ES2397330T3

ES2397330T3 - Preparado farmaceútico para el tratamiento de arterioesclerosis que contiene como componente activo una sustancia de acción anti-apoptótica

Info

Publication number: ES2397330T3
Application number: ES04003517T
Authority: ES
Inventors: Mark Freyberg; Peter Friedl; Dirk Kaiser
Original assignee: Cytotools AG
Current assignee: Cytotools AG
Priority date: 1999-11-03
Filing date: 2000-11-02
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2020-11-02
Also published as: DE50006011D1; US20090162381A1; JP2003536049A; US20120282277A1; EP1512412B1; EP1512412A1; EP1226433B1; US7008773B1; EP1226433A1; AU1517401A; JP4634682B2; WO2001033218A1; DE19952960A1; US8252283B2; US20060172921A1; ATE263972T1

Abstract

Preparado farmacéutico para el tratamiento de la arterioesclerosis, que contiene como componente activo unasustancia activa antiapoptótica, que se une a por lo menos un compuesto seleccionado entre trombospondina-I (TSP-I),proteína asociada a integrina (IAP) e integrina αVß3 (αVß3) de tal modo que se inhibe la unión simultánea de TSP-1 a IAPy a αVß3, y caracterizado porque la sustancia es seleccionada entre el grupo compuesto por anticuerpos específicos y/ofragmentos de estos, que poseen un sitio de unión al antígeno, contra TSP-1, IAP y/o αVß3.

Description

Preparado farmacéutico para el tratamiento de arterioesclerosis que contiene como componente activo una sustancia de acción anti-apoptótica

La invención se refiere a un procedimiento para la identificación de sustancias activas antiapoptóticas y a las sustancias identificadas por medio de éste. La invención se refiere además a preparados farmacéuticos que contienen tales sustancias, así como a su utilización para el tratamiento de enfermedades vasculares.

La arterioesclerosis (“endurecimiento de las arterias”) es la alteración patológica de las arterias más importante y más frecuente. Se produce aquí una alteración del contenido vascular y lesiones del endotelio (de las células endoteliales) y, provocado por esto, se producen reacciones metabólicas y celulares de la pared vascular. Los trastornos de la irrigación arterial son la causa de muerte más frecuente en los países industrializados (aprox. 50%). En la mayoría de los casos la causa es una arterioesclerosis.

La efectividad de los medios utilizados actualmente contra las enfermedades cardíacas coronarias se basa sustancialmente en disminuir el consumo de oxígeno del miocardio y adaptarlo a la irrigación coronaria reducida. Estos medios provocan, además, una dilatación de las arterias coronarias. En el caso de estenosis coronarias arterioescleróticas, en cambio, casi no es posible un aumento medicamentoso de la irrigación coronaria porque los vasos enfermos ya no pueden ser dilatados. Todos los medicamentos se administran recién en un estadio muy tardío de la enfermedad. No se conocen hasta ahora agentes que puedan tratar directamente la causa de la enfermedad o que sean adecuados para un reconocimiento temprano. Ante la falta de una posibilidad efectiva para el diagnóstico temprano, la mayoría de los pacientes son tratados recién después de un infarto cardíaco. En el estadio avanzado en la mayoría de los casos sólo es posible una intervención quirúrgica (por ejemplo, bypass).

Las paredes interiores de todos los vasos sanguíneos están recubiertas con células endoteliales. Éstas participan en la regulación de diversos procesos fisiológicos, como por ejemplo, la regulación de la presión sanguínea y la degradación y la nueva formación de los vasos. Una multiplicidad de situaciones patológicas está ligada con la mala función de las células endoteliales, por ejemplo, el desarrollo focal de la arterioesclerosis.

La apoptosis (sinónimo: muerte celular programada) es un proceso irreversible y no se puede detener. Una célula apoptótica muere por lo tanto inevitablemente.

En la solicitud de patente europea EP-A-0 903 149, se describe un procedimiento para la identificación de sustancias que activan la apoptosis en células inmunológicas. Se ha demostrado que las sustancias que se unen a una proteína asociada a integrina (IAP o CD 47) sobre la superficie de las células inmunológicas pueden tener la capacidad de activar la apoptosis. No se describieron los mecanismos de acción.

Ya se ha propuesto que la IAP participa en la formación de un canal de calcio específico (Schwartz, M. A. et al., The Journal of Biological Chemistry, 268: 27, 19931-19934). No se mencionó un papel de este canal de calcio hipotético en la activación de la apoptosis.

En bifurcaciones (ramificaciones) en el sistema vascular, se forman con mayor frecuencia lesiones arterioescleróticas que en zonas no ramificadas de los vasos sanguíneos. En la zona de estas lesiones, ya se pudieron observar células endoteliales apoptóticas. Se comenta una participación de las células endoteliales apoptóticas en la formación de la arterioesclerosis [Asakura, T., Karino, T., Circulation Research, 66, 1045-1066 (1990).

La publicación de SAMANEN J. et al.: "Vascular indications for integrin av antagonists" CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN, Vol. 3, No. 6, 1997, páginas 545-584, y el documento WO 99/52551 A describen el impedimento de una nueva formación de tejido.

No se conocen actualmente agentes que eviten la aparición de la apoptosis en los endotelios del sistema vascular o para tratarla terapéuticamente.

La presente invención tiene por lo tanto por objeto proveer un procedimiento con el cual se puedan hallar sustancias que inhiban la apoptosis en las células endoteliales. Este procedimiento deberá ser de manipulación sencilla, y seguro y económico en su realización. Las sustancias así identificadas deberán utilizarse como componentes de preparados farmacéuticos para el tratamiento de condiciones en las cuales está indicada una inhibición de la apoptosis, especialmente de la arterioesclerosis.

Este objeto se logra por medio de un preparado farmacéutico con todas las características de la reivindicación 1 así como un uso para la preparación de un medicamento de acuerdo con la reivindicación 3. Formas de realización ventajosas de estos objetos se presentan en las reivindicaciones secundarias 2 y 4.

Sorprendentemente los inventores demostraron que la unión simultánea de trombospondina-1 (TSP-1) a la IAP y a la integrina avß3, en las células endoteliales activa la apoptosis. Además se pudo demostrar sorprendentemente, que la TSP-1 es formada por las propias células endoteliales, es decir, se trata de una apoptosis autoinducida o espontánea.

Estas investigaciones se llevaron a cabo en cultivos celulares estáticos, convencionales. Estos se caracterizan por la falta de flujos en el medio de cultivo celular. Pero se pudo demostrar en forma inesperada, que las células endoteliales en un cultivo de perfusión, es decir, bajo condiciones, en las cuales las células se ven confrontadas con un medio de cultivo celular que fluye, no se forma la TSP-1 y no aparece la apoptosis en este cultivo celular o sólo en medida muy reducida.

Una suplementación de medio fresco con TSP-1 causa un aumento de la apoptosis espontánea en células endoteliales cultivadas estáticamente. Este aumento corresponde aproximadamente al efecto de un medio condicionado estáticamente (es decir, un medio que ya se usó antes durante el cultivo de HUVEC en cultivo estático) (Tabla 1). Esto muestra que el medio condicionado estáticamente posee la capacidad de inducir la apoptosis a través de un mediador como TSP-1.

El concepto medio "condicionado" significa aquí un medio de cultivo celular, que ya se usó antes para el cultivo de otras células. Este medio se caracteriza porque en él se encuentran disueltos mediadores solubles, por ejemplo, factores de crecimiento hormonal, etc., los que son formados por las células en el transcurso de su cultivo.

Por medio del uso de un anticuerpo anti-TSP-1, el cual se une a la TSP-1 y de este modo la neutraliza, se pudo demostrar que la TSP-1 es el mediador de la apoptosis de las células endoteliales. El efecto de la TSP-1 agregada, así como el efecto de medio condicionado estáticamente puede ser inhibido por medio de un antisuero policlonal agregado contra TSP-1, como también por medio del agregado de un anticuerpo anti-TSP-1 monoclonal (Tabla1).

Condiciones de cultivo: Medio de cultivo (24 hs) Tasa de apoptosis (%)

Estática: Medio fresco (a) 0,9 ± 0,1

Estática: Medio condicionado (b) 3,0 ± 0,2

Estática: Condicionado + anti TSP-1 (c) 0,1 ± 0,1

Estática: Fresco + TSP-1 (e) 3,0 ± 0,4

Estática: Fresco + anti-TSP-1 (d) 0,2 ± 0,1

Estática: Fresco ´TSP-1 + anti-TSP-1 (f) 0,2 ± 0,1

Estática: Fresco + mAk TSP-1 (g) 0,4 ± 0,1

Tabla 1

La tasa de apoptosis (%) se determinó como se muestra en el Ejemplo 6. Las letras (a) a (g) se refieren a las investigaciones presentadas en el Ejemplo 10 y a las condiciones de ensayo específicas allí seleccionadas (ver Ejemplo 10).

