ES2400490T3 - Método para el diagnóstico y pronóstico de tolerancia en transplante de hígado empleando tejido hepático - Google Patents

Abstract

Método para el diagnóstico o pronóstico in vitro del estado de tolerancia de un paciente sometido a untrasplante hepático que comprende: a. Medición, en una muestra biológica obtenida del aloinjerto hepático del paciente bajo investigación, delos niveles de expresión de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2; b. Evaluación de la tolerancia o no tolerancia del paciente bajo investigación al trasplante de hígadomediante la comparación del nivel de expresión de al menos uno de los genes o combinaciones de losmismos, del paso a), con el nivel de expresión de los mismos genes o combinaciones de los mismos,obtenido a partir de una muestra de referencia.

Description

Método para el diagnóstico y pronóstico de tolerancia en trasplante de hígado empleando tejido hepático

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención hace referencia al campo de la medicina humana. Más específicamente, la presente invención se centraliza en un método para el diagnóstico in vitro o el pronóstico del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante de hígado, el cual comprende la medición de los niveles de expresión, in vitro, en muestras de tejido hepático, de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La supervivencia a largo plazo de los injertos trasplantados depende de forma crítica de la administración de larga duración de fármacos inmunosupresores para prevenir el rechazo del injerto. Estos fármacos son muy efectivos para la prevención del rechazo del injerto, pero están también asociados a graves efectos secundarios, como la nefrotoxicidad, y a un riesgo aumentado de infecciones oportunistas y tumores, y complicaciones metabólicas como la diabetes, la hiperlipidemia y la hipertensión arterial. Debido a los efectos secundarios de los fármacos inmunosupresores, la inducción de la tolerancia, definida como un estado en el que el injerto mantiene una función normal en ausencia de inmunosupresión crónica, es uno de los principales objetivos de la investigación en la inmunología del trasplante. La inducción de la tolerancia es posible en un gran número de modelos de trasplante en roedores. Sin embargo, la aplicación de estos tratamientos experimentales en la práctica clínica ha fallado en gran medida. Una de las razones por las que la aplicación clínica en humanos de tratamientos experimentales de inducción de la tolerancia no ha sido exitosa está relacionada con la falta de una herramienta precisa para el diagnóstico no invasivo de la inducción de la tolerancia en los receptores humanos del trasplante. Publicaciones recientes señalan la necesidad urgente de esta herramienta (N. Najafian et al 2006 y Newell et al. 2006). Por otra parte, se ha detectado ocasionalmente el mantenimiento de la función normal del alotrasplante a pesar de la completa retirada de los fármacos inmunosupresores en trasplantes clínicos de órganos, particularmente después de un trasplante hepático. Los pacientes que espontáneamente aceptan los injertos se consideran convencionalmente como tolerantes “operacionales”, y proporcionan una prueba de que la tolerancia inmunológica puede conseguirse realmente en humanos. El trasplante de hígado es el único entorno clínico en el que la tolerancia ocurre espontáneamente en una proporción sustancial de pacientes. De hecho, la retirada completa de la inmunosupresión puede lograrse en alrededor del 21% de los pacientes (Lerut, J. et al 2006). Desafortunadamente, no hay actualmente ningún medio para identificar estos pacientes antes de que se lleve a cabo la retirada de la inmunosupresión. Por esta razón, la completa retirada de los fármacos inmunosupresores raras veces se lleva a cabo en el trasplante de hígado, y así muchos pacientes continúan siendo innecesariamente inmunosuprimidos, con los problemas de salud y económicos que esto acarrea.

Algunos intentos anteriores para identificar la tolerancia en el trasplante, principalmente en receptores de riñón e hígado, han empleado bien ensayos funcionales antígeno-específicos o bien análisis no específicos de antígeno. En los ensayos funcionales, se prueban los linfocitos T del receptor con los antígenos del donante tanto in vitro como in vivo (J. Cai et al 2004), (J. Cai et al 2004) y (E. Jankowska-Gan E et al 2002), (P. Sagoo et al. 2010). Estos ensayos son muy valiosos desde un punto de vista mecanístico, ya que son los únicos análisis capaces de revelar qué rutas son las responsables de la especificidad del estado de tolerancia. Desafortunadamente, estos ensayos son también muy difíciles de llevar a cabo, altamente variables de laboratorio a laboratorio (difíciles de estandarizar), y requieren la disponibilidad de células del donante cuidadosamente criopreservadas. Por estos motivos, los ensayos funcionales no son óptimos para su aplicación clínica generalizada, y se emplean actualmente sólo en laboratorios seleccionados, altamente especializados, y básicamente para fines de investigación.

WO 2010/000320 A1 (INST INVEST S BIOMEDIQUESM, 7 January 2010) divulga un método para el diagnóstico o pronóstico in vitro del estado de tolerancia de un paciente sometido al transplante de hígado, que comprende la medición de los niveles de expresión de un grupo de genes en una muestra y la determinación de la tolerancia o no tolerancia del paciente mediante la comparación del nivel de expresión con una muestra de referencia (de un paciente no tolerante al transplante de hígado).

El análisis de monitorización inmune no específico de antígeno constituye una variedad de metodologías dirigidas a la caracterización fenotípica del sistema inmune del receptor, sin el uso de la inmunización con antígenos del donante. Entre estos análisis, se han empleado el estudio del receptor de las células T mediante los patrones de distribución de la longitud de CDR3 (TcLandscape), el inmunofenotipaje de las células sanguíneas periféricas mediante citometría de flujo, y el perfil de expresión génica, para identificar biomarcadores característicos de la tolerancia en humanos. La técnica TcLandscape se ha empleado en sangre periférica para discriminar entre receptores de riñón tolerantes y receptores que experimentan rechazo crónico (S. Brouard et al. 2005). Sin embargo, esta técnica es cara, actualmente sólo está disponible en un laboratorio (Inserm 643 y TcLand Expression en Nantes, Francia), y nunca ha sido validada en trasplante de hígado. El uso del inmunofenotipaje de sangre periférica se ha utilizado con muestras de sangre periférica obtenidas de receptores tolerantes tanto de trasplante hígado como de riñón. Al menos son conocidos por los inventores cuatro estudios que abordan esta metodología. En el primero de ellos, de la Universidad de Pittsburgh en EE.UU. (G.V. Mazariegos et al 2003), se dice que el ratio entre subgrupos de células dendríticas pDC y mDC podría distinguir entre receptores tolerantes y no tolerantes en trasplante pediátrico de hígado. En el segundo estudio, de Kyoto

(Y.

Li et al 2004), se dice que un ratio incrementado entre células T gamma/delta delta-1 y delta-2 en sangre periférica es más prevalente en receptores tolerantes de hígado que en los no tolerantes. En el tercer estudio, que fue coordinado por los inventores (Martínez-Llordella et al 2007), se detectó en sangre periférica un número incrementado de células T CD4+CD25+ y un ratio incrementado de células T gamma/delta delta-1 a delta-2 en receptores de hígado tolerantes comparado con los receptores no tolerantes. El valor del ratio entre gamma/delta delta-1 y delta-2 ha sido sin embargo cuestionado en un estudio posterior del mismo grupo (Puig-Pey et al. Transplant Int 2010). Además, ninguno de estos análisis ofrece la precisión requerida para una aplicación clínica generalizada. El uso de técnicas que obtienen el perfil de expresión génica para identificar biomarcadores de tolerancia se ha empleado tanto en trasplantes de riñón como de hígado (S. Brouard et al. PNAS 2007; M. Martínez-Llordella et al. J Clin Invest 2008; K.Newell et al. J Clin Invest 2010;

P.

Sagoo et al. J Clin Invest 2010). Estas técnicas son más fáciles de estandarizar que las pruebas descritas anteriormente. Además, los estudios referenciados han mostrado que el uso de los biomarcadores transcripcionales identificados es un medio extremadamente preciso para diferenciar entre receptores tolerantes sin fármacos inmunosupresores y receptores no tolerantes que requieren el mantenimiento de la inmunosupresión. La principal limitación de los estudios publicados en la literatura hasta el momento es que no han intentado validar prospectivamente sus resultados. En otras palabras, no han sido capaces de demostrar si estos marcadores pueden identificar receptores tolerantes antes de que se interrumpa la inmunosupresión. Ante la ausencia de esta demostración no es posible estar seguros de que las diferencias observadas en la expresión génica no están causadas realmente por el efecto de la inmunosupresión farmacológica en el grupo de los receptores no tolerantes. Además, ninguno de los estudios comentados anteriormente ha intentado investigar si las diferencias en la expresión génica también existen a nivel del injerto en sí.

Mientras que el uso crónico de fármacos inmunosupresores es actualmente el único medio para asegurar la supervivencia a largo plazo de los aloinjertos trasplantados, estos fármacos son caros y están asociados a graves efectos secundarios (nefrotoxicidad, tumores y desarrollo de infecciones, diabetes, complicaciones cardiovasculares, etc.) que conducen a una morbilidad y mortalidad sustanciales. Por lo tanto, cualquier estrategia capaz de reducir significativamente el uso de fármacos inmunosupresores en el trasplante puede tener un gran impacto en la salud y la calidad de vida de los receptores trasplantados.

