ES2399318T3

ES2399318T3 - Método para la detección e identificación rápidas de microorganismos

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Publication number: ES2399318T3
Application number: ES09752779T
Authority: ES
Inventors: Pieter Vos; Joost Thijssen; Wouter De Levita
Original assignee: Check Points Holding BV
Current assignee: Check Points Holding BV
Priority date: 2008-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2029-10-29
Also published as: EP2344668A1; WO2010049489A1; EP2344668B1; JP2012506712A; US8486638B2; US20110287962A1

Abstract

Un método para determinar la presencia de microorganismos en un muestra e identificar y caracterizar dichosmicroorganismos si están presentes, que comprende los pasos de: (a) extraer ácidos nucleicos de los microorganismos, dichos ácidos nucleicos comprenden ácidosnucleicos diana; (b) realizar una reacción de detección de la ligasa (LDR) en dichos ácidos nucleicos diana, quecomprende: (b1) proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácidonucleico, dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia I específica de dianalocalizada en 3' complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y dicha segundasonda de ácido nucleico comprende una secuencia II específica de diana localizada en 5'complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizada esencialmenteadyacente a y en 3' de dicha secuencia I específica de diana, en donde dicha primera sonda de ácidonucleico comprende una sección I de unión a cebador (PBS(I)) localizada en 5' y posiblemente unrelleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión a cebador(PBS(II)) localizada en 3' y posiblemente un relleno; y opcionalmente en donde la primera sonda deácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una regiónidentificadora que (i) corresponde a una región correspondiente de una sonda de capturapreferiblemente en una micromatriz y (ii) es esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleicodiana, y (iii) está localizada entre la secuencia específica de diana y la sección de unión al cebador, (b2) incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segundasonda de ácido nucleico en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicoscomplementarios; (b3) unir cualquier sonda esencialmente adyacente, (b4) proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en donde el primer cebador (cebador I) esesencialmente idéntico a la sección I de unión a cebador, y el segundo cebador (cebador II) esesencialmente complementario a la sección II de unión a cebador, en donde dicho primer o segundocebador está opcionalmente marcado, y (b5) amplificar cualquier ácido nucleico sonda unido del paso (b3), en donde la amplificación se iniciamediante la unión del cebador de ácido nucleico específico para una sección de unión a cebador,proporcionando así ácidos nucleicos diana amplificados, en donde una o más moléculas detectoras, que detectan los ácidos nucleicos diana amplificados están presentes en el paso (b5), (c) seguir la señal de dicha molécula detectora y/o la modulación de la señal de dicha moléculadetectora, dicha modulación en la señal de dicha molécula detectora indica la presencia de dichasecuencia diana mediante lo cual se determina la presencia de un microorganismo, (d) donde el paso (c) determina que un microorganismo está presente, hibridar los ácidos nucleicos dianaamplificados del paso (c) a una sonda de captura, preferiblemente presente en una micromatriz, y (e) detectar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (d), mediante lo cual se identifica elmicroorganismo.

Description

Método para la detección e identificación rápidas de microorganismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método rápido y eficaz para detectar la presencia de microorganismos e identificar los microorganismos en una muestra.

Antecedentes de la invención

Tanto las aplicaciones clínicas como las aplicaciones en la industria alimenticia requieren métodos muy eficaces para el cribado de muestras sobre la presencia o ausencia de microorganismos patógenos. Mientras que los métodos de cribado para las aplicaciones clínicas requieren identificación de alto rendimiento, rápida y correcta de los microorganismos presentes en la muestra para fines diagnósticos, las aplicaciones en la industria alimenticia requieren métodos de alto rendimiento muy fiables para el control microbiológico y seguimiento microbiológico para validar la seguridad y la calidad de los productos alimenticios. Para ambos casos, se requieren métodos que permitan la detección, identificación y caracterización rápidas de microorganismos en varias muestras. Otros requisitos importantes para tales métodos de cribado son la facilidad de uso y la eliminación de errores (falsos positivos y/o falsos negativos).

Varios métodos de cribado conocidos en la técnica tales como PCR en tiempo real permiten el cribado rápido y proporcionan un método para ensayar la presencia o ausencia de bacterias patógenas. Sin embargo, por ejemplo, después de detectar la presencia de microorganismos, la identificación adicional requiere ensayos multiparámetros, que generalmente no los pueden proporcionar estos métodos de cribado. Por ejemplo, la PCR en tiempo real permite solo el multiplexado limitado de biomarcadores. Además, la detección de pequeños cambios en las secuencias de ADN tales como los SNP con frecuencia es difícil.

Los métodos de prueba de identificación y caracterización típicos son lentos, laboriosos y requieren un alto nivel de experiencia para ejecutarlos y para interpretar los resultados. La determinación del subtipo de bacterias, o la determinación de la resistencia a antibióticos solo se puede hacer mediante métodos clásicos caros y laboriosos que requieren gran cantidad de experiencia. Además, los métodos moleculares de determinación de tipos (ribotipado, MLST, AFLP, MLVA, MicroSeq, rep PCR etc.) requieren que las pruebas se hagan en cepas puras. La purificación de las muestras con frecuencia también es un proceso muy tedioso, que lleva mucho tiempo. Por tanto, muchas de estas pruebas se realizan en laboratorios especializados. La principal desventaja de este planteamiento es que los resultados de la identificación adicional de las muestras positivas con frecuencia son muy tardíos para el uso práctico así como que son relativamente caros, tanto en el campo alimenticio como también en el clínico.

Se ha descrito un método para cribar eficazmente muestras sobre la presencia o ausencia de microorganismos patógenos y la posterior identificación de los microorganismos en el documento EP1633887. Sin embargo, un problema del método descrito en el documento EP1633887 es que todas las muestras se someten al proceso entero. Incluso si no se detectan microorganismos, se realiza el paso del cribado de las muestras en una micromatriz para todas las muestras. Puesto que generalmente más del 95% de las muestras de alimentos y muestras de control de agua son negativas para la presencia de microorganismos, muchas de estas muestras se prueban y se someten a identificación y caracterización de microorganismos que no están presentes en la muestra. Por tanto, el método de cribado descrito proporciona pasos de proceso evitables.

En vista de las consideraciones de tiempo y coste, la presente invención proporciona un método optimizado para la detección, identificación y caracterización de microorganismos en muestras. El método detecta en primer lugar si están presentes o no microorganismos en la muestra y en un paso posterior se lleva a cabo la identificación y caracterización solo en las muestras positivas.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un método específico que logra la detección, identificación y caracterización rápidas y específicas de microorganismos contaminantes en varias muestras. Se ha desarrollado un método basado en la detección de secuencias de nucleótidos específicas de especie y/o específicas de cepa que únicamente se identifican y amplifican y posteriormente se detectan en una micromatriz usando oligonucleótidos ZIP identificadores direccionables (Zip-Comcode (cZIP) o Zipcode (ZIP)). Mediante el uso de un proceso de cribado de dos pasos, el método de la presente invención permite en primer lugar el cribado rápido de una multitud de muestras para la presencia o ausencia de microorganismos específicos en tales muestras, mientras que en un segundo paso de cribado los resultados positivos del primer paso se procesan adicionalmente para identificar y caracterizar los microorganismos detectados.

Figuras

Figura 1: Representación esquemática del ADN diana y las sondas de ligación amplificación en tiempo real específicas de la diana.

Figura 2: Representación esquemática del ADN diana y las sondas de ligación amplificación en tiempo real específicas de la diana, en donde la sonda I y la sonda II están acopladas. Solo las sondas ligadas proporcionan amplificación exponencial, que se detecta mediante una molécula detectora específica.

Figura 3: Gráficos de LDR en tiempo real de las muestras 1 a 6. El eje X muestra el número de ciclo; el eje Y las unidades de fluorescencia relativas corregidas para la fluorescencia de fondo. Las muestras 1 y 2 dan una (señal positiva) alta, lo que indica la presencia de Salmonella; las muestras 3 a 6 dan una señal muy baja lo que indica la ausencia de Salmonella en estas muestras.

Figura 4: Productos de reacción de LDR en tiempo real de las muestras 1, 2 y 3 hibridadas a una micromatriz usando el protocolo de detección de Salmonella PremiTest. El panel superior (amarillo) presenta la muestra 1, el panel medio (verde) presenta la muestra 2 y el panel inferior (azul) presenta la muestra 3. Las muestras 1 y 2 presentan un patrón de manchas típico para las serovariedades Virchow y Paratyphi B, respectivamente. La muestra 3 presenta solo las manchas de control de amplificación 16, 19 y 22: esto indica que la reacción se llevó a cabo adecuadamente y que esta muestra no contiene ADN de Salmonella.

Figura 5: Representación esquemática de pares de sondas preferidos. Las moléculas resultantes de la amplificación se representan después de la flecha. Se indica detección en tiempo real (RT) y/o por micromatriz. La sonda para la detección RT comprende una región complementaria (cDET) a la región DET. En este caso, para la detección por matriz, la micromatriz comprende sondas de captura que comprenden un Zipcode (ZIP) esencialmente complementario al ZipComcode (cZIP).

Figura 6a, 6b y 6c: Representación esquemática de la detección en tiempo real de la reacción de amplificación usando respectivamente sondas Taqman, cebadores Scorpion y sondas de baliza molecular.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a métodos para recoger, detectar, identificar y caracterizar microorganismos contaminantes en artículos alimenticios, líquidos corporales y en el control del agua. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para determinar la presencia y caracterización de microorganismos en una muestra usando dos pasos de detección, en el que el primer paso comprende la detección de la presencia de microorganismos a través de una molécula detectora, y un segundo paso comprende la identificación y caracterización adicionales de dicho microorganismo preferiblemente a través de un cebador marcado. Preferiblemente dicho primer paso comprende seguir la señal de moléculas detectoras, detectar ácidos nucleicos diana amplificados resultantes de una reacción de detección de ligasa en la esencialmente sondas adyacentes hibridadas a un ácido nucleico diana se unen, y posteriormente amplifican. Preferiblemente dicho segundo paso comprende detectar la hibridación de ácidos nucleicos diana amplificados a una sonda de captura.

En particular, la presente invención se refiere a un método para determinar la presencia de microorganismos en una muestra e identificar y caracterizar dichos microorganismos, que comprende los pasos de:

(a): posiblemente extraer los ácidos nucleicos de microorganismos , dichos ácidos nucleicos comprenden los ácidos nucleicos diana,

(b): realizar la reacción de detección de la ligasa (LDR), preferiblemente reacción de detección de la ligasa en

tiempo real (RT-LDR), en dichos ácidos nucleicos, que comprende: (b1) proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico, dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia I específica de diana localizada en 3’ complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y dicha segunda sonda comprende una secuencia II específica de diana localizada en 5’ complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizada esencialmente adyacente a y en 3’ de dicha secuencia I específica de diana, en donde dicha primera sonda de ácido nucleico comprende además una sección I de unión a cebador (PBS(I)) localizada en 5’ y posiblemente un relleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión al cebador (PBS(II)) localizada en 3’ y posiblemente un relleno; y opcionalmente en donde la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una región identificadora, tal como ZipComcode o Zipcode (ZIP), que (i) corresponde a una región correspondiente de una sonda de captura en una micromatriz y (ii) es esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana, y (iii) está localizada entre la secuencia específica de diana y la sección de unión al cebador, (b2) incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segunda sonda de ácido nucleico en condiciones que permiten la hibridación de ácidos nucleicos complementarios, (b3) unir cualquier sonda esencialmente adyacente, (b4) proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en donde el primer cebador (cebador I) es esencialmente idéntico a la sección I de unión al cebador, y el segundo cebador (cebador II) es

esencialmente complementario a la sección II de unión a cebador, en donde dicho primer o segundo cebador está opcionalmente marcado, y (b5) amplificar cualquier ácido nucleico sonda unido, en donde la amplificación se inicia mediante la unión de la sonda de ácido nucleico específica para una sección de unión a cebador, proporcionando de esta manera ácidos nucleicos diana amplificados, en donde están presente una o más moléculas detectoras, que detectan los ácidos nucleicos diana amplificados, en el paso (b5),

(c): seguir la señal de dicha molécula detectora y/o la modulación de la señal de dicha molécula detectora, una modulación en la señal de dicha molécula detectora indica la presencia de dicha secuencia diana por lo cual se determina la presencia de un microorganismo,

(d): donde el paso (c) determina que un microorganismo está presente, hibridar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (c) a una sonda de captura, preferiblemente presente en una micromatriz, y dichos ácidos nucleicos diana amplificados del paso (c) opcionalmente comprenden una región identificadora, tal como ZipComcode (cZIP) o Zipcode (ZIP), esencialmente complementaria a una región correspondiente de dicha sonda de captura, y

(e): detectar los ácidos nucleicos diana hibridados del paso (d), por lo cual se identifica el microorganismo.

Como el método de la presente invención determina la presencia de un microorganismo usando moléculas detectoras, detectando ácidos nucleicos diana amplificados, el método según la presente invención implícitamente también determina la presencia de las secuencias de ADN específicas presentes en dichos microorganismos, determinando de esta manera la presencia del microorganismo y/o los genes específicos del organismo, caracterizando así adicionalmente dicho microorganismo.

Antes de describir el presente método y los dispositivos usados en la invención, se debe entender que esta invención no está limitada a métodos, componentes o dispositivos particulares descritos, ya que tales métodos, componentes y dispositivos pueden, por supuesto, variar. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento no se pretende que sea limitante, ya que el ámbito de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se describa de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como comúnmente entiende el experto en la materia a la que esta invención pertenece. Aunque se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, los métodos y materiales preferidos se describen ahora.

Como se usa en el presente documento, los términos “comprender”, “comprende” y “compuesto de” como se usan en el presente documento, son sinónimos de “incluir”, “incluye” o “contener”, “contiene”, y son inclusivos o abiertos y no excluyen miembros, elementos o pasos del método adicionales no enumerados. Los términos “comprender”, “comprende” y “compuesto de” también incluye el término “consistente en”. La enumeración de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los números y fracciones subsumidos dentro de los respectivos intervalos, así como los puntos finales enumerados. El término “aproximadamente” como se usa en el presente documento cuando hace referencia a un valor medible tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal, y similares, se pretende que abarque variaciones de +/-10% o menos, preferiblemente de +/-5% o menos, más preferiblemente de +/-1% o menos, aún más preferiblemente +/-0,1% o menos de y desde el valor especificado, en tanto que tales variaciones sean apropiadas para realizar en la invención divulgada. Se debe entender que el valor al que el modificador “aproximadamente” se refiere también se divulga él mismo específicamente, y preferiblemente.

