5 SISTEMA DE CONTEO DE PARTICULAS ADAPTABLE A UN INSTRUMENTO ÓPTICO Campo técnico de la invención La presente invención se refiere al campo de conteo celular y de partículas. En particular, se refiere a los sistemas de conteo de células y partículas con microscopio o lupa. 10 Más concretamente, se refiere a los sistemas de conteo con microscopio o lupa basados en análisis de imagen que realizan un conteo automático, semi-automático o semi-asistido. 15 20 25 30 Estado de la Técnica Se conocen diversas técnicas antiguas de conteo celular como puede ser la divulgada por la patente US-5135302 (Citómetro de flujo) o por la patente US-1918351 (hemacitómetro/Cámara de Neubauer). Estas técnicas presentan diversas desventajas y problemas. Entre los que destacan los siguientes: El conteo en cámara de Neubauer presenta las siguientes desventajas y problemas: (a) errores humanos de conteo; (b) errores estadísticos; (c) errores en el cálculo de concentración, al aplicar la fórmula matemática correspo ndiente; (d) baja reproductibilidad / alta varianza en las mediciones realizadas; (e) proceso muy tedioso y monótono para los técnicos de laboratorio; (f) proceso difícil de realizar para personas con deficiencias visuales; (g) proceso fatigante para la vista del técnico de laboratorio. El conteo en citómetro de flujo presenta las siguientes desventajas y problemas: (a) destrucción de la muestra al realizarse el conteo;
5 (b) sistema con un alto coste de mantenimiento; (c) sistema requiere calibraciones periódicas; (d) si el sistema no se usa a menudo, se estropea; (e) el sistema no permite la observación visual de las muestras por los técnicos. Las cámaras de recuento del tipo de las descritas por US 1918351 (cámara de Neubauer) son unas cámaras adaptadas al microscopio de campo claro o al de 10 contraste de fases. Consisten, en general, en un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula con unas dimensiones dadas, con una separación entre dos líneas consecutivas conocida. Para contar las células se observa el retículo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las células. 15 Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la muestra líquida inicial. 20 Uno de los problemas de esta técnica reside en la inexactitud que se produce cuando se realiza el conteo, ya que, se utiliza una fórmula estadística que introduce cierto error, y además también está presente el error humano. Esta inexactitud se traduce en una menor fiabilidad y reproductibilidad (fiabilidad = ausencia de error en la medida, reproductibilidad = precisión = coherencia en las mediciones de una misma 25 concentración). US 5135302 describe un Citó metro de flujo. La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo 30 de luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con éste causando dispersión de la luz. Basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de 35 estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas
fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. Un problema importante de esta técnica reside en la destrucción de la muestra que se 5 va a utilizar para realizar el conteo, ya que al exponer las células al rayo de luz y a la fluorescencia estamos destruyendo la muestra extraída. También se conocen diversas técnicas basadas en otros principios para recuento de células. Ejemplos de ello son patentes y solicitudes de patente como US 10 2007/0143033 que divulga sistemas y métodos para contar partículas por Beckam Coulter, US 2007/0012784 trata sobre la autentificación de producto por Thomas J. Mercolino, US 2008/0050619 "Fuel celllife counter and method of managing remaining life" por Life Technologies, US 3973194 de 1976 por Daniel W. McMorris y William J. Skidmore, US 5159642 de 1992 por Tokihiro Kosaka o US 5741648 de 1998 por 15 George P. Hemstreet que describe un método de análisis celular usando análisis de imagen cuantitativo fluorescente. 20 Breve descripción de la invención La presente invención propone un sistema adaptable a cualquier microscopio o lupa. Actualmente, los sistemas de conteo automáticos celulares son máquinas cerradas que únicamente permiten realizar conteos celulares. El sistema reivindicado aprovecha los microscopios existentes y los convierte en máquinas de contar células permitiendo 25 realizar conteos y medidas en un rango más amplio. El montaje sobre el microscopio, permite además ahorrar espacio en el banco de trabajo. 30 Ventajosamente, la invención permite además el conteo automático en cualquier recipiente de profundidad conocida que pueda ser observado en el microscopio. Para conseguir estos objetivos, se han tenido que resolver varias dificultades: Problemas con la iluminación de algunos microscopios. Según el microscopio, puede ser necesario incorporar un detector de luminosidad, e incluir un parámetro de luminosidad asociado a cada perfil celular. Si cuando se intenta contar se ha
