ES2401899A1 - Uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de un medicamento antiviral. - Google Patents
Uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de un medicamento antiviral. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de un medicamento antiviral. La presente invención se refiere al uso de RNAs correspondientes a dominios altamente estructurados de las regiones no codificantes del genoma del virus de la fiebre aftosa (VFA) y al uso de secuencias que los comprenden para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades causadas por virus sensibles a interferón. Los virus sensibles a interferón son virus RNA de cadena simple, como el virus de la fiebre aftosa, el virus de la estomatitis vesicular y el virus del Nilo Occidental. La invención se refiere también a la composición farmacéutica que comprende las regiones no codificantes de la invención y que además comprende al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables, así como también al uso de dicha composición farmacéutica.
Description
Uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de un medicamento antiviral
La presente invención se refiere al uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades causadas por virus sensibles a interferón.
La respuesta inmune innata es la primera línea de defensa frente a la invasión de patógenos basada en diversos mecanismos y rutas de señalización. En el caso de una infección viral, uno de los mecanismos de la respuesta inmune innata es la producción de interferón (IFN) de tipo I (IFN-a e IFN-¡3, o también denominado IFN-a/¡3) que tiene efecto antiviral, antiproliferativo y presenta actividad inmunomoduladora. La producción de IFN de tipo I se produce tras la detección de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS, "pathogen assocíated molecular pattems") presentes en los productos virales que se generan en una infección vírica. Entre los PAMPS se incluyen tanto ácido ribonucléico (RNA) de cadena simple como RNA de doble cadena. Sin embargo, se han descrito virus sensibles a interferón que consiguen evadir este sistema de defensa. Entre los virus sensibles a interferón se encuentran el virus de la fiebre aftosa, el virus de la estomatitis vesicular y el virus del Nilo Occidental (Randall RE et al. 2008. J Gen Virol 89: 1-47).
El virus de la fiebre aftosa (VFA, "foot and mouth disease virus", FMDV,) es un miembro de la familia Picomaviridae que es el causante de la fiebre aftosa (glosopeda) que afecta a humanos (Bauer K 1997 Arch Virol (S) 13:95-97; Hyslop NStG 1976 Boletín de la Oficina Sanitaria Panamericana:375-387) y mamíferos ungulados artiodáctilos, entre ellos rumiantes y cerdos. El VFA es un virus de RNA de cadena simple de aproximadamente 8,5 kilobases (Kb) de longitud que en sus extremos term inales contiene regiones no codificantes (NCR, "non-coding regions') que contienen dominios altamente estructurados formando un RNA de doble cadena. Las NCRs del VFA contienen estructuras específicas que participan en el control de la replicación y la traducción del genoma viral. Entre las regiones no codificantes se sitúan los denominados fragmento S, IRES ("internal ríbosome entry site') y 3'NCR (Witwer CS et al. 2001. Nucleic Acid Res 29:5079-5089; Escarmis CM et al. 1992. Virus Res
26: 113-125; Belsham GJ et al. 2009. Virus Res 139: 183-192).
Se ha demostrado que VFA es sensible a IFN-a, IFN-¡3 e IFN-y pero es capaz de desarrollar mecanismos para evadir la respuesta inmune. La proteasa Lpro es la primera proteína viral que se traduce y bloquea la respuesta innata inmune del hospedador, entre las que se incluye la respuesta mediada por INF. Lpro es capaz de inhibir la inducción del RNA mensajero (RNAm) de IFN-¡3 y la expresión de los genes que estimulan IFN-a/¡3. Este hecho representa un problema para el control de la enfermedad de la fiebre aftosa.
La fiebre aftosa es una enfermedad que constituye un grave problema en el sector de la ganadería. Es una enfermedad altamente contagiosa que se propaga a través de animales infectados, equipos ganaderos, ropa o incluso calzado portador del VFA. Se controla en la actualidad mediante vacunación y medidas preventivas pero una vez contagiados los animales implica su sacrificio y por lo tanto deriva en grandes pérdidas económicas en el sector.
En relación a la vacunación frente al VFA, la inmunidad adaptativa aparece varios días después de la vacunación de los animales, siendo de aproximadamente una semana en el caso de la vacunación tradicional. Esto supone un problema al poder quedar expuestos dichos animales al virus durante el período ventana y ser susceptibles de infección durante ese tiempo. Se han realizado esfuerzos para cubrir esa ventana de susceptibilidad mediante el uso de adenovirus recombinantes defectivos en replicación que expresan IFN-a pero dicha estrategia, además de implicar el uso de un vector viral, no llega a cubrir la ventana de susceptibilidad al VFA en su totalidad ya que se protege de esta manera a cerdos inoculados desde 24 horas postinfección y la protección dura entre 3 y 5 días. Se hace necesaria por lo tanto, una herramienta que cubra la ventana de susceptibilidad frente al virus de la fiebre aftosa previa al desarrollo de una inmunidad adaptativa efectiva en la que los animales infectados son susceptibles a la infección.
El virus de la estomatitis vesicular (VEV, "vesicular stomatitis virus", VSV) es un virus perteneciente a la familia Rhabdovirídae que produce una enfermedad vesicular aguda en bovinos, caballos, ciervos y cerdos. Se ha encontrado evidencia serológica de que infecta otros muchos animales y ocasionalmente infecta también humanos. Hay dos especies principales, denominadas New Jersey e Indiana. Se transmite por picadura de insectos vectores, principalmente las moscas de la arena (Lutzomya sp.), moscas negras (familia Simuliídae) e insectos del género Culícoides. Su genoma está formado por 1112 Kb de RNA de cadena sencilla y polaridad negativa. El VEV también es capaz de evitar la respuesta inmune del hospedador. En el caso de VEV la infección induce el bloqueo general de la expresión génica en la célula hospedadora, que afecta a la producción de IFN y otras moléculas antivirales. Actualmente el control de la enfermedad se realiza utilizando medidas de restricción de movimiento de animales infectados, cuarentena, control de los insectos vectores y vacunación con virus inactivado. Una alternativa capaz de activar una respuesta inmune innata eficaz frente al virus sería de gran utilidad para el control de esta enfermedad.
El virus del Nilo Occidental (VNO, "West Ni/e Virus", WNV), un virus transmitido principalmente por mosquitos y cuyo hospedador natural son las aves, está clasificado dentro de la familia Flaviviridae, junto a otros importantes patógenos animales como el virus de la peste porcina clásica, y humanos como el virus de la hepatitis C, el virus dengue, el virus de la fiebre amarilla (Blitvich BJ 2008. Anim Health Res Rev 9:71-86). El VNO es un virus con envoltura lipídica, cuyos viriones poseen simetría icosaédrica y un diámetro aproximado de 50 nm. Como material genético, el VNO cuenta con una única molécula de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva de unos 11.000 nucleótidos de longitud. El VNO también es capaz de evitar la respuesta inmune del hospedador. El VNO es un claro ejemplo de zoonosis re-emergente, que actualmente constituye un grave problema para la sanidad humana y animal dado que origina meningoencefalitis mortales en humanos, équidos, bóvidos, suidos y aves, en las que en general produce infecciones subclínicas, pero en las que ocasionalmente llega a causar una elevada mortalidad (Granwehr BP et al. 2004. Lancet Infect Dis 4:547-556, Ringia AM et al. 2004 Emerging Infectious Disease 10(6):1120-1123; Komar N. et al. 2003 Emerging infectious Diseases 9(3):311-322; USGS "National Wildlife Health Center" listado de especies afectadas por el VNO 2005). En los últimos años, el número y la gravedad de los casos en humanos y caballos han aumentado considerablemente. En la actualidad como herramientas para el control de la misma únicamente se dispone de una vacuna comercial para équidos basada en el uso de virus inactivado y en el caso de humanos, terapias basadas en la administración de interferón (IFN) o de anticuerpos de forma compasiva (Ng et al. 2003. Dev Biol 114:221-227; Davis et al. 2006. Ann Neurol 60:286-300) que no son suficientes para el control de la enfermedad, por lo que se hace necesario una alternativa eficaz para la profilaxis y/o el tratamiento de la enfermedad del Nilo Occidental.
