ES2394033T3 - Variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza - Google Patents

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Abstract

Un virus influenza reagrupado, donde dicho virus comprende 6 segmentos genómicos internos de uno o más virus donantes diferentes de A/Ann Arbor/6/60 y un segmento genómico que codifica un polipéptido HA de la cepa viral A/VN/1203/04, donde el polipéptido HA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11.

Description

Variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza
Antecedentes de la invención
Las vacunas contra cepas diversas y evoluciones de influenza son importantes desde un punto de vista de la salud de la comunidad, así como comercialmente, ya que cada año numerosos individuos se ven infectados con diferentes cepas y tipo del virus influenza. Los bebés, los ancianos, aquellos sin un cuidado sanitario adecuado y personas inmunocomprometidas están en riesgo especial de muerte por dichas infecciones. Lo que compone el problema de las infecciones por influenza es que se generan nuevas cepas de influenza fácilmente y pueden propagarse entre diversas especies, necesitando de este modo la producción continua de nuevas vacunas.
Se han producido numerosas vacunas capaces de producir una respuesta inmune protectora específica para dichos virus/cepas virales diferentes y de influenza durante más de 50 años e incluyen vacunas de virus completo, vacunas de virus dividido, vacunas de antígeno de superficie y vacunas de virus vivo atenuado. Sin embargo, aunque las formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacuna son capaces de producir una respuesta inmune sistémica, las vacunas de virus vivo atenuado tienen la ventaja de ser capaces también de estimular la actividad de la mucosa local en el tracto respiratorio. Se ha hecho un considerable trabajo en la producción de virus de influenza, y fragmentos de los mismos, para la producción de vacunas por los presentes inventores y colaboradores; véase, por ejemplo, el documento US 2004 029 251 y el documento US 2005 042 229.
A causa del surgimiento continuo (o resurgimiento) de cepas diferentes de influenza, continuamente se desean nuevas vacunas contra influenza. Dichas vacunas típicamente se crean usando restos antigénicos de las cepas virales recién surgidas, por tanto, son altamente deseables polipéptidos y polinucleótidos de nuevas cepas virales recién surgidas, o recién resurgidas (especialmente secuencias de genes antigénicos).
Webby et al. 2004 describe la producción de un virus de referencia contra los virus 2004 H5N1 que circulan en Asia. El virus de referencia descrito en Webby et al. 2004 se basa en una estructura A/Puerto Rico/8/34 que comprende una secuencia HA derivada de A/Hong Kong/213/03 en la que los aminoácidos polibásicos que están asociados con alta virulencia se han eliminado.
Subbarao et al. 2003 describe un virus influenza reagrupado H5N1 basado en una estructura A/Puerto Rico/8/34 y una secuencia HA y NA de A/HK/491/97, donde el sitio de escisión multibásico en la secuencia HA se mutagenizó.
Hien et al. 2004 describe las características clínicas y hallazgos epidemiológicos preliminares en pacientes con casos confirmados de influenza aviar A/H5N1) en Vietnam en diciembre de 2003 y enero de 2004.
El registro epidemiológico semanal publicado por la Organización Mundial de la Salud en 2004 describe cinco casos humanos confirmados por laboratorio de influenza aviar A H5N1 todos de Hanói y obtenidas en el primer mes del año.
Wareing et al. 2001 compararon la inmunogenicidad de las cepas donantes adaptadas al frío ruso A/Leningrad/134/17/57 y A/Leningrad/134/47/57 y la cepa de Estados Unidos A/Ann Arbor/6/60-ca en ratones con sus respectivos virus parentales de tipo silvestre.
La presente descripción proporciona variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza nuevas y/o recién aisladas que son capaces de usarse en la producción de numerosos tipos de vacunas así como en investigación, diagnóstico, etc. Llegarán a ser evidentes otros numerosos beneficios tras la revisión de lo siguiente.
Sumario de la invención
La invención está abarcada por las reivindicaciones independientes. En este documento se describe un polipéptido aislado o recombinante que se selecciona entre: los polipéptidos codificados por una cualquiera de las secuencias de por ejemplo SEQ ID No: 1 o SEQ ID No: 2, uno cualquiera de los polipéptidos codificados por ejemplo SEQ ID No: 1 o SEQ ID No: 2 uno cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID No: 11 o SEQ ID No: 12; solamente la fase de lectura abierta de los polipéptidos de SEQ ID No: 11 o SEQ ID No: 12; formas alternativas (por ejemplo, la forma madura sin el péptido señal, o sin las secuencias 5' y 3' fuera de la fase de lectura abierta, o las secuencias expresadas en la superficie de un virus (por ejemplo, influenza)) del polipéptido de SEQ ID No: 11-12. Los polipéptidos descritos en este documento comprende opcionalmente proteínas de fusión, proteínas con una secuencia líder, un polipéptido precursor, proteínas con una señal de secreción o una señal de localización, o proteínas con una marca epitópica, una marca E, o una marca epitópica His. Las secuencias descritas en este documento también se muestran en el Apéndice 1 y en la lista de secuencias de este documento. Las secuencias de hemaglutinina descritas en este documento comprenden secuencias con sitios de escisión polibásicos modificados (que permiten de este modo el crecimiento de los virus en huevos). Las secuencias del polipéptido hemaglutinina de SEQ ID No: 11-12 comprende las secuencias del péptido señal amino-terminal endógenas, sin embargo, las secuencias del polipéptido hemaglutinina descritas en este documento también incluyen la forma madura (péptido señal amino-terminal escindido) de los polipéptidos hemaglutinina. Los sitios de escisión de cualquier secuencia del polipéptido hemaglutinina de cualquier cepa de influenza puede medirse o predecirse rutinariamente usando cualquiera de varios métodos en la técnica.
En este documento también se describe una composición con uno o más polipéptidos enumerados anteriormente, o fragmentos de los mismos. Se describen adicionalmente polipéptidos que se unen específicamente por un antisuero policlonal creado contra al menos un antígeno que comprende al menos una secuencia de aminoácido descrita anteriormente, o un fragmento de la misma. Dichos anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos anteriormente también se describen en este documento. Los polipéptidos descritos en este documento son opcionalmente inmunogénicos.
Se describen adicionalmente composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de uno o más de cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente así como métodos para estimular el sistema inmune de un individuo para producir una respuesta inmune protectora contra el virus influenza administrando al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los polipéptidos anteriores en un vehículo fisiológicamente aceptable.
La invención incluye el virus influenza recombinante caracterizado por las reivindicaciones adjuntas que comprende uno o más de los polipéptidos o polinucleótidos anteriores, además de composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de dicho virus influenza recombinante. El virus influenza recombinante de la invención para su uso en métodos para estimular el sistema inmune de un individuo para producir una respuesta inmune protectora contra el virus influenza, a través de la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de dicho virus influenza recombinante en un vehículo fisiológicamente aceptable también son parte de la invención.
En este documento también se describe una composición de materia que tiene dos o más de los ácidos nucleicos descritos anteriormente (por ejemplo, una biblioteca que comprende al menos aproximadamente 2, 5, 10, 50 o más ácidos nucleicos). Dichas composiciones pueden producirse opcionalmente por escisión de uno o más ácidos nucleicos descritos anteriormente (por ejemplo, mecánicamente, químicamente, enzimáticamente con una endonucleasa de restricción/ARNasa/ADNasa, etc.). Otras composiciones incluyen, por ejemplo, composiciones producidas por la incubación de uno o más de los ácidos nucleicos descritos anteriormente en presencia de desoxirribonucleótidos trifosfato y una polimerasa termoestable de ácido nucleico.
En este documento también se describen células que comprenden al menos uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, o un fragmento escindido o amplificado o producto de los mismos. Estas pueden expresar opcionalmente un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico. Adicionalmente se describen vectores (por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, fragmentos virales, etc.) que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Dichos vectores pueden comprender opcionalmente un vector de expresión. Los vectores de expresión preferidos incluyen, aunque sin limitación, vectores que comprenden el promotor pol I y secuencias de terminación o vectores que usan los promotores tanto pol I como pol II "el sistema promotor pol II/pol III" (por ejemplo, Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607; documento US20020164770; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; y documento US20030035814). También se describen células transducidas por dichos vectores.
En algunas realizaciones, la invención abarca un virus (por ejemplo, un virus influenza) que comprende uno o más de los ácidos nucleicos descritos anteriormente (por ejemplo, que codifican hemaglutinina y/o neuraminidasa) caracterizado por las reivindicaciones adjuntas. Las composiciones inmunogénicas que comprenden dicho virus también son parte de la presente invención caracterizada por las reivindicaciones adjuntas. Dichos virus son un virus reagrupado, tal como un virus reagrupado 6:2 (por ejemplo, que comprende 6 regiones codificantes de genes de uno
o más virus donantes diferentes de A/Ann Arbor/6/60 y al menos una región que codifica un gen de una o más de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente que codifica hemaglutinina A que comprende la SEQ ID No: 11 o una hemaglutinina que comprende la SEQ ID No: 11 y neuraminidasa caracterizada por las reivindicaciones adjuntas. Los virus reagrupados (opcionalmente vivos) de la invención pueden incluir virus donantes que son uno o más de, por ejemplo, sensibles al frío, adaptados al frío, o atenuados. Por ejemplo, los virus reagrupados pueden comprender por ejemplo, PR8, etc. Los virus reagrupados de la invención excluyen A/Ann Arbor/6/60. Los métodos caracterizados por las reivindicaciones adjuntas para producir virus influenza recombinantes a través del cultivo de una célula hospedadora que alberga un virus influenza en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de ácido nucleico y, el aislamiento del virus influenza recombinante de una o más de las células hospedadoras o el medio también son parte de la invención.
En otras realizaciones de este documento, la invención comprende composiciones inmunogénicas que tienen una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los virus influenza recombinantes descritos anteriormente caracterizados por las reivindicaciones adjuntas. Otras realizaciones incluyen en virus influenza recombinantes de la invención para su uso en métodos para estimular el sistema inmune de un individuo para producir una respuesta inmune protectora contra el virus influenza administrando al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los virus influenza recombinantes caracterizados por las reivindicaciones adjuntas (opcionalmente en un vehículo fisiológicamente eficaz).
En este documento también se describen métodos para producir un polipéptido aislado o recombinante cultivando cualquier célula hospedadora anterior, en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de ácido nucleico y, aislando el polipéptido de una o más de las células hospedadoras o el medio en el que se cultivan las células.
Las composiciones inmunogénicas caracterizadas por las reivindicaciones adjuntas también son características de la invención. Por ejemplo, composiciones inmunogénicas que comprenden uno cualquiera o más de los virus descritos anteriormente caracterizados por las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, junto con uno o más componentes de administración farmacéuticamente aceptables).
El virus recombinante de la invención para su uso en métodos para producir respuestas inmunogénicas en un sujeto a través de la administración de una cantidad eficaz de cualquiera de los virus anteriores (o composiciones inmunogénicas) a un sujeto también está dentro de la presente invención. Adicionalmente, el virus recombinante de la invención para su uso en métodos de tratamiento profiláctico de una infección vírica (por ejemplo, influenza vírica) en un sujeto a través de la administración de uno cualquiera o más de los virus descritos anteriormente (o composiciones inmunogénicas) en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunogénica contra la infección vírica también es parte de la presente invención. Los sujetos para dicho tratamiento pueden incluir mamíferos (por ejemplo, seres humanos). Dicho virus recombinante de la invención para su uso en dichos métodos también puede ser para administración in vivo al sujeto así como para administración in vitro o ex vivo a una o más células del sujeto. Adicionalmente, dicho virus recombinante de la invención para su uso en dichos métodos también puede comprender una composición del virus y un excipiente farmacéuticamente aceptable para administración al sujeto en una cantidad eficaz para tratar profilácticamente la infección vírica.
En este documento también se describen composiciones de materia que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos hemaglutinina y/o neuraminidasa de una o más cepas pandémicas de la influenza y secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de A/Ann Arbor/6/60. Se describen adicionalmente composiciones de materia que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos hemaglutinina y/o neuraminidasa de una o más cepas pandémicas de la influenza y secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de PR8 o A/Ann Arbor/6/60. Dichas secuencias pueden incluir las enumeradas en la lista de secuencias de este documento. Adicionalmente, estas composiciones incluyen composiciones de materia que comprenden secuencias que codifican la hemaglutinina y/o neuraminidasa de una o más cepas pandémicas de la influenza y secuencias de ácido nucleico que codifican una cepa estructural seleccionada en una reagrupación 6:2. Dicha composición descrita en este documento incluye secuencias que codifican la hemaglutinina y neuraminidasa seleccionadas entre la lista de secuencias de este documento y una cepa estructural, donde la cepa estructural el PR8 o A/Ann Arbor/6/60. También se describen composiciones descritas anteriormente donde la hemaglutinina comprende un sitio de escisión polibásico modificado. La invención también incluye una vacuna viva atenuada contra la influenza que comprende dichas composiciones anteriores caracterizadas por las reivindicaciones adjuntas.
Estos y otros objetos y características de la invención llegarán a ser completamente evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada junto con las figuras adjuntas y el apéndice.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Muestra modificaciones diseñadas por ingeniería en el gen HA de VN/1203/2004 para retirar el sitio de escisión polibásico.
Figura 2: Presenta los resultados que muestran que virus reagrupados H5N1 ca administrado por vía intranasal no se replican en pollos.
Figura 3: Ilustra que las vacunas candidatas H5N1/AA ca no son letales para ratones.
Figura 4: Ilustra que los virus reagrupados H5N1 ca 1997 y 2004 tienen restringida la replicación en ratones.
Figura 5: Ilustra que los virus influenza reagrupados H5N1/AA ca tienen restringida la replicación en pulmones de ratones.
Figura 6: Muestra los títulos séricos de Ab HAI producidos en ratones después de una única dosis i.n. de vacuna.
Figura 7: Muestra los títulos séricos de Ab neutralizante producidos en ratones después de una única dosis i.n. de vacuna.
Figura 8: Ilustra que virus reagrupado H5N1 ca protegen a los ratones de exposiciones letales con 50, 500 ó 5000 LD50 de virus H5N1 de tipo silvestre.
Figura 9: Ilustra la eficacia de la protección contra la replicación pulmonar de virus de exposición H5N1 homólogos y heterólogos en ratones.
Figura 10: Ilustra la eficacia de protección contra la replicación de virus de exposición H5N1 homólogos y heterólogos en el tracto respiratorio superior de ratones.
Figura 11: Ilustra la eficacia de protección conferida por la vacuna 2004 H5N1 ca contra exposición de elevada dosis (105TCID50) con virus H5N1 wt homólogos o heterólogos en ratones.
Figura 12: Ilustra la eficacia de protección conferida por vacunas 1997 y 2003 H5N1 ca contra exposiciones de alta dosis (105TCID50) con virus H5N1 de tipo silvestre homólogos o heterólogos en ratones.
Figura 13: Ilustra la eficacia de protección conferida por la vacuna 2004 H5N1 ca contra dosis bajas o elevadas de exposiciones al virus H5N1 de tipo silvestre homólogo en ratones.
Descripción detallada
Definiciones
Salvo que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un especialista en la técnica al que pertenece la invención. Las siguientes definiciones suplementan las de la técnica y se refieren a la presente solicitud y no deben imputarse necesariamente a ningún caso relacionado o no relacionado, por ejemplo, a cualquier patente o solicitud del mismo propietario que la presente. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica para ensayar la presente invención, en este documento se describen los materiales y métodos preferidos. Por consiguiente, la terminología usada en este documento es con el propósito de describir las realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitante.
Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "un virus" incluye una pluralidad de virus; una referencia a una "célula hospedadora" incluye mezclas de células hospedadores, y similares.
Una "secuencia de aminoácidos" es un polímero de restos aminoacídicos (una proteína, polipéptido, etc.) o una cadena de caracteres que representa un polímero de aminoácidos, dependiendo del contexto.
Las expresiones "ácido nucleico", "polinucleótido", "secuencia polinucleotídica" y "secuencia de ácido nucleico" se refieren a polímeros desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, quimeras o análogos de los mismos, o una cadena de caracteres que representa esto, dependiendo del contexto. Como se usa en este documento, el término incluye opcionalmente polímeros de análogos de nucleótidos de origen natural que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales ya que hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de un modo similar a los nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos). Salvo que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular abarca opcionalmente secuencias complementarias además de la secuencia explícitamente indicada. Puede determinarse para cualquier secuencia polinucleotídica especificada, el ácido nucleico dado o la secuencia polinucleotídica complementaria (por ejemplo, el ácido nucleico complementario).
La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" también abarca cualquier cadena física de unidades monoméricas que pueda corresponderse a una cadena de nucleótidos, incluyendo un polímero de nucleótidos (por ejemplo, un polímero de ADN o ARN típico), PNA, oligonucleótidos modificados (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas en un ARN o ADN biológico en solución, tal como oligonucleótidos 2'-O-metilados), y similares. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, monocatenario o bicatenario.
Una "subsecuencia" es cualquier porción de una secuencia completa, hasta e incluyendo la secuencia completa. Típicamente, una subsecuencia comprende menos que la secuencia de longitud completa. Una "subsecuencia única" es una subsecuencia que no se encuentra en ninguna secuencia polinucleotídica o polipeptídica de influenza determinada previamente.