En conclusión, sigue siendo un reto la provisión de un método validado capaz de predecir la tolerancia en los pacientes trasplantados de hígado, y por lo tanto, capaz de indicar si puede prescindirse de la administración de fármacos inmunosupresores a dichos pacientes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Por lo tanto, la presente invención está dirigida a solucionar el problema citado anteriormente por medio de la identificación de perfiles de expresión génica como biomarcadores, capaces de predecir la tolerancia en pacientes trasplantados de hígado. Por lo tanto, con el objetivo de identificar aquellos genes que muestran una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión entre los receptores de hígado que pueden interrumpir el tratamiento inmunosupresor (tolerantes) y aquellos que requieren el mantenimiento de los fármacos inmunosupresores (no tolerantes), se tomaron muestras de biopsias de tejido hepático a partir de un grupo de receptores de trasplante hepático estables bajo el mantenimiento del tratamiento inmunosupresor quienes se reclutaron en un estudio clínico prospectivo de retirada de los fármacos inmunosupresores.

El perfil de expresión puede determinarse mediante cualquier tecnología conocida por un experto medio en la materia. En concreto, cada nivel de expresión génica puede medirse a nivel genómico y/o nucleico y/o proteico. En un aspecto preferido, el perfil de expresión se determina midiendo la cantidad de transcritos de ácido nucleico de cada gen. En otro aspecto, el perfil de expresión se determina midiendo la cantidad de proteína producida por cada uno de los genes.

La cantidad de transcritos de ácido nucleico puede medirse mediante cualquier tecnología conocida por un experto medio en la materia. En concreto, la medición puede llevarse a cabo directamente sobre una muestra de la que se extrae el ARN mensajero (ARNm), o sobre un ADN complementario (ADNc) retrotranscrito a partir de ARNm extraído mediante tecnologías bien conocidas en el estado de la técnica. A partir de la muestra de ARNm o ADNc, la cantidad de transcritos de ácido nucleico puede medirse utilizando cualquier tecnología conocida por un experto medio en la materia, incluyendo microarrays nucleicos, PCR cuantitativa e hibridación con una sonda marcada.

En un aspecto concreto, que no debe considerarse como limitante del campo de la invención, la determinación del perfil de expresión de estas biopsias se llevó a cabo primero con el microarray de expresión de todo el genoma Illumina Beadchip, que identificó genes con un p-valor<0.01 y una tasa de falso descubrimiento (FDR) <25% (Tabla 1).

Tabla 1. Lista de genes expresados diferencialmente entre muestras de biopsia hepática de tolerantes y no tolerantes.

Secuencia

Gen

referencia NCBI (RefSeq) FDR p-valor

TFRC

No Annotation 0 1,19E-005

LOC644037

XR_017337 0 2,13E-005

LOC729266

XM_001721977 10,01418211 4,50E-006

ST7OT1

NR_002330 10,01418211 9,12E-006

MYO19

NM_001033580 10,01418211 1,16E-005

TP53I3

NM_004881 10,01418211 0,000143629

HAMP

NM_021175 10,01418211 0,001152774

MCOLN1

NM_020533 15,02127316 3,52E-005

OTUD7A

NM_130901 15,02127316 4,21E-005

EXT2

NM_000401 15,02127316 7,92E-005

KLHL28

NM_017658 15,02127316 0,000219206

UHMK1

NM_175866 15,02127316 0,000252044

FIGF

NM_004469 15,02127316 0,000482129

SLC1A7

NM_006671 15,02127316 0,000917616

ADORA3

NM_020683 15,02127316 0,001104349

SLC5A12

NM_178498 15,02127316 0,001594655

TAF15

NM_139215 15,02127316 0,001995782

TPPP3

NM_016140 16,89893231 2,00E-005

TAGLN

NM_001001522 16,89893231 2,71E-005

NFKBIL2

NM_013432 16,89893231 3,36E-005

OR2C3

NM_198074 16,89893231 0,000221256

UNG

NM_080911 16,89893231 0,000297046

GHSR

NM_004122 16,89893231 0,000320149

KRTAP5-10

NM_001012710 16,89893231 0,000411491

UNC13A

NM_001080421 16,89893231 0,000434094

G3BP1

NM_198395 23,05590765 0,000139785

ANKRD5

NM_022096 23,05590765 0,000181261

RBM23

NM_018107 23,05590765 0,000181688

RAG2

NM_000536 23,05590765 0,000191286

TUBA8

NM_018943 23,05590765 0,000201266

DGKK

NM_001013742 23,05590765 0,000210462

C1orf61

NM_006365 23,05590765 0,000286859

ADSSL1

NM_199165 23,05590765 0,0004024

FBXL4

NM_012160 23,05590765 0,000406323

VAC14

NM_018052 23,05590765 0,000426174

LOC643668

XR_039201 23,05590765 0,000427565

RNASE13

NM_001012264 23,05590765 0,000451496

SAGE1

NM_018666 23,05590765 0,000474797

RTP2

NM_001004312 23,05590765 0,000516765

SYNE2

NM_182910 23,05590765 0,00052836

TSPAN2

NM_005725 23,05590765 0,000583719

SCRG1

NM_007281 23,05590765 0,000676665

ACSL1

NM_001995 23,05590765 0,000734359

STRN4

NM_013403 23,05590765 0,000767142

TUBA4A

NM_006000 23,05590765 0,000924509

RIBC1

NM_144968 23,05590765 0,000965443

MCHR1

NM_005297 23,05590765 0,00099149

MUTED

NM_201280 23,05590765 0,001028448

TANK

NM_004180 23,05590765 0,001031594

DPP4

NM_001935 23,05590765 0,001174649

CHD3

NM_001005271 23,05590765 0,00129579

KLK15

NM_017509 23,05590765 0,00133

Secuencia

Gen

referencia NCBI (RefSeq) FDR p-valor

NFIX

NM_002501 23,05590765 0,001358456

FAM3B

NM_206964 23,05590765 0,001386029

DOC2A

NM_003586 23,05590765 0,001388434

NQO2

NM_000904 23,05590765 0,001470921

KIAA1143

NM_020696 23,05590765 0,001478818

PLCD3

NM_133373 23,05590765 0,001551069

PLXNA4

NM_181775 23,05590765 0,001589304

ADAMTS3

NM_014243 23,05590765 0,001589498

ABAT

NM_001127448 23,05590765 0,001742645

POF1B

NM_024921 23,05590765 0,001746171

CYP2W1

NM_017781 23,05590765 0,001815383

HSPA1A

NM_005345 23,05590765 0,002150872

FAM162A

NM_014367 23,05590765 0,002262613

KIAA1274

NM_014431 23,05590765 0,002458413

CP

NM_000096 23,05590765 0,002664451

OR5A2

NM_001001954 23,05590765 0,002806537

C9orf127

NM_001042589 23,05590765 0,003069775

AMPD2

NM_203404 23,05590765 0,004156098

KRT19

NM_002276 23,05590765 0,006219448

ATP1B1

NM_001677 23,05590765 0,006336133

C20orf71

NM_178466 24,92892142 0,001022188

LTBP4

NM_001042544 24,92892142 0,00131758

CNTNAP1

NM_003632 24,92892142 0,002377442

FNDC3A

NM_014923 24,92892142 0,00241448

ZNF665

NM_024733 24,92892142 0,00332211

Sobre la base de los resultados del microarray y varios estudios dirigidos en modelos experimentales animales de tolerancia inmunológica, se seleccionó un grupo de 104 genes (enumerados en la Tabla 2) para su validación empleando la PCR cuantitativa en tiempo real.

Tabla 2. Lista de genes analizados mediante PCR en tiempo real Criterio de

Gen ID Gen NCBI Nombre

Selección 18S 100008588 ARNr Eucariótico 18S HK TP53I3 9540 proteína inducible 3 de la proteína p53 del tumor M HAMP 57817 hepcidina, péptido antimicrobiano M SAGE1 55511 antígeno 1 del sarcoma M DPP4 1803 dipeptidil-peptidasa 4 M MYO19 80179 miosina XIX M MCOLN1 57192 mucolipina 1 M ACSL1 2180 miembro 1 de la familia acil-CoA sintetasa de cadena

larga M UNG 7374 uracil-ADN glicosilasa M TFRC 7037 receptor de la transferrina (p90, CD71) M TUBA4A 7277 tubulina, alfa 4a M COG5 10466 componente 5 del complejo oligomérico de golgi M FAM162A 26355 familia con secuencia 162 similar, miembro A PK FKBP1A 2280 proteína 1A de unión a FK506, 12kDa PK ABAT 18 4-aminobutirato aminotransferasa M CP 1356 ceruloplasmina (ferroxidasa) PK HLA-E 3133 complejo mayor de histocompatibilidad, clase I, E PK CXCR7 57007 receptor 7 de la quimiocina (motivo C-X-C) PK SRGN 5552 serglicina PK PRF1 5551 perforina 1 (proteína formadora de poros) PK TLR8 51311 receptor tipo toll 8 PK STAT1 6772 transductor de señales y activador de la transcripción 1 PK IL18BP 10068 proteína de unión a interleucina 18 PK PSMB9 5698 proteasoma (prosoma, macropain) subunidad 9 PK

