ES2402576T3

ES2402576T3 - Ultrahumanización de anticuerpos por generación y selección de bibliotecas cohorte y blast de cdr maduras previstas

Info

Publication number: ES2402576T3
Application number: ES06809242T
Authority: ES
Inventors: Guido Cappucilli; Roberto Crea; Nurten Bayez; Toshihiko Takeuchi; Randy Shen; Ramesh Bhatt
Original assignee: Bioren LLC
Current assignee: Bioren LLC
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2013-05-06
Anticipated expiration: 2026-11-10
Also published as: WO2007054816A3; JP5791496B2; WO2007054816A2; EP1966374A2; CA2627075A1; JP2009515516A; JP2012097107A; US20090318297A1; US8716195B2; EP1966374B1

Abstract

Un procedimiento para producir una biblioteca de pUn procedimiento para producir una biblioteca de polinucleótidos que codifica al menos una región deolinucleótidos que codifica al menos una región determinantede la complementariedad (CDR) en la que terminantede la complementariedad (CDR) en la que el procedimiento comprende: (a) determinar la variel procedimiento comprende: (a) determinar la variación de secuencia de aminoácidos de la CDR presenación de secuencia de aminoácidos de la CDR presente en una biblioteca de anticuerposde referencia qte en una biblioteca de anticuerposde referencia que consiste en las CDR naturales como se define deue consiste en las CDR naturales como se define de acuerdo con el Índice EU, Kabat, Chothia odefinic acuerdo con el Índice EU, Kabat, Chothia odefinición de punto de contacto, en el que la variación dión de punto de contacto, en el que la variación de secuencia CDR se determina en cada posición deree secuencia CDR se determina en cada posición deresto de aminoácido de la CDR; (b) alinear una secuesto de aminoácido de la CDR; (b) alinear una secuencia peptídica CDR problema de un anticuerpo contrncia peptídica CDR problema de un anticuerpo contra un antígeno diana con lassecuencias CDR de la bia un antígeno diana con lassecuencias CDR de la biblioteca de anticuerpo de referencia; y (c) sintetblioteca de anticuerpo de referencia; y (c) sintetizar una biblioteca de polinucleótidos que codificizar una biblioteca de polinucleótidos que codifica secuencias CDR, en la que(i) el resto de aminoáca secuencias CDR, en la que(i) el resto de aminoácido codificado en cualquier posición simple dentroido codificado en cualquier posición simple dentro de una secuencia CDR esidéntico a un resto de ami de una secuencia CDR esidéntico a un resto de aminoácido en la posición alineada correspondiente denoácido en la posición alineada correspondiente de la secuencia peptídica de laCDR problema de un an la secuencia peptídica de laCDR problema de un anticuerpo dirigido contra un antígeno candidato; o ticuerpo dirigido contra un antígeno candidato; o (ii) es un resto, o restos, de aminoácido predeter(ii) es un resto, o restos, de aminoácido predeterminado si un resto de aminoácido idéntico para lasminado si un resto de aminoácido idéntico para lasecuencia peptídica de CDR problema en la posición ecuencia peptídica de CDR problema en la posición que se alinea no aparece en la biblioteca derefereque se alinea no aparece en la biblioteca dereferencia, por lo que se proporciona una biblioteca de ncia, por lo que se proporciona una biblioteca de polinucleótidos que codifica análogos de CDR de lapolinucleótidos que codifica análogos de CDR de la secuencia peptídicade CDR problema de un anticuer secuencia peptídicade CDR problema de un anticuerpo contra un antígeno diana, enriqueciéndose los apo contra un antígeno diana, enriqueciéndose los análogos de CDR deaminoácidos que existen en estadonálogos de CDR deaminoácidos que existen en estado natural en una o más posiciones de restos. natural en una o más posiciones de restos.

Description

Ultrahumanización de anticuerpos por generación y selección de bibliotecas cohorte y blast de cdr maduras previstas

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos tienen una gran importancia como herramientas de investigación y aplicaciones para diagnóstico y terapéuticas. Sin embargo, la identificación de dichos anticuerpos útiles es difícil y, frecuentemente, especialmente si se contemplan aplicaciones terapéuticas, requiere un considerable rediseño de “humanización” antes de que el anticuerpo sea adecuado para la administración.

Procedimientos anteriores para identificar anticuerpos deseables han implicado típicamente presentación de fagos de anticuerpos representativos, por ejemplo bibliotecas humanas o bibliotecas sintéticas, sin embargo, estos enfoques tienen limitaciones. Por ejemplo, la mayoría de las bibliotecas humanas solo contienen la diversidad de secuencias de anticuerpos que puede capturarse experimentalmente o clonarse a partir del tejido fuente. Por consiguiente, la biblioteca humana puede carecer o infrarrepresentar otras secuencias de anticuerpos valiosas. Las bibliotecas sintéticas o consenso tienen otras limitaciones tales como la posibilidad de codificar secuencias de origen no natural que tiene la posibilidad de ser inmunogénicas. Además, las bibliotecas sintéticas, en un esfuerzo de ser exhaustivas, frecuentemente contienen demasiada diversidad y son difíciles de seleccionar. Además, estas bibliotecas, cuando se usan para identificar un anticuerpo candidato que se une a una diana particular, no pueden tratarse por técnicas de maduración por afinidad de seguimiento lógico para mejorar la unión de la molécula candidata. Por ejemplo, con frecuencia los procedimientos para realizar una mejora posterior de anticuerpos implican la mutagénesis in vitro tal como mutagénesis aleatorizada, mutagénesis por saturación, PCR propensa a error, redistribución de genes y redistribución de cadenas de anticuerpos. Estos enfoques son intrínsecamente estocásticos y a menudo requieren la construcción de bibliotecas extremadamente grandes para explorar cualquier diversidad de secuencia significativa. A medida que el número de posiciones a mutar en un anticuerpo determinado se hace más grande, el tamaño de la biblioteca resultante es tan grande de lo que puede explorarse de manera viable.

Un procedimiento recientemente identificado ha descrito la construcción por ordenador (y opcionalmente in vitro) de bibliotecas de anticuerpos universales que sistemáticamente representan anticuerpos candidatos no inmunogénicos de origen natural que poseen propiedades deseadas, por ejemplo bibliotecas que son completamente representativas de la diversidad de CDR natural prevalente conocida (por ejemplo, frecuencia !10% en una población examinada) en la línea germinal (por ejemplo anticuerpos derivados de la base de datos V BASE) y/o en anticuerpos maduros (por ejemplo, anticuerpos derivados de la base de datos de Kabat).

Existe una necesidad de un procedimiento lógico, eficaz mediante el cual la información con respecto a la diversidad de secuencia natural que está contenida dentro de las bibliotecas de referencia, tales como bibliotecas universales de anticuerpos, pueden aprovecharse óptimamente para mejorar el diseño de los anticuerpos (por ejemplo diseño de nuevos anticuerpos humanos que posean una afinidad óptima y una mínima inmunogenicidad).

Sumario de la invención

La presente invención resuelve el problema anterior proporcionando un procedimiento mediante el cual al menos una secuencia CDR de un anticuerpo problema puede usarse para buscar una biblioteca de anticuerpos de referencia (por ejemplo, una biblioteca universal de anticuerpos) para identificar nuevas secuencias CDR candidatas para su uso en nuevos anticuerpos y/o sus fragmentos.

En una realización, la invención presenta procedimientos de generación de bibliotecas de secuencias (bibliotecas cohorte) que comprenden al menos una secuencia CDR que representa solo una diversidad natural prevalente conocida presente en la biblioteca de referencia (por ejemplo, una biblioteca universal de anticuerpos) en cualquier resto de CDR seleccionado. La diversidad de secuencia resto por resto alineada presente dentro de las secuencias de dominio CDR de la biblioteca de referencia puede clasificarse independientemente para generar nuevas secuencias CDR como miembros de dichas bibliotecas CDR cohorte.

Aunque las bibliotecas de CDR de producción (cohorte) de la invención están predominantemente comprendidas por una diversidad de secuencias humanas resto por resto seleccionada a partir de una biblioteca de referencia (diversidad), los procedimientos de la presente invención también permiten “fijar” determinados restos CDR en la secuencia (o secuencias) de la biblioteca de producción para coincidir con el resto presente en, por ejemplo, una secuencia problema alineada en esa posición de resto. La fijación de determinados restos de secuencia de producción (biblioteca cohorte) como restos de secuencia problema puede implicar la realización de los procedimientos de la invención usando una estrategia de “alineamiento con huecos”. Dicha estrategia de alineamiento con huecos también puede emplearse para proporcionar suficiente flexibilidad a los procedimientos de la presente invención para permitir la presencia de inserciones y/o deleciones (in/del) de uno o más nucleótidos de longitud, tras el alineamiento de secuencias de la biblioteca de referencia (diversidad) y problema y/o durante la generación de secuencias de producción (biblioteca cohorte).

Los procedimientos de la presente invención también permiten el uso de comparaciones de similitud entre restos de la secuencia de la biblioteca y problema para ajustar la diversidad global de una biblioteca CDR de producción (cohorte) de una manera lógica. En dichas realizaciones, los veinte restos de aminoácidos de mamíferos de origen natural se asignan a siete grupos distintos en base a las características de la cadena lateral. Si un resto problema en una posición CDR determinada no coincide con un resto de la biblioteca de la diversidad humana en la misma posición, el uso de dicha similitud de comparación puede permitir la selección de uno o más restos similares como un componente de la biblioteca de producción (cohorte) en una posición de resto, si dicho resto similar estuviera presente en la biblioteca de referencia (diversidad). La implementación de un criterio de similitud para la selección de restos CDR de producción (cohorte) puede producir bibliotecas de cohorte de complejidad reducida, en comparación con el uso de un criterio de identidad (en el que la ausencia de identidad entre un resto de la secuencia problema y el resto (o restos) de la biblioteca de referencia (diversidad) en esa posición da como resultado el uso de todos los restos CDR presentes en la biblioteca de referencia (diversidad) en esa posición en la biblioteca de producción (cohorte) resultante en la posición correspondiente). Dichos criterios de similitud también pueden implementarse de una manera permisiva o limitante para cualquier posición de resto CDR seleccionada. En determinadas realizaciones, la implementación de criterios de similitud puede dar como resultado la selección de un solo resto de aminoácido a partir de la biblioteca de referencia (diversidad) que es similar al resto de la secuencia problema correspondiente para la incorporación en las secuencias de la biblioteca de producción (cohorte) en esa posición. En otras realizaciones, puede seleccionarse más de un resto de aminoácido de la biblioteca de referencia (diversidad) con respecto a un resto de la secuencia problema en una posición determinada para su uso en las secuencias de la biblioteca de producción (cohorte) de la invención. En la más permisiva de dichas realizaciones, todos los restos similares presentes en la biblioteca de referencia (diversidad) en un determinado resto no idéntico (entre la secuencia problema y la biblioteca de referencia) están representados en la biblioteca de secuencia de producción (cohorte) en ese resto (denominado como un criterio “del todo similar”). Los procedimientos de la invención pueden realizarse usando los criterios anteriores (restos fijos/alineamientos con huecos, in/del, criterios de similitud de cualquier grado de permisividad y/o criterios de identidad) en cualquier combinación, en cualquier posición de resto seleccionada para la generación de una secuencia (o secuencias) de una biblioteca de producción (cohorte). (Los criterios aplicados a una posición de resto de una secuencia problema pueden ser por lo tanto distintos de los aplicados a un resto adyacente dentro de la misma secuencia).

Las bibliotecas CDR cohorte seleccionadas y/o secuencias seleccionadas derivadas de las bibliotecas CDR cohorte de la invención pueden combinarse con otras (y con secuencias de dominio armazón seleccionadas; por ejemplo, mediante SOE (extensión solapada sencilla) génica) para producir bibliotecas de anticuerpos completamente nuevas que comprendan al menos un anticuerpo o fragmento del mismo que incorpore predominantemente variación CDR natural cuando se examina resto por resto, minimizando así la probabilidad de que dichos anticuerpos o fragmentos nuevos sean inmunogénicos.

Debido a que la complejidad de cualquier biblioteca CDR seleccionada de la invención se minimiza con respecto a otras formas aleatorizadas de bibliotecas CDR sintéticas, las bibliotecas CDR seleccionadas de la invención (por ejemplo, bibliotecas independientes de CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 de VH, etc.) también pueden clasificarse independientemente entre sí para producir nuevas bibliotecas de anticuerpos que, por ejemplo, representen toda la diversidad humana a través de todas las secuencias CDR en los restos de aminoácidos en los que una secuencia CDR problema no es idéntica a ningún resto de aminoácido CDR de la biblioteca de referencia en esa posición, sin embargo son de un tamaño que puede explorarse fácilmente usando tecnologías actuales (por ejemplo, complejidades de biblioteca de menos de aproximadamente 1012 a 1015, más preferentemente de 10 a 1012 o intervalos o rangos en su interior). La presente invención también presenta composiciones producidas por los procedimientos de la presente invención, así como dispositivos para realizar los procedimientos caracterizados en la presente invención.

Por lo tanto la presente invención presenta un procedimiento de producción de una biblioteca de polinucleótidos que codifica al menos una región determinante de la complementariedad (CDR), en el que el procedimiento comprende determinar la variación de secuencia de aminoácidos de la CDR presente en una biblioteca de anticuerpos de referencia que comprende regiones de aminoácidos CDR naturales, en la que la variación de secuencia de la CDR se determina en cada posición de resto de aminoácido de la CDR, alineando una secuencia peptídica CDR problema a partir de un anticuerpo contra antígenos diana con las secuencias CDR de una biblioteca de anticuerpo de referencia; y sintetizando una biblioteca de polinucleótidos que codifica secuencias CDR, en la que para la mayoría de las secuencias CDR de la biblioteca sintetizada el resto de aminoácido codificado en cualquier posición sencilla dentro de una secuencia CDR es idéntico a un resto de aminoácido en la posición alineada correspondiente de la secuencia peptídica CDR problema a partir de un anticuerpo contra un antígeno candidato; o es un resto (o restos) de aminoácido predeterminado si un resto de aminoácido idéntico para la secuencia peptídica CDR problema en la posición que se alinea no aparece en la biblioteca de referencia, mediante lo cual se proporciona una biblioteca de polinucleótidos que codifica análogos de CDR de la secuencia peptídica CDR problema a partir de un anticuerpo contra un antígeno diana, enriqueciéndose los análogos de CDR de restos de aminoácidos de origen natural en una

o más posiciones de restos. En una realización, la longitud de los aminoácidos de la CDR problema que se está alineando es 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25. En otra realización, el resto de aminoácido predeterminado es un resto de aminoácido de cadena lateral pequeña seleccionado del grupo que consiste en Glicina (G) y Alanina (A); un resto de aminoácido de cadena lateral nucleófila seleccionado del

grupo que consiste en Serina (S), Treonina (T), Cisteína (C) e Histidina (H); un resto de aminoácido de cadena lateral hidrófoba seleccionado del grupo que consiste en Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I), Metionina (M) y Prolina (P); un resto de aminoácido de cadena lateral aromática seleccionado del grupo que consiste en Fenilalanina (F), Tirosina (Y) y Triptófano (W); un resto de aminoácido de cadena lateral ácida seleccionado del grupo que consiste en Aspartato (D) y Glutamato (E); un resto de aminoácido de cadena lateral amida seleccionado del grupo que consiste en Asparagina (N) y Glutamina (Q); o un resto de aminoácido de cadena lateral básica seleccionado del grupo que consiste en Lisina (K) y Arginina (R). En determinadas realizaciones, el alineamiento se realiza mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en alineamiento con huecos, alineamiento completo, alineamiento discontinuo o combinaciones de los mismos. En otra realización, la CDR se define de acuerdo con el índice EU, Kabat, Chothia o basándose en la definición de punto de contacto. También se describe una biblioteca producida por el procedimiento anterior.

En una divulgación adicional se describe una biblioteca de regiones de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) en la que para una mayoría de secuencias CDR de la biblioteca el resto de aminoácido en cualquier posición sencilla dentro de la secuencia CDR es idéntico a un resto de aminoácido en una posición alineada correspondiente de una secuencia peptídica CDR problema a partir de un anticuerpo contra un antígeno diana; o un resto (o restos) de aminoácido predeterminado si un resto de aminoácido idéntico para la secuencia peptídica CDR problema en la posición alineada no aparece en una biblioteca de referencia, mediante la cual se proporciona una biblioteca de análogos CDR de la secuencia peptídica CDR problema a partir de un anticuerpo contra un antígeno candidato, enriqueciéndose los análogos CDR de secuencias de aminoácidos de origen natural en una o más posiciones de restos. De acuerdo con la divulgación el antígeno diana de la biblioteca de anticuerpos de referencia es una proteína, un péptido, una molécula pequeña, un lípido, un polisacárido o un polinucleótido.

De acuerdo con la divulgación, la secuencia peptídica CDR problema es una secuencia CDR sintética o una secuencia CDR de vertebrado, o la secuencia CDR de vertebrado es de ser humano, primate, murina, de rata, conejo o pollo.

De acuerdo con la divulgación, la secuencia peptídica CDR problema se une a un antígeno diana. En realizaciones relacionadas, el antígeno diana es una proteína, un péptido, una molécula pequeña, un polisacárido o un polinucleótido. De acuerdo con la divulgación, más del 10%, más del 50% o más del 80% de las secuencias de la biblioteca comprenden secuencias CDR naturales conocidas. De acuerdo con la divulgación, la biblioteca comprende solo una diversidad natural conocida de cualquier CDR determinada. De acuerdo con la divulgación la biblioteca comprende toda la diversidad CDR conocida de una CDR humana. De acuerdo con la divulgación, la biblioteca comprende toda la diversidad CDR conocida de una clase de antígeno. De acuerdo con la divulgación el análogo CDR se selecciona del grupo que consiste en CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y combinaciones de los mismos. De acuerdo con la divulgación, la secuencia CDR problema se selecciona del grupo que consiste en CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3. De acuerdo con la divulgación se alinea más de una CDR, en la que la diversidad de secuencia de una biblioteca CDR sintética se define, expande o limita basándose en la variabilidad de una CDR unida linealmente.

De acuerdo con la divulgación, la CDR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos de la biblioteca cohorte mostrada en cualquiera de las Figuras 13 o 16-27. De acuerdo con la divulgación la CDR-H2 comprende una secuencia de aminoácidos de la biblioteca cohorte mostrada en cualquiera de las figuras 13 o 16-27. De acuerdo con la divulgación la CDR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos de la biblioteca cohorte mostrada en cualquiera de las Figuras 13 o 16-27. De acuerdo con la divulgación la CDR.L1 comprende una secuencia de aminoácidos de la biblioteca cohorte mostrada en cualquiera de las Figuras 13 o 16-27. De acuerdo con la divulgación la CDR-L2 comprende una secuencia de aminoácidos de la biblioteca cohorte mostrada en cualquiera de las Figuras 13 o 16-27. De acuerdo con la divulgación la CDR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos de la biblioteca cohorte mostrada en cualquiera de las Figuras 13 o 16-27.

De acuerdo con la divulgación la CDR-L1 de cadena ligera (lambda (L)) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 44. De acuerdo con la divulgación, la CDR-L1 de cadena ligera (kappa (K)) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura. De acuerdo con la divulgación, la CDR-L2 de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 44. De acuerdo con la divulgación la CDR-L3 de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 44.

De acuerdo con la divulgación, el análogo de CDR comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las Figuras 9-31, 34-36 o 44-61. De acuerdo con la divulgación, los análogos de CDR comprenden una diversidad en la que uno o más restos dentro de los análogos CDR se representan usando codones regenerados, mutagénesis walk-through o mutagénesis look-through. De acuerdo con la divulgación las regiones de unión al anticuerpo comprenden adicionalmente una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. De acuerdo con la divulgación las regiones de unión a antígeno comprenden adicionalmente regiones marco conservadas naturales de ser humano, primate, murino, rata, conejo o pollo. De acuerdo con la divulgación las regiones marco conservadas naturales son VH1, VH3 o VH4. De acuerdo con la divulgación las regiones marco conservadas humanas son regiones marco conservadas de cadena ligera, regiones marco conservadas de cadena pesada, regiones marco conservadas interclonadas, regiones marco conservadas consenso o sus combinaciones.

De acuerdo con la divulgación las regiones marco conservadas humanas se han seleccionado de acuerdo con su frecuencia de aparición en conexión lineal con una o más regiones CDR humanas. De acuerdo con la divulgación, las regiones marco conservadas humanas entre las CDR son del mismo isotipo. De acuerdo con la divulgación, la biblioteca de la invención es una biblioteca de expresión. De acuerdo con la divulgación, la biblioteca de expresión se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de ribosomas, una biblioteca de presentación de polisomas, una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de virus, una biblioteca de expresión bacteriana, una biblioteca de presentación de levaduras y una biblioteca de presentación de mamíferos. De acuerdo con la divulgación, la biblioteca se produce sintetizando polinucleótidos que codifican una o más regiones marco conservadas y una o más regiones CDR en las que los polinucleótidos son predeterminados, en las que los polinucleótidos que codifican dichas regiones comprenden adicionalmente una secuencia de solapamiento suficiente mediante la cual las secuencias de polinucleótidos, en condiciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pueden ensamblarse en polinucleótidos que codifican regiones de unión a anticuerpo completas. De acuerdo con la divulgación se presenta una región de unión a anticuerpo codificada por un polinucleótido de la biblioteca de la invención. De acuerdo con la divulgación se presenta un procedimiento de identificación de un polipéptido que tiene una afinidad de unión deseada que comprende expresar la biblioteca de expresión de la invención para producir regiones de unión de anticuerpo, y explorar las regiones de unión de anticuerpo para seleccionar una región de unión a anticuerpo que tenga una afinidad de unión deseada. De acuerdo con la divulgación la exploración comprende poner en contacto la región de unión de antígeno con un sustrato diana, asociándose la región de unión de anticuerpo con el polinucleótido que codifica la región de unión de anticuerpo. De acuerdo con la divulgación, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de identificar el polinucleótido que codifica la región de unión a anticuerpo seleccionada. De acuerdo con la divulgación el polinucleótido se asocia con la región de unión de anticuerpo usando una presentación de expresión seleccionada del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de ribosomas, una biblioteca de presentación de polisomas, una biblioteca de presentación de fagos, una biblioteca de presentación de virus, una biblioteca de expresión bacteriana, una biblioteca de presentación de levaduras y una biblioteca de presentación de mamíferos. Una divulgación adicional presenta una región de unión a anticuerpo identificada de acuerdo con los procedimientos anteriores.

De acuerdo con la divulgación una o más etapas de los procedimientos presentados de la invención se realizan con ayuda de ordenador. Una divulgación adicional presenta un medio adecuado para su uso en un dispositivo electrónico que tiene instrucciones para realizar una o más etapas de los procedimientos de la invención. Una divulgación adicional presenta un dispositivo para realizar una o más etapas de los procedimientos de la invención.

Una divulgación adicional presenta una biblioteca de polinucleótidos que codifica regiones de unión a anticuerpo que comprenden una o más regiones marco conservadas que tienen una secuencia expuesta en cualquiera de las figuras o tablas; y una o más regiones CDR que tienen una secuencia expuesta en cualquiera de las figuras o tablas en que las regiones marco conservadas de a) y regiones CDR de b) forman juntas una región de unión a anticuerpo contra un antígeno predeterminado.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un esquema para realizar la construcción de una biblioteca universal de anticuerpos presentada en determinadas realizaciones de la invención usando bioextracción de bases de datos asistida por ordenador. La Figura 2 destaca el procedimiento de selección de la presente invención mediante el cual se usa una sonda CDR mAb problema para la identificación por ordenador de bibliotecas cohorte, que luego pueden usarse para enfoques de exploración in vitro para identificar clones de cohorte optimizados. La Figura 3 muestra una vista global del procedimiento mediante el cual puede construirse una biblioteca universal de anticuerpos cotejada, para su uso en la búsqueda de cohorte. La Figura 4 proporciona una vista global del proceso mediante el cual se generan tablas de frecuencia CDR1 y CDR2. La Figura 5 muestra una partición ejemplar de secuencias marco conservadas UAL y CDR entre las clases VH (SEC ID Nº: 1-5, respectivamente, en orden de aparición), CDR1 VK (SEC ID Nº: 6-8, respectivamente, en orden de aparición) y V∀ (SEC ID Nº: 9-12, respectivamente en orden de aparición). La Figura 6 muestra el ensamblaje ejemplar de cadenas pesadas UAL, que permiten cruzamientos de región marco conservada de CDR1 y CDR2. La Figura 7 muestra el ensamblaje ejemplar de cadenas ligeras kappa UAL, que permiten cruzamientos de región marco conservada de CDR1 y CDR2. Las secuencias VK-3_CDR1-7, VK-1_CDR2-10 y VK-3_CDR2-10 se desvelan como SEC ID Nº: 167, 276 y 278, respectivamente. La Figura 8 muestra el ensamblaje ejemplar de cadenas ligeras lambda UAL, que permite cruzamientos de región marco conservada de CDR1 y CDR2. Las secuencias VL-1_CDR2-10, VL-2_CDR2-10 y VL-3_CDR2-10 se desvelan como SEC ID Nº: 280. La Figura 9 muestra histogramas de frecuencia de población de restos de aminoácidos posición por posición para las cuatro estructuras canónicas (La Figura 9A muestra la CS1-A (SEC ID Nº: 636) y CS1-1 (SEC ID Nº: 637), mientras que la Figura 9B muestra CS1-2 (SEC ID Nº: 638) y CS1-3 (SEC ID Nº: 639)) identificadas para secuencias CDR2 de clase de isotipo VH-4 de 12 restos de longitud. Se observa que las distribuciones de las frecuencias de población varían entre las cuatro subclases en las posiciones de restos variables.

La Figura 10 (UAL de tipo BLAST con sonda CDR1 de ratón VH CDR1 “TNYGMN” (SEC ID Nº: 13)) muestra el uso ejemplar de una secuencia peptídica CDR1 derivada de un anticuerpo de ratón para identificar la diversidad de secuencia presente en cada posición de amino CDR1 en las secuencias CDR1 humanas presentes en bibliotecas universales de anticuerpo de referencia CDR1 VH-1 (SEC ID Nº: 14) y CDR1 VH-3 (SEC ID Nº: 15). La Figura 11 (UAL de tipo BLAST con la sonda CDR2 de ratón VH CDR2 “WMGWINTYTGEPT” (SEC ID Nº: 16)) muestra el uso ejemplar de una secuencia peptídica CDR2 derivada de un anticuerpo de ratón para identificar la diversidad de secuencia presente en cada posición de aminoácido CDR2 en secuencias CDR2 humanas presentes en bibliotecas universales de anticuerpos de referencia VH-1 CDR2 (SEC ID Nº: 17) y VH3 CDR2 (SEC ID Nº: 18). La Figura 12 muestra bibliotecas cohorte cuantificadas ejemplares en las que se calcula la diversidad de bibliotecas cohorte generadas por clasificación independiente de diversidad de biblioteca de referencia para generar nuevas secuencias de anticuerpos. La Figura 13 muestra selecciones CDR de biblioteca cohorte en forma de tabla para cadenas pesada (Figura 13A-1 a 13A-4) y ligera (kappa, Figura 13B-1 a 13B-3) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo A4.6.1 Avastin de ratón. En la Figura 13A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 13 y 15, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 13 y 14, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 13A-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 16 y 17, respectivamente. En la Figura 13A-3 se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 16 y 18, respectivamente. En la Figura 13A-4 se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como se SEC ID Nº: 19 y 20, respectivamente. En la Figura 13B-1 se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 21 y 22, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 21 y 249, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 13B-2 se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 23 y 24, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 23 y 25, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 13B-3 se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 26 y 27, respectivamente. La Figura 14 (paneles A-E) representa la selección de secuencias CDR de biblioteca cohorte para cadenas pesadas y ligeras usando secuencia problema derivada de un anticuerpo monoclonal anti-gp41 de VIH de ratón. Se subrayan los restos de la tríada catalítica. En la Figura 14A, se desvelan las secuencias como SEC ID Nº: 28-31, respectivamente, en orden de aparición. En la Figura 14B, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 32 y 33, respectivamente. En la Figura 14C, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 32 y 34, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 35 y 36, respectivamente en la segunda tabla. En la Figura 14D, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 30 y 37, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 30 y 38, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 14E, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 31 y 39, respectivamente. La Figura 15 (paneles A-D) representa la selección de secuencias CDR de biblioteca de cohorte para cadenas pesada y ligera usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo HK14 humano. En la Figura 15A, la secuencias se desvelan como SEC ID Nº: 40-43, respectivamente, en orden de aparición. En la Figura 15B, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 41 y 44, respectivamente. En la Figura 15C, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 42 y 45, respectivamente. En la Figura 15D, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 43 y 46, respectivamente. La Figura 16 muestra selecciones de CDR de biblioteca de cohorte presentada en tablas para cadenas pesada (Figura 16A-1 a 16A-4) y ligera (kappa, Figura 16B-1 a 16B-3) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo AAV293 MCP-1 humano. En la Figura 16A-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 47 y 48, respectivamente en la primera tabla y SEC ID Nº: 49 y 50, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 16A-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 51 y 52, respectivamente. En la Figura 16A-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 51 y 53, respectivamente. En la Figura 16A-4, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 54 y 55, respectivamente. En la Figura 16B-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 56 y 57, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 56 y 58, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 16B-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 59 y 60, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 59 y 60, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 16B-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 59 y 582, respectivamente, en la primera tabla, y SEC ID Nº: 61 y 62, respectivamente en la segunda tabla. La Figura 17 muestra selecciones de CDR de biblioteca de cohorte presentada en tablas para cadenas pesada (Figura 17A-1 a 17A-4) y ligera (kappa, Figura 17B-1 a 17B-3) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo ACZ885 de ratón. En la Figura 17A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 63 y 64, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 63 y 65, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 17A-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 66 y 67, respectivamente. En la Figura 17A-3, se desvelan

secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 66 y 68, respectivamente. En la Figura 17A-4, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 69 y 70, respectivamente. En la Figura 17B-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 71 y 72, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 71 y 73, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 17B-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 74 y 75, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 74 y 76, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 17B-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 77 y 78. La Figura 18 muestra selecciones CDR de una biblioteca de cohorte representada en tabla para cadenas pesada (Figura 18A-1 a 18A-4) y ligera (kappa, Figura 18B-1 a 18B-3) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo ITH52 gp120 humano. En la Figura 18A-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 79 y 80, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 79 y 81, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 18A-2, se desvelan la secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 82 y 83, respectivamente. En la Figura 18A-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 82 y 84, respectivamente. En la Figura 18A-4, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: NOS 85 y 86, respectivamente. En la Figura 18B-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 87 y 88, respectivamente, en ambas tablas. En la Figura 18B-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 89 y 90, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 89 y 91, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 18B-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 92 y 93, respectivamente. La Figura 19 muestra selecciones de CDR de una biblioteca cohorte representada en tabla para cadenas pesada (Figura 19A-1 a 19A-4) y ligera (kappa, Figura 19B-1 a 19B-2) usando secuencias problemas derivadas de un anticuerpo ITH52 gp120 scFv humano. En la Figura 19A-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 94 y 95, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 94 y 96, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 19A-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 97 y 98, respectivamente, En la Figura 19A-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 97 y 99, respectivamente. En la Figura 19A-4, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 100 y 101, respectivamente. En la Figura 19B-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 102 y 103, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 104 y 105, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 19B-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 104 y 106, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 107 y 108, respectivamente, en la segunda tabla. La Figura 20 muestra selecciones CDR de bibliotecas cohorte representada en tablas para cadenas pesada (Figura 20A-1 a 20A-4) y ligera (kappa, Figura 20B-1 a 20B-3) usando las secuencias problema derivadas de un anticuerpo de Herceptina 4D5 humano. En la Figura 20A-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 109 y 110, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 109 y 111, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 20A-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 112 y 113, respectivamente. En la Figura 20A-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 112 y 114, respectivamente. En la Figura 20A-4, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 115 y 116, respectivamente. En la Figura 20B-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 117 y 118, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 117 y 119, respectivamente en la segunda tabla. En la Figura 20B-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 120 y 121, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 120 y 122, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 20B-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 123 y 124, respectivamente. La Figura 21 muestra selecciones de CDR de biblioteca cohorte representada en tabla para cadenas pesada (Figura 21A-1 a 21A-4) y ligera (kappa, Figura 21B-1 a 21B-3) usando secuencias problema derivadas de un anticuerpo de CD19 HD37 humano. En la Figura 21A-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 125 y 126, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 125 y 127, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 21A-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 128 y 129, respectivamente. En la Figura 21A-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 128 y 130, respectivamente. En la Figura 21A-4, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 131 y 132, respectivamente. En la Figura 21B-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 133 y 134, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 133 y 135, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 21B-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 136 y 137, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 136 y 138, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 21B-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 139 y 140, respectivamente. La Figura 22 muestra selecciones CDR de una biblioteca cohorte representada en tablas para cadenas pesada (Figura 22A-1 a 22A-3) y ligera (kappa, Figura 22B-1 a 22B-3) usando secuencias problema derivadas de un

anticuerpo g10-1 de CD8 humano. En la Figura 22A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 141 y 142, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 141 y 143, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 22A-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 144 y 145, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 144 y 146, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 22A-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 147 y 148, respectivamente. En la Figura 22B-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 149 y 150, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 149 y 151, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 22B-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 152 y 153, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 152 y 154, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 22B-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 155 y 156, respectivamente. La Figura 23 muestra selecciones CDR de biblioteca cohorte representada en tablas para cadenas pesada (Figura 23A-1 a 23A-3) y ligera (kappa, Figura 23B-1 a 23B-3) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo C5 5G1.1 de ratón. En la Figura 23A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 157 y 158, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 157 y 159 en la segunda tabla. En la Figura 23A-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 160 y 161, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 160 y 162, respectivamente en la segunda tabla. En la Figura 23A-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 163 y 164, respectivamente. En la Figura 23B-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 165 y 166, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 165 y 167, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 23B-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 168 y 169, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 168 y 170, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 23B-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 171 y 172, respectivamente. La Figura 24 muestra selecciones CDR de biblioteca cohorte representada en tablas para cadenas pesada (Figura 24A-1 a 24A-4) y ligera (kappa, Figura 24B-1 a 24B-3) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo 7E3 Reopro de ratón. En la Figura 24A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 173 y 174, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 173 y 175, respectivamente en la segunda tabla. En la Figura 24A-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 176 y 177, respectivamente. En la Figura 24A-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 176 y 178, respectivamente. En la Figura 24A-4, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 179 y 180, respectivamente. En la Figura 24B-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: Nº: 181 y 182, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 181 y 183, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 24B-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 184 y 185, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 184 y 186, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 24B-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 187 y 188, respectivamente. La Figura 25 muestra selecciones CDR de biblioteca cohorte representadas en tablas para cadenas pesada (Figura 25A-1 a 25A-3) y ligera (kappa, Figura 25B-1 a 25B-3) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo MHM24 Raptiva de ratón. En la Figura 25A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón como SEC ID Nº: 189 en la primera tabla y secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 189 y 191, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 25A-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 192 y 193, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 192 y 194, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 25A-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 195 y 196, respectivamente. En la Figura 25B-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 197 y 198, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 197 y 198, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 25B-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 200 y 201, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 200 y 202, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 25B-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 203 y 204, respectivamente. La Figura 26 muestra selecciones CDR de biblioteca cohorte representadas en tablas para cadenas pesada (Figura 26A-1 a 26A-3) y ligera (kappa, Figura 26B-1 a 26B-2) usando la secuencia problema derivada de un anticuerpo OVA de ratón. En la Figura 26A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón como SEC ID Nº: 205 en la primera tabla y secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 207 y 208, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 26A-2, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 209 y 210, respectivamente en la primera tabla y SEC ID Nº: 209 y 211, respectivamente en la segunda tabla. En la Figura 26A-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 212 y 213, respectivamente. En la Figura 26B-1, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 214 y 215, respectivamente en la primera tabla y SEC ID Nº: 216 y 217, respectivamente en la segunda tabla. En la Figura 26B-2, se desvelan secuencias de sondas de humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 216 y 218, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 219 y 220, respectivamente, en la segunda tabla.