La presente invención se refiere al uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades causadas por virus sensibles a interferón.
Con el fin de evaluar el potencial antiviral de las regiones no codificantes del genoma del virus de la fiebre aftosa (VFA), en la presente invención se procedió a generar mediante transcripción in vitro RNAs sintéticos no codificantes análogos de dichas regiones, los ncRNAs de la invención.
Los virus sensibles a interferón para los que se ha demostrado que son sensibles a la respuesta inmune innata inducida por los ncRNAs de la presente invención son virus de las familias Picomavirídae, Rhabdoviridae y Flaviviridae. Dentro de la familia Picomaviridae se eligió al virus de la fiebre aftosa, en la familia Rhabdoviridae se eligió el virus de la estomatitis vesicular, mientras que de la familia Flaviviridae se eligió el virus del Nilo Occidental como los más representativos de dichas familias para la realización de los ensayos que demuestran la actividad de los ncRNAs de la invención.
Con los ncRNAs utilizados en la invención, se realizaron estudios in vitro e in vivo en los que se detectó la producción de RNA mensajero (RNAm) de IFN-a o IFN-¡3 y respuesta antiviral. Además también se realizaron ensayos de supervivencia frente a desafío viral en un modelo de ratón lactante. En los ensayos se comparó el efecto con un conocido estimulador de interferón, el poly I:C (Richmond JY et al. Proc Natl Acad Sci USA 1969. 64: 81-86) y se demostró que la actividad estimulante de la respuesta inmune innata de los ncRNAs de la invención es superior a este control.
Los resultados obtenidos con los ncRNAs de la invención muestran que estos ncRNAs estimulan la producción de IFN en células transfectadas. Además, los niveles de inducción del RNAm de IFN correlacionan con actividad antiviral frente al virus de la estomatitis vesicular (VEV). En estudios de desafío viral, los ncRNAs de la invención protegen frente al virus de la fiebre aftosa así como frente al virus del Nilo Occidental, siendo la secuencia IRES del VFA la que mejor protección ofrece en ambos casos mientras que las regiones S y 3'NCR de dicho virus ofrecen una menor protección. Por otra parte, la producción de IFN ocurre en las primeras horas tras la transfección y la actividad antiviral frente al VEV es detectable a las 12 horas post infección, lo que convierte a los ncRNAs de la invención en una herramienta eficaz para el tratamiento de enfermedades causadas por los virus sensibles a IFN ya que los ncRNAs de la invención activan la respuesta inmune innata de manera rápida. Los resultados obtenidos en la presente invención muestran el potencial uso de los ncRNAs de la invención para la elaboración de un medicamento antiviral frente a virus sensibles a IFN. Los ncRNAs de la invención pueden ser de gran utilidad en combinación con vacunas frente a las enfermedades causadas por virus sensibles a IFN para cubrir su ventana de susceptibilidad.
Por todo lo aquí descrito, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de una composición farmacéutica.
En la presente invención se entiende como "región no codificante" (NCR, "nancadíng regían", "untranslated regían" o UTR) aquella región del genoma del virus de la fiebre aftosa situada en sus extremos terminales (5' y 3') que contiene dominios altamente estructurados formando un RNA de doble cadena y que no codifica para ninguna proteína. Entre las regiones no codificantes se sitúan los denominados fragmento S, IRES ("ínternal ríbasame entry síte') en el extremo 5', en la denominada 5'NCR y en el extremo 3' se sitúa la región 3'NCR.
En la presente invención se utilizan RNAs obtenidos mediante transcripción ín vítro de las regiones S e IRES de la 5'NCR y a la región 3'NCR de virus de la fiebre aftosa. En adelante nos referiremos a las regiones S e IRES del extremo 5' ya la región 3'NCR del VFA como a las "NCRs de la invención" o "regiones no codificantes de la invención", mientras que nos referiremos a los RNAs obtenidos mediante transcripción ín vítro de dichas regiones como a los "ncRNAs de la invención" (RNAs no codificantes de la invención).
El término "composición farmacéutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición que comprenda al menos los ncRNAs o las NCRs de la invención. La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones farmacéuticas, entre ellas vacunas yantivirales. La combinación de dicha composición farmacéutica con vacunas o antivirales podría hacer más efectiva la respuesta inmune que generan, actuando así como adyuvante. El término composición farmacéutica y medicamento se utilizan en esa invención de manera indistinta. En el contexto de la presente invención el término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica empleada para provocar una respuesta del sistema inmune a la enfermedad causada por un virus. Es un preparado de antígenos que, una vez dentro del organismo, provoca la respuesta del sistema inmunitario mediante la producción de anticuerpos, y genera memoria inmunológica produciendo inmunidad permanente o transitoria.
En la presente invención el término "antiviral" se refiere a cualquier sustancia que no permita la replicación, ensamblaje o liberación de virus, como por ejemplo interferón, ribavirina, etc.
Los ncRNAs de la invención han demostrado ser capaces de inducir actividad antiviral frente a virus sensibles a INF, como son el VFA, el VEV, y el VNO.
Por dicho motivo, un segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de una región no codificante del genoma del virus del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades causadas por virus sensibles a interferón.
"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al profiláctico o medidas preventivas. Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento.
Se entiende por "virus sensible a interferón" aquél virus cuya replicación se ve afectada o interrumpida por el interferón secretado por las células del hospedador.
El interferón es una citoquina secretada por diversas células, entre ellas las células del sistema inmune, que tiene efecto antiviral. De los grupos de interferones, son el alfa y el beta los que se inducen generalmente en respuesta a infección viral, por dicho motivo en la presente invención "interferón" se refiere a IFN-a o IFN-¡3.
El virus de la fiebre aftosa (VFA, "foot and mouth disease virus", FMDV) es el virus causante de la fiebre aftosa. Pertenece a la familia Picomaviridae (género Aphthovirus) y su genoma es un RNA de cadena simple. Se han descrito siete serotipos distintos con múltiples subtipos y variantes, el serotipo O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 Y SAT3. Los aislados utilizados en la presente invención son el 01 K, perteneciente al serotipo O (el genoma de aislados de linaje 01, 01 c Y 01 K se encuentra recogido en los números de acceso de Genbank D1 0138 Y X00871) y el aislado C-S8c1 de serotipo C (genoma en número de acceso de Genbank AJ133357). La longitud de las regiones NCRs en los distintos aislados varía y la homología es de un 80% para la región S, un 85% para la región 5'NCR que comprende IRES además de fragmentos de otras regiones y de un 82% para la región 3'NCR, por lo que las regiones no codificantes del VFA presentarían al menos un 80% de homología entre los diferentes serotipos (Carrillo et al. 2005. J ViroI79:6487-6504).
Los ncRNAs utilizados en la invención corresponden a las regiones S e IRES del extremo 5' y a la región 3'NCR. Los ncRNAs utilizados en la invención constituyen un material no infeccioso de fácil producción y manipulación biotecnológica. Los resultados obtenidos con los ncRNAs utilizados en la presente invención demuestran el potencial uso de regiones no codificantes del VFA para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades causadas por virus sensibles a interferón.