El término "variante" con respecto a un polipéptido se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia. La variante puede tener cambios "conservativos", donde un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, el reemplazo de leucina con isoleucina. Como alternativa, una variante puede tener cambios "no conservativos", por ejemplo, el reemplazo de una glicina con un triptófano. Una variación minoritaria análoga también puede incluir una deleción o inserción de un aminoácido, o ambos. Pueden encontrarse directrices para determinar qué restos aminoacídicos pueden sustituirse, insertarse, o delecionarse sin eliminar la actividad biológica o inmunológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software de DNASTAR. En este documento también se describen ejemplos de sustituciones conservativas.
El término "gen" se usa ampliamente para hacer referencia a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica. Por tanto, los genes incluyen secuencias codificantes y/o las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. El término "gen" se aplica una secuencia genómica específica, así como a un ADNc, a un ARNm codificados por esa secuencia genómica.
Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen "promotores" y "potenciadores", a los que dichas proteínas reguladoras tales como factores de transcripción se unen, provocando la transcripción de secuencias adyacentes o cercanas. Un promotor o potenciador "específico de tejido" es uno que regula la transcripción en un tipo o tipos tisulares o celulares específicos.
"Expresión de un gen" o "expresión de un ácido nucleico" significa la transcripción de ADN en ARN (opcionalmente incluyendo la modificación del ARN, por ejemplo, corte y ayuste), traducción de ARN en un polipéptido (posiblemente incluyendo la posterior modificación del polipéptido, por ejemplo, modificación post-traduccional), o tanto transcripción como traducción, como se indique por el contexto.
Una "fase de lectura abierta" u "ORF" es una posible fase de lectura de traducción de ADN o ARN (por ejemplo, de un gen), que tiene capacidad de traducirse en un polipéptido. Es decir, la fase de lectura no está interrumpida por codones de parada. Sin embargo, debe apreciarse que el término ORF no indica necesariamente que el polinucleótido se traduzca de hecho en un polipéptido.
El término "vector" se refiere al medio por el cual un ácido nucleico puede propagarse y/o transferirse entre organismos, células, o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagómidos, transposones, cromosomas artificiales, y similares, que se replican de forma autónoma y puede integrarse en un cromosoma de una célula hospedadora. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto tanto por ADN como por ARN dentro de la misma cadena, un ADN o ARN conjugado a polilisina, un ADN o ARN conjugado a un péptido, un ADN conjugado a un liposoma, o similares, que no se replican de forma autónoma. En muchos casos habituales, pero no todos, los vectores son plásmidos.
Un "vector de expresión" es un vector, tal como un plásmido que es capaz de promover la expresión, así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Típicamente, el ácido nucleico a expresar está "unido de forma funcional" a un promotor y/o potenciador, y está sometido al control regulador de la transcripción por el promotor y/o potenciador.
Un "vector de expresión bidireccional" se caracteriza por dos promotores alternativos orientados en direcciones opuestas con relación al ácido nucleico situado entre los dos promotores, de modo que la expresión puede iniciarse en ambas orientaciones provocando, por ejemplo, la transcripción de ARN tanto de la cadena positiva (+) o con sentido, como de cadena negativa (-) o antisentido.
Un "polipéptido" es un polímero que comprende dos o más restos aminoacídicos (por ejemplo, un péptido o una proteína). El polímero puede comprender opcionalmente modificaciones tales como glicosilación o similares. Los restos aminoacídicos del polipéptido pueden ser naturales o no naturales y pueden estar no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados.
En el contexto de la invención, el término "aislado" se refiere a un material biológico, tal como un virus, un ácido nucleico o una proteína, que está sustancialmente libre de componentes que lo acompañan normalmente o interaccionan con el mismo en su entorno de origen natural. El material biológico aislado opcionalmente comprende material adicional no encontrado con el material biológico en su entorno natural, por ejemplo, una célula o virus de tipo silvestre. Por ejemplo, si el material está en su entorno natural, tal como una célula, el material puede haberse situado en una localización en la célula (por ejemplo, genoma o elemento genético) no nativo para dicho material encontrado en ese entorno. Por ejemplo, un ácido nucleico de origen natural (por ejemplo, una secuencia codificante, un promotor, un potenciador, etc.) llega a estar aislado si se introduce por un medio de origen no natural en un locus del genoma (por ejemplo, un vector, tal como un plásmido o vector viral, o amplicón) no nativo para ese ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos también se mencionan como ácidos nucleicos "heterólogos". Un virus aislado, por ejemplo, está en un entorno (por ejemplo, un sistema de cultivo celular, o purificado del cultivo celular) diferente del entorno nativo del virus de tipo silvestre (por ejemplo, la nasofaringe de un individuo infectado).
El término "quimérico" o "quimera", cuando se hace referencia a un virus, indica que el virus incluye componentes genéricos y/o polipeptídicos derivados de más de una cepa o fuente viral parental. De forma similar, el término "quimérico" o "quimera", cuando hace referencia a una proteína viral, indica que la proteína incluye componentes polipeptídicos (es decir, subsecuencias de aminoácidos) derivados de más de una cepa o fuente viral parental.
El término "recombinante" indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o proteína) se ha alterado de forma artificial o sintética (no natural) por intervención humana. La alteración puede realizarse en el material dentro, o retirado de, su entorno o estado natural. Específicamente, por ejemplo, un virus influenza es recombinante cuando se produce por la expresión de un ácido nucleico recombinante. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es uno que se hace recombinante recombinando ácidos nucleicos, por ejemplo, durante clonación, arrastre de ADN u otros procedimientos, o por mutagénesis química u otra mutagénesis; un "polipéptido recombinante" o "proteína recombinante" es un polipéptido o proteína que se produce por expresión de un ácido nucleico recombinante; y un "virus recombinante", por ejemplo, un virus influenza recombinante, se produce por la expresión de un ácido nucleico recombinante.
El término "reagrupado", cuando hace referencia a un virus, indica que el virus incluye componentes genéticos y/o polipeptídicos derivados de más de una cepa o fuente viral parental. Por ejemplo, un reagrupado 7:1 incluye 7 segmentos genómicos virales (o segmentos génicos) derivado de un primer virus parental, y 1 único segmento genómico viral complementario, por ejemplo, que codifica una hemaglutinina o neuraminidasa. Un reagrupado 6:2 incluye 6 segmentos genómicos, más habitualmente los 6 genes internos de un primer virus parental, y 2 segmentos complementarios, por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa, de un virus parental diferente.
El término "introducido" cuando hace referencia a un ácido nucleico heterólogo o aislado se refiere a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertido en un replicón autónomo,
o expresado de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado). El término incluye métodos tales como "infección", "transfección", "transformación" y "transducción". En el contexto de la invención puede emplearse una diversidad de métodos para introducir ácidos nucleicos en células, incluyendo electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por lípidos (lipofección), etc.
La expresión "célula hospedadora" significa una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, tal como un vector, y soporta la replicación y/o expresión del ácido nucleico. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, de insecto, de anfibio, de ave o mamífero, incluyendo células humanas. Las células hospedadoras ejemplares pueden incluir, por ejemplo, células Vero (riñón de mono verde africano), células BHK (riñón de cría de hámster), células de riñón de pollo primarias (PCK), células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK), células 293 (por ejemplo, células 293T), y células COS (por ejemplo, células COS1, COS7), etc.
Una "cantidad inmunológicamente eficaz" de virus influenza es una cantidad suficiente para potenciar la propia respuesta inmune de un individuo (por ejemplo, de un ser humano) contra una exposición posterior al virus influenza. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos de secreción y/o séricos neutralizantes, por ejemplo, por neutralización de placas, fijación del complemento, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, o ensayo de microneutralización.
Una "respuesta inmune protectora" contra el virus influenza se refiera a una respuesta inmune mostrada por un individuo (por ejemplo, un ser humano) que es protectora contra la enfermedad cuando el individuo se expone posteriormente a y/o se infecta con dicho virus influenza. En algunos casos, el virus influenza (por ejemplo, de circulación natural) aún puede causar infección, pero no puede causar una infección grave. Típicamente, la respuesta inmune protectora provoca niveles detectables de anticuerpos séricos y de secreción engendrados por el hospedador que son capaces de neutralizar el virus de la misma cepa y/o subgrupo (y posiblemente también de un cepa y/o subgrupo no de vacuna diferente) in vitro e in vivo.
Como se usa en este documento, un "anticuerpo" es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancial
o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gama, mu, alfa, delta, o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina típica (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. Las expresiones cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra convirtiendo de este modo el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo). Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un especialista en la técnica apreciará que dichos fragmentos Fab' pueden sintetizarse de novo de forma química o utilizando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, como se usa en este documento, incluye anticuerpos o fragmentos producidos por la modificación de los anticuerpos completos o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. Los anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena múltiple o sencilla, incluyendo anticuerpos Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) en los que una cadena pesada variable y una cadena ligera variable están unidas juntas (directamente o a través de un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo, y anticuerpos humanizados o quiméricos.
Virus influenza
Los péptidos y polinucleótidos descritos en este documento, por ejemplo, la SEQ ID Nos: 1-20, son variantes de las secuencias HA y NA de la influenza. En general, los virus influenza están compuestos por un núcleo ribonucleoproteico interno que contiene un genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta lipoproteica exterior revestida por una proteína de matriz. El genoma de los virus influenza están compuestos por ocho segmentos de ácido ribonucleico (ARN) de cadena lineal (-), que codifica las proteínas inmunogénicas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), y seis polipéptidos centrales internos: la nucleoproteína de nucleocápsida (NP); proteína de matriz (M); proteínas no estructurales (NS); y 3 proteínas ARN polimerasa (PA, PB1, PB2). Durante la replicación, el ARN viral genómico se transcribe en ARN mensajero de cadena (+) y ARNc genómico de cadena (-) en el núcleo de la célula hospedadora. Cada uno de los ocho segmentos genómicos se empaqueta en complejos ribonucleoproteicos que contienen, además del ARN, NP y un complejo polimerasa (PB1, PB2, y PA).
La influenza se agrupa habitualmente en las categorías de influenza A e influenza B. Los virus influenza A e influenza B contienen cada uno ocho segmentos de ARN monocatenario con polaridad negativa. El genoma de la influenza A codifica once polipéptidos. Los segmentos 1-3 codifican tres polipéptidos, que componen una ARN polimerasa dependiente de ARN. El segmento 1 codifica la proteína del complejo polimerasa PB2. Las restantes proteínas polimerasa PB1 y PA están codificadas por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente. Además, el segmento 1 de algunas cepas de la influenza codifica una pequeña proteína, PB1-F2, producida de una fase de lectura alternativa dentro de la región codificante de PB1. El segmento 4 codifica la glicoproteína de superficie hemaglutinina (HA) implicada en la adhesión celular y la entrada durante la infección. El segmento 5 codifica el polipéptido nucleoproteico de nucleocápsida (NP), el componente estructural principal asociado con el ARN viral. El segmento 6 codifica una glicoproteína de envuelta neuraminidasa (NA). El segmento 7 codifica dos proteínas de matriz, denominadas M1 y M2, que se traducen a partir de ARNm con corte y ayuste diferencial. El segmento 8 codifica NS1 y NS2, dos proteínas no estructurales, que se traducen a partir de variantes de ARNm con corte y ayuste alternativo. Los ocho segmentos genómicos de la influenza B codifican 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica la proteína HA. El segmento 5 codifica NP. El segmento 6 codifica la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de fases de lectura solapantes de un ARNm bicistrónico. El segmento 7 de la influenza B también codifica dos proteínas: M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm de corte y ayuste.
Vacunas contra el virus influenza
Las secuencias, composiciones y métodos de este documento se refieren principalmente, pero no únicamente, a la producción de virus influenza para vacunas. Históricamente, las vacunas contra el virus influenza se han producido principalmente en huevos de gallina embrionados usando cepas de virus seleccionadas o basadas en predicciones empíricas de cepas relevantes. Más recientemente, se han producido virus reagrupados que incorporan hemaglutinina y/o neuraminidasa seleccionadas, antígenos en el contexto de una cepa maestra sensible a la temperatura atenuada aprobada. Después del cultivo del virus a través de múltiples pases en huevos de gallina, los virus influenza se recuperan y, opcionalmente, se inactivan, por ejemplo, usando formaldehído y/o 1-propiolactona (o se usa alternativamente en vacunas atenuadas vivas). Por tanto, se apreciará que las secuencias de HA y NA (por ejemplo, SEQ ID Nos: 1-20) son bastante útiles para construir vacunas contra la influenza. La presente descripción incluye virus/vacunas que comprenden secuencias de HA o HA y NA de cepas pandémicas de la influenza (incluyendo cuando las secuencias HA comprende sitios de escisión polibásicos modificados tales como las modificaciones descritas en este documento); e incluyendo cuando los virus/vacunas comprenden una estructura ca tal como la estructura de PR8.
Los intentos de producir vacunas recombinantes y reagrupados en cultivo celular se han visto impedidos por la incapacidad de algunas de las cepas aprobadas para producción de vacunas de crecer de forma eficaz en condiciones de cultivo celular convencionales. Sin embargo, trabajos previos de los inventores y sus colaboradores proporcionaron un sistema de vector, y métodos para producir virus recombinantes y reagrupados en cultivo, por tanto, haciendo posible producir rápidamente vacunas correspondientes a una o muchas cepas antigénicas seleccionadas de virus, por ejemplo, las cepas A o B, diversos subtipos de subcepas, etc., por ejemplo, que comprenden las secuencias HA y/o NA de este documento. Véase, el Sistema Multiplásmido para la producción del virus influenza, documento US 2004029251. Típicamente, los cultivos se mantienen en un sistema, tal como un incubador de cultivo celular, en humedad y CO2 controlados, a temperatura constante usando un regulador de temperatura, tal como un termostato para asegurar que la temperatura no excede de 35ºC. Los virus influenza reagrupados pueden obtenerse fácilmente introduciendo un subconjunto de vectores correspondientes a segmentos genómicos de un virus influenza maestro, en combinación con segmentos complementarios derivados de cepas de interés (por ejemplo, variantes antigénicas de HA y/o NA de este documento). Típicamente, las cepas maestras se seleccionan en base a las propiedades deseables relevantes para la administración de la vacuna. Por ejemplo, para la producción de vacunas, por ejemplo, para la producción de una vacuna viva atenuada, la cepa de virus donante maestra puede seleccionarse para un fenotipo atenuado, adaptación al frío y/o sensibilidad a la temperatura. Se apreciará que las secuencias Ha y Na de este documento son capaces de reagruparse con varios genes virales o tipos virales (por ejemplo, varias "estructuras" diferentes tales como PR8, etc., que contienen los otros genes de la influenza presentes en un reagrupado, concretamente los genes no HA y no NA).
Diversas realizaciones de este documento pueden comprender vacunas vivas atenuadas indicadas en las reivindicaciones, que tienen las secuencias HA y/o NA de SEQ ID No: 11 o SEQ ID No: 12 de este documento, para influenza pandémica. Dichas vacunas comprenden las secuencias HA o HA y NA de SEQ ID Nos: 11-12, o sus nucleótidos correspondientes de por ejemplo SEQ ID Nos: 1-2. Un problema que surge del cultivo de cepas virales de vacuna (por ejemplo, reagrupados) en huevos es que las cepas aviares (que pueden estar implicadas en pandemias) pueden eliminar los huevos en que las vacunas tienen que producirse y son, por tanto, difíciles de manipular, producir, etc. a través del uso de producción reagrupante tradicional (rescate no plasmídico). Dichas cepas aviares son de interés ya que las evidencias indican que pueden producir influenza en seres humanos y posibles pandemias. Por tanto, el uso de sistemas de rescate de plásmidos para crear/manipular reagrupados de influenza con cepas pandémicas tales como diversas secuencias aviares (por ejemplo, las secuencias HA y NA de este documento) es bastante deseable. Se apreciará, sin embargo, que las actuales secuencias también son capaces de usarse con sistemas no plasmídicos o tradicionales.
Los pájaros acuáticos (entre otros) pueden infectarse por virus de influenza A de 15 subtipos de hemaglutinina (HA) y 9 neuraminidasa (NA). Dichos pájaros pueden servir como reserva a partir de los cuales pueden introducirse nuevos subtipos de influenza en poblaciones humanas y causar pandemias. La observación de que los virus de influenza A H7N7 aviar infectaron seres humanos en Holanda en 2003 y los virus aviares H5N1 y H9N2 infectaron seres humanos en Hong Kong y China anteriormente, crea la preocupación de que estos (y otros) subtipos tienen el potencial de causar pandemias. Por tanto, las vacunas tienen que prevenir infecciones humanas con virus de influenza A aviares. Recientemente obtuvieron licencia en los Estados Unidos vacunas contra el virus de influenza A vivo atenuado contra virus de influenza humana. Véase anteriormente. Dichos vacunas son virus H1N1 y H3N2 reagrupados en los que los genes de las proteínas internas de A/Ann Arbor (AA)/6/60 (H2N2) virus adaptado al frío (ca) confieren los fenotipos de atenuación adaptado al frío y se sensible a temperatura del virus ca AA en los virus reagrupados (es decir, los que tienen los genes de hemaglutinina y neuraminidasa de la cepa no Ann Arbor). Se han aplicado la reagrupación genética clásica y las técnicas de genética inversa basada en plásmidos para generar virus reagrupados caracterizados en las reivindicaciones adjuntas. La generación y evaluación de estos virus reagrupados como virus semilla para vacunas son etapas importantes en preparaciones pandémicas. Se contempla que ensayos clínicos pueden establecer la seguridad, efectividad e inmunogenicidad de dichas vacunas pandémicas atenuadas vivas. También se incluyen los métodos de construcción y uso de dichos virus y vacunas. "Cepas víricas pandémicas" como se usa en este documento se define como un subtipo de virus A de cepa de la influenza que no está en circulación en la población humana, que se declara como cepa pandémica por los Centros de Control de Enfermedades o la Organización Mundial de la Salud o que se conocen generalmente como tales dentro de la comunidad científica.