Además se demostró por medio de los ensayos de Western Blot cualitativamente, que la TSP-1 sólo es segregada por células endoteliales cultivadas estáticamente (Figura 1). Las tasas de secreción fueron determinadas para cultivos postconfluentes dinámicos y estáticos (Figura 2). Los resultados mostraron que la inducción de la apoptosis puede ser controlada por medio de la tasa de secreción de la TSP-1.

El concepto “(condiciones de) cultivo celular estático" significa aquí un cultivo de células bajo condiciones en las cuales no aparecen flujos laminares continuos, es decir, direccionados en forma constante, en el medio celular que rodea a las células. Las "condiciones de cultivo celular estáticas” en el sentido aquí utilizado comprenden aquí también aquellas condiciones de cultivo celular bajo las cuales aparecen flujos laminares turbulentos o discontinuos, es decir, por ejemplo, aquellos que tienen direcciones de flujo cambiantes o incluso con inversión de flujo. El concepto "(condiciones de) cultivo celular dinámico” significa aquí aquellas condiciones de cultivo celular en las cuales predominan sólo condiciones de flujo laminares, direccionadas en forma constante en el medio de cultivo, es decir, condiciones de cultivo celular tales como las que se pueden alcanzar en el estado de la técnica, por ejemplo, con ayuda de un así llamado cultivo de perfusión. Está claro que tanto en el sistema vascular sanguíneo, es decir, en la situación in vivo, como también bajo condiciones de cultivo celular, no se alcanzan las condiciones de la hidrodinámica físicas ideales. En el caso de las condiciones de flujo aquí descriptas se trata de aquellas que se pueden alcanzar y se utilizan aproximadamente en general en los experimentos de cultivo celular en el estado de la técnica.

Según las condiciones de flujo actúan diferentes fuerzas de cizallamiento sobre las células cultivadas. Un flujo laminar direccionado en forma constante da por resultado una fuerza de cizallamiento que es mayor que 0,001 dyn/cm2 y cuya suma de vectores es mayor que bajo condiciones de flujo discontinuas con direcciones de flujo cambiantes. Las

(condiciones de) cultivo celular estáticas se caracterizan por un efecto de fuerza claramente más pequeño (< 0,001 dyn/cm2) o ningún efecto de fuerza. Los cultivos celulares dinámicos presentan fuerzas de cizallamiento de > 0,001 dyn/cm2 o un número de Reynolds de > 0,1. Con números de Reynolds de > 200 (-1000) pueden aparecer flujos turbulentos (dependiendo de la geometría de la cámara de flujo), las que como las condiciones de flujo estáticas o discontinuas no tienen carácter protector sobre la activación de la apoptosis.

La adición de TSP-1 a un cultivo de perfusión en general, no tiene efecto, sin embargo, sorprendentemente sobre la apoptosis. Esto demuestra que la apoptosis no sólo depende de la aparición de la TSP-1 en la corriente sanguínea, sino más bien de la aparición o de la accesibilidad de receptores específicos sobre la superficie de las células. Aquí se pudo demostrar sorprendentemente que el receptor integrina avß3 se puede determinar en células cultivadas en forma estática y dinámica, en cambio el receptor IAP sólo se expresa en cultivo estático en cantidades detectables.

Es conocido que la TSP-1 se une a la integrina avß3. La unión de la TSP-1 a la integrina avß3 es mediada a través de un motivo de secuencia RGD. Por eso se agregó un potente agonista de la unión mediada por RGD, un péptido cíclico Arg-Gly-Asp-(D-Phe)-Val (Péptido RGD cíclico) (Firma Merck), a células endoteliales post-confluentes. Esto sin embargo, no tuvo efecto inesperadamente sobre la tasa de apoptosis. Se demostró que por lo menos la sola unión de TSP-1 a la integrina avß3 no conduce a la inducción de la apoptosis (Tabla 2).

Medio de cultivo (48 hs): Tasa de apoptosis (%)

Medio fresco (Control): 1,5 ± 0,2

Medio condicionado: 6,4 ± 0,5

Fresco + TSP1: 6,9 ± 1,2

Fresco + RGD activo: 1,2 ± 0,5

Fresco + RGD inactivo: 1,0 ± 0,4

Fresco + CBD: 2,0 ± 0,2

Fresco + CBD +RGD activo: 7,0 ± 0,6

Fresco + CBD + RGD inactivo: 1,7 ± 0,6

Fresco + CBD + RGD activo + anti-TSP1: 6,3 ± 1,3

Tabla 2

La tasa de apoptosis se determinó como se muestra en el Ejemplo 6. El cultivo en medio fresco sirve para el control y muestra la tasa de apoptosis espontánea en cultivo celular estático. El medio condicionado es aquel que se incubó ya durante 48 a 72 horas con células endoteliales, de modo que ya contenía factores segregados por las células endoteliales. El medio condicionado provocó una tasa de apoptosis en la misma cantidad que medio fresco + TSP-1 y mostró de este modo que en este medio condicionado tenían que encontrarse uno o más mediadores de la apoptosis. La preparación del medio condicionado se explica en el Ejemplo 5.

Otra interacción posible de la TSP-1 con un receptor sobre las células endoteliales es la unión a la IAP a través de los dominios de unión celular (CBD) C- terminales. El dominio de unión celular C-terminal (CBD) es un dominio de la TSP-1, el cual interactúa específicamente con la IAP. Una TSP-1 más corta, que sólo está compuesta por este dominio de unión celular C-terminal, es comercializada por la firma Bachem como péptido CBD. La adición del péptido CBD no condujo a un aumento de la tasa de apoptosis (Tabla 2). La adición simultánea del péptido CBD y del péptido RGD cíclico llevó sin embargo sorprendentemente a un claro aumento de la tasa de apoptosis (Tabla 2), que era casi tan alto como el aumento de la tasa de apoptosis por la adición de TSP-1. De esto se deduce que sólo una unión simultánea a la IAP y a la integrina avß3 es apoptóticamente efectiva.

La sustitución por un péptido RGD inactivo para uno de los otros dos péptidos hace que el efecto desaparezca nuevamente. Una administración simultánea de un antisuero anti-TSP-1 y los dos péptidos activos no tiene efecto sobre el aumento de la tasa de apoptosis (Tabla 2). Esto demuestra que la formación de TSP-1 durante la incubación no tiene influencia. De esta manera se pudo demostrar sorprendentemente que la actividad de la TSP-1 para la inducción de la apoptosis espontánea es mediada a través de la unión simultánea a la IAP y a la avß3.

Después de la unión de la TSP-1 a la IAP y a la avß3, se produce un flujo de calcio hacia adentro de la célula (Figura 3). Este flujo de calcio hacia adentro se observa directamente después de la adición (en un período de tiempo de algunos segundos) y es un paso de la transducción de señales, la que finalmente conduce a la activación de la apoptosis. Por medio del uso de indicadores de calcio fluorescentes [Merrit, J. Z. et. al., Biochem. J. 269, 513-519 (1990)] se puede preparar con esto un procedimiento de prueba muy rápido para determinar la inhibición de la apoptosis por la falta de la señal de calcio (Figura 3, explicado con más detalles en el Ejemplo 7).

En otras investigaciones realizadas por los inventores se pudo demostrar que no sólo condiciones de cultivo estáticas llevan a la inducción de la apoptosis en células correspondientes, sino que son suficientes para ello condiciones de flujo discontinuas o turbulentas. Por medio de la introducción de un impedimento en una cámara de perfusión se producen flujos discontinuos. Un modelo de esto se muestra en la Figura 4. Una cámara de flujo se caracteriza por la posibilidad de generar un flujo de líquido que es conducido a través de la cámara de flujo con tasas de flujo definidas. El flujo puede ser empujado por ejemplo, por una bomba o la fuerza de la gravedad. El líquido en cada caso se conduce por medio de mangueras o tuberías adecuadas a través de la cámara propiamente dicha. En el presente sistema se trata de mangueras de silicona y tuberías de acero inoxidable. La cámara es definida por una placa de Petri con un inserto de policarbonato y suplementos de silicona.