La Figura 27 muestra selecciones CDR de biblioteca cohorte representadas en tabla para cadenas pesada (Figura 27A-1 a 27A-3) y ligera (kappa, Figura 27B-1 a 27B-3) usando secuencia problema derivada de un anticuerpo monoclonal de TNF-O de ratón. En la Figura 27A-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 221 y 222, respectivamente en la primera tabla y SEC ID Nº: 221 y 223, respectivamente en la segunda tabla. En la Figura 27A-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 224 y 225, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 224 y 226, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 27A-3, se desvelan secuencias de sondas humanas y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 227 y 228, respectivamente. En la Figura 27B-1, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 229 y 230, respectivamente en la primera tabla y SEC ID Nº: 229 y 231, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 27B-2, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 232 y 233, respectivamente en la primera tabla y SEC ID Nº: 232 y 234, respectivamente, en la segunda tabla. En la Figura 27B-3, se desvelan secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas como SEC ID Nº: 235 y 236, respectivamente. La Figura 28 muestra grupos de aminoácidos clasificados como similares basándose en la química de cadena lateral, como se emplea en realizaciones ejemplares de la presente invención. La Figura 29 muestra una comparación de secuencias cohorte obtenidas para una secuencia problema CDR1 anti-DR4 4H6 con criterios similares o criterios de identidad para comparación contra una biblioteca de referencia CDR1 VH4 usando los procedimientos de la invención. La primera tabla desvela SEC ID Nº: 237-239, respectivamente en orden de aparición. La segunda tabla desvela las SEC ID Nº: 240-242, respectivamente, en orden de aparición. La tercera tabla desvela las SEC ID Nº: 243-245, respectivamente en orden de aparición. La Figura 30 (paneles A-G) muestra las secuencias de la biblioteca de cohorte obtenidas con criterios de similitud e identidad usando un anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 monoclonal de ratón como un anticuerpo sonda. Panel A: sonda de ratón VH CDR1 “TNYGMN.” (SEC ID Nº: 13). Se desvelan secuencias similares y de identidad como SEC ID Nº: 14 en la primera tabla y SEC ID Nº: 246 y 15, respectivamente, en la segunda tabla. Panel B: sonda de ratón VH CDR2 “WMGWINTYTGEPT.” (SEC ID Nº: 16). Se desvelan secuencias similares y de identidad como SEC ID Nº: 247 y 17, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 248 y 18, respectivamente en la segunda tabla. Panel C: sonda de ratón VH CDR3 “AKYPHYYGSSHWYFD.” (SEC ID Nº: 19). Se desvelan secuencias similares y de identidad como SEC ID Nº: 20. Panel D: sonda de ratón VL CDR1 “SNYLNWY.” (SEC ID Nº: 21). Se desvelan secuencias similares o de identidad como SEC ID Nº: 22 en la primera tabla, SEC ID Nº: 249 en la segunda tabla y SEC ID Nº: 250 y 251, respectivamente en la tercera tabla. Panel E: sonda de ratón VL CDR2 “VLIYFTSSLH.” (SEC ID Nº: 23). Se desvelan secuencias similares y de identidad como SEC ID Nº: 252 y 24, respectivamente, en la primera tabla, SEC ID Nº: 253 y 25, respectivamente, en la segunda tabla y SEC ID Nº: 254 y 255, respectivamente, en la tercera tabla. Panel F: sonda de ratón VL CDR3 “QQYSTVPW.” (SEC ID Nº: 26). Se desvelan secuencias similares y de identidad como SEC ID Nº: 256 y 27, respectivamente, en la primera tabla y se desvelan secuencias similares como SEC ID Nº: 257, en la segunda tabla. Panel G: diversidad de cohorte combinatoria y similitud de valores de factor de reducción. Figura 31 (paneles A-F) muestra las secuencias de la biblioteca de cohorte obtenida para el anticuerpo anti-VEGF A4.6.1 cuando se usaron criterios de “todo similar” además de criterios de similitud e identidad. Panel A: sonda de ratón VH CDR1 “TNYGMN.” (SEC ID Nº: 13). Se desvelan secuencias similares, y de identidad y todas similares como SEC ID Nº: 14, 14 y 259, respectivamente, en la primera tabla y SEC ID Nº: 246, 15 y 261, respectivamente, en la segunda tabla. Panel B: sonda de ratón VH CDR2 “WMGWINTYTGEPT.” (SEC ID Nº: 16). Se desvelan secuencias similares, de identidad, todas similares y de bases de datos como SEC ID Nº: 247, 17, 263 y 264, respectivamente, en la primera tabla. Se desvelan secuencias similares, de identidad y todas similares como SEC ID Nº: 248, 18 y 265, respectivamente, en la segunda tabla. Panel C: sonda de ratón VH CDR3 “AKYPHYYGSSHWYFD.” (SEC ID Nº: 19). Se desvelan secuencias similares y de identidad como SEC ID Nº: 20. Panel D: sonda de ratón VL CDR1 “SNYLNWY.” (SEC ID Nº: 21). Se desvelan secuencias similares, de identidad y todas similares como SEC ID Nº: 22, 22 y 269, respectivamente, en la primera tabla. Se desvelan secuencias similares, de identidad, todas similares y de bases de datos como SEC ID Nº: 249, 249, 271 y 272, respectivamente, en la segunda tabla. Se desvelan secuencias similares y de identidad como SEC ID Nº: 250 y 251, respectivamente, en la tercera tabla. Panel E: sonda de ratón VL CDR2 “VLIYFTSSLH.” (SEC ID Nº: 23). Se desvelan secuencias similares, de identidad, todas similares y de bases de datos desveladas como SEC ID Nº: 252, 24, 275 y 276, respectivamente, en la primera tabla, SEC ID Nº: 253, 25, 277 y 278, respectivamente, en la segunda tabla y SEC ID Nº: 254, 255, 279 y 280, en la tercera tabla. Panel F: sonda de ratón VL CDR3 “QQYSTVPW.” (SEC ID Nº: 26). Se desvelan secuencias similares, de identidad y todas similares como SEC ID Nº: 256, 27 y 281, respectivamente, en la primera tabla. Se desvelan secuencias similares y todas similares como SEC ID Nº: 257 y 283, respectivamente, en la segunda tabla. La Figura 32 ilustra un ejemplo de realización de un dispositivo electrónico 500 adecuado para llevar a la práctica las realizaciones ilustrativas de la presente invención. La Figura 33 muestra diversas moléculas quiméricas scFv representativas esquemáticas que están formadas de acuerdo con la presente invención. Las construcciones scFv quiméricas pueden comprender una secuencia líder N-terminal para la exportación y conservación periplásmica bacteriana. La construcción quimérica Cterminal scFv alternativa utiliza una señal de anclaje Gene III para conservar la proteína scFv. La Figura 34 muestra la construcción de la biblioteca de cadena pesada A4.6.1 anti-VEGF natural usando una combinación de oligonucleótidos no degenerados solapantes que puede convertirse a ácidos nucleicos

bicatenarios usando la reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapante sencilla (SOE-PCR). La Figura desvela la SEC ID Nº: 285. La Figura 35 muestra la construcción de la biblioteca de cadena ligera A4.6.1 anti-VEGF natural usando una combinación de oligonucleótidos no degenerados solapantes que puede convertirse a ácidos nucleicos bicatenarios usando la reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapante sencilla (SOE-PCR). La Figura desvela la SEC ID Nº: 286. La Figura 36 muestra una serie de clones scFv que presentan mutaciones beneficiosas combinatorias (CBM). Estas son mutaciones múltiples en las regiones CDR VL yVH incorporadas dentro del anticuerpo humano scFv de referencia de ensayo que se asocian con valores de unión Koff superiores al antígeno diana. Estas sustituciones posicionales para la construcción de CBM se identificaron previamente como clones de mutaciones Look Through (LTM) individuales con características de unión Koff yKon mejoradas. Las secuencias L1 se desvelan como SEC ID Nº: 287-298, respectivamente, en orden de aparición. Las secuencias L2 se desvelan como SEC ID Nº: 299-310, respectivamente, en orden de aparición. Las secuencias L3 se desvelan como SEC ID Nº: 311-322, respectivamente, en orden de aparición. Las secuencias H1 se desvelan como SEC ID Nº: 323-334, respectivamente en orden de aparición. Las secuencias H2 se desvelan como SEC ID Nº: 335346, respectivamente, en orden de aparición. Las secuencias H3 se desvelan como SEC ID Nº: 347-358, respectivamente, en orden de aparición. La Figura 37 muestra una determinación Biacore de cinéticas Koff de unión para seis clones CBM mejorados por afinidad a partir de la Figura 36 en comparación con la cinética de los clones naturales parentales. La Figura 38 es una representación FACS que muestra la unión de un antígeno diana biotinilado y FITC con estreptavidina para ensayar el scFv candidato. La representación FACS del panel izquierdo muestra una entrada de selección (el trapezoide P2) para identificar solo aquellos clones que expresan la fusión scFv con una mayor afinidad de unión con respecto al antígeno diana en relación con la distribución de afinidades de unión de la biblioteca LTM total. El panel FACS derecho muestra el análisis FACS posterior a la clasificación que confirma que !25% de clones scFv preseleccionados P2 se encontraban dentro de los criterios predeterminados de la afinidad del antígeno diana mejorada. La Figura 39 muestra cinética de unión Biacore para un clon scFv anti-VEGF 3D5 recuperado de una biblioteca cohorte A4.6.1 (panel izquierdo). El clon scFv anti-VEGF 3D5 que se une a VEGF, como se demostró mediante el aumento en unidades de respuesta (RU) a medida que se añadió más antígeno VEGF. Por el contrario, no hubo un aumento en RU cuando se añadió BSA no específico a scFv anti-VEGF 3D5. La Figura 40 muestra el procedimiento de selección para conjuntos de subgrupos de secuencias de cadena pesada, división de subclase de secuencias de subgrupos y posterior división de poblaciones de subclases basándose en la estructura canónica, como se detalla en el Ejemplo 2. La Figura 41 muestra un diagrama de flujo que representa una selección del perfil de variabilidad de CDR3 como se detalla en el Ejemplo 2. La Figura 42 muestra cruzamientos de diseño de CDR1 y CDR2 de VH1 y VH3 con convergencia a un dominio CDR3 común. La Figura 43 muestra cruzamientos de diseño de CDR1 y CDR2 de VK1 y VK3 con convergencia a un dominio CDR3 común. Las secuencias VK-1_CDR2-10, VK-3_CDR1-7 y VK-3_CDR2-10 se desvelan como SEC ID Nº: 276, 167 y 278, respectivamente. La Figura 44 muestra una tabla de diversidad para bibliotecas de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera y pesada de diversas longitudes. Las secuencias VL1-CDR2, VL2-CDR2 y VL3-CDR2 se desvelan como SEC ID Nº: 640, 641 y 280, respectivamente. La Figura 45 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 6 tamaños de longitud de CDR1 de cadenas pesadas VH-1 (panel A), VH-3 (panel B) y VH-4 (panel C), como se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Los límites de las CDR enumeradas se trazaron de acuerdo con la definición de CDR por contacto antes de la alineación de secuencias. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos particulares en esa posición CDR de anticuerpos expresados in vivo. Después, el perfil de variabilidad de CDR1 generado (Figura 44) indicó la posible diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR para imitar preferencias de especies huésped. La Figura 46 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 13 tamaños de longitud de CDR2 de VH-1 (panel A), VH-3 (panel B) y 12 tamaños de longitud de CDR2 de cadenas pesadas VH-4 (panel C) como se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Los límites de las CDR enumeradas se trazaron de acuerdo con la definición de CDR de Contacto antes del alineamiento de secuencia. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en particular en esa posición CDR de anticuerpos expresados in vivo. Después, los perfiles de variabilidad de CDR1 generados (Figura 44) indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR para imitar las preferencias de la especie huésped. La Figura 47 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 10 tamaños de longitud de CDR3 de VH (panel A), y 11 tamaños de longitud de CDR3 (panel B) como se determina a partir de la base de datos de Kabat de secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias VH originales, las secuencias CDR3 de VH Se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración del perfil de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en posición CDR3 de VH particular. Los perfiles de variabilidad de CDR3 de VH generados (Figura 44) después indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VH de 10 y 11 tamaños de longitud. La Figura 48 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 12 tamaños de longitud de CDR3 de VH

(panel A), y 13 tamaños de longitud de CDR3 (panel B) según se determina a partir de la base de datos de Kabat de secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias VH originales, las secuencias CDR3 de VH se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración del perfil de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en posición CDR3 de VH particular. Los perfiles de variabilidad de CDR3 de VH generados (Figura 44) después indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VH de 12 y 13 tamaños de longitud. La Figura 49 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 14 tamaños de longitud de CDR3 de VH (panel A), y 15 tamaños de longitud de CDR3 (panel B) según se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias VH originales, las secuencias CDR3 de VH se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración de los perfiles de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en la posición CDR3 de VH particular. Los perfiles de variabilidad de CDR3 de VH generados (Figura 44) después indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VH de 14 y 15 tamaños de longitud. La Figura 50 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 16 tamaños de longitud de CDR3 de VH (panel A) y 17 tamaños de longitud de CDR3 (panel B) como se determina a partir de la base de datos de Kabat de secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias VH originales, las secuencias CDR3 de VH se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración del perfil de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en la posición CDR3 de VH particular. Después los perfiles de variabilidad de CDR3 de VH generados (Figura 44) indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VH de 16 y 17 tamaños de longitud. La Figura 51 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 18 tamaños de longitud de CDR3 de VH (panel A), y 19 tamaños de longitud CDR3 (panel B) según se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias VH originales, las secuencias CDR3 de VH se alinearon de acuerdo con la definición de CDR de Contacto para la enumeración de perfiles de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en la posición CDR3 de VH particular. Después, los perfiles de variabilidad de la CDR3 de VH generados (Figura 44) indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VH de 18 y 19 tamaños de longitud. La Figura 52 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 20 tamaños de longitud de CDR3 de VH como se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias VH originales, las secuencias CDR3 de VH se alinearon de acuerdo con la definición de CDR de Contacto para la enumeración de perfiles de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en la posición CDR3 de VH particular. Después los perfiles de variabilidad de la CDR3 de VH generados (Figura 44) indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VH de 20 tamaños de longitud. La Figura 53 marca los perfiles de variabilidad enumerados de 7 tamaños de longitud de CDR1 de V kappa-1 (panel superior) y V kappa-3 (panel inferior) como se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familia V kappa originales, las secuencias CDR1 de V kappa se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración de los perfiles de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en la posición CDR1 de V kappa particular. Después los perfiles de variabilidad de CDR1 de V kappa generados (Figura 44, representados en la tabla debajo de cada gráfico) indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR1 de V kappa de 7 tamaños de longitud. La secuencia VK-3_CDR1-7 se desvela como SEC ID Nº: 167. La Figura 54 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 10 tamaños de longitud de CDR2 de V kappa1 (SEC ID Nº: 276) (panel A) y V kappa-3 (SEC ID Nº: 278) (panel B) como se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias V kappa originales, las secuencias CDR2 de V kappa se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración de los perfiles de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de aminoácidos en la posición CDR2 de V kappa particular. Después los perfiles de variabilidad de CDR2 de V kappa generados (Figura 44, representados en la tabla debajo de cada gráfico) indicaron el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR1 de V kappa de 10 tamaños de longitud. La Figura 55 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 9 tamaños de longitud de CDR3 de V kappa (panel A) y V lambda (panel B) según se determina a partir de la base de datos de Kabat de las secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus subfamilias Vkappa y Vlambda originales, las secuencias CDR3 se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración de los perfiles de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de los aminoácidos en la posición CDR3 de VL particular. Después los perfiles de variabilidad de CDR3 de Vkappa y Vlambda generados (Figura 44, representado en la tabla debajo de cada gráfico) indicó el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VL de 9 tamaños de longitud. La Figura 56 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 8 tamaños de longitud CDR3 de VL (tanto kappa como lambda) (panel A) y 10 tamaños de longitud de CDR3 (panel B) como se determina a partir de la base de datos de Kabat de secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias Vkappa y Vlambda originales, las secuencias CDR3 se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración de perfiles de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de los aminoácidos en la posición CDR3 de VL particular. Después, los perfiles de variabilidad CDR3 de VL

generados (Figura 44, representado en la tabla debajo de cada gráfico) indicaban el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VL para 8 y 10 tamaños de longitud. La Figura 57 muestra los perfiles de variabilidad enumerados de 11 tamaños de longitud de CDR3 de VL (tanto kappa como lambda) como se determina a partir de la base de datos de Kabat de secuencias inmunológicas depositadas. Independientemente de sus familias Vkappa y Vlambda originales, las secuencias CDR3 se alinearon de acuerdo con la definición CDR de Contacto para la enumeración del perfil de aminoácidos. El eje vertical (Y) indica la frecuencia de aparición de los aminoácidos en la posición CDR3 de VL particular. Después, los perfiles de variabilidad CDR3 de VL generados (Figura 44, representado en tabla debajo de cada gráfico) indicó el potencial de diversidad que podría sustituirse en cada posición CDR3 de VL para 11 tamaños de longitud. La Figura 58 ilustra el procedimiento de mutagénesis de Kunkel según se aplica usando oligonucleótidos múltiples para generar tres mutaciones CDR distintas en una sola secuencia lineal. Después estas iteraciones se repitieron hasta incorporar todas las mutaciones de CDR de VL y VH deseadas. La Figura 59 ilustra el procedimiento de mutagénesis de Kunkel según se aplica en la presente invención para generar mutaciones que codifican CDR usando una sola reacción de hibridación con oligonucleótidos. Para el procedimiento mostrado, el primer molde WTM-CDRH3 modificado se volvió a aislar y se volvió a hibridar con un segundo oligonucleótido CDRH1 diferente para generar dos mutaciones WTM-CDR distintas en la misma secuencia lineal. Después estas iteraciones se repitieron hasta incorporar todas las mutaciones de CDR deseadas. La Figura 60 muestra un histograma de frecuencias de restos de aminoácidos posición por posición para una biblioteca universal de anticuerpos (UAL) de CDR1 de VH-1 de longitud 6, estructura canónica 1. La Figura 61 muestra un histograma de frecuencias de restos de aminoácidos posición por posición para bibliotecas universales de anticuerpo (UAL) de CDR2 de VH-1 de longitud 13, estructuras canónicas 2 (panel A) y 3 (panel B). La Figura 62A-J muestra secuencias de oligonucleótidos para construcciones de la presente invención (SEC ID Nº: 359-562, respectivamente, en orden de aparición). La Figura 63 muestra histogramas de análisis de longitud de CDR3 de VH para antígenos proteicos (panel izquierdo inferior) y no proteicos (panel derecho superior).

Descripción detallada de la invención

Para proporcionar un buen entendimiento de la memoria descriptiva y reivindicaciones, a continuación se proporcionan las siguientes definiciones.

Definiciones

Como se usa en el presente documento la expresión “biblioteca universal de anticuerpos” se refiere a una biblioteca de anticuerpos como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 60/585.931. La biblioteca universal de anticuerpos puede ser una biblioteca de referencia. Una biblioteca de referencia puede ser información por ordenador que representa diversidad CDR natural, por ejemplo, diversidad CDR humana, en particular, diversidad CDR encontrada en anticuerpos expresados sensibles a una clase de antígeno predeterminada.

La expresión “biblioteca de cohorte” se refiere a una biblioteca subconjunto, a una subbiblioteca o a una biblioteca análoga que represente la diversidad CDR que puede ensamblarse, de acuerdo con los procedimientos de la invención, que es representativa y/o comprende una secuencia CDR problema determinada o una secuencia CDR sonda y, preferentemente, está enriquecida con restos de aminoácidos humanos en una mayoría de las posiciones de aminoácidos cuando se alinea con la secuencia CDR problema/sonda.

La expresión “antígeno candidato” se refiere a una diana bien definida o a un antígeno diana que se conoce y, típicamente, para el cual se encuentra disponible un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo murino, que es capaz de unirse al antígeno. Dichos anticuerpos pueden aprovecharse como una fuente de secuencia (o secuencias) CDR problema. Un antígeno diana puede pertenecer, por ejemplo, a una clase de antígeno particular, por ejemplo, una clase de antígenos proteicos, una clase de antígenos peptídicos, una clase de antígenos de molécula pequeña, una clase de antígenos polisacáridos, una clase de antígenos lipídicos o una clase de antígenos polinucleotídicos. Una clase de antígeno puede definirse adicionalmente, por ejemplo, una clase de antígeno de polipéptido o proteína, comprendiendo antígenos solubles, antígenos de la superficie celular, antígenos extracelulares, antígenos intracelulares, etc.

La expresión “secuencia CDR problema” o “secuencia CDR sonda” se refiere a una secuencia CDR, que típicamente procede de un anticuerpo con una especificidad de unión conocida pero para el cual son deseables secuencias CDR análogas humanas o casi humanas.

La expresión “regiones de unión a anticuerpo” se refieren a una o más partes de una región variable de una inmunoglobulina o anticuerpo capaz de unirse a un antígeno (o antígenos). Típicamente, la región de unión al anticuerpo es, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo (VL) (o su región variable), una cadena pesada de anticuerpo (VH) (o su región variable), una región variable, una región Fd de cadena pesada, una cadena ligera y pesada de anticuerpo combinadas (o sus regiones variables) tal como un anticuerpo Fab, F(ab’)2, un solo dominio,

un anticuerpo monocatenario (scFv) o un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, una IgG (por ejemplo, un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), anticuerpo IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM. Se entiende que la secuencia CDR problema procede de un anticuerpo contra un antígeno diana puede proceder de un anticuerpo de longitud completa

o un fragmento de unión a antígeno que comprende en una CDR, tanto de origen natural como sintético, por ejemplo, un Fab, un scFv, una cadena pesada, una cadena ligera, un Fd, un DAb o similar.

La expresión “región marco conservada” se refiere a las partes reconocidas en la técnica de una región variable de un anticuerpo que existe entre las regiones CDR más divergentes. Dichas regiones marco conservadas se denominan típicamente regiones marco 1 a 4 (FR1, FR2, FR3 y FR4) y proporcionan un armazón para sostener, en el espacio tridimensional, a las tres CDR encontradas en una región variable del anticuerpo de cadena pesada o ligera, tal como las CDR que pueden formar una superficie de unión a antígeno. Se entiende que, si se desea, la región (o regiones) marco conservadas usadas para sostener la una o más secuencias CDR determinadas u obtenidas como se describe en el presente documento pueden ser, por ejemplo, de origen natural o sintéticas o combinaciones de las mismas, por ejemplo, una secuencia marco conservada puede ser de origen natural o derivar en parte pero idealizada por completo o en parte para formar una secuencia consenso, por ejemplo, para permitir o alojar una CDR consenso o canónica, o clonada por cruzamiento, es decir, representar partes de armazones que pueden ser naturales pero después se yuxtaponen linealmente.

La expresión “frecuencia umbral de aparición” se refiere a un criterio de determinadas realizaciones de la invención que requiere que una secuencia seleccionada para su uso en la biblioteca universal de anticuerpos de referencia derive de una secuencia que se ha determinado que es una secuencia favorecida para expresarse por células inmunitarias cuando, por ejemplo, responden a una clase de antígenos particular. Típicamente, dichas secuencias expresadas (reordenadas) que se determina que cumplen la frecuencia de aparición umbral son secuencias que se expresan en un porcentaje de aparición de aproximadamente 10% o más.

La expresión “frecuencia umbral de origen de línea germinal” se refiere a un criterio de determinadas realizaciones de la invención que requiere que una secuencia seleccionada (es decir, secuencia expresada o reordenada) para su uso en la biblioteca universal de anticuerpos de referencia derive de una secuencia que se ha determinado que es una secuencia de línea germinal favorecida para expresarse por células inmunitarias cuando, por ejemplo, responden a una clase de antígenos particular. Típicamente, las secuencias que se determina que cumplen la frecuencia umbral de origen de línea germinal son secuencias que derivan o que se originan de una secuencia de línea germinal a un porcentaje de aparición de aproximadamente el 10% o más.

La expresión “clase de antígeno predeterminada” o “clase de antígenos” o “clase antigénica” se refiere a antígenos que son estructural, químicamente similares en cuanto a su composición básica. Las clases antigénicas típicas son proteínas (polipéptidos), péptidos, polisacáridos, polinucleótidos y pequeñas moléculas.

La expresión “estructura canónica” incluye consideraciones con respecto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, según se cataloga en la base de datos de Kabat. El esquema de numeración de Kabat es un patrón ampliamente adaptado para enumerar los restos de aminoácidos de una variable de anticuerpos de una manera coherente. Otras consideraciones estructurales, por ejemplo, aquellas diferencias no completamente reflejadas en la numeración de Kabat, por ejemplo, como se describe en Chothia y col. y revela, por ejemplo, por modelación tridimensional y cristalografía, también pueden usarse para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por consiguiente, una secuencia de anticuerpo determinada puede situarse en una clase canónica que permite, entre otras cosas, identificar secuencias aceptoras apropiadas. La numeración de Kabat de las secuencias de aminoácidos de anticuerpos y consideraciones estructurales, por ejemplo, como se describe por Chothia y col., y su implicación para construir aspectos canónicos de un anticuerpo determinado, se describen en la bibliografía (véase también, por ejemplo, Materiales y Procedimientos, más adelante).

La expresión “región CDR definida” se refiere a una región determinante de la complementariedad (CDR) de la que tres constituyen el carácter de unión de una región variable de cadena ligera y/o región variable de cadena pesada de una molécula de unión. Las regiones CDR definidas contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo y pueden estar separadas por secuencias de aminoácidos que son simplemente regiones armazón o regiones marco conservadas. Las regiones CDR se definen típicamente de acuerdo con el Índice EU, Kabat, (véase, por ejemplo, Kabat y col., en “Sequences of Proteins of immunological Interest.” U.S. Department of Health and Human Services, 1983), Chothia (véase, por ejemplo, Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987), o definición de punto de contacto (véase, por ejemplo, MacCallum y col., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)), aunque se entiende que también puede emplearse cualquier otro sistema en el que las regiones variables marco conservadas y de contacto de antígeno pueden identificarse y demarcarse. Además, los restos de aminoácidos/posiciones dentro de las regiones CDR definidas pueden numerarse de acuerdo con una convención seleccionada del grupo que consiste en índice EU, numeración de Kabat, numeración de Chothia, definición de punto de contacto y numeración de posición de resto de aminoácido lineal.

La expresión “biblioteca” se refiere a una o más CDR o moléculas de anticuerpo (o fragmentos de anticuerpo de las mismas) que tiene una diversidad como se describe en el presente documento, mutagenizada de acuerdo con el procedimiento de la invención. Los anticuerpos de la biblioteca pueden estar en forma de polinucleótidos, polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos, polinucleótidos y polipéptidos en un extracto acelular o como

polinucleótidos y/o polipéptidos en el contexto de un fago, células procariotas o en células eucariotas. Una biblioteca, por ejemplo una biblioteca de análogos de CDR, también puede estar en forma de una biblioteca virtual, es decir, una biblioteca de información de secuencias de restos de aminoácidos o polinucleótidos que puede usarse para diseñar o sintetizar una biblioteca real o que puede consultarse o modelarse bien por ordenador o de otra manera.

La expresión “polinucleótido (o polinucleótidos)” se refiere a ácidos nucleicos tales como moléculas de ADN y moléculas de ARN y sus análogos (por ejemplo, ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos o usando química de ácidos nucleicos). Según se desee, los polinucleótidos pueden fabricarse sintéticamente, por ejemplo, usando química de ácidos nucleicos reconocida en la técnica, o enzimáticamente usando, por ejemplo, una polimerasa y, si se desea, modificarse. Las modificaciones típicas incluyen metilación, biotinilación y otras modificaciones conocidas en la técnica. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria y, cuando se dese, unirse a un resto detectable.

La expresión “mutagénesis” se refiere a, salvo que se especifique de otra manera, cualquier técnica reconocida en la materia para modificar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica. Los tipos preferidos de mutagénesis incluyen mutagénesis walk-through (WTM), mutagénesis walk-through beneficiosa, mutagénesis look-through (LTM), mutagénesis look-through mejorada (LTM2) o combinaciones de las mismas.

La expresión “mutagénesis beneficiosa combinatoria” se refiere a una biblioteca de combinación de secuencias codificantes que codifican mezclas degeneradas de variaciones de secuencias de aminoácidos de CDR VL y/o VH inicialmente identificadas a partir de exploración con mutagénesis de aminoácidos LTM predeterminada que tiene una modificación en una propiedad que puede medirse. En la estrategia de mutación beneficiosa combinatoria, se generan secuencias codificantes de oligonucleótidos que representan la combinación de estas mutaciones beneficiosas identificadas por LTM. Estas combinaciones pueden ser combinaciones de diferentes mutaciones beneficiosas con una sola CDR, mutaciones con dos o más CDR con una sola cadena de anticuerpo o mutaciones dentro de las CDR de diferentes cadenas de anticuerpos.

La expresión “alineamiento con huecos” se refiere a un alineamiento de al menos dos secuencias de nucleótidos o de péptidos en el que el alineamiento de la secuencia se optimiza de tal manera que una o más secuencias pueden contener huecos en su secuencia, por ejemplo, cuando se produce un alineamiento óptimo de las secuencias si el algoritmo del alineamiento supone la presencia de una inserción o deleción de secuencia en cualquiera de las secuencias comparadas. La formación de huecos se usa más frecuentemente en comparaciones de secuencias de especies cruzadas (por ejemplo, ratón/humano), como polimorfismos de inserción/deleción (“in/del”) y rara vez con respecto a polimorfismos de un solo nucleótido (“SNP”) en la población humana, aunque dichas características (in/del) existen en determinadas secuencias humanas. En determinadas realizaciones de la presente invención, se realiza un alineamiento “de tipo BLAST con huecos”. La expresión alineamiento “BLAST con huecos” como se usa en el presente documento se refiere a una forma de alineamiento con huecos en el que uno o más restos de un polipéptido (o polinucleótido) problema puede designarse mediante uno o más restos espaciadores (generalmente representados como líneas discontinuas “-“ dentro de las secuencias de dichos alineamientos), en el que dichos restos espaciadores no tienen ningún impacto sobre el alineamiento BLAST posterior distinto de la provisión de espaciado en los restos circundantes durante el alineamiento. Con fines de la presente invención, dichas alineaciones BLAST con huecos a menudo se realizan en casos en los que el resto (o restos) con huecos de la secuencia problema se fija en la secuencia (o secuencias) de producción (biblioteca cohorte) como el mismo resto presente en la posición correspondiente dentro de la secuencia problema. Las herramientas de alineación de secuencia/búsqueda de bases de datos normalmente usadas para generar alineamientos con hueco incluyen, por ejemplo, FASTA (Wilbur y Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 80: 726-730; Lipman y Pearson, Science, 227: 14351441; Pearson y Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448; Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98) y BLAST (Altschul y col., J. Mol. Biol., 215: 403-41; Altschul y col., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402).

La expresión “alineamiento discontinuo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un alineamiento de al menos dos secuencias peptídicas, en la que al menos un resto de una secuencia problema lineal se “fija”, lo que significa que el resto fijado no necesita compararse con los restos de la secuencia de referencia. La expresión “alineamiento parcial” se refiere a una forma relacionada de alineamiento, en el que al menos un resto N-o Cterminal de la secuencia problema lineal se fija y por lo tanto no es necesario que se compare con los restos de la secuencia de referencia. Un experto habitual en la técnica reconocerá que las formas de alineamiento anteriores también pueden realizarse con un efecto similar sobre secuencias de nucleótidos que comprendan codones, que puedan sustituirse por un alineamiento directo o de secuencias peptídicas.

La expresión “aminoácido similar” se refiere a un aminoácido que es de la misma clase de química de cadena lateral que un aminoácido inicial. En realizaciones ejemplares de la presente invención, los aminoácidos naturales se sitúan dentro de las siguientes clases basándose en la química de cadena lateral:

Cadenas Laterales Pequeñas: Glicina (G), Alanina (A)

Nucleófilas: Serina (S), Treonina (T), Cisteína (C), Histidina (H)

Hidrófobas: Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I), Metionina (M), Prolina (P)

Aromáticas: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W)

Ácidas: Aspartato (D), Glutamato (E)

Amidas: Asparagina (N), Glutamina (Q)

Básicas: lisina (K), Arginina (R)

Por tanto, la Glicina y la Alanina son aminoácidos similares entre sí, como lo son: Serina, Treonina, Cisteína e Histidina; Valina, Leucina, Isoleucina, Metionina y Prolina; Fenilalanina, Tirosina y Triptófano; Aspartato y Glutamato; Asparagina y Glutamina; y Lisina y Arginina. Un experto en la técnica reconocerá que también son posibles clasificaciones alternativas de similitud para aminoácidos sintéticos y/o naturales (por ejemplo, por carga, hidrofobicidad, grupos activos, criterios estéricos, etc.) y se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Sin embargo, para fines de la presente invención, la división de aminoácidos en agrupaciones similares implica la denominación de al menos dos grupos, en los que cada grupo comprende al menos un aminoácido.

Descripción detallada

Visión de conjunto

Los anticuerpos son herramientas poderosas de diagnóstico y terapéuticas. Las bibliotecas de anticuerpos comprenden moléculas de unión candidatas que pueden explorarse fácilmente contra dianas. La presente invención, busca al menos en parte, aprovechar la prometedora estrategia descrita recientemente para construir bibliotecas universales de anticuerpos (UAL) exhaustivas. Los procedimientos de la presente invención permiten la síntesis lógica de diversas bibliotecas cohorte de las CDR y/o anticuerpos que de manera predominante o exclusiva contienen una diversidad humana natural en cualquier posición de resto de aminoácido seleccionada (haciendo así a dichas secuencias no inmunógenas pero significativamente más diversas que los ensamblajes solamente de secuencias de anticuerpo y/o CDR conocidas). Las bibliotecas de cohorte presentadas en los procedimientos de la invención y composiciones descritas en el presente documento por lo tanto tienen la ventaja de representar una amplia serie de diversidad de secuencia humana (por ejemplo, a través de la clasificación independiente de diversidad resto por resto de secuencias CDR) en una biblioteca de tamaño relativamente pequeño en relación con, por ejemplo, bibliotecas sintéticas preparadas mediante enfoques de mutagénesis aleatorizada a través del mismo tramo de secuencia. La inmensa mayoría de bibliotecas sintéticas (por ejemplo, bibliotecas producidas por mutagénesis aleatorizada) tienen interferencia y demasiada diversidad que no es de origen natural. Las bibliotecas completamente humanas están sesgadas contra determinadas clases de antígenos y son solo tan diversas como permitan las técnicas de captura.

La presente invención, proporciona, al menos en parte, un procedimiento mediante el que las bibliotecas de anticuerpos de referencia tales como bibliotecas universales de anticuerpos (UAL) pueden someterse a “BLAST” (por ejemplo, alineadas, opcionalmente alienadas con huecos) con secuencias CDR de anticuerpos problema para identificar bibliotecas de anticuerpo cohorte humanas. Las aplicaciones de dicha estrategia incluyen:

(1): identificación de bibliotecas de cohorte de anticuerpos monoclonales sesgados humanos usando anticuerpos monoclonales no humanos existentes (por ejemplo, ratón).

(2): (re)generación lógica de una biblioteca de anticuerpos de cohorte sesgada humana en torno a un anticuerpo monoclonal existente o familia de anticuerpos monoclonales.

Dichas bibliotecas de anticuerpos de cohorte sometidas a “BLAST” con CDR pueden después usarse para:

(1): Generar anticuerpos de tipo humano que están basados en anticuerpos no humanos.

(2): Regenerar una diversidad humana a partir de un anticuerpo o anticuerpos humanos existentes para la selección específica de calidades mejoradas (por ejemplo, inmunogenicidad, afinidad, especificidad, expresión, estabilidad, etc.).

(3): Identificar de manera prospectiva subbibliotecas productivas de bibliotecas de anticuerpos de referencia (por ejemplo, subbibliotecas UAL: porque las UAL son un compuesto de muchas subbibliotecas, podría usarse análisis de resultados de BLAST de CDR para numerosos antígenos para guiar los esfuerzos de selección de novo sobre subbibliotecas UAL productivas).

En determinadas realizaciones, la presente invención emplea bibliotecas universales de anticuerpos como bibliotecas de referencia que son exhaustivas y pueden por tanto usarse para identificar/generar bibliotecas de anticuerpos y/o CDR de cohorte que se benefician de la naturaleza exhaustiva de dichas bibliotecas. Dichas bibliotecas de anticuerpos de referencia tales como UAL y bibliotecas de cohorte descritas pueden explorarse fácilmente usando, por ejemplo, procedimientos de alto rendimiento para obtener nuevos agentes terapéuticos.

En particular, las bibliotecas de preferencia tales como UAL tienen la posibilidad de reconocer cualquier antígeno. Otras ventajas significativas de dichas bibliotecas de referencia incluyen una gran diversidad, por ejemplo, para los autoantígenos que normalmente se pierden en una biblioteca humana expresada porque a los anticuerpos autorreactivos los elimina el sistema inmunitario del donante mediante selección negativa. Otra ventaja característica de las bibliotecas de referencia (por ejemplo UAL) y de cohorte descritas en el presente documento es que la exploración de dichas bibliotecas usando selección de clones positivos por FACS (clasificación de células activada por fluorescencia) desvía la metodología convencional y tediosa de la generación de una biblioteca de hibridomas y exploración de sobrenadantes. Aún más, una biblioteca de referencia tal como una biblioteca UAL puede volver a explorarse para descubrir anticuerpos adicionales contra otras dianas seleccionadas.

1.1 Bibliotecas de anticuerpos de referencia caracterizadas

Las bibliotecas de anticuerpo de referencia y especialmente las bibliotecas universales de anticuerpos (UAL) empleadas en determinados procedimientos de la presente invención pueden representar todos los anticuerpos candidatos deseados contra una determinada clase de antígeno. Una biblioteca universal de anticuerpos ejemplar que puede emplearse por los procedimientos de la invención procede de secuencias humanas y es por lo tanto no inmunogénica, dando como resultado anticuerpos seleccionados a partir de dicha biblioteca adecuada para aplicaciones terapéuticas -por ejemplo, para administración a pacientes humanos para la prevención o tratamiento de trastornos o enfermedades humanas.

Las bibliotecas caracterizadas en la invención tienen una diversidad que se introduce de manera eficaz usando, por ejemplo, técnicas de mutagénesis, tales como mutagénesis walk-through (WTM) o mutagénesis look-through (LTM) (véase respectivamente, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.649.340; 5.830.650; 5.798.208; y el documento U.S.S.N. 60/483.282) dependiendo de si la diversidad de restos múltiples o una diversidad de restos simples necesita introducirse en un sitio determinado, por ejemplo, dentro de una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR). Cabe destacar que estas técnicas permiten maximizar la cantidad de diversidad productiva y minimizar la cantidad de diversidad no productiva, es decir, más fondo o aleatorización. Por consiguiente, tanto las bibliotecas de referencia como las de cohorte caracterizadas en la presente invención pueden ser más pequeñas que las bibliotecas de anticuerpos existentes y aun así comprender más diversidad lógica para identificar moléculas de unión a anticuerpos candidatas de manera más eficaz. Dichas eficacias de las bibliotecas de anticuerpos de referencia se aprovechan de manera eficaz para generar bibliotecas de cohorte de CDR y anticuerpo usando los procedimientos de la presente invención.

En determinadas realizaciones, las bibliotecas de cohorte y/o preferencia (por ejemplo, biblioteca universal de anticuerpos) resulta de la aplicación de la tecnología WTM o LTM para crear una biblioteca completamente sintética que presente una diversidad deseada en una o más de las CDR de las cadenas ligera y/o pesada. La secuencia de anticuerpo, por ejemplo, las regiones marco conservadas y las CDR de las bibliotecas de referencia se seleccionan de acuerdo con determinados criterios. Los criterios para seleccionar las bibliotecas de cohorte a partir de bibliotecas de referencia implican en gran medida la comparación de secuencias problema con secuencias de la biblioteca de referencia, seguido por enfoques mutagénicos para crear las bibliotecas de CDR/anticuerpo cohorte de la invención. Dichas bibliotecas de referencia se seleccionan y/o se ensamblan mediante diversos criterios. Por ejemplo, un criterio es que la secuencia de anticuerpo de referencia debe tener un umbral de frecuencia mínimo (por ejemplo, de aproximadamente 10% o más) de aparición dentro de secuencias de anticuerpos expresadas (reordenadas), por ejemplo, secuencias de anticuerpos humanos y, preferentemente, en respuesta a una clase de antígenos en particular. Opcionalmente, aún otro criterio, es que la secuencia de anticuerpo expresada (reorganizada) con (o derivada de) un umbral de frecuencia mínimo (por ejemplo, aproximadamente 10% o más) a partir de una secuencia de línea germinal. La diversidad se identifica y después se diseña por ingeniería genética en un formato génico convencional, por ejemplo, un formato de anticuerpo monocatenario (scFv), fab, o Ig completo usando oligonucleótidos que permiten el ensamblaje completo de regiones marco conservadas individuales mediante PCR y diversas secuencias CDR por mutagénesis de kunkel de una manera sistemática.

