ES2411504T3 - Métodos de purificación de condroitinasa y formulaciones estables de la misma - Google Patents

Abstract

Una formulación que comprende una condroitinasa en un tampón de fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 750 a 1000 mM.

Description

Metodos de purificacion de condroitinasa y formulaciones estables de la misma.

Campo de la invenci6n

Un aspecto de la presente invencion se refiere a una formulacion estable de condroitinasa. Tambien se describen metodos de purificacion de condroitinasa.

Antecedentes

Los proteoglicanos, los principales componentes de la matriz extracelular, son conocidos por estar presentes en grandes cantidades en el tejido de la cicatriz glial y por inhibir la recuperacion despues de lesiones de la medula espinal (Fawcett y Asher, (1999) Brain Res. Bull. 49 (6): 377-391). Las enzimas que son capaces de digerir tejido de la cicatriz glial son un objetivo importante para el desarrollo de agentes terapeuticos para la lesion de la medula espinal (SCI). La condroitinasa ABCI (EC 4.2.2.4; cABCI) es una enzima bacteriana que cataliza la digestion de las cadenas laterales de condroitina sulfatada y dermatan de los proteoglicanos. Se ha demostrado que esta enzima promueve la recuperacion funcional despues de lesion de la medula espinal (Bradbury et al., (2002) Nature 416:636640; Caggiano et al., (2005) J. Neurotrauma 22 (2): 226-239).

La medula espinal se compone de fibras nerviosas. El dano al sistema nervioso central, incluyendo la medula espinal, da como resultado una perdida de funcion. Dependiendo del tipo de lesion en el sistema nervioso central, la perdida de funcion se puede manifestar en la perdida de funciones sensoriales, motoras o autonomas o una combinacion de las mismas. Las funciones sensoriales incluyen la capacidad de sentir sensaciones como el dolor. Las funciones motoras incluyen la capacidad de mover voluntariamente el cuerpo. Las funciones autonomas incluyen funciones involuntarias del cuerpo, por ejemplo la capacidad de sudar y respirar.

Los tipos mas comunes de lesiones de la medula espinal (SCI) incluyen contusiones (hematomas de la medula espinal) y las lesiones por compresion (causadas por una presion prolongada sobre la medula espinal). En lesiones por contusion, a menudo se forma una cavidad o un hueco en el centro de la medula espinal. A diferencia de las celulas nerviosas, o neuronas del sistema nervioso periferico (SNP), las neuronas del sistema nervioso central (SNC) no se regeneran despues de la lesion.

La lesion de la medula espinal puede estar caracterizada por contusion del tejido neural que da como resultado una disminucion o perdida de la capacidad del tejido nervioso para transmitir adecuadamente los impulsos nerviosos. La causa habitual es debida a una lesion por impacto de alguna naturaleza, pero tambien puede ocurrir durante la manipulacion de la medula espinal en ciertos procedimientos quirurgicos. Despues de una lesion de la medula espinal en el mamifero adulto, la incapacidad de los axones para regenerarse puede conducir a la perdida de sensacion, perdida de funcion motora y/o perdida de la funcion autonoma, asi como paralisis permanente. Una de las razones de que las neuronas no logren regenerarse es su incapacidad para atravesar la cicatriz glial que se desarrolla tras una lesion de la medula espinal. La lesion inducida por herida desarrollara cicatriz glial, que contiene moleculas de la matriz extracelular incluyendo proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG). Los CSPG inhiben el crecimiento de tejido nervioso in vitro y la regeneracion del tejido nervioso en regiones ricas en CSPG in vivo.

Diversas moleculas, y regiones especificas de las mismas, han sido implicadas en la capacidad para apoyar el brote de las neuritas a partir de una celula neuronal, un proceso tambien conocido como sobrecrecimiento de neuritas. El termino neuritas hace referencia tanto a las estructuras de los axones como de las dendritas. El proceso de brote de las neuritas es esencial en el desarrollo y la regeneracion neuronales, especialmente despues de que una lesion fisica o enfermedad hayan danado las celulas neurales. Las neuritas se prolongan profusamente durante el desarrollo en los sistemas nerviosos tanto centrales como perifericos de todas las especies animales. Este fenomeno se refiere tanto a los axones como a las dendritas.

