ES2395170B2

ES2395170B2 - Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por escherichia coli, para pontenciar la productividad de biomasa

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Publication number: ES2395170B2
Application number: ES201100896A
Authority: ES
Inventors: José Manuel GÓMEZ MONTES DE OCA; Domingo Cantero Moreno; Martín RAMÍREZ MUÑOZ; Ociel COFRÉ CARVAJAL
Original assignee: Universidad de Cadiz
Current assignee: Universidad de Cadiz
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-07-29
Also published as: WO2013017710A2; ES2395170A1; WO2013017710A3

Abstract

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli.#La invención consiste en un medio de cultivo específico para el proceso de biotransfórmación de glicerina en etanol e hidrógeno, utilizando el microorganismo E. coli MG1655. Este medio de cultivo potencia el crecimiento del microorganismo con el objetivo de obtener una concentración de E. coli que permita obtener mayores indices de producción de etanol respecto a procesos similares reportados en bibliografía.

Description

MEDIO DE CULTIVO SIMPLIFICADO Y OPTIMIZADO PARA LA PRODUCCiÓN DE ETANOL E HIDRÓGENO, A PARTIR DE GLICERINA, POR ESCHERICHIA COLl, PARA POTENCIAR LA

PRODUCTIVIDAD DE BIOMASA.

SECTOR DE LA TtCNICA

La presente invención se encuadra en el sector de los procedimientos biológicos y consiste en un medio de cultivo para aumentar la productividad de biomasa de E. coJí con glicerina como fuente de carbono principal.

10 ESTADO DE LA TtCNICA

La glicerina es el principal constituyente de todas las grasas y aceites, ha sido el subproducto de mayor valor agregado producido durante la saponificación de aceites y grasas y reacciones de transesterificación en procesos oleoquímicos y de fabricación de Biodiesel, respectivamente (Kenar 2007).

15 En algunos países europeos, la producción de glicerina se ha incrementado significativamente debido al aumento en la producción de Biodiesel. Como consecuencia, los precios han caído significativamente y la mayoría de las compañías dedicadas a la producción de glicerina, por síntesis química han tenido que cancelar sus operaciones (da Silva et al., 2009), convirtiéndose entonces la sobreproducción de glicerina en un problema que debe ser

20 resuelto.

La disponibilidad de glicerina y su bajo precio, han hecho crecer el interés en su utilización como fuente de carbono para diferentes procesos de fermentación, en reemplazo de otras fuentes de carbono utilizadas tradicionalmente en estos procesos (Dharmadi et al., 2006). La glicerina no solamente es abundante y barata sino que su alto nivel de reducción, en

25 comparación a azúcares, ofrece la oportunidad de obtener compuestos químicos reducidos como succinato, etanol, xilitol, propionato, hidrógeno, etc. con rendimientos de producción superiores respecto a los obtenidos a partir de azúcares (da Silva et al., 2009).

El proceso de biotransformación permite transformar un compuesto (materia prima)

en otro de interés técnico, comercial, etc. (producto), por medio de enzimas o microorganismos que permitan catalizar las reacciones de transformación requeridas. El proceso de biotransformación presenta ventajas, frente a la síntesis química tradicional, respecto a su selectividad, especificidad y condiciones de proceso moderadas (presión, temperatura, pH), repercutiendo en beneficios relacionados a la no producción de isómeros no deseados, menor gasto energético, etc. lo que finalmente se traduce en un proceso más eficiente y factible desde el punto de vista técnico y económico.

Diversos microorganismos son capaces de metabolizar glicerina, como fuente de carbono Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Lactobacillus, Bacillus, Propionibacterium, Anaerobiospirillum, etc., sin embargo la utilización comercial de estos organisos se ve limitada por el grado de patogenicidad que poseen, requerimientos nutricionales y dificultad para la manipulación genética de los mismos (Yazdani y Gonzalez, 2008).