La referencia a lo largo de esta especificación a “una forma de realización” significa que se incluye un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la forma de realización en al menos una forma de realización de la presente invención. Por tanto, las apariciones de la frase “en una forma de realización” en varios sitios a lo largo de esta especificación no se refieren todos necesariamente a la misma forma de realización, pero pueden. Además, los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada, como sería aparente para el experto en la materia a partir de esta divulgación, en una o más formas de realización.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos usados en la divulgación de la invención, incluyendo los términos técnicos y científicos, tienen el significado como comúnmente entiende el experto en la materia a la que esta invención pertenece. A modo de directrices adicionales, se incluyen definiciones de los términos usados en la descripción para apreciar mejor la enseñanza de la presente invención.

En la presente especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen las referencias en plural, y viceversa, a menos que el contexto claramente indique lo contrario. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como comúnmente entiende el experto en la materia.

En general se tomará una muestra o espécimen como una parte de algo. Para aplicaciones en la industria alimenticia tales muestras son, por ejemplo, comestibles, productos lácteos, bebidas y cerveza, que se producen,

presentadas para inspección o mostradas como evidencia de la calidad del todo. Para las aplicaciones clínicas la muestra o espécimen puede ser de cualquier tipo de sustancia sólida, semisólida o líquida corporal tal como, pero no limitado a heces, sangre, plasma sanguíneo, suero, orina, líquido corporal, frotis rectales, frotis nasales, esputo, tejido infectado, etc.

En un aspecto de la invención, el presente método es aplicable a microorganismos que se sabe que contaminan productos alimenticios, productos lácteos, cerveza y otras bebidas, por ejemplo, los microorganismos presentados en el presente documento. De forma alternativa, según otro aspecto de la presente invención, el presente método es aplicable a los microorganismos que se sabe que producen infecciones y enfermedades.

Como tal, la presente invención se refiere a un método para determinar la presencia de microorganismos en una muestra, que comprende los pasos de opcionalmente recoger dichos organismos si están presentes, extraer los ácidos nucleicos de dichos microorganismo, específicamente amplificar dichos ácidos nucleicos detectando de esta manera los ácidos nucleicos diana amplificados, por lo cual se determina la presencia de dichos microorganismos. Para muestras donde se detecta la presencia de dichos microorganismos, los ácidos nucleicos amplificados se analizan adicionalmente, identificando y caracterizando así los microorganismos presentes. Como consecuencia, solo las muestras positivas se someten a un análisis adicional lo que constituye un método que ahorra tiempo, trabajo y/o material.

Como será evidente, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por microorganismos eucariotas y/o procariotas, además de virus. El microorganismo puede seleccionarse del grupo que comprende algas, arqueas, bacterias, virus, nematodos, protozoos, microesporas y hongos, incluyendo levaduras, mohos y micorrizas.

De forma similar, se apreciará que la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde dicho microorganismo se selecciona del grupo que consiste en microorganismos transmitidos por alimentos y transmitidos por el agua.

De forma similar, se apreciará que la presente invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde dicho microorganismo se selecciona del grupo que consiste en microorganismos parasíticos, simbióticos, comensales y/o patógenos humanos y/o de animales.

A este respecto, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde el microorganismo se selecciona de:

el grupo de bacterias y (sub)especies de las mismas que consiste en Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Averyella, Hafnia, Morganella, Pantoea, Photorhabdus, Pleosimonas, Proteus, Providencia, Raoultella, Edwardsiella, Ewingella, Cedecea, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Rahnella, TatumeIla, Yokenella, Enterobacter, Yersinia, Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Actinomadura, Streptomyces, Mycobacterium, Propionibacterium, Actinomyces, Lactobacillus, Eurobacterium, Eggerthella, Olsenella, Bifidobacterium, Mobiluncus, Alistipes, Bacteroides, Cetobacterium, Desulfovibrio, Dialister, Faecalibacterium, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Sneathia, Tannerella Lactococcus, Listeria, Erysipelothrix, Leuconostoc, Bacillus, Staphylococcus, Clostridium, Vibrio, Enterococcus, Legionella, Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, Leptospira, Borrelia, Treponema, Mycoplasma, Ureoplasma, Chlamydia, Chlamydophila, Rickettsia, Orientia, Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia, Aegyptianella, Tropheryma, Streptococcus, Micrococcus, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Microbacterium, Neisseria, Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, Pasteurella, Haemophilus, Aeromonas, Burkholderia, Stenotropomonas, Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Brevundimonas, Comamonas, Delftia, Acidovorax, Acinetobacter, Achromobacter, Chryseobacterium, Moraxella, Bordetella, Psychrobacter, Oligella, Haematobacter, Alcaligenes, Advenella, Alishewanella, Aquaspirillum, Laribacter, Myroides, Shewanella, Ochrobactrum, Rhizobium, Halomonas, Herbaspirillum, Inquilinus, Massilia, Sphingobacterium, Pedobacter, Paracoccus, Asaia, Methylobacterium, Roseomonas, Azospirillum, Elizabethkingia, Empedobacter, Weeksella, Bergeyella, Balneatrix, Bordetella, Francisella, Brucella, Bartonella, Peptostreptococcus, Finegoldia, Anaerococcus, Peptoniphilus, Veillonella, Gallicola, Sackia, Atopobium, Ruminococcus, Aerococcus, Abiotrophia,

el grupo de virus que consiste en: Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), Virus linfotrópico de células T humanas, virus de la gripe, virus paragripal, virus de la paperas, virus respiratorio sincitial, metapneumovirus humanos, virus del sarampión, virus de la rubeola, Enterovirus, Pareochvirus, Hepatovirus, Rinovirus, Coronavirus, Rotavirus, Calicivirus, Astrovirus, Adenovirus, Coronavirus, Torovirus, virus Aichi, Picobirnavirus, virus de la rabia, virus Hendra y Nipah, Arbovirus, Hantavirus, Arenavirus, Filovirus, Herpesvirus humanos, Papilomavirus humanos, Polyomavirus humanos, Parovirus humanos, Poxvirus, Virus de la hepatitis.

el grupo de hongos que consiste en: Candida, Cryptococcus, Blastoschizomyces, Clavispora, Debaryomyces, Kluyveromyces, Geotrichum, Ustilago, Prototheca, Dipodascus, Malassezia, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Trichosporon, Pneumocystis, Aspergillus, Fusarium, Scedosporium,

Penicillium, Scopulariopsis, Chaetomium, Schizophyllum, Acremonium, Lecythophora, Phialemonium, Phaeoacremonium, Arthrographis, Onychocola, Scytalidium, Beauveria, Engyodontium, Sporothix, Chrysosporium, Mycellophthora, Myriodontium, Metarrhizum, Trichoderma, Paecilomyces, Rhizopus, Rhizomucor, Absidia, Apophysomyces, Mucor, Cunninghamella, Basidiobolus, Conidiobolus, Mortierella, Cokeromyces, Syncephalastrum, Saksenaea, Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Paracoccidioides, Emmonsia, Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Malassezia, Piedraia, Calosphaeriales, Chaetothyriales, Dothideales, Microascales, Ophiostomatales, Pleosporales, Sordariales, Hypocreales, Diaporthales, y/o

el grupo de parásitos que consiste en: Plasmodium, Babesia, Leishmania, Trypanosoma, Toxoplasma, Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia, Entamoeba, Endolimax, lodamoeba, Blastocystis, Giardia, Dientamoeba, Trichomonas, Chilomastix, Enteromonas, Retortamonas, Isospora, Cyclospora, Sarcocystis, Cryptosporidium, Microsporidium.

En una forma de realización particular de la presente invención, los microorganismos se capturan o recogen antes del paso (a) del método de la presente invención. La captura o recogida de los microorganismos antes del paso (a) del método proporciona un paso de concentración que permite una concentración de los microorganismos antes del método de la invención, proporcionando de esta manera un método más preciso.

Con el fin de aumentar la cantidad de microorganismos presentes en una muestra, dichos microorganismos, si están presentes, pueden cultivarse en medios. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicho método, por ejemplo al paso (a) de antes, está precedido de un enriquecimiento de microorganismos, que comprende (i) el crecimiento de dichos microorganismos en medios selectivos, o (ii) el crecimiento de dichos microorganismos en medios no selectivos. El crecimiento de dichos microorganismos en medios selectivos favorecerá preferiblemente el crecimiento de los microorganismos de interés, mientras que el crecimiento en medios no selectivos mantendrá el crecimiento de la mayoría de los microorganismos, por ejemplo, sin favorecer especialmente el crecimiento de un microorganismo particular.

Aunque la muestra se puede usar directamente para el aislamiento de ADN, algunas técnicas requieren el crecimiento y recogida de los microorganismos antes del aislamiento del ADN. Según el método de la invención, el crecimiento y recogida de los microorganismos antes del aislamiento del ADN no se requiere ni es esencial, proporcionando de esta manera un método de detección más rápido comparado con los métodos del estado de la técnica. El crecimiento y recogida de los microorganismos antes del aislamiento del ADN, sin embargo, se puede incluir opcionalmente en el método de la invención. Según esto, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde dicho método, por ejemplo el paso (a) de antes, está precedido por un enriquecimiento de microorganismos, que comprende concentrar los microorganismos. Las estrategias de recogida típicas que se conocen en la técnica son, por ejemplo, pero no están limitadas a, sembrar la muestra en un medio de cultivo sólido adecuado, añadir la muestra en un medio de cultivo líquido adecuado o suministrar primero la muestra a un medio de cultivo líquido adecuado seguido por sembrarla en un medio de cultivo sólido adecuado. A partir de un medio de cultivo sólido, los microorganismos se pueden recoger directamente para el aislamiento de ADN, mientras que un medio de cultivo líquido en general requiere primero un paso de centrifugación para recoger los microorganismos.

La recogida y/o captura de dichos microorganismos se puede realizar por medio de centrifugación, filtración, tal como filtrar una solución acuosa o líquida, por lo cual todas las partículas mayores del tamaño de malla se capturan, sedimentación, fuerzas electrostáticas, coagulación floculación, captura de microorganismos por anticuerpos, y/o captura de microorganismos por ligandos.

Otras técnicas de recogida y/o captura pueden incluir la microfiltración y preferiblemente la microfiltración de membrana tal como el método de cribado microanalítico (MAS, por sus siglas en inglés). Este método alcanza baja resistencia de flujo, una alta resistencia química y una distribución de tamaño de poro bien controlada de los filtros de membrana, para obtener un alto flujo operacional, largos tiempos de permanencia (por ejemplo una vida larga/tiempo de operación del microtamiz) y un buen comportamiento de separación. Preferiblemente, los filtros de microtamiz según la presente invención se caracterizan por finas capas de membrana con poros de dimensión uniforme. Para la mayoría de las aplicaciones, la capa de membrana se sujeta por un soporte. Un microtamiz que tiene una capa de filtración o tamizado relativamente fina con una alta densidad de poros y una estrecha distribución de tamaños de poro sobre un soporte macroporoso mostrará un comportamiento de separación de satisfactorio a bueno o incluso excelente y una alta velocidad de flujo. En suspensiones muy diluidas será importante tener una determinación rápida del tipo y concentración de partículas, tales como por ejemplo zumos de frutas contaminados con microorganismos. La baja resistencia al flujo del microtamiz permite que pase una gran cantidad de líquido a través del filtro en una cantidad de tiempo pequeña, por lo que los microorganismos contaminantes (si están presentes) se concentran en una superficie muy pequeña (20-100 mm2). Esta rápida concentración de los microorganismos contaminantes ayuda en la simplificación y la calidad del posterior análisis de estos microorganismos. Con respecto a la tecnología de microfiltración, la presente invención se refiere también a microfiltración de flujo cruzado como describen Daufin et al., (2001), a una tecnología de microfiltración descrita por la solicitud de patente WO 02/43937 (por Aquamarijn Holding Ltd.) o a una tecnología de microfiltración desarrollada

por CEPAration B.V. (Helmond, Países Bajos). Según esto, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde dicha microfiltración se realiza usando un filtro Aquamarijn® o un filtro CEPAration®. Por ejemplo, se puede usar un filtro de nitruro de silicio como membrana, y silicio como soporte, o el filtro puede comprender una membrana de cerámica de fibra hueca. El tamaño de los poros puede ser, por ejemplo de entre 0,5 y 1,2 micrómetros o entre 0,15 y 1,4 micrómetros.

Se entenderá que la presente invención se refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en el que dicha concentración va seguida de la separación de los microorganismos del resto de la muestra. Además, la concentración y separación pueden realizarse simultáneamente, lo que aumenta así la velocidad del análisis.

Puede usarse una amplia variedad de técnicas de coloración y/o teñido con el fin de mejorar el reconocimiento de los microorganismos en la superficie del microtamiz. Los microtamices son preferiblemente inertes, lo que hace posible el uso de todos los agentes y productos químicos de tinción sin colorear o atacar la superficie del microtamiz. Dicho microtamiz pueden usarse de nuevo.

El método MAS presentado también puede aplicarse para el control de calidad del agua en general y del agua potable en particular sobre la presencia de microorganismos contaminantes, tales como por ejemplo, Cryptosporidium, Escherichia coli y Legionella. En la industria cárnica también puede aplicarse el método MAS para seguir microorganismos contaminantes, tales como por ejemplo contaminaciones por Campylobacter y Salmonella.

Con el fin de caracterizar el microorganismo contaminante, la presente invención puede emplear técnicas conocidas para identificar el ácido nucleico del microorganismo en cuestión. La presente invención se refiere preferentemente a la técnica de amplificación múltiplex y de marcaje descrita más adelante. El multiplexado proporciona la oportunidad de realizar análisis múltiples durante un único paso del proceso lo que proporciona tiempos de análisis más rápidos y menores cantidades de consumibles que se van a usar.

El término “ácido nucleico” como se usa en este documento significa un polímero compuesto de nucleótidos, por ejemplo, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Los términos “ácido ribonucleico” y “ARN” como se usa en este documento significan un polímero compuesto de ribonucleótidos. Los términos “ácido desoxirribonucleico” y “ADN” como se usan en este documento significan un polímero compuesto de desoxirribonucleótidos. Los términos “oligonucleótido”, “cebador” y “sonda” como se usan en este documento indican multímeros de nucleótidos monocatenarios desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. El término “polinucleótido” como se usa en este documento se refiere a polímeros mono o bicatenarios compuestos de monómeros de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, normalmente de más de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud hasta aproximadamente 2000 nucleótidos de longitud.

Se entenderá que la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dichos ácidos nucleicos se eligen del grupo constituido por ADN, ARNr, ARNt, ARNip, ARNm, ARN total y ARNtm (naturaleza dual similar a ARNt y ARNm; también conocido como ARN 10Sa o SsrA).