Existen también otras posibilidades de generar un flujo laminar. Para ello se pueden usar también otros aparatos adecuados, por ejemplo, un aparato de placa cónica, en el cual el flujo es generado haciendo girar una placa llena de líquido o haciendo girar un sello cilíndrico en el líquido de la placa.

Además se pudo demostrar por primera vez por investigaciones in vitro que justo en las regiones de corrientes de flujo discontinuas se produce la inducción de la apoptosis en células endoteliales. Esto se pudo probar por un estudio realizado localmente de células apoptóticas en el sistema de perfusión (Figura 5).

Los resultados presentados muestran que la causa real de la inducción de la apoptosis es la falta de un flujo laminar continuo. Por esta causa las células endoteliales son inducidas a la secreción de TSP-1, lo que a continuación por la interacción con la integrina avß3 y la IAP lleva a la inducción de la apoptosis.

En base a los hallazgos presentados se puede desarrollar un procedimiento de prueba por medio del cual es posible buscar en forma direccionada inhibidores de la activación de los procesos de apoptosis. De este modo se pueden identificar sustancias que actúan antiapoptóticamente. Para ello se cultivan células que expresan tanto la IAP como también la integrina avß3. Éstas pueden ser células naturales o generadas en forma recombinante. Tales células son conocidas por un experto en el arte. Se trata preferentemente de células endoteliales cultivadas y en una forma de realización especialmente preferida de células endoteliales de venas del cordón umbilical humano (HUVEC). Ejemplos de células adecuadas son además los monocitos, eritrocitos, células T activadas, fibroblastos, plaquetas de la sangre, células CHO, células musculares lisas y células de tumores ováricos. También pueden ser adecuadas líneas celulares completas, tales como las líneas celulares de la médula. Las células utilizadas en el procedimiento de acuerdo con la invención también pueden ser células que fueron modificadas por tecnología genética de tal modo que expresan sobre su superficie celular IAP o integrina avß3 recombinante, modificada eventualmente manteniendo la propiedad de unión original.

La presente invención emplea por lo tanto un procedimiento para la identificación de sustancias activas antiapoptóticamente, en el cual i) se cultivan células que expresan tanto la IAP como también la integrina avß3, ii) se induce a las células a que formen una sustancia que induce la apoptosis, y/o se agrega una sustancia o sustancias, que induce/n la apoptosis, iii) se agrega la sustancia de prueba, y iv) se mide la tasa de apoptosis. Las células utilizadas son células endoteliales, preferentemente células endoteliales de venas del cordón umbilical humano (HUVEC), células endoteliales placentarias humanas (HPEC), células endoteliales de aorta de bovino (BABC), células endoteliales de capilares de cerebro porcino (PSMEC), líneas celulares híbridas (EA.hy 926) y células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC). Las células utilizadas son preferentemente en especial las células musculares lisas o fibroblastos. Las células utilizadas igualmente preferidas son las células modificadas por tecnología genética, las que expresan la IAP y la avß3 sobre su superficie. En otro ejemplo de realización, las células endoteliales son cultivadas bajo condiciones en las cuales no aparecen flujos laminares direccionados en forma continua. También se prefiere agregar TSP-1 o un compuesto análogo con las mismas propiedades de unión para el cultivo celular en el paso ii) del procedimiento. La activación de la apoptosis se puede determinar preferentemente por medio de la medición del flujo de calcio hacia adentro aumentado en la célula. Bajo otro punto de vista la tasa de apoptosis se puede determinar de forma ya conocida por medio de coloración DAPI, ensayo TUNEL, conductor ADN, coloración con anexina o una determinación enzimática. La invención se refiere además a sustancias que se puedan identificar de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, y las que eventualmente se pueden unir a por lo menos un compuesto seleccionado entre TSP-1, IAP y avß3, de tal modo que se inhibe la unión simultánea de TSP-1 a IAP o avß3. Preferentemente estas sustancias son aquellas que inhiben la unión de TSP-1 a IAP o integrina avß3 sobre la superficie celular de las células endoteliales, las células endoteliales placentarias humanas (HPEC), las células endoteliales de aorta bovina (BAEC), las células endoteliales de capilares porcinos (PBMEC), las líneas celulares híbridas (EA.hy 926) y las células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC) o células recombinantes correspondientes. También se prefieren las sustancias que inhiben la unión de TSP-1 a IAP o integrina avß3 sobre la superficie celular de células musculares lisas o fibroblastos. Se prefieren además las sustancias que se pueden identificar con el procedimiento arriba indicado y que se unen a un canal de calcio en la membrana celular de tal modo que se inhibe el flujo de calcio hacia adentro específico de la apoptosis en la célula, en donde preferentemente participa la IAP en la formación del canal de calcio. La presente invención se refiere también a sustancias que inhiben el flujo de calcio hacia adentro específico de la apoptosis en células endoteliales, células endoteliales placentarias humanas (HPEC), células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales de capilares porcinos (PBMEC), líneas celulares híbridas (EA.hy 926) y células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC) o células recombinantes correspondientes así como células musculares lisas o fibroblastos. Las sustancias son preferentemente anticuerpos, péptidos o compuestos de bajo peso molecular. La invención se refiere además a un preparado farmacéutico que contiene como principio activo una de las sustancias arriba mencionadas. Preferentemente, el preparado farmacéutico es adecuado para el tratamiento de enfermedades vasculares, preferentemente de arterioesclerosis. La invención se refiere además al uso de estas sustancias para el tratamiento de enfermedades vasculares, preferentemente de arterioesclerosis.

Estas células se cultivan en recipientes para cultivo celular adecuados, en los medios de cultivo celular adecuados, comúnmente son medios estándar que son conocidos en general en el estado de la técnica. Por ejemplo, las células se cultivan en DMEM, M-199, medio basal IF, etc. Para casi todas las células y líneas celulares existen actualmente medios de cultivo adecuados. Al medio de cultivo se pueden agregar antes de comenzar el cultivo factores de crecimiento y hormonas, como por ejemplo, suero fetal de ternero (FCS, fetal calf serum). El cultivo de células de mamíferos se realiza generalmente a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO2, la que junto con los tampones utilizados en los medios de cultivo celular, por ejemplo, tampones de carbonato de sodio, posibilitan la estabilización del valor de pH del medio de cultivo celular. Además se pueden agregar a los medios de cultivo celular antes de comenzar el cultivo antibióticos, los que interactúan específicamente con microorganismos contaminantes procarióticos e inhiben su crecimiento, pero que casi no influyen sin embargo sobre el crecimiento de las células eucarióticas y así protegen al cultivo celular de la contaminación. Otras indicaciones y datos para el cultivo celular se pueden obtener de obras estándar, por ejemplo, Zell- und Gewebekultur, 3ra. edición, Toni Lindl, Jörg Bauer, (1994), Gustav Fischer Verlag.

Condiciones de cultivo adecuadas para el cultivo de HUVEC y otras células endoteliales se indican en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2.

La apoptosis se induce por lo tanto por medio de las condiciones de cultivo o por el agregado de una o más sustancias que inducen la apoptosis. Tales condiciones de cultivo son especialmente aquellas bajo las cuales no aparecen flujos laminares regulares, como se explicó más arriba.

Para la inducción o el aumento de la tasa de apoptosis se pueden agregar al sistema de prueba mediadores adicionalmente, o en lugar de, las condiciones de flujo elegidas. El agregado simultáneo de mediadores aumenta la sensibilidad del sistema de prueba. La tasa de apoptosis espontánea de un cultivo celular estático es relativamente reducida, comparada con las tasas de apoptosis que son activadas por mediadores, como TNF-a. En la tasa de apoptosis espontánea, activada por las condiciones de cultivo celular estáticas, se alcanzan tasas de apoptosis en el rango de 0,5% a 7% de las células totales. En la apoptosis provocada por mediadores se pueden alcanzar tasas de apoptosis de hasta 50%.

En el procedimiento se agregan por lo tanto muy especialmente, antes de la medición de la inhibición de la tasa de apoptosis por inhibidores potenciales, sustancias que inducen una tasa de apoptosis aumentada, de modo que se refuerza la señal de medición. Preferentemente se logran por medio del mediador agregado tasas de apoptosis de por lo menos 1% hasta más del 10 al 50%. Más preferentemente se agrega aquí TSP-1 al sistema de cultivo celular, ya que la TSP-1 es un mediador natural de la apoptosis, cuya interacción con los receptores celulares IAP y avß3 tiene que ser inhibida. Por medio del agregado de TSP-1 se pueden alcanzar tasas de apoptosis del 5%, preferentemente del 7%, con mayor preferencia, del 10% en función de la concentración del mediador. Queda claro, sin embargo, que también otras sustancias, que interactúan de forma análoga a TSP-1 con avß3 y IAP, son adecuadas de acuerdo con la invención. Una alternativa a TSP-1 en el sentido arriba indicado es el aumento de la tasa de apoptosis por medio del agregado simultáneo de los péptidos RGD y CBD.

