronidasa; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; otras hemicelulasas, incluyendo galactosidasas; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; y proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa para la generacion de alimentos funcionales, especificamente, la modificacion de carbohidratos vegetales (terrestres y algunos marinos) para generar productos alimenticios con propiedades promotoras de la salud potenciadas, por ejemplo, productos alimenticios enriquecidos en glucooligosacaridos inmunoestimuladores, xilooligosacaridos, oligosacaridos de soja, (arabino) gatactooligosacaridos (galacto) y/o (gluco) manooligosacaridos, gentiooligosacaridos, isomaltooligosacaridos y oligosacaridos de galatinosa, y promover la liberacion de moleculas antioxidantes tales como carotenoides y sustancias fenolicas (acidos cinamicos, catequinas y glicosidos flavonoides).

La cepa puede producir un sistema enzimatico que comprende CBH I (1-15%), CBH II (1-15%), β(1,3)4-glucanasa (10-45%), β-glucosidasa (1-15%), xilanasa (1-30%), 0,5-20% de β-xilosidasa. La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-L-arabinofuronosidasa; β(1,3)6-glucanasa; N-acetilglucosaminidasa; quitinasa; α-glucuronidasa; enzimas pectinoliticas, incluyendo galactosidasas, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa; actividad modificadora de almidon; oxidoreductasa oxidasa y esterasas; proteasa. La invencion tambien proporciona un procedimiento para usar esta cepa para la produccion de nuevas bebidas alcoholicas y no alcoholicas de diseno, zumos de frutas y bebidas sanas. Este sistema puede modificar β-(1,3) 4-glucanos, sustancias pecticas, arabinanos, xilanos, lactosa, proteinas y sustancias fenolicas para generar cervezas/cervezas rubias alcoholicas y no alcoholicas bajas en calorias, zumos de frutas y bebidas sanas con potencial sensorial, antioxidante, inmunoreforzador, antibacteriano y antiviral mejorado, por ejemplo, una cerveza "ligera" con bajo contenido en β-glucano residual para evitar la formacion de turbidez (pero suficiente βglucano para proporcionar caracteristicas organolepticas) que contiene glucooligosacaridos de enlace mixto bioactivos y acidos cinamicos (antioxidantes), o un zumo de frutas rico en fragmentos de pectina (oligosacaridos), que tienen un efecto prebiotico, y acidos cinamicos y glicosidos flavonoides que proporcionan potencial antioxidante.

La cepa puede producir una composicion enzimatica CBH I (1-25%), CBH II (1-28%), β(1,3)4-glucanasa (18-40%), βglucosidasa (2-30%), xilanasa (15-55%) y β-xilosidasa (0,7-20%). La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa (1-10%), α-L- arabinofuronosidasa (0,1-5,0%), 1-15% de exoxilanasa, 5-25% de enzimas pectinoliticas, 2-12% de actividad modificadora de almidon, 2-11% de hemicelulasas, 1-15% de oxidoreductasa/oxidasa y esterasas y 2-15% de proteasa. La composicion puede usarse en la produccion de

6 5

materias primas ricas en monosacaridos a partir de restos vegetales.

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (12-55%), CBH II (15-30%), β(1,3)4glucanasa (12-26%), β-glucosidasa (5-12%), xilanasa (5-30%), β-xilosidasa (0,1-10%) y α-L- arabinofuronosidasa (0,5-3,0%). La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa, otras hidrolasas incluyendo enzimas pectinoliticas, acido fenolico y acetil (xilan) esterasas, proteasa y actividades oxidasa modificadoras de lignina, proteasas y oxidasas. La composicion puede usarse en el procesamiento y reciclado de madera, productos de papel y papel.

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), β(1,3) 4glucanasa (15-45%), β-glucosidasa (1-15%), xilanasa (16-55%) y β-xilosidasa (0,5-7%). La composicion puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa, α-L- arabinofuronosidasa, exoxilanasa, enzimas pectinoliticas, enzimas con actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas y proteasas. La composicion puede usarse en la produccion de compuestos biofarmaceuticos, tales como oligosacaridos bioactivos (incluyendo 1,3(4) y 1,3(6)-glucooligosacaridos de enlace mixto, galactooligosacaridos, xiloglucooligosacaridos, oligosacaridos pecticos, xilooligosacaridos ramificados y lineales, (galacto) glucomanooligosacaridos, glicopeptidos y glicosidos flavonoides de plantas terrestres y marinas, restos vegetales, hongos y flujos de aguas residuales o productos secundarios ricos en azucares sencillos.

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (1-20%), CBH II (1-40%), β(1,2)4glucanasa (15-45%), β-glucosidasa (2-12%), xilanasa (1-35%) y β-xilosidasa (1-5%). La composicion enzimatica puede comprender ademas una o mas de las siguientes; α-glucuronidasa, α-L- arabinofuronosidasa, exoxilanasa, enzimas pectinoliticas, actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas y proteasas. La composicion puede usarse para aumentar la biodisponibilidad de biomoleculas con actividad antibacteriana y antiviral natural, incluyendo glicosidos flavonoides y cianogenicos, saponinas, oligosacaridos y fenolicos (incluyendo acidos ferulico y p-cumarico, epicatequina, catequina, acido pirogalico y similares).

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (3-15%), CBH II (3-15%), β(1,3) 4glucanasa (25-45%), β-glucosidasa (2-15%), xilanasa (10-30%) y β-xilosidasa (0,5-8%). La composicion enzimatica puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa, α-L- arabinofuronosidasa, exoxilanasa, enzimas pectinoliticas, actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas y proteasa. La composicion puede usarse para aumentar la biodisponibilidad de biomoleculas antioxidantes naturales, por ejemplo, carotenoides, licopenos, xantofilas, antocianinas, fenolicos y glicosidos de todos los materiales, restos, residuos vegetales, incluyendo diversos frutos y bayas.

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (1-25%), CBH II (1-40%), β(1,3) 4glucanasa (15-40%), β-glucosidasa (2-15%), xilanasa (18-35%) y β-xilosidasa (0,5-12%). La composicion enzimatica puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa, α-L- arabinofuronosidasa, enzimas pectinoliticas, actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas y proteasa. La composicion puede usarse para la generacion de piensos a partir de materias primas vegetales, restos vegetales y residuos para su uso en la produccion microbiana de antibioticos por hongos y bacterias, incluyendo Penici//ium sp. y Streptomyces sp.

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (1-30%), CBH II (1-40%), β(1,3)4glucanasa (15-40%), β-glucosidasa (2-15%), xilanasa (18-35%) y β-xilosidasa (0,5-8%). La composicion enzimatica puede comprender ademas una o mas de las siguientes; α-glucuronidasa, α-L-arabinofuronosidasa, enzimas pectinoliticas, actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas; exoxilanasa y proteasas. La composicion puede usarse en la generacion de piensos a partir de materias primas vegetales, restos vegetales y residuos para su uso en la produccion microbiana del acido citrico.

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (2-15%), CBH II (2-15%), β(1,3)4glucanasa (20-45%), β-glucosidasa (2-25%), xilanasa (1-30%) y β-xilosidasa (0,5-8%). La composicion enzimatica puede comprender ademas una o mas de las siguientes; α-glucuronidasa, α-L-arabinofuronosidasa, enzimas pectinoliticas, actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas, exoxilanasa y proteasas. La composicion puede usarse en la produccion de oligosacaridos a partir de polisacaridos de algas (por ejemplo, laminarano y fucoidano) y aditivos derivados de extractos vegetales, por procedimientos generalmente considerados seguros, en la formulacion de cosmeticos.

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (3-30%), CBH II (1-10%), β(1,3)4glucanasa (10-45%), β-glucosidasa (2-12%), xilanasa (1-48%) y β-xilosidasa (0,1-8%). La composicion enzimatica puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa, α-L- arabinofuronosidasa, enzimas pectinoliticas, actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas, exoxilanasa y proteasas. La composicion puede usarse en la produccion de oligosacaridos y glicopeptidos para su uso como reactivos de investigacion, en la produccion de biodetectores y como herramientas en glicomica funcional para explorar interacciones de tipo receptor-ligando y en la produccion de bibliotecas de sustratos para realizar los perfiles de especificidad de enzima-sustrato.

7 5

La cepa puede producir una composicion enzimatica que comprende CBH I (5-15%), CBH II (5-30%), β(1,3)4glucanasa (20-45%), β-glucosidasa (1-12%), xilanasa (10-30%) y β-xilosidasa (0,5-8%). La composicion enzimatica puede comprender ademas una o mas de las siguientes: α-glucuronidasa, α-L-arabinofuranosidasa, enzimas pectinoliticas, enzimas con actividad modificadora de almidon, hemicelulasas, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas y proteasas. La composicion puede usarse para la produccion de celulosa modificada y β-glucanos, celooligosacaridos, almidones modificados y maltooligosacaridos, lactulosa y polioles (por ejemplo, manitol, glucitol o dulcitol, xilitol, arabitol).

Como materia prima puede usarse un sustrato producido por cualquiera de los procedimientos anteriores en la produccion de biocombustible y bioetanol o biogas tal como metano o dioxido de carbono, siempre que se produzca por ese procedimiento. La ventaja de usar esta cepa para producir bioetanol o biogas, es que este es un procedimiento rentable para producir, a partir de un producto residual poco valioso, un producto valioso que puede usarse en muchas industrias. Al mismo tiempo que produce un producto valioso, hay una reduccion de los residuos lo que a su vez tiene un impacto positivo en el medio ambiente.

Todos los procedimientos descritos anteriormente podrian llevarse a cabo con las composiciones enzimaticas como se han definido en el presente documento o con las cepas microbianas descritas en el presente documento.

La invencion tambien proporciona el uso de la cepa o mutantes de la misma que comprende ademas el uso de enzimas derivadas de otras especies fungicas incluyendo Chaetomium thermophi/e y Thermoascus aurantiacus.

La cepa del microorganismo es Ta/aromyces emersonii IMI 393751 o un mutante de la misma que tambien es capaz de producir enzimas capaces de tener actividad a temperaturas de, o por encima de, 55 'C.

Se describe ademas un procedimiento para obtener un sistema enzimatico adecuado para convertir un sustrato diana comprendiendo el procedimiento: obtener una muestra del sustrato diana; permitir que crezca un inoculo de una cepa de microorganismo en el substrato diana y secrete enzimas; recuperar las enzimas secretadas durante el crecimiento en el substrato diana; determinar las actividades y propiedades enzimaticas; construir un perfil de expresion genico; identificar las proteinas enzimaticas y construir un perfil de expresion proteico; comparar la expresion genica con el perfil de expresion proteico; purificar las enzimas. Las enzimas pueden despues conservarse. El procedimiento puede comprender ademas analizar las enzimas y/o disenar un sistema enzimatico.

Descripci6n�detaaaada�de aa�invenci6n

La invencion se entendera mas claramente a partir de la siguiente descripcion, proporcionada solamente como ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Figura 1: esquema de proceso para un procedimiento de diseno de un sistema enzimatico adecuado para convertir un sustrato diana. Figura 2: Generacion de una materia prima rica en azucar para la produccion de biocombustible por tratamiento termoenzimatico de pulpa/orujo de manzana. Figura 3: Cromatograma en capa fina de los productos generados durante la hidrolisis de vasos de papel. Figura 4: Microscopia electronica de vasos de papel antes (0 h) y despues (24 h) del tratamiento con el coctel enzimatico de Ta/aromyces emersonii inducido en vasos de papel demostrando amplia hidrolisis del sustrato diana. Figuras 5A-D: Comparacion de la produccion de xilanasa por la cepa 393751 y la cepa de tipo silvestre CBS

549.92 (anteriormente CBS 814.70). Figuras 6A-E: Comparacion de la produccion de glucanasa y (galacto) mananasa por la cepa 393751 y la cepa de tipo silvestre CBS 549.92. Figura 7: Reduccion del volumen de residuos clinicos ricos en celulosa esterilizados, catalizado por los cocteles de 10 enzimas a 50'C despues de 24 horas. Figura 8: Reduccion del volumen de residuos clinicos ricos en celulosa esterilizados por STG catalizado por los cocteles de 10 enzimas a 70'C despues de 24 horas. Figuras 9A-B: Residuos ricos en celulosa no tratados (A) y residuos tratados con enzimas (B). Figuras 10A-B: Produccion de etanol por S. cerevisiae en hidrolizados obtenidos por tratamiento de residuos clinicos ricos en celulosa esterilizados a 70'C durante 24 h (humedad al 60%) con coctel 5 (A) y coctel 8 (B). Figura 11A: efecto del pH sobre la actividad celulasa en los cocteles de T. emersonii . Figura 11B: efecto del pH sobre la actividad xilanasa en los cocteles de T. emersonii. Figura 12: efecto de la temperatura sobre la actividad celulasa en los cocteles de T. emersonii. Figura 13: efecto de la temperatura sobre la actividad xilanasa en los cocteles de T. emersonii. Figura 14: Actividad de la nueva xilanasa purificada frente a diferentes xilanos. OSX, xilano de cascarillas de avena (Oat Spe/ts Xy/an); WSX, xilano de paja de trigo (Wheat Straw Wylan); LWX, xilano de madera de alerce (LarchWood Xy/an); BWX, xilano de madera de abedul (BirchWood Xylan); RM, Rodimenano (1,3; 1,4-β-D-xilano de algas rojas). La actividad se expresa como un % relativo al xilano de cascarillas de avena (100%). Figura 15A-B: Actividad de (A) Xyn IV y (B) Xyn VI purificados frente a diferentes xilanos. La actividad se

8 5

expresa como un % relativo al xilano de cascarillas de avena (100%). Figura 15 C-D: Actividad de (C) Xyn VII y (D) Xyn VIII purificados frente a diferentes xilanos. La actividad se expresa como un % relativo al xilano de cascarillas de avena (100%). Figura 15E-F: Actividad de (E) Xyn IX y (F) Xyn X purificados contra diferentes xilanos. La actividad se expresa como un % relativo al xilano de cascarillas de avena (100%). Figura 15G: Actividad de Xyn XI purificado, frente a diferentes xilanos. La actividad se expresa como un % relativo al xilano de cascarillas de avena (100%). Figura 16: % de actividad relativa de Xyn XII purificado frente a una diversidad de polisacaridos purificados. OSX, xilano de cascarillas de avena (Oat Spe/ts Xy/an); BBG, β-glucano de cebada (Bar/ey β-g/ucan); LIC, liquenano (Lichenan); CMC, carboximetilcelulosa; LAM, laminarina; D1, dextrano; D2, dextrina; INU, inulina; ARA, arabinano; GAL L, Galactano (Lupino); GAL P, Galactano (Patata); RG, Ramnogalacturonano; LWAG, arabino-galactano de madera de alerce (LarchWood Arabino-Ga/actano) Figura 17: Actividad especifica de Xyn XII purificado frente a aril β-xilosidos y aril β-glucosidos. Figura 18: Comparacion de las actividades especificas de xilanasas seleccionadas expresadas por IMI393751 y CBS549.92 frente a OSX, xilano de cascarillas de avena, como sustrato de ensayo.

En referencia a la Figura 1, se proporciona un esquema de proceso para disenar un sistema enzimatico para convertir un sustrato diana. En la etapa 1 se obtiene un sustrato diana. En la etapa 2, el sustrato diana se inocula con el microorganismo que se cultiva en el sustrato diana para proporcionar un cultivo. El microorganismo secreta enzimas y estas enzimas se recuperan en la etapa 3, obteniendo muestras del cultivo. Las muestras de cultivo se separan en fraccion celular y filtrado de cultivo en la etapa 4. La fraccion celular (ARNm) se analiza en la etapa 5, para determinar las actividades y propiedades enzimaticas. En la etapa 6, se construye un perfil de expresion genico basandose en el analisis de la etapa 5. En la etapa 7, el filtrado de cultivo se explora con respecto a la actividad proteica y se construye un perfil de expresion proteico en la etapa 8. En la etapa 9 se comparan los perfiles de expresion proteica y genica. En la etapa 10 las enzimas se purifican. Las enzimas pueden conservarse en la etapa 11 y en la etapa 12 las enzimas pueden analizarse adicionalmente y en la etapa 13 se disena un sistema enzimatico.

Se ha descubierto que cuando se usa un hongo como microorganismo, se obtienen mejores resultados cuando el sustrato se inocula con el micelio del hongo. Este cultivo se lleva a cabo preferentemente en un fermentador y las condiciones de reaccion variaran dependiendo del tipo de microorganismo y del sustrato usado. El cultivo puede estar en forma de fermentacion en estado liquido o solido. Para Ta/aromyces emersonii es preferible una temperatura de cultivo en la region de 45' a 65', e stando activas de forma optima las enzimas hasta 85-90 'C.

Las enzimas se recuperan del sustrato diana por separacion de la biomasa celular (fungica) del filtrado de cultivo extracelular usando centrifugacion en el caso de enzimas producidas por fermentacion liquida, o con la ayuda de un sistema de separacion de celulas para cultivos mayores. Las enzimas se recuperan despues de la fraccion de biomasa celular por homogeneizacion de un peso conocido de la biomasa en dos volumenes de tampon. Los tampones adecuados incluyen acetato de amonio 50 mM, pH 4,5-6,0 o fosfato sodico 50 mM, pH 7,0-8,0. Para la extraccion de enzimas para cultivos en estado solido, los cultivos se mezclaron con 10 volumenes de tampon de fosfato de citrato 100 mM, pH 5,0 que contenia Tween 80 0,01% (v/v), homogeneizado y extraido agitando durante 2 horas a 140 rpm a temperatura ambiente. Se recupera despues un extracto rico en enzimas por centrifugacion.

Es esencial realizar una comparacion del sistema enzimatico a niveles tanto de genoma como de proteoma, es decir, se compraran los genes, los productos de expresion (ARNm) y las proteinas identificados. Esto se debe a que puede haber informacion genetica presente que se exprese a nivel de ARNm, pero que no se traduzca a proteina funcional a nivel proteico. Para determinar la abundancia relativa de determinadas enzimas son importantes los analisis transcriptomicos, genomicos y proteomicos.

Un aislado de la cepa de hongo filamentoso, del que se han aislado algunas de las enzimas, se ha depositado en el Instituto Micologico International (IMI) (CABI Bioscience Reino Unido), Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey TW20 9TY, Reino Unido para los fines del procedimiento de patentes el 22 de Noviembre de 2005, con el ND de deposito IMI 393751. Despues de la purificacion de las enzimas estas pueden, opcionalmente, conservarse o analizarse directamente para obtener (a) informacion detallada sobre la actividad termica/termoestabilidad individual en propiedades cataliticas y funcionales generales, (b) informacion detallada sobre su modo de accion y potencial catalitico, individualmente y en combinacion, (c) informacion sobre interacciones sinergicas, (d) informacion de secuencia parcial que ayudaria en la clonacion de los genes y (e) en algunos casos, obtener suficiente proteina para facilitar la recogida de los datos estructurales tridimensionales. El analisis de estas enzimas se aprovecha despues para identificar sistemas enzimaticos clave y momentos de recogida optimos para estos sistemas. Los sistemas pueden optimizarse con respecto a niveles de actividades clave y combinaciones de enzimas clave, caracteristicas y condiciones de rendimiento (a escala de laboratorio) para aplicaciones diana.

Ejempao 1 T. emersonii IMI393751,�aisaamiento

Se colocaron esquejes de hierba (cesped) limpia recien recogida (∼ 200 g) y otra biomasa vegetal mixta en un recipiente cerrado para simular un ambiente de compostaje, y se incubaron en una camara a temperatura constante, a 65 'C, durante aproximadamente 2 horas (pasteurizacion y equilibracion combinadas del sustrato). El contenido de humedad/humectacion se mantuvo a ∼ 65-70%. El recipiente se equipo con una linea que proporcionaba un pulso

9 5

bajo de aire humedo, filtrado, a intervalos. Despues de 2 horas, se uso una suspension de esporas (1 x 108 esporas en agua esteril al 2%) de T. emersonii (reservas de laboratorio de un aislado de 12 anos de vida, originalmente de CBS814.70) para inocular la region central de la biomasa. La temperatura se mantuvo a 65 'C durante 2 dias, y se aumento en intervalos de 2 'C cada 24 horas a continuacion hasta que se alcanzo una temperatura en el aire de 70 'C en el interior de la camara. El cultivo se dejo crecer durante 7 dias mas antes de que se retirara, de forma aseptica, una muestra del "punto caliente" inoculado o region central y se transfiriera a placas de agar (medio de agar de Emerson para hongos termofilos), y se subcultivo, para asegurar la pureza del cultivo; la pureza se verifico por analisis microscopico. Se inoculo medio liquido que contenia nutrientes basicos (Tuohy y col. 1992; Moloney y col., 1983) y glucosa al 2% (p/v) con trozos de 1 cm2 de tapiz de micelio a partir de cultivos en placas de agar de 36 horas de vida. Los cultivos liquidos se dejaron crecer a 55 'C durante 36 horas en matraces de Erlenmeyer de 250 ml (que contenian 100 ml de medio de crecimiento), con agitacion a 220 rpm. Despues de 36 horas, se extrajeron alicuotas (2,0 ml) de suspensiones de micelio, se lavaron de forma aseptica con agua esteril, se transfirieron a placas de Petri esteriles (10 mm de diametro) y se irradiaron con luz UV (ultravioleta) durante intervalos de tiempo cronometrados (10-60 segundos). Se inocularon medios de agar esteril (agar noble que contenia 0,2% p/v de represores de catabolitos individuales, tales como 2-desoxiglucosa) con muestras del micelio fungico irradiado. Se incubaron cultivos repetidos a 45 y 58 'C. Se seleccionaron cuidadosamente colonias individuales (de aspecto esponjoso de color blanco), se transfirieron de forma aseptica a placas de agar de dextrosa Sabouraud y se purificaron adicionalmente mediante diversas transferencias. La cepa IMI 393751 representa un aislado extraido de las placas incubadas a 58 'C. El mutante se evaluo en un estudio comparativo con el organismo parental, con respecto a la estabilidad termica potenciada y produccion enzimatica, lo que revelo claras diferencias entre ambas cepas en cuanto al aspecto del cultivo, capacidad para esporular (la cepa IMI 393751 es no-esporulante), termofilia y estabilidad, patrones de produccion enzimatica en condiciones de crecimiento identicas, expresion diferencial y niveles de actividades enzimaticas individuales.

Diferencias�fisioa6gica/micoa6gicas �entre�CBS ��14.70�e�IMI393751

Aspecto�dea�cuativo�durante ea�crecimiento en�diferentes medios�de�agar. Cuando la cepa CBS 814.70 se cultiva en agar de Emerson, tiene las caracteristicas tipicas de esta especie (Stolk y Samson, 1972), es decir, color beis/crema palido, con tonos amarillentos palidos cerca de la superficie del agar (alrededor de la zona de inoculacion), que se convierte en un color beis/marron rojizo mas fuerte a medida que el cultivo madura, y consiste en un tapiz de micelio denso de muchos ascomas. Por el contrario, la cepa IMI393751 es mucho mas blanca y el cultivo tiene un aspecto muy 'esponjoso'.

Diferencias con respecto a la esporulacion. La cepa CBS 814.70 es una cepa esporulante de T. emersonii, que produce conidioforos, ascos y ascosporas. Los conidioforos aparecen como ramas perpendiculares en las hifas (de color amarillo claro y septados). Los ascos, o sacos que contienen esporas, tienen una forma un tanto elipsoidal, y pueden encontrarse con frecuencia en cadenas; las ascosporas son lisas y de forma eliptica (aparecen de color verde en una microfotografia electronica). Por el contrario, el micelio de IMI393751 produce muy pocos conidioforos, ascos y ascosporas clasicos. Completamente al contrario que CBS814.70, la cepa IMI393751 solo produce un numero insignificante de esporas en condiciones extremas y bastante especificas, mientras que la cepa CBS 814.70 produce esporas en varios medios diferentes.

Diferencias con respecto a Termofiaia e intervaao de temperatura de crecimiento 6ptimo. La cepa CBS 814.70 tiene un intervalo de crecimiento estricto de 35-54'C, con poco crecimiento a temperaturas menores o mayores y un intervalo de crecimiento optimo de 40-45'C. Por otro lado, la cepa IMI393751, muestra un intervalo de temperatura de crecimiento mas amplio de 30-65 'C, con buen crecimiento a 80 DC, 85 DC y hasta 90 DC, con un optimo entre 4855 'C. La cepa IMI393751 crece muy bien a una temperatura >55 'C y continua produciendo niveles altos de biomasa fungica (micelio) y secretando activamente cantidades significativas de diversas proteinas.

Diferencias con respecto aa crecimiento a vaaores de pH mas aatos - La cepa CBS 814.70 no crece bien (de hecho comienza a morir) a valores de pH por encima de 6-6,5 (datos anteriores, Tuohy y Coughlan, 1992), mientras que la cepa IMI393751 crece bien y secreta niveles sustanciales de enzimas a valores de pH de hasta 9,0.

Crecimiento en condiciones de aimitaci6n de nutrientes/empobrecidas. IMI393751 sobrevive bien en cultivos con escasos nutrientes durante hasta 55 dias, mientras que CBS 814.70 experimenta autolisis a partir de 7 dias en adelante y despues de 15 dias quedan pocas celulas/micelios supervivientes. Los micelios recogidos de cultivos liquidos con escasos nutrientes de 55 dias de vida de IMI393751 podrian resucitarse por transferencia a medios de agar con dextrosa Sabouraud, mientras que, mediante la misma estrategia, los restos de micelios de la cepa CBS814.70 (55 dias de vida) no podrian revivir.

Ejempao 2: un sistema enzimatico de Talaromyces emersonii para convertir materiaaes hemiceaua6sicos. La hidrolisis completa de xilano requiere la accion sinergica de xilanasas, β-xilosidasa, α-glucuronidasa, α-Larabinofuranosidasa y esterasas. La Tabla 1 proporciona un ejemplo de sustratos diana seleccionados (incluyendo residuos/restos) y el porcentaje de la fuente de carbono inductora usada en este ejemplo. El porcentaje de induccion se refiere a la cantidad de fuente de carbono por volumen de medio (g/100 ml)

Tabaa1: Sustratos de crecimiento/fuentes de carbono inductoras para aa producci6n enzimatica por T. emersonii

Fuente�de�carbono Abreviatura % de�fuente�de�carbono�inductora

Xilano de madera de haya BEX 1,0 Xilano de madera abedul BWX 1,0 Xilano de cascarilla de avena OSX 1,0 Xilano de madera de alerce LWX 0,3 Arabinoxilano de trigo WAX 1,0 Virutas de picea SS 2,0-6,0 Material de envasado PK 0,5-6,0 Pajas de cereales CS 1,0-2,0 Vasos de papel PC 2,0-6,0 Papel de oficina blanco WOP 2,0-6,0 Hojas de te TL 2,0-4,0 Metil xilosa MEX 0,2 Xilosa Xyl 1 Acido glucuronico GlcA 1 Solka floc SF 2 A Glucosa Glc 2 A

A incluido con fines comparativos

Basandose en los resultados obtenidos, se diseno un sistema enzimatico usando enzimas purificadas de Ta/aromyces emersonii para la degradacion de una hemicelulosa (xilano) o de un producto, resto o residuo, derivado de madera, rico en xilano. En la Tabla 2 se indican las cantidades relativas de las enzimas clave presentes en el sistema enzimatico.

Tabaa 2: �Un�sistema�para aa degradaci6n�de�una �hemiceauaosao �de�un�producto�de madera�rico�en �iiaano.

ENZIMA A

%�REQUERIDO

Xilanasa Exoxylanasa β-Xilosidasa α-glucuronidasa α-L-arabinofuranosidasa Actividades accesorias modificadoras de biopolimeros (por ejemplo, celulasa, β-glucanasa no celulolitica, actividades pectinoliticas, actividades mananoliticas, acetil(xilan) esterasa, oxidoreductasa, proteasa)

10-50 % 4,0-25,0 % 0,1-5,0% 0,2-4,0% 0,1-5,0% 25-50%

Las cantidades relativas de las actividades principales, el perfil y las cantidades relativas de las actividades accesorias variaran dependiendo de la composicion del sustrato diana. La Tabla 3 resume los sistemas enzimaticos 10 de Ta/aromyces emersonii que se han disenado para aplicaciones especificas.

Tabaa 3: �Sistemas enzimaticos�especificos�adecuados �para�aa�degradaci6n de�oaigosacaridos �de iiaanos�de madera,�restos �de�papea de peri6dico y �aeoosos.

Sistema enzimatico y composici6n

Apaicaciones/sustrato�diana seaeccionados Dosificaci6n enzimatica** % de�hidr6aisis�de carbohidratos

Celulas de madera TE (inducido por LWX)*

Oligosacaridos de xilanos de madera xilano 15-30 nkat/g 91-100% (1-3 h)

Xilanasa 15-30% A

β-xilosidasa 0,2-1,0% α-glucuronidasa 0,1-3,0% α-L-arabinofuranosidasa 0,13,0%

Bioconversion de papel de periodico papel de periodico$ 11,5 -46,0 nkat/g 70-85% de carbohidrato presente% 34-50% (70 ' C/24

Celulasa 7-10%

h) A A

Glucanasa no celulosica, enzimas pectinoliticas,

Bioconversion de restos lenosos (por ejemplo, serrin, virutas, madera virgen, corteza, etc.) Restos lenosos 46,0-150 nkat/g 35-55% (80 DC/24h) A A

esterasas) 20-35%

A Los niveles de xilanasa se midieron con diferentes modelos de xilanos como sustratos * LWX, glucuronoarabinoxilano de madera de alerce ** Niveles de xilanasa: 45,2 UI/ml (753,5 nkat/ml), 40,9 UI/ml (681,8 nkatml) y 27,5 UI/ml (458,4 nkat/ml) con xilano de madera alerce, xilano de madera de abedul y xilano de cascarillas de avena como sustratos de ensayo, respectivamente; en el momento de la cosecha, en los que nkat = nanokatales (16,67 UI/ml)$ Dependiendo de la calidad del papel de periodico, es decir, en color frente a blanco y negro, pulido frente a acabado tosco/reciclado, etc. % de celulosa, 40-55%, y hemicelulosa, 25-40% como los tipos principales de carbohidratos presentes A A % Conversion de substrato de coniferas (fracciones no molidas y molidas en trozos grandes, no tratadas y previamente tratadas con acido diluido). El % de conversion total puede aumentarse (hasta 74%) usando este sistema enzimatico en una combinacion con otros sistemas enzimaticos de T. emersonii o Chaetomium thermophi/e, o amplificacion de actividades enzimaticas clave mediante la adicion de enzima recombinante.

Ejempao 3: Sistema de Talaromyces emersonii para convertir cereaaes, puapa de remoaacha y otros materiaaes�iincauyendo�residuos)�ricos�en arabinoiiaanos y �hemiceauaosas�acetiaadas.

5 La Tabla 4 proporciona cantidades relativas de diferentes actividades enzimaticas en sistemas enzimaticos disenados de Ta/aromyces emersonii , cepa IMI 393751 y dos cepas mutantes previamente identificadas disenadas para la conversion de cereales, pulpa de remolacha y otros materiales (incluyendo residuos) ricos en arabinoxilanos y hemicelulosas acetiladas.

Tabaa 4: �Actividades�enzimaticas�de�sistemas�para �aa conversi6n�de�materiaaes�ricos �en�arabinoiiaanos y 10 hemiceauaosas�acetiaadas

Preparaci6nenzimatica/composici6n

T. emersonii �iIMI 393751; �1:1 WB/BP�como inductor) T. emersonii �iIMI 393751; �poavo�de aagarroba como inductor) T. emersonii �iTC2 mutante; �WB como�inductor) T. emersonii �iTC5 mutante; �hojas�de�te�como �inductor)

Perfil de actividad enzimatica (%)

Perfil de actividad enzimatica (%)

Perfil de actividad enzimatica (%)

Perfil de actividad enzimatica (%)

Xilanasa

20-30 % 15-25 % 35-50 % 12-20 %

Exoxilanasa

5-10 % 2-5 % 10-15 % 2-8 %

β-xilosidasa

0,5-2,0% 0,2-1,5% 0,5-1,5% 0,1-1,0%

α-glucuronidasa

0,5-2,0% 0,2-1,5% 0,2-1,5% 0,2-1,5%

α-L-arabinofuranosidasa

0,5-2,0% 0,2-2,0% 0,2-1,2% 0,1-1,5%

Enzimas modificadoras de biopolimeros incluyendo acetil esterasa y acetil xilan esterasa

30-45 % 32-50 % 20-35 % 25-60 %

12 5

Ejempao 4: Sistema de Talaromyces emersonii para convertir materiaaes no ceaua6sicos, taaes como hojas de te y poavo de aagarroba. Caracterizacion de tres endoglucanasas (EG) nuevas, que son importantes tanto para la modificacion selectiva como para la degradacion de una diversidad de restos de cereales, incluyendo posibles candidatos para la fabricacion de cerveza y piensos animales, tales como sorgo, maiz y centeno. Estas tres enzimas se han purificado a partir de Ta/aromyces emersonii, cepa IMI393751.