Recientemente se ha descrito que E. coli puede fermentar eficientemente el glicerina cuando el pH del medio de cultivo es ácido, siendo el etanol y el succinato los principales

productos de esta fermentación, lo que hace de éste un atractivo modelo para el aprovechamiento del glicerina en la producción de etanol e hidrógeno (Hakobyan et al. , 2005; Dharmadi et al., 2006; Murarka et al., 2008; Yazdani et al., 2008; Gonzalez, 2009; Guebel et al., 2009).

La optimización del medio de cultivo es un paso importante en el diseño de un proceso de fermentación. Un resultado deseable es la reducción en el coste de materiales y/o de energía.

Es posible corroborar la ausencia de un medio de cultivo específicamente formulado para el proceso de biotransformación de glicerina en etanol e hidrógeno, por medio de E. coli en condiciones anaerobias. Por lo tanto la presente invención supone un avance en esta área ya que, se formuló y optimizó un medio de cultivo específico para el proceso de biotransformación de glicerina en etanol, utilizando el microorganismo E. coli MG1655. Este medio de cultivo potencia el crecimiento del microorganismo con el objetivo de obtener una concentración de E. coli que permita obtener mayores índices de producción de etanol respecto a procesos similares reportados en bibliografía. El medio de cultivo desarrollado y optimizado en este trabajo se puede considerar una manera simple y atractiva de producir el

etanol e hidrógeno usando glicerina como fuente de carbono y Escherichia coli como

biocatalizador, convirtiéndose en una alternativa atractiva ante futuras etapas de escalamiento, donde los bajos costos y la simplicidad en la formulación y preparación de un medio de cultivo es importante.

Referencias citadas:

•: Da Silva, G.P., Mack, M., Conteiro., J. 2009. Glycerol: A promising and abundant carbon source for industrial microbiology. Biotechnology Advances 27: 3(}-39.

•: Oharmadi, Y., Murarka, A., Gonzalez, R. 2006. Anaerobic Fermentation of Glycerol by Escherichia coli: A New Platform for Metabolic Engineering. Biotechnology and Bioengineering. 94(5): 821-829.

•: Gonzalez, R. 2009. Anaerobic Fermentation of Glycerol. United 5tates Patent Application. Pub. No.: U5 2009/0186392 Al.

•: Guebel, O.V., Cánovas, M., Torres, N.V. 2009. Analysis of the Escherichia coli Response to Glycerol Pulse in Continuous, High-Cell Oensity Culture Using a Multivariate Approach. Biotechnology and Bioengineering 102(3): 91(}-922.

•: Hakobyan, M., 5argsyan, H., Bagramyan K. 2005. Proton translocation coupled to formate oxidation in anaerobically grown fermenting Escherichia coli. Biophysical Chemistry 115: 55-61.

•: Kenar, J.A. 2007. Glycerol as a platform chemical: sweet opportunities on the horizon? lipid Technology 19(11): 249-253.

•: Murarka, A., Oharmadi, Y., Yazdani, S.S., Gonzalez, R. 2008. Fermentative Utilization of Glycerol by Escherichia coli and Its Implications for the Production of Fuels and Chemicals. Applied and environmental microbiology. 74(4) :1124-1135.

•: Yazdani, S.S., Gonzalez, R. 2008. Engineering Escherichia coli for the efficient conversion of glycerol to ethanol and co-products. Metabolic Engineering. 10: 340

351.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La invención consiste en un medio de cultivo formulado y optimizado para potenciar el crecimiento de la biomasa responsable de la producción de etanol e hidrógeno a partir de glicerina, en condiciones anaerobias. El medio de cultivo está compuesto de glicerina, Na2S04, NaCl, MgS04·7H20 y peptona.

Tanto glicerina y peptona, como las sales inorgánicas que componen el medio se presentan en la Tabla 1, donde es posible observar los rangos de concentración apropiados y

rangos de concentración preferidos, expresados en g r.

Tabla 1

Compuesto

Glicerina

NaCI

Peptona

Concentración
Concentración

apropiada (g L-1): preferida (g L-1)

5-50: 8-12

0,02-1,2: 0, 05-1,05

0-0,03: 0, 01-0, 02

0,01-0,05: 0, 02-0, 04

2-8: 3-6

Este medio puede ser preparado directamente o en solución concentrada, preferiblemente 15x, la peptona puede ser preparada de manera separada.