Se sabe que varios polipeptidos, especialmente las moleculas de adhesion celular (CAM), promueven el crecimiento de las celulas neurales. Si bien los primeros esfuerzos en esta area de investigacion se concentraron en la proteina fibronectina (FN) de la matriz extracelular que promueve la adhesion, tambien se ha encontrado que otros polipeptidos promueven el crecimiento neural. Por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Num. 5.792.743 se describen nuevos polipeptidos y metodos para promover el crecimiento neural en el sistema nervioso central de un mamifero mediante la administracion de una CAM neural soluble, un fragmento de la misma, o un producto de fusion con Fc de la misma. En la Patente de los Estados Unidos Num. 6.313.265 se describen polipeptidos sinteticos que contienen las regiones farmacologicamente activas de las CAM que se pueden utilizar en la promocion de la regeneracion nerviosa y la reparacion tanto de las lesiones de los nervios perifericos como de las lesiones en el SNC. Aunque util, el uso de proteinas regenerativas por si solo puede no ser suficiente para efectuar la reparacion de un sistema nervioso danado.

Durante aproximadamente las ultimas dos decadas, se ha expandido rapidamente el conocimiento de la adhesion celular y la migracion en matrices extracelulares (ECM) a nivel molecular. La accion de las enzimas y otros polipeptidos que degradan componentes de la matriz extracelular y las membranas basales puede facilitar los eventos de reparacion neural mediante una variedad de mecanismos, incluyendo la liberacion de citoquinas unidas y mediante el aumento de la permeabilidad de la matriz, mejorando de este modo la movilidad de las moleculas mediadoras, factores de crecimiento y agentes quimiotacticos, asi como de las celulas que participan en el proceso de cicatrizacion. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Num. 5.997.863 describe el uso de glicosaminoglicanos para manipular la proliferacion celular y promover la cicatrizacion de heridas.

Los componentes de los CSPG inhibidores se han identificado como glicosaminoglicanos, sulfato de condroitina (CS) y sulfato de dermatan (DS). La eliminacion de estas moleculas inhibidoras permitiria que las neuritas se regeneraran y reinervaran un area despues de una lesion fisica o una enfermedad, asi como permitiria la recuperacion de las funciones sensoriales, motoras y autonomas.

Estudios previos han encontrado que las condroitinasas pueden lisar y degradar los CSPG, incluyendo CS y DS. Un estudio encontro que la condroitinasa ABC eliminaba las cadenas de glicosaminoglicanos (GAG) en y alrededor de las zonas lesionadas del SNC de rata in vivo. La degradacion de las los GAG promovio la expresion de una proteina asociada al crecimiento, GAP-43, lo que indica un aumento en la capacidad de las celulas tratadas para regenerarse. Sin embargo, esta proteina asociada al crecimiento esta asociada con la regeneracion en las lesiones nerviosas perifericas, pero no centrales.

Los sulfatos de condroitina (CS) son polisacaridos sulfatados en las cadenas lineales de disacaridos repetidas. Tienen un peso molecular que oscila de alrededor de 10.000 a mas de 100.000 Da. Existen sustratos de sulfato de condroitina en diferentes isomeros designados por las letras adjuntas A, B yC (Hoffman et al., (1958) Federation Proc. 17:1078-1082). Las unidades que se repiten estan compuestas de acido uronico (GlcA o IdoA) y galactosamina, y se denominan galactosaminoglicanos, y son un ejemplo de los glicosaminoglicanos, abreviados tipicamente como GAG. A pesar de que estas especies de cadenas de GAG tienen diferentes regiones repetidas de disacaridos, estan unidas covalentemente a traves de la denominada secuencia de tetrasacarido e la region de conexion (vease mas abajo) al residuo de serina en la secuencia consenso de anclaje a GAG (Glu/Asp-X-Ser-Gly) de las respectivas proteinas centrales. Los sulfatos de condroitina A y C (ChS-A, ChS-C) son los GAG mas abundantes y se encuentran en el cartilago, el hueso y las valvulas cardiacas. La condroitina B (ChS-B, o, alternativamente, sulfato de dermatan) se expresa principalmente en la piel, los vasos sanguineos, las valvulas cardiacas.