Gen

ID Gen NCBI Nombre Criterio de Selección

HFE

3077 hemocromatosis PK

IRF1

3659 factor 1 regulador del interferón PK

CXCL9

4283 ligando 9 de la quimiocina (motivo C-X-C) PK

UBD

10537 ubiquitina D PK

CD8A

925 molécula CD8a PK

IL32

9235 interleucina 32 PK

CXCL10

3627 ligando 10 de la quimiocina (motivo C-X-C) PK

CCL3

6348 ligando 3 de la quimiocina (motivo C-C) PK

CD3D

915 molécula CD3d, delta (complejo CD3-TCR) PK

IL6

3569 interleucina 6 (interferón, beta 2) PK

IL1A

3552 interleucina 1, alfa PK

IL1B

3553 interleucina 1, beta PK

TFR2

7036 receptor 2 de la transferrina PK

HFE2

148738 hemocromatosis tipo 2 (juvenil) PK

BMP4

652 proteína 4 morfogenética de hueso PK

SMAD4

4089 miembro 4 de la familia SMAD PK

FTH1

2495 ferritina, polipéptido pesado 1 PK

PDCD1

5133 muerte celular programada 1 PK

HLA-G

3135 complejo mayor de histocompatibilidad, clase I, G PK

FOXP3

50943 caja P3 del forkhead PK

IL10

3586 interleucina 10 PK

TGFB1

7040 factor de crecimiento transformador, beta 1 PK

IL2RB

3560 receptor interleucina 2, beta PK

KLRF1

51348 receptor tipo lectina en células killer, subfamilia F, 1 PK

SLAMF7

57823 miembro 7 de la familia SLAM PK

KLRD1

3824 receptor tipo lectina en células killer, subfamilia D, 1 PK

CX3CR1

1524 receptor 1 de la quimiocina (motivo C-X3-C) PK

LINGO2

158038 repeticiones ricas en leucina conteniendo 2 dominios Ig PK

BNC2

54796 basonuclina 2 PK

NCR1

9437 receptor desencadenante de citotoxicidad natural 1 PK

COL13A1

1305 colágeno, tipo XIII, alfa 1 PK

IGFBP7

3490 proteína 7 de unión al factor de crecimiento tipo insulina PK

SH2D1B

117157 dominio SH2 que contiene 1B PK

NCAM1

4684 molécula 1 de adhesión a la célula neuronal PK

KLRK1

22914 receptor tipo lectina en células killer, subfamilia K, 1 PK

KLRC1

3821 receptor tipo lectina en células killer, subfamilia C, 1 PK

MICA

4276 secuencia polipéptido-relacionada A de la clase I de

MHC

PK

MICB

4277 secuencia polipéptido-relacionada B de la clase I de

MHC

PK

TLR4

7099 receptor tipo toll 4 PK

GZMB

3002 granzima B (granzima 2) PK

AP1S2

8905 complejo adaptador proteico 1, sigma 2 PK

SMARCD3

6604 relacionado con SWI/SNF, asociado a la matriz PK

CD37

951 molécula CD37 PK

FCER2

2208 fragmento relacionado de IgE, afinidad baja II, receptor

de Fc (CD23)

PK

MS4A1

931 4 dominios que atraviesan la membrana PK

CXCR3

2833 receptor 3 de la quimiocina (motivo C-X-C) PK

CXCL11

6373 ligando 11 de la quimiocina (motive C-X-C) PK

IFNG

3458 interferón, gamma PK

CD274

29126 molécula CD274 PK

PDCD1LG2

80380 muerte celular programada 1, ligando 2 PK

C3

718 componente 3 del complemento PK

TBX21

30009 caja T 21 PK

GATA3

2625 proteína 3 de unión a GATA PK

FAS

355 Fas (superfamilia receptor TNF, miembro 6) PK

FASLG

356 ligando Fas (superfamilia receptor TNF, miembro 6) PK

RORC

6097 receptor C huérfano asociado a RAR PK

HMOX1

3162 hemo-oxigenasa (deciclizadora) 1 PK

TNFAIP3

7128 factor de necrosis tumoral, proteína alfa-inducida 3 PK

BCL2

596 linfoma 2/LLC de célula B PK

SOCS1

8651 supresor de la señalización de citoquinas 1 PK

TNF

7124 factor de necrosis tumoral (superfamilia TNF, 2) PK

Gen

ID Gen NCBI Nombre Criterio de Selección

NOS2

4843 óxido nítrico sintasa 2, inducible PK

IL12B

3593 interleucina 12B (estimulador de las células natural

killer 2)

PK

IL18

3606 interleucina 18 (factor inductor de interferón-gamma) PK

IRF3

3661 factor regulador de interferón 3 PK

CCL21

6366 ligando 21 de la quimiocina (motivo C-C) PK

HPRT1

3251 hipoxantina-fosforribosiltransferasa 1 HK

GAPDH

2597 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa HK

DTWD2

285605 dominio DTW conteniendo 2 M

POF1B

79983 fallo ovárico prematuro, 1B M

MYD88

4615 respuesta primaria de diferenciación mieloide

dependiente del gen (88)

PK

DAB2

1601 discapacitado homólogo 2 M

TIPARP

25976 poli(ADP-ribosa) polimerasa inducible por TCDD M

RBM23

55147 motivo 23 de la proteína de unión a ARN M

TTC3

7267 dominio repetido 3 del tetratricopéptido M

MIF

4282 factor inhibidor de la migración de macrófagos M

PEBP1

5037 proteína 1 de unión a la fosfatidiletanolamina M

SLC5A12

159963 familia 5 miembro 12 del transportador de solutos M

FABP4

2167 proteína 4 de unión a ácido graso M

PCDH24

54825 protocadherina 24 M

VNN3

55350 vanina 3 M

ADORA3

140 receptor A3 de adenosina M

TAF15

8148 Factor asociado a la proteína de unión a la caja TATA

(TBP)

M

(M=significativo en microarray, PK=conocido previamente, HK= control constitutivo) Fecha de acceso NCBI: 28 de julio 2010

Los resultados de los experimentos llevados a cabo por PCR en tiempo real revelaron que los genes enumerados en la Tabla 3 muestran una diferencia significativa en la expresión entre biopsias tomadas de pacientes trasplantados de hígado que pueden abandonar de forma segura los fármacos inmunosupresores (tolerantes) y los pacientes que sufren rechazo cuando se interrumpen los fármacos inmunosupresores (no tolerantes). Como se muestra en la Tabla 3, los genes TFRC y MIF están sobre-regulados, y los genes CDHR2, HMOX1, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2 están infra-regulados, en receptores de trasplante hepático tolerantes comparados con una muestra de ARN de referencia (que puede ser un conjunto de ARNs obtenidos de tejido hepático no trasplantado sano, un ARN de referencia como el disponible comercialmente Human Liver Total RNA de Ambion, o una referencia absoluta que consiste en una muestra que contiene un número previamente cuantificado de moléculas de ARN)

Tabla 3

p-valor

Gen

t de Student Wilcox Ratio de cambio de expresión

TFRC

0,000035 0,000026 -2,505329

CDHR2

0,006059 0,004665 1,747146

HMOX1

0,007195 0,005044 1,399586

MIF

0,008793 0,003526 -1,547565

HAMP

0,012583 0,077430 2,173470

IFNG

0,013215 0,020816 1,319508

PEBP1

0,023371 0,011855 1,132884

SLC5A12

0,032834 0,022216 2,345670

ADORA3

0,039721 0,041890 1,464086

DAB2

0,046314 0,049169 1,193336

Es importante destacar que los genes comprendidos en la Tabla 3 comparten una ruta de señalización funcional porque la mayoría de ellos están implicados en la regulación del metabolismo del hierro. De hecho, las biopsias de los pacientes que pueden interrumpir con éxito la medicación inmunosupresora mostraron una mayor acumulación de hierro, como se muestra en la Figura 1. Se sabe que los genes TFRC, HAMP, IFNG y HMOX1 están directamente implicados en el control del metabolismo celular del hierro. Además, la expresión de muchos de los genes expresados diferencialmente entre pacientes en los que es posible eliminar la medicación inmunosupresora (tolerantes) y aquellos en los que dicha eliminación no es recomendable (no tolerantes), como CDHR2, MIF, SLC5A12, ADORA3 y DAB2, se correlaciona significativamente con el depósito de hierro intrahepático (medido mediante el método modificado de Scheuer o el método “resultado total de hierro”; ver Figura 2). Una prueba adicional que enfatiza el papel del metabolismo del hierro en la adquisición de la tolerancia operacional en los aloinjertos de hígado es la observación de que los niveles séricos de hepcidina (la hormona más importante en la regulación de la homeostasis del hierro sistémico, codificada por HAMP) son significativamente mayores en receptores de hígado tolerantes que en los no tolerantes (ver Figura 3). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la regulación del metabolismo del hierro a

5 nivel intrahepático juega un papel en el control de las respuestas alo-inmunes en el trasplante de hígado.

Más específicamente, estos resultados indican que el nivel de expresión de los genes involucrados en dicha regulación del metabolismo del hierro debería ser particularmente relevante para el diseño de un método de acuerdo con la presente divulgación.