Cabe destacar que las bibliotecas descritas en el presente documento minimizan cualquiera de las mutaciones que pueden conducir a proteínas no funcionales impidiendo mutaciones no deseadas que típicamente se producen cuando se usa PCR propensa a error o degeneración de oligonucleótidos al azar. Además, el nivel de precisión apto cuando se usa WTM contrasta con las tecnologías de mutagénesis al azar y/o redistribución de genes. Además, controlando la selección de la región marco conservada y el nivel de diversidad de secuencia en cuanto a la posición y tipo de aminoácido, el reconocimiento de la biblioteca de las clases de “antígeno” se optimiza. Adicionalmente, esta metodología in vitro elude la selección inmunológica negativa de autoantígenos y cualquier sesgo génico debido a la exposición ambiental del organismo.

Por consiguiente, la invención proporciona la ventaja de ser capaz de comenzar con una biblioteca de exploración dimensionada para ser informativa sin ser innecesariamente grande. Después de la identificación del primer conjunto de clones, las posteriores bibliotecas por maduración de afinidad pueden compartir conjuntos comunes de oligonucleótidos LTM y/o WTM con ahorro de tiempo y costes de reactivos. Adicionalmente aún, las bibliotecas de referencia (por ejemplo, bibliotecas universales de anticuerpo) y bibliotecas de cohorte derivadas de las mismas mediante los procedimientos de la invención, son capaces de producir rápida y eficazmente anticuerpos muy específicos contra una diversidad de antígenos, especialmente, por ejemplo, autoantígenos que son difíciles de obtener mediante cualquier otro procedimiento.

Las bibliotecas universales de anticuerpo de referencia descritas pueden generarse y explorarse sintetizando en primer lugar polinucleótidos individuales que codifican una región o regiones definidas de un anticuerpo en el que, de manera colectiva, los polinucleótidos representan todos los anticuerpos variantes posibles de acuerdo con los criterios descritos en el presente documento. De manera similar, las bibliotecas de anticuerpos y CDR cohorte de la invención pueden generarse y explorarse sintetizando en primer lugar polinucleótidos individuales que codifican una región o regiones definidas de un anticuerpo en el que, en su conjunto, los polinucleótidos representan una selección de posiciones CDR variantes de acuerdo con los criterios de la presente invención. Los anticuerpos pueden expresarse, por ejemplo, usando transcripción y/o traducción in vitro y/o usando una tecnología de presentación, tal

como presentación de ribosomas, presentación de fagos, presentación de bacterias o presentación de levaduras.

Como alternativa, las bibliotecas universales de anticuerpos de referencia descritas pueden generarse y explorarse sintetizando en primer lugar polipéptidos individuales correspondientes a una región o regiones definidas de un anticuerpo en el que, en su conjunto, los polipéptidos representan todos los anticuerpos de variantes posibles de acuerdo con los criterios descritos en el presente documento. De manera similar, las bibliotecas de anticuerpos y CDR de cohorte descritas pueden generarse y explorarse sintetizando en primer lugar polipéptidos individuales que codifican una región o regiones definidas de un anticuerpo en el que, en su conjunto, los polipéptidos representan una selección de posiciones CDR variantes de acuerdo con los criterios de la presente invención. Los anticuerpos pueden generarse y/o traducirse de manera inversa a partir de polipéptidos y expresarse, por ejemplo, usando transcripción y traducción in vitro y/o usando una tecnología de presentación, tal como presentación de ribosomas, presentación de fagos, presentación de bacterias o presentación de levaduras. Las bibliotecas CDR y/o de anticuerpos de referencia (universales o filtradas) virtuales también pueden usarse en los procedimientos de la invención, generándose dichas bibliotecas mediante recopilación manual y/o por ordenador de una información de diversidad de secuencia de péptidos humanos en una biblioteca de referencia virtual de la invención. Las secuencias componente de dichas bibliotecas de referencia virtual (por ejemplo, secuencias simples, bibliotecas de cohorte o bibliotecas de referencia entera) pueden expresarse usando técnicas muy conocidas en la materia (por ejemplo, síntesis de secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia peptídica, seguido por transcripción y traducción in vivo (por ejemplo mediada por línea celular) y/o in vitro y/o usando una tecnología de presentación tal como presentación de ribosomas, presentación de fagos, presentación de bacterias o presentación de levaduras).

Los anticuerpos expresados pueden después explorarse y seleccionarse usando ensayos funcionales, tales como ensayos de unión. Por ejemplo, los polipéptidos pueden expresarse en asociación con el polinucleótido que codifica la molécula de unión a anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monocatenario (scFv), permitiendo de esta manera la identificación de la secuencia del polinucleótido que codifica la molécula de unión de anticuerpo (por ejemplo, scFv). Los anticuerpos también pueden secretarse y presentarse sobre la membrana de un procariota tal como E. coli, usando, por ejemplo, la tecnología descrita, por ejemplo, en los documentos US20040072740A1; US20030036092A1; y US20030100023A1.

Los procedimientos de la invención pueden usarse para identificar secuencias de anticuerpos humanos para desarrollar anticuerpos o fragmentos de los mismos nuevos o mejorados, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios (scFv). Además, el procedimiento puede realizarse con el beneficio de una información a priori, por ejemplo, mediante modelado por ordenador y bioextracción de bases de datos electrónicas que puede usarse para preparar una biblioteca de referencia que representa un subconjunto inicial de secuencias que van a diversificarse, por ejemplo, de acuerdo con el criterio descrito en el presente documento, usando, por ejemplo, mutagénesis WTM o LTM.

Otras ventajas y aspectos de la presente invención serán fácilmente obvias a partir de la siguiente descripción y ejemplos.

1.2 Identificación y selección de componentes de la biblioteca universal de anticuerpos usando bioinformática

La primera etapa en la construcción de una biblioteca universal de anticuerpo (UAL) como se emplea en determinadas realizaciones de la presente invención es seleccionar secuencias que cumplan determinados criterios predeterminados. Por ejemplo, la base de datos de Kabat, una base de datos electrónica que contiene secuencias de anticuerpos reorganizadas no redundantes puede investigarse con respecto a aquellas secuencias que son más frecuentemente representadas, en particular, contra una clase de antígeno particular. La clase de antígeno puede incluir, por ejemplo, antígenos de proteína y de péptidos, pero también pequeñas moléculas, polisacáridos y polinucleótidos. Un análisis de agrupación de las secuencias marco conservadas de estos anticuerpos se realiza seguido de una comparación (usando el algoritmo de búsqueda BLAST) con las secuencias de la línea germinal (bases de datos V BASE) para determinar las familias de la línea germinal más frecuentemente usadas que posteriormente se redistribuyen para generar los anticuerpos funcionales que reconocen una clase de antígeno determinada, por ejemplo, antígenos o dianas proteicos.

Las secuencias marco conservadas candidatas que representan los grupos diversos más grandes y más estructuralmente diversos de anticuerpos funcionales se seleccionan después y las estructuras canónicas de CDR1 y CDR2 se determinan después para determinar la longitud de las CDR y, por tanto, la diversidad que puede alojarse en las regiones marco conservadas. Para la CDR3, se realiza una distribución de longitudes por tamaño para identificar un análisis de frecuencia de las secuencias de anticuerpo redistribuidas.

El procedimiento para derivar secuencias de aminoácidos de las CDR incluye un análisis de frecuencia de las secuencias de anticuerpo reorganizadas existentes. Como norma, el uso de aminoácidos se hace coincidir para una posición de resto CDR, y los aminoácidos más frecuentemente usados (prevalentes) en la posición dentro de una población o subpoblación (por ejemplo, un panel de secuencias CDR derivadas de las bases de datos) se observan hasta que la suma de las frecuencias alcanza un límite predeterminado. Una vez que el límite predeterminado se consigue, después se añaden los aminoácidos a la biblioteca de referencia solamente si su frecuencia (prevalencia)

es igual a o superior a un umbral predeterminado. Para la biblioteca de referencia del Ejemplo 4, el límite se estableció al 80% y el umbral de prevalencia ajustado para aminoácidos individuales fue del 10%.

La estrategia de construcción de bibliotecas universales implica la selección de secuencias marco conservadas seguido de diseño de bucles CDR hipervariables. Para la selección de secuencias marco conservadas, se ordenó un subconjunto de todos los armazones de las regiones marco conservadas que se había determinado que se habían expresado en respuesta a un antígeno particular. Determinando las regiones marco conservadas que eran las más frecuentemente expresadas en la naturaleza en respuesta a una clase de antígeno determinada se seleccionó un aceptor de región marco conservada apropiado. Por ejemplo, para determinar las regiones marco conservadas aceptoras preferidas expresadas en respuesta a antígenos basados en proteínas, la base de datos Kabat (una base de datos de secuencia de anticuerpos de suscripción a la que puede accederse, por ejemplo, en la http://www.kabatdatabase.com) se busca con respecto a regiones marco conservadas dirigidas por proteína. Si las secuencias aceptoras preferidas son necesarias para la presentación de las CDR contra una clase de antígeno diferente y/o secuencias aceptoras de una especie particular, el filtro de la secuencia de la proteína por Kabat se establece de manera conveniente. Por ejemplo, para determinar secuencias para su uso como agentes terapéuticos humanos contra dianas basadas en proteínas, el filtro se establece para centrarse exclusivamente en secuencias de anticuerpos humanas (no secuencias de ratones, de rata o de pollo, etc.) que reconozcan los antígenos de proteína/péptido. Esto reduce enormemente la redundancia en el conjunto de datos y la información de secuencia que podría sesgar los resultados.

La etapa anterior minimiza la necesidad de generar numerosos armazones de regiones marco conservadas sintéticas diferentes y típicamente da como resultado un conjunto de datos de posibles aceptores de aproximadamente 600 secuencias o menos. Por consiguiente, la cantidad de secuencias resultante es fácil de manejar para análisis posterior para determinar las secuencias precursoras de la línea germinal que dan lugar a las secuencias de genes reorganizadas que se seleccionan por clases de antígenos. Esta segunda determinación del origen de la línea germinal refina la selección de las secuencias de anticuerpo que se han seleccionado mediante una clase de antígeno porque identifica si hay secuencias marco conservadas de la línea germinal óptimas (o una alta frecuencia) que se sobreexpresan. De hecho, se ha observado que en algunas respuestas policlonales contra determinados antígenos, cuando se produce una gran cantidad de secuencias de anticuerpo reorganizadas, únicamente se usan unas pocas secuencias de la región marco conservada aceptora. En dicho caso, la secuencia de anticuerpo y la diversidad de unión para los antígenos está muy localizada en las CDR, no en las regiones marco conservadas. El análisis bioinformático anterior se centra en genes VH para propósitos descriptivos, pero se entenderá que de manera similar se evalúan genes tanto para VA como para V#. Las regiones marco conservadas usadas en las bibliotecas de anticuerpo cohorte de la invención pueden seleccionarse a partir de las empleadas durante el diseño de las bibliotecas de anticuerpo de referencia empleadas por la invención o mediante cualquier procedimiento reconocido por la técnica de selección de regiones marco conservadas.

1.3 Enfoques de diseño para maximizar la diversidad de la CDR

La elección de las regiones marco conservadas candidatas usadas en las Bibliotecas Universales de Anticuerpo (UAL) de referencia ejemplares dictamina tanto los tamaños de CDR como la diversidad de secuencia de aminoácidos inicial de las UAL. Cuando las secuencias de anticuerpos se identifican para 1) frecuencia de aparición contra una clase de antígeno y 2) frecuencia de la línea germinal, las secuencias pueden después ordenarse de acuerdo con su clase canónica. La clase canónica se determina usando las convenciones descritas por Chothia (véase Materiales y Procedimientos, más adelante). De un conjunto determinado de secuencias de anticuerpo, la mayoría de las secuencias de anticuerpos identificadas pueden encontrarse dentro de una determinada clase canónica. Por tanto la clase canónica dictamina la cantidad de restos de aminoácidos que pueden incluirse en las CDR. Por ejemplo, si la clase canónica es 1-3, entonces la CDR1 tendría un bucle de 5 aminoácidos y la CDR2 tendría un bucle de 17 aminoácidos. Para la secuencia variable de la cadena pesada la contribución de la secuencia del segmento J está relativamente bien conservada de manera que, típicamente, solo es necesario considerar la secuencia que mejor se ajusta de un subconjunto de solo seis secuencias. Un análisis de frecuencia de aminoácidos de la CDR de las bases de datos Kabat y V BASE permite la identificación de posiciones de restos de aminoácidos en la CDR que se encuentran dentro de tres categorías, es decir, 1) posiciones que deben conservarse, 2) posiciones que son adecuadas para la generación de diversidad y 3) posiciones que pueden mutarse para imitar la hipermutación somática.

Por consiguiente, en el diseño de la diversidad de VH-CDR1 de una UAL de referencia, los restos de aminoácidos dentro de la CDR se agrupan en tres diferentes categorías: 1) posiciones conservadas en los genes de la línea germinal y reagrupados que por lo tanto permanecen sin cambios, 2) posiciones conservadas en la línea germinal pero que varían en los genes reordenados que son por lo tanto inicialmente fijos pero mutados durante la maduración por afinidad y 3) posiciones que tienen una diversidad en la línea germinal y secuencias reorganizadas y por lo tanto se identifican como posiciones para la incorporación de la diversidad usando WTM∃ durante la construcción inicial de la biblioteca.

En el diseño de VH-CDR2, el análisis de diversidad en las bases de datos V BASE y Kabat se enfoca de una manera similar a la realizada para la VH-CDR1 anterior.

En el diseño de la diversidad de VH CDR3, las secuencias CDR3 de anticuerpos a partir de las bases de datos de Kabat se alinean de acuerdo con su tamaño y clase de antígeno. Las longitudes de las CDR3 de los anticuerpos que reconocen antígenos de proteína/péptidos y no proteína se comparan y se realiza un análisis de frecuencia y se usa una frecuencia umbral del 10% para identificar las secuencias más favorables para usar en el diseño de la diversidad de la CDR3. Dado que del tamaño de la CDR3 y el análisis de frecuencia de restos de aminoácidos se realiza usando, por ejemplo, las secuencias reorganizadas del gen D y J de la inmunoglobulina, no hay equivalentes de la línea germinal de “CDR3” para comparaciones Kabat y V BASE filtradas directas. Sin embargo, puede realizarse un análisis de frecuencia Kabat filtrado para cada tamaño de CDR reorganizado que revela, para cada tipo de clasificación, el aminoácido más frecuente en todas las posiciones CDR3 y da como resultado una secuencia “natural” consenso. Sorprendentemente, esta estrategia “consenso” identifica aminoácidos particulares bajo presión muy selectiva. Por consiguiente, esta posición de resto está típicamente fijada introduciéndose una diversidad en las restantes posiciones de aminoácidos (teniendo en cuenta la preferencia identificada para determinados aminoácidos presentes en estas posiciones).

Cuando se diseña la diversidad de una biblioteca de UAL de referencia o CDR cohorte o de anticuerpos derivada de la misma para cualquiera de las CDR mencionadas anteriormente, los restos de aminoácidos modificados, por ejemplo, restos fuera de los 20 aminoácidos tradicionales usados en la mayoría de los polipéptidos, por ejemplo, homocisteína, pueden incorporarse en las CDR si se desea. Esto se realiza usando técnicas reconocidas en la materia que típicamente introducen codones de terminación en el polinucleótido cuando se desea modificar el resto de aminoácido. La técnica proporciona entonces un ARNt modificado unido al aminoácido modificado a incorporar (un ARNt denominado supresor de, por ejemplo, el codón de detención ámbar, ópalo u ocre) en el polipéptido (véase, por ejemplo, Köhrer y col., import of amber and ochre suppressors tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins, PNAS, 98, 14310-14316 (2001)).

2. Construcción de biblioteca de anticuerpo cohorte y biblioteca universal de anticuerpo (UAL) de referencia

La generación de bibliotecas de anticuerpo de cohorte y bibliotecas universales de anticuerpo de referencia y su construcción se realizan con el beneficio de la información de secuencia y estructural referente a la diversidad de anticuerpo a generar, de tal manera que el potencial para generar anticuerpos mejorados aumenta. También puede usarse información de modelado para guiar la selección de la diversidad de aminoácidos para introducirse en las regiones definidas, por ejemplo, en las CDR. Adicionalmente aún, los resultados reales obtenidos con los anticuerpos de la invención pueden guiar la selección (o exclusión), por ejemplo, la maduración por afinidad, de anticuerpos posteriores para realizar y explorar de una manera iterativa.

En realizaciones específicas, la modelación se usa para eliminar la producción de cualquiera de los anticuerpos previstos que tengan una estructura y/o función mala o no deseada. De esta manera, la cantidad de anticuerpos a producir puede reducirse enormemente aumentando por lo tanto la señal con respecto al ruido en ensayos de exploración posteriores. En otra realización particular, la modelación se actualiza de manera continuada con información adicional, a partir de cualquier fuente relevante, por ejemplo, a partir de una secuencia génica y de proteína y bases de datos tridimensionales y/o resulta de anticuerpos previamente ensayados, de tal manera que las bases de datos virtuales (en determinadas realizaciones, por ordenador) se hace más precisa en su capacidad predictiva (Figura 1).

En otra realización adicional, las bases de datos virtuales se proporcionan con los resultados del ensayo, por ejemplo, afinidad de unión/avidez de anticuerpos previamente ensayados y categoriza los anticuerpos basándose en el criterio o los criterios de ensayo, como respondedores o no respondedores, por ejemplo, como anticuerpos que se unen bien o no se unen bien. De esta manera, la maduración por afinidad de la invención puede igualar un intervalo de respuestas funcionales con información de secuencia y estructural particular y uso de dicha información para guiar la producción de futuros anticuerpos a ensayar. El procedimiento es especialmente adecuado para explorar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para una afinidad de unión particular a un antígeno diana usando, por ejemplo, un ensayo Biacore.

Por consiguiente, la mutagénesis de restos no contiguos dentro de una región puede ser deseable si se conoce, por ejemplo, a través de modelación por ordenador, que determinados restos en la región no participarán en la función deseada. La estructura coordinada e interrelación espacial entre las regiones definidas, por ejemplo, los restos de aminoácidos funcionales en las regiones definidas del anticuerpo, por ejemplo, la diversidad que se ha introducido, puede considerarse y modelarse. Dichos criterios de modelación incluyen, por ejemplo, química de grupo lateral de restos de aminoácidos, distancias de átomos, datos de cristalografía, etc. Por consiguiente, la cantidad de anticuerpos a producir puede minimizarse de manera inteligente.

Para la síntesis de una UAL de referencia, una o más de las etapas anteriores pueden realizarse mediante ordenador. La etapa realizada por ordenador puede comprender por ejemplo extracción en la base de datos de Kabat y, opcionalmente, realizar referencias en cruzado de los resultados contra V BASE, mediante la cual se determinan determinados criterios de la invención y se usan para diseñar la diversidad de la CDR deseada (Figura 1). La síntesis de una biblioteca (UAL) de referencia también puede implicar la compilación de información de secuencia (opcionalmente con ayuda de ordenador) a partir de una colección de clones rescatados. La selección de bibliotecas de anticuerpos y CDR de cohorte a partir de las bibliotecas de referencia empleadas por los

procedimientos de la invención también puede asistirse por ordenador. Dichos procedimientos también son susceptibles de realizarse, en parte o en su conjunto, por un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo accionado mediante un ordenador. Por ejemplo, alineamientos de secuencia, comparaciones de secuencia, selecciones de restos específicos/posiciones, cálculos de diversidades de biblioteca, selección de secuencia de anticuerpo por extracción en base de datos, diseño de diversidad, síntesis de oligonucleótidos, ensamblaje por mutagénesis de kunkel o mediada por PCR de lo anterior y expresión y selección de anticuerpos candidatos que se unen a una diana determinada, pueden realizarse en parte o en su totalidad, mediante dispositivo entrelazados. Además, las instrucciones para realizar el procedimiento, en parte o por completo, pueden conferirse a un medio adecuado para su uso en un dispositivo electrónico para realizar las instrucciones. En suma, los procedimientos de la invención son enmendables a una estrategia de alto rendimiento que comprende programación (por ejemplo, instrucciones que pueden leerse por ordenador) y soporte lógico (por ejemplo, ordenadores, robótica y microplacas).

Determinadas realizaciones de la invención pueden realizarse mediante el uso de un ordenador u otro aparato electrónico capaz de realizar y/o ayudar a realizar los procedimientos característicos de la invención. Una realización de ejemplo de un dispositivo electrónico 500 adecuado para llevar a la práctica las realizaciones ilustrativas de la presente invención se muestra en la Figura 32. El dispositivo electrónico 500 es representativo de diversas tecnologías diferentes, tales como ordenadores personales (PC), ordenadores portátiles, estaciones de trabajo, asistentes digitales personales (PDA), aplicaciones de internet, teléfonos móviles y similares. En la realización ilustrada, el dispositivo electrónico 500 incluye una unidad de procesamiento central (CPU) 502 y un dispositivo de pantalla 504. El dispositivo de pantalla 504 permite que el dispositivo electrónico 500 se comunique directamente con un usuario a través de una pantalla visual. El dispositivo electrónico 500 incluye adicionalmente un teclado 506 y un ratón 508. Otros posibles dispositivos de entrada no representados incluyen un lápiz, un puntero de bola, una palanca de juego, un panel táctil, una pantalla táctil y similares. El dispositivo electrónico 500 incluye un almacenamiento primario 510 y un almacenamiento segundario 512 para almacenar datos e instrucciones. Los dispositivos de almacenamiento 510 y 512 pueden incluir tecnologías tales como un disquete flexible, un disco duro, un lector de cinta, un lector óptico, una memoria de solo lectura (ROM), una memoria de acceso aleatorio (RAM) y similares. Aplicaciones tales como navegadores, máquinas virtuales JAVA y otras utilidades y aplicaciones pueden incluirse en uno o ambos de los dispositivos de almacenamiento 510 y 512. El dispositivo electrónico 500 también puede incluir una interfaz en red 514 para la comunicación con uno o más de los dispositivos electrónicos externos al dispositivo electrónico 500 representado. Un módem es una forma de interfaz en red 514 para establecer una conexión con un dispositivo o red electrónica externa. La CPU 502 tiene interna o externamente, unidos a la misma uno o más de los componentes mencionados anteriormente. Además de las aplicaciones anteriormente mencionadas, aplicaciones de modelado tales como Simuling% 516, pueden instalarse y ponerse en funcionamiento en el dispositivo electrónico 500.

Debe observarse que el dispositivo electrónico 500 es únicamente representativo de una estructura para implementar la presente invención. Sin embargo, un experto habitual en la técnica apreciará que la presente invención no se limita a la implementación sobre únicamente el dispositivo 500 descrito. Pueden utilizarse otras implementaciones incluyendo una implementación basada parcial o enteramente en un código incluido en el que no son necesarios ningún dato introducido por usuario ni dispositivos de pantalla. En su lugar, un procesador puede establecer la comunicación directamente con otro procesador u otro dispositivo.

3. Síntesis de bibliotecas de anticuerpos y de CDR de cohorte seleccionadas

En una realización, las bibliotecas de anticuerpos y CDR cohorte seleccionadas descritas se generan para la exploración sintetizando oligonucleótidos individuales que codifican la región definida del polipéptido y no tienen más de un codón para el aminoácido predeterminado. Esto se consigue incorporando, en cada posición de codón dentro del oligonucleótido bien el codón requerido para la síntesis del polipéptido natural o bien un codón para el aminoácido predeterminado y se denomina mutagénesis look-through (LTM) (véase, por ejemplo, el documento

U.S.S.N. 60/483282).

En otra realización, cuando se requiere diversidad en posiciones de aminoácidos múltiples, puede usarse la degeneración de oligonucleótidos o la mutagénesis walk-through (WTM) (véase por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.649.340; 5.830.650; y 5.798.208; y el documento U.S.S.N. 60/483.282). La WTM permite realizar mutaciones múltiples con una cantidad mínima de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden producirse individualmente, en lotes, usando, por ejemplo, técnicas de dopaje, y después mezclarse o agruparse como se desee.

La mezcla de oligonucleótidos para la degeneración de la biblioteca puede sintetizarse fácilmente por procedimientos conocidos para la síntesis de ADN. El procedimiento preferido implica el uso de química con betacianoetil fosforamidita en fase sólida (por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.725.677). Por comodidad, puede usarse un instrumento para automatizar la síntesis de ADN que contenga recipientes de nucleótidos para reactivos específicos. Los polinucleótidos también pueden sintetizarse para contener sitios de restricción o sitios de hibridación con cebadores para facilitar la introducción o ensamblaje de los polinucleótidos que representan, por ejemplo, una región definida, en un contexto génico más grande.

Los polinucleótidos sintetizados pueden insertarse en un contexto génico más grande, por ejemplo, un anticuerpo monocatenario (scFv), fab o Ig completo usando técnicas de modificación por ingeniería genética convencionales. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden prepararse para contener sitios de reconocimiento flanqueantes para enzimas de restricción (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.888.288). Los sitios de reconocimiento pueden diseñarse para corresponderse con sitios de reconocimiento que bien existen naturalmente o se introducen en el gen próximo al ADN que codifica la región. Después de la conversión en forma bicatenaria, los polinucleótidos se ligan en el gen o vector génico mediante técnicas convencionales. Mediante un vector apropiado (incluyendo, por ejemplo, vectores de fagos, plásmidos) los genes pueden introducirse en un extracto acelular, fago, célula procariota o célula eucariota adecuada para la expresión de los anticuerpos.

Como alternativa, se diseñan polinucleótidos parcialmente solapantes, típicamente de una longitud de aproximadamente 20-60 nucleótidos. Los polinucleótidos internos se hibridan después con su compañero complementario para proporcionar una molécula de ADN bicatenaria con extensiones monocatenarias útiles para una hibridación posterior. Los pares hibridados pueden después mezclarse juntos, extenderse y ligarse para formar moléculas bicatenarias de longitud completa usando PCR. Pueden diseñarse sitios de restricción convenientes cerca de los extremos del gen sintético para la clonación en un vector adecuado. Después las moléculas de longitud completa pueden ligarse en un vector adecuado.

Cuando se usan polinucleótidos parcialmente solapantes en el ensamblaje génico, también puede incorporarse directamente un conjunto de nucleótidos degenerados en lugar de uno de los polinucleótidos. La cadena complementaria apropiada se sintetiza durante la reacción de extensión a partir de un polinucleótido parcialmente complementario de la otra cadena mediante extensión enzimática con una polimerasa. La incorporación de los polinucleótidos degenerados en el estadio de síntesis también simplifica la clonación cuando no más de un dominio

o región definida de un gen se muta o se modifica por ingeniería genética para tener diversidad.

En otra estrategia, el anticuerpo se presenta en un plásmido monocatenario. Por ejemplo, el gen puede clonarse en un vector fago o un vector con un origen de replicación de fago filamentoso que permite la propagación de moléculas monocatenarias con el uso de un fago auxiliar. El molde monocatenario puede hibridarse con un conjunto de polinucleótidos degenerados que representan las mutaciones deseadas y alongarse y ligarse, incorporando así cada cadena análoga en una población de moléculas que puede introducirse en un huésped apropiado (véase, por ejemplo Sayers, J. R. y col., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 (1988)). Esta estrategia puede eludir sitios de clonación múltiples en las que se seleccionan dominios múltiples para mutagénesis.

También puede usarse la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incorporar polinucleótidos en un gen, por ejemplo, una diversidad de CDR en regiones marco conservadas. Por ejemplo, los propios polinucleótidos pueden usarse como cebadores para la extensión. En esta estrategia, los polinucleótidos que codifican los casetes mutagénicos correspondientes a la región definida (o parte de la misma) son complementarios entre sí, al menos en parte, y pueden extenderse para formar un casete génico grande (por ejemplo, un scFv) usando una polimerasa, por ejemplo, usando amplificación por PCR.

El tamaño de la biblioteca variará dependiendo de la longitud de la CDR y de la cantidad de la diversidad de CDR que es necesario representar usando, por ejemplo WTM o LTM. Preferentemente, la biblioteca se diseñará para que contenga menos de 1015, 1014, 1013, 1012, 1011, 1010, 109, 108, 107, y más preferentemente, 108 anticuerpos o menos.

La anterior descripción se ha centrado en representar la diversidad de anticuerpos modificando el polinucleótido que codifica el polipéptido correspondiente. Sin embargo, se entiende que el alcance de la invención también incluye procedimientos de representación de la diversidad de anticuerpos desvelados en el presente documento por síntesis directa de las regiones polipeptídicas deseadas usando química de proteínas. Realizando esta estrategia, los polipéptidos resultantes aún incorporan las características de la invención excepto que el uso de un intermedio polinucleotídico puede eliminarse.

Para las bibliotecas descritas anteriormente, se entiende que bien en forma de polinucleótidos y/o polipéptidos correspondientes, las bibliotecas también pueden unirse a un soporte sólido, tal como una microplaca, y preferentemente disponerse, usando técnicas reconocidas en el campo.

El procedimiento de la presente invención es especialmente útil para modificar moléculas de anticuerpo candidatas mediante maduración por afinidad. Pueden introducirse modificaciones en la región variable y/o en la región marco conservada (constante) de un anticuerpo. La modificación de la región variable puede producir anticuerpos con mejores propiedades de unión al antígeno y, si se desea, propiedades catalíticas. La modificación de la región marco conservada también puede conducir a la mejora de las propiedades químico físicas tales como solubilidad o estabilidad que son especialmente útiles, por ejemplo, en la producción comercial, biodisponibilidad y afinidad por el antígeno. Típicamente, la mutagénesis dirigirá la región Fv de la molécula de anticuerpo, es decir, la estructura responsable de la actividad de unión al antígeno que se realiza por regiones variables de dos cadenas, una de la cadena pesada (VH) y otra de la cadena ligera (VL). Una vez identificadas las características de unión al antígeno deseadas, la región (o regiones) variable puede modificarse por ingeniería genética en una clase de anticuerpo apropiada tal como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE. En una realización preferida, una molécula de unión candidata identificada se somete a maduración por afinidad para aumentar la afinidad/avidez de la molécula de unión por una

diana/antígeno.

4. Sistemas de expresión y exploración

Las bibliotecas de polinucleótidos generadas por cualquiera de las técnicas anteriores u otras técnicas adecuadas pueden expresarse y explorarse para identificar anticuerpos que tienen una estructura y/o actividad deseada. La expresión de los anticuerpos puede realizarse usando extractos acelulares (y, por ejemplo, presentación de ribosomas), presentación de fagos, células procariotas o células eucariotas (por ejemplo, presentación de levaduras).

En una realización, los polinucleótidos se diseñan por ingeniería genética para servir como moldes que pueden expresarse en un extracto acelular. Pueden usarse vectores y extractos como se describe, por ejemplo en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.324.637; 5.492.817; 6.665.563, y muchos se encuentran disponibles en el mercado. Pueden usarse técnicas de presentación de ribosomas y otras técnicas acelulares para la unión de un polinucleótido (es decir, un genotipo) a un polipéptido (es decir, un fenotipo), por ejemplo, Profusion™ (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.348.315; 6.261.804; 6.258.558; y 6.214.553).

Como alternativa, los polinucleótidos pueden expresarse en un sistema de expresión de E. coli conveniente, tal como el descrito por Pluckthun y Skerra. (Pluckthun, A. y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178: 476-515 (1989); Skerra, A. y col., Biotechnology 9: 273-278 (1991)). Las proteínas mutantes pueden expresarse para la secreción en el medio y/o en el citoplasma de las bacterias, como describen M. Better y A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178: 476 (1989). En una realización, cada uno de los dominios sencillos que codifican VH y VL está unido al extremo 3’ de una secuencia que codifica una secuencia de señal, tal como la secuencia de señal ompA, phoA o pelB (Lel, S. P. y col., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)). Estas fusiones génicas se ensamblan en una construcción dicistrónica, de manera que puedan expresarse a partir de un solo vector y secretarse en el espacio periplásmico de E. coli donde se replegarán y pueden recuperarse en forma activa. (Skerra, A. y col., Biotechnology 9: 273-278 (1991)). Por ejemplo, los genes de cadena pesada del anticuerpo pueden expresarse simultáneamente con genes de la cadena ligera del anticuerpo para producir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

En otra realización, las secuencias de anticuerpos se expresan en la superficie de membrana de un procariota, por ejemplo E coli, usando una señal de secreción y un resto de lipidación como se describe, por ejemplo, en los documentos US20040072740A1; US20030100023A1; y US20030036092A1.

En otra realización más, los polinucleótidos pueden expresarse en células eucariotas tales como levaduras usando, por ejemplo, presentación de levaduras como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.423.538; 6.331.391; y 6.300.065. En esta estrategia, los anticuerpos de la biblioteca (por ejemplo, los scFv) se fusionan a un polipéptido que se expresa y se presenta sobre la superficie de la levadura.

También puede usarse células eucariotas superiores para la expresión de los anticuerpos de la invención, tales como células de mamífero, por ejemplo células de mieloma (por ejemplo células NS/0), células de hibridoma o células de ovario de hámster chino (CHO). Típicamente, cuando los antibióticos se expresan en células de mamíferos, se diseñan para expresarse en el medio de cultivo o expresarse en la superficie de dicha célula. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden producirse, por ejemplo, como moléculas de anticuerpo enteras o como fragmentos VH y VL individuales, fragmentos Fab, dominios sencillos o como cadenas sencillas (sFv) (véase por ejemplo, Huston, J. S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)).

La exploración de los anticuerpos expresados (o anticuerpos producidos por síntesis directa) puede realizarse mediante cualquier medio apropiado. Por ejemplo, la actividad de unión puede evaluarse mediante cromatografía por afinidad y/o inmunoensayo convencional. La exploración de los anticuerpos de la invención para la función catalítica, por ejemplo, función proteolítica, puede conseguirse usando un ensayo de placa con hemoglobina convencional como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.798.208. La determinación de la capacidad de los anticuerpos candidatos para unirse a dianas terapéuticas puede someterse a ensayo in vitro usando, por ejemplo un instrumento Biacore que mide las velocidades de unión de un anticuerpo a una diana o antígeno determinado. Pueden realizase ensayos in vivo usando cualquiera de diversos modelos animales y después posteriormente ensayarse, según sea apropiado, en seres humanos.

Ejemplos

En todos los ejemplos, salvo que se indique de otra manera, se usaron los siguientes materiales y procedimientos.

Materiales y procedimientos

En general, la realización práctica de la presente invención emplea, a menos que se especifique de otra manera, técnicas de química convencional, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, tecnología PCR, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología con anticuerpos), sistemas de expresión (por ejemplo, expresión acelular, presentación de fagos, presentación de ribosomas y Profusion™) y cualquier cultivo celular necesario que se encuentre dentro de la habilidad de la técnica y se explique en la bibliografía. Véase, por ejemplo Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, Vols. 1

y 2, (D.N. Glover, Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Ed. 1984); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor); Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle, Ed., Oxford Univ Press (1999); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y col., Academic Press (1990); PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke, Ed., John. Wiley & Son Ltd (1996); The PCR Technique: RT-PCR, Siebert, Ed., Eaton Pub. Co. (1998); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y col.,

C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons (1992); Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, A., Ed., Marcel Dekker, Pub., (1990). Phage Display : A Laboratory Manual, C. Barbas (Ed.), CSHL Press, (2001); Antibody Phage Display, P O’Brien (Ed.), Humana Press (2001); Border y col., Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnology, 15(6):553-7 (1997); Border y col., Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol., 328: 430-44 (2000); presentación de ribosomas como describen Pluckthun y col. en la Patente de Estados Unidos Nº 6.348.315 y Profusion™ como describen Szostak y col. en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.258.558; 6.261.804; y 6.214.553.

Pueden encontrarse otros detalles con respecto a los análisis de secuencia de anticuerpos usando convenciones de Kabat, por ejemplo, en Johnson y col., The Kabat database and a bioinformatics example, Methods Mol Biol. 2004;

248: 11-25; Johnson y col., Preferred CDRH3 lengths for antibodies with defined specificities, Int Immunol. Dic, 1998; 10(12): 1801-5; Johnson y col., SEQ-HUNT. A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences, Methods Mol Biol. 1995; 51: 1-15. y Wu y col., Length distribution of CDRH3 in antibodies; y Johnson y col., Proteins. Mayo 1993; 16(1): 1-7. Revisión).

Pueden encontrarse otros detalles con respecto a los análisis de secuencia de anticuerpos usando convenciones Chothia, por ejemplo, en Chothia y col., Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain, J Mol Biol. 1 de mayo 1998; 278(2): 457-79; Morea y col., Antibody structure, prediction and redesign, Biophys Chem. Oct 1997; 68(1-3): 9-16. ; Morea y col., Conformations of the third hypervariable region in the VH domain of immunoglobulins; J Mol Biol. 16 de enero 1998; 275(2): 269-94; Al-Lazikani y col., Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins, J Mol Biol. 7 de noviembre 1997; 273(4): 927-48. Barre y col., Structural conservation of hypervariable regions in immunoglobulins evolution, Nat Struct Biol. Dic 1994; 1 (12): 91520; Chothia y col., Structural repertoire of the human VH segments, J Mol Biol. 5 de octubre 1992; 227(3): 799-817 Conformations of immunoglobulin hypervariable regions, Nature. 21-28 de diciembre 1989; 342(6252): 877-83; y Chothia y col., Review Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J Mol Biol. 20 de agosto 1987; 196(4): 901-17).

Se describen otros detalles con respecto al análisis de Chothia, por ejemplo, en Morea V, Tramontano A, Rustici M, Chothia C, Lesk AM. Conformations of the third hypervariable region in the VH domain of immunoglobulins. J Mol Biol. 16 de Enero 1998; 275(2): 269-94; Chothia C, Lesk AM, Gherardi E, Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. J Mol Biol. 5 de octubre 1992; 227(3): 799817; Chothia C, Lesk AM, Tramontano A, Levitt M, Smith-Gill SJ, Air G, Sheriff S, Padlan EA,. Davies D, Tulip WR, y col. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 21-28 de diciembre 1989; 342(6252): 877-83; Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 20 de agosto 1987; 196(4): 901-17; y Chothia C, Lesk AM. The evolution of protein structures. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1987; 52: 399-405.

Se describen otros detalles con respecto a las consideraciones de contacto de CDR, por ejemplo, en MacCallum RM, Martin AC, Thornton JM. Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site Topography. J Mol Biol. 11 de octubre 1996; 262(5): 732-45.