En la región no codificante del extremo 5' (5'NCR) del genoma del VFA se encuentra el fragmento S. El fragmento S abarca 366 nucleótidos 5'-terminales del RNA y se predice su plegamiento en una estructura secundaria tipo horquilla ("hairpin'') largo y estable (comprendido en la secuencia de acceso en GenBank X00871). Al fragmento S le sigue una región poli C ("heteroplolymeríe poli e traef', Cn), varios pseudonudos (pseudoknots, Pk), el elemento de replicación ere ("cís-aetíng replieatíon element') y el sitio de entrada interna de ribosomas (IRES, "internal ribosome entry site') (Fig. 1). El IRES es una región de 454 nucleótidos estructurada en múltiples dominios que media la traducción cap-independiente del genoma viral (comprendida en la secuencia de acceso en GenBank AJ133357). Por otra parte, en el extremo 3' del genoma viral también se sitúa una región no codificante denominada 3'NCR. La 3'NCR incluye 90 nucleótidos desde el codón de term inación de la fase de lectura abierta del RNA viral y una cola de poli A de longitud variable, donde dicha longitud aumenta con el curso de la infección (los 90 nucleótidos sin la cola poli A están comprendidos en la secuencia de acceso en GenBank X00871). El 3'NCR del VFA se ha visto que ejerce efecto activador de la traducción dependiente de IRES y que es capaz de interaccionar con las regiones IRES y S localizadas en el extremo 5' mediante interacciones directas RNA-RNA.
En la presente invención se han generado mediante transcripción in vitro análogos de las NCRs del VFA. Debido a las estrategias conocidas por cualquier experto en la materia que se derivan de los métodos biotecnológicos utilizados en dicha transcripción in vitro (como por ejemplo el uso de un DNA complementario insertado en el plásmido utilizado en la transcripción, el clonaje y el uso de enzimas de restricción), los ncRNAs de la invención contienen en sus extremos terminales nucleótidos extra. Los ncRNAs de la invención son regiones no codificantes que son análogos funcionales de las NCRs de la invención.
El término "análogo" se refiere a una región de igual función pero de diferente secuencia. En la presente invención se refiere a que los ncRNAs tienen la misma función que las regiones NCRs, comprenden la secuencia del NCR pero contienen más nucleótidos provenientes de la estrategia biotecnológica utilizada para su síntesis.
Los nucleótidos "extra" a los que se refiere la presente invención son los ribonucleótidos no presentes en las NCRs del VFA pero que son fruto de las estrategias biotecnológicas utilizadas en la presente invención para la generación de los ncRNAs. Estos nucleótidos extra se pueden incorporan a las NCRs del VFA por el uso, por ejemplo, de una RNA polimerasa, por ser nucleótidos presentes en el plásmido en el que está clonado el DNA complementario utilizado para la transcripción in vitro o por introducirse en la secuencia para generar dianas de restricción para favorecer las estrategias biotecnológicas.
Una "diana de restricción" (o sitio de restricción) es una secuencia reconocida por una enzima de restricción, es decir, se refiere a un sitio o lugar que reconoce una endonucleasa que es capaz de cortar los enlaces fosfodiéster de la cadena de nucleótidos generando un corte en la cadena del ácido desoxirribonucléico (ADN). En la presente invención se refiere a una secuencia reconocida por una enzima de restricción que es capaz de cortar los enlaces fosfodiéster del DNA complementario utilizado para la transcripción in vitro. Por ejemplo secuencias reconocidas por las enzimas de restricción Stu I y EcoRV.
El ncRNA de la región 3'NCR del VFA (SEQ ID NO: 1) contiene 188 ribonucleótidos de los cuales los 15 primeros y los 16 últimos corresponden a nucleótidos no presentes en la 3'NCR del VFA y que son fruto de las estrategias biotecnológicas utilizadas para su generación. Además contiene tres ribonucleótidos adicionales que se han introducido para generar sitios de restricción que permiten su manipulación biotecnológica y que no afectan a la estructura secundaria que se genera en el 3'NCR y por lo tanto a su función. Es el caso del uracilo de la posición 36 que deriva de una timina en el clon de DNA molde que genera una diana de restricción para la enzima Stu I (AGGCCT) y el caso de la guanina de la posición 108 Y del uracilo de la posición 110, derivados de una guanina y una timina en el clon molde que generan una diana de restricción para EcoFN (GATATC). De modo que la región 3'NCR del VFA a la que se refiere la presente invención se considera como la región comprendida entre el nucleótido 23 y el 114 descritos en la SEO ID NO: 1 (donde dichos nucleótidos están también incluidos) en la que no están presentes los nucleótidos 36, 108 Y 110. Por otra parte, el ncRNA de la región S del VFA (SEO ID NO: 2) contiene 404 ribonucleótidos de los cuales los 20 primeros y los 18 últimos corresponden a nucleótidos no presentes en la secuencia S del VFA y que son fruto de las estrategias biotecnológicas utilizadas para su generación. De modo que la región S del virus de la fiebre aftosa a la que se refiere la presente invención es la secuencia comprendida entre (e inclusive) el nucleótido 21 y el 386 descritos en la SEO ID NO: 2. En el caso del ncRNA de la región IRES del VFA (SEO ID NO: 3), éste contiene 476 ribonucleótidos de los cuales los 14 primeros y los 8 últimos corresponden a nucleótidos no presentes en el IRES del VFA y que son fruto de las estrategias biotecnológicas utilizadas para su generación. De modo que la región IRES del virus de la fiebre aftosa a la que se refiere la presente invención es la secuencia comprendida entre (e inclusive) el nucleótido 15 y el 468 descritos en la SEO ID NO: 3.
En la presente invención el térm ino "región", "secuencia" o "secuencia nucleotídica" se utilizan indistintamente en la memoria.
Por lo expuesto anteriormente, una realización preferida del primer y segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de una región no codificante del genoma del VFA donde dicha región no codificante está comprendida en la secuencia nucleotídica que se selecciona de la lista que comprende: SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3 o cualquiera de sus combinaciones. Donde la SEO ID NO: 1 comprende la región 3'NCR del VFA, la SEO ID NO: 2 comprende la región o fragmento S del VFA, la SEO ID NO: 3 comprende la región IRES del VFA.
Una realización más preferida se refiere al uso donde la secuencia es SEO ID NO: 1.
Otra realización más preferida se refiere al uso donde la secuencia es SEO ID NO: 2.
Otra realización más preferida se refiere al uso donde la secuencia es SEO ID NO: 3.
La presente invención también se refiere al uso de otras NCRs o ncRNAs de otros aislados de virus. Por este motivo y por lo expuesto anteriormente, la presente invención también se refiere al uso de las regiones no codificantes de la invención y a los ncRNAs de la invención donde la región no codificante se refiere a una región con una homología de al menos un 80% con dicha región.
La presente invención también se refiere a las NCR o a las ncRNAs de la invención que por estrategias biotecnológicas conocidas por cualquier experto en la materia tienen modificada su secuencia, por ejemplo por la generación dianas de restricción, pero donde dichas modificaciones no afectan significativamente a la estructura secundaria del RNA.
Es conocido por cualquier experto en la materia que los virus cuyo genoma es un RNA de cadena simple son más sensibles a IFN que los virus con DNA. Se han descrito diversos virus que son sensibles a interferón, entre ellos se incluyen miembros de las familias Pícomavírídae, Flavívírídae y Rhabdovírídae, por ejemplo el virus de la fiebre aftosa, el virus de la fiebre del Nilo Occidental y el virus de la estomatitis vesicular. A pesar de presentar sensibilidad a INF, muchos virus son capaces de desarrollar mecanismos para evitar esta respuesta inmune innata, como sucede en el caso del VFA, del VEV y del VNO (Randall R E et al. J Gen Virol 2008. 89: 1-47). La presente invención demuestra que el uso de los ncRNAs de la invención es útil como antiviral incluso en virus que presentan dichos mecanismos de evasión.