10 Así, el primer aspecto de la presente invención hace referencia a un método para el diagnóstico o pronóstico in vitro del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante hepático que comprende:

a. Medición, en una muestra biológica obtenida del aloinjerto hepático del paciente bajo investigación, de

15 los niveles de expresión de al menos uno de los siguientes genes o combinación o equivalente de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2;

b. Evaluación de la tolerancia o no tolerancia del paciente bajo investigación al transplante de hígado mediante la comparación del nivel de expresión de al menos uno de los genes del paso a), o combinación de los mismos, con el nivel de expresión de los mismos genes tomado a partir de una

20 muestra de referencia.

La muestra de referencia es un perfil de expresión predeterminado, obtenido a partir de una muestra biológica de un sujeto obtenida de un tejido hepático no trasplantado sano. Puede ser un conjunto de ARNs, un ARN de referencia como el disponible comercialmente Human Liver Total RNA de Ambion, o una referencia absoluta que consiste en una

25 muestra que contiene un número previamente cuantificado de moléculas de ARN.

Como se muestra en la Tabla 4 más abajo, la medición del nivel de expresión de cada uno de los genes comprendidos en la Tabla 3 es útil para la identificación de pacientes que puedan interrumpir de forma segura la medicación inmunosupresora sin sufrir rechazo (tolerancia). Por lo tanto, esta Tabla 4 muestra la capacidad de los genes

30 individuales ahí enumerados para diferenciar estadísticamente los pacientes que tolerarán el hígado trasplantado en ausencia de tratamiento inmunosupresor, de aquellos receptores que lo rechazarán cuando se interrumpa la medicación inmunosupresora.

Tabla 4 GENES AUC SN SP ER PPV NPV

TFRC 0,76 51,72 90,48 25,35 78,95 73,08 CDHR2 0,70 58,62 83,33 26,76 70,83 74,47 HMOX1 0,70 55,17 83,33 28,17 69,57 72,92 PEBP1 0,68 44,83 90,48 28,17 76,47 70,37 MIF 0,68 93,1 52,38 30,99 57,45 91,67 SLC5A12 0,66 44,83 85,71 30,99 68,42 69,23 DAB2 0,65 58,62 73,81 32,39 60,71 72,09 IFNG 0,64 31,03 90,48 33,8 69,23 65,52 HAMP 0,63 86,21 52,38 33,8 55,56 84,62 ADORA3 0,65 20,69 95,24 35,21 75 63,49

35 AUC: área bajo la curva SN: sensibilidad SP: especificidad ER: tasa de error

40 PPV: valor predictivo positivo NPV: valor predictivo negativo

Sin embargo, aunque los genes citados en las Tablas 3 ó 4 tienen una capacidad predictiva individual, se han hecho diferentes grupos partiendo de algunas combinaciones de dichos genes, con el objetivo de identificar un método 45 predictivo lo más preciso posible. Además, los genes enumerados en las Tablas 3 ó 4 se agruparon también con otros genes que no mostraron un valor predictivo per se (tomados independientemente), por ejemplo: LC5A12, VNN3, SOCS1, TTC3, RBM23, SH2D1B, NCR1, TFRC, TUBA4A, TAF15, TIPARP, MOX1, MCOLN1, EBP1, DHR2, y AB2. Por lo tanto, en un aspecto preferido, la presente invención comprende además la medición de los niveles de expresión de al menos uno de los siguientes genes: LC5A12, VNN3, SOCS1, TTC3, RBM23, SH2D1B, NCR1, TFRC, TUBA4A,

50 TAF15, TIPARP, MOX1, MCOLN1, EBP1, DHR2, y AB2 en combinación con al menos uno de los genes enumerados en la Tabla 3 ó 4.

Para identificar la/s combinación/es de biomarcadores de la expresión génica con el mejor perfil en el diagnóstico del resultado de la retirada de los fármacos inmunosupresores en el trasplante de hígado, llevamos a cabo una búsqueda exhaustiva de modelos predictivos empleando el análisis discriminante lineal y algoritmos de regresión logística implementados en el software de penalización posterior de la clasificación errónea (misclassification penalized posterior, 5 MiPP). En primer lugar, llevamos a cabo un paso de validación cruzada con 10 subconjuntos en un grupo de muestras hepáticas (18 tolerantes y 31 no tolerantes) recogidas de pacientes reclutados en el Hospital Clínic de Barcelona. A continuación, se llevó a cabo una validación cruzada con divisiones aleatorias de los modelos diagnósticos sobre el conjunto completo de datos (que incluía las 56 muestras de Barcelona y 21 muestras adicionales de Roma y Lovaina) dividiéndolo repetidamente en grupos de entrenamiento (2/3) y en grupos de evaluación independiente (1/3) para la 10 validación del modelo externo. Además, para cada modelo identificado en el grupo de entrenamiento el valor de corte para la probabilidad óptima de tolerancia se calculó empleando el análisis ROC (Característica Operativa del Receptor). Para demostrar que la interpretación de los modelos no era centro-dependiente, calculamos entonces SN, SP, NPV, PPV y las tasas de error globales para las muestras recogidas de Barcelona y para aquellas obtenidas de Roma y Lovaina. Es importante destacar que todas las mediciones de la expresión génica se llevaron a cabo sobre muestras

15 obtenidas antes de que se interrumpiera la medicación inmunosupresora. Nuestros resultados por lo tanto indican que los marcadores genéticos identificados son capaces de predecir el éxito de la retirada de los fármacos inmunosupresores.

Como se comentó anteriormente, este tipo de análisis tiene en cuenta no sólo aquellos genes que se encontró que se

20 expresaban de forma diferenciada (Tabla 3) sino también los genes que, aunque no se expresan de forma significativamente diferente, si se analizan de forma individual, sí que contribuyen a optimizar el diagnóstico en combinación con los genes de la Tabla 3. La Tabla 5 muestra los grupos de muestras empleados para el diseño y evaluación de los modelos predictivos basados en la expresión de biopsias hepáticas de los genes medidos mediante PCR en tiempo real. Es importante destacar que, mientras que las muestras recogidas en los receptores de Barcelona

25 se emplearon tanto para los experimentos con microarray y qPCR, ninguna de las muestras obtenidas de Roma y Lovaina se emplearon en los experimentos con microarray.

Tabla 5

TOL (n)

No-TOL (n) origen

Grupo de entrenamiento

18 31 Barcelona

Grupo de análisis

10 11 Roma/Lovaina

30 Así, la Tabla 6 muestra las combinaciones de genes cuya expresión mejor clasifica a los pacientes en las categorías de tolerantes y no tolerantes de acuerdo con los resultados de las mediciones de expresión por PCRq. Se seleccionó arbitrariamente un error de clasificación menor del 15% en el grupo de aprendizaje y menor del 10% en el grupo de validación para seleccionar los modelos más precisos y clínicamente útiles.