Estos mediadores son hormonas y otras sustancias, que son apoptóticamente activas. Estos mediadores se agregan en forma disuelta al cultivo celular, debiendo tener en cuenta que las soluciones utilizadas tienen que ser estériles. La esterilidad de las soluciones se puede lograr de diversas maneras, preferentemente por tratamiento térmico (colocación en autoclave a 2 bar y 120 °C), o, si este procedimiento no es adecuado debido a una especial sensibilidad del mediador al calor, por medio de filtración estéril, por ejemplo con un filtrado estéril de uso único Nalgene. Tales procedimientos para la esterilización de agregados para el cultivo celular son bien conocidos por el experto.

Para la identificación de sustancias activas antiapoptóticamente se agregan sustancias de prueba al cultivo celular, cuyo efecto sobre la apoptosis de las células cultivadas tiene que ser investigada. Preferentemente se trata de anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos policlonales y péptidos. También se pueden agregar, sin embargo, otras sustancias, de la cuales se supone que pueden desarrollar una acción antiapoptótica. Estas sustancias se administran preferentemente en forma disuelta. Los solventes tienen que ser compatibles con el cultivo celular. Preferentemente estas sustancias de prueba se disuelven por lo tanto en soluciones tampón como se han hecho muy comunes en el cultivo celular. Ejemplos de estos son tampón fosfato, tampón carbonato de sodio y otros. Las sustancias de prueba disueltas deben ser filtradas en forma estéril (esterilizadas) preferentemente antes del agregado al cultivo celular por filtración estéril (Filtro estéril de uso único Nalgene), para eliminar microorganismos contaminantes o esporas de hongos y componentes no disueltos.

Preferentemente, la sustancia de prueba disuelta se atempera antes del agregado al cultivo celular, es decir, se adapta a la temperatura del cultivo celular. Los volúmenes se adecuan según la concentración de la sustancia de prueba usada que se debe alcanzar y preferentemente se trata de volúmenes reducidos, para que no aparezcan efectos de dilución en los medios de cultivo. Los procedimientos con los cuales deben ser introducidas tales sustancias de prueba en los cultivos celulares, preferentemente en estado disuelto, son conocidos por el experto.

La disminución de la tasa de apoptosis puede ser determinada por cualquier procedimiento adecuado. Especialmente adecuado como indicador temprano es la medición de la ausencia del flujo de calcio hacia adentro de la célula por medio de la utilización de indicadores de calcio intracelulares. Un procedimiento que es adecuado para determinar las tasas de apoptosis exactas es la coloración de los ADN de células apoptóticas y el subsiguiente análisis del núcleo celular morfométrico o el análisis del contenido celular de ADN en un citómetro de flujo. Un ejemplo de un colorante de fluorescencia adecuado es el DAPI. Estos procedimientos son bien conocidos en el estado de la técnica y se utilizan en general como comprobante de células apoptóticas. Si el número de células apoptóticas disminuye después del uso de un inhibidor potencial de la apoptosis en más del 50%, preferentemente más de 70% y con mayor preferencia, aún más de 90%, referido al número de células apoptóticas en el sistema de prueba en el cultivo estático, eventualmente después del agregado de una sustancia que induce la apoptosis, entonces esta sustancia vale de acuerdo con la invención como inhibidor de la apoptosis en las células utilizadas. Como indicador temprano para fines de rastreo se puede utilizar la ausencia del flujo de calcio hacia adentro de la célula. Las sustancias que llevan a la ausencia del flujo de calcio hacia adentro, tienen que ser examinadas a continuación por coloración con DAPI.

Además se pueden usar también otros colorantes de ADN (por ejemplo, Hoechst 33258) o procedimientos comunes, tales como el ensayo TUNEL (Tdt-mediated XdUTP nick end labeling; rupturas de ADN), la determinación de enzimas apoptóticas (por ejemplo, PARP, caspasas) o proteínas (por ejemplo, p53, CD95), la translocación de fosfatidilserina con anexina fluorescente o la determinación del ADN conductor en el gel de agarosa.

Con el procedimiento se pueden encontrar sustancias con acción antiapoptótica. Preferentemente son compuestos que se unen o bien a receptores sobre la superficie celular, con mayor preferencia, IAP y/o la integrina avß3 o a factores humorales en la circulación sanguínea, con mayor preferencia, TSP-1, de tal modo que no se produce la interacción simultánea específica aquí descripta entre TSP-1 y IAP y avß3, la que conduce a la inducción de la apoptosis, de modo que no se puede inducir la apoptosis y por lo tanto no se produce.

En otra forma de realización preferida, estas sustancias se unen a la IAP y evitan de este modo la entrada de calcio en la célula específica de la apoptosis, de modo que no se puede inducir la apoptosis y por lo tanto no se produce.

Estos inhibidores son adecuados para la preparación de preparados farmacéuticos que pueden ser utilizados para el tratamiento de condiciones en las cuales se desea la inhibición de la apoptosis, preferentemente en el sistema vascular para la inhibición de la apoptosis de células endoteliales y otras células (por ejemplo, células musculares lisas). En principio, por medio de las sustancias de acción antiapoptótica identificables por medio del procedimiento, se pueden inhibir estados apoptóticos en todas las células que expresan IAP y avß3 sobre su superficie. Con esto es posible un tratamiento de condiciones en las cuales está indicada una inhibición de la apoptosis, como especialmente en la arterioesclerosis, la que a través de una inhibición de la muerte celular programada en las lesiones, lleva a una mejora del estado de los vasos. También es posible un tratamiento profiláctico mediante el uso de tales inhibidores en los preparados farmacéuticos.

Substancias activas a probar con el procedimiento son anticuerpos, sobre todo anticuerpos monoclonales, los que se pueden obtener con los métodos usuales de la biología molecular y la tecnología genética. El concepto "anticuerpos” se utiliza aquí para describir tanto los anticuerpos completos (es decir, anticuerpos que poseen dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas) como también fragmentos de anticuerpos que poseen un sitio que se une a antígenos. La identificación de un anticuerpo anti-TSP-1 con acción antiapoptótica se describe en el Ejemplo 10. De manera similar, se pueden probar muchos otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, para evitar la inducción de la apoptosis.

Está claro que se pueden preparar una serie completa de péptidos y anticuerpos (fragmentos de anticuerpos), que se pueden identificar de manera similar con el procedimiento de acuerdo con la invención como activos antiapoptóticamente.

La preparación de preparados correspondientes se realiza de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, anticuerpos (fragmentos de anticuerpos), que son un componente activo de un preparado farmacéutico, se pueden disolver en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden ser las soluciones tampón, como el tampón fosfato o el tampón citrato. Para mantener la actividad de los péptidos también se pueden agregar reactivos que son farmacéuticamente aceptables y por ejemplo, mantienen un medio reductor en el preparado farmacéutico.

La dosificación y posología específicas para cada paciente depende de diversos factores, inclusive la actividad de los compuestos específicos utilizados, la edad del paciente, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la alimentación, el tiempo de la administración, la vía de administración, la tasa de excreción, la combinación con otros medicamentos y la gravedad de la enfermedad individual para la cual se aplica esta terapia. Será calculada por un médico en función de estos factores.

Los medicamentos a base de anticuerpos se administran comúnmente en forma parenteral, por ejemplo, por un spray de inhalación, en forma rectal, por técnicas de inyección e infusión subcutánea, endovenosa, intramuscular, intraarticular e intratecal, o además en formulaciones farmacéuticas, que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. Según el tipo de sustancia identificada se pueden considerar también otras vías de administración, por ejemplo, oral.