Con el fin de caracterizar el ácido nucleico de un microorganismo contaminante, es decir, el ácido nucleico diana, dicho ácido nucleico se aísla normalmente del microorganismo contaminante después de que dicho organismo se haya opcionalmente recogido o capturado. La recogida o captura del microorganismo contaminante y el aislamiento de los ácidos nucleicos se realizan usando técnicas generalmente conocidas. En general, el aislamiento de ácidos nucleicos de microorganismos requiere como una de las primeras etapas la lisis de dicho microorganismo. Será aparente que las estrategias de lisis de células empleadas dependen de la naturaleza de los microorganismos contaminantes. En general puede usarse un tratamiento con una lisozima, un pectinolítico o un tratamiento mecánico tal como sonicación o un molino de perlas para lisar las células. Un procedimiento tradicional es la inyección directa de las muestras bacterianas en una disolución de fenol caliente, tal como se describe por Selinger et al. (2000, Nature Biotechnol. 18, 1262-1268). Alternativamente, las células pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y romperse mecánicamente antes del aislamiento con una disolución ácida de fenol. Los métodos clásicos para aislar ácidos nucleicos que se refieren a combinaciones de degradación enzimática, extracción orgánica y precipitación en alcohol y/o sales son muy conocidos en la técnica y se contemplan en la presente invención. A este respecto, las técnicas para aislar ácidos ribonucleicos descritas en Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Co, EE UU son especialmente mencionadas. La presente invención también se refiere a una rápida purificación a pequeña escala de ADN y ARN de muestras clínicas. Este último método puede basarse en las propiedades de lisado e inactivación de nucleasas del agente caotrópico tiocianato de guanidinio (GuSCN) y las propiedades de unión a ácido nucleico de partículas de sílice o diatomeas en presencia de este agente, tal como se describe por Boom et al. (1999; J. Clin. Microbiol. 37: 615-619). Para el aislamiento de ARN se pueden usar métodos típicos conocidos en la técnica. La mayoría de las especies de ARNm microbiano sólo tienen una semivida de minutos, principalmente debido a la actividad de las RNasas. Por tanto, la velocidad requerida para estabilizar la población de ARN, es decir, para detener o disminuir la degradación de ARN, es crucial, y, por tanto, pueden emplearse diversos inhibidores de actividad de la ribonucleasa tales como, por ejemplo, dietilpirocarbonato, ácido aurintricarboxílico, etc., en los procedimientos de aislamiento de ARN, y pertenecen al conocimiento general común respecto al aislamiento de ARN. La lisis de dicho microorganismo contaminante puede realizarse antes o después de estabilizar la población de ácido nucleico. La presente invención también se refiere a una disolución de parada que contiene

etanol y fenol, como se ha descrito para el aislamiento de ARN total de E. coli (Ye et al., 2001, J. Microbiol. Methods 47, 257-272). Esta disolución de parada puede usarse satisfactoriamente para otras bacterias gram-negativas. Además, la presente invención contempla el uso de la disolución RNAlater® (Ambion y Qiagen). La principal ventaja de esta última disolución es la rápida estabilización de la población de ARNm, permitiendo que las muestras se almacenen durante un largo periodo de tiempo en condiciones apropiadas antes del aislamiento de ARN. Es especialmente útil para la recogida de muestras cuando no es posible el aislamiento inmediato de ARN. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicha etapa de extraer ácidos nucleicos de dichos microorganismos comprende lisar los microorganismos, y opcionalmente además inactivar las RNasas.

Puede usarse una etapa de enriquecimiento debido a que la mayoría de los ARNm de bacterias no tienen una cola de poli A+ y por tanto son difíciles de separar del ARN total. La presente invención se refiere a una etapa de enriquecimiento para ARNm mediante eliminación del ARN ribosómico como se conoce en la técnica, por ejemplo como se describe por Affymetrix (http://www.affymetrix.com/index.affx). Además, la presente invención incorpora un método para aislar ARNm de E. coli mediante poliadenilación en extractos de células crudas con poli A+ polimerasa I de E. coli y purificación mediante cromatografía en oligo-dT como se describe por Wendisch et al. (2001 Anal. Biochem. 290: 205-213).

Están disponibles una variedad de kits de aislamiento de ARN de diferentes fuentes comerciales, por ejemplo de Ambion, Qiagen, Sigma-Aldrich y otras, que pueden usarse satisfactoriamente en el método de la presente invención.

Como se ha descrito anteriormente para el aislamiento de ARN, en el aislamiento de ADN el procedimiento para lisar el microorganismo depende del tipo de microorganismo, por ejemplo mohos, hongos, levaduras, bacterias gramnegativas o gram-positivas. A este respecto, se mencionan especialmente las técnicas para aislar ADN como se describen en Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Co, EE UU. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicho lisado se elige del grupo que consiste en un tratamiento con una lisozima, un pectinolítico o tiocianato de guanidinio, o mediante un tratamiento mecánico tal como sonicación o el uso de un molino de perlas, inyectando los microorganismos en fenol caliente, y congelación ultrarrápida de los microorganismos en nitrógeno líquido seguido por un tratamiento mecánico. Un método conveniente para aislar ARN de organismos gram-negativos es resuspender las células en agua y hervir el agua durante al menos un minuto. Opcionalmente se puede añadir EDTA y/o un detergente al agua.

Están disponibles una variedad de kits de aislamiento de ADN genómico de diferentes fuentes comerciales, por ejemplo de Gentra, Promega, Qiagen y otras, que pueden usarse satisfactoriamente en los procedimientos de la presente invención.

Una manera conveniente de estimar la concentración del ácido nucleico aislado es mediante espectrofotometría a 260 nm, que es bien conocida en la técnica.

Después de aislar los ácidos nucleicos de los microorganismos contaminantes, dichos ácidos nucleicos tienen que detectarse y posiblemente analizarse. En general sólo están presentes cantidades mínimas de microorganismos contaminantes. Por tanto, pueden amplificarse los ácidos nucleicos aislados o una parte específica de los mismos, es decir, el ácido nucleico diana. En caso de que el ácido nucleico diana sea ARN, dicho ARN puede convertirse en primer lugar en ADNc antes del análisis. Se entenderá que los términos “ácidos nucleicos amplificados” y “mezcla de ácidos nucleicos amplificados” como se usan a lo largo de la invención tienen esencialmente el mismo significado.

Por tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en el que dicho ácido nucleico es ARNr, ARNt, ARNm, ARNip, ARN total o ARNtm y en el que dicho ARNr, ARNt, ARNm, ARNip, ARN total o ARNtm se convierte en ADNc, por ejemplo, mediante la actividad de una transcriptasa inversa, como es bien conocido en la técnica.

El experto en la materia conoce diversas técnicas para amplificar ADN y/o ADNc. Todas estas técnicas están contempladas por la presente invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicho ácido nucleico es ADN y/o ADNc, y en el que dicho ADN y/o ADNc se amplifica usando una técnica de amplificación tal como bDNA, captura híbrida, SDA, TMA, PCR, LCR, TAS, 3SR, NASBA y amplificación por Qβ, como se explica en Versalovic y Lupski (2002, Trends Microbiology 10: S15-S21).

La presente invención contempla especialmente amplificación múltiplex, tal como PCR múltiplex. La amplificación múltiplex, tal como PCR múltiplex, permite la amplificación y, por tanto, el análisis de dos o más dianas simultáneamente. Esta técnica de amplificación se usa para cribado genético, análisis de microsatélites y otras aplicaciones en las que es necesario amplificar varios productos en una única reacción. Mediante experimentación rutinaria, el experto en la materia podrá optimizar las condiciones de reacción en vista de que tiene múltiples pares de cebadores en una única reacción que pueden aumentar la probabilidad de dímeros de cebadores y otros productos no específicos que pueden interferir con la amplificación de productos específicos. Además, las concentraciones de pares de cebadores individuales frecuentemente necesitan optimizarse ya que frecuentemente

se amplifican diferentes amplicones múltiplex con diferentes eficiencias, y múltiples pares de cebadores pueden competir entre sí en la reacción. El experto en la materia hará consideraciones similares y optimizará las condiciones para las otras técnicas de amplificación anteriormente descritas para amplificaciones múltiplex, es decir, amplificación de más de una diana.

Además, la presente invención se refiere a la amplificación directa de ARN, tal como por ejemplo, mediante un método Tyras modificado, en el que se usa un cebador/sonda que comprende un sitio de reconocimiento de la ARN polimerasa y un sitio de reconocimiento complementario al ácido nucleico diana.

Después de aislar el ácido nucleico diana, se hibridan sondas y/o cebadores con dicho ácido nucleico diana. Los cebadores pueden usarse para amplificar dicho ácido nucleico diana. Alternativamente, las sondas pueden ligarse y pueden amplificarse con cebadores que reconocen específicamente regiones en dichas sondas. Las sondas y/o cebadores pueden marcarse. Por tanto, el marcador puede incorporarse durante la etapa de amplificación o unirse después de la amplificación. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que el ácido nucleico amplificado está marcado. Prácticamente cualquier marcador que produce una señal detectable, cuantificable y que puede unirse al ácido nucleico amplificado puede usarse junto con los métodos y matrices de la invención. Los marcadores adecuados incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, restos quimioluminiscentes, etc. En formas de realización en las que el marcador se une al ácido nucleico amplificado, el marcador puede unirse a cualquier parte del ácido nucleico, que incluye el extremo libre o una o más de las bases. Preferentemente, la posición del marcador no interferirá con la hibridación, detección u otras modificaciones posteriores a la hibridación del ácido nucleico marcado. Pueden usarse una variedad de protocolos diferentes para generar los ácidos nucleicos marcados, como se conoce en la técnica, donde que tales métodos se basan normalmente en la generación enzimática de ácido nucleico marcado usando un cebador inicial y ácido nucleico molde. Se pueden emplear cebadores marcados para generar el ácido nucleico amplificado marcado. Alternativamente, el marcador puede incorporarse dentro del ácido nucleico durante la síntesis de la primera hebra o síntesis posterior, etapas de marcaje o amplificación con el fin de producir ácido nucleico amplificado marcado. El marcador también puede incorporarse directamente al ARNm usando modificación química de ARN con derivados de marcadores reactivos o modificación enzimática usando sustratos marcados. Se describen métodos representativos para producir ácido nucleico amplificado marcado en la patente en EE UU 5.994.076; patente en EE UU 6.121.361.

Los ácidos nucleicos amplificados pueden marcarse, por ejemplo, mediante los marcadores y las técnicas descritas anteriormente. Alternativamente, pueden marcarse mediante cualquier otro método conocido en la técnica. Técnicas preferidas incluyen métodos directos de marcaje químico y métodos de marcaje enzimático tales como usando quinasas y desplazamiento de mellas. Por consiguiente, la presente invención se refiere métodos como se describen en este documento, en el que el ácido nucleico diana amplificado está marcado. Preferiblemente, el ácido nucleico se marca durante la amplificación, o el ácido nucleico amplificado se marca después de la amplificación. Como tal, la presente invención se refiere a métodos como se describen en el presente documento, en donde el cebador I y/o el cebador II están marcados. El marcaje durante la amplificación proporciona tiempos de análisis más rápidos ya que proporciona la oportunidad de eliminar un paso del proceso donde las dianas amplificadas se marcan.

Pueden emplearse una variedad de diferentes marcadores donde tales marcadores incluyen marcadores fluorescentes, marcadores fosforescentes, marcadores isotópicos, marcadores enzimáticos, marcadores particulados, etc. Por ejemplo, los marcadores adecuados incluyen fluorocromos, por ejemplo isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, tal como rodamina 123, R6G, IRDyes™, Texas Red, ficoeritrina, aloficocianina, 6carboxifluoresceína (6-FAM), 2’,7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), TET, JOE, NED, (ET-)ROX, 6-carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexacloro-fluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM) o N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxi-rodamina (TAMRA), flúor 488™, colorantes de cianina, por ejemplo Cy5, Cy3, Cy2, colorantes BODIPY, por ejemplo Biodipy™ 630/650, Biodipy 530, Biodipy™ FL, Alexa tal como Alexa542, Alexafluor™ 532, etc. Marcadores isotópicos adecuados incluyen marcadores radiactivos, por ejemplo 32P, 33P, 35S,3H. Otros marcadores adecuados incluyen partículas de tamaño que poseen dispersión de la luz, propiedades fluorescentes o que contienen múltiples fluoróforos encerrados. El marcador puede ser un sistema de dos fases en el que el cebador y/o la sonda están conjugados a biotina, haptenos, etc. que tienen un compañero de unión de alta afinidad, por ejemplo avidina, anticuerpos específicos, etc. El compañero de unión está conjugado a un marcador detectable, por ejemplo un marcador enzimático que puede convertir un sustrato en un producto cromógeno, un marcador fluorescente, un marcador isotópico, etc.

En ciertas formas de realización, los cebadores dirigidos a diferentes ácidos nucleicos diana pueden estar marcados diferencialmente. Por “diferencialmente marcado” y “contienen un marcador diferente” se entiende que los cebadores dirigidos a diferentes ácidos nucleicos diana están marcados diferencialmente entre sí de tal manera que pueden distinguirse simultáneamente entre sí. Por tanto, el cebador I puede contener un marcador diferente del cebador II. Por ejemplo, el cebador I o el cebador II que se une a un primer par de sondas, puede contener un marcador diferente del cebador I o el cebador II que se une a un segundo par de sondas.

Una forma de realización de la invención se refiere a la combinación de (1) reacción de detección de ligasa múltiplex (LDR) y (2) reacción en cadena de la polimerasa múltiplex (PCR). La reacción de detección de ligasa (LDR) es un

ensayo sensible para detectar polimorfismos de un sólo nucleótido (SNP), como se describe por Favis et al., (2000, Nature Biotechnology 18: 561-564). Una diferencia en un sólo nucleótido a lo largo del ARNr 16S puede emplearse para distinguir entre secuencias de diferentes microorganismos, como se describe por Busti et al. (2002, BMC Microbiology 2: 27-39). Similarmente, las diferencias en un sólo nucleótido a lo largo del ARNr 18S, 23S o 28S pueden emplearse para distinguir entre secuencias de diferentes microorganismos. Similarmente, cualquier diferencia entre dos organismos en cualquier tipo de ADN o ARN, tal como ADN cromosómico, ADNr, ADN de plásmido, ADN mitocondrial o ADN de cualquier otro orgánulo, ARNr, ARNm, ARNt o cualquier otra molécula de ARN tal como se describe posteriormente, se puede emplear para distinguir entre microorganismos. Puede diseñarse un conjunto de dos sondas (sonda I y II) basado en la secuencia diana que va a detectarse, de la que al menos se conoce una parte. Ambas sondas contienen una región en el extremo (el extremo 3’ y el 5’ de las sondas I y II respectivas) que puede hibridar con la sección conocida de la secuencia diana. En otras palabras, una sonda (sonda I) comprende una región Ir o tss(I) (que se hibrida específicamente con una región diana, estando localizada dicha región Ir o tss(I) en el extremo 3’ final de la sonda I. Dicha sonda I comprende además una sección de unión al cebador (PBS(I)) localizada en 5’ de la región Ir. Dicha sonda I y/o II puede contener una región de relleno y/o una ZipDectCode (ZDc o DET) también denominada en el presente documento región detectora (DET). Por ejemplo, dicha región de relleno y/o DET en la sonda I puede localizarse entre la región Ir o tss(I) y PBS(I).