Como se describe en este documento, las secuencias antigénicas (por ejemplo, las secuencias HA) así como los virus y vacunas de dichos virus comprenden sitios de escisión polibásicos modificados. Algunas cepas altamente patogénicas de la influenza pandémica aviar comprenden múltiples sitios de escisión de aminoácidos básicos dentro de las secuencias de hemaglutinina. Véase, por ejemplo, Li et al., J. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999. Dichos sitios de escisión, en realizaciones típicas de este documento, se modifican o alteran, por ejemplo, en sus secuencias en comparación con las secuencias de tipo silvestre a partir de las cuales se obtienen las actuales secuencias (por ejemplo, para deshabilitar la escisión o reducir la escisión allí, etc.). Dichas modificaciones/alteraciones pueden ser diferentes en diferentes cepas debido a las diversas secuencias de los sitios de escisión en las secuencias de tipo silvestre. Por ejemplo, típicamente se eliminan cuatro restos polibásicos (RRKK) en 326-329 de H5 madura en secuencias de este documento (en comparación con wt). Véase la lista de secuencias y la Figura 1. Los sitios de escisión polibásicos pueden modificarse de varios modos. Por ejemplo, el sitio de escisión polibásico puede eliminarse un aminoácido cada vez (por ejemplo, una R eliminada, dos R eliminadas, RRK eliminado, o RRKK eliminado). Adicionalmente, el resto aminoacídico directamente cadena arriba del sitio de escisión también puede eliminarse o alterarse (por ejemplo, de una R a una T, etc.); además, los nucleótidos que codifican el resto aminoacídico directamente después del sitio de escisión también pueden modificarse. Véase, por ejemplo, la Figura 1 para una ilustración de la modificación del sitio de escisión. Además, las secuencias polipeptídicas de hemaglutinina del virus influenza comprenden secuencias péptidos señal amino-terminales, por tanto, las secuencias polipeptídicas de hemaglutinina incluyen tanto la forma madura (péptido señal amino-terminal escindido) de los polipéptidos de hemaglutinina como la forma pre-escindida de la hemaglutinina. Los sitios de escisión de cualquier secuencia polipeptídica de hemaglutinina de cualquier cepa de la influenza puede medirse o predecirse rutinariamente usando cualquiera de varios métodos en la técnica.
Las expresiones "sensible a la temperatura", "adaptado al frío" y "atenuada" se aplican a virus (típicamente usados como vacunas o para la producción de vacunas) que abarcan opcionalmente las presentes secuencias, son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la expresión "sensible a la temperatura" (ts) indica, por ejemplo, que el virus muestra una reducción de factor 100 o mayor en el título a 39ºC con relación a 33ºC para cepas de la influenza A, o que el virus muestra una reducción de factor 100 o mayor en el título a 37ºC con relación a 33ºC para cepas de la influenza B. la expresión "adaptado al frío" (c) indica que el virus muestra crecimiento a 25ºC dentro de un factor 100 de su crecimiento a 33ºC, mientras que el término "atenuado" (att) indica que el virus se replica en las vías respiratorias superiores de hurones pero no es detectable en sus tejidos pulmonares, y no causan enfermedad tipo influenza en el animal. Se entenderá que virus con fenotipos intermedios, es decir, virus que muestran reducciones en los títulos de menos de 100 veces a 39ºC (para virus de la cepa A) o 37ºC (para virus de la cepa B), o que muestran crecimiento a 25ºC que es más de 100 veces su crecimiento a 33ºC (por ejemplo, dentro un factor 200, factor 500, factor 1000, factor 10.000 menos), y/o muestran crecimiento reducido en los pulmones con relación al crecimiento en las vías respiratorias superiores de hurones (es decir, parcialmente atenuado) y/o enfermedad tipo influenza reducida en el animal, también son virus útiles y pueden usarse junto con las secuencias HA y NA de este documento.
De nuevo, las secuencias HA y NA descritas en este documento se utilizan en dichas vacunas reagrupadas plasmídicas (y/o en otros virus y vacunas ts, cs, ca, y/o att).
Métodos y composiciones para la administración profiláctica de vacunas
Los virus recombinantes y reagrupados de la invención (por ejemplo, aquellos que comprenden polinucleótidos de, por ejemplo, SEQ ID Nos: 1-2, polipéptidos de SEQ ID Nos: 11-12), pueden administrarse profilácticamente en una cantidad inmunológicamente eficaz y en un vehículo o excipiente apropiado para estimular una respuesta inmune específica para una o más cepas del virus influenza determinada por la secuencia HA y/o NA. Típicamente, el vehículo o excipiente es un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina acuosa, solución salina tamponada acuosa, soluciones acuosas de dextrosa, soluciones acuosas de glicerol, etanol, o combinaciones de los mismos. La preparación de dichas soluciones que asegura la esterilidad, pH, isotonicidad, y estabilidad se realiza de acuerdo con protocolos establecidos en la técnica. Generalmente, se selecciona un vehículo o excipiente para minimizar los efectos alérgicos y otros efectos indeseables, y para adecuar la vía particular de administración, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intranasal, etc.
Un aspecto relacionado de la invención proporciona el virus influenza recombinante de la invención para su uso en métodos para estimular el sistema inmune de un individuo para producir una respuesta inmune protectora contra el virus influenza. En los métodos, se administras una cantidad inmunológicamente eficaz de un virus influenza recombinante (por ejemplo, que comprende una molécula HA y/o NA como se describe en este documento) al individuo en un vehículo fisiológicamente aceptable.
Generalmente, los virus influenza de la invención se administran en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmune específica para una o más cepas del virus influenza (es decir, contra las cepas HA y/o NA descritas en este documento). Preferiblemente, la administración de los virus influenza provoca una respuesta inmune protectora contra dichas cepas. Las dosificaciones y métodos para provocar una respuesta inmune protectora contra una o más cepas de la influenza son conocidos para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento USPN 5.922.326; Wright et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982); Kim et al., Pediatrics 52:5663 (1973); y Wright et al., J. Pediatr. 88:931-936 (1976). Por ejemplo, los virus influenza se proporcionan en el intervalo de aproximadamente 1-1000 HID50 (dosis infecciosa humana), es decir, aproximadamente 105 -108 pfu (unidades formadoras de placa) por dosis administrada. Típicamente, la dosis se ajustará dentro de este intervalo en base a, por ejemplo, la edad, estado físico, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se administra sistémicamente, por ejemplo, por inyección subcutánea
o intramuscular usando una aguja y jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. Como alternativa, la formulación de vacuna se administra por vía intranasal, por gotas, aerosol de partículas grandes (más de aproximadamente 10 micrómetros), o pulverización en el tracto respiratorio superior. Aunque ninguna de las vías anteriores de suministro produce una respuesta inmune sistémica protectora, la administración intranasal confiere el beneficio añadido de provocar inmunidad en la mucosa en el sitio de entrada del virus influenza. Para administración intranasal, a menudo se prefieren vacunas de virus vivo atenuado, por ejemplo, un virus influenza recombinante o reagrupado adaptado al frío y/o sensible a la temperatura atenuado. Véase anteriormente. Aunque se prefiere la estimulación de una respuesta inmune protectora con una única dosis, pueden administrarse dosificaciones adicionales, por la misma vía
o una diferente, para conseguir el efecto profiláctico deseado.
Típicamente, el virus influenza recombinante atenuado de esta invención usado en una vacuna está suficientemente atenuado de modo que los síntomas de la infección, o al menos los síntomas de infección grave, no sucedan en la mayoría de los individuos inmunizados (o infectados de otro modo) con el virus influenza atenuado. En algunos casos, el virus influenza atenuado aún puede ser capaz de producir síntomas de enfermedad leve (por ejemplo, enfermedad leve del tracto respiratorio superior) y/o de diseminarse a individuos no vacunados. Sin embargo, su virulencia está suficientemente anulada de modo que no aparezcan infecciones graves del tracto respiratorio inferior en el hospedador vacunado o accidental.
Alternativamente, una respuesta inmune puede estimularse por direccionamiento ex vivo o in vivo de células dendríticas con virus influenza que comprenden las secuencias de este documento. Por ejemplo, se exponen células dendríticas proliferantes a virus en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la captura de los antígenos de la influenza por las células dendríticas. Las células después se transfieren a un sujeto a vacunar por métodos de trasplante intravenoso convencionales.
Aunque se prefiere la estimulación de una respuesta inmune protectora con una única dosis, pueden administrarse dosificaciones adicionales, por la misma vía o una diferente, para conseguir el efecto profiláctico deseado. En neonatos y bebés, por ejemplo, pueden requerirse múltiples administraciones para provocar niveles suficientes de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos en toda la niñez, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección contra infección por la influenza de tipo silvestre. Así mismo, adultos que son particularmente susceptibles a infección repetida o grave de la influenza, tales como, por ejemplo, trabajadores sanitarios, trabajadores de cuidados de día, miembros de la familia de niños jóvenes, los ancianos, e individuos con función cardiopulmonar comprometida pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunes protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos secretores y séricos neutralizantes, y las dosificaciones pueden ajustarse o las vacunaciones repetirse según sea necesario para provocar y mantener niveles deseados de protección.
Opcionalmente, la formulación para administración profiláctica de los virus influenza también contiene uno o más adyuvantes para potenciar la respuesta inmune de los antígenos de la influenza. Dichas adyuvantes incluyen: adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas o de hidrocarburo, bacilo de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum, y el adyuvante sintético QS
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Si se desea, la administración de la vacuna profiláctica de virus influenza puede realizarse junto con la administración de una o más moléculas inmunoestimuladoras. Las moléculas inmunoestimuladoras incluyen diversas citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras, y proinflmatorias, tales como las interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulador de colonias (CSF) de granulocitos-macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la misma formulación que los virus influenza, o pueden administrarse por separado.
Aunque la vacunación de un individuo con un virus influenza atenuado de una cepa particular de un subgrupo particular puede inducir protección cruzada contra un virus influenza de cepas y/o subgrupos diferentes, la protección cruzada puede potenciarse, si se desea, vacunando al individuo con virus influenza atenuada de al menos dos cepas, por ejemplo, cada una de las cuales representa un subgrupo diferente. Adicionalmente, las combinaciones de vacuna pueden incluir opcionalmente mezclas de vacunas pandémicas (por ejemplo, aquellas contra cepas pandémicas de la influenza tales como diversas cepas aviares, véase, por ejemplo, las secuencias de este documento, u otras cepas pandémicas) y cepas no pandémicas. Las mezclas de vacuna (o vacunaciones múltiples) pueden comprender componentes de cepas de la influenza humana y/o no humana (por ejemplo, aviar y humana, etc.). Así mismo, las vacunas del virus influenza atenuadas de esta invención pueden combinarse opcionalmente con vacunas para inducir respuestas inmunes protectoras contra otros agentes infecciosos.
Polinucleótidos
Es bien sabido en la técnica que los segmentos polinucleotídicos de HA y NA de virus influenza comprenden tanto una región codificante (que codifica la ORF) como regiones no codificantes (NCR), tanto 5' y 3' de la secuencia codificante HA y NA. Un ejemplo de estas NCR se muestra en las SEQ ID Nos: 1-9 (fuera de las ORF). También se sabe que pueden prepararse cebadores para estas NCR para facilitar la amplificación de los segmentos completos HA y NA del virus influenza. (Véase, por ejemplo, Hoffmann et al. Arch Virol. 2001 Dic;146(12):2275-89). Además, se sabe que las NCR de la HA y NA de la influenza pueden aumentar la eficacia para conseguir reagrupados. Por lo tanto, las secuencias polinucleotídicas de estas NCR se describen en este documento. Cuando se amplifican los segmentos HA y NA de cualquier cepa pandémica, se podrían preparar y usar cebadores polinucleotídicos para unirse a regiones conservadas (por ejemplo, entre cepas relacionadas) de las NCR de HA y NA para la amplificación (por ejemplo, por RT-PCR).
Los polinucleótidos HA y NA del virus de la invención, por ejemplo, la SEQ ID No: 1 y la SEQ ID No: 2, se usan opcionalmente en varias competencias diferentes alternativas a, o además de, las vacunas descritas anteriormente. Otros usos ejemplares se describen en este documento por motivos ilustrativos y no como limitaciones del intervalo real de usos. También se describen en este documento diferentes métodos de construcción, purificación, y caracterización de las secuencias de nucleótidos de la descripción. En este documento se describe que, los ácidos nucleicos incluyendo una o más secuencias polinucleotídicas descritas anteriormente se usan de forma favorable como sondas para la detección de ácidos nucleicos correspondientes o relacionados en una diversidad de contextos, tal como en experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, por ejemplo, para encontrar y/o caracterizar variantes de la influenza homólogos (por ejemplo, homólogos a las secuencias de este documento, etc.) infectando a otras especies o en diferentes brotes de la influenza, etc. Las sondas pueden ser moléculas de ADN o ARN, tales como fragmentos de restricción de ADN genómico o clonado, ADNc, productos de amplificación por PCR, transcritos, y oligonucleótidos, y pueden variar en longitud de oligonucleótidos tan cortos como de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud a secuencias de longitud completa o ADNc en exceso de una kb o más. Por ejemplo, una sonda incluye una secuencia polinucleotídica o subsecuencia seleccionada, por ejemplo, de entre las SEQ ID No: 1
o la SEQ ID No: 2, o secuencias complementarias a las mismas. Como alternativa, se usan secuencias polinucleotídicas que son variantes de una de las secuencias designadas anteriormente como sondas. Más típicamente, dichas variantes incluyen una o unas pocas variaciones nucleotídicas conservativas. Por ejemplo, pueden seleccionarse pares (o series) de oligonucleótidos, en los que las dos (o más) secuencias polinucleotídicas son variaciones conservativas entre sí, donde una secuencia polinucleotídica corresponde de forma idéntica a una primera variante y la otra u otras corresponden de forma idéntica a variantes adicionales. Dichos pares de sondas oligonucleotídicas son particularmente útiles, por ejemplo, para experimentos de hibridación específica para detectar nucleótidos polimórficos o para, por ejemplo, detectar variantes homólogas de HA y NA de la influenza, por ejemplo, homólogos a las presentes secuencias HA y NA, que infectan otras especies o están presentes en diferentes (por ejemplo, diferentes temporal y/o geográficamente) brotes de la influenza. En otras aplicaciones, se seleccionan sondas que son más divergentes, es decir sondas que son al menos aproximadamente un 91% (o aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 98,5%, aproximadamente un 98,7%, aproximadamente un 99%, aproximadamente un 99,1%, aproximadamente un 99,2%, aproximadamente un 99,3%, aproximadamente un 99,4%, aproximadamente un 99,5%, o aproximadamente un 99,6% o más aproximadamente un 99,7%, aproximadamente un 99,8%, aproximadamente un 99,9% o más) idénticas.
Las sondas descritas en este documento, por ejemplo, ejemplificadas por secuencias derivadas de las secuencias de este documento, también pueden usarse para identificar secuencias polinucleotídicas útiles adicionales de acuerdo con procedimientos rutinarios en la técnica. Se utilizan una o más sondas, como se describe anteriormente, para explorar bibliotecas de productos de expresión o segmentos cromosómicos (por ejemplo, bibliotecas de expresión o bibliotecas genómicas) para identificar clones que incluyen secuencias idénticas a, o con similitud significativa de secuencia a, por ejemplo, una o más sondas de las secuencias de este documento, es decir, variantes, homólogos, etc. Se entenderá que además de dichos métodos físicos como exploración de bibliotecas, enfoques bioinformáticos asistidos por ordenador, por ejemplo, BLAST y otros algoritmos de búsqueda de homología de secuencia, y similares, también pueden usarse para identificar secuencias polinucleotídicas relacionadas.
Las sondas oligonucleotídicas se producen opcionalmente mediante una diversidad de métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica. Más típicamente, se producen por métodos sintéticos bien conocidos, tales como el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers (1981) Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, o como se describe en Needham-Van Devanter et al. (1984) Nucl Acids Res, 12:6159-6168. Los oligonucleótidos también pueden prepararse de forma personalizada y encargarse de una diversidad de fuentes comerciales conocidas para los especialistas en la técnica. La purificación de oligonucleótidos, cuando es necesaria, se realiza típicamente por electroforesis en gel de acrilamida nativo o por HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson y Regnier (1983) J Chrom 255:137-149. La secuencia de los oligonucleótidos sintéticos puede verificarse usando el método de degradación química de Maxam y Gilbert (1980) en Grossman and Moldave (eds.) Academic Press; Nueva York, Methods in Enzymology 65:499-560. También pueden encargarse fácilmente oligos personalizados de una diversidad de fuentes comerciales conocidas para los especialistas en la técnica.