Tabla 6

Barcelona

Roma + Lovaina

Genes

n SN SP ER SN SP ER

SLC5A12+VNN3+TFRC+SOCS1+MIF+TTC3+RBM23 +PEBP1+SH2D1B+NCR1+DAB2+ADORA3

12 100 90,32 6,12 90 90,91 9,52

TFRC+PEBP1+MIF+CDHR2+HAMP+TUBA4A+TTC3 +HMOX1+VNN3+NCR1+ADORA3+TAF15+IFNG+SO CS1+TIPARP

15 94,44 93,55 6,12 80 100 9,52

HMOX1+CDHR2+MIF+PEBP1+TFRC+SLC5A12+SO CS1+HAMP+VNN3+IFNG

10 94,44 90,32 8,16 80 100 9,52

TFRC+PEBP1+MIF+CDHR2+SLC5A12+HAMP+SOC S1+IFNG+HMOX1

9 94,44 90,32 8,16 80 100 9,52

TFRC+IFNG+CDHR2+ADORA3+HAMP+MIF+PEBP1 +VNN3+SOCS1+HMOX1+DAB2

11 88,89 90,32 10,2 80 100 9,52

TFRC+DAB2+MIF+PEBP1+IFNG+HAMP+SLC5A12+ SOCS1+VNN3+ADORA3+CDHR2+MCOLN1+HMOX 1

13 77,78 96,77 10,2 80 100 9,52

TFRC+IFNG+HMOX1+MCOLN1+MIF+HAMP+ADOR A3+CDHR2+PEBP1+SOCS1

10 88,89 90,32 10,2 80 100 9,52

PEBP1+TFRC+HMOX1+IFNG+MCOLN1+SOCS1+MI F+CDHR2+HAMP+ADORA3

10 88,89 90,32 10,2 80 100 9,52

TFRC+PEBP1+IFNG+CDHR2+ADORA3+VNN3+HM OX1+DAB2+SOCS1+MIF+HAMP

11 88,89 90,32 10,2 80 100 9,52

CDHR2+ADORA3+IFNG+TFRC+VNN3+HMOX1+PE BP1+MIF+SLC5A12+HAMP+SOCS1+MCOLN1

12 77,78 96,77 10,2 80 100 9,52

SLC5A12+TFRC+IFNG+MIF+DAB2+HMOX1+CDHR 2+SOCS1+HAMP+PEBP1+VNN3+ADORA3+MCOLN 1

13 77,78 96,77 10,2 80 100 9,52

TFRC+SOCS1+HMOX1+PEBP1+VNN3+CDHR2+HA MP+IFNG+DAB2+MCOLN1+ADORA3+MIF

12 83,33 93,55 10,2 80 100 9,52

TFRC+PEBP1+VNN3+SOCS1+MIF+HMOX1+DAB2+ HAMP+IFNG+CDHR2+ADORA3+MCOLN1

12 83,33 93,55 10,2 80 100 9,52

SLC5A12+MIF+CDHR2+TFRC+IFNG+ADORA3+HA MP+VNN3+SOCS1+MCOLN1+PEBP1+HMOX1

12 77,78 96,77 10,2 80 100 9,52

TFRC+IFNG+CDHR2+ADORA3+PEBP1+VNN3+MIF +HMOX1+MCOLN1+SOCS1+SLC5A12+DAB2,+HAM P

13 77,78 96,77 10,2 80 100 9,52

TFRC+VNN3+HAMP+CDHR2+SLC5A12+HMOX1+S OCS1+PEBP1+MIF

9 94,44 83,87 12,24 80 100 9,52

DAB2+TFRC+MIF+CDHR2+PEBP1+VNN3+TTC3+H MOX1+SOCS1

9 83,33 90,32 12,24 80 100 9,52

TFRC+PEBP1+MIF+CDHR2+VNN3+IFNG+MCOLN1 +SOCS1

8 88,89 83,87 14,29 80 100 9,52

TFRC+PEBP1+MIF+SOCS1+CDHR2

5 94,44 80,65 14,29 80 100 9,52

SN: sensibilidad SP: especificidad

5 ER: tasa de error PPV: valor predictivo positivo NPV: valor predictivo negativo

Un aspecto de la presente invención hace referencia al uso de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones

10 de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2, en un método para el diagnóstico in vitro o el pronóstico del estado de tolerancia de un paciente sometido a una trasplante de hígado. En un aspecto preferido, el método de la invención se lleva a cabo usando una combinación de al menos uno de los genes citados anteriormente con al menos uno de los siguientes genes: LC5A12, VNN3, SOCS1, TTC3, RBM23, SH2D1B, NCR1, TFRC, TUBA4A, TAF15, TIPARP, MOX1, MCOLN1, EBP1, DHR2, y AB2. En un aspecto particularmente

15 preferido, el método de la invención se lleva a cabo usando una de las siguientes combinaciones de genes: LC5A12, VNN3, TFRC, SOCS1, MIF, TTC3, RBM23, PEBP1, SH2D1B, NCR1, DAB2 y ADORA3; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, HAMP, TUBA4A, TTC3, HMOX1, VNN3, NCR1, ADORA3, TAF15, IFNG, SOCS1 y TIPARP; MOX1, CDHR2, MIF, PEBP1, TFRC, SLC5A12, SOCS1, HAMP, VNN3 y IFNG; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, SLC5A12, HAMP, SOCS1, IFNG y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, HAMP, MIF, PEBP1, VNN3, SOCS1, HMOX1 y DAB2; TFRC, DAB2,

20 MIF, PEBP1, IFNG, HAMP, SLC5A12, SOCS1, VNN3, ADORA3, CDHR2, MCOLN1 y HMOX1; TFRC, IFNG, HMOX1, MCOLN1, MIF, HAMP, ADORA3, CDHR2, PEBP1 y SOCS1; EBP1, TFRC, HMOX1, IFNG, MCOLN1, SOCS1, MIF, CDHR2, HAMP y ADORA3; TFRC, PEBP1, IFNG, CDHR2, ADORA3, VNN3, HMOX1, DAB2, SOCS1, MIF y HAMP; DHR2, ADORA3, IFNG, TFRC, VNN3, HMOX1, PEBP1, MIF, SLC5A12, HAMP, SOCS1 y MCOLN1; LC5A12, TFRC, IFNG, MIF, DAB2, HMOX1, CDHR2, SOCS1, HAMP, PEBP1, VNN3, ADORA3 y MCOLN1; TFRC, SOCS1, HMOX1, PEBP1, VNN3, CDHR2, HAMP, IFNG, DAB2, MCOLN1, ADORA3 y MIF; TFRC, PEBP1, VNN3, SOCS1, MIF, HMOX1, DAB2,

5 HAMP, IFNG, CDHR2, ADORA3 y MCOLN1; LC5A12, MIF, CDHR2, TFRC, IFNG, ADORA3, HAMP, VNN3, SOCS1, MCOLN1, PEBP1 y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, PEBP1, VNN3, MIF, HMOX1, MCOLN1, SOCS1, SLC5A12, DAB2 y HAMP; TFRC, VNN3, HAMP, CDHR2, SLC5A12, HMOX1, SOCS1, PEBP1 y MIF; AB2, TFRC, MIF, CDHR2, PEBP1, VNN3, TTC3, HMOX1 y SOCS1; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, VNN3, IFNG, MCOLN1 y SOC S1; TFRC, PEBP1, MIF, SOCS1 y CDHR2.

10 Algunas variables clínicas pueden influir en el desarrollo de la tolerancia operacional tras un trasplante hepático en humanos. En concreto, los receptores que fueron trasplantados tras un largo periodo de tiempo o aquellos que son mayores tienen una mayor probabilidad de ser capaces de interrumpir con éxito los medicamentos inmunosupresores. Llevamos a cabo análisis adicionales de regresión logística para excluir el potencial efecto de confusión de estas 2

15 variables clínicas sobre las mediciones de la expresión génica. Aparte de los genes descritos en las Tablas 3 ó 4, se encontró que los siguientes genes eran estadísticamente significativos tras excluir el efecto de la edad del receptor y el tiempo desde el trasplante (Tabla 7)

20 Tabla 7

Genes

p-valor

TFRC

0,0033

PEBP1

0,0125

HMOX1

0,0177

IFNG

0,0198

CDHR2

0,0234

DAB2

0,0572

Para desarrollar un modelo predictivo genético independiente de variables clínicas, empleamos la regresión logística y el software MiPP sobre los genes mostrados en la Tabla 7. Se encontró que el siguiente modelo era el mejor para predecir 25 tanto en los grupos de pacientes de aprendizaje como en el de validación (Tabla 8).

Tabla 8

Barcelona

Roma+Lovaina

Genes

n SN SP ER SN SP ER

TFRC + IFNG + CDHR2

3 83.3 83.9 16.3 60 100 19

30 Así, un aspecto adicional de la presente invención hace referencia a un método para el diagnóstico in vitro o el pronóstico del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante de hígado mediante la medición de la expresión génica de la siguiente combinación de genes: TFRC, IFNG y CDHR2.

En un aspecto concreto de un método de acuerdo a la invención, dicho método puede comprender además la

35 determinación de al menos un parámetro adicional útil para el diagnóstico o pronóstico. Esos “parámetros útiles para el diagnóstico” son parámetros que no pueden ser utilizados por sí solos para el diagnóstico pero se ha descrito que presentan valores significativamente diferentes entre los sujetos tolerantes y los sujetos que claramente necesitan tratamiento inmunosupresor y podrían también de esta forma utilizarse para perfeccionar y/o confirmar el diagnóstico de acuerdo con el método descrito anteriormente de acuerdo con la invención. Entre estos se podría incluir en particular la

40 medición de los niveles séricos de proteínas codificadas por los genes implicados en la regulación del metabolismo del hierro en el hígado, como la Hepcidina.

Un aspecto adicional de la invención en un método como el descrito anteriormente y que además comprende la determinación de la edad del paciente y/o el tiempo de post-trasplante.

45 Otro aspecto divulgado hace referencia a un kit, para llevar a cabo el método de la invención para el diagnóstico in vitro

o el pronóstico del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante de hígado, que comprende (i) medio para la medición de los niveles de expresión génica de los genes correspondientes, y (ii) instrucciones para correlacionar dichos niveles de expresión génica por encima o por debajo del nivel de expresión de los mismos genes

50 tomados de la muestra de referencia de ARN.

Dichas muestras de referencia pueden ser un conjunto de ARNs obtenido a partir de un tejido hepático no trasplantado sano, un ARN de referencia como el disponible comercialmente Human Liver Total RNA de Ambion, o una referencia absoluta que consiste en una muestra que contiene un número previamente cuantificado de moléculas de ARN. En un 55 aspecto preferido el medio comprende un microarray o un chip génico el cual comprende sondas de ácido nucleico,

dichas sondas de ácido nucleico comprenden secuencias que hibridan específicamente con los transcritos del correspondiente grupo de genes, junto con reactivos para llevar a cabo el análisis del microarray. En otro aspecto preferido de la invención el kit comprende cebadores oligonucleótidos (es decir, HS02559818s1 para el gen TFRC o Hs01125168m1 para el gen VNN3), para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa, dichos cebadores comprenden secuencias que hibridan específicamente con el ADN complementario derivado de los transcritos del correspondiente grupo de genes. Además, el kit de la invención puede comprender un soporte sólido donde se dispongan las sondas de ácido nucleico que comprenden las secuencias que hibridan específicamente con los transcritos del correspondiente grupo de genes.

En otro aspecto, el medio comprende un microarray o un chip de proteína que comprenden porciones de unión específicas como los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos.