La invención provee además composiciones farmacéuticas, que comprenden una cantidad efectiva de una sustancia de acción antiapoptótica en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable convencional. Un portador farmacéutico es, por ejemplo, una carga sólida o líquida, un material de encapsulación o un solvente. Ejemplos de materiales, que pueden servir como portadores farmacéuticos, son azúcares como lactosa, glucosa y sacarosa; almidón como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; sebo; portadores de medicamentos como manteca de cacao y ceras de supositorios, como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; polioles como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tampón como hidróxido de sodio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos, solución salina isotónica; solución de Ringer, alcohol etílico y soluciones tampón fosfato, como también otras sustancias compatibles no tóxicas, que se usan en las formulaciones farmacéuticas. Humectantes; emulsionantes y lubricantes como laurilsulfato sódico y estearato de magnesio, como también colorantes; lubricantes, agentes de recubrimiento así como agentes de perfume y conservantes también pueden estar presentes en los preparados, de acuerdo a los requerimientos del galeno. La cantidad del principio activo que puede ser combinada con los materiales portadores, para producir una dosis individual, variará dependiendo del paciente tratado y del método de administración especial. Un ejemplo para una formulación farmacéutica como ésta se muestra en el Ejemplo 13.

Abreviaturas

IAP: Proteína asociada a integrina (CD 47)

CBD: Dominio de unión celular C-terminal

LSD-1: Trombospondina 1

RGD : Arg-Gly-Asp

HUVEC: Células endoteliales de venas del cordón umbilical humano

HPEC: Células endoteliales placentarias humanas

DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol

Las siguientes figuras explican con mayores detalles la invención:

La Figura 1 muestra la determinación de trombospondina en el sobrenadante de células endoteliales cultivadas sin suero (HUVEC). Análisis Western-blot con anticuerpos antitrombospondina. Fila 1: medio sin suero; Fila 2: medio sin suero, condicionado 4 días estáticamente; Fila 3: 500 ng de TSP-1; Fila 4: medio sin suero, condicionado 3 días dinámicamente.

La Figura 2 muestra la determinación cuantitativa de la TSP-1 segregada en el sobrenadante de células endoteliales (HUVEC) cultivadas en forma estática y dinámica.

La Figura 3 muestra la modificación del dosaje de calcio intracelular de células endoteliales en cultivo estático después de la aplicación de trombospondina o de los dos péptidos activos.

La Figura 4 muestra la geometría de la cámara de flujo y del divisor de flujo en la cámara de perfusión. Las células endoteliales crecen en la zona libre.

Las Figuras 5a y 5b muestran rejillas de evaluación para ensayos con el divisor de flujo y una representación de acuerdo a la posición de la aparición de la apoptosis en el cultivo de perfusión con condiciones de flujo discontinuas. Después de 2 días de cultivo de perfusión se determina para cada zona la tasa de apoptosis. Detrás del divisor de flujo se pueden determinar tasas de apoptosis significativas. La tasa de apoptosis depende la posición de la cámara de perfusión.

Los siguientes ejemplos aclaran con mayores detalles la invención.

Ejemplo 1

Cultivo de células endoteliales humanas de venas umbilicales (HUVEC) Soluciones (estériles):

-: Medio de cultivo: Medio basal IF + 15% (v/v) de NCS, 5 μg/ml de transferrina, 5 pg/ml de heparina, 0,7 μg/ml de FGF, 2 mM de L-glutamina-[medio basal IF: mezcla 1:1 de Medio Dulbecco modificado por Iscovet (IMDM) y Ham's F12, ambos de Life Technologies, Paisley (Inglaterra)].

-: NCS: Suero de ternero fetal (Sebak, Aidenbach)

-: FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos (Preparación propia de cerebro porcino purificado) Materiales:

-: Recipientes de cultivo celular, gelatinizados El cultivo de HUVEC se realiza en recipientes de cultivo recubiertos con gelatina a 37ºC, 5% de CO2 y atmósfera de aire saturada con vapor de agua. El medio de cultivo se cambia cada 2-3 días; en caso de confluencia las células se pasan con una tasa de división de 1:3 a 1:5. Las HUVEC crecen fuertemente inhibidas por contacto y forman céspedes de células de una capa con la típica morfología de adoquines. En caso de confluencia los cultivos alcanzan densidades de

células de 4-9 x 104 células/cm2. Para los estudios de apoptosis se utilizan exclusivamente cultivos HUVEC de los pasajes 1-4. Complemento Recubrimiento de recipientes de cultivo Soluciones (estériles): -Solución de gelatina, 1% (p/v) en agua Milli-Q Suspender 1 g de gelatina (probada en cultivo celular) en 100 ml de agua Milli-Q, disolver por autoclave durante 20 min

a 121°C y 2 bar y almacenar a temperatura ambiente. -PBS (140 mM de NaCl, 3 nM de KCl, 8 mM de Na2HPO4, 1,5 mM de KH2PO4)

-: 8 g/l de NaCl

-: 0,2 g/l KCl

-: 1/44 g/l de Na2HPO4 x2 H2O

-: 0,2 g/l de KH2PO4

Disolver las sales en un volumen correspondiente de agua Milli-Q, colocar en autoclave durante 20 min a 121ºC y 2 bar y almacenar a temperatura ambiente. Se examina el valor del pH y se encuentra entre 7,2 y 7,4. Materiales:

-: Recipientes de cultivo celular Realización: Para el cultivo de células que crecen en forma adherente se recubren recipientes de cultivo celular con gelatina. El piso

de los recipientes de cultivo celular es recubierto con una solución de gelatina estéril, los recipientes de cultivo celular se dejan 15 min a temperatura ambiente. La solución de gelatina es aspirada, los recipientes de cultivo se lavan una vez con PBS y se pueden usar así.

Subcultivo de células adherentes Soluciones (estériles):

-PBS -Tripsina/EDTA (0,05% (p/v)/ 0,02% (p/v))

- 0,1 ml de solución stock de tripsina. -0,05 ml de solución stock de EDTA Llenar con PBS estéril a 50 ml y almacenar en porciones de 10 ml a -20 °C.

Materiales: Recipientes de cultivo celular, gelatinizados Realización: Todos los tipos celulares indicados son separados de la superficie de cultivo con una solución de tripsina/EDTA. El

medio de cultivo es aspirado, el piso del recipiente de cultivo se lava brevemente con PBS y se recubre con una solución de tripsina/EDTA (~1 ml para un frasco de cultivo de 25 cm2). La solución enzimática se aspira de nuevo inmediatamente, de tal modo que queda una película de líquido delgada sobre las células. Las células se dejan durante 1-10 min a temperatura ambiente y la separación de las células se sigue con el microscopio. La separación de las células se puede acelerar por medio de una suave palmadita al recipiente de cultivo en el borde. Las células se toman en medio de cultivo fresco, eventualmente se cuentan y se siembran en nuevos recipientes de cultivo.

Ejemplo 2 Cultivo de células endoteliales de aorta vacuna (BAEC) Soluciones (estériles): -Medio de cultivo: medio basal IF + 5% (v/v) de NCS, 5 μg/ml de transferrina, 20 μg/ml de heparina, 2 mM de L

glutanina; temperado a 37ºC Materiales:

-: Recipientes de cultivo celular, gelatinizados Realización: El cultivo de BAEC se realiza en recipientes de cultivo celular recubiertos con gelatina a 37 ºC, 5% de CO2 y atmósfera

de aire saturada con vapor de agua. El medio de cultivo se cambia cada 2-3 días; en caso de confluencia las células se pasan con una tasa de división de 1:3 a 1:5. Las BAEC crecen con gran inhibición de contacto y forman céspedes de células de una sola capa con la típica morfología de adoquines. La densidad celular es de 7-9 x 104 células/cm2.