Se encuentran otros detalles con respecto a las secuencias de anticuerpos y las bases de datos indicadas en el presente documento, por ejemplo, en Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G. The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops. J Mol Biol. 5 de octubre 1992; 227(3): 776-98; U W, Jaroszewski L, Godzik A. Clustering of highly homologous sequences to reduce the size of large protein databases. Bioinformatics. marzo 2001; 17(3): 282-3; [VBDB] www.mrccpe.cam.ac.uk/V_BASE-ok.php?menu=901; [KBTDB] www.kabatdata-base.com; [BLST] www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/[CDHIT]bioinformatics.ljcrf.edu/cd-hi/; [EMBOSS] www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/; [PHYLIP] evolution.genetics.washington.edu/phylip.html; y [FASTA] fasta.bioch.virginia.edu.

Ejemplo 1

Procedimientos para la identificación y selección de secuencias de la biblioteca universal de anticuerpos de referencia

En este ejemplo, se identifican y seleccionan secuencias de la biblioteca universal de anticuerpos de referencia usando bioinformática y criterios de selección como se desvela en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 60/585.931.

En resumen, la base de datos electrónica de Kabat que contiene secuencias de inmunoglobulina expresadas, es decir, reordenadas, se investigó usando determinados algoritmos de filtrado. En particular, los algoritmos de filtrado se diseñaron para identificar solamente secuencias humanas que se expresaron en respuesta a una clase de antígeno particular. La clase de antígeno seleccionada fue antígenos/dianas basados en proteínas porque este es un conjunto de dianas que pueden tratarse para el desarrollo de agentes terapéuticos humanos. Sin embargo, se entiende que la base de datos se consulta con la misma facilidad para otras clases de antígenos, por ejemplo, péptidos, polisacáridos, polinucleótidos y pequeñas moléculas así como para secuencias de anticuerpo derivadas de otras especies, tales como secuencias de primate, de ratón, de rata o de pollo, etc., para el desarrollo de, por ejemplo, agentes terapéuticos para aplicación veterinaria. Los criterios anteriores se aplicaron a un conjunto inicial de 3319 secuencias VH (sin embargo, se observa que este conjunto de secuencias puede aumentar en número a medida que se clonan secuencias adicionales y se introducen en la base de datos).

La investigación y el análisis de filtrado anteriores volvieron a incorporarse a un conjunto de datos de -600 secuencias génicas VH que representan clones de anticuerpos humanos reordenados de manera no redundante que reconocen antígenos de proteína. La siguiente etapa implica la designación del precursor de la línea germinal que genera estas secuencias génicas reordenadas, seguido por un análisis de frecuencia de estas secuencias de la línea germinal candidatas. En otras palabras, una determinación de si hay secuencias marco conservadas de la línea germinal de frecuencia óptima o elevada para los antígenos de proteína. Para determinar las secuencias de la línea germinal empleadas por los genes reordenados en las secuencias VH filtradas (de Kabat), se usó V BASE. V BASE es un directorio exhaustivo de todas las secuencias de la región variable de la línea germinal humana compilado de más de miles de secuencias publicadas, incluyendo las que se encuentran en las ediciones actuales de las bibliotecas de datos del Genbank y EMBL (véase respectivamente, por ejemplo, Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. y Lipman, D. J. (1990) quot;Basic local alignment search tool.quot; J. Mol. Biol. 215: 403-410 y www.mrc-cpe.cam.ac.uk/V BASE-ok mantenida por el Centre for Protein Engineering MRC Centre, Hills Rd, Cambridge, Reino Unido, CB2 2QH). Actualmente existen 51 segmentos VH funcionales agrupados en 7 familias: (es decir, VH 1-7), 40 segmentos VK funcionales agrupados en 7 familias: (es decir., VK I-VII) y 31 segmentos V funcionales agrupados en 10 familias: (es decir., V 1-10). Se realizó un BLAST discontinuo de las secuencias de la línea germinal V BASE con las secuencias Kabat filtradas (∋600 VH) para identificar los genes de la línea germinal VH (y familias) que más frecuentemente contribuían a secuencias que se expresan (reordenadas). El análisis por ejemplo, identificó que seis de las ocho regiones marco conservadas más altamente representadas (regiones marco conservadas 1, 2 y 3) pertenecían a la familia de la línea germinal VH3 y los miembros de la familia VH4 formaban un grupo de representación intermedia. Se realizó un análisis de frecuencia en las secuencias marco conservadas (1,2 y 3) VH de la línea germinal que estaban representadas en la base de datos de Kabat filtrada. Para este análisis se permitieron hasta 4 mutaciones somáticas durante la clasificación de las secuencias reordenadas para un gen de la línea germinal. La línea umbral se ajustó para identificar aquellos genes de la línea germinal que eran los más frecuentemente representados en secuencias reordenadas de anticuerpos que reconocían antígenos de proteína/péptidos.

La identificación de las regiones marco conservadas VH3 de mayor frecuencia tiene una importante consecuencia. La selección de la secuencia marco conservada inicial VH3 dictamina la diversidad de la secuencia de la CDR correspondiente y las limitaciones de tamaño como se define mediante estructuras canónicas convencionales (véase, por ejemplo Chothia, C., y col., Structural repertoire of the human VH segments. J Mol Biol, 1992. 227(3): páginas 799-817 y Tomlinson, I. M., y col., The Structural repertoire of the human V kappa domain. Embo J, 1995. 14(18): páginas 4628-38). La búsqueda BLAST Kabat filtrada por V BASE también identifica posiciones que se denominan “puntos calientes” para la hipermutación somática que pueden mutarse durante la maduración por afinidad de moléculas candidatas. Los resultados de la V BASE-Kabat preliminar identificaron seis regiones marco conservadas VH3 muy utilizadas; 3-07, 3-21, 3-23, 3-30,5, 3-48 y 3-74. En la selección de regiones marco conservadas de partida múltiples se creó una diversidad estructural añadida fuera de las CDR para la posible unión al antígeno. El análisis comparativo de las seis secuencias JH (que codifican la región marco conservada 4) indica que cuatro de estas secuencias son idénticas y que solo existen dos diferencias en los aminoácidos en las otras dos secuencias. Esta conservación de secuencia permite el uso de una región marco conservada común 4 para las seis familias de región marco conservada minimizando la generación de diversidad no funcional.

Por tanto, se demostró que podía identificarse de un modo lógico un conjunto de secuencias marco conservadas de anticuerpo manejable usando los criterios de la invención y usando una estrategia bioinformática y las bases de datos de anticuerpos existentes. Además, la identificación de estas secuencias proporciona el fundamento para maximizar la diversidad de la CDR inteligente dentro de la biblioteca universal de anticuerpos y bibliotecas de cohorte de la invención seleccionada a partir de las mismas, como se analiza más adelante.

Ejemplo 2

Procedimientos para diseñar la diversidad de cdr para las bibliotecas universales de anticuerpos de referencia

En este ejemplo, se presentan procedimientos para optimizar la diversidad de CDR de una biblioteca universal de anticuerpos de referencia.

La elección de las regiones marco conservadas candidatas, como se ha indicado anteriormente, dictamina tanto los tamaños de la CDR para introducir como la selección de la secuencia de aminoácidos inicial. Las seis familias de genes VH3 seleccionadas tienen las mismas estructuras canónicas de 1-3. La estructura canónica 1-3 requiere que la CDR1 y CDR2 tengan, respectivamente, 5 y 17 bucles de aminoácidos. Un análisis de frecuencia de aminoácidos de CDR de las bases de datos Kabat y V BASE permite la identificación de los aminoácidos de la CDR para 1) una conservación de secuencia absoluta, 2) la primera ronda de generación de diversidad y 3) posterior maduración por afinidad imitando la hipermutación somática. El diseño de cada CDR en las regiones variables de cadena pesada y ligera se analiza secuencialmente más adelante.

Para diseñar la primera CDR de la cadena pesada, en lo sucesivo en el presente documento “VH-CDR1”, se consideraron los criterios anteriores de la siguiente manera:

Las posiciones CDR que están conservadas tanto en la línea germinal como en los genes reordenados se fijan; las posiciones CDR conservadas en la línea germinal pero que varían en los genes reordenados se fijan en la construcción de la biblioteca inicial pero se permite que muten durante la maduración por afinidad; y las posiciones CDR que presentan diversidad en las secuencias de la línea germinal y reordenadas son posiciones para incorporar diversidad usando mutagénesis, por ejemplo, mutagénesis walk-through (WTM™). Comenzando con las seis familias de genes VH3 identificadas (es decir, 3-07, 3-21, 3-23, 3-30,5, 3-48 y 3-74), el análisis V BASE comparativo de la secuencia de la CDR1 de 5 aminoácidos de la línea germinal reveló que S31, Y32 y M34 están conservadas entre los seis genes. Un análisis de frecuencia de todas las secuencias CDR1 de 5 aminoácidos reordenadas en el conjunto de datos de Kabat filtrado ilustró tres importantes hallazgos: primero, Y32 está muy conservado, segundo, las posiciones S31 y M34 de la línea germinal conservadas se someten a mutaciones somáticas posteriores y tercero, las posiciones 33 y 35 de la CDR1 no están conservadas ni en las secuencias de la línea germinal ni en el anticuerpo reordenado.

Por consiguiente, en VH-CDR1, Y32 se fija y nunca se somete a ninguna alteración ya que la conservación estricta de Y32 indica una fuerte presión selectiva para su preservación. Las posiciones 33 y 35 de la CDR1 son sitios para la creación de una diversidad de secuencia CDR1 inicial por mutagénesis, por ejemplo WTM™. Las posiciones S31 y M34 están inicialmente “fijas” pero se identifican como sitios para mutagénesis durante la maduración por afinidad en cualquiera de los clones candidatos scFv. La razón para no crear diversidad en todos los sitios es restringir la diversidad inicial de la biblioteca para facilitar la expresión y presentación.

A partir del análisis de frecuencia Kabat anterior, la CDR1 tiene una secuencia consenso “natural” de SYAMH (SEC ID Nº: 563). Los restos A33 y H35 se seleccionan como secuencias naturales debido a su frecuencia más elevada. En la introducción posterior de diversidad de aminoácidos, la secuencia de la CDR1 sería entonces SYXMX, en la que X indica la posición en la que se realiza la mutagénesis, por ejemplo, WTM. Por ejemplo, cuando se realiza mutagénesis, por ejemplo, WTM, en el resto de tirosina en las posiciones 33 y 35 de la CDR1, las secuencias de la CDR1 resultantes deseadas son SYYMH (SEC ID Nº: 564), SYAMY (SEC ID Nº: 565) y SYYMY (SEC ID Nº: 566). En este caso, se exploraron los efectos de introducir una cadena lateral aromática. La secuencia del codón oligonucleotídico para la posición A33 natural es GCX. Si se reemplaza por Y33, la secuencia de oligonucleótido correspondiente necesaria sería TAY. Por tanto, para una mezcla de oligonucleótidos A33(Y33, las secuencias codón resultantes son (G/T)(A/C)C. Los oligonucleótidos A33(Y33 generados en este caso también pueden tener permutaciones de codón que codifican glicina (GCC), aspartato (GAC) y serina (TCC). Estos subproductos “adicionales” contribuyen a una diversidad adicional en la posición 33. Para la siguiente posición 35 de WTM™, la secuencia de codón natural para H35 sería CAY y, si se reemplaza con Y35, la secuencia oligonucleotídica requerida sería TAY. Por tanto para una mezcla H35(Y35 la secuencia codón resultante es (C/T)AC. En este caso, no se formaría ningún “subproducto” de aminoácido adicional.

En otro enfoque, los subproductos se evitan empleando mutagénesis look-through (LTM) que típicamente requiere la síntesis de un oligonucleótido para cada cambio deseado pero elimina cualquiera de los subproductos (interferencia).

Para diseñar la segunda CDR de la cadena pesada, en lo sucesivo en el presente documento “VH-CDR2”, se abordó el análisis de secuencia anterior en las bases de datos V BASE y Kabat de una manera similar como para VH-CDR1 anteriormente. Se realizó un análisis de frecuencia para las secuencias VH-CDR2 y se construyó un alineamiento de las secuencias CDR2 de la línea germinal a partir de las seis regiones marco conservadas candidato y se seleccionó una frecuencia umbral del 10%.

Comenzando con las mismas familias génicas VH3 (3-07, 3-21, 3-23, 3-30,5, 3-48 y 3-74), el análisis de frecuencia V BASE y Kabat de filtro muestra que las posiciones I51, Y59, A60 y G65 de la CDR2 se conservan en toda la línea germinal y en la mayoría de los genes reordenados y por lo tanto debe ser invariante en una CDR2 sintética. El análisis de frecuencia Kabat anterior indica que VH-CDR2 debe tener una secuencia consenso “natural” de GISGGTTYYADSVKG (SEC ID Nº: 567). Debido a que las posiciones 54, 55, 58, 61, 62, 63, 64 de VH-CDR2 presentan conservación de secuencia en la línea germinal pero están sometidas a mutaciones somáticas posteriores, están por lo tanto “fijas” pero se permite que muten durante la maduración por afinidad. Para una diversidad de CDR2 inicial, se incorporan aminoácidos investigadores (subrayados) en las posiciones 50, 52, 52a, 53, 56 y 57 (XIXXXGGXXYYADS-VKG) (SEC ID Nº: 568) y se introduce por mutagénesis, por ejemplo, WTM™.

La mutagénesis aleatoria distinta de WTM, permite la colocación predeterminada de aminoácidos particulares. Por ejemplo, para realizar WTM™ de CDR2 con un resto de tirosina (Y) en las posiciones 50, 52, 53, 56 y 57 (subrayadas), las secuencias de CDR2 WTM™ resultantes deseadas incluyen los siguientes (las modificaciones se indican subrayadas): sustituciones sencillas (YIXXXGGXX-YYADSVKG (SEC ID Nº: 569), XIYXXGGXXYYADSVKG (SEC ID Nº: 570) y etc.), sustituciones dobles (YIYXXG-GXXYYADSVKG (SEC ID Nº: 571), YIXXYGGXXYYADSVKG (SEC ID Nº: 572) y etc.), sustituciones triples (YIXX-YGGYXYYADSVKG (SEC ID Nº: 573) y etc.), sustituciones cuádruples (YIYYYGGXXYYADSVKG (SEC ID Nº: 574) o YIXYYGGYXYYADSVKG (SEC ID Nº: 575)), sustituciones quíntuples (YIXYYGGYVYYADSVKG) (SEC ID Nº: 576), y sustituciones séxtuples (YIYYXGGYYYYADSVKG) (SEC ID Nº: 577). Típicamente, se prefieren 2-3 sustituciones por CDR y esto puede conseguirse fácilmente por dopaje de síntesis de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, el documento US20040033569A1 para detalles técnicos).

La WTM™ para CDR2 usando los nueve aminoácidos WTM™ preseleccionados produce una diversidad de biblioteca de 9 x 26 o 576 miembros. Con fines comparativos, la mutagénesis por saturación de CDR2 de seis posiciones con los veinte aminoácidos sería 206 o 6,4 x 107. Por consiguiente, realizando mutagénesis por saturación en las 12 posiciones “no fijas” de la CDR2 en solitario, la diversidad de bibliotecas sería 2012 o 4 x 1015 que se encuentra por debajo de las capacidades de la presentación de bibliotecas actuales y tecnología de exploración. Esto ilustra una ventaja de la invención que, por otro lado, permite construir una biblioteca más pequeña pero más representativa. De hecho, los procedimientos de la invención proporcionan una biblioteca manejable en algunas posiciones CDR para identificar la primera generación de moléculas de unión. Posteriormente la mutagénesis por maduración de afinidad en las otras posiciones CDR optimiza después a aquellas moléculas de unión identificadas.

Para diseñar la diversidad de CDR3 VH, se alinearon secuencias CDR3 de anticuerpos de la base de datos de Kabat de acuerdo con su tamaño y clase antigénica. Las longitudes de las CDR3 de los anticuerpos que reconocen antígenos no proteína y proteína/péptido se ajustaron a líneas de tendencia. Se realizó un análisis de frecuencia de las 13 secuencias de aminoácidos de la CDR3 a partir del conjunto de datos de Kabat filtrado y se seleccionó una frecuencia umbral del 10%. Dado que el tamaño de la CDR3 y el análisis de frecuencia de los restos de aminoácidos se realizó usando, por ejemplo, las secuencias reordenadas de los genes D y J de la inmunoglobulina, no hubo equivalentes de la línea germinal de la CDR3 para establecer comparaciones directas entre V BASE y Kabat filtrada. No obstante, se examinó una base de datos Kabat filtrada y los resultados investigados indicaron que, en cuanto al tamaño del bucle de la CDR3, hay una curva de distribución normal que varía de 6 a 24 aminoácidos con un pico a de aproximadamente 13 aminoácidos. Cabe observar, que el análisis también indica que los anticuerpos que reconocen otros tipos de antígenos (es decir no proteína/péptido), aborda una distribución de tamaño bimodal. Esta distribución dividida se debe a la población heterogénea de tener algunos anticuerpos sesgados hacia pequeñas moléculas (por ejemplo haptenos) y otros dirigidos contra antígenos más grandes (polisacáridos complejos, ADN).

Sin un análisis comparativo paralelo V BASE con respecto a Kabat para las posiciones CDR3, se realizó un análisis de frecuencia Kabat filtrado para cada tamaño de CDR3 reorganizado. Dentro de cada clasificación de tamaño, enumerando el aminoácido más frecuente en esa posición de la CDR3 se produce una secuencia “natural” consenso. Sorprendentemente, esta estrategia “consenso” identifica aminoácidos particulares bajo presiones selectivas altas. Por ejemplo, en una CDR3 de un tamaño de 13 aminoácidos, la posición 101 se conservó altamente como un aspartato. Por lo tanto, como se ha indicado anteriormente en el diseño de la diversidad de VH-CDR1 y VH-CDR2, D101 se mantiene como una posición de resto “fija” en la VH-CDR3 de 13 aminoácidos sintética. Sin embargo, las posiciones 96, 98, 100c y 102 de VH-CDR3 muestran una preferencia más elevada para algunos aminoácidos y están por lo tanto preliminarmente “fijas” pero después se mutan durante la maduración por afinidad. La distribución de frecuencia indica que las posiciones 95, 97, 99, 100, 100a, 100b, 100d y 100e de la CDR3 no mostraron ningún aminoácido preferencial. Por tanto en la secuencia CDR3 de 13 aminoácidos, la fórmula XGXSXXXXYXXDY (SEC ID Nº: 578) representa las posiciones (subrayadas) que son sitios de diversidad usando, por ejemplo, mutagénesis tal como WTM. Puede realizarse un análisis similar para todos los tamaños de secuencias CDR3 entre 8 y 20 aminoácidos. Este intervalo de tamaño abarca la mayoría de la diversidad de longitud encontrada en CDR3 de anticuerpos que reconocen antígenos/dianas proteicos.

Ejemplo 3

Ensamblaje de repertorio ual completamente cotejado

Como se describe en los ejemplos anteriores, puede usarse análisis de frecuencia posicional de CDR para ensamblar una biblioteca de referencia para su uso en los procedimientos de la presente invención. La producción de un repertorio UAL totalmente cotejado inicialmente implica la generación de todas las secuencias CDR combinatorias que se predicen a partir de dichos análisis posicionales de frecuencia de CDR. Dichos análisis de frecuencia posicionales se realizan para cada CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) de cada cadena de anticuerpo aplicable, pesada o ligera (o clases kappa o lambda para cadenas ligeras). Estas secuencias CDR combinatorias pueden después ensamblarse como secuencias marco conservadas y polipéptidos del mismo isotipo individualmente para todas las cadenas pesadas y ligeras. Los isotipos para las cadenas pesadas incluyen VH-1, VH-3 y VH-4, mientras que los isotipos para las cadenas kappa ligeras incluyen VK-1 y VK-3 y los isotipos para las cadenas lambda ligeras incluyen VL-1, VL-2 y VH-3. Como alternativa al emparejamiento por isotipo a través de una UAL, las secuencias

CDR puede “redistribuirse en secuencia marco conservada”, lo que significa que una UAL puede comprender una CDR1 derivada de un tipo de clase de isotipo que está fusionado a una CDR2 derivada de una clase de isotipo distinto (por ejemplo, CDRL1 de Vk1 y CDRL2 de Vk3 dentro una sola UAL ensamblada). El ensamblaje de una UAL completa cotejada implica después la generación de todas las combinaciones de cadenas de anticuerpo pesada y ligera derivadas como se ha descrito anteriormente (como se indica en la Figura 3).

El emparejamiento de una clase de CDR con su región marco conservada natural puede usarse para delimitar el intervalo de secuencia representado en las bibliotecas de referencia CDR. Dicho agrupamiento de secuencias marco conservadas y CDR para secuencias V□, V□ y V□ ejemplares se muestra en la Figura 5. Puede después realizarse combinación de secuencias de biblioteca de referencia de CDR para producir las UAL. La Figura 6 representa un ensamblaje ejemplar de la secuencia de cadena pesada en las UAL de cadena pesada, mediante un procedimiento que permite mezclar isotipos de región marco conservada (denominados “cruzamientos de región marco conservada”) entre las clases VH-1 y VH-3 para CDR1 y CDR2. Del mismo modo, la Figura 7 representa el ensamblaje ejemplar de las UAL de cadena ligera V□ de las secuencias de referencia CDR, empleando un procedimiento que permite el entrecruzamiento de regiones marco conservadas entre las clases VK-1 y VK-3 para CDR1 y CDR2. Finalmente, la Figura 8 representa el ensamblaje ejemplar de las UAL de cadena ligera V□ de las secuencias de referencia CDR empleando un procedimiento que permite el cruzamiento de la región marco conservada entre las clases VL-1, VL-2 y VL-3 de las secuencias CDR1 y CDR2.

La subclasificación de la información de secuencias de anticuerpos en clases canónicas también puede realizarse con el efecto de modificar adicionalmente el intervalo de secuencia que se representa en las bibliotecas de referencia CDR resultantes. Por ejemplo, para las bibliotecas VH-4 CDR2 de 12 aminoácidos de longitud, existen cuatro estructuras canónicas distintas y cada estructura canónica revela valores de frecuencia de población diferentes para aquellas posiciones de restos CDR que presentan variabilidad en la población (indicado en la Figura 9).

Ejemplo 4

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte ANTI-VEGF ejemplar a partir de dominios cdr de sondas de ratón

La selección de una biblioteca cohorte a partir de una biblioteca de referencia, por ejemplo, una biblioteca universal de anticuerpo (UAL) se realiza mediante alineamiento y comparación de una secuencia peptídica CDR problema con la secuencia (o secuencias) peptídicas de CDR de la biblioteca de referencia (por ejemplo, UAL). Cualquier anticuerpo monoclonal (que incluya anticuerpos monoclonales múltiples) puede proporcionar una secuencia (o secuencias) CDR problema para ensamblar dicha biblioteca cohorte. En este ejemplo, las bibliotecas CDR cohorte, que pueden ensamblarse en bibliotecas de anticuerpo cohorte, se realizaron usando un anticuerpo monoclonal anti-VEGF de ratón ejemplar (Avastin A4.6.1). Los criterios de identidad se usaron para todas las comparaciones de restos durante el ensamblaje de las bibliotecas cohorte resultantes.

Se determinó que la secuencia CDR1 del anticuerpo monoclonal Avastin A4.6:1 de ratón era “TNYGMN” (SEC ID Nº: 13). En este caso una CDR1 se definió de acuerdo con la definición de contacto. Esta secuencia CDR1 se usó como una secuencia peptídica problema para comparación contra una diversidad de dominio CDR1 presente en dos Bibliotecas Universales de anticuerpo (UAL) distintas, VH-1 y VH-3. Los resultados de estas comparaciones se resumen en la figura 10 y en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1: CDR1 de cadena pesada de Avastin A4.6:1 de ratón alineada con la Diversidad de secuencia de

CDR1 VH-1 UAL

VH-1 CDR1

S: A

Constituyentes UAL: T G N Y G I H S

S: DY D M N

sonda de ratón

(SEC ID Nº: 13): T N Y G M N

Biblioteca que codifica

(SEC ID Nº: 14): T N Y G M N Sin diversidad

restos posibles: 1 1 1 1 1 1 Producto 1

Tabla 2: CDR1 de cadena pesada de Avastin A4.6:1 de ratón alineada con la Diversidad de secuencia deCDR1 VH-3 UAL

VH-3 CDR1

Constituyentes UAL: S N S N D T Y A S A G W Y M S H N

sonda de ratón

(SEC ID Nº: 13): T N Y G M N

Biblioteca que codifica: S o

(SEC ID Nº: 15): N N Y G M N

restos posibles: 2 1 1 1 1 1 Producto 2

La realización de las alineaciones anteriormente representadas en tablas implica comparaciones posición por posición individuales de secuencias problema con diversidad de secuencia prevalente conocida dentro de dos UAL de referencia, VH-1 y VH-3. Para las comparaciones mostradas en la Tabla 1, cada resto de la secuencia problema de ratón (“sonda de ratón”) “TNYGMN” (SEC ID Nº: 13) se encontró en una posición correspondiente en la UAL de referencia examinada y por tanto representa un resto prevalente conocido en esa posición CDR1. Toda la secuencia “TNYGMN” (SEC ID Nº: 14) estaba por lo tanto presente en la UAL de referencia y la comparación produjo un resultado en el que no se necesitó una diversidad seleccionada por UAL adicional para generar una biblioteca cohorte CDR1 óptima correspondiente a la secuencia problema. (Es importante observar que aunque cada resto de la secuencia de la sonda de ratón “TNYGMN” (SEC ID Nº: 13) era idéntica a un resto conocido presente en la misma posición en la UAL VH-1 de la CDR1 humana, este hallazgo no indica que toda la secuencia “TNYGMN” (SEC ID Nº: 14) fuese una secuencia CDR humana de origen natural. Por tanto, un hallazgo de que la UAL de referencia examinada contiene una “coincidencia perfecta” con la secuencia problema no significa que la secuencia problema fuese una secuencia conocida natural antes del ensamblaje de la UAL de referencia).

También se realizó una comparación entre la secuencia problema “TNYGMN” (SEC ID Nº: 13) y la UAL de la CDR1 de VH-3 de referencia (Tabla 2). Para esta comparación, la UAL de la CDR1 de VH-3 de referencia no contenía un resto de Treonina (T) en la primera posición de la CDR1, conteniendo en su lugar solo restos de Serina (S) y Asparagina (N). La diversidad de biblioteca cohorte CDR1 óptima se consiguió por lo tanto usando las secuencias “SNYGMN” (SEC ID Nº: 246) y “NNYGMN” (SEC ID Nº: 579), constituyendo por tanto una diversidad de 2 para la biblioteca cohorte derivada de la UAL de la CDR1 VH-3 de referencia para el anticuerpo monoclonal Avastin A4.6.1 de ratón.

La secuencia de la CDR2 del anticuerpo monoclonal Avastin A4.6.1 “WMGWINTYTGEPT” (SEC ID Nº: 16) se usó adicionalmente como una secuencia problema para generar bibliotecas cohorte CDR2. La secuencia se alineó con una diversidad de CDR2 presente en las UAL VH-1 y VH de referencia, respectivamente, mostrándose los resultados de estas comparaciones en la Figura 11 y en las Tablas 3 y 4:

Tabla 3: CDR2 de cadena pesada de Avastin A4.6:1 de ratón alineada con diversidad de secuencia CDR2 de VH-1 UAL

VH-1 CDR2

Constituyentes UAL: W M G W G R I N I S P A I N S Y G M F S N G G T N G S D T A N K S G

sonda de

ratón

(SEC ID Nº: 16): W M G W I N T Y T G E P T

Biblioteca que codifica (SEC ID Nº: 17): W M G W I N P/A Y F/S/ N/G G T/N/G/ S/D T/A N/K/ S/G

restos posibles 111111 2 1 4 1 5 2 4 Producto 320

Tabla 4: CDR2 de cadena pesada de Avastin A4.6.1 de ratón alineada con diversidad de secuencia CDR2 deVH-3 UAL

VH-3 CDR2

Constituyentes UAL: W A S A V A N G Y S T I S K W N G Y S Q W N F D S N G S S G T D S N T E Y D T K I Y N F H

sonda de ratón

(SEC ID Nº: 16): W M G W I N T Y T G E P T

Biblioteca que codifica (SEC ID Nº: 18): W V S/A V/A/N/G/ Y/S/T I N G/Y/S/Q/ W/N/F D/ S/ N G/ S G E T/ K/ I Y/N/ F/H

restos posibles 112 7 11 7 3211 3 4Producto 70

Como se muestra anteriormente en la Tabla 3, el alineamiento de la CDR2 de cadena pesada de Avastin A4.6.1 de ratón con los dominios de CDR2 de la UAL de VH-1 reveló la presencia de restos idénticos en la misma posición en la UAL para los primeros seis, ocho y diez restos de la secuencia problema CDR2. La UAL no contenía una Treonina

(T): como un resto usado prevalentemente en la posición séptima en lugar de contener Prolina (P) y Alanina (A) en esta posición, para un impacto neto sobre la diversidad de 2 en esta posición. El resto de Treonina (T) en la novena posición de la secuencia problema CDR2 tampoco coincidió con un resto presente en la UAL en esta posición, conteniendo en su lugar la UAL Fenilalanina (F), Serina (S), Arginina (N) y Glicina (G) como restos normalmente presentes en esta posición. Para el fin de generar una biblioteca cohorte a partir de esta UAL de referencia, el impacto de diversidad de este emparejamiento erróneo es de 4. La consideración de los tres restos finales de la secuencia problema de la CDR2 produce impacto sobre la diversidad de 5 (el Glutamato (E) de la secuencia problema no coincide en esta posición con los restos de Treonina (T), Arginina (N), Glicina (G), Serina (S) o Aspartato (D) de UAL), 2 (la Prolina (P) de la secuencia problema no coincide con los restos Treonina (T) o Alanina

(A): de UAL en esta posición) y 4 (la Treonina (T) de la secuencia problema no coincide con los restos de Arginina (N), Lisina (K), Serina (S) o Glicina (G) de UAL en esta posición), respectivamente. Por lo tanto una biblioteca cohorte óptima derivada de la UAL de la CDR2 de VH-1 humana tiene la secuencia “W-M-G-W-I-N-P/A-Y-F/S/N/G-G-T/N/G/S/D-T/A-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 17) y puede generarse usando mutagénesis walk-through o look-through y otras técnicas de este tipo. La diversidad total de dicha biblioteca cohorte representa el resultado de una clasificación independiente de los restos variables dentro de esta secuencia (el séptimo, noveno y del once al décimo tercero), dando como resultado el producto de 2 x 4 x 5 x 2 x 4 = 320. Las ventajas de usar los procedimientos de la invención para consultar una UAL (o una forma relacionada de biblioteca de referencia) en el ensamblaje de una biblioteca cohorte se ilustra cuando se considera que la aleatorización de los cinco sitios variables dentro de esta secuencia de la biblioteca cohorte produciría 3,2 x 108 secuencias distintas, y este aumento en 10.000 veces en cuanto a diversidad probablemente solo añadiría interferencia en la forma de secuencias CDR2 posiblemente inmunorreactivas.

El uso de los procedimientos de la invención realizando una comparación de la secuencia problema de la CDR2 de cadena pesada de Avastin A4.6.1 de ratón con los dominios CDR2 de la UAL de VH-3 produjo la secuencia “W-V-5/A-V/A/N/G/Y/S/T/I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-E-T/K/I-Y/N/F/H” (SEC ID Nº: 18). La biblioteca cohorte representada por esta secuencia tiene una diversidad de 7056. En la Tabla 4 anterior se muestran detalles del alineamiento que produce este resultado.

Los procedimientos de la invención también se aplicaron a la secuencia problema de la CDR3 de cadena pesada de Avastin A4.6.1 para identificar la secuencia cohorte “A-K-G/D/E/R/A/H/V/T-P-H-Y-Y-G-S-S-H-W-Y-F-D” (SEC ID Nº: 20) a partir de una UAL de la CDR3 de VH. Esta secuencia cohorte contiene una diversidad de 8. En la Tabla 5 se presentan detalles del alineamiento que produce este resultado:

Tabla 5: CDR3 de cadena pesada de Avastin A4.6.1 de ratón alineada con la diversidad de secuencia deCDR3 de VH UAL

VH – CDR3

Constituyentes UAL: A R K G D E R A H V T G R S P W L Y A T V G Y A S R E T F L W H I S Y G D E A C T F N I S G Y D R T W A L S G T Y D T P A E G S Y T R A V D W G Y S T P L F V H M W Y G S N R V A C K D H Y N G S W H D R A Q Y G W P F A L H F L M D D P G H

sonda de ratón

(SEC ID Nº: 19) AK Y PHYYGSSHWY F D

Biblioteca que codifica

(SEC ID Nº: 20) AKG/D/E/R/A/H/V/TPHYYGSSHWY F D

restos posibles 11 8 111111 1 1 1 1 1 1Producto

La aplicación de los procedimientos de la invención a las secuencias CDR de cadena ligera del anticuerpo monoclonal Avastin A4.6.1 produjo secuencias de biblioteca cohorte de la CDR para todos dichos dominios CDR de cadena ligera. Las secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo Avastin A4.6.1 de ratón son “SNYLNWY” (SEC ID Nº: 21), “VLIYFTSSLH” (SEC ID Nº: 23) y “QQYSTVPW” (SEC ID Nº: 26), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de la cadena kappa de Avastin A4.6.1 de ratón produjo las secuencias de la biblioteca cohorte de “S-N-Y-L-N-W-Y” (SEC ID Nº: 22) (sin diversidad) y “S-N-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 249) (diversidad 1) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de la CDR1 de VK-1 humana y una UAL de la CDR1 de VK-3, respectivamente. La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa de Avastin A4.6.1 de ratón contra una UAL de la CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de la biblioteca cohorte con diversidad 20, “L/R-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S-L-Q/E” (SEC ID Nº: 24), aunque la comparación de la secuencia de la sonda de la CDR2 de cadena kappa con una UAL de la CDR2 de VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 2, “L-L-I-Y-G/D-T-S-S-R-A” (SEC ID Nº: 25). El uso de la CDR3 ACZ885 como secuencia problema produjo una secuencia de la CDR3 de la biblioteca cohorte de “Q-Q-Y-S-T-Y/T/S/L/W/F-P-W” (SEC ID Nº: 27) cuando se alineó con una UAL de la CDR3 VK. Esta biblioteca CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 6.

La producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmento de los mismos, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas CDR cohorte puede realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir tanto cadenas pesadas (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) como ligeras (por ejemplo, kappa o lambda) y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos), a partir de las bibliotecas CDR cohorte identificadas por los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca CDR cohorte da como resultado diversidades de biblioteca de cohorte de anticuerpos completos y en cadena como se muestra en la Figura 12 y en la Tabla 6 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando secuencias problema con Avastin A4.6.1 de ratón:

Tabla 6: Diversidades de cadena y anticuerpos completos de bibliotecas CDR cohorte combinadas generadas usando sondas de Avastin A4.6.1 de ratón

Diversidad de Cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

2560: 112896 120 12

diversidad mAb: K1 K3

H1: 3,1 x 106 3,1 x 104

H3: 1,4 x 107 1,4 x106

Incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos tiene un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede mostrarse y/o explorarse fácilmente usando procedimientos actualmente disponibles. La síntesis de dichas bibliotecas puede realizarse usando técnicas tales como, por ejemplo, mutagénesis look-through y/o walk-through, y la síntesis de cadenas y/o anticuerpos completos puede emplear técnicas tales como PCR por extensión de solapamiento sencillo (SOE) de genes, mutagénesis de Kunkel u otras técnicas conocidas para fabricar dichas proteínas de fusión.

Ejemplo 5

Identificación y generación de bibliotecas de cohorte de la cdr de cadena ligera kappa a partir de dominios cdr del anticuerpo monoclonal 41-S-2-L anti-gp41 de VIH de sondas de ratón

Se obtuvieron secuencias de cadena ligera kappa para el anticuerpo monoclonal 41-S-2-L anti-gp41 de VIH. Se identificó una tríada catalítica en estas secuencias de cadena ligera y se incluyeron restos dentro de dominios CDR1 y CDR3 de cadena kappa. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena Kappa para este anticuerpo son “LYSNGNTYLYWF” (SEC ID Nº: 29), “LLI-YRLFHLA” (SEC ID Nº: 30) y “MQHLEYPYT” (SEC ID Nº: 31), respectivamente, subrayándose los restos de la tríada catalítica (véase Figura 14A). Para conservar la tríada catalítica, se determinó que las secuencias de la biblioteca cohorte podrían fijar estos restos (subrayados) como los restos de la secuencia problema de ratón en estas posiciones en la CDR1 y CDR3. Adicionalmente, el alineamiento en hueco reveló que la secuencia problema de la CDR1 de ratón para este anticuerpo contenía una inserción de cinco restos (“YSNGN”) (SEC ID Nº: 580) cuando se comparó con los constituyentes UAL de la CDR1 de cadena kappa humana de siete restos de aminoácidos de longitud. Las bibliotecas cohorte de secuencia “S/R/G/N/Y-YSNGN-N-Y-L-A/N-W-Y” (SEC ID Nº: 33) y “S/G/N-YSNGN-T-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 34) se obtuvieron mediante la aplicación de los procedimientos de la invención a la secuencia problema CDR1 de ratón cuando se comparó con las UAL de referencia de la CDR1-7 VK-1 y CDR1-7 de VK-3, respectivamente (véanse Figuras 14B-C). Las diversidades de estas bibliotecas de cohorte fueron de 10 y 3, respectivamente. La inserción observada en la CDR1 anti-gp41 de VIH de ratón también permitió comparar la secuencia con los constituyentes UAL de la CDR1 de 8 péptidos de longitud. Esta comparación entre la secuencia problema CDR1 de ratón y la biblioteca de referencia CDR1-8 VK-3 produjo una secuencia de CDR1 de biblioteca cohorte de “S-YSNG-N-T-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 36) (Fig. 14C). Las comparaciones de las secuencias problema de la CDR2 de cadena ligera kappa anti-gp41 de VIH de ratón con las bibliotecas de referencia de la CDR2 VK-1 y VK-3 humana también se realizaron mediante los procedimientos de la invención, produciendo bibliotecas CDR2 de cadena kappa cohorte de secuencia “L-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-I/S/T/N-L-Q/E” (SEC ID Nº: 37) y “L-L-I-Y-G/D-A/T-S-S/T/N-R-A” (SEC ID Nº: 38), respectivamente (Fig. 14D). Estas bibliotecas cohorte tuvieron diversidades de 40 y 12, respectivamente. Una comparación en paralelo de la secuencia problema de la CDR3 de la cadena ligera kappa anti-gp41 de VIH de ratón con una biblioteca de referencia de CDR3-9 VK humana produjo una biblioteca cohorte de la CDR3 de cadena kappa de secuencia “Q-Q-H-S/D/Y/N/G-D/G/T/WS-Y-P-P/L/R/S/T-T” (SEC ID Nº: 39) (con el resto de Histidina en la tercera posición fija para conservar la tríada catalítica; Fig. 14E). Obsérvese que cuando este resto de Histidina se fija, se realiza un alineamiento discontinuo entre las secuencias de biblioteca de referencia y problema (constituyendo una comparación de únicamente los restos 1, 2 y 4 hasta 9 entre las secuencias de la biblioteca de referencia y problema). Obsérvese también que si se hace la elección de fijar los tres primeros restos de la CDR3 con los restos de la secuencia problema, “M-Q-H”, habría sido deseable un alineamiento de únicamente los restos 4 a 9 de las bibliotecas de referencia y problema, constituyendo así un alineamiento parcial). Esta biblioteca de cohorte de la CDR3 tuvo una diversidad de 125.

