ES2403155A2 - Procedimiento de producción de plantas haploides, dobles haploides y/o dihaploides, por ginogénesis - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento de prodLa invención se refiere a un procedimiento de producción de plantas haploides H, dobles haploides HDucción de plantas haploides H, dobles haploides HD y/o dihaploides DH, siendo las HD y DH homocigota y/o dihaploides DH, siendo las HD y DH homocigotas o esencialmente homocigotas, siendo este un tipos o esencialmente homocigotas, siendo este un tipo de procedimiento que concierne a la técnica de la de procedimiento que concierne a la técnica de la ginogénesis inducida por polen irradiado. Este pr ginogénesis inducida por polen irradiado. Este procedimiento comprende una etapa de irradiación delocedimiento comprende una etapa de irradiación del material reproductor del parental masculino con u material reproductor del parental masculino con una dosis comprendida entre 160 y 190 rayos gamma yna dosis comprendida entre 160 y 190 rayos gamma y/o una etapa de selección de las plantas haploides/o una etapa de selección de las plantas haploides H y/o DH mediante la utilización de marcador(es) H y/o DH mediante la utilización de marcador(es) molecular(es). La invención también se refiere a umolecular(es). La invención también se refiere a un procedimiento de producción de plantas haploidesn procedimiento de producción de plantas haploides, dobles haploides y/o dihaploides homocigotas que, dobles haploides y/o dihaploides homocigotas que comprende una etapa de determinación de la (o de comprende una etapa de determinación de la (o de las) dosis de irradiación adecuada(s) para aumentalas) dosis de irradiación adecuada(s) para aumentar los rendimientos de dichas plantas en función der los rendimientos de dichas plantas en función de múltiples factores dados como la especie vegetal, múltiples factores dados como la especie vegetal, los genotipos del parental masculino y del parent los genotipos del parental masculino y del parental femenino, las condiciones climáticas y fisiológal femenino, las condiciones climáticas y fisiológicas, el momento de la cosecha de los frutos, el nicas, el momento de la cosecha de los frutos, el nivel de crecimiento de los embriones recogidos conivel de crecimiento de los embriones recogidos con vista a su cultivo, el nivel de desarrollo de los vista a su cultivo, el nivel de desarrollo de los embriones puestos en cultivo. Por otra parte, la embriones puestos en cultivo. Por otra parte, la invención se refiere a el (los) marcador(es) molecinvención se refiere a el (los) marcador(es) molecular(es) utilizado(s) en la etapa de selección asíular(es) utilizado(s) en la etapa de selección así como a los embriones haploides, los embriones dih como a los embriones haploides, los embriones dihaploides obtenidos por el procedimiento de la inveaploides obtenidos por el procedimiento de la invención, la descendencia y las semillas de las plantnción, la descendencia y las semillas de las plantas obtenidas por el procedimiento de la invención.as obtenidas por el procedimiento de la invención.

Description

PROCEDIMIENTO DE PRODUCCiÓN DE PLANTAS HAPLOIDES, DOBLES HAPLOIDES YIO DIHAPLOIDES, POR GINOGÉNESIS

El ámbito de la invención es el de la selección o mejora vegetal, es decir, la producción de plantas tanto en forma de embriones como en cualquier otro estadio, especialmente de la plántula a la planta adulta.

Más precisamente, la selección o mejora vegetal según la presente invención significa la obtención de una planta haploide o diploide homocigota o esencialmente homocigota con una descendencia estable en cuanto a sus caracteres fenotípicos y/o genotípicos. En otros términos, para una planta de este tipo se llega a una fijación de su genoma con un número reducido de generaciones (por ejemplo, una o dos).

Más precisamente todavía, la presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de producción de plantas (p. ej. embriones, plántulas, plantas adultas), Haploides (H), Dobles Haploides (HD) y/o DiHaploides (OH), homocigotas o esencialmente homocigotas, siendo este un tipo de procedimiento que concierne a la técnica de ginogénesis ventajosamente asociada a una irradiación del polen. Las plantas afectadas son, por ejemplo, los calabacines.

Los sistemas de creación varietal, es decir, la creación de nuevas plantas adaptadas a las necesidades específicas de los agricultores y productores, se han acelerado desde principios del siglo XX. Uno de los cambios más drásticos fue el desarrollo de los híbridos, también llamados comercialmente híbridos F1, inicialmente en el maíz, y la utilización del fenómeno de heterosis, que corresponde al incremento de las capacidades o del vigor de un híbrido en numerosos caracteres (vigor, rendimiento, resistencia a las enfermedades y al encamado, precocidad) sobre la media de los dos parentales o sobre el mejor de los dos parentales. Otro cambio se refiere a la utilización de las técnicas de cultivo in vitro de las plantas basadas en su totipotencia.

La creación de plantas híbridas F1, que permiten en particular reunir en la planta híbrida F1 los caracteres dominantes de sus parentales, se extendió rápidamente del maíz a otras especies como el tomate, los pimientos, las berenjenas. En efecto, además del vigor híbrido presente en algunas especies, la obtención de híbridos F1 permite también una mejora de las capacidades de homeostasis de la planta (estabilidad de la planta y de la expresión de sus caracteres en diferentes entornos), y la posibilidad de

5 acumular genes de interés. Sin embargo, la creación de plantas híbridas F1 implica la creación de líneas parentales relativamente homocigotas. Una vez cruzadas, estas líneas parentales permiten la obtención del híbrido F1. Mientras la pureza genética de las líneas parentales se mantiene, los híbridos F1 pueden obtenerse de manera repetida.

Esta búsqueda de homocigosis de las líneas parentales no se desarrolla únicamente para la obtención de las plantas híbridas F1. De forma similar, durante el desarrollo de nuevas plantas comercializadas en forma de variedades población (lechuga, judía, milamores, etc.), la creación de

15 cultivares (o variedades) relativamente homocigotas se ha convertido en una necesidad. Las exigencias de homogeneidad del producto para los agricultores y para la comercialización (criterios de homogeneidad y de estabilidad de los nuevos cultivares inscritos en el catálogo), así como la mecanización y la creciente precisión de las técnicas de cultivo y de

20 producción implican la necesidad de plantas cada vez más homogéneas en la expresión de sus caracteres.

El seleccionador llega tradicionalmente al nivel de homocigosis buscada

autofecundando las plantas más prometedoras de varias generaciones,

25 seleccionando aquellas que presentan los caracteres buscados, homogeneizando de esta forma progresivamente el genoma de las plantas de una generación a otra.

Las nuevas plantas de calabacines desarrolladas por los seleccionadores son

30 o bien autocultivares autógamos, o bien híbridos F1. En ambos casos, la búsqueda de homogeneidad del cultivar y/o de las líneas parentales del híbrido F1 es uno de los objetivos del programa de selección.

Hay que recordar que, para iniciar el ciclo sexual de las plantas, es necesario

35 un proceso de reducción del número de los cromosomas (meiosis) para dar origen a unas células gaméticas con un número haploide de cromosomas (n). En las plantas con flor, la reproducción sexuada implica una doble fecundación. El grano de polen produce dos núcleos gaméticos (n) masculinos o núcleos reproductores. Un núcleo masculino se fusiona con un óvulo (n) para formar un cigoto (2n) que produce el embrión restaurando el número de cromosomas somáticos (2n). Otro núcleo masculino (n) se une

5 con los núcleos polares del saco embrionario haploide para formar una célula triploide (3n). En algunos casos, la formación del cigoto no se produce, pero las divisiones celulares del óvulo no obstante se inician, llegando a un embrión haploide capaz de dar origen a una plántula cuyo genoma haploide es en su totalidad de origen materno (Sarkar and Coe, Genetics, 1966, vol.

10 54,453-464). Las plantas haploides existen en un número reducido en la naturaleza y son estériles.

El descubrimiento, a principios de la década de 1920, de las plantas

haploides viables y de la posibilidad de duplicar su genoma ha suscitado

15 numerosas investigaciones. En efecto, estas plantas haploides son interesantes no solo en el ámbito de la genética, sino también para la mejora de las plantas ya que, tras la duplicación cromosómica (espontánea o no), las informaciones genéticas son idénticas en los dos cromosomas de cada par. De este modo, la información genética se fija y los dobles haploides permiten

20 acelerar los procesos de selección.

En 1964, Guha et Maheshwari (Guha and Maheshwari, Nature, 1964, 204, 497) descubren que algunas plantas pueden ser regeneradas a partir de células haploides durante el cultivo de granos de polen.

25 Desde entonces, se han puesto en marcha numerosas investigaciones acerca de la producción de plantas haploides de diversas especies, utilizando técnicas de cultivo in vitro de gametofitos. Las dos principales técnicas de producción de embriones y de plantas haploides (haploidización) por cultivo in

30 vitro de gametofitos son la androgénesis y la ginogénesis.

En la androgénesis, unos gametofitos masculinos inmaduros se ponen en cultivo en un medio sintético con el fin de obtener embriones haploides que, a continuación, se desarrollan como plantas enteras. Los resultados varían con

35 el genotipo, pero también con los protocolos utilizados.

En la ginogénesis son los gametofitos femeninos maduros (ovarios u óvulos)

los que se ponen en cultivo.

Las dos técnicas pueden utilizarse con la misma especie, sabiendo que una de ellas es más ventajosa para ciertas especies, mientras que la otra técnica 5 se adapta mejor a otras especies.

Algunos autores también citan la producción de embriones y de plantas haploides mediante la utilización de agentes químicos o físicos. El principio de esta técnica es provocar el desarrollo del óvulo no fecundado en la planta (in

10 situ). Aunque algunos intentos mediante choques térmicos, rayos X o sustancias químicas no han llevado más que a mediocres resultados, la utilización de polen irradiado ha dado, en ciertas especies como el melón, resultados no directamente aplicables a otras especies.

15 La mayoría de las plantas inducidas por estas técnicas son plantas haploides, pero pueden obtenerse otras plantas con unos niveles de ploidías variables. Si los aneuploides o los tetraploides pueden no presentar más que un interés menor en los programas de mejora de las plantas, los diploides espontáneos (dihaploides OH) sí son muy buscados puesto que la duplicación espontánea

20 de su genoma durante las primeras fases del cultivo in vitro los vuelve fértiles. Estas plantas homocigotas son utilizables directamente por los seleccionadores, lo que representa una enorme ventaja a distintos niveles (tiempo, espacio, coste ... ).

25 Las plantas Haploides (H), que se obtienen mediante estas diferentes técnicas y que no han duplicado espontáneamente su genoma, deben sufrir a continuación una etapa suplementaria para hacerlas diploides (2n) o Dobles Haploides (HD). Esto puede hacer usando diferentes productos químicos como la colchicina (alcaloide que permite la duplicación de un genoma).

30 Los dobles haploides HD, así como los dihaploides OH (resultado de una diploidización espontánea) son individuos homocigotas, que se pueden utilizar directamente como cultivares homogéneos (variedades población) o como líneas parentales de variedades híbridas. En efecto, estas plantas HD y

35 OH tienen, en forma duplicada, la información genética de un único juego (n) de cromosomas, el del gameto femenino del que descienden originalmente.

De este modo, estas técnicas de creación de plantas in vitro permiten no solo ganar tiempo, sino también conseguir una mejor homogeneidad genética: el genoma se estabiliza (homocigoto) en una única generación en lugar de llegar a la homocigosis genómica tras múltiples generaciones de

5 autofecundación. Estas permiten también mejorar el programa de selección puesto que ponen de manifiesto las características recesivas de la planta creada de esta forma. La utilización de los dobles haploides HD y de los dihaploides OH es por consiguiente una herramienta muy interesante. Su uso se ha extendido para ciertas especies: la androgénesis se utiliza para las

10 plantas del género Brassica (Keller et al., en K. Giles, S. Sen (eds.), Plant Cell Culture in Crop Improvment, 1984, 169-183. Plenum Pub. Corp., New York), la ginogénesis para el pepino (patente europea EP 0374755) Yla remolacha azucarera (Hosemans and Bossoutrot, Z. Pflanzenzuecht, 1983, 91, 74-77), el polen irradiado en el melón (Sauton et Dumas de Vaulx, Agronomie 7, 1987,7

15 (2),141-148).

En consecuencia, las plantas que se han utilizado para el desarrollo de estas técnicas de haploidización in vitro están disponibles hoy en día comercialmente en diversas especies e inscritas en el catálogo oficial.

20 Sin embargo, a pesar de estas variedades comerciales, los rendimientos de los diferentes procedimientos de haploidización dependen todavía demasiado de múltiples factores desconocidos o no totalmente controlados (genotipo, cultivo de las plantas madre, condiciones de realización de la haploidización,

25 etc.) y en ocasiones todavía son demasiado débiles, en numerosas especies, para integrarse de manera rutinaria en los procedimientos de selección actuales.

En lo que respecta a los calabacines Cucurbita pepo, solo se conocen

30 algunos resultados fragmentarios a día de hoy y ninguno indica cómo producir suficientes embriones haploides H (que dan a continuación los dobles haploides HD), o embriones dihaploides OH para mantener un programa de mejora vegetal.