En un aspecto el kit mide la expresión de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2, para el diagnóstico in vitro o el pronóstico del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante de hígado. En un aspecto preferido el kit mide la expresión génica de una combinación de al menos uno de los genes citado anteriormente con al menos uno de los siguientes genes: LC5A12, VNN3, SOCS1, TTC3, RBM23, SH2D1B, NCR1, TFRC, TUBA4A, TAF15, TIPARP, MOX1, MCOLN1, EBP1, DHR2, y AB2. En un aspecto particularmente preferido el kit mide la expresión génica de las siguientes combinaciones de genes: LC5A12, VNN3, TFRC, SOCS1, MIF, TTC3, RBM23, PEBP1, SH2D1B, NCR1, DAB2 y ADORA3; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, HAMP, TUBA4A, TTC3, HMOX1, VNN3, NCR1, ADORA3, TAF15, IFNG, SOCS1 y TIPARP; MOX1, CDHR2, MIF, PEBP1, TFRC, SLC5A12, SOCS1, HAMP, VNN3 y IFNG; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, SLC5A12, HAMP, SOCS1, IFNG y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, HAMP, MIF, PEBP1, VNN3, SOCS1, HMOX1 y DAB2; TFRC, DAB2, MIF, PEBP1, IFNG, HAMP, SLC5A12, SOCS1, VNN3, ADORA3, CDHR2, MCOLN1 y HMOX1; TFRC, IFNG, HMOX1, MCOLN1, MIF, HAMP, ADORA3, CDHR2, PEBP1 y SOCS1; EBP1, TFRC, HMOX1, IFNG, MCOLN1, SOCS1, MIF, CDHR2, HAMP y ADORA3; TFRC, PEBP1, IFNG, CDHR2, ADORA3, VNN3, HMOX1, DAB2, SOCS1, MIF y HAMP; DHR2, ADORA3, IFNG, TFRC, VNN3, HMOX1, PEBP1, MIF, SLC5A12, HAMP, SOCS1 y MCOLN1; LC5A12, TFRC, IFNG, MIF, DAB2, HMOX1, CDHR2, SOCS1, HAMP, PEBP1, VNN3, ADORA3 y MCOLN1; TFRC, SOCS1, HMOX1, PEBP1, VNN3, CDHR2, HAMP, IFNG, DAB2, MCOLN1, ADORA3 y MIF; TFRC, PEBP1, VNN3, SOCS1, MIF, HMOX1, DAB2, HAMP, IFNG, CDHR2, ADORA3 y MCOLN1; LC5A12, MIF, CDHR2, TFRC, IFNG, ADORA3, HAMP, VNN3, SOCS1, MCOLN1, PEBP1 y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, PEBP1, VNN3, MIF, HMOX1, MCOLN1, SOCS1, SLC5A12, DAB2 y HAMP; TFRC, VNN3, HAMP, CDHR2, SLC5A12, HMOX1, SOCS1, PEBP1 y MIF; AB2, TFRC, MIF, CDHR2, PEBP1, VNN3, TTC3, HMOX1 y SOCS1; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, VNN3, IFNG, MCOLN1 y SOC S1; TFRC, PEBP1, MIF, SOCS1 y CDHR2.

Uno de los aspectos preferidos hace referencia a un kit para el diagnóstico in vitro o el pronóstico del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante de hígado que mide la expresión génica de la siguiente combinación de genes: TFRC, IFNG y CDHR2.

Los kits, de acuerdo con la presente divulgación, pueden además comprender reactivos para llevar a cabo un análisis del microarray y/o soportes sólidos donde se disponen las sondas de ácido nucleico que comprenden secuencias que hibridan específicamente con los transcritos del correspondiente grupo de genes.

Otro aspecto hace referencia a un kit para seleccionar o modificar el protocolo de tratamiento inmunoterápico mediante el análisis del estado de tolerancia del receptor del hígado usando el método o kit descritos anteriormente.

El último aspecto hace referencia a un método para adaptar el tratamiento inmunosupresor de un paciente con injerto de hígado, comprendiendo dicho método el uso del método o los kits descritos anteriormente.

El estado de la técnica comprende (Benitez C et al., Abstract #517, American Transplant Congress, San Diego, CA, 3 Mayo - 5 Mayo, 2010) la medición en muestras de sangre periférica de la expresión de un grupo de genes (KLRF1, PTGDR, NCALD, CD160, IL2RB, PTCH1, ERBB2, KLRB1, NKG7, KLRD1, FEZ1, GNPTAB, SLAMF7, CLIC3, CX3CR1, WDR67, MAN1A1, CD9, FLJ14213, FEM1C, CD244, PSMD14, CTBP2, ZNF295, ZNF267, RGS3, PDE4B, ALG8, GEMIN7) diferentes de los presentados en la presente invención, como un método para identificar receptores de hígado tolerantes. Se llevó a cabo un ensayo comparativo (ver Ejemplo 10) para determinar si los genes que forman parte de la presente invención tienen un mayor poder discriminativo comparados con los genes previamente descritos en sangre periférica. Se concluyó que la medición de la expresión de los genes comprendidos en la presente invención en muestras de tejido hepático, parece al menos tan precisa como la medición de los genes comprendidos en el estado de la técnica en sangre periférica, con el fin de identificar los receptores de hígado que pueden abandonar con éxito la medicación inmunosupresora porque son tolerantes al trasplante.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. El contenido de hierro del hígado (medido de manera semi-cuantitativa tras tinción de Perls empleando bien el método modificado de Scheuer o el método “resultado total de hierro”) es mayor en los hígados de pacientes que abandonan con éxito el tratamiento inmunosupresor (TOL) que en aquellos donde esto no es posible (No-TOL).

Figura 2. Esta figura muestra que el depósito de hierro intra-hepático (medido por el método modificado de Scheuer) se correlaciona con la expresión de muchos de los genes expresados diferencialmente entre los pacientes en los que es posible interrumpir la medicación inmunosupresora (tolerante) y entre aquellos en los que no es posible (no tolerante).

Figura 3. Esta figura muestra que los niveles séricos de hepcidina (el péptido codificado con el gen HAMP) están incrementados en los receptores tolerantes comparados con los receptores de hígado no tolerantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Población de pacientes y diseño del estudio.

Se recogieron muestras de sangre y biopsias de hígado a partir de un grupo de receptores de trasplante hepático reclutados en un ensayo clínico prospectivo multicéntrico apoyado por la Comisión Europea de retirada de los fármacos inmunosupresores en el trasplante de hígado (Título: Búsqueda de la Firma Inmunológica de la Tolerancia Operacional en el Trasplante de Hígado; identificación en clinicaltrials.gov NCT00647283). Los criterios de inclusión fueron los siguientes: 1) >3 años tras el trasplante; 2) función hepática estable y sin episodios de rechazo durante los 12 meses previos a la inclusión; 3) sin historia de enfermedad hepática autoinmune; 4) biopsia hepática previa a la inclusión sin anormalidades significativas (sin signos de rechazo agudo o crónico de acuerdo a los criterios de Banff; ausencia de inflamación portal en >50% del tracto portal; ausencia de perivenulitis central en >50% de las venas centrales; ausencia de fibrosis en puente o cirrosis). En los receptores reclutados se retiraron gradualmente los fármacos inmunosupresores hasta completar la retirada durante un periodo de 6-9 meses y después se siguieron durante 12 meses adicionales. Los pacientes se consideraron como tolerantes si no ocurrió ningún episodio de rechazo durante la completa duración del estudio y no se observaron cambios histológicos significantes en una biopsia obtenida al final del periodo de 12 meses de seguimiento. Los pacientes que sufrieron un rechazo agudo durante el estudio se consideraron como no tolerantes. Aparte de los 102 receptores reclutados en el estudio, se incluyeron 79 (33 tolerantes y 46 no tolerantes) en el actual estudio. Las muestras de sangre y biopsias hepáticas disponibles para el estudio se obtuvieron antes de que se interrumpieran los fármacos inmunosupresores tanto de los receptores tolerantes (TOL, n=33) como de los no tolerantes (No-TOL, n=46), en el momento del rechazo de los receptores no tolerantes (n=14), y al final del estudio en los pacientes tolerantes (n=4). Además, las muestras de tejido hepático se obtuvieron también de los siguientes grupos de pacientes: a) receptores de trasplante hepático con hepatitis crónica debida a una infección recurrente por el virus de la hepatitis C (HEPC, n=12); b) receptores de trasplante hepático con rechazo celular agudo típico que tiene lugar durante el periodo inmediato al post-trasplante (REJ, n=9); c) receptores de trasplante hepático bajo el mantenimiento de la inmunosupresión con función hepática normal e histología hepática normal tras 1 año del trasplante (CONT-Tx, n=8); y d) pacientes no trasplantados que se someten a cirugía por metástasis colorrectales hepáticas (CONT, n=10). Los receptores participantes se reclutaron del Hospital Clínic de Barcelona (España), Universidad Tor Vergata de Roma (Italia) y Hospital Universitario de Lovaina (Bélgica). El estudio fue aprobado por los tres consejos institucionales de revisión y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes en estudio. Las características clínicas y demográficas de los pacientes incluidos en el estudio se resumen en la Tabla 1 y el esquema del diseño del estudio se describe en la Figura 1. Una descripción detallada de la población de pacientes y de los resultados clínicos del ensayo clínico sobre la retirada de la inmunosupresión se presentará en otro lugar.

Ejemplo 2. Muestras de biopsia hepática y evaluación histológica.