El contenido total de carbohidratos de las preparaciones enzimaticas purificadas se determino mediante el procedimiento de acido fenolsulfurico (Dubois y col) por referencia a las curvas patron de glucosa o manosa (20-100 μg.ml-1).

Tecnicas de separaci6n de proteinas. Para obtener preparaciones altamente purificadas de EG V, EG VI y EG VII se necesitaron la filtracion en gel secuencial, el intercambio de iones, la interaccion hidrofoba, cromatografias de afinidad de lectina y cromatoenfoque (pseudo-intercambio de iones). Se realizo electroforesis en gel no desnaturalizante e isoelectroenfoque seguido por tincion con azul de coomassie mediante metodologia convencional conocida por el experto en este campo y proporcionada en las referencias relevantes (por ejemplo, Murria y col., 2001; Tuohy y Coughlan. 1992, Tuohy y col. 2002; Maloney y col., 2004). Los experimentos iniciales revelaron que los valores de pI de EG V-VII fueron < pH 3,5. Por lo tanto, se uso cromatoenfoque en PBE 94, pre-equilibrado con piperazina-HCl 0,025 M, pH 3,5, para determinar los valores de pI precisos para EG V-VII. Se determino que el pH correspondiente al pico de elucion para la β-glucanasa era el pI. Pudieron detectarse diferencias de 0,01 unidades de pH produciendo de este modo valores de pI precisos para cada enzima.

pH y temperatura 6ptimos y estabiaidades. Se determinaron los valores de pH optimos supervisando la actividad enzimatica a valores de pH entre 2,5 y 9,0, a 50 'C, en tampon fosfato de citrato de fuerza ionica constante. Para evaluar los efectos del pH en la actividad de EG V-VII, se incubaron muestras purificadas de cada enzima a pH 4,0, 5,0 y 6,0 a 50 'C. Se extrajeron alicuotas despues de 0, 1, 2, 3, 6, 9,12, 24, 36, 48 y hasta 336 horas (14 dias), se diluyeron de forma apropiada en tampon de NaOAc 100 mM, pH 5,0 (pH de ensayo normal) y se ensayaron con respecto a la actividad residual de acuerdo con el procedimiento de ensayo convencional. La estabilidad de cada enzima purificada se investigo a 50 'C, 60 'C, 70 ' C y 80 'C, en ausencia de sustrato. Las EG V-VII no fueron proteinas modulares porque ninguna de las tres enzimas se adsorbia en celulosa (u otros carbohidratos insolubles, es decir, no contenian union a carbohidratos).

Se evaluo la especificidad de sustrato en diversos polisacaridos y glicosidos sinteticos midiendo la actividad frente a una amplia diversidad de carbohidratos (BBG, liquenano, CMC, otros polisacaridos y glicosidos sinteticos) usando el procedimiento de ensayo de β-glucanasa normal.

Efectos de iones metaaicos, reactivos de modificaci6n quimica y posibaes inhibidores. Se investigo una serie de iones monovalentes, divalentes y de metales pesados, a concentraciones de ensayo final de 1,0 mM, con respecto a sus posibles efectos sobre las actividades de EG V, EG VI y EG VII, incubando las enzimas con los compuestos quimicos y realizando despues el ensayo enzimatico normal. Finalmente, se examinaron los efectos inhibidores de los glicosidos, tales como disacaridos, lactonas y glicosidos flavonoides en las enzimas purificadas. Se incluyeron concentraciones especificas de cada glicosido en cocteles de ensayo normales y la actividad residual se determino por comparacion con controles (sin glicosido presente).

En la Tabla 5 se proporciona un resumen de la purificacion de EG V, EG VI y EG VII, y parametros de purificacion tales como rendimiento (%).

Tabaa 5: �Resumen�de�aa purificaci6n�de enzimas �endogaucanasas�de Talaromyces emersonii

Etapa�de �purificaci6n

Actividad totaa�iUI) Proteina totaa�img) Actividad especifica iUI.mg·1) Factor�de purificaci6n�ii veces) Rendimiento i%)

Extracto en Bruto

54.806,2 573,1 95,6 1,00 100,00

Ultrafiltracion (Amicon DC2)

50.613,4 452,2 111,9 1,17 92,30

Propan-2-ol pptn.

50.016,9 364,8 137,4 1,44 91,30

Intercambio de aniones

(DE-52, pH 5,5) Fenil Sepharose

25.064,7 240,1 104,4 1,10 45,70

CL-4B

Pico 1

3.862,6 24,9 154,9 1,62 7,10

Pico 2

6.763,5 30,8 219,3 2,29 12,30

Pico 3

14.411,1 42,1 342,3 3,58 26,30

EG VII (Pico 1)

Concanavalina A

3.120,2 11,3 275,9 2,89 5,70

Sephacryl S-100 HR

670,1 3,2 212,5 2,22 1,20

13 5

(continuacion)

Actividad Factor�de

Actividad Proteina Rendimiento

Etapa�de �purificaci6n especifica purificaci6n�ii

totaa�iUI) totaa�img) i%)

iUI.mg·1) veces)

Cromatoenfoque

400,4 0,53 756,9 7,92 0,71

EGV, EGVI (Pico 3)

Intercambio de aniones (DE-52, pH 4,5)

4.662,3 10,40 447,4 4,68 8,50

Intercambio de aniones (DE-52, pH 7,0)

3.339,2 5,77 579,1 6,06 6,10

BioGel P-60

3.043,8 3,60 855,7 8,95 5,50

Concanavalina A

Pico 1

1.115,6 1,60 679,1 7,10 2,10

Pico 2

863,50 1,20 738,7 7,73 1,60

Cromatoenfoque PBE

94,

pH 3,5-2,0

EG V

415,3 0,54 764,8 7,99 0,76

EGVI

168,7 0,18 947,6 9,09 0,31

Los rendimientos, asi como los valores de actividad especifica finales, fueron similares para EG V y EG VII, mientras que EG VI se obtuvo a un menor rendimiento y tuvo una mayor actividad especifica.

Vaaores de Mr y pa de homogeneidad enzimatica. La tincion positiva con reactivo de Schiff (resultados no mostrados) indico que las tres enzimas eran glicoproteinas de una subunidad. La homogeneidad de cada preparacion enzimatica se verifico mediante IEF. Los valores de pl obtenidos fueron los siguientes EG V, 2,45; EG VI, 3,00; EG VII, 2,85.

Pruebas de gaicosiaaci6n y caacuao de coeficientes de eitinci6n moaar. Los contenidos de carbohidratos totales (p/p) fueron 22,6 p 0,1 %, 14,7 p 0,1 % y 65,9 p 0,04% para EG V, EG VI y EG VII, respectivamente. Los valores de coeficiente de extincion molar calculados (ε280) (mol.1.cm-1) fueron 1,04 x 10-5 para EG V, 8,80 x 10-6 para EG VI y 7,05 x 10-6 para EG VII.

pH y temperatura 6ptimos y estabiaidades. Las tres enzimas fueron activas a lo largo de intervalos de pH relativamente amplios pero mostraron valores optimos a pH acidos de 5,7, 5,4 y 5,7 para EG V, EG VI y EG VII, respectivamente. Se obtuvo un pH optimo de 4,5 para la actividad de BBGasa en el extracto en bruto de T. emersonii. Resulto evidente aproximadamente el 75% de la actividad optima entre pH 3,0 y 7,0 (EG V), pH 2,5 y 7,5 (EG VI) y pH 2,8 y 7,5 (EG VII).

La aiberaci6n de azucares reductores de BBG, a pH 5,0, durante 10 min, a 30-90 DC. Los valores de temperatura optimos para la actividad fueron 78,0 DC, 78,0 DC y 76,0 DC para EG V, EG VI y EG VII, respectivamente. Las energias de activacion (Ea), calculadas a partir de representaciones de Arrhenius, fueron 21,2 p 0,05 kJ.mol-1 para EG V, 23,5 p 0,02 kJ.mol-1 para EG VI, y 26,7 p 0,05 kJ.mol-1 para EG VII.

El efecto del pH sobre la estabilidad enzimatica se investigo a pH 5,0, pH 5,5 y pH 6,0 (a 50 DC y 70 DC). La estabilidad de pH fue mayor en el intervalo de pH 4,0-7,0, durante un periodo de incubacion de 1 hora, con una reduccion notable observada a pH < 4,0 y > 7,0. EG V no perdio actividad a pH 5,0 y a 50 DC durante un periodo de 15 dias, mientras que EG VI y EG VII perdieron actividad minima (13,0% y 11,5% respectivamente). Sin embargo, a 70 DC y el mismo pH, EG V, EG VI y EG VII perdieron 42%, 35% y 33% respectivamente, de la actividad original en cada muestra durante un periodo de 60 minutos. A pH 5,5 (50 DC), EG V, EG VI y EG VII perdieron 30%, 22% y 8% de sus actividades originales respectivas durante un periodo de 15 dias, pero a 70 DC, EG V se desestabilizo mas (reduccion del 58% de la actividad original despues de 60 minutos), mientras que la actividad de EG VI y EG VII despues de 60 minutos fue muy similar a la obtenida despues de incubacion a pH 5,5 y 70 DC. EG V fue considerablemente menos estable a pH 6,0 y a 50 DC perdiendo el 63% de su actividad original en 15 dias. EG VI y EG VII fueron considerablemente mas estables al ultimo pH con estabilidades similares a las determinadas a pH 5,5 (30% de perdida de actividad para ambas enzimas). Aumentando la temperatura de incubacion a 70 DC, la actividad de EG V se redujo notablemente (65%) durante un periodo de incubacion de 60 minutos (a pH 6,0), mientras que EG VII permanecio notablemente estable perdiendo solamente el 22% de su actividad original. Los valores de semivida (TY) fueron mayores de 15 dias a pH 5,0 y a 50 DC, mientras que a valores de 70 DC variaban de 67 minutos (EG V) a > 80 minutos (EG VI y EG VII.

Pruebas de aa estructura moduaar. EG V, EG VI, y EG VII se adsorbieron debilmente a Avicel (celulosa microcristalina) a pH 5,0 y a 4 DC (adsorcion del 8-15%); sin embargo, este grado de adsorcion no es indicativo de la presencia de un modulo de union a carbohidratos (CBM, Carbohydrate Binding Modu/e).

14 5

Efecto de aos iones metaaicos, modificadores quimicos y posibaes inhibidores sobre aa actividad enzimatica. Se investigaron los efectos de concentraciones finales 1 mM de una serie de cationes mono, di y multivalentes sobre la actividad de EG V, EG VI y EG VII. La actividad se expreso como un % en relacion con un control (sin ion metalico presente en mezcla de incubacion). En general, se cree que los iones metalicos pesados inactivan enzimas formando sales covalentes con cisteina, histidina o grupos carboxilo. Aunque varios de los iones metalicos, por ejemplo, Mg2+, Zn2+ y Mo6+ potenciaron la actividad de las tres enzimas y los iones tales como Ag+, Fe2+ y especialmente Hg2+ redujeron notablemente la actividad de EG V-VII, se observaron diferencias notables entre enzimas con respecto a los efectos de otros iones metalicos. Las sales de cloruro de Na+ y K+ no tuvieron ningun efecto o estimularon ligeramente la actividad de cada enzima, por ejemplo K+ aumento la actividad de EG VII en un 20%, mientras que Na+ potencio la actividad de EG V en >39%. Ba2+ y Ca2+ redujeron la actividad de EG V en 16,5% y 21,5-24,6%, respectivamente, mientras que ambos iones aumentaron la actividad de EG VI en 37,6% y 10%. Otros cationes divalentes, tales como, Cd2+, Co2+ y Cu2+ ejercieron un efecto inhibidor notable en EG V (∼26,5-77,4% de perdida de actividad). La inhibicion casi total de la actividad de las tres enzimas por Hg2+ sugiere la presencia de un grupo (o grupos) tiol esencial implicado en la catalisis. Se observo que la valencia modulaba la actividad, por ejemplo, Fe3+ ejercia un efecto negativo mas fuerte sobre la actividad de las tres enzimas (35,4-88,0% de reduccion de la actividad), a diferencia de Fe2+, que potencia de hecho la actividad de EG V en 20%, tiene efectos minimos sobre EG VII y reduce la actividad de EG VI en 38,6% (Fe3+ reduce la actividad de EG VI en 53,6-59,3%). La naturaleza del contra-anion, es decir, Cl-frente a SO42-tuvo un gran efecto sobre la actividad cuando se investigaron ambas sales de un anion particular. Las sales de SO42- de Ca2+ y Fe3+ potenciaron selectivamente la actividad de EG VII ∼2 veces y ∼4,5 veces, respectivamente, en relacion con la actividad observada con la sal de Cl-correspondiente. Por el contrario, la sal de SO42- de Mg2+ redujo notablemente la actividad de EG V (54,2%) y EG VI (50,1%) en relacion con la sal Cl-del mismo cation. Se ensayo una seleccion de reactivos que se sabe que modifican grupos R de aminoacidos con respecto a sus efectos sobre EG V, EG VI y EG VII, ambos en ausencia y presencia de sustrato (de esta manera pudieron observarse efectos protectores de sustrato) (vease la Tabla 6).

Tabaa 6: �Estudios�de�modificaci6n�quimica�para�identificar�grupos�de�aminoacidos �esenciaaes para�aa cataaisis�en�EG �V,�EG �VI y EG �VII

Reactivo�quimico

Enzima �r�reactivoa EGV EV�VI EG�VII EGV Sustrato�r�reactivob EV�VI EG�VII

Control

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

DL-DTT

218,9 514,3 575,0 264,3 915,5 348,6

Ditioeritritol

270,6 657,2 773,8 271,9 917,90 360,9

Dimetilsufoxido

125,5 124,3 194,0 93,6 141,7 100,0

Borohidruro sodico

96,1 125,0 194,0 81,5 104,8 82,8

Peryodato sodico

181,0 357,1 300,0 283,3 1001,2 469,7

Reactivo K de Woodward

162,7 280,0 305,9 121,1 266,7 143,0

Acido tioglicolico

211,1 187,1 188,1 148,1 269,0 150,0

o-Ftaldialdehido

106,1 100,0 155,0 94,6 139,0 98,8

N-bromosuccinimida (NBS)

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

p-cloromercuribenzoato

125,4 115,4 105,4 89,7 107,1 91,6

p-hidroximercuribenzoato

92,8 98,3 99,5 261,7 125,0 94,8

Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio

97,5 97,6 98,5 89,1 97,4 100,0

Yodoacetamida

103,6 99,9 101,6 87,4 122,6 83,7

Yodo

143,4 180,6 200,0 97,2 147,6 104,8

Cisteina

163,8 170,4 196,5 237,8 370,20 367,7

13 Incubacion (30 minutos) Enzima + 23 incubacion EG V EGVI EG VII (30 minutos) + NBS Control X 100,0 100,0 100,0

Cisteina

' 117,0 217,0 167,0

DDT

' 204,3 140,0 94,6

NBS

' 0,0 0,0 0,0

a Preincubacion de enzima con reactivo durante 30 minutos (50 DC) antes de la adicion de sustrato b Preincubacion de sustrato con reactivo durante 30 minutos (50 DC) antes de la adicion de sustrato

El fuerte efecto inhibidor de la N-bromosuccinimida (NBS) sugiere la implicacion del triptofano en la union y/o catalisis. Sin embargo, el o-ftaldialdehido, otro reactivo modificador de triptofano no tiene efecto neto sobre la actividad de EG V, EG VI o EG VII, por lo tanto la NBS podria modificar otro resto de aminoacido con el que se sabe que tiene reactividad secundaria, por ejemplo, la cisteina. Ademas, la incapacidad del sustrato para proteger contra la inactivacion de enzimas descartaria un papel directo para el triptofano en la union o catalisis. Puesto que tanto la cisteina como el ditiotreitol (DTT) protegieron contra la inactivacion, el efecto de la NBS puede deberse a reacciones secundarias, por ejemplo, oxidacion de cisteina. Los reactivos de sulfidrilo yodoacetamida, p-hidroximercuribenzoato y N-etilmaleimida provocan poca o ninguna inhibicion en presencia o ausencia de sustrato, lo que pareceria sugerir que EG V, EG VI y EG VII no tienen grupos tiol esenciales. Sin embargo, la cisteina, DTT y ditiotreitol activan las tres enzimas, especialmente EG VI y EG VII, lo que puede sugerir la reduccion de un disulfuro oxidado quizas durante la extraccion y/o purificacion enzimatica, restaurando de este modo la conformacion nativa

15 5

de la region del sitio activo de la enzima, o la molecula enzimatica en su conjunto. El borohidruro sodico, un agente reductor fuerte, inhibe las tres enzimas (especialmente EG VI) en presencia de sustrato. Por el contrario, la oxidacion de otros grupos reactivos en el sitio activo mediante la accion de agentes oxidantes fuertes, tales como, peryodato sodico, yodo y acido tioglicolico, potencian notablemente la actividad de las tres enzimas siendo los efectos mas pronunciados con peryodato sodico y EG VI, en presencia de un sustrato. El reactivo K de Woodward, un reactivo modificador de carboxilato, potencio la actividad de EG V, EG VI y EG VII, siendo mas eficaz en ausencia de sustrato.

En general, las sustancias fenolicas, tales como m-fenilfenol, (-)epicatequina, (+)catequina, acido o-cumarico, acido cafeico, acido ferulico, acido siringico y acido tanico, por nombrar algunos de los compuestos ensayados, no tuvieron un efecto inhibidor notable sobre la actividad enzimatica (en ausencia de sustrato) con la excepcion del acido tanico que es un inhibidor fuerte debido a su funcion precipitadora de proteinas. De hecho, algunos de los compuestos, por ejemplo, el acido protocatecuico, acido siringico, acido cafeico y alcohol polivinilico activaron notablemente las tres enzimas (resultados obtenidos durante la preincubacion de enzima con inhibidor en ausencia de sustrato). Sin embargo, cuando se incubaron conjuntamente con la enzima y el sustrato, se observo que varios de los fenolicos efectuaban una reduccion de la actividad de ∼7-32% (el sustrato no protegio a ninguna de las enzimas contra el fuerte efecto del acido tanico).

En general, la mayoria de los detergentes ensayados no dio como resultado perdida de actividad enzimatica. Sin embargo, el acido taurocolico, acido taurodesoxicolico, Tween 20 y Tween 80 redujeron todos la actividad de EG V, en 47,7%, 22,7%, 12,7% y 30,8% respectivamente, cuando se preincubaron con enzima antes de la adicion del sustrato. Con la excepcion de Tween 80 (perdida de actividad del 34,2%), la incubacion simultanea con sustrato restauro la actividad completa. Se observo actividad potenciada cuando se incubaron sustrato, enzima y detergente (acido desoxicolico, CHAPS, acido taurodesoxicolico y acido quenodesoxicolico) simultaneamente, por ejemplo, la actividad de EG VI aumento > 2 veces en presencia de sustrato y acido desoxicolico.

Los glicosidos, tales como salicina, esculina y arbutina, no tuvieron efecto aparente sobre la actividad de EG V-VII, al igual que los disacaridos melibiosa, maltosa, sacarosa y el alditol, sorbitol. Sin embargo, concentraciones de celobiosa de 50-75 mM inhibieron notablemente las tres enzimas, especialmente EG V, que tambien se inhibio por lactosa a concentraciones > de 75 mM. La lactosa tambien efectuo inhibicion de ∼50% de la actividad de BBGasa de EG VI y EG VII a concentraciones de ∼120 mM. La glucono-δ-lactona y glucoheptono-1,4-lactona tambien inhibieron EG V-VII pero a concentraciones mucho mayores (de 500 a > de 750 mM para una inhibicion al 50%).

Especificidad de sustrato. Los extractos en bruto de T. emersonii, catalizan la hidrolisis de una diversidad de polisacaridos incluyendo celulosa, CMC, BBG, laminarano, liquenano, xilano, pectina y un espectro de derivados de glicosidos sinteticos. Ninguna de las tres enzimas purificadas fueron activas contra derivados de 4-nitrofenilo de β-Dxilopiranosido o α-D-galactopiranosido (Tabla 7).

Tabaa 7: �Especificidades�de sustrato�de EG �V,�EG �VI yEG �VII�purificadas�de Talaromyces emersonii

xilopiranosido

Sustrato

% �de Actividad�reaativaa

Enaace

"aiquenasa"�de 40,7�DDa EGV EG�VI EG�VII

β-glucano de cebada

β-(1,3)(1,4) 100,0 100,0 100,0 100,0

DP BBG mixto

β-(1,3)(1,4) 159,0 165,0 230,0 107,6

DP BBG alto CMC

β-(1,3)(1,4) β-(1,4) 118,0 0,5c 249,9 74,9 342,8 58,4 144,1 57,7

Liquenano

β-(1,3)(1,4) 118,9 204,3 177,7 166,9

Laminarano

β-(1,3) 0,0 0,0 21,3 18,1

Xilano

β-(1,4) 0,0 1,8 0,7 1,5

Rodimenano (xilano)

β-(1,3)(1,4) 0,0 35,4 9,3 0,0

Pectina

α-(1,4) 0,0 0,0 0,0 0,0

Manano

β-(1,4) 0,0 0,0 0,0 0,0

Avicel

β-(1,4) 0,0 0,0 0,0 0,0

Papel de Filtro

β-(1,4) 0,0 0,0 0,0 0,0

4NP-β-D-glucopiranosido

β-(1,4) 0,0 0,0 0,0 0,0

4NP-β-D-galactopiranosido

β-(1,4) 0,0 0,0 0,0 0,0

4NP-β-D-

β-(1,4) 0,0 0,0 0,0 0,0

a % de actividad en relacion con la actividad frente a BBG, que se toma como el 100%; bliquenasa de Ta/aromyces emersonii purificada [6]; c Despues de 24 h a 50 DC

16 5

Ademas, EG V, EG VI y EG VII no presentaron ninguna actividad contra papel de filtro, Avicel, galactomanano de goma de algarrobo y no catalizaron la oxidacion de celobiosa, incluso en incubacion ampliada con sustrato. Los resultados se expresan en terminos de % de actividad en relacion con el control (a la actividad contra BBG se le asigna un valor de 100%). Las tres enzimas muestran actividad maxima contra los β-glucanos de enlace mixto, BBG y liquenano, notablemente con mas actividad sobre el ultimo sustrato. La actividad residual mostrada por las tres enzimas con xilano en periodos de incubacion ampliados puede explicarse por el hecho de que la preparacion usada de xilano de cascarillas de avena contenia menores cantidades contaminantes de β-glucano.

Despues de realizar analisis similares en cada una de las enzimas expresadas, se diseno un sistema enzimatico usando enzimas purificadas a partir de Ta/aromyces emersonii para la degradacion de material no celulosico, tal como hojas de te, polvo de algarroba y otros materiales similares.

La Tabla 8 proporciona un ejemplo de las cantidades relativas de diferentes actividades enzimaticas para este sistema enzimatico.

Tabaa �: �Sistema�para�aa �conversi6n�de�materiaaes�no �ceaua6sicos,�por ejempao,�hojas �de�te, poavo�de aagarroba.

Composici6n�enzimatica

Perfia de actividad enzimatica �i%)

β-glucanasa

45,0-55,0

Xilanasa

16,5-42,0

β-glucosidasa

0,5-2,0

β-xilosidasa

0,1-1,0

Proteasa

0,1-1,0

Enzimas hemicelulasas adicionales que incluyen β-galactosidasa, esterasas, αglucuronidasa, etc.

10,0-18,0

Ejempao 5: �Sistema de T. emersonii �para�convertir �ceauaosa,�residuos�ricos en�ceauaosa yceaooaigosacaridos

Se cultivo la cepa IMI 393751 de Ta/aromyces emersonii en una diversidad de residuos de papel y productos de papel como sustratos. Las enzimas excretadas se extrajeron y se superviso la expresion enzimatica y se cuantifico por analisis de proteoma y transcriptoma y por un espectro exhaustivo de ensayos funcionales. Varios residuos de papel demostraron ser excelentes inductores de celulasas (y actividades complementarias, por ejemplo, enzimas que hidrolizan almidon, en las que se usaron productos revestidos/acabados de papel). Las diferencias fueron bastante evidentes con respecto a las cantidades relativas/tipos de enzimas celulasa inducidas por diferentes residuos/productos de papel. Los datos obtenidos confirmaron que las isoenzimas celobiohidrolasa I (CBH I) y celobiohidrolasa II (CBH II) eran las actividades celulasa mas importantes y, cuando se deseaba sacarificacion/bioconversion mas completa de celulosa en el sustrato diana (por ejemplo generacion de materias primas ricas en monosacaridos para produccion de biocombustibles), tambien era muy importante la β-glucosidasa I (BG I).

Los platos de papel indujeron niveles notables de actividad degradadora de papel de filtro (FP) (1573 UI/g, en la que UI representa μmoles de producto formado/minutos de tiempo de reaccion/g de sustrato inductor), bajos niveles de endocelulasa (27,5 UI/g) y bajos niveles de β-glucosidasa (6,05 UI/g). En el nivel del transcriptoma, la CBH I era la celulasa mas abundante/altamente expresada, una observacion complementada a nivel funcional detectandose actividad de tipo CBH I 242,0 UI/g. Las enzimas producidas durante el crecimiento en vasos de papel fueron significativamente mas exoactivas, detectandose actividad FP 495,0 UI/g y β-glucosidasa 53,9 UI/g. En el ultimo ejemplo, la expresion genica y los ensayos funcionales indicaron que la CBH II era la celulasa clave (los niveles de transcripto y enzima para CBH II fueron ∼2 veces los niveles correspondientes para las enzimas CBH I). La CBH II fue de nuevo la celulasa clave inducida por papel de color marron, carton corrugado y papel de oficina blanco. Se mostro que los sistemas enzimaticos individuales, y sus combinaciones (por ejemplo para la amplificacion de actividades accesorias/secundarias o externas clave), eran herramientas eficaces para la conversion de celulosa (y hemicelulosas/otros carbohidratos) en una amplia diversidad de materiales virgenes, secundarios y residuales ricos en celulosa.

Las enzimas se aislaron y analizaron por procedimientos convencionales (Walsh, (1997) y col., 2002).

CBH IA, que contiene restos de xilanasa como unica actividad contaminante, eluyo a una concentracion de NaCl entre 115 y 170 mM. Las fracciones 52-66 se agruparon y se dializaron durante 16 horas frente a 4 cambios de tampon de acetato de amonio 100 mM, pH 5,0, y se sometieron a cromatografia de afinidad en una columna (1,4 x 11,3 cm) de CH Sepharose 4B sustituida con p-aminobencil-1-tio-celobiosido. La actividad xilanasa contaminante residual no se unio y se eluyo en la aplicacion y tampones de lavado. Usando lactosa 0,1 M en tampon de acetato de amonio 100 mM, pH 5,0, se eluyo CBH IA. Las fracciones 13-21 se agruparon, se dializaron frente a agua destilada para retirar la lactosa y se conservaron a 4 DC hasta su uso.

17 5

CBH IB de la etapa de intercambio anionico (DE 52 a pH 5,5) se dializo frente a tampon de acetato de amonio 100 mM, pH 5,5 y se aplico a la columna de afinidad como para BCH IA. Las actividades contaminantes residuales, principalmente endoglucanasa, no se unieron a la matriz de afinidad y se eluyeron en el lavado. CBH IB se eluyo especificamente usando lactosa 0,1 M en tampon de afinidad. Las fracciones 43-48 se agruparon y se dializaron frente a agua destilada para retirar la lactosa y se conservaron a 4 'C hasta su uso posterior.

Basandose en el analisis anterior, se diseno el siguiente sistema enzimatico usando enzimas purificadas de Ta/aromyces emersonii para la degradacion de residuos de papel y productos de papel, y otros residuos que contienen celooligosacaridos.

Tabaa 9: Sistema�para�aa �conversi6n�de�ceauaosa,�residuos�ricos en�ceauaosa yceaooaigosacaridos

Composici6n�enzimatica

Perfia�de�actividad enzimatica�i%)

Celobiohidrolasa 1A y 1B

5,0-80,0

Celobiohidrolasa II

6,0-45,0

Endoglucanasa (Cel 45, EGV, EGVI, EGVII)

4,6-66,0

�-xilosidasa

0,1-2,5

Xilanasa

1,0-89,0

Otras hidrolasas (incluyendo enzimas modificadoras de pectina, arabinofuranosidasa, �-galactosidasa)

1,2-20,5

Ejempao 6: �Sistema de�especies�fungicas�term6fiaas, Chaetomium thermophile y Thermoascus aurantiacus.

La estrategia descrita para el diseno de sistemas enzimaticos/composiciones termoenzimaticas de la cepa IMI 393751 de T. emersonii y mutantes previamente conocidos se adapto para la produccion de composiciones modificadoras de carbohidratos por mas de veintitres especies fungicas mesofilas y termofilas. Se presto especial atencion a la produccion/induccion de fuertes sistemas enzimaticos ricos en pectinasa y hemicelulasa (xilanasa, mananasa) por estas especies fungicas.

Las especies Chaetomium thermophi/e y Themoascus aurantiacus se cultivaron individualmente en fermentacion liquida, como se ha descrito anteriormente, en el medio nutriente de T. emersonii que contenia 1-6% de fuente de carbono inductora (tambien se investigo la produccion enzimatica por fermentacion solida). Se obtuvo un fuerte sistema enzimatico que degradaba manano por cultivo de C. thermophi/e durante 96-120 horas en residuos de cafe. Esta composicion de este sistema se caracterizo y se mostro que contenia 45-60% de actividades de hidrolisis de manano, 0,7-4,0% de enzimas modificadoras de pectina, 35,2-52,0% de actividades modificadoras de xilano atribuyendose el resto a actividades celulasa (se observaron CBH y β-glucosidasa muy bajas o residuales).

El cultivo del mismo hongo en salvado de soja produjo un fuerte sistema enzimatico xilanolitico (atribuyendose el 70,2-86,5% de las actividades totales a enzimas modificadoras de xilano); se atribuyeron ∼10,6-28,0% y ∼8,6-22,5% de las actividades modificadoras de carbohidratos restantes a enzimas celulasas, pectinoliticas y niveles bajos de mananoliticas.

De forma similar, durante el cultivo de Th. aurantiacus en salvado de trigo y pulpa de remolacha (1:1), se indujo un fuerte sistema enzimatico modificador de pectina, representandose > 56,5-80,0% del perfil de actividad modificadora de carbohidratos total por actividades pectinoliticas; este sistema enzimatico tambien contenia ∼22,1-40,1% de enzimas modificadoras de xilano, siendo el resto principalmente actividades modificadoras de β-glucano/celulasa. Por el contrario, el cultivo de Th. aurantiacus en salvado de soja indujo un fuerte sistema enzimatico xilanolitico (> 62,1-85,8%), complementado por enzimas modificadoras de pectina ∼3,5-11,0% siendo las actividades restantes predominantemente modificadoras de β-glucano. A diferencia de C. thermophi/e, Th. aurantiacus no proceso niveles significativos de enzimas degradantes de manano durante el cultivo en uno de los sustratos.

Se ha mostrado que estos sistemas, por si mismos y en combinacion entre si o con otros sistemas enzimaticos (por ejemplo, T. emersonii) efectuan abundante sacarificacion (liberacion de azucar) de una amplia diversidad de materiales agricolas, alimentarios/vegetales, de bebidas, lenosos/de papel y otros virgenes ricos en carbohidratos y de residuos diferentes, y pueden usarse para la generacion de productos oligosacaridos especializados o materias primas ricas en azucares para una amplia serie de aplicaciones biotecnologicas (por ejemplo, produccion de biocombustible).

Ejempao 7: Sistema de T. emersonii para aa generaci6n de materias primas ricas en azucares a partir de residuos �de�aaimento/bebida,�papea y�aeoosos�para usar en�aa�producci6n�de�biocombustibae.

ia)�Bioconversi6n�de�un�residuo�de aaimento/bebida: �puapa/orujo�de�manzana

18 5

A partir de proveedores de fruta locales, distribuidores de procesamiento de alimentos y de produccion de sidra/bebidas, se obtuvieron residuos de manzanas (reducidas a pulpa), pulpa y orujo de manzana. Se cultivo T. emersonii en orujo/pulpa de manzana al 2-6% (tanto por fermentacion solida como liquida) y se midieron altos niveles de una serie de enzimas modificadoras de carbohidratos. Este sistema se caracterizo por altos niveles de βglucano hidrolasas, principalmente β-glucanasa no celulosica (∼27,4% en filtrados de cultivo liquido de 120 horas), cantidades sustanciales de exoglicosidasas clave con niveles especialmente altos α-arabinofuronosidasa (13,3% de la actividad carbohidrasa total) y β-galactosidasa (22,6%). Tambien se detectaron enzimas esterasa, modificadoras de pectina y xilano adicionales (> 7,2-33,5%). Por lo tanto usando el analisis anterior, es posible disenar un sistema enzimatico adecuado para degradar residuos de manzanas.