Por lo aquí descrito, una realización aún más preferida se refiere al uso donde el virus sensible a interferón es un virus RNA de cadena simple. Preferiblemente, el virus es un virus de la familia Pícomavírídae, más preferiblemente el virus de la fiebre aftosa. Preferiblemente también el virus es un virus de la familia Rhabdovírídae, más preferiblemente se refiere al virus de la estomatitis vesicular. Y también preferiblemente el virus es un virus de la familia Flavívírídae, donde dicho virus es preferiblemente el virus del Nilo Occidental.
Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al uso donde dichas enfermedades son enfermedades en animales mamíferos no humanos. Preferiblemente animales ungulados, más preferiblemente de la familia Suídae (por ejemplo del género Sus, por ejemplo S. scrofa), de la familia Bovídae o de la familia Equídae. También la presente invención se refiere al uso en aves, preferentemente de las familias de aves que se seleccionan de la lista que comprende: Phasíanídae, Corvídae, Paserídae, Fríngíllídae y Turdídae (pertenecientes a los ordenes Paseriformes y Galliformes), así como de las familias Accípítrídae y Strígídae, entre otras.
Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al uso donde dichas enfermedades son enfermedades en humanos. Las enfermedades pueden ser enfermedades zoonóticas.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica del primer o segundo aspectos de la invención que además comprende al menos un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptables.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de la composición farmacéutica que comprende la NCR o el ncRNA de la invención, la estabiliza o ayuda en su preparación en el sentido de darle una consistencia, forma, sabor o cualquier otra característica funcional específica. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
Un "vehículo farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención y cuya función es facilitar la incorporación del fármaco así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
Por lo aquí descrito, una realización preferida del tercer aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que además comprende al menos otro principio activo.
Como se emplea aquí, el término "principio activo" ("sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo") significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. La composición farmacéutica o medicamento proporcionado por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. Por dicho motivo, una realización preferida por este aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica donde dicha composición farmacéutica se presenta en una forma adaptada a la administración por vía oral, parenteral o intradérmica.
La presente invención también se refiere al uso de la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para la elaboración de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades causadas por virus sensibles a interferón.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Motivos estructurales en las NCRs del genoma de VFA.
Representación esquemática de los motivos en las 5'y 3'NCRs del VFA. NCR, región no codificante; S, fragmento S; IRES, "ríbosome entry síte"; VPg, "genome línked víral proteín"; Cn, región poli C; Pk, región de "pseudoknots"; cre, el elemento de replicación en cís ("cís-actíng replícatíon element'); Lpro, proteasa "Ieadef'; 3Dpol, polimerasa 3D; SL1, "stem-Ioop 1"; SL2, "stem-Ioop 2"; 3'NCR, 3' "non codíng regíon"; Mn, transcrito 3'NCR al que se ha eliminado la cola poli A.
Fig. 2. Inducción de IFN-f3 en células porcinas. Muestra la producción de IFN-f3 por los ncRNAs de la invención del VFA en células porcinas. Células SK6 se transfectaron con 20 !-Ig/ml de los transcritos NCR o con 10 !-Ig/ml del control poly I:C o el control negativo tRNA (RNA transferente). Los niveles de inducción del RNAm de IFN-f3 en células transfectadas respecto a las células transfectadas con tampón fosfato salino (PBS) a los tiempos indicados se determinaron mediante RT-qPCR (RT-PCR cuantitativa) normalizada respecto a GAPDH. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media de tres experimentos independientes realizados en triplicado. IFN-f3, RNA mensajero del IFN-f3 porcino; T, tiempo; h, horas.
Fig. 3. Análisis de la contribución de las secuencias de la 3'NCR de VFA en la inducción de IFN-f3. Muestra la producción de IFN-f3 por la región 3'NCR de VFA y fragmentos de la misma en células porcinas. RNAs correspondientes al SL1, SL2, 3'NCRilAn así como 3'NCR RNAs (20 !-Ig/ml) tratados o no con CIP y poly I:C (10 !-Ig/ml) se transfectaron en células SK-6. Los niveles de inducción del RNAm de IFN-f3 en células transfectadas respecto a las células transfectadas con PBS a los tiempos indicados se determinaron mediante RTqPCR normalizada respecto a GAPDH. Las barras de error muestran la desviación estándar de la media entre triplicados. IFN-f3, RNA mensajero del IFN-f3 porcino; T, tiempo; h, horas; SL1, "stem-Ioop 1"; SL2, "stem-Ioop 2"; 3'NCR, 3' "non codíng regíon"; !J.An, transcrito 3'NCR en el que se ha eliminado la cola poli A; 3'NCR+CIP, 3'NCR que ha sido tratado con fosfatasas.
Fig. 4. Inducción de un estado antiviral en células transfectadas con los NCR RNAs. Muestra el efecto antiviral frente al virus de la estomatitis vesicular en células porcinas. Tras 24 h de transfección con 40 !-Ig/ml de los transcritos correspondientes a las NCRs de VFA, o 10 !-Ig/ml de tRNA, células SK-6 fueron infectadas con VEV (multiplicidad de infección (MOI)= 1). Los sobrenadantes de las células infectadas se recogieron a 12 y 24 h postinfección y los títulos virales se determinaron en células IBRS-2. Las barras indican los valores medios de dos experimentos independientes realizados por triplicado más las desviaciones estándar. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA y test de Bonferroni (* p<0.05, ** p<0.01). T, tiempo post infección; h, horas; log10pfu/ml, titulación viral medida en log10 de las unidades formadoras de placas (ufp, "plaque forming unit", pfu) por mililitro; mock, control de transfección.
Fig. 5. Las NCRs de VFA inducen la respuesta innata en ratón lactante. Muestra la producción de IFN-~ por los ncRNAs de la invención en ratones lactantes. Grupos de 4 a 5 ratones lactantes Swiss fueron inoculados intraperitonealemnte (i.p.) con 100 !-Ig de transcritos 3'NCR, S, IRES o poly I:C. Los niveles de IFN-a (A).e IFN-~ (B) en "pools" de suero extraído a distintos tiempos postinoculación para cada RNA fueron determinados por ELlSA. Los valores promedio de IFN-q e IFN-~ para "pools" de suero a O h postinoculación fueron de 25 y 6 pg/ml, respectivamente.
EJEMPLOS ILUSTRATIVOS DE LA INVENCiÓN
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1: Las NCRs del genoma de VFA contienen PAMPs (patrones moleculares asociados a patógenos) que activan la señalización de la respuesta innata.
Se analizó inicialmente la capacidad de inducir la expresión de IFN-¡3 en células porcinas de elementos altamente estructurados de las regiones 5' y 3'NCRs del RNA de VFA. Se sintetizaron mediante transcripción in vitro RNAs correspondientes a las 5'y 3'NCRs y al fragmento S e IRES del virus de la fiebre aftosa (Fig. 1). Los ncRNAs del VFA se utilizaron para transfectar células SK-6 (células porcinas de riñón) (Fig. 2). La inducción de expresión del RNAm de IFN-¡3 se analizó por RT-PCR cuantitativa en tiempo real a tres tiempos distintos (Fig. 2) utilizando el cebador sentido que se muestra en la SEO ID NO: 4 y el cebador antisentido que se muestra en la SEO ID NO: 5. Se observaron diferencias destacables entre los distintos RNAs. A los tres tiempos el 3'NCR fue el inductor transcripcional de IFN-¡3 más potente de todos, alcanzando niveles de casi 200 veces por encima de las células control de transfección a 9 h postransfección. El fragmento S indujo niveles 10 veces superiores al control seguido de la 5'NCR completa. Para el transcrito correspondiente al IRES se detectaron inducciones de 4.5 veces, ligeramente superiores al poly I:C. Estos resultados sugieren que las estructuras presentes en la 3'NCR son reconocidas más eficientemente que las de la 5'NCR por los sensores virales presentes en células porcinas y que el fragmento S es el principal elemento inductor en la 5'NCR en estas células.