35 La primera mención del cultivo in vitro de óvulos no fecundados de Cucurbita pepo la hacen Dumas de Vaux et Chambonnet en 1986 (Dumas and Chambonnet, Genetic Manipulation in Plant Breeding, 1986, 285). Los óvulos se extraen de los ovarios uno o dos días antes de la floración o esa misma mañana. En los dos primeros casos, las flores no se polinizan, en el tercero, estas son polinizadas, pero no fecundadas. Los óvulos se ponen en placas de Petri en un medio que contenga macro o micronutrientes, así como vitaminas,

5 ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4 O) Yquinetina. Los autores obtienen su mejor rendimiento, es decir 4,3 embriones por 100 óvulos cultivados, cuando los ovarios se extraen un día antes de la floración. Sin embargo, encuentran dificultades para obtener plantas que se desarrollen normalmente. El origen de las plantas se analiza durante una etapa posterior de autopolinización de

10 las plantas diploides fértiles y durante un examen fenotípico de la descendencia.

Más recientemente, tratándose siempre de los calabacines Cucurbita pepo, Shalaby (Shalaby, Scientia Horticultura e, 2007, 115, 1-6) analizó la influencia

15 del genotipo, de la posición de las flores hembra en el tallo, de la temperatura y de la concentración de sacarosa durante la ginogénesis. Las plantas haploides regeneradas se tratan con colchicina con el fin de obtener dobles haploides. Los autores concluyen que el genotipo utilizado influye en gran medida en las posibilidades de utilizar esta técnica de manera rutinaria. De

20 este modo el genotipo Yellow Bik no produce ningún embrión por ginogénesis, mientras que sí responde a la androgénesis.

La conclusión de este artículo en cuanto a la influencia del genotipo indica claramente que las técnicas de androgénesis y de ginogénesis no son hoy en

25 día satisfactorias como para utilizarlas de manera generalizada y rutinaria en un programa de mejora del calabacín Cucurbita pepo.

Se ha propuesto irradiar el polen en un procedimiento de ginogénesis inducida para la obtención de plantas haploides H, y/o de plantas dihaploides

30 OH, dando las plantas haploides H a continuación plantas dobles haploides HO. La irradiación del grano de polen le hace perder su poder fecundante (el AON de los gametos se daña por las radiaciones), pero conserva su poder germinativo, pudiendo de este modo inducir la división de la oosfera y su desarrollo en embrión.

35 Esta técnica de ginogénesis con irradiación del polen se utiliza especialmente en el melón (Cucumis mela) (Sauton, Cinquantenaire de la Culture in vitro, 24-25 octubre 1989) donde la mayoría de los genotipos es capaz de producir

embriones y/o plantas haploides o dihaploides.

En la técnica de ginogénesis aplicada al calabacín Cucurbita pepo y referida

5 por Kurtar et al. (Kurtar et al., Euphytica, 2002, 127, 335-344), también se recurre a la irradiación del polen. Kurtar et al. han estudiado la influencia de la dosis de irradiación y de los genotipos en la obtención de los embriones haploides. Estos autores obtienen embriones y plantas haploides sin haber podido optimizar la dosis de irradiación y habiendo constatado que la

10 producción de los embriones está fuertemente influenciada por el nivel de irradiación, por el desarrollo de los embriones puestos en cultivo y por los genotipos. De este modo, al contrario de lo que sucede con el melón, las condiciones técnicas de producción de embriones haploides de calabacines Cucurbita pepo no pueden, hasta el momento, generalizarse.

15 Esta variabilidad multifactorial constituye un primer inconveniente importante de los procedimientos conocidos de ginogénesis, con o sin irradiación del polen.

20 Un segundo inconveniente de dichos procedimientos tiene que ver con los análisis del estado de ploidía y del estado de homocigosis de las plantas obtenidas (embriones/ plántulas/ plantas adultas). En efecto, las plantas pueden ser haploides o dihaploides, pero estas pueden tener diferentes niveles de ploidía, en particular pueden ser quimeras haploides-diploides,

25 tetraploides o aneuploides (Dumas de Vaux y Chambonnet en 1986).

De forma opuesta al principio de ginogénesis, la irradiación del polen puede dar lugar a fecundaciones del óvulo por el ADN del grano del polen, principalmente por fragmentos de ADN. Esto puede deberse al hecho de que

30 las radiaciones no han degradado suficientemente el ADN como para impedir la fecundación parcial, de la que resulta la formación de un embrión quimérico (sin querer verse limitados por la teoría, estos inventores piensan en recombinaciones entre el ADN del óvulo y fragmentos del ADN del grano de polen). Cuando las radiaciones degradan bastante el ADN, el grano de polen

35 debería perder su poder fecundante y no conservar más que su poder germinativo. Se ha constatado sin embargo que en algunos casos, a lo largo de la extensión del tubo polínico, algunos fragmentos de ADN masculino

pueden encontrarse en contacto con el óvulo y, durante una pseudofecundación, recombinarse con el AON femenino, dando así plantas quiméricas haploides (cuando a la recombinación entre el AON del óvulo y los fragmentos del AON del grano de polen irradiado le sigue la pérdida del AON

5 sobrante durante las siguientes divisiones celulares) o con diferentes ploidías, pudiendo ser en particular heterocigotas en ciertos genes cuando estas tienen uno o varios cromosomas supernumerarios. Las plantas quiméricas haploides son interesantes ya que no tienen más que una única copia de la información genética (incluso si una ínfima parte del genoma procede del gameto

10 masculino) y porque una duplicación de su genoma, de igual modo que en los haploides, produce plantas homocigotas o esencialmente homocigotas.

También pueden producirse algunas plantas heterocigotas diploides resultantes de una fecundación «clásica», en el caso, por ejemplo, de una 15 irradiación insuficiente.

Además, en las cucurbitáceas, se ha constatado que algunas plantas obtenidas mediante estos procedimientos diferentes de cultivo in vitro pueden ser diploides pero heterocigotas, porque estas no sufren reducción gamética

20 durante la formación de los gametos femeninos (Veilleux, Plant Breeding RevieWS, 1985,3,253-288). De este modo ellas tienen la totalidad de la información genética de la planta de origen y por lo tanto no presentan las características de interés buscadas y propias de las plantas haploides, HO y/o OH.

25 Los métodos conocidos para determinar los niveles de ploidía permiten diferenciar las plantas haploides n de las plantas diploides 2n. Sin embargo, los métodos actuales para determinar de manera más exacta el nivel de ploidía (quimerismo, cromosomas o fragmentos de cromosomas que faltan o

30 supernumerarios) resultan todavía muy costosos en materiales y en tiempo. Así pues, sería necesario un método sencillo, rápido y económico para diferenciar entre las plantas haploides y las plantas quiméricas resultantes de una pseudofecundación. Además, actualmente no existe ninguna opción satisfactoria para diferenciar las plantas 2n diploides heterocigotas obtenidas

35 por una fecundación, las plantas 2n diploides heterocigotas resultantes de una fecundación, las plantas 2n diploides heterocigotas resultantes de la no reducción gamética y las plantas diploides 2n dihaploides OH homocigotas

resultantes de una duplicación espontánea.

La identificación de los haploides H (quimeras o no) y de los diferentes

diploides puede hacerse por análisis citológico, especialmente por conteo de

5 los cromosomas en preparaciones de células de raíz de plantas analizadas en el microscopio óptico. El análisis citológico es difícil de aplicar en un programa de creación varietal donde la rapidez y la precisión son necesarias. Esto no resuelve no obstante el problema de la identificación de los haploides respecto de las quimeras no haploides resultantes de una

10 pseudofecundación.

La selección de las plantas diploides 2n se hace hasta el momento por análisis fenotípico de la descendencia de la planta regenerada; la autopolinización de una planta homocigota debe dar una descendencia

15 homogénea estable a lo largo de las sucesivas generaciones de autofecundación. Si esta no lo es y se observa una segregación de caracteres, es porque la planta regenerada no era homocigota, sino heterocigota. De este modo, hasta ahora solo se ha podido realizar la identificación de los dihaploides OH por la selección morfológica y/o la

20 utilización de marcadores recesivos (por ejemplo, liguleless, glossy ... ) presentes en el genoma del parental femenino. La utilización de estos marcadores recesivos presenta el inconveniente de necesitar, previamente a la inducción de la ginogénesis, su introducción en el genoma de la línea destinada a utilizarse como parental femenino, si esta no los posee ya.

25 Algunos marcadores de coloración pueden utilizarse en la selección de los embriones y plantas haploides o dihaploides (Chase and Nanda, Maize Gen Coop, 1965, News letter, 39, 59-60; Coe and Sarkar, J of Heredity, 1964, vol. 55,231-233). Sin embargo, la expresión de estos marcadores está influenciada por el genotipo del parental femenino o incluso por el proceso

30 general de maduración del embrión y esto puede acarrear una evaluación incorrecta del origen de los individuos obtenidos.

El análisis fenotípico de la descendencia es largo, puesto que hay que esperar a la floración, obtener los granos y observar la descendencia de cada 35 grano con el fin de verificar su homogeneidad.

Las causas de la ausencia de resultados satisfactorios en los diferentes métodos conocidos de haploidización se encuentran, en parte, en los límites actuales de las técnicas de cultivo in vitra, es decir, la gran especificidad genotípica de respuesta en el cultivo in vitra, los bajos porcentajes de diferenciación para dar origen a embriones, las importantes pérdidas de estos

5 embriones cuando se quiere alcanzar una organogénesis completa de estos.

No existe por lo tanto, a día de hoy, ninguna técnica satisfactoria para producir, de manera reproducible, las suficientes plantas (p. ej. embriones/ plántulas/ plantas adultas) haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides

10 OH, con el fin de mantener un programa de selección, en particular de calabacines. Cucurbita y particularmente Cucurbita pepo forma parte efectivamente de estas especies en las que el esfuerzo desplegado es muy importante para superar los diferentes problemas.

15 En este contexto, uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar un procedimiento eficaz que permita mejorar la producción de plantas haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides OH, mediante ginogénesis inducida por un gametofito masculino irradiado (por ejemplo, polen irradiado).

20 Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento perfeccionado de selección o de mejora vegetal, es decir, de obtención de una planta, haploide o diploide homocigota o esencialmente homocigota con una descendencia estable en cuanto a sus caracteres

25 fenotípicos y/o genotípicos, o, en otros términos, una planta para la cual una estabilización del genoma se consigue con un número reducido de generaciones (por ejemplo, una o dos).

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de

30 producción de plantas haploides, dobles haploides y/o dihaploides, por ginogénesis inducida con irradiación de los gametofitos masculinos (polen), resolviendo los inconvenientes de la técnica anterior y satisfaciendo al menos una de las siguientes especificaciones:

35 -Optimización de la dosis de irradiación; -Poder liberarse, al menos en parte, de la influencia del nivel de desarrollo de los embriones en cultivo y/o de los genotipos y/o de las condiciones

climáticas y/o del momento de la cosecha de los frutos, del nivel de crecimiento de los embriones recogidos con vistas a su cultivo, entre otras variables (variabilidad multifactorial);

-Generalización del procedimiento a un máximo de especies y de géneros, 5 en particular a la mayoría de los calabacines Cucurbita pepo; -Permitir un análisis eficaz y seguro del estado de ploidía y del origen de las plantas producidas; -Permitir una buena identificación de las plantas obtenidas.

10 Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de producción de plantas haploides (que dan a continuación plantas dobles haploides) y/o dihaploides, mediante ginogénesis inducida por polen irradiado, permitiendo dicho procedimiento reducir el tiempo, así como el espacio de cultivo necesario para la creación y la selección varietal, gracias a

15 una etapa de selección de las plantas haploides, y/o dihaploides, de entre el conjunto de las plantas producidas con diferentes ploidías.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento que permita, más allá de un procedimiento de producción de plantas haploides y/o

20 dihaploides por ginogénesis con irradiación del material reproductor del parental masculino, determinar la dosis de irradiación adecuada para incrementar los rendimientos de producción de dichas plantas en función de múltiples factores dados y seleccionados preferentemente de entre la especie vegetal, los genotipos del parental masculino y del parental femenino, las

25 condiciones climáticas y fisiológicas de estas plantas, el momento de la cosecha de los frutos, las condiciones de crecimiento de los embriones inmaduros recogidos con vistas a su cultivo.

Otro objetivo de la invención es proporcionar al menos uno de los siguientes 30 elementos:

-Marcador(es) molecular(es); -Embriones; -Plantas regeneradas a partir de embriones;

35 -Descendencia de las plantas; -Semillas de plantas; que sean utilizables en u obtenidos por un procedimiento de producción de plantas haploides, dobles haploides y/o diplohaploides, mediante ginogénesis inducida por polen irradiado, siendo este un tipo de procedimiento como el que se apunta en los objetivos comentados anteriormente.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento eficaz de análisis del origen de plantas, especialmente de plantas producidas por un procedimiento de producción de plantas haploides (que dan a continuación plantas dobles haploides) y/o dihaploides, mediante ginogénesis inducida por

10 polen irradiado, siendo este un tipo de procedimiento como el que se apunta en los objetivos comentados anteriormente, y que permita determinar si las plantas contienen material genético del parental masculino.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento eficaz de

15 identificación de plantas, especialmente de plantas producidas por un procedimiento de producción de plantas haploides (que dan a continuación plantas dobles haploides) y/o dihaploides, mediante ginogénesis inducida por polen irradiado, siendo este un tipo de procedimiento como el que se apunta en los objetivos comentados anteriormente y que permita determinar si las

20 plantas son homocigotas o heterocigotas.