La región detectora (DET) comprende una secuencia única que se puede usar para la identificación de productos amplificados. DET hibridará con su sonda detectora oligonucleotídica complementaria (por ejemplo cDET) presente durante la reacción de amplificación. Se debe advertir que para todas las estructuras de sondas ligadas proporcionadas por los métodos según la invención, ZDc (o DET) se puede sustituir por una ZDc complementaria (cZDc o cDET) ya que tras la amplificación se formará una ácido nucleico bicatenario del que al menos una hebra comprenderá una ZDc (o DET) detectable por la sonda detectora oligonucleotídica. DET y cDET se refieren a segmentos de ADN usados para detección en tiempo real durante la amplificación, donde cDET tiene la secuencia complementaria de DET.

La sonda II comprende una región IIr o tss(II) que hibrida específicamente con una región diana, estando localizada dicha región IIr o tss(II) en el extremo 5’ final de la sonda II. Dicha sonda II comprende además una sección de unión del cebador (PBS(II)) localizada en 3’ de la región IIr. La sonda I o sonda II puede comprender adicionalmente una región identificadora, tal como Zipcode (Zc o ZIP) o ZipComcode (ZCc o cZIP) localizada entre la región Ir o tss(I) y PBS(I) o la región IIr o tss(II) y PBS (II), respectivamente. ZIP y cZIP se refiere a los segmentos de ADN usados para detección por micromatriz, donde cZIP tiene la secuencia complementaria de ZIP. ZCc (o cZIP) o su complemento Zc (o ZIP) es una secuencia única para la identificación de los productos finalmente amplificados. ZCc (o cZIP) hibridará con su complemento el Zc (o ZIP). El complemento del producto amplificado está presente en, por ejemplo, un microchip (sonda de captura; véase más adelante). Tras la hibridación, la región diana Ir de la sonda I (tss(I)) está localizada adyacente a la región diana IIr de la sonda II (tss(II)). ZCc (o cZIP) o Zc (o ZIP) y la PBS están localizados en los extremos de las sondas y no pueden hibridar con la secuencia diana. Cuando ambas sondas hibridan con la secuencia diana y están localizadas adyacentes entre sí, las sondas pueden ligarse usando una ligasa, tal como por ejemplo Pfu ADN ligasa. Después de la ligación, las sondas ligadas pueden amplificarse usando al menos un cebador que puede hibridar con una sección de unión al cebador. Preferentemente, la amplificación se lleva a cabo por PCR, usando la sonda I con una PBS(I) que se diferencia de la sonda II con PBS(II). Por tanto, el cebador I que se une a la región caracterizada por PBS(I) se diferenciará del cebador II que se une a la región caracterizada por PBS(II). Se apreciará que si el cebador I comprende una secuencia sustancialmente complementaria a PBS(I), entonces el cebador II comprende una secuencia sustancialmente idéntica a PBS(II), y viceversa, que si el cebador I comprende una secuencia sustancialmente idéntica a PBS(I), entonces el cebador II comprende una secuencia sustancialmente complementaria a PBS(II).

En una forma de realización adicional, la sonda I o la sonda II puede comprender un Zipcode. Puesto que es el objeto de la presente invención que tras la ligación de la sonda I y la sonda II, la sonda ligada se amplifique, se puede entender que la sonda ligada amplificada contenga un ZipComcode para que hibride con el Zipcode, presente en, por ejemplo, un microchip. Por tanto, proporcionar la sonda I o la sonda II con un Zipcode también produciría una sonda ligada amplificada que comprende un ZipComcode.

Uno de los cebadores puede estar marcado, por ejemplo en su extremo 5’. Bien el primer cebador o el segundo cebador puede estar marcado en su extremo 5’. Alternativamente, ambos cebadores pueden estar marcados con el mismo o diferentes marcadores. En un múltiplex, el método puede funcionar usando un cebador común, por ejemplo que hibrida con PBS(I), y un cebador específico de la sonda, por ejemplo que hibrida con PBS(II). Se apreciará que el cebador común puede hibridar con PBS(II), mientras que el cebador específico de la sonda hibrida con PBS(I). En una forma de realización adicional, la sonda I contiene un marcador.

Por tanto, en el método según la presente invención, dicho ácido nucleico y/o ADNc puede amplificarse usando la reacción de detección de ligasa, que comprende una primera sonda de ácido nucleico complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y una segunda sonda de ácido nucleico complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizada esencialmente adyacente a dicha parte distinta de dicho ácido nucleico diana, en el que dicha primera sonda de ácido nucleico comprende además una sección de unión del cebador localizada en 5’ y posiblemente un relleno, y dicha primera o dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una etiqueta ZipComcode localizada en 3’ que es esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana y una sección de unión del cebador, que en caso de dicha segunda sonda de ácido nucleico está localizada en 3’ de ZipComcode. El método comprende además incubar dicho ácido nucleico y/o ADNc, permitir la hibridación de ácidos nucleicos complementarios, unir cualquier sonda esencialmente adyacente (mediante ligación) y amplificar cualquier

5 ácido nucleico sonda unido, en donde la amplificación se inicia mediante la unión de cebadores de ácido nucleico específicos para las secciones de unión al cebador.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicha etapa de unión comprende el uso o actividad de una ligasa, tal como ADN ligasa de T4, ARN ligasa de T4, ADN ligasa de 10 E. coli, o una ligasa termoestable tal como Taq ADN ligasa, Pfu ADN ligasa, Tth ADN ligasa o Ampligasa™. Las condiciones en las que se puede producir una reacción de ligación se conocen bien en la técnica.

Una estructura típica de sondas ligadas es la siguiente:

15 I: 5’-PBS(I) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] – ZCc (o cZIP) [relleno] -PBS(II)-3’,

II: 5’-PBS(I) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana

[relleno] -PBS(II)-3’, 20

III: 5’-PBS(I) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -secuencia I específica de diana --secuencia II específica de diana -[relleno] -PBS(II)-3’,

IV: 5’-PBS(I) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana --25 secuencia II específica de diana -[relleno] -PBS(II)-3’,

V: 5’-PBS(I) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana [relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] PBS(II)-3’,

30 VI: 5’-PBS(I) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -PBS(II)-3’,

VII: 5’-PBS(I) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -ZDc (o DET)

-: [relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] PBS(II)-3’, o 35

VIII: 5’-PBS(I) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -PBS(II)-3’.

(las regiones entre corchetes son opcionales).

40 En el caso de que el cebador I marcado comprenda una secuencia sustancialmente idéntica a PBS(I) y el cebador II no marcado comprenda una secuencia sustancialmente complementaria a PBS(II), las estructuras típicas de la sonda ligada después de la amplificación son:

45 I: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -PBS(II)-3’,

II: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II

específica de diana -[relleno] -PBS(II)-3’, 50

III: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -PBS(II)-3’,

IV: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -secuencia I específica de 55 diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -PBS(II)-3’,

V: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] PBS(II)-3’,

60 VI: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -PBS(II)-3’,

VII: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -

ZDc (o DET) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] PBS(II)-3’, o 65

VIII: 5’-Marcador -PBS(I) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -PBS(II)-3’.

(las regiones entre corchetes son opcionales).

En aún otra forma de realización, el cebador I no marcado comprende una secuencia sustancialmente idéntica a PBS(I) y el cebador II marcado comprende una secuencia sustancialmente complementaria a PBB(II). La estructura típica de las sondas ligadas es la siguiente:

I: 5’-PBS(I) -[relleno] -Zc (o ZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana [relleno] -PBS(II)-3’,

II: 5’-PBS(I) -[relleno] -Zc (o ZIP) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -PBS(II)-3’,

III: 5’-PBS(I) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -Zc (o ZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana -[relleno] -PBS(II)-3’, o

IV: 5’-PBS(I) -[relleno] -Zc (o ZIP) -[relleno] -secuencia I específica de diana ---secuencia II específica de diana [relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] PBS(II)-3’

(las regiones entre corchetes con opcionales).

Y las estructuras típicas de la sonda ligada después de la amplificación son:

I: 5’-Marcador -cPBS(II) -[relleno] -secuencia II específica de diana complementaria (ctssII) ---secuencia I específica de diana complementaria (ctssI)-[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -cPBS(I)-3’,

II: 5’-Marcador -cPBS(II) -[relleno] – ctss II ---ctss I -[relleno] -cZDc (o cDET) -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -cPBS(I)-3’,

III: 5’-Marcador -cPBS(II) -[relleno] – ctss II ---ctss I -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -ZDc (o DET) -[relleno] -cPBS(I)-3’, o

IV: 5’-Marcador -cPBS(II) -[relleno] -cZDc (o cDET) -[relleno] – ctss II ---ctss I -[relleno] -ZCc (o cZIP) -[relleno] -cPBS(I)-3’.

Se debe advertir que en el caso de que se use un cebador II marcado que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a PBS(II), la primera y segunda sondas de ácido nucleico deben proporcionar Zipcodes en lugar de ZipComcodes y preferiblemente el Zipcode se posiciona en la primera sonda de ácido nucleico. Proporcionando el Zipcode en la primera sonda de ácido nucleico la hebra marcada de la sonda ligada amplificada contendrá un ZipComcode.

En una forma de realización preferida de la presente invención, ZDc (o DET) se proporciona en la hebra no marcada de la sonda ligada amplificada.

En una forma de realización adicional, dicha primera sonda de ácido nucleico está acoplada en su extremo 5’ al extremo 3’ de dicha segunda sonda de ácido nucleico, posiblemente a través de una región de relleno (figura 2).

Se debe advertir que en el caso que se use un cebador I marcado o un cebador II marcado durante la amplificación de la sonda ligada, se formará una sonda ligada amplificada bicatenaria en donde una de las hebras estará marcada, mientras que la otra sonda no estará marcada. La presente invención proporciona que la hebra marcada de la sonda ligada amplificada comprende un ZipComcode, lo que permite que esta hebra hibride con el Zipcode presente en, por ejemplo, un microchip. O bien la hebra marcada o bien la hebra no marcada de la sonda ligada amplificada comprende un ZipDectcode, lo que permite que esta hebra se detecte por la sonda detectora oligonucleotídica complementaria. Al proporcionar ZCc (o cZIP) y ZDc (o DET) en respectivamente la hebra marcada y la no marcada de la sonda ligada amplificada, la detección de ambas se produce por separado sin impedimentos entre ambas estrategias de detección. En el primer caso, la detección de ZDc (o DET) proporcionará información respecto a la presencia o ausencia de la sonda ligada amplificada y por consiguiente de la presencia o ausencia de un microorganismo contaminante, mientras que la muestras que proporcionan un señal de detección positiva de ZDc (o DET) se hibridarán posteriormente en el segundo paso de cribado donde se detectará la hebra marcada de la sonda ligada amplificada que contiene ZCc (o cZIP).

En una forma de realización preferida, el cebador I está marcado si el ZipComcode se localiza en la primera o la segunda sonda de ácido nucleico.

En una forma de realización, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde (véase la figura 5):

(a) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una secuencia I de unión al cebador (PBS(I)),

5 ZipComcode (ZCc o cZIP), y una secuencia I específica de diana (tss(I)), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una secuencia II específica de diana (tss(II)), ZipDectCode (ZDc o DET) y una secuencia II de unión al cebador (PBS(II)), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(b) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZDc (o DET) y tss(I), dicha segunda

sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), ZCc (o cZIP) y PBS(II), y preferiblemente el 10 cebador I está marcado;

(c): dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZDc complementaria (cZDc o cDET) y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), ZCc (o cZIP) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(d): dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZCc (o cZIP), ZDc (o DET) y tss(I),

15 dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(e) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZCc (o cZIP), cZDc (o cDET) y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

20 (f) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZDc (o DET), ZCc (o cZIP) y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(g) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cZDc (o cDET), ZCc (o cZIP) y tss(I),

dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el 25 cebador I está marcado;

(h): dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I) y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), ZDc (o DET), ZCc (o cZIP) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(i): dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I) y tss(I), dicha segunda sonda de

30 ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), ZCc (o cZIP), ZDc (o DET) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(j) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), Zc (o ZIP) y tss(I), y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), ZDc (o DET) y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado;

35 (k) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZCc (o cZIP), ZDc (o DET) y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado;

(l) dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), Zc (o ZIP), cZDc (o cDET) y tss(I), y

dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el 40 cebador II está marcado;

(m): dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZDc (o DET), Zc (o ZIP) y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado; y/o

(n): dicha primera sonda ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cZDc (o cDET), Zc (o ZIP) y tss(I),

45 dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado.

Eco y Mse se refieren a las regiones de unión al cebador 1 y 2, cEco y cMse a sus secuencias complementarias respectivas. ZIP y cZIP se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en micromatriz, donde cZIP tiene

50 la secuencia complementaria de ZIP. DET y cDET se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en tiempo real durante la amplificación, donde cDET tiene la secuencia complementaria de DET. cSeq-1 y cSeq-2 se refiere los segmentos de ADN complementarios al ADN diana.

A este respecto, el experto en la materia apreciará que se usan términos equivalentes de forma intercambiable en la 55 presente descripción tales como, 23

-cSeq-1 y c-Seq-2 se refiere a la secuencia I específica de diana y la secuencia II específica de diana, respectivamente, -Eco y cMse se refiere a la sección I de unión al cebador y la sección II de unión al cebador, 60 respectivamente. En un producto de PCR bicatenario, una hebra siempre tendrá la secuencia sentido (Eco

o Mse) de un cebador y la secuencia antisentido o complementaria (cEco o cMse) del otro cebador. Es

decir bien Eco y cMse o cEco y Mse. -cZIP se refiere a ZipComcode, mientras que ZIP se refiere a Zipcode, -DET se refiere a ZipDectCode, mientras que cDET se refiere a ZipDectCode complementario.

Además, la presente invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde dicha sonda I y/o dicha sonda II comprende una región de relleno. A este respecto, se pretende que una región de relleno separe regiones estructurales tales como las PBS, ZCc (o cZIP), Ir (tss(I)) o IIr (tss(II)), evitando o minimizando de esta manera el impedimento estérico.

Como ya se ha explicado anteriormente, se apreciará que el marcador puede estar unido a al menos uno de los cebadores y/o sondas, o en la alternativa, se puede incorporar durante la amplificación. El marcador es por ejemplo, un marcador fluorescente. Según esto, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde al menos un cebador contiene un marcador, y preferiblemente un marcador fluorescente. Esto proporciona un método de detección económico.

Se apreciará que los híbridos ARN-ADN puedan actuar como sustratos para ADN ligasa de T4, como se describe por Charani Ranasinghe y Andrew A. Hobbs, Affiliations en Elsevier Trends Journals Technical Tips Online, [consejo] 01519 “A simple method to obtain the 5’ ends of mRNA sequences by direct ligation of cDNA-RNA hybrids to a plasmid vector”.

En la alternativa, una sonda o cebador contiene un sitio de unión a la ARN polimerasa. Las sondas ligadas se amplifican posteriormente mediante la actividad de una ARN polimerasa, por ejemplo ARN polimerasa de T4, T7 o SP6.