EJEMPLO 2: Análisis de las características del 3'NCR del VFA relevantes para la inducción de IFN-~.
La contribución de las distintas estructuras presentes en la 3'NCR y del poli A del VFA a la inducción del RNAm de IFN-¡3 se analizó mediante transfección en células SK-6 de los transcritos correspondientes (Fig. 1 Y 3). Ninguno de los dos "stem-Ioops" presentes en la 3'NCR, SL 1 (SEO ID NO: 6) y SL2 (SEO ID NO: 7) fueron capaces de inducir niveles detectables de IFN-¡3, siendo mínimamente activos (Fig. 3). Sin embargo, la 3'NCR con la cola de poli A eliminada (3'NCR {J.An, SEQ ID NO: 8) todavía fue un potente activador, reduciéndose sólo entre 2-10 veces según el tiempo post-transfección analizado (Fig. 3). Los niveles de activación detectados no correlacionaron con
5 el tamaño o la molaridad de los RNAs transfectados. El papel en inducción del extremo 5'-trifosfato en el RNA se analizó mediante tratamiento con fosfatasa alcalina (CIP). El efecto de este tratamiento redujo considerablemente los niveles de inducción a 9h postransfección, aunque todavía se detectaron inducciones de 20 veces respecto a células control.
10 EJEMPLO 3: Los elementos "PAMP" del genoma de VFA estimulan la inmunidad innata y respuesta antiviral en células porcinas
Para determinar si la inducción de RNAm de IFN-13 observada en células SK-6
15 transfectadas con los elementos S, IRES y 3'NCR del VFA se correspondía con la activación de un estado anti-viral en las células, se analizó la actividad antiviral en los sobrenadantes de transfección, incubando con ellos células IBRS-2 (células porcinas de riñón) (Tabla 1). Tras 24 horas, las células se infectaron con el VEV. En todos los casos se detectó actividad antiviral (Tabla
20 1), excepto en los controles (células transfectadas con poly I:C o tRNA, donde el resultado fue el mismo para ambos casos), y los niveles de inhibición de infección de VEV correlacionaban bien con los niveles de RNAm de IFN-13 inducidos por cada RNA. El tratamiento de los sobrenadantes de transfección con anticuerpos monoclonales específicos bloqueantes de IFN-a, -13 confirmó
25 que la actividad antiviral observada está mediada principalmente por IFNs.
Tabla 1. Actividad antiviral en células porcinas transfectadasa
Actividad antiviral
- RNA
- Sobrenadante sin tratar Anticuerpo monoclonal anti-IFN-a. Anticuerpo monoclonal anti-IFN-p Anticuerpo monoclonal anti-IFN-a.+p
- VFA 3'NCR
- 27 <2 6 <2
- VFAS
- 13 3.8
VFA IRES 9
Poly I:C o tRNA <2 NA NA NA
a Las células SK-6 se transfectaron durante 24 h con 40 !-Ig/ml de los ncRNAs,
o 10 !-Ig/ml de poly I:C o tRNA. La actividad antiviral se expresa como el recíproco de la dilución más alta de los sobrenadante de células SK-6 transfectadas necesaria para reducir el número de placas de VEV sobre células IBRS-2 en un 50%. Los datos son la media de duplicados de tres experimentos de transfección independientes. En algunos casos, los sobrenadantes fueron incubados previamente durante 1 h a 37 oC con 1 !-Ig/ml de anticuerpos monoclonales neutralizantes frente a IFN-a, -~ o ambos, respectivamente. -, no determinado. NA, no aplicable.
Por otro lado se estudió la actividad antiviral inducida sobre las propias células SK-6 transfectadas con los distintos RNAs, infectándolas con VEV a una MOl de 1. A 12 Y 24 h post infección, se recogieron sobrenadantes y se determ inó el título viral mediante un plaqueo sobre células IBRS-2 (en la Fig. 4 se muestran 5 los resultados a las 12 y 24 horas post infección). En las células tratadas con los RNAs el rendimiento viral se había reducido en 3 lag respecto al observado en las células transfectadas control (con tRNA-o con PBS, "mock"). A 12 h post infección los títulos de VEV mostraban diferencias de 5.5 veces (aunque no significativas) entre las células tratadas con el elemento 3'NCR respecto a las
10 demás, mientras que a las 24 horas los títulos virales fueron más similares.
Estos resultados sugieren que todos los elementos NCR RNAs utilizados, aún induciendo la transcripción de IFN-¡3 a distintos niveles, son capaces de alcanzar el nivel umbral de inducción necesario para desencadenar en las
15 células porcinas transfectadas una respuesta anti-viral efectiva, tanto autocrina como paracrina.
EJEMPLO 4: La inoculación de los elementos "PAMP" del genoma de VFA induce una respuesta inmune innata en ratones lactantes
20 Para determinar si los elementos "PAMP" del genoma de VFA eran capaces de inducir una respuesta antiviral in vivo, los transcritos correspondientes a las regiones S, IRES y 3'NCR del VFA se inocularon por vía intraperitoneal a camadas de ratones Swiss de 5-7 días de edad. Como control se inoculó poly I:C, un compuesto sintético para el que ya se había descrito un efecto en la inducción de respuesta inmune.
5 Los niveles de IFN-a e IFN-¡3 en muestras de suero recogidas a 4, 8, 24 Y 48 horas post-inoculación para cada grupo de ncRNA se analizaron por ELlSA (Fig. 5 A Y 5 B). Todos los elementos ensayados resultaron ser potentes inductores de IFN-a/¡3 en ratón lactante, incluso aquellos que en células porcinas en cultivo habían inducido unos niveles bajos de expresión de RNAm
10 de IFN-¡3.
Los picos de IFN-a en suero se detectaron a las 8 h tras la inoculación de los elementos 3'NCR e IRES, mientras que para el S los niveles de IFN-a se mantenían altos durante más tiempo, con un máximo a las 24 h post
15 inoculación (Fig. 5 A). Comparando los niveles de IFN-a a 8 h post-inoculación, los elementos RNA del genoma de VFA indujeron entre 15 y 40 veces más que el poly I:C, mientras que a las 24 h post-inoculación, los niveles inducidos por S fueron 90 veces superiores a los inducidos por el poly I:C. Este patrón se repitió en la cinética de IFN-¡3 (Fig. 5 B).
20 La relevancia biológica de estos niveles de IFN-a/¡3 detectados por ELlSA en suero se comprobó mediante un ensayo de inhibición de la infectividad de VEV en células L-929 (Tabla 2), observándose una buena correlación entre los dos ensayos, tanto en los niveles como la cinética.
Tabla 2. Actividad antiviral en el suero de los ratones lactantes transfectados8
h postinoculación
- RNA
- 4 8 24 48
- S
- 2 128 162 <2
- IRES
- 64 128 8 <2
- 3'NCR
- <2 32 <2 NR
Poly I:C 8 8 <2 <2
aGrupas de 4-5 ratones fueron inoculados con 100 I-Ig de ncRNAs de VFA
o poly I:C. Los sueros se recogieron y mezclaron, a los tiempos postinoculación indicados, para cada RNA. La actividad antiviral se expresa como el recíproco de la dilución más alta de suero capaz de suprimir el efecto citopático inducido por VEV en células L-929 en el 50% de los pocillos. No se detectó actividad antiviral en los pooles de suero recogidos a Oh postinoculación « 2). NR, no realizado.
En conjunto estos resultados indican que los transcritos de RNA correspondientes a los elementos estructurales presentes en las NCRs de los extremos 3' y 5' del genoma de VFA pueden estimular una respuesta inmune innata e inducir un estado antiviral in vivo.