Al menos uno de los objetivos precedentes, entre otros, se alcanza con la presente invención que concierne, en primer lugar, a un nuevo procedimiento de producción de plantas haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides

25 OH, siendo las HO y OH homocigotas o esencialmente homocigotas, siendo este un tipo de procedimiento que compete a la técnica de la ginogénesis inducida por polen irradiado, caracterizado por que comprende:

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una etapa de irradiación del material reproductor del parental masculino con 30 una dosis comprendida entre 160 y 190 rayos gamma, preferentemente entre 165 y 185 rayos gamma (Gy); -o una etapa de selección de las plantas haploides H, o OH, o H Y OH mediante la utilización de un marcador molecular; -o una etapa de irradiación del material vegetal reproductor del parental

35 masculino con una dosis comprendida entre 160 y 190 rayos gamma, preferentemente entre 165 y 185 rayos gamma (Gy) y una etapa de selección de las plantas haploides H, o OH, o H Y OH mediante la

utilización de un marcador molecular.

Hay que señalar que en la presente solicitud, normalmente el artículo

indefinido "un" debe considerarse como un plural genérico (significado de "al

5 menos uno" o, incluso, "uno o varios"), salvo cuando el contexto indique lo contrario (1 o "solo uno"). Así pues, por ejemplo, cuando anteriormente se dice que se añade una etapa de irradiación, se trata de la añadidura de una o varias etapas de irradiaciones. Lo mismo sucede con la etapa de selección de las plantas que puede hacerse por varias etapas de selección, con la

10 utilización de uno o varios marcadores moleculares.

El procedimiento según la presente invención abre una nueva vía de obtención de plantas (lato sen su) haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides OH. Esta nueva vía aporta mejoras en términos de:

15 -ampliación del espectro de los vegetales afectados por esta técnica de

ginogénesis con irradiación de los gametófitos masculinos (polen); -reducción de la variabilidad multifactorial propia de esta técnica hasta ahora; -análisis del estado de ploidía de las plantas producidas;

20 -identificación del origen de las plantas obtenidas; -reducción de tiempo y de espacio de cultivo necesarios para la creación y la selección varietal.

Por otra parte este procedimiento se ha mostrado totalmente adecuado para 25 las plantas de calabacines.

Teniendo en cuenta la variabilidad factorial de la ginogénesis inducida por irradiación del polen, todos los avances en términos de optimización son bienvenidos. Así pues, según otro de sus aspectos, la invención apunta a un

30 procedimiento de producción de plantas haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides OH, siendo las HO y OH homocigotas o esencialmente homocigotas, mediante ginogénesis inducida por irradiación del material reproductor del parental masculino, caracterizado por que comprende una etapa previa de determinación de la (o de las) dosis de irradiación

35 adecuada(s) para incrementar los rendimientos de obtención de dichas plantas en función de múltiples factores dados y seleccionados preferentemente de entre la especie vegetal, los genotipos del parental masculino y del parental femenino, las condiciones climáticas y fisiológicas, el momento de la cosecha de los frutos, el nivel de crecimiento de los embriones recogidos con vistas a su cultivo.

5 La invención apunta también a un procedimiento de producción de plantas haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides OH, siendo las HO y OH homocigotas o esencialmente homocigotas, mediante ginogénesis inducida por polen irradiado, caracterizado por que comprende la utilización de un marcador molecular para identificar las plantas exentas de material genético

10 del parental masculino cuyo polen se ha irradiado o que poseen una cantidad insuficiente de este para provocar, en la descendencia de dichas plantas, una disyunción de un carácter fenotípico y/o genotípico así como para determinar su estado de homocigosis.

15 Según otro de sus aspectos, la invención se refiere a un marcador molecular que pueda utilizarse en el procedimiento según la invención, siendo seleccionado este marcador, por ejemplo, entre los marcadores microsatélites (SSR), definidos por las parejas de cebadores de secuencias nucleotídicas anexas SEQ ID N° 1 a 16, preferentemente SEQ ID N° 3 a 14.

20 Según otro de sus aspectos, la invención se refiere a embriones haploides H, HO y/o OH de plantas, como productos intermedios del procedimiento según la invención.

25 Según otro de sus aspectos, la invención se refiere a la descendencia de las plantas obtenidas por el procedimiento según la invención.

Según otro de sus aspectos, la invención se refiere a las semillas de las

plantas obtenidas por el procedimiento según la invención.

30 Con el fin de entender mejor la invención, en primer lugar conviene recordar o dar algunas definiciones, que deben considerarse en todo caso como ejemplos no excluyentes.

35 -Por genotipo se entiende el conjunto del material genético que un individuo lleva y que constituye su herencia. Un carácter genotípico corresponde o no a un carácter fenotípico, que puede ser recesivo o dominante.

-

El término fenotipo designa al conjunto de los caracteres morfológicos o funcionales aparentes de un individuo, que corresponden a su vez a la parte expresada del genotipo y a unos fenómenos determinados por el medio

5 ambiente.

-

Por planta se entiende un vegetal en cualquier estadio de desarrollo en que se encuentre, en particular: embrión, o cualquier otro estadio plántula o de la planta adulta.

-

Por planta macho o parental masculino se entiende una planta que se utiliza como donante de polen en un cruzamiento.

-

Por planta hembra o parental femenino se entiende una planta que se utiliza 15 como receptora de polen o como donante de óvulo en un cruzamiento.

-

Por material reproductor masculino se entiende la flor macho o cualquier parte que incluya las células gaméticas haploides masculinas, es decir, la etamina, los gametofitos masculinos o granos de polen.

Para simplificar, en la presente solicitud, por polen se entiende el material

reproductor masculino utilizado.

-

Por material reproductor femenino se entiende la flor hembra o cualquier

25 parte que incluya las células gaméticas haploides femeninas, los ovarios, los óvulos, los gametofitos femeninos (saco embrionario) o las células reproductivas femeninas (oosferas).

-

Por autógama se entiende una planta cuyo modo de reproducción es la

30 autogamia y cuyos granos se obtienen de la fecundación de dos gametos extraídos del mismo individuo.

-

Por polinización se entiende la aportación de un grano de polen desde la estamina (órgano masculino) a los órganos femeninos. La polinización da 35 lugar a una fecundación, incluso a una pseudofecundación cuando el material masculino utilizado se ha irradiado.

-

Por fecundación se entiende la fusión entre un gameto masculino y un

gameto femenino dando origen a un embrión.

-

Por pseudofecundación se entiende la formación inducida de un embrión sin

5 fusión previa de un gameto masculino y femenino. En el ámbito de la presente invención, la técnica de ginogénesis inducida por irradiación del polen permite la formación de un embrión por pseudofecundación. La pseudofecundación puede también ser una fecundación parcial, cuando algunos fragmentos de ADN del gameto masculino se fusionan con el gameto

10 femenino.

-

Por autofecundación se entiende la polinización de un individuo por su

propio polen, denominándose a los individuos resultantes autofecundados.

15 -Por planta híbrida se entiende una planta resultante del cruzamiento entre dos parentales genéticamente diferentes. Para una planta de la primera generación de un cruzamiento entre dos parentales homocigotas genéticamente distintos, por ejemplo, dos variedades distintas, se podrá hablar de híbrido F1.

20 -Por heterosis o vigor híbrido se entiende el fenómeno por el cual un híbrido F1 es significativamente superior al mejor de sus parentales respecto a uno o varios caracteres, especialmente en lo que relativo al vigor.

25 -Por genoma se entiende el número de cromosomas contenidos en el núcleo de la célula, o la cantidad de ADN.

-

Por alelo se entiende según la presente invención las diversas versiones de una secuencia de ADN dada situada en un locus (ubicación en un

30 cromosoma) cromosómico dado.

-

Por homocigota se entiende una célula o un individuo que posee dos alelos idénticos de un mismo gen en un locus determinado del mismo par de cromosomas, y esto para la característica aportada por ese gen.

-

Por esencialmente homocigota se entienden las plantas según la invención,

cuando la identidad de dos alelos se verifica por ejemplo por al menos un 80%, preferentemente un 85%, en particular un 90% y más particularmente por un 95% de los alelos examinados o cuando tras una autofecundación, no hay segregación de los caracteres en la descendencia. Por extensión, en la presente solicitud, las plantas esencialmente

5 homocigotas se consideran como plantas homocigotas.

-

Por diploides se entiende un calificativo aplicable a células o a plantas o partes de plantas que comprenden este tipo de células, las cuales presentan, en su núcleo, un lote de cromosomas semejantes de dos en dos, llamados

10 homólogos. Las células diploides habitualmente son el resultado de la fecundación de dos gametos haploides.

-

Por haploides se entiende un calificativo aplicable a células o a plantas o partes de plantas que comprenden este tipo de células, cuyos cromosomas 15 contenidos en su núcleo son cada uno solamente un único ejemplar (n).

-

Por quimeras se entiende un calificativo aplicable a células o a plantas o partes de plantas que comprenden este tipo de células, que contienen un fragmento de AON adicional procedente del polen irradiado o del cual uno de

20 los cromosomas ha sufrido una recombinación con el AON del polen irradiado. Esas células pueden ser haploides H, dihaploides OH (cuando hay duplicación espontánea del genoma) o con diferentes ploidías.

Cuando una planta es una quimera con diferentes ploidías (comprendiendo

25 especialmente cromosomas o fragmentos de cromosomas supernumerarios), esta es heterocigota para ciertos alelos.

Cuando una planta se obtiene de una recombinación con un fragmento de

AON del polen masculino irradiado, esta es interesante en dos casos:

30 1) Si no tiene más que una única copia de cada uno de los cromosomas, se la considera como haploide y por consiguiente podrá sufrir una duplicación cromosómica posterior para convertirse en una planta doble haploide (2n) homocigota.

35 2) Si ha sufrido una duplicación cromosómica espontánea, esta es dihaploide (2n) homocigota.

-

Por doble haploide (HO) se entiende un calificativo aplicable a células o a plantas o partes de plantas que comprenden este tipo de células, cuyo genoma se ha multiplicado artificialmente, la mayor parte de las veces por

5 tratamiento químico y principalmente por la colchicina.

-

Por dihaploides (OH) se entiende un calificativo aplicable a células o a plantas o partes de plantas que comprenden este tipo de células, siendo estas células haploides al principio y que han visto duplicado su genoma

10 espontáneamente. Esta duplicación del genoma permite obtener una célula, planta o parte de planta con 2n completamente homocigota.

-

Por parental femenino híbrido se entiende una planta híbrida que se utiliza

como planta receptora de polen en un cruzamiento.

15 -Por calabacín se entiende una planta del género Cucurbita. El calabacín es en realidad un conjunto de cultivares de la especie Cucurbita pepo y de la subespecie Cucurbita pepo ssp. pepo.

20 -Por dosis se entiende la dosis de irradiación absorbida por la diana, es decir, en particular el material vegetal reproductor del parental masculino.

-

Por marcador molecular se entiende un fragmento específico de una

secuencia de AON que puede identificarse en el interior del genoma de un

25 individuo y que puede utilizarse en particular para localizar un gen de interés, verificar si un individuo ha heredado una característica particular de un parental o diferenciar dos individuos. Se puede tratar o no de una secuencia codificadora. El marcador puede ser dominante o co-dominante. La detección del marcador molecular, o su no-detección, permite seleccionar a los

30 individuos que presentan el gen de interés o la característica particular, o por el contrario, no seleccionar a los individuos que no presentan el gen de interés o la característica particular. En la presente invención, los marcadores moleculares permiten someter rápidamente a ensayo a las plantas o plántulas durante su desarrollo y escoger aquellas que poseen las características

35 buscadas. El experto en la materia conoce marcadores moleculares de diferentes tipos: AFLP (polimorfismos de longitud de los fragmentos de amplificación), SCAR (caracterización de productos de amplificación) SSR (microsatélites, repeticiones de secuencias simples), RFLP (polimorfismos de

longitud de los fragmentos de restricción), etc.

-

Por marcador microsatélite o secuencia microsatélite o también SSR se

5 entiende una secuencia de ADN formada por una repetición continua de motivos compuestos por 1 a 4 nucleótidos. Esas secuencias microsatélites están presentes en el conjunto del genoma, lo más habitual a nivel de los intrones de los genes, pero también a nivel de los exones. El polimorfismo de los microsatélites puede utilizarse como marcador genético con el fin de

10 identificar un individuo o una población, por ejemplo, plantas.

En la creación y la selección de variedades vegetales la transmisión de manera estable y homogénea de los caracteres seleccionados es un prerrequisito indispensable. También es fundamental poder conocer de forma

15 fiable el genotipo y el fenotipo de las plantas producidas. Para mantener un híbrido, de preferencia un híbrido F1, son necesarias líneas parentales estables. Para obtener plantas fijadas, generalmente se autofecundan las plantas de manera repetida, no presentando las plantas las características buscadas al eliminarse en cada generación. Nuevas técnicas han permitido el

20 desarrollo de plantas a partir solo de los gametos (n). Así pues, se han desarrollado la androgénesis y la ginogénesis. La utilización de la ginogénesis con polen irradiado es de uso habitual para generar plantas. Sin embargo, como ya se ha expuesto anteriormente, esta técnica presenta algunas limitaciones y principalmente los casos de pseudofecundaciones por el polen,

25 incluso cuando este se ha fragmentado por las radiaciones, preferentemente rayos X o gamma. En efecto, puede suceder que el polen no se haya degradado bastante y que un fragmento de ADN del polen irradiado «pseudofecunde» el gametofito femenino, mientras que en esta técnica únicamente debe inducir el desarrollo de un embrión haploide sin modificar su

30 genoma. Este embrión, yen consecuencia la planta resultante de este embrión, en el mejor de los supuestos no debe contener genoma del parental masculino que se haya utilizado para la polinización del material reproductor del parental femenino. Pero resulta que la descendencia producida mediante ginogénesis inducida por polen irradiado puede ser de diferentes tipos, en

35 particular:

-

plantas haploides (con n cromosomas),

-

plantas dihaploides (con 2n cromosomas idénticos n+n),

-

quimeras que contienen n cromosomas del parental femenino y algunos pedazos fragmentados de AON del parental masculino recombinados o no con el AON del parental femenino, ya sea en forma haploide, o con

5 diferentes ploidías, o siendo dihaploides que han sufrido una duplicación

espontánea de su genoma, -plantas diploides resultantes de una fecundación, -plantas diploides que tengan el mismo genoma que la planta madre (2n).