Los estudios iniciales usaron una carga enzimatica que contenia 2.344 nkat de xilanasa, 5.472 nkat de β-glucanasa de enlace mixto y 8.529 nkat de liquenanasa por 3,6 kg de sustrato y se uso una temperatura de reaccion de 70 'C. Se consiguio la pasteurizacion completa del hidrolizado a 70 'C, y se uso el hidrolizado para alimentar reactores anaerobios de flujo ascendente mesofilos y termofilos (UAHR). Se ha observado 100% de utilizacion de la materia prima de azucar, con produccion conjunta de metano (50-70% en la corriente de biogas). Se realizaron estudios de optimizacion posteriores, que demostraron que la incubacion a 80 'C, con agitacion suave (-120 rpm) durante un periodo de 24 horas con aproximadamente 2/3 de la dosificacion de enzima original, consiguio ∼87% de sacarificacion de los carbohidratos presentes a azucares fermentables sencillos.

Los azucares producidos por este sistema enzimatico pueden usarse como una materia prima rica en monosacaridos para la produccion de biocombustible.

ib)�Bioconversi6n �de�residuos�de�papea: �vasos�de �papea y productos�de �papea

Se cultivo T. emersonii sin complementacion en una diversidad de residuos de papel en fermentacion liquida (vease el Ejemplo 5). Se demostro que los vasos de papel eran inductores de carbohidrasa muy eficaces, produciendo un coctel enzimatico multicomponente fuerte con altos niveles de actividades enzimaticas xilanasa y degradantes de almidon, y niveles de actividades celulasa mayores que los presentados en sustratos de crecimiento convencional. El potencial de este sistema enzimatico para liberar eficazmente azucares reductores y efectuar degradacion de residuos de papel se ilustro claramente por ensayos bioquimicos y microscopia electronica de barrido. El efecto del tratamiento termoenzimatico en la integridad y morfologia del sustrato usando microscopia electronica de barrido confirmo el potencial de estos cocteles como herramientas biotecnologicas potentes para conversion de residuos de papel. La MEB (microscopia electronica de barrido) proporciono pruebas claras de una amplia degradacion de fibras de celulosa (perdida completa de estructura fibrosa en determinadas muestras) despues del tratamiento del sustrato rico en celulosa con los cocteles de T. emersonii.

El coctel enzimatico producido por T. emersonii despues de 108 horas de crecimiento en vasos de papel contiene una acumulacion de celulosa, hemicelulosa y enzimas degradantes de almidon y los estudios de sacarificacion realizados con este coctel multi-componente demuestran su capacidad para liberar eficazmente glucosa y otros azucares reductores de celulosa convencional y sustratos de residuos de papel. Se ha descubierto que este coctel enzimatico era activo en todos los sustratos de residuos de papel y celulosa convencional analizados. Aunque todos los sustratos se degradaban cada vez mas con el tiempo se mostraron diferentes susceptibilidades de biodegradacion en respuesta a las diferentes composiciones de sustrato.

Antes de cualquier tratamiento previo, el envasado biodegradable mostro la mayor susceptibilidad hacia la hidrolisis enzimatica seguido del papel de seda, vasos de papel y carton corrugado. El sistema enzimatico inducido por vasos de papel, actua de forma optima, liberando niveles maximos de azucares de los residuos de papel, a una temperatura de 50 DC, pH 4,5, a una dosificacion enzimatica de 4 ml/g de sustrato y con agitacion a 37 rpm. La homogeneizacion de los vasos de papel aumento el nivel de hidrolisis en 2,3 veces. En estas condiciones experimentales (dosificacion enzimatica de 36 UPF) (unidades de papel de filtro) se consiguio un % de hidrolisis total del 85%, representando la glucosa ∼80% de los azucares reductores liberados. La glucosa y la xilosa fueron los principales productos liberados (vease la Figura 3). Sin embargo, la reduccion de la dosificacion enzimatica a 9 UPF efectuo una hidrolisis global de ∼76%. La microscopia electronica demostro las excelentes propiedades hidroliticas de este coctel (Figura 4).

El tratamiento termico aumento la conversion de carton por el mismo sistema enzimatico, en un factor del 34% (una hidrolisis de carbohidratos global basada en azucares reductores liberados de ∼88%), mientras que la combinacion tanto del tratamiento termico como de homogeneizacion aumento los azucares reductores liberados en 80% produciendo glucosa 1,47 mg/ml (31,7% de los azucares totales liberados). Los platos de papel se degradaron rapidamente por el coctel enzimatico inducido por vasos de papel representando la glucosa ∼67% de los azucares totales liberados.

Se ha investigado la sacarificacion enzimatica de residuos de papel y alimentos en hidrolisis y sacarificacion secuencial (SHF), es decir, pre-tratamiento enzimatico seguido de fermentacion con levaduras para producir etanol, y en hidrolisis y sacarificacion simultaneas (SSF), en las que se genera de forma continua materia prima y se fermenta inmediatamente por levadura. Las temperaturas de reaccion de pre-tratamiento enzimatico son diferentes en ambos procedimientos, es decir, mayores en SHF ya que el hidrolizado se enfria antes de la fermentacion y a

19 5

una temperatura cercana a las temperaturas ambiente para el crecimiento de levaduras y fermentacion en SSF. Aunque las enzimas de la cepa IMI 393751 de T. emersonii son mas eficientes y tienen mayores velocidades de reaccion, y se consigue pasteurizacion (y se requiere menos enzima), las enzimas de T. emersonii aun funcionan bastante bien a 25-37 'C y se comparan bien con preparaciones enzimaticas comerciales de otras fuentes fungicas. Se descubrio que las materias primas ricas en azucares producidas eran adecuadas para la produccion de biocombustible (bioetanol y biogas).

ic)�Bioconversi6n�de�restos de�coniferas�para�aa �producci6n�de bioetanoa

Los restos y residuos lenosos de fuentes primarias y secundarias (por ejemplo, corteza, residuos de aclareos y procesamiento, tales como virutas y serrin) representan un inmenso recurso comprendiendo hasta 65-70% de peso seco que comprende carbohidratos complejos tales como hemicelulosa (∼19-28% y principalmente xilanos y mananos con algunos otros polisacaridos) y celulosa (∼39-46%), que estan revestidos de lignina.

Se cultivo la cepa IMI 393751 de T. emersonii en fermentacion de estado liquido o solido, en restos lenosos, tales como serrin y de picea de Sitka y virutas de fresno para generar sistemas enzimaticos con el perfil apropiado de enzimas para la conversion de los residuos diana. Se investigaron diferentes temperaturas de reaccion/pretratamiento y dosificaciones enzimaticas. Los sistemas enzimaticos evaluados incluyeron cocteles obtenidos durante el cultivo de T. emersonii en una diversidad de sustratos. Se investigaron temperaturas de reaccion de 50 'C, 60 'C, 70 'C y 80 'C, y se usaron varios sustratos diferen tes, es decir, restos lenosos no tratados y pre-tratados. Tambien se investigo la carga enzimatica, comenzando los estudios iniciales con 60 UPF, aumentada posteriormente a 200 UPF (UPF: unidades de papel de filtro, una medida de la actividad celulasa total).

Tabaa 10: �Sacarificaci6n �de�restos�aeoosos�por c6ctea�de WB/BP�i1:1)�de T. emersonii

Dosificaci6n

Temperatura Serrin�de�picea de�SitDa Serrin�de�picea�de�SitDa �moaido�en trozos�grandes

% �de Hidr6aisis

% de Conversi6n Heiosa �ig) % �de Hidr6aisis % de Conversi6n Heiosa�ig)

60 UPF

50'C 34,3 40,9 0,39 35,2 27,0 0,24

60 UPF

80'C 44,3 50,6 0,49 48,1 39,5 0,38

60 UPF de mezcla*

50'C 48,7 62,3 2,95 41,8 35,1 1,87

60 UPF de mezcla*

80'C 62,4 79,1 3,45 55,9 65,2 3,1

El contenido de hexosa se proporciona como gramos liberados a partir de un lote de partida de 10 g en un periodo de reaccion de 24 horas *Mezcla= Se investigo la hidrolisis inducida por el coctel de (WB/BP (1:1) de T. emersonii + residuos de cafe de C. thermophi/e en condiciones tamponadas y no tamponadas, asi como el efecto de los niveles de humedad de la reaccion y la dosificacion enzimatica.

En la Tabla 11 se presentan los efectos de la dosificacion enzimatica sobre los rendimientos de etanol teoricos.

Tabaa 11: �Efecto�de �aa�dosificaci6n �enzimatica�sobre ea % �de�conversi6n yrendimiento�de�etanoa�te6rico

Enzima

Dosificaci6n iUPF) Temperatura de�reacci6n Heiosa �aiberada ig) % de conversi6n Rendimiento de�etanoa te6rico�ia/ton de�materia prima)

Mezcla*

60 70 'C 4,5 70,0 325,5

Mezcla*

200 70 'C 5,1 76,4 345,4

*Mezcla = Inducido por coctel (WB/BP (1:1) de T. emersonii + residuos de cafe de C. Thermophi/e; el contenido de hexosa se proporciona como gramos liberados a partir de un lote de partida de 10 g en un periodo de reaccion de 24 horas

Ejempao �: �Sacarificaci6n de �biomasa�aeoosa

Preparaci6n dea sustrato de ensayo. Se impregnaron astillas de picea (2-10 mm de diametro) con dioxido de azufre (humedad 3% p/v) durante 20 minutos a temperatura ambiente a una tasa de absorcion de 2,5% p/p de humedad. La picea tratada con SO2 se trato con vapor a 215 'C durante 2-5 minutos. El contenido de hemicelulosa se hidrolizo casi completamente; la recuperacion de solidos fue del 60-65% de la materia prima de partida. Enzimas Termoenzimas MGBG: MGBG 1, MGBG 2, MGBG 3 y MGBG 4 numeradas. Se usaron las enzimas comerciales Celluclast 2 l de T. reesei y Novozym 188 de A. niger (Novo Industri A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).

Evaauaci6n�de�hidr6aisis �enzimatica

En recipientes de reaccion de 300 ml, 1 l y 10 l, con agitacion a ∼130 rpm, se realizo la hidrolisis enzimatica convencional a 37 'C, 50 'C y 60 'C. La dosificacio n enzimatica de cada enzima fue de 32 UPF por g de celulosa en una solucion de sustrato tamponada (Gilleran, 2004). El pH del tampon de reaccion se ajusto a pH 5,0 para las

5 enzimas MGBG y a pH 4,8 para las preparaciones comerciales. Las muestras se retiraron a intervalos temporales y la accion enzimatica finalizo hirviendo cada mezcla de reaccion (y controles) durante 10 minutos. A las temperaturas de reaccion mas bajas (37-50 'C), 2 de las preparaciones enzimaticas de la invencion rindieron tan bien como la preparacion comercial Celluclast, y (ii) el rendimiento de 3 de las enzimas MGBG esta en el mismo intervalo que el de Celluclast comercial (y mezcla Cellulclast/Novozym).

10 El rendimiento de glucosa usando la composicion de la invencion fue similar al de las preparaciones comerciales optimizadas pero produjeron mayores niveles de azucares fermentables adicionales que las enzimas comerciales.

Las preparaciones enzimaticas de la invencion rindieron mejor que las enzimas/combinaciones de enzimas comerciales a mayores condiciones de reaccion (60-70 'C), en cuanto al grado global de hidrolisis, rendimiento de producto y estabilidad enzimatica. Pudo usarse una dosificacion enzimatica mas baja a mayores temperaturas de 15 reaccion para conseguir un rendimiento similar de hidrolisis (dependiendo de la preparacion enzimatica, solo se necesito el 62,5 -78% de la carga de enzima comercial). Tambien se ven menos afectadas por sustancias inhibidoras presentes en el sustrato previamente tratado con vapor y mayores concentraciones de glucosa y celobiosa en los hidrolizados ricos en azucares. Tambien produjeron una mayor cantidad de azucar en 24 horas a 60 'C, en comparacion con la conseguida por las enzimas comerciales en 72 horas a 50 'C, que es la temperatura de

20 funcionamiento optima para las enzimas comerciales.

En la Tabla 12 se presentan los resultados clave para la hidrolisis enzimatica, mientras que en la Tabla 13 se muestran las mejores combinaciones de temperatura de reaccion/tiempo de reaccion para el % de hidrolisis optimo, para cada una de las composiciones comerciales y enzimaticas de la invencion ensayadas.

Tabaa 12: Resumen �de�resuatados�comparando�ea�rendimiento�enzimatico/potenciaa�hidroaitico�de�aas 25 preparaciones enzimaticas comerciaaes yde�MGBG �en�picea�pre·tratado

Temp. de reacci6n i'C)

Tiempo de reacci6n ih) Criterios de vaaoraci6n/productos ig/a) Ceaauacaast Ceaar Novozym i24:4) MGBG 1 MGBG 2 MGBG 3 MGBG4

50 'C

24 h Hexosa 7.33 13.85 6.8 11.9 3.84 8.64

Pentosa

0.83 0 1.1 1.93 0.59 1.33

Celobiosa

2.58 0 1.22 2.14 1.28 2.88

% de Hidrolisis*

40.2 51.9 34.1 59.8 21.4 48.1

48 h

Hexosa 14.1 20.4 14.45 15.75 7.7 15.55

Pentosa

1.59 1.1 2.34 2.55 1.18 2.52

Celobiosa

4.96 0.6 1.01 0.3 2.57 0.35

% de Hidrolisis

77.3 82.7 66.6 69.6 42.9 69.0

72 h

Hexosa 12.98 20.8 21.25 21.48 9.16 20.84

Pentosa

2.26 2.34 3.4 3.47 1.40 3.88

Celobiosa

1.33 0.3 0.93 0.12 3.05 0.16

% de Hidrolisis

62.0 87.8 95.8 93.9 51.0 91.3

60 'C

24 h Hexosa 4.18 3.74 20.55 22.12 4.65 10.46

Pentosa

0.47 0.31 2.1 1.87 0.71 1.49

Celobiosa

1.47 0.17 3.69 1.34 1.55 3.61

% Hidrolisis

22.9 15.8 98.6 94.8 25.9 58.3

48 h

Hexosa 8.04 11.86 22.71 23.02 9.32 17.38

Pentosa

0.9 0.63 2.47 2.55 1.43 2.67

(continuacion)

Temp.�de reacci6n i'C)

Tiempo de reacci6n ih) Criterios�de vaaoraci6n/productos ig/a) Ceaauacaast Ceaar Novozym i24:4) MGBG 1 MGBG 2 MGBG 3 MGBG 4

Celobiosa

2.83 0.34 1.31 0.39 3.11 5.80

% de Hidrolisis

44.1 48.0 -100.0 97.2 51.9 96.8

72 h

Hexosa 12.98 14.80 23.51 23.33 12.56 21.9

Pentosa

2.26 1.33 2.53 2.67 1.92 2.43

Celobiosa

1.33 0.17 0.85 0.17 5.7 1.34

% de Hidrolisis

62.0 61.3 -100.0 98.0 75.6 96.1

70 'C

24 h** Hexosa 1.2 1.07 21.72 24.11 16.8 20.98

Pentosa

0.14 0.09 2.39 2.07 2.58 2.73

Celobiosa

0.42 0.05 2.43 0.55 5.60 2.44

% Hidrolisis

6.6 4.5 99.4 -100.0 93.5 97.9

*% de hidrolisis: azucares totales liberados expresados como un % de los azucares disponibles totales en el sustrato; ** no se mostraron los puntos temporales posteriores ya que las enzimas MGBG no consiguieron hidrolisis completa

Tabaa 13: �Combinaciones�de �temperatura�de�reacci6n/tiempo�de�reacci6n�para�ea�%�de�hidr6aisis�maiimo, para�cada�una�de aas enzimas�comerciaaes yMGBG �investigadas

Preparaci6n enzimatica

Temperatura�de reacci6n �6ptima i'C) Tiempo de �reacci6n 6ptima ih) % de�hidr6aisis Heiosa g/a

Celluclast

50,0 48 h 77,3 14,1

Cell + Novozym (24: 4)

50,0 48 h 82,7 20,4

50,0

72 h 87,8 20,8

MGBG 1

50,0 48 h 66,6 14,45

50,0

72 h 95,8 21,25

60,0

24 h 98,6 20,55

70,0

24 h 99,4 21,72

MGBG 2

60,0 24 h 94,8 22,12

70,0

24 h -100,0 24,11

MGBG 3

70,0 24 h 93,5 16,8

MGBG 4

70,0 24 h 97,9 20,98

70,0

48 h 96,8 17,38

Sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF)

Se realizaron experimentos de SSF discontinuos con hidrolizado de picea para comparar el rendimiento de diferentes preparaciones enzimaticas. Se realizo fermentacion a una concentracion de fibras de picea del 4%, el material pre-tratado se diluyo con agua esteril a la concentracion deseada. El pH se mantuvo a 5,0 con la adicion de

NaOH 2 M. La temperatura de fermentacion fue de 37 DC y la velocidad de agitacion fue de 500 rpm. El medio reactor se rocio con nitrogeno (600 ml/minuto) y se midio el contenido de CO2 con un analizador de gases. Se anadio la preparacion enzimatica directamente al fermentador a una carga de 25 unidades de papel de filtro (UPF)/g de celulosa. El medio de fermentacion se complemento con nutrientes: (NH4)2HPO4 0,5 g/l, MgSO4.7H2O 0,025 g/l y 1,0 g/l

5 de extracto de levadura. La concentracion de masa celular de levadura (levadura de panadero, Saccharomyces cerevisiae) anadida fue de 5 g/l y todos los experimentos de SSF se realizaron a 37 DC durante 72 horas. Las muestras se retiraron a diversos intervalos de tiempo, se centrifugaron en tubos de microcentrifuga de 1,5 ml a 14.000 g durante 5 minutos (Z 160 M; Hemle Labortechnik, Alemania), el sobrenadante se preparo despues para analisis de HPLC.

Se analizaron productos de hidrolisis generados durante la degradacion de materiales lignocelulosicos por HPLC. Se

10 separaron, la celobiosa, glucosa, xilosa, galactosa, manosa, HMF y furfural en una columna polimerica (Aminex HPX87P) a 85 DC, la fase movil fue agua millipore a un caudal de 0,5 ml/minuto. Se determinaron las concentraciones de etanol, glicerol y acetato usando una columna Aminex HPX-87H a 60 DC, usando un sistema de HPLC Shimadzu equipado con un detector de indice refractario. La fase movil fue una solucion acuosa 5 mM de H2SO4 a un caudal de 0,5 ml/minuto. Tambien se determino el etanol producido usando un ensayo ligado a enzima (r-Biopharm,

15 Alemania).

El crecimiento de levaduras tiene lugar en dos fases. El dioxido de carbono es un producto secundario importante del proceso de fermentacion de etanol ya que la fermentacion anaerobia de un mol de glucosa produce un mol de etanol y dos moles de dioxido de carbono. Por lo tanto, la medicion de la concentracion de dioxido de carbono en el gas de salida es una medicion indirecta de la tasa de fermentacion. En la primera fase de crecimiento se consume la

20 glucosa disponible y se forma etanol, y se representa la respuesta rapida inicial a la glucosa presente por un aumento en la evolucion del CO2.

Los resultados obtenidos durante la SSF se proporcionan en la Tabla 3. Como se ha menciona anteriormente, el tiempo total transcurrido para la SSF, para cada preparacion enzimatica fue de 72 horas, y la temperatura usada para la SSF fue de 37 DC. La eficacia de la fermentacion se determino dividiendo la concentracion real de etanol

25 producido (g/l) entre el etanol teorico total (g/l) que se produciria si todo el sustrato disponible se convirtiera en azucar soluble fermentable y todo el azucar se convirtiera a etanol, y multiplicando por 100.

Basandose en los datos obtenidos, los rendimientos de etanol para cada combinacion de enzima/SSF se proporcionan en litros de etanol/tonelada en seco, y las unidades correspondientes, litros de etanol/toneladas en seco.

30 Tabaa 14: �Resumen �de�aos�eiperimentos�de�SSF

Preparaci6n enzimatica

Etanoa g/a Eficacia �de fermentaci6n i%) Rendimiento de�etanoa ia/toneaada) Rendimiento de�etanoa�ia /toneaada) Coste�de aa�enzima�i� estadounidenses/toneaada)

Cell + Novo (24: 4) #1

5,83 54,0 178,78 215,68 No disponible

Cell + Novo (24: 4) #2

9,10 84,3 279,05 334,94 No disponible

MGBG 1*

5,02 46,5 153,88 185,6 ∼17 US $

MGBG 1

7,33 67,9 224,62 270,97 ∼21,76 US $

MGBG 2*

7,24 67,1 221,89 267,68 ∼16,8 US $

MGBG 2

7,89 73,1 241,79 291,68 ∼23 US $

MGBG 3**

8,62 79,9 264,46 319,01 ∼17,4 US $

MGBG 4**

9,67 89,6 296,37 357,54 ∼15,4 US $

* Se uso una carga enzimatica de 21,3 UPF en lugar de 32,0 UPF ** Mezclas mas optimizadas de MGBG 3 y MGBG 4.

Ejempao 9: Comparaci6n de aas enzimas comerciaaes y MGBG en una estrategia de hidr6aisis y fermentaci6n secuenciaaes�iSHF) para�producci6n �de�bioetanoa.

Se investigaron los rendimientos de bioetanol obtenidos por hidrolisis y fermentacion secuenciales, para las preparaciones comerciales y enzimaticas de la invencion. Una ventaja de la SSF, es que el procedimiento consiste 5 en una fermentacion rapida inicial y metabolismo de azucares monomericos resultantes de la etapa de pretratamiento. Se libera una glucosa del sustrato mediante la accion de las enzimas hidroliticas que se han anadido, la fermentacion es rapida, lo que significa que, en la SSF, la concentracion de azucares libres siempre permanece baja. En la SSF, la velocidad de fermentacion disminuye con el tiempo como resultado de una disminucion de la velocidad de conversion de sustrato por las enzimas, o inhibicion del metabolismo de las levaduras, el que sea

10 limitante para la velocidad. Los datos obtenidos en estos experimentos se resumen en la Tabla 15.

Tabaa 15: �Resumen �de�eiperimentos �de�SHF

Preparaci6n enzimatica

Temperatura y tiempo de hidr6aisis Etanoa g/a Eficacia de fermentaci6n i%) Rendimiento de�etanoa ia/toneaada) Rendimiento de etanoa ia/toneaada) Coste de aa enzima i� estadounidenses/toneaada))

Celluclast

50 DC durante 48 h 7,21 66,8 220,94 269,55 No disponible

Cell + Novo (24:4)# 1

50 DC durante 48 h 9,35 86,7 286,7 345,89 No disponible

Cell + Novo (24:4)#2

50 DC durante 48 h 10,42 96,6 319,53 385,45 No disponible

MGBG 1

60 DC durante 24 h 10,50 93,37 321,98 388,40 ∼21,76 US $

MGBG 1 *

70 DC durante 24 h 11,10 -100,0 340,38 410,62 ∼21,76 US $

MGBG 2

60 DC durante 24 h 11,30 -100,0 346,51 418,05 ∼21,8 US $

MGBG 2*

70 DC durante 24 h 12,32 >100,0** 377,79 455,91 ∼21,8 US $

MGBG3%

70 DC durante 24 h 8,59 79,6 263,26 317,40 21,4 US $

MGBG 4

70 DC durante 24 h 10,72 99,4 328,73 396,55 ∼21,4 US $

* Preparacion enzimatica usada a temperatura de reaccion mayor. % Este coctel enzimatico es particularmente eficaz en la liberacion de azucares fermentables de sustratos ricos en hemicelulosa y no se esperaria que fuera tan eficaz en un sustrato que tiene una parte significativa de la fraccion de hemicelulosa retirada (etapa de pre-tratamiento).

El analisis de HPLC confirmo que los principales productos formados son monosacaridos (azucares sencillos) con cantidades muy pequenas de oligomeros mayores formados (siendo la celobiosa, que es un disacarido, el principal,

o unico, azucar de cadena mayor presente en los hidrolizados).

15 Ejempao 10�Apaicaciones �para�piensos�animaaes:

Cada composicion enzimatica se evaluo en aplicaciones diana individuales, realizandose estudios modelo a escala de laboratorio con 5-25 gramos del sustrato (cereal, harina de cereal u otro resto vegetal) en volumenes de reaccion final de 50-250 ml, a pH 2,5-7,0 y a 37-85 DC, con o sin agitacion. Se evaluo el rendimiento enzimatico con y sin pretratamiento de sustrato, es decir pre-tratamiento de vapor suave (105 DC, 55,16 kPa (8 p.s.i.) durante 5 minutos), 20 molienda usando un mortero, homogeneizacion en un homogeneizador Parvalux o Ultraturrax. Para tejidos/restos de verduras y frutas blandas, el sustrato se macero sin mucha precision, mezclando, y se incubo con enzima, sin pretratamiento. La hidrolisis del sustrato se superviso mediante (i) medicion de azucares reductores liberados y ensayos para detectar y cuantificar azucares individuales, (ii) analisis de TLC y HPLC de confirmacion de los azucares productos de hidrolisis, (iii) analisis de reduccion de peso/volumen del resto, (iv) comparacion de contenidos de

25 celulosa, hemicelulosa, almidon y pectina antes y despues del tratamiento enzimatico, y (v) analisis fisico de la degradacion del sustrato mediante microscopia electronica de barrido (MEB) para sustratos fibrosos tales como papel y residuos lenosos.

Tabaa 16

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura detratamiento�optima�i�C) Productos

MGBG15

CBH I (25-30%) CBH II (1-5%)β(1,3)4-glucanasa (10-15%)β-glucosidasa (2-10%) Xilanasa (44-48%) β-Xilosidasa 0,1-1,5%, α-Glucuronidasa 0,1-2,0 % αL-arabinofuranosidasa 0,11,5%;enzimas peptinoliticas yesterasas 2-5% proteasa 7-15% Digestibilidad potenciada Trigo, avena >60 DC (hasta 75 DC) Principalmente glucooligosacaridos, xilooligosacaridos yalgunas otras cantidades menores de diversos azucares

MGBG16

CBH I (10-15%) CBH II (10-15%) β(1,3)4glucanasa (25-30%) β-glucosidasa (2-8%) Xilanasa (25-30%) β-Xilosidasa 1-2,0%, α-Glucuronidasa 1-2,0 % α-Larabinofuranosidasa 0,12,0%;enzimas peptinoliticas 5-10%,actividad modificadora de almidon ∼5%; oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 5-10% proteasa 10-15% Digestibilidad potenciada Piensos enriquecidos en Galacto-yGlucooligosacaridos Liberacion de antioxidante Trigo; avena; centeno >60 DC (hasta 80-85 C) Galactooligosacaridos, glucooligosacaridos yxilooligosacaridos

25

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura�de�tratamiento�optima�i�C) Productos

MGBG17

CBH I (5-10%)CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (20-30%)β- glucosidasa (2-8%) Xilanasa (30-35%)-Xilosidasa 1-2,0%, α-Glucuronidasa 1-3,0% α-L-arabinofuranosidasa 1,54,0%; enzimas peptinoliticas 5-10%, actividad modificadora dealmidon 5-8%; oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 1-4%, proteasa 18-25% Digestibilidad potenciada Trigo; avena; centeno; maiz;cebada; colza >60DC (hasta 80DC) Glucooligosacaridos y xilooligosacaridos

MGBG13

CBH I (5-10%)CBH II (5-10%)�� β(1,3)4-glucanasa (25-40%)β-glucosidasa (∼5%) Xilanasa (18-25%) β-Xilosidasa 1-2,0%, Exoxilanasa 1-3,0%, α-Glucuronidasa 8-10%, α-L-arabinofuranosidasa 1,55,0%;enzimas peptinoliticas 1015%,actividad modificadora dealmidon 5-7%; otrashemicelulasas 5-10%,oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 1-4%, proteasa 8-12% Digestibilidad potenciada Liberacion de antioxidantes Trigo; avena; centeno; maiz;cebada; colza >60DC (hasta 85/90DC) Glucooligosacaridos y xilooligosacaridos,algunos monosacaridos y disacaridos de polimeros de pectina (por ejemploarabinooligosacaridos, acido galacturonico,ramnosa, etc.)

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura�de�tratamiento�optima�i�C) Productos

MGBG19

CBH I (10-15%) CBH II (10-15%)β(1,3)4-glucanasa (25-30%)β-glucosidasa (∼10-15%)Xilanasa (20-27%) β-Xilosidasa 4,0-7,0%, Exoxilanasa 5-10%, α-Glucuronidasa 1-4% α-L-arabinofuranosidasa 2,05,0%;enzimas peptinoliticas 5%,actividad modificadora dealmidon ∼5%,otras hemicelulasas ∼5%,oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 1-4%, proteasa ∼25% Digestibilidad potenciada;Flexibilidad para usardiferentes piensos Sorgo; colza; tambienotros cereales, por ejemplo trigo; avena; centeno; maiz; cebada >60DC (hasta 80/85DC) Glucooligosacaridos y xilooligosacaridos,algunos monosacaridos o algunas otrascantidades menores de azucares de polimeros pepticos

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura�de�tratamiento�optima�i�C) Productos

MGBG20

CBHI (5-10%)CBH II (5-10%)β(1,3)4-glucanasa (20-32%)β-glucosidasa (∼2-9,5%)Xilanasa (15-25%)β-Xilosidasa 15-20,0%,Exoxilanasa 10-15%,α-Glucuronidasa 2-5%, α-L-Arabinofuranosidasa 1,55%;enzimas peptinoliticas 1015%,actividad modificadora dealmidon ∼10%;otras hemicelulasas ∼5%,oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 2-5%,proteasa�∼7-10% Digestibilidad potenciada; Trigo, cebada ycenteno >60DC (hasta 80/85DC) Glucooligosacaridos y xilooligosacaridos oalgunas otras cantidades menores de azucares de polimeros pepticos

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura�de�tratamiento�optima�i�C) Productos

MGBG21

CBH I (5-10%)CBH II (5-10%)β(1,3)4-glucanasa (15%)β-glucosidasa (∼2-10%)Xilanasa (50-55%)Xilosidasa 1-5%;Exoxilanasa 5-10%,α-Glucuronidasa 1-4%,α-L-Arabinofuranosidasa 25%;enzimas peptinoliticas 2025%,actividad modificadora dealmidon 4-6%;otras hemicelulasas 7-10%,oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 2-4%,proteasa ∼10% Digestibilidad potenciada; Liberacion de fructooligosacaridos Trigo, cebada y maiz; tambien pulpa de remolacha >60DC (hasta 80/85DC) Glucooligosacaridos, xilooligosacaridos, algunos monosacaridos o algunas otrascantidades menores de azucares de polimeros pepticos y fructooligosacaridos

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura�de�tratamiento�optima�i�C) Productos

MGBG22

CBH I (∼5%) CBH II (∼5%) β(1,3)4-glucanasa (27-45%)β-glucosidasa (∼1-5%)Xilanasa (16-25%) Xilosidasa 0,5-4%, Exoxilanasa ∼10%, α-Glucuronidasa 0,5-4%, α-L-Arabinofuranosidasa 15%;enzimas peptinoliticas 510%,actividad modificadora dealmidon 4-8%;otras hemicelulasas 8-10%,oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 1-4%proteasa ∼5-6% Digestibilidad potenciada; Formacion deglucooligosacaridos Trigo, cebada, centeno >60DC (hasta 85/90DC) Glucooligosacaridos, xilooligosacaridos, algunos monosacaridos o algunas otrascantidades menores de azucares, etc.

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura�de�tratamiento�optima�i�C) Productos

MGBG23

CBH I (∼3-6%) CBH II (∼3-6%) β(1,3)4-glucanasa (35-45%)β-glucosidasa (∼3-6%) Xilanasa (∼30%)Xilosidasa 0,5-2,0%, Exoxilanasa ∼2-5%, α-Glucuronidasa 0,5-2%, α-L-Arabinofuranosidasa 15%;enzimas peptinoliticas 510%,actividad modificadora dealmidon ∼2-4%;otras hemicelulasas ∼10%,oxidoreductasa/oxidasa yesterasas 6-10% proteasa ∼8-10% Digestibilidad potenciada; Glucooligosacarido, xilooligosacaridosAlto potencial de liberacion de antioxidantes Trigo, cebada, centeno >60DC (hasta 85/90DC) Glucooligosacaridos de DP bajo, xilooligosacaridos, con monosacaridossignificativos o algunas otras cantidades menores de azucares, etc.

Para piensos enriquecidos en oligosacaridos clave, por ejemplo Galactooligosacaridos - es mejor el coctel enzimatico de MGBG 16 Glucooligosacaridos - son mejores los MGBG 16 y 22 Fructooligosacaridos - es mejor el coctel de MGBG 21

Para preparaciones de piensos enriquecidos con antioxidantes, los mejores cocteles para usar para el tratamiento son los preparados en: MGBG 13, 16 y 23.