5 EJEMPLO 5: Supervivencia frente al desafío con VFA o con VNO. Para determinar cuál de los ncRNAs del VFA es el que mayor protección induce frente a desafío viral con VFA o con VNO, se procedió a realizar ensayos de protección en ratón lactante basados en la inoculación
10 intraperitoneal (i.p.), e intracraneal (i.c.) e i.p. en el caso del VNO, de los ncRNAs y posterior infección con distintas dosis infectivas de los virus (VFA o VNO) que originan la muerte de los ratones a dosis y tiempos establecidos previamente. El efecto protector de la inoculación con los ncRNAs se establece por comparación con el grupo control de animales inoculados con tampón
15 fosfato salino (PBS). En el caso del VNO también se incluyeron grupos control que fueron inoculados con PBS y desafiados con las mismas cantidades de virus que habían sido previamente incubadas (dilución 1: 1) durante 1 hora a temperatura ambiente con una mezcla de sueros de ratones supervivientes a la infección cuya capacidad protectora frente a la infección con el VNO era
20 conocida (Alonso-Padilla et al. 2011 Vaccine 29: 1830-1835), y grupos sin tratar que fueron inoculados i.c. con PBS como control de buena manipulación.
5.1. Efecto protector de los ncRNAs de VFA frente a infección con VFA Los resultados de supervivencia frente a las distintas diluciones ensayadas se
25 muestran en la Tabla 3. Brevemente, el efecto protector de los distintos ncRNAs en comparación con el del poly I:C fue gradual. El efecto del 3'NCR y
el poly I:C fue similar. De 8 x 103pfu (dilución 10-3) en adelante el poly I:C fue mejor; por debajo de esa dosis (10-4 en adelante) fueron equivalentes en protección. La inoculación del RNA S indujo un mayor efecto protector, con el 50% de los animales vivos hasta el día 11 post infección (p. i). de la dilución 105 2, igual que el poly I:C. Sin embargo, a dosis superiores de virus el RNA S protegió al 50% de los animales incluso frente a preparación de virus sin diluir (8 x 106 pfu), mientras que el poly I:C dejó de proteger a la dilución 10-1. Los mejores resultados de protección se obtuvieron al inocular el IRES, con protección total (100%) frente a VFA hasta la dilución 10-2 Y del 90% a dosis 10 superiores hasta virus sin diluir, indicando que incluso con dosis de virus muy superiores a los niveles fisiológicos, el VFA sólo es capaz de matar a un 10% de los animales inoculados con este RNA. Ningún animal del grupo control sobrevivió a partir del día 1 p. i. con la dilución 10-2. Es interesante el efecto "meseta" observado para los RNAs con mayor capacidad de protección (S e
15 IRES). Con estos RNAs parece establecerse una barrera antiviral que la infectividad del virus es incapaz de superar, alrededor del 50% para el S y del 10% para eIIRES.
Los valores de LOso (dosis letal-50/ml) que se muestran en la Tabla 3
20 corresponden a la dilución de la preparación viral utilizada necesaria para matar al 50% de los animales inoculados en cada caso. Para el S e IRES, al no existir una dilución a la que el virus mate un porcentaje de animales> 50% sólo se indica que es < 10°.
25 Tabla 3. Supervivencia de ratones lactantes inoculados con los ncRNAs a 11 días postinfección con el VFA.
RNA Dilución Porcentaje de
O (5/10) 50 -1 (4/8) 50
S < 10°
- -
- 2 (7/12) 58 -3 (10/11 ) 90
- -
- 4 (12/12) 100 -5 (11/11) 100
O (9/10) 90
- -
- 1 (7/8) 87,5
- -
- 2 (10/10) 100
IRES < 10°
- -
- 3 (10/10) 100 -4 (10/10) 100 -5 (9/9) 100
- -
- 1 (0/8) O -2 (1/10) 10 3'NCR -3 (6/11 ) 54 9 x 10-3 -4 (5/5) 100 -5 (4/4) 100
O (1/10) 10
- -
- 1 (0/10) O
- -
- 2 (7/11 ) 64
Polyl:C 7 x 10-2
- -
- 3 (7/8) 87,5 -4 (12/12) 100 -5 (8/8) 100
- -
- 2 (0/9) O -3 (1/24) 4 PBS -4 (7/25) 28 5 x 10-5 -5 (18/27) 67 -6 (9/9) 100
PBS+LP* I -4 (0/6) O
* Lipofectina; LO, dosis letal. -1, dilución 10-1. -2, dilución 10-2. -3, dilución 10-3. 4, dilución 10-4. -5, dilución 10-5.
5.2. Efecto dosis 5 Se realizó un experimento de inoculación con dosis inferiores a la utilizada habitualmente (100 I-Ig) con el ncRNA que mostró una mayor capacidad de protección, el IRES utilizando una dosis elevada de virus. Los animales se inocularon intraperitonealmente, como se describe anteriormente, con el RNA y 24 h después con la dilución 10-2, equivalente a 8 x 104 ufp (unidades
formadoras de placa) de VFA. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Efectivamente, se observó un efecto dosis en la protección, con un descenso muy leve (90%) con 50 I-Ig de RNA y mayor, un 10% con 1 I-Ig. Este resultado confirma la especificidad de la protección observada con los ncRNAs y la idoneidad de la dosis de 100 I-Ig utilizada en los ensayos.
Tabla 4. Supervivencia de ratones lactantes inoculados con distintas dosis de
IRES del VFA a día 11 postinfección con VFA
50l-lg 10 I-Ig 5 I-Ig 1 I-Ig
su pervivientesli nocu lados
(9/10) (3/10) (4/10) (1/10)
Porcentaje de supervivencia
90 30 40 10
Para valorar la ventana de tiempo que abarca la protección mediada por los ncRNAs con respecto al momento de infección, se inocularon las diluciones 102 Y 10-4 de VFA en camadas de lactantes que habían sido inoculados previamente con el IRES (intraperitonealmente, 100 I-Ig) a distintos tiempos tras 15 la inoculación del RNA. Los resultados se muestran en la Tabla 5. La protección total frente a la infección con la dilución 10-4 de virus de la fiebre aftosa se mantuvo en todos los tiempos ensayados desde minutos tras la inoculación hasta 72 h después. Para la dilución 10-2 la protección fue completa tras 8 h de la inoculación con el IRES y del 60% tras 4h. Sin embargo, de
20 manera casi inmediata a la inoculación (5-10 min, correspondientes al tiempo O) los niveles de protección fueron del 100%. Por otra parte, 48 h tras la inoculación del RNA la protección frente a la dilución 10-2 fue del 50% y a 72 h los animales fueron totalmente susceptibles a la infección.
25 Tabla 5. Número de supervivientes a día 10 postinfección / número de inoculados Horas pre-inoculacion RNA
Desafio -72 -48 -24 -8 -4 O
con virus Dil (-2) 0/8 4/8 6/7 10/10 6/10 9/9
Dil (-4) 8/8 8/8 7/7 10/10 9/9 10/10
5.4. Efecto de la lipofectina El efecto de la lipofectina como agente vehiculante sobre la capacidad protectora de los ncRNAs fue analizado. Se estudió el nivel de protección
5 inducido por el IRES con y sin lipofectina frente a las diluciones 10-2 Y 10-4 del VFA (Tabla 6). El efecto protector deliRES se redujo en un 30% al ser inoculado sin lipofectina frente a la dilución 10-2 Y en un 10% frente a la 10-4 (Tablas 1 y 4). Ningún animal inoculado con PBS + lipofectina sobrevivió a la infección con la dilución 10-2 del VFA. Estos resultados indican que la
10 lipofectina per se no induce protección aunque sí potencia el efecto protector de los ncRNAs probablemente aumentando su estabilidad y/o acceso a las células diana.