10 En los procesos de creación varietal, es preciso no conservar más que las plantas haploides H (incluidas las quimeras haploides), que a continuación pueden dar por duplicación del genoma los dobles haploides HO, y las plantas dihaploides OH para estar seguros de su homocigosis.

15 Tras largas investigaciones, los investigadores han perfeccionado esta selección proponiendo una gama cuidadosamente escogida de dosis de irradiación de los gametofitos masculinos, que permite orientar la ginogénesis hacia una población de individuos deseados (H, OH) exenta o casi exenta de individuos no deseados.

20 El hecho de asociar o de sustituir la elección de esta gama de dosis a un proceso de selección mediante la utilización de marcadores moleculares y/o de citometría de flujo va en la misma dirección.

25 Según un modo preferido de aplicación de la invención, el procedimiento en cuestión de ginogénesis inducida con radiación del polen, comprende las siguientes etapas sucesivas:

a) Aplicar material reproductor del parental masculino, preferentemente

30 una flor; b) Irradiar dicho material vegetal reproductor del parental masculino con una dosis comprendida entre 160 y 190 rayos gamma, de preferentemente entre 165 y 185 rayos gamma (Gy) y más particularmente entre 170 y 180 Gy;

35 c) Polinizar el material vegetal reproductor del parental femenino con dicho material vegetal reproductor del parental masculino irradiado; d) Recolectar los frutos cuyos granos contienen los embriones;

e) Extraer los granos de dichos frutos; f) Extraer los embriones de dichos granos; g) Poner en cultivo los embriones en un medio adecuado hasta la obtención de una planta, preferentemente una plántula.

La etapa de irradiación del material reproductor masculino puede repetirse varias veces, preferentemente dos o tres veces, con el fin de que el material genético se degrade bastante. La dosis de irradiación del material reproductor masculino especialmente preferida está en torno a 175 Gy.

En un modo particularmente preferido de aplicación de la invención, el procedimiento comporta además, tras la etapa g) ya descrita anteriormente, una etapa h) que consiste en seleccionar las plantas haploides H y/o OH por citometría de flujo, o mediante la utilización de marcador(es) molecular(es), o

15 por citometría de flujo y utilización de marcador(es) molecular(es).

Esta etapa h) de selección de las plantas haploides H y/o OH comporta:

-1-la utilización de marcador(es) molecular(es) específico(s) de alelo(s)

20 dado(s) contenido(s) en el material genético del parental masculino irradiado para seleccionar de entre las plantas obtenidas tras la etapa g) las plantas que no contienen material genético del parental masculino irradiado o que poseen una cantidad insuficiente de este como para provocar en la descendencia de dichas plantas, una disyunción de uno o varios caracteres

25 fenotípicos y/o genotípicos;

-11-la utilización de marcador(es) molecular(es) específico(s) de alelo(s) dado(s) contenido(s) en el material genético del parental femenino híbrido, permitiendo este (estos) marcador(es) determinar el estado

30 homocigota/heterocigota de las plantas a seleccionar, es decir, las plantas obtenidas tras la etapa g), utilizándose este (estos) marcador(es) para seleccionar las plantas homocigotas y esencialmente homocigotas, en particular las plantas OH.

35 Resulta evidente que durante la etapa h) de selección, el orden de utilización de los marcadores moleculares específicos dados contenidos en el material genético del parental masculino y de los contenidos en el material genético del parental femenino importa poco. I y 11 no se realizan necesariamente en un orden preciso y pueden ser concomitantes (1 y 11 al mismo tiempo) o sucesivos (1 y luego 11, o 11 y luego 1). Además, la etapa de selección h) puede repetirse varias veces. Esto puede resultar interesante cuando se utilizan

5 varios marcadores moleculares específicos para efectuar selecciones sucesivas cada vez más precisas con cada vez menos individuos que probar. Por último, cuando la etapa h) consiste en seleccionar las plantas haploides H y/o OH por citometría de flujo y utilización de marcador(es) molecular(es), la citometría de flujo puede preceder a la utilización de marcador(es)

10 molecular(es), la utilización de marcador(es) molecular(es) puede preceder a la citometría de flujo, y la utilización de marcador(es) molecular(es) puede ser concomitante a la citometría de flujo.

Preferentemente, las plantas parentales se seleccionan de entre el género

15 Cucurbita, familia de las cucurbitáceas, preferentemente entre la especie Cucurbita pepo, y, aun más preferentemente, entre la subespecie Cucurbita pepo ssp. pepo.

Según una característica destacable de la invención, se aplica como planta

20 hembra de las plantas híbridas y de las plantas híbridas F1. En efecto, durante la producción de los gametos de una planta híbrida o de una planta híbrida F1, los apareamientos cromosómicos de los cromosomas homólogos durante la primera división permiten recombinaciones genéticas y dan por consiguiente una gran variabilidad genética de los gametos producidos. Las

25 plantas haploides H (que dan las dobles haploides HO) y las plantas dihaploides OH resultantes de estos gametos y que se obtienen por el procedimiento según la presente invención son genéticamente diferentes las unas de las otras, ofreciendo así una mayor elección al seleccionador.

Para hacer un breve repaso del ciclo de vida de plantas con flor, como los calabacines, una flor polinizada o autopolinizada va a producir frutos que a su vez contienen granos, los cuales contienen embriones, que se van a

35 desarrollar en plántulas hasta convertirse en plantas.

El material vegetal masculino y femenino se selecciona en función de las

características buscadas. El material vegetal reproductor masculino cosechado y aplicado comprende principalmente flores de una planta macho seleccionada, pero también puede tratarse de etaminas o de gametófitos o directamente de gametos masculinos o granos de polen.

Las flores por ejemplo son ventajosamente recolectadas de la planta madre macho en el momento de la antesis. Se utilizan generalmente una o dos flores macho para la fecundación de cada flor hembra. En las plantas preferidas según la invención, es decir, las del género Cucurbita, las plantas

10 macho escogidas según la invención pueden ser, por ejemplo, aquellas cuyos genotipos están en el grupo que comprende: JIB, JEOIOA, ESKENOARENI.

Estas plantas macho resultan de especial interés porque son buenas

polinizadoras, es decir que emiten importantes cantidades de polen.

15 El momento de la cosecha del material vegetal reproductor del parental masculino, preferentemente flores, puede ser importante. Este momento se escoge en función del desarrollo de la planta de la que proceden las flores, de la estación ... Así pues, es preferible recolectarlos durante la antesis y

20 fecundar las flores hembra antes de que se abran.

La etapa de irradiación b) del material vegetal reproductor del parental

25 masculino, es decir, de los gametofitos masculinos, como el polen, es importante para el éxito del procedimiento de producción de las plantas H (que dan dobles haploides HO) y/o de las plantas OH.

Los rayos utilizados son preferentemente los rayos gamma, pero también 30 pueden utilizarse los rayos X.

La irradiación se realiza usando medios conocidos y adecuados como los rayos gamma, por ejemplo, durante un tiempo suficiente para que el material vegetal reproductor del parental masculino reciba la dosis prescrita en tarros

35 cerrados que contengan preferentemente de diez a doce flores macho por tarro. Por ejemplo, para JIB, el tiempo de irradiación es preferentemente de entre 20 minutos y una hora y media.

Las condiciones elegidas de irradiación (sin distinción entre parámetros) permiten obtener resultados muy satisfactorios, es decir tras la polinización con el material vegetal reproductor masculino, una producción suficiente de

5 frutos, los cuales contienen un número suficiente de embriones que se convierten en plantas de las cuales la mayoría posee las características buscadas. En efecto, la mayor parte de los embriones y, por consiguiente, de las plantas producidas por el procedimiento según la invención son H y/o OH, los haploides dando dobles haploides.

Antes de realizar la etapa c) del procedimiento según la invención, puede

resultar ventajoso hacer germinar algunos granos de polen irradiados, en un

15 medio adecuado, como por ejemplo en un medio denominado MP15 (solución de sacarosa al 15%, 100 mg/L H3B03 y 700 mg/L CaCI2, 2H20), con el fin de verificar que el polen irradiado aún tiene capacidad de germinación. Tras un tiempo dado de germinación, por ejemplo de 15 a 60 min, los granos de polen se observan a continuación a través de la lupa con el fin de determinar los

20 porcentajes de granos germinadas y de granos abiertos.

El material reproductor del parental femenino utilizado tendrá un genotipo

seleccionado en función de la planta a obtener.

25 En las plantas preferidas según la invención, es decir, las del género Cucurbita, las plantas hembra escogidas según la invención pueden ser por ejemplo aquellas cuyos genotipos están en el grupo de genotipos que incluyen VN001, VG06, VN002, Odessa, VG 14, Tosca et VE 547 también pueden utilizarse.

30 La etapa c) del procedimiento según la invención consiste esencialmente en la polinización del material reproductor del parental femenino con el material reproductor del parental masculino.

35 En esta técnica de ginogénesis, pueden regenerarse plantas enteras a partir de los gametofitos femeninos (ovarios u óvulos) contenidos en el material vegetal reproductor del parental femenino.

La polinización consiste ventajosamente en poner en contacto los gametos masculinos y los gametos femeninos, pero dado que los gametos masculinos están irradiados no puede darse una fecundación real de los gametos

5 femeninos sino únicamente un alargamiento del tubo polínico y, por inducción de la oosfera, el desarrollo de un embrión.

La polinización del material vegetal reproductor del parental femenino puede hacerse de diferentes maneras. Las técnicas preferidas serán la polinización

10 por la técnica «flor a flor» en la que toda la superficie de los estigmas (extremidad de los pistilos) se recubre con el material reproductor del parental masculino, pero también por la polinización con pincel. En la técnica «flor a flor» una flor o el material reproductor del parental femenino es «fecundada/o» por una flor o por el material reproductor del parental macho.

15 En la técnica denominada del «pincel», se emplea un pincel para realizar la transferencia de los granos de polen del material reproductor del parental masculino hacia una o varias flores o material reproductor del parental femenino.

De forma ventajosa, en los días que siguen a la polinización, se observa la correcta formación del fruto (cuajado) y se eliminan las flores que no forman 25 fruto. Tras la polinización, el tiempo tras el cual los frutos se recolectan depende de la familia, del género y de la especie en cuestión.

Preferentemente, se cosechan los frutos cuya madurez es adecuada para la extracción de los embriones.

La morfología del fruto y su aspecto exterior permite evaluar el momento oportuno para recoger el fruto.

Por ejemplo, en torno a 4 o 5 semanas (tiempo variable según el género y la

35 especie) tras la polinización, los frutos se cosechan y preferentemente se lavan a continuación con agua y eventualmente con un detergente (p. ej. jabón de Marsella), se aclaran, se secan y eventualmente se limpian de

nuevo con alcohol.

5 Los frutos ahora se abren para extraer los granos, preferentemente en condiciones estériles, por ejemplo, con flujo laminar.

10 Los granos se abren a continuación para extraerles los embriones.

Los embriones extraídos se ponen en cultivo en un medio adaptado, del tipo 15 de los que se describen en los ejemplos que veremos posteriormente, siendo el medio S2P el preferido (véase tabla 8).

Los embriones, por ejemplo, se cultivan en la oscuridad, una o dos noches, a 20-25 oC, luego se ponen a plena luz durante de 10 horas hasta 20 horas 20 aproximadamente, p. ej. unas 16 horas a la misma temperatura.

Los embriones pueden recolectarse en diferentes estadios de desarrollo embrionario y algunos estadios pueden influir en el rendimiento del procedimiento según la invención. En efecto, los embriones pueden

25 recolectarse en el estadio embrionario globular, corazón, torpedo o cotiledonar.

Los embriones pueden replantarse regularmente, preferentemente cada 15 días aproximadamente, en el mismo medio o en un medio de cultivo diferente 30 adaptado a su estadio de desarrollo, en particular desde el momento de la aparición de hojas jóvenes y de pequeñas raíces.

Cuando las plántulas están bien desarrolladas, estas se replantan de manera ventajosa en otro medio de cultivo adecuado, cuya composición es p. ej. la 35 que se da en los ejemplos que veremos posteriormente (véase tablas 8 y 9).

En una variante preferida del procedimiento según la invención se realiza una etapa de selección de las plantas haploides H y/o OH producidas según el procedimiento:

5 h1) por citometría de flujo y/o, h2) mediante la utilización de un marcador molecular.