La presente invención contempla especialmente que durante el procedimiento de amplificación estén presentes una

o más moléculas detectoras. La presencia de moléculas detectoras durante la amplificación permite la detección de la acumulación de los ácidos nucleicos diana amplificados y por tanto este paso proporciona un primer cribado de las muestras. Puesto que se presume que una gran cantidad de las muestras son negativas, el primer paso de cribado rápido y barato evalúa si están presentes o ausentes en la muestra microorganismos contaminantes. Por tanto, el segundo paso de cribado más complicado, tedioso y más caro se puede evitar cuando no están presentes microorganismos.

La amplificación de los ácidos nucleicos diana se puede detectar y/o cuantificar usando la fluorescencia o fosforescencia de un colorante, fluorescencia o fosforescencia que se asocia directa o indirectamente con la multiplicación del ADN amplificado. Puesto que la amplificación de los ácidos nucleicos diana se detecta usando moléculas detectoras que pueden ser colorantes que se intercalan en el ADN bicatenario o sondas detectoras oligonucleotídicas complementarias a los ácidos nucleicos diana, el experto en la materia esperaría que estas moléculas detectoras alteraran la reacción de hibridación del segundo paso de cribado si estas moléculas detectoras están presentes durante la hibridación. Puesto que la hibridación del ADN es un proceso muy delicado influido por una gran variedad de factores medioambientales, se debe evitar la presencia de estas moléculas detectoras durante la reacción de hibridación. Eliminar estas moléculas detectoras antes del segundo paso de cribado es un proceso muy elaborado. Sin embargo, los inventores han encontrado, sorprendentemente, que la presencia de estas moléculas detectoras durante el segundo paso de cribado no altera los resultados obtenidos durante este cribado ni aumentan el número de resultados falsos positivos o falsos negativos.

Un método de detección directa puede usar, por ejemplo, un colorante que se une de forma no específica a ADN bicatenario y solo fluoresce o fosforece en relación a esta unión. Cuando los ácidos nucleicos diana se amplifican, dicho colorante se une al ADN bicatenario recién formado de modo que la fluorescencia o fosforescencia medible aumenta. Los ejemplos de tales colorantes incluyen, pero no están limitados a, SYBR Green-I®, bromuro de etidio, yoduro de propidio, TOTO®-1{Quinolinio, 1-1’-[1,3-propanediiI[bis-(dimetiliminio)-3,1-propanediil]]bis [4-[(3-metil2(3H)-benzotiazolilideno) metil]]-,tetrayoduro}, y YoPro® {Quinolinio,4-[(3-metil-2(3H)-benzoxazolilideno) metil]-1[3(trimetilamonio)propil]-diyoduro}. El colorante más preferido para la presente invención es un colorante de cianuro no asimétrico tal como SYBR Green-I®, fabricado por Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.).

Otro método directo de detección que se puede usar en el método de la presente invención es un método que usa sondas detectoras oligonucleotídicas. Las sondas detectoras oligonucleotídicas son oligonucleótidos cortos complementarios a los ácidos nucleicos diana. Estas sondas detectoras oligonucleotídicas proporcionan una señal fluorescente tras la unión a los ácidos nucleicos diana amplificados. El método por el cual las sondas detectoras oligonucleotídicas proporcionan la señal fluorescente o fosforescente puede ser cualquier método conocido en la técnica.

En una forma de realización específica de la presente invención, las sondas detectoras oligonucleotídicas se proporcionan con la técnica de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). La sonda detectora oligonucleotídica FRET comprende dos colorantes fluorescentes, es decir, un “indicador” en un extremo, por ejemplo, el 5’, y un “extintor” en el otro extremo, por ejemplo, el 3’, de la sonda detectora oligonucleotídica FRET. En las sondas detectoras oligonucleotídicas FRET, los colorantes se mantienen, en el estado no unido, en proximidad espacial, por medio de una disposición en bucle (bucle horquillado). El bucle horquillado se genera por medio de secuencias complementarias que están presentes en los extremos de la secuencia de la sonda real. Debido a su proximidad al indicador, el colorante extintor se capaz de extinguir su fluorescencia por medio de la FRET. Tras la unión a los ácidos nucleicos diana amplificados, la sonda detectora oligonucleotídica FRET que es complementaria a

la secuencia de ácido nucleico diana altera el bucle horquillado y por tanto separa los dos colorantes, lo que produce que se suprima la interferencia FRET y la fluorescencia del indicador se hace medible.

En otra forma de realización específica de la presente invención se proporciona una sonda detectora oligonucleotídica FRET que, al contrario que las sondas mencionadas anteriormente, no posee ningún bucle horquillado. Durante el paso de amplificación, la actividad endonucleasa de la enzima polimerasa que replica los ácidos nucleicos diana, degrada la sonda FRET, que está unida al ácido nucleico diana, en su extremo 5’ de modo que el colorante indicador se libera de la sonda. Como resultado, el colorante indicador no está más en vecindad espacial del colorante extintor y ahora se puede medir. La amplificación del ADN diana y, como resultado, el aumento en la liberación del colorante indicador, se puede detectar entonces usando un sistema de medida óptico adecuado.

Las moléculas que se usan con frecuencia como etiquetas para FRET incluyen, fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), 2'7-dimetoxi-4'57-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), rodamina, 6-carboxirrodamina (R6G), N,N,N7,N'tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), y ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS). Otras potenciales moléculas donantes o aceptoras de FRET se conocen en la técnica (véase la patente en EE UU No. 5.866.366, tabla 1). El experto en la materia será familiar con la selección de pares de moléculas etiqueta para FRET (patente en EE UU No. 5.866.366).

Se pueden usar diferentes sondas detectoras oligonucleotídicas para llevar a cabo el método de la presente invención incluyendo, pero no limitado a, un ensayo de nucleasa 5’ en el que la sonda detectora oligonucleotídica lleva un colorante indicador fluorogénico en su extremo 5’ y un extintor en si extremo 3’, cebadores Scorpion en los que un cebador está unido covalentemente a la sonda, el complejo de cebador y sonda comprende un fluoróforo y una molécula extintora cada una unida al cebador o la sonda, y balizas moleculares que son moléculas en forma de horquilla con un fluoróforo internamente extinguido.

En un ensayo de nucleasa 5’, la sonda detectora oligonucleotídica tal como, por ejemplo, una sonda Taqman tiene un colorante indicador fluorogénico en su extremo 5’ y un extinguidor en su extremo 3’. Cuando la sonda está intacta, la emisión del colorante indicador se extingue. Durante cada ciclo de PCR, la ADN polimerasa corta el colorante indicador de la sonda. Una vez separado del extinguidor, el colorante indicador emite su fluorescencia característica. La figura 6a proporciona una representación esquemática de la reacción de amplificación en tiempo real usando sondas TaqMan para detección en tiempo real. Eco y Mse se refiere a las regiones de unión al cebador 1 y 2, cEco y cMse a sus secuencias complementarias respectivas. ZIP y cZIP se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en micromatriz, donde cZIP tiene la secuencia complementaria de ZIP. DET y cDET se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en tiempo real durante la amplificación, donde cDET tiene la secuencia complementaria de DET. cSeq-1 y c-Seq-2 se refiere a segmentos de ADN complementarios al ADN diana. “1. Hibridación” muestra los pares de sondas hibridados al ADN diana; “2. Ligación” muestra los pares de sondas unidos como resultado de la reacción de ligación; “3. Ciclo 1” muestra la estructura bicatenaria que resulta de copiar los pares de sondas unidos mediante extensión del cebador Mse por la ADN polimerasa; “4. Ciclo n” muestra el cebador Eco y la sonda TaqMan hibridadas con una de las hebras del producto de PCR. Se genera una señal fluorescente cuando la ADN polimerasa se extiende en la sonda TaqMan y libera el marcador fluorescente de la sonda TaqMan.

Los cebadores Scorpion comprenden un cebador que está unido a la sonda detectora oligonucleotídica. Esta sonda tiene tanto un fluoróforo como un extintor, que pueden estar en la misma hebra de ADN o en una hebra complementaria de ADN. En ausencia de la secuencia diana, el extintor casi absorbe la fluorescencia emitida por el fluoróforo. Durante la reacción de PCR, en presencia de la diana, el fluoróforo y el extintor se separan lo que produce un aumento de la fluorescencia emitida. La fluorescencia se puede detectar y medir en el tubo de reacción. La figura 6b proporciona una representación esquemática de la reacción de amplificación en tiempo real usando sondas Scorpion para detección en tiempo real. Eco y Mse se refiere a las regiones de unión al cebador 1 y 2, cEco y cMse a sus secuencias complementarias respectivas. ZIP y cZIP se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en micromatriz, donde cZIP tiene la secuencia complementaria de ZIP. DET y cDET se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en tiempo real durante la amplificación, donde cDET tiene la secuencia complementaria de DET. cSeq-1 y c-Seq-2 se refiere a segmentos de ADN complementarios al ADN diana. “1. Hibridación” muestra los pares de sondas hibridados al ADN diana; “2. Ligación” muestra los pares de sondas unidos como resultado de la reacción de ligación; “3. Ciclo 1” muestra la estructura bicatenaria que resulta de copiar los pares de sondas unidos mediante extensión del cebador Mse por la ADN polimerasa; “4. Ciclo 2” muestra el producto de extensión bicatenario de la sonda Scorpion. Después de la desnaturalización una de las hebras se vuelve a plegar (reacción Scorpion) para generar la estructura Scorpion que emite la señal de fluorescencia.

Las balizas moleculares se refiere a un método donde las sondas de hibridación oligonucleotídicas son moléculas con forma de horquilla con un fluoróforo internamente extinguido. Tras la presencia de la secuencia diana la horquilla se elimina y el fluoróforo no se extingue más. La figura 6c proporciona una representación esquemática de la reacción de amplificación en tiempo real usando balizas moleculares para la detección en tiempo real. Eco y Mse se refiere a las regiones de unión al cebador 1 y 2, cEco y cMse a sus secuencias complementarias respectivas. ZIP y cZIP se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en micromatriz, donde cZIP tiene la secuencia

complementaria de ZIP. DET y cDET se refiere a los segmentos de ADN usados para detección en tiempo real durante la amplificación, donde cDET tiene la secuencia complementaria de DET. cSeq-1 y c-Seq-2 se refiere a segmentos de ADN complementarios al ADN diana. “1. Hibridación” muestra los pares de sondas hibridados al ADN diana; “2. Ligación” muestra los pares de sondas unidos como resultado de la reacción de ligación; “3. Ciclo 1” muestra la estructura bicatenaria que resulta de copiar los pares de sondas unidos mediante extensión del cebador Mse por la ADN polimerasa. La desnaturalización del producto de extensión del cebador Mse y posterior rehibridación con la baliza molecular cambia la conformación de la baliza molecular separando el fluoróforo del extintor y emitiendo por tanto la señal fluorescente.

Además de permitir la detección en tiempo real de los ácidos nucleicos diana el uso de sondas detectoras oligonucleotídicas FRET también permite la cuantificación de los ácidos nucleicos diana.

Será aparente que la presente invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde se detecta una señal después y/o durante la amplificación de los ácidos nucleicos diana. Dicha señal es preferiblemente una señal fluorescente o fosforescente, y dicha señal fluorescente o fosforescente se puede detectar mediante una cámara CCD o mediante barrido láser.

Al proporcionar moléculas detectoras durante el procedimiento de amplificación es posible realizar en el primer paso del método de la presente invención un cribado hacia la presencia de microorganismos contaminantes en las muestras. Puesto que el segundo paso del método de la invención, que implica la caracterización e identificación adicional de los microorganismos contaminantes mediante hibridación de los ácidos nucleicos diana amplificados en una micromatriz, tiene un mayor coste por prueba, una reducción de las muestras que se van a analizar en el segundo paso del método de la presente invención sería muy beneficioso.

Por tanto, la presente invención, proporciona un método en donde los ácidos nucleicos diana amplificados hibridados en el paso (d) son las secuencias diana que proporcionan una señal positiva en el paso (c) del método de la presente invención.

En una forma de realización específica de la presente invención, dichas moléculas detectoras son una o más sondas detectoras oligonucleotídicas y más preferiblemente sondas detectoras oligonucleotídicas FRET, que tienen una secuencia al menos parcialmente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana que se va a detectar e incluyen una molécula indicadora fluorescente y una molécula extintora fluorescente capaz de extinguir la fluorescencia de dicha molécula indicadora, dicha sonda oligonucleotídica existe en al menos una conformación monocatenaria, parcialmente monocatenaria o bicatenaria cuando no está hibridada, donde dicha molécula extintora extingue la fluorescencia de dicha molécula indicadora, dicha sonda oligonucleotídica existe en al menos una conformación cuando hibrida con dicho ácido nucleico diana donde la fluorescencia de dicha molécula indicadora está sin extinguir.

En una forma de realización más específica de la presente invención, la secuencia de dichas sondas detectoras oligonucleotídicas es al menos complementaria a al menos una región, por ejemplo, ZCc (o cZIP) o Zc (o ZIP) de la primera sonda de ácido nucleico y/o al menos una región, por ejemplo, ZCc (o cZIP) o Zc (o ZIP) de la segunda sonda de ácido nucleico.

La presente invención proporciona que al menos dos sondas detectoras oligonucleotídicas se suministren con diferentes moléculas indicadoras fluorescentes proporcionando de esta manera un ensayo donde dependiendo del tipo de molécula indicadora fluorescente detectada o de la cantidad detectada de cada molécula indicadora fluorescente se obtiene información respecto al tipo de microorganismo que se detecta así como de la cantidad de cada tipo de microorganismo.

En una forma de realización adicional de la presente invención, la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos un ZipDectCode (ZDc o DET), que es (i) esencialmente complementario (por ejemplo, después de la amplificación) a una o más sondas detectoras oligonucleotídicas usadas para detectar la acumulación de los productos de reacción durante la reacción de amplificación del paso (b5), (ii) esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana, y (iii) que se localiza entre la secuencia diana y la sección de unión al cebador.

Dicho ZipDectCode (ZDc o DET) es una secuencia única para la identificación de los productos finalmente amplificados. El ZDc (o DET) hibridará con su sonda detectora oligonucleotídica complementaria presente durante la reacción de amplificación. Por consiguiente, cuando se usan sondas detectoras oligonucleotídicas para la detección de los ácidos nucleicos diana amplificados, dicha sonda detectora oligonucleotídica comprendería un ZipDectCode complementario (cZDc o cDET), una secuencia de oligonucleótidos complementaria a ZDc (DET).

En una forma de realización específica de la presente invención, se proporciona el método de tal manera que el proceso de cribado entero se realiza en un sistema cerrado. Para evitar contaminación y proporcionar resultados muy fiables el método de la presente invención se debe realizar de una manera automatizada y en un sistema cerrado reduciendo así los riesgos de contaminación y errores del usuario.