En otras circunstancias, por ejemplo, con relación a los atributos de células u organismos que expresan los polinucleótidos y polipéptidos descritos en este documento (por ejemplo, aquellos que albergan virus que comprenden las secuencias descritas en este documento), se utilizan favorablemente sondas que son polipéptidos, péptidos o anticuerpos. Por ejemplo, se usan favorablemente polipéptidos aislados o recombinantes, fragmentos polipeptídicos y péptidos derivados de cualquiera de las secuencias aminoacídicas descritas en este documento (por ejemplo, SEQ ID Nos: 11-12) y/o codificadas por secuencias polinucleotídicas descritas en este documento, por ejemplo, seleccionadas entre la SEQ ID No: 1 o la SEQ ID No: 2, para identificar y aislar anticuerpos, por ejemplo, de bibliotecas de presentación de fagos, bibliotecas combinatorias, sueros policlonales, y similares. Los fragmentos polipeptídicos incluyen un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 10 restos aminoacídicos contiguos; o al menos 15 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 20 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 25 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 40 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 50 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 60 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 70 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 80 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 90 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 100 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 125 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 150 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 175 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 200 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 250 restos aminoacídicos contiguos, o al menos 350 contiguos, o al menos 400 contiguos, o al menos 450 contiguos, o al menos 500 contiguos, o al menos 550 restos aminoacídicos contiguos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido HA o NA descrito en este documento (por ejemplo, las SEQ ID Nos: 11-12). Los polinucleótidos que codifican dichos fragmentos polipeptídicos, y anticuerpos que se unen específicamente a dichos polipéptidos también se describen en este documento.
Los anticuerpos específicos para cualquier secuencia o subsecuencia polipeptídica, por ejemplo, de SEQ ID No: 11
o SEQ ID No: 12, y/o codificada por las secuencias polinucleotídicas de por ejemplo la SEQ ID No: 1 o la SEQ ID No: 2, son así mismo valiosos como sondas para evaluar productos de expresión, por ejemplo, de células o tejidos. Además, los anticuerpos son particularmente adecuados para evaluar la expresión de proteínas que comprenden subsecuencias de aminoácidos, por ejemplo, de las dadas en este documento, o codificadas por secuencias polinucleotídicas mostradas en este documento, in situ, en una serie tisular, en una célula, tejido u organismo, por ejemplo, un organismo infectado por un virus influenza no identificado o similares. Los anticuerpos pueden marcarse directamente con un reactivo detectable, o detectarse directamente por marcaje de un anticuerpo secundario específico para la región constante de cadena pesada (es decir, isotipo) del anticuerpo específico. Detalles adicionales respecto a la producción de anticuerpos específicos se proporcionan a continuación.
Ensayos de diagnóstico
Las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento pueden usarse en ensayos de diagnóstico para detectar la influenza (y/o hemaglutinina y/o neuraminidasa) en una muestra, para detectar secuencias tipo hemaglutinina y/o secuencias tipo neuraminidasa, y para detectar diferencias de cepas en aislados clínicos de la influenza usando fragmentos polinucleotídicos sintetizados químicamente o recombinantes, por ejemplo, seleccionados entre las secuencias de este documento. Por ejemplo, pueden usarse fragmentos de las secuencias de hemaglutinina y/o neuraminidasa que comprendan al menos entre 10 y 20 nucleótidos como cebadores para amplificar ácidos nucleicos usando métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR de transcripción inversa) y como sondas en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos para detectar material genético diana tal como ARN de la influenza en muestras clínicas.
Las sondas descritas en este documento, por ejemplo, como se ejemplifica por secuencias únicas seleccionadas entre las dadas en este documento, también pueden usarse para identificar secuencias polinucleotídicas útiles adicionales (tal como para caracterizar cepas adicionales de la influenza) de acuerdo con procedimientos rutinarios en la técnica. Se utilizan una o más sondas, como se ha descrito anteriormente, para explorar bibliotecas de productos de expresión o ácidos nucleicos virales clonados (es decir, bibliotecas de expresión o bibliotecas genómicas) para identificar clones que incluyen secuencias idénticas a, o con identidad de secuencia significativa con la secuencias de este documento. A su vez, cada una de estas secuencias identificadas puede usarse para preparar sondas, incluyendo pares o series de sondas variantes como se ha descrito anteriormente. Se entenderá que además de dichos métodos físicos como exploración de bibliotecas, enfoques bioinformáticos asistidos por ordenador, por ejemplo, BLAST y otros algoritmos de búsqueda de homología de secuencia, y similares, también pueden usarse para identificar secuencias polinucleotídicas relacionadas.
Las sondas descritas en este documento son particularmente útiles para detectar la presencia y para determinar la identidad de ácidos nucleicos de la influenza en células, tejidos u otras muestras biológicas (por ejemplo, un lavado nasal o lavado bronquial). Por ejemplo, las sondas descritas en este documento se utilizan favorablemente para determinar si una muestra biológica, tal como un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) o sistema modelo (tal como una muestra celular cultivada) se ha expuesto a, o se ha llegado a infectar con la influenza, o una cepa o cepas particulares de la influenza. La detección de hibridación de la sonda selecciona con ácidos nucleicos originados en (por ejemplo, aislados de) la muestra biológica o sistema modelo es indicativa de exposición a o infección con el virus (o un virus relacionado) del cual se selecciona el polinucleótido sonda.
Se apreciará que el diseño de la sonda está influenciado por la aplicación pretendida. Por ejemplo, cuando tienen que detectarse varias interacciones sonda especifica alelo-diana en un único ensayo, por ejemplo, en un único chip de ADN, es deseable tener temperaturas de fusión similares para todas las sondas. Por consiguiente, las longitudes de las sondas se ajustan de modo que las temperaturas de fusión para todas las sondas en la serie sean muy similares (se apreciará que puede necesitarse diferentes longitudes para diferentes sondas para conseguir una Tm particular cuando diferentes sondas tengan diferentes contenidos de GC). Aunque la temperatura de fusión es una consideración principal en el diseño de la sonda, se usan opcionalmente otros factores para ajustar adicionalmente la construcción de la sonda, tal como selección frente a autocomplementariedad de cebador y similares.
Vectores. Promotores y sistemas de expresión
En este documento también se describen construcciones recombinantes que incorporan una o más de las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento. Dichas construcciones incluyen opcionalmente un vector, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), etc., en la que se ha insertado una o más de las secuencias polinucleotídicas, por ejemplo, de la SEQ ID No: 1 o la SEQ ID No: 2, o una subsecuencia de las mismas, etc., en una orientación directa o inversa. Por ejemplo, el ácido nucleico insertado puede incluir una secuencia cromosómica viral o ADNc que incluye todo o parte de al menos una de las secuencias polinucleotídicas descritas en este documento. En un ejemplo, la construcción comprende adicionalmente secuencias reguladoras, incluyen, por ejemplo, un promotor, unido de forma funcional a la secuencia. Se conocen grandes cantidades de vectores y promotores adecuados por los especialistas en la técnica, y están disponibles en el mercado.
Los polinucleótidos pueden incluirse en uno cualquiera de una diversidad de vectores adecuados para generar ARN con sentido o antisentido, y opcionalmente, productos de expresión de polipéptidos (o péptidos) (por ejemplo, una molécula de hemaglutinina y/o neuraminidasa descrita en este documento). Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivadas de SV40; plásmidos bacterianos; ADN fágico; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fágico, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorrabia, adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus y muchos otros (por ejemplo, pCDL). Puede usarse cualquier vector que sea capaz de introducir material genético en una célula, y, si se desea la replicación, que sea replicable en el hospedador relevante.
En un vector de expresión, la secuencia polinucleotídica de HA y/o NA de interés se dispone físicamente en proximidad y orientación a una secuencia de control de la transcripción apropiada (por ejemplo, promotor, y opcionalmente, uno o más potenciadores) para dirigir la síntesis de ARNm. Es decir, la secuencia polinucleotídica de interés se une de forma funcional a una secuencia de control de la transcripción apropiada. Ejemplos de dichos promotores incluyen: el promotor LTR o SV40, el promotor lac o trp de E. coli, el promotor PL del fago lambda, y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus.
Es adecuada una diversidad de promotores para su uso en vectores de expresión para regular la transcripción de segmentos genómicos del virus influenza. En ciertas realizaciones, se utiliza el promotor de la ARN polimerasa II (Pol II) dependiente de ADN de citomegalovirus (CMV). Si se desea, por ejemplo, para regular la expresión condicional, pueden sustituirse otros promotores que inducen la transcripción de ARN en las condiciones especificadas, o en los tejidos o células especificados. Están disponibles numerosos promotores virales y de mamífero, por ejemplo, de seres humanos, o pueden aislarse de acuerdo con la aplicación específica contemplada. Por ejemplo, promotores alternativos obtenidos de los genomas de virus animales y humanos incluyen promotores tales como el promotor de adenovirus (tal como adenovirus 2), el virus del papiloma, virus de la hepatitis B, polioma virus, y el virus de simio 40 (SV40), y diversos promotores retrovirales. Los promotores de mamífero incluyen, entre muchos otros, el promotor de la actina, promotores de inmunoglobulina, promotores de choque térmico, y similares.
La transcripción se aumenta opcionalmente incluyendo una secuencia potenciadora. Los potenciadores son típicamente elementos de ADN cortos, por ejemplo, de 10-500 pb, de acción en cis que actúan en concierto con un promotor para aumentar la transcripción. Se han aislado muchas secuencias potenciadores de genes de mamífero (hemoglobina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína, e insulina), y virus de células eucariotas. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia codificante heteróloga, pero típicamente se inserta en un sitio 5' al promotor. Típicamente, el promotor, y si se desea, las secuencias potenciadoras de la transcripción adicional se eligen para optimizar la expresión en un tipo de célula hospedadora en la que tiene que introducirse el ADN heterólogo (Scharf et al (1994) Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:12562; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 512-27). Opcionalmente, el amplicón también puede contener un sitio de unión al ribosoma o un sitio de entrada interno del ribosoma (IRES) para el inicio de la traducción.
Los vectores descritos en este documento también incluyen favorablemente secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm, tal como un sitio de poliadenilación o una secuencia terminadora. Dichas secuencias están habitualmente disponibles desde regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADN o ADNc eucariotas o virales. Las secuencias de la señal de poliadenilación de SV40 pueden proporcionar un sitio de poliadenilación bidireccional que aísla la transcripción de moléculas de ARNm de cadena (+) desde el promotor PolI que inicia la replicación del genoma viral de cadena (-).
Además, como se ha descrito anteriormente, los vectores de expresión incluyen opcionalmente uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas, además de los genes previamente enumerados, marcadores tales como la dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina son adecuados para la selección en cultivo celular eucariota.
El vector que contiene la secuencia de ácido nucleico apropiada como se ha descrito anteriormente, así como un promotor o secuencia de control apropiada, pueden emplearse para transformar una célula hospedadora que permita la expresión de la proteína. Aunque los vectores descritos en este documento pueden replicarse en células bacterianas, más frecuentemente será deseable introducirlos en células de mamífero, por ejemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células 239, células COS, o similares, para propósitos de expresión.
Como se describe en alguna otra parte, las secuencias HA y NA de este documento pueden estar comprendidas dentro de plásmidos implicados en reagrupación de rescate de plásmidos. Véase, por ejemplo, el documento US 2004 029251 y el documento US 2005 042229. Por ejemplo, vectores de expresión preferidos descritos en este documento incluyen, aunque sin limitación, vectores que comprenden el promotor de pol I y las secuencias terminadoras o vectores que usan los promotores tanto pol I como pol II "el sistema promotor polI/polIII" (por ejemplo, Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607; documento US20020164770; Neumann et al., Proc. Natal.
Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; y el documento US20030035814). Los reagrupados producidos pueden incluir los genes HA y NA dispuestos con los otros 6 genes de la influenza de la cepa donante A/Ann Arbor/6/60 (y/o derivados y modificaciones de la misma), la estructura de cepa donante PR8, la estructura de cepa donante A/Leningtad/17, etc. Otras cepas estructurales se describen, por ejemplo, en el documento US20040137013 y el documento US20030147916.
Elementos adicionales de expresión
Más habitualmente, el segmento genómico que codifica la proteína HA y/o NA del virus influenza incluye cualquier secuencia adicional necesaria para su expresión, incluyendo la traducción en una proteína viral funcional. En otras situaciones, puede emplearse un minigén, u otra construcción artificial que codifique las proteínas virales, por ejemplo, una proteína HA y/o NA. De nuevo, en dicho caso, a menudo es deseable incluir señales de inició específicas que ayuden en la traducción eficaz de la secuencia codificante heteróloga. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Para asegurar la traducción del inserto completo, el codón de inicio se inserta en la fase de lectura correcta relativa a la proteína viral. Los elementos transcripciones exógenos y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse por la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso.
Si se desea, pueden incorporarse secuencias polinucleotídicas que codifican elementos expresados adicionales, tales como secuencias señal, secuencias de secreción o localización, y similares en el vector, habitualmente, en fase con la secuencia polinucleotídica de interés, por ejemplo, para dirigir la expresión del polipéptido a un compartimento, membrana, u orgánulo celular deseado, o para dirigir la secreción de los polipéptidos al espacio periplásmico o en el medio de cultivo celular. Dichas secuencias son conocidas para los especialistas en la técnica, e incluyen péptidos líder de secreción, secuencias de dirección a orgánulos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención del RE, secuencias de tránsito mitocondrial), secuencias de localización/anclaje a membrana (por ejemplo, secuencias de transferencia de detención, secuencias de anclaje a GPI), y similares.
Cuando se desea la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico descrita en este documento, señales de inicio específicas de traducción adicionales pueden mejorar la eficacia de traducción. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, un codón de inicio ATG y secuencias adyacentes, una región IRES, etc. En algunos casos, por ejemplo, se insertan moléculas de ADNc de longitud completa o segmentos cromosómicos que incluyen una secuencia codifican que incorpora, por ejemplo, una secuencia polinucleotídica descrita en este documento, un codón de inicio de la traducción y elementos de secuencia asociados en el vector de expresión apropiado simultáneamente con la secuencia polinucleotídica de interés. En dichos casos, frecuentemente no se requieren señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en casos en que se inserta solamente una secuencia codificante de polipéptido, o una parte de la misma, a menudo se proporcionan señales de control de la traducción exógenas incluyendo, por ejemplo, un codón de inicio ATG para la expresión de la secuencia relevante. El codón de inicio se pone en la correcta fase de lectura para asegurar la transcripción de la secuencia polinucleotídica de interés. Los elementos transcripcionales exógenos y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse por la inclusión de potenciadores apropiados al sistema celular en uso (véase, por ejemplo, Scharf D. et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).
Producción de virus recombinante
Pueden diseñarse por ingeniería genética virus ARN de cadena negativa y recuperarse usando un enfoque de genética inversa recombinante (véase, por ejemplo, USPN 5.166.057 de Palese et al.). Dicho método se aplicó originalmente para diseñar genomas virales de la influenza (Luytjes et al. (1989) Cell 59:1107-1113; Enami et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567), y se ha aplicado satisfactoriamente a una amplia diversidad de virus ARN de cadena negativa segmentados y no segmentados, por ejemplo, el virus de la rabia (Schnell et al. (1994) EMBO J. 13: 4195-4203); VSV (Lawson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481); virus del sarampión (Radecke et al. (1995) EMBO J. 14:5773-5784); el virus de la peste bovina (Baron y Barrett (1997) J. Virol. 71: 1265-1271); virus de la parainfluenza humana (Hoffman y Banerjee (1997) J. Virol. 71: 3272-3277; Dubin et al. (1997) Virology 235:323-332); SV5 (He et al. (1997) Virology 237:249-260); virus del moquillo canino (Gassen et al. (2000) J. Virol. 74:10737-44); y virus Sendai (Park et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537-5541; Kato et al. (1996) Genes to Cells 1:569-579). Los especialistas en la técnica estarán familiarizados con éstas y técnicas similares para producir un virus influenza que comprenda las secuencias HA y NA descritas en este documento. Los virus influenza recombinantes producidos de acuerdo con dichos métodos son una característica de la descripción así como virus influenza recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos y/o polipéptidos descritos en este documento.
Cultivo celular y hospedadores de expresión
En este documento también se describen células hospedadoras que se introducen (transducen, transforman o transfectan) con vectores descritos en este documento, y la producción de polipéptidos descritos en este documento por técnicas recombinantes. Las células hospedadoras están modificadas por ingeniería genética (es decir, transducidas, transformadas o transfectadas) con un vector, tal como un vector de expresión. Como se ha descrito anteriormente, el vector puede estar en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Ejemplos de hospedadores de expresión apropiados incluyen: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Neurospora crassa; o células de insecto tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda.
Más habitualmente, se usan células de mamífero para cultivar las moléculas HA y NA descritas en este documento. Las células hospedadoras adecuadas para la replicación de virus influenza incluyen, por ejemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células 293 y células COS, incluyendo células 293T, células COS7 o similares. Habitualmente, se emplean co-cultivos que incluyen dos de las anteriores líneas celulares, por ejemplo, células MDCK y células 293T o COS a una proporción, por ejemplo, de 1:1, para mejorar la eficacia de replicación. Típicamente, las células se cultivan en un medio de cultivo comercial convencional, tal como medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero (por ejemplo, suero bovino fetal al 10%), o en medio sin suero, en humedad y concentración de CO2 controladas adecuadas para mantener el pH tamponado neutro (por ejemplo, a pH entre 7,0 y 7,2). Opcionalmente, el medio contiene antibióticos para evitar el crecimiento bacteriano, por ejemplo, penicilina, estreptomicina, etc., y/o nutrientes adicionales, tales como L-glutamina, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales, suplementos adicionales para promover las características de crecimiento favorables, por ejemplo, tripsina, 1-mercaptoetanol, y similares.
Las células hospedadoras modificadas por ingeniería pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar las secuencias polinucleotídicas insertadas. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son típicamente las usadas previamente con la célula hospedadora particular seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los especialistas en la técnica y en las referencias citadas en este documento, incluyendo, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3ª edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en ese documento. Otras referencias de ayuda incluyen, por ejemplo, Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5ª ed., Livingston, Edimburgo; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam. Detalles adicionales respecto a procedimientos de cultivo tisular de particular interés en la producción de virus influenza in vitro incluyen, por ejemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. En Cohen and Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. Además, se determinan fácilmente variaciones en dichos procedimientos adaptadas a la presente descripción a través de experimentación rutinaria y serán conocidas para los especialistas en la técnica.