Cuando se caracterizaron preparaciones bacterianas de condroitinasa frente a diferentes sustratos de sulfato de condroitina (ChS), se descubrio una serie de condroitinasas distintas: condroitinasa AC que degrada la mayor parte de la condroitina A (ChA) y la condroitina C (ChC) (Yamagata et al., (1968) J. Biol. Chem. 243 (7): 1523-1535), condroitinasa B que degrada la condroitina (ChB) (Michelacci y Deitrich, (1976) J. Biol. Chem. 251 (4): 1154-1158), condroitinasa C que actua principalmente sobre ChC (Michelacci y Dietrich, (1976) supra), y condroitinasa ABC que exhibe especificidad frente a los tres sustratos -ChS-A, ChS-B y ChS-C (Yamagata et al, 1968, supra., Michelacci et al., (1987), Biochem. Biophys. Acta, 923:291-301).

En la Patente de los Estados Unidos Num. 5.578.480 se describe el aislamiento y la purificacion de condroitinasa I utilizando tampon de fosfato 5 mM o 20 mM en la columna de intercambio cationico.

Sato et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:39-46 hace referencia a un analisis enzimatico para la condroitinasa ABC llevado a cabo utilizando tampon de fosfato de potasio 100 mM.

Las Patentes de los Estados Unidos Nums. US 5.763.205 y US 6.007.810 describen cada una condroitinasa ABC combinada con un tampon de fosfato de 1 a 100 mM, preferiblemente de 10 a 50 mM.

Compendio de la invenci6n

La presente invencion proporciona formulaciones estables que comprenden condroitinasa en un tampon de fosfato de sodio como se reivindica en la reivindicacion 1. En realizacion, se proporciona una formulacion que comprende condroitinasa ABCI y fosfato de sodio.

Tambien se describen metodos de purificacion de condroitinasa. Opcionalmente, el metodo de purificacion de condroitinasa comprende extraer la condroitinasa de las celulas, separar la condroitinasa a partir del extracto, preferiblemente utilizando cromatografia de intercambio cationico, eliminar contaminantes e impurezas, preferiblemente utilizando la cromatografia de filtracion en gel, y eliminar endotoxinas, preferentemente utilizando intercambio anionico. El metodo puede comprender adicionalmente dialisis. El metodo tambien puede comprender adicionalmente secado. Opcionalmente, la condroitinasa es condroitinasa ABCI. Opcionalmente, la condroitinasa es condroitinasa AC.

Generalmente, las celulas se suspenden en una disolucion tampon que contiene un agente tensioactivo y se someten a sonicacion. A continuacion se captura o se separa la condroitinasa de la mezcla del extracto, preferiblemente haciendo pasar el extracto a traves de una columna de intercambio cationico. Los contaminantes y las impurezas se eliminan de la condroitinasa capturada, preferiblemente mediante filtracion en gel. Las endotoxinas se eliminan de la muestra de condroitinasa, preferiblemente por medio de una columna de intercambio anionico. La muestra de condroitinasa se puede someter a dialisis, preferiblemente utilizando un tampon volatil. La condroitinasa se puede procesar adicionalmente mediante secado o liofilizacion. En una realizacion, la condroitinasa es condroitinasa ABC. En una realizacion adicional, la condroitinasa es condroitinasa AC. En una realizacion adicional, la condroitinasa es una condroitinasa recombinante.

Tambien se describe un vector de expresion recombinante que comprende una condroitinasa ABCI con una secuencia del SEC ID NO: 1. Tambien se describe un vector de expresion recombinante que comprende una condroitinasa ABCI con una secuencia del SEC ID NO: 2.

Descripci6n de los dibujos

En parte, otros aspectos, caracteristicas, beneficios y ventajas de las realizaciones de la presente invencion seran evidentes con respecto a la siguiente descripcion, reivindicaciones adjuntas y dibujos acompanantes donde:

Fig. 1. Intervalo lineal para las tasas de formacion de producto en un analisis de la actividad cABCI.

Fig. 2A. Purificacion de condroitinasa ABCI, perfil A280 de la columna S200. Fig. 2 B y C: SDS-PAGE de las fracciones de elucion de condroitinasa ABCI. B - Tenido con plata. C - Tenido con Azul de Coomassie

Fig. 3. Curvas de Michaelis-Menten para cABCI y sustratos.

