ES2401904B1 - Vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva), con deleción en el gen c6l, como vacunas contra el vih/sida y otras enfermedades. - Google Patents

Abstract

Vectores recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA), con deleción en el gen C6L, como vacunas contra el VIH/SIDA y otras enfermedades.#La presente invención se engloba dentro de los campos de la biología molecular y de la biotecnología. Específicamente se refiere a virus recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) que expresan los antígenos gp120 y Gag-Pol-Nef del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) de subtipo B (MVA-B), sobre los que se ha delecionado el gen de vaccinia C6L, y que han sido diseñados para utilizarse como vacunas contra el VIH/SIDA y otras enfermedades.

Description

VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL VIRUS MODIFICADO DE ANKARA (MVAI, CON DELECIÓN EN EL GEN C6L, COMO VACUNAS CONTRA EL VIH/SIDA y OTRAS ENFERMEDADES

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se engloba dentro de los campos de la biología

molecular y de la biotecnología. Específicamente se refiere a virus recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) que expresan los antígenos

gp120 Y Gag-Pol-Nef del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) de subtipo B (MVA-B), sobre los que se ha delecionado el gen de vaccinia C6L, y que han sido diseñados para utilizarse como vacunas contra el VIH/SIDA y otras enfermedades.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Según datos de la OMS, el SIDA, causado por el VIH-1, es una pandemia que se expande mundialmente, con alto impacto y severidad en la salud humana.

Cada afio aumenta el número de nuevas infecciones y muertes causadas por el

SIDA, sobre todo en los países no desarrollados o en vías de desarrollo. Por lo tanto, la búsqueda de una vacuna efectiva contra el VIH-1 que pueda controlar la infección y la progresión de la enfermedad es una de las prioridades en el ámbito

científico.

Uno de los vectores más prometedores para ser utilizados como una vacuna efectiva frente a VIH-1 es MVA, una estirpe altamente atenuada de vaccinia (Esteban, 2009. Hum. Vaccin. 5:867-871). MVA posee un excelente perfil de seguridad, y recombinantes de MVA que expresan antígenos de VIH-1 inducen protección después de un desafío con el virus de la inmunodeficiencia simia/humana (SHIV), generando respuestas inmunes fuertes, amplias, polifuncionales y duraderas frente a antígenos de VIH-1 en díferentes modelos animales y ensayos clínicos en humanos (García-Arriaza et aL, 2010. PLoS One

5: e12395; Gómez et al., 2009. Vaccine 27: 3165-3174; Harari et al., 2008. J Exp Med 205: 63-77; Mooij et al., 2008. J Virol 82: 2975-2988; Gómez et al., 2007.

Vaccine 25: 2863-2885; Gómez et al., 2007. Vaccine 25: 1969-1992; resumen en Gómez et al., 2008. Curr Gene Ther 8: 97-120).

Previamente se ha construido en nuestro laboratorio un recombinante de

MVA que expresa los antígenos de VIH-l de subtipo B, gp120 (SEO ID No 15 de PCT/ES2006/070114) como una proteína monomérica y la poliproteína Gag-PolNef (SEO ID No 16 de PCT/ES2006/070114) (virus denominado MVA-B) (Patente: PCT/ES2006/070114, fecha de publicación: 1/212007. Autores: Heeney, Jonathan; Mooij, Petra; Gómez Rodríguez, Carmen Elena; Nájera Garcia, José Luis;

Jiménez Tentor, Victoria; Esteban Rodríguez. Mariano). En un protocolo de

inmunización "DNA prime/MVA boost" en ratones MVA-B indujo fuertes respuestas inmunes frente a los antígenos de VIH-l (Garcia-Arriaza et al., 2010. PLoS One 5: e12395; Gómez et al., 2009. Vaccine 27: 3165-3174; Gómez et al., 2007. Vaccine 25: 2863-2885). En macacos, una construcción similar que expresa Env (gp120 de SHIV".6P) y Gag-Pol-Nef (de SIVm• c239) mostró fuertes respuestas inmunes específicas de células T CD4" y CD8" con una preferencia por CD8", y una alta protección después de un desafío con SHIV89.6P (Mooij et al., 2008. J Viral

82: 2975-2988). Además, la expresión de antígenos de VIH-l por parte de MVA-B

induce de forma selectiva en células dendríticas humanas la expresión de

diferentes genes celulares que pueden actuar como reguladores de las respuestas inmunes frente a los antígenos de VIH-l (Guerra et al., 2010. J Virol

84: 8141-8152). Basado en todos estos resultados previos, se ha realizado en

EspaFla un ensayo clínico de Fase I con MVA-B en voluntarios sanos. Sin embargo, a pesar de todos estos antecedentes, son necesarios y

deseables nuevos vectores poxvirales MVA-B más eficientes que puedan aumentar la magnitud, amplitud, polifuncionalidad y durabilidad de las respuestas inmunes frente a los antígenos de VIH-l. Esto es particularmente relevante cuando un solo inmunógeno es deseable para los propósitos de vacunación en

masa para simplificar los protocolos de inmunización y reducir los costes de fabricación. Los vectores poxvirales expresan numerosos genes que codifican para proteínas inmunomoduladoras que interfieren con la respuesta anti-viral del

hospedador (Alcaml, 2003. Na!. Rev. Immunol. 3:36-50). Por lo tanto, la deleción en el vector poxviral MVA-B de genes de vaccinia que se conocen o sugieren que

puedan tener una función inmunomoduladora, es una estrategia general que

puede aumentar la inmunogenicidad del vector frente a los antígenos de VIH-l .

Uno de estos genes cuya función se desconoce pero que pensamos puede tener

función inmunomoduladora es el gen de vaccinia C6l, el cual está presente en el genoma de las estirpes de vaccinia MVA (gen denominado MVA 019l, SEO ID No: 1), Western Reserve (WR) (gen denominado VACV-WR_022, SEO ID No: 3), 5 Y Copenhagen (gen denominado C6l, SEO ID No: 5), pero ausente en la estirpe New York Vaccinia Virus (NYVAC). Se postula que C6l es un gen inmediatotemprano, según el análisis del promotor de C6l y el análisis del transcriptoma que detecta ARN mensajero de C6 a los 30 minutos post-infección (Assarsson et al., 2008. P.NAS. 105: 2140-2145). C6l codifica una protelna de 157 10 aminoácidos con un peso molecular predicho de 18.2 kDa. Análisis bioinformáticos, sin datos experimentales, han agrupado C6l en la familia de genes poxvirales denominada "BCl-2-like", que incluye A46R, A52R, B15R (denominado B14R en WR) y K7R (González y Esteban, 2010. Virol. J. 7:59), una

familia de proteínas que inhiben a diferentes niveles la ruta de señalización

15 mediada por "TolI-like receptor (TlR)" (Bowie et al., 2000. P.NAS. 97:1016210167; Chen et al., 2006. J. Gen. Virol. 87:1451-1458; Chen et al., 2008. PloS Pathog. 4:e22; Graham et al., 2008. PloS Pathog. 4:e1000128; Harte et al., 2003.

J. Exp. Med. 197:343-351 ; Kalverda et al., 2009. J. Mol. Biol. 385:843-853; Oda et al., 2009. Structure 17:1528-1537; Schroder et al., 2008. EMBO J. 27:2147-2157; 20 Stack et al., 2005. J. Exp. Med. 201 :1007-1018). la proteina C6 está presente, aunque a bajos niveles, en los viriones maduros intracelulares de vaccinia (IMV) (Chung et al., 2006. J. Virol. 80:2127-2140), y se une a las proteínas KRT4 (queratina 4), PDCD61P y TNNI2 (troponina 1) (Zhang et al., 2009. J. Proteome Res. 8:4311-4318). Además, un epltopo de C6 (aminoácidos 74-82 de SEO ID 25 No: 1 y SEO ID No: 3) es altamente inmunogénico en ratones BAlB/c, y WR induce en ratones aHos niveles de células secretoras de IFN-y específicas para C6l, de forma similar a péptidos de vaccinia de E3l, F2l Y A52R (Oseroff et al., 2008. J. Immunol. 180:7193-7202). Todas estas características nos indican que C6 puede tener una importante función inmunomoduladora antagonizando con la

30 ruta de señalización TlR.

Por lo tanto, en esta invención se ha generado un nuevo candidato vacunal frente

a VIH-1 , denominado MVA-B "'C6l, el cual contiene una deleción en el vector MVA-B del gen de vaccinia C6l y que demostramos actúa induciendo la producción de interferón tipo 1 y activando in vivo la producción de células T de

memoria, lo que no era de esperar, pero que representa una atractiva alternativa

para incrementar la inmunogenicidad de candidatos vacunales basados en MVA.