Esta selección h1 y/o h2 se realiza ventajosamente cuando la planta resultante de la ginogénesis presenta algunas hojas, extrayéndose y 10 analizándose una muestra de la planta, preferentemente de hoja, según esta etapa de selección h) del procedimiento.

Estas selecciones h1) y/o h2) que pueden aplicarse, simultáneamente o no,

en cualquier orden, incluso de forma discontinua, permiten especialmente

15 determinar el nivel de ploidía de las plantas producidas. Mediante estas técnicas es posible distinguir entre las plantas que tiene 2n cromosomas y las plantas con n cromosomas. De este modo, las plantas que tienen n cromosomas (haploides H) se conservan para someterse a continuación a una etapa de duplicación de su genoma, preferentemente con colchicina,

20 produciendo así dobles haploides (HD). Las plantas haploides H son estériles, en cambio las plantas dobles haploides HD y las dihaploides OH no lo son y resultan de especial interés para los seleccionadores.

En el caso de las selección h1) por citometría de flujo, la citometría de flujo

25 permite hacer un distinción fiable entre las plantas 2n y las plantas n, pero esta técnica no permite diferenciar las plantas dihaploides OH (2n idénticas, homocigotas) y las plantas diploides 2n heterocigotos resultantes de un defecto de reducción gamética o de una fecundación por el grano de polen. Durante esta selección, se conservarán tanto las plantas 2n como las plantas

30 n.

Las plantas 2n se analizarán posteriormente con unos marcadores moleculares (la etapa h2 ya mencionada) con el fin de realizar una selección más precisa entre las plantas 2n dihaploides homocigotas o esencialmente

35 homocigotas y las plantas 2n diploides heterocigotas.

Las plantas n haploides (quimeras o no) se conservarán con vistas a que se

analicen también mediante marcadores moleculares, con vistas después a obtener dobles haploides homocigotas o esencialmente homocigotas tras la duplicación del genoma.

5 La selección por citometría de flujo permite clasificar las plantas en dos grupos: haploides n y dihaploides 2n.

Como métodos alternativos o complementarios a la citometría de flujo se puede citar el recuento cromosómico realizado en puntas de raíz o el conteo 10 del número de cloroplastos en las células de guarda de los estomas que se realizan en el microscopio óptico.

La selección h2) mediante la utilización de un marcador molecular ofrece por

su parte la posibilidad de distinguir entre los diferentes tipos de plantas 2n ya

15 expuestos anteriormente. Esto permite un ahorro de tiempo, de espacio y de coste muy importante. Además, este método de selección ofrece también un análisis mucho más preciso ya que permite también determinar si las plantas haploides H o dihaploides OH contienen o no genoma del parental masculino, y esto de forma fiable y rápida. De este modo, el método de selección

20 mediante la utilización de un marcador molecular permite determinar el estado de homocigosis de la planta en cuestión, pero también su nivel de ploidía.

La selección h2) mediante la utilización de un marcador molecular es

25 preferentemente una etapa h2) de selección de las plantas H y/o OH que comporta:

-1-la utilización de un marcador molecular específico de alelo(s) dado(s) contenido(s) en el material genético del parental masculino irradiado

30 para seleccionar de entre las plantas obtenidas tras la etapa g) las plantas que no contienen material genético del parental masculino irradiado o que poseen una cantidad insuficiente para provocar en la descendencia de dichas plantas seleccionadas una disyunción de un carácter fenotípico y/o genotípico;

35 -11-la utilización de un marcador molecular específico de alelo(s) dado(s) contenido(s) en el material genético del parental femenino híbrido,

permitiendo este (estos) marcador(es) determinar el estado homocigota/heterocigota, eventualmente el nivel de ploidía, de las plantas a seleccionar, es decir, las plantas obtenidas tras la etapa g), utilizándose este (estos) marcador(es) para seleccionar las plantas homocigotas o

5 esencialmente homocigotas, en particular las plantas OH, dejando bien claro que al menos un marcador utilizado para cada análisis puede ser un marcador único, durante un análisis único, especialmente en el ámbito de un marcador codominante que permite distinguir inmediatamente entre varias formas alélicas de un mismo marcador genético. Preferentemente, se utiliza

10 un marcador molecular específico de al menos dos alelos.

Este marcador molecular específico de alelo(s) del material genético del parental masculino irradiado y/o de un, preferentemente dos, alelos dados contenidos en el material genético del parental femenino híbrido es

15 preferentemente un marcador microsatélite SSR.

Estos diferentes marcadores sirven por consiguiente, por una parte, para identificar las plantas que tienen una parte de material genético masculino en su genoma y, por otra parte, para diferenciar las plantas homocigotas de las

20 plantas heterocigotas. Cuanto más se utilizan marcadores moleculares, más se define el nivel de homocigosis. Puede suceder que en un locus dado la planta se muestre homocigota con los marcadores moleculares utilizados, pero que no sea homocigota (o esencialmente homocigota) en el conjunto de sus genes. Es por lo tanto preferible utilizar varios marcadores moleculares

25 (preferentemente al menos 3, particularmente 5 y más particularmente 6) para seleccionar con fiabilidad las plantas OH. Dichos marcadores se seleccionan en función de los genomas de los parentales utilizados en la ginogénesis. Estos marcadores moleculares permiten distinguir entre las plantas haploides H y/o dihaploides OH homocigotas que han resultado de los gametos

30 femeninos y las plantas diploides (2n) heterocigotas resultantes de una no reducción gamética, resultantes de una fecundación, o recombinados resultantes de una fecundación parcial con el polen irradiado.

Los marcadores se seleccionan de forma ventajosa de modo que identifiquen

35 alelos diferentes entre las plantas hembra que dan los gametos femeninos y las plantas macho que dan el polen que se irradia. De este modo, una planta resultante de una fecundación parcial posee los alelos procedentes de las dos plantas parentales (macho y hembra) mientras que una planta haploide H o dihaploide OH no tiene más que los alelos procedentes de la planta madre hembra. Las plantas resultantes de la ginogénesis inducida por el polen irradiado y que tienen en su genoma alelos del parental masculino que

5 confirman así una "fecundación" son por consiguientes descartados. Las quimeras haploides son un caso particular puesto que estas tienen alelos procedentes de la planta hembra y de la planta macho, pero cada alelo únicamente está presente con una sola copia.

10 Para abreviar, si la planta hembra contiene los alelos A y B Y la planta macho contiene los alelos C, todas las plantas regeneradas que tienen un alelo C se consideran como resultantes de una fecundación y son por consiguiente descartadas. Solamente se conservan las plantas que presentan únicamente el alelo A o las plantas que presentan únicamente el alelo B. Las plantas que

15 presentan el alelo A pueden ser plantas AA cuando estas son dihaploides y A cuando son haploides, las plantas que presentan el alelo B pueden ser plantas BB cuando son dihaploides y B cuando son haploides. En el caso particular de las quimeras haploides, su identificación podrá ser posible mediante la utilización de varios marcadores.

20 Este (estos) marcador(es) molecular(es) puede(n) también servir para clasificar y para descartar las plantas diploides resultantes de gametos no reducidos e idénticos a la planta madre, ya que estas son heterocigotas para unos alelos dados y determinados del material femenino utilizado (planta

25 madre). En este caso, el (los) marcador(es) molecular(es) se selecciona(n) de manera que identifique(n) los alelos que se encuentran en el estado heterocigota en las plantas hembra y, por consiguiente, también en las plantas resultantes de gametos no reducidos pero que se encuentran o bien en el estado homocigota en el caso de las plantas dihaploides, o bien con una

30 sola copia en el caso de las plantas haploides.

En resumen, si la planta hembra contiene los alelos A y B todas las plantas regeneradas que llevan la combinación de alelos AB se consideran como resultantes de un gameto no reducido. Aquí también solo se escogen las

35 plantas que presentan únicamente el alelo A o las plantas que presentan únicamente el alelo B.

Según una forma preferida de la invención, los marcadores microsatélites o

SSR se utilizan para determinar, en las plantas obtenidas y sometidas a

5 ensayo, a la vez la presencia del genoma del parental masculino y el estado homocigota/heterocigota. También pueden utilizarse para determinar el nivel de ploidía de las plantas obtenidas y sometidas a ensayo.

Según una forma particular y destacable de la invención, el (los) marcado(es)

10 molecular(es) utilizado(s) para la aplicación del procedimiento según la invención, es (son) un (unos) marcador(es) microsatélite(s). Cada uno de estos marcadores moleculares microsatélites se define por una secuencia nucleotídica dada de un tamaño dado, amplificado por PCR gracias a una pareja de cebadores específicos (un cebador sentido y un cebador

15 antisentido). Para la etapa de selección h), el o los marcadores moleculares que pueden utilizarse en la presente invención son los ocho marcadores siguientes: CMAGN73, CMBR153, CMBR22, CMMP73, CUCNITRA, FAD2, PATL1, T J3. Cada uno de estos marcadores se define por una pareja de cebadores nucleotídicos de secuencias dadas (véase más arriba SEO ID N° 1

20 a 16). Resulta evidente que para esta etapa h) se pueden utilizar marcadores moleculares (microsatélites o no) distintos a los ocho marcadores antes citados. Preferentemente, se utilizarán los marcadores definidos por las parejas de cebadores SEO ID N° 3 Y SEO ID N° 4; SEO ID N° 5 Y SEO ID N° 6; SEO ID N° 7 Y SEO ID N° 8; SEO ID N° 9 Y SEO ID N° 10; SEO ID N° 11 Y

25 SEO ID N° 12 y/o SEO ID N° 13 Y SEO ID N° 14.

Las secuencias SEO ID N° 1 a 16 son particularmente interesantes para la aplicación del procedimiento de la invención. Además, la invención apunta también a un marcador molecular que puede utilizarse en el procedimiento

30 según la invención, del tipo microsatélite (SSR), y seleccionado de forma ventajosa dentro del grupo de los marcadores microsatélites definidos por la pareja de cebadores de secuencias nucleotídicas anexas SEO ID N° 1 a 16.

La invención apunta preferentemente a un marcador molecular susceptible de

35 utilizarse en el procedimiento según la invención, del tipo microsatélite, y seleccionado de forma ventajosa dentro del grupo de microsatélites definidos por las parejas de cebadores de secuencias nucleotídicass anexas SEO ID N°

3 a 14.

Para incrementar la fiabilidad de la selección, es preferible utilizar una

combinación de dos marcadores moleculares según la invención, es decir,

5 preferentemente los marcadores microsatélites. De manera aun más preferida según la invención, se utiliza una combinación de tres marcadores moleculares microsatélites, particularmente de cuatro marcadores moleculares microsatélites, y más particularmente se selecciona una combinación de cinco marcadores microsatélites. Evidentemente pueden

10 utilizarse más de cinco marcadores moleculares si fuera necesario. Para estas combinaciones de marcadores microsatélites utilizados, las secuencias de las parejas de cebadores que definen el (los) marcador( es) se seleccionan de entre las secuencias SEO ID N° 1 a 16, preferentemente SEO ID N° 3 a

14.

15 Los marcadores microsatélites de secuencia SEO ID N° 1 a 16 que pueden utilizarse son en particular específicos de la familia de las Cucurbitáceas, preferentemente del género Cucurbita y aun más preferentemente de la especie cucurbita pepo.

20 El (los) marcador(es) molecular(es) microsatélite(s) (SSR) de los calabacines según la invención se seleccionan(n) en función de los genotipos de plantas para la ginogénesis inducida por polen irradiado.

25 Este (estos) marcador(es) molecular(es) microsatélite(s) se define(n) por su secuencia nucleotídica que se detectará por amplificación por reacción en cadena (PCR) usando cebadores específicos cuyas secuencias SEO ID 1 a 16 se detallan en los ejemplos que veremos a continuación. Estos cebadores pueden ser fragmentos de polinucleótidos clonados u oligonucleótidos

30 sintetizados químicamente. Se utilizarán preferentemente los marcadores de secuencias SEO ID N° 3 a 14.

35 Las plantas seleccionadas y/o obtenidas tras la etapa h son las plantas haploides H y dihaploides OH. Las plantas H dan plantas dihaploides OH cuando la duplicación del genoma es espontáneo o haploides dobles HO cuando la duplicación del genoma se hace por tratamiento químico o físico,

preferentemente usando colchicina.

El procedimiento según la invención comporta por consiguiente

5 preferentemente una etapa i) de duplicación del genoma de las plantas haploides H, realizándose preferentemente la etapa de duplicación del genoma de cromosomas usando colchicina.

Las plantas HD ya 2n se cultivan en tierra en invernadero mientras que las

10 plantas haploides H se "colchicinan" preferentemente in vitro y a continuación se replantan en un medio adecuado, luego enraízan y se cultivan en tierra en invernadero.

Esta técnica de duplicación del genoma usando la colchicina comprende de 15 forma ventajosa las siguientes etapas sucesivas:

1-Aislar el ápice principal de la planta así como las yemas axilares si las hay; 2-Preparar una solución de colchicina, esterilizarla a continuación; 3-Colocar los esquejes en pequeñas placas de Petri estériles;

20 4-Echar una cantidad suficiente de colchicina para cubrirlos, a continuación cerrar las placas de Petri; 5-Dejar en remojo durante varias horas; 6-Sacar los esquejes y aclararlos en botes con agua estéril; 7-Tras haberlos secado ligeramente en papel estéril, replantar todos los

25 esquejes en el medio de origen; 8-Replantar las yemas en desarrollo en el medio de origen; 9-Cuando los esquejes han enraizado, cultivarlos in vivo en un soporte con una solución nutritiva.