En caso de ser necesario, el medio puede ser suplementado con sales inorgánicas trazas, presentadas en la Tabla 2, en concentraciones que no resulten inhibitorias para E. coli, 15 durante este proceso.

Tabla 2

Compuesto Concentración Concentración apropiada (g L-1) preferida (g L-1)

Fe2(S04)3: 0-0,0045 0-0,00225

MnS04H2O: 0-0,0037 0-0,00185

CuS045H2O: 0-0,0047 0-0,00235

ZnS047H20: 0-0,0053 0-0,00265

(NH4)6M07024 4H2O: 0-0,00055 0-0,000275

CoCI36H2O: 0-0,001 0-0,0005

El pH del medio de cultivo puede ser ajustado a valores entre 6,0-6,5; de acuerdo a los requerimientos del proceso que se desee llevar a cabo. En la tabla 3 se muestra una comparación de los parámetros de fermentación S obtenidos en el medio propuesto, respecto a Murarka et al. (2008) Tabla 3

Parámetro Unidades En este trabajo Murarka et al. (2008) Cepa

0.0313iO.0015 0.040iO.003 () MG1655

Glicerol % 84.46±0.023 =80+ MG1655 consumido

-: 1

getano! gglicerol 0.581 0.461 MG1655

yx/s gcel gglicerol -1 0.059±0.019 0.0329±0.0029 MG1655

-lh-l

getanol el 0.128 =0.146+ MG1655

gcel r1d-1 0.165iO.0126 =0.0752+ MG1655

+calculado a partir de Murarka et al., 2008.

El medio propuesto permite producir de una manera simple y atractiva etanol e hidrógeno, reduciendo tanto el coste de formulación, como el tiempo de preparación en usos a mayor escala.

Como se observa en la Figura 2, la fase estacionaria para el crecimiento de la biomasa fue alcanzada en 70 horas de fermentación comparadas a las 97 horas necesarias en el medio no-optimizado (Figura 1). Por otra parte, la producción del etanol máxima se alcanzó a las 80 horas para el medio optimizado (Figura 2) frente a las 120 horas necesarias para el medio no optimizado (Figura 1). Los parámetros de la fermentación fueron calculados para los experimentos realizados con el medio de cultivo optimizado. Como control, estos resultados fueron comparados con datos previamente divulgados, según muestra la Tabla 1. El medio de cultivo usado por Murarka era un medio mínimo modificado diseñado por Neidhardt et al. (1973).

los resultados obtenidos con el medio de cultivo optimizado son bastante significativos frente a los reportados por Murarka et al. (2008) ya que se alcanzan valores de Ox, Yx/s Y Yp/s son 2,19, 1,79 Y 1,26 veces más altos, respectivamente, que los datos divulgados por estos autores para un proceso similar.

Respecto a la producción de hidrógeno, se encuentran dentro del orden de magnitud respecto a los reportados en literatura, para procesos similares.

BREVE DESCRIPCiÓN DE lAS FIGURAS

Figura 1.-Muestra la cinética de fermentación obtenida para medio de cultivo no-optimizado: crecimiento de biomasa (o) (aparece multiplicado cinco veces), consumo de glicerina (+) y producción de etanol (.).

Figura 2.-Muestra la cinética de fermentación obtenida para medio de cultivo optimizado: crecimiento de biomasa (o) (aparece multiplicado cinco veces), consumo de glicerina (+) y producción de etanol (.).

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, en condiciones anaerobias para potenciar la productividad de biomasa, compuesto de glicerina, Na2S04, NaCI, MgS04· 7H20 y peptona.
2.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 1, en el que la concentración de glicerina se encuentra en un rango de entre 5 y 50 g L-1•
3.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 1, en el que la concentración de Na2S04 se encuentra en un rango de entre 0, 02 y 1,2 g L-1.
4.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 1, en el que la concentración de NaCI se encuentra en un rango de entre O y 0,03 g L-1•
5.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 1, en el que la