Ejempao 11�Apaicaciones �de piensos�para animaaes �monogastricos:

Se realizaron estudios a temperaturas en el intervalo 50-85 DC (con agitacion a 140 rpm), con fracciones de cereales en bruto (lotes de 1-5 g). Se superviso la hidrolisis de carbohidratos en el sustrato, por cada preparacion enzimatica (dosificacion maxima 0,5 UI por g de sustrato), durante 24 horas cuantificando los azucares reductores liberados, y productos formados en muestras retiradas de la mezcla de reaccion a intervalos periodicos.

Tabaa 17

C6ctea

Composici6n�dea Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura Productos

c6ctea�i%)

de tratamiento 6ptima�i�C)

MGBG

CBH I (1-5%) Digestibilidad Cebada, >60DC (hasta Principalmente

24

CBH II (1-5%) β(1,3)4-glucanasa (27-43%) β-glucosidasa (210%) Xilanasa (44-48%) -Xilosidasa 0,10,4%, α-Glucuronidasa 0,1-3,0% α-L-Arabinofuranosidasa 0,1-0,4%; enzimas peptinoliticas y estearasas 5-10% proteasa 20-25% potenciada. Produccion de piensos basados en cereales facilmente digeridos bajos en pentosa para aves de corral y cerdos, en los que se han reducido las propiedades de union a agua de β1,3; 1,4-glucanos viscosos mediante fragmentacion enzimatica mijo, trigo, avena. Dietas de cebadasoja. Dietas de maiz-trigosoja. Dietas de trigocentenosoja 85DC) glucooligosacaridos, xilooligosacaridos y algunas otras cantidades menores de diversos azucares. Algunos de los productos oligosacaridos (y peptidos) tendrian propiedades reforzadoras para la salud

MGBG 17

Como antes

MGBG 25

CBH I (0,5-2,5%) CBH II (0,5-2,5%) β(1,3)4-glucanasa (15-20%) β-glucosidasa (410%) Xilanasa (70-88%) -Xilosidasa 0,10,4%, α-Glucuronidasa 0,1-2,0% α-L-Arabinofuranosidasa 0,1-1,0%; enzimas peptinoliticas y estearasas 1-6% proteasa 8-10% Digestibilidad potenciada. Produccion de piensos basados en cereales facilmente digeridos bajos en pentosa para aves de corral y cerdos. Mas del 30% de hidrolisis del βglucano no celulosico presente en centeno, que se acompana de una reduccion notable de la viscosidad Cebada, avena, centeno >60DC (hasta 85DC) Principalmente glucooligosacaridos, xilooligosacaridos (DP 26)

Se observo hidrolisis significativa del xilano y la fraccion de β-glucano no celulosico, lo que dio como resultado la formacion de productos de hidrolisis oligosacaridos de cadena media a alargada, que tambien serian sustratos de fermentacion adecuados para microorganismo probioticos.

Ejempao de�producci6n�de biogas

5 Se usaron dos reactores hibridos anaerobios de flujo superior de 10 l (UAHR; Reynolds, 1986), uno mantenido a 37 DC y el otro a 55 DC para produccion de biogas por poblaciones mixtas individuales de bacterias mesofilas y termofilas, respectivamente. El hidrolizado rico en azucares se bombeo a traves del lecho de lodo y se degrado por las comunidades de microorganismos presentes. Se uso un dispositivo separador en la parte superior del reactor para separar el gas producido de cualquier particula de lodo que pudiera haberse disgregado durante la digestion

10 anaerobia. Ambos reactores se evaluaron continuamente durante un periodo de funcionamiento de 650 dias supervisando la eficacia de la retirada de COD (APHA, 1992), reduccion de carbohidratos total (procedimiento de Dubois) y produccion de metano. Se supervisaron la produccion de acidos grasos, un indicador de metabolismo de azucares, y la produccion de metano por cromatografia de gases (CG).

Puede producirse biocombustible a partir de varias materias primas. Muchas de estas requieren el uso de diferentes

15 cocteles enzimaticos. MGBG 16 es el mejor coctel para la produccion de materias primas a partir de los residuos de alimentos y verduras enumerados mas adelante para produccion de biogas por digestion anaerobia.

Tabaa 1�

C6ctea�de Tratamiento

Restos�de desperdicios usados Principaaes azucares aiberados % de Reducci6n de Carbonos por Digesti6n Anaerobia Mes6fiaa % de Reducci6n de Carbonos por Digesti6n Anaerobia Term6fiaa % de metano en biogas por Digesti6n Anaerobia Mes6fiaa % de metano en biogas por Digesti6n Anaerobia Term6fiaa

MGBG 16

Algarroba Xilosa, glucosa manosa, celobiosa 99-100 94,0-96,6 58,0 49,0

Pan

Xilosa, xilobiosa, Glucosa, celobiosa 96,1-99,7 96,0-99,3 71,9 69,0

Orujo de Manzana

Glucosa, Acido galacturonico, Fructosa, Arabinosa, Galactosa, Xilosa 96,0-99,3 95,4-99,5 58,0 52,0

Carton

Xilosa, Glucosa (oligos traza mayores) 95,4-96,9 94,0-96,6 63,0 49,0

MGBG 18

Residuos mixtos de verduras/frutas (restaurante) Xilosa, Glucosa, Acido galacturonico, Fructosa; Arabinosa, Galactosa, Ramnosa

(* el % de Metano en biogas es normalmente 50-65% maximo);

Los datos de la Tabla 18 se consiguieron a tiempos de retencion de solo 3 dias, a diferencia de los informes de la bibliografia, en los que los tiempos de retencion estan normalmente entre 9 y 30 dias. Los tiempos de retencion 20 indican el periodo que tarda (o periodo de latencia) el metabolismo de las materias primas de carbohidratos y la

produccion de biogas.

Ejempao 12�Producci6n�de bioetanoa

Se realizo hidrolisis enzimatica convencional a 37 DC, 50 DC y 60 DC en recipientes de 300 ml y 1 l con agitacion a ∼ 130 rpm. La dosificacion enzimatica fue de 32 UPF de cada preparacion enzimatica por gramo de celulosa en una solucion de sustrato tamponada (como describe Gilleran, (NUI, Galway, Ph.D. Thesis, 2004) peso total procesado =

5 a 100 g en estudios a escala de laboratorio). El pH del tampon de reaccion se ajusto a pH 5,0. Las muestras se retiraron a intervalos cronometrados y la accion enzimatica finalizo hirviendo durante 10 minutos. Durante un periodo de 0-72 horas se midio lo siguiente:

• Liberacion de azucares reductores y deteccion y cuantificacion de azucares individuales (expresado como g/l)

• Analisis por HPLC de los azucares producto de hidrolisis (cantidades de producto expresadas en g/l) 10 • Reduccion de peso/volumen del resto

• Contenido de fibras de celulosa antes y despues del tratamiento enzimatico

La microscopia electronica de barrido (MEB) de la integridad del sustrato, antes y despues de la produccion, por tratamiento enzimatico, de acidos grasos clave durante el metabolismo de azucares por las bacterias anaerobias, y la produccion de metano, se supervisaron por cromatografia de gases (CG). Se midio el bioetanol producido por

15 fermentacion de levadura usando dos estrategias, un kit de ensayo ligado a enzimas, para la cuantificacion de etanol (r-Biopharm, Alemania) y tambien por cromatografia liquida de alto rendimiento (HPLC).

Se ensayaron restos de hidrolizado de picea de sitka, residuos de papel y lenosos (mezcla de restos de coniferas, principalmente picea de sitka) en estudios a escala de laboratorio. Se investigaron dos formatos de produccion de etanol, SHF (Hidrolisis y Fermentacion Secuenciales, Secuentia/ Hydro/isis and Fermentation) y SSF (Sacarificacion

20 y Fermentacion Simultaneas, Simu/taneous Saccharification and Fermentation).

Tabaa 19: Composici6n�de�c6ctea�enzimatico �para aa�producci6n �de�Bioetanoa

Enzima

MGBG�1a % MGBG2b % MGBG�3c % MGBG4d %

CBH I CBH II β-(1,3)4-glucanasa

20-28 15-20 20-25 15-20 20-28 20-26 15-17 22-26 25 12-15 24-30 20-22

β-glucosidasa Xilanasa β-Xilosidasa, α-Glucuronidasa α-L-Arabinofuranosidasa (Otras hidrolasas, incluyendo enzimas Pectinoliticas, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; actividades oxidasa modificadoras de Lignina)

10-12 20-25 5-10 5-8 0,5-2,0 8-15 10-11 18-30 8-10 8-10 0,5-2,0 6-17 11-15 24-27 10-12 6-8 2-4,0 12-15 ∼10.0 20-30 5-8 8-10 1,5-3,0 10-15

Datos de estudios a escala de laboratorio de 1 l en SHF y SSF; los valores de hidrolisis se basan en la celulosa disponible y cualquier hemicelulosa residual en sustrato

34 35

Tabaa 20: �Comparaci6n�de �aa �producci6n�de �bioetanoa de hidroaizado�de�picea�generado�por�composiciones�de �aa invenci6n yenzimas�comerciaaes

Preparaci6nenzimatica

Tiempo de�Reacci6n�Optimo�ih) % �de�Hidr6aisis* Heiosa�g/a Etanoa�SSF�g/a�i37�C) Eficacia �de�Fermentaci6n de�SSF�i37�C) Temperatura�de�Reacci6n�Optima�i�C)�para�SHF Etanoa�de�SHF�g/a Eficacia �de�Fermentaci6n de�SHF

Celluclast

48 h 74,5 13,59 4,69 43,44 50,0 6,93 64,21

Cell +Novozym (24:4)

48 h 78,9 19,46 nd nd 50,0 8,97 83,18

72 h

82,3 19,50 5,70 52,80 50,0 nd nd

MGBG 1

48 h 57,9 12,56 4,83 44,74 50,0 nd nd

72 h

87,2 19,34 nd nd 50,0 nd nd

24 h

88,1 19,14 nd nd 60,0 10,29 91,50

24 h

90,4 19,75 6,89 63,82 70,0 10,51 93,46

MGBG 2

24 h 89,3 20,84 7,04 65,25 60,0 10,39 92,39

24 h

91,2 22,32 8,01 74,21 70,0 10,53 93,64

MGBG 3

24 h 87,3 15,69 8,58 79,53 70,0 8,71 80,71

MGBG 4

24 h 92,2 19,76 9,55 88,49 70,0 10,65 98,75

48 h

89,9 16,14 nd nd 70,0 nd nd

Tabaa 21: �Producci6n �de�bioetanoa�de�residuos de�Papea y restos�de�Coniferas generado�por �aos�c6cteaes�de �enzimas�termoestabaes �de T. emersonii en comparaci6n con �enzimas comerciaaes idatos �de estudiosa escaaa�de �aaboratorio�de�1a �en�SHF y�SSF; �aos�vaaores�de hidr6aisis�se�basan�en aa�ceauaosa�disponibae y�cuaaquier�hemiceauaosa�residuaa�en �ea�sustrato)

Preparaci6nenzimatica

Temperatura�de�Reacci6n�Optima�i�C) Tiempo de�Reacci6n�Optimo�ih) % �de�Hidr6aisis* Heiosa�g/a�i37�C) Etanoa�deSSF�g/a�i37�C) Eficacia �de�Fermentaci6n de�SSF Etanoa�deSHF�g/a�i37�C) Eficacia �de�Fermentaci6n de�SHF�i37�C)

Residuos de Papel

MGBG 1

70,0 24 h 76,5 13,59 8,36 74,3 7,18 66,5

MGBG 3

70,0 24 h 79,2 17,57 7,89 70,2 8,08 74,6

MGBG 4

70,0 24 h 83,4 19,46 7,54 69,9 8,22 76,2

Residuos de Coniferas

MGBG 1

70,0 24 h 63,8 11,21 7,57 67,3 7,03 65,1

MGBG 3

70,0 24 h 74,9 13,09 7,92 70,4 7,53 69,8

MGBG 4

70,0 24 h 77,9 13,57 7,74 71,8 7,82 72,5

Tabaa 22: �Otros�c6cteaes�para�producci6n�de�hidroaizados �ricos en�azucares�fermentabaes a�partir�de�faujos�de residuos �de�verduras/frutas

C6ctea

Composici6n dea c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucar de aos productos

MGBG 18

CBH I (5-10%) CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (2540%) βglucosidasa (∼5%) Xilanasa (18-25%) + [ -Xilosidasa 1-2,0%, Exoxilanasa 1-3,0%, α-Glucuronidasa 8-10%, α-L-Arabinofuranosidasa 1,5-5,0%; enzimas peptinoliticas 10-15%, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 5-7%; otras hemicelulasas al 510% incluyendo βgalactosidasa, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 1-4% + proteasa 8-12%] Produccion de azucares fermentables para la fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materia primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, etc. Residuos mixtos de verduras/frutas (restaurante) >60DC (hasta 80DC) Xilosa, Glucosa, acido Galacturonico, Fructosa, Arabinosa, Galactosa, Ramnosa

MGBG 32

CBH I (1-5%) CBH II (1-5%) β(1,3)4-glucanasa (2025%) βglucosidasa (8-12%) Xilanasa (30-35%) + [ -Xilosidasa 0,51,5%, α-L-Arabinofuranosidasa 12,5%; enzimas peptinoliticas 18-25%, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon ∼5-10%; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 8-15% + proteasa 10-15%] Produccion de azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materia primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, precursores de aroma y sabor, etc. Tambien pueden usarse para extraccion de zumo potenciada y produccion de "bebidas sanas" Residuos mixtos de verduras/frutas (restaurante) Tambien frutas blandas mixtas >60DC (hasta 80DC) Xilosa, Glucosa, acido Galacturonico, Fructosa, Arabinosa, Galactosa, Ramnosa

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de�tratamiento 6ptima�i�C) Azucar �de�aos productos

MGBG 6

CBH I (1-5%) CBH II Produccion de Residuos >60DC (hasta Xilosa,

(4%

(1-5%) azucares mixtos de 80DC) Glucosa,

CarrotBP;

fermentables para verduras/frutas

1:1)

β(1,3)4-glucanasa (2228%) βglucosidasa (10-15%) Xilanasa (25-30%) + [ -Xilosidasa 0,7-2,1%, α-L-Arabinofuranosidasa 24%; enzimas peptinoliticas 20-25%, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon ∼5-8%; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 12-15% + proteasa 8-12%] la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materia primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, precursores de aroma y sabor, etc. Tambien pueden usarse para extraccion de zumo potenciada y produccion de "bebidas sanas" (restaurante) Tambien frutas blandas mixtas acido Galacturonico, Fructosa, Arabinosa, Galactosa, Ramnosa

Tabaa 23: �C6cteaes �para�aa�producci6n�de hidroaizados�ricos�en azucares�fermentabaes�a�partir de�faujos�de residuos �de�hospitaa�ricos�en�ceauaosa

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucar �de�aos productos

MGBG

CBH I (20-28%) Produccion de Flujo de 65DC (hasta Xilosa, Glucosa,

1

CBH II (15-20%) β(1,3)4glucanasa (20-25%) β-glucosidasa (10-12%) Xilanasa (20-25%) -Xilosidasa (5-10%) α-Glucuronidasa (5-8%) α-L-Arabinofuranosidasa (0,5-2,0%) (8-15%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, acido fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 85DC) como los principales azucares, con algo de galactosa

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucar �de�aos productos

MGBG

CBH I (15-20%) Produccion de Flujo de 60DC (hasta Glucosa y

2

CBH II (20-28%) β(1,3)4glucanasa (20-26%) azucares fermentables para fabricacion de residuos de hospital ricos en celulosa 85DC) xilosa, como los principales azucares, con

β-glucosidasa (10-11%)

biocombustible esterilizados algo de manosa

Xilanasa (18-30%) -

y galactosa

Xilosidasa (8-10%) α-

Glucuronidasa (8-10%)

α-L-Arabinofuranosidasa

(0,5-2,0%) (6-17%:

otras hidrolasas, incluyendo

enzimas Peptinoliticas, acido

fenolico y acetil(xilan)

esterasas, Proteasa;

actividades oxidasa

modificadoras de Lignina)

MGBG

CBH I (12-15%) Produccion de Flujo de 60DC (hasta Glucosa y

4

CBH II (24-30%) β(1,3)4glucanasa (20-22%) azucares fermentables para fabricacion de residuos de hospital ricos en celulosa 85DC) xilosa, como los principales azucares, con

β-glucosidasa (∼10%) Xilanasa (20-30%) -

biocombustible esterilizados algo de manosa y galactosa

Xilosidasa (5-8%) α-

Glucuronidasa (8-10%)

α-L-Arabinofuranosidasa

(1,5-3,0%) (10-15%:

otras hidrolasas, incluyendo

enzimas Peptinoliticas, acido

fenolico y acetil(xilan)

esterasas, Proteasa;

actividades oxidasa

modificadoras de Lignina)

MGBG

CBH I (50-55%) Produccion de Flujo de 60DC (hasta Principalmente

27

CBH II (20-25%) β(1,3)4glucanasa (12-20%) azucares fermentables para fabricacion de residuos de hospital ricos en celulosa 85DC) glucosa; cantidad menor de xilosa

β-glucosidasa (5-8%)

biocombustible esterilizados

Xilanasa (∼5%) -

Xilosidasa (0,1-0,5%) α-L-

Arabinofuranosidasa (0,5

2,0%) (5-8%: otras

hidrolasas, incluyendo

enzimas Peptinoliticas

seleccionadas, esterasas;

Proteasa 0,5-1,5%;

actividades oxidasa 0,5

1,5%)

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucar �de�aos productos

MGBG 31

CBH I (5-10%) CBH II (∼15%) β(1,3)4-glucanasa (28-32%) β-glucosidasa (8-12%) Xilanasa (22-30%) -Xilosidasa 10-15% α-Glucuronidasa (2-5%) α-L-Arabinofuranosidasa (13,0%) (20-25%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) Produccion de azucares fermentables para fabricacion de biocombustible Flujo de residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 60DC(hasta 85DC) Glucosa y xilosa, como los principales azucares, con algo de manosa, galactosa y acido galacturonico

MGBG

CBH I (20-25%) Produccion de Flujo de 60DC(hasta Glucosa y

34

CBH II (10-15%) β(1,3)4glucanasa (24-28%) β-glucosidasa (10-15%) Xilanasa (25-30%) -Xilosidasa (5-8%) α-Glucuronidasa (1-3%) α-L-Arabinofuranosidasa (23,0%) (5-10%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 85DC) xilosa, como los principales azucares, con algo de manosa, galactosa y acido galacturonico

MGBG

CBH I (10-12%) CBH II Produccion de Flujo de 60DC(hasta Glucosa y

35

(∼15%) β(1,3)4-glucanasa (30-40%) βglucosidasa (5-10%) Xilanasa (15-28%) -Xilosidasa (2-5%) α-Glucuronidasa (1-3%) α-L-Arabinofuranosidasa (13,0%) (∼15%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 85DC) xilosa, como los principales azucares, con algo de manosa, galactosa y acido galacturonico

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucar �de�aos productos

MGBG

CBH I (10-12%) CBH II Produccion de Flujo de 60DC(hasta Glucosa y

36

(∼15%) β(1,3)4-glucanasa (30-40%) βglucosidasa (5-10%) Xilanasa (15-28%) -Xilosidasa (2-5%) α-Glucuronidasa (1-3%) α-L-Arabinofuranosidasa (13,0%) (∼15%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, tales como β-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo-galacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como αgalactosidasa; acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 85DC) xilosa, como los principales azucares, con algo de manosa, galactosa y acido galacturonico

MGBG

CBH I (15-20%) CBH II Produccion de Flujo de 60DC(hasta Glucosa y

37

(35-40%) β(1,3)4-glucanasa (20-25%) βglucosidasa (5-10%) Xilanasa (15-20%) -Xilosidasa (1-3%) α-Glucuronidasa (0,5-2%) α-L-Arabinofuranosidasa (13,0%) (12-15%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, tales como β-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo-galacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como αgalactosidasa; acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 85DC) xilosa, como los principales azucares, con algo de manosa, galactosa y acido galacturonico

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucar �de�aos productos

MGBG

CBH I (25-30%) Produccion de Textiles ricos 60DC(hasta Glucosa, algo

38

CBH II (15-20%) β(1,3)4glucanasa (15-20%) β-glucosidasa (2-8%) Xilanasa (25-30%) -Xilosidasa (1-3%) α-Glucuronidasa (0,5-2%) α-L-Arabinofuranosidasa (13,0%) (15-20%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, tales como β-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como α-galactosidasa; acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, compuestos de aroma y saporiferos de alimentos, materias primas quimicas etc. en algodon, especialmente en formas de algodon muy purificadas 85DC) de manosa, galactosa y acido galacturonico. Cantidades menores de xilosa

MGBG

CBH I (20-25%) Produccion de Textiles ricos 60DC(hasta Principalmente

39

CBH II (20-25%) β(1,3)4glucanasa (20-25%) β-glucosidasa (8-12%) Xilanasa (20-25%) -Xilosidasa (2-5%) α-Glucuronidasa (1-3%) α-L-Arabinofuranosidasa (13,0%) (8-12%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, tales como β-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como α-galactosidasa; acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, compuestos de aroma y saporiferos de alimentos, materias primas quimicas etc. en algodon, incluyendo mas fibras mixtas 85DC) glucosa, con algo de xilosa y manosa

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea�i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucar �de�aos productos

MGBG

CBH I (18-25%) Produccion de Flujo de 60DC(hasta Glucosa y

40

CBH II (15-20%) β(1,3)4glucanasa (25-30%) β-glucosidasa (5-10%) Xilanasa (20-25%) -Xilosidasa (0,5-2%) α-Glucuronidasa (0,5-2%) α-L-Arabinofuranosidasa (1,5-4,0%) (20-25%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, tales como β-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como α-galactosidasa; acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 85DC) xilosa, como los principales azucares, con algo de manosa y galactosa

MGBG

CBH I (10-15%) Produccion de Flujo de 60DC(hasta Glucosa y

43

CBH II (20-25%) β(1,3)4glucanasa (25-30%) β-glucosidasa (5-10%) Xilanasa (25-30%) -Xilosidasa (5-10%) α-Glucuronidasa (1-3%) α-L-Arabinofuranosidasa (13,0%) (10-14%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas Peptinoliticas, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para fabricacion de biocombustible residuos de hospital ricos en celulosa esterilizados 85DC) xilosa, como los principales azucares, con algo de manosa

Tabaa 24: C6cteaes para aa producci6n de hidroaizados ricos en azucares fermentabaes de faujos de residuos teitiaes.

C6ctea

Composici6n dea c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares de aos�productos

MGBG

CBH I (20-25 %) Produccion de Textiles ricos 60 DC (hasta Glucosa

34

CBH II (10-15%) �(1,3)4-glucanasa (24-28 %) �-glucosidasa (10-15 %) Xilanasa (25-30 %) �-Xilosidasa (5-8 %) a-Glucuronidasa (1-3 %) a-L-Arabinofuranosidasa (23,0 %) (5-10 %: otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas, acido fenolico y acetil(xilan) esterasas, proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa o modificadoras de Lignina) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, compuestos aromatizantes y saporiferos de alimentos, materias primas quimicas, etc. en algodon 85 DC) principalmente con algo de xilosa, galactosa y acido galacturonico.

MGBG

CBH I (15-20 %) Produccion de Textiles ricos 65 DC (hasta Principalmente

37

CBH II (35-40 %) �(1,3)4-glucanasa (20-25 %) �-glucosidasa (5-10 %) Xilanasa (15-20 %) �-Xilosidasa (1-3 %) a-Glucuronidasa (0,5-2 %) a-L-Arabinofuranosidasa (0,13,0 %) (12-15 %: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas Pectinoliticas tales como , �-galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como a-galactosidasa, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, compuestos aromatizantes y saporiferos de alimentos, materias primas quimicas, etc. en algodon, incluyendo mas fibras mixtas y mas textiles de algodon procesados. 85 DC) glucosa, algunas cantidades menores de xilosa y manosa.

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares�de aos�productos

MGBG

CBH I (25-30 %) Produccion de Textiles ricos 60 DC (hasta Glucosa, algo

38

CBH II (15-20 %) �(1,3)4-glucanasa (15-20 %) -glucosidasa (2-8 %) Xilanasa (25-30 %) -Xilosidasa (1-3 %) a-Glucuronidasa (0,5-2 %) a-L-Arabinofuranosidasa (13,0 %) (15-20 %: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas Pectinoliticas tales como , -galctosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como a-galactosidasa, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, compuestos aromatizantes y saporiferos de alimentos, materias primas quimicas, etc. en algodon, especialmente en formas de algodon muy purificadas 85 DC) de manosa, galactosa y acido galacturonico. Cantidades menores de xilosa.

MGBG

CBH I (20-25 %) Produccion de Textiles ricos 65 DC (hasta Principalmente

39

CBH II (20-25 %) �(1,3)4-glucanasa (20-25 %) -glucosidasa (8-12 %) Xilanasa (20-25 %) -Xilosidasa (2-5 %) a-Glucuronidasa (1-3 %) a-L-Arabinofuranosidasa (13,0 %) (8-12 %: Otras hidrolasas, incluyendo enzimas Pectinoliticas tales como , -galctosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como a-galactosidasa, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, compuestos aromatizantes y saporiferos de alimentos, materias primas quimicas, etc. en algodon, incluyendo mas fibras mixtas. 85 DC) glucosa, con algo de xilosa y manosa.

Tabaa 25: �C6cteaes �para�aa�producci6n�de hidroaizados�ricos�en azucares�fermentabaes�de�cereaaes, incauyendo�cuativos�compaetos,�granos,�restos�de�procesamiento y�residuos�de�fabricaci6n�de�cerveza.

C6ctea

Composici6n dea c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares de aos�productos

MGBG

CBH I (5-10 %) Produccion de Cereales, >60 DC. Xilosa,

5

CBH II (8-15 %) �(1,3)4-glucanasa (18-22 %) -glucosidasa (6-10 %) Xilanasa (30-35 %) + [�-Xilosidasa 5-12 % Exoxylanasa 10-15 %; a-Glucuronidasa (3-5 %), a-L-Arabinofuranosidasa (1,5-5,0 %); enzimas Pectinoliticas 8-10 %, incluyendo -galctosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 57 %; otras hemicelulasas incluyendo agalactosidasa 4-7 %, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 1-4 %, + proteasa 2-6 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. incluyendo cultivos completos, granos, restos de procesamiento y residuos de fabricacion de cerveza, especialmente residuos de cebada, trigo, centeno, maiz, malta/masa (incluyendo granos de destilacion). (hasta 80 DC) arabinosa, glucosa, celobiosa, xelobiosa, galactosa, acido glucuronico, algunos acidos fenolicos, cantidades pequenas de acidos glucuronicos, acido galacturonico y Ramnosa y oligosacaridos superiores.

MGBG

CBH I (1-5 %) Produccion de Cereales, >60 DC. Xilosa,

6

CBH II (1-5 %) (1,3)4-glucanasa (22-28 %) -glucosidasa (10-15 %) Xilanasa (25-30 %) +[�-Xilosidasa 0,7-2,1 %, a-L-Arabinofuranosidasa 2-4%;enzimas Pectinoliticas 20-25 %, incluyendo -galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon ∼ 5-8 %; oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 12-15 %, + proteasa 8-12 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, precursores de aromatizantes y saporiferos, edulcorantes naturales, etc. incluyendo cultivos completos, granos, restos de procesamiento y residuos de fabricacion de cerveza especialmente cebada, trigo y avena. (hasta 85 DC) arabinosa, principalmente glucosa, cantidades pequenas de acidos glucuronicos, galactosa, acido galacturonico y Ramnosa y disacaridos (celobiosa y xilobiosa).

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares�de aos�productos

MGBG

CBH I (5-10 %) Produccion de Restos de >60 DC. Principalmente

7

CBH II (8-12 %) (1,3)4-glucanasa (25-30 %) -glucosidasa (5-10 %) Xilanasa (40-45 %) + [�-Xilosidasa 0,5-2,0 %, α-glucuronidasa, a-L-Arabinofuranosidasa 0,52,0 %; enzimas Pectinoliticas 8-15 %, principalmente �-galactosidasa y exogalacturonasa, esterasas 2-4 %, + proteasa 10-15 %] azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo, productos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. cebada, mijo, trigo, avena. (hasta 85 DC) xilosa, arabinosa, glucosa, celobiosa, xilobiosa, acido glucuronico, algo de galactosa, acidos fenolicos, acido galacturonico.

MGBG

CBH I (5-10 %) Produccion de Cereales, >60 DC. Xilosa,

8

CBH II (5-10 %) (1,3)4-glucanasa (∼20 %) -glucosidasa (4-8 %) Xilanasa (25-30 %), incluyendo Exoxylanasa (5-10 %) + [β-Xilosidasa 12,0 %, a-Glucuronidasa 58 %, a-L-Arabinofuranosidasa 0,53,0 %; enzimas Pectinoliticas 8-12 %, incluyendo -galctosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 8-12 %; otras hemicelulasas 5-10 %, incluyendo agalactosidasa, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 1-3 %, + proteasa 10-12 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. incluyendo cultivos completos, granos, restos de procesamiento y residuos de fabricacion de cerveza, especialmente residuos de trigo, avena, cebada, malta/masa (incluyendo granos de destilacion). (hasta 80 DC) arabinosa, glucosa, celobiosa, xilobiosa; cantidades menores de acido glucuronico, acidos fenolicos y galactosa.

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares�de aos�productos

MGBG

CBH I (5-10 %) Produccion de Cereales, >60 DC. Xilosa,

9

CBH II (5-10 %) (1,3)4-glucanasa (20-25 %, incluyendo liquenanasa superior) -glucosidasa (8-10 %) Xilanasa (25-30 %), incluyendo Exoxylanasa a ∼ 8-12 %)+ [β-xilosidasa 25,0 %, a-Glucuronidasa 14 %, a-L-Arabinofuranosidasa (25,0 %); enzimas Pectinoliticas 5-10 %, incluyendo α-galctosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 5-10 %; otras hemicelulasas 3-6 %, incluyendo βgalactosidasa, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 2-4 %, + proteasa 5-10 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. incluyendo cultivos completos, granos, restos de procesamiento y residuos de fabricacion de cerveza, especialmente residuos de trigo, avena, cebada, sorgo y mas residuos adyuvantes nuevos, residuos de malta/masa (incluyendo granos de destilacion). (hasta 80 DC) arabinosa, glucosa, celobiosa, xilobiosa; cantidades menores de acido glucuronico, acidos fenolicos y galactosa.

MGBG

CBH I (3-6 %) Produccion de Cereales, >60 DC. Xilosa,

10

CBH II (5-10 %) (1,3)4-glucanasa (25-40 %, incluyendo liquenanasa superior) -glucosidasa (2-5 %) Xilanasa ∼(25-30 %), incluyendo Exoxylanasa a ∼10-15 %)+ [β-xilosidasa 5-12 %, a-Glucuronidasa 2-5 %, a-L-Arabinofuranosidasa (25,0 %); enzimas Pectinoliticas ∼ 5-8 %, incluyendo β-galctosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 2-5 %; otras hemicelulasas 2-5 %, incluyendo βgalactosidasa, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 1-3 %, + proteasa 3-6 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. incluyendo cultivos completos, granos, restos de procesamiento y residuos de fabricacion de cerveza, especialmente residuos de trigo, avena, cebada, maiz, centeno, malta/masa (incluyendo granos de destilacion). (hasta 80 DC) arabinosa, glucosa, celobiosa, xilobiosa; cantidades menores de acido glucuronico, acidos fenolicos y galactosa. Algunos oligosacaridos superiores.

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares�de aos�productos

MGBG

CBH I (1-5 %) Produccion de Cereales, >60 DC. Xilosa,

11

CBH II (5-8 %) �(1,3)4-glucanasa (20-25 %, incluyendo alta actividad frente a glucanos de enlace mixto DP superiores y medios) -glucosidasa (20-30 %) Xilanasa (∼ 15-20 %), incluyendo Exoxilanasa ∼ 3-6 %) + β-xilosidasa 2-6 %, a-Glucuronidasa 13 %, a-L-Arabinofuranosidasa 1,5-3,0 %; enzimas Pectinoliticas ∼8-12 %, incluyendo β-galctosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 5-10 %; otras hemicelulasas 6-11 %, incluyendo αgalactosidasa, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 3-7 %, + proteasa 10-15 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. incluyendo cultivos completos, granos, restos de procesamiento y residuos de fabricacion de cerveza, especialmente restos de trigo, maiz, avena, cebada, malta/masa de centeno (incluyendo granos de destilacion). (hasta 80 DC) arabinosa, glucosa, cantidades menores de acido glucuronico, acidos fenolicos galactosa y Ramnosa. Algunos oligosacaridos superiores.