Los marcadores genéticos representan (marcan la localización de) loci específicos en el genoma de una especie o especie muy relacionadas. Un muestreo de diferentes genotipos en estos loci del marcador revela variación genética. La variación genética en los loci del marcador puede entonces describirse y aplicarse en el diagnóstico y similares. La variación genética entre especies puede atribuirse a sustituciones de un sólo nucleótido en el ADN o los ARNr 16S, 18S, 23S y/o 28S. La región de unión diana de las sondas puede adaptarse correspondientemente. Por ejemplo, puede proporcionarse un conjunto de cuatro sondas I, cada una de las cuales comprende un nucleótido final en 3’ diferente, por ejemplo la sonda I-A, sonda I-C, sonda I-G y sonda I-T, que contienen el nucleótido A, C, G y T respectivamente en su extremo 3’. Entonces, será ventajoso si la PBS de cada sonda I es específica y corresponde con dicho nucleótido final. En otras palabras, la PBS de cada sonda I hibrida con un cebador I diferente. Por tanto, la presente invención contempla la sonda I-A con PBS(I-A), que hibrida con el cebador I-A correspondiente, la sonda I-C con PBS(I-C), que hibrida con el cebador I-C correspondiente, la sonda I-G con PBS(I-G), que hibrida con el cebador I-G correspondiente, y la sonda I-T con PBS(I-T), que hibrida con el cebador I-T correspondiente. Cada uno de dichos cebadores I-A, I-C, I-G y I-T puede comprender un marcador diferente. El experto en la materia apreciará que pueden concebirse variaciones sobre este tema, por ejemplo, donde el marcador genético está localizado dentro de la región diana de las sondas, o en el extremo 5’ final de la sonda II. En el caso de que el marcador genético esté localizado en la sonda II, la PBS(II) puede adaptarse como se describe anteriormente para la sonda I. Además, la PBS, es decir, PBS(I) y PBS(II), puede ser idéntica o diferente. Según esto, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde, la sonda I, es decir, la primera sonda de ácido nucleico y/o la sonda II, es decir, la segunda sonda de ácido nucleico, hibrida específicamente con un marcador genético. Además, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que se proporcionan 4 variantes de la sonda I, es decir, dicha primera sonda de ácido nucleico, siendo dichas 4 variantes sustancialmente idénticas, excepto en que cada una de las 4 variantes contiene un nucleótido diferente en su extremo 3’ final. Además, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que cada una de dichas 4 variantes contiene una sección I de unión al cebador diferente.

En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que se proporcionan al menos dos grupos de pares de primera y segunda sondas de ácido nucleico, en el que cada grupo de primera y segunda sondas de ácido nucleico hibrida con un ácido nucleico diana específico, y comprende un sitio I y/o II de unión al cebador específico. En una forma de realización preferida, cada grupo de la primera y segunda sondas de ácido nucleico tienen sitios I y/o II de unión al cebador idénticos. En otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que se proporcionan al menos dos grupos de pares de primera y segunda sondas de ácido nucleico, en el que cada grupo de primera y segunda sondas de ácido nucleico hibrida con un ácido nucleico diana específico, y la primera sonda de ácido nucleico de cada grupo comprende una región identificadora específica, preferiblemente ZipComcode o Zipcode. Como tal, la región identificadora, tal como ZCc (o cZIP) o Zc (o ZIP) puede localizarse en la sonda de ácido nucleico entre la secuencia específica de diana y la secuencia de unión al cebador. En otro aspecto, la primera sonda de ácido nucleico se une o acopla con su extremo 5’ al extremo 3’ de dicha segunda sonda de ácido nucleico, posiblemente mediante una región de relleno. Se entenderá que después de ligar la secuencia I específica de diana a la secuencia II específica de diana se produce una sonda circular.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que cada uno de los cebadores que se unen a cada una de las diferentes secciones I de unión al cebador de dichas 4 variantes contiene un marcador fluorescente diferente.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que se proporciona un conjunto de dos sondas adyacentes para los microorganismos como se ha definido anteriormente. Además, estas sondas pueden acoplarse.

El método descrito en este documento se refiere a la detección simultánea de varios microorganismos contaminantes, proporcionando al menos un conjunto, y preferentemente más de un conjunto de dos sondas, diseñadas específicamente para identificar y/o caracterizar la presencia de un microorganismo contaminante (múltiplex). Los diferentes conjuntos de sondas preferiblemente no deben hibridar de manera cruzada, mientras que por otra parte la temperatura de fusión Tm de los diferentes conjuntos de sonda/cebadores es aproximadamente similar, por ejemplo, todos entre 60 y 70ºC. Programas informáticos comúnmente disponibles, tales como Probe Match, Universidad del Estado de Michigan, East Lansing, Michigan EE UU, software Oligo 5.0 (PE Biosystems, Foster City, California, EE UU), y el uso del algoritmo Clustal W, pueden facilitar el diseño de sondas específicas. Preferentemente, los cebadores/sondas tienen una temperatura de fusión Tm entre aproximadamente 37-85ºC o 5080ºC o 55-75ºC o 60-70ºC. Como tal, la presente invención también se refiere a la amplificación múltiplex.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, que comprende proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en el que el primer cebador (cebador A) comprende un marcador localizado en 5’ y una región A que hibrida específicamente con una primera región de ácido nucleico diana, dicha región A está localizada en el extremo 3’ final del cebador A, y en el que el segundo cebador (cebador B) comprende un ZipComcode localizado en 3’ y una región B que hibrida específicamente con una segunda región

de ácido nucleico diana, dicha región B está localizada en el extremo 5’ final del cebador B; la región diana de la primera región de ácido nucleico diana está localizada en 3’ adyacente a la segunda región de ácido nucleico diana; incubar dicho ácido nucleico diana con dicho cebador A y dicho cebador B en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicos complementarios; unir cualquier cebador esencialmente adyacente; e hibridar los cebadores unidos con una sonda de captura, que comprende una región esencialmente complementaria a ZipComcode, y que está presente en una micromatriz de flujo continuo. Como tal, dicho cebador A puede hibridar específicamente con un marcador genético. En otro aspecto se proporcionan 4 variantes del cebador A, siendo dichas 4 variantes sustancialmente idénticas, excepto que cada una de las 4 variantes contiene un nucleótido diferente en su extremo 3’ final, y cada una de las 4 variantes contiene un marcador fluorescente diferente.

Después de recoger el microorganismo contaminante, aislamiento de su ácido nucleico y amplificación, los ácidos nucleicos amplificados o mezcla de ácidos nucleicos amplificados pueden analizarse. Un método conveniente para analizar dicho ácido nucleico amplificado o dicha mezcla de ácidos nucleicos amplificados es mediante la determinación de la secuencia de los mismos. Las técnicas para determinar la secuencia de ácidos nucleicos son muy conocidas en la técnica. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que el análisis comprende determinar la secuencia de la mezcla de ácidos nucleicos amplificados. Dicha secuencia puede determinarse por medios enzimáticos, químicos o físicos. La secuencia determinada del organismo contaminante puede compararse con secuencias almacenadas en una base de datos. Por tanto, la etapa de análisis en el método para caracterizar microorganismos posiblemente presentes en una muestra según la presente invención puede comprender proporcionar un medio legible por ordenador que lleve datos de salida de ordenador que tiene una base de datos que caracteriza microorganismos basados en secuencias de nucleótidos, proporcionar un ordenador y algoritmo, procesar los datos de salida del ordenador para determinar el microorganismo.

Otro método conveniente para caracterizar los microorganismos contaminantes es realizar un análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), ribotipado, análisis VNTR de loci múltiples (MLVA), REP-PCR, RFLP, electroforesis en gel de campo pulsado u otros métodos de determinación de huella conocidas en la técnica.

Otra forma de realización de la presente invención se refiere al uso de matrices, por ejemplo, micromatrices, para el análisis de los ácidos nucleicos amplificados. Las matrices pueden contener miles de manchas de ADN. Una única matriz tiene el potencial para una amplia capacidad de identificación, es decir, se pueden analizar muchos microorganismos contaminantes diferentes en una micromatriz, de una vez. Además, el método de la invención no requiere laboriosas hibridaciones cruzadas y puede proporcionar una base de datos abierta de perfiles de hibridación, lo que evita las limitaciones de las hibridaciones ADN-ADN tradicionales.

En presencia de un molde de apareamiento perfecto, las sondas pueden ligarse mediante la acción de una ADN ligasa. Después de ligarse, dichas sondas pueden amplificarse. A continuación, las sondas ligadas, que pueden o no estar amplificadas, se ponen en contacto con una sonda de captura en condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación son bien conocidas en la técnica o las puede determinar sin dificultad el experto en la materia, véase por ejemplo “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” segunda edición (Sambrook et al., 1989) y “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas). Dicha sonda de captura comprende una secuencia complementaria respecto a la secuencia de ácido nucleico diana, o una parte de la misma, tal como ZCc (o cZIP). Las sondas de captura pueden localizarse en una micromatriz. Por tanto, la micromatriz comprende secuencias complementarias de las secuencias de ácido nucleico diana, es decir, la sonda de captura. La localización de la sonda de captura en la micromatriz se conoce.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicho análisis comprende hibridar los ácidos nucleicos amplificados o dicha mezcla de ácidos nucleicos amplificados a una sonda de captura, dicha sonda de captura hibrida específicamente con dichos ácidos nucleicos amplificados o dicha mezcla de ácidos nucleicos amplificados. El término “hibridar específicamente” se refiere a un apareamiento perfecto entre una región del analito, por ejemplo ZCc (o cZIP) del producto amplificado, y la sonda de captura en la micromatriz. Hibridar específicamente tiene en cuenta la longitud, el contenido de G/C y las condiciones de hibridación, tales como sal y temperatura, como sabe el experto en la materia. Según esto, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en donde dicha sonda de captura se localiza en una micromatriz. La sonda de captura es espacialmente direccionable en la micromatriz.

Las micromatrices de la presente invención pueden ser de cualquier tamaño deseado, desde dos manchas hasta 106 manchas o incluso más. Los límites superiores e inferiores en el tamaño del sustrato están determinados exclusivamente por las consideraciones prácticas de trabajo con sustratos extremadamente pequeños o grandes.

Para un tamaño de sustrato determinado, el límite superior está determinado solo por la capacidad para crear y detectar las manchas en la micromatriz. El número de machas preferido en una micromatriz depende generalmente del uso particular que se le va a dar a la micromatriz. Por ejemplo, la secuenciación mediante hibridación requerirá generalmente matrices grandes, mientras que la detección de mutaciones puede requerir solo una pequeña matriz. En general, las micromatrices contienen de 2 a aproximadamente 106 manchas, o de aproximadamente 4 a

aproximadamente 105 manchas, o de aproximadamente 8 a aproximadamente 104 manchas, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 2000 manchas, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 manchas.

Además, no todas las manchas en la micromatriz necesitan ser únicas. En efecto, en muchas aplicaciones se desean redundancias en las manchas con el fin de actuar como controles internos (véase, por ejemplo, la figura 4).

Se han descrito una variedad de técnicas para sintetizar y/o inmovilizar matrices de polinucleótidos, incluyendo síntesis in situ, en las que los polinucleótidos se sintetizan directamente sobre la superficie del sustrato (véase, por ejemplo, la patente en EE UU número 5.744.305 concedida a Fodor y col.) y la unión de polinucleótidos previamente sintetizados a la superficie de un sustrato en localizaciones discretas (véase, por ejemplo, el documento WO98/31836). Se describen métodos adicionales en el documento WO98/31836 en las páginas 41-45 y 47-48, entre otros sitios. La presente invención es adecuada para el uso con cualquiera de estas técnicas actualmente disponibles o desarrolladas más tarde.

La inmovilización de polinucleótidos previamente sintetizados en diferentes direcciones espaciales da una matriz de polinucleótidos cuyas secuencias pueden identificarse por sus direcciones espaciales.

En formas de realización que suponen la síntesis in situ de polinucleótidos, los polinucleótidos se sintetizan en su modo usual. El esquema de síntesis da una matriz de polinucleótidos cuyas secuencias pueden identificarse por sus direcciones espaciales.

La naturaleza y geometría del sustrato sólido dependerá de una variedad de factores, que incluyen, entre otros, el tipo de matriz (por ejemplo, unidimensional, bidimensional o tridimensional) y el modo de unión (por ejemplo, covalente o no covalente). Generalmente, el sustrato puede estar compuesto de cualquier material que permitirá la inmovilización de la sonda de captura, por ejemplo, polinucleótido, y que no se fundirá o degradará sustancialmente de otro modo en las condiciones usadas para unir la sonda de captura, por ejemplo, hibridación y/o desnaturalización de ácidos nucleicos. Además, si se contempla la inmovilización covalente, el sustrato debe activarse con grupos reactivos que pueden formar un enlace covalente con la sonda de captura que va a inmovilizarse.

Otros materiales adecuados ejemplares para su uso como sustratos en la presente invención incluyen óxidos metálicos. Los óxidos metálicos proporcionan un sustrato que tiene tanto una alta densidad de canales como una alta porosidad, lo que permite matrices de alta densidad que comprenden diferentes primeras sustancias de unión por unidad de superficie para la aplicación de la muestra. Además, los óxidos metálicos son sumamente transparentes para la luz visible. Los óxidos metálicos son sustratos relativamente económicos que no requieren el uso de ninguna tecnología de microfabricación típica y que ofrece un control mejorado respecto a la distribución líquida sobre la superficie del sustrato, tal como membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente. Las membranas de óxidos metálicos que tienen canales de paso orientados pueden fabricarse mediante grabado electroquímico de una hoja de metal. Los óxidos metálicos considerados son, entre otros, óxidos de tántalo, titanio y aluminio, además de aleaciones de dos o más óxidos metálicos y óxidos metálicos dopados y aleaciones que contienen óxidos metálicos. Las membranas de óxidos metálicos son transparentes, especialmente si están mojadas, lo que permite ensayos usando diversas técnicas ópticas. Tales membranas tienen canales de paso orientados con diámetro muy controlado y propiedades superficiales químicas útiles. La solicitud de patente EP-A0975427 es ejemplar en este respecto y se incorpora específicamente en la presente invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicha micromatriz es una micromatriz de flujo continuo. Además, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicho sustrato es un sustrato poroso, dicho sustrato puede ser una membrana de óxido metálico electroquímicamente fabricada. Preferentemente, dicho sustrato comprende óxido de aluminio. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicha micromatriz es PamChip®.

La composición de las sondas de captura inmovilizadas no es crítica. El único requisito es que puedan hibridar con un ácido nucleico diana de secuencia complementaria, por ejemplo, el ácido nucleico amplificado, si está presente. Por ejemplo, las sondas de captura pueden estar compuestas de bases de nucleótidos todas naturales o todas sintéticas, o una combinación de ambas. Ejemplos no limitantes de bases modificadas adecuadas para su uso con la presente invención se describen, por ejemplo, en Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, G. Fasman, Ed., CRC Press, 1989, páginas 385-392. Aunque en la mayoría de los casos los polinucleótidos estarán compuestos completamente de bases naturales (A, C, G, T o U), en ciertas circunstancias puede preferirse el uso de bases sintéticas.