Ejemplo 3: Cultivo en el sistema de perfusión Soluciones (estériles):

-: Medio (especial para las células correspondientes/ HUVEC, ver Ejemplo 1) -Agua Milli-Q (agua purificada para cultivos celulares) Materiales:

-: Pequeña placa de Petri, gelatinizada

-: Sellos de policarbonato para placas de Petri

-: Láminas de silicona

-: Atornillados Peek

-: Manguera de silicona DI 0,5 mm

-: Manguera para bomba de Maprene DI 1 mm

-: Placa de aluminio con sujeciones para sellos

-: Tubos de Greiner

-: Frascos de Schott con inserto de tapa de Teflon

Realización:

Las células se subcultivan como se describió. Después que las células adherentes alcanzaron confluencia, pueden ser introducidas en el sistema de perfusión. Para ello se ensambla un sistema. Todas las partes fueron limpiadas antes muy bien con agua Milli-Q. El sistema completamente ensamblado se coloca en autoclave durante 40 minutos. El recipiente de almacenamiento está compuesto por un frasco de Schott con tapa especial de Teflon. Se encuentran 3 agujeros en

la tapa, a través de los cuales se pasan tubitos de acero inoxidable (3 cm, DI 1 mm). Un tubito está provisto de un filtro estéril y sirve como compensación de presión. Los otros dos forman la entrada y la salida para el medio. Un tubito se encuentra prolongado hacia adentro con una manguera de silicona, para que quede sumergido en el medio en el frasco. De aquí sigue a través de una manguera de silicona y Maprene a un tubito de Greiner de 15 ml, el que también está cerrado con una tapa de Teflon especial, en el cual se han introducido 2 tubitos de acero inoxidable. El tubo de Greiner sirve para precalentar el medio y como trampa para burbujas de aire. De aquí se conduce el medio a través de otra manguera de silicona al sello o al conector Peek de la parte superior del sello. El sello se coloca para el cultivo sobre una placa de Petri con las células correspondientes. El sello se hace estanco por medio de un O-ring en el costado. Para que las células no sean aplastadas, se encuentra una lámina de silicona cortada especialmente sobre el piso de la placa de Petri. La salida del sello está acoplada con ayuda de un adaptador Peek a una manguera de silicona y lleva el medio de vuelta al reservorio del medio. Antes de comenzar el sistema, se llena el recipiente almacenador del medio y el tubo de Greiner con medio precalentado. El medio en la placa de Petri es aspirado por las células y se colocan cuidadosamente las láminas de silicona. A continuación se presiona el sello y se puede conectar el sistema a la bomba peristáltica. La velocidad de la bomba puede adaptarse según el requerimiento de las células. Depende del diámetro interior de la manguera de la bomba y del número de rotaciones de la bomba elegido. Después de un tiempo de perfusión a elegir, el sistema puede ser desmontado en el banco estéril y las células se pueden usar para otros tests. Por medio de la construcción modular, se puede usar el sistema de muchas maneras. Con ayuda de válvulas e interruptores de la técnica de HPLC es posible introducir posteriormente sustancias o retirar probetas de medio. Por medio del uso de medio adaptado (por ejemplo, medio IF con 25 mM de tampón HEPES, 12,5 mM de NaCl y 0,5 mM de carbonato de sodio) también se puede trabajar fuera del armario de incubación. Entonces se usa una placa de calefaccionado o una cámara calefaccionada para la temperación.

Para los ensayos con el divisor de flujo se coloca otra lámina de silicona (ver Figura 4). De este modo se puede modificar la característica de flujo en la cámara.

Ejemplo 4

Cultivo en el aparato de cillazamiento de placa cónica

Soluciones:

-: Medio de cultivo con 200 E/ml de penicilina, 200 μg/ml de estreptomicina -70% (v/v) de etanol

Material:

-: Aparato de cizallamiento de placa cónica, Bussolori et al. (1982)

Rev. Sci. Instrum. 53, 1851 - 1854.

-: Placa de cultivo gelatinizada (ø = 994 mm)

Realización:

El aparato de cizallamiento de placa cónica se limpia primero con un paño suave y 70% de etanol, se esteriliza el cono y luego se tempera el aparato a 37 ºC en el armario de calefaccionado durante por lo menos 30 min. Las células precultivadas se lavan con medio de cultivo, se proveen de 0,06 ml/cm2 de medio de cultivo fresco y se introduce la placa de cultivo en el aparato de cizallamiento de placa cónica.

El cono se eleva con ayuda del ajuste grueso y la placa de cultivo con la tapa se coloca cuidadosamente en el alojamiento previsto para ello. Se retira la tapa y se baja el cono sobre la placa de cultivo y se ajusta: la punta del cono tiene entonces una distancia mínima con respecto al césped de células y el cono gira sin rozar. El aparato de cizallamiento de placa cónica ensamblado se coloca para el cultivo dinámico de las células en la incubadora a 37 ºC, 5% (v/v) CO2, y bajo atmósfera saturada con vapor de agua.

Ejemplo 5

Preparación de medio condicionado

Soluciones (estériles):

-: Medio HUVEC

Materiales:

-: HUVEC, confluente

-: Tubos de Greiner

Realización: El medio de cultivo HUVEC del Ejemplo 1 se aplica sobre un césped de células confluente de células endoteliales de vena umbilical humana y se condiciona durante 48 horas - 72 horas. A continuación se centrifuga el medio condicionado

5 minutos a 1000 xg. El medio condicionado se enfría hasta el uso a -20 °C. El medio HUVEC condicionado se usa para investigaciones de apoptosis. Para ello puede ser enriquecido con 2 mM de glutamina y 0,7 μg/ml de FGF. Ejemplo 6 Determinación de la tasa de apoptosis por medio de coloración de las células apoptóticas con DAPI DAPI pertenece al grupo de colorantes de indol y es un colorante de ADN selectivo. El colorante se excita a 340-360

nm, y el máximo de emisión se encuentra en 480 nm. Se usa para investigaciones de apoptosis [ver Cohen et al., Immunology Today, 14, No. 3, 126-130 (1993)]. Evaluación morfológica: Soluciones:

-PBS

-: Solución de formaldehído 4% (v/v) de formaldehído en PBS

-: Solución DAPI (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) 2 μg/ml de DAPI en metanol Materiales:

-: Placa de Petri (35 mm) con células en cultivo Realización: Se aspira el sobrenadante de cultivo de una placa de Petri, el césped celular se fija durante 15 minutos con 1 ml de

solución de formaldehído sobre hielo, se lava dos veces con 2 ml de PBS, se mezcla durante 15 minutos con 0,5 ml de una solución de DAPI, se lava con PBS y se evalúa bajo el microscopio de fluorescencia. Se trabaja con un juego de filtro UV y un objetivo 20 x o 40 x. Se eligen aleatoriamente 500-1000 células y se cuentan las células que tienen núcleos apoptóticos.

El índice de apoptosis se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: Número de células apoptóticas Índice de apoptosis [%] = --------------------------------------------------- x 100

Número total Citometría de flujo Soluciones:

-PBS -Medio

-: Etanol (p.a.) enfriado con hielo (-20 °C)

-: Tampón DAPI

-: Solución stock DAPI

-: Solución colorante DAPI

Realización:

Se aspira el sobrenadante y las células se tripsinizan sin lavarlas con PBS. La suspensión celular se toma en el medio, se cuenta, se centrifuga a 800 xg durante 5 minutos, el sedimento se vuelve a suspender en 0,5 ml de IF y se gotea en 1,5 ml de etanol helado. La suspensión se almacena durante la noche a -20 °C. Después de una nueva centrifugación y nueva suspensión del sedimento en 2 ml de PBS se realiza una incubación de media hora a 37 ºC, una nueva centrifugación, una nueva suspensión del sedimento en 5 ml de solución DAPI y se hace un conteo en el citómetro de flujo a una tasa de conteo de 50-300 eventos por segundo. La aplicación obtenida muestra un pico alto de células en la fase G1 del ciclo celular seguido por una fracción de células en la fase S (intensidades de fluorescencia medias) y un último pico de intensidades de fluorescencia altas, el cual representa las células en la fase G2. Las células apoptóticas aparecen condicionadas por la cantidad absoluta decreciente de ADN por célula, en un pico sub-G1 [Darzynklewicz, S. et al., Cytometry, 13, 795-808 (1992); Zamai L. et al., Cytometry, 14, 891-897 (1993)]. Esto muestra la aparición de la apoptosis bajo condiciones elegidas.

Ejemplo 7

Medición del flujo de entrada de calcio provocado en las células por medio del uso de un indicador de calcio intracelular Fluo-3 AM

Fluo-3 es un indicador de calcio, el cual después de unir el Ca2+ forma un complejo fluorescente. El éster Fluo-3 AM es captado por difusión de la célula. Recién después de la hidrólisis del éster en la célula se forma el indicador de calcio Fluo 3. Un éster colorante extracelular no influye por lo tanto sobre la medición. La medición se realiza con filtros de fluoresceína normales. Con una longitud de onda de excitación de 488 nm (500 nm) el máximo de emisión se encuentra en 525 nm y aumenta por la unión del calcio por un factor de 100 (200). El rango de medición se encuentra entre 0,05 y 20 μM de Ca2+ [Merritt, J.E. et al., Biochem. J. 269, 513-519 (1990)).