Las células para la producción de virus influenza (por ejemplo, que tiene las secuencias HA y/o NA de la descripción) pueden cultivarse en medio que contiene suero o libre de suero. En algunos casos, por ejemplo, para la preparación de virus purificados, típicamente es deseable cultivar las células hospedadoras en condiciones libres de suero. Las células pueden cultivarse a pequeña escala, por ejemplo, menos de 25 ml de medio, tubos o matraces de cultivo o en matraces grandes con agitación; en frascos rotatorios, o en microperlas de vehículo (por ejemplo, microperlas de vehículo DEAE-Dextrano, tales como Dormacell, Pfeifer y Langen; Superbead, Flow Laboratories; perlas de copolímero de estireno-trimetilamina, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) en matraces, frascos o cultivos en reactor. Las microperlas de vehículo son esferas pequeñas (en el intervalo de 100-200 micrómetros de diámetro) que proporcionan una gran área superficial para el crecimiento celular adherente por volumen de cultivo celular. Por ejemplo, un único litro de medio puede incluir más de 20 millones de microperlas de vehículo que proporcionan más de 8000 centímetros cuadrados de superficie de cultivo. Para producción comercial de virus, por ejemplo, para la producción de vacunas, a menudo es deseable cultivar las células en un biorreactor o fermentador. Los biorreactores están disponibles en volúmenes de por debajo de 1 litro hasta en exceso de 100 litros, por ejemplo, biorreactor Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN); biorreactores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, NJ); biorreactores de laboratorio y de escala comercial de B. Braun Biotech international (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania).
Independientemente del volumen de cultivo, en muchos aspectos deseados de la presente descripción, es importante que los cultivos se mantengan a una temperatura apropiada, para asegurar la recuperación eficaz de virus influenza recombinante y/o reagrupado usando sistemas multi plásmido dependientes de temperatura (véase, por ejemplo, Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus, documento US 2004 029251), calentamiento de las soluciones de virus para filtración, etc. Típicamente, se emplea un regulador, por ejemplo, un termostato, u otro dispositivo para detectar y mantener la temperatura del sistema de cultivo celular y/u otra solución, para asegurar que la temperatura está al nivel correcto durante el periodo apropiado (por ejemplo, replicación del virus, etc.).
En la descripción de este documento (por ejemplo, cuando tienen que producirse virus reagrupados a partir de segmentos en vectores) se introducen vectores que comprenden segmentos del genoma de la influenza (por ejemplo, se transfectan) en células hospedadoras de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos heterólogos en células eucariotas incluyendo, por ejemplo, co-precipitación con fosfato cálcico, electroporación, microinyección, lipofección, y transfección empleando reactivos de transfección con poliamina. Por ejemplo, pueden introducirse por transfección vectores, por ejemplo, plásmidos, en células hospedadoras, tales como células COS, células 293T o combinaciones de células COS o 293T y células MDCK, usando el reactivo de transfección con poliamina TransIT-LT1 (Mirus) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para producir virus reagrupados, etc. Por tanto, en un ejemplo, se introduce aproximadamente 1 !g de cada vector en una población de células hospedadoras con aproximadamente 2 !l de TransIT-LT1 diluido en 160 !l de medio, preferiblemente medio libre de suero, en un volumen total de 200 !l. Las mezclas de ADN:reactivo de transfección se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos seguido de la adición de 800 !l de medio. La mezcla de transfección se añade a las células hospedadoras, y las células se cultivan como se ha descrito mediante otros métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica. Por consiguiente, para la producción de virus recombinantes o reagrupados en cultivo celular, se mezclan vectores que incorporan cada uno de los 8 segmentos genómicos (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA) con aproximadamente 20 !l de TransIT-LT1 y se introducen por transfección en células hospedadoras. Opcionalmente, se remplaza el medio que contiene suero antes de la transfección con medio libre de suero, por ejemplo, Opti-MEM I, y se incuba durante 4-6 horas.
Como alternativa, puede emplearse electroporación para introducir dichos vectores que incorporan segmentos genómicos de la influenza en células hospedadoras. Por ejemplo, se introducen favorablemente vectores plasmídicos que incorporan un virus influenza A o influenza B en células Vero usando electroporación de acuerdo con el siguiente procedimiento. En resumen, se resuspenden aproximadamente 5 x 106 células Vero, por ejemplo, cultivadas en medio de Eagle modificado (MEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% en 0,4 ml de OptiMEM y se colocan en una cubeta de electroporación. Se añaden veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 !l a las células en la cubeta, que después se mezcla suavemente por golpeteo. La electroporación se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, BioRad Gene Pulser II con Capacitance Extender Plus conectado) a 300 voltios, 950 microFaraday con una contante de tiempo entre 28-33 msegundos. Estas células se vuelven a mezclar por golpeteo suave y aproximadamente 1-2 minutos después de la electroporación se añaden 0,7 ml MEM con FBS al 10% directamente a la cubeta. Las células después se transfieren a dos pocillos de una placa de cultivo tisular convencional de 6 pocillos que contiene 2 ml de MEM, FBS al 10%. La cubeta se lava para recuperar cualquier célula restante y la suspensión de lavado se divide entre los dos pocillos. El volumen final es aproximadamente 3,5 ml. Las células después se incuban en condiciones permisivas para el crecimiento viral, por ejemplo, a aproximadamente 33ºC para cepas adaptadas al frío.
En células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión, tales como sistemas basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, se liga opcionalmente una secuencia codificante en un complejo de transcripción/traducción adenoviral que consta del promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral producirá un virus viable capaz de expresar los polipéptidos de interés en células hospedadoras infectadas (Logan y Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 81:3655-3659). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de rous (RSV), para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
Una cepa celular hospedadora se elige opcionalmente por su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o de procesar la proteína expresada del modo deseado. Dichas modificaciones de la proteína incluyen, aunque sin limitación, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento post-traduccional, que escinde una forma precursora en una forma madura, de la proteína, a veces es importante para la correcta inserción, plegamiento y/o función. Además, también es importante la apropiada localización dentro de una célula hospedadora (por ejemplo, sobre la superficie celular). Diferentes células hospedadoras tales como COS, CHO, BHK, MDCK, 293, 293T, COS7, etc. tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades post-traduccionales y pueden elegirse para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la presente proteína foránea introducida.
Para producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes codificadas por, o que tienen subsecuencias codificadas por, los polinucleótidos descritos en este documento, se usan opcionalmente sistemas de expresión estables. Por ejemplo, se transfectan líneas celulares, que expresan de forma estable un polipéptido descrito en este documento, usando vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador de selección. Por ejemplo, después de la introducción del vector, se deja que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a medio selectivo. El propósito del marcador de selección es conferir resistencia para la selección, y su presencia permite el cultivo y recuperación de células que expresan de forma satisfactoria las secuencias introducidas. Por tanto, los grupos resistentes de células transformadas de forma estable, por ejemplo, derivadas de un único tipo celular, pueden proliferarse usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo celular.
Las células hospedadoras transformadas con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en este documento, se cultivan opcionalmente en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. Las células que expresan dicha proteína pueden clasificarse, aislarse y/o purificarse. La proteína o fragmento de la misma producida por una célula recombinante puede estar secretada, unida a membrana, o retenida de forma intracelular, dependiendo de la secuencia (por ejemplo, dependiendo de proteínas de fusión que codifican una señal de retención en membrana o similares) y/o el vector usado.
También pueden producirse productos de expresión correspondientes a los ácidos nucleicos descritos en este documento en células no animales tales como plantas, levaduras, hongos, bacterias y similares. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, todos infra, pueden encontrarse detalles respecto al cultivo celular en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el producto expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de un polipéptido o fragmentos del mismo para la producción de anticuerpos, se usan favorablemente vectores que dirigen una expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, aunque sin limitación, vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia codificante de interés, por ejemplo, secuencias que comprenden las encontradas en este documento, etc., pueden ligarse en el vector en fase con secuencias para la metionina de inicio de la traducción amino-terminal y los posteriores 7 restos de betagalactosidasa que codifican una proteína de fusión beta galactosidasa catalíticamente activa; vectores pIN (Van Heeke y Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison WI); y similares. Asimismo, en la levadura Saccharomyces cerevisiae pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH para la producción de los productos de expresión deseados. Para revisiones, véase Ausubel, infra, y Grant et al., (1987); Methods in Enzymology 153:516-544.
Hibridación de ácidos nucleicos
Puede usarse hibridación comparativa para identificar ácidos nucleicos (por ejemplo, SEQ ID Nos: 1-2), incluyendo variaciones conservativas de ácidos nucleicos descritos en este documento. Este método de hibridación comparativa es un método preferido para distinguir ácidos nucleicos. Además, los ácidos nucleicos diana que hibridan con los ácidos nucleicos representados por los mostrados en este documento en condiciones de rigurosidad elevada, ultraelevada y ultra-ultra-elevada son características de la descripción. Ejemplos de dichos ácidos nucleicos incluyen aquellos con una o unas pocas sustituciones silenciosas o conservativas de ácido nucleico en comparación con una secuencia de ácido nucleico dada.
Se dice que un ácido nucleico diana de ensayo hibrida específicamente con un ácido nucleico sonda cuando hibrida al menos la mitad de bien con la sonda que con la diana complementaria perfectamente apareada, es decir, con una proporción señal a ruido de al menos la mitad de elevada que la hibridación de la sonda y la diana en condiciones en que una sonda perfectamente apareada se une a una diana complementaria perfectamente apareada con una proporción señal a ruido que es al menos aproximadamente 5x-10x de elevada que la observada para la hibridación con cualquiera de los ácidos nucleicos diana no apareados.
Los ácidos nucleicos "hibridan" cuando se asocian, típicamente en solución. Los ácidos nucleicos hibridan debido a una diversidad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. Numerosos protocolos para la hibridación de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Se encuentra una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" (Elsevier, Nueva York), así como en Ausubel, Sambrook, y Berger y Kimmel, todos a continuación. Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, (Hames y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 2) proporcionan detalles sobre la síntesis, marcaje, detección y cuantificación de ADN y ARN, incluyendo oligonucleótidos.
Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o Northern es formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, realizándose la hibridación durante una noche. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas comprende un lavado con SSC 0,2x a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, infra para una descripción del tampón SSC y otros parámetros de hibridación de ácidos nucleicos). A menudo el lavado de alta rigurosidad está precedido por un lavado de baja rigurosidad para retirar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad es SSC 2x a 40ºC durante 15 minutos. En general, una proporción señal a ruido de 5x (o mayor) a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica.
Después de la hibridación, pueden retirarse los ácidos nucleicos no hibridados por una serie de lavados, cuya rigurosidad puede ajustarse dependiendo de los resultados deseados. Las condiciones de lavado de baja rigurosidad (por ejemplo, usando salinidad mayor y temperatura inferior) aumentan la sensibilidad, pero pueden producir señales de hibridación no específicas y altas señales de fondo. Condiciones de mayor rigurosidad (por ejemplo, usando menor salinidad y mayor temperatura que está más cerca de la Tm) disminuyen la señal de fondo, típicamente dejando principalmente la señal específica. Véase, también, Rapley, R. y Walker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook (Humana Press, Inc. 1998).
"Condiciones rigurosas de lavado de hibridación" en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridaciones de Southern y Northern son dependientes de secuencia, y son diferentes en diferentes parámetros ambientales. Se encuentra una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993), supra, y en Hames y Higgins, 1 y 2. Las condiciones rigurosas de hibridación y lavado pueden determinarse fácilmente de forma empírica para cualquier ácido nucleico de ensayo. Por ejemplo, en la determinación de condiciones altamente rigurosas de hibridación y lavado, se aumentan gradualmente las condiciones de lavado e hibridación (por ejemplo, aumentando la temperatura, disminuyendo la concentración salina, aumentando la concentración de detergente y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos tales como formalina en la hibridación o lavado), hasta que se cumpla una serie seleccionada de criterios. Por ejemplo, las condiciones de hibridación y lavado se aumentan gradualmente hasta que una sonda se une a una diana complementaria completamente apareada con una proporción señal a ruido que es al menos 5x tan elevada como la observada para la hibridación de la sonda con una diana no apareada.
En general, una proporción señal a ruido de al menos 2x (o mayor, por ejemplo, al menos 5x, 10x, 20x, 50x, 100x, o más) la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica. La detección de al menos hibridación rigurosa entre dos secuencias en el contexto de la presente descripción indica similitud estructural relativamente fuerte con, por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionados en la lista de secuencias de este documento.
Las condiciones "muy rigurosas" se seleccionan para igualar el punto de fusión térmico (Tm) para una sonda particular. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia de ensayo hibrida con una sonda perfectamente apareada. Para los propósitos de la presente descripción, generalmente, las condiciones "altamente rigurosas" de hibridación y lavado se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferiores a la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos (como se indica a continuación, condiciones altamente rigurosas también pueden mencionarse en términos comparativos). Las secuencias diana que están muy relacionadas o son idénticas a la secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, "sonda") pueden identificarse en condiciones rigurosas o altamente rigurosas. Condiciones de rigurosidad inferior son apropiadas para secuencias que son menos complementarias.
Las condiciones "de rigurosidad ultra-elevada" de hibridación y lavado son aquellas en que la rigurosidad de las condiciones de hibridación y lavado se aumentan hasta que la proporción señal a ruido para la unión de una sonda a un ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado es al menos 10x tan elevada como la observada para la hibridación a cualquier ácido nucleico diana no apareado. Un ácido nucleico diana que hibrida con una sonda en dichas condiciones, con una proporción señal a ruido de al menos la mitad de la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado, se dice que se une a la sonda en condiciones de rigurosidad ultraelevada.
En la determinación de condiciones rigurosas o altamente rigurosas de hibridación (o incluso hibridación más rigurosas) y lavado, se aumentan gradualmente las condiciones de hibridación y lavado (por ejemplo, aumentando la temperatura, disminuyendo la concentración salina, aumentando la concentración de detergente y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos, tales como formamida, en la hibridación o el lavado), hasta que se cumpla una serie seleccionada de criterios. Por ejemplo, las condiciones de hibridación y lavado se aumentan gradualmente hasta que una sonda que comprende una o más secuencias polinucleotídicas de la descripción, por ejemplo, secuencias o subsecuencias únicas seleccionadas entre las dadas en este documento (por ejemplo, SEQ ID Nos: 12) y/o secuencias polinucleotídicas complementarias, se une a una diana complementaria perfectamente apareada (de nuevo, un ácido nucleico que comprende una o más secuencias o subsecuencias de ácido nucleico seleccionadas entre las dadas en este documento y/o secuencias polinucleotídicas complementarias de las mismas), con una proporción señal a ruido que es al menos 2x (y opcionalmente 5x, 10x, o 100x o más) tan elevada como la observada para la hibridación de la sonda con una diana no apareada (por ejemplo, una secuencia polinucleotídica que comprende una o más secuencias o subsecuencias seleccionadas entre secuencias de la influenza conocidas presentes en bases de datos públicas tales como GenBank en el momento de la presentación, y/o secuencias polinucleotídicas complementarias de las mismas), según se desee.
Usando los polinucleótidos descritos en este documento o subsecuencias de los mismos, pueden obtenerse nuevos ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, dichos ácidos nucleicos diana incluyen secuencias que hibridan en condiciones rigurosas con una sonda oligonucleotídica única correspondiente a cualquiera de los polinucleótidos de, por ejemplo, las SEQ ID Nos: 1-2).
Asimismo, pueden determinarse niveles de rigurosidad incluso más elevados aumentando gradualmente las condiciones de hibridación y/o lavado del ensayo de hibridación relevante. Por ejemplo, aquellos en los que la rigurosidad de las condiciones de hibridación y lavado se aumentan hasta que la proporción señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico complementario perfectamente apareado es al menos 10X, 20X, 50X, 100X, o 500X o más tan elevado como la observada para la hibridación a cualquier ácido nucleico diana no apareado. La señal particular dependerá del marcador usado en el ensayo relevante, por ejemplo, un marcador fluorescente, un marcador colorimétrico, un marcador radiactivo, o similares. Un ácido nucleico diana que hibrida con una sonda en dichas condiciones, con una proporción señal a ruido de al menos la mitad de la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado, se dice que se une a la sonda en condiciones de rigurosidad ultra-ultraelevada.
Ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas aún son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético.
Clonación, mutagénesis y expresión de biomoléculas de interés
Textos generales que describen técnicas de biología molecular, que son aplicables a la presente invención, tales como clonación, mutación, cultivo celular y similares, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado a través de 2002) ("Ausubel")). Estos textos describen la mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros asuntos relevantes relacionados con, por ejemplo, la generación de moléculas HA y/o NA, etc.
También se describen en este documento diversos tipos de mutagénesis, por ejemplo, para producir y/o aislar, por ejemplo, moléculas HA y/o NA nuevas o recién aisladas y/o para modificar/mutar adicionalmente los polipéptidos (por ejemplo, moléculas HA y NA como en las SEQ ID Nos: 11-12) descritos en este documento. Incluyen, aunque sin limitación, mutagénesis aleatoria dirigida al sitio, recombinación homóloga (arrastre de ADN), mutagénesis usando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato, mutagénesis usando ADN dúplex con huecos o similares. Métodos adecuados adicionales incluyen reparación de desapareamientos puntuales, mutagénesis usando cepas hospedadoras deficientes de la reparación, selección por restricción y purificación por restricción, mutagénesis por deleción, mutagénesis por síntesis génica total, reparación de rotura de la doble cadena, y similares. También se describe en este documento mutagénesis, por ejemplo, que implica construcciones quiméricas. La mutagénesis puede estar guiada por información conocida de la molécula de origen natural o molécula de origen natural alterada o mutada, por ejemplo, secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura cristalina o similares.