30 Como ya se ha explicado anteriormente, la presente invención se extiende más allá de la producción de plantas H, HD Y OH mediante ginogénesis inducida por polen irradiado. En efecto esta propone un nuevo método de optimización de la producción de plantas. Este método permite resolver el problema de la variabilidad multifactorial y generalizar la ginogénesis con

35 irradiación del polen a numerosas especies vegetales.

Este método se basa en una etapa previa de determinación de la (o de las)

dosis de irradiación adecuada(s) para aumentar los rendimientos de obtención de las plantas, teniendo en cuenta múltiples factores como la especie vegetal, los genotipos del parental masculino y del parental femenino, las condiciones climáticas y fisiológicas, el momento de la cosecha de los

5 frutos, el nivel de crecimiento de los embriones recogidos con vistas a su cultivo.

Esta etapa previa consiste esencialmente en aplicar, para cada dosis de irradiación sometida a ensayo, una etapa h') de selección de las plantas H y/o

10 OH, siendo h') igual que h) tal y como aparece definida anteriormente, para establecer después los rendimientos en plantas correspondientes y al final determinar la o las dosis que ofrecen los mejores rendimientos.

Además de los rendimientos en plantas, en esta etapa previa también se

15 pueden extraer otros resultados como: el porcentaje de frutos obtenidos, el porcentaje de granos obtenidos, el porcentaje de embriones y de plantas H, HO y OH, para una dosis de irradiación determinada.

De este modo, la presente invención trata acerca de un procedimiento de

20 producción de plantas haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides OH, siendo las HO y OH homocigotas o esencialmente homocigotas, por ginogénesis con irradiación del material reproductor del parental masculino, caracterizado por que comprende una etapa previa de determinación de la (o de las) dosis de irradiación adecuada(s) para aumentar los rendimientos de

25 dichas plantas en función de factores múltiples dados y seleccionados preferentemente de entre la especie vegetal, los genotipos del parental masculino y del parental femenino, las condiciones climáticas y fisiológicas, el momento de la cosecha de los frutos, el nivel de crecimiento de los embriones recogidos con vistas a su cultivo, el nivel de desarrollo de los embriones

30 puestos en cultivo; consistiendo esta etapa previa:

i) en someter a ensayo, para un factor dado, diferentes dosis de irradiación

sobre el material vegetal reproductor del parental masculino,

35 ii) en aplicar, para cada dosis de irradiación sometida a ensayo, una etapa h') de selección de las plantas H y/o OH, incluyendo dicha etapa:

-1-la utilización de un marcador molecular específico de alelo(s) del material genético del parental masculino irradiado para seleccionar de entre las plantas obtenidas tras la ginogénesis inducida por polen irradiado, las plantas que no contienen material vegetal del parental masculino irradiado o

5 que poseen una cantidad insuficiente como para provocar en la descendencia de dichas plantas una disyunción de un carácter fenotípico y/o genotípico;

-11-la utilización de un marcador molecular específico de un alelo, preferentemente dos alelos dados específicos del material genético del

10 parental femenino híbrido aplicado en la ginogénesis, permitiendo este marcador determinar el estado homocigota/heterocigota, eventualmente el nivel de ploidía, de las plantas a seleccionar, es decir, las plantas obtenidas tras la ginogénesis, utilizándose este marcador para seleccionar las plantas homocigotas o esencialmente homocigotas, en particular las plantas OH.

15 iii) en contar, para cada dosis de irradiación sometida a ensayo, las plantas haploides H, o OH, o H Y OH obtenidas;

iv) en calcular, para cada dosis de irradiación sometida a ensayo y a partir de 20 los recuentos resultantes de (iii), el rendimiento en plantas haploides H, o OH, o H Y OH obtenidas;

v) en comparar los recuentos resultantes de (iii) y/o los rendimientos resultantes de (iv) para deducir de ello la (o las) dosis de irradiación

25 adecuada(s).

Como ya se ha comentado anteriormente, la etapa h' comporta la utilización de marcadores y el orden de utilización del o de los marcadores moleculares específico(s) de alelo(s) del material genético masculino y el (los)

30 específico(s) del (de los) alelo(s) del material femenino importa poco. I y 11 no se realizan necesariamente en un orden preciso y pueden ser concomitantes (1 y 11 juntos) o sucesivos (1 y luego 11, o 11 y luego 1).

La invención también trata de las plantas H y OH producidas estas por el

35 procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, sabiendo que el término "planta" engloba aquí todos los estadios de desarrollo: embriones, plántula, planta adulta. En particular, concierne a los embriones haploides H y dihaploides OH obtenidos, como productos intermedios, por el procedimiento según la invención tal y como se ha definido anteriormente y las plantas regeneradas a partir de dichos embriones.

5 La invención trata también acerca de las plantas y plántulas HO obtenidas por el procedimiento tal y como se ha definido anteriormente con la etapa i) de colch icinación.

Por otra parte, la invención se refiere también a la descendencia así como a

10 las semillas y los granos procedentes de las plantas obtenidas por el procedimiento tal y como se ha definido anteriormente. En efecto, la presente solicitud también se refiere a la descendencia de las plantas obtenidas por el procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, obteniéndose dicha descendencia por cruzamiento de dichas plantas (HO o OH) entre ellas o por

15 cruzamiento entre una planta HO o OH obtenida por el procedimiento tal y como se ha definido anteriormente y una planta resultante de una línea o resultante de autofecundaciones repetidas.

Por último, la invención trata también de las semillas de plantas obtenidas por

20 el procedimiento tal y como se ha definido anteriormente o a partir de los embriones tal y como se han definido anteriormente, así como a partir de plantas resultantes de la descendencia tal y como se ha definido anteriormente.

25 Las condiciones preferentes de aplicación de los procedimientos descritos anteriormente se aplican también a los otros elementos de la invención vistos anteriormente, especialmente al procedimiento de optimización de producción de plantas mediante la determinación de la dosis de irradiación adecuada, a los embriones y a la descendencia de las plantas obtenidas por los

30 procedimientos así como su aplicación.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente solicitud.

EJEMPLOS

1-El procedimiento de fabricación de plantas haploides H vIo

dihaploides OH mediante ginogénesis inducida por polen irradiado

según la invención.

Los ensayos se realizan en invernaderos cuya temperatura por la noche es

de 15 oC y por el día de 25 oC.

Las plantas se llevan en sacos de mantillo (2 plantas por saco en el caso de las hembra y 3 plantas por saco en el caso de las macho), en espaldera y regadas por goteo.

10 El invernadero está a la sombra y ventilado y el control de las plagas se hace por protección biológica integrada.

El material biológico vegetal utilizado se constituye de lo siguiente:

15 Plantas hembra: 2 genotipos. VN001: 66 plantas. VG06: 66 plantas. Plantas macho: 1 genotipo. JIB: 90 plantas.

Las plantas se etiquetan con un número y el nombre de su genotipo.

Etapa a)

25 La víspera de la irradiación (o ionización) todas las plantas macho y hembra se comprueban y únicamente se conservan las flores que se usarán para la polinización. El número de flores macho en el estadio adecuado (el extremo de la corola comienza a ponerse amarilla) se contabiliza para conocer aproximadamente el número de polinizaciones que se harán para cada dosis

30 de irradiación. Lo mismo sucede con las flores hembra en el estadio adecuado (el extremo de la corola comienza a ponerse amarilla).

Se preparan unos controles:

35 -Control viajero (V): las flores viajan en las mismas condiciones pero no se irradian; -Control no viajero no cortado (NV): las flores se recogen inmediatamente

antes de la polinización.

Etapa b)

Las flores macho se extraen muy temprano por la mañana (de 5h30 a 6h).

-

Condiciones de las flores durante el transporte y la irradiación.

10 Se introducen 10-12 flores en cada tarro, que se cerrará. Los tarros cerrados se colocan en una nevera con un bloque refrigerante. En cada tarro se anota el tratamiento o el tipo de control. La irradiación del material reproductor del parental masculino se hace por la mañana durante una hora. Esto se repetirá en cinco fechas diferentes y se someterán a ensayo dos dosis de irradiación:

15 dosis H 175 rayos gamma (Gy) dosis O 200 rayos gamma (Gy)

-

Estimación del poder germinativo del polen irradiado.

20 El polen se pone a germinar en una gota de 45 IlL de medio con 15% de sacarosa, 100 mg/L de H3B03 y 700 mg/L de CaCI2, 2H20.

Las gotas se depositan en una lámina EPOXY y se dejan 45 min en una placa de Petri cuya atmósfera está saturada de agua, a 26 oC.

El porcentaje de granos germinados y de granos abiertos se determina con la

lupa.

Etapa e)

Dos horas tras la irradiación el material reproductor del parental masculino se

utiliza para la polinización.

Una flor hembra o material reproductor del parental femenino se fecunda con 35 una flor macho o material reproductor del parental masculino.

Los días posteriores a la polinización, se verifica el cuajado de los frutos y si

este no se produce, el fruto se elimina.

Etapa d)

5 Los frutos se cosechan de 4 a 5 semanas después de la polinización y se etiquetan en función de su genotipo, del tratamiento de las flores macho o del tipo de control.

Los frutos se cosechan preferentemente por la mañana.

Etapa e)

Cada fruto se lava con agua y con jabón de Marsella, se aclara y se seca.

15 Bajo el flujo laminar se echa alcohol de 70° sobre el fruto que se limpia a continuación en toda su superficie con un papel estéril.

A partir de esta etapa todas las operaciones se desarrollarán en condiciones de esterilidad bajo el flujo laminar.

Se realiza una incisión alrededor de todo el fruto, a continuación se retira la pulpa usando un cuchillo.

Los granos se recogen usando una cuchara, se separan de la pulpa con una 25 pinza y un escalpelo y a continuación se cuentan.

Los granos se ponen en agitación durante toda la noche.

Etapa f)

Bajo el flujo laminar el tarro ancho se vacía en un tarro alto estéril mediante un embudo estéril, a continuación se aclara con agua estéril. Los granos se abren uno a uno bajo la lupa binocular usando una pinza y un escalpelo.

35 Los instrumentos se esterilizan regularmente para evitar cualquier riesgo de contam inación.

El embrión se deposita en un medio de cultivo S1 C, cuya composición se detalla en las tablas 8 y 9 que veremos posteriormente, en placas de Petri de 60x15, 4 embriones por placa de Petri.

5 Los embriones obtenidos tras fecundación por polen irradiado no tienen la misma forma que los embriones normales.

Las placas de Petri se colocan en la oscuridad de 1 a 2 noches en cámara a 20/25 oC, luego se ponen a la luz en la misma cámara a 20/25 oC durante 16 10 horas.

Etapa g)

Los embriones se ponen en cultivo en el medio de cultivo por el PPM (plant 15 preservative mixture) comercializado por la empresa Kalys®.

Los embriones se replantan en el medio S3P (P =PPM) cuya composición figura en las tablas 8 y 9.

20 Las placas de Petri se controlan regularmente. Los embriones se replantan si existe contaminación por una bacteria o un hongo.

Los embriones se replantan cada 15 días en placa de Petri en un medio nuevo mientras no estén lo suficientemente desarrollados.

Desde el momento de la aparición de hojas jóvenes y pequeñas raíces los embriones se trasladan a un medio en tubos S3P (véase composición en las tablas 8 y 9).

30 Las plántulas bien desarrolladas se replantan a continuación en tarro en S2P

o S4P cuyas composiciones figuran en las tablas 8 y 9.

Etapa h)

35 Desde el momento en que el desarrollo foliar es suficiente, se toma una muestra de cada planta y se analiza por citometría de flujo así como mediante marcadores moleculares SSR.

Etapa h1)

Se toma una muestra de cada planta y se analiza el nivel de ploidía por 5 citometría de flujo de acuerdo con los protocolos desarrollados por Laat et al. en Theo. Appl. Genet, 1984, 67: 463-467 y en Plant Breeding, 1987, 99: 303

307. Las plantas con ploidías indeterminadas, anormales, se descartan y las plantas con n cromosomas se diferencian de las plantas con 2n cromosomas.

10 Etapa h2)

Se toma una muestra de cada planta, el AON se extrae según el protocolo CTAB modificado por Tomas et al. (1989). El (los) marcador(es) SSR se selecciona(n) de entre los SSR definidos por las parejas de cebadores de

15 secuencias SEO ID N° 1 a SEO ID N° 16 que veremos posteriormente. El marcador FA02 se define por las parejas de cebadores SEO ID Na 11 y SEO ID N° 12. La reacción de PCR se realiza en un volumen de reacción de 5 111 constituido por la mitad de 5 111 de AON diluido, 0,85 111 de agua, 1 111 de tampón 10x, 1 111 de MgCI2 (25 mM), 1 111 de dNTP (2,5 mM), 0,5 111 de cada

20 cebador (2 IlM), 0,075 de queue M13 (8 IlM) Y 0,075 de Taq Invitrogen (5U/ Ill).

La reacción de PCR consiste en varios ciclos de amplificación que se

describen a continuación: 1 etapa de 5 minutos a 94 oC, 10 ciclos a 94 oC

25 durante 15 segundos, luego a 57 grados durante 15 segundos y finalmente a 72 oC durante 30 segundos, a continuación 30 ciclos a 94 oC durante 15 segundos, luego a 52 grados durante 15 segundos y finalmente a 72 oC durante 30 segundos, y una elongación final realizada a 72 oC durante 7 minutos.