Soluciones:

-: PBS

-: Medio

-: Solución stock Fluo-3 AM

50 μg en 10 μl de DMSO dimetilsulfóxido (Molecular Probes, Leiden) (6 mM)

-: Concentración de uso de Fluo-3 AM

3 μM en medio sin suero

Materiales:

-: Células en cultivo

Realización:

Césped de células confluente de HUVEC en placas de 24 cavidades se enjuagan tres veces con medio sin suero, se incuban durante 30 minutos con medio libre de suero precalentado con Fluo-3 AM bajo condiciones de cultivo, se enjuagan tres veces y la placa se mide primero con un fluorímetro. Primero se ajusta la sensibilidad del aparato y a continuación se registran todos los valores de fluorescencia cada 1-10 segundos, los que corresponden al dosaje de calcio actual en la célula. Mientras se realiza la medición se pueden agregar sustancias a las células. Si una sustancia tiene influencia sobre el dosaje de calcio, esto se puede reconocer en el aumento o disminución de los valores de fluorescencia (ver Figura 3). Con este procedimiento es posible una evaluación del dosaje de calcio. El flujo de entrada de calcio es una señal temprana de la aparición de la apoptosis.

Ejemplo 8

Inducción de la apoptosis en células endoteliales cultivadas con TSP-1

Las células son cultivadas como se describió en los Ejemplos 1 y 2. Después de alcanzar la confluencia completa se introducen las células para la prueba. Primero se agrega al medio fresco trombospondina 1 en diversas concentraciones (1-600 μg/ml) y se compara con el efecto del medio condicionado sobre la tasa espontánea de apoptosis de HUVEC. La siguiente Tabla muestra que la adición de trombospondina lleva a un aumento significativo de la tasa de apoptosis. Se corresponde con la que se puede lograr con el medio condicionado. La apoptosis observada con la adición de medio fresco es inducida por la trombospondina segregada durante el experimento. Sobre HUVEC perfundidas la trombospondina no tiene efecto .La tasa de apoptosis es determinada por la coloración de las células apoptóticas con DAPI.

Tabla 3

Condiciones de cultivo: Medio de cultivo Tasa de apoptosis (%) después de 24 hs

Estática: Medio fresco 0,9 ± 0,1

Estática: Medio condicionado 3,0 ± 0,2

Estática: Fresco + TSP-1 (1 μg/ml) 3,0 ± 0,4

Dinámica: Medio fresco < 0,1

Dinámica: Medio condicionado < 0,1

Dinámica: Fresco + TSP-1 (1 μg/ml) < 0,1

La tasa de apoptosis, después de la coloración DAPI se indicó como se mostró en el Ejemplo 6 (se indican en cada caso el valor medio y la desviación estándar). La tasa de apoptosis porcentual se refiere a la cantidad total de células.

5 Ejemplo 9

Sistema de prueba para péptidos o proteínas activos antiapoptóticamente

Las células se cultivan como se describió en los Ejemplos 1 y 2. Las células se siembran en los recipientes de cultivo correspondientes (por ejemplo, placa de 24 cavidades /0,5 ml por cavidad) y se introdujeron para la prueba después de alcanzar la confluencia completa. Se realiza una investigación con respecto a la influencia de diversos péptidos y 10 proteínas (Tabla 2) sobre la tasa de apoptosis de las células endoteliales. Para ello se disuelven los péptidos y proteínas (Tabla 4) en medio de cultivo (Ejemplo 1) y en las concentraciones indicadas (Tabla 4). El medio con las sondas disueltas se agrega a las células y se incuba durante tres días bajo condiciones de cultivo (Ejemplo 1). A continuación, como se describe en el Ejemplo 6 se colorean las células para la determinación de la tasa de apoptosis con DAPI. Los resultados de 3 experimentos independientes con la indicación de los valores medios y la desviación estándar se

15 resumen en la Tabla 2. Se puede reconocer claramente la acción de inducción de la apoptosis del medio condicionado, TSP-1 y de péptido RGD activo con el péptido CBD.

Como indicador temprano se puede usar la medición de calcio intracelular (Ejemplo 7). Para ello se tratan previamente las células como se describió en el Ejemplo 7 y se mide el momento de la adición de los péptidos o de TSP-1 en el fluorímetro. Sólo TSP-1 o la adición simultánea de los dos péptidos lleva a un aumento del dosaje intracelular de calcio

20 (Figura 3). La adición de medio fresco o de sólo un péptido no tiene influencia sobre el dosaje de calcio. El flujo de calcio hacia adentro de las células puede usarse como indicador temprano. Una verificación de sustancias positivas (señal de calcio) puede obtenerse mediante la determinación de la tasa de apoptosis con DAPI (Ejemplo 6) después de por lo menos 24 horas de incubación. De este modo se pueden identificar compuestos de acción antiapoptótica en forma clara y evidente.

25 Tabla 4

Ligando: Concentración Tiempo de incubación Actividad biológica

Trombospondina: 1 μg/ml (2-) 24-72 hs une integrina avß3 y IAP

RGD-cíclico, act.: 250 μg/ml (2-) 24-72 hs une integrina avß3

RGD-cíclico, inact.: 250 μg/ml (2-) 24-72 hs inactivo

Péptido IAP (CBD): 400 μg/ml (2-) 24-72 hs une IAP

Ejemplo 10

Identificación de un anticuerpo activo antiapoptótico con ayuda de un procedimiento de acuerdo con la invención

Las células se cultivan como se describió en los Ejemplos 1 y 2. Las células se siembran en los recipientes de cultivo correspondientes (por ejemplo, placas de 24 cavidades/0,5 ml por cavidad) y después de alcanzar la confluencia completa se usan para la prueba. Se agrega medio nuevo a las células: (a) medio de cultivo fresco [tasa de base de la apoptosis], (b) medio condicionado (Ejemplo 5) [acción que induce la apoptosis], (c) medio condicionado con antisuero anti-TSP-1 de conejo (1:20) [sustancias que inducen la apoptosis y sustancias que inhiben la apoptosis], (d) medio de cultivo fresco con antisuero anti-TSP-1 de conejo (1:20) [sustancia que inhibe la apoptosis, (e) medio fresco con 1 μg/ml de TSP-1 [sustancia que induce la apoptosis], (f) medio fresco con 1 μg/ml de TSP-1 y antisuero anti-TSP-1 de conejo

(1:20) [sustancias que inducen la apoptosis y que inhiben la apoptosis], (g) medio fresco con anticuerpo anti-TSP-1 monoclonal (1:30) [sustancia que inhibe la apoptosis]. Después de 24 hs de incubación bajo condiciones de cultivo (Ejemplo 1) las células se fijan, se tiñen con DAPI y se investigan morfológicamente bajo el microscopio de fluorescencia o por citómetro de flujo (Ejemplo 6). Las células apoptóticas y el número total de células se determinan y se calcula el índice de apoptosis (porcentaje de células apoptóticas). Los datos de 3 experimentos independientes con la indicación de los valores medios y la desviación estándar se indican en la Tabla 1.

Los ensayos con antisuero policlonal (= antisuero: anticuerpo policlonal contra TSP-1 (de conejo) no purificado; concentración de proteína: 900 μg/ml) y con un anticuerpo monoclonal contra TSP-1 (= MAK: anticuerpo monoclonal contra TSP-1 M 101 no purificado; concentración de proteína: 300 μg/ml) muestran una disminución significativa de la tasa de apoptosis (> 50%) y pueden ser usados como inhibidores de sustancias naturales que inducen la apoptosis (medio condicionado y TSP-1). Pudieron ser identificadas por lo tanto como anti-apoptóticas. El antisuero y el anticuerpo monoclonal fueron puestos a disposición por el Prof. Dr. P. Vischer, Institut fur Arterioskleroseforschung, Münster.

El sistema de prueba también se puede realizar con el indicador de calcio Fluo-3 AM. Las células se cultivan para ello como se describió en los Ejemplos 1 y 2. Después de alcanzar la confluencia completa, las células se usan en la prueba. Se cargan con el indicador de calcio (Ejemplo 7) y se colocan en un fluorímetro y se miden. Durante la medición se agregan las sustancias b, c, e, f, g a las células. En estos Ejemplos se encuentran contenido siempre un activador (medio condicionado o TSP-1). En los Ejemplos b) y e) se produce un flujo hacia adentro del calcio y con ello un aumento de los valores de fluorescencia medidos. Si se agregan al mismo tiempo sustancias que inhiben la apoptosis, como en los ejemplos c), f) y g), se puede observar un aumento. El anticuerpo monoclonal contra TSP-1 o el antisuero policlonal evitan el flujo hacia adentro del calcio y la activación de la apoptosis. Por la adición simultánea de un activador (por ejemplo, TSP-1) y de la sustancia a probar se puede establecer un procedimiento de prueba tan rápido para los inhibidores potenciales de la apoptosis.