cambiado la luminosidad con la que se configuró el sistema obliga a volver a definir el perfil. Problemas de desenfoque. Hay microscopios que se desenfocan en cuestión de segundos o moviendo la pletina. Se ha paliado este problema mostrando 5 instantáneamente el análisis en pantalla (si el análisis es incorrecto, normalmente es un problema de desenfoque y el usuario se da cuenta inmediatamente y lo corrige). Problemas de artefactos, suciedad del microscopio y aberraciones de las lentes en microscopios de baja calidad, usados, etc. Se pueden definir áreas de exclusión 10 para eliminar áreas de la pantalla especialmente problemáticas y evitar que se utilicen en el conteo. Sistema de conteo de partículas adaptable a un instrumento óptico que incluye unos medios de captación de imágenes para adquirir imágenes de un recipiente con una 15 muestra a través del instrumento óptico, unos medios de visualización para visualizar imágenes adquiridas por los medios de captación asociadas a la muestra, unos medios de procesamiento de las imágenes adquiridas. Los medios de procesamiento identifican bordes de zonas de la posible partícula y permiten identificar una pluralidad de regiones de la imagen delimitadas por los bordes, para asociarlas al fondo de la 20 imagen o para asociarlas a una zona de posible partícula. También permiten comprobar si cumple con una condición preestablecida basada en al menos uno de los siguientes parámetros geométricos: longitud máxima, longitud mínima, perímetro, área o coincidencia con un patrón de contorno prefijado. También permiten contabilizar como partículas aquellas zonas que cumplen con la condición preestablecida. 25 Los medios de procesamiento pueden opcionalmente convertir la imagen adquirida a una escala de tonalidades de acuerdo con su intensidad luminosa y longitud de onda. Opcionalmente, los medios de visualización pueden marcar distintivamente las zonas 30 de posible partícula que han sido contabilizadas.
Opcionalmente, los medios de visualización pueden comprender una interfaz para verificar mediante la comprobación interactiva por un usuario de una zona de posible partícula contabilizada para permitir descartarla como contabilizada. 5 Opcionalmente, los medios de procesamiento permiten además asignar un valor en la escala de tonalidades a las regiones identificadas como fondo de la imagen. 10 Ventajosamente, los medios de procesamiento pueden asociar un tamaño de partícula de acuerdo con el número de píxeles en la imagen correspondiente. Ventajosamente, los medios de procesamiento pueden calcular la concentración de partículas por unidad de volumen cuando la muestra se sitúa en un contenedor de dimensiones conocidas. 15 Favorablemente, los medios de procesamiento pueden excluir de una imagen adquirida una región de exclusión de acuerdo con lo definido por un usuario a través de la interfaz de los medios de visualización. 20 Opcionalmente, la imagen captada se convierte a una imagen en escala de grises. El sistema es aplicable en particular cuando las partículas son microorganismos biológicos. Los microorganismos biológicos pueden ser, entre otros, células, hongos, algas o plaquetas. 25 Los medios de procesamiento pueden realizar opcionalmente un conteo selectivo en la imagen captada al ser filtrada cuando se ilumina con luz de una longitud de onda asociada a una determinada característica de los microorganismos biológicos, si dichos microorganismos fueron previamente marcados con un marcador sensible a tal longitud de onda. 30
Opcionalmente, los medios de visualización permiten detectar la iluminación de la muestra y modificar la intensidad luminosa aplicada a la muestra celular. Opcionalmente, los medios de captación de imágenes comprenden una cámara digital 5 y/o una pantalla táctil. 10 El sistema es aplicable, tanto si el dispositivo óptico es una lupa como si es un microscopio. Figuras Se representan en los siguientes dibujos, de forma esquemática, aspectos relacionados con una realización de la invención. 15 Figura 1. Esquema de sistema de conteo adaptado para un microscopio (4). Figura 2. Ejemplo de definición de una zona de exclusión (14) para evitar falsas detecciones. Figura 3. Ejemplo de varias operaciones llevadas a cabo por el sistema de conteo con la imagen esquemática producida por cada operación: captación de imagen (21), 20 detección de bordes (22), delimitación de áreas de posibles partículas (23), filtrado según criterios geométricos (24) y conteo resultante (25). 25 Descripción detallada de la invención En las próximas páginas, la invención se ilustra adicionalmente y sin carácter limitativo mediante su integración en un microscopio óptico (4) (de contraste de fases, fluorescencia, etc.) con unos medios de acoplamiento a la cámara digital (2). 30 No obstante, para el conteo de partículas y más en concreto de microorganismos la invención es aplicable tanto a un microscopio como a una lupa. Por ejemplo, dichos medios de acoplamiento se pueden realizar en:
1) el trinocular del microscopio si existiese (normalmente se utilizará un acople de cámara digital al tubo de anillo C, o de rosca C de 25 mm de diámetro aproximadamente, aunque también se dispone de acoples para rosca de cámara fotográfica, acople para bayoneta, etc.). 5 2) si no existiese trinocular, se realizaría un acople a una de las lentes del binocular, que tienen un diámetro generalmente de 25 mm. Esta opción es más incómoda ya que se pierde una de las lentes que permiten realizar visualización con el microscopio. En sistemas monoculares no existe posibilidad de visualización más que por la pantalla de la invención. 10 Otra posibilidad es la adaptación a la cámara de toma de imágenes existente en el microscopio (si existiese). El sistema puede incluir además los siguientes elementos: Cámara de toma de imagen (2). 15 Dispositivo de procesamiento (1) (PC o equivalente) con capacidad de almacenamiento. Interfaz visual/pantalla (3). Cable de comunicaciones entre la cámara y el dispositivo de procesamiento Dispositivo de calibración (puede ser una cámara de Neubauer o una cámara 20 donde podamos tomar una medida de referencia, un calibrador de microscopio, etc.). 25 30 35 Cámara de contención de la muestra (6) (puede ser una cámara de Neubauer, una cámara de Thoma, etc. El único requisito es que la profundidad de la cámara ha de ser conocida). La cámara de contención puede ser lavable o desechable. Es necesario también disponer de un microscopio (4) donde adaptar el sistema. El microscopio debe estar limpio, en la medida de lo posible, disponer de luz para iluminación de las muestras y disponer cómo mínimo de una óptica, preferentemente de 10x al menos. El sistema también se puede acoplar opcionalmente a la red local de datos a través de una conexión Ethernet RJ45, wifi o similar, con el objeto de: 1) realizar copias de seguridad en el servidor 2) enviar imágenes a la central receptora de datos para labores de mantenimiento, control de calidad, detección de descalibrado / mal funcionamiento del sistema, actualizaciones, etc.
Se prevé la opción de utilizar unas credenciales de identificación en el mismo dispositivo, para facilitar las labores de trazabilidad. 5 Ventajas: trazabilidad completa con identificación de usuario, barreras de acceso para personal externo, incremento de la responsabilidad en la toma de muestras por parte del personal, mejora la calidad de las medidas ya que los empleados se esmerarán más en la preparación de la muestra, diluciones etc. al quedar registradas sus operaciones de medida. 10 El sistema admite conexión con otros periféricos como teclado, ratón y/o lápiz de plástico para tableta pe. Incluso, el sistema permite a través de una pantalla táctil (3), ser utilizado con el dedo. 15 Se seleccionan las opciones mediante pulsaciones en la pantalla táctil y mediante el uso de un teclado virtual que aparece en la pantalla cuando es requerido.
Conteo en cámara de Neubauer Problema Errores humanos de conteo Errores estadísticos Errores de cálculo de concentración, al aplicar la fórmula Baja reproductibilidad / alta varianza Proceso tedioso y monótono Proceso difícil para problemas con deficiencias visuales Proceso fatigante para la vista Gasto en material desechable Gasto en reactivos Solución La automatización del conteo permite resultados reproductibles El error estadístico se reduce aumentando el número de muestras, y el área analizada por el sistema. (Con conteo humano supone una inversión en tiempo considerable por parte del personal de laboratorio) La automatización elimina este tipo de errores El sistema realiza un muestreo de un mayor número de muestras, reduciendo significativamente la varianza, y el error estadístico. La parte de conteo es eliminada completamente con el conteo automático. Pantalla de visualización permite a las personas con deficiencias realizar conteo y observar imágenes al microscopio. Pantalla de visualización permite realizar conteos con menos fatiga visual. Permite el uso de cámaras de recuento lavables El uso del microscopio permite contar células sin usar reactivos Las ventajas de realizar el conteo automático con respecto a soluciones tradicionales 5 son: 1) Reproductibilidad. El error que introduce el sistema está acotado, y es sistemático. No depende del personal de laboratorio que realiza el conteo.
2) Fiabilidad. Se eliminan errores humanos, la toma de más imágenes permite reducir el error estadístico. 3) Eliminación del tedioso proceso de conteo manual. La medición mediante conteo manual al microscopio puede tomar entre 1 y 10 minutos de un técnico 5 de laboratorio, dependiendo de la concentración 4) Menos mantenimiento, menor tiempo de configuración y limpieza que un citómetro de flujo. 5) Trazabilidad (imágenes y conteos asociados a un usuario y determinados en el tiempo) 10 6) Recuperación de imágenes 15 7) Detección visual de contaminación Las ventajas de realizar el conteo semi-asistido con respecto a soluciones tradicionales son: 8) Fiabilidad. Se eliminan ciertos errores humanos en los cálculos de la concentración. 9) Usabilidad. Reducción de la fatiga visual, y permite a personal con ciertas deficiencias visuales utilizar el microscopio. 20 10) Usabilidad. Reducción de la fatiga intelectual. El sistema guarda 25 automáticamente las células que lleva contadas, y mediante la marca en pantalla de las que han sido contadas permite al personal "despistarse" sin perder la cuenta. 11) Responsabilidad. Los conteos realizados quedan registrados con el nombre del personal de laboratorio que ha realizado el recuento. Los recuentos mal hechos pueden relacionarse con una persona determinada, mejorando posteriormente sus hábitos mediante training, etc. 12) Menos mantenimiento, menor tiempo de setup y limpieza que un citó metro de flujo. 30 13) Trazabilidad (imágenes y conteos asociados a un usuario y determinados en el tiempo) 14) Recuperación posterior de imágenes, y de los conteos junto con la información de lo que se ha considerado célula / partícula a contar. 15) Detección visual de contaminación
5 10 16) Conteo de elementos con alta complejidad visual (células adherentes, muestras con mucha suciedad etc.) donde el sistema no puede ser configurado para contar de forma automática. 17) Usado en conjunción con el conteo automático, el conteo semi-asistido permite validar el calibrado realizado para el modo de funcionamiento automático, y comprobar que el sistema está funcionando dentro de los rangos de funcionamiento aceptables. La utilización del sistema por primera vez requiere los siguientes pasos, en este orden 1) Calibración en tamaño. 2) Definición de perfil celular 3) Lanzamiento de conteo celular 15 En un segundo uso, podrá lanzarse el conteo celular de forma directa, sin tener que realizar la calibración en tamaño y definición de perfil, siempre y cuando se use el mismo microscopio, y el tipo de célula a contar sea el mismo (o haya sido definido previamente ). 20 A continuación se describen cada uno de los pasos. CONFIGURACiÓN Y CALIBRADO DEL SISTEMA PREVIO A LA REALIZACiÓN DEL CONTEO. 25 1) Se realiza un calibrado del sistema, donde se realizan las siguientes acciones 30 35 (A) Calibrado en tamaño. Se toma como referencia una distancia conocida en el microscopio (4), para obtener la relación distancia real con número de píxeles en pantalla (calibración de tamaño). (B) Definición del perfil biológico. Para ello se define: a. Profundidad del recipiente de conteo (6). (calibración de distancia / profundidad en el eje Z del microscopio (4)) b. Tamaño máximo y mínimo de células
5 10 c. Iluminación mínima y máxima (no se selecciona, se detecta de forma automática) d. Sensibilidad y contraste de la muestra e. Otras características morfológicas del tipo de célula a medir (redondez, factor de forma, etc.). f. Características dependientes de la longitud de onda del elemento a analizar (por ejemplo, en el espectro visible) A continuación se definen en más detalle estos ajustes. (A) CALIBRADO EN TAMAÑO. El calibrado puede realizarse de diferentes modos, aunque siempre ha de realizarse con un objeto en el cual conozcamos la distancia exacta entre 2 puntos al microscopio. 15 Pueden utilizarse entre otros, los siguientes elementos de calibración. 20 25 30 1) Placa de calibración estándar de microscopio. Viene de serie con algunos microscopios comerciales. Se trata de una placa donde viene impreso un patrón con líneas, donde la distancia entre las líneas es conocida. 2) Una cámara de Neubauer, cámara de Thoma, cámara de Neubauer Improved, cámara desechable o cualquier otro tipo de cámara de profundidad conocida. En este tipo de cámaras, aparece una rejilla / cuadricula al microscopio en la parte central. Esta rejilla se ha utilizado históricamente como referencia para realizar conteos manuales en el microscopio. Las distancias y dimensiones de la cuadrícula están por regla general escritas en la parte superior de la cámara. 3) Otros sistemas. La calibración del sistema puede realizarse con cualquier sistema, siempre y cuando se conozca la distancia exacta entre 2 puntos visibles al microscopio. (B) DEFINICiÓN DEL PERFIL BIOLÓGICO. El calibrado del perfil biológico determina las características morfológicas, de tamaño, forma, textura, color y/o absorbancia en el espectro visible (o invisible dependiendo del 35 captor de imagen), y contraste en la muestra.
El calibrado del perfil biológico se realiza siempre posteriormente al calibrado en tamaño, ya que para realizar este calibrado debemos conocer las distancias de los elementos que estamos visualizando en la pantalla, para poder seleccionar el rango de parámetros geométricos máximo y mínimo de los elementos biológicos que el 5 sistema va a contar. En el perfil biológico, el usuario selecciona las características de los elementos de la imagen que desea contar. 10 -Sensibilidad (valor entre 1 y 100). Determina el contraste mínimo que ha de tener el cuerpo o borde del elemento biológico (célula o equivalente) para ser considerado válido para conteo. Si seleccionamos una sensibilidad demasiado alta, el sistema captará elementos extraños de la imagen, como suciedad de la cámara o el microscopio, artefactos, etc. 15 Produciéndose falsos positivos (detecciones de elementos donde no debería haberlas) 20 Si seleccionamos una sensibilidad demasiado baja, el sistema ignorará elementos de la imagen que deberían ser tenidos en cuenta en el recuento. Produciéndose falsos negativos (no detecciones de elementos donde debería haberlas). -Parámetros Geométricos (24): Determina el tamaño (longitud máxima, longitud mínima, perímetro, área o coincidencia con un patrón de contorno prefijado) que ha de tener el elemento biológico para ser tenido en cuenta en el conteo (25). 25 -Calibrado por color / absorbancia de luz: Este filtro determina el rango de colores aceptables para el conteo de los elementos. Por ejemplo, si se selecciona el color rojo para las células, porque se desean contar únicamente las células que han absorbido un colorante rojo, el sistema ignorará las células/elementos que sean de colores muy distintos al rojo, y contará los elementos de la tonalidad de rojo seleccionada, así como 30 las de tonalidades parecidas y similar (próximas en el espectro de color, y de frecuencias) Los filtros de perfil pueden activarse o desactivarse. Si el filtro de perfil está desactivado, no se realizará discriminación de los elementos según la característica 35 del perfil. Por ejemplo, si el filtro de color está desactivado, el sistema ignorará el color
a la hora de considerar los elementos para el conteo, contando todos los elementos de la imagen que cumplan el resto de los filtros, e ignorando el color ello. -Viabilidad: El sistema permite un calibrado específico para la medida de viabilidad 5 celular (porcentaje de células muertas sobre células totales, vivas y muertas). La medición de viabilidad puede estar desactivada. El sistema realiza un conteo simple y proporciona únicamente la concentración celular en células I mi, o activada, en cuyo caso se proporcionará la concentración celular en células Iml totales y el porcentaje de células vivas de la muestra, en tanto por cien. 10 En el caso de activación de la medida de viabilidad, han de definirse los filtros de color específicos para células vivas (blancas generalmente) y muertas (azules generalmente cuando se utiliza tinción con trypan blue) 15 -Óptica utilizada: El usuario selecciona la óptica utilizada. Esto es necesario para tener en cuenta las distancias en la imagen, y realizar los ajustes pertinentes una vez realizado el calibrado inicial. Las ópticas más comunes en microscopios ópticos son 4x,1 Ox, 40x y 100x. 20 -Profundidad de la cámara I Contenedor: Por regla general, las cámaras comerciales (Neubauer, Thoma, etc) tienen una profundidad estándar y conocida, y además dicha profundidad está escrita en la superficie de la cámara. Para realizar esta calibración, ha de introducirse en el sistema la profundidad exacta 25 del recipiente de medición en mm. Las profundidades más comunes son 0,1 mm y 0,2 mm. 30 Es por tanto independiente del microscopio utilizado, la cámara (captor de imágenes) y las muestras biológicas que se deseen medir. TIPO DE CONTEO [automático] vs [semi-asistido] En casos en que el que la naturaleza de las imágenes o el tipo de célula a contar no 35 permitan realizar un conteo automático con suficiente fiabilidad, el sistema permite configurar un perfil para conteo semi-asistido.
En el caso en que se seleccione conteo semi-asistido en un perfil celular, el sistema ignorará todos los filtros anteriormente descritos y no realizará un análisis automático de las imágenes, sino que será el usuario el que indicará de forma manual o semi-5 asistida lo que considera una célula en cada una de las imágenes capturadas en la pantalla (pulsando con el dedo o con el ratón). 10 LA CONFIGURACiÓN DEL PERFIL BIOLÓGICO PASO A PASO. Mientras que las características de calibrado en tamaño son comunes y no varían, siempre que no se cambie de cámara (captor de imagen) y de microscopio, las características del perfil biológico cambian con cada tipo de partícula o célula a medir. Por tanto el usuario deberá definir un perfil biológico diferente para cada tipo de 15 elemento biológico que desea medir. El sistema permite el almacenamiento de las características definidas para cada perfil en la memoria del sistema, para su recuperación posterior. 20 Ejemplo de nombre de perfil: hepatocitos-tipo-a-10x-viabilidad-María. Las operaciones para la realización del calibrado del perfil biológico son las siguientes: 1) Preparación de muestra biológica del tipo de célula / microorganismo a medir 25 2) Introducción en una cámara de Neubauer o similar de la muestra. Si es 30 necesario previamente se ha hecho una dilución introduciendo con un asa de siembra en un tubo de ensayo una muestra. Este paso se realiza para conseguir una concentración adecuada que permite el análisis visual en la pantalla. Se estima que el sistema puede realizar un calibrado si podemos visualizar en la pantalla o al microscopio entre 1 y 2 células como mínimo y unas 50-100 células como máximo. Lo que corresponde a una concentración de entre 200.000 cel / mi y 10.000.000 cel / mi (aproximadamente) 3) Se selecciona la sección Configuración en el dispositivo. 4) Se selección un Perfil de conteo (una serie de parámetros que definirán lo 35 que ha de contarse y lo que no en cada imagen).
5 10 15 20 5) Se seleccionan los parámetros correspondientes al tipo de célula / elemento que deseamos contar. 6) En el caso de que el microscopio tenga suciedad, o una parte de la imagen aparezca desenfocada por imperfecciones en la lente, se eliminará la parte de la pantalla que suponga un problema mediante una Zona de Exclusión (14) (equivale a una máscara para ignorar las zonas problemáticas). 7) Después del ajuste de los parámetros (y eventual configuración de zona de exclusión) visualmente se podrá comprobar que el sistema detecta las células de la imagen dibujando un circulo (10) coloreado encima de cada célula. La comprobación de que el sistema está bien calibrado consiste en contar de forma manual las células en la imagen, y comprobar que en todas ellas el sistema ha dibujado un círculo superpuesto. 8) En caso de que no se detecten todas las células / elementos de forma correcta se repiten los pasos 5,6,7 hasta que al menos el 90%-95% de las células de la imagen se detecten de forma correcta. 9) Después de la comprobación visual, se mueve el microscopio y se comprueba con 2 o 3 imágenes más que la detección de células se realiza de forma correcta. (detección correcta de al menos el 95% de las células / elementos) 10) Se guardan los datos del perfil, y el sistema está listo para poder realizar conteos con este microscopio concreto, y con el tipo de elemento para el que ha sido configurado. CONTEO DE ELEMENTOS BIOLÓGICOS -MODO AUTOMÁTICO ( CON SISTEMA 25 PREVIAMENTE CALIBRADO / CONFIGURADO ). 30 35 Una vez realizado el calibrado del sistema (ver párrafo anterior) y definido el perfil biológico del elemento que deseamos contar, para realizar un conteo se siguen los siguientes pasos. 1) se prepara la muestra biológica y se introduce en el recipiente de conteo (c. Neubauer, Thoma, Howard, Porta + cubre, o un recipiente propietario y realizado a medida para el sistema, un cámara con marcas especiales para calibración, una placa de 24 o 96 pocillos, una placa de Petri, un frasco de cultivo, etc.)
5 10 15 20 25 30 35 2) Se selecciona el PERFIL que previamente ha sido configurado en el paso 1) para este microscopio y tipo celular concreto. Se toman las imágenes con la cámara digital (se utiliza el dispositivo correspondiente para mover la bandeja del microscopio, y la pantalla táctil o el teclado para indicar al sistema que se puede capturar la imagen). Se captura un número de imágenes que puede variar. Se toman varias imágenes para reducir el error estadístico (de la misma forma que en un conteo manual con cámara de Neubauer, la costumbre es medir 5 cuadrantes y realizar un promedio de los mismos). En nuestro caso, la toma de más imágenes supone un esfuerzo mínimo para el usuario, que se traduce en una reducción significativa del error. Por regla general se tomarán entre 5 y 10 imágenes, aunque en una próxima versión del producto pretendemos tomar 1 sola imagen con alta resolución. Si se desea reducir más el error estadístico es posible tomar tantas imágenes como se desee, siendo el error estadístico inversamente proporcional al número de imágenes tomadas. 3) las imágenes son enviadas al sistema de procesado de datos (1). 4) En caso de que las imágenes no tengan la suficiente iluminación o excesiva iluminación, el sistema realizará los ajustes pertinentes a. Mediante el ajuste del nivel de iluminación en la imagen captada b. Mediante un bucle de ajuste, donde la unidad de proceso envía una señal a la unidad de control de intensidad de la fuente luminosa indicando que se incremente o disminuya la intensidad de la fuente luminosa. c. Se vuelve al punto 4 (y se itera hasta la iluminación caiga dentro del rango) d. Si no fuese posible realizar un ajuste automático, se indicará al usuario que los niveles de iluminación están fuera del rango y que el sistema está fuera de rango para realizar el conteo.
5 10 5) En caso de que el nivel de enfoque de las imágenes no sea el adecuado, el sistema realizará los ajustes pertinentes. a. Mediante un bucle de ajuste, donde la unidad de proceso (1) envía una señal a la unidad de control de enfoque del microscopio (4) indicando que el microscopio se acerque o aleje de la muestra b. Se vuelve al punto 4 (y se itera hasta el enfoque caiga dentro del rango) c. Si no fuese posible realizar un ajuste automático del enfoque (porque el microscopio no incorpora control del enfoque), el sistema indica sistemáticamente en cada imagen analizada los elementos que está reconociendo, de modo de que si el sistema no está correctamente enfocado, el usuario puede ver en la pantalla que las células no están siendo detectadas correctamente. 15 6) El sistema de análisis procesa las imágenes, aplicando: 20 25 7) 30 35 a. filtros de tamaño b. filtros sobre la morfología del objeto c. filtros sobre la longitud de onda que atraviesa el elemento / o es reflejada por el elemento. d. filtros sobre la excentricidad del elemento (similar a la excentridad de una elipse) e. filtros sobre la longitud del contorno del objeto f. filtros sobre el area del objeto g. filtros sobre el área a analizar (áreas de exclusión (14) ) h. eliminación de la "imagen de fondo (12)" (ruido y suciedad de la imagen que permanece constante en cada imagen) a. calcula el número de células en cada imagen. b. Realiza un promediado de las mismas c. Posteriormente multiplica por el volumen medio de la imagen (este volumen medio se calcula a partir de la calibración en tamaño y la profundidad de la cámara utilizada -detallada en el perfil biológico previamente definido).
El sistema muestra en pantalla los resultados del recuento de elementos: El sistema proporciona: 5 -Concentración celular o de partículas por unidad de volumen. También puede proporcionar: -Número total de células contadas en pantalla. 10 -Grado de confluencia celular (la confluencia celular es el porcentaje de superficie ocupada por las células o partículas respecto al porcentaje total de la pantalla). -Porcentaje de células de un tipo o perfil celular con respecto al número de celulas totales. -Porcentaje de células de un tipo o perfil celular con respecto al número de celulas de 15 otro perfil celular. 20 -Porcentaje de células vivas con respecto a celulas totales. -Porcentaje de células muertas con respecto a celular totales. 8) El sistema almacena las muestras e imágenes para su posterior consulta, generación de gráficas de crecimiento, etc. La muestra de resultados, imágenes y gráficas se realiza a través del interfaz gráfico (pantalla) CONTEO DE ELEMENTOS BIOLÓGICOS -MODO SEMI-ASISITIDO ( CON 25 SISTEMA PREVIAMENTE CALIBRADO / CONFIGURADO ). El sistema permite el conteo semi-asistido de elementos al microscopio. En este modo de funcionamiento el sistema no aplica ningún filtro definido en el perfil 30 biológico ni realiza ningún análisis automático de la imagen (es el propio usuario quien realiza el conteo de forma manual, y su propia inteligencia la que se utiliza para seleccionar las células en la pantalla). Los pasos a seguir en este caso son: 35 1) calibrado en tamaño. (que se realiza una única vez para cada microscopio)
2) definición del perfil biológico (en este caso solo se ha de definir la profundidad de la cámara utilizada y la óptica) 3) se realiza el punto 2) del método automático 4) se realiza el punto 3) del método automático. 5 5) se toman las imágenes con la cámara digital (se utiliza el dispositivo 10 15 20 25 correspondiente para mover la bandeja del microscopio, y la pantalla táctil o el teclado para indicar al sistema que se puede capturar la imagen). Se captura un número determinado de imágenes. Se toman varias imágenes para reducir el error estadístico En modo semi-asistido, después de la captura de cada imagen las células han de marcarse de forma manual en la pantalla usando el ratón, el dedo o el lápiz de plástico. Cada vez que una célula se ha marcado, se dibuja un círculo semitransparente sobre la célula para indicar al usuario que la célula ya ha sido contada. 6) El sistema muestra en pantalla la concentración celular (caso de conteo simple) o la concentración celular junto con la viabilidad en porcentaje (en caso de conteo con viabilidad). El sistema proporciona: -Concentración celular o de partículas por unidad de volumen. También puede proporcionar: -Número total de células contadas en pantalla 7) El sistema almacena las muestras e imágenes para su posterior consulta, generación de gráficas de crecimiento, etc. La muestra de resultados, imágenes y gráficas se realiza a través del interfaz gráfico (pantalla) 30 En este caso el procesamiento de datos se ha limitado al cálculo de la concentración celular o al cálculo de la suma total de células marcadas por el usuario en la pantalla. 35 El cálculo de la concentración celular puede realizarse en este caso gracias al innovador sistema de calibrado del sistema.
Una de las componentes innovadoras más ventajosa del sistema es el acoplamiento a cualquier microscopio del mercado. Esto se logra gracias al conjunto de los siguientes factores: a. la adaptación mecánica, que se realiza a través de adaptadores mecánicos 5 comunes, que existen generalmente en el mercado b. el calibrado en tamaño. c. la detección de los cambios de luminosidad y ajustes en luminosidad d. la detección de desenfoque y ajuste del enfoque. e. el detector de bordes, que evita problemas de iluminación. 10 f. las zonas de exclusión. 15 El sistema también puede considerarse un todo, unido a un microscopio concreto y precalibrado para el juego de lentes del microscopio. Referencias numéricas 1 Unidad de proceso. 2 Cámara fotográfica. 3 Pantalla táctil. 20 4 Microscopio. 5 Ocular. 6 Recipiente para muestra. 10 Borde de partícula/célula. 11 Partícula. 25 12 Fondo fotografía. 13 Área de inclusión. 14 Área de exclusión. 21 Captación de imagen. 22 Detección de bordes. 30 23 Delimitación de áreas de posibles partículas/células. 24 Filtrado según criterios geométricos. 25 Conteo.