MGBG

CBH I (5-10 %) Produccion de Cereales, >60 DC Xilosa,

13

CBH II (5-10 %) (1,3)4-glucanasa (25-40 %) -glucosidasa (∼5 %) Xilanasa (18-25 %), + [β-xilosidasa 1-2,0 %, exoxilanasa 1-3,0 %, a-Glucuronidasa 8-10 %, a-L-Arabinofuranosidasa 1,5-5,0 %; enzimas Pectinoliticas 10-15 %, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 5-7 %; otras hemicelulasas 5-10 %, incluyendo αgalactosidasa, oxidoreductasa/oxidasa y esterasas 1-4 %, + proteasa 8-12 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. incluyendo cultivos completos, granos, restos de procesamiento y residuos de fabricacion de cerveza, especialmente de avena, cebada, trigo, malta/masa (incluyendo granos de destilacion). (hasta 80 DC) arabinosa, glucosa, celobiosa, xilobiosa, galactosa, acido glucuronico, algunos acidos fenolicos, acido Galacturonico y Ramnosa.

Tabaa 26: �C6cteaes �para�aa�producci6n�de hidroaizados�ricos�en azucares�fermentabaes�a�partir de�residuos horticoaas�basados �en�no·cereaaes, incauyendo�hierbas�iy �ensiaaje),�hojas,�recortes�de�poda y�faujos�de residuos �de�faoristeria.

C6ctea

Composici6n dea c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares de aos�productos

MGBG

CBH I (15-20 %) Produccion de Residuos 60 DC. (hasta Glucosa y

2

CBH II (20-28 %) �(1,3)4-glucanasa (20-26 %) -glucosidasa (10-11 %) Xilanasa (18-30%) β-xilosidasa (8-10 %) a-Glucuronidasa (8-10 %), a-L-Arabinofuranosidasa (0,5-2,0 %) (6-17%:otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas, acido fenolico y acetil (xilan)esterasas, proteasa; actividades oxidasa modificadoras de Lignina). azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo, compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, moleculas antioxidantes, etc. horticolas, incluyendo hierbas, hojas, recortes de poda y flujos de residuos de floristeria mixtos; especialmente buenos para mas materiales lenosos. 85 DC) xilosa como los principales azucares, con algo de arabinosa, manosa y galactosa, acidos glucuronico y galacturonico, algunos acidos fenolicos y ramnosa, asi como algunos oligosacaridos DP superiores.

MGBG

CBH I (5-10 %) Produccion de Residuos >60 DC. Xilosa,

13

CBH II (5-10 %) (1,3)4-glucanasa (25-40 %) -glucosidasa (∼5 %) Xilanasa (18-25%), + [βxilosidasa 1-2,0%, 1-3,0; exoxilanasa 8-10, a-Glucuronidasa 1,5-5,0 %), a-L-Arabinofuranosidasa; 10-15%;enzimas pectinoliticas incluyendo α galactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactosaza, actividad modificadora de almidon 5-7 %; otras hemicelulasas 5-10 %, incluyendo αgalactosidasa, 1-4 %, oxido reductasa/oxidasa y estearasas + proteasa 812 %] azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo, compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, moleculas antioxidantes, etc. horticolas, incluyendo hierbas, hojas, recortes de poda y flujos de residuos de floristeria mixtos; especialmente buenos hierbas y ensilaje. (hasta 80 DC) arabinosa, glucosa, celobiosa, xilobiosa, galactosa, manosa, acido glucuronico, algunos acidos fenolicos, acido galacturonico y Ramnosa. Algunos oligosacaridos superiores.

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i� �C) Azucares�de aos�productos

MGBG

CBH I (5-10 %) Produccion de Residuos >60 DC. Xilosa, glucosa,

21

CBH II (5-10 %) (1,3)4-glucanasa (15 %) -glucosidasa (∼2-10 %) Xilanasa (50-55 %), + [xilosidasa 1-5%); exoxilanasa 5-10 %,a-Glucuronidasa (1-4 %), a-L-Arabinofuranosidasa (25%);enzimas pectinoliticas 20-25 %, actividad modificadora de almidon 4-6 %; otras hemicelulasas 7-10 %, oxidoreductasa/oxidasa y estearasas 2-4 % + proteasa ∼10 %]. azucares fermentables para fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo, compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, precursores de aroma y sabor, moleculas antioxidantes, etc. horticolas, incluyendo hierbas, hojas, recortes de poda y flujos de residuos de floristeria mixtos; tambien buenos para corteza. (hasta 80/85 DC) arabinosa, galactosa, manosa, acido galacturonico, algo de fructosa, Ramnosa; algunos acidos fenolicos y sacarosa; algunos oligosacaridos superiores.

MGBG

CBH I (1-5 %) Produccion de Residuos >60 DC. Xilosa, glucosa,

32

CBH II (1-5 %) �(1,3)4-glucanasa (20-25 %) -glucosidasa (8-12 %) Xilanasa (30-35 %) + [βxilosidasa (0,5-1,5%), a-L-Arabinofuranosidasa (12,5%); enzimas pectinoliticas 18-25 %, incluyendo αgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon ∼5-10 %; oxido reductasa/oxidasa y estearasas 8-15 % + proteasa 10-15 %]. azucares fermentables para fabricacion de biocombustible y/u otros productos de alto valor, por ejemplo, compuestos (bio) quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, moleculas antioxidantes, etc. horticolas, incluyendo hierbas, hojas, recortes de poda y flujos de residuos de floristeria mixtos. (hasta 80 DC) arabinosa, galactosa, acido galacturonico, algo de fructosa, Ramnosa; algunos acidos fenolicos.

MGBG

CBH I (20-25 %) Produccion de Residuos 60 DC. (hasta Glucosa,

34

CBH II (10-15 %) azucares horticolas, 85 DC) arabinosa y

CBH

� (1,3)4-glucanasa (24-28 %) -glucosidasa (10-15 %) Xilanasa (25-30 %), + βxilosidasa (5-8 %), a-Glucuronidasa (1-3 %), a-L-Arabinofuranosidasa (23,0 %) (5-10%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas, acido fenolico y acetil (xilan)esterasas, proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina). fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, compuestos aromaticos y saporiferos de los alimentos, materias primas quimicas, etc. incluyendo hierbas, hojas, recortes de poda y flujos de residuos de floristeria mixtos. xilosa principalmente con algo de galactosa y acido galacturonico; acidos fenolicos, Ramnosa y algun oligosacarido.

Tabaa 27: �C6cteaes �para�producci6n �de�hidroaizados�ricos�en�azucares�fermentabaes a�partir�de �faujos�de residuos �de�papea

Los residuos de papel incluyen: papel de periodico en blanco y negro, papel de periodico en color, revistas satinadas, vasos de papel, platos de papel, panuelos de papel/toallitas, papel marron, carton corrugado, papel de oficina blanco, celofan, papel de cocina, KleenexTM y vendas de algodon domesticas

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares�de�aos productos

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de Vasos de 60 DC (hasta Glucosa,

26

CBH II (45-50%) β(1,3)4-glucanasa (10-15%) -glucosidasa (0,5-2,0%) Xilanasa (15-20%) β-Xilosidasa (0,2-1,0%) α-Glucuronidasa (0,5-2,0%) a-L-Arabinofuranosidasa (0,5-1,5%) Otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas 3-6%, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas 0,2-1,0, Proteasa 1-5%; enzimas modificadoras de almidon 5-10%, actividades oxidorreductasa/oxidasa 25 azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, saporiferos de alimentos y compuestos aromaticos, materias primas quimicas, etc. papel, papel marron, KleenexTM y productos residuales de papel relacionados 85 DC) arabinosa y xilosa, algo de galactosa y acido galacturonico; algunos oligosacaridos

MGBG

CBH I (50-55%) Produccion de Papel blanco 60 DC (hasta Glucosa,

27

CBH II (20-25%) β(1,3)4-glucanasa (12-20%) -glucosidasa (5-8%) Xilanasa (∼5%) β-Xilosidasa (0,1-0,5%) a-L-Arabinofuranosidasa (0,5-2,0%) (5-8%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas seleccionadas, esterasas; Proteasa 0,5-1,5%; actividades oxidasa 0,51,5%) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, saporiferos de alimentos y compuestos aromaticos, materias primas quimicas, etc. de oficina, platos de papel y productos relacionados 85 DC) cantidades menores de arabinosa y xilosa, galactosa y acido galacturonico; algunos oligosacaridos, pero principalmente monosacaridos

MGBG

CBH I (10-15%) Produccion de Papel blanco 60 DC (hasta Glucosa,

28

CBH II (30-35%) β(1,3)4-glucanasa (15-20%) -glucosidasa (2-5%) Xilanasa (20-25%) β-Xilosidasa (0,5-2,0%) a-L-Arabinofuranosidasa (0,5-2,0%) (17-26%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas y modificadoras de almidon seleccionadas, esterasas 25%; Proteasa 8-10%; actividades oxidasa 2-5%) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, saporiferos de alimentos y compuestos aromaticos, materias primas quimicas, etc. de oficina, platos de papel y productos relacionados 85 DC) cantidades menores de arabinosa y xilosa, galactosa y acido galacturonico; algunos oligosacaridos, pero principalmente monosacaridos

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares de aos productos

MGBG

CBH I (8-10%) Produccion de Toallitas, 60 DC (hasta Glucosa,

29

CBH II (8-10%) β(1,3)4-glucanasa (20-30%) -glucosidasa (25-30%) Xilanasa (20-30%) β-Xilosidasa (0,5-2,0%) β-L-Arabinofuranosidasa (0,5-2,0%) Hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas 510% y modificadoras de almidon 5-8%, esterasas 13%; Proteasa 5-10%; oxidasas 2-5% azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, saporiferos de alimentos y compuestos aromaticos, materias primas quimicas, etc. vendas de algodon, carton y celofan 85 DC) cantidades menores de arabinosa y xilosa, galactosa y acido galacturonico; algunos oligosacaridos, pero principalmente monosacaridos

Tabaa 2�: �C6cteaes �para�producci6n �de�hidroaizados ricos�en�azucares�fermentabaes a�partir�de residuos/restos �de�envasado�biodegradabaes

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares�de aos�productos

MGBG

CBH I (20-25%) Produccion de Residuos/restos 60 DC (hasta Xilosa, glucosa,

30

CBH II (20-25%) β(1,3)4-glucanasa (1520%) -glucosidasa (1-5%) Xilanasa (25-30%) β-Xilosidasa (5-10%) α-L-Arabinofuranosidasa (0,6-2,0%) (otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas 812% seleccionadas, enzimas modificadoras de almidon 4-8%, enzimas degradantes de manano 13%, esterasas 1-5%; Proteasa 3-6,0%; actividades oxidasa 2-5%) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, saporiferos de alimentos y compuestos aromaticos, materias primas quimicas, etc. de envasado biodegradables 85 DC) galactosa, cantidades pequenas de manosa, acido galacturonico; y algunos oligosacaridos, pero principalmente monosacaridos

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares de aos�productos

MGBG

CBH I (10-12%) Produccion de Residuos/restos 60 DC (hasta Glucosa y xilosa

35

CBH II (∼15%) β(1,3)4-glucanasa (3040%) -glucosidasa (5-10%) Xilanasa (15-28%) β-Xilosidasa (2-5%) α-Glucuronidasa (1-3%) α-L-Arabinofuranosidasa (1-3,0%) (∼15%: otras hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, saporiferos de alimentos y de envasado biodegradables 85 DC) como los principales azucares, con algo de manosa, galactosa y acido galacturonico

tales como αgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exo

compuestos aromaticos, materias primas quimicas, etc.

galacturonasa, enzimas degradantes de manano tales como βgalactosidasa, acido Fenolico y acetil(xilan) esterasas, Proteasa; enzimas modificadoras de almidon, actividades oxidasa modificadoras de Lignina)

MGBG

CBH I (8-10%) Produccion de Residuos/restos 60 DC (hasta Glucosa,

29

CBH II (8-10%) β(1,3)4-glucanasa (2030%) -glucosidasa (25-30%) Xilanasa (20-30%) β-Xilosidasa (0,5-2,0%) α-L-Arabinofuranosidasa (0,5-2,0%) (Hidrolasas, incluyendo enzimas pectinoliticas 5-10% seleccionadas y modificadores de almidon 5-8%, esterasas 1-3%; Proteasa 5-10%; actividades oxidasa 2-5%) azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y otros productos de alto valor, incluyendo antibioticos, carotenoides, saporiferos de alimentos y compuestos aromaticos, materias primas quimicas, etc. de envasado biodegradables 85 DC) cantidades menores de arabinosa y xilosa, galactosa y acido galacturonico; principalmente monosacaridos

Tabaa 29: C6cteaes �para�producci6n �de�hidroaizados�ricos�en�azucares�fermentabaes a�partir �de �biomasa fungica�iincauyendo�biomasa�gastada�despues�de �aa�fermentaci6n) y�biomasa�de�aagas�marinas

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares�de aos�productos

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de azucares Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

9

CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (2025%, incluyendo liquenanasa superior) -glucosidasa (8-10%) Xilanasa (25-30%, incluyendo Exoxilanasa ∼8-12%) + [β-Xilosidasa 2-5,0% α-Glucuronidasa 1-4%, α-L-Arabinofuranosidasa 2-5,0%; enzimas pectinoliticas 5-10%, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 5-10%; otras hemicelulasas 3-6%, incluyendo αgalactosidasa, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas 2-4% + proteasa 5-10%] fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de azucares Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

13

CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (2540%) -glucosidasa (∼5%) Xilanasa (18-25%) + [β-Xilosidasa 1-2,0%, Exoxilanasa 1-3,0%, α-Glucuronidasa 8-10%, α-L-Arabinofuranosidasa 1,5-5,0%; enzimas pectinoliticas 10-15%, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 5-7%; otras hemicelulasas 5-10%, incluyendo αgalactosidasa, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas 1-4% + proteasa 8-12%] fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares de aos�productos

MGBG

CBH I (2-5%) Produccion de Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

44

CBH II (2-5%) β(1,3)4-glucanasa (2025%) (1,3)6-glucanasa (2025%) N-Acetilglucosaminidasa y/o quitinasa 2-5% -glucosidasa (5-10%) Xilanasa (10-15%) + �[β-Xilosidasa 5-10%, α-Glucuronidasa 1-5%, α-L-Arabinofuranosidasa 15,0%; enzimas pectinoliticas 2-5%, incluyendo αgalactosidasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 2-5%; otras hemicelulasas 3-5%, incluyendo mananasa, oxidorreductasa/oxidasa 2-5% y esterasas 2-4% + proteasa 25-30%] azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

45

CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (1520%) (1,3)6-glucanasa (2530%) N-Acetilglucosaminidasa y/o quitinasa 5-10% -glucosidasa (5-10%) Xilanasa (1-4%) + �[β-Xilosidasa 2-5%, enzimas pectinoliticas 5-10%, incluyendo βgalactosidasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 12-15%; otras hemicelulasas 2-5%, incluyendo mananasa, oxidorreductasa/oxidasa 2-5% y esterasas 2-4% + proteasa 10-15%] azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos o Biomasa de algas y restos de procesamiento 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares de aos�productos

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

46

CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (2530%) -glucosidasa (5-10%) Xilanasa (20-25%) + �[β-Xilosidasa 2-5%, α-Glucuronidasa 1-4%, α-L-Arabinofuranosidasa 25%; enzimas pectinoliticas 5-8%, incluyendo βgalactosidasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 5-10%; otras hemicelulasas 1-2%, incluyendo mananasa, oxidorreductasa/oxidasa 2-5% y esterasas 2-5% + proteasa 30-35%] azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

MGBG

CBH I (2-5%) Produccion de Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

47

CBH II (2-5%) β(1,3)4-glucanasa (1015%) (1,3)6-glucanasa (4045%) -glucosidasa (8-10%) Xilanasa (2-5%) + �[β-Xilosidasa 1-3%, αglucuronidasa 1-2%, α-L-Arabinofuranosidasa 25%; enzimas pectinoliticas 2-5%, incluyendo βgalactosidasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 2-5%; otras hemicelulasas ∼5%, incluyendo mananasa, oxidorreductasa/oxidasa 2-5% y esterasas 1-3%] azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares de aos�productos

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

48

CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (4045%) (1,3)6-glucanasa (1015%) -glucosidasa (8-12%) Xilanasa (10-15%) + �[β-Xilosidasa 5-8%, αglucuronidasa 0,5-1,5%, α-L-Arabinofuranosidasa 0,5-1,5%; enzimas pectinoliticas 2-5%, incluyendo βgalactosidasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 2-5%; otras hemicelulasas ∼5%, incluyendo mananasa, oxidorreductasa/oxidasa 1-3% y esterasas 1-3%] azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

MGBG

CBH I (0,4-2%) Produccion de Biomasa de >60 DC (hasta Glucosa,

49

CBH II (0,4-1,0%) β(1,3)4-glucanasa (7,015,0%) (1,3)6-glucanasa (1215%) -glucosidasa (3,0-5,0%) Xilanasa (75,0-78,0%) + [β-Xilosidasa 0,4-2,0%, α-glucuronidasa 0,51,5%, α-L-Arabinofuranosidasa 0,21,5%; enzimas pectinoliticas 2-5%, incluyendo βgalactosidasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon 2-5%; otras hemicelulasas ∼4,0-7,0%, incluyendo mananasa, oxidorreductasa/oxidasa 1-3% y esterasas 1-3%] azucares fermentables para fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides antibioticos, probioticos, edulcorantes naturales, etc. levadura y hongos filamentosos 80 DC) celobiosa, manosa, Galactosa y algunos oligosacaridos, principalmente

Tabaa 30: �C6cteaes �para�producci6n �de�hidroaizados�ricos�en�azucares�fermentabaes a�partir�de �puapa�de remoaacha�azucarera,�caoa de�azucar yrestos�de�aas�mismas

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares�de aos productos

MGBG

CBH I (1-5%) Produccion de Remolacha >60 DC (hasta Xilosa,

6

CBH II (1-5%) β(1,3)4-glucanasa (2228%) -glucosidasa (10-15%) Xilanasa (25-30%) + [β-Xilosidasa 0,7-2,1%, α-L-Arabinofuranosidasa 24%; enzimas pectinoliticas 20-25%, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa, poligalacturonasa, exogalacturonasa y galactanasa, actividad modificadora de almidon ∼5-8%; oxidorreductasa/oxidasa y esterasas 12-15% + proteasa 8-12%] azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides antibioticos, probioticos, precursores de aroma y sabor, etc. azucarera, incluyendo las partes superiores, pulpa de remolacha y planta completa, asi como cana de azucar y residuos de procesamiento 85 DC) Glucosa, acido Galacturonico, Fructosa, Arabinosa, Galactosa, Ramnosa, Algunos oligosacaridos; acido fenolico liberado

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de Remolacha >60 DC (hasta Xilosa,

20

CBH II (5-10%) β(1,3)4-glucanasa (2032%) -glucosidasa (∼2-10%) Xilanasa (15-25%) + [β-Xilosidasa 15-20,0% Exoxilanasa 10-15%, α-Glucuronidasa 2-5%, α-L-Arabinofuranosidasa 1,5-5%; enzimas pectinoliticas 10-15%, actividad modificadora de azucares fermentables para la fabricacion de biocombustibles y/u otros productos de alto valor, por ejemplo compuestos (bio)quimicos/materias primas quimicas, carotenoides, antibioticos, probioticos, etc. azucarera, incluyendo las partes superiores, pulpa de remolacha y planta completa, asi como cana de azucar y residuos de procesamiento 80/85 DC) Glucosa, acido Galacturonico, Fructosa, Sacarosa, Arabinosa, Galactosa, Ramnosa, Algunos oligosacaridos; acido fenolico liberado

almidon ∼10%; otras hemicelulasas ∼5%, oxidorreductasa/oxidasa y esterasas 2-5% + proteasa ∼7-10%]

(continuacion)

C6ctea

Composici6n�dea�c6ctea i%) Apaicaci6n�diana Sustrato Temperatura de tratamiento 6ptima�i�C) Azucares de aos productos

MGBG

CBH I (5-10%) Produccion de Remolacha >60 DC Xilosa,

18

azucares fermentables azucarera, (hasta 80 DC)

CBH II (5-10%)

para la fabricacion de incluyendo las Glucosa,

β(1,3)4-glucanasa (25

biocombustibles y/u partes acido

40%)

otros productos de alto superiores, Galacturonico,

-glucosidasa (∼5%)

valor, por ejemplo pulpa de

Xilanasa (18-25%) + [β

compuestos remolacha y Fructosa,

Xilosidasa 1-2,0%,

(bio)quimicos/materias planta Sacarosa,

Exoxilanasa 1-3,0%, α

primas quimicas, completa, asi Arabinosa,

Glucuronidasa 8-10%, αL-Arabinofuranosidasa 1,5-5,0%; enzimas pectinoliticas 10-15%, incluyendo βgalactosidasa, ramnogalacturonasa,

carotenoides, antibioticos, probioticos, etc. como cana de azucar y residuos de procesamiento Galactosa, Ramnosa Algunos oligosacaridos; acido fenolico liberado

poligalacturonasa,

exogalacturonasa y

galactanasa, actividad

modificadora de almidon

5-7%; otras hemicelulasas

5-10%, incluyendo α

galactosidasa,

oxidorreductasa/oxidasa y

esterasas 1-4% +

proteasa 8-12%]

Varios de los cocteles enumerados anteriormente tienen aplicaciones en una amplia serie de otras aplicaciones. En estas aplicaciones, las diferencias clave en el uso de los cocteles corresponden a (a) dosificacion de enzimas, o cantidad usada en cada tratamiento, y (b) la duracion de la incubacion. Por ejemplo, MGBG 18 esta muy bien 5 adaptada para el tratamiento de ciertos flujos de residuos, asi como en las aplicaciones de nutraceuticos. En las etapas de sacarificacion/tratamiento de "residuos", se usa una mayor dosificacion de enzima y el tiempo de reaccion es de ∼18-24 horas (∼25-32 unidades de papel de filtro). El objetivo ultimo es conseguir la degradacion exhaustiva del resto diana en monosacaridos fermentables. Por el contrario, cuando se requiere produccion de oligosacaridos bioactivos (glucooligosacaridos y xilooligosacaridos), y/o un cambio de textura para panes, se requiere una

10 concentracion enzimatica menor y el tiempo de modificacion (o reaccion) puede no tardar mas de 1 (maximo 2) horas en conseguir el punto final deseado.

Cuando el sustrato diana es principalmente rico en celulosa, las concentraciones de enzima se han basado en "unidades de papel de filtro o UPF". Cuando se produce un oligosacarido bioactivo (por ejemplo β-glucooligosacarido no celulosico), las concentraciones de enzima se basan en la actividad principal requerida para fermentar el sustrato

15 diana (por ejemplo β-1,3;1,4-glucanos o β-1,3;1,6-glucanos no celulosicos, de enlace mixto de fuentes fungicas o de algas).

Ejempao 13�Producci6n�de enzimas�por cepas�de T. emersonii �durante�aa�fermentaci6n�aiquida

Se examinaron las cepas de Ta/aromyces emersonii:

IMI (Imperial Mycological Institute (CABI Bioscience))393751 (cepa de Patente), IMI 393753 (CBS(Centraal

20 Bureau voor Schimmelcultures) 180.68), IMI 393755 (CBS 355.92), IMI 393756 (CBS 393.64), IMI 393757 (CBS 394.64), IMI 393758 (CBS 395.64), IMI 393759 (CBS 397.64), IMI 393760 (CBS 472.92), IMI 393752 (CBS 549.92), IMI 393761 (CBS 759.71).

Fermentacion liquida; se dejaron crecer cultivos liquidos repetidos de la T. emersonii individual a 45 DC, en el medio descrito por Moloney y col., (1983) y Tuohy y Coughlan (1992), en condiciones con pH no controlado. Las cuatro 25 fuentes de carbono seleccionadas fueron: glucosa (monosacarido), xilano de cascarillas de avena (arabinoglucuronoxilano), polvo de algarroba y una mezcla de hojas de te/platos de papel 1:1 (fragmentada en una mezcladora durante ∼15-20 segundos, se recuperaron los sobrenadantes de cultivo (Tuohy y Coughlan, 1992; Murray y col., 2002) y se usaron para analizar la produccion enzimatica extracelular. Ensayos de enzima; la actividad

60 5

enzimatica se expreso en Unidades Enzimaticas Internacionales (UI) por gramo de fuente de carbono inductora. Una unidad UI libera 1 micromol de producto (azucar reductor, 4-nitrofenol, etc.) por minuto. Todos los ensayos de enzima exoglicosidasa y endo-hidrolasa se realizaron como se ha descrito previamente (Tuohy y Coughlan, 1992; Tuohy y col., 1994, 2002; Murray y col., 2002; Gilleran, 2004). A no ser que se indique de otro modo, todas las mediciones de actividad iniciales se realizaron a 50 DC y pH 5,0. Las actividades exoglicosidasa incluyeron: β-Glucosidasa, α-Glucosidasa, β-Xilosidasa, β-Galactosidasa, β-Manosidasa, β-Fucosidasa, α-Arabinofuranosidasa, N-Acetilglucosaminidasa, α-Ramnopiranosidasa, α-Galactosidasa, α-Fucosidasa, α-Arabinopiranosidasa, α-Manosidasa y α-Xilosidasa. La actividad α-Glucuronidasa se ensayo mediante un procedimiento de azucares reductores usando una mezcla de acidos aldouronicos reducidos como sustrato (Megazyme International Ltd). Este sustrato contenia acidos aldotriouronicos, aldotetrauronicos y aldopentauronicos reducidos en una relacion de aproximadamente 40:40:20. La actividad se midio a pH 5,0 con una reserva de 5 mg/ml de esta mezcla. Los grupos reductores liberados durante un periodo de incubacion de 30 minutos se detectaron mediante el procedimiento de DNS. Puesto que algunas de las muestras de enzimas contenian actividad β-xilosidasa apreciable que podria liberar restos de xilosa de los acidos aldouronicos, el ensayo se repitio y la xilosa se incluyo en la mezcla de reaccion para inhibir la actividad β-xilosidasa.

Tambien se midieron enzimas xilanoliticas de accion externa adicionales tales como: α-arabinoxilan arabinofuranohidrolasa (liberacion de arabinosa de arabinoxilano de paja de trigo usando un ensayo ligado a enzima), acetil esterasa (usando sustratos de 4-nitrofenil y 4-metilumbeliferil acetato), actividad acetil xilan esterasa (supervisando la liberacion de acetato del xilano de haya acetilado), esterasa de acido ferulico (procedimientos de ensayo espectrofotometrico y HPLC).

Las actividades endohidrolasa incluyeron: β-D-(1,3;1,4)-glucanasa (β-glucano de cebada (BBG) o liquenano como sustratos de ensayo), xiloglucanasa (xiloglucano de tamarindo), laminarinasa (laminarano de Laminaria digitata), endo-1,4-β-glucanasa, (denominada CMCasa), basandose en la actividad frente a sustrato comercial carboximetilcelulosa, β-mananasa (galactomanano de algarroba) pectinasa y poligalacturonasa, ramnogalacturonasa (ramnogalacturonano de soja), galactanasa (galactanos pecticos de patata y altramuz como sustratos), arabinanasa (arabinano de remolacha azucarera), amilasa, glucoamilasa y dextrinasa.

Temperatura/pH optimos y estabilidades; la temperatura optima para la actividad se determino llevando a cabo los ensayos convencionales apropiados a incrementos de temperatura en el intervalo 30-100 DC, en tampon de ensayo normal (NaOAc 100 mM, 5,0). Se tuvo en consideracion la variacion del pH con la temperatura. Se determinaron los pH optimos usando los siguientes tampones pH 2,2-7,6: tampon de citrato-fosfato de fuerza ionica constante de tipo McIlvaine; pH 7-pH 10 tampon Tris-HCl. Todos los tampones independientemente del pH se ajustaron a la misma fuerza ionica con KCl.

Se determinaron las estabilidades de temperatura y pH como se ha descrito previamente (Tuohy y col., 1993; Gilleran, 2004; Braet, 2005).

Determinacion proteica; se estimo la concentracion proteica en muestras de enzima (muestras de cultivo en bruto) mediante la modificacion de Bensadoun y Weinstein del procedimiento de Lowry (Bensadoun y Weinstein, 1976; Lowry y col., 1951) usando la fraccion V de BSA como un patron (Murray y col., 2001). Electroforesis y zimografia; para determinar el perfil de proteinas presente en los filtrados de cultivo, se concentro un volumen conocido de cada muestra por liofilizacion y se analizo mediante SDS-PAGE nativo y/o renaturalizante o isoelectroenfoque (IEF; Tuohy y Coughlan, 1992). Se identificaron las bandas activas para endoglicanasa en los geles de SDS-PAGE renaturalizados y geles de IEF usando una modificacion de la tecnica de superposicion de geles de MacKenzie y Williams (1984), (Tuohy y Coughlan, 1992). Para detectar actividad de exoglicosidasa, los geles se incubaron inmediatamente en solucion 50-100 pM del derivado apropiado de 4-metilumbeliferil glicosido (periodo de reaccion de 2-30 minutos). La banda o las bandas activas de enzimas se visualizaron con luz ultravioleta usando un Multimager Fluor-S' (Bio-Rad).

Resultados:

Se repitio el cultivo liquido de las cepas al menos 3 veces, en experimentos independientes realizados en diferentes periodos de tiempo. Los filtrados de cultivo recogidos (120 horas) de matraces de repeticion (para cada combinacion de fuente de carbono/cepa) se ensayaron con respecto a actividad enzimatica; se ensayaron multiples repeticiones en un intervalo de diluciones de enzima. Ademas, los resultados se validaron mediante mediciones dentro del ensayo y entre los ensayos, y ensayos de independencia de volumen. Hubo claras diferencias entre los cultivos con respecto a apariencia del cultivo y patron de crecimiento. Por ejemplo, la cepa IMI393751 produjo rapidamente un cultivo bastante denso, filamentoso en glucosa, mientras que varias de las otras cepas (por ejemplo, CBS180.68, CBS355.92, CBS393.64, CBS395.64, CBS397.64, CBS 549.92 y CBS 759.71) presentaron crecimiento limitado y morfologia atipica, es decir ausencia de crecimiento filamentoso normal y formacion de una masa de cultivo limitada de aspecto viscoso. La cepa CBS394.64 produjo una biomasa de micelio menor, pero crecio como un cultivo filamentoso, mientras que CBS472.92 adopto morfologia de granulos en condiciones de crecimiento identicas. Se selecciono un punto temporal de crecimiento de 120 horas, ya que estudios previos han mostrado que las actividades exoglicosidasa y endoglicanasa extracelulares estan presentes en cantidades significativas durante el crecimiento de T. emersonii en la mayoria de las fuentes de carbono (en condiciones de pH no controlado, se han

observado "picos y valles" de actividades clave. Sin embargo, la actividad maxima se detecta generalmente hacia el final del ciclo de fermentacion).

La utilizacion de glucosa fue solamente de aproximadamente 15-25% a las 120 horas para muchas de las cepas. La cepa CBS 394.64 utilizo ∼ 50-55%, mientras que CBS472.92 (que presento morfologia de granulos) utilizo ∼ 20-25% de la glucosa en el medio. Por el contrario, ∼95% de la glucosa en el medio de cultivo se utilizo por la cepa de la invencion (IMI393751) a las 72 horas y no se detecto glucosa en el medio de cultivo en el punto temporal de recogida de 120 horas.

Las Tablas 31A-D muestran la produccion de exoglicosidasas seleccionadas por las cepas. Como revelan los resultados, pueden verse claras distinciones entre la cepa de la invencion y otras cepas de T. emersonii con respecto a produccion de exoglicosidasa.

La glucosa no reprime completamente la produccion de exoglicosidasa por las cepas de T. emersonii (Tabla 31A). La cepa 393751 produce niveles significativamente mayores de β-glucosidasa (BGasa) que las otras cepas y los segundos mayores niveles de N-acetilglucosaminidasa (NAGasa) durante el crecimiento en glucosa. El patron de produccion obtenido para la cepa 393751 contrata notablemente con el de la cepa CBS549.92 (previamente CBS814.70). La produccion de varias actividades exoglicosidasa por la ultima cepa parece reprimirse por glucosa. Deberia observarse que los niveles de actividad exoglicosidasa se midieron en filtrados de cultivo no dializados y dializados en caso de que la glucosa residual en el medio estuviera inhibiendo BGasa y/o NAGasa presentes (se observaron patrones similares en las muestras dializadas).

La algarroba induce produccion diferencial de glicosidasas extracelulares por las cepas (Tabla 31B). La cepa CBS

394.64 produce relativamente ninguna actividad exoglicosidasa aparte de α-arabinofuronasidasa. Se produjeron bajos niveles de todas las exoglicosidasas mediante la cepa CBS 393.64, CBS 395.64 y CBS 549.92. La cepa 393751 produjo niveles significativos de una amplia serie de exoglicosidasas (niveles mayores de ciertas actividades, por ejemplo, la exoglicosidasa β-glucosidasa modificadora de pectina).

Producci6n �de endogaicanasa�por�cepas�de T. emersonii

A. Produccion de xilanasa: dos de los tipos principales de actividades endohidrolasa requeridas para la conversion de biomasa vegetal y restos residuales ricos en polisacaridos no de almidon son glucanasa y xilanasa. De todas las actividades degradantes de glicano polimerico ensayadas, glucanasa y xilanasa fueron las actividades glicanasa predominante presentes.