Además, mientras que los esqueletos de las sondas de captura normalmente estarán compuestos por completo de enlaces fosfodiéster “nativos”, pueden contener uno o más enlaces modificados, tales como uno o más enlaces fosforotioatos, fosforamiditos u otros modificados. Como un ejemplo específico, uno o más polinucleótidos inmovilizados pueden ser un ácido péptido nucleico (APN) que contiene enlaces amida. Ejemplos adicionales de bases y esqueletos modificados que pueden usarse junto con la invención, además de métodos para su síntesis,

pueden encontrarse, por ejemplo, en Uhlman & Peyman, 1990, Chemical Review 90(4):544-584; Goodchild, 1990, Bioconjugate Chem. 1(3):165-186; Egholm et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897; Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc. 116:3143-3144, además de la bibliografía citada en todos los anteriores.

Como tal, las sondas de captura pueden incluir polímeros de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, estando unidos los ribonucleótidos y/o los desoxirribonucleótidos mediante enlaces de 5’ a 3’. Las sondas de captura de la invención pueden ser ácidos ribonucleicos, por ejemplo ácidos ribonucleicos sentido o antisentido, fragmentos de longitud completa o parcial de ARNc, fragmentos de longitud completa o parcial de ARNm y/o ribo-oligonucleótidos. Alternativamente, las sondas de captura de la invención pueden ser ácidos desoxirribonucleicos, preferentemente secuencias de longitud completa monocatenarias o fragmentos de secuencias que codifican los ARNm correspondientes. La forma de las sondas de captura debe elegirse de tal manera que sean complementarias a y formen enlaces de hidrógeno de Watson-Crick apropiados con el ácido nucleico diana amplificado y/o las sondas ligadas en una muestra.

Como se menciona anteriormente, las sondas de captura pueden ser polímeros de análogos de nucleótidos sintéticos. Tales sondas de captura pueden utilizarse en ciertas formas de realización debido a su estabilidad superior en las condiciones de ensayo. Se ha mostrado que las modificaciones en la estructura nativa, que incluye alteraciones en el esqueleto, azúcares o bases heterocíclicas, aumentan la estabilidad intracelular y la afinidad de unión. Entre los cambios útiles en la química del esqueleto están los fosforotioatos; los fosforoditioatos, en los que ambos oxígenos que no forman puentes están sustituidos con azufre; fosforamiditas; fosfotriésteres de alquilo y boranofosfatos. Derivados de fosfato quirales en a incluyen 3’-O-5’-S-fosforotioato, 3’-S-5’-O-fosforotioato, 3’-CH2-5’O-fosfonato y 3’-NH-5’-O-fosforamidato. Los ácidos péptido nucleicos sustituyen todo el esqueleto de ribosa fosfodiéster por un enlace peptídico. Los ácidos nucleicos bloqueados dan una estabilidad conformacional adicional del resto de azúcar debido a enlaces adicionales entre grupos 2’-carboxilo y 5’-carboxilo o 4’-carboxilo de desoxirribosa. Las modificaciones de azúcares también se usan para mejorar la estabilidad y afinidad. El anómero a de la desoxirribosa puede usarse cuando la base esté invertida con respecto al anómero p natural. El 2’-OH del azúcar ribosa puede alterarse para formar azúcares 2’-O-metilo o 2’-O-alilo, que proporcionan resistencia a la degradación sin comprender afinidad. La modificación de las bases heterocíclicas que encuentran uso en el método de la invención son aquellas que pueden aparear bases apropiadas. Algunas sustituciones útiles incluyen desoxiuridina por desoxitimidina; 5-metil-2’-desoxicitidina y 5-bromo-2’-desoxicitidina por desoxicitidina. Se ha mostrado que aumenta la afinidad y actividad biológica cuando se sustituye 5-propinil-2’-desoxiuridina y 5-propinil-2’desoxicitidina por desoxitimidina y desoxicitidina, respectivamente.

Ejemplos de bases no naturales que pueden formar relaciones de apareamiento de bases incluyen, pero no se limitan a, análogos aza-y deaza-pirimidina, análogos aza-y deaza-purina y otros análogos de bases heterocíclicas, en los que uno o más de los átomos de carbono y nitrógeno de los anillos de purina y pirimidina han sido sustituidos por heteroátomos, por ejemplo, oxígeno, azufre, selenio, fósforo y similares. Ejemplos de bases no naturales adecuadas incluyen, pero no están limitados a, 8-oxo-guanina, y 8-oxoadenina, 8-bromo-guanina, guanosina, xantosina, wiosina, pseudouridina, 6-mercaptoguanina, 8-mercaptoguanina, 2-tioxantina, 6-tioxantina, 6mercaptopurina, 2-amino-6-carboximetil-mercaptopurina, 2-mercaptopurina, 6-metoxipurina, 2-acetilamino-6hidroxipurina, 6-metiltio-2-hidroxipurina, 2-dimetilamino-6-hidroxipurina, 2-hidroxipurina, 2-aminopurina, 6-amino-2dimetilalil-purina, 2-tioadenina, 8-hidroxi-adenina, 8-metoxiadenina.

Las sondas de captura inmovilizadas pueden tener tan sólo cuatro, o tantos como cientos, o incluso más, nucleótidos de longitud. Como sondas de captura según la invención se consideran ácidos nucleicos que en la técnica normalmente se denominan oligonucleótidos y también aquellos denominados ácidos nucleicos. Por tanto, las matrices de la presente invención son útiles no sólo en aplicaciones en las que los ácidos nucleicos diana amplificados o las sondas ligadas hibridan con matrices inmovilizadas de sondas de captura relativamente cortas (tales como, por ejemplo, que tienen una longitud de aproximadamente 6, 8, 10, 20, 40, 60, 80 o 100 nucleótidos), sino también en aplicaciones en las que las sondas de captura relativamente cortas hibridan con matrices de ácidos nucleicos diana inmovilizados. Las sondas de captura de la matriz pueden ser de cualquier secuencia deseada.

En otra forma de realización, la micromatriz de la invención comprende una sonda de captura que comprende la secuencia Zipcode (Zc o ZIP) que es esencialmente complementaria a una ZipComcode (ZCc o cZIP) correspondiente. La sonda de captura que comprende la secuencia Zipcode (o ZIP) puede salpicarse o sintetizarse en una localización específica en la micromatriz. La secuencia Zipcode (o ZIP) es una secuencia identificadora única que es complementaria a la secuencia ZipComcode. La presente invención se refiere particularmente a micromatrices y al uso de las mismas, que comprenden de 20 a 30 bases oligonucleotídicas únicas, por ejemplo 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 bases oligonucleotídicas, llamadas Zipcodes, que están acopladas a un sustrato tridimensional poroso en localizaciones conocidas, como describen van Beuningen et al., (2001, Clinical Chemistry 47: 1931-1933).

Estos Zipcodes hibridan específicamente con moléculas que contienen secuencias que son complementarias a los Zipcode, es decir, los ZipComcodes. Mediante la unión de estos ZipComcode a cebadores fluorescentes mediante una reacción de ligación-amplificación, pueden usarse micromatrices de Zipcode para detectar e identificar microorganismos, tales como por ejemplo especímenes microbianos. Debido a que los Zipcodes representan

secuencias artificiales únicas, las micromatrices que comprenden Zipcodes pueden usarse como una plataforma universal para el reconocimiento molecular simplemente cambiando las secuencias específicas del gen unidas a los ZipComcodes.

La detección de un marcador en una localización especificada en la micromatriz, tal como PamChip, indica la presencia de un producto de hibridación entre el producto ligado y la secuencia Zipcode en la micromatriz.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que dicha sonda de captura hibrida específicamente con un ZipComcode correspondiente. El ácido nucleico diana amplificado o ácidos nucleicos hibridados con una sonda de captura correspondiente o sondas en una micromatriz pueden producir un patrón de hibridación. El patrón de hibridación, que incluye la intensidad de hibridación, puede ser característico para un microorganismo determinado.

Será aparente que la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que se detecta una señal después de hibridar los ácidos nucleicos específicamente amplificados o las sondas ligadas con la sonda de captura. Dicha señal es preferentemente una señal fluorescente o fosforescente, y dicha señal fluorescente o fosforescente puede detectarse mediante una cámara CCD o mediante barrido láser, tal como por ejemplo, FD10 system@ (Olympus) o Pamalyzer® (PamGene NV). Alternativamente, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento en donde dicha micromatriz es una Arraytube® y dicha señal fluorescente o fosforescente se puede detectar mediante una cámara CCD y/o barrido láser.

Alternativamente, la presente invención se refiere a un método como se describe en el presente documento, en donde la señal de hibridación es una señal colorimétrica usando cebadores marcados con biotina y cualquier método conocido en la técnica tal como por ejemplo, conjugación con peroxidasa de rábano-estreptavidina seguido por una reacción de coloración de peroxidasa. La última reacción se puede visualizar usando un lector ArrayTube (Clondiag GMBH, Jena, Alemania).

Como ya se ha mencionado anteriormente, el precio de una micromatriz presenta el mayor coste por prueba. Con el fin de disminuir el precio por prueba, la micromatriz puede someterse simultáneamente a más de una muestra. Como tal, se contempla que cada muestra individual se someta al método de la presente invención hasta la etapa de hibridación, es decir, de cada muestra individual, se capturan los microorganismos, después de lo cual los ácidos nucleicos se extraen (etapa a), que posteriormente se someten a una reacción de detección de ligasa (etapa b). A continuación, los ácidos nucleicos diana amplificados si están presentes se detectan (etapa c) y las muestras positivas se hibridan colectivamente con las sondas de captura en una única micromatriz (etapa d) y los ácidos nucleicos diana hibridados se detectan (etapa e). El par de sondas usadas por muestra puede ser idéntico, por ejemplo, detección del mismo ácido nucleico diana, o puede ser diferente por muestra, por ejemplo, detección de diferentes ácidos nucleicos diana. Sin embargo, con el fin de diferenciar entre ácidos nucleicos diana amplificados de diferentes muestras o entre diferentes ácidos nucleicos diana amplificados procedentes de una única muestra, cada sonda, y por tanto, el ácido nucleico diana amplificado, debe poder asignarse y detectarse por separado. Por tanto, cada sonda comprende una etiqueta diferente e individualmente identificable (por ejemplo, región identificadora ZIP), tal como un ZipComcode particular, complementaria a una sonda de captura distinta en la micromatriz. Aunque los pares de sondas de ácido nucleico pueden detectar los mismos ácidos nucleicos diana en diferentes muestras, cada ácido nucleico diana amplificado procedente de cada muestra puede seguirse debido a su etiqueta diferenciada correspondiente a una dirección específica en la micromatriz. En una forma de realización alternativa, las sondas no comprenden etiquetas, sino que solo los cebadores usados para la amplificación comprenden una etiqueta diferenciada e individualmente identificable, tal como ZCc (o cZIP). Obviamente, se aplican las mismas consideraciones mencionadas anteriormente ya que las etiquetas deben ser diferentes por muestra y/o por sonda, haciendo cada muestra y/o sonda individual identificable. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método como se describe en este documento, en el que los ácidos nucleicos diana amplificados procedentes de al menos dos muestras hibridan con sondas de captura presentes en una única micromatriz.

El experto en la materia entenderá que la región ZIP y su secuencia complementaria cZIP solo pretenden referirse a la complementariedad, es decir, la capacidad de hibridar entre sí específicamente, independientemente de la posición de la secuencia ZIP y/o cZIP. Por tanto, la sonda de captura en la micromatriz puede comprender cZIP, siempre que las moléculas que se vayan a detectar comprendan la región ZIP.

Los datos obtenidos por los métodos de la presente invención pueden analizarse adicionalmente, posiblemente de un modo automatizado. Por ejemplo, el patrón de hibridación obtenido puede compararse con patrones de hibridación almacenados en una base de datos. A este respecto, la presente invención también se refiere a un programa informático almacenado en un medio legible por ordenador que puede realizar la comparación del patrón de hibridación obtenido con los patrones de hibridación almacenados en la base de datos. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un ordenador que comprende un medio legible por ordenador que puede realizar los métodos descritos anteriormente. Además, la presente invención se refiere a un medio legible por ordenador que comprende un programa informático que puede realizar el método descrito anteriormente. Además, la presente

invención se refiere a un programa informático que puede mostrar una página web en un ordenador remoto, lo que permite el uso del método descrito anteriormente.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a kits para determinar la presencia de microorganismos en una muestra que comprende los elementos esenciales de los métodos de la presente invención, por ejemplo, dichos kits pueden comprender posiblemente un filtro, posiblemente medios para extraer ácidos nucleicos de dichos microorganismos, medios para amplificar específicamente dichos ácidos nucleicos, medios para detectar los ácidos nucleicos amplificados, posiblemente medios para analizar los ácidos nucleicos amplificados, por ejemplo micromatrices, tales como micromatrices de flujo continuo, posiblemente tampones y/o un manual de instrucciones.

La caracterización de poblaciones microbianas mixtas no se logra fácilmente mediante los métodos actuales y tiene un amplio potencial de aplicación. En la mayoría de los entornos en los que se encuentran bacterias está presente una mezcla compleja de especies que puede cambiar como respuesta a las condiciones locales o evolucionar con el tiempo. Generalmente, los métodos microbiológicos clásicos no son muy adecuados para el estudio de estos sistemas ya que se basan en el cultivo y posterior aislamiento de colonias individuales. Esto puede recuperar solo una parte de las especies presentes y también produce un gran número de aislados que deben caracterizarse. Los métodos moleculares que suponen la amplificación de genes conservados a partir de poblaciones complejas y su posterior caracterización, mediante clonación y secuenciación, o hibridación, proporcionan alternativas al cultivo, pero siguen siendo complejos. Adicionalmente, la etapa de amplificación también puede introducir sesgos.

En poblaciones de células que crecen activamente, cada célula contiene muchas copias de los ARN ribosómicos cuya secuencia específica se usa ampliamente para identificar especies bacterianas (Woese 1987, Microbiol. Rev. 51:221-271). Debido a esta “amplificación” natural de estas secuencias dentro de células activas es posible detectar estas secuencias sin amplificación (Small J. et al. 2001 App. Environ. Micro. 67:4708-4716). Aquí se presenta un método para la extracción e identificación directa de ARN ribosómico en una superficie de matriz tridimensional. Esto permite potencialmente la rápida identificación en paralelo de una amplia gama de especies en una muestra sin la necesidad de amplificación o marcaje enzimático. El método presentado en este documento demuestra que el seguimiento casi en tiempo real de comunidades bacterianas complejas será posible, lo que tendrá aplicaciones en muchas áreas.