Los textos anteriores y los ejemplos encontrados en este documento describen estos procedimientos así como las siguientes publicaciones (y referencias citadas en las mismas): Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:436-460 (2001); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the fosforotioate method, Methods Mol Biol 57:369-374 (1996);
I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res 23, 3067-8 (1995); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Fritz et al., Oligonucleotidedirected construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl Acids Res 16: 7207 (1988); Sakamar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl Acids Res 14: 6361-6372 (1988); Sayers et al., Y-T Exonucleases in fosforotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of fosforotioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl Acids Res 16: 803-814; Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol 154: 382-403 (1987); Kramer y Fritz Oligonucleolide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367 (1987); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol 154, 367-382 (1987); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol 154:329-350 (1987); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh y Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl Acids Res 14: 5115 (1986); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc Natl Acad Sci USA, 83:7177-7181 (1986); Nakamaye y Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I c/eavage by fosforotioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 14: 9679-9698 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil Trans R Soc Lond A 317: 415-423 (1986); Botstein y Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl Acids Res 13: 4431-4443 (1985); Grundström et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl Acids Res 13: 3305-3316 (1985); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492 (1985); Smith, In vitro mutagenesis, Ann Rev Genet 19:423-462(1985); Taylor et al., The use of fosforotioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using fosforotioatemodified DNA, Nucl Acids Res 13: 8765-8787 (1985); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl Acids Res 12: 94441-9456 (1984); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned in M13 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); y Zoller y Smith, Oligonucleotidedirected mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucl Acids Res 10:6487-6500 (1982). Pueden encontrarse detalles adicionales de muchos de los métodos anteriores en Methods in Enzymol Volumen 154, que también describe controles útiles para solucionar problemas con diversos métodos de mutagénesis, aislamiento de genes, expresión, y otros métodos.
Los oligonucleótidos, por ejemplo, para su uso en mutagénesis, por ejemplo, mutar bibliotecas de las moléculas HA y/o NA, o alterarlas, se sintetizan típicamente de forma química de acuerdo con el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862, (1981) por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984).
Además, puede encargarse esencialmente cualquier ácido nucleico personalizado o convencional de cualquiera de una diversidad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com). The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchas otras. Asimismo, pueden encargarse péptidos y anticuerpos personalizados de cualquiera de una diversidad de fuentes, tales como PeptidoGenic (disponible en pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (www.htibio.com), BMA Biomedicals Ltd. (R.U.), Bio.Synthesis, Inc., y muchas otras.
En este documento también se describen células hospedadoras y organismos que comprenden una molécula HA y/o NA u otro polipéptido y/o ácido nucleico, por ejemplo, las SEQ ID Nos: 1-2. Las células hospedadoras se diseñan por ingeniería genética (por ejemplo, se transforman, transducen o transfectan con los vectores descritos en este documento, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo, en forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo, o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos por métodos convencionales incluyendo electroporación (véase, From et al., Proc-Natl Acad Sci USA 82, 5824 (1985), infección por vectores virales, penetración balística a alta velocidad por pequeñas partículas con el ácido nucleico dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas, o sobre la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)). Berger, Sambrook, y Ausubel proporcionan una diversidad de métodos apropiados de transformación. Véase, anteriormente.
Están disponibles varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos diana en células bacterianas,cualquiera de los cuales puede usarse en la presente invención. Éstos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporación, bombardeo de proyectiles, e infección con vectores virales, etc. Pueden usarse células bacterianas para amplificar la cantidad de plásmidos que contienen construcciones de ADN de esta invención. Las bacterias se cultivan hasta fase log y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook). Además, está disponible una plétora de kits en el mercado para la purificación de plásmidos de bacterias (véase, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; y, QIAprep™ de Qiagen). Los plásmidos aislados y purificados después se manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, se usan para transfectar células o se incorporan en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de inicio de la transcripción y la traducción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores opcionalmente comprenden casetes genéricos de expresión que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del casete en eucariotas, o procariotas, o ambos (por ejemplo, vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procariotas como eucariotas. Los vectores son adecuados para la replicación e integración en procariotas, eucariotas, u opcionalmente ambos. Véase, Giliman y Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr Purif 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra). Se proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para clonación, por ejemplo, por la ATCC, por ejemplo, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds.) publicado por la ATCC. También se encuentran procedimientos básicos adicionales para secuenciación, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes en Watson et al. (1992) Recombinant DNA Segunda Edición Scientific American Books, NY. Véase, anteriormente. Anteriormente se han ilustrado vectores adicionales útiles con las secuencias de este documento en la sección referente a la producción de virus influenza para vacunas y las referencias citadas en la misma.
Producción y recuperación de polipéptido
Después de la transducción de una línea o cepa celular hospedadora adecuada y el cultivo de las células hospedadoras hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce por un medio apropiado (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. En algunas realizaciones, después se recupera un producto polipeptídico secretado, por ejemplo, un polipéptido HA y/o NA como en una forma de proteína de fusión secretada, etc., del medio de cultivo. En otras realizaciones, se produce una partícula viral de la invención que contiene una HA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11 y un polipéptido NA a partir de la célula. Como alternativa, las células pueden recogerse por centrifugación, alterarse por un medio físico o químico, y retenerse el extracto bruto resultante para purificación adicional. Las células eucariotas o microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden alterarse por cualquier método conveniente, incluyendo sonicación por ciclos de congelación-descongelación, alteración mecánica, o uso de agentes de lisis celular, u otros métodos, que son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Además, las células que expresan un producto polipeptídico HA y/o a NA descrito en este documento pueden utilizarse sin separar el polipéptido de la célula. En dichas situaciones, el polipéptido se expresa opcionalmente sobre la superficie celular y se examina de este modo (por ejemplo, teniendo moléculas HA y/o NA (o por ejemplo, comprendiendo proteínas de fusión o similares) sobre la superficie celular de unión a anticuerpos, etc.
Los polipéptidos expresados pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando cualquiera de los sistemas de marcaje conocidos para los especialistas en la técnica), cromatografía con hidroxilapatita, y cromatografía con lectina. Pueden usarse etapas de replegamiento proteico, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Además, puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en las etapas de purificación finales. Además de las referencias indicadas en este documento, es bien conocida en la técnica una diversidad de métodos de purificación, incluyendo, por ejemplo, los expuestos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2ª Edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3ª Edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.
Cuando los polipéptidos expresados se producen en virus, los virus se recuperan típicamente del medio de cultivo, en el que se han cultivado las células infectadas (transfectadas). Típicamente, el medio bruto se aclara antes de la concentración de los virus influenza. Los métodos comunes incluyen ultrafiltración, adsorción sobre sulfato de bario y elución, y centrifugación. Por ejemplo, el medio bruto de cultivos infectados puede primero aclararse por centrifugación a, por ejemplo, 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para retirar los desechos celulares y otra materia particulada grande, por ejemplo, entre 10 y 30 minutos. Opcionalmente, el sobrenadante del medio aclarado después se centrifuga para sedimentar los virus influenza, por ejemplo, a 15,000 x g, durante aproximadamente 3-5 horas. Después de la resuspensión del sedimento de virus en un tampón apropiado, tal como STE (Tris-HCl 0,01 M; NaCl 0,15 M; EDTA 0,0001 M) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, se concentra el virus por centrifugación en gradiente de densidad sobre sacarosa (60%-12%) o tartrato de potasio (50%-10%). Son adecuados gradientes continuos o por etapas, por ejemplo, un gradiente de sacarosa entre el 12% y el 60% en cuatro etapas del 12%. Los gradientes se centrifugan a una velocidad, y durante un tiempo, suficientes para que los virus se concentren en una banda visible para su recuperación. Como alternativa, y para la mayoría de las aplicaciones comerciales a gran escala, el virus se somete a elutriación a partir de gradientes de densidad usando un rotor de centrífuga zonal que funciona en modo continuo. Se proporciona detalles adicionales suficientes para guiar a los especialistas en la técnica a través de la preparación de virus influenza a partir de cultivo tisular, por ejemplo, en Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pág. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen y Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pág. 141-151, y la patente de Estados Unidos nº 5.690.937. Si se desea, los virus recuperados pueden almacenarse a -80ºC en presencia de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) como estabilizador.
Como alternativa, pueden emplearse sistemas de transcripción/traducción sin células para producir polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos o subsecuencia de, por ejemplo, las secuencias dadas en este documento tales como las SEQ ID Nos: 11-12, o codificadas por las secuencias polinucleotídicas de por ejemplo las SEQ ID Nos: 1-12. Están disponibles en el mercado varios sistemas adecuados de transcripción y traducción in vitro. Se encuentra una guía general para protocolos de transcripción y traducción in vitro en Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volumen 37, Garland Publishing, NY.
Además, los polipéptidos, o subsecuencias de los mismos, por ejemplo, subsecuencias que comprenden péptidos antigénicos, pueden producirse de forma manual o usando un sistema automatizado, por síntesis directa de péptidos usando técnicas en fase sólida (véase, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). Los sistemas automatizados ejemplares incluyen el Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Si se desea, pueden sintetizarse químicamente subsecuencias por separado, y combinarse usando métodos químicos para proporcionar polipéptidos de longitud completa.
Aminoácidos modificados
Los polipéptidos expresados descritos en este documento pueden contener uno o más aminoácidos modificados. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa en, por ejemplo, (a) el aumento de la semi-vida sérica del polipéptido, (b) la reducción/aumento de la antigenicidad del polipéptido, (c) el aumento de la estabilidad en almacenamiento del polipéptido, etc. El o los aminoácidos se modifican, por ejemplo, de forma co-traduccional o post-traduccional durante la producción recombinante (por ejemplo, glicosilación ligada a N en motivos N-X-S/T durante la expresión en células de mamífero) o se modifican por medios sintéticos (por ejemplo, mediante PEGilación).
Ejemplos no limitantes de un aminoácido modificado incluyen un aminoácido glicosilado, un aminoácido sulfatado, un aminoácido prenilado (por ejemplo, farnesilado, geranilgeranilado), un aminoácido acetilado, un aminoácido acilado, un aminoácido PEG-ilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido carboxilado, un aminoácido fosforilado, y similares, así como aminoácidos modificados por conjugación con, por ejemplo, restos lipídicos u otros agentes orgánicos de derivatización. La bibliografía está repleta de referencias adecuadas para guiar a los especialistas en la técnica en la modificación de aminoácidos. Se encuentran ejemplos de protocolos en Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Human Press, Towata, NJ.
Proteínas de fusión
En este documento también se describen proteínas de fusión que comprenden fusiones de las secuencias descritas en este documento (por ejemplo, que codifican polipéptidos HA y/o NA ejemplificados por las SEQ ID Nos: 11-12) con, por ejemplo, inmunoglobulinas (o partes de las mismas), secuencias que codifican, por ejemplo, GFP (proteína fluorescente verde), u otros marcadores similares, etc. Las proteínas de fusión se usan opcionalmente para, por ejemplo, aplicaciones similares (incluyendo, por ejemplo, aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico, experimentales, etc. descritas en este documento) a las de las proteínas no de fusión descritas en este documento. Además de la fusión con secuencias de inmunoglobulina y secuencias marcadoras, las proteínas descritas en este documento también se fusionan opcionalmente con, por ejemplo, secuencias que permiten la clasificación de las proteínas de fusión y/o el direccionamiento de las proteínas de fusión a tipos celulares específicos, regiones, etc.
Anticuerpos
Los polipéptidos descritos en este documento pueden usarse para producir anticuerpos específicos para los polipéptidos dados en este documento y/o polipéptidos codificados por los polinucleótidos descritos en este documento y variantes conservativas de los mismos. Anticuerpos específicos para los polipéptidos mencionados anteriormente son útiles, por ejemplo, para propósitos de diagnóstico y terapéuticos, por ejemplo, relacionados con la actividad, distribución, y expresión de polipéptidos diana.
Pueden generarse anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos en este documento por métodos bien conocidos en la técnica. Dichos anticuerpos pueden incluir, aunque sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab.
Los polipéptidos no requieren actividad biológica para la producción de anticuerpos (por ejemplo, no se requiere hemaglutinina o neuraminidasa funcional de longitud completa). Sin embargo, el polipéptido u oligopéptido debe ser antigénico. Los péptidos usados para inducir anticuerpos específicos típicamente tienen una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 4 aminoácidos, y a menudo al menos 5 ó 10 aminoácidos. Tramos cortos de un polipéptido pueden fusionarse con otra proteína, tal como hemocianina de lapa californiana, y producirse anticuerpos contra la molécula quimérica.
Numerosos métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos para los especialistas en la técnica, y pueden adaptarse para producir anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos en este documento, y/o codificados por las secuencias de poli-nucleótidos descritas en este documento, etc. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul (ed.) (1998) Fundamental Immunology, Cuarta Edición, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en el mismo; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Otras técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos incluyen selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fágicos o similares. Véase, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; y Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546. Anticuerpos y antisueros monoclonales y policlonales específicos habitualmente se unirán con una KD de, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 !M, al menos aproximadamente 0,01 !M o mejor y, típicamente y al menos aproximadamente 0,001 !M o mejor.
Para ciertas aplicaciones terapéuticas, son deseables anticuerpos humanizados. Pueden encontrarse métodos detallados para la preparación de anticuerpos quiméricos (humanizados) en la patente de Estados Unidos 5.482.856. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la humanización y otras técnicas de producción y diseño de anticuerpos en Borrebaeck (ed.) (1995) Antibodv Engineering. 2ª Edición Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering. A Practical Approach IRL en Oxford Press, Oxford, Inglaterra (McCafferty), y Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Human Press, Towata, NJ (Paul). Pueden encontrarse detalles adicionales respecto a procedimientos específicos, por ejemplo, en Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, patente de Estados Unidos nº 4.634.664, y Engelman et al., patente de Estados Unidos nº 4.634.666.
Definición de polipéptidos por inmunorreactividad
En este documento también se describe la generación de antisueros que se unen específicamente a los polipéptidos descritos en este documento así como los polipéptidos que se unen por dichos antisueros.
Por ejemplo, se describen polipéptidos (por ejemplo, moléculas HA y NA) que se unen específicamente a o que son específicamente inmunorreactivos con un anticuerpo o antisuero generado contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre una o más de las secuencias dadas en este documento (por ejemplo, SEQ ID Nos: 11-12), etc. Para eliminar la reactividad cruzada con otros homólogos, el anticuerpo o antisuero se sustrae con las moléculas HA y/o NA encontradas en bases de datos públicas en el momento de la presentación, por ejemplo, el o los polipéptidos de "control". Cuando las otras secuencias de control corresponden con un ácido nucleico, se genera un polipéptido codificado por el ácido nucleico y se usa para propósitos de sustracción del anticuerpo/antisuero.
En un formato típico, el inmunoensayo usa un antisuero policlonal que se creó contra uno o más polipéptidos que comprenden una o más de las secuencias correspondientes a las secuencias de este documento (por ejemplo, SEQ ID Nos: 11-12), etc. o una subsecuencia sustancial de las mismas (es decir, al menos aproximadamente el 30% de la secuencia de longitud completa proporcionada). La serie de inmunógenos polipeptídicos potenciales derivados de las presentes secuencias se mencionan colectivamente a continuación como "los polipéptidos inmunogénicos". El antisuero resultante se selecciona opcionalmente para que tenga reactividad cruzada contra los homólogos de control de hemaglutinina y/o neuraminidasa y se elimina cualquier dicha reactividad cruzada, por ejemplo, por inmunoabsorción, con uno o más de los homólogos de control de hemaglutinina y neuraminidasa, antes del uso del antisuero policlonal en el inmunoensayo.
Para producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, se produce y se purifica uno o más de los polipéptidos inmunogénicos como se describe en este documento. Por ejemplo, puede producirse proteína recombinante en una célula recombinante. Se inmuniza una cepa endogámica de ratones (usada en este ensayo porque resulta ser más reproducible debido a la identidad genérica virtual de los ratones) con la proteína o proteínas inmunogénicas en combinación con un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo convencional de inmunización de ratones (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción convencional de generación de anticuerpos, formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar inmunorreactividad específica). En este documento también se encuentran referencias adicionales y un análisis de anticuerpos y pueden aplicarse aquí para definir polipéptidos por inmunorreactividad. Como alternativa, se conjuga uno o más polipéptidos sintéticos o recombinante derivados de las secuencias descritas en este documento con una proteína vehículo y se usa como inmunógeno.
Los sueros policlonales se recogen y titulan frente al polipéptido inmunogénico en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con una o más de las proteínas inmunogéncias inmovilizadas en un soporte sólido. Se seleccionan los antisueros policlonales con un título de 106 o mayor, se combinan y sustraen con los polipéptidos de control hemaglutinina y/o neuraminidasa para producir antisueros policlonales titulados combinados sustraídos.