Las Tablas 32A-D presentan valores para produccion de xilanasa por todas las cepas en las mismas fuentes de carbono. Estudios anteriores han mostrado que el tipo silvestre (CBS814.70) y otras cepas mutantes producen un sistema enzimatico xilanolitico complejo (Tuohy y col., 1993; 1994), con multiples endoxilanasas. Varias de las xilanasas aisladas presentan especificidad selectiva para diferentes tipos de xilanos, por ejemplo, arabinoxilanos, arabinoglucuronoxilanos, glucuronoxilanos, mas xilanos sustituidos frente a xilanos no sustituidos (a partir de resultados previos y resultados continuados con las enzimas de la cepa de la invencion). Como muestran los resultados, la glucosa es un represor fuerte de la expresion de xilanasa en todas las cepas de T. emersonii. Se expresan niveles significativos de actividad xilanasa activa frente a arabinoxilano de cascarillas de avena (OSX) por la cepa 393751. Este componente no es activo frente a arabinoxilanos de centeno o trigo.

La algarroba, que es principalmente rica en galactomananos (contiene algo de xilano), es un inductor potente de niveles muy altos de actividad xilanasa contra todos los sustratos de xilano por la cepa 393751. El papel de la algarroba como un inductor de actividad xilanasa potente no se esperaria basandose en el conocimiento de su composicion. La apariencia de los cultivos obtenidos para varias de las cepas CBS (despues de 120 horas) fue significativamente diferente y pudieron observarse claras diferencias morfologicas entre las cepas 393751 y CBS549.92, es decir, crecimiento de micelio denso (filamentoso) para IMI 393751 y formacion de una masa de cultivo limitada, de aspecto viscoso, (no filamentosa) para la cepa CBS549.92. Como se muestra en la Tabla 31B, los niveles de xilanasa son significativamente mayores para la cepa 393751 que cualquier otra. A diferencia de la cepa 393751, la algarroba es un inductor muy bajo de xilanasa en cepas CBS394.64, CBS395.64 y CBS549.92. Puede verse otra diferencia notable en el tipo de actividad xilanasa inducida por algarroba. En la cepa 393751 se produce actividad potente contra todos los xilanos. En las otras cepas, en general, se produce muy poca o ninguna actividad contra arabinoxilanos de centeno y trigo. Solamente dos cepas distintas de la cepa 393751 producen niveles apreciables de actividad contra ambos de estos xilanos, es decir, CBS472.92 y CBS759.71. El analisis de zimograma del filtrado de cultivo de cepa 393751 revelo altos niveles de multiples bandas activas para xilanasa, incluyendo una nueva xilanasa bifuncional que se ha aislado.

La mezcla de hojas de te/platos de papel (TL/PPL) tambien demostro ser un potente inductor de actividad xilanasa en la cepa 393751 (Tabla 32C), y aunque esta mezcla indujo expresion de xilanasa en las otras cepas, los niveles fueron significativamente menores. Como se observo con la algarroba, se produjo actividad potente por la cepa 393751 contra todos los xilanos, obteniendose una actividad casi 1:8 veces mayor frente a arabinoxilano de centeno (AX de centeno) y menor actividad contra OSX y xilano de abedul. Esto sugiere expresion diferencial de xilanasas individuales por los inductores TL/PPL y algarroba, lo que fue apoyado posteriormente por analisis de zimograma.

TL/PPL tambien induce un sistema enzimatico xilanolitico multicomponente, y actividades esterasa y oxidasa/peroxidasa complementarias en la cepa 393751 y no en las otras cepas. Estas actividades complementarias potencian la eficacia de polisacarido hidrolasas en cocteles de enzimas optimizados para aplicaciones de degradacion de biomasa clave (por ejemplo cereales, residuos vegetales, residuos lenosos, productos de papel). En comparacion con la algarroba, TL/PPL induce produccion de xilanasa mayor por todas las cepas (especialmente actividad contra los arabinoxilanos), pero los niveles son mucho menores que para la cepa 393751. Aunque OSX es un inductor conocido de xilanasa en hongos e indujo produccion de enzimas por todas las cepas, la induccion mas pronunciada fue con la cepa 393751. Sin embargo, a diferencia de la cepa 393751, solamente OSX indujo actividad xilanasa alta y TL/PPL fue un bajo inductor de produccion de xilanasa por la cepa 472.92. El patron de produccion de enzimas en OSX es diferente del obtenido con algarroba y TL/PPL. En general, los resultados para produccion de xilanasa en OSX, sugieren que la cepa 393751 puede metabolizar los sustratos en bruto muy rapidamente y eficazmente para generar inductores solubles de xilanasa. La hemicelulosa en sustratos en bruto mas complejos es mas accesible a esta cepa. Los resultados tambien sugieren que los cocteles de enzimas producidos por la cepa 393751 en tales sustratos complejos serian mas adecuados para hidrolisis de materiales y restos vegetales en bruto complejos. Los estudios de modelo y aplicaciones investigadas hasta la fecha (por ejemplo, conversion de biomasa lenosa, sacarificacion de residuos de verduras y alimentos ricos en carbohidratos y OFMSW y cereales) han confirmado el potencial de estos cocteles.

Finalmente, las Figuras 32A-D comparan y contrastan la produccion de xilanasa activa frente a los diferentes sustratos de ensayo (es decir, OSX, AX de centeno, etc.) por la cepa 393751 y la cepa parental CBS549.92 (tambien CBS814.70) en las cuatro fuentes de carbono.

B. Produccion de glucanasa y mananasa: estudios previos han mostrado que la cepa de tipo silvestre (CBS814.70) y otras cepas mutantes producen un sistema enzimatico glucanolitico complejo (Murray y col. 2001, 2004; Tuohy y col., 2002; McCarthy y col., 2003, 2005), que incluye celulasas y una serie de actividades modificadoras de βglucano no celuloliticas. Como se ha observado para el sistema xilanolitico, se producen multiples endoglucanasas, dependiendo de la fuente de carbono. Varias de las -glucanasas aisladas presentan especificidad selectiva para diferentes tipos de β-glucanos.

Las Tablas 7A-D muestran actividad contra el β-1,4-glucano comercial modificado (CMC) (Sigma Aldrich), β-1,3;1, 4glucanos de cebada (BBG; Megazyme) y el liquen Cetraria is/andica (liquenano; Sigma Aldrich), xiloglucano (cadena principal de β-1,4-glucano; Megazyme) de tamarindo y galactomanano de algarroba (Megazyme). Estan presentes βglucanos no celulosicos en concentraciones significativas en el componente polisacarido no de almidon de varios restos vegetales, especialmente los derivados de cereales. Las Tablas 7A-D ilustran induccion diferencial de las actividades respectivas en las cepas, siendo el patron de induccion completamente diferente en las fuentes de carbono mas complejas (en bruto).

La glucosa es un represor potente de produccion de glucanasa y mananasa en casi todas las cepas (Tabla 33A). Para todas las muestras, se midieron las actividades en muestras dializadas y no dializadas.

Como revelan los resultados, la algarroba es un inductor potente de niveles altos de β-1,3;1,4-glucanasa (contra BBG y liquenano) en la cepa 393751, los mayores niveles para todas las cepas ensayadas (Tabla 33B). Los niveles de β-1,4-glucanasa (contra CMC) producidos por la cepa 393751 fueron ∼10 veces menores que la actividad contra BBG (el nivel de CMCasa fue mayor para esta cepa en comparacion con otras cepas). Se detecto xiloglucanasa aun menor, siendo los niveles obtenidos para la cepa 393751 los mayores. El analisis de zimograma confirmo que los tipos de componentes de endoglucanasa, patron de expresion y niveles relativos de expresion de componentes de glucanasa en los filtrados de cultivos de T. emersonii respectivos son notablemente diferentes. Se produjeron bajos niveles de (galacto)mananasa por todas las cepas durante el crecimiento en algarroba.

La mezcla TL/PPL fue un inductor aun mas potente de β-1,3,1,4-glucanasa (tanto BBGasa como liquenanasa), y (galacto)mananasa, por la cepa 393751 (Tabla 33C). En general estos resultados destacan la ausencia de equivalencia de produccion de β-glucanasa por las cepas de T. emersonii y confirman que la cepa 393751 es una excelente fuente de actividades β-glucanasa diferentes y la mezcla TL/PPL induce un coctel potente de estas actividades.

Como se esperaba, OSX (Tabla 33D), indujo niveles mucho menores de β-glucanasa que algarroba o TL/PPL. El patron de produccion enzimatica es diferente para las cepas 393751 y CBS 549.92. En la Tabla 33D, los niveles de β-1,4-glucanasa (actividad carboximetilcelulasa) fueron menores para la mayoria de las cepas excepto CBS 397.64, que produjo niveles dos veces mayores que la cepa 393751 (en OSX como inductor), y no se detecto en filtrados de cultivo de cuatro cepas (es decir, CBS 393.64, CBS 394.64, CBS 395.64 y CBS 549.92). Se produjo actividad (galacto)mananasa significativa durante el crecimiento en OSX por la cepa 393751 (menor que con TL/PPL como inductor) y CBS 472.92. La Figura 6A-E compara y contrasta la produccion de glucanasa y mananasa en las condiciones experimentales presentadas por las cepas 393751 y CBS814.70.

En conclusion, los resultados indican que:

la cepa 393751 es un productor potente de altos niveles de una serie de actividades enzimaticas muy

importantes, la cepa 393751 es la unica cepa de T. emersonii que produce niveles muy altos tanto de xilanasa como de β-1,3;1,4-glucanasa en dos actividades hemicelulasa despolimerizantes clave, en inductores de bajo coste (algarroba y TL/PPL), y los mayores niveles de actividad se obtuvieron en fuentes de carbono en bruto demostrando de este modo que la cepa 393751 es una fuente rentable de una serie potente de cocteles de enzimas.

64 65

Tabaa 31A: Produccion de exoglicosidasa despues de crecimiento durante 120 horas en glucosa como fuente de carbono

Gaucosa�como�inductor Cepas de Talaromyces emersonii iUI/g�de�inductor)

Actividad exoglicosidasa

IMI 393751 CBS180.68 (IMI393753) CBS355.92 (IMI393755) CBS393.64 (IMI393756) CBS394.64 (IMI393757) CBS395.64 (IMI393758) CBS397.64 (IMI393759) CBS472.92 (IMI393760) CBS549.92 (IMI393752) CBS759.71 (IMI 393761)

a-arabinofuranosidasa

3,69 5,83 6,82 5,17 6,00 6,33 2,64 4,73 4,18 3,08

-xilosidasa

0,00 0,00 1,49 0,00 0,00 1,60 0,00 1,63 0,00 2,40

-Glucosidasa

31,90 1,96 15,42 0,99 0,19 10,67 2,20 2,15 8,97 9,30

a-Glucosidasa

0,44 0,67 0,09 0,43 1,71 0,00 0,00 0,00 0,00 1,71

-Galactosidasa

0,28 1,16 0,00 0,55 0,86 0,00 0,00 0,00 0,00 1,49

-Manosidasa

1,30 2,64 1,97 1,60 1,51 1,63 1,10 1,63 0,00 2,15

-Fucosidasa

0,00 0,11 0,58 0,22 0,00 0,09 0,00 7,37 0,00 1,10

N AcetilGlucosaminidasa

86,08 156,97 27,83 33,72 0,00 43,56 59,57 74,91 6,22 34,87

Tabaa 31B: Produccion de exoglicosidasa despues del crecimiento durante 120 horas en algarroba como fuente de carbono

Aagarroba�como�inductor Cepas de Talaromyces emersonii 1UI/g de inductor)

Actividad exoglicosidasa

IMI 393751) CBS180.68 (IMI393753) CBS355.92 (IMI393755) CBS393.64 (IMI393756) CBS394.64 (IMI393757) CBS395.64393758) CBS397.64 (IMI393759) CBS472.92 (IMI393760) CBS549.92 (IMI393752) CBS759.71 (IMI393761)

a-arabinofuranosidasa

0,72 0,22 3,30 1,49 7,04 1,45 1,32 1,05 2,55 1,49

-xilosidasa

7,15 0,39 10,29 1,65 0,00 0,77 2,37 16,45 2,60 11,66

-Glucosidasa

23,65 17,22 67,54 6,55 0,00 10,04 24,53 85,36 11,25 74,14

a-Glucosidasa

0,99 0,00 0,44 2,26 0,00 0,91 6,27 0,22 1,64 1,43

-Galactosidasa

2,97 4,24 1,71 3,52 0,00 1,95 3,30 1,49 1,73 3,03

-Manosidasa

1,16 0,77 1,32 2,42 0,00 0,98 3,19 11,17 1,31 7,04

-Fucosidasa

36,58 0,00 4,79 1,76 0,00 0,50 3,19 10,12 0,62 6,55

N AcetilGlucosaminidasa

31,02 15,95 19,91 3,85 0,00 7,98 14,85 44,55 6,73 18,15

Tabaa 31C: Produccion de exoglicosidasa despues de crecimiento durante 120 horas en hojas de te/platos de papel como fuente de carbono. Hojas�de �te/paatos�de�Cepas de Talaromyces emersonii iUI/g �inductor) papea

Actividad exoglicosidasa

IMI 393751 CBS 180.68(IMI 393753) CBS 355.92(IMI 393755) CBS 393.64 (IMI 393756) CBS 394.64(IMI 393757) CBS 395.64(IMI 393758) CBS 397.64(IMI 393759) CBS 472.92(IMI 393760) CBS 549.92(IMI 393752) CBS 759.71(IMI 393761)

a-arabinofuranosidasa

3,30 1,10 8,53 0,00 25,74 23,93 3,08 0,88 1,87 2,53

-xilosidasa

6,93 0,00 3,08 0,00 12,49 12,82 1,98 4,18 1,93 1,43

-Glucosidasa

44,61 20,19 22,72 61,16 9,13 41,20 20,74 32,86 15,51 34,32

a-Glucosidasa

0,44 0,00 3,41 0,00 18,10 7,65 0,83 0,00 0,61 0,44

-Galactosidasa

2,81 0,00 1,01 0,00 7,26 6,27 3,19 0,00 0,88 2,42

-Manosidasa

1,16 0,00 3,25 0,00 12,60 12,27 2,48 0,00 1,44 1,98

-Fucosidasa

18,87 0,00 3,58 0,00 12,05 10,51 2,15 14,96 6,88 1,82

N AcetilGlucosaminidasa

27,23 18,15 9,85 46,04 13,20 45,05 16,78 56,71 25,65 25,91

Tabaa 31D: Produccion de exoglicosidasa despues de crecimiento durante 120 horas en xilano de cascarillas de avena como fuente de carbono.

�iaano�de�cascariaaas�de avena Cepas�de Talaromyces emersonii iUI/g �de�inductor)

Actividad exoglicosidasa

IMI 393751 CBS 180.68(IMI 393753) CBS 355.92(IMI 393755) CBS 393.64 (IMI 393756) CBS 394.64(IMI 393757) CBS 395.64(IMI 393758) CBS 397.64(IMI 393759) CBS 472.92(IMI 393760) CBS 549.92(IMI 393752) CBS 759.71(IMI 393761

a-arabinofuranosidasa

15,18 2,97 4,07 5,83 23,60 8,91 0,00 1,10 0,00 5,39

-Xilosidasa

9,63 0,00 2,26 0,66 0,00 2,10 11,77 14,91 12,16 6,93

-Glucosidasa

32,84 16,83 42,30 24,97 0,00 26,13 15,73 67,27 3,14 61,04

a-Glucosidasa

0,92 0,00 1,05 0,77 0,00 0,17 1,76 0,00 0,44 0,84

-Galactosidasa

4,68 0,00 0,83 1,49 0,00 1,30 1,43 0,00 0,00 0,00

-Manosidasa

0,00 0,00 2,09 2,97 0,39 2,75 2,53 0,00 0,11 0,48

-Fucosidasa

19,64 0,00 0,00 1,60 0,00 1,82 1,65 6,82 0,77 1,26

N AcetilGlucosaminidasa

82,12 20,85 30,86 40,87 0,99 68,15 40,21 118,80 10,89 28,16

Tabaa 32A: Produccion de xilanasa extracelular por cepas de T. emersonii en glucosa como unica fuente de carbono

Gaucosa�comoinductor Cepas�de Talaromyces emersonii iUI/g de�inductor

Sustrato deensayo de xilano

IMI 393751 CBS 180.68393753) CBS 355.92(IMI 393755) CBS 393.64393756) CBS 394.64393757) CBS 395.64(IMI 393758) CBS 397.64(IMI 393759) CBS 472.92393760) CBS 549.92(IMI 393752) CBS 759.71(IMI 393761

Xilano de cascarillas de avena

513,10 28,71 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Arabinoxilanode centeno

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Arabinoxilanode trigo

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Xilano de abedul

254,49 155,98 736,78 147,79 279,13 779,90 0,00 452,87 116,99 0,00

Tabaa 32B: Actividad xilanasa extracelular en filtrados de cultivo de T. emersonii de 120 h en polvo de algarroba como unica fuente de carbono

Aagarroba�como�inductor Cepas�de Talaromyces emersonii iUI/g �de�inductor)

Sustrato deensayo de xilano

IMI 393751 CBS 180.68(IMI 393753) CBS 355.92(IMI 393755) CBS 393.64(IMI 393756) CBS 394.64(IMI 393757) CBS 395.64(IMI 393758) CBS 397.64(IMI 393759) CBS 472.92(IMI 393760) CBS 549.92 (IMI 393752) CBS 759.71(IM I 393761)

Xilano de cascarillas de avena

3168,55 177,87 610,23 266,81 17,77 217,53 238,10 727,65 283,20 361,19

Arabinoxilanode centeno

1212,20 0,00 0,00 15,07 0,00 0,00 0,00 135,47 90,31 201,30

Arabinoxilanode trigo

2464,00 21,89 116,27 108,08 0,00 0,00 49,28 365,31 9,57 271,15

Xilano de abedul

2520,27 474,76 607,48 513,10 373,45 428,23 348,92 751,30 348,92 636,35

Tabaa 32C: Actividad xilanasa extracelular en filtrados de cultivo de T. emersonii de 120 h durante crecimiento en Hojas de Te/platos de papel como unica fuente de

carbono

Hojas�deTe/Paatos�de�papea

Cepas�de Talaromyces emersonii �iUI/g �de�inductor)

Sustrato deensayo de xilano

IMI 393751 CBS 180.68 (IMI 393753) CBS 355.92 (IMI 393755) CBS 393.64 (IMI 393756) CBS 394.64 (IMI 391757) CBS 395.64 (IMI 393758) CBS 397.64 (IMI 393759) CBS 472.92 (IMI 393760) CBS 549.92 (IMI 393752) CBS 759.71 (IMI 393761

Xilano de cascarillas de avena

2696,65 124,52 198,39 618,20 166,93 467,94 280,50 287,32 335,23 264,06

Arabinoxilanode centeno

2398,55 102,63 180,62 522,67 260,15 399,52 441,93 281,88 114,95 254,49

Arabinoxilanode trigo

2525,60 53,35 123,15 499,40 123,20 351,62 305,09 261,25 170,34 236,01

Xilano de abedul

2127,40 417,29 458,37 771,65 457,00 626,45 727,65 617,10 647,13 521,29

Tabaa 32D: Actividad xilanasa extracelular en filtrados de cultivo de T. emersonii de 120 h durante crecimiento en Xilano de Cascarillas de Avena como unica fuente de carbono

�iaano�de�cascariaaas de�avena Cepas�de Talaromyces emersonii �iUI/g �de�inductor)

Sustrato deensayo de xilano

IMI 393751 CBS 180.68 (IMI 393753) CBS 355.92 (IMI 393755) CBS 393.64 (IMI 393756) CBS 394.64 (IMI 393757) CBS 395.64 (IMI 393758) CBS 397.64 (IMI 393759) CBS 472.92 (IMI 393760) CBS 549.92 (IMI 393752) CB S 759.71 (IMI 393761

Xilano de cascarillas de avena

2725,25 216,15 287,87 295,35 235,35 262,68 389,95 2126,30 789,47 305,09

Arabinoxilanode centeno

2009,15 284,51 220,28 384,45 372,13 247,67 351,62 1543,30 723,80 328,35

Arabinoxilanode trigo

2722,50 180,62 265,43 297,00 191,51 197,01 220,28 1641,75 577,50 281,88

Xilano de abedul

2196,15 548,68 567,82 695,20 550,00 489,83 584,21 1908,50 871,53 623,92

Tabaa 33A: Glucanasa y mananasa extracelulares presentes en filtrados de cultivo de 120 h de las cepas de T. emersonii durante el crecimiento en glucosa como unica fuente de carbono

Gaucosa�como�inductor Cepas�de Talaromyces emersonii �iUI/g �de�inductor)

Sustrato deglucanasa/mananasa

IMI 393751 CBS 180.68 (IMI 393753) CBS 355.92 (IMI 3937551 CBS 393,64 (IMI 393756) CBS 394.64 (IMI 393757) CBS 395.64 (IMI 393758) CBS 397.64 (IMI 393759) CBS 472.92 (IMI 393760) CBS 549.92 (IMI 393752) CBS 759.71 (IMI 393761)

Carboximetilcelulosa

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

β-glucano de cebada

0,00 0,00 0,00 0,00 77,00 69,25 137,78 95,98 0,00 0,00

liquenano

0,00 0,00 0,00 0,00 202,46 112,64 0,00 0,00 0,00 0,00

Xiloglucano

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Galactomananode algarroba

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Tabaa 33B: Glucanasa y mananasa extracelulares presentes en filtrados de cultivo de 120 h de las cepas de T. emersonii durante el crecimiento en algarroba como unica fuente de carbono

Aagarroba�como�inductor Cepas�de Talaromyces emersonii �iUI/g �de�inductor)

Sustrato deglucanasa/mananasa

IMI393751 CBS 180.68 (IMI 393753) CBS 355.92 (IMI 393755) CBS 393.64 (IMI 393756) CBS 394.64 (IMI 393757) CBS 395.64 (IMI 393758) CBS 397.64 (IMI 393759) CBS 472.92 (IMI 393760) CBS 549.92 (IMI 393752) CBS 759.71 (IMI 393761

Carboximetilcelulosa

318,34 76,89 246,84 34,93 0,00 64,96 109,40 166,54 7,21 221,71

β-glucano de cebada

3420,45 145,64 1120,35 81,29 0,00 60,06 281,77 1150,05 45,65 1702,47

Liquenano

2162,60 135,52 429,39 47,36 0,00 32,01 203,45 431,97 19,91 914,65

Xiloglucano

180,24 40,15 89,82 45,71 0,00 43,45 39,16 48,68 10,45 112,97

Galactomananode algarroba

54,18 108,08 90,15 107,42 110,99 61,05 107,09 94,71 49,01 101,86

Tabaa 33C: Glucanasa y mananasa extracelulares presentes en filtrados de cultivo de 120 h de las cepas de T. emersonii durante el crecimiento en Hojas de Te/Platos de

Papel como unica fuente de carbono

Hojas�dete/paatos�de�papea Cepas�de Talaromyces emersonii �iUI/g �de�inductor)

Sustrato deglucanasa/mananasa

IMI393751 CBS 180,68 (IMI 393753) CBS 355,92 (IMI 393755) CBS 393,64 (IMI 393756) CBS 394,64 (IMI 393757) CBS 395,64 (IMI3937581 CBS 397,64 (IMI 393759) CBS 472,92 (IMI 393760) CBS 549,92 (IMI 393752) CBS 759,71 (IMI 393761)

Carboximetilcelulosa

368,61 90,75 147,02 282,10 0,00 131,56 196,90 396,72 257,95 109,40

β-glucano de cebada

4341,15 393,47 783,20 1818,30 100,54 783,64 804,65 3113,00 1512,50 626,89

Liquenano

2735,15 452,54 581,90 1239,70 164,56 631,40 611,05 2268,75 1356,85 559,79

Xiloglucano

192,34 88,83 26,46 171,44 6,16 146,63 77,06 177,65 82,94 39,82

Galactomananode algarroba

825,44 845,68 130,96 347,44 313,78 210,65 321,97 339,90 421,52 846,34

Tabaa 33D: Glucanasa y mananasa extracelulares presentes en filtrados de cultivos de 120 h de las cepas de T. emersonii durante el crecimiento en Xilano de Cascarillas de avena como unica fuente de carbono

�iaano�de�cascariaaas de�avena Cepas�de Talaromyces emersonii iUI/g �de�inductor)

Sustrato deglucanasa/mananasa

IMI393751 CBS 180.68 (IMI 393753) CBS 355.92 (IMI 393755) CBS 393.64 (IMI 393756) CBS 394.64 (IMI 393757) CBS 395.64 (IMI 393758) CBS 397.64 (IMI 3937591 CBS 472.92 (IMI 393760) CBS 549.92 (IMI 393752) CBS 759.71 (IMI 393761)

Carboximetilcelulosa

101,86 32,62 22,22 0,00 0,00 0,00 213,24 64,35 0,00 25,14

β-glucano de cebada

375,82 100,27 100,87 44,72 21,23 72,49 283,42 282,76 52,58 117,87

Liquenano

477,68 176,33 197,56 114,62 203,72 135,52 353,27 360,80 115,61 840,40

Xiloglucano

35,26 44,39 0,00 0,00 3,91 6,88 230,84 25,14 0,00 38,23

Galactomananode algarroba

653,84 344,80 56,82 85,53 174,02 95,48 298,38 641,30 110,72 139,10

Ejempao 14: �Termozimas �de T. emersonii IMI393751�con potenciaa�para �producci6n de �bioenergia

El objeto fue reducir el componente biodegradable de residuos clinicos ricos en celulosa esterilizados, reduciendo de este modo el volumen de residuos para vertedero, y recuperar la produccion de liquidos enriquecidos con azucares despues de tratamiento enzimatico y recuperar energia en forma de biocombustible.

El flujo de residuos contenia una alta proporcion de celulosa (50%) y consistia principalmente en papel, panuelos de papel, hisopos medicos y vendas y telas ricas en algodon, algodon en rama, etc. La "fibra" principal en el flujo de residuos es celulosa, pero muchos productos estan "acabados" con revestimientos de polisacaridos, agentes aglutinantes y cargas, de modo que es esencial una mezcla de enzimas adyuvantes (concretamente hemicelulasa, pectinasa y enzimas degradantes de almidon) para potenciar la accesibilidad de celulosa y mejorar la reduccion de residuos o conversion a azucares solubles sencillos (por ejemplo, glucosa, galactosa, xilosa, etc.).

Enfoque�eiperimentaa:

Se determino el perfil de actividades enzimaticas endohidrolasa y exoglicosidasa en cada uno de los 10 cocteles de termozimas, derivados de la cepa 393751 (Tuohy & Coughlan 1992; Tuohy y col., 1993, 1994, 2002; Murray y col., 2001, 2004). La Tabla 34 resume los niveles relativos de actividades clave determinados en una seleccion de los cocteles. Las preparaciones enzimaticas se anadieron en diferentes concentraciones a lotes de 100 g de residuos ricos en celulosa tratados con STG, a 50 DC y 70 DC, y se incubaron durante 24-48 h (a niveles de humedad de 5060%). Las muestras del licor rico en azucares (y materiales ricos en celulosa, por ejemplo panuelos de papel, etc.) se retiraron periodicamente durante 48 h y se analizaron con respecto a (i) reduccion de peso y volumen, (ii) volumen de licor rico en azucar recuperado, (iii) azucares reductores liberados, (iv) estructura fisica del sustrato despues del tratamiento enzimatico (usando microscopia electronica de barrido), (v) analisis cualitativo de los tipos de azucares liberados por TLC, (vi) analisis cuantitativo de los azucares producidos por HPLC, CG-EM y ESI-QTOF-MS, (vii) sustancias potencialmente toxicas para microorganismos de fermentacion (produccion de bioenergia),

(viii) esterilidad de los hidrolizados, (ix) produccion de bioetanol y (x) produccion de biogas, como se describe en Tuohy y col., 1993,1994, 2002; Murray y col., 2001, 2004, Gilleran (2004) y Braet (2005).

Resuatados:

A. Reducci6n de peso y vo/umen, vo/umen de /icor rico en azucares recuperado, azucares reductores /iberados

Se registraron los pesos antes y despues de tratamiento enzimatico y se realizaron estimaciones de la reduccion del volumen registrado para todas las preparaciones enzimaticas. Se ilustran los datos de reduccion de volumen y azucares reductores obtenidos a 50 DC, usando los mismos parametros de reaccion (carga enzimatica, contenido de humedad al 60% y un tiempo de reaccion de 24 h) en la Figura 7.

En resumen, 70 DC durante 24 h a 60% de humedad produjo los mejores resultados con respecto a reduccion de volumen para todos los cocteles. En estudios repetidos con los 6 cocteles seleccionados (y con ensayos repetidos), la reduccion de volumen fue sistematicamente de entre aproximadamente 60-75% dependiendo del coctel (vease Figura 8). Los azucares reductores liberados se convirtieron a porcentaje de hidrolisis o conversion de la celulosa presente, que estaba entre 62-82% de la fraccion rica en celulosa presente en los residuos esterilizados iniciales. Se obtuvo una reduccion del volumen del 60-75% en ensayos de laboratorio.

Por cada lote de 100 g, se anadieron aproximadamente 70-100 ml de humedad anadida (H2O) para llevar el contenido de humedad final al 50-60%. Los volumenes de recuperacion de liquidos, despues de la hidrolisis enzimatica, variaron de 69-105 ml. Tambien se completaron experimentos a temperaturas de reaccion de 75-85 DC y diferentes valores de pH. Por encima de 70 DC se observo un aumento minimo (∼2-5,5%) en la hidrolisis global, en comparacion con valores obtenidos a 70 DC, y aunque el pH 3,5-4,0 produjo niveles optimos de hidrolisis, los valores no fueron significativamente mayores (5%) que los obtenidos usando H2O.

B. Perdida ffsica de integridad de sustrato, productos de azucares generados y cantidades re/ativas de cada tipo de azucar. La MEB demostro perdida significativa de la estructura de las fibras de celulosa (Figura 9B)

Productos�de�hidr6aisis: �anaaisis�cuaaitativo�por�TLC; �anaaisis�cuantitativo�por�HPLC

76-92% del azucar liberado fue monosacarido para los 7 mejores cocteles, y este consistia principalmente en glucosa, con algo de galactosa, manosa y xilosa. Por ejemplo, los niveles de azucares variaron de 0,2-0,55 g/ml y los intervalos de concentracion de monosacaridos por HPLC fueron como sigue (dependiendo del coctel de termozimas y lote de residuos):

Glucosa: 43-70%; Manosa: 5-15%; Galactosa: 4-10%; Xilosa: 20-30%; Celobiosa: 4-12% y oligosacaridos superiores: 5-26%.

C. Exp/oraci6n con respecto a sustancias que son potencia/mente t6xicas para microorganismos de fermentaci6n (producci6n de bioenergfa), antes y despues de /a fermentaci6n, ana/isis de esteri/idad de hidro/izados y producci6n de bioetano/ y biogas

71 5

La fraccion liquida recuperada no parecia ser toxica para especies de levadura exploradas con respecto a fermentacion de los hidrolizados ricos en azucares a bioetanol, es decir no evito el crecimiento de S. cerevisiae (levadura de panadero), Pachyso/en tannophi/us, Pichia sp., Candida shehatae y �/uveromyces marxianus. Ademas, el analisis de produccion de etanol (usando un kit de ensayo ligado a enzima) indico que las levaduras producian etanol.

Se inocularon placas de agar (que contenian el medio de agar apropiado) con muestras de los licores ricos en azucares y desperdicios residuales, se incubaron en las condiciones recomendadas (para el microorganismo) y se analizaron con respecto a la presencia de colonias (bacterias y levaduras) y crecimiento radial (hongos filamentosos). No se produjo crecimiento microbiano en placas inoculadas con los licores ricos en azucares y muestras de residuos de los tratamientos enzimaticos a 70 DC, es decir no se produjo deterioro microbiano (y perdida de azucares) de los hidrolizados de residuos.

Producci6n �de�bioetanoa

Se evaluo la produccion de bioetanol a partir de materias primas ricas en azucares por diferentes especies de levadura como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pachyso/en tannophi/us, Pichia sp., Candida shehatae y

�/uveromyces marxianus (y cepas). Los criterios de valoracion medidos incluyeron crecimiento de levadura (y biomasa de levadura), utilizacion de azucares, evolucion de CO2 y etanol producidos. Se seleccionaron dos de las digestiones enzimaticas a 70 DC (hidrolizados generados por cocteles 5 y 8 en la Figura 8) como las materias primas de ensayo para produccion de bioetanol por todas las especies de levadura en cultivos a escala de laboratorio de 1 l.

Las Figuras 10A y B ilustran los perfiles de produccion de etanol obtenidos con S. cerevisiae. Los rendimientos de etanol son similares con ambas materias primas, incluso aunque el coctel de termozimas 8 produce minimamente mas azucares sencillos en el hidrolizado. Sin embargo, el producto de digestion del coctel 8 contiene mas pentosa (no fermentada por S. cerevisiae) que la generada por el coctel de termozimas 5. El producto de digestion del coctel de termozimas 5 contiene algo de celobiosa (y cantidades menores de celooligosacaridos) que se metabolizan facilmente por la levadura.