Fig. 4A-4E. Perfiles de dispersion de luz SEC de la cABCI no tratada (control) y tratada con estres. Fig. 4A Congelacion/descongelacion: Rojo -Control, Azul -1 ciclo; Verde -2 ciclos; Purpura -3 ciclos; Fig. 4B Exposicion a H2O2: Rojo -control; Azul -0,5 mM; Verde -5 mM; Purpura -20 mM; Fig. 4C Vortice continuo: Rojo -Control; Azul 5 min; Verde - 20 min; Purpura -60 min; Fig. 4D Exposicion UV: Rojo - Control; Azul -40 min; verde - 1 hora; Purpura -2 horas; Fig. 4E Estres termico (37quot;C): Rojo - Control; Azul -1 hora; verde - 4 horas; Purpura -20hr.

Fig. 5. Analisis HPLC de intercambio cationico debil de las muestras cABCI tratadas con UV. 5A. Muestra inicial; 5B. Despues de 30 segundos de exposicion UV; 5C. despues de 2 minutos de exposicion UV; 5D. despues de 5 minutos de exposicion UV.

Fig. 6. Comparacion de area del pico de HPLC de ABCI con la actividad unidad.

Fig. 7. Estabilidad de ABCI - UV portatil.

Fig. 8. Estabilidad de ABCI - exposicion a UV en campana.

Fig. 9. Correlacion de los datos de actividad de cABCI con el perfil de HPLC de cABCI durante la inactivacion termica. 9A. Histograma del porcentaje de areas de los picos iniciales en la HPLC y porcentaje de la actividad inicial mediante ensayo espectrofotometrico. 9B. Regresion de las areas de los picos y actividades mediante espectrofotometria.

Fig. 10. Dependencia de la estabilidad termica de cABCI de la fuerza ionica en presencia de tampon de fosfato de Na 50 mM.

Fig. 11. Dependencia de la estabilidad termica de cABCI de la concentracion de las especies de tampon en presencia de NaCl 100 mM y Acetato de Na 50 mM.

Fig. 12. Analisis mediante SDS-PAGE de la condroitinasa AC purificada final.

Descripci6n detallada

Antes de describir las presentes composiciones y metodos, se ha de entender que esta invencion no se limita a las moleculas, composiciones, metodologias o protocolos concretos descritos, ya que estos pueden variar. Tambien se debe entenderse que la terminologia usada en la descripcion tiene el proposito de describir las versiones o realizaciones concretas solamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invencion que estara limitado unicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Tambien se debe observar que segun se utilizan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular quot;unquot;, quot;unaquot;, y quot;elquot; y quot;laquot; incluyen las referencias al plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a una quot;celulaquot; es una referencia a una o mas celulas y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la tecnica, y asi sucesivamente. A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados entendidos comunmente por un experto normal en la tecnica. Aunque se pueden utilizar metodos y materiales cualesquiera similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la practica o ensayo de las realizaciones de la presente invencion, se describen a continuacion los metodos, dispositivos, y materiales preferidos.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino quot;aproximadamentequot; significa mas o menos del 10% del valor numerico del numero con el que se esta utilizando. Por lo tanto, aproximadamente 50% significa en el intervalo de 45%-55%.

El termino quot;proteina recombinantequot; hace referencia a un polipeptido que es producido mediante tecnicas de ADN recombinante, en donde generalmente, el ADN que codifica un polipeptido se inserta en un vector de expresion adecuado que se utiliza a su vez para transformar una celula anfitriona para producir la proteina. Por otra parte, se pretende que la expresion quot;derivado dequot;, con respecto a un gen recombinante, incluya dentro del significado de quot;proteina recombinantequot; las proteinas que tienen una secuencia de aminoacidos de una proteina nativa, o una secuencia de aminoacidos similar a la misma que se genera por mutaciones, que incluyen sustituciones y deleciones (incluyendo truncamiento) de una forma de origen natural de la proteina.

Los terminos quot;cantidad terapeuticamente eficazquot; o quot;cantidad eficazquot;, segun se utilizan en la presente memoria, se pueden utilizar indistintamente y hacen referencia a una cantidad de un componente del compuesto terapeutico de la presente invencion. Por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto terapeutico es una cantidad predeterminada calculada para lograr el efecto deseado, es decir, para tratar con eficacia una lesion en el sistema nervioso central. Por ejemplo, un compuesto terapeutico que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de condroitinasa que se puede purificar mediante un metodo de la presente invencion y formular para proporcionar una enzima estable, activa, es suficiente para degradar los CSPG de la zona lesionada de la medula espinal o una cantidad suficiente para restaurar, en su totalidad o en parte, la funcion motora, sensorial o autonoma del mamifero y puede dar lugar a una regeneracion de neuronas en un sistema nervioso