30 Para realizar la etapa de selección h (en particular h2), de entre los ocho marcadores moleculares microsatélites (SSR) preferidos siguientes y definidos por los cebadores nucleotídicos SEO ID N° 1 a 16 siguientes, se han utilizado los marcadores FA02, CMAGN73, CUCNITRA, T J3, CMBR153

35 y PALT1:

-

Marcador CMAGN73 definido por la pareja de cebadores de las siguientes

secuencias nucleotídicas: 5' ATCCAACTCGACCAAGAAAC 3' (SEa ID N° 1) es decir el cebador sentido y 3' CAGCTCTACAACAACATCTC 5' (SEa ID N° 2) es decir el cebador

5 antisentido.

-

Marcador CMBR153 definido por la pareja de cebadores de las siguientes secuencias nucleotídicas: 5' TCAAAGACAAGAAGACCAACCA 3' (SEa ID N° 3) es decir el cebador

10 sentido y 3' TGTGCTAAGAGAGAGAGAGAAGATTG 5' (SEa ID N° 4) es decir el cebador antisentido.

15 -Marcador CMBR22 definido por la pareja de cebadores de las siguientes secuencias nucleotídicas: 5' CCAAAACGACCAAATGTTCC 3' (SEa ID N° 5) es decir el cebador sentido y 3' ATACAGACACGCCTTCCACC 5' (SEa ID N° 6) es decir el cebador

20 antisentido.

-

Marcador CMMP73 definido por la pareja de cebadores de las siguientes secuencias nucleotídicas: 5' GCACTTTGAGTAAGAAGCAGA 3' (SEa ID N° 7) es decir el cebador

25 sentido y 3' GCTGTGAGGTTGACTACGA 5' (SEa ID N° 8) es decir el cebador antisentido.

30 -Marcador CUCN ITRA definido por la pareja de cebadores de las siguientes secuencias nucleotídicas: 5' CAAACCATAACTTCCAAGG 3' (SEa ID N° 9) es decir el cebador sentido y 3' GGAGATCGACGAATTTGA 5' (SEa ID N° 10) es decir el cebador

35 antisentido.

-

Marcador FAD2 definido por la pareja de cebadores de las siguientes

secuencias nucleotídicas: 5' CACGAGCAGAGAGATAATAAA 3' (SEa ID N° 11) es decir el cebador sentido y

5 3' CCTGAAAGAGAGGAAGAAGAA 5' (SEa ID N° 12) es decir el cebador antisentido.

-

Marcador PATL 1 definido por la pareja de cebadores de las siguientes secuencias nucleotídicas:

10 5' TACTCCGCCCTCTCTCTC 3' (SEa ID N° 13) es decir el cebador sentido y 3' CAGGTGCAGAATCTGGTAGT 5' (SEa ID N° 14) es decir el cebador antisentido.

15 -Marcador T J3 definido por la pareja de cebadores de las siguientes secuencias nucleotídicas: 5' TGGGCCTACGCTACAAACTT 3' (SEa ID N° 15) es decir el cebador sentido y

20 3' AGCAGCACAAAAGCACTTCA 5' (SEa ID N° 16) es decir el cebador antisentido.

Estos cebadores se han realizado según los métodos conocidos por el experto en la materia. Para los marcadores satélites dados, en función del

25 tamaño de los fragmentos amplificados por PCR gracias a los cebadores específicos (véase tablas 3 a 6 que veremos posteriormente), se han podido seleccionar las plantas H, o OH, o H y OH. De este modo, los marcadores moleculares utilizados permiten, entre otros aspectos, determinar si una planta es resultante o no de una fecundación, si es homocigota o no.

Si la planta es resultante de una fecundación entre el material vegetal masculino y el material vegetal femenino o si esta no ha sufrido reducción gamética, se elimina tras el análisis con los marcadores moleculares SSR, pero si es una planta dihaploide, se conserva.

Las plantas n sufren un tratamiento con colchicina in vitro para duplicar su genoma (véase etapa i) ya expuesta). A continuación se replantan, se enraízan y brotan.

Etapa i) La duplicación del genoma (tratamiento con colchicina):

5 1-Aislar el ápice principal de la planta así como las yemas axilares si las hay (esquejes); 2-Preparar una solución de colchicina de 5 por 1000 (0,5 g de colchicina en 100 mi) y esterilizarla; 3-Colocar los esquejes en pequeñas placas de Petri estériles (BP 35x10);

10 4-En cabina de seguridad microbiológica, echar una cantidad suficiente de colchicina para cubrir los esquejes (de 6 a 8 mi), a continuación cerrar la placa; 5-Dejar en remojo durante 2 horas; 6-Sacar los esquejes y aclararlos en botes pequeños con agua estéril;

15 7-Tras haberlos secado ligeramente en papel estéril, replantar todos los esquejes en botes en su medio de origen; 8-Replantar las yemas en desarrollo en el medio de origen numerándolas de C1 (<<C» para colchicina) a CX; 9-Cuando los esquejes hayan enraizados y por consiguiente estén listos,

20 cultivarlos in vivo en un soporte coco con un riego de la solución nutritiva.

11-Resultados de los cuajados y número en frutos en función de los genotipos (Tabla 1) Tabla 1

Irradiación N° Día y Hora irradiación Día y Hora polinización

1 J-116H J 7H 2 J 8H J 11H30 3 J-116H J 7H 4 J 8H J 12H15 5 J 8H J 11H30 Total

Número frutos

VG06

VG06 polinizados Número frutos 10 9 19 11 12 61

general

VG06 a término % de agarre de 10 9 19 11 12 61

VG06

100% 100% 100% 100% 100% 100%

VN001

Número frutos

11

10 19 15 9 61

general

VN001 polinizados Número frutos

VN001 a término

11 10 16 14 8 59

Irradiación N°

1 2 3 4 5 Total

Día y Hora irradiación

J-116H J 8H J-116H J 8H J 8H

Día y Hora polinización

J 7H J 11H30 J 7H J 12H15 J 11H30

% de agarre de

100%

100%

100%

93% 88% 97%

VN001

VG06

VG06 175 Gy JIB 7 7 13 7 7 41

detalle (Número

VG06 200 Gy JIB 3 2 4 2 3 14

de frutos)

Controles X X 2 2 2 6

VN001

VN001 175 Gy JIB 7 7 12 9 6 41

detalle (Número

VN001 200 Gy JIB 3 2 4 5 2 16

de frutos)

Controles 1 1 X X X 2

Total

21 19 35 30 20 125

Se constata un muy buen cuajado general. 127 fecundaciones han permitido el desarrollo de 125 frutos, es decir, el 98% de éxito.

5 111-Resultados obtenidos en función de los genotipos de los parentales y de la dosis de irradiación (ionización) realizada (Tabla 2)

Las dosis 175 Gy y 200 Gy se han sometido a ensayo en el material vegetal 10 reproductor del parental masculino JIB y los resultados de la ginogénesis con el material vegetal femenino (VN001 y VG06) figuran a continuación.

Genotipo

Dosis Gy Número de frutos Número de granos Número embriones Talla media embriones cm Número plantas en tubos

VG06

175(H) 200(0) 44 16 9707 3710 289 30 0,18 0,12 24 1

VN001

175(H) 200(0) 41 16 2435 722 62 11 0,13 0,1 4 O

Tabla 2

La tabla muestra que la dosis 200 Gy utilizada para la irradiación del polen es demasiado fuerte para obtener, con los genotipos VG06 y VN001, embriones que se desarrollen. Por el contrario, la dosis de 175 Gy se adapta mejor puesto que permite producir no solo más frutos con los dos genotipos femeninos sometidos a ensayo (VG06 y VN001), sino que también se desarrollan más embriones (24 para VG06 y 4 para VN001).

IV-Selección con los marcadores moleculares

1. Análisis de las plantas resultantes de VN001

Al Análisis de las plantas con el fin de identificar las plantas que contienen material genético del parental masculino (Tabla 3):

Las plantas híbridas VN001 utilizadas como hembra en el procedimiento de producción de plantas por ginogénesis con irradiación del material reproductor del parental masculino poseen un alelo de 171 pares de bases para el marcador FAD2, mientras que las plantas JIB utilizadas como planta macho poseen un alelo de 169 pares de bases para ese mismo marcador.

De manera similar, el alelo del marcador CMAGN73 es de 128 pares de bases para VN001, mientras que es de 132 para JIB, yel alelo del marcador CUCN ITRA es de 160 pares de bases para VN001, mientras que es de 165 para JIB.

La tabla 3 muestra el análisis molecular de las plantas resultantes de VN001 según el procedimiento de la presente invención e indica, para cada planta sometida a ensayo, la presencia o la ausencia de material genético del parental masculino.

Marcadores

N° Planta

FAD2 CMAGN73 CUCNITRA

JIB

169 132 165

VNOO1

171 128 160

Marcadores

N° Planta

FAD2 CMAGN73 CUCNITRA

Planta 1

X X X

Planta 2

X X X

Planta 3

X X

Planta 4

X X X X

Tabla 3

Esta tabla 3 muestra que los marcadores FA02, CMAGN73 y CUCNITRA permiten identificar las plantas que tienen genoma masculino. Tras una PCR

5 que utiliza los cebadores (SEQ ID N° 11 Y 12 ya definidos anteriormente) específicos del marcador molecular FA02, el análisis de esta PCR muestra para las plantas 1, 3 y 4 la presencia del alelo de 169 pares de bases específico del material reproductor masculino JIB. Las plantas 1, 3 Y 4 tienen por consiguiente un genoma masculino en su genoma. Estos resultados

10 demuestran por tanto que la utilización de marcador(es) molecular(es) determinado(s) (aquí CMAGN73, CUCNITRA y particularmente FA02) permite hacer un análisis y una selección eficaz y segura del origen de las plantas producidas.

15 BI Análisis de las plantas con el fin de distinguir las plantas homocigotas de las plantas heterocigotas (Tabla 4):

Las plantas híbridas VN001 utilizadas como hembra en el procedimiento de producción de plantas por ginogénesis con irradiación del material

20 reproductor del parental masculino tienen un alelo de 130 pares de bases y un alelo de 138 pares de bases para el marcador T J3.

De modo similar, los alelas del marcador CMBR153 son de 166 y 182 pares

de bases para VN001, y los de PLAT1 son de 195 y 204 pares de bases.

25 La tabla 4 muestra el análisis molecular de las plantas resultantes de VN001 según el procedimiento de la presente invención e indica, para cada planta sometida a ensayo, la presencia de uno o varios alelas de cada marcador.

Marcadores

N° Planta

TJ3 CMBR153 PALT1

VNOO1

130 138 166 182 195 204

Planta 1

X X X X

Planta 2

X X X

Planta 3

X X X X

Planta 4

X X X

Tabla 4

Esta tabla muestra que las plantas 1 y 3 son heterocigotas. En efecto, gracias al marcador T J3, se constata la presencia de un alelo de 130 pares de bases

5 y de otro alelo de 138 pares de bases. Con los marcadores T J3, CMBR153 y PAL T1, las plantas 2 y 4 se muestran homocigotas. Estos resultados demuestran que la utilización de marcador(es) molecular(es) determinado(s) (aquí TJ3, CMBR153, PATL 1) permite hacer un análisis y una selección eficaz y segura del estado homocigota/heterocigota, y eventualmente de

10 ploidía, de las plantas producidas.

2. Análisis de las plantas resultantes de VG06

Al Análisis de las plantas con el fin de identificar las plantas que 15 contienen material genético del parental macho (Tabla 5):

Las plantas híbridas VG06 utilizadas como hembra en el procedimiento de producción de plantas por ginogénesis con irradiación del material reproductor del parental masculino poseen un alelo de 171 pares de bases

20 para el marcador FAD2, mientras que las plantas JIB utilizadas como planta macho poseen un alelo de 169 pares de bases para ese mismo marcador.

De manera similar, el alelo del marcador CUCNITRA es de 160 para VN001, mientras que es de 165 para JIB, y el alelo del marcador CMAGN73 es de

25 128 pares de bases para VG06, mientras que es de 132 para JIB.

La tabla 5 muestra el análisis molecular de las plantas resultantes de VG06 según el procedimiento de la presente invención e indica, para cada planta sometida a ensayo, la presencia o la ausencia de material genético del

parental masculino.

Marcador

N° Planta

FAD2 CUCNITRA CMAGN73

JIB

169 165 132

VG06

171 160 128

Planta 1

X X X

Planta 2

X

Planta 3

X

Planta 4

X X X X X

Planta 5

X X X X

Planta 6

X X X X X

Planta 7

X X X

Planta 8

X X X

Planta 9

X X X X

Planta 10

X X X X X

Planta 11

X X X X

Planta 12

X X X X X X

Planta 13

X X X X

Planta 14

X X

Planta 15

X X

Planta 16

X X

Planta 17

X X

Planta 18

X X X

Planta 19

X X

Tabla 5

5 Del mismo modo que para los análisis con VN001 (tabla 3), gracias a los marcadores moleculares FAD2, CUCNITRA, CMAGN73, esta tabla permite identificar las plantas que contienen genoma masculino: las plantas 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 18 Y 19. Estos resultados demuestran por tanto que la utilización de marcador(es) molecular(es) determinado(s) (aquí FAD2, 10 CUCNITRA, CMAGN73) permite hacer un análisis y una selección eficaz y segura del origen de las plantas producidas.