Los antisueros policlonales titulados combinados sustraídos se ensayan para la reactividad cruzada contra el homólogo u homólogos de control en un inmunoensayo comparativo. En este ensayo comparativo, se determinan condiciones de unión discriminatorias para los antisueros policlonales titulados sustraídos que producen una proporción señal a ruido al menos aproximadamente 5-10 veces mayor para la unión de los antisueros policlonales titulados a los polipéptidos inmunogénicos en comparación con la unión a los homólogos de control. Es decir, la rigurosidad de la reacción de unión se ajusta por la adición de competidores no específicos tales como albúmina o leche en polvo desnatada, y/o ajustando las condiciones salinas, la temperatura, y/o similares. Estas condiciones de unión se usan en posteriores ensayos para determinar si un polipéptido de ensayo (un polipéptido que se está comparando con los polipéptidos inmunogénicos y/o los polipéptidos de control) se une específicamente por los antisueros policlonales sustraídos combinados. En particular, los polipéptidos de ensayo que muestran una proporción señal a ruido al menos 2-5x mayor que los homólogos receptores de control en condiciones de unión discriminatoria, y una proporción señal a ruido de al menos aproximadamente ½ en comparación con el o los polipéptidos inmunogénicos, comparten similitud estructural sustancial con el polipéptido inmunogénico en comparación con el receptor conocido, etc.
En otro ejemplo, se usan inmunoensayos en el formato de unión competitiva para la detección de un polipéptido de ensayo. Por ejemplo, como se indica, se retiran anticuerpos de reacción cruzada de la mezcla de antisueros combinados por inmunoabsorción con los polipéptidos de control. El o los polipéptidos inmunogénicos después se inmovilizan en un soporte sólido que se expone a los antisueros combinados sustraídos. Se añaden las proteínas de ensayo al ensayo para que compitan por la unión a los antisueros sustraídos combinados. La capacidad de la proteína o proteínas de ensayo de competir por la unión con los antisueros sustraídos combinados en comparación con la proteína o proteínas inmovilizadas se compara con la capacidad del o de los polipéptidos inmunogénicos añadidos al ensayo de competir por la unión (los polipéptidos inmunogénicos compiten de forma eficaz con los polipéptidos inmunogénicos inmovilizados por la unión a los antisueros combinados). Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas de ensayo, usando cálculos convencionales.
En un ensayo paralelo, se determina opcionalmente la capacidad de la proteína o proteínas de control de competir por la unión a los antisueros sustraídos combinados en comparación con la capacidad del o de los polipéptidos inmunogénicos de competir por la unión a los antisueros. De nuevo, se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para el o los polipéptidos de control, usando cálculos convencionales. Cuando el porcentaje de reactividad cruzada se al menos 5-10x tan elevado para los polipéptidos de ensayo en comparación con el o los polipéptidos de control y
o cuando la unión de los polipéptidos de ensayo está aproximadamente en el intervalo de la unión de los polipéptidos inmunogénicos, se dice que los polipéptidos de ensayo se unen específicamente a los antisueros sustraídos combinados.
En general, los antisueros inmunoabsorbidos y combinados pueden usarse en un inmunoensayo de unión competitiva como se describe en este documento para comparar cualquier polipéptido de ensayo con el o los polipéptidos inmunogénicos y/o de control. Para hacer esta comparación, los polipéptidos inmunogénicos, de ensayo y de control se ensayan cada uno a un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada polipéptido necesaria para inhibir el 50% de la unión de los antisueros sustraídos a, por ejemplo, una proteína inmovilizada de control, de ensayo o inmunogénica usando técnicas convencionales. Si la cantidad del polipéptido de ensayo necesaria para la unión en el ensayo competitivo es menor de dos veces la cantidad del polipéptido inmunogénico que se requiere, entonces se dice que el polipéptido de ensayo se une específicamente a un anticuerpo generado contra la proteína inmunogénica, siempre que la cantidad sea al menos aproximadamente 510x tan elevada como para el polipéptido de control.
Como determinación adicional de la especificidad, los antisueros combinados se inmunoabsorben por completo opcionalmente con el o los polipéptidos inmunogénicos (en lugar del o de los polipéptidos de control) hasta que se detecta poco o nada de unión del antisuero combinado sustraído de polipéptido inmunogénico resultante con el o los polipéptidos inmunogénicos usados en la inmunoabsorción. Este antisuero completamente inmunoabsorbido después se ensaya para la reactividad con el polipéptido de ensayo. Si se observa poca o ninguna reactividad (es decir, no más de 2x la proporción señal a ruido observada para la unión del antisuero completamente inmunoabsorbido con el polipéptido inmunogénico), entonces el polipéptido de ensayo se une específicamente por el antisuero producido por la proteína inmunogénica.
Variantes de secuencia de ácidos nucleicos y polipéptidos
Variantes silenciosas
Debido a la degeneración del código genético, se produce opcionalmente cualquiera de una diversidad de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos descritos en este documento, algunas de las cuales pueden albergar niveles inferiores de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico y polipeptídicas de HA y NA de este documento. A continuación se proporciona una tabla de codones típica que especifica el código genético, encontrada en muchos textos de biología y bioquímica.
Tabla 1
Tabla de codones
Aminoácidos
Codón
Alanina Ala
A GCA GCC GCG GCU
Cisteína Cys
C UGC UGU
Ácido aspártico Asp
D GAC GAU
Ácido glutámico Glu
E GAA GAG
Fenilalanina Phe
F UUC UUU
Glicina Gly
G GGA GGC GGG GGU
Histidina His
H CAC CAU
Isoleucina Ile
I AUA AUC AUU
Lisina Lys
K AAA AAG
Leucina Leu
L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina Met
M AUG
Asparagina Asn
N AAC AAU
Prolina Pro
P CCA CCC CCG CCU
Glutamina Gln
Q CAA CAG
Arginina Arg
R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina Ser
S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina Thr
T ACA ACC ACG ACU
Valina Val
V GUA GUC GUG GUU
Triptófano Trp
W UGG
Tirosina Tyr
Y UAC UAU
La tabla de codones muestra que muchos aminoácidos están codificados por más de un codón. Por ejemplo, los
5 codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, y CGU codifican todos el aminoácido arginina. Por tanto, en cualquier posición en los ácidos nucleicos descritos en este documento donde se especifica una arginina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente sin alterar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN corresponde a T en una secuencia de ADN.
10 Dichas "variaciones silenciosas" son una especie de "variaciones modificadas de forma conservativa", analizadas a continuación. Un especialista en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto ATG, que es normalmente el único codón para metionina, y TTG, que es normalmente el único codón para triptófano) puede modificarse por técnicas convencionales para que codifique un polipéptido funcionalmente idéntico. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cualquier
15 secuencia descrita. La descripción, por lo tanto, proporciona de forma explícita todas y cada una de las posibles variaciones de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en este documento que podría hacerse seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codón. Estas combinaciones se hacen de acuerdo con el código genético convencional de tripletes (por ejemplo, como se expone en la Tabla 1, o como está habitualmente disponible en la técnica) aplicado a la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido
20 hemaglutinina o neuraminidasa descrito en este documento. Todas estas variaciones de cada ácido nucleico de este documento se proporcionan y describen específicamente por consideración de la secuencia en combinación con el código genético. Un especialista en la técnica es completamente capaz de hacer estas sustituciones silenciosas usando los métodos de este documento.
25 Variaciones conservativas
Debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones en una secuencia de ácido nucleico que no provocan una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia de ácido nucleico descrita en este documento que codifica un aminoácido.
30 "Variaciones conservativas" de una secuencia de ácido nucleico particular se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas. Finalmente, la adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservativa del ácido nucleico básico.
35 Subsecuencias polipeptídicas y polinucleotídicas únicas
En este documento también se describe un ácido nucleico que comprende una subsecuencia única en un ácido nucleico seleccionado de la secuencia de moléculas HA y NA descritas en este documento, por ejemplo, las SEQ ID
40 Nos: 1-2. La subsecuencia única es única en comparación con ácidos nucleicos correspondientes a ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, los encontrados en GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación. La alineación puede realizarse usando, por ejemplo, BLAST establecido a parámetros por defecto.
Cualquier subsecuencia única es útil, por ejemplo, como sonda para identificar los ácidos nucleicos descritos en este documento. Véase, anteriormente.
Asimismo, se describe un polipéptido que comprende una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado entre la secuencia de moléculas HA y NA descritas en este documento, por ejemplo, las SEQ ID Nos: 11-12. Aquí, la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a, por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a secuencias polinucleotídicas encontradas en, por ejemplo, GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación.
Se describen adicionalmente ácidos nucleicos diana que hibridan en condiciones rigurosas con un oligonucleótido codificante único que codifica una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado entre las secuencias de moléculas HA y NA descritas en este documento donde la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquiera de los polipéptidos de control (secuencias de, por ejemplo, los ácidos nucleicos correspondientes a los encontrados en, por ejemplo, GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación). Las secuencias únicas se determinan como se ha indicado anteriormente.
Identidad y homología de comparación de secuencia
Las expresiones "idénticas" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales, en comparación y alineados para la máxima correspondencia, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencia descritos a continuación (u otros algoritmos disponibles para los especialistas en la técnica) o por inspección visual.
La expresión "sustancialmente idénticos", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos (por ejemplo, ADN que codifica una molécula HA o NA, o la secuencia de aminoácidos de una molécula HA o NA) se refiere a dos
o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente un 90%, preferiblemente un 91%, más preferiblemente un 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% o mayor identidad de nucleótidos o restos aminoacídicos, en comparación y alineados para la máxima correspondencia, medida usando un algoritmo de comparación de secuencia o por inspección visual. Dichas secuencias "sustancialmente idénticas" se considera típicamente que son "homólogas," sin referencia a un linaje real. Preferiblemente, existe "identidad sustancial" sobre una región de las secuencias de aminoácidos que e de al menos aproximadamente 200 restos de longitud, más preferiblemente sobre una región de al menos aproximadamente 250 restos, y más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 300 restos, 350 restos, 400 restos, 425 restos, 450 restos, 475 restos, 480 restos, 490 restos, 495 restos, 499 restos, 500 restos, 502 restos, 559 restos, 565 restos, o 566 restos, o sobre la longitud completa de las dos secuencias a comparar.
Para la comparación de secuencias y la determinación de homología, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, se introducen las secuencias de ensayo y referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo con relación de la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados.
Puede realizarse una alineación óptima de secuencias para la comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv Appl Math 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J Mol Biol 48:443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de algoritmos tales como GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o por inspección visual (véase en líneas generales, Ausubel et al., supra).
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J Mol Biol 215:403-410 (1990). El software para ejecutar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias con elevada valoración (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que aparean o satisfacen algún valor umbral valorado positivo T cuando se alienan con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral del valor de la palabra vecina (véase, Altschul et al., supra). Estos aciertos iniciales de palabra vecina actúan como semillas para iniciar búsquedas para hallar HSP más largos que los contienen. Los aciertos de palabra después se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para todo lo que pueda aumentarse el valor de alineación cumulativo. Los valores cumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (valor de recompensa para un par de restos de apareamiento; siempre > 0) y N (valor de penalización para restos de desapareamiento; siempre< 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valoración para calcular el valor cumulativo. Los aciertos de extensión de palabra en cada dirección se interrumpen cuando: el valor de alineación cumulativo disminuyen en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; el valor cumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con valoración negativa; o cuando se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11, una previsión (E) de 10, un límite de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defectos una longitud de palabra (W) de 3, una previsión (E) de 10, y la matriz de valoración BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915).
Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría por causalidad un apareamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es de menos de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01, y mucho más preferiblemente menos de aproximadamente 0,001.
Otro ejemplo de un algoritmo de alineación de secuencia útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas, por pares. También puede representar un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS5:151-153. El programa puede alinear, por ejemplo, hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5.000 letras. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo después puede alinearse con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionado. Puede alinearse dos grupos de secuencias por una simple extensión de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue por una serie de alineaciones progresivas por pares. El programa también puede usarse para representar un dendograma o representación en árbol de las relaciones de agrupamiento. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia.
Un ejemplo adicional de un algoritmo que es adecuado para múltiples alineaciones de secuencia de ADN, o aminoácidos es el programa CLUSTALW (Thompson, J. D. et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680). CLUSTALW realiza múltiples comparaciones por pares entre grupos de secuencias y los ensambla en una alineación múltiple basada en homología. Las penalizaciones por Abrir hueco y Extensión de hueco pueden ser, por ejemplo, 10 y 0,05 respectivamente. Para alineaciones de aminoácidos, puede usarse el algoritmo BLOSUM como matriz de peso de proteína. Véase, por ejemplo, Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1091510919.
Sistemas digitales
En este documento se describen adicionalmente sistemas digitales, por ejemplo, ordenadores, medios legibles en ordenador y sistemas integrados que comprenden cadenas de caracteres correspondientes a la información de secuencia de este documento para los ácidos nucleicos y los polipéptidos aislados o recombinantes de este documento, incluyendo, por ejemplo, las secuencias mostradas en este documento, y las diversas sustituciones silenciosas y sustituciones conservativas de las mismas. Los sistemas integrados pueden incluir adicionalmente, por ejemplo, un equipo de síntesis génica para preparar genes correspondientes a las cadenas de caracteres.
Pueden usarse diversos métodos conocidos en la técnica para detectar homología o similitud entre diferentes cadenas de caracteres (véase, anteriormente), o pueden usarse para realizar otras funciones deseables tales como controlar los archivos de salida, proporcionar la base para hacer presentaciones de información incluyendo las secuencias y similares. Ejemplos incluyen BLAST, analizado supra. Los sistemas informáticos pueden incluir dichos programas, por ejemplo, junto con uno o más archivos de datos o bases de datos que comprenden una secuencia indicada en este documento.
Por tanto, pueden detectarse y reconocerse diferentes tipos de homología y similitud de diversa rigurosidad y longitud entre diversas secuencias o fragmentos de HA o NA, etc. en los sistemas integrados de este documento. Por ejemplo, se han diseñado muchos métodos de determinación de homología para análisis comparativo de secuencias de biopolímeros, para revisión ortográfica en el tratamiento de textos, y para la recuperación de datos de diversas bases de datos. Como una comprensión de interacciones complementarias por pares de doble hélice entre 4 nucleobases principales en polinucleótidos natural, también pueden usarse modelos que estimulan la hibridación de cadenas polinucleotídicas homólogas complementarias como fundamento de alineación de secuencia u otras operaciones típicamente realizadas sobre las cadenas de caracteres correspondientes a las secuencias de este documento (por ejemplo, manipulaciones de tratamiento de textos, construcción de figuras que comprenden cadenas de caracteres de secuencia o subsecuencia, tablas de salida, etc.).
Por tanto, pueden adaptarse aplicaciones de escritorio convencionales tales como software de tratamiento de textos (por ejemplo, Microsoft Word™ o Corel Word-Perfect™) y software de bases de datos (por ejemplo, software de hojas de cálculo tales como Microsoft Excel™, Corel Quattro Pro™, o programas de bases de datos tales como Microsoft Access™, Paradox™, Gene Works™, o Mac Vector™ u otros programas similares) introduciendo una cadena de caracteres correspondiente a uno o más polinucleótidos y polipéptidos descritos en este documento (ácidos nucleicos o proteínas, o ambos). Por ejemplo, un sistema puede incluir el software anterior que tiene la información de cadena de caracteres apropiada, por ejemplo, usada junto con una interfaz de usuario (por ejemplo, una GUI en un sistema operativo convencional tal como un sistema Windows, Macintosh o LINUX) para manipular cadenas de caracteres correspondientes a las secuencias de este documento. Como se ha indicado, también pueden incorporarse programas especializados de alineación tales como BLAST en los sistemas descritos en este documento para la alineación de ácidos nucleicos o proteína (o cadenas de caracteres correspondientes).
Los sistemas descritos en este documento típicamente incluyen un ordenador digital con series de datos introducidas en el sistema de software que comprende cualquiera de las secuencias de este documento. El ordenador puede ser, por ejemplo, un PC (sistema basado en Intel x86 o Pentium chip-compatible DOS™, OS2™ WINDOWS™ WINDOWSNT™, WINDOWS95™, WINDOWS2000™, WINDOWS98™, LINUX, un MACINTOSH™, Power PC, o un sistema basado en UNIX (por ejemplo, puesto de trabajo SUN™)) u otro ordenador disponible en el mercado que sea conocido para un especialista en la técnica. Está disponible el software para alinear o manipular de otro modo secuencias, o puede construirlo fácilmente un especialista en la técnica usando un lenguaje de programación convencional tal como Visualbasic, PERL, Fortran, Basic, Java, o similares. Cualquier controlador u ordenador opcionalmente incluye un monitor que a menudo es una pantalla de tubo de rayos catódicos ("CRT"), una pantalla de panel plano (por ejemplo, una pantalla de cristal líquido de matriz activa, pantalla de cristal líquido), u otras. La circuitería del ordenador a menudo se coloca en una caja que incluye numerosos chips de circuito integrados, tal como un microprocesador, memoria, circuitos de interfaz, y otros. La caja también incluye opcionalmente una unidad de disco duro, una unidad de disquete, una unidad extraíble de alta capacidad tal como un CD-ROM grabable, y otros elementos periféricos comunes. Los dispositivos de entrada tales como un teclado o ratón opcionalmente proporcionan entradas por un usuario y para la selección por parte del usuario de secuencias a comparar o manipular de otro modo en el sistema informático relevante.
El ordenador típicamente incluye un software apropiado para recibir instrucciones del usuario, en forma de entrada por un usuario en una serie de campos de parámetros, por ejemplo, en una GUI, o en forma de instrucciones preprogramadas, por ejemplo, preprogramadas para una diversidad de diferentes operaciones específicas. El software entonces convierte estas instrucciones en el lenguaje apropiado para instruir la operación, por ejemplo, de mecanismos apropiados o controladores de transporte para realizar la operación deseada. El software también puede incluir elementos de salida para controlar la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, basados en una secuencia o una alineamiento de secuencias de este documento), comparaciones de muestras para expresión génica diferencial, u otras operaciones.