concentración de MgS04· 7H20 se encuentra en un rango de entre 0,01 y 0,05 g r.
6.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 1, en el que la concentración de Peptona se encuentra en un rango de entre 2 y 8 g L-1.
7.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicaciones 1 y 2, en el que la concentración de glicerina preferida se encuentra en un rango de entre 8 y 12 g L-1•
8.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicaciones 1 y 3, en el que la concentración de Na2S04 preferida se encuentra en un rango de entre 0,05 y 1,05 g L-1•
9.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicaciones 1 y 4, en el que la concentración de NaCI preferida se encuentra en un rango de entre 0,01 y 0,02 g r1•
10.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicaciones 1 y 5, en el que la concentración de MgS04· 7H20 preferida se encuentra en un rango de entre 0,02 y 0,04

L"l
11.

Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a

partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicaciones 1 y 6, en el que la 1

concentración de Peptona preferida se encuentra en un rango de entre 3 y 6 g r.
12. Medio de cultivo simplificado y optimizado para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia colí, según reivindicaciones 1 a 11, preparado

10 directamente o en solución concentrada, preferiblemente 15x, la peptona puede ser preparada de manera separada.
13. Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicaciones 1 a 12, suplementado con las sales inorgánicas

15 14. Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 13, en el que la concentración de Fe2(S04h se

encuentra en un rango de entre O y 0,0045 g r.
15. Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 13, en el que la concentración de MnS04 H20 se

20 encuentra en un rango de entre O y 0,0037 g r.
16.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 13, en el que la concentración de CUS04 5H20 se encuentra en un rango de entre O y 0,0047 g r1•
17.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por

25 Escherichia coli, según reivindicación 13, en el que la concentración de ZnS04 7H20 se encuentra en un rango de entre O y 0,0053 g r1•
18.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 13, en el que la concentración de (NH4)6Mo7024 4H20 se encuentra en un rango de entre O y 0,0055 g L"l.
19.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por

Escherichia coli, según reivindicación 13, en el que la concentración de CoCI3 6H20 se encuentra en un rango de entre O y 0,001 g r1.
20.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia colí, según reivindicación 14, en el que la concentración de Fe2(S04h preferida se encuentra en un rango de entre O y 0,00225 g r1.
21.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 15, en el que la concentración de MnS04 H20 preferida se encuentra en un rango de entre O y 0,00185 g r1.
22.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coJi, según reivindicación 16, en el que la concentración de CUS04 5H20 preferida se encuentra en un rango de entre O y 0,00235 g L-1.
23.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia coli, según reivindicación 17, en el que la concentración de ZnS04 7H20 preferida se encuentra en un rango de entre O y 0,00265 g L-1•
24.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia colí, según reivindicación 18, en el que la concentración de (NH4)6M07024 4H20 preferida se encuentra en un rango de entre O y 0,00275 g r1.
25.

Medio de cultivo para la producción de etanol e hidrógeno, a partir de glicerina, por Escherichia colí, según reivindicación 19, en el que la concentración de CoCI3 6H20 preferida se encuentra en un rango de entre O y 0,0005 g r1•
26.

Uso del medio de cultivo simplificado y optimizado, según reivindicación 1, en procesos de producción de etanol e hidrógeno a partir de glicerina por Escherichia colí.
27.

Uso del medio de cultivo simplificado y optimizado, según reivindicaciones 2 a 6, en procesos de producción de etanol e hidrógeno a partir de glicerina por Escherichia coli.
28.

Uso del medio de cultivo simplificado y optimizado, según reivindicaciones 7 a 12, en procesos de producción de etanol e hidrógeno a partir de glicerina por Escherichia coli.
29.

Uso del medio de cultivo simplificado y optimizado, según reivindicaciones 13, en procesos de producción de etanol e hidrógeno a partir de glicerina por Escherichia colí.
30.

Uso del medio de cultivo simplificado y optimizado, según reivindicaciones 14 a 19, en procesos de producción de etanol e hidrógeno a partir de glicerina por Eseheriehia eoli.
31.

Uso del medio de cultivo simplificado y optimizado, según reivindicaciones 20 a 25, en procesos de producción de etanol e hidrógeno a partir de glicerina por Eseheriehia eoli.