Tabla 6. Supervivencia tras infección con el VFA a las 24 h postinoculación del 15 IRES del VFA con/sin lipofectina (LP)
Supervivientes
Número
Dilución Día Día Día Día Día Día %
Inóculo inicial de
virus 3 4 5 6 7 10 final
animales IRES (+ LP) -2 9 9 9 9 9 9 9 100
- -
- 2 10 9 8 8 7 7 7 70
IRES (-LP) -4 10 10 9 9 9 9 9 90
PBS (+ LP) -2 7 1 O O O O O O
5.5. Efecto protector frente a la infección con el virus del Nilo Occidental Los ensayos de supervivencia frente al VNO confirman los obtenidos frente al VFA, de modo que se obtuvo una mayor protección con la región IRES del VFA que con la región S del VFA, la cual también fue mayor que la obtenida con el
RNA control (poly I:C).
Los resultados de supervivencia 15 días post infección frente a las distintas
5 diluciones ensayadas se muestran en la Tabla 7. Brevemente, el efecto protector de los distintos ncRNAs (IRES y S) inoculados 24 horas antes de la infección vírica fue igual o mejor que el del control (poly I:C).en todas las condiciones de infección ensayadas (10 ufp/ratón por vía i.c, y 100 ufp/ratón tanto por vía i.c. como i.p.). El IRES confirió una protección muy elevada, que
10 llegó a ser completa (100%, 100% Y 46.2%). Por su parte, los porcentajes de supervivencia de la región S fueron también muy notables (100%, 96% Y 12.5%) en comparación con los obtenidos con poly I:C (100%, 33.3% Y 0%). Las supervivencias obtenidas con los ncRNAs de la invención fueron similares a los obtenidos cuando el virus fue neutralizado con sueros murinos, cuya
15 capacidad protectora era conocida, previamente a su inoculación (100%, 100% Y 77%). Los porcentajes de supervivencia de los grupos control inoculados con PBS fueron del 12.5%, 40% Y 0%, respectivamente.
Tabla 7. Supervivencia de ratones lactantes inoculados con los ncRNAs a 15
20 días postinfección intracraneal (i.c.) o intraperitoneal (i.p.) con el VNO. RNA Dosis Vía Supervivientesl Porcentaje de p~ inoculado virus inoculación Inoculados supervivencia (Chi2) (ufp/ratón) (Lp/Lc.) IRES 10 i.c 15/15 100 0.0001 100 i.p 12/12 100 0.0010 100 i.c 5/13 46.2 0.0266
S 10 i.c 11/11 100 0.0002 100 i.p 16/17 94.1 0.0010 100 i.c 2/14 12.5 ns
Polyl:C 10 i.c 12/12 100 0.0001 100 i.p 4/12 33.3 ns 100 i.c 0/17 O ns
PBS 10 i.c 1/7 12.5 100 i.p 6/15 40 100 i.c 0/10 O
Suero 10 i.c 13/13 100 0.0001 100 i.p 11/11 100 0.0010 100 i.c 10/13 77 0.0002
...
Ns, no sglnlflcatlvo
MATERIAL Y MÉTODOS EMPLEADOS
Se han empleado las líneas celulares de riñón de cerdo IBRS-2, SK-6 y células Vero (epiteliales de riñón de mono) del Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Valdeolmos, España, y las células murinas L-929, del
10 laboratorio del Dr. Alcamí, del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid, España. Las células se crecieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina y glutamina.
Los virus empleados en los experimentos de infección fueron: el virus de la 15 fiebre aftosa 01 K, el virus de la estomatitis vesicular Indiana y el virus del Nilo Occidental cepa NY-99.
Preparación de los RNAs y transfecciones.
20 Los transcritos de RNA correspondientes al fragmento S, 3'NCR y sus derivados SL 1 (3'NCRilSL2), SL2 (3'NCRilSL1) Y {J.An (con la cola poli A eliminada) del genoma del VFA 01 K (la secuencia del genoma del aislado 01 K se considera recogida en los números de acceso de Genbank D10138 Y X00871) se generaron por transcripción in vitro con la RNA polimerasa de T3 a
25 partir de plásmidos descritos previamente y linearizados con Not I (Serrano PM et al. 2006. J Gen Virol 87:3013-3022). El RNA correspondiente al IRES de VFA del aislado C-S8c1 se obtuvo de un clan derivado de pGEM (Ramos R et al. 1999. RNA 5:1374-1783) cedido por E. Martínez-Salas, tras linearizar con Xhol y transcribir in vitro con la RNA polimerasa de T7 (NEB). El RNA correspondiente al 5'NCR, incluyendo el fragmento S, el IRES y 212 nucleótidos de la secuencia codificante de Lpro se sintetizó con la RNA polimerasa de SP6, usando como molde el clan p01 K (Rodríguez-Pulido MF et al. 2009. Journal of Virology 83(8):3475-3485) linearizado con Accl. Salvo que se indique lo contrario, todos los transcritos contienen un grupo trifosfato en el extremo 5' y los elementos 3'NCR del VFA y sus derivados llevan una cola de poli A de 58 nucleótidos.
Tras la transcripción, los RNAs se trataron con la DNasa R01 (1 U/lJg, Promega), se extrajeron con fenal/cloroformo y se precipitaron con etanol. Finalmente se resuspendieron en agua y se cuantificaron por espectrofotometría. La integridad y el tamaño del RNA se analizaron por electroforesis en geles desnaturalizantes 6% acrilamida, 7 M urea o geles de agarosa.
La eliminación de los grupos fosfato del extremo 5' en los transcritos del VFA 3'NCR se realizó incubando durante 90 minutos con 0.5 U/lJg de fosfatasa alcalina (CIP, New England Biolabs). Después de este tratamiento, el RNA se extrajo 2 veces con fenal/cloroformo, se precipitó con etanol y se trató como se indica anteriormente. La integridad de estos transcritos de analizó por electroforesis en geles desnaturalizantes 6% acrilamida, 7 M urea. De esta manera se generaron los ncRNAS de la invención SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2 y SEO ID NO: 3.
Antes de ser transfectados, los RNAs se calentaron durante 5 minutos a 92°C, se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos y se mantuvieron en hielo.
Las células SK-6 se transfectaron usando 20 !-Ig/ml de cada uno de los ncRNAs con Lipofectina (Invitrogen) o con 10 !-Ig/ml de poly I:C (Sigma) usando Lipofectamina (Invitrogen).
A distintos tiempos post-transfección, las células se lisaron y el RNA total se extrajo y se cuantificó con los métodos conocidos por cualquier experto en la materia. La retro-transcripción (RT) se realizó empleando 500 ng de RNA total y la enzima Transcriptor RT (Rache). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa se realizó a partir de alícuotas de las reacciones de retrotranscripción (RT) (1/10) Y los reactivos del kit"UghtCycler FastStart DNA Master SYBR green f' (Roche).Todas las reacciones se realizaron en triplicado. Los datos se analizaron mediante el método ~~Ct conocido por cualquier experto en la materia. En todos los ensayos la expresión del gen de IFN-¡3 se normalizó respecto al gen de expresión constitutiva GADPH, y se expresó como incremento respecto a las células transfectadas control.
Los oligonucleótidos usados para amplificar el RNAm del IFN-¡3 porcino fueron las secuencias a las que se refieren SEQ ID NO: 4 (cebador sentido) y SEQ ID NO: 5 (cebador antisentido). Para GAPDH se usaron oligonucleótidos descritos previamente (García-Briones MM et al. 2004. Virology 322:264-75).