Kits y reactivos
En este documento también se describe un kit. Por ejemplo, un kit contiene uno o más ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, o líneas celulares descritos en este documento (por ejemplo, que comprende, o con, una molécula HA y/o NA descrita en este documento). El kit puede contener un ácido nucleico o polipéptido de diagnóstico, por ejemplo, anticuerpo, serie de sondas, por ejemplo, como una micro-serie de ADNc envasada en una recipiente adecuado, u otro ácido nucleico tal como uno o más vectores de expresión. El kit también puede comprender adicionalmente, uno o más reactivos adicionales, por ejemplo, sustratos, marcadores, cebadores, para el marcaje de productos de expresión, tubos y/u otros accesorios, reactivos para recoger muestras, tampones, cámaras de hibridación, cubreobjetos, etc. El kit opcionalmente comprende adicionalmente una serie de instrucciones o manual del usuario que detalla los métodos preferidos para usar los componentes del kit para el descubrimiento o aplicación de series de diagnóstico, etc.
Cuando se usa de acuerdo con las instrucciones, el kit puede usarse, por ejemplo, para evaluar una patología o afección, para evaluar efectos de un agente farmacéutico u otra intervención de tratamiento sobre el progreso de una patología o afección en una célula u organismo, o para su uso como vacuna, etc.
En este documento se describen adicionalmente kits de sistema que incorporan los métodos, composición, sistemas y aparato de este documento. Los kits de sistema comprenden opcionalmente uno o más de los siguientes: (1) un aparato, sistema, componente de sistema o componente de aparato; (2) instrucciones para poner en práctica los métodos descritos en este documento, y/o para hacer funcionar el aparato o componentes de aparato de este documento y/o para usar las composiciones de este documento. También de describe el uso de cualquier aparato, componente de aparato, composición o kit de este documento, para la práctica de cualquier método o ensayo de este documento, y/o para el uso de cualquier aparato o kit para la práctica de cualquier ensayo o método de este documento.
Además, los kits pueden incluir uno o más sistemas de traducción como se ha indicado anteriormente (por ejemplo, una célula) con material de envasado apropiado, recipientes para albergar los componentes del kit, materiales de instrucción para poner en práctica los métodos de este documento y/o similares. Asimismo, los productos de los sistemas de traducción (por ejemplo, proteínas tales como las moléculas HA y/o NA) pueden proporcionarse en forma de kit, por ejemplo, con recipientes para albergar los componentes del kit, materiales de instrucción para poner en práctica los métodos de este documento y/o similares.
Para facilitar el uso de los métodos y composiciones de la invención, puede envasarse cualquiera de los componentes y/o composiciones de vacuna, por ejemplo, virus reagrupado en fluido alantoideo, etc., y componentes adicionales, tales como, tampón, células, medio de cultivo, útiles para el empaquetamiento e infección de virus influenza para propósitos experimentales o de vacuna terapéutica, en forma de un kit. Típicamente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para realizar los métodos de la invención, material de envasado, y un recipiente.
Ejemplos
Construcción y análisis de virus y vacunas H5N1 ca
Se usaron diversas secuencias de este documento que comprenden secuencias HA/NA H5N1 para crear virus influenza y vacunas. Las secuencias HA en dichas vacunas se alteraron a partir del tipo silvestre por eliminación del sitio de escisión polibásico dentro de la HA. Las secuencias HA/NA se reagruparon (en un reagrupado 6:2) con A/AA/6/60 (un virus att, ca, véase anteriormente). Se usaron tres cepas de influenza H5N1 en este ejemplo: A/VN/1203/2004, A/HK/491/97, y A/HK/213/2003. Dichas cepas también se mencionan en este ejemplo como las cepas '97, '03, y '04 basadas en sus años de designación. El porcentaje de similitud de los genes de HA de estas tres cepas es del 95-96%. La Figura 1 ilustra la modificación del sitio de escisión polibásico de una secuencia HA ejemplar, las secuencias HA '04, usadas para construir los virus/vacunas. Como se ha indicado previamente, diversas realizaciones de la invención comprenden secuencias que tienen diferentes regiones del sitio de escisión polibásico eliminadas. Véase anteriormente.
Como se ha indicado, las secuencias H5N1 modificadas (es decir, los '97, '03, y '04 modificados) se usaron para construir virus reagrupados 6:2 con A/AA/6/60. Se apreciará, y se señala en otra parte de este documento, que también podrían usarse otras estructuras deseables (por ejemplo, PR8, etc.).
En los reagrupados 6:2 de este ejemplo, las secuencias génicas HA y NA se obtuvieron del virus parental de tipo silvestre y los genes restantes se caracterizaron por análisis de secuencia derivada del virus parental A/AA/6/60 ca. Los virus reagrupados se replicaron a 8,0-8,5 log10TCID50 en huevos. Sin embargo, se apreciará que un virus reivindicado en el que log10TCID50 está comprendido entre aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0, entre aproximadamente 7,5-8,5, o entre aproximadamente 8,0-8,5 también es parte de la invención. La capacidad de escisión de la HA modificada en los virus construidos por proteasas endógenas se restringió in vitro y los virus fueron dependientes de tripsina (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 !g/ml a aproximadamente 1,0 !g/ml) para el cultivo. Los virus construidos fueron sensibles a la temperatura in vitro.
Los virus reagrupados H5N1 ca (que tienen los genes HA '97, '03, o '04) fueron no elevadamente patogénicos para pollos. Por ejemplo, cuando se inocularon pollos Plymouth Rock blancos SPF de cuatro semanas de edad por vía intravenosa con una dilución 1:10 de virus de reserva (108-8,75 TCID50/ml) y se observaron durante 10 días, se observó que morían 8 de 8 pollos en 1-2 días cuando se usaban H5N1 '97, '03, y '04, mientras que morían 0 de 8 pollos cuando se usaban virus reagrupados H5N1 ca. Como puede observarse en la Figura 2, los virus reagrupados H5N1 ca administrados por vía intranasal no se replicaban en pollos.
Los reagrupados H5N1/AA ca tampoco fueron letales para ratones. Véase la Figura 3, que también muestra la TCID50 para las cepas de tipo silvestre H5N1. La Figura 4 muestra que los virus reagrupados H5N1 ca 1997 y 2004 estaban restringidos en la replicación en ratones. La Figura 5, muestra que los virus reagrupados H5N1 ca están restringidos en la replicación en pulmones de ratones.
Se muestra una comparación de los títulos de anticuerpos HAI séricos producidos en ratones después de una única dosis intranasal de vacuna (2003 ca en comparación con 2003 de tipo silvestre), en la Figura 6. La Figura 7 muestra mediciones similares, pero usando títulos de anticuerpos neutralizantes séricos.
La Figura 8 presenta que los virus reagrupados H5N1 ca protegen a los ratones de la exposición letal con 50, 500, o 5,000 LD50 de virus H5N1 de tipo silvestre. La Figura 9 muestra la eficacia de protección contra la replicación pulmonar de virus homólogos y heterólogos de exposición H5N1 en ratones. Como puede observarse, los reagrupados ca se replicaban menos bien que los virus de tipo silvestre. La Figura 10 muestra datos relacionados usando tractos respiratorios superiores de ratones. Los especialistas en la técnica estarán familiarizados con exposiciones homólogas y heterólogas (por ejemplo, ensayo de si las vacuna 2003 protege contra una exposición de 2003 de tipo silvestre (homóloga) o si una vacuna 2003 protege contra una exposición de 1997 de tipo silvestre (heteróloga), etc.).
La Figura 11 muestra la eficacia de protección conferida por una vacuna 2004 H5N1 ca contra exposición de alta dosis (105TCID50) con virus homólogos o heterólogos H5N1 de tipo silvestre en ratones. La Figura 12 muestra la eficacia de protección conferida por vacunas H5N1 ca 1997 y 2003 contra exposición de alta dosis (105TCID50) con virus homólogos y heterólogos H5N1 de tipo silvestre en ratones. La Figura 13 muestra la eficacia de protección conferida por la vacuna 2004 H5N1 ca contra dosis bajas o altas de exposición con virus homólogo H5N1 de tipo silvestre en ratones. Las Figuras 11-13 demuestran que las vacunas ensayadas podían proteger contra otros virus relacionados.
5 El presente ejemplo demuestra varios puntos referentes a virus/vacunas reagrupados H5N1 ca ejemplares de la invención. Los virus modificados '97, '03, y '04 ca reagrupados demostraron tener fenotipo ts in vitro, pérdida de patogenicidad en pollos y atenuación en ratones. Se espera que la atenuación también esté presente en hurones. También se muestra eficacia de protección y protección cruzada contra exposición letal y propagación sistémica con
10 virus de tipo silvestre en ratones. También se espera eficacia de protección y protecciones cruzadas contra la replicación de virus de exposición de tipo silvestre en el tracto respiratorio de ratones.
Se contempla usar estos (y similares) virus/vacunas para determinar si se mejora la inmunogenicidad y eficacia después de 2 dosis de vacuna; evaluar la inmunogenicidad en primates no humanos; evaluar la atenuación y la
15 eficacia de vacuna en hurones; determinar la contribución de la inmunidad humoral y celular a la eficacia observada de las vacunas producidas en ratones; determinar qué restos de la HA 2003 contribuyen a la inmunogenicidad potenciada e introducirlos en HA 1997 y 2004; y determinar los efectos de delecionar el sitio de escisión de aminoácidos multibásico y la constelación génica.
20 Secuencias
A/Vietnam/1203/04
Secuencia de aminoácidos de A/Vietnam/1203/04 H5 (SEQ ID No: 11) Longitud de la molécula completa: 564 aa
Secuencia de nucleótidos de A/Vietnam/1203/04 N1 (SEQ ID No: 2) Longitud de la molécula completa: 1398 nt
Secuencia de aminoácidos de A/Vietnam/1203/04 N1 (SEQ ID No: 12) Longitud de la molécula completa: 449 aa
A/Hong Kong/213/03
Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/213/03 H5 (SEQ ID No: 13) Longitud de la molécula completa: 564 aa Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/213/03 N1 (SEQ ID No: 4) Longitud de la molécula completa: 1458 nt
Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/213/03 N1 (SEQ ID No: 14) Longitud de la molécula completa: 469 aa
A/Hong Kong/491/97 (HA) + A/Hong Kong/486/97 (NA)
Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/491/97 H5 (SEQ ID No: 15) Longitud de la molécula completa: 564 aa Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/486/97 H5 (SEQ ID No: 6) Longitud de la molécula completa: 1401 nt
Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/486/97 N1 (SEQ ID No: 16) Longitud de la molécula completa: 450 aa
A/Hong Kong/491/97 (Ser211) (HA) + A/Hong Kong/486/97 (NA)
Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/491/97 (Ser211) H5 (SEQ ID No: 7) Longitud de la molécula completa: 1767 nt
Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/491/97 (Ser211) H5 (SEQ ID No: 17) Longitud de la molécula completa: 564 aa
Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/486/97 N1 (SEQ ID No: 8) Longitud de la molécula completa: 1401 nt
Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/486/97 N1 (SEQ ID No: 18) Longitud de la molécula completa: 450 aa
ca A/ck/Hong Kong/G9/97
Secuencia de nucleótidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 (SEQ ID No: 9) Longitud de la molécula completa: 1690 pb
Secuencia de aminoácidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 H9 (SEQ ID No: 19) Longitud de la molécula completa: 558 aa
Secuencia de nucleótidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 N2 (SEQ ID No: 10) Longitud de la molécula completa: 1428 pb
Secuencia de aminoácidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 N2 (SEQ ID No: 20) Longitud de la molécula completa: 469 aa
Sumario de las designaciones de los No de SEQ ID
SEQ ID No
HA o NA NOMBRE DE LA CEPA Aminoácido o nucleótido
SEQ ID No:
HA (H5) ca A/Vietnam/1203/04 Nucleótido
SEQ ID No:
NA (N1) ca A/Vietnam/1203/04 Nucleótido
SEQ ID No: SEQ ID No:
HA (H5) NA (N1) ca A/Hong Kong/213/03 ca A/Hong Kong/213/03 Nucleótido Nucleótido
SEQ ID No:
HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 Nucleótido
SEQ ID No:
NA (N1) ca A/Hong Kong/486/97 Nucleótido
SEQ ID No:
HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 (Ser211) Nucleótido
SEQ ID No:
NA (N1)
ca A/Hong Kong/486/97
Nucleótido
SEQ ID No:
HA (H9) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Nucleótido
SEQ ID No:
NA (N2) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Nucleótido
SEQ ID No:
HA (H5) ca A/Vietnam/1203/04 Aminoácido
SEQ ID No:
NA (N1) ca A/Vietnam/1203/04 Aminoácido
SEQ ID No:
HA (H5) ca A/Hong Kong/213/03 Aminoácido
SEQ ID No:
NA (N1) ca A/Hong Kong/213/03 Aminoácido
SEQ ID No:
HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 Aminoácido
SEQ ID No:
NA (N1) ca A/Hong Kong/486/97 Aminoácido
SEQ ID No:
HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 (Ser211) Aminoácido
SEQ ID No:
NA (N1) ca A/Hong Kong/486/97 Aminoácido
SEQ ID No:
HA (H9) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Aminoácido
SEQ ID No:
NA (N2) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Aminoácido
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> MedImmune Vaccines, Inc et al.
<120> VARIANTES DE HEMAGLUTININA Y NEURAMINIDASA DE INFLUENZA 5
<130> FL260
<150> 60/574.553
<151> 10
<150> 60/657.554
<151>
<160> 20 15
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 1767 20 <212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 1
<210> 2
<211> 1398
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 2
<210> 3
<211> 1767
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 3
<210> 4
<211> 1458
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 4
<210> 5
<211> 1767
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 5
<210> 6
<211> 1401
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 6
<210> 7
<211> 1767
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 7
<210> 8
<211> 1401
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 8
<210> 9
<211> 1690
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 9
<210> 10
<211> 1428
<212> ADN
<213> Virus influenza
<400> 10
<210> 11
<211> 564
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 11
<210> 12
<211> 449
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 12
<210> 13
<211> 564
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 13
<210> 14
<211> 469
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 14
<210> 15
<211> 564
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 15
<210> 16
<213> Virus influenza
<400> 16
<210> 17
<211> 564
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 17
<210> 18
<211> 450
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 18
<210> 19
<211> 558
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 19
<210> 20
<211> 469
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 20

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un virus influenza reagrupado, donde dicho virus comprende 6 segmentos genómicos internos de uno o más virus donantes diferentes de A/Ann Arbor/6/60 y un segmento genómico que codifica un polipéptido HA de la cepa viral A/VN/1203/04, donde el polipéptido HA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11.
  2. 2.
    El virus influenza reagrupado de la reivindicación 1, que comprende un segmento genómico que codifica un polipéptido NA de la cepa viral A/VN/1203/04, donde el polipéptido NA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 12.
  3. 3.
    El virus influenza reagrupado de la reivindicación 1 ó 2, donde dicho uno o más virus donantes tienen una o más de las siguientes propiedades: sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, o están atenuados.
  4. 4.
    El virus influenza reagrupado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho uno o más virus donantes son PR8.
  5. 5.
    El virus influenza reagrupado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho uno o más virus donantes son A/Leningrad/134/17/57.
  6. 6.
    Una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del virus influenza reagrupado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  7. 7.
    El virus influenza reagrupado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un método de tratamiento estimulando el sistema inmune de un sujeto para producir una respuesta inmune protectora contra el virus influenza, donde el virus influenza reagrupado tiene que administrarse al sujeto en una cantidad inmunológicamente eficaz y en un vehículo fisiológicamente eficaz.
  8. 8.
    El virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en un método profiláctico de tratamiento de una infección vírica en un sujeto, donde el virus tiene que administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunogénica contra la infección vírica.
  9. 9.
    El virus para uso en un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho virus está muerto o inactivado.
  10. 10.
    Una vacuna de influenza atenuado vivo que comprende la composición de la reivindicación 6.
  11. 11.
    Un método para producir virus influenza en cultivos celulares, comprendiendo el método:
    i) introducir en una población de células hospedadoras, siendo capaz dicha población de células hospedadoras de soportar la replicación de virus influenza, una pluralidad de vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico correspondientes a:
    (a)
    al menos 6 segmentos genómicos internos de una primera cepa de influenza, donde la primera cepa de influenza no es A/Ann Arbor/6/60; y, al menos un segmento genómico que codifica un antígeno de superficie inmunogénico de influenza de A/VN/1203/04, donde dicho antígeno de superficie comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11; o
    (b)
    al menos 6 segmentos genómicos internos de una primera cepa de influenza, donde la primera cepa de influenza no es A/Ann Arbor/6/60 y donde dicha primera cepa de influenza tiene uno o más atributos fenotípicos seleccionados entre el grupo compuesto por: atenuada, adaptada al frío y sensible a la temperatura; y, al menos un segmento genómico que codifica un antígeno de superficie inmunogénico de influenza de A/VN/1203/04, donde dicho antígeno de superficie comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 11,
    ii) cultivar la población de células hospedadoras a una temperatura inferior a o igual a 35ºC en presencia de tripsina; y, iii) recuperar una pluralidad de virus influenza.
  12. 12.
    El método de la reivindicación 11, donde dicho antígeno de superficie comprende adicionalmente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 12.
  13. 13.
    Una vacuna de virus dividido o virus inactivado que comprende la composición inmunogénica de la reivindicación
  14. 6.
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
    La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
    10 Literatura no patente citada en la descripción
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