Las biopsias hepáticas se llevaron a cabo de forma percutánea bajo anestesia local. Se preservó inmediatamente una porción de 2-3 mm del cilindro de la aguja de la biopsia hepática en reactivo RNAlater (Ambion, Austin, EE.UU.), se mantuvo a 4ºC durante 24h y se criopreservó después en nitrógeno líquido tras eliminar el reactivo RNAlater. El cilindro restante se fijó con formalina y se embebió en parafina. En los pacientes CONT las biopsias hepáticas quirúrgicas de hígado no tumoral se obtuvieron y procesaron como se ha descrito previamente. Para el análisis histológico se tiñeron muestras de 3 !m de espesor utilizando hematoxilina-eosina. Tricrómico de Masson para el análisis del tejido conectivo y tinción de Perl para la evaluación de contenido en hierro. El examen histológico se llevó a cabo por el mismo patólogo (R.M.) que trabajaba ciego para todos los datos clínicos y biológicos. Los siguientes aspectos histopatológicos fueron valorados y puntuados semicuantitativamente: 1) número de tractos portales completos; 2) número de venas centrales; 3) arquitectura parenquimal global; 4) inflamación lobular; 5) perivenulitis de las venas centrales; 6) inflamación del tracto portal; 7) lesiones de los conductos biliares; 8) pérdida de conductos biliares; 9) presencia de ramificaciones de las venas portales; 10) fibrosis portal; 11) fibrosis perisinusoidal. La puntuación detallada empleada para la clasificación se muestra en la Tabla Suplementaria 1. Para la evaluación semicuantitativa del contenido en hierro se empleó el sistema de puntuación modificado de Scheuer y el Resultado Total de Hierro (Total Iron Score, TIS) como se describe (Deugnier et al. Hepatology 1993; Scheuer et al. J Pathol Bacteriol 1962).

Ejemplo 3. Extracción y procesamiento del ARN.

Para la extracción total del ARN, se homogenizaron las muestras de tejido hepático criopreservadas en reactivo TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) utilizando un mortero y tubos de reacción libres de nucleasa de 1,5 ml (Ambion). El ARN total se extrajo entonces siguiendo las guías del fabricante y se evaluó la calidad con el Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, EE.UU.).

Ejemplo 4. Experimentos con el microarray de Illumina.

Se procesaron ciento cinco muestras de ARN hepático (20 TOL, 32 No-TOL, 14 No-TOL-Rej, 12 HEPC, 9 REJ, 8 CONT-Tx y 10 CONT; todas ellas del Hospital Clínic de Barcelona) a ARNc y se hibridaron sobre el Illumina HumanHT12 Expression BeadChips que contiene 48,771 sondas correspondientes a 25,000 genes comentados (Illumina, Inc. San Diego, CA, EE.UU.). Los datos de expresión se calcularon utilizando el software de análisis de datos BeadStudio (Illumina, Inc.) y se procesaron posteriormente empleando la normalización por cuantiles utilizando el paquete bioconductor de Lumi [6]. A continuación, llevamos a cabo un paso conservativo de filtrado de sondas para excluir aquellas sondas con un coeficiente de variación del 5%, lo que resultó en la selección de un total de 33,062 sondas extraídas del grupo original de 48,771.

Ejemplo 5. Experimentos con el microarray de Affymetrix.

En un grupo seleccionado de 10 receptores TOL y 10 receptores No-TOL se repitieron los experimentos con microarray sobre chips Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 que cubren 47,000 genes comentados mediante 54,675 sondas (Affymetrix, Inc, Santa Clara, CA, EE.UU.) y que comprenden sondas de ácidos nucleicos comercialmente disponibles. Se llevaron a cabo experimentos adicionales con Affymetrix empleando el ARN extraído de 4 muestras hepáticas TOL-Post (4 de los 10 receptores TOL cuyo tejido de la biopsia hepática, que se obtuvo 12 meses después de completar la retirada de los fármacos, estaba también disponible). Los datos de la expresión génica se normalizaron utilizando el algoritmo sólido de multiarray por el contenido ajustado de guanidina-citosina, que calcula los valores de expresión a partir de la intensidad de la sonda incorporando información de la secuencia de la sonda. Por lo tanto, empleamos un paso conservativo de filtrado de sondas para excluir las sondas que no alcanzaron un valor de expresión log2 de 5 en al menos una muestra, lo que resultó en la selección de un total de 18,768 sondas extraídas del grupo original de 54,675.

Ejemplo 6. Análisis de datos de la expresión génica por microarray.

Para identificar genes expresados diferencialmente entre los diferentes grupos de estudio con el microarray, empleamos el Análisis de Significancia de Microarray (SAM). SAM utiliza la prueba estadística de la t modificada para cada gen de un grupo de datos y un factor de corrección para calcular el valor de t, controlando así las desviaciones estándar irrealmente bajas para cada gen. Además, SAM permite controlar la tasa de falsos descubrimientos (FDR) seleccionando un umbral para la diferencia entre el resultado actual de la prueba y el resultado obtenido por permutaciones repetidas de los grupos evaluados. Para el presente estudio empleamos la selección SAM utilizando una FDR<10% y 1000 permutaciones. Para representar gráficamente las diferencias en la expresión génica globales entre los diferentes grupos de estudio, se utilizó la lista completa de sondas filtradas para llevar a cabo un análisis de correspondencia como el implementado en la función del análisis-entre-grupos (BGA) incluida en el paquete made4 (Culhane AC, et al. Bioinformatics 2005). Este método es capaz de visualizar datos altamente dimensionales como las mediciones múltiples de la expresión génica en un gráfico 2D en el que las áreas delimitadas por las elipses representan el 95% de la distribución binormal estimada de las puntuaciones de las muestras en el primer y segundo eje. Para determinar si el grupo de genes de interés estaba significativamente asociado con los resultados clínicos (tolerancia vs. rechazo), las variables clínicas (edad del donante y receptor, género, tipo de tratamiento inmunosupresor, tiempo desde el trasplante) y las características histológicas (contenido en hierro), se empleó el software de Globaltest (Goeman, et al. Bioinformatics 2004). Se empleó también una sintaxis dentro de este software para corregir la asociación encontrada entre la expresión génica y los resultados clínicos por los posibles efectos de confusión de las molestas covariables clínicas de las que se encontró que eran estadísticamente diferentes entre receptores tolerantes y no tolerantes.

Ejemplo 7. Experimentos de PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real.

Para validar los resultados de expresión por microarray, se midieron los patrones de expresión de un grupo de 104 genes diana y 3 genes constitutivos (Tabla Suplementaria 1) empleando el sistema de detección de secuencias ABI 7900 y las tarjetas microfluídicas TaqMan LDA (Applied Biosystems, Carlsbad, EE.UU.), que comprenden oligonucleótidos cebadores disponibles comercialmente, sobre un subgrupo de 48 receptores (18 TOL y 31 No-TOL; todos ellos del Hospital Clínic de Barcelona). Además, los experimentos de qPCR se llevaron a cabo en un grupo independiente de 10 receptores TOL y 11 No-TOL proporcionados por la Universidad Tor Vergata de Roma y el Hospital Universitario de Lovaina y cuyos datos del microarray no están disponibles. Los genes diana se seleccionaron basándose en: 1) resultados de los experimentos con el microarray de Ilumina y Affymetrix; 2) biomarcadores transcripcionales sanguíneos previamente descritos por nuestro grupo ya que están asociados con la tolerancia hepática operacional (M. Martínez-Llordella et al. J Clin Invest 2008); y 3) genes inmunorreguladores destacados descritos en la literatura. Se eliminó el ADN del las preparaciones de ARN total utilizando el tratamiento Turbo DNA-free DNAse (Ambion), y se retrotrasncribió el ARN en ADNc utilizando el Kit de Alta Capacidad de Transcripción Inversa ADNc (Applied Biosystems). Para cuantificar los niveles de transcripción de los genes diana se normalizaron los valores Ct con los genes constitutivos para generar valores MCt. Los resultados se calcularon entonces cono la expresión relativa entre el ADNc de las muestras diana y una muestra calibrada de acuerdo con el método MMCt. Los siguientes tres ejemplos se emplearon como calibradores: 1) conjunto de ARNs proveniente de 8 muestras CONT-Tx; 2) conjunto de ARNs proveniente de 10 muestras CONT; y 3) ARN hepático comercialmente disponible (Human Liver Total RNA, Ambion).

Ejemplo 8. Identificación y validación de los clasificadores de genes.