BREVE DESCRIPCiÓN DE lA INVENCiÓN

La presente invención representa un nuevo candidato vacunal frente a VIH

1, denominado MVA-B LlC6l, el cual contiene una deleción en el vector MVA-B del gen de vaccinia C6L. MVA-B LlC6l replica en cultivos celulares al mismo nivel

que el virus parental MVA-B, indicando que e6 no es esencial para la replicación

viral. De forma adicional, MVA-B LlC6l induce respuestas inmunes innatas incrementando la expresión de IFN-13 y genes inducidos por IFN-a/(3 (IFIT1 e IFIT2) en células humanas THP-1 y células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs), sugiriendo que C6 inhibe la ruta de señalización de IFN-(3 bloqueando algún componente desconocido involucrado en la inducción de IFN-¡3. la deleción del gen C6l en el vector MVA-B aumenta en ratones la respuesta inmune humoral y de células T de memoria frente a los antígenos de VIH-1 . Así, mediante

un protocolo de inmunización NONA prime/MVA boost" en ratones se mostró que,

comparado con MVA-B, MVA-B LlC6l aumenta significativamente la magnttud y polifuncionalídad de la respuesta inmune de células T de memoria CD4+ y CDa+ especificas frente a VIH-1, la cual está mediada principalmente por células T CDa+ de fenotipo efector, en ambos grupos de inmunización. La respuesta de células T de memoria CD4+ específicas frente a VIH-1, inducidas por MVA-B y MVA-B LlC6L fue preferencialmente específica frente a Env. Sin embargo, mientras que MVA-B induce respuestas inmunes de células T de memoria CDa+ especificas frente a Env y Gag, MVA-B LlC6L induce preferencialmente respuestas inmunes de células T de memoria CDa+ especificas frente a Gag-PolNef (GPN). Además, en comparación con MVA-B, MVA-B LlC6L aumenta los

niveles de anticuerpos contra Env.

Por lo tanto, MVA-B LlC6L representa un nuevo candidato vacunal frente a VIH-1 que, no siendo obvio, posee un beneficio inmunológico al aumentar las respuestas dependientes de IFN-(3 en células humanas e incrementar la

respuesta humoral y la magnitud y calidad de las respuestas inmunes de memoria

de células T específicas frente a los antígenos de VIH-1.

Partiendo de los ejemplos incluidos en la presente memoria, donde se ha

experimentado sólo con MVA-B LlC6l, los resultados obtenidos permitirian ampliar el ámbito de protección para mejorar la inmunogenicidad de nuevos 5 vectores recombinantes basados en MVA, que expresan otros antígenos heterólogos (ejemplos, malaria, leishmania, virus de la hepatitis C y cáncer de próstata) mediante la deleción del gen C6l, con el fin de poder ser utilizados

como vacunas frente a dichas enfermedades.

10 DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

la construcción de MVA-B LlC6l descrita en la presente invención y los

ensayos en los que se evalúa tanto su comportamiento in vitro, como la respuesta inmune innata inducida en células humanas, y su capacidad inmunogénica en

15 ratones frente a los antigenos de VIH-1 se describen con más detalle con ayuda de las figuras y los ejemplos que aparecen más adelante en la presente memoria.

La presente invención hace referencia a un vector viral basado en un virus

recombinante MVA, caracterizado por que la secuencia nucleotídica codificante

20 para dicho vector comprende: a) al menos una mutación en la secuencia SEO ID No: 1 que codifica para la proteina C6l, y b) al menos una secuencia nucleotidica que codifica para un antigeno heterólogo.

En una realización preferente de la presente invención, se hace referencia al vector viral anteriormente definido, caracterizado por que la mutación en la secuencia SEQ ID No: 1 es una deleción parcial o total. En una realización aún más preferente, la mutación en la secuencia SEO ID No: 1 es una deleción total.

En otra realización preferente de la presente invención, se hace referencia

al vector viral anteriormente definido, caracterizado por que la secuencia

nucleotídica codificante para dicho vector comprende al menos una secuencia

nucleotidica que codifica para un antigeno heterólogo seleccionado de entre el siguiente grupo: antígeno del VIH, antígeno de la malaria, antígeno de la leishmaniosis, antígeno del virus de la hepatitis C y antígeno del cáncer de próstata.

5 En una realización aún más preferente, la secuencia nucleotídica

codificante para dicho vector comprende las secuencias nucleotidicas que

codifican para los siguientes antígenos del VIH : antígenos gp120 (SEO ID No 15 de PCT/ES2006/070114) y Gag-Pol-Nef (SEO ID No 16 de PCT/ES2000/070114) de VIH de subtipo B, o de cualquier otro subtipo, bajo el control del promotor

10 sintético viral temprano/tardío insertado dentro dellocus viral TK.

La presente invención también hace referencia al método de fabricación del

vector viral basado en un virus recombinante MVA anteriormente definido, caracterizado por comprender las siguientes etapas: 15 a) construir un plásmido que comprende en su secuencia nucleotídica las

secuencias flanqueantes de recombinación del gen C6L, es decir las secuencias del flanco derecho y del flanco izquierda de SEO ID No: 1, b) recombinar un virus recombinante MVA, que contiene al menos una secuencia nucleotídica que codifica para un antígeno heterólogo, con el

20 plásmido generado en a) el cual dirige la mutación de SEO ID No: 1, preferentemente dicha mutación es una deleción parcial o total, y más preferentemente es una deleción total, y e) purificar el vector viral basado en un virus recombinante MVA definido anteriormente, obtenido en el paso b).

La presente invención también hace referencia al uso del vector viral

basado en un virus recombinante MVA anteriormente definido, como inmunógeno para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria,

leishmaniosis, hepatitis C, y cáncer de próstata. En una realización preferente,

30 dicho vector se usa como inmunógeno para prevenir o tratar la enfermedad del

VIH.

En otra realización de la presente invención, se hace referencia al uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA anteriormente definido, como parte de un protocolo de inmunización para prevenir o tratar una de las siguientes

enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis C, y cáncer de próstata, en

el que se administra al individuo al menos una dosis de vacunación. En una realización preferente, dicho vector se administra al individuo una única dosis de vacunación para:

a) inducir una respuesta inmune de células T C04+ y C08+ de memoria

antígeno específicas, y/o

b) para inducir la expresión de IFN-13 en células inmunes innatas.

En otra realización preferente de la presente invención, dicho vector se usa como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra al individuo al menos una dosis de vacunación, para prevenir o tratar la enfermedad del VIH.

En otra realización preferente de la presente invención, dicho vector se usa

como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra al individuo

al menos una dosis de vacunación o bien varias dosis de vacunación de una combinación de vectores heterólogos (protelnas, ONA, VLPs, vectores virales atenuados) para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis C, y cáncer de próstata.

La presente invención también hace referencia a una composición inmunogénica o vacuna caracterizada por que comprende al menos un vector viral basado en un virus recombinante MVA definido anteriormente y caracterizado por que la secuencia nucleotídica codificante para dicho vector

comprende: a) al menos una mutación en la secuencia SEQ ID No: 1 que codifica para la proteína C6L, y

b) al menos una secuencia nucleotídica que codifica para un antígeno

heterólogo.

La presente invención también hace referencia al uso de la composición inmunogénica o vacuna definida anteriormente, para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis e, y cáncer de

próstata. En una realización preferente, dicha composición inmunogénica o vacuna es para prevenir o tratar el VIH.

En la presente invención se hace referencia a los siguientes términos:

• El término "virus recombinantes MVA" o "MVA" se refieren indistintamente

a: una estirpe altamente atenuada de vaccinia, denominada virus

modificado de Ankara (MVA), obtenida tras 576 pases seriados en cultivos de células embrionarias de pollo (CEF).

• El término: "virus recombinante MVA-S" o "virus parental MVA-B" o "vector

poxviral MVA-B" se refieren indistintamente a: poxvirus basados en el virus modificado de Ankara (MVA) que expresan los antígenos gp120 y Gag-PolNef del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) de subtipo B (MVAB). El ténnino "parental" se utiliza cuando se compara MVA-B con MVA-B t.C6L, pues la deleción de C6L se realiza sobre el genoma de MVA-B.

• El término "vector viral" o "vector viral recombinante" se refiere a: un virus

modificado que hace de vehiculo para introducir material genético exógeno en una célula.

• El término: "vector MVA-B t.C6L" se refiere a: un virus MVA aislado, caracterizado por que expresa los antígenos gp120 y Gag-Pol-Nef del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) de subtipo B, y posee una

deleción en la secuencia de polinucJeótidos que codifica una secuencia

aminoacidica homóloga a la del gen C6L (SEO ID No: 1), y se presenta

para su uso como composición farmacéutica o medicamento. La deleción

del gen C6L en MVA-B incluye las posiciones 19068 a 19541 del genoma

de MVA.