BI Análisis de las plantas con el fin de distinguir las plantas

homocigotas de las plantas heterocigotas (Tabla 6):

Las plantas híbridas VG06 utilizadas como hembra en el procedimiento de

5 producción de plantas por ginogénesis con irradiación del material reproductor del parental masculino tienen un alelo de 130 pares de bases y un alelo de 138 pares de bases para el marcador T J3.

De modo similar, los alelas del marcador CMBR153 son de 166 y 182 pares 10 de bases para VG06, y los de PLAT1 son de 195 y 204 pares de bases.

La tabla 6 muestra el análisis molecular de las plantas resultantes de VG06 según el procedimiento de la presente invención e indica, para cada planta sometida a ensayo, la presencia de uno o varios alelas de cada marcador.

Marcadores

N° Planta

TJ3 CMBR153 PALT1

VG06

130 138 166 182 195 204

Planta 1

X X X X X

Planta 2

X X X

Planta 3

X X X X X

Planta 4

X X X

Planta 5

X X X X X

Planta 6

X X X

Planta 7

X X X

Planta 8

X X X X X

Planta 9

X X X X X

Planta 10

X X X X X X

Planta 11

X X X X

Planta 12

X X X X

Planta 13

X X X X X X

Planta 14

X X X

Planta 15

X X X X X

Planta 16

X X X X

Planta 17

X X X X X

Marcadores

N° Planta

TJ3 CMBR153 PALT1

VG06

130 138 166 182 195 204

Planta 18

X X X X

Planta 19

X X X X X

Tabla 6

Esta tabla 6 muestra que con los marcadores T J3, CMBR153 y PAL T1, solo

las plantas 4 y 6 son homocigotas, las demás plantas se muestran

5 heterocigotas con estos marcadores moleculares. Estos resultados demuestran que la utilización de marcador(es) molecular(es) determinado(s) (aquí T J3, CMBR153, PAL T1) permite hacer un análisis y una selección eficaz y segura del estado homocigota/heterocigota, y eventualmente de ploidía, de las plantas producidas.

IV-Tabla recapitulativa del efecto de las dosis de irradiación en la

obtención de plantas heterocigotas y de plantas haploides (Tabla 7)

Dosis de irradiación

Año Número de plantas sometidas a ensayo por citometría de flujo ySSR Número de plantas heterocigotas (2n) Número de plantas haploides (n)

25 Gy /150 Gy

2003 628 628 O

125 Gy /150 Gy

2004 1734 1734 O

125 Gy

2005 2931 2931 O

125 Gy /150 Gy

2006 461 460 O

175 Gy / 200 Gy

2007 20 10 10

Tabla 7

15 Las dosis de 25 a 50 Gy implican la producción de numerosas plantas, todas identificadas como heterocigotas. La dosis de 175 Gy permite no solo reducir el número de plantas producidas a analizar, sino también aumentar considerablemente el número de plantas haploides entre las plantas

20 producidas. Como ya se ha explicado ampliamente con anterioridad, estas plantas haploides resultan de especial interés. En consecuencia, esta tabla demuestra que la dosis de irradiación influye en el éxito del procedimiento aplicado en la presente invención y que esta dosis puede optimizarse para una mayor producción de plantas haploides. De este modo, con la dosis de 175 Gy es posible mejorar la producción de plantas haploides H y dobles

5 haploides HD, mediante ginogénesis inducida por un gametofito masculino irradiado y obtener en consecuencia una estabilización del genoma de las plantas producidas con un número reducido de generaciones.

VI-Medios de cultivo

Composición

S1C S3P S2P S4P

TZ2

X Y>X

TZ4

X Y>X

Sacarosa

30 gil 5 gil 5 gil

Plant Preservation Mixture (Kalys®)

1 mili 1 mili 1 mili

Vitro Agar

8 gil 8 gil 8 gil 8 gil

pH

5,9 5,9 5,9 5,9

Autoclave 120 °C/20 min

Quinetina

0,05 mg/l 0,05 mg/l

Ácido naftaleno acético

0,05 mg/l 0,05 mg/l

Cefotaxima

300 mg/l

Tabla 8

Composición medio

TZ2 TZ4

Macro Murashige et Skoog

X 5

Macro CP

X

Micro Murashige et Skoog

X

Micro CP

X

Vitaminas MOREL

X

Vitaminas P

X

Sacarosa

3% 10

Tabla 9

15 Detalles de las composiciones de la tabla 9: -Medio TZ4 sin sacarosa ni agar:

Macro elemento CP : en mg. L-1

KN03 NH4N03 Ca(N03b 4 H20 CaCb,2H2O MgS04,7H2O KCI Na H2P04, H20 KH2P04 (NH4hS04

Fer EDTA : en mg. L-1 FeS04,7H20 Na2EDTA 2150 1238 50 313 412 7 38 142 34

27,8 37,8

Macro elemento CP : en mg. L-1 MnS04,H20 22,13 H3B03 3,15 ZnS04,7H2O 3,62 Na2Mo04 0,188 CuS04,5H2O 0,016 CoCb 0,016 KI 0,695

Vitaminas P: en Ilg L-1 Meso Inositol 50,35 mg. L_1 Tiamina 600 ug. L _1 Ácido nicótico 700 Piridoxina 5500 Pantotenato de calcio 500 Biotina 5

-

Medio TZ2 con sacarosa: Micro elemento M5: en mg. L-1 KN03 1900 NH4N03 1650 Macro elemento M5: en mg. L-1 MnS04,H20 16,90 H3B03 6,20 ZnS04,7H2O 8,60 Na2Mo04, 2H2O 0,25 CuS04,5H2O 0,025 CoCb,6H20 0,025 KI 0,83

CaCb

332,02

Mg S04,

180,54

KH2P04

170

FeNa EDTA:

36,70

Vitaminas MOREL: en mg. L-1 Meso Inositol 100 mg. L-1 Tiamina 1 Ácido nicotínico 1 Piridoxina 1 Pantotenato de calcio 1 Biotina 0,01 Sacarosa: 30 000,00 mgll

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de producción de plantas haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides OH , siendo las HO y OH homocigotas o esencialmente

   5 homocigotas, siendo este un tipo de procedimiento que compete a la técnica de ginogénesis inducida por polen irradiado, caracterizado por que comprende:

   -

   una etapa de irradiación del material reproductor del parental masculino con

   10 una dosis comprendida entre 160 y 190 rayos gamma, preferentemente entre aproximadamente 165 y 185 rayos gamma (Gy), -o una etapa de selección de las plantas haploides H, o OH, o H Y OH mediante la utilización de marcador(es) molecular(es), -o una etapa de irradiación del material vegetal reproductor del parental

   15 masculino con una dosis comprendida entre 165 y 185 rayos gamma (Gy) y una etapa de selección de las plantas haploides H, o OH, o H Y OH mediante la utilización de marcador(es) molecular(es).
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que

   20 comprende las siguientes etapas sucesivas: a) Aplicar material reproductor del parental masculino; b) Irradiar dicho material reproductor del parental masculino con una dosis comprendida entre 160 y 190 rayos gamma (Gy), preferentemente entre 165 y 185 rayos gamma;

   25 c) Polinizar el material reproductor del parental femenino híbrido con dicho material reproductor del parental masculino irradiado; d) Recolectar los frutos cuyos granos contienen los embriones; e) Extraer los granos de dichos frutos; f) Extraer los embriones de dichos granos;

   30 g) Poner en cultivo los embriones en un medio adecuado hasta la obtención de una planta.
3. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende además, tras la etapa g), una etapa h) que consiste en

   35 seleccionar la plantas haploides H, o OH, o H Y OH por citometría de flujo, o mediante la utilización de marcador(es) molecular(es), o por citometría de flujo y utilización de marcador(es) molecular(es).
4. 4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que comprende en la etapa h de selección de las plantas haploides H, o OH, o H y OH:

   5 -1-la utilización de marcador(es) molecular(es) específico(s) de alelo(s) dado(s) contenido(s) en el material genético del parental masculino irradiado para seleccionar de entre las plantas obtenidas tras la etapa g) las plantas que no contienen material genético del parental masculino irradiado o que

   10 poseen una cantidad insuficiente para provocar en la descendencia de dichas plantas una disyunción de un carácter fenotípico y/o genotípico; -11-la utilización de marcador(es) molecular(es) específico(s) de alelo(s) dado(s) contenido(s) en el material genético del parental femenino híbrido, permitiendo este (estos) marcador( es) determinar el estado

   15 homocigota/heterocigota de las plantas a seleccionar, es decir, las plantas obtenidas tras la etapa g), utilizándose este (estos) marcador( es) para seleccionar las plantas homocigotas o esencialmente homocigotas, en particular las plantas OH.

   20 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende además una etapa i) de duplicación del genoma de las plantas haploides H.
5. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que la etapa 25 i) de duplicación del genoma se realiza usando colchicina.
6. 7. Procedimiento, en particular según cualquiera las reivindicaciones anteriores, de producción de plantas haploides H, dobles haploides HO y/o dihaploides OH, siendo las HO y OH homocigotas o esencialmente

   30 homocigotas, por ginogénesis inducida con irradiación del material reproductor del parental masculino, caracterizado por que comprende una etapa previa de determinación de la (o de las) dosis de irradiación adecuada(s) para aumentar los rendimientos de dichas plantas en función de factores múltiples dados y seleccionados preferentemente de entre la especie

   35 vegetal, los genotipos del parental masculino y del parental femenino, las condiciones climáticas y fisiológicas, el momento de la cosecha de los frutos, el nivel de crecimiento de los embriones recogidos con vistas a su cultivo, el nivel de desarrollo de los embriones puestos en cultivo; consistiendo esta

   etapa previa:

   i) en someter a ensayo, para un factor dado, diferentes dosis de irradiación

   5 sobre el material vegetal reproductor del parental masculino, ii) en aplicar, para cada dosis de irradiación sometida a ensayo, una etapa h') de selección de las plantas H, o OH, o H Y OH , incluyendo dicha etapa h': -1-la utilización de marcador(es) molecular(es) específico(s) de alelo(s) del material genético del parental masculino irradiado para seleccionar de entre

   10 las plantas obtenidas tras la ginogénesis inducida por polen irradiado las plantas que no contienen material vegetal del parental masculino irradiado o que poseen una cantidad insuficiente para provocar, en la descendencia de dichas plantas, una disyunción de un carácter fenotípico y/o genotípico; -11-la utilización de marcador(es) molecular(es) específico(s) de alelo(s)

   15 dado(s) específico(s) del material genético del parental femenino híbrido aplicado en la ginogénesis, permitiendo este (estos) marcador(es) determinar el estado homocigota/heterocigota de las plantas a seleccionar, es decir, de las plantas obtenidas tras la ginogénesis, utilizándose este (estos) marcador(es) para seleccionar las plantas homocigotas o esencialmente

   20 homocigotas, en particular las plantas OH. iii) en contar, para cada dosis de irradiación probada, las plantas haploides H,

   o OH, o H Y OH obtenidas; iv) en calcular, para cada dosis de irradiación sometida a ensayo y a partir de los recuentos resultantes de (iii), el rendimiento en plantas haploides H, o OH,

   25 o H Y OH obtenidas; v) en comparar los recuentos resultantes de (iii) y/o los rendimientos resultantes de (iv) para deducir de ello la (o las) dosis de irradiación adecuada(s).

   30 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las plantas parentales se seleccionan entre el género Cucurbita.
7. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

   35 caracterizado por que el (los) marcador(es) molecular(es) utilizado(s) es (son) un(os) marcador(es) microsatélite(s) (SSR).
8. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el (los) marcador(es) molecular(es) utilizado(s) se selecciona(n) entre los marcadores definidos por una o algunas parejas de cebadores de secuencias nucleotídicas SEO ID N° 1 a 16, preferentemente

   5 SEO ID N° 3 a 14.
9. 11. Uso de un marcador molecular caracterizado por que es un marcador microsatélite (SSR) seleccionado entre los marcadores definidos por una o algunas parejas de cebadores de secuencias nucleotídicas anexas SEO ID N°

   10 1 a 16, preferentemente SEO ID N° 3 a 14, en el procedimiento según cualquiera las reivindicaciones 1 a 10.
10. 12. Embriones haploides H de plantas como las obtenidas por el

    procedimiento tal y como aparece definido en cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 10.

11. 13.

    Embriones dihaploides OH de plantas como las obtenidas por el procedimiento tal y como aparece definido en cualquiera las reivindicaciones 1 a 10.

12. 14.

    Descendencia de las plantas obtenidas por el procedimiento tal y como aparece definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. 15.

    Descendencia de las plantas obtenidas por el procedimiento tal y como

    25 aparece definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, obteniéndose dicha descendencia por cruzamiento entre dos plantas (HD o OH) resultantes del procedimiento tal y como aparece definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o por cruzamiento entre una planta HD o OH resultante del procedimiento tal y como aparece definido en cualquiera de las

    30 reivindicaciones 1 a 10 y una planta resultante de una línea estable o resultante de autofecundaciones repetidas.
14. 16. Semillas de plantas obtenidas por el procedimiento tal y como aparece definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o a partir de los

    35 embriones tal y como aparecen definidos en cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, así como a partir de plantas resultantes de la descendencia tal y como aparece definida en cualquiera de las

    reivindicaciones 14 o 15.