Para desarrollar clasificadores de la expresión génica por qPCR a partir de biopsias para predecir el éxito de la retirada de la inmunosupresión, llevamos a cabo una búsqueda exhaustiva de modelos predictivos empleando el análisis discriminante lineal y algoritmos de regresión logística implementados en el software de penalización posterior de la clasificación errónea (misclassification penalized posterior, MiPP). MiPP se basa en un modelo de clasificación incremental paso a paso para descubrir los modelos diagnósticos más parsimoniosos y emplea una estrategia de doble validación cruzada. En primer lugar, para obtener los modelos óptimos mientras que se evitan los riesgos de una larga búsqueda de cribado, llevamos a cabo un paso de validación cruzada con 10 subconjuntos sobre el grupo de entrenamiento de 18 receptores hepáticos TOL y 31 No-TOL del Hospital Clínic de Barcelona. A continuación, se llevó a cabo una validación cruzada con divisiones aleatorias de los modelos diagnósticos sobre el conjunto completo de datos (que incluía las 56 muestras de Barcelona y 21 muestras de Roma y Lovaina) dividiéndolo repetidamente en grupos de entrenamiento (2/3) y en grupos de evaluación independiente (1/3) para la validación del modelo externo. Para cada modelo identificado en el grupo de entrenamiento el valor de corte para la probabilidad óptima de tolerancia se calculó empleando el análisis ROC. El uso de un gran número de divisiones aleatorias de grupos de pruebas y entrenamiento nos permitió obtener intervalos de confianza de la precisión del diagnóstico. Basándonos en estos intervalos de confianza, la realización del diagnóstico y las tasas medias de clasificación errónea se obtuvieron para cada uno de los clasificadores candidatos. Para demostrar que la interpretación de los modelos no era centro-dependiente, calculamos entonces SN, SP, NPV, PPV y las tasas de error globales para las muestras recogidas de Barcelona y para aquellas obtenidas de Roma y Lovaina.

Ejemplo 9. Mediciones de la hepcidina sérica.

Las muestras séricas se obtuvieron a partir de los 64 receptores de hígado reclutados al inicio utilizando el BD Vacutainer SST II (BD Bioscience, Franklin Lakes, EE.UU.) y almacenado a -80ºC. Las mediciones cuantitativas de hepcidina sérica se llevaron a cabo mediante una combinación de cromatografía de intercambio catiónico débil y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF SM). Para la cuantificación se empleó un análogo de la hepcidina (hepcidina sintética-24; Peptide International Inc.) como estándar interno. El espectro del péptido se generó con una plataforma TOF MScon con ionización/desorción láser asistida por matriz con Microflex LT (Bruker Daltonics). Las concentraciones de hepcidina-25 sérica se expresaron en nmol/l. El límite de detección inferior de este método fue de

0.5 nM; los coeficientes medios de variación fueron 2.7% (intra-ensayo) y 6.5% (inter-ensayo). El nivel medio de referencia de hepcidina-25 sérica es 4.2 nM, con un rango de 0.5 – 13.9 nM.

Ejemplo 10. Ensayo comparativo entre el método para el diagnóstico de la tolerancia en el trasplante de hígado comprendido en el estado de la técnica y el método de la invención.

El método del estado de la técnica comprende la medición en muestras de sangre periférica de la expresión de un grupo de genes (KLRF1, PTGDR, NCALD, CD160, IL2RB, PTCH1, ERBB2, KLRB1, NKG7, KLRD1, FEZ1, GNPTAB, SLAMF7, CLIC3, CX3CR1, WDR67, MAN1A1, CD9, FLJ14213, FEM1C, CD244, PSMD14, CTBP2, ZNF295, ZNF267, RGS3, PDE4B, ALG8, GEMIN7) diferentes de los presentados en la presente invención. Además, este ejemplo muestra que el método de la invención tiene un mayor poder discriminativo.

El método del estado de la técnica da lugar a los siguientes resultados:

A) Combinación de FEM1C e IL8:

SN=63%; SP=80.77%; ER= 7.08%; PPV=77.68%; NPV=72.41%

B) Combinación de KLRF1 y SLAMF7

SN= 27.7%, SP 92.31%, ER= 37.5%, PPV=73.68%, NPV=72.41%

C) Combinación de KLRF1 y IL2RB

SN= 50%, SP= 84.62%, ER=31.25%, PPV= 73.33%, NPV=66.67%

SN: sensibilidad

SP: especificidad

ER: tasa de error

PPV: valor predictivo positivo

NPV: valor predictivo negativo

Sin embargo, el método de la presente invención basado en la medición de los genes comprendidos en las Tablas 3, 4 y 6 en tejido hepático de los mismos 48 pacientes (se seleccionaron los tres mejores modelos realizados para este ensayo comparativo) condujo a los siguientes resultados:

A) Combinación de TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3: SN=77.27%, SP=96.15%, ER=12.5%, PPV=94.44%, NPV=83.33%

B) Combinación de TFRC, PEBP1, MIF, ADORA3: SN=90.91%, SP=84,62%, ER=12.5%, PPV=83.33%, NPV=91.67%

C) Combinación de TFRC, IFNG, HAMP, CDHR2: 5 SN=77.27%, SP=88.46%, ER=16.67%, PPV=85%, NPV=82.14%

SN: sensibilidad SP: especificidad ER: tasa de error

10 PPV: valor predictivo positivo NPV: valor predictivo negativo

Por lo tanto, se concluyó que la medición de la expresión de los genes comprendidos en la presente invención en muestras de tejido hepático, parece ser, al menos, tan precisa como la medición de los genes comprendidos en el 15 estado de la técnica en sangre periférica, para identificar los receptores de hígado que pueden abandonar con éxito la medicación inmunosupresora porque son tolerantes al trasplante.

REFERENCIAS

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Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para el diagnóstico o pronóstico in vitro del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante hepático que comprende:

   a.

   Medición, en una muestra biológica obtenida del aloinjerto hepático del paciente bajo investigación, de los niveles de expresión de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2;

   b.

   Evaluación de la tolerancia o no tolerancia del paciente bajo investigación al trasplante de hígado mediante la comparación del nivel de expresión de al menos uno de los genes o combinaciones de los mismos, del paso a), con el nivel de expresión de los mismos genes o combinaciones de los mismos, obtenido a partir de una muestra de referencia.

2. 2.

   Método, según la reivindicación 1, donde la muestra de referencia es una muestra de ARN seleccionada entre: un conjunto de ARNs obtenido de un tejido hepático no trasplantado sano; un ARN de referencia disponible comercialmente; o un ARN de referencia absoluta que consiste en una muestra que contiene un número previamente cuantificado de moléculas de ARN.

3. 3.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los genes TFRC y MIF están sobre-regulados, y los genes CDHR2, HMOX1, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2 están infraregulados, en receptores de trasplante hepático tolerantes comparado con el nivel de expresión de los mismos genes tomados de la muestra de referencia de ARN.

4. 4.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende la medición de los niveles de expresión de al menos una de las siguientes combinaciones de genes: LC5A12, VNN3, TFRC, SOCS1, MIF, TTC3, RBM23, PEBP1, SH2D1B, NCR1, DAB2 y ADORA3; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, HAMP, TUBA4A, TTC3, HMOX1, VNN3, NCR1, ADORA3, TAF15, IFNG, SOCS1 y TIPARP; MOX1, CDHR2, MIF, PEBP1, TFRC, SLC5A12, SOCS1, HAMP, VNN3 y IFNG; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, SLC5A12, HAMP, SOCS1, IFNG y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, HAMP, MIF, PEBP1, VNN3, SOCS1, HMOX1 y DAB2; TFRC, DAB2, MIF, PEBP1, IFNG, HAMP, SLC5A12, SOCS1, VNN3, ADORA3, CDHR2, MCOLN1 y HMOX1; TFRC, , IFNG, HMOX1, MCOLN1, MIF, HAMP, ADORA3, CDHR2, PEBP1 y SOCS1; EBP1, TFRC, HMOX1, IFNG, MCOLN1, SOCS1, MIF, CDHR2, HAMP y ADORA3; TFRC, PEBP1, IFNG, CDHR2, ADORA3, VNN3, HMOX1, DAB2, SOCS1, MIF y HAMP; DHR2, ADORA3, IFNG, TFRC, VNN3, HMOX1, PEBP1, MIF, SLC5A12, HAMP, SOCS1 y MCOLN1; LC5A12, TFRC, IFNG, MIF, DAB2, HMOX1, CDHR2, SOCS1, HAMP, PEBP1, VNN3, ADORA3 y MCOLN1; TFRC, SOCS1, HMOX1, PEBP1, VNN3, CDHR2, HAMP, IFNG, DAB2, MCOLN1, ADORA3 y MIF; TFRC, PEBP1, VNN3, SOCS1, MIF, HMOX1, DAB2, HAMP, IFNG, CDHR2, ADORA3 y MCOLN1; LC5A12, MIF, CDHR2, TFRC, IFNG, ADORA3, HAMP, VNN3, SOCS1, MCOLN1, PEBP1 y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, PEBP1, VNN3, MIF, HMOX1, MCOLN1, SOCS1, SLC5A12, DAB2 y HAMP; TFRC, VNN3, HAMP, CDHR2, SLC5A12, HMOX1, SOCS1, PEBP1 y MIF; AB2, TFRC, MIF, CDHR2, PEBP1, VNN3, TTC3, HMOX1 y SOCS1; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, VNN3, IFNG, MCOLN1 y SOCS1; TFRC, PEBP1, MIF, SOCS1 y CDHR2.

5. 5.

   Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde se miden los niveles de expresión de la combinación de genes que consiste en TFRC, IFNG y CDHR2.

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que además comprende la determinación de al menos un parámetro adicional útil para el diagnóstico o pronóstico.

7. 7.

   Método según la reivindicación 6 donde este parámetro adicional es el nivel sérico de Hepcidina.

8. 8.

   Método según la reivindicación 6 donde este parámetro adicional es la edad y/o el tiempo tras el trasplante.

   Figura 1 Figura 2 Figura 3

   REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

   La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

   Literatura no patente citada en la descripción