Tabaa 34 resultados para varias combinaciones de productos de digestion ricos en azucares levadura

Especie �de aevadura

Producto�de �digesti6n de c6ctea de�termozimas 5 Producto�de �digesti6n de c6ctea de�termozimas �

S. cerevisiae

Etanol 9,2 g/l Etanol 9,4 g/l

P. tannophi/us

Etanol 8,5 g/l Etanol 8,8 g/l

�. marxianus

Etanol 9,6 g/l Etanol 8,4 g/l

A. pu//u/ans

Etanol 6,7 g/l Etanol 7,4 g/l

C. shehatae

Etanol 6,3 g/l Etanol 5,4 g/l

Ana/isis de productos de fina/ de fermentaci6n potencia/mente t6xicos.

Se uso una serie de tecnicas (HPLC, EM), especialmente CG-EM, para determinar la presencia de productos de final de fermentacion potencialmente toxicos. Se consiguio utilizacion de azucares casi completa (con la excepcion de productos de digestion ricos en azucares de pentosa (xilosa, arabinosa) para S. cerevisiae, y se detectaron productos de final de fermentacion normales, es decir glicerol, acetato y algunos productos secundarios traza (disolventes).

Producci6n �de�biogas

Se prepararon lotes mayores de productos de digestion de Coctel 5 y 8 para alimentar los digestores anaerobios de Reactor Hibrido Anaerobio de Flujo Superior (UAHR) termofilos y mesofilos. Se midieron los niveles de carbohidratos totales de las entradas y salidas de ambos reactores (Dubois y col. 1956; protocolo de Laboratorio). Se determinaron los azucares reductores presentes en muestras de entrada y salida (Tuohy y col., 1994). Para determinar la Demanda Quimica de Oxigeno (DQO), se oxido un volumen conocido del hidrolizado usando dicromato potasico (acido sulfurico concentrado con sulfato de plata como catalizador), durante 2 horas (procedimiento de ensayo internacional: protocolo de Laboratorio). El dicromato restante se determino mediante valoracion con una solucion normalizada de sulfato de amonio ferroso. Se midio la eficacia de retirada de carbohidratos y DQO (muestras diarias) a lo largo del ensayo. Se analizo la actividad metanogenica especifica (AME) de las aguas residuales usando la tecnica del transductor de presion (Colleran y Pistilli, 1994; Coates y col. 1996). Se retiro una muestra de agua residual del lecho de agua residual a traves de un orificio de salida y se llevaron a cabo ensayos a 37 DC (para agua residual de reactor mesofilo) o 55 DC (para agua residual de reactor termofilo).

Los azucares presentes en las digestiones generadas de forma enzimatica se metabolizaron rapidamente por las bacterias en UAHR tanto mesofilos (37 DC) como termofilos (55 DC), es decir reduccion del 95-97% de carbohidratos a velocidades de carga de 4,5 g DQO/m3/dia, en condiciones no optimizadas. Los niveles de metano en el flujo de biogas obtenido estuvieron entre 55 y 61%, y el tiempo de retencion estimado (dias) que se tardo en metabolizar

todo el azucar y alcanzar los niveles maximos de metano fueron ∼3,0-4,0 dias. El pH de la salida se superviso y no hubo cambio observable del pH de las salidas de ninguno de los reactores.

C. Optimizaci6n de aos sistemas de termozimas para tratamiento de faujos de residuos cainicos ricos en ceauaosa.

Se uso una combinacion de genomica y proteomica funcional para identificar las condiciones de crecimiento optimas y sustratos para usar (basandose en informacion de los 10 cocteles usados en los experimentos iniciales) para obtener un coctel de enzimas que tendria niveles optimos de todos los componentes enzimaticos clave. Se seleccionaron dos combinaciones inductoras: una mezcla 1:1 de hojas de te gastadas y platos de papel residuales, y una mezcla 1:1 de sorgo y pulpa de remolacha no melazada. Tambien se prepararon mezclas adicionales de cocteles seleccionados de los 10 usados anteriormente. El nuevo coctel y las mezclas se caracterizaron con respecto a las enzimas componentes y su capacidad para catalizar conversion exhaustiva de celulosas comerciales, hemicelulosas y residuos ricos en celulosa esterilizados en azucares fermentables sencillos. Se determinaron el pH y la temperatura optimos para reactividad enzimatica maxima, termoestabilidad del sistema enzimatico optimizado y cocteles mezclados, e inhibicion potencial por producto o productos finales de reaccion, los azucares sencillos o moleculas toxicas potenciales (compuestos fenolicos/derivados de benceno). Temperaturas 6ptimas: 75-80 DC, con 70-85% de actividad restante a 85 DC, dependiendo de la preparacion enzimatica/mezcla (la actividad enzimatica se detecto a 90-95 DC). Termoestabiaidad: no hubo verdadera perdida de actividad despues de 24 h a 50 DC y 5-10% de perdida de actividad despues de 1 semana a la misma temperatura. A 70 DC, 2-20% de perdida de actividad en las primeras 24 h, con 10% de perdida adicional de actividad a continuacion durante un periodo de 5 dias. pH 6ptimos: aunque las enzimas estaban mas activas a entre pH 4-5, se observo 60% de actividad a pH 3,0 y pH 6,8, presentando aun todas las enzimas actividad a pH 7,0. Las preparaciones enzimaticas eran mas estables entre pH 3,5 y 6,0 (4-50 DC, durante un periodo de 1 semana).

Aunque la tasa de reaccion/conversion de sustrato a monosacaridos se redujo o alcanzo una meseta cuando estaban presentes altas concentraciones de glucosa y otros monosacaridos, las preparaciones enzimaticas aun estaban bastante activas en presencia de altas concentraciones (hasta 100 nM) de monosacaridos (glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa). Ademas, aunque los compuestos fenolicos/derivados de benceno redujeron la actividad global de los cocteles, las concentraciones usadas en los ensayos fueron significativamente mayores que las presentes potencialmente en los residuos. No obstante, ciertos cocteles y el coctel enzimatico optimizado presentaron actividad significativa (50-70%) en presencia de estos compuestos.

En general, las concentraciones de cada enzima requeridas para conseguir valores de hidrolisis de ∼65-75% fueron sorprendentemente bajas (9-16 unidades de celulasa/10 g de residuos) y, aunque eran dependientes de coctel/mezcla, las dosificaciones mayores (hasta 60 unidades de celulasa) no aumentaron el grado final de hidrolisis de forma notable. El aumento de escala del tratamiento enzimatico a lotes de 100 y 10 Kg produjo un grado de hidrolisis final similar, y un perfil y concentracion de productos de azucares similares. Los mejores valores de reduccion de volumen obtenidos para los cocteles optimizados fueron del 73-80%, mientras que los valores de % de hidrolisis correspondientes para conversion de la fraccion celulosica a azucares sencillos fueron 72-81%. Dos de las mezclas optimizadas produjeron puntos finales similares con respecto a reduccion de volumen e hidrolisis de celulosa. El rendimiento de etanol obtenido fue de 195-210 l/tonelada con S. cerevisiae y 215-220 l/tonelada con P. tannophi/us. Aproximadamente 80-85% del bioetanol pudo recuperarse por destilacion, pero esto podria mejorarse.

Ejempao 15: termozimas de T. emersonii IMI393751 para generaci6n de materias primas ricas en azucares, a partir�de�residuos �de�papea ypaoueaos�de�papea�ricos�en ceauaosa

Mediciones�de�aa�actividad�enzimatica:

Se realizaron preparaciones de enzima en bruto para una serie de actividades enzimaticas de hidrolisis de lignocelulosa diferentes usando concentraciones de 10-30 mg/ml de los sustratos relevantes para enzimas de accion interna, 50 mg de papel de filtro/ml de volumen de reaccion para "filter paperasa" (celulasa general) o 1 mM del derivado de 4-nitrofenil-glicosido apropiado (Tuohy y col., 2002; Murray y col., 2001). Se realizaron ensayos por triplicado. Todos los resultados son representativos de dos experimentos identicos usando diferentes preparaciones enzimaticas en bruto.

Requisitos�de pH y�temperatura�para�actividad y�estabiaidad:

Los requisitos de pH y temperatura para actividad y estabilidad enzimaticas se evaluaron a lo largo del intervalo de pH de 2,6-7,6, y a lo largo de un intervalo de temperatura de 30-90 DC, usando los procedimientos de ensayo normales.

Estudios de�hidr6aisis�de escaaa�de�modeao:

Se incubo una alicuota de enzimas individuales, que contenia 5-60 UPF (o 2-20 unidades de xilanasa, segun sea

73 5

apropiado), con 1 g del sustrato diana, al pH y la temperatura de reaccion apropiados, durante hasta 24 h. Las muestras se retiraron a intervalos temporalizados y se analizo el contenido y composicion de azucares (azucares reductores).

Sustratos ricos en ceauaosa investigados: papel higienico y panuelos de papel mixtos, residuos de papel de oficina, papel marron, papel de periodico mixto.

Sumario de resuatados: los cocteles de termozimas presentaron alta actividad en un espectro amplio de sustratos de carbohidratos y por lo tanto reflejan la complejidad y eficacia de la produccion de enzimas por T. emersonii IMI393751. La produccion de termozimas particulares reflejo la composicion y variacion de sustrato inductor (Tabla 35).

Tabaa 35: cantidades relativas de enzimas hidrolizantes de celulosa y hemicelulosa

Actividad

C6cteaes MGBG 2 MGBG 3 MGBG 4 UI/g�de�Inductor MGBG 5 MGBG 6 MGBG 7 MGBG 8

β-glucosidasa

26,4 240,35 90,75 134,2 114,4 119,9 36,85

Endocelulasa

710,6 468,6 310,2 747,45 799,15 70,4 919,6

Endo 1,3,1,4 glucanasa

4471,5 3199,9 2067,45 8004,7 9493 313,5 6207,85

Endoxilanasa

1234,2 1646,15 1051,6 1429,45 1369,5 653,95 1731,4

Filterpaperasa

216,7 205,7 271,15 155,65 146,85 105,6 172,15

β-xilosidasa

8,25 4,125 9,24 11,77 11,715 5,17 5,335

αArabinofuranosidasa

4,29 33,33 17,105 34,87 20,24 7,205 23,155

β-galactosidasa

10,175 137,5 6,82 42,79 13,695 1,98 115,5

Pectinasa

173,25 358,6 119,9 168,85 157,3 19,25 429,55

MGBG 2, derivado de cultivos de T. emersonii de 108 h crecidos en una mezcla 1:1 de hojas de te gastadas/platos de papel, MGBG 3, derivada de cultivos de T. emersonii de 120 h crecidos en una mezcla 1:1 de sorgo/pulpa de remolacha; MGBG 4, derivada de cultivos de T. emersonii de 120 h crecidos en una mezcla 1:1 de salvado de trigo/pulpa de remolacha; MGBG 5, derivado de cultivos de T. emersonii de 120 h. crecidos en una mezcla 1:1 de platos de papel/pulpa de remolacha; MGBG 6, derivado de cultivos de T. emersonii de 120 h crecidos en una mezcla

(2:1:1) de papel marron/platos de papel/pulpa de remolacha; MGBG 7, derivado de cultivos de T. emersonii de 120 h crecidos en una mezcla 1:1 de copos de centeno/salvado de trigo; MGBG 8, derivado de cultivos de T. emersonii de 120 h crecidos en una mezcla 1:1 de pulpa de remolacha/hojas de te gastadas.

La celulasa en los cocteles de termozimas fue mas activa a aproximadamente pH 4,0 (Figura 11A) y entre 70 'C y 80 'C (Figura 12). El componente o los componentes de celulasa en cada preparacion enzimatica estan activos a lo largo de un intervalo de pH amplio (<pH 2,6 - >pH 6,5). La actividad xilanasa presente en los mismos cocteles estaba mas activa a pH 4,0-5,0 (Figura 11B) y entre 75-85 'C (Figura 13). Sin embargo la actividad xilanasa en los cocteles estaba activa a lo largo de un intervalo de pH amplio (<pH-2,6 a >pH 7,0), mientras que se observaron niveles de actividad similares a 90 'C y 50 'C.

La estabilidad termica de varios de los cocteles de MGBG (enumerados en la Tabla 35) se reflejo en los largos valores de semivida a 50 'C y 70 'C, es decir, de h echo sin perdida o con perdida minima de actividad endoxilanasa

o endocelulasa a 50 'C despues de incubacion en tampon solamente (pH 5,0). Todos los cocteles fueron preparaciones enzimaticas en bruto y no se anadieron estabilizadores o potenciadores. La actividad xilanasa presente en los cocteles 2, 5, 6 y 8 fue particularmente estable a 70 'C (perdida de solamente aproximadamente <220 % de actividad xilanasa despues de 25 h). Por ejemplo, el valor de tY del coctel 2 a 70 'C fue mayor de 6 dias. Las estabilidades a 70 'C de los cocteles 3 y 4, y en menor grado coctel 7, fueron menores debido a la presencia de altos niveles de proteasa ecolisina (tY de 2 h, 12 h y 25 h). En presencia de sustrato (es decir, residuos en bruto), la estabilidad de los tres cocteles fue notablemente mayor, es decir, (valores tY de 22 h, 46 h y 72 h). El rendimiento general de los cocteles de MGBG en sustratos de celulosa y hemicelulosa fue muy alto (Tabla 36). El nivel de hidrolisis aumento significativamente a medida que aumento la temperatura de la reaccion de 50 'C a 70 'C (Tabla 37). A las temperaturas de reaccion mayores (por ejemplo 70 'C), el porcentaje de hidrolisis se consiguio en 18 h. y fue similar a, y en algunos casos mayor que, el porcentaje de hidrolisis obtenido despues de 24 h a 50 'C (Tabla 37). Este hallazgo destaca la ventaja de las termozimas en comparacion con las enzimas de organismos mesofilos, que serian activas a temperaturas menores.

Tabaa 36: % de hidrolisis de materiales ricos en celulosa

C6cteaes

% �de�hidr6aisis�i50 ��C)

Sustrato

2 3 4 5 6 7 �

Papel higienico

37,9 85,6 9,8 9,7 47,4 22,4 22,6

Vasos de papel

17,6 20,0 16,1 27,5 34,2 16,3 26,2

Papel de filtro

18,3 23,7 7,2 17,4 18,8 0,0 20,7

β- glucano de cebada

72,6 90,1 60,2 83,3 80,4 78,7 61,9

74 5

35 Tabaa 37: % de hidrolisis de panuelo de papel rico en celulosa

MGBG 2

MGBG 3 MGBG 4 MGBG 5 MGBG 6 MGBG 7 MGBG �

24 horas a 50 DC

70 87 51 79 80 66 71

18 horas a 70 DC

68 89 68 66 74 61 67

Los productos de la hidrolisis en ciclo temporal de celulosa y hemicelulosa, que se analizaron por TLC, han confirmado la alta eficacia de conversion de las termozimas MGBG. Los sustratos polisacaridos se degradaron inicialmente en oligosacaridos y finalmente en glucosa, que era casi el unico producto de hidrolisis, mientras que la celulosa presente en residuos ricos en celulosa, por ejemplo panuelos de papel, se hidrolizaron de forma similar casi completamente a glucosa.

Las implicaciones de estos resultados para la industria basada en bioetanol son significativas e indican el potencial de los sistemas de termozimas de T. emersonii.

Ejempao 16: Bioconversi6n de puapa de remoaacha en hidroaizados ricos en azucares para producci6n de Bioetanoa.

Se seleccionaron ocho cocteles de termozimas a partir de una serie inicial de 20 cocteles. Se determino el perfil de las actividades endohidrolasa y exoglicosidasa en cada uno de ocho cocteles de termozimas, derivados de la cepa 393751 (Tuohy & Coughlan, 1992, Tuohy y col., 1993, 1994, 2002; Murray y col., 2001, 2004).

Las preparaciones enzimaticas se combinaron en diferentes concentraciones o dosificaciones con lotes de 1 g De fracciones de remolacha azucarera, preparadas usando diferentes procedimientos de extraccion. Las fracciones fueron como sigue:

A. Partes superiores y tallos de remolacha azucarera (1 g de peso seco / 10 ml de volumen total)

B. Pulpa de remolacha azucarera (1 g de peso seco / 10 ml de volumen total)

C. Fruto de la remolacha azucarera (1 g de peso seco)

D. Piel de la remolacha azucarera (1 g de peso seco)

Se homogeneizaron las fracciones de remolacha azucarera A-D en un mezclador Waring (2 x 30 rafagas de 30 segundos). Se anadieron alicuotas de enzima, es decir 2 ml y 5 ml de soluciones de enzimas (1-8) a un volumen de reaccion total final de 10 ml (con agua del grifo, pH 7,2) y se incubaron a 63 'C inicialmente. Se realizaron experimentos adicionales para optimizar la temperatura de reaccion (75 'C), pH (pH 4,0) y para reducir el tiempo de incubacion (16 horas). Se tomaron muestras a intervalos temporalizados durante la incubacion de 16-48 horas, se centrifugaron, y se termino la accion enzimatica hirviendo a 100 'C durante 10 min. La fraccion de sobrenadante se analizo con respecto a azucares reductores liberados.

Se analizo el analisis cualitativo de los tipos de azucares liberados por TLC, y se determino el analisis cuantitativo de los azucares producidos por HPLC. Las materias primas ricas en azucares se evaluaron con respecto a produccion de bioetanol (Tuohy y col., 1993, 1994, 2002; Murray y col., 2001, 2004; Gilleran, 2004; Braet, 2005).

Resuatados:

Las condiciones de reaccion optimas fueron 75 'C y pH 4,0. La tabla 38 presenta los azucares reductores liberados despues de 16 horas en condiciones optimas. El aumento de la incubacion a 48 horas aumento el porcentaje de hidrolisis en el caso de las fracciones de piel y fruto. La optimizacion de las condiciones de carga enzimatica permitieron que el tiempo de incubacion se redujera en la mitad (es decir 24 horas) con los rendimientos mostrados en la Tabla 39.

Tabaa 3�: % de hidrolisis del carbohidrato presente despues de 16 horas a 75 DC

C6cteaes

% �de�hidr6aisis�i75 ��C)�despues�de �16�horas

Sustrato

2 3 4 5 6 7 �

Pulpa

35,5 91,1 48,8 38,5 59,8 37,4 48,6

Piel

12,8 32,7 5,8 14,8 7,8 9,8 20,0

Fruto

13,8 6,4 3,0 26,0 11,5 3,0 20,7

75 Tabaa 39: % de hidrolisis del carbohidrato presente despues de 24 horas a 75 DC con cargas enzimaticas optimizadas

C6cteaes

Hidr6aisis�i75��C) -mg�RS�despues�de 4��horas

Sustrato

Pulpa

84,4

90,8

85,4

88,4

69,9

82,5

90,0

Piel

86,3

79,8

38,5

53,2

77,5

81,6

67,5

Fruto

66,6

75,5

59,1

104,1

79,5

85,4

102,2

Se emprendio desarrollo y optimizacion de un coctel de enzimas para efectuar hidrolisis usando una combinacion de genomica y proteomica funcional (basandose en informacion de los 8 cocteles usados en los experimentos iniciales). 5 Se produjeron dos cocteles, marcados MGBG SB#1 y MGBG SB#2. Se comparo la hidrolisis de la planta de remolacha azucarera total y el componente de fruto total por los dos cocteles optimizados con los cocteles 3 y 5 de los experimentos anteriores. Se analizaron reacciones en las condiciones optimas para los dos nuevos cocteles, es decir 71 'C y pH 4,5. La Tabla 40 proporciona los niveles relativos de enzima incluidos en cada reaccion por gramo de sustrato (es decir, planta de remolacha azucarera total o el componente de fruto total). Las Tablas 41 y 42

10 resumen los resultados de hidrolisis obtenidos.

Tabaa 40: Cargas enzimaticas por gramo de sustrato de remolacha azucarera

Actividad

C6ctea3 C6ctea5 MGBG�SB�1 MGBG�SB�2

Xilanasa

4,8 4,98 0,68 0,20

Celulasa (FPasa)

1,64 1,12 0,12 1,22

Pectinasa

0,96 2,26 0,30 0,56

Las principales diferencias entre los cocteles optimizados y los cocteles 3 y 5 estuvieron en las cantidades relativas de actividades clave, especialmente exoglicosidasas.

Tabaa 41: % de hidrolisis basado en los azucares reductores liberados (71 'C, pH 4,5) despues de 24 horas.

C6cteaes �i% de�Hidr6aisis)· RS

Sustrato

3 5 MGBG�SB�1 MGBG�SB�1

Fruto de remolacha

56,8 46,9 65,6 58,3

Planta total

51,8 68,3 97,5 87,8

Tabaa 42: % del azucar total liberado que corresponde a glucosa

C6cteaes

Sustrato

3 5 MGBG�SB�1 MGBG�SB�1

Remolacha

116,8 90,3 112,0 97,9

Planta total

95,0 65,6 67,1 43,2

Ambos cocteles nuevos liberaron altos niveles de azucar reductor del homogeneizado de planta total. De los

15 azucares reductores liberados aproximadamente 88-90 % fueron monosacaridos de los que aproximadamente el 4367 % fue glucosa.

Fermentaci6n a�bioetanoa

Se realizaron estudios para investigar la produccion de bioetanol a partir de los hidrolizados de remolacha y planta total. Mas del 90 % de la glucosa presente en el hidrolizado de planta total se convirtio a bioetanol por S. cerevisiae

20 (a partir de azucar fermentable 40 g/l, se obtuvo etanol aproximadamente a 9,0 g/l). Se investigaron otras especies de levadura con respecto a produccion de bioetanol (condiciones aerobias), por ejemplo Pachyso/en tannophi/us. La ultima levadura utilizo azucares de glucosa y pentosa liberados (xilosa y arabinosa) en fermentaciones repetidas (>92-95 % del metabolismo). Sin embargo, los rendimientos de etanol fueron ligeramente menores que con S. cerevisiae (a partir de azucar fermentable 40 g/l, se obtuvo etanol aproximadamente 6,7 g/l).

25 Propiedades�bioquimicas �seaeccionadas�de aos�nuevos�c6cteaes.

Temperaturas�6ptimas: 75-80 'C, con >75-87 % de la actividad restante a 85 DC, dependiendo del coctel.

Termoestabiaidad: sin perdida real de actividad despues de 24 horas a 50'C y <10% despues de 3 semanas a 50 'C. A 71 'C, aproximadamente 4-9 % de perdida de actividad en las primeras 24 horas, con < 5-7 % de perdida adicional durante 5 dias.

pH 6ptimos y estabiaidades: aunque ambos cocteles estaban mas activos a pH 4,5, se observo >55 % de la actividad a pH <2,6 y >50-60 % a pH 6,8; ambas enzimas presentaron actividad significativa (>48-58 %) a pH 7,0. Las preparaciones enzimaticas fueron mas estables entre pH 3,5-6,0 (4-50 'C, durante 1 mes).

Ejempao 17: Identificaci6n y propiedades seaeccionadas de una nueva iiaanasa bifuncionaa producida por Talaromyces emersonii IMI393751.

Ta/aromyces emersonii secreta entre 14 y 20 componentes de endoxilanasa distintos cuando se cultiva en la fuente de carbono apropiada. Trece de estas endoxilanasas se han purificado hasta su homogeneidad y se han caracterizado con respecto a propiedades cataliticas. Los pesos moleculares de las endoxilanasas purificadas varian entre 30-130 kDa. La expresion de xilanasa y glucanasa no es equivalente entre 10 cepas de T. emersonii cultivadas en condiciones identicas en el mismo medio nutriente e inductores de carbono. Se ha identificado una nueva xilanasa de bajo peso molecular, Xyn XII (17,5 kDa) a partir de la cepa de T. emersonii IMI393751 del sistema degradante de xilano. Se ha indicado secrecion de xilanasas con valores de Mr menores de o iguales a 20 kDa para varias otras especies fungicas y bacterianas, pero no para T. emersonii antes de esto.

Purificaci6n ycaracterizaci6n�de�enzimas

Se cultivo T. emersonii IMI393751 en una mezcla 1:1 de salvado de trigo y pulpa de remolacha durante 120 horas a 45 'C, 210 rpm (o como alternativa durante 11 dias en fermentacion solida (estatica), sustrato 33 %: humedad 67 %; a 45 'C). Se analizaron los contenidos de xilanasa y proteina de muestras de enzimas en bruto y fraccionadas como se ha descrito previamente (Tuohy & Coughlan, 1992; Tuohy y col., 1993,1994; Murray y col., 2001). Se recogio extracto de enzima en bruto como se ha descrito previamente (Tuohy & Coughlan, 1992). Se uso ultrafiltracion usando un sistema Amicon DC2, equipado con un dializador de fibra hueca HIP 10-43 para separar la nueva xilanasa (fraccion permeada) de las xilanasas de mayor peso molecular (retenido). Xyn XII se purifico hasta su homogeneidad usando una combinacion de tecnicas de fraccionamiento, incluyendo "precipitacion por la adicion de sal" o precipitacion con (NH4)2SO4 (corte de 0-90 %), cromatografia de permeacion en gel (GPC) en Sephacryl S200 SF (Tampon de NaOAc 100 mM, pH 5,0 como eluyente), cromatografia intercambio ionico (IEC) en Whatman DE-52 (equilibrado con tampon de NaOAc 30 mM, pH 5,0; se eluyo xilanasa mediante aplicacion de un gradiente de NaCl 0,0-0,3 M tamponado lineal), seguido de cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC) en Fenil Sepharose CL4B (equilibrado con (NH4)2SO4 15 % en NaOc 30 mM, pH 5,0). Antes de la HIC, la muestra de xilanasa se "disolvio por adicion de sal" con (NH4)2SO4 hasta una concentracion final de 15 % (p/v). Se retiraron las sales de tampon y (NH4)2SO4 mediante aplicacion de la muestra a Sephadex G-25 (no mostrado aqui). Finalmente las fracciones ricas en xilanasa se fraccionaron adicionalmente mediante aplicacion a una segunda columna de intercambio anionico de DE-52, a pH 7,0, seguido de cromatografia de permeacion en gel en Sephacryl S-100 HR (tampon NaOAc 100 mM, pH 5,0 usado como tampon de equilibrio e irrigacion) y se uso una etapa de fraccionamiento final en DEAE-Sepharose, preequilibrado con tampon NH4OAc 50 mM, pH 5,5 (gradiente de NaCl 0,0-0,2 M usado para eluir xilanasa). La enzima agrupada se desalo mediante aplicacion a Sephadex G-25 o BioGel P-6 y se liofilizo antes del analisis electroforetico.

Propiedades�seaeccionadas de�aa�nueva�iiaanasa�bifuncionaa

Propiedades�fisicoquimicas seaeccionadas

La pureza de la nueva enzima se confirmo por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en geles de (acrilamida/bis-acrilamida) al 15 %, de acuerdo con el procedimiento de Laemmli. El SDS-PAGE revelo una banda proteica unica en tincion de plata que se correspondia a una Mr estimada de 17,5 kDa. Ademas, se obtuvo una banda proteica unica en IEF correspondiente a un valor de pI de pH 5,0 para Xyn XII. Se determino que la temperatura optima para la degradacion catalizada por Xyn XII de OSX era 75 'C, y el pH optimo para la actividad era pH 4,0 -4,5. Sin embargo, a diferencia de Xyn I -XI, que perdia entre 25-81 % de las actividades originales respectivas durante un periodo de incubacion de 10 minutos a pH 3,0, Xyn XII era notablemente estable ante acido y conservo mas del 91 % de su actividad original a pH 3,0 incluso en incubacion prolongada.

Propiedades�cataaiticas seaeccionadas

Se incubaron alicuotas diluidas de forma adecuada de Xyn XII con una serie de polisacaridos, incluyendo diversos xilanos, β-glucanos, polimeros pecticos y fructano (todos a concentracion de 1,0 % (p/v)). Se cuantificaron los azucares reductores liberados durante un periodo de incubacion prolongado de 30 minutos como se ha descrito anteriormente. Se determino la actividad contra aril-glicosidos (1,0 mM) usando un procedimiento de microensayo (Murray y col., 2001). Se llevaron a cabo estudios preliminares para determinar las constantes cineticas variando la [sustrato], xilano, entre 0,2 y 25 mg/ml, en las condiciones de ensayo normales.

Los resultados presentados en la Figura 14 ilustran la reactividad relativa de la nueva xilanasa (Xyn XII) frente a diferentes xilanos. Esta enzima es mas activa en un xilano no sustituido de enlace mixto (1,3;1,4-β-D-xilano)

conocido como rodimenano del alga roja Pa/maria pa/mata. Por el contrario, de los dos arabinoxilanos de cereales, es decir OSX y WSX, la enzima presento mayor actividad contra el WSX sustituido. El patron global de reactividad fue: RM >WSX>LWX>OSX>BWX.

Como demuestran las Figuras 15A·G las preferencias se sustrato de varias de las otras xilanasas (Xyn IV a Xyn XI) son bastante distintas de Xyn XII.

Con Xyn IV, OSX>RM>WSX>LWX>>>BWX (Figura 15A). El orden de reactividad con Xyn VI es OSX>LWX>RM>BWX>WSX (Figura 15B), mientras que la representada por Xyn VII es RM>LWX>WSX>BWX>>OSX (Figura 15C). La reactividad de Xyn VIII fue RM>BWX>WSX>>LWX>OSX (Figura 15D), y Xyn IX fue RM>LWX>BWX>OSX>WSX (Figura 15E). Finalmente Xyn X presento la siguiente preferencia RM>>BWX-WSX>OSX >>>LWX (Figura 15F) y Xyn XI RM>LWX>WSX>BWX>OSX (Figura�15G).

Ademas, la diferencia de Xyn I-XI que eran estrictamente activas contra xilanos solamente, la nueva xilanasa bifuncional (Xyn XII) presento actividad sustancial contra β-glucano de enlace mixto de cebada (1,3;1,4-β-Dglucano), es decir, mas del 55 % de actividad en relacion con la observada OSX, el sustrato de ensayo normal (Figura 16). A diferencia de Xyn I-XI, la nueva xilanasa bifuncional presento actividad contra los aril-β-xilosidos 4nitrofenil β-D-xilosido (4NPX) y cloronitrofenil β-D-xilosido (CNPX), con mayor actividad contra el segundo sustrato (Figura 17). Este hallazgo puede reflejar el efecto de retirada de electrones del resto de cloro, haciendo al grupo cloronitrofenilo un mejor "grupo saliente". Sin embargo, otras nuevas endoxilanasas de la cepa CBS814.70 de T. emersonii (Tuohy y col., 1993; tambien producidas por la cepa IMI393751, aunque expresadas de forma diferente) son significativamente activas contra CNPX y presentan poca o ninguna actividad contra 4NPX. Este fenomeno reflejo las caracteristicas de accion "externa" parciales de estas enzimas, y tambien pueden reflejar una caracteristica similar para Xyn XII. Ademas, se observo baja actividad contra 4NP β-glucosido y CNP-β-celobiosido, lo que no era inesperado ya que Xyn XII es activa contra 1,3;1,4-β-D-glucano y si posee algunas propiedades de accion externa, como se observo con los aril β-xilosidos, podria esperarse que tuviera actividad correspondiente contra los aril β-glucosidos. No se observo reactividad contra ningun otro aril glicosido ligado a α o β.

Por lo tanto, "in vivo", esta nueva xilanasa bifuncional puede desempenar un papel muy importante para T. emersonii IM I393751 al proporcionar acceso a hemicelulosa de la pared celular de la planta, por ejemplo, degradando glucanos de enlace mixto en cereales y otras plantas, restos y residuos vegetales.

Ejempao 1�: �Eipresi6n�de�hidroaasas �caave y�otras�enzimas�adyuvantes�por �cepas�de T. emersonii.

La�eipresi6n de�enzimas caave �en�aa�misma�fuente �de carbono�es �diferente

El numero, tipo y abundancia relativa de xilanasa o xilanasas producidas por T. emersonii IMI393751 y de otras cepas son diferentes. Como se ha mostrado anteriormente, los niveles de enzimas en filtrados de cultivo son notablemente diferentes y sugieren que las cepas de T. emersonii producen diferentes niveles de las mismas xilanasas, o expresan diferentes isoformas. Para ilustrar este punto, se realizo tincion de zimograma despues de electroforesis en gel SDS-PAGE (renaturalizada como se describe en Tuohy & Coughlan (1992)) e IEF con los filtrados de cultivo de cepa IMI393751 y CBS549.92. Estos estudios confirmaron que (i) se expresan diferentes xilanasas y (ii) el numero de isoformas de xilanasa expresadas es notablemente diferente. Los resultados obtenidos para expresion de xilanasa en algarroba se resumen como sigue: isoformas de xilanasa detectadas (vease Tuohy y col., (1994) para referencia a pI y Mr de las isoformas) IMI393751: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX y Xyn XI, Xyl I (βxilosidasa) y Xyl II CBS549.92: Xyn II, Xyn VII (nota: Xyn VII es identica a la secuencia publicada en una patente anterior (Numero de acceso de GenBank AX403831) y cantidades muy bajas de Xyl I (β-xilosidasa).