La actividad antiviral de los sobrenadantes de las células SK-6 transfectadas se determinó mediante un ensayo de inhibición de la infeccion de VEV sobre células IBRS-2. Brevemente, las células SK-6 se transfectaron durante 24 horas con 40 !-Ig/ml de los transcritos NCR, o con 10 !-Ig de poly I:C o tRNA (control negativo ya que el RNA tranferente es un RNA endógeno y por lo tanto su tranfección no debe inducir la respuesta innata ni la inducción de INF). Las células IBRS-2 se incubaron durante 24 horas con distintas diluciones de los sobrenadantes de transfección, se lavaron y se infectaron con 100 ufp de VEV. A 24 horas post-infección se contaron las placas. En algunos casos, los sobrenadantes de transfección se incubaron previamente durante 1 hora a 37°C con 1 I-Ig de anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos anti-IFN-a porcino (K9, de PBL InterferonSource) o anti-IFN-¡3 descrito previamente (Overend C R et al. 2007. J Gen Virol 88:925-31). No se observó efecto inhibitorio sobre la infectividad de VEV para cantidades de anticuerpo monoclonal de hasta 10 I-Ig. La actividad antiviral se expresó como la mayor dilución de sobrenadante requerida para reducir un 50% el número de placas.
Camadas de ratones Swiss (de 3-7 días de edad) se inocularon intraperitonealmente con 100 1-11 conteniendo 100 I-Ig de los transcritos del VFA 3'NCR (SEO ID NO: 1), S (SEO ID NO: 2), IRES (SEO ID NO: 3) o poly I:C, en tampón PBS. Para los transcritos RNA, se añadieron 20 I-Ig de lipofectina (Invitrogen). A O, 4, 8, 24 Y 48 horas postinoculación se recogieron muestras de suero, y las muestras de 4-5 animales para cada RNA se juntaron y se mantuvieron a -80°C hasta su uso. La cantidad de IFN-a e IFN-¡3 en suero se determinó empleando kits de ELlSA (PBL InterferonSource). Para analizar la actividad antiviral en estas muestras de suero, se realizó un ensayo de inhibición de efecto citopático (Rubinstein SPC et al. 1981. J Virol 37:755-758). Brevemente, monocapas de células L-929 sembradas en placas multipocillo M96 se incubaron durante 24 horas con diluciones seriadas de los correspondientes sueros. Posteriormente se retiró el medio y se sustituyó por medio fresco conteniendo 100 dosis infectivas-50 (TCIDso) de VEV. A las 72 horas se controló el efecto citopático por observación al microscopio. La actividad antiviral se expresó como la recíproca de la mayor dilución de suero que protege de citotoxicidad en el 50% de los pocillos.
El manejo de animales en este estudio ha seguido en todo momento las pautas de la Comunidad Europea 86/609/CEE. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de INIA (Permisos Número CBS 2008/016 para el VFA y 2011/023 para el VNO).
Ensayos de supervivencia. Se inocularon grupos de ratones lactantes Swiss de aproximadamente una semana de edad por vía intraperitoneal (i.p) con cada RNA (ncRNA) que fueron posteriormente inoculados con distintas diluciones de virus: VFA (una camada de 8-12 animales por dilución) 24 h después por la misma vía, o VNO (una camada de 9-17 animales por dilución) 24 h después bien por vía i.p. o bien por vía intracraneal (i.c.) (se utilizaron ambas vías de administración en camadas distintas). El inóculo tenía un volumen final de 100 I-lI Y contenía 100 I-lg del RNA a ensayar diluido en PBS y 20 I-lg de Lipofectina (Invitrogen). Brevemente, los RNAs sintetizados mediante transcripción in vitro fueron calentados a 92°C durante 5 min en agua. A continuación se añadió el PBS y se dejó renaturalizar a temperatura ambiente durante 10 mino Después se añadió la lipofectina y tras 15 min de incubación a temperatura ambiente la mezcla fue inyectada. La Lipofectina es un preparado de liposomas catiónicos comercial de uso rutinario en transfecciones de RNA de cadena sencilla. La metodología de inoculación de RNAs de VFA en ratones y cerdos ha sido desarrollada previamente. La preparación del inóculo de poly I:C se realiza igualmente con 100 I-lg del RNA diluido en PBS pero sin liposomas ya que se ha descrito su capacidad de inducir IFN en ratón adulto tras inoculación intraperitoneal como RNA desnudo. La infección con el virus se realizó 24 h después de la inoculación con los RNAs por dar los mejores resultados de protección en ensayos previos con el 3'NCR inoculado a 4, 8 Y 24 h preinfección. El volumen de inóculo de VFA fue de 100 I-lI diluido en PBS. Se ensayaron las diluciones comprendidas entre 10° (sin diluir) y 10-5 de un sobrenadante de infección en cultivo celular con un título de 8 x 107 unidades formadoras de placa (pfu)/ml. En el caso del desafío con el VNO el volumen de inoculación fue de 10 o 100 1-l1, dependiendo de si la inoculación fue i.c. o i.p., diluidos en PBS. El desafío se realizó con sobrenadante de infección en cultivo celular del VNO cepa NY-99 (10 0100 ufp/ratón por vía i.c., y con 100 ufp/ratón por vía i.p) 24 h tras la inoculación de los RNAs.
En el ensayo de desafío frente al VNO, además del grupo control inoculado con PBS y desafiado con virus (como es el caso del VFA) también se incluyeron grupos control que fueron inoculados con PBS y desafiados con las mismas
5 cantidades de virus que habían sido previamente incubadas (dilución 1: 1 ) durante 1 hora a temperatura ambiente con sueros inmunes de ratones cuya capacidad protectora frente a la infección con el VNO era conocida, y grupos sin tratar que fueron inoculados i.c. con PBS como control de buena manipulación.
Claims (23)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de una composición farmacéutica
-
- 2.
- Uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades causadas por virus sensibles a interferón donde dichos virus son virus RNA de cadena simple.
-
- 3.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde la región no codificante se refiere a una región con una identidad de al menos un 80% con una secuencia nucleotídica que se selecciona de la lista que comprende: SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3 o cualquiera de sus combinaciones.
-
- 4.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde dicha región no codificante consiste en la secuencia nucleotídica que se selecciona de la lista que comprende: SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3
o cualquiera de sus combinaciones. -
- 5.
- Uso según la reivindicación 4 donde la secuencia es SEO ID NO: 1.
-
- 6.
- Uso según la reivindicación 4 donde la secuencia es SEO ID NO: 2.
-
- 7.
- Uso según la reivindicación 4 donde la secuencia es SEO ID NO: 3.
-
- 8.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 donde el virus RNA de cadena simple es un virus de la familia Pícomavírídae.
-
- 9.
- Uso según la reivindicación 8 donde el virus es el virus de la fiebre aftosa.
-
- 10.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7donde el virus RNA de cadena simple es un virus de la familia Rhabdovírídae.
-
- 11.
- Uso según la reivindicación 10 donde el virus es el virus de la estomatitis vesicular.
-
- 12.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7donde el virus RNA de cadena simple es un virus de la familia Flavívírídae.
-
- 13.
- Uso según la reivindicación 12 donde el virus es el virus del Nilo Occidental.
-
- 14.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13 donde dichas enfermedades son enfermedades en animales mamíferos no humanos.
-
- 15.
- Uso según la reivindicación 14 donde los animales pertenecen a la familia Suídae.
-
- 16.
- Uso según la reivindicación 14donde los animales pertenecen a la familia Bovídae.
-
- 17.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 y 10 a 14 donde dichas enfermedades son enfermedades en animales que pertenecen a la familia Equídae.
-
- 18.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 donde dichas enfermedades son enfermedades en aves.
-
- 19.
- Uso según la reivindicación 18 donde las aves se seleccionan de las familias de la lista que comprende: Phasíanídae, Corvídae, Paserídae, Fríngíllídae, Turdídae, Accípítrídae y Strígídae.
-
- 20.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13 donde dichas enfermedades son enfermedades en humanos.
-
- 21.
- Composición farmacéutica que comprende la región no codificante
5 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 que además comprende al menos un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptables. - 22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21 que ademáscomprende al menos otro principio activo. 10
- 23. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, donde dicha composición farmacéutica se presenta en una forma adaptada a la administración por vía oral, parenteral o intradérmica.
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-
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