Por tanto, se apreciará que la presente invención se refiere a los métodos descritos anteriormente, en los que dicha etapa de análisis comprende hibridar una sonda de acumulación con los ácidos nucleicos, mezcla de ácidos nucleicos y/o ADNc, siendo dicha sonda de acumulación complementaria para una región de ARNr 16S, 18S, 23S o 28S, lo que proporciona así un complejo de ácido nucleico/sonda de acumulación. Dicha etapa de análisis puede comprender además hibridar dicho complejo de ácido nucleico/sonda de acumulación con una sonda de captura, siendo dicha sonda de captura complementaria a una región del ácido nucleico diferente del complejo de ácido nucleico/sonda de acumulación. Dicha sonda de captura puede ser específica para un microorganismo. La sonda de acumulación puede estar marcada. La región de ARNr 16S, 18S, 23S o 28S puede estar conservada (entre especies).

Será evidente para el experto en la materia que la presente invención se refiere al uso de un filtro una micromatriz como se menciona en este documento en el método de la presente invención. Por tanto, la presente invención se refiere al uso de al menos un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico como se definen anteriormente, incluyendo sondas acopladas, al uso de un filtro como se describe anteriormente y/o al uso de al menos un conjunto de dos cebadores como se define anteriormente en los métodos según la invención.

Los siguientes ejemplos y figuras se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. Sin embargo, el contenido de dichos ejemplos y figuras se puede generalizar en el concepto de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Diseño de sondas se ligación-amplificación en tiempo real

Se usaron dos sondas de ligación-amplificación, denominadas “I” y “II”, que tienen el siguiente diseño (de 5’-3’), con segmentos a, b, c, d, e, f, que van desde el extremo 5’ al extremo 3’ (figura 1):

-: Segmento I-a de 20 nucleótidos igual al cebador 1 de amplificación (figura 1, Eco);

-: Segmento I-b de 24 nucleótido que comprende la secuencia cZIP (figura 2, cZIP);

-: Segmento I-c de 20-30 nucleótidos complementario a la secuencia diana (figura 1, cSeq 2);

-: Segmento II-d de 20-30 nucleótidos complementario a la secuencia diana y localizado inmediatamente

después del segmento I-c (figura 1, cSeq 1);

-: Segmento II-e de 20 nucleótidos que comprende la secuencia DET (figura 1, DET):

-: Segmento II-f de 20 nucleótidos complementario al cebador 2 de amplificación (figura 1, cMse); las

secuencias cZIP son como se describen en el documento WO-2004-106547.

Todas las sondas se pidieron a Biolegio B.V. (Nijmegen, los Países Bajos).

Eco y Mse se refiere a las regiones 1 y 2 de unión a cebadores, cEco y cMse se refiere a sus secuencias complementarias respectivas. ZIP y cZIP se refiere a los segmentos de ADN usados para la detección en micromatrices, donde cZIP tiene la secuencia complementaria de ZIP. DET y cDET se refiere a segmentos de ADN usados para la detección en tiempo real durante la amplificación, donde cDET tiene la secuencia complementaria de DET. cSeq-1 y cSeq-2 se refiere a segmentos de ADN complementarios al ADN diana.

Ejemplo 2. Descripción de las cepas bacterianas y aislamiento de ADN

Se eligieron las siguientes 6 cepas bacterianas para LDR en tiempo real

1.: Salmonella enterica ssp. enterica serovariedad Virchow

2.: Salmonella enterica ssp. enterica serovariedad Paratyphi variedad Java

3.: Escherichia coli

4.: Enterobacter cloaca

5.: Shigella flexneri

6.: Campylobacter jejuni

Se inocularon cultivos puros en caldo nutriente y se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. Se usaron 100 μl de este cultivo nocturno para el aislamiento de ADN usando el kit de aislamiento de ADN genómico de Qiagen siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante (Qiagen, Venlo, Los Países Bajos).

Ejemplo 3. Reacciones de detección de la ligasa en tiempo real (figura 2)

Los cebadores de amplificación tienen las siguientes secuencias:

Cebador 1 (Eco): 5’-biotina-GTAGACTGCGTACCAATTC-3’

Cebador 2 (Mse): 5’-GACGATGAGTCCTGAGTAA-3’

Los cebadores se pidieron a Biolegio B.V. (Nijmegen, los Países Bajos). La biotina está unida covalentemente a extremo 5’ del cebador 1, y se usó para detectar los productos de amplificación en la micromatriz.

Las reacciones de ligación se llevaron a cabo en un volumen de 10 μl que contenía:

-: 1,0 fmol de cada oligonucleótido sonda de ligación-amplificación en tiempo real;

-: 0,5 ng de ADN diana de los organismos que se van a analizar

-: 1 unidad de Taq ADN polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MA, EE UU)

-: 1,0 μl de tampón de Taq ADN polimerasa 10 x (New England Biolabs, Beverly, MA, EE UU)

-: agua estéril hasta un volumen de 10 μl.

Se usaron 23 sondas de ligación-amplificación en tiempo real basadas en el sondas de Salmonella PremiTest (DSM PremiTest, Geleen, Los Países Bajos; Wattiau et al., Int. J. Food Microbiol., 123 (2008), 293-298), y a las que se añade el segmento IIe DET con la secuencia 5’-TCCGATGAGTCGCAATCCTA-3. Este segmento DET no se añade a las sondas 16, 17, 19, 20, 22 y 23, ya que estas constituyen las sondas de control de la reacción. En estos ejemplos para cada sonda los segmentos I y II se unen creando sondas únicas con el orden IId-IIe-IIf-Ia-Ib-Ic en lugar de dos segmentos de sonda separados.

La reacción de ligación se incubó durante 30 segundos a 98ºC y posteriormente durante 16 horas a 55ºC en MyCycler de Biorad (Biorad, Hercules, CA. EE UU).

Posteriormente, se llevó a cabo la reacción de amplificación en tiempo real. Para este fin se añadieron 40 μl de una solución que contenía 10 pmoles del cebador 1, 10 pmoles del cebador 2, 2 pmoles de la molécula detectora D1 con la secuencia 5’FAM-TAGGATTGCGACTCATGCCA-TAMRA-3’, 0,5 unidades de Amplitaq ADN polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE UU), dNTP 0,25 mM (de una mezcla de dNTP 20 mM, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE UU), en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5. La PCR se llevó a cabo usando las condiciones de amplificación como describen Vos et al., Nucleic Acids Research 23(21), (1995), 4407-4414, usando un icycler IQ de Biorad (Biorad Inc., Hercules, CA, EE UU).

Ejemplo 4. Detección y tipado de Salmonella en 6 muestras bacterianas usando LDR en tiempo real

1.: El ADN se aisló de las 6 cepas bacterianas descritas en el ejemplo 2;

2.: Se llevaron a cabo reacciones de ligación-amplificación en tiempo real como se describe en el ejemplo 3. Las reacciones produjeron 6 perfiles de PCR en tiempo real (véase la figura 3);

3.: Los productos de reacción de las muestras 1, 2 y 3 (dos LDR en tiempo real positivas y una negativa) se hibridaron con Clondiag Array Tube usando el “paso de detección” del protocolo de Salmonella PremiTest (DSM PremiTest, Geleen, Los Países Bajos).

4. Los resultados se muestran en la figura 4, y confirman que las 2 muestras positivas en tiempo real contienen Salmonella de los serotipos Virchow y Paratyphi B variedad Java, respectivamente. La muestra negativa produce la imagen de la matriz de una muestra negativa de Salmonella que muestra solo las manchas control de la reacción.

Lista de secuencias

<110> check-points Holding B.V.

<120> Métodos para la detección e identificación rápidas de microorganismos

<130> CHE-005-PCT

<150> EP08167803.9

<151>

<160> 4

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador 1 (ECO)

<220>

<221> característica mezcla

<222> (1)..(1)

<223> n = biotina

<400> 1 ngtagactgc gtaccaattc 20

<210> 2

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador 2 (Mse)

<400> 2 gacgatgagt cctgagtaa 19

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda segmento DET

<400> 3 tccgatgagt cgcaatccta 20

<210> 4

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda <220>

<221> característica mezcla

<222>: (1)..(1) 5 <223> n = FAM

<220>

<221> característica mezcla

<222>: (22)..(22) 10 <223> n = TAMRA

<400> 4

ntaggattgc gactcatgcc an 22 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la presencia de microorganismos en un muestra e identificar y caracterizar dichos

microorganismos si están presentes, que comprende los pasos de: 5

(a)

extraer ácidos nucleicos de los microorganismos, dichos ácidos nucleicos comprenden ácidos nucleicos diana;

(b)

realizar una reacción de detección de la ligasa (LDR) en dichos ácidos nucleicos diana, que comprende:

(b1) proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico, dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia I específica de diana localizada en 3’ complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una secuencia II específica de diana localizada en 5’

15 complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizada esencialmente adyacente a y en 3’ de dicha secuencia I específica de diana, en donde dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una sección I de unión a cebador (PBS(I)) localizada en 5’ y posiblemente un relleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión a cebador (PBS(II)) localizada en 3’ y posiblemente un relleno; y opcionalmente en donde la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una región identificadora que (i) corresponde a una región correspondiente de una sonda de captura preferiblemente en una micromatriz y (ii) es esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana, y (iii) está localizada entre la secuencia específica de diana y la sección de unión al cebador, (b2) incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segunda

25 sonda de ácido nucleico en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicos complementarios; (b3) unir cualquier sonda esencialmente adyacente, (b4) proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en donde el primer cebador (cebador I) es esencialmente idéntico a la sección I de unión a cebador, y el segundo cebador (cebador II) es esencialmente complementario a la sección II de unión a cebador, en donde dicho primer o segundo cebador está opcionalmente marcado, y (b5) amplificar cualquier ácido nucleico sonda unido del paso (b3), en donde la amplificación se inicia mediante la unión del cebador de ácido nucleico específico para una sección de unión a cebador, proporcionando así ácidos nucleicos diana amplificados, en donde una o más moléculas detectoras,

35 que detectan los ácidos nucleicos diana amplificados están presentes en el paso (b5),

(c)

seguir la señal de dicha molécula detectora y/o la modulación de la señal de dicha molécula detectora, dicha modulación en la señal de dicha molécula detectora indica la presencia de dicha secuencia diana mediante lo cual se determina la presencia de un microorganismo,

(d)

donde el paso (c) determina que un microorganismo está presente, hibridar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (c) a una sonda de captura, preferiblemente presente en una micromatriz, y

(e)

detectar los ácidos nucleicos diana amplificados del paso (d), mediante lo cual se identifica el microorganismo.

45 2. El método según la reivindicación 1, en donde los ácidos nucleicos diana amplificados que hibridan del paso

(d) son secuencias diana que proporcionan una señal positiva en el paso (c).
3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dichas moléculas detectoras son una o más sondas detectoras oligonucleotídicas que tienen una secuencia al menos parcialmente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana que se va a detectar e incluyen una molécula indicadora fluorescente y una molécula extintora fluorescente capaz de extinguir la fluorescencia de dicha molécula indicadora, dicha sonda oligonucleotídica existe en al menos una conformación monocatenaria, parcialmente monocatenaria o bicatenaria cuando está sin hibridar donde dicha molécula extintora extingue la fluorescencia de dicha molécula indicadora, dicha sonda oligonucleotídica existe en al menos una conformación cuando está

55 hibridada a dicho ácido nucleico diana donde la fluorescencia de dicha molécula indicadora está sin extinguir.
4.

El método según la reivindicación 3, en donde la secuencia de dichas sondas detectoras oligonucleotídicas es al menos complementaria a al menos una región de la primera sonda de ácido nucleico o al menos una región de la segunda sonda de ácido nucleico.
5.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además al menos una región detectora DET que es

(i) esencialmente complementaria a una o más sondas detectoras oligonucleotídicas, en donde la una o 65 más sondas detectoras oligonucleotídicas comprende una secuencia cDET complementaria con la región detectora DET, usada para detectar la acumulación de los productos de reacción durante la reacción de amplificación del paso (b5);

(ii) esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana; y

(iii) que está localizada entre la secuencia diana y la sección de unión al cebador. 5
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se proporcionan al menos dos grupos de pares de primera y segunda sondas de ácido nucleico, en donde cada grupo de primera y segunda sondas de ácido nucleico hibrida con un ácido nucleico diana específico, y comprende un sitio I y/o II de unión a cebador.

10 7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se proporcionan al menos dos grupos de pares de primera y segunda sondas de ácido nucleico, en donde cada grupo de primera y segunda sondas de ácido nucleico hibrida con un ácido nucleico diana específico, y la primera o segunda sonda de ácido nucleico de cada grupo comprende una región identificadora específica.

15 8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha región identificadora en la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico se localizan entre la secuencia específica de diana y la secuencia de unión al cebador.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha primera sonda de ácido nucleico

20 está acoplada con su extremo 5’ al extremo 3’ de dicha segunda sonda de ácido nucleico, posiblemente a través de una región de relleno.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho paso de unión (b3) comprende el

uso de una ligasa. 25
11.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ácido nucleico diana amplificado se marca, preferiblemente durante la amplificación.
12.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha sonda de captura comprende una

30 región ZIP que es esencialmente complementaria a una región identificadora correspondiente cZIP en la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico, o en donde dicha sonda de captura comprende una región cZIP que es esencialmente complementaria a una región identificadora correspondiente ZIP en la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico.

35 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde:

(a) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una secuencia I de unión a cebador (PBS(I)), cZIP y una secuencia I específica de diana (tss(I)), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una secuencia II específica de diana (tss(II)), DET y una secuencia II de unión

40 a cebador (PBS(II)), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(b)

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), DET y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), cZIP y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(c)

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cDET y tss(I), dicha

45 segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), cZIP y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(d) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cZIP, DET y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

50 (e) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cZIP, cDET y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(f) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), DET, cZIP y tss(I), dicha

segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el 55 cebador I está marcado;

(g)

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cDET, cZIP y tss(I), y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(h)

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I) y tss(I), dicha segunda

60 sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), DET, cZIP y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(i)

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I) y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), cZIP, DET y PBS(II), y preferiblemente el cebador I está marcado;

(j)

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZIP y tss(I), y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II), DET y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado;

(k)

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cZIP, DET y tss(I), dicha

5 segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado;

(l) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), ZIP, cDET y tss(I), y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado;

10 (m) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), DET, ZIP y tss(I), dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el cebador II está marcado; y/o

(n) dicha primera sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una PBS(I), cDET, ZIP y tss(I), y dicha

segunda sonda de ácido nucleico comprende de 5’ a 3’: una tss(II) y PBS(II), y preferiblemente el 15 cebador II está marcado.
14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicha sonda de captura es espacialmente direccionable en una micromatriz.

20 15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde los ácidos nucleicos diana amplificados derivados de al menos dos muestras hibridan a sondas de captura presentes en una única micromatriz.
16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde los ácidos nucleicos diana amplificados

hibridados a las correspondientes sondas de captura en una micromatriz producen un patrón de hibridación. 25
17. Uso de al menos un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico como se definen en la reivindicación 1 y/o el uso de al menos un conjunto de dos cebadores como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 12 en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

Figura 4