Ademas, IMI393751 es la unica cepa que produce Xyn XII durante el crecimiento en hojas de te/platos de papel (y en hojas de te solamente).

Ea�patr6n�de�eipresi6n �en�diferentes�fuentes�de carbono es�diferente

El patron de expresion de xilanasa en diferentes fuentes de carbono no es equivalente, es decir

IMI393751:

Gaucosa como fuente de carbono: Xyn I, Xyn VIII, una cantidad menor de Xyn XI y sin β-xilosidasa Aagarroba: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX y Xyn XI, Xyl I (β-xilosidasa) y Xyl II TL/PPL: Xyn III, Xyn V, Xyn IX, Xyn X, Xyn XII, Xyl I y Xyl II

CBS549.92:

Gaucosa: niveles bajos de un componente que podria ser equivalente a Xyn IV y sin β-xilosidasa Aagarroba: Xyn II, Xyn VII y cantidades muy bajas de Xyl I (β-xilosidasa). TL/PPL: proteinas similares a Xyn I, Xyn VII y Xyn IX, algo de Xyl I

Ademas, se observaron otros ejemplos claros de diferencias de expresion, por ejemplo, expresion de Xyl I. No se expresa Xyl por IMI393751, CBS549.92, CBS180.68, CBS393.64, CBS394.64 o CBS397.64 durante el crecimiento en glucosa. Por el contrario, en condiciones identicas, Xyl se expresa por CBS355.92, CBS395.64, CBS472.92 y CBS759.71.

De forma similar en algarroba, Xyl se expresa por todas las cepas, aunque a niveles notablemente diferentes, con la excepcion de CBS394.64. Xyl tambien se expresa por todas las cepas, excepto CBS180.68 y CBS394.64 durante el crecimiento en TL/PPL. Con OSX como fuente de carbono, Xyl no se expreso por CBS 180.68 y CBS394.64, pero se expreso por CBS393.64 (bajos niveles) y todas las otras cepas. En general se observaron diferencias notables en los niveles de expresion de Xyl I y el patron de expresion (es decir, las cepas que expresaban las cantidades mayores o menores de Xyl I) entre todos los sustratos inductores.

Diferencias�de actividad especifica �de�hom6aogos�producidos�por�diferentes cepas.

Las diferentes cepas se compararon con respecto a la expresion de xilanasas clave como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, ademas las xilanasas presentes en cultivos inducidos de IMI393751 y CBS549.92 se fraccionaron y se comparo la actividad especifica de los componentes de xilanasa purificados. En el primer caso, solamente IMI393751 parece producir Xyn XII. Ademas, cuando se compararon las actividades especificas (se presentan resultados para OSX como sustrato de ensayo posteriormente), se observaron claramente algunas diferencias de actividad especifica de enzimas individuales (Figura�1�).

Producci6n de nuevos componentes por T. emersonii IMI393751 durante�ea crecimiento en diferentes fuentes de�carbono

Se cultivo T. emersonii IMI393751 en una serie de fuentes de carbono y se realizo su perfil mediante SDS-PAGE renaturalizante e IEF, seguido de tincion de zimograma, como se ha presentado anteriormente. Los siguientes son una muestra de algunos de los resultados obtenidos:

(i)

Hojas de�te como inductor: Xyn III, Xyn V, Xyn IX, algo de Xyn X y Xyn XII; Xyl I y Xyl II

(ii)

Aagarroba: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX y Xyn XI, Xyl I (β-xilosidasa) y Xyl II

(iii) Copos de centeno: Xyn IV, Xyn V, Xyn VI, Xyn IX, con un nuevo componente de "xilanasa" de pI 6,5; Xyl I (β-xilosidasa) y Xyl II

(iv)

Harina de venta: Xyn III, Xyn VI, Xyn VIII, Xyn IX, Xyn X, Xyl I (β-xilosidasa) y Xyl II, con un nuevo componente de "xilanasa" adicional de pI 5.8

(v)

Sorgo: Xyn I, Xyn VIII, Xyn IX, Xyn X, Xyn XI, algo de Xyl I (β-xilosidasa) y Xyl II

(vi)

�iaosa: Xyn I y Xyn VIII, Xyl I

(vii) Gaucosa: Xyn I, Xyn VIII, una cantidad menor de Xyn XI y sin β-xilosidasa

Ejempao 19: Eipresi6n diferenciaa de otras enzimas adyuvantes por cepas de T. emersonii, gautati6n peroiidasa

Se procesaron muestras de filtrado de cultivo (muestras no concentradas y concentradas) en geles de PAGE nativos 7,5%, empapados en glutation reducido a 50 'C, seguidode incubacion con H2O2 0,002%. El gel se tino despues con cloruro ferrico 1%/ferrocianuro potasico 1%. La tincion de zimograma tambien se complemento por ensayos de enzimas en los filtrados de cultivo.

IMI393751 produce glutation peroxidasa extracelular (Mr ∼45 kDa), observandose expresion diferencial en varios inductores de carbono (los numeros 1-18 representan diferentes inductores). Por el contrario no se observo actividad extracelular para ninguna de las otras cepas de T. emersonii, incluso en las muestras concentradas. La cepa IMI393751 tambien produce niveles significativos de glutation peroxidasa extracelular durante el crecimiento en TLIPPL.

Cataaasa

Se procesaron muestras de filtrado de cultivo (muestras no concentradas y concentradas) en geles de PAGE nativo 7,5%, seguido de incubacion con H2O2 3%. El gel se tino despues con cloruro ferrico 1%/ferrocianuro potasico 1% (aparecen bandas de catalasa como bandas amarillas intensas). La tincion de zimograma tambien se complemento por ensayos de enzima en los filtrados de cultivo, usando el procedimiento publicado convencional.

IMI393751 produce catalasa extracelular (Mr ∼230 kDa), observandose expresion diferencial en varios inductores de carbono (los numeros 1-18 representan diferentes inductores). Por el contrario no se observo actividad extracelular para ninguna de las otras cepas de T. emersonii, incluso en las muestras concentradas.

La presencia de estas actividades enzimaticas en los filtrados de cultivo de IMI393751 seria importante potencialmente al afectar a la estructura del sustrato, pero tambien al retirar cualquier compuesto que pudiera oxidar actividades hidrolasa clave, por ejemplo, xilanasa o glucanasa.

79 5

Ejempao 20: Comparacion de fenotipo de 10 cepas de T. emersonii en diferentes medios solidos (agar)

B.�Medios�de �agar

1.

Agar de dextrosa Sabouraud (Oxoid Ltd., Reino Unido)

2.

Agar de maltosa de patata (Oxoid Ltd., Reino Unido)

3.

Czapek Dox (Oxoid Ltd., Reino Unido; pH no ajustado)

4.

Agar de harina de maiz (Oxoid Ltd., Reino Unido)

5.

Agar de extracto de malta (Oxoid Ltd., Reino Unido)

6.

Agar nutriente (Difco Ltd., Reino Unido)

7.

Agar de Emerson (almidon soluble en potasio de levadura; YpSs) Se anadieron los siguientes ingredientes a 1 l de H2O destilada

15,0 g de almidon soluble (Sigma-Aldrich, Dublin, Irlanda) 4,0 g de extracto de levadura (Oxoid Ltd., Reino Unido) 1,0 g de di-hidrogeno fosfato potasico (KH2PO4) 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidrato (MgSO4.7H2O) 20,0 g de agar ND 1 (Oxoid Ltd., Reino Unido)

8.

Agar de glucosa de levadura (YGA) Se anadieron los siguientes ingredientes a 1 l de H2O destilada

20,0 g de glucosa (Sigma-Aldrich, Dublin, Irlanda) 10,0 g de extracto de levadura (Oxoid Ltd., Reino Unido) 15,0 g de agar ND 1 (Oxoid Ltd., Reino Unido)

Se inocularon placas de agar (cada tipo de agar) con las 10 cepas de T. emersonii diferentes. Se incubo un lote de placas a 45 'C y el segundo a 55 'C (el contenido d e humedad del aire fue de ∼20-30%). Los cultivos se comprobaron diariamente, y se registraron los siguientes resultados:

(a)

medicion de diametro de cultivo (usando unos calibradores)

(b)

registro fotografico usando una camara digital de 7,0 M pixeles

(c)

registro de diferencias/cambios fenotipicos visibles

(d)

indicios de formacion de esporas (analisis microscopico) u otros

Resuatados:

El cultivo de las cepas de T. emersonii en los diferentes medios de agar revelo claras diferencias entre la cepa 393751 y las otras 9 cepas con respecto a lo siguiente:

Tabaas 43 y 44 Sumario de la velocidad y alcance del crecimiento a 45 DC - mediciones de diametro de cultivo tomadas el dia 2 y el dia 5 Tabaa 45: Velocidad de crecimiento a 55 'C - mediciones de diametro de cultivo tomadas el dia 5 Tabaa 46: Sumario de cambios fenotipicos visibles y pruebas de formacion de esporas.

Observaci6n importante 1: muchas de las cepas de IMI/CBS produjeron cultivos de multiples colores. Sin embargo, se verifico la pureza de estos cultivos. Los colores/pigmentos producidos y el patron de produccion es tipico de muchas especies de Penici//ium, por ejemplo, P. pinophi/um.

Observaci6n importante 2: Como se indica en la Tabla 20, existen claras diferencias entre la cepa 393751 y la otra con respecto a formacion de esporas.

Tabaa 43: Velocidad y alcance de crecimiento a 45 'C - Mediciones de diametro de cultivo tomadas el dia 5

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar Nutr CzapeD �Doi AHA

IMI 393751 (la cepa de los inventores)

++++++

+++++ ++ ++++++ ++ ++++++ ++

++++++

++++++

IMI393752 (CBS 549.92)

++++++ +++++ ++ +++ ++ ++++ ++ +++ +++++

80 (continuacion)

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar Nutr CzapeD �Doi AHA

IMI393753 (CBS 180.68)

+++ ++++ + +++ + ++++ ++ +++ +++

IMI393755 (CBS 355.92)

++++ +++++ ++ ++++ + ++++ + ++ ++++

IMI393756 (CBS 393.64)

++++ +++++ +++ ++++ ++ ++++ ++ +++ ++++

IMI393757 (CBS 394.64)

+++ +++ + ++++ + +++ + ++ +++

IMI393758 (CBS 395.64)

+++++ +++++ ++ +++ + ++++ +++ ++ ++++

IMI393759 (CBS 397.64)

+++++ +++++ ++ +++ ++ +++++ ++ +++ ++++

IMI393760 (CBS 472.92)

+++++ +++++ ++++ +++++ ++ ++++ ++ +++ ++++++

IMI393761 (CBS 759.71)

+++++ +++++ nd ++++ ++ +++ ++ ++ ++++

ADS, Agar de dextrosa Sabouraud; AHM, agar de harina de maiz; AMP, agar de maltosa de patata; AEM, agar de extracto de malta; YpSs, almidon soluble en potasio de levadura; YG, agar de glucosa de levadura; AN, agar nutriente; AHA, agar de harina de avena. Diametros del cultivo: placa completa, ++++++; 65-80 mm, +++++; 50-65 mm, ++++; 35-50 mm, +++; 20-35 mm, ++; y <20 mm, +.

81 82 83 (continuacion)

Tabaa 44: Velocidad y alcance del crecimiento a 45 DC - mediciones del diametro de cultivo tomadas el dia 2

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar nutr CzapeD�Doi AHA

IMI 393751 (la cepa de los inventores)

++++

++ + ++++ + +++ + +++

++++

IMI393752 (CBS 549.92)

+++ +++ + + + ++ + + +++

IMI393753 (CBS 180.68)

++ ++ - + + ++ + + +

IMI393755 (CBS 355.92)

++ ++ + ++ - + - - +

IMI393756 (CBS 393.64)

++ + + + + ++ - + +

IMI393757 (CBS 394.64)

+ + - ++ - + - + +

IMI393758 (CBS 395.64)

++ ++ + + - + + + ++

IMI393759 (CBS 397.64)

++ ++ + + + + + + +

IMI393760 (CBS 472.92)

++ ++ ++ ++ + ++ - + +++

IMI393761 (CBS 759.711

++ ++ nd + +/- + +/- + +

ADS, Agar de dextrosa Sabouraud; AHM, agar de harina de maiz; AMP, agar de maltosa de patata; AEM, agar de extracto de malta; YpSs, almidon soluble en potasio de levadura; YG, agar de glucosa de levadura; AN, agar nutriente; AHA, agar de harina de avena. Diametros del cultivo: placa completa, ++++++; 65-80 mm, +++++; 50-65 mm, ++++; 35-50 mm, +++; 20-35 mm, ++; y <20 mm, +; sin pruebas de crecimiento, -.

Tabaa 45: Velocidad de alcance de crecimiento a 55 'C - mediciones de diametro de cultivo tomadas el dia 5

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar nutr CzapeD�Doi AHA

IMI 393751 (la cepa de los inventores)

++++++

+++++ ++ ++++++ +++ ++++++ ++

++++++

++++++

IMI393752 (CBS 549.92)

++ ++ + + + ++ + + +++

IMI393753 (CBS 180.68)

+ + - + - + - + +

IMI393755 (CBS 355.92)

+ ++ +/- + - + - - ++

IMI393756 (CBS 393.64)

+ ++ + - - +- - - +

IMI393757 (CBS 394.64)

+ + - + - + - - +/-

IMI393758 (CBS 395.64)

+++ +++ + +++ + ++ + + +++

IMI393759 (CBS 397.64)

+ - - - - ++ - +/- +/-

IMI393760 (CBS 472.92)

+ ++ ++ ++ - +/- - - ++

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar�nutr CzapeD �Doi AHA

IMI393761 (CBS 759.71)

+ - - +/- - +/- - - +

ADS, Agar de dextrosa Sabouraud; AHM, agar de harina de maiz; AMP, agar de maltosa de patata; AEM, agar de extracto de malta; YpSs, almidon soluble en potasio de levadura; YG, agar de glucosa de levadura; AN, agar nutriente; AHA, agar de harina de avena. Diametros del cultivo: placa completa, ++++++; 65-80 mm, +++++; 50-65 mm, ++++; 35-50 mm, +++; 20-35 mm, ++; y <20 mm, +; sin pruebas de crecimiento, -.

Tabaa 46: Sumario de cambios fenotipicos visibles y pruebas de formacion de esporas (cultivos de 5 dias de edad, 45 'C).

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar�nutr CzapeD�Doi AHA

IMI 393751(la cepa delosinventores)

Apariencia Crecimiento�muy �denso,�esponjoso,�baanco�cremoso;coaor�naranja�en�ea centro Crecimiento�aigero,�transaucido;crecimiento�denso en ea�punto deinocuaaci6n Apariencia�de�coaor�ante yesponjosa; Crecimiento�baanco�esponjoso;coaor�ante�en�ea�borde�de�ataque Centro�de�ante�oscuro;crecimiento�denso�baanco en�ea�borde de�ataque Centro �de �anteoscuro;�crecimiento�denso de ante�mas caaro �en�ea�borde �deataque Crecimiento�transaucido;borde�de�ataque de�ante�oscuro Crecimiento�transaucido;apariencia�"paumosa" Baanco ycentro�deante

Esporulacion

X algo X X X X X X Si

Apariencia

Baanca/crema;verde�aima;ante�mas�oscuro·verde�en�ea centro Crecimiento�transaucido�paaido;esporas�verdes Crecimientodenso·centrocrema·antey bordes �de�ante Centro�crema�caaro; �verde�aima Crema·ante�caaro Verde�aima;borde�de�ataque crema Ante�caaro;�borde�deataque viscoso Crecimiento�transaucido;centro�verde Crecimientodenso verdeaima; centro�rosado; bordede �ataquecrema

IMI393752 (CBS549.92)

Esporuaaci6n

Si Si � Si Aago Si � Si Si

Apariencia

Baanco�esponjoso�con�centro�deverde�a�ante�oscuro Crecimientotransaucido�cremabaanco Crecimientomuy �denso;crema·ante Crecimiento�denso;borde�crema,�centro�amariaao·verde·naranja�paaido Crema·ante Bordes�verdes; �centro�crema�paaido yverde Denso�ante·crema; bordede �ataqueviscoso Crecimientotransaucido;centro �verdecaaro Borde�de�ataque cremapaaido; �centro�de�verde�caaroa�cremaoscuro

IMI393753 (CBS180.68)

Esporuaaci6n

Si Si Si Si Aago Aago � Si Si

(continuacion)

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar�nutr CzapeD�Doi AHA

Apariencia

Centro�ante�oscuro;borde�de�ataque�crema Crecimiento�transaucido�crema Crecimiento�denso;crema·ante Bordes�crema;medio�verde�aima; �centro�naranja Ante·crema Centro�crema·ante�oscuro Ante·crema;borde�de�ataque�viscoso Crecimientomuytransaucido Bordes de�ante; centro�verde caaro�crema y anteoscuro

IMI393755 (CBS355.92)

Esporuaaci6n

Si Si Si Si Aago Si Aago Aago Si

Apariencia

Crecimiento�muy �denso;crema·ante Crecimiento�caaro,�transaucido Ante�oscuro Ante�caaro·crema·verde�caaro·naranja�y �centro�crema Ante,crecimiento�denso Bordes�de�ante,�de�verde�a�verde�mas�oscuro�en�ea centro Ante·baanco Crecimiento�muy caaro ytransaucido Crema�en�aos�bordes; �centro�verde·naranja

(IMI393756 (CBS393.64)

Esporuaaci6n

Si Aago Si Si Si Si Si Aago Si

Apariencia

Crema en�aos�bordes;centro verde�aima·naranja;crecimiento�muy�denso Transaucido;verde caaro Ante�oscuro;esporangio�crema Cruciforme;bordes�verde�paaido;centro�naranja·ante Crema Crecimiento�denso�verde·ante Crema·ante;apariencia�viscosa Caaro;esporas de�ante�en �aos�bordes Bordes�verde�paaido·crema;centro�verde�mas�oscuro

IMI393757 (CBS394.64)

Esporuaaci6n

Si Si Si Si No�concauyente Si Aago Aago Si

Apariencia

Bordes�de�ante·baanco;centro�mas�oscuro Escaso�crecimiento;transaucido;esporas�de�ante Crecimiento�denso;crema·verde Crecimientodenso,esponjoso;ante·verde Ante·crema;crecimiento�muy escaso Bordes�de�ante;esporasverdes Ante·un�poco�baanco;viscoso Muy caaro ytransaucido;muy escaso Crecimiento�denso;centro�crema·ante

IMI393758 (CBS395.64)

(continuacion)

Cepa

ADS AHM AMP AEM YpSs YG Agar�nutr CzapeD �Doi AHA

Esporuaaci6n

Si Si Si Si�iamariaao) Si Si Aago No�concauyente Si

Apariencia

Bordes�baancos,�verde·ante�en�ea centro Transaucido;esporas�baancas Antedenso Borde crema;�centro verde·naranja Crecimiento�escaso;centro�deante,�baanco Bordes�verde·ante;centro�denso�verde·ante Escasocrecimiento;ante,viscoso �en�aos �bordes Muy caaro ytransaucido;ante�paaido Bordes�baancos�amariaao·verde

IMI393759 (CBS397.64)

Esporuaaci6n

Si Si No�concauyente Si No�concauyente Si No�concauyente Si Si

Apariencia

Centro�denso�ocre·ante·verde�aima Baanco;crecimiento�aigero Baanco Bordes�paaidos,�centro�verde�fauorescente Baanco�paaido·crema Centro�denso·verde�oscuro;bordes�de�ante Ante,apariencia�viscosa Transaucido;aagunas�esporas�baancas Transaucido yante

IMI393760 (CBS472.92)

Esporuaaci6n

Si Si Si Si Aago Si No�concauyente Aago Si

Apariencia

Bordes�de�ante�oscuro;crema�paaido·verde�aima·ocre Crecimientoescaso·matiz verdepaaido nd Bordes�baancos,�centro�amariaao·ocre�oscuro·ante�oscuro De�baanco�a�paaido en�aos�bordes Crecimiento�denso�crema·ante Crema·ante,�apariencia�viscosa Crecimiento�escaso;esporas�baancas Crema �en�aos�bordes,interior �de�verde aima�paaido �a�verde

IMI393760 (CBS472.92)

Esporuaaci6n

Si Si Si No�concauyente No�concauyente No�concauyente Si Si

ADS, agar dextrosa Sabouraud; AHM, agar de harina de maiz; AMP, agar de maltosa de patata; AEM, agar de extracto de malta; YpSs, almidon soluble en potasio de levadura, YG, agar de glucosa de levadura; AN, agar nutriente; AHA, agar de harina de avena

Ejempao 20: Reducci6n dea voaumen y aumento dea vaaor caaorifico de aos faujos de residuos antes de aa incineraci6n

Residuos �cainicos esteriaizados�ricos�en ceauaosa

Los residuos clinicos tienen un valor calorifico de ∼14 GJ/tonelada. En esta forma, contienen ∼50-55% de material rico en celulosa, que tiene una alta capacidad de union a agua y menor valor calorifico en comparacion con plasticos presentes en el flujo de residuos. El tratamiento del componente rico en celulosa de estos residuos usando los cocteles de enzimas termoestables de la invencion, por ejemplo, cocteles 5 y 8, puede reducir el volumen de residuos en ∼73-8% y convertir la celulosa presente (conversion del 79-84%) y generar ∼2,25-2,61 GJ/tonelada (valor calorifico). El resto, que esta enriquecido en plasticos podria usarse como un combustible derivado de desechos "seleccionados" con un valor calorifico potencial de hasta 34-38 GJ/tonelada.

Fracci6n �organica�de�residuos�s6aidos municipaaes

La fraccion organica de los residuos solidos municipales tiene un poder calorifico de ∼9,2-10,2 GJ/tonelada. En esta forma, contiene ∼50-65% de material rico en carbohidratos (principalmente de residuos de alimentos y papel), que tiene una alta capacidad de union a agua y menor valor calorifico en comparacion con otros componentes, por ejemplo, poliestireno, plasticos y goma presentes en el flujo de residuos. El tratamiento del componente rico en celulosa de este residuo con los cocteles de enzimas termoestables de la invencion puede reducir el volumen de residuos en ∼50-70% y convertir el carbohidrato presente (conversion del 71-91%) y generar ∼3.8-7,8 GJ/tonelada (valor calorifico). El resto, que esta enriquecido en componentes no biodegradables (por ejemplo, poliestireno, plasticos y goma), podria usarse como un combustible derivado de desechos "seleccionados" con un valor calorifico potencial de hasta 26-38 GJ/tonelada.

Es por lo tanto posible tratar los residuos municipales y otras formas de residuos antes de su incineracion. Tratando de este modo tales materias primas se puede reducir, aumentar o alterar su valor calorifico. Por lo tanto, cuando un tratamiento produce una mezcla de azucares liquida o lixiviado que se recoge o retira seria posible reducir el valor calorifico. La alteracion del valor calorifico podria facilitar la incineracion de tales materias primas: por ejemplo, reduciendo el valor calorifico a un nivel "establecido" seria mas facil controlar el procedimiento de incineracion; aumentando el valor calorifico (es decir, tratar los azucares presentes como azucares sencillos en la materia prima tratada) el valor calorifico podria aumentarse lo que significa que se reduce la cantidad de energia requerida para la incineracion en si misma. Por ejemplo, convirtiendo la celulosa presente en el flujo de residuos clinicos ricos en celulosa en azucares sencillos y retirando estos, el valor calorifico del resto seria bastante bajo ya que contendria principalmente plasticos, algunos metales, etc. La conversion enzimatica de carbohidratos complejos en residuos de papel a azucares sencillos y recuperacion de los azucares sencillos reduciria significativamente el valor calorifico de los residuos, el resto aun tendria valor calorifico, pero este seria mucho menor (y dependeria mucho del contenido de lignina).

Por lo tanto en un aspecto adicional la invencion proporciona un procedimiento para alterar el valor calorifico de un flujo de residuos tratando el flujo de residuos con una cepa de Ta/aromyces emersonii de la invencion o una enzima

o composicion enzimatica de la invencion.

Referencias

1.

Raeder U. y Broda P. (1985), Lett. Appl. Microbiol. Vol. 1 pags. 17-20.

2.

P. Chomozynski y N. Sacchi (1987), Anal. Biochem Vol. 162, 156-159.

3.

J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989), "Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

4.

G. Zaide, D. Shallom, S. Shulami, G. Zolotnitsky, G. Golan, T. Baasov, G. Shoham y Y. Shoham (2001) Eur. J. Biochem. Vol. 268; 3006-1016.

5.

P.G. Murray, C.M. Collins, A. Grassick y M.G. Tuohy (2003), Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 301, 280

286.

6.

A.J. Harvey, M. Hrmova, R. De Gori, J.N. Varghese y G.B. Fincher, (2000) Proteins Vol. 41, 257-269.

7.

A.P. Moloney, T.J. Hackett, P.J. Considine, M.P. Coughlan, (1983) Enzyme Microb. Technol. Vol. 5, 260-264.

8.

G.L. Miller (1951), Anal. Chem. Vol. 31, 426-428.

9.

M. Dubois, K. Gilles, P.A. Hamillton, P.A. Rebers, F. Smith, (1956) Anal. Chem. 28, 350-356.

10.

U.R. Laemmli, (1970), Nature (Londres), Vol. 227, 680-685.

11.

P.G. Murray, A-Grassick, C.D. Laffey, M.M. Cuffe, T. Higgins, A.V. Savage, A. Planas, M.G. Tuohy, (2001), Enzyme Microbial Technol. Vol. 29, 90-98.

12.

O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall (1951), J. Biol. Chem. 193:265-275.

13.

L. Falquet, M. Pagni, P. Bucher, N. Hulo, C.J. Sigrist, K. Hofmann, A. Bairoch, (2002). Nucleic Acids Research, Vo. 30, 235-238.

14.

H. Nielsen, J. Engelbrecht, S. Brunak, G. on Heigne, (1997), Int. J. Neural Syst., Vol. 8, 581-599.

15.

D. Higgins, J. Thompson, T. Gibson (1994): Nucleic Acids Res, Vo. 22. 4673-4680.

16.A.C. Stolk, R.A. Samson (1972) Studies in Mycology ND 2, pags. 1-65. 17.Tuohy M.G., Coughlan, M.P. (1992) Bioresource Technol. 39, 131-137 18.Tuohy, M.G., Walsh, D.J., Murray, P.G., Claeyssens, M., Cuffe, M.M., Savage, A.V., Coughlan, M.P. (2002). Biochim. Biophys. Acta, 1596, 336-380. 5 19.Reynolds, P.J. (1986) Tesis Doctoral, Universidad Nacionalde Irlanda, Galway. 20.APHA, A., WEF. (1992) Standard methods for the examination of wastewater. 21.Walsh, D.J. (1997) Tesis Doctoral, Universidad Nacional de Irlanda, Galway. 22.Gilleran, C.T. (2004) Tesis Doctoral, Universidad Nacional de Irlanda, Galway. 23.Maloney, A.P., Callan, S.M., Murray, P.G., Tuohy, M.G. (2004) Eur. J. Biochem. 271, 3115-3126. 10 24.Braet, C. (2005) Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway. Bensadoun, A. yWeinstein, D. (1976). Anal. Biochem. 70: 241-250. 25.Tuohy, M.G., Laffey, C.D. & Coughlan. M.P. (1994) Bioresource Technol. 50, 37-42. Tuohy, M.G., Puls, J., Claeyssens, M. Vrsanska, M. & Coughan. M.P. (1993). Biochem. J. 290, 515-523. 26.Murray, P.G., Aro, N., Collins, C., Grassick, A., Penttil�, M., Saloheimo, M. & Tuohy, M. 2004. Prot. Expr. Purif. 15 Vol. 38, pags. 248-257. 27.McCarthy, T., Hanniffy, O., Lalor, E., Savage, A.V. & Tuohy, M.G. 2005. Process Biochem. Vol. 40, pags. 17411748. 28.McCarthy, T., Hanniffy, O., Savage, A.V. & Tuohy, M.G. (2003) Int. J. Biol. Macrmol. 33: 141-148. 29.Colleran, E. & Pistilli, A. (1994) Ann. Microbiol. Enzimol. 44: 1-18. 20 30.Coates, J.D., Coughlan, M.F. & Colleran, E. (1996) J. Microbiol. Meth. 26: 237-246.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una cepa termofila de Ta/aromyces emersonii, con el ND de deposito IMI 393751 o un mutante de la misma con un intervalo de temperatura de crecimiento de 30 a 90 'C yque secrete de forma activa enzimas a temperaturas por encima de 55 'C.

2. 2.

   Uso de una cepa o mutante de acuerdo con la reivindicacion 1 para producir una composicion enzimatica.

3. 3.

   Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para bioconversion de materiales vegetales o derivados de plantas o flujos de residuos incluyendo residuos de hospital.

4. 4.

   Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la produccion de materias primas ricas en monosacaridos a partir de restos vegetales.

5. 5.

   Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el procesamiento y reciclado de productos de papel de madera, papel y textiles.

6. 6.

   Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la sacarificacion de residuos de papel.

7. 7.

   Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el control de fangos, antifungico y biocontrol.

8. 8.

   Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para aplicaciones horticolas.

9. 9.

   Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la produccion de piensos animales para potenciar la digestibilidad de piensos basados en cereales.

10. 10.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la produccion de piensos basados en cereales con bajo contenido en pentosa para animales monogastricos con digestibilidad mejorada y contenidos bajos en βglucanos no celulosicos.

11. 11.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la produccion de piensos funcionales con potencial bioactivo para su uso en asistencia medica veterinaria.

12. 12.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la produccion de productos lacteos o dieteticos especializados, por ejemplo, y formulacionesde alimentos, de bebidas para asistencia medica geriatrica e infantil.

13. 13.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en los sectores de panaderia y confiteria, y en la formulacion de nuevos productos de panaderia de alimentos dieteticos.

14. 14.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la generacion de compuestos precursores de sabor, aroma y sensoriales en la industria alimentaria.

15. 15.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para la generacion de alimentos funcionales.

16. 16.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para la produccion de nuevas bebidas alcoholicas y no alcoholicas de diseno, zumos de frutas y bebidas dieteticas.

17. 17.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en la produccion de compuestos biofarmaceuticos, tales como oligosacaridos bioactivos (incluyendo 1,3(4) y 1,3(6)-glucooligosacaridos de enlace mixto, galactooligosacaridos, xiloglucooligosacaridos, oligosacaridos pecticos, xilooligosacaridos ramificados y lineales, (galacto)glucomanooligosacaridos), glicopeptidos y glicosidos flavonoides de plantas terrestres y marinas, restos vegetales, hongos y flujos de residuos o productos secundarios ricos en azucares sencillos.

18. 18.

    Uso de los microorganismos de acuerdo con la reivindicacion 1, para aumentar la biodisponibilidad de biomoleculas con actividad antibacteriana y antiviral natural, incluyendo glicosidos flavonoides y cianogenos, saponinas, oligosacaridos y fenolicos (incluyendo acidos ferulico y p-cumarico, epicatequina, catequina, acido pirogalico y similares).

19. 19.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para aumentar la biodisponibilidad de biomoleculas antioxidantes naturales, por ejemplo, carotenoides, licopenos, xantofilas, antocianinas, fenolicos y glicosidos de todos los materiales, restos, residuos vegetales, incluyendo diversos frutos y bayas.

20. 20.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para la generacion de materias primas a partir de materiales vegetales sin procesar, restos vegetales y residuos para su uso en la produccion microbiana de antibioticos por hongos y bacterias, incluyendo Penici//ium sp. y Streptomyces sp.

21. 21.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para la generacion de materias primas a partir de materiales vegetales sin procesar, restos vegetales y residuos para su uso en la produccion microbiana de acido citrico.

22. 22.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para la produccion de oligosacaridos a partir de polisacaridos de algas (por ejemplo, laminarano y fucoidano) y aditivos derivados de extractos vegetales, mediante procedimientos generalmente considerados seguros, en la formulacion de productos cosmeticos.

23. 23.

    Uso del microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para la produccion de oligosacaridos y glicopeptidos

    5 para su uso como reactivos de investigacion, en la produccion de biosensores y como herramientas en glicomica funcional para explorar interacciones receptor-ligando y en la produccion de bibliotecas de sustratos para realizar perfiles de especificidad de enzima-sustrato.
24. 24. Uso de la cepa de microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, para la produccion de celulosa y β

    glucanos modificados, celooligosacaridos, almidones y maltooligosacaridos modificados, lactulosa y polioles (por 10 ejemplo, manitol, glucitol o dulcitol, xilitol, arabitol).

25. 25.

    Uso de la cepa de microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en un procedimiento para alterar el valor calorifico de un flujo de residuos.

26. 26.

    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-25 que comprende ademas el uso de enzimas derivadas de una o ambas de las cepas Chaetomium thermophi/e y Thermoascus aurantiacus.

    91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106