Con este procedimiento se pudieron identificar otros dos anticuerpos con el procedimiento descripto, los que se pueden usar como inhibidores de la apoptosis. Se trata aquí de:

1.: Anticuerpo monoclonal contra integrina a, de la firma Chemicon (No. M9B 1960), Clon VNR 139 (100 μl); dilución usada: 1:100 (mAk/av)

2.: Anticuerpo monoclonal contra IAP humano (CD 47) de la firma CYMBUS Biotechnology (No. CBL 489), Clon BRIC 126, Concentración: 100 μg/ml; dilución usada: 1:100 (1 μg/ml) (mAk/IAP)

Los anticuerpos fueron agregados a las células después de alcanzar la confluencia con el activador TSP-1 (1 μg/ml) en las concentraciones indicadas. Después de 48 horas de incubación bajo condiciones estáticas se midieron las siguientes tasas de apoptosis:

Medio de cultivo Tasa de apoptosis [%] (con SEM)

Medio fresco + TSP-1 7,3 ± 0,6

Medio fresco + TSP-1 + mAk/av 0,9 ± 0,2

Medio fresco + TSP-1 + mAk/IAP 0,5 ± 0,1

Tabla 1

Condiciones de cultivo: Medio de cultivo (24 hs) Tasa de apoptosis (%)

Estática: Medio fresco (a) 0,9 ± 0,1

Estática: Medio condicionado (b) 3,0 ± 0,2

Estática: Condicionado + anti TSP-1 (c) 0,1 ± 0,1

Estática: Fresco + TSP-1 (e) 3,0 ± 0,4

Estática: Fresco + anti-TSP-1 (d) 0,2 ± 0,1

Estática: Fresco ´TSP-1 + anti-TSP-1 (f) 0,2 ± 0,1

Estática: Fresco + mAk TSP-1 (g) 0,4 ± 0,1

Ejemplo 11

Inhibición de la apoptosis provocada por condiciones de cultivo estáticas por complejización del calcio o inhibición del 5 flujo de calcio hacia adentro

Material (adicional al Ejemplo 1):

-: Medio de cultivo con 2,5 mmoles/l EGTA

Realización:

Las células se preparan como se describió en el Ejemplo 1 y después de alcanzar la confluencia se cultivaron durante

10 otras 24 horas en el aparato de cizallamiento de placa cónica (ver Ejemplo 4). La placa de cultivo se agranda y se divide por la introducción de un inserto adecuado en 12 cavidades de cultivo independientes (Superficie de cultivo por cavidad 0,8 cm2). Una mitad del cultivo se cultiva en medio de cultivo con EGTA, la segunda mitad se cultiva en medio de cultivo sin EGTA. La siguiente Tabla 5 muestra como resultado que el cultivo en medio de cultivo con EGTA lleva a una disminución significativa de la tasa de apoptosis, es decir, una complejización del calcio con EGTA lleva a una inhibición

15 de la apoptosis. La tasa de apoptosis es determinada por la coloración de las células apoptóticas con DAPI.

Tabla 5

Duración del ensayo (horas): Tasa de apoptosis (%) con EGTA [2,5 mM] Tasa de apoptosis (%) sin EGTA

0: 0,40 ± 0,22 0,42 ± 0,23

2: 0,42 ± 0,22 2,22 ± 0,55

3: 0,96 ± 0,27 2,80 ± 0,64

4: 1,56 ± 0,23 3,10 ± 0,31

5: 2,26 ± 0,35 5,33 ± 0,59

La tasa de apoptosis se calculó según el procedimiento de la coloración con DAPI, como se muestra en el Ejemplo 6 de la patente principal (se indican en cada caso el valor medio y la desviación estándar). La tasa de apoptosis porcentual 20 se refiere a la cantidad total de células. Ejemplo 12 Inhibición de la apoptosis provocada por péptidos biológicamente activos por complejización del calcio Material (adicional al Ejemplo 4): -Medio de cultivo con péptidos biológicamente activos (comparar con patente principal Ejemplo 10, Tabla 4) 25

Realización

Las células se preparan como se describe en el Ejemplo 1 y después de alcanzar la confluencia completa se cultivan durante otras 24 horas en el aparato de cizallamiento de placa cónica (ver Ejemplo 4). La placa de cultivo se retira del aparato de cizallamiento y se divide por introducción de un inserto adecuado, como se describió ya en el Ejemplo 11 en

5 12 cavidades de cultivo independientes. Los péptidos biológicamente activos se disuelven por un lado en medio de cultivo con 0,5 mM de EGTA y por el otro en medio de cultivo sin EGTA (concentraciones: péptido RGD: 250 μg/ml [0,5 nM]; péptido IAP: 400 μg/ml [0, 5 mM]). Después se mezcla una mitad de las sondas con medio de cultivo con EGTA y los péptidos activos y la otra mitad con medio de cultivo, el cual contiene los péptidos activos pero no EGTA.

El resultado de estos ensayos se presenta en la siguiente Tabla 6:

10 Tabla 6

Duración del ensayo (horas): Tasa de apoptosis (%) con EGTA y con péptidos Tasa de apoptosis (%) sin EGTA y con péptidos

0: 0,45 ± 0,24 0,61 ± 0,22

2: 1,00 ± 0,29 2,08 ± 0,22

3: 0,65 ± 0,24 2,67 ± 0,18

4: 1,25 ± 0,33 3,82 ± 0,50

La adición de los péptidos biológicamente activos en un medio de cultivo sin EGTA lleva en un período de ensayo a un claro aumento de la apoptosis. Por medio de la adición de EGTA al medio de cultivo con los péptidos activos se puede alcanzar una disminución significativa de la tasa de apoptosis.

15 La tasa de apoptosis se calculó según el procedimiento de coloración con DAPI, como se muestra en el Ejemplo 6 (se indican en cada caso el valor medio y la desviación estándar). La tasa de apoptosis porcentual se refiere a la cantidad total de células.

Ejemplo 13

Uso de anticuerpos o péptidos como principio activo en la formulación farmacéutica

20 Los compuestos activos antiapoptóticos identificados en el Ejemplo 10, es decir, los anticuerpos anti-TSP-1, el anticuerpo monoclonal VNR 139 y el anticuerpo monoclonal BRIC 126, podrían usarse como principios activos en formulaciones farmacéuticas.

Estos anticuerpos se usan para ello convenientemente en una concentración de 3-5 mg por ml en la siguiente formulación:

25 - Agua para inyección

-: Polisorbato 80

-: Hidrógeno fosfato disódico/dihidrógeno fosfato sódico

-: Cloruro de sodio

Esta formulación se administra como solución inyectable. 30

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Preparado farmacéutico para el tratamiento de la arterioesclerosis, que contiene como componente activo una sustancia activa antiapoptótica, que se une a por lo menos un compuesto seleccionado entre trombospondina-I (TSP-I), proteína asociada a integrina (IAP) e integrina aVß3 (aVß3) de tal modo que se inhibe la unión simultánea de TSP-1 a IAP y a aVß3, y caracterizado porque la sustancia es seleccionada entre el grupo compuesto por anticuerpos específicos y/o fragmentos de estos, que poseen un sitio de unión al antígeno, contra TSP-1, IAP y/o aVß3.
2.

Preparado farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia activa antiapoptótica se puede identificar de la siguiente manera:

i) se cultivan células que expresan tanto IAP como también la integrina aVß3, ii) se induce a las células a formar una sustancia que induce la apoptosis, y/o se agrega una sustancia o sustancias, que induce/inducen la apoptosis,

iii) se agrega la sustancia de prueba, y iv) se mide la tasa de apoptosis.
3.

Uso de una sustancia activa antiapoptótica, que se une a por lo menos un compuesto seleccionado entre trombospondina-1 (TSP-1), proteína asociada a integrina (IAP) e integrina aVß3 (aVß3) de tal modo que se inhibe la unión simultánea de TSP-1 a IAP y a aVß3, y caracterizado porque la sustancia es seleccionada entre el grupo compuesto por anticuerpos específicos y/o fragmentos de estos, que poseen un sitio de unión al antígeno, contra TSP-1, IAP y/o aVß3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la arterioesclerosis.
4.

Uso de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la sustancia activa antiapoptótica se puede identificar de la siguiente manera:

i) se cultivan células que expresan tanto IAP como también la integrina aVß3, ii) se induce a las células a formar una sustancia que induce la apoptosis, y/o se agrega una sustancia o sustancias, que induce/inducen la apoptosis,

iii) se agrega la sustancia de prueba, y iv) se mide la tasa de apoptosis.