En este ejemplo, la actividad catalítica reside en la cadena ligera del anticuerpo, por tanto los restos de cadena pesada se dejaron invariables en la biblioteca cohorte. Los valores de diversidad globales de las bibliotecas de cohorte generadas para este anticuerpo por lo tanto se representaron por los valores de diversidad de la cadena ligera, que fueron 50.000 y 4500 para las cohortes K1 y K3, respectivamente.

Ejemplo 6

Identificación y generación de bibliotecas cohorte de la CDR de cadena ligera kappa a partir de los dominios cdr3 de hk14 de sonda humana

Las secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para un anticuerpo HK14 humano son “IFNLSWY” (SEC ID Nº: 41), “LVLYAASTLQ” (SEC ID Nº: 42) y “QQSYILPPT” (SEC ID Nº: 43), respectivamente (Fig. 15A). El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena kappa produjo una secuencia de biblioteca cohorte de “S/R/G/N/Y-N-Y/W/D/S-L-A/N-W-Y” (SEC ID Nº: 581) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de la CDR1 de VK-1 humana. Esta secuencia de biblioteca cohorte tuvo una diversidad de 40. La comparación de la secuencia “IFNLSWY” (SEC ID Nº: 41) de la CDR1 con una UAL de la CDR1-7 de VK-3 humana usando la invención produjo una secuencia cohorte de diversidad 9, “S/G/N-S/N/T-N-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 44) (Fig. 15B). La implementación de la invención con respecto a la secuencia CDR2 de cadena kappa problema contra una UAL de la CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte idéntica a la secuencia problema, “L-L-I-Y-A-A-S-T-L-Q” (SEC ID Nº: 635), mientras que la consulta de la misma secuencia contra una biblioteca de la CDR2 VK-3 produjo una secuencia con una diversidad de 2, “L-L-I-Y-G/D-A-S-T-R-A” (SEC ID Nº: 45) (Fig.15C). El uso de la CDR3 de HK14 como una secuencia problema produjo una secuencia de CDR3 de la biblioteca de cohorte de “Q-Q-S-Y-/N/T/G/D-Y/T/S/W-P-P-T” (SEC ID Nº: 46) cuando se alineó con una UAL de la CDR3 VK (Fig.15D). Esta biblioteca de la CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 20.

En cuanto al anticuerpo 41-S-2-L anterior, la actividad catalítica reside en la cadena ligera del anticuerpo, por tanto los restos de cadena pesada se dejaron sin modificar en la biblioteca cohorte. Los valores de diversidad globales de las bibliotecas de cohorte generadas para este anticuerpo por lo tanto se representaron por los valores de diversidad de la cadena ligera, que fueron de 800 y 360 para las cohortes K1 y K3, respectivamente.

Ejemplo 7

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte de AAV293 MCP-1 de dominios CDRsonda

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo AAV293 MCP-1 son “SHYWMS” (SEC ID Nº: 47), “WVANIEQDGSEKY” (SEC ID Nº: 51), y “ARDLDGYTD” (SEC ID Nº: 54), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-S/N/D/TY-W-M-S” (SEC ID Nº: 48) (diversidad 4) y “S-S/G/N/D-Y-A/Y/G/D-M-S” (SEC ID Nº: 50) (diversidad 16) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 16A). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con diversidad de 4320, “W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P/A-I/N/S/Y/G/M-G-G-T/N/G/S/D-T/A-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 52), mientras que la comparación de la secuencia sonda de la CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 4, “W-V-A-N-I-S/K/W/N-Q-D-G-S-E-K-Y” (SEC ID Nº: 53). El uso de la CDR3 AAV293 MCP-1 como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “A-RD-L-G/S/V/Y/R/T/N/I/L/Q-G-Y-F/L/G/S/M/A/I/P-D” (SEC ID Nº: 55) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca de cohorte de la CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 80.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para un anticuerpo AAV293 MCP-1 humano son “SSALAWY” (SEC ID Nº: 56), “LLIYDASSLE” (SEC ID Nº: 59) y “QQFNSYPL” (SEC ID Nº: 61), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca de cohorte de “S-S-Y/W/D/S-L-A-WY” (SEC ID Nº: 57) (diversidad 4) y “S-S-N/Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 58) (diversidad 2) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 humana y una UAL de CDR1 VK-3, respectivamente (Figura 16B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte idéntica a la secuencia problema, “L-L-I-Y-D-A-S-S-L-E” (SEC ID Nº: 60), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 1, “L-L-I-Y-D-A-S-S-R-A” (SEC ID Nº: 582). El uso de la CDR3 AAV293 como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y/S/A/G/R-N-S -Y-P-L” (SEC ID Nº: 62) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 5.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos de cohorte final (o fragmento de los mismos, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto pesadas como ligeras, y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos), a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de bibliotecas de CDR cohorte da como resultado diversidad de biblioteca cohorte de anticuerpo completo y de cadena como se muestra en la Tabla 7 para aquellas bibliotecas de cohorte generadas usando las secuencias problema del anticuerpo AAV293 MCP-1 humano:

Tabla 7: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando sondas de anticuerpo AAB293 MCP-1 humano

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

5.529.600: 1.280 20 10

diversidad mAb: K1 K3

H1: 110.592.000 55.296.000

H3: 25.600 12.800

En lo que respecta a otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos son de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menos de aproximadamente 1012) que puede mostrarse y/o explorarse usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 8

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte ACZ855 humana a partir de dominios cdr de sonda de ratón

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo ACZ885 de ratón son “SVYGMN” (SEC ID Nº: 63), “WVAIIWYDGDNQY” (SEC ID Nº: 66) y “ARDLRTGPFD” (SEC ID Nº: 69), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena pesada de ACZ885 de ratón produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-S/N/D/T-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 64) (diversidad 4) y “S-S/G/N/D-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 65) (diversidad 4) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 de VH-3 humana y una UAL de CDR1 de VH-1 humana, respectivamente (Figura 17A). La implementación de la invención para consultar una secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca de cohorte con una diversidad de 216, “W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P/A-I/N/S/Y/G/M-G-D-N-T/A-N/K/S/G-(SEC ID Nº: 67), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 21, “W-V-A-V/A/N/G/Y/S/T-I-W-Y-D-G-D-N-T/K/IY” (SEC ID Nº: 583). El uso de la CDR3 de cadena pesada de ACZ885 de ratón como una secuencia problema produjo una secuencia de CDR3 de biblioteca cohorte de “A-R-D-L-R-G/S/A/D/L/Y/V/I/P/Q-G-P-F-D” (SEC ID Nº: 70) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca de cohorte CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 10.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo ACZ885 de ratón son “GSSLHWY” (SEC ID Nº: 71), “LLIKYASQSF” (SEC ID Nº: 74) y “HQSSSLPF” (SEC ID Nº: 77), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa ACZ885 de ratón produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/R/G/N/YS-S-L-A/N-W-Y” (SEC ID Nº: 72) (diversidad 10) y “G-S-N/N-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 73) (diversidad 2) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 humana y una UAL de CDR1 VK-3, respectivamente (Figura 17B). La implementación de la invención para consultar una secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 40, “L-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-I/S/T/N-L-Q/E” (SEC ID Nº: 75), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 6, “L-L-1-Y-G/D-A-S-S/T/N-R-A” (SEC ID Nº: 76). El uso de la CDR3 de ACZ885 de ratón como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q/M-Q-S-S-S-L-P-F” (SEC ID Nº: 78) cuando se alineó con una UAL de la CDR3 de VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 2.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos de cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto pesadas como ligeras, y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos), a partir de las bibliotecas CDR cohorte identificadas por los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de biblioteca de cohorte de anticuerpos completos y cadena como se muestra en la Tabla 8 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando secuencias problema del anticuerpo ACZ885.

Tabla 8: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando sondas de anticuerpo ACZ885 de ratón

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

8,640: 840 800 24

diversidad mAb: K1 K3

H1: 6.912.000 207.360

H3: 672.000 20.160

En lo que respecta a otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos son de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede mostrarse y/o explorarse fácilmente usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 9

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte oligo ITH52 de GP120 humano a partir de dominios cdr sonda

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo oligo ITH52 de gp120 humano son “SDYGVS” (SEC ID Nº: 79), “WLSGISGGGSTVY” (SEC ID Nº: 82) y “ARDLRTGPFD” (SEC ID Nº: 85), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo oligo ITH52 de gp120 produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-D-Y-G-M-S” (SEC ID Nº: 80) (diversidad 1) y “S-D-Y-G-I/M-S” (SEC ID Nº: 81) (diversidad 2) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 18A). La implementación de la invención para consultar una secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 16, “W-M-G-G-I-S-P/A-G-G-G-T-T/A-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 83), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca CDR2 cohorte de diversidad 9, “W-V-S-G-I-S-G-D/S/N-G-S-T-T/K/I-Y” (SEC ID Nº: 84). El uso de la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo oligo ITH52 de gp120 como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “A-R-G-R-G-G-Y-F/L/G/S/M/A/I/P-D” (SEC ID Nº: 86) cuando se alineó con una UAL de CDR3 de VH. Esta biblioteca cohorte de CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 8.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo oligo ITH52 de gp120 humano fueron “GSYLAWY” (SEC ID Nº: 87), “SLIYAASSLQ” (SEC ID Nº: 89) y “QQYNSYPI” (SEC ID Nº: 92), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa del anticuerpo oligo ITH52 de gp120 produjo secuencias de biblioteca cohorte idénticas de “G-S-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 88) (sin diversidad) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 de VK-1 humana y una UAL de CDR1 de VK-3 (Figura 18B). La implementación de la invención con una secuencia CDR2 de cadena kappa problema contra una UAL de CDR2 de VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 2, “L/R-L-I-Y-A-AS-S-L-Q” (SEC ID Nº: 90), mientras que la comparación de la secuencia sonda de la CDR2 de cadena kappa con una UAL de la CDR2 de VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 2, “L-L-I-Y-G/D-A-S-S-R-A” (SEC ID Nº: 91). El uso de la CDR3 del anticuerpo oligo ITH52 de gp120 como secuencia problema produjo una secuencia de la CDR3 de biblioteca cohorte idéntica sin diversidad adicional de “Q-Q-Y-N-S-Y-P-I” (SEC ID Nº: 93) cuando se alineó con una UAL de CDR3 de VK.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo Fab, scfv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto ligeras como pesadas y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos), a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de bibliotecas cohorte de anticuerpos completos y cadena como se muestra en la Tabla 9 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando secuencias problema del anticuerpo oligo ITH52 de gp120 humano:

Tabla 9: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando las sondas de anticuerpo oligo ITH52 de gp120 humano

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

256: 72 2 2

diversidad mAb: K1 K3

H1: 512 512

H3: 144 144

En cuanto a otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos es de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede mostrarse y/o explorarse fácilmente usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 10

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte de GP120 SCFV humano a partir de dominios CDR sonda

Secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo de gp120 scfv humano son “SNFVIH” (SEC ID Nº: 94), “WVGWINPYNGNKE” (SEC ID Nº: 97) y “ARVGPYSWDDSPQDNYYMD” (SEC ID Nº: 100), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo de gp120 scFv produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-N-Y/A/S-A/G/W/Y-M-H” (SEC ID Nº: 95) (diversidad 12) y “S-N-Y-A/Y/G/D-I-H” (SEC ID Nº: 96) (diversidad 4) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 19A). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 8, “W-M-G-W-I-N-P-Y-N-G-N-T/A-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 98), mientras que la comparación de la secuencia sonda de la CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca CDR2 cohorte de diversidad 7056, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-NG/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-N-K-Y/N/F/H” (SEC ID Nº: 99). El uso de la CDR3 de cadena del anticuerpo de gp120 scFv como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte idéntica de “A R-V-G-P-Y-S-W-D-D-S-P-Q-D-N-Y-Y-M-D” (SEC ID Nº: 101) (sin diversidad) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo de gp120 scfv son “RSRRVAWY” (SEC ID Nº: 102), “LLIYGVSNRA” (SEC ID Nº: 104) y “QWGASSY” (SEC ID Nº: 107), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR de cadena kappa del anticuerpo de gp120 scFv produjo una secuencia de biblioteca cohorte de “SM-S/N-S/N/T-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 103) (diversidad 12) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-3 humana. La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-3 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con diversidad 2, “L-L-I-Y-G-A/T-S-N-R-A” (SEC ID Nº: 106), mientras que una consulta de la secuencia contra una UAL de CDR2 de VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte distinta de diversidad 2, “L-L-I-Y-G-AS-NL-Q/E” (SEC ID Nº: 105) (Figura 19B). El uso de la CDR3 de anticuerpo de gp120 scFv como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y-G-S/N/T/H/Q/G-S-P-Y” (SEC ID Nº: 108) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 6.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos de cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversidad bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir las cadenas tanto pesadas como ligeras y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos), a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de bibliotecas cohorte de anticuerpo completo y cadena como se muestra en la Tabla 10 para aquellas bibliotecas de cohorte generadas usando las secuencias problema del anticuerpo de gp120 scFv:

Tabla 10: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando sondas de anticuerpo de gp120 scFv

Diversidades de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K3

32: 84.672 144

diversidad mAb: K3

H1: 4.608

H3: 12.192.768

En cuanto a los otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos es de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede presentarse y/o explorarse fácilmente usando procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 11

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte de 4D5 herceptin a partir de dominios cdr sonda

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo de 4D5 Herceptin humano son “KDTYIH” (SEC ID Nº: 109), “WIGRIYPTNGYTR” (SEC ID Nº: 112) y “SRWGGDGFYAMD” (SEC ID Nº: 115), respectivamente. El uso de los procedimientos de la presente invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/N-DY/A/S-Y-M-H” (SEC ID Nº: 110) (diversidad 6) y “T/S-D-Y-Y-I-H” (SEC ID Nº: 111) (diversidad 2) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 20A). la implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 360, “W-M-G-R-I-N/I/S-P-I/N/SN/G/M-N-G-T/N/G/S/D-T-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 113), mientras que la comparación de la secuencia sonda de CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 9408, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-YT-Y/N/F/H” (SEC ID Nº: 114). El uso de la CDR de cadena pesada de 4D5 Herceptin como secuencia problema produjo una secuencia de la CDR3 de biblioteca cohorte de “A-R-G/D/E/R/V/A-G-G-D-G-S/G/Y/L/T/A/R/D/E/N-Y-A-M-D-(SEC ID Nº: 116) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca cohorte de CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 60.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo de 4D5 Herceptin son “NTAVAWY” (SEC ID Nº: 117), “LLIYSASFRY” (SEC ID Nº: 120) y “QQHYTTPP” (SEC ID Nº: 122), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca cohorte de “N-T-Y/W/D/S-L-A-WY” (SEC ID Nº: 118) (diversidad 4) y “N-T-N/Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 119) (diversidad 2) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 humana y UAL de CDR1 VK3, respectivamente (Figura 20B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 8, “L-L-1-Y-S-A-S-I/S/T/N-L-Q/E” (SEC ID Nº: 121), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 12, “L-L-I-Y-G/D-A/T-S-S/T/N-R-A” (SEC ID Nº: 122). El uso de CDR3 de 4D5 Herceptin como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y/S/A/G/R-Y-T-T-P-L/Y/W/R/F/I” (SEC ID Nº: 124) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 30.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto pesadas como ligeras, y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos), a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de bibliotecas cohorte de anticuerpos completos y de cadena como se muestra en la Tabla 11 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando las secuencias problema del anticuerpo de 4D5 Herceptin.

Tabla 11: diversidades de cadena y anticuerpo completo de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando sondas del anticuerpo de 4D5 Herceptin humano

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

43.200: 3.386.880 960 360

diversidad mAb: K1 K3

H1: 41.472.000 15.552.000

H3: 3,251 x 109 1,219 x 109

En lo que respecta a otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos es de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede presentarse y/o explorarse fácilmente usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 12

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte de CD19 HD37 a partir de dominios CDR sonda

La secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo de CD19 HD37 humano son “SSYWMN” (SEC ID Nº: 125), “WIGQIWPGDGDTN” (SEC ID Nº: 128), y “ARRETTTVGRYYYAMD” (SEC ID Nº: 131), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de la biblioteca cohorte de “SS-Y-W-M-N” (SEC ID Nº: 126) (sin diversidad) y “S-S-Y-A/Y/G/D-M-N” (SEC ID Nº: 127) (diversidad 4) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 21A). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de la biblioteca cohorte con una diversidad de 36, “W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P-G-F/S/N/G-G-D-T-N” (SEC ID Nº: 129), mientras que la comparación de la secuencia sonda de la CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 2352, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/NG/S-G-D-T-N” (SEC ID Nº: 130). El uso de la CDR3 de cadena pesada de CD19 HD37 como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de diversidad 9, “A-R-R-E-T-T-T-G/SN/A/T/D/R/F/W-G-R-Y-Y-Y-A-M-D” (SEC ID Nº: 132) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo de CD19 HD37 son “VTYVSWY” (SEC ID Nº: 133), “LLIYGASNRY” (SEC ID Nº: 136) y “GQGYSYPY” (SEC ID Nº: 139), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/R/G/N/Y-T-Y-L-A/NW-Y” (SEC ID Nº: 134) (diversidad 10) y “S/G/N-T-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 135) (diversidad 3) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 humana y una UAL de CDR1 VK-3, respectivamente (Figura 21B). La implementación de la invención para averiguar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 2, “L-L-I-Y-G-A-S-N-L-Q/E” (SEC ID Nº: 137), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 1, “L-L-I-Y-G-A-S-N-R-A” (SEC ID Nº: 138). El uso de la CDR3 de CD19 HD37 como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q/M-Q-G-Y-S-Y-P-Y” (SEC ID Nº: 140) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 12.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir las cadenas tanto ligeras como pesadas y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos) a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de bibliotecas de cohorte de anticuerpos completos y cadena como se muestra en la Tabla 12 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando las secuencias problema del anticuerpo de CD19 HD17:

Tabla 12: diversidades de cadena y anticuerpos completos de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando las sondas de anticuerpo de CD19 HD37

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

1.296: 5.292 20 6

diversidad mAb: K1 K3

H1: 25.920 7.776

H3: 105.840 31.752

En cuanto a los otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas biblioteca de anticuerpos es de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede presentarse y/o explorarse fácilmente usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 13

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte de CD8 g10-1 humana a partir dedominios CDR de sonda de ratón

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo de CD8 g10-1 de ratón son “TDYYMK” (SEC ID Nº: 141), “WIGHINPNNDDTF” (SEC ID Nº:144) y “VRDDYDGGWFA” (SEC ID Nº: 147), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema de la CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/N-D-Y-YM-S/H/N” (SEC ID Nº: 142) (diversidad 6) y “T-D-Y-Y-M-S/H/N” (SEC ID Nº: 143) (diversidad 3) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 22A). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 12, “W-M-G-W/G/R-I-N-P-N-N-G-D-T-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 145), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de la biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 196, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-N-G/S-D-D-T-F” (SEC ID Nº: 146). El uso de la CDR3 de cadena pesada de CD8 g10-1 como secuencia problema produjo una secuencia de la CDR3 de biblioteca cohorte de “V-R-D-D-Y-D-G-G-WF-D/G (SEC ID Nº: 148) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca cohorte de CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 2.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo de CD8 g10-1 son “NNYLNWY” (SEC ID Nº: 149), “LLIYTSRSSY” (SEC ID Nº: 152) y “QQGKTLPW” (SEC ID Nº: 155), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca cohorte de “N-N-Y-L-N-W-Y” (SEC ID Nº: 156) (sin diversidad) y “N-N-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 151) (diversidad 1) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 y una UAL de CDR1 VK-3 humana, respectivamente (Figura 22B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 10, “LL-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S-L-Q/E” (SEC ID Nº: 153), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 4, “LL-I-Y-G/D-A/T-S-S-R-A” (SEC ID Nº: 154). El uso de la CDR3 de cadena kappa de CD8 g10-1 como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-G-Y/N/G/S/D/T/LT-L-P-W” (SEC ID Nº: 156) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 7.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmento de los mismos, por ejemplo Fab, scFv, etc.) a partir de diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir las cadenas tanto pesadas como ligeras y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos) a partir de las bibliotecas de CDR de cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de biblioteca cohorte de anticuerpos completos y cadena como se muestra en la Tabla 13 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando las secuencias problema con el anticuerpo de CD8 g10-1:

Tabla 13: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas CDR cohorte combinadas generadasusando sondas de anticuerpo de CD8 g10-1 humano

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

72: 2352 70 28

diversidad mAb: K1 K3

H1: 5.040 2.016

H3: 164.640 65.856

En cuanto a los otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas biblioteca de anticuerpos es de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede mostrarse y/o explorarse fácilmente usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 14

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte 5G1.1 de C5 humana a partir de dominios cdr de sonda de ratón

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo 5G1.1 de C5 de ratón son “SNYWIQ” (SEC ID Nº: 157), “WIGEILPGSGSTE” (SEC ID Nº: 160) y “ARYFFGSSPNWYFD” (SEC ID Nº: 163), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-N-Y-W-MS/H/N” (SEC ID Nº: 158) (diversidad 3) y “S-N-Y-A/Y/G/D-I-H/S/N” (SEC ID Nº: 159) (diversidad 12) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 23A). La implementación de la secuencia CDR2 de cadena pesada problema de la invención contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 36, “W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P-G-S-G-S-T-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 161), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 4704, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-S-G-S-TY/N/F/H” (SEC ID Nº: 162). El uso de la CDR3 de cadena pesada de 5G1.1 de C5 de ratón como la secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de la biblioteca cohorte de “A-R-D/G/E/A/S/R/T/V/H-R/G/L/P/S/A/T/Q/H/I/K-G/Y/L/R/I/V/A/P/S/D/T/E-G-S-S-P-Y/G/D/S/T/F/A/P/E/L/R-W-Y-F-D” (SEC ID Nº: 164) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca de cohorte de CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 13.068.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo 5G1.1 de C5 de ratón son “TGALNWY” (SEC ID Nº: 165), “LLIYGATNLA” (SEC ID Nº: 168) y “QNVLNTPL” (SEC ID Nº: 171), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/R/G/N/Y-N/S/T/KY/W/D/S-L-N-W-Y” (SEC ID Nº: 166) (diversidad 80) y “S/G/N-S/N/T-S/N/T-N/Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 167) (diversidad 18) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 y una UAL de CDR1 VK-3, respectivamente (Figura 23B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 2, “L-L-I-Y-G-A-S-N-L-Q/E” (SEC ID Nº: 169), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 1, “L-L-1-Y-G-A-S-N-R-A” (SEC ID Nº: 170). El uso de la CDR3 de cadena kappa de 5G1.1 de C5 de ratón como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y/S/A/G/R-L-N-T-P-L” (SEC ID Nº: 172) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 5.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmento de los mismos, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de la biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto ligeras como pesadas y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos) a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de bibliotecas cohorte de anticuerpos completos y de cadena como se muestra en la Tabla 14 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando las secuencias problema del anticuerpo 5G1.1 de C5:

Tabla 14: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando sondas del anticuerpo 5G1.1 de C5 de ratón

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

5.645.376: 184.415.616 800 90

diversidad mAb: K1 K3

H1: 4,52 x 109 5,08 x 108

H3: 1,48 x 1011 1,66 x 1010

En cuanto a los otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos es de un tamaño (por ejemplo, diversidad menor de aproximadamente 1012) que puede presentarse y/o explorarse fácilmente usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 15

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte de reopro 7E3 humano a partir dedominios cdr de sonda de ratón

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo Reopro 7E3 de ratón son “KDTYVH” (SEC ID Nº: 173), “WIGRIDPANGYTK” (SEC ID Nº: 176) y “VRPLYDYYAMD” (SEC ID Nº:179), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/N-D-Y/A/SY-M-H” (SEC ID Nº: 174) (diversidad 6) y “T/S-D-Y-Y-I/M-H” (SEC ID Nº: 175) (diversidad 4) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 24A). la implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 90, “W-M-G-R-I-N/I/S-P-I/N/S/Y/G/M-N-G-T/N/G/S/D-T-K” (SEC ID Nº: 177) mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca CDR2 cohorte de diversidad 9408, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-Y-TY/N/F/H” (SEC ID Nº: 178). El uso de la CDR3 de cadena pesada de Reopro 7E3 de ratón como secuencia problema produjo una secuencia de CDR3 de biblioteca cohorte de “V-R-D/K/G/A/E/L/R/N-L-Y-D-Y-Y-A-M-D” (SEC ID Nº: 180) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca cohorte de CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 9.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo Reopro 7E3 de ratón son “SSNIGWL” (SEC ID Nº: 181), “GLIYYGTNLV” (SEC ID Nº: 184) y “VQYAQLPY” (SEC ID Nº: 187), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-S-Y/W/D/SL-A/N-W-Y” (SEC ID Nº: 182) (diversidad 8) y “S-S-N-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 183) (diversidad 1) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 humana y una UAL de CDR1 VK-3, respectivamente (Figura 24B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 20, “L/R-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-N-L-Q/E” (SEC ID Nº:185), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 4, “L-L-I-Y-G/D-T/A-S-N-R-A” (SEC ID Nº: 186). El uso de la CDR3 de cadena kappa de Reopro 7E3 de ratón como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q/M-Q-Y-Y/N/G/S/D/T/L-Q-L-P-Y” (SEC ID Nº: 188) cuando se alineó con una UAL de CDR VK. Esta biblioteca CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 14.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto pesadas como ligeras y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos) a partir de las bibliotecas CDR cohortes identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de biblioteca cohorte de anticuerpos completos y cadena como se muestra en la Tabla 15 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando secuencias problema con el anticuerpo Reopro 7E3 de ratón:

Tabla 15: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando las sonda de anticuerpo Reopro 7E3 de ratón

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

3.240: 508.032 2.240 56

diversidad mAb: K1 K3

H1: 7.257.600 181.440

H3: 1.137.991.680 28.449.792

En cuanto a los otros anticuerpos evaluados mediante los procedimientos de la presente invención, incluso la más diversa de estas bibliotecas de anticuerpos es de un tamaño (por ejemplo, diversidad sustancialmente menor de aproximadamente 1012) que puede presentarse y/o explorarse fácilmente usando los procedimientos actualmente disponibles.

Ejemplo 16

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte raptiva MHM24 humano a partir de dominios cdr de sonda de ratón

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo Raptiva MHM24 de ratón son “TGHWMN” (SEC ID Nº: 189), “WIGMIHPSDSETR” (SEC ID Nº: 192) y “ARGIYFYGTTYFD” (SEC ID Nº: 195), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/NS/N/D/T-Y/A/S-W-M-N” (diversidad 24) y “T-G-Y-A/Y/G/D-M-N” (SEC ID Nº: 191) (diversidad 4) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-1 y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Figura 25A). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 720, “W-M-G-W/G/R-I-N/I/S-P-S-F/S/N/G-G-T/N/G/S/D-T-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 193), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 3136, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-S/K/W/N-G/Y/S/Q/W/N/F-S-G/S-S-E-TY/N/F/H” (SEC ID Nº: 194). El uso de la CDR3 de cadena pesada de Raptiva MHM24 de ratón como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “A-R-G-I-Y-G/S/T/Y/D/P/I/L/V/R-Y-G-T-G/Y/N/P/S/A/D/R/F-Y-F-D” (SEC ID Nº: 196) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca cohorte CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 90.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo Raptiva MHM24 de ratón son “SKYLAWY” (SEC ID Nº: 197), “LLIYSGSTLQ” (SEC ID Nº: 200) y “QQHNEYPL” (SEC ID Nº: 203), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-K-Y-L-AW-Y” (SEC ID Nº: 198) (sin diversidad) y “S-S/N/T-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 199) (diversidad 3) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 humana y una UAL de CDR1 VK-3, respectivamente (Figura 25B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con diversidad 1, “L-L-I-Y-S-A-S-T-L-Q” (SEC ID Nº: 201), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca CDR2 cohorte de diversidad 4, “L-L-I-Y-G/D-T/A-S-T-R-A” (SEC ID Nº: 202). El uso de la CDR3 de cadena kappa Raptiva MHM24 de ratón como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y/S/A/G/R-N-S/N/T/H/Q/G-Y-P-L” (SEC ID Nº: 204) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 30.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas de CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto pesadas como ligeras y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos), a partir de las bibliotecas de CDR cohortes identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de biblioteca cohorte de anticuerpo completo y de cadena como se muestra en la Tabla 16 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando las secuencias problema con el anticuerpo Raptiva MHM24:

Tabla 16: diversidades de anticuerpo completo y cadena de bibliotecas de CDR cohorte combinadas generadas usando sondas del anticuerpo Raptiva MHM24 de ratón

Diversidad de cadena

Cohortes H1: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

259.200: 6.773.760 30 360

diversidad mAb: K1 K3

H1: 7.776.000 93.312.000

H3: 203.212.800 2.438.553.600

Ejemplo 17

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos cohorte de ovoalbúmina de ratón a partir de dominios CDR sonda

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo de ovoalbúmina de ratón son “TDYNMD” (SEC ID Nº: 205), “WIGDINPSNGYTI” (SEC ID Nº: 209) y “ARSGYGSRHPPGFA” (SEC ID Nº: 212), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/N-D-Y-A/G/W/Y-M-S/H/N” (diversidad 24) y T-D-Y-A/Y/G/D-M-H/S/N” (SEC ID Nº: 585) (diversidad 12) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Fig. 26A). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca de cohorte con una diversidad de 60, “W-M-G-W/G/R-I-N-P-S-N-G-T/N/G/S/D-T-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 210) mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 2352, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-S-G/S-G-Y-T-Y/N/F/H” (SEC ID Nº: 211). El uso de la CDR3 de cadena pesada de la ovoalbúmina como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “A-R-S-G-Y-G-S-N/D/A/V/L/Y/T/S/G-V/I/E/P/L/T/A/Y/S/G-P-T/A/W/D/R/N/S/G/Y-G-F-A” (SEC ID Nº: 213) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH. Esta biblioteca cohorte de CDR3 de cadena pesada tuvo una diversidad de 810.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo ovoalbúmina son “DSYGNSFMHWY” (SEC ID Nº: 586), “LLlYLASNLE” (SEC ID Nº: 587) y “QQNIEDPF” (SEC ID Nº: 588), respectivamente. Debido a que la CDR1 de la antiovoalbúmina posee 11 aminoácidos, podría haberse realizado cualquier análisis insercional o uso de secuencias CDR de la línea germinal coincidentes con la región marco conservada (para CDR1, “SNYLAWF” (SEC ID Nº: 589)). Por tanto, no se generó ninguna información de secuencia cohorte o diversidad mediante los procedimientos de la invención para CDR1 VK1. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo una secuencia de biblioteca cohorte de “S/N-S-S/N/T-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 215) (diversidad 6) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-3 humana (Fig. 26B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con diversidad 2, “L-L-I-Y-G-A-S-N-L-Q/E” (SEC ID Nº: 217), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca CDR2 cohorte de diversidad 2, “L-L-I-Y-G-A/T-S-N-R-A” (SEC ID Nº: 218). El uso de la CDR3 de cadena kappa del anticuerpo ovoalbúmina como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y-G-S/N/T/H/Q/G-S-P-Y” (SEC ID Nº: 220) cuando se alineó con una UAL de CDR2 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 6.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto pesadas como ligeras y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos) a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de bibliotecas de cohorte de anticuerpos completos y cadena como se muestra en la Tabla 17 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando secuencias problema del anticuerpo ovoalbúmina:

Tabla 17: Diversidades de Anticuerpo Completo y Cadena de Bibliotecas de CDR Cohorte Combinadas Generadas Usando Sondas con el Anticuerpo de Ovoalbúmina

Diversidad de Cadena Cohortes H1 Cohortes H3 Cohortes K3

583.200 45.722.880

diversidad mAb K3

H1 41.990.400

H3 3.292.047.360

Ejemplo 18

Identificación y generación de una biblioteca de anticuerpos de cohorte de TNF-□ humano a partir dedominios CDR de sonda de ratón

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo monoclonal TNF-□ de ratón son “THYGMN” (SEC ID Nº: 221), “WMGWINTYTGEPT” (SEC ID Nº: 224) y “ARERGDAMD” (SEC ID Nº: 227), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena pesada produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S/N-S/N/D/T-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 222) (diversidad 8) y “T-S/G/N/D-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 223) (diversidad 4) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH-3 humana y una UAL de CDR1 VH-1 humana, respectivamente (Fig. 27A). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 320, “W-M-G-W-I-N-P/A-Y-F/S/N/G-G-T/N/G/D-T/A-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 225), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena pesada con una UAL de CDR2 VH-3 humana por los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca de CDR2 cohorte de diversidad 7056, “W-V-S/A-V/A/N/G/Y/S/T-I-N-G/Y/S/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-E-T/K/I-Y/N/F/H” (SEC ID Nº: 226). El uso de la CDR3 de cadena pesada de TNF-□ de ratón como secuencia problema produjo una secuencia CDR de biblioteca cohorte idéntica (sin diversidad) de “A-R-E-R-G-D-A-M-D” (SEC ID Nº: 228) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VH.

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera kappa para el anticuerpo TNF-□ de ratón son “SNDVVWY” (SEC ID Nº: 229), “MLMYSAFNRY” (SEC ID Nº: 232) y “QQDYNSPR” (SEC ID Nº: 235), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena kappa produjo secuencias de biblioteca cohorte de “S-N-D-L-A/N-W-Y” (SEC ID Nº: 230) (diversidad 2) y “S-N-N/Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 231) (diversidad 2) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VK-1 humana y una UAL de CDR1 VK-3, respectivamente (Fig. 27B). La implementación de la invención para consultar la secuencia CDR2 de cadena kappa contra una UAL de CDR2 VK-1 humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 4, “L/R-L-1-Y-S-A-S-N-L-Q/E” (SEC ID Nº: 233), mientras que la comparación de la secuencia sonda CDR2 de cadena kappa con una UAL de CDR2 VK-3 humana mediante los procedimientos de la invención produjo una secuencia de biblioteca CDR2 cohorte de diversidad 2, “L-L-I-Y-G/D-A-S-N-R-A” (SEC ID Nº: 234). El uso de la CDR3 de cadena kappa TNF-□ de ratón como secuencia problema produjo una secuencia CDR3 de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y/S/A/G/R-Y-N-S-P-R” (SEC ID Nº: 236) cuando se alineó con una UAL de CDR3 VK. Esta biblioteca de CDR3 de cadena kappa tuvo una diversidad de 5.

De nuevo, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmentos de los mismos, por ejemplo Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas CDR cohorte podría realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto pesadas como ligeras y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos) a partir de las bibliotecas de CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. Dicha clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte da como resultado diversidades de bibliotecas cohorte de anticuerpos completos y de cadena como se muestra en la Tabla 18 para aquellas bibliotecas cohorte generadas usando secuencias problema del anticuerpo de TNF-□ de ratón:

Tabla 18: Diversidades de Anticuerpo Completo y Cadena de Bibliotecas de CDR Cohorte Combinadas Generadas Usando Sondas de Anticuerpo de TNF-□ de Ratón

Diversidad de Cadena: Cohortes H3 Cohortes K1 Cohortes K3

Cohortes H1

1.280: 56.448 40 20

diversidad mAb K1 K3

H1 51.200 25.600

H3 2.257.920 1.128.960

Ejemplo 19

Uso de criterios de similitud en la generación de bibliotecas de anticuerpo cohorte

Los procedimientos de la presente invención permiten la implantación de criterios de selección divergentes en una o más posiciones de restos de aminoácidos dentro de una secuencia CDR usando generación de secuencias de bibliotecas de anticuerpos cohorte. Como se describe anteriormente en el Ejemplo 5 (para los restos de la tríada catalítica del anticuerpo monoclonal anti-gp41 VIH de ratón 41-S-2-L), determinados restos de una secuencia CDR3 problema pueden “fijarse” y por tanto incorporarse en una secuencia (o secuencias) de biblioteca cohorte independientemente del uso del aminoácido presente en una biblioteca de referencia en la posición de ese resto. Los procedimientos de la invención pueden adicionalmente implementar criterios basados en similitud (en oposición a basados en identidad) en una o más posiciones de restos de una secuencia CDR durante la selección de una secuencia (o secuencias) de anticuerpos cohorte. En la mayoría de las realizaciones, las distinciones entre criterios de similitud y criterios de identidad pueden resumirse de la siguiente manera: para los criterios de identidad, los restos de una secuencia CDR problema que también aparecen en una biblioteca de referencia en la misma posición están cerrados (el aminoácido idéntico aparece en la secuencia de biblioteca cohorte resultante), y los restos que carecen de coincidencias posicionales correspondientes se sustituyen con todos los constituyentes de aminoácidos de la biblioteca de referencia en esta posición; por otro lado, para los criterios de similitud, los restos de una secuencia CDR problema que también aparecen en una biblioteca de referencia en la misma posición están de nuevo cerrados, pero los restos que carecen de coincidencias posicionales correspondiente pueden sustituirse por un subconjunto de restos de aminoácidos a partir de la biblioteca de referencia en esa posición si se encuentra que un componente de aminoácido de la biblioteca de referencia es “similar” a la secuencia problema en ese resto (para aquellas posiciones de restos en las que dicha similitud no existe, todos los restos de la biblioteca de referencia se incorporan en esa posición).