• el término "gen de vaccinia C6l" se refiere a: un gen de vaccinia, cuya

función se desconocia previamente a la presentación de esta invención. El gen C6L está presente en el genoma de las estirpes de vaccinia MVA (gen denominado MVA 019L, posiciones 19068 a 19541 del genoma de MVA, SEO ID No: 1), Westem Reserve (WR) (gen denominado VACV-WR_022, posiciones 16401 a 16856 de WR, SEO ID No: 3), y Copenhagen (gen denominado C6L, posiciones19484 a 19939, SEO ID No: 5), pero ausente en la estirpe New York Vaccinia Virus (NYVAC).

• El término "plásmido~ o "vector de transferencia" se refiere a fragmento circular de ADN circular o lineal bicatenario extracromosómico, que se

encuentra en el interior de casi todas las bacterias, y que actúan y se replican de forma independiente al ADN cromosómico bacteriano y pueden transferirse de unas bacterias a otras. Se utilizan como vectores en manipulación genética.

• El término "virus" se refiere a: una entidad infecciosa microscópica que sólo

puede multiplicarse dentro de las células de otros organismos. Más

concretamente se refiere a los virus pertenecientes a la familia Poxviridae,

que es una familia de virus de ADN relacionados entre sí llamados

poxvirus, ¡nfectivos para animales vertebrados e invertebrados.

• El término "composición" se refiere a: aquellas sustancias que están presentes en una determinada muestra y en unas cantidades

determinadas.

• El término "antígeno heterólogo" se refiere a: una molécula (generalmente una proteína o un polisacárido), que desencadena la formación de

anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria. Preferentemente se refiere a aquellos antígenos de una especie viral diferente a vaccinia que se insertan dentro de un vector viral de vaccinia.

• El término "antígenos de VIH" se refiere a: los antlgenos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), los cuales son expresados a partir de los virus recombinantes MVA que los contienen. Incluye cualquier antígeno de VIH codificado a partir del genoma de VIH.

• El término "antígenos de la malaria" se refiere a: los antígenos de malaria, los cuales son expresados a partir de los virus recombinantes MVA que los contienen. Incluye cualquier antígeno de malaria codificado a partir del genoma del patógeno del género Plasmodium, que genera la enfermedad.

• El término "antigenos de la leishmaniosis" se refiere a: los antlgenos de

leishmania, los cuales son expresados a partir de los virus recombinantes

MVA que los contienen. Incluye cualquier antígeno de leishmania codificado a partir del genoma del patógeno del género Leishmania, que genera la enfermedad.

• El término "antígenos del virus de la hepatitis C" se refiere a: los antlgenos del virus de la hepatitis C, los cuales son expresados a partir de los virus recombinantes MVA que los contienen. Incluye cualquier antígeno del virus de la hepatitis C codificado a partir del genoma del virus de la hepatitis C.

o El término "antígenos del cáncer de próstata" se refiere a: los antígenos de

5 cáncer de próstata (entre ellos los antígenos PSCA y STEAP), los cuales son expresados a partir de los virus recombinantes MVA que los contienen.

• El ténnino "vacuna frente a enfermedad" se refiere a: una preparación o

composición inmunogénica o antigénica empleada para establecer la

respuesta del sistema inmune a una enfermedad. Son preparados o

10 combinaciones de inmunógenos o antígenos que una vez dentro del

organismo provocan la respuesta del sistema inmunitario, mediante la

producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica produciendo

inmunidad permanente o transitoria.

o El término "vacuna frente a el cáncer de próstata" se refiere a: una

15 preparación antigénica empleada para establecer la respuesta del sistema inmune a cáncer de próstata.

• El término "mutación" se refiere a: una alteración o cambio en la

información genética de un ser vivo y que, por lo tanto, va a producir un cambio de características, que se presenta súbita y espontáneamente, y

20 que se puede transmitir o heredar a la descendencia. La unidad genética capaz de mutar es el gen que es la unidad de información hereditaria que forma parte del ADN.

• El término "deleción" se refiere a: un tipo especial de mutación que consiste

en la pérdida de un fragmento de ADN, que puede ir desde la pérdida de 25 un solo nucleótido (deleción puntual) hasta la pérdida de grandes regiones.

o El término "deleción parcial" se refiere a: la pérdida de un fragmento de ADN de un gen, que no origina la pérdida total del mismo.

o El término "deleción total" se refiere a: la pérdida de un fragmento de ADN

de un gen, que origina la pérdida total del mismo. 30 o El término: "inmunógeno" se refiere a: aquellos antlgenos que provocan

una respuesta inmunitaria.

• El término: "protocolo de inmunización" se refiere a: método utilizado para la

administración de un agente inmunogénico o una vacuna a un organismo

para generar una respuesta inmune.

• El término: "inducir una respuesta inmune de células T CD4+ y CD8+ de

memoria antigeno específicas" se refiere a: la capacidad de la vacuna administrada en el protocolo de inmunización de estimular la respuesta

inmune del hospedador generando células T CD4+ y CD8+ que son capaces de reconocer específicamente el antígeno administrado.

• El término: "inducir la expresión de IFN-j3 en células inmunes innatas" se

refiere a: la capacidad de la vacuna administrada de estimular la

producción de IFN-j3 por parte de las células inmunes innatas, como los macrófagos y las células dendríticas.

• El término: "aumentar respuestas dependientes de IFN-j3 en células humanas" se refiere a: la capacidad de la vacuna administrada de estimular

en mayor medida aquellas respuestas inmunes que se producen como

consecuencia de la producción de IFN-j3 por parte de las células inmunes innatas humanas, como los macrófagos y las células dendríticas.

• El término: "incrementar la magnitud y calidad de las respuestas inmunes

de memoria de células T específicas frente a antígenos" se refiere a: la

capacidad de la vacuna administrada de estimular en mayor medida el

número y proporción de células T de memoria que son capaces de

reconocer específicamente el antígeno administrado. El término calidad se refiere a la capacidad de las células T de memoria de ser polifuncionales, es decir, de secretar al mismo tiempo diferentes citoquinas, como por ejemplo IFN-')', IL-2, o TNFa.

• El término: "fenotipos EM y TEMRA" se refieren a: dos subpoblaciones de células T de memoria, que se definen en función de la expresión de diferentes marcadores de superficie como CD44 y CD62L, y que se denominan EM ("Effector memory" ó células T de memoria efectoras. CD44'/CD62L-)) y TEMRA {"Effector memory terminally differentiated" ó células T de memoria efectoras terminalmente diferenciadas. CD44' /CD62L}

• El término uhomologla", tal y como se utiliza en esta memoria, hace

referencia a la semejanza entre dos estructuras, y más concretamente, a la

semejanza entre los aminoácidos de dos o más proteínas o secuencias aminoacídicas. Dos proteínas se consideran homólogas si tienen el mismo origen evolutivo o si tienen función y estructura similares. En el caso

particular de la invención MVA-B l>C6L, aunque la deleción del gen de vaccinia C6L se ha realizado sobre MVA-B, es suficiente para pennitir a un experto en la materia obtener nuevos vectores recombinantes basados en MVA, que expresan otros antígenos heterólogos (malaria, leishmania, virus de la hepatitis C y cáncer de próstata) mediante la deleción del gen C6L,

con el fin de poder ser utilizados como vacunas frente a dichas

enfennedades. De igual forma, aunque la deleción de C6L se ha realizado sobre un vector MVA que expresa antlgenos de VIH-l del subtipo B (MVA

B) es suficiente para permitir a un experto en la materia obtener nuevos

vectores MVA recombinantes que expresen antlgenos de VIH-l de otros subtipos (A, C, D, E, F, G, H Y O). Asimismo, es suficiente para permitir a

un experto en la materia obtener nuevos vectores poxvirales

recombinantes basados en otras cepas que estén comprendidas dentro de la especie, como las estirpes de vaccinia Western Reserve y Copenhagen, que también presentan en sus genomas el gen C6L (SEO ID No: 3 y SEO ID No: 5, respectivamente).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Caracterización in vitro del mutante de deleción MVA-B l>C6L.

(A) Esquema del genoma de MVA-B ll.C6L, adaptado de (Nájera et al., 2006. J Viral 80: 6033-6047; Antaine et al., 1998. Virology 244: 365-396). Las diferentes

regiones del genoma viral se indican mediante letras mayúsculas. Se muestran

las regiones terminales derecha e izquierda y debajo del mapa se dibujan en negro los diferentes genes fragmentados o delecionados. De fonna adicional se

indica el gen C6L delecionado. Se indican las secuencias de los antígenos de VIH-1 de subtipo B Gag-Pol-Nef (del aislado IIIB) y gp120 (del aislado BX08), bajo el control del promotor sintético viral temprano/tardío (sE/L) insertado dentro del locus viral TK (gen J2R) (adaptado de Gómez et al., 2007. Vaccine 25: 28635 2885). (B) Análisis por PCR del locus C6L. ADN extraído de células DF-1 infectadas a 2 PFU/célula con MVA, MVA-B o MVA-B óC6L fue utilizado para el análisis de PCR. Los productos de ADN correspondientes al virus parental o a la

deleción de C6L se indican mediante una flecha en la derecha, incluyendo el tamaño esperado en pares de bases. El marcador de peso molecular (1 Kb) con

10 los tamaños correspondientes (en pares de bases) se indica a la izquierda. La columna Mock representa células sin infectar. (C) Expresión de las proteínas de VIH-1 Bxo,gp120 Y "'BGPN en células DF-1 infectadas (2 PFU/célula) con MVA-B y MVA-B óC6L, a 24 horas post-infección. (D) Cinética de crecimiento viral de MVAB y MVA-B óC6L en células DF-1 infectadas (0.01 PFU/célula) a diferentes

15 tiempos y titulada mediante un ensayo de inmunotinción de placa con anticuerpos anti-WR. Se representa la media de 3 experimentos independientes. (E) Cinética de crecimiento viral de WR, MVA-B y MVA-B óC6L en células HeLa infectadas

(0 .01 PFU/célula) a diferentes tiempos y titulada mediante un ensayo de

inmunotinción de placa con anticuerpos anti-WR. Se representa el título viral 20 extracelular y el intracelular.

Figura 2. Caracterización de la expresión y localización de C6. Células DF-1 fueron infectadas con 5 PFU/célula de MVA-B y MVA-B óC6L (A) o WR Y MVA (B) en presencia o ausencia de AraC (B). Los extractos celulares

25 fueron recogidos a las 24 horas post-infección (A) o a los tiempos indicados (B) y fueron analizados mediante SDS-PAGE. La proteína C6 de vaccinia fue detectada mediante Western blot utilizando un suero de conejo policlonal contra C6. (C) Células DF-1 fueron infectadas con WR, MVA, MVA-B o MVA-B óC6L durante 18 horas. La localización de C6 fue analizada mediante immunofluorescencia y las

JO células fueron teñidas con DAPI (tiñe el núcleo celular), anticuerpo purificado policlonal de conejo anti-C6 y anti-14K.

Figura 3. MVA-B "'C6L induce la producción de IFN-Il y genes inducidos por IFN tipo I en macrófagos y células dendríticas. Macrófagos humanos THP-l (A) Y moDCs (B, C, D) fueron infectados con MVA, MVA-B y MVA-B "'C6L (5 PFU/célula en A, y 0.2, 0.02 o 0.002 PFU/célula en B, C y D). A diferentes tiempos post-infección (1 h, 3 h Y 6 h en A, 6 h en B), el ARN fue extra ido y los niveles de ARN mensajero de IFN-Il, genes inducidos por IFN tipo I (IFIT1 e IFIT2), quimiocinas y HPRT fueron analizados mediante RT-PCR.

Los resultados se expresan como el ratio entre los niveles de ARN mensajero del gen frente a los niveles de ARN mensajero de HPRT. U.A.: unidades arbitrarias. Los datos representan la media ± desviación estándar de las muestras por duplicado. (C, D) moDCs humanos fueron infectados con 0.2, 0.02 Y 0.002 PFU/célula de MVA, MVA-B y MVA-B "'C6L. 6 horas más tarde, los sobrenadantes libres de células fueron recogidos para cuantificar la concentración de IFN-Il mediante EUSA (C) y la concentración de IFN tipo I utilizando la linea

celular HL 116, que expresa luciferasa bajo el control de un promotor inducido por

IFN tipo I (D). Los resultados se expresan mediante valores de absorbancia a 450 nm (C), y en unidades de luciferasa (D). Los datos representan la media ± desviación estándar de duplicados y son representativos de 2 experimentos independientes.

Figura 4. Interacción entre la ruta de señalización "Toll-like receptors" (TLRs) y proteínas del virus vaccinia (VACV), La ruta de señalización TLR está compuesta por varios TLRs localizados en la superficie celular o en compartimentos intracelulares. La activación de estos TLRs conduce al reclutamiento de varias proteínas adaptadoras y quinasas y a la subsecuente activación de factores de transcripción (IRFs, NF-KB y ATF2/c-Jun) que son translocados al núcleo y activan la transcripción de IFN tipo I y citoquinas

proinflamatorias. VACV codifica varias proteínas inmunomoduladoras que

interfieren con la ruta de señalización TLR (indicadas mediante rectángulos): A46 inhibe moléculas adaptadoras TLR como MyD88, TRIF, MAL Y TRAM; A52 inhibe moléculas como IRAK-2 and TRAF6; K7 interacciona con DDX3 y previene la inducción de IFN via TBK1/lkk-[-; y B14 inhibe la fosforilación de IKKf! y por tanto impide la activación de NF-KB.

Figura 5. Interacción entre la ruta de señalización "retinoic acid-inducible

gene I (RIG-I)-like receptors" (RLRs) y proteínas del virus vaccinia (VACV). La ruta de señalización RLR está compuesta por las proteínas RIG-I. MDA5 Y

LGP2. La activación de estos RlRs conduce al reclutamiento de varias proteínas

5 adaptadoras y quinasas y a la subsecuente activación de factores de transcripción (IRFs y NF-KB) que son translocados al núcleo y activan la transcripción de IFN tipo I y citoquinas proinflamatorias. VACV codifica proteínas inmunomoduladoras que interfieren con la ruta de señalización RLR (indicadas mediante rectángulos): K7 interacciona con DDX3 y previene la inducción de IFN vía TBK1/1kk-E-; y C6

10 inhibe la fosforilación de IRF3 aunque su mecanismo es desconocido aún.

Fígura 6. MVA-B ~C6L actíva la ruta de señalización de IRF3. Células THP-1 diferenciadas con PMA fueron infectadas a una multiplicidad de infección de 5 PFU/célula con MVA-B, MVA-B IIC6L, MVA o con medio (Mock). A

15 diferentes tiempos post-infección las células fueron lavadas con PBS frio y lisadas

durante 10 minutos a 4"C con "Cen Lysis Buffer" (Cen Signaling). Las mezclas de reacción fueron centr~ugadas durante 10 min a 13.000 rpm. La concentración de proteína de los sobrenadantes fue determinada utilizando el "bicinchoninic acid protein assay" (Pierce Biotechnology). 30~g de proteína total fue cargada en geles 20 de poliacrilamida de 10% (w/v) y transferida a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas con anticuerpos dirigidos contra phospho-IRF3 (Cen Signaling) y o-tubulina (Cel! Signaling). Después de lavar, las membranas fueron incubadas con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Pierce). La señal fue revelada utilizando el "ECL Westem blotting Analysis System" (GE

25 Healthcare).

Figura 7. La inmunización con MVA-B IIC6L aumenta la magnitud de las

respuestas inmunes de memoria de células T CD4+ y COS+ específicas frente

a VIH-1 .

30 Se recogieron esplenocitos de ratones (n=4 por grupo) inmunizados con DNAB/MVA-B, DNA-B/MVA-B IIC6L o DNA-$/MVA, 53 días después de la última inmunización. (A) Los esplenocitos secretores de IFN-y específicos frente al péptido de VIH-1 Gag-B fueron cuantificados mediante un ensayo de ELlSPOT.

Los datos representan la media ± desviación estándar de triplicados. '** representa

p<0.005. (B-D) Análisis fenotípicos mediante citometría de flujo de células T C04' y COS· específicas frente a los antígenos de VIH-l Env, Gag y GPN. La expresión de C044 y C062L fue utilizada para identificar las sub-poblaciones de memoria denominadas "memoria central" (CM: C044'/C062L'), "memoria efectora" (EM: C044'/C062q y "memoria efectora terminalmente diferenciada" (TEMRA: C044' /C062L'). La producción de IFN-y y IL-2 fue analizada mediante marcaje intracelular (ICS). (B) Se muestra un ensayo de citometría de flujo representativo.

Las sub-poblaciones de células T de memoria se dibujan mediante dibujos de

densidad. Los puntos representan las células T productoras de IFN-y y IL-2. (C) Se representa el porcentaje de células T de memoria C04' y COS· específicas frente a los antígenos de VIH-l Env, Gag y GPN. Las frecuencias fueron calculadas representando el número de células T de memoria productoras de IFNy y/o IL-2 frente al número total de esplenocitos CD4' y CDS·. Los valores de los

controles sin estimular fueron restados en todos los casos.•• representa p<O.005.

(D) Los circulas representan la proporción de CM, EM Y TEMRA dentro de las células T de memoria C04' y COS· específicas frente a los antígenos de VIH-l Env, Gag y GPN. (A-O) Los datos derivan de un experimento, representativo de 2

experimentos realizados.

Figura 8. La inmunización con MVA-B Ll.C6L aumenta la polifuncionalidad de las respuestas inmunes de memoria de células T C04' y coa' específicas frente a VIH-1 . Se recogieron esplenocitos de ratones (n;4 por grupo) inmunízados con ONAB/MVA-B, ONA-B/MVA-B Ll.C6L o ONA-$/MVA, 53 dlas después de la última

inmunización y se analizaron mediante citometría de flujo tal y como está descrito

en la Figura 7. La polifuncionalidad de las células T de memoria C04' (parte izquierda) y CDS' (parte derecha) especificas frente a los antígenos de VIH-l Env+Gag+GPN se define basándose en la producción de IFN-y y/o IL-2. Todas las posibles combinaciones de respuestas se muestran en el eje X. Los porcentajes de células T de memoria productoras de IFN-y y/o IL-2 entre el total de células T C04' y COS· se muestra en el eje Y . •• representa p<O.005. Los círculos resumen los datos. Cada parte del círculo corresponde a la proporción de células T C04' o CD8+ productoras de IFN-y, IL-2 o IFN-y+IL-2 dentro del total de células T de memoria CD4+ o CDS+ especificas frente a los antígenos de VIH-1 . El tamaño de

cada círculo representa la magnitud de la respuesta inmune de memoria inducida

especifica frente a los antígenos de VIH-1.

Figura 9. La inmunización con MVA-B .1C6L aumenta la respuesta inmune humoral inducida contra la proteina gp120 de VIH-1. Se recogió suero de ratones (n=3 por grupo) inmunizados con DNA-B/MVA-B, DNA-B/MVA-B .1C6L o DNA-~IMVA, 53 dlas después de la última inmunización. Los títulos de anticuerpos anti-gp120 fueron determinados mediante ELlSA. Los títulos representan la última dilución del suero que dio una señal 3 veces más alta que las señales obtenidas con el suero de ratones naNeo La línea punteada representa el límite detección del ELlSA. La barra horizontal representa el valor medio y los valores obtenidos por cada ratón se representan mediante círculos. * representa p<0.05.

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2S EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante una serie de ensayos

realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la buena inmunogenicidad de la vacuna MVA-B AC6L. los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a 30 modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente

invención.

Ejemplo 1.-Generación de la invención MVA-B AC6L.

La función del gen de vaccinia C6l era desconocida hasta el momento de

presentar esta invención, aunque se predecia por ana logias bioinformáticas que

pudiera tener una función inmunomoduladora, lo que no quiere decir que sea

obvia la similitud entre predicción y demostración (González y Esteban, 2010. Virol J 7: 59). De hecho nos hemos encontrado que C6L ejerce funciones distintas a las postuladas, actuando sobre la ruta de interferón e induciendo células memoria especificas. Por lo tanto, para analizar el posible papel inmunomodulador de C6L, hemos construido un mutante de deleción que carece

del gen de vaccinia G6l a partir del virus recombinante MVA-B, previamente

descrito (Gómez et al., 2007. Vaccine 25: 2863-2885; Patente: PCT/ES2006/070114, fecha de publicación: 1/212007. Autores: Heeney, Jonathan; Mooij, Petra; Gómez Rodrlguez, Carmen Elena; Nájera García, José Luis; Jiménez Tentar, Victona; Esteban Rodríguez, Mariano) y que expresa los antlgenos de VIH-l de subtipo B Env, Gag, Poi y Nef. Al virus recombinante generado, presentado en esta invención, se le ha denominado MVA-B ~C6L. Un

diagrama esquemático del mutante de deleción MVA-B ~C6L se representa en la Figura lA. El método de fabricación de MVA-B ~C6L comprende las siguientes etapas:

a) construir un plásmido que comprende en su secuencia nucleotídica las

secuencias del flanco derecho y del flanco izquierdo del gen C6L (SEO ID No:

1),

b} recombinar el virus recombinante MVA-B, que contiene las secuencias

nucleotldicas que codifican para los antlgenos del VIH de subtipo B gp120 Y

Gag-Pol-Nef, con el plásmido generado en a} el cual dirige la deleción del gen

C6L (SEO ID No: 1), y

c} purificar el vector viral denominado MVA-B ~C6L, basado en un virus

recombinante MVA-B con deleción del gen C6L (SEQ ID No: 1), obtenido en

el paso b}.

El plásmido ó vector de transferencia denominado pGem-RG-C6L wm fue construido para poder generar el mutante de deleción MVA-B ~C6L, que posee una deleción en el gen C6L de vaccinia (El gen MVA 019L de MVA, SEO ID No: 1, es equivalente al gen VACV-WR_022 de la estirpe Western Reserve (WR) de

vaccinia, SEa ID No: 3, y al gen C6l de la estirpe Copenhagen de vaccinia, SEa ID No: S. Por simplificación, se utiliza la nomenclatura correspondiente a los genes de la estirpe Copenhagen para referirnos a los genes de MVA). pGem-RGC6l wm fue obtenido mediante clonaje secuencial de cinco fragmentos de ADN 5 que contienen los genes dsRed2, rsGFP y secuencias flanqueantes (izquierda y derecha) de recombinación del gen C6l en el plásrnido pGem-7Zf(-) (Promega). Primeramente se realizó la construcción del plásmido pGem-Red-GFP wm (4S40 pb), que contiene los genes dsRed2 y rsGFP bajo el control de un promotor viral

sintético tempranoltardío (E/L) y que fue descrito previamente (García-Arriaza et

10 al., 2010. PloS One S: e1239S). Brevemente, el gen dsRed2 bajo el control de un promotor viral sintético tempranoltardio (Ell) fue amplificado por PCR del plásmido pG-dsRed2 utilizando los oligonucleótidos Red2-B (SEO ID No: lS. S'GAACTAGGATCCTAA CTCGAGAAA-3') (comprende el sitio de restricción Bam HI) y Red2-N (SEO ID No: 16. S'-ATTAGTATGCATTTATTTATTTAGG-3')

15 (comprende el sitio de restricción Nsi 1) (78S pb), digerido con Bam HI y Nsi I y clonado en el plásmido pGem-7Zf(-) previamente digerido con las mismas enzimas de restricción para generar pGem-Red wm (3740 pb). El gen rsGFP bajo el control de un promotor viral sintético tempranoltardio (ElL) fue amplificado por PCR del plásmido pG-dsRed2 utilizando los oligonucleótidos GFP-X (SEO ID No:

20 17. S'-CGTTGGTCTAGAGAGAAAA ATTG-3') (comprende el sitio de restricción Xbal) y GFP-E (SEO ID No: 18. S '-CTATAGAATTCTCAAGCTATGC-3') (comprende el sitio de restricción Eco RI) (832 pb), digerido con Xba I y Eco RI y clonado en el plásmido pGem-Red wm previamente digerido con las mismas enzimas de restricción para generar pGem-Red-GFP wm (4540 pb).

25 Posterionnente, el genoma de MVA-B fue utilizado como molde para la amplificación por PCR del flanco derecho del gen C6l (Nucleótidos 18689-19079 en el genoma de MVA. 391 pb), utilizando los oligonucleótidos RFC6L-Aatll-F (SEO ID No: 7. Nucleótidos 18689-18714 en el genoma de MVA) (comprende el sitio de restricción Aatll ) y RFC6l-Xbal-R (SEO ID No: 8. Nucleótidos 19054

30 19079 en el genoma de MVA) (comprende el sitio de restricción Xbal). Este flanco derecho fue digerido con Aatll y Xbal y clonado en el plásmido pGem-Red-GFP wm previamente digerido con las mismas enzimas de restricción para generar pGem-RG-RFsC6l wm (4898 pb). El flanco derecho repetido del gen C6l (Nucleótidos 18689-19079 en el genoma de MVA. 391 pb) fue amplificado por

PCR a partir del genoma de MVA-B con los oligonucleótidos RF'C6L-Xmal-F (SEO ID No: 9, Nucleótidos 18689-18714 en el genoma de MVA) (comprende el silio de restricción Xmal) y RF'C6L-Clal-R (SEO ID No: lO, Nucleótidos 1905419079 en el genoma de MVA) (comprende el sitio de restricción Clal), digerido con Xmal y Glal e insertado en el plásmido pGem-RG-RFsG6L wm digerido con XmallClal para generar pGem-RG-RFdG6L wm (5259 pb), El flanco izquierdo del gen G6L (Nucleótidos 19530-19942 en el genoma de MVA. 413 pb) fue amplificado por PGR a partir del genoma de MVA-B con los oligonucleótidos LFC6L-Glal-F (SEO ID No: 11, Nucleótidos 19530-19555 en el genoma de MVA) (comprende el sitio de restricción Glal) y LFG6L-BamHI-R (SEO ID No: 12. Nucleótidos 19917-19942 en el genoma de MVA) (comprende el sitio de restricción BamHI), digerido con Glal y BamHI e insertado en el plásmido pGemRG-RFdG6L wm digerido con GlallBam HI. El plásmido resultante pGem-RG-G6L wm (5642 pb) se confirmó mediante análisis de secuencia de AON y dirige la deleción del gen G6L del genoma de MVA y MVA-B,

Una vez generado el plásmido pGem-RG-G6L wm, la obtención de la

invención MVA-B .ó.C6L se realiza en cultivos celulares mediante un proceso de

recombinación entre el virus MVA-B y el plásmido pGem-RG-G6L wm , que contiene los flancos derecho e izquierdo del gen G6L. Asl, MVA-B LlC6L fue

construido mediante la selección en cultivos celulares de placas virales que

coexpresan dsRed2/rsGFP (expresan proteinas con fluorescencia roja y verde respectivamente), utilizando los genes dsRed2 y rsGFP como marcadores de selección transitorios, como se ha descrito previamente (García-Arriaza et al., 2010, PLoS One 5: eI2395). 3 x lO' células OF-l fueron infectadas con MVA-B a una multiplicidad de infección de 0.05 PFU/célula y luego fueron transfectadas 1 h más tarde con 6 ~g de AON del plásmido pGem-RG-G6L wm utilizando Lipofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, Después de 72 horas, las células se recogieron, se lisaron por ciclos de congelación-descongelación, fueron sonicadas y utilizadas para la selección de virus recombinantes. El mutante de deleción MVA-B LlG6L fue seleccionado de la progenie viral obtenida tras 6 rondas consecutivas de purificación de placas en células OF-l y durante este proceso las placas fueron seleccionadas entre aquellas con fluorescencia rojalverde, Asi, en los dos primeros pases, los virus

fueron seleccionados de entre placas que expresaban a la vez ambas proteínas

fluorescentes (dsRed2 y rsGFP, fluorescencia roja y verde). En los dos siguientes pases, la progenie viral de las placas seleccionadas sólo expresa un marcador fluorescente (Red2 o GFP) y en los dos últimos pases (6 pases en total) los virus 5 de las placas seleccionadas no expresan ningún marcador fluorescente debido a la pérdida de los genes dsRed2 y rsGFP. Asi, tras 6 rondas consecutivas de purificación de placas en células OF-l, se obtuvo el mutante de deleción MVA-B "'C6l y la deleción del gen C6l fue confirmada mediante amplificación por PCR dellocus de C6l, utilizando los oligonucleótidos RFC6l-Aatll-F y lFC6l-BamHI-R

10 (descritos previamente) y posterior análisis por secuenciación de AON. Asi, el gen C6l 01er SEO ID No: 1. 474 nUcleótidos, posiciones 19068-19541 en el genoma de MVA) ha sido delecionado totalmente en el genoma de MVA-B "'C6L. la deleción del gen C6l en MVA-B incluye las posiciones 19068 a 19541 del genoma de MVA.

15 Posteriormente, el virus recombinante MVA-B "'C6l obtenido fue crecido en células OF-l para obtener un preparado viral denominado P2, el cual fue crecido en células embrionarias de pollo (CEF), y purificado mediante centrifugación a través de dos colchones de sacarosa al 36% (w/v) en 10 mM Tris-HCI pH 9, tal y como se ha descrito previamente (Ramirez et al., 2000. J

20 Virol, 74 (2): 923-933. MVA-B "'C6l fue titulado en células OF-l mediante un ensayo de inmunotinción, utilizando un anticuerpo policlonal de conejo contra la estirpe de vaccinia WR (Centro Nacional de Biotecnologla; 1:1000) seguido de anti-rabbit-HRP (Sigma; 1: 1 000), tal y como se ha descrito previamente (Antaine et al., 1998. Virology 244: 365-396). la preparación de MVA-B "'C6l está libre de

25 micoplasmas o bacterias.

Partiendo de esta técnica de generación de virus recombinantes de MVA

con deleción en C6L, incluida en la presente memoria, y aunque sólo se ha

experimentado con MVA-B ",C6l, el plásmido pGem-RG-C6l wm (o uno similar

30 que contenga los flancos izquierdo y derecho del gen C6l) puede ser utilizado mediante una tecnologia similar a la propuesta aqui para delecionar el gen C6l sobre cualquier virus recombinante MVA que exprese otros antígenos heterólogos diferentes al aqui presentado 01IH, subtipo B), como antigenos de malaria, leishmania, virus de la hepatitis C, cáncer de próstata, etc; con el fin de poder ser

utilizados como vacunas frente a dichas enfermedades.

Ejemplo 2.-Caracterización in vitro de la invención MVA-B <lC6L.

La deleción de C6l en MVA·B <lC6l se confirmó mediante PCR utilizando oligonucleótidos capaces de amplificar el locus de C6l (Figura 1 B). la deleción de C6l en MVA-B <lC6l fue también confirmada mediante secuenciación del ADN. De fonma adicional, un análisis mediante Western blot confirmó que MVA-B <lC6l expresa los antígenos de VIH-l Bxoagp120 Y IIIBGPN al mismo nivel que su virus parental MVA-B (Figura lC).

Ejemplo 3.-C6 no es esencial en cultivos celulares.

El mero aislamiento del mutante de deleción MVA-B /lC6l demuestra que la proteína C6 no es esencial para la replicación de MVA. Para determinar si la deleción de C6l altera la replicación del virus, se comparó el crecimiento de MVAB /lC6l y MVA-B en células DF-l. los estudios de cinética viral revelaron que la deleción de C6l en el genoma de MVA-B no afecta a la replicación viral. Por lo tanto, C6l no es esencial para la propagación viral en cultivos celulares (Figura 1D). Además, y de forma similar al virus parental MVA-B y a MVA, MVA-B /lC6l es un virus atenuado que no replica en células de mamífero (Figura 1 E).

Ejemplo 4.-Expresión de la proteína C6 en E. coli y producción de anticuerpos policlonales anti-C6.

El marco de lectura abierto (ORF) de C6 (gen MVA 019l, 157 aa, 18.2 kDa. Ver SEO ID No: 1) fue amplificado mediante PCR utilizando los oligonucleótidos C6l-Nhel-F (SEO ID No: 13) (comprende el sitio de restricción Nhel) and C6lBamHI-R (SEO ID No: 14) (comprende el sitio de restricción BamHI), y el ADN de MVA como molde. El producto amplificado (Nucleótidos 19068-19541 en el genoma de MVA. 488 pb) fue digerido con Nhel y BamHI y clonado en el plásmido pET-27b(+) (Novagen). El producto de ligación fue utilizado para trasformar la cepa Bl21 de E.coli, y el plásmido de una colonia positiva resistente a kanamicina fue secuenciado para confirmar que contiene la secuencia del gen C6L. El plásmido generado fue denominado pET-27b-C6L (5837 pb). El plásmido pET27b(+) provee de una cola de 6 histidinas en el extremo carboxi terminal de la proteina C6, generando una proteína C6 recombinante de alrededor de 24 kDa.

Colonias resistentes a kanamicina fueron crecidas en medio Luria broth hasta

alcanzar una densidad óptica de 0.5 a 595 nm. IPTG fue añadido (0.5 mM) y el

5 cultivo se creció durante 4 horas más. las células se centrifugaron y para la lisis celular las células fueron resuspendidas en 50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0.3 M NaCI, 8 M Urea, e incubadas con lisozima (1 mg/ml) durante 30 minutos en presencia de phenylmethylsulfonyl fluoride (1 mM). la suspensión fue congelada-descongelada

dos veces, el debris celular se eliminó mediante centrifugación y el sobrenadante

10 fue incubado con resina Probound (Invitrogen). la elución fue llevada a cabo con diferentes concentraciones de imidazol (100 a 500 mM) en 50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0.3 M NaCI. las fracciones eluidas se agruparon, se cargaron en columnas desaladas siguiendo las instrucciones del fabricante (GE-HeaHhcare, Freiburg, Germany), y fueron recolectadas. la proteína fue cuantificada utilizando el ensayo

15 Bradford, fraccionada mediante 12% SDS-PAGE y analizada por Western blot utilizando un anticuerpo anti-His tag (1 :5000) para detectar la presencia de la

proteína C6 de vaccinia. Las fracciones que contienen la proteína C6 (con una

pureza estimada del 90%) fueron almacenadas en allcuotas a -20'C. la proteína C6 (1150 ~g) fue inyectada en conejos "New Zealand Wh~e" para producir suero 20 anti-C6 y anticuerpos policlonales de conejo anti-C6 (laboratorios Biomedal, Sevilla).

Ejemplo 5.-e6 se expresa de forma temprana en una infección viral. Análisis mediante Western blot utilizando anticuerpos policlonales de

25 conejo contra C6 (su generación se describe en el ejemplo 4) permiten la identificación de una proteina de 18.2 kDa en células DF-1 infectadas con MVA-B, pero no con MVA-B "C6l (Figura 2A). Posteriormente se determinó cómo se expresa C6 en células DF-1 infectadas con WR y MVA (Figura 2B). la expresión de C6 fue detectada a las 3 horas post-infección, y su expresión aumenta

30 fuertemente durante al menos 22 horas. El tratamiento de células DF-1, al inicio de la infección, con "cytosine arabinoside (AraC)", un inhibidor de la replicación del ADN viral y por tanto de la expresión de genes tardios, no inhibe la expresión de C6 sugiriendo que C6l es un gen temprano.

La localización intracelular de la proteína C6 fue examinada mediante

inmunofluorescencia en células DF-1 infectadas con diferentes estirpes de vaccinia (Figura 2C). C6 fue detectada en el citoplasma, presumiblemente en las factorias virales, de células DF-1 infectadas con WR, MVA y MVA-B, pero no con MVA-B ilC6L. la reducida intensidad de fluorescencia de C6 indica la expresión de bajos niveles de proteina en comparación con la protelna tardla A27.

Ejemplo 6.-MVA-B ilC6L aumenta la expresión de IFN-f! en macrófagos y

células dendríticas humanas.

Como un primer paso para determinar si C6 bloquea la respuesta de células inmunes innatas hacia MVA-B, examinamos mediante PCR a tiempo real la expresión de IFN-f!, genes inducidos por IFN-f! (IFIT1, IFIT2) Y quimiocinas por macrófagos humanos THP-1 infectados durante 1, 3 Y 6 horas con MVA, MVA-B y MVA-B "C6l (Figura 3A). Comparado con MVA y MVA-B, MVA-B ilC6l (5 PFUlcélula, Figura 3A y 1 PFUlcélula, datos no mostrados) incrementa de forma significativa la expresión de IFN-f3, así como de IFIT1 y IFIT2 en células THP-1. MVA-B "C6l también incrementa la expresión de MIP-1a y RANTES, pero no la de Il-8 y IP-10 (Figura 3A y datos no mostrados).

Para confirmar si C6 bloquea la expresión de IFN-f! y de genes dependientes de IFN-f! en células inmunes innatas, infectamos moDCs humanos con dosis crecientes (0.002, 0.02 Y 0.2 PFUlcélula) de MVA, MVA-B y MVA-B ilC6l y medimos los niveles de ARN mensajero de IFN-/3, IFIT1 Y IFIT2 a 6 horas post-infección (Figura 3B). Utilizamos bajas dosis de virus puesto que MVA induce apoptosis moOCs humanos (Guerra et al., 2007. J Virol 81: 8707-8721). los resultados mostraron que, de forma similar a los resultados obtenidos con células THP-1 humanas, MVA-B "C6l incrementa fuertemente la expresión de IFN-f! comparado con MVA y MVA-B en moOCs. Cuando se realizan las inlecciones a

0.2 PFU/ml, los tres virus analizados estimulan de forma similar la expresión de ARN mensajero de IFIT1 y IFIT2 en moDCs. Sin embargo, MVA-B ilC6l fue un inductor más potente que MVA y MVA-B a bajas dosis inlectivas (0.002 PFU/ml, Figura 3B). Además, MVA-B ilC6l estimula la liberación al medio por parte de moOCs de unos niveles más altos de IFN-f! (Figura 3C) y IFN tipo I que MVA y MVA-B (Figura 3D).

Asi, la deleción de C6l en el genoma de MVA-B promueve la producción de IFN-¡3, sugiriendo que C6 interfiere con la ruta de señalización que controla la expresión del gen de IFN-¡3 en células inmunes innatas.

Estudios anteriores mostraron que MVA es capaz de inducir IFN-¡3 en

5 células THP-1 que carecen de varios de los TlRs; y que dicha inducción es dependiente de los factores MDA-5 e IPS-l, pertenecientes a la ruta de señalización mediada por "retinoic acid-inducible gene I (RIG-l)-Iike receptors (RlRs)" (Delaloye et al., 2009. PloS Pathogens 5: el 000480). Por tanto, al

contrario de lo esperado por su homologia de secuencia con genes de vaccinia

10 que inhiben la ruta de los TlRs (Figura 4), C6 actúa inhibiendo la ruta de señalización mediada por RlRs bloqueando algún componente aún desconocido (Figura 5).

Ejemplo 7.-MVA-B "C6L induce la fosforilación de IRF3 en células THP-1 .

15 Para detenninar qué componente de la ruta de señalización mediada por RlRs que controla la expresión del gen de IFN-¡3 en células inmunes innatas pudiera estar bloqueado por C6 se realizaron infecciones en células THP-l con MVA, MVA-B y MVA-B "C6l y a distintos tiempos se recogieron extractos totales y se analizaron mediante Western blot utilizando un anticuerpo anti-fosfo IRF3.

20 los resultados mostraron que, en comparación con MVA y MVA-B, MVA-B "C6l induce una mayor fosforilacíón de IRF3, fenómeno observado principalmente a tiempos cortos post-infección (Figura 6). Este resultado demuestra que C6 bloquea la fosforilación de IRF3, aunque su diana aún es desconocida.

Ejemplo 8.-MVA-B "C6L aumenta la magnitud y la polifuncionalidad de la

respuesta de células T de memoria específicas frente a VIH-1.

Una vez mostradas las propiedades inmunomoduladoras de C6, expuestas

anterionnente en esta invención, pasamos a testar si la deleción de C6 en MVA-B

30 " C6l pudiera aumentar la inmunogenicidad in vivo analizando la respuesta inmune de células T específicas frente a VIH-l en ratones BAlB/c inmunizados con MVA-B o MVA-B " C6l utilizando un protocolo de inmunización ''DNA prime (100 ~g de DNA-B, intramuscular) I MVA boost (1 x la' PFU, intraperitoneal)" (García-Arriaza et al., 2010. PLoS One 5: e12395; Mooij et al., 2008. J Virol 82: 2975-2988; Gómez et al., 2007. CE, Vaccine 25: 2863-2885; Robinson et al., 2007. AIDS Res Hum Retroviruses 23: 1555-1562; Amara et al., 2002. J Viral 76: 7625-7631; Barouch et al., 2000. Science 290: 486-492). Animales inoculados con DNA vacío (DNA-~) y "boosted" con MVA fueron utilizados como controles. Considerando que las respuestas de células T de memoria pueden ser críticas para la protección contra la infección por VIH-l (Seder et al., 2008. Nat Rev Immunol 8: 247-258; Sallusto et al., 2004. Annu Rev Immunol 22: 745-763; Champagne et al., 2001 . Nature 410: 106-111; Sallusto et al., 1999. Nature 401 : 708-712), analizamos mediante IFN-y ELlSPOT y marcaje intracelular de citoquinas (ICS) el perfil inmunogénico a largo plazo (53 días después de la última inoculación) inducido en esplenocitos por la vacunación con DNA-B/MVA-B y DNA-B/MVA-B Ll.C6L.

El IFN-y ELlSPOT reveló que, comparado con MVA-B, MVA-B Ll.C6L aumentó 2.1 veces (p<0.005) la respuesta de células T de memoria secretoras de IFN-y especificas frente el péptido Gag-B de VIH-l (un péptido de VIH-l representativo del antígeno Gag) (Figura 7A). MVA, utilizado como control, no indujo ninguna respuesta memoria especifica de VIH-l .

El fenotipo de las células T de memoria específicas frente a VIH-l inducidas tras la inmunización con DNA-B/MVA-B y DNA-B/MVA-B Ll.C6L fue caracterizado mediante citometrla de flujo policromática utilizando ICS. Células T esplénicas CD4' y CD8' fueron ca-teñidas para los marcadores de superficie CD44 y CD62L con el fin de definir las diferentes sub-poblaciones de memoria: naIve (CD44-/CD62L'), "memoria central" (CM: CD44'/CD62L'), "memoria efectora" (EM: CD44'/CD62L-) y "memoria efectora terrninalmente diferenciada" (TEMRA: CD44-/CD62L} También se evaluó la producción de IFN-y y IL-2 después de la estimulación in vitro con diferentes "pooles" de péptidos de VIH-l (Env-pool, Gag-pool y GPN-pool) que cubren las secuencias enteras de VIH-l presentes en el vector poxviral (Figura 7B).

La respuesta inmune total especifica de VIH-l a los 53 días "post-boas\" fue mediada principalmente por células T CD8' (70%-85%) (Figura 7C) de fenotipos EM y TEMRA (Figura 7D), en ambos grupos de inmunización. Sin embargo, a diferencia de la inmunización con DNA-B/MVA-B, DNA-B/MVA-B

IIC6L indujo una mayor magnitud de la respuesta de células T C04· y C08· de memoria específicas frente a VIH-1 y productoras de IFN-r ylo IL-2 [Células T C04·: 1.91 % en ONA-B/MVA-B IIC6L vs. 1.30% en ONA-B/MVA-B, (p<0.005); Células T C08·: 10.95% en ONA-B/MVA-B IIC6L vs. 3.06% en ONA-B/MVA-B 5 (p<0.005)] (Figura 7C). Ambos vectores inducen un patrón similar de respuestas de células T C04· de memoria específicas frente a VIH-1 (con preferencia hacia Env) (Figura 7B y 7C). Interesantemente, el patrón de células T C08· de memoria específicas frente a VIH-1 fue diferente ente ambos vectores: ONA-B/MVA-B IIC6L indujo un mayor porcentaje de respuestas de células T C08· específicas !O frente a GPN, mientras que ONA-B/MVA-B indujo preferencialmente respuestas de células T COS· específicas frente a Env y Gag (Figura 7B y 7C). En ambos grupos de inmunización, las células T C08· específicas frente VIH-1 fueron principalmente de los fenotipos EM (60.5-63%) Y TEMRA (37%-39.5%) (Figura 70). Todas las células T C04· específicas frente VIH-1 fueron del fenotipo EM en

15 el grupo ONA-B/MVA-B. Aunque en el grupo ONA-B/MVA-B IIC6L, la mayoria de las células T C04· específicas frente VIH-1 fueron del fenotipo EM (S2.S%), un porcentaje sustancial de células (17.2%) expresaba el fenotipo TEMRA (Figura 70). No se detectaron células T de fenotipo CM productoras de IFN-r y/o IL-2 en ambos grupos de inmunización (Figura 70).

20 Para tener una medida detallada de la calidad de la respuesta de memoria de células T, evaluamos a continuación la producción de IFN-r y/o IL-2 por las células de memoria T C04· y COS· especificas frente VIH-1 (Figura 8). ONAB/MVA-B IIC6L incrementó la polifuncionalidad de las células de memoria T CD4· y COS· específicas frente VIH-1, consistiendo en células que producen a la vez

25 IFN-r y IL-2 [Células T C04·: 34% en ONA-B/MVA-B IIC6L vs. 16% en ONAB/MVA-B, (p<O.005); Células T COS·: 29% en ONA-B/MVA-B IIC6L vs. 16% en ONA-B/MVA-B, (p<0.005)] (Figura S).

Todos estos resultados, de forma conjunta, establecen que la inmunización

con ONA-B/MVA-B IIC6L incrementa significativamente la magnitud y la

30 polifuncionalidad de la respuesta de células de memoria T C04+ y COS· específicas frente VIH-1 , con la mayoría de la respuesta mediada por células T EM Y TEMRA. Tras la vacunación con ONA-BIMVA-B y ONA-B/MVA-B IIC6L las respuestas de células de memoria T C04· especificas frente VIH-1, fueron preferencialmente especificas frente a Env. ONA-B/MVA-B óC6L indujo una inmunodominancia frente a células de memoria T C08" especificas frente a GPN, mientras que ONA-BIMVA-B indujo preferencialmente células de memoria T C08" especificas frente a Env y Gag.

Ejemplo 9.-MVA-B óC6L aumenta los niveles de anticuerpos frente a la proteína gp120 de VIH-1. Puesto que las células infectadas con MVA-B liberan la proteína monomérica gp120 (Gómez et al., 2007. CE, Vaccine 25: 2863-2885), evaluamos si la

10 ínmunización con ONA-B/MVA-B y ONA-B/MVA-B óC6L estimulaba la producción de anticuerpos contra la proteína Env de VIH-l . Se extrajo suero de ratones individuales a 53 dlas "post-boost" y los anticuerpos anti-gpl20 fueron cuantificados mediante ELlSA, midiendo los niveles de anticuerpos específicos que reaccionan contra la proteína gp160 del aislado LAV de VIH-l (subtipo B), la

15 cual incluye gp120. Comparado con ONA-B/MVA-B, la inmunización con ONAB/MVA-B tlC6L incrementó 44 veces los niveles de anticuerpos reactivos frente a la proteína gp120 (Figura 9). Por lo tanto, MVA-B óC6L incrementa las respuestas inmunes humorales frente a la proteína Env de VIH-l.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un vector viral basado en un virus recombinante MVA. caracterizado por que la secuencia nucleotídica codificante para dicho vector comprende:

   a) al menos una mutación en la secuencia SEO ID No: 1 que codifica para la proteina C6l, y

   b) al menos una secuencia nucleotídica que codifica para un antígeno

   heterólogo.
2. 2. El vector viral basado en un virus recombinante MVA según la reivindicación 1, caracterizado por que la mutación en la secuencia SEO ID No: 1

   es una deleción parcial o total.
3. 3. El vector viral basado en un virus recombinante MVA según la

   reivindicación 2, caracterizado por que la mutación en la secuencia SEO ID No: 1

   es una deleción total.
4. 4. El vector viral basado en un virus recombinante MVA según las

   reivindicaciones 1-3, caracterizado por que la secuencia nucleotidica codificante para dicho vector comprende al menos una secuencia nucleotídica que codifica

   para un antígeno heterólogo seleccionado de entre el siguiente grupo: antigeno

   del VIH, antígeno de la malaria, antigeno de la leishmaniosis, antígeno del virus

   de la hepatitis e y antígeno del cáncer de próstata.
5. 5. El vector viral basado en un virus recombinanle MVA segú n las reivindicaciones 1-4, caracterizado por que la secuencia nucleotldica codificante para dicho vector comprende las secuencias nucleotldicas que codifican para los siguientes antlgenos del VIH: antlgenos gp120 y Gag-Pol-Nef de VIH de subtipo

   B. o de cualquier airo subtipo, bajo el control del promotor sintético viral tempranoltardío insertado dentro dellocus viral TK.
6. 6. Método de fabricación del vector viral basado en un virus recombinante

   MVA definido en las reivindicaciones 1-5, caracterizado por comprender las siguientes etapas:

   a) construir un plásmido que comprende en su secuencia nucleotídica las

   secuencias del flanco derecho y del flanco izquierdo de SEO ID No: 1, b)

   recombinar un virus recombinante MVA, que contiene al menos una secuencia nucleotídica que codifica para un antígeno heterólogo, con el

   plásmido generado en a) el cual dirige la mutación de SEO ID No: 1, y c) purificar el vector viral basado en un virus recombinante MVA definido en las reivindicaciones 1-5, obtenido en el paso b).
7. 7. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA definido en las reivindicaciones 1-5 en la fabricación de un medicamento o composición

   inmunogénica para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis C, y cáncer de próstata.
8. 8. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA según la

   reivindicación 7. caracterizado por que dicho medicamento o composición

   inmunogénica es para prevenir o tratar la enfermedad del VIH.
9. 9. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA definido en las reivindicaciones 1-5 en la fabricación de un medicamento o composición inmunogemca para usar como parte de un protocolo de inmunización para

   prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis C, y cáncer de próstata, en el que se administra al individuo al menos

   una dosis de vacunación.
10. 10. Uso del vector viral basado en un virus recombinanle MVA según la reivindicación 9 caracterizado por que dicho medicamento o composición

    inmunogénica se administra al individuo al menos una dosis de vacunación para:

    a) inducir una respuesta inmune de células T CD4+ y CD8+ de memoria antígeno específicas, ylo b) para inducir la expresión de IFN-j3 en células inmunes innatas.
11. 11. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA según la

    reivindicación 10, caracterizado por que dicho medicamento o composición inmunogénica se usa como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra al individuo al menos una dosis de vacunación, para prevenir o tratar la

    enfermedad del VIH .
12. 12. Uso del vector viral basado en un virus recombinante MVA según la

    5 reivindicación 10, caracterizado por que dicho medicamento o composición inmunogénica se usa como parte de un protocolo de inmunización en el que se

    administra al individuo al menos una dosis de vacunación de una combinación de vectores heter61ogos para prevenir o tratar una de las siguientes enfermedades:

    VIH , malaria, leishmaniosis, hepatitis e, y cáncer de próstata.
13. 13. Una composición inmunogénica caracterizada por que comprende al

    menos un vector viral definido en las reivindicaciones 1-5.
14. 14. Uso de la composición inmunogénica definida en la reivindicación 13 , en la

    15 fabricación de una vacuna para prevenir o tratar una de las siguientes

    enfermedades: VIH, malaria, leishmaniosis, hepatitis e, y cáncer de próstata.
15. 15. Uso de la composición inmunogénica según la reivindicación 14, caracterizada por que dicha vacuna es para prevenir o tratar el VIH.