Para el presente ejemplo, se colocaron aminoácidos naturales dentro de las siguientes siete clases de similitud basándose en la química de cadena lateral (clases también tabuladas en la Figura 28):

Cadenas Laterales Pequeñas: Glicina (G), Alanina (A)

Nucleófilas: Serina (S), Treonina (T), Cisteína (C), Histidina (H)

Aromáticas: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W)

Ácidas: Aspartato (D), Glutamato (E)

Amidas: Asparagina (N), Glutamina (Q)

Básicas: lisina (K), Arginina (R)

La distinción entre criterios de similitud y de identidad se ilustra mediante aplicación en paralelo de ambos criterios con respecto a un anticuerpo anti-DR4 4H6 de ratón. Las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para un anticuerpo monoclonal anti-DR4 4H6 de ratón son “TSYGVH” (SEC ID Nº: 237), “WLGVIWAVGSTN” (SEC ID Nº: 240) y “AREGEFDYYGSSLLSYHSMN” (SEC ID Nº: 243), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena pesada usando criterios de similitud produjo una secuencia de biblioteca cohorte de “T-S-Y-Y/F/S-W-S/T” (SEC ID Nº: 238) (diversidad 6) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL de CDR1 VH4_1-1 humana (Fig. 29). Por otro lado, el uso de los procedimientos de la invención usando la misma secuencia problema CDR1 con criterios de identidad produjo la secuencia de biblioteca cohorte “T-S-Y-Y/F/S-W-S/T/N” (SEC ID Nº: 239) (diversidad). El uso de criterios de similitud por tanto permitió la

omisión lógica de asparagina en la posición final de CDR1 en la secuencia de la biblioteca cohorte, ya que la histidina parece ser similar a los componentes de la biblioteca de referencia serina y treonina pero no similar a asparagina. La implementación de la invención usando criterios de similitud para consultar la secuencia CDR2 de cadena pesada contra una UAL de CDR2 VH4_1-1 humano produjo una secuencia de biblioteca cohorte con diversidad de 16, “W-I-G-E/Y-I-Y-H/Q/Y/D-S/R-G-S-T-N” (SEC ID Nº: 241), mientras que la implementación en paralelo de criterios de identidad produjo una secuencia de biblioteca cohorte con una diversidad de 64, “W-I-G-E/Y-I-NN/S/D-H/Q/Y/D-S/R-G-S-T-N” (SEC ID Nº: 242). El uso de criterios de similitud para consultar la secuencia CDR3 de cadena pesada contra una UAL VH humana produjo una secuencia de biblioteca cohorte de diversidad 2, “A-R-E-G-D-F-D-Y-P-G-S-S-V-I-S-Y-S-S-M-D/G” (SEC ID Nº: 244), mientras que los criterios de identidad produjeron una secuencia de biblioteca cohorte de diversidad 79.200, “A-R-E-G Y/P/G/D/L/R/T/H/S-F-D-Y-S/G/N/D/E/V/T/A/F/I/L-G-S-S-Y/S/G/V/T/D/P/W/A/C-T/G/R/S/A/D/E/F/I-S-Y-Y/D/T/S-S-M-D/G” (SEC ID Nº: 245). La diversidad de cadena pesada total de las bibliotecas de cohorte resultantes usando criterios de similitud fue por lo tanto de 192, mientras que la diversidad total de bibliotecas cohorte resultantes diseñadas en paralelo usando criterios de identidad fue de

45.619.200. El uso de los criterios de similitud por lo tanto produjo lógicamente una reducción mayor de 200.000 veces en la diversidad total.

La implementación comparativa de criterios de similitud e identidad también se realizó para las secuencias CDR de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal anti-VEGF de ratón A4.6.1. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 de ratón son “TNYGMN” (SEC ID Nº: 13), “VMGWINTYTGEPT” (SEC ID Nº: 16) y “AKYPHYYGSSHWYFD” (SEC ID Nº: 19), respectivamente. El uso de los procedimientos de la invención con la secuencia problema CDR1 de cadena pesada usando criterios de similitud o identidad produjo una secuencia de biblioteca cohorte de “T-N-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 14) (diversidad 1) cuando la secuencia problema se comparó con una UAL VH1 humana (Fig. 30A). La comparación de la misma secuencia problema con una UAL VH3 humana usando criterios de similitud produjo una secuencia de biblioteca cohorte de diversidad 1, “S-N-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 246), mientras que la misma comparación usando criterios de identidad produjo una secuencia de biblioteca cohorte de diversidad 2, “S/N-N-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 15). La aplicación de los procedimientos de la invención para la CDR2 de cadena pesada usando criterios de similitud produjo secuencias de biblioteca de anticuerpo cohorte de “W-M-G-W-I-N-P/A-Y-S-G-D-T/A-S” (SEC ID Nº: 247) (diversidad 4) y “W-V-A-Y-I-N-S-D/S/N-S-G-E-I-H” (SEC ID Nº: 248) (diversidad 3), cuando se comparó con las bibliotecas de referencia VH1 y VH3, respectivamente (Fig. 30B). La aplicación en paralelo de los procedimientos de la invención con la CDR2 de cadena pesada usando criterios de identidad produjo secuencias de biblioteca de anticuerpo cohorte de “W-M-G-W-I-N-P/A-Y-F/S/N/G-G-T/N/G/S/D-T/A-N/K/S/G” (SEC ID Nº: 17) (diversidad 320) y “W-V-S/A-V/A/N/G/Q/W/N/F-D/S/N-G/S-G-E-T/K/I-Y/N/F/H” (SEC ID Nº: 18) (diversidad 7056), cuando se comparó con bibliotecas de referencia VH1 y VH3, respectivamente. La aplicación de los procedimientos de la invención con respecto a CDR3 de cadena pesada usando criterios de similitud y de identidad para la comparación con una UAL de CDR3 VH produjo secuencias de biblioteca cohorte idénticas de diversidad 8, “A-K-G/D/E/R/A/H/V/T-P-H-Y-Y-G-S-S-H-W-Y-F-D” (SEC ID Nº: 20) (Fig. 30C).

Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera para el anticuerpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 de ratón son “SNYLNWY” (SEC ID Nº: 21), “VLIYFTSSLH” (SEC ID Nº: 23) y “QQYSTVPW” (SEC ID Nº: 26), respectivamente. Las comparaciones CDR1 de cadena ligera produjeron bibliotecas cohorte de “S-N-Y-L-N-W-Y” (SEC ID Nº: 22) (diversidad 1) y “S-N-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 249) (diversidad 1) para la comparación de la secuencia problema CDR1 de cadena ligera con UAL de CDR1 VL□1 y VL□3, respectivamente, independientemente sí se emplearon criterios de similitud o identidad (Fig. 30D). Cuando la secuencia CDR1 de cadena ligera problema se comparó con una UAL de CDR1 VL□3, los criterios de similitud produjeron la biblioteca cohorte “S-K/Q/Y/E-Y-V-H/Y/S/C-W-Y” (SEC ID Nº: 250) (diversidad 16), mientras que los criterios de identidad produjeron la biblioteca cohorte “S-K/Q/Y/E-Y-A/V-H/Y/S/C-W-Y” (SEC ID Nº: 251) (diversidad 32). Las comparaciones CDR2 de cadena ligera con una UAL de CDR2 VL□1 produjeron bibliotecas cohorte de “L-L-I-Y-A/D/KG/S-A-S-Q/E” (SEC ID Nº: 252) (diversidad 10) y “L/R-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S-L-Q/E” (SEC ID Nº: 24) (diversidad 20) bajo los criterios de similitud e identidad, respectivamente (Fig. 30E). Las comparaciones de CDR2 de cadena ligera con bibliotecas de referencia CDR2 VL□3 y VL□3 produjeron secuencias de biblioteca cohorte de “L-L-I-Y-G/D-T-S-S-R-A” (SEC ID Nº: 253) (diversidad 2) y “L-V-I-Y-D/Q/E/K-D/K-S-K/D/E/N-R-P” (SEC ID Nº: 254) (diversidad 40) bajo los criterios de similitud e identidad. Para la CDR3 de cadena ligera, la comparación de la secuencia problema con una biblioteca de referencia CDR3 VL□ produjo secuencias de biblioteca cohorte de “Q-Q-Y-S-T-L-P-W” (SEC ID Nº: 256) (diversidad 1) y “Q-Q-Y-S-TY/T/S/L/W/F-P-W” (SEC ID Nº: 27) (diversidad 6) usando criterios de similitud y diversidad, respectivamente. La comparación de esta secuencia problema CDR3 con una biblioteca de referencia CDR3 VL□ produjo secuencias de biblioteca cohorte de “Q-S/A/T/I/L-Y-D/Y/H/A-S-S/G/N/D-I/L-W” (SEC ID Nº: 257) (diversidad 160) y “Q-S/A/T/I/L-Y-D/Y/H/A-S/G/N/R-S/G/N/D-T/A/N/I/S/L/G-W” (diversidad 2240) usando criterios de similitud y diversidad, respectivamente (Fig. 30F). Los valores de diversidad total de secuencias de biblioteca cohorte con criterios de identidad y similitud se resumen en la Fig. 30G y a continuación en la Tabla 19:

Tabla 19: Diversidad de Secuencias de Biblioteca Cohorte para el Anticuerpo Monoclonal A4.6.1-Comparación de Criterios de Identidad y Similitud

Diversidad de Cadena Con Criterios de Identidad

H1: H3 K1 K3 L3

2560: 112896 120 12 2867200

Diversidad de Anticuerpo Con Criterios de Identidad

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 3,1E+05 3,1E+04 7,3E+09

H3: 1,4E+07 1,4E+06 3,2E+11

Diversidad de Cadena Con Criterios de Similitud

H1: H3 K1 K3 L3

32: 72 10 2 102400

Diversidad de Anticuerpo Con Criterios de Similitud

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 320 64 3276800

H3: 720 144 7372800

Factor de Reducción en Diversidad Con Criterios de Similitud

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 960 480 2240

H3: 18816 9408 43904

Aunque la implementación anterior de criterios de similitud incorporó uno o más restos similares en la secuencia de biblioteca cohorte solamente si no se encontraba coincidencia de identidad entre las secuencias de biblioteca de 10 referencia y problema en ninguna posición de resto individual, los criterios de similitud también pueden aplicarse en las posiciones en las que exista identidad entre la secuencia biblioteca de referencia y problema. En dicha implementación, un resto de secuencia problema para el cual una biblioteca de referencia contiene tanto una coincidencia de identidad como uno o más restos similares produce secuencias de cohorte que comprenden el resto idéntico más uno o más de dichos restos similares en esa posición. Por tanto, la aplicación de estos criterios “todos 15 similares” puede usarse para ampliar la diversidad de una biblioteca cohorte de una manera lógica, consiguiendo niveles de diversidad totales mayores que para el uso de criterios de similitud convencionales descritos anteriormente, y posiblemente dando como resultado una diversidad derivada de forma lógica, total mayor que la que puede conseguirse usando solo criterios de identidad. El efecto de usar un criterio “todo similar” como un componente de la presente invención se ilustró a través de la aplicación de criterios de identidad, similitud y “todos 20 similares” con respecto al mismo anticuerpo monoclonal anti-VEGF anterior (A4.6.1). Cuando se aplicaron los criterios “todos similares” a la secuencia CDR1 de cadena pesada “TNYGMN” (SEC ID Nº: 13), se obtuvo una secuencia de biblioteca cohorte de “T/S-N-Y-G-M-N” (SEC ID Nº: 259) (diversidad 2) para cuando se realizó la comparación entre la secuencia problema y una biblioteca de referencia VH1 (Fig. 31 A). Por tanto, aunque existe un resto coincidente perfecto para el primer resto de la secuencia problema y la biblioteca de referencia (T), los criterios 25 “todos similares” dan como resultado un uso de T o el aminoácido S similar en la primera posición de las secuencias

de la biblioteca cohorte CDR1 resultante. El uso de criterios “todos similares” para la comparación de la secuencia problema CDR1 de cadena pesada y la biblioteca de referencia de CDR1 VH3 produjo la secuencia de biblioteca cohorte “S-N-Y-G/A-M-N” (SEC ID Nº: 261). La secuencia de la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo A4.6.1 es “WMGWINTYTGEPT” (SEC ID Nº: 16). La comparación de esta secuencia CDR2 problema usando los procedimientos de la invención empleando al mismo tiempo los criterios “todos similares” produjo secuencias de biblioteca cohorte de “W-M-G-W-I-N-P/A-Y-5-G-D-T/A-S” (SEC ID Nº: 263) (diversidad 4) y “W-V-A-Y-I-N-S-D/S/N-S-G-E/D-I-H” (SEC ID Nº: 265) (diversidad 6) cuando la secuencia problema se comparó con las bibliotecas de referencia de CDR2 VH1 y VH3, respectivamente (Fig. 31B). Con criterios “todos similares”, la comparación de la secuencia problema CDR3 de cadena pesada “AKYPHYYGSSHWYFD” (SEC ID Nº: 19) con una biblioteca de referencia de CDR3 VH produjo la secuencia de biblioteca cohorte “A-R/K-G/D/E/R/A/H/V/T-P/V/L-S/T/H-Y/F-Y/W-G/A-S/T-S/T-S/H-Y/W-Y/W-F-D” (diversidad 36.884; Fig. 31 C).

La aplicación de criterios “todos similares” con respecto a la secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de A4.6.1 (“SNYLNWY” (SEC ID Nº: 21), “VLIYFTSSLH” (SEC ID Nº: 23) y “QQYSTVPW” (SEC ID Nº: 26), respectivamente), produjo las siguientes secuencias de biblioteca cohorte: “S-N-Y/W-L-N-W-Y” (SEC ID Nº: 269) (diversidad 2), “S-N-Y-L-A-W-Y” (SEC ID Nº: 271) (diversidad 1) y “S/T-K/Q/Y/E-Y/F-V-H/Y/S/C-W-Y” (diversidad 64) para las comparaciones de la secuencia problema CDR1 con bibliotecas de referencia VL□1, VL□3 y VL□3, respectivamente (Fig. 31 D); “L-L-I-Y-A/D/K/G/S-A-S-S/T-L-Q/E” (SEC ID Nº: 275) (diversidad 20), “L-L-I-Y-G/D-T-S-S/T-R-A” (SEC ID Nº: 277) (diversidad 4) y “L-V-I/V-Y-D/Q/E/K/G-D/K-S/T-K/D/E/M-R-P” (SEC ID Nº: 280) (diversidad 160) para comparaciones de secuencia problema CDR2 con bibliotecas de referencia VL□1, VL□3 y VL□3, respectivamente (Fig. 31 E); y “Q-Q-Y-S/T-S/T/H-L-P/W/F” (SEC ID Nº: 281) (diversidad 18) y “Q-S/A/T/I/L-W/Y-H-S-S/G/N/D-I/L-W” (SEC ID Nº: 283) (diversidad 80) para comparaciones de secuencia problema CDR3 con bibliotecas de referencia VL□ y VL□, respectivamente (Fig. 31F). En cuanto a las secuencias de anticuerpo consideradas anteriormente, la producción de una biblioteca de anticuerpos cohorte final (o fragmento de la misma, por ejemplo, Fab, scFv, etc.) a partir de las diversas bibliotecas CDR cohorte puede realizarse mediante clasificación independiente de secuencias de biblioteca de CDR cohorte entre sí para construir cadenas tanto ligeras como pesadas y anticuerpos completos (o fragmentos de los mismos a partir de las bibliotecas CDR cohorte identificadas mediante los procedimientos de la invención. La Tabla 20 resume los datos de diversidad para bibliotecas cohorte y anticuerpos que se producen de la aplicación de criterios de identidad, similitud o “todos similares” a través de las secuencias CDR del anticuerpo monoclonal A4.6.1 de ratón.

Tabla 20: Diversidad Producida Usando Criterios de Identidad, Similitud y “Todos Similares” para las Secuencias Problema CDR A4.6.1 de Ratón

Diversidad de Cadena Con Criterios de Identidad

H1: H3 K1 K3 L3

2560: 112898 120 12 2867200

Diversidad de Anticuerpos con Criterios de identidad

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 3,1E+05 3,1E+04 7,3E+09

H3: 1,4E+07 1,4E+08 3,2E+11

Diversidad de Cadena con Criterios de Similitud

H1: H3 K1 K3 L3

32: 72 10 2 102400

Diversidad de Anticuerpos con Criterios deSimilitud

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 320 64 3276800

H3: 720 144 7372800

Diversidad de Cadena Con Criterios “Todos Similares”

H1: H3 K1 K3 L3

294.912: 442.368 720 72 819.200

Diversidad de Anticuerpo Con Criterios “Todos Similares”

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 2,1E408 2,1E+07 2,4E+11

H3: 3,2E+08 3,2E+07 3,6E+11

Factor de Reducción en Diversidad de Anticuerpos Completos conCriterios de Similitud Frente a Identidad

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 960 480 2240

H3: 18816 9408 43904

Factor de Expansión en Diversidad de Anticuerpos Completos conCriterios “Todos Similares” Frente a Similitud

diversidad mAb: K1 K3 L3

H1: 663.552 331.776 73.728

H3: 442.368 221.184 49.152

Ejemplo 20

Procedimientos para modificar por ingeniería genética una biblioteca de anticuerpos cohorte

En este ejemplo se describen las etapas para preparar y ensamblar una biblioteca de anticuerpos cohorte usando 10 técnicas de modificación por ingeniería genética.

El formato scFv consiste en las unidades de unión a antígeno funcionales (regiones VH y VL) unidas entre sí. En

resumen, los fragmentos VL y VH de los anticuerpos se clonan usando técnicas de biología molecular

convencionales. Los oligonucleótidos que codifican las CDR y región marco conservadas de las regiones variables

se ensamblan mediante la reacción en cadena de la polimerasa solapada sencilla (SOE-PCR). Los fragmentos VL y 15 VH separados después se unen posteriormente con un engarce poli-Gly-Ser (típicamente GGGGS-GGGGSGGGGS)

(SEC ID Nº: 590) para generar anticuerpos monocatenarios (scFv). Después, las moléculas de longitud completa se

amplifican usando cebadores 5’ y 3’ flanqueantes que contienen sitios de restricción que facilitan la clonación en el

vector de presentación de expresión). La diversidad total de las bibliotecas generadas depende del número de

secuencias marco conservadas y del número de posiciones en las CDR seleccionadas para mutagénesis, por ejemplo, usando WTM.

Típicamente, para la síntesis de una biblioteca de referencia universal de anticuerpos completa, la diversidad promedio de la biblioteca VH, usando 9 aminoácidos para realizar la WTM™, es de 3,5 x 106 (6 restos marco conservados x 9 aminoácidos x (22 para CDR1 x 26 para CDR2 x 28 para la CDR3 de 13 aminoácidos)). La diversidad de la biblioteca VH es un límite superior y la diversidad de las bibliotecas V y Vk es significativamente más pequeña, limitando por lo tanto la diversidad combinada de la biblioteca scFV completa a partir de 1010 a 1011 que se encuentra dentro del intervalo de las eficacias de transformación de los sistemas bacterianos.

Por consiguiente, para la generación de bibliotecas universales de anticuerpos de referencia, se sintetizaron 90 oligonucleótidos para incluir las regiones marco conservadas de las diversas bibliotecas VH, V y VK (véase Figuras 62A-62E) junto con 2 oligonucleótidos que codificaban inmunomarcadores H y Myc respectivamente en los extremos N y C (Figura 33). Además, se sintetizó un subconjunto de 30-60 oligonucleótidos degenerados que representaban la diversidad en las CDR 1, 2 y 3 de cada una de las tres bibliotecas (total 90-180). Estos oligonucleótidos se ensamblaron mediante el procedimiento SOE-PCR para generar las bibliotecas que incluían las combinaciones VH-VA y VH-Vk necesarias. Después se seleccionaron clones al azar de cada biblioteca para la verificación de secuencia y evaluación de la calidad de la biblioteca.

Se realizó la síntesis de bibliotecas de anticuerpos y CDR cohorte mediante el mismo procedimiento que el descrito para las UAL. La síntesis de bibliotecas de anticuerpo cohorte tenían la ventaja añadida de que dichas bibliotecas de cohorte podrían tener una menor diversidad que las bibliotecas de referencia, ofreciendo así bibliotecas cohorte más fáciles para generar, que a menudo requieren menos oligonucleótidos que una biblioteca de referencia. Para cada generación de biblioteca cohorte de anticuerpo diana, se sintetizó un conjunto de oligonucleótidos de las secuencias CDR1, 2 y 3 de VL y VH de miembros de la subfamilia de anticuerpos naturales (Figuras 62G-H). Estas VH, VL y oligonucleótidos de la CDR también se ensamblaron mediante SOE-PCR para generar las combinaciones VH-VL necesarias iniciales para la base del molde de la mutagénesis scFv. La generación del anticuerpo natural de partida para control positivo se realizó esencialmente de la misma manera. Véase las Figuras 34 y 35 para región marco conservada anti-VEGF A4.6.1 y aminoácidos de CDR codificados y ensamblados por oligonucleótidos SOE-PCR (Figuras 62G-I).

La introducción de codones de terminación en VL y VN, CDR 1, 2 y 3 (véase a continuación y el resto en las Figuras 62G-I) fue una característica adicional del molde de mutagénesis natural empleado para aumentar la eficacia de exploración de la biblioteca cohorte. Como un ejemplo, el oligonucleótido de codón de terminación VH CDR1 H1e_1_VEGF tuvo dos paradas en fase (TAA TAA) en lugar de los restos de tirosina y glicina (TAC GGG) en las posiciones de CDR correspondientes de la secuencia natural, como se muestra a continuación.

Usando el codón de terminación en fase, cualquiera de los moldes no mutados de CDR VL y VH, no se traducirían y/o exportarían por completo al espacio periplásmico bacteriano. Limitando FACS posterior a solamente scFv funcional, la señal de fondo con respecto al nivel de interferencia de la unión del antígeno con respecto a las scFv naturales por lo tanto se minimizó.

Con respecto a la diversidad CDR, se usó LTM para explorar pequeñas perturbaciones dentro de los bucles CDR del anticuerpo (por ejemplo, un cambio por bucle). Para mejorar adicionalmente, la WTM, que permite la incorporación de más de una sustitución dentro de una CDR, posteriormente puede usarse para explorar exhaustivamente el entorno químico de la CDR (o las CDR). Usando WTM, el aminoácido natural y las variantes de aminoácidos deseadas se exploran en posiciones CDR diana manipulando la síntesis de oligonucleótidos. Se sintetiza un conjunto mixto de oligonucleótidos en los que un subconjunto de los oligonucleótidos codifica el natural y otro subconjunto codifica la mutación diana en una posición específica. En el procedimiento WTM, en cada etapa de la síntesis, la cadena oligonucleotídica en crecimiento se extiende por una de dos bases. Una base codifica el codón natural mientras que la otra base pertenece a un codón para la mutación deseada.

Integrando las CDR naturales con diferentes regiones marco conservadas VH y VL, se generó diversidad añadida más allá de la de las mutaciones de CDR LTM y WTM (véase Ejemplo 2X más adelante). La diversidad total de las bibliotecas cohorte generadas depende de la cantidad de posiciones CDR mutadas y de cuantos aminoácidos se sustituyeron basándose en el perfil de variabilidad coincidente. El perfil de variabilidad para cada molde de partida fue independiente de la región marco conservada VL y VH circundante.

Ejemplo 21

Creación de bibliotecas scfv Vh, Va y Vk cohorte por mutagénesis walk through

A. Preparación de molde monocatenario de scFv para mutagénesis de Kunkel

Se clonaron construcciones de expresión scFv diana en PBSKII para la preparación de ADN monocatenario scFv. Los huéspedes E. coli CJ236 se cultivaron en medio líquido 2YT/Amp hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente de 0,2 a 0,5 Unidades de Absorbancia (UA). En este momento, se añadió 1 ml de fago auxiliar M13 K07 al cultivo bacteriano para continuar la incubación a 37º C. Después de 30 minutos, el cultivo de bacteria y fago se transfirió a un volumen más grande de un medio líquido 2YT/Amp (30 ml) que contenía uridina 0,25 ug/ml para el cultivo durante una noche.

Al día siguiente, el medio de cultivo se aclaró por centrifugación (10 minutos a 10.000 x g), después de lo cual se recogió el sobrenadante y se añadió 1/5 volumen de PEG-NaCl durante 30 minutos. Posteriormente la mezcla se centrifugó dos veces, pero después de cada centrifugación, el sobrenadante se descartó a favor del sedimento PEG/fago retenido. El sedimento PEG/fago se resuspendió después en PBS (1 ml), se volvió a centrifugar (5 minutos a 14.000 x g). El sobrenadante se recogió y después se aplicó a una columna de purificación de ADN (QIAprep Spin M13, Qiagen) para eluir el ADN uridinilado scFv monocatenario.

B. Oligonucleótidos por mutagénesis walk through (WTM)

Se sintetizaron oligonucleótidos sintéticos en un Oligosintetizador 3900 (Syngen Inc., San Carlos, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante, y se verificó la cualidad del cebador mediante electroforesis PAGE antes del uso de la PCR o mutagénesis Kunkel. El oligonucleótido por Mutagénesis Walk Through (WTM) hibridado al molde monocatenario uridinilado se diseñó para mutar una posición (o posiciones) específica con aminoácidos predeterminados (véase Solicitud de Patente Nº PCT/US2004/020306). Esta precisión y control de sustituciones de aminoácidos fue distinta de otras técnicas de mutagénesis estocástica que permiten sustituciones de CDR específicas múltiples.

Usando WTM, el aminoácido natural y las variantes de aminoácido deseadas se exploraron en posiciones CDR diana manipulando síntesis de oligonucleótidos. Se sintetizó un conjunto mezclado de oligonucleótidos, en el que un subconjunto de los oligonucleótidos codificaba el codón natural y otro subconjunto codificaba la mutación diana en una posición específica. En el procedimiento WTM, en cada etapa de la síntesis, la cadena oligonucleotídica en crecimiento se extendió mediante una de dos bases. Una base codificaba el codón natural mientras que la otra base se diseñó para insertar el codón mutante deseado.

C. Mutagénesis por ultrahumanización con oligonucleótidos CDR a partir de blast de CDR VH anti-VEGF Avastin

Para el proceso de ultrahumanización, se sustituyeron posiciones CDR particulares por aminoácidos seleccionados basándose en su frecuencia in vivo (véase Ejemplo 4 anterior y resultados más adelante). Durante la humanización de Avastin A4.6.1 derivado de ratón en la primera región marco conservada VH1 humana, no hubo sustituciones de aminoácidos CDR1 basándose en el perfil de variabilidad correspondiente (tabla más adelante). La CDR1 del oligonucleótido H1e_1_VEGF01 (véase Figura XE), consistió en la secuencia: 5’-AGGCTTCCGGTGGCACATTC ACC AAC TAC GGG ATG AAC TGGGTTAGACAGGCACCTGG-3’ (SEC ID Nº: 592). La secuencia codificante CDR1 VH1, 5’-ACC AAC TAC GGG ATG AAC-3’ (SEC ID Nº: 593) se flanqueó mediante las secuencias de ADN 5’-AGGCTTCCGGTGGCACATTC (SEC ID Nº: 594) y TGGGTTAGACAGGCACCTGG-3’ (SEC ID Nº: 595), que se extendieron respectivamente en la región marco conservada VH1 circundante.

Tabla 21: Alineamiento de la Sonda de Ratón CDR1 VH-1 Avastin

Secuencias de sondas de ratón y de codificación de bibliotecas desveladas como SEC ID Nº: 13 y 14, respectivamente

CDR1 VH-1

Constituyentes UAL: S A

G: Y H

T: N G I S

S: D Y D M N

sonda de ratón: T N Y G M N

Biblioteca que codifica: T N Y G M N

posibles restos: 1 1 1 1 1 1

Para reiterar la reorganización de las regiones marco conservadas CDR, esta secuencia codificante CDR1 VH1 humanizada también podría integrarse en el contexto de otra región marco conservada (de miembros de la subfamilia VH1, VH3, VH4 u otros) por yuxtaposición de extensión de regiones marco conservadas específicas de la secuencia de la subfamilia. La secuencia codificante CDR VH1 podría en su lugar flanquearse mediante extensiones de las secuencias marco conservadas VH3-07 cadena arriba 5’-GCCAGCGGCTTTACCTTCTCT (SEC ID Nº: 596) y cadena abajo GCTGGGTTA-GACAGGCACCT-3’ (SEC ID Nº: 597) en la región marco conservada VH3 circundante.

Durante la realización de blast de Avastin A4.6.1 CDR2 VH1, cinco de los 13 aminoácidos naturales (T, T, E, P y T) se reemplazaron con aminoácidos preferidos humanos (respectivamente P/A, F/S/N/T, T/N/G/S/D, y N, K, S, G) basándose en el perfil de variabilidad de CDR2 VH1 (véase cuadros en blanco en la tabla de perfil de variabilidad más adelante). En este caso, la secuencia de aminoácidos natural CDR2 WMGWINTYTGEPT (SEC ID Nº: 16) se codificó por: 5’-TTG ATG GGA TTG ATA AAC CCA TAC TTC GGA ACA AAC-3’ (SEC ID Nº: 598) que se flanqueó por la región marco conservada VH1 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAG y secuencias TACGCT-CAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 600).

Secuencias de sondas de ratón y codificación de bibliotecas desveladas como SEC ID Nº: 16 y 601, respectivamente

Tabla 21: Alineamiento de Sondas de Ratón CDR2 VH-1 Avastin

CDR2 VH-1

Constituyentes UAL: I

N: T

S: F N N

W: N Y S G K

G: I P G N S T S

W: M G R I S A M G G D A G

sonda de ratón: W M G W I N T Y T G E P T

Biblioteca que codifica: W M G W I N P/A Y F/S/N/T G T/N/G/S/D T/A N/K/S/G

degeneración mínima: 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 2 1 2

restos posibles: 1 1 1 1 1 1 2 1 4 1 5 2 4

Estas sustituciones de humanización CDR2 VH1 A4.6.1 para P/A, F/S/N/T, T/N/G/S/D y N, K, S, G requirieron por lo tanto un mínimo de 12 oligonucleótidos para generar las 320 posibles variaciones de reemplazo único. Basándose en la tabla anterior, las sustituciones de humanización necesarias en las posiciones CDR2 que ser realizaron se muestran mediante las mezclas de bases degeneradas en cursiva en las que S es (C o G) y R es (A o G) (véase las secuencias de oligonucleótidos H1e_2_VEGF01-12 a continuación).

Tabla 22: Oligonucleótidos de Humanización de Bases Degeneradas CDR2 VH-1 Avastin

H1e_2_VEGF01 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACTTCGG CACCRCCRGCTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 602)

H1e_2_VEGF02 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACTTCGG CACCRCCAASTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 603)

H1e_2_VEGF03 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACRGCGG CACCRCCRGCTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 604)

H1e_2_VEGF04 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACRGCGG CACCRCCAASTACGCTCAGAAATTCCAGGG3’ (SEC ID Nº: 605)

H1e_2_VEGF05 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACAACGG CACCRCCRGCTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 606)

(continuación)

H1e_2_VEGF06 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACAACGG CACCRCCAASTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 607)

H1e_2_VEGF07 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACTTCGG CRRCRCCRGCTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 608)

H1e_2_VEGF08 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACTTCGG CRRCRCCAASTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 609)

H1e_2_VEGF09 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACRGCGG CRRCRCCRGCTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 610)

H1e_2_VEGF10 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACRGCGG CRRCRCCAASTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 611)

H1e_2_VEGF11 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACAACGG CRRCRCCRGCTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 612)

H1e_2_VEGF12 5’-CACCTGGTCAGGGCTTGGAGTTGATGGGCTTGATCAACSCCTACAACGG CRRCRCCAASTACGCTCAGAAATTCCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 613)

Para CDR3 VH, no se originaron subfamilias, ya que CDR3 se formó a partir de la unión por recombinación de los genes de los segmentos D y J de inmunogloblulina. Usando el análisis de perfil de variabilidad descrito anteriormente, solamente una posición de la CDR3 de longitud de tamaño 15 se sustituyó con los 8 aminoácidos preferidos. Específicamente, la secuencia de aminoácidos natural de CDR3, AKYPHYYGSSHWYPD (SEC ID Nº: 19) se humanizó por la secuencia A-K-G/D/E/R/A/H/Y/T-P-H-Y-Y-G-S-S-H-W-Y P-D (SEC ID Nº: 20). En este caso, solamente fueron necesarios cuatro oligonucleótidos degenerados para las sustituciones de humanización CDR3 VH1 A4.6.1 (véase secuencias H1e_3_VEGF01-4 a continuación).

Tabla 23: Oligonucleótidos de Humanización de Bases Degeneradas CDR3 VH Avastin

H1e_3_VE GF01: 5’-ATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAAGRGACCCCACTACTACGGCAGCAGCCACTTGTACTTCG ACTACTGGGGTCAGGGCACTCT-3’ (SEC ID Nº: 614)

H1e_3_VE GF02: 5’-ATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAAGSACCCCCACTACTACGGCAGCAGCCACTTGTACTTCGA CTACTGGGGTCAGGGCACTCT-3’ (SEC ID Nº: 615)

H1e_3_VE GF03: 5’-ATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAAGGWGCCCCACTACTACGGCAGCAGCCACTTGTACTTCG ACTACTGGGGTCAGGGCACTCT-3’ (SEC ID Nº: 616)

H1e_3_VE GF04: 5’-ATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAAGRCCCCCCACTACTACGG CAGCAGCCACTTGTACTTCGACTACTGGGGTCAGGGCACTCT-3’ (SEC ID Nº: 617)

La CDR3 se codificó por: 5’-GCC AAG (RGA O SAC O GWG O RCC) CCC CAC TAC TAC GGC AGC AGC CAC TTG TAC TTC GAC-3’ (SEC ID Nº: 618) que está flanqueada por las secuencias de región marco conservada VH1 5’-ATACCGCCGTGTATTACTGT y TACTGGGGTCAGGGCACTCT-3’ (SEC ID Nº: 619). Las posiciones degeneradas de CDR3 se indican por las mezclas de bases degeneradas en negrita en las que S es (C o G), R es (A o G) y W es (A o T).

Para la humanización CDR21 y CDR2 VH3 de A4.6.1, las tablas de sustitución y oligonucleótidos que codifican CDR se indican a continuación (véase Figura 62I para un listado de oligonucleótidos completo). Para VH3, se emplearon cuatro miembros de familias distintas, 3-30, 3-07, 3-11 y 3-23. Por lo tanto, el flanqueamiento de las secuencias codificantes CDR1 y CDR2 degeneradas respectivas fue VH3: secuencias específicas de marco conservadas 3-30, 3-07, 3-11 y 3-23 para la hibridación exacta con sus respectivos moldes scFv mutagénicos VH3 de partida.

Las secuencias de las sondas de ratón y codificación de biblioteca se desvelan como SEC ID Nº: 13 y 15, respectivamente

Tabla 24: Alineación de Sondas de Ratón CDR1 VH-3 Avastin

CDR1 VH-3

Constituyentes UAL: S N D Y A A G W

S

S: H

N: T S Y M
N

sondas de ratón: T N Y G M N

Biblioteca que codifica: S o N N Y G M N

posibles restos: 2 1 1 1 1 1 Diversidad 2

Tabla 25: Alineamiento de Sondas de Ratón CDR2 VH-1 Avastin

Las secuencias de las sondas de ratón y codificación de bibliotecas desveladas como SEC ID Nº: 16 y 18, respectivamente

CDR2 VH-3

Constituyent es UAL: V G

A: Y S

N: S
N

G: S Q S G T T E Y Y

Y: K W D T N

S
S: W N S G K F

W: V A T I N F N S D D I H

sonda de ratón: W M G W I N T Y T G E P T

Biblioteca que codifica: W V S/ A V/A/N/G/Y/S /T I N G/Y/S/Q/W/N /F D/S/ N G/ S G E T/K/ I Y/N/F/ H

posibles restos: 1 1 2 7 1 1 7 3 2 1 1 3 4 Producto 7056

D. Realización de blast CDR VL anti-VEGF Avastin

10 De una manera relacionada, las sustituciones de ultrahumanización para las cadenas ligeras kappa VL y lambda VL se establecieron a partir de sus perfiles de variabilidad respectivos. Por ejemplo, el uso de los miembros de la familia VL kappa I y VL kappa III se determinó, específicamente VL kappa-L1, VL kappa III-A27 y VL kappa III-L6. Las tablas de reemplazo VK-1 y VK-3 de ultrahumanización resultante identificadas son como se muestran a continuación. En ambos casos VK-1 y VK-3, no fueron necesarios reemplazos de ultrahumanización VK-1 y VK-3.

Secuencias de sondas de ratón y de codificación de biblioteca desveladas como SEC ID Nº: 21 y 22, respectivamente

Tabla 26: Alineación de Sondas de Ratón CDR1 VK-3 Avastin

CDR1 VH-3

Constituyentes UAL: S R N S Y W

G

N: T D A

Y: K S L N W
Y

sondas de ratón: S N Y L N W Y

Biblioteca que codifica: S N Y L N W Y Sin diversidad

posibles restos: 1 1 1 1 1 1 1 Producto 1

Tabla 27: Alineación de Sondas de Ratón CDR1 VK-3 Avastin

Las secuencias de las sondas de ratón y codificación de biblioteca se desvelan como SEC ID Nº: 21 y 249, respectivamente

CDR1 VK-3

Constituyentes UAL: S G S N T

N

N: Y L A W Y

sondas de ratón: S N Y L N W Y

Biblioteca que codifica: S N Y L A W Y

posibles restos: 1 1 1 1 1 1 1 Producto 1

Los oligonucleótidos de CDR1 VK-1 y VK-3 resultantes identificados se muestran respectivamente a continuación

10: (véase K1_1_VEGF01 y K3_1_VEGF01):

K1_1_VEGF01:: 5’- GCAGAGCTTCTCAGGGTATC-AGC AAC TAC CTG AAC TTG TAC -

CAACAGAAGCCTGGTAAAGC-3’ (SEC ID Nº: 621).

K3_1_VEGF01:: 5’-GCAGAGCTTCTCAGTCCGTG AGC AAC TAC CTG GCC TTG TAC -

CAACAGAAACCTGGTCAGGC-3’ (SEC ID Nº: 622).

15 Ultrahumanización para CDR2 VL kappa I y VL kappa III establecida a partir de sus tablas de reemplazo de perfiles de variabilidad respectivos como se muestra a continuación. En los casos VK-1 y VK-3, hubo cuatro posiciones CDR que necesitaron sustituciones de humanización. Sin embargo, las tablas de diversidad demuestran que incluso con el mismo número de reemplazos, (cuatro posiciones), la diversidad real VK-1 y VK-3 creada fue 20 y 2, respectivamente. Esto ilustró la particularidad de que diferentes perfiles de variabilidad producen diferentes niveles

de diversidad cuando se usó el mismo molde de entrada para el alineamiento.

Las secuencias de las sondas de ratón y codificación de biblioteca se describen como SEC ID Nº: 23 y 24, respectivamente

Tabla 28: Alineamiento de Sondas de Ratón CDR2 VK-1 Avastin

CDR2 VK-1

Constituyentes UAL: A

D: I

K: S

L: G T Q

R: L I Y S A S N L E

sonda de ratón: V L I Y F T S S L H

Biblioteca que codifica: L/R L I Y A/D/K/G/S A S S L Q/E

posibles restos: 2 1 1 1 5 1 1 1 1 2 Producto 20

Tabla 29: Alineamiento de Sondas de Ratón CDR2 VK-3 Avastin

Las secuencias que codifican las sondas de ratón y biblioteca se desvelan como SEC ID Nº: 23 y 25, respectivamente

CDR2 VK-3

Constituyentes UAL: S

G: A T

L
L: I Y D T S N R A

sonda de ratón: V L I Y F T S S L H

Biblioteca que codifica: L L I Y G/D T S S R A

posibles restos: 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 Producto 2

10 Los oligonucleótidos de ultrahumanización CDR2 VK-1 son como se indica a continuación (con respecto a la Tabla 30, secuencias K1_2_VEGF01-3). Las secuencias marco conservadas que flanquean VK-1 5’ y 3’ alrededor de CDR2 son respectivamente: 5’-AGCCTGTAAAGCCCCTAAG-3’ (SEC ID Nº: 623) y 5’-TCCGGCGTTCCTAGCAGATT-3’ (SEC ID Nº: 624).

Tabla 30: Oligonucleótidos de humanización de bases degeneradas CDR2 VK-1 Avastin 15 K1_2_VEGF01 5’-AGCCTGGTAAAGCCCCTAAGCKGCTGATCTACAAGGCCAGC AGCCTGSAGTCCGGCGTTCCTAGCAGATT-3’ (SEC ID Nº: 625) K1_2_VEGF02 5’-AGCCTGGTAAAGCCCCTAAGCKGCTGATCTACGMCGCCAGC AGCCTGSAGTCCGGCGUCCTAGCAGATT-3’ (SEC ID Nº: 626)

(continuación)

K1_2_VEGF03 5’-AGCCTGGTAAAGCCCCTAAGCKGCTGATCTACAAGRGCAGC

AGCCTGSAGTCCGGCGTTCCTAGCAGATT-3’ (SEC ID Nº: 627)

Para la CDR2 VK-3, la secuencia que codifica la humanización del oligonucleótido CDR2 fue 5’-CTG CTG ATC TAC G ACC AGC AGC AGG GCC -3’ (SEC ID Nº: 628). Sin embargo, como hubo que utilizar dos miembros de la subfamilia VK-3, específicamente A27 y L6, las diferencias (letra cursiva en negrita) en las secuencias marco conservadas de flanqueamiento 5’ y 3’ alrededor de CDR2 VL-3 fueron respectivamente:

VK-3 A27: 5’-AACCTGGTCAGGCCCCTCGC...CAGGCATCCCTGATATATT-3’ (SEC ID Nº 629 y 630, respectivamente), y

VK-3 L6: 5’-AACCTGGTCAGGCCCCTAGA…CAGGTATCCCTGCCAGATT-3’ (SEC ID Nº 631 y 632, respectivamente).

Tabla 31: Oligonucleótidos de Humanización de CDR2 VK-3 de Avastin

K3A27_2_VEGF01ACCTGGTCAGGCCCCTCGC CTGCTGATCTACGRCACCAGCAGC AGGGCC ACAGGCATCCCTGATATATT (SEC ID Nº: 633)

K3L6_2_VEGF01AACCTGGTCAGGCCCCTAG ACTGCTGATCTACGRCACCAGCAGCAGGGCC ACAGGTATCCCTGCCAGATT (SEC ID Nº: 634)

E. Mutagénesis del molde scFV

Para bibliotecas cohorte, se necesitaban CDR mutadas múltiples veces dentro de cada scFv para explorar por completo los efectos de las secuencias de CDR de aminoácidos preferidos humanos dentro del bolsillo de unión a antígeno. Comenzando con el gen scFv diana natural como el molde Kunkel, se generó un primer molde de biblioteca CDR WTM (Figura 59). Como un ejemplo, la CDRH3 se reemplaza con los aminoácidos preferidos humanos apropiados como se identifica a partir de los perfiles de variabilidad de VH1, VH3, VH4 CDRH3 respectivos. Estos scFv WTM-CDRH3 realizados por primera vez se usaron como moldes posteriores a los que después se hibridaron el conjunto apropiado de oligonucleótidos WTM-CDRH1 para generar la biblioteca de cohorte de la región WTM-CDRH1 y WTM-CDR de doble mutación. Esta biblioteca WTM-CDRH1 y WTM-CDRH3 doble puede después usarse como moldes para incorporar otros oligonucleótidos WTM-CDRH2 restantes para constituir las bibliotecas WTM-CDR VH triples. Por combinación iterativa progresiva del resto de cada uno de los oligonucleótidos WTM CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de cadena ligera V y Vκ, se desarrollan matrices complejas de bibliotecas de CDR cohorte VH (VH1, VH3, VH4) y VL (V y Vκ).

F. Mutación doble, triple, cuádruple Kunkel simultánea de las CDR scFv

Existe una alternativa a la construcción gradual a partir de la biblioteca WTM-CDR sencilla en construcciones WTM-CDR dobles y posteriores bibliotecas WTM-CDR triples. Esta estrategia alternativa se basa en observaciones experimentales recientes de que los oligonucleótidos múltiples pueden hibridarse simultáneamente al mismo molde scFv en diferentes localizaciones de la misma construcción genética (Figura 58). Por ejemplo, dos conjuntos de oligonucleótidos WTM CDRH1, CDRH2 y CDRH3 pueden introducirse en la mezcla de reacción para hibridar en las tres CDR VH. Se observó que se producían incorporaciones de oligonucleótidos WTM-CDR múltiples para niveles tan altos como cinco reacciones de hibridación simultáneas.

El molde monocatenario incorpora los tres oligonucleótidos WTM-CDRH1, WTM-CDRH2 y WTM-CDRH3. Sin embargo, después de una ronda de hibridación, hubo aproximadamente una frecuencia de recuperación del 50% de los productos scFv en los que las tres modificaciones WTM CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se había conseguido. Típicamente, para generar una mayor proporción de scFv CDR mutados múltiples veces, el producto de reacción a partir de la primera reacción de hibridación se recuperó y después se “rehibridó” con los mismos oligonucleótidos WTM-CDR múltiples. Después de esta rehibridación, el porcentaje de scFv CDR mutados múltiples veces aumentó otro 50% para una población total del 75% que tenía las CDR mutadas múltiples veces.

Este procedimiento se ha denominado “enriquecimiento” por su capacidad de reintroducir múltiples oligonucleótidos WTM-CDR al molde previamente mutado. Por tanto, incorporando dos o tres rondas posteriores de “enriquecimiento”, una proporción de la población de moldes scFv CDR mutados múltiples veces alcanza el 90%. Un sorprendente aspecto del “enriquecimiento” es que la hibridación de oligonucleótidos adyacentes múltiples introduce aún las sustituciones deseadas incluso si las terminaciones del oligonucleótido se solapan en algunas bases. Esto fue inesperado, ya que durante el procedimiento de ligamiento, los enlaces fosfato diéster entre los extremos 5’ y 3’ de los dos oligonucleótidos no se formaban fácilmente si no se encontraban contiguos. Si hay algún solapamiento, podría esperarse que un oligonucleótido se “subiese” sobre el otro (véase Figura 58).

G. Cruzamiento interfamiliar CDR VH y VL para generar una diversidad aumentada

Las Figuras 42 y 43 representan las diversas combinaciones CDR posibles disponibles en la reconstrucción de un scFv anti-VEGF A4.6.1 humano después de emparejamiento de CDR de los respectivos perfiles de variabilidad VH 1,3 y VL kappa, lambda. Por ejemplo, la Figura 42 demuestra que las secuencias cohorte CDR1 VH1 anti-VEGF humanas pueden combinarse con las secuencias cohorte CDR2 VH1 anti-VEGF humanas esperadas (flecha en negrita) y después con las secuencias cohorte CDR3 VH1 anti-VEGF normales. Las secuencias cohorte CDR1, 2 y 3 VH1 anti-VEGF completas se expresaron después en relación con sus secuencias marco conservadas VH1-1-e naturales. Del mismo modo para las secuencias cohorte CDR1, 2 y 3 VH3 anti-VEGF recogidas estas pueden expresarse con las secuencias marco conservadas VH3 3-07, 3-11, 3-23 y 3-30 naturales enumeradas (Figura 5).

La diversidad de anticuerpo fue capaz de aumentar basándose en las metodologías genéticas in vitro presentadas de la invención. Con técnicas de manipulación, podrían crearse combinaciones marco conservadas -CDR artificiales. En el caso de VH, las CDR VH3 pueden ensamblarse con regiones marco conservadas VH1 y viceversa. Por tanto, los resultados de perfiles de variabilidad CDR1, 2 y 3 individuales de VH1 también pueden emparejarse con regiones marco conservadas VH3 3-07, 3-11, 3-23 y 3-30 para explorar el contexto de unión a antígeno en cuatro otros formatos estructurales (líneas de puntos y líneas discontinuas de la Figura 42). De manera similar, para VL, fue posible mezclar y emparejar los perfiles de variabilidad de CDR V□1, V□2 y V□3 con V□1 y V□3 (líneas de puntos y líneas discontinuas de la Figura 43). Las CDR mezcladas podrían después expresarse en cualquiera de las siguientes regiones marco conservadas VL: V□1-1b, V□2 2a2 y V□3 3r, 31 con V□lL1 y V□3 A27 y L20 (Figura 5). Estos cruces de diseño de CDR 1 y CDR2 son después un subconjunto de las bibliotecas UAL cotejadas globales (Figuras 6, 7 y 8). La distinción en la biblioteca cohorte es que solamente se selecciona un tamaño de CDR3, basándose en la longitud de CDR3 del anticuerpo natural.

Ejemplo 22

Procedimientos para la expresión y presentación de una biblioteca universal de anticuerpos de referencia

Los enfoques para permitir la expresión y presentación de bibliotecas universales de anticuerpos son fácilmente aplicables a cualquiera de las bibliotecas de anticuerpos cohorte y de referencia. Dichas bibliotecas aumentan la diversidad del repertorio natural y una vez construidas pueden explorarse de manera repetida para otros antígenos.

La biblioteca scFv se transfecta en el hospedador bacteriano receptor usando técnicas convencionales. Las proteínas de fusión scFv expresadas se expresan en una localización en la superficie externa lo que permite la unión de antígenos marcados con fluorescencia. Los miembros de la biblioteca que expresan clones scFv adecuados que se unen eficazmente al antígeno se enriquecen después usando FACS. Esta población de células después se recultiva y se somete a rondas posteriores de selección usando niveles de rigurosidad aumentados para aislar un subconjunto más pequeño de clones que reconocen la diana con una mayor especificidad y afinidad. Las bibliotecas se manejan fácilmente para formatos a alto rendimiento usando, por ejemplo, anticuerpos marcados con FITC anti marcadores Myc y análisis FACS para una rápida identificación y confirmación.

Después los clones candidatos se aíslan y se realizan preparaciones plasmídicas para obtener información de secuencia scFv. La estrategia permite una sustitución lógica dirigida por la hipótesis de codones necesaria para determinar y optimizar la funcionalidad de aminoácidos en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las regiones VH y VL del anticuerpo. El análisis de secuencia comparativo y perfiles de afinidad/especificidad de clones individuales determinan después qué clones se someten a maduración por afinidad.

A. Expresión superficial de APex scFv

El objetivo esencial en el procedimiento de exploración fue para que cada célula bacteriana expresase una cepa huésped de la proteína de fusión scFV E. coli DH12S™ (Invitrogen™) transformada con las construcciones de scFv pAPEx1 o pAK200. Las células transformadas se inocularon en Caldo Terrific complementado con glucosa al 2% y ampicilina a 50 )g/ml y se dejó cultivar hasta una DO800 de 0,1. Después de la inducción, la membrana externa celular se permeabilizó. Resumiendo, las células (equivalente a ≈ 1 ml de 20 DO600) se sedimentaron y resuspendieron en 350 )l de solución enfriada con hielo de sacarosa 0,75 M/Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0/lisozima de huevo de gallina 100 )g/ml. Después, se añadieron 700 )l de EDTA 1 mM enfriado con hielo suavemente y la suspensión celular se dejó en hielo durante 10 minutos; después se añadieron 50 )l de MgCl2 0,5 M y la mezcla se dejó en hielo durante 10 minutos más.

Las células resultantes se sedimentaron suavemente y se resuspendieron en PBS 1x a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de la evaluación por FACS. Después las células se analizaron en ARIA/FACSscan (Becton Dickinson) usando el programa informático CellQuest siguiendo las instrucciones del fabricante. La expresión periplásmica de scFv puede determinarse por la adición de anticuerpo anti-ficoeritrina scFv anti-humano o también mediante tinción para las etiquetas Myc o HA (todas de PharMingen, San Diego, Calif.).

Después de que se confirmó la expresión periplásmica de scFv en las células de la biblioteca APEx, la siguiente tarea fue verificar que las construcciones scFv eran capaces de unirse a su antígeno diana. La unión al antígeno funcional es esencial para la FACS posterior de clones de cohorte. Para investigar, las células E. coli que

expresaban el scFv natural original se recogió como se ha indicado anteriormente y se incubó con proteína marcada fluorescentemente FITC o ficoeritrina o biotina. Las variantes de cohorte funcionales y naturales se unen a la proteína marcada y producen lecturas de mayor fluorescencia en comparación con células de control vectoriales. Los siguientes protocolos describen los procedimientos usados para el marcaje con biotina de proteínas VEGF, aunque también puede conseguirse la conjugación con FITC o con ficoeritrina directa.

B. Expresión y presentación de una biblioteca de anticuerpos scFv cohorte

En este ejemplo, se describen procedimientos para expresar y mostrar una biblioteca de anticuerpos cohorte explorando contra antígenos diana. La biblioteca scFv se transfectó en los huéspedes bacterianos receptores usando técnicas convencionales. En resumen, se usó un sistema de presentación y expresión bacteriana que se había demostrado que era fiable para la expresión de moléculas scFv a partir de bibliotecas. El scFv se unió a péptidos de engarce pequeños derivados de la lipoproteína NlpA o la proteína de cubierta del gen tres del fago (Gen III) de M13 en cada uno de los extremos N o C respectivamente, para exportar y presentar en el espacio periplásmico bacteriano (Figura 33). Las bacterias E. coli están rodeadas por dos membranas, una interna y una externa con el espacio periplásmico entre ellas. En APEx, las proteínas scFv están en contacto con la membrana interna mediante la lipoproteína NlpA o el Gen III y después la membrana externa se disuelve químicamente por tratamiento con lisozima EDTA para permitir el acceso a las dianas marcadas con fluorescencia.

Los miembros de la biblioteca cohorte que expresan clones scFv que se unen más eficazmente a los antígenos marcados se enriquecieron después mediante FACS. Los antígenos diana se marcaron directa o indirectamente mediante un engarce biotina-estreptavidina con un anticuerpo secundario. El ADN plasmídico scFv se recuperó usando un protocolo miniprep de lisis alcalina convencional (referencia a Sambrook y col., secciones 1.25-1.28), retransformado y después recultivado y sometido a posteriores rondas de selección usando niveles aumentados de rigurosidad para aislar un subconjunto más pequeño de clones que reconocen la diana con una mayor especificidad y afinidad. Después un análisis de secuencia comparativa y perfiles de afinidad/especificidad de clones individuales determinó qué clones se sometieron a maduración por afinidad (véase Ejemplo 23).

C. Producción y purificación de proteínas de unión scFv: marcaje con biotina VEGF

La proteína VEGF bioactiva se encuentra disponible en el mercado en una forma purificada ((R and D System, San Diego, CA). La biotinilación de la proteína VEGF puede conseguirse de diversas maneras; sin embargo, la suprabiotinilación no es deseable ya que puede bloquear el sitio de interacción epítopo-anticuerpo. El protocolo usado se adaptó a partir del Kit de Marcaje Biotina-XX de Molecular Probes FluoReporter (cat Nº F-2610). En resumen, se añadió VEGF a una concentración de reserva a tampón con bicarbonato sódico 1 M y solución Biotina-XX (solución a concentración de reserva de Biotina-XX en DMSO). La mezcla se incubó durante 1 hora a 25 ºC. La solución se transfirió a un tubo de filtro de centrífuga micrométrico, se centrifugó y se lavó repetidamente (cuatro veces) con solución PBS. La solución de VEGF biotinilada se recogió, se purificó sobre una columna Sephadex G-25 y la concentración de proteína se determinó mediante DO 280.

D. Marcaje con FITC de VEGF

A un vial de reactivo FITC, se añadieron 850 ml de disolvente (Calbiochem, San Diego, CA) y se mezclaron cuidadosamente, mediante lo cual el reactivo disolvente FITC resultante tenía una concentración de 1 mg/ml. La mezcla de FITC (500 )l) se añadió después a 2,5 mg de solución de proteína VEGF (2 mg/ml) y se agitó vorticialmente de manera inmediata. Esta mezcla de reacción proporcionó una proporción de conjugación de 200 )g de FITC con respecto a 1 mg de anticuerpo/proteína. El VEGF-FITC se mezcló por rotación durante 2 horas a temperatura ambiente en un envase hermético con papel de aluminio para bloquear la luz ambiental, agitando al mismo tiempo. El concentrado de tampón PBS se diluyó en agua destilada y el conjugado VEGF-FITC se transfirió después a un tubo de diálisis y se dializó durante una noche a temperatura ambiente. El VEGF-FITC se retiró después del tubo de diálisis y se volvió a determinar la concentración de proteína.

E. Clasificación ARIA-FACS y recuperación de células de la biblioteca de variante scFv

La siguiente metodología implica exploración FACS de bibliotecas scFv para enriquecimiento y aislamiento de variantes de afinidad de unión de cohorte. Después de cultivar en medio de cultivo, las células E. coli permeabilizadas anteriores se incubaron con VEGF biotinilado a concentraciones saturantes (200 ng/ml) durante 3 horas a 37 ºC con una suave rotación. Después, las células E. coli se lavaron dos veces con tampón para eliminar el VEGF biotinilado no unido. Después las células se clasificaron en ARIA (Becton Dickinson) usando software CellQuest siguiendo las instrucciones del fabricante.

La entrada de clasificación podría ajustarse para recoger esta fracción de población cohorte. Para potenciar la afinidad de VEGF, la entrada se ajusta para señales de fluorescencia más elevada. Ahora se ha demostrado que la selección FACS se enriquece, en más del 80%, para una subpoblación de mayor afinidad en un sistema de ensayo con otras líneas celulares y proteínas de unión asociadas (Figura 38).

F. Recuperación y expresión de scFv cohorte

La E. coli capturada después de la primera clasificación se reclasificó inmediatamente a través de un citómetro de flujo. Posteriormente, los genes scFv en la suspensión celular clasificada se reclasificaron, recuperaron y retransformaron a 37 ºC. Los genes scFv mutantes se reclonaron después en el vector pAPEx1, se retransformaron en las células y se cultivaron durante una noche en placas de agar a 30 ºC. Los clones resultantes se sometieron a una segunda ronda de clasificación más reclasificación como se ha descrito anteriormente. La Segunda/Tercera clasificación de los genes scFv se subclonaron después en el plásmido de expresión (pBAD) para la producción de la proteína scFv soluble.

G. Análisis BIAcore

Para evaluar la unión de scFv funcional y calibrar las afinidades preliminares (KD=kd/ke = koff/kon), se emplea el análisis del sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore -2000 (BIAcore, Inc. Piscatawy, NJ). El ligando, por ejemplo, scFv anti-VEGF Avastin A4.6.1 de ratón, se inmoviliza sobre la superficie de la microplaca biodetectora BIAcore por acoplamiento covalente usando clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbo-diimida (EDC) Nhidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIAcore, Inc). Como agente bloqueante se inyectó una solución de etanolamina.

Para el análisis de flujo, la diana del ligando, por ejemplo VEGF, se diluye en tampón de desarrollo BIAcore (solución salina tamponada con Hepes 20 mM pH 7,0) en tres alícuotas de igual concentración por ejemplo 0,010 )M. Las alícuotas de la diana, por ejemplo, VEGF, se inyectan a un caudal de, por ejemplo 2 )l/minuto para mediciones cinéticas. La disociación puede observarse en el tampón de desarrollo sin agentes de disociación. Los parámetros cinéticos de las reacciones de unión se determinan después usando, por ejemplo, el programa informático de BIAevaluation 2.1.

H. Expresión de pBAD en E. coli

Se prepararon células huésped E. coli competentes siguiendo las instrucciones del fabricante (sistema de expresión pBAD de Invitrogen). En resumen, se incubaron 40 )l de células competentes LMG 194 y 0,5 )l de construcción scFv pBAD (aproximadamente 1 )g del ADN) juntas en hielo durante 15 minutos, después de los cuales se aplicó un minuto de choque térmico a 42 ºC. Después las células se dejaron recuperar durante 10 minutos a 37 ºC en medio SOC antes de la siembra en placas de LB-Ampicilina y un cultivo de 37 ºC durante una noche. Se recogieron colonias sencillas al día siguiente para cultivos líquidos a pequeña escala para determinar inicialmente las concentraciones de inducción de L-arabinosa óptimas para la producción de scFv. Se indujeron ensayos de copias de cada clon después de alcanzar una DO600= 0,5 con titulaciones en serie (1:10) de L-arabinosa (0,2% a 0,00002% de concentración final) después de un cultivo durante una noche a temperatura ambiente. Los cultivos de ensayo (1 ml) se recogieron, se sedimentaron y se añadieron 100 )l de tampón BBS 1x (NaCl 10 mM, 160 mM, ácido bórico 200 mM, pH=8,0) para resuspender las células antes de la adición de 50 )l de solución de Lisozima durante 1 hora (37 ºC). Los sobrenadantes celulares de las digestiones con lisozima se recogieron después de centrifugación y se añadió MgSO4 a una concentración final de 40 mM. Esta solución se aplicó a columnas Ni-NTA preequilibradas con PBS. Las muestras scFv unidas marcadas con His se lavaron dos veces con tampón PBS después de lo cual se realizó la elución con la adición de Imidazol 250 mM PBS. La expresión de scFv soluble se examinó después mediante SDS-PAGE.

I. Purificación de scFv a partir de cultivo de E. coli a gran escala:

Después de la determinación de las condiciones de crecimiento óptimas, se recogieron sedimentos de cultivo de células E. coli completas gran escala (volumen) por centrifugación después de un cultivo de una noche a 25 ºC. Después los sedimentos se resuspendieron en tampón PBS (Tween al 0,1%) y se sometieron a 5 rondas de ultrasonidos repetidas (Virtis Ultrasonic cell Disrupter) para lisar la membrana celular bacteriana y liberar el contenido citoplásmico. Primero la suspensión se aclaró mediante centrifugación a alta velocidad para recoger el sobrenadante para procesamiento posterior. Este sobrenadante se aplicó a columnas Ni-NTA preequilibradas con PBS. Las muestras de scFv unidas marcadas con His se lavaron dos veces con tampón PBS después de lo cual se realizó la elución con la adición de imidazol 250 mM. El pH del sobrenadante se ajustó después a 5,5 con HCl 6 M y antes de cargar sobre una columna de intercambio catiónico Sepharose HP SP (Pharmacia). El scFv se eluyó en un gradiente salino (NaCl) y las concentraciones de fracción que contenían el scFv se determinaron por densidad óptica: a 280 nm y se verificaron por PAGE. Las fracciones que contenían scFv se agruparon después y se analizaron con PBS.

J. Análisis BIAcore de la unión de la proteína VEGF a scFv Avastin A4.6.1 de ratón

Para evaluar la unión scFv funcional y calibrar las afinidades preliminares (KD=kd/ke = koff/kon), se empleó el análisis de sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore-2000 (BIAcore, Inc. Piscatawy, NJ). El ligando, scFv anti-VEFG Avastin A4.6.1 de ratón se inmovilizó sobre la superficie de la microplaca biodetectora BIAcore mediante acoplamiento covalente usando clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbo-diimida (EDC) y Nhidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIAcore, Inc). Como un agente bloqueante

se inyectó una solución de etanolamina.

Para el análisis de flujo, el VEGF se diluyó en tampón de desarrollo BIAcore (solución salina tamponada con Hepes 20 mM pH 7,0) en tres alícuotas de concentración 0,010 )M. Las alícuotas de VEGF se inyectaron a un caudal de 2 )l/minuto para las mediciones cinéticas. La disociación se observó en tampón de desarrollo sin agentes de disociación. Los parámetros cinéticos de las reacciones de unión se determinaron después usando el programa informático BIAevaluation 2.1.

La Figura 39 presenta los resultados de BIAcore para la unión VEGF al scFv anti-VEFG A4.6.1. Fue evidente a partir de estas representaciones que el VEFG reconstituido se unió al scFv anti-VEGF A4.6.1 inmovilizado, como se indica mediante el aumento de UR (Kon) en comparación con el control negativo de la proteína desnaturalizada por calor. Adicionalmente, el aumento de UR fue proporcionado con respecto a la concentración aplicada de proteína scFv anti-VEGF A4.6.1. Los perfiles BIAcore también presentaron perfiles de disociación esperados para VEGF.

Ejemplo 23

Procedimientos para realizar la maduración por afinidad de alto rendimiento de candidatos a partir de una biblioteca de anticuerpos universal de referencia

Esta sección describe etapas ejemplares para identificación y mejora posterior de una secuencia candidata a partir de una biblioteca de anticuerpos cohorte usando maduración por afinidad a través de mutagénesis Look Through (LTM) y/o usando WTM. La Mutagénesis Look Through (WTM) se describió previamente en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/877.467 (publicada como documento US20050136428).

En resumen, para validar el poder de la biblioteca universal de anticuerpos y la capacidad de tomar una molécula de anticuerpo candidata y refinar las propiedades de unión de la molécula, se diseñó un anticuerpo disponible en el mercado como un anticuerpo de ensayo y mutagenizado (usando por ejemplo tecnología WTM∃/LTM∃), expresado, presentado y mejorado de acuerdo con los procedimientos de la invención. Una ilustración de la mejora de las propiedades de unión de un anticuerpo de referencia de ensayo candidato usando tecnología LTM se desvela en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 60/586.487.

El anticuerpo de ensayo se mutagenizó en un formato scFv y después se expresó y mostró usando presentación de levaduras aunque también puede usarse cualquiera de los sistemas de presentación de bacterias anteriormente mencionados. La selección cinética de las bibliotecas de presentación en levaduras de scFv implica un marcaje inicial de células con antígeno biotinilado seguido de una clase dependiente del tiempo en presencia de un exceso grande de antígeno no biotinilado. Los clones con menores cinéticas de disociación se identificaron mediante marcaje con SA-PE después del periodo de búsqueda y se clasificó usando un clasificador FACS a alta velocidad. Las representaciones puntuales de la entrada de control natural y clasificación, la biblioteca y la cantidad de clones en la entrada de clasificación, y se generaron los clones aislados a partir de la post-clasificación de la biblioteca (Figura 38).

Los datos de secuencia presentados en tablas a partir de un análisis LTM con anticuerpo de ensayo indicaron una colección diversa de 29 mutaciones individuales que aumentaron la afinidad de la molécula precursora en 1,5 veces

o más. Se descubrió que estas mutaciones se producían en las seis CDR del anticuerpo de ensayo. Se aislaron diversos de estos cambios múltiples veces, por ejemplo en CDR3, se encontraron tres cambios S a K individuales y dos cambios S a Q. A diferencia, nunca se descubrió que los cambios en algunas posiciones CDR aumentaban la afinidad para el antígeno. La siguiente etapa implicó la combinación de todas las mutaciones simples LTM descubiertas en una sola biblioteca posterior. Después de esta etapa, los clones scFv fueron después capaces de incorporar más de una mutación LTM por CDR. Además de la incorporación de mutaciones múltiples en una CDR, estos clones scFv también se diseñaron para que tuviesen más de una CDR mutagenizada en cada scFv. Esta combinación de mutaciones LTM distintas sencillas en una sola secuencia lineal se denominó análisis “de mutación beneficiosa combinatoria” (CBM). Este procedimiento se detalló en la Solicitud de Patente de Estados Unidos relacionada Nº 60/585.918. La combinación de todas las mutaciones sencillas LTM descubiertas en una biblioteca facilitó el aislamiento de clones que presentaban una avidez mejorada entre estas mutaciones de alta afinidad.

La exploración de la expresión de esta biblioteca CBM facilitó adicionalmente el aislamiento de clones que presentaban una avidez mejorada a través de interacciones sinérgicas entre estas mutaciones de alta afinidad. La Figura 36 muestra clones candidatos ejemplares recuperados de análisis CBM. Además, la Figura 37 presenta resultados de scFv BIAcore a partir de scFv natural de referencia y seis clones Koff potenciados por afinidad. Estos datos se ajustaron a una sola curva exponencial para determinar las constantes de la velocidad de disociación (koff). Fue obvio a partir de estas gráficas que el scFv natural de referencia, cuando se comparaba con los seis clones, presentaba una pendiente decreciente notablemente más aguda, indicativa de una Koff más rápida.

Las técnicas descritas anteriormente de maduración por afinidad pueden aplicarse fácilmente a las bibliotecas cohorte seleccionadas descritas en el presente documento.

Ejemplo 24

Procedimientos para generar perfiles de variabilidad posicional (VP) para CDR de anticuerpo usando bioinformática

Este ejemplo describe la determinación de los Perfiles de Variabilidad Posicional (VP) para las CDR de anticuerpos expresados in vivo. Los Perfiles de Variabilidad Posicional representan el catálogo de los diferentes aminoácidos y sus respectivas velocidades de aparición (frecuencia de población) presentes en una posición particular en un conjunto de datos de secuencias alineadas de anticuerpos que se expresan naturalmente. (Véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 60/585.931 (PCT/US2005/024002). El propósito principal para generar el perfil de variabilidad de CDR UAL fue ajustar mejor las secuencias marco conservadas con estructuras canónicas CDR y sus secuencias variables en su interior para obtener las configuraciones más estables y funcionales.

Por lo tanto, la determinación de VP conlleva dos etapas, por ejemplo ETAPA 1): recogida y selección de (un conjunto de datos de) secuencias de aminoácidos alineadas que comparten una o más propiedades definidas de interés para crear un conjunto de datos. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 alineadas individualmente de bien VH

o bien VL formaron los conjuntos de datos iniciales para propósitos típicos. En la ETAPA2, se dispone de diversos enfoques en la derivación de conjuntos de datos CDR con resultados VP correspondientes. Típicamente, para realizar la ETAPA 2, los conjuntos de datos (CDR) se enumeraron con respecto a variabilidad de aminoácidos y sus frecuencias relativas para cada posición alineada (Figura 4). La VP para cada conjunto de datos de CDR identificó después las características deseadas de una posición CDR determinada para introducción posterior de representación de diversidad.

Para realizar la ETAPA 1, se ensambló una base de datos UAL de secuencias alineadas. El conjunto de datos de entrada de partida podría derivar de una recopilación previa de secuencias previamente caracterizadas y agrupadas tales como la base de datos de Kabat de anticuerpos maduros endógenamente expresados. A partir de la base de datos de Kabat, la inmunoglobulina humana y, en particular, las secuencias VH se recogieron selectivamente para el conjunto de datos de base de partida. Típicamente, el origen de la línea germinal de la raíz para cada secuencia VH humana reordenada se determinó por análisis de secuencia comparativo. De esta manera, por ejemplo, el anticuerpo expresado se atribuyó (ETAPA 1: selección de cadena) a cualquiera de las familias VH1, VH2, VH3, VH4, o VH6. La fundación de la línea germinal específica correspondiente se denominó “subfamilia de origen” (ETAPA 1 de la Figura 4). Las CDR adicionales en las secuencias VH usando los parámetros expuestos por la definición por contacto dentro de este “conjunto de datos base” de partida podrían después identificarse y delinearse. La designación de las CDR y los aminoácidos que las comprenden también puede describirse por Kabat, Chothia o cualquier otra definición adecuada (ETAPA 2 en la Figura 4).

Dentro del “conjunto de datos de bases” de la secuencia VH humana de partida, las secuencias VH recopiladas aún posiblemente poseían varias características diferentes. Las secuencias marco conservadas VH tienden a variar en los siguientes aspectos: 1-agrupaciones de una familia (VH1, VH2, VH3, VH4, etc.). 2-“subfamilias de origen” (por ejemplo, VH3 3-07, 3-11, 3-23, 3-30), 3-longitudes de CDR, 4-clases de estructura canónica CDR, 5-especificidad antigénica entre otras. Debido a la disparidad de secuencia entre los miembros “del conjunto de datos de bases” el procedimiento de derivar un análisis coherente puede requerir una selección adicional a partir del “conjunto de datos de bases de partida” de tal manera que los conjuntos de datos que comparten una o más propiedades seleccionadas de interés puede identificarse. Los miembros constituyentes comparten aquellas propiedades respectivas que producen un conjunto más estandarizado de secuencias para un análisis comparativo significativo dentro del subgrupo. Este procedimiento puede repetirse, dando como resultado la generación de conjuntos de datos más pequeños de mayor grado de relación y como tal se ilustra en la Figura 40. La Figura 41 presenta diagramas de procedimientos similares empleados para derivar la base de datos de CDR3 para VH y VL.

Las CDR pueden clasificarse de la siguiente manera. Empezando con el “conjunto de datos de base” no redundante de todas las secuencias VH humanas, solamente las secuencias que generan secuencias VH1 se seleccionaron después (Figura 40). La secuencia de anticuerpos duplicada eliminada por filtro no redundante se depositó de nuevo en el mismo antígeno. Si había diferentes anticuerpos suscitados contra el mismo antígeno, estas secuencias se conservaban en la base de datos. Dentro de las secuencias CDR1 y CDR2 de subgrupo VH1, se identificaron y después se dividieron adicionalmente como subgrupos CDR1 o CDR2. Debe observarse que en la división de CDR1 dentro de las familias VH, los subgrupos CDR1 o CDR2 podrían aún estar poblados con CDR de diferentes longitudes. La CDR2 VH1 se produjo tanto en longitudes de 13 como de 15 aminoácidos. Para CDR1 y CDR2, se seleccionaron longitudes de 6 y 13 aminoácidos, respectivamente, y los conjuntos de datos generados se denominaron por consiguiente respectivamente VH-1_CDR1_6 y VH-1_CDR2_13.

Cuando eran necesarios conjuntos de datos de UAL aún más rigurosos, el agrupamiento podría realizarse basándose en las estructuras canónicas. Por ejemplo, dentro de las secuencias CDR2 VH1, se realizó otro subgrupo de división para filtrar entre aquellos que eran de estructura canónica 2 (CS2) o estructura canónica (CS3). Las estructuras canónicas pueden definirse diferenciando restos de firma en posiciones clave en la región marco conservada. Por ejemplo, las secuencias CDR2 VH1 que incorporan un V, A, L o T en la posición de aminoácido 71 indican estructura canónica 2, mientras que una R en la misma posición de aminoácidos significa una estructura canónica 3. Estas operaciones generaron conjuntos de datos de perfil de variabilidad denominados, respectivamente, VH-1_CDR2_13_CS2 y VH-1_CDR2_13_CS3 (Figura 61). Del mismo modo, la CDR1 VH1 fue de clase canónica 1 (CS1) con las necesidades de longitud de seis restos de aminoácidos. En este caso, las firmas de aminoácido clave diferenciadas CS1 CDR1 incluyen, por ejemplo, una T, A, V, G o S en la posición 24; una G en la posición de aminoácido 26; y bien I, F, L, V o S en la posición 29. Por lo tanto, es posible que el conjunto de datos VH-1_CDR1_6 pueda contener secuencias que no pertenezcan a CS1, ya que algunas variantes de CDR de seis aminoácidos que no tienen el requisito de secuencias firmas. Una vez explorado, un perfil de variabilidad para clase 1 canónica CDR1 VH1 (CS1) se generó después como VH-1_CDR1_6_CS1 (Figura 60).

Los resultados anteriores demostraron que dependiendo de las estructuras canónicas tanto CDR1 como CDR2 seleccionadas para el uso como aceptores, el uso de aminoácidos debe “ajustarse”. Dicho ajuste dependería de qué aminoácidos se introdujesen en las diversas posiciones de aminoácidos CDR2 para los fines de replicación de la diversidad natural empleada de la biblioteca de referencia emparejando secuencias más probablemente encontradas con clases particulares de antígenos. La clasificación antigénica de CDR se realizó de la siguiente manera. Una vez agrupadas basándose en clasificaciones estructurales, los miembros de la secuencia CDR recogidos también pueden subclasificarse basándose en la especificad antigénica (Figura 40). Una correlación de aminoácidos preferidos dentro de las CDR para una clase de antígeno determinada puede existir, similar a la observada para la preferencia de clase antigénica para determinadas regiones marco conservadas. Por tanto, un parámetro adicional, especificidad de antígeno, puede añadirse durante la división de secuencias CDR para generar perfiles de variabilidad específicos de antígeno.

La ventaja importante de este procedimiento es que eran posibles muchas vías diferentes de “selección” o “recogida” y cada una generaba un conjunto de datos diferente y por tanto un perfil de variabilidad (VP) diferente. Esto se ilustró cuando los perfiles de variabilidad para CDR1 se compararon entre los conjuntos de datos individuales VH1, VH3 y VH4 (Figura 45). Las tablas bajo cada gráfico de barra enumera la sustitución de humanización disponible de aminoácidos basándose en el parámetro “80 por ciento” descrito anteriormente. En general las VP fueron algo similares, ya que la “Y” se “fijó” en la posición 30 para las subfamilias VH1, VH3 y VH4. Sin embargo se observaron diferencias. En VH3, una “S” puede fijarse en la posición 30 mientras que para VH1 y VH4, la VP indicó que “T y S” podían sustituirse en la posición 30. Otros ejemplos de diferentes VP se produjeron en la posición 34. En VH4, una “W” se fijó, mientras que en la VH3 se fijó una “M”. Por otro lado, en VH1, la “I y M” estaba disponible para el diseño de CDR cohorte.

Ya que estas VP CDR1 diferían entre las subfamilias VH, el diseño de biblioteca cohorte puede variar dependiendo de qué región marco conservada VH se selecciona. Por ejemplo, si el anticuerpo diana de aminoácidos de CDR1 en la posición 33 no coincide con ninguno de los aminoácidos enumerados de VH1, VH3 o VH4 entonces sus respectivas VP se sustituyen. Por tanto, en injertos CDR1 de anticuerpo diana en VH1, los aminoácidos A, Y, G y D se seleccionaron para la incorporación en la posición 33. En injertos CDR1 con respecto a regiones marco conservadas VH3, el VP determinó que también debían usarse A, G, W e Y. Del mismo modo, en injertos CDR1 con respecto a regiones marco conservadas VH4, la VP determinó que Y, F y S deben sustituirse en la posición 33.

La Figura 44 muestra las diversas VP disponibles para la generación de bibliotecas de anticuerpo cohorte. En esta realización de la invención, las respectivas VP no estaban previamente filtradas basándose en estructura canónica para recoger una colección más grande de aminoácidos disponibles en la VP resultante. Por ejemplo, en la estructura canónica 2 en la posición 53 de la CDR2 VH-1, los aminoácidos I, Y, M, S, L y E se identificaron para VH1_CDR2_13_CS2 VP (Figura 61). En la estructura canónica 3 en la misma posición 53, la VP de la VH1_CDR2_13_CS3 en su lugar tenía N, G, S y K. Por lo tanto, la VP de VH-1_CDR2_13 sin las divisiones de estructura canónica debería tener I, Y, M, S, E, N, G y K disponible (panel superior de la Figura 46). El aminoácido “L” no formaba parte de la colección VP, ya que la frecuencia de aparición de los primer siete aminoácidos había alcanzado el umbral del “80%”. Por lo tanto este conjunto extra podría actuar para aumentar la diversidad de la biblioteca cohorte en la posición 53 (y, por tanto, la CDR resultante) en nueve veces donde se seleccionaron criterios de “identidad”.

Por otro lado, cuando se usaron criterios de “similitud”, la diversidad de la biblioteca cohorte se redujo, ya que era más probable que se encontrara que un aminoácido sustituible que también pertenecía a los grupos predeterminados (por ejemplo alifático, polar, etc.). Por tanto, la base de datos de la Figura 46 ilustra las diferencias de las secuencias VP entre VH1, VH3 y VH4 para la longitud 13 de la CDR2. Otra realización de la invención usada para recoger un perfil VP incluso más amplio fue derivar una CDR2 VH general. La idea básica fue impedir la predivisión basándose en las diversas subfamilias VH1, VH3, VH4 y otras subfamilias y en su lugar simplemente ensamblar todas las secuencias CDR2 VH de longitud 13 para la enumeración. La realización de blast de CDR con la VP de VH CDR2_13 después obvió la necesidad de realizar diseños de cruzamiento CDR2 de las diversas bibliotecas cohorte VH1, VH3 y VH4 ya que podrían generarse casi todas las posibles combinaciones en una biblioteca cohorte más grande.

Esta idea de un ensamblaje VP general fue lo que ocurrió en CDR3 VH, en el que las secuencias CDR3 expresadas eventualmente no pudieron asignarse específicamente para originar subfamilias. Las Figuras 47 -52 demuestran las VP de las CDR3 de VH de tamaños de longitud de 10 a 20.

También se realizó el mismos análisis con respecto a VL kappa y lambda. En la Figura 53, se ilustra la diferencia en las VP de la CDR1 de longitud 7 entre Vk1 y Vk3. La Figura 54 ilustra las VP de longitud 10 de CDR2 entre Vk1 y Vk3. Para la Figura 55, las VP de longitud 9 de CDR3 derivaban de Vkappa y Vlambda. Las Figuras 56 y 57 también demuestran la mayor amplitud de las VP Vlambda de CDR3 de longitud 8, 10 y 11 derivadas de la base de datos

5 UAL.

LISTADO DE SECUENCIAS

lt;110gt; BIOREN, INC.

10 lt;120gt; ULTRAHUMANIZACIÓN DE ANTICUERPOS POR GENERACIÓN Y SELECCIÓN DE BIBLIOTECAS COHORTE Y BLAST DE CDR MADURAS PREVISTAS

lt;130gt; PC33159

15 lt;140gt;

lt;141gt;

lt;150gt; 60/736.726

lt;151gt;

20 lt;160gt; 641

lt;170gt; PatentIn versión 3.3

lt;210gt; 1 25 lt;211gt; 96

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt; 30 lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 1

lt;210gt; 2

lt;211gt; 96

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial 40

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 2

5 lt;210gt; 3

lt;211gt; 96

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

10 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 3

lt;210gt; 4

lt;211gt; 96 20 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético 25

lt;400gt; 4

5 lt;210gt; 5

lt;211gt; 96

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

10 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 5

lt;210gt; 6

lt;211gt; 88

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético lt;400gt; 6

5 lt;210gt; 7

lt;211gt; 89

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

10 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 7

lt;210gt; 8

lt;211gt; 88

lt;212gt; PRT 20 lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético lt;400gt; 8

5 lt;210gt; 9

lt;211gt; 89

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

10 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 9

lt;210gt; 10

lt;211gt; 90

lt;212gt;: PRT 20 lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 10

lt;210gt; 11

lt;211gt; 87

lt;212gt;: PRT 10 lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

15 lt;400gt; 11

lt;210gt;: 12 20 lt;211gt; 87

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético

lt;400gt; 12

lt;210gt;: 13 10 lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus ,

lt;400gt; 13

20 lt;210gt; 14

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

25 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 14

lt;210gt; 15

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial 35

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;: 40 lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser o Asn

lt;400gt; 15

lt;210gt; 16

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 16

lt;210gt; 17

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Phe, Ser, Asn o Gly

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Thr, Asn, Gly, Ser o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 17

lt;210gt; 18

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asp, Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES 222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr, Lys o Ile

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Tyr, Asn, Phe o His

lt;400gt; 18

lt;210gt; 19

lt;211gt; 15

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 19

lt;210gt; 20

lt;211gt; 15

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(33)

lt;223gt; Gly, Asp, Glu, Arg, Ala, His, Val o Thr

lt;400gt; 20

lt;210gt; 21

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 21

lt;210gt; 22

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 22

lt;210gt; 23

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 23

lt;210gt; 24

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Leu o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala, Asp, Lys, Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 24

lt;210gt; 25

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;400gt; 25

lt;210gt; 26

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 26

lt;210gt; 27

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Tyr, Thr, Ser, Leu, Trp o Phe

lt;400gt; 27

lt;210gt; 28

lt;211gt; 114

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 28

lt;210gt; 29

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 29

lt;210gt; 30

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 30

lt;210gt; 31

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 31

lt;210gt; 32

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Tyr, Ser, Asn o Gly

lt;400gt; 32

lt;210gt; 33

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser, Arg, Gly, Asn o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Tyr, Ser, Asn o Gly

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ala o Asn

lt;400gt; 33

lt;210gt; 34

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser, Gly o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Tyr, Ser, Asn o Gly

lt;400gt; 34

lt;210gt; 35

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Tyr, Ser, Asn o Gly

lt;400gt; 35

lt;210gt; 36

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Tyr, Ser, Asn o Gly

lt;400gt; 36

lt;210gt; 37

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala, Asp, Lys, Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ile, Ser, Thr o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 37

lt;210gt; 38

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ala o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser, Thr o Asn

lt;400gt; 38

lt;210gt; 39

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ser, Asp, Tyr, Asn o Gly

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Asp, Gly, Thr, Asn o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Pro, Leu, Arg, Ser o Thr

lt;400gt; 39

lt;210gt; 40

lt;211gt; 107

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 40

lt;210gt; 41

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 41

lt;210gt; 42

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 42

lt;210gt; 43

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 43

lt;210gt; 44

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser, Gly o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Asn o Thr

lt;400gt; 44

lt;210gt; 45

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;400gt; 45

lt;210gt; 46

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Asp, Gly, Thr, Asn o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Tyr, Thr, Ser o Trp

lt;400gt; 46

lt;210gt; 47

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 47

lt;210gt; 48

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Asn, Asp o Thr

lt;400gt; 48

lt;210gt; 49

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 49

lt;210gt; 50

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Gly, Asp o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ala, Tyr, Gly o Asp

lt;400gt; 50

lt;210gt; 51

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 51

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;220gt;

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;221gt; MOD_RES

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;221gt; MOD_RES

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lt;400gt; 52

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

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lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;221gt; MOD_RES

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;222gt; (3)..(3)

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Homo sapiens

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lt;211gt; 8

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;400gt; 63

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Gly, Asn o Asp

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;223gt; Trp, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

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lt;221gt; MOD_RES

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

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lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

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lt;211gt; 10

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 74

lt;210gt; 75

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT’

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

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lt;221gt; MOD_RES

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lt;221gt; MOD_RES

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lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 80

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;211gt; 10

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

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lt;213gt; Homo sapiens

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lt;211gt; 8

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Homo sapiens

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

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lt;211gt; 13

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

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lt;220>: 5 lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

15 lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Tyr, Asn, Phe o His

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lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 100

lt;210gt; 101

lt;211gt; 19

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 101

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lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 102

lt;210gt; 103

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(2)

lt;223gt; Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser, Asn o Thr

lt;400gt; 103

lt;210gt; 104

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 104

lt;210gt; 105

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 105

lt;210gt; 106

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

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lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 107

lt;210gt; 108

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ser, Asn, Thr, His, Gln o Gly

lt;400gt; 108

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lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 109

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lt;211gt; 6

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

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lt;400gt; 110 lt;210gt; 111

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

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lt;213gt; Homo sapiens

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ile, Asn, Ser, Tyr, Gly o Met

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 113 lt;210gt; 114

lt;211gt; 13

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, Lys, Trp o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asp, Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Tyr, Asn, Phe o His

lt;400gt; 114

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lt;211gt; 12

lt;213gt;: PRT

lt;213gt;: Homo sapiens

lt;400gt; 115

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lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Gly, Asp, Glu, Arg, Val o Ala

lt;400gt; 116

lt;210gt; 117

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 117

lt;210gt; 118

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr, Trp, Asp o Ser

lt;400gt; 118

lt;210gt; 119

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Asn o Tyr

lt;400gt; 119

lt;210gt; 120

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 120

lt;210gt; 121

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ile, Ser, Thr o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 121

lt;210gt; 122

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser, Thr o Asn

lt;400gt; 122

lt;210gt; 123

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 123 lt;210gt; 124

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr, Ser, Ala, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

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lt;400gt; 124

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lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 125

lt;210gt; 126

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético ..

lt;400gt; 126

lt;210gt; 127

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ala, Tyr, Gly o Asp

lt;400gt; 127

lt;210gt; 128

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 128

lt;210gt; 129

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Trp, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, Ile o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Phe, Ser, Asn o Gly

lt;400gt; 129

lt;210gt; 130

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Phe o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser, Asp o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;400gt; 130

lt;210gt; 131

lt;211gt; 16

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 131

lt;210gt; 132

lt;211gt; 16

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Gly, Ser, Tyr, Ala, Thr, Asp, Arg, Phe o Trp

lt;400gt; 132

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lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 133

lt;210gt; 134

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala o Asn

lt;400gt; 134

lt;210gt; 135

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser, Gly o Asn

lt;400gt; 135

lt;210gt; 136

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 136

lt;210gt; 137

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 137

lt;210gt; 138

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 138

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lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 139

lt;210gt; 140

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Gln o Met

lt;400gt; 140

lt;210gt; 141

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

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lt;210gt; 142

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser o Asn lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;223gt;: (6)..(6)

lt;223gt;: Ser, His o Asn

lt;400gt; 142

lt;210gt; 143

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, His o Asn

lt;400gt; 143

lt;210gt; 144

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 144

lt;210gt; 145

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Trp, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 145

lt;210gt; 146

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Thr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;400gt; 146

lt;210gt; 147

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 147

lt;210gt; 148

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Asp o Gly

lt;400gt; 148

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lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 149

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lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 150

lt;210gt; 151

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 151

lt;210gt; 152

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 152

lt;210gt; 153

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala, Asp, Lys, Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 153 lt;210gt; 154

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;400gt; 154

lt;210gt; 155

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 155

lt;210gt; 156

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Tyr, Asn, Gly, Ser, Asp, Thr o Leu

lt;400gt; 156

lt;210gt; 157

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 157 lt;210gt; 158

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, His o Asn

lt;400gt; 158

lt;210gt; 159

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ala, Tyr, Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; His, Ser o Asn

lt;400gt; 159

lt;210gt; 160

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 160

lt;210gt; 161

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt; lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Trp, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asn, Ile o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 161

lt;210gt; 162

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, Lys, Trp o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asp, Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr, Lys o Ile

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Tyr, Asn, Phe o His

lt;400gt; 162 lt;210gt; 163

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 163

lt;210gt; 164

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Asp, Gly, Glu, Ala, Ser, Arg, Thr, Val o His

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Arg, Gly, Leu, Pro, Ser, Ala, Thr, Gln, His, Ile o Lys

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly, Tyr, Leu, Arg, Ile, Val, Ala, Pro, Ser, Asp Thr o Glu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Tyr, Gly, Asp, Ser, Thr, Phe, Ala, Pro, Glu, Leu o Arg

lt;400gt; 164

lt;210gt; 165

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 165

lt;210gt; 166

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser, Arg, Gly, Asn o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Asn, Ser, Thr o Lys

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr, Trp, Asp o Ser

lt;400gt; 166

lt;210gt; 167

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser, Gly o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Asn o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Asn o Tyr

lt;400gt; 167

lt;210gt; 168

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 168

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lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 169

lt;210gt; 170

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 170

lt;210gt; 171

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 171

lt;210gt; 172

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr, Ser, Ala, Gly o Arg

lt;400gt; 172

lt;210gt; 173

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 173

lt;210gt; 174

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr, Ala o Ser

lt;400gt; 174

lt;210gt; 175

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Thr o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Met o Ile

lt;400gt; 175

lt;210gt; 176

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 176

lt;210gt; 177

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asn, Ile o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ile, Asn, Ser, Tyr, Gly o Met

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;223gt;: (11).. (11)

lt;223gt;: Thr, Asn, Gly, Ser o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;400gt; 177

lt;210gt; 178

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, Lys, Trp o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt; lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asp, Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Thr, Asn, Phe o His

lt;400gt; 178

lt;210gt; 179

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 179

lt;210gt; 180

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Asp, Lys, Gly, Ile, Ala, Glu, Leu, Arg o Asn

lt;400gt; 180

lt;210gt; 181

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 181

lt;210gt; 182

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Thr, Trp, Asp o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala o Asn

lt;400gt; 182

lt;210gt; 183

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 183

lt;210gt; 184

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 184

lt;210gt; 185

lt;211gt; 10 lt;212 PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Leu o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala, Asp, Lys, Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 185

lt;210gt; 186

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;400gt; 186

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lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 187

lt;210gt; 188

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Gln o Met

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Tyr, Asn, Gly, Ser, Asp, Thr o Leu

lt;400gt; 188 lt;210gt; 189

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 189

lt;210gt; 190

lt;400gt; 190 000

lt;210gt; 191

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ala, Tyr, Gly o Asp

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lt;213gt; Mus musculus

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lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4).. (4)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Thr, Asn, Gly, Ser o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Lys, Asn, Ser o Gly

lt;400 193

lt;210gt; 194

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4).. (4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, Lys, Trp o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Tyr, Asn, Phe o His

lt;400gt; 194 lt;210gt; 195

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 195

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lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Pro, Ile, Leu, Val o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

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lt;400gt; 196

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lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

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lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 198

lt;210gt; 199

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;222gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Asn, Ser o Thr

lt;400gt; 199

lt;210gt; 200

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 200

lt;210gt; 201

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 201

lt;210gt; 202

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;400gt; 202

lt;210gt; 203

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 203

lt;210gt; 204

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr, Ser, Ala, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ser, Asn, Thr, His, Gln o Gly

lt;400gt; 204

lt;210gt; 205

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 205

lt;210gt; 206

lt;400gt; 206 000

lt;210gt; 207

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 207

lt;210gt; 208

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ala, Tyr, Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; His, Ser o Asn

lt;400gt; 208

lt;210gt; 209

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 209

lt;210gt; 210

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Trp, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Thr, Asn, Gly, Ser o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 210

lt;210gt; 211

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt; lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Lys, Ile o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Tyr, Asn, Phe o His

lt;400gt; 211

lt;210gt; 212

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 212

lt;210gt; 213

lt;211gt; 14

lt;213gt;: PRT

lt;213gt;: Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

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lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Val, Ile, Glu, Pro, Leu, Thr, Ala, Tyr, Ser o Gly

lt;220gt; lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Thr, Ala, Trp, Asp, Arg, Asn, Ser, Gly o Tyr

lt;400gt; 213

lt;210gt; 214

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 214

lt;210gt; 215

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser, Asn o Thr

lt;400gt; 215

lt;210gt; 216

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 216

lt;210gt; 217

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 217

lt;210gt; 218

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ala o Thr

lt;400gt; 218

lt;210gt; 219

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 219

lt;210gt; 220

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;320gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ser, Asn, Thr, His, Gln o Gly

lt;400gt; 220

lt;210gt; 221

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 221 lt;210gt; 222

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Asn, Asp o Thr

lt;400gt; 222

lt;210gt; 223

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Gly, Asn o Asp

lt;400gt; 223

lt;210gt; 224

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 224

lt;210gt; 225

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Phe, Ser, Asn o Gly

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Thr, Asn, Gly, Ser o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 225

lt;210gt; 226

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ser o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Gly, Tyr, Ser, Gln, Trp, Asn o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asp, Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr, Lys o Ile

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Tyr, Asn, Phe o His

lt;400gt; 226

lt;210gt; 227

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Homo sapiens

lt;400gt; 227

lt;210gt; 228

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;233gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 228

lt;210gt; 229

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 229

lt;210gt; 230

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5).. (5)

lt;223gt; Ala o Asn

lt;400gt; 230 lt;210gt; 231

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr o Asn

lt;400gt; 231

lt;210gt; 232

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 232

lt;210gt; 233

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Leu o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 233

lt;210gt; 234

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;400gt; 234

lt;210gt; 235

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 235

lt;210gt; 236

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr, Ser, Ala, Gly, Arg

lt;400gt; 236

lt;210gt; 237

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 237

lt;210gt; 238

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Tyr, Phe o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser o Thr

lt;400gt; 238 lt;210gt; 239

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Tyr, Phe o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, Thr o Asn

lt;400gt; 239

lt;210gt; 240

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 240

lt;210gt; 241

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Glu o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; His, Gln, Tyr o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser o Arg

lt;400gt; 241

lt;220gt; 242

lt;211gt; 12 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt;: Glu o Tyr 15

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asn, Tyr, Ser o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt;: His, Gln, Tyr o Asp 25

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser o Arg

lt;400gt; 242

lt;210gt; 243

lt;211gt; 20

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Mus musculus

lt;400gt; 243

lt;210gt; 244 45 lt;211gt; 20

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (20)..(20) , 55 lt;223gt; Asp o Gly

lt;400gt; 244 lt;210gt; 245

lt;211gt; 20 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt;: Tyr, Pro, Gly, Asp, Leu, Arg, Thr, His o Ser 15

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Ser, Gly, Asn, Asp, Glu, Val, Thr, Ala, Phe, Ile o Leu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt;: Tyr, Ser, Gly, Val, Thr, Asp, Pro, Trp, Ala o Cys 25

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (14)..(14)

lt;223gt; Thr, Gly, Arg, Ser, Ala, Asp. Glu, Phe o Ile

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (17)..(17) 35 lt;223gt; Tyr, Asp, Thr o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (20)..(20)

lt;223gt; Asp o Gly

lt;400gt; 245

lt;210gt; 246

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 246

lt;210gt; 247

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;400gt; 247

lt;210gt; 248

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asp, Ser o Asn

lt;400gt; 248

lt;210gt; 249

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 249

lt;210gt; 250

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Lys, Gln, Tyr o Glu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; His, Tyr, Ser o Cys

lt;400gt; 250

lt;210gt; 251

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Lys, Gln, Tyr o Glu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ala o Val

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; His, Tyr, Ser o Cys

lt;400gt; 251

lt;210gt; 252

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala, Asp, Lys, Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 252

lt;210gt; 253

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;400gt; 253

lt;210gt; 254

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial 220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Asp, Gln, Glu o Lys

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asp o Lys

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Lys, Asp, Glu o Asn

lt;400gt; 254

lt;210gt; 255

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Asp, Gln, Glu o Lys lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asp o Lys

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Lys, Asp, Glu o Asn

lt;400gt; 255

lt;210gt; 256

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 256

lt;210gt; 257

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Ala, Thr, Ile o Leu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Asp, Tyr, His o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6) .. (6)

lt;223gt; Ser, Gly, Asn o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Ile o Leu

lt;400gt; 257

lt;210gt; 258

lt;400gt; 258

210gt; 259 211gt; 6 212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Thr o Ser

lt;400gt; 259

lt;210gt; 260

lt;400gt; 260 000

lt;210gt; 261

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Gly o Ala

lt;400gt; 261

lt;210gt; 262

lt;400gt; 262 000

lt;210gt; 263

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;400gt; 263

lt;210gt; 264

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt; MOD_RES

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Trp, Gly o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asn, Ile o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ile, Asn, Ser, Tyr, Gly o Met

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Phe, Ser, Asn o Gly

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Thr, Asn, Gly, Ser o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 264

lt;210gt; 265

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asp, Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Glu o Asp

lt;400gt; 265

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lt;400gt; 266 000

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lt;400gt; 268 000

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lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Tyr o Trp

lt;400gt; 269

lt;210gt; 270

lt;400gt; 270

lt;210gt; 271

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 271

lt;210gt; 272

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Ser, Gly o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Asn o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Asn o Tyr

lt;400gt; 272

lt;210gt; 273

lt;400gt; 273 000

lt;210gt; 274

lt;400gt; 274 000

lt;210gt; 275

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala, Asp, Lys, Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser o Thr lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 275

lt;210gt; 276

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; Leu o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala, Asp, Lys, Gly o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser, Thr o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Gln o Glu

lt;400gt; 276

lt;210gt; 277

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;220gt; lt;221 MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser o Thr

400gt; 277 lt;210gt; 278

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ala o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser. Thr o Asn

lt;400gt; 278

lt;210gt; 279

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ile o Val

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Asp, Gln, Glu, Lys o Gly

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES 222gt; (6)..(6) 223gt; Asp o Lys 220gt; 221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Lys, Asp, Glu o Asn

lt;400gt; 279

lt;210gt; 280

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Ile o Val

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5),

lt;223gt; Asp, Gln, Glu, Lys o Gly

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asp o Lys

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Ser, Asn o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Lys, Asp, Glu o Asn

lt;400gt; 280

lt;210gt; 281

lt;211gt; 8

lt;222gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ser, Thr o His

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Tyr, Trp o Phe

lt;400gt; 281

lt;210gt; 282

lt;400gt; 282

lt;210gt; 283

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Ser, Ala, Thr, Ile o Leu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Trp o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Ser, Gly, Asn o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Ile o Leu

lt;400gt; 283

lt;210gt; 284

lt;400gt; 284 000

lt;210gt; 285

lt;211gt; 123

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: secuencia de proteína sintética

lt;400gt; 285 lt;210gt; 286

lt;211gt; 109 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: secuencia de proteína sintética 10

lt;400gt; 286

lt;210gt; 287

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 267

lt;210gt; 288

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 288

lt;210gt; 289

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 289

lt;210gt; 290

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 290

lt;210gt; 291

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 291 lt;210gt; 292

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;210gt; 293

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 293

lt;210gt; 294

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 294

lt;210gt; 295

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 295

lt;210gt; 296

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 296

lt;210gt; 297

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 297

lt;210gt; 298

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 298

lt;210gt; 299

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 299

lt;210gt; 300

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 300

lt;210gt; 301

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 301

lt;210gt; 302

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 302

lt;210gt; 303

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 303

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lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 304

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lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 305

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lt;211gt; 6

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 306

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 307

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lt;211gt; 6

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 308

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lt;211gt; 6

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 309

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lt;211gt; 6

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 310 lt;210gt; 311

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 311

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lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 312

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lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 313

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lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 315 lt;210gt; 316

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 319

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lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 321

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lt;211gt; 9

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 325

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 326

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 327

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 330

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 332

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 333

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lt;211gt; 5

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 334

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 335

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lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 336

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lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 337

lt;210gt; 338

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 338

lt;210gt; 339

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 339 lt;210gt; 340

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 340

lt;210gt; 341

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 341

lt;210gt; 342

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 342

lt;210gt; 343

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 343

lt;210gt; 344

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 344 lt;210gt; 345

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 345

lt;210gt; 346

lt;211gt; 14

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 346

lt;210gt; 347

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 347

lt;210gt; 348

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 348

lt;210gt; 349

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 349

lt;210gt; 350

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 350

lt;210gt; 351

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 351

lt;210gt; 352

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 352

lt;210gt; 353

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 353

lt;210gt; 354

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 354

lt;210gt; 355

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 355

lt;210gt; 356

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 356

lt;210gt; 357

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 357

lt;210gt; 358

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 358 lt;210gt; 359

lt;211gt; 30

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

lt;400gt; 359 caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa 30

lt;210gt; 360

lt;211gt; 39

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 360 gtgaagaaac caggctctag cgtgaaagtg agctgcaaa 39

lt;210gt; 361

lt;211gt; 54

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 361 gccagcggtg gcaccttctc cagctacgcc atcagctggg tgagacaggc ccca 54

lt;210gt; 362

lt;211gt; 72

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 362

lt;210gt; 363

lt;211gt; 39

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 363 ggcagagtga caatcaccgc cgataaaagc accagcacc 39

lt;210gt; 364

lt;211gt; 36

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético lt;400gt; 364 gcctacatgg aactgtctag cctgagaagc gaagat 36

lt;210gt; 365

lt;211gt; 72

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 365

lt;210gt; 366

lt;211gt; 42

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220> lt;223gt;.Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 366 ctggttcagt ctggtgccga agtgaaaaag ccaggttcta gc 42

lt;210gt; 367

lt;211gt; 36

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220>

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 445

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lt;211gt; 30

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

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lt;211gt; 30

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 448

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lt;212gt; ADN

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;211gt; 36

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;210gt; 497

lt;211gt; 39

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;211gt; 54

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 507

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 508

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 510

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 515

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 516

lt;210gt; 517

lt;211gt; 85

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 517

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 518

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 519

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lt;211gt; 64

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 520

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 521

lt;210gt; 522

lt;211gt; 64

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 522

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lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 523

lt;210gt; 524

lt;211gt; 58

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 524 aggcttccgg tggcagattc accaactacg ggatgaactg ggttagacag gcacctgg 58

lt;210gt; 525

lt;211gt; 71

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 525

lt;210gt; 526

lt;211gt; 71

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 526

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lt;211gt; 71

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 527

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lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

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lt;400gt; 528

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15: lt;220gt; lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 529 aggcttccgg tggcacattc accaactaat aaatgaactg ggttagacag gcacctgg: 58

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25: lt;220gt; lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 530

lt;210gt; 531

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lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;400gt; 532

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lt;211gt; 61

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 534

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lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

35 lt;400gt; 535

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lt;400gt; 536 ctgccagtgg ctttaccttc agcasctact ggatgagctg ggttagacag gctcctgg 58

lt;210gt; 537

lt;211gt; 58

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

5: lt;220gt; lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético lt;400gt; 537 ctgccagtgg ctttaccttc agcractact ggatgagctg ggttagacag gctcctgg 58

lt;210gt; 538 lt;211gt; 79 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial

lt;400gt; 538

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lt;211gt; 79

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lt;220gt;

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lt;220gt;

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lt;211gt; 67

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

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lt;400gt; 544

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lt;220gt;

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lt;220gt;

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 548

lt;210gt; 549

lt;211gt; 67

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lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

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lt;400gt; 549

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lt;211gt; 67

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 550 lt;210gt; 551

lt;211gt; 67

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 551

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lt;211gt; 61

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 552

lt;210gt; 553

lt;211gt; 61

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 553

lt;210gt; 554

lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 554

lt;210gt; 555

lt;211gt; 64

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 555

lt;210gt; 556

lt;211gt; 64

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 556

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lt;211gt; 64

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 557

lt;210gt; 558

lt;211gt; 61

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético ’

lt;400gt; 558

lt;210gt; 559

lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 559

lt;210gt; 560

lt;211gt; 64

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 560

lt;210gt; 561

lt;211gt; 64

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 561

lt;210gt; 562

lt;211gt; 64

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 562

lt;210gt; 563

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;211gt; 5

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 564

lt;210gt; 565

lt;211gt; 5

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 565

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lt;211gt; 5

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 566

lt;210gt; 567

lt;211gt; 15

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

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lt;210gt; 568

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220> 5 lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1)..(1)

lt;223gt; aminoácido variable

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3) .. (5)

lt;223gt; Aminoácido variable

15 lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(9)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;400gt; 568

lt;210gt; 569 25 lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(5) 35 lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220> lt;221 MOD_RES

lt;222gt; (8)..(9)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;400gt; 569

lt;210gt; 570

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt; 55 lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1).. (1)

lt;223gt; Aminoácido variable

5: lt;220gt; lt;221gt; MOD_RES lt;222gt; (4)..(5) lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220gt; lt;221gt; MOD_RES lt;222gt; (8)..(9) lt;223gt; Aminoácido variable

15: lt;400gt; 570

lt;210gt; 571

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt;: Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético 25

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(5)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220> c221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(9).

lt;223gt;: Aminoácido variable 35

lt;400gt; 571

lt;210gt; 572

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

45 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(4)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220gt; 55 lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(9)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;40.0gt; 572

lt;210gt; 573

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt;: Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético 15

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3) .. (4)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt;: Aminoácido variable 25

lt;400gt; 573

lt;210gt; 574

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

35 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(9)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;400gt; 574

lt;210gt; 575

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

5 lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; aminoácido variable

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES .

lt;222gt; (9) .. (9)

lt;223gt; Aminoácido variable 15

lt;400gt; 575

lt;210gt; 576

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

25 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3)..(3)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;210gt; 577

lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 577 45

lt;210gt; 578

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES.

lt;222gt; (1) .. (1)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; 13)..(3)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5) .. (8)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(11)

lt;223gt; Aminoácido variable

lt;400gt; 578

lt;210gt; 579

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 579

lt;210gt; 580

lt;211gt; 5

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 580

lt;210gt; 581

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (1).. (1)

lt;223gt; Ser, Arg, Gly, Asn o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (3).. (3)

lt;223gt; Tyr, Trp, Asp o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ala o Asn

lt;400gt; 581

lt;210gt; 582

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 582

lt;210gt; 583

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Val, Ala, Asn, Gly, Tyr, Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr, Lys o Ile

lt;400gt; 583

lt;210gt; 584

lt;400gt; 584

lt;210gt; 585

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4) .. (4)

lt;223gt; Ala, Tyr, Gly o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; His, Ser o Asn

lt;400gt; 585

lt;210gt; 586

lt;211gt; 11

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 586

lt;210gt; 587

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;233gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 587

lt;210gt; 588

lt;211gt; 8

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 588

lt;210gt; 589

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 589

lt;210gt; 590

lt;211gt; 15

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 590

lt;210gt; 591

lt;211gt; 58

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificia

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 591 aggcttccgg tggcacattc accaactacg ggatgaactg ggttagacag gcacctgg 58

lt;210gt; 592

lt;211gt; 58

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 592 aggcttccgg tggcacattc accaactacg ggatgaactg ggttagacag gcacctgg 58

lt;210gt; 593

lt;211gt; 18

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 593 accaactacg ggatgaac 18

lt;210gt; 594

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 594 aggcttccgg tggcacattc 20

lt;210gt; 595

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 595 tgggttagac aggcacctgg 20

lt;210gt; 596

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 596 gccagcggct ttaccttctc t 21

lt;210gt; 597

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 597 gctgggttag acaggcacct 20

lt;210gt; 598

lt;211gt; 36

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 598 ttgatgggat tgataaaccc atacttcgga acaaac 36

lt;210gt; 599

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 599 cacctggtca gggcttggag 20

lt;210gt; 600

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 600 tacgctcaga aattccaggg 20

lt;210gt; 601

lt;211gt; 13

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Pro o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (9)..(9)

lt;223gt; Phe, Ser, Asn o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (11)..(11)

lt;223gt; Thr, Asn, Gly, Ser o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Thr o Ala

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (13)..(13)

lt;223gt; Asn, Lys, Ser o Gly

lt;400gt; 601

lt;210gt; 602

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 602

lt;210gt; 603

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 603

lt;210gt; 604

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 604

lt;210gt; 605

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 605

lt;210gt; 606

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 606

lt;210gt; 607

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 607

lt;210gt; 608

lt;211gt; 79 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;400gt; 608

15 lt;210gt; 609

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

20 lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 609

lt;210gt; 610

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN 30 lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

35 lt;400gt; 610

lt;210gt; 611 40 lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;400gt; 611

lt;210gt; 612

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 612

lt;210gt; 613

lt;211gt; 79

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 613

lt;210gt; 614

lt;211gt; 85

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 614

lt;210gt; 615

lt;211gt; 85

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 615

lt;210gt; 616

lt;211gt; 85

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 616

lt;210gt; 617

lt;211gt; 85

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 617

lt;210gt; 618

lt;211gt; 45

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; modified_base

lt;222gt; (7)..(9)

lt;223gt; Esta región puede incluir RGA, SAC, GWG o RCC

lt;400gt; 618 gccaagnnnc cccactacta cggcagcagc cacttgtact tcgac 45

lt;210gt; 619

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 619 ataccgccgt gtattactgt 20

lt;210gt; 620

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 620 tactggggtc agggcactct 20

lt;210gt; 621

lt;211gt; 61

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 621

lt;210gt; 622

lt;211gt; 61

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 622

lt;210gt; 623

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 623 agcctggtaa agcccctaag 20

lt;210gt; 624

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 624 tccggcgttc ctagcagatt 20

lt;210gt; 625

lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 625

lt;210gt; 626

lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 626

lt;210gt; 627

lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 627

lt;210gt; 628

lt;211gt; 30

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 628 ctgctgatct acgrcaccag cagcagggcc 30

lt;210gt; 629

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 629 aacctggtca ggcccctcgc 20

lt;210gt; 630

lt;211gt; 19

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 630 caggcatccc tgatatatt 19

lt;210gt; 631

lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 631 aacctggtca ggcccctaga 20

lt;210gt; 632

lt;211gt; 19

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 632 caggtatccc tgccagatt 19

lt;210gt; 633

lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;210gt; 634

lt;400gt; 633

lt;210gt; 634

lt;211gt; 70

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

lt;400gt; 634

lt;210gt; 635

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;400gt; 635

lt;210gt; 636

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Glu, Tyr, Ser o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Tyr, Asn o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; His, Tyr, Gln o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Ser o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Ser, Thr o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Asn, Tyr, Ile

lt;400gt; 636

lt;210gt; 637

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Glu o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asn, Tyr o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; His, Gln o Tyr

lt;220>: 221gt; MOD_RES 222gt; (8)..(8) 223gt; Ser o Thr

lt;220>

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Ser, Thr o Ash

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Asn o Ile

lt;400gt; 637

lt;210gt; 638

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Ser, Glu o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; His o Tyr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Tyr, Asn o Ser

lt;400gt; 638

lt;210gt; 639

lt;211gt; 12

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Tyr, Ser o Arg

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ile o Val

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Tyr o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Tyr o Thr

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (10)..(10)

lt;223gt; Ser o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (12)..(12)

lt;223gt; Tyr o Asn

lt;400gt; 639

lt;210gt; 640

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Ser, Gly, Asp, Arg o Glu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Asn o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Asn, Asp o Ser

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Gln, Asn o Lys

lt;400gt; 640

lt;210gt; 641

lt;211gt; 10

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Met, Ile o Leu

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Tyr o Phe

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Glu o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Ser, Thr o Asn

lt;220gt;

lt;221gt; MOD_RES

lt;222gt; (8)..(8)

lt;223gt; Asn, Lys o Tyr

lt;400gt; 641

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir una biblioteca de polinucleótidos que codifica al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) en la que el procedimiento comprende:

(a)

determinar la variación de secuencia de aminoácidos de la CDR presente en una biblioteca de anticuerpos de referencia que consiste en las CDR naturales como se define de acuerdo con el Índice EU, Kabat, Chothia o definición de punto de contacto, en el que la variación de secuencia CDR se determina en cada posición de resto de aminoácido de la CDR;

(b)

alinear una secuencia peptídica CDR problema de un anticuerpo contra un antígeno diana con las secuencias CDR de la biblioteca de anticuerpo de referencia; y

(c)

sintetizar una biblioteca de polinucleótidos que codifica secuencias CDR, en la que

(i)

el resto de aminoácido codificado en cualquier posición simple dentro de una secuencia CDR es idéntico a un resto de aminoácido en la posición alineada correspondiente de la secuencia peptídica de la CDR problema de un anticuerpo dirigido contra un antígeno candidato; o

(ii)

es un resto, o restos, de aminoácido predeterminado si un resto de aminoácido idéntico para la secuencia peptídica de CDR problema en la posición que se alinea no aparece en la biblioteca de referencia,

por lo que se proporciona una biblioteca de polinucleótidos que codifica análogos de CDR de la secuencia peptídica de CDR problema de un anticuerpo contra un antígeno diana, enriqueciéndose los análogos de CDR de aminoácidos que existen en estado natural en una o más posiciones de restos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1:

en el que el resto de aminoácido predeterminado es

(a)

un resto de aminoácido de cadena lateral pequeña seleccionado del grupo que consiste en Glicina (G) y Alanina (A);

(b)

un resto de aminoácido de cadena lateral nucleófila seleccionado del grupo que consiste en Serina (S), Treonina (T), Cisteína (C) e Histidina (H);

(c)

un resto de aminoácido de cadena lateral hidrófoba seleccionado del grupo que consiste en Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I), Metionina (M) y Prolina (P);

(d)

un resto de aminoácido de cadena lateral aromática seleccionado del grupo que consiste en Fenilalanina (F), Tirosina (Y) y Triptófano (W);

(e)

un resto de aminoácido de cadena lateral ácida seleccionado del grupo que consiste en Aspartato (D) y Glutamato (E);

(f)

un resto de aminoácido de cadena lateral amida seleccionado del grupo que consiste en Asparagina

(N)

y Glutamina (Q); o

(g)

un resto de aminoácido de cadena lateral básica seleccionado del grupo que consiste en Lisina (K) y Arginina (R).
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha alineación es mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en un alineamiento con huecos, alineamiento completo, alineamiento discontinuo o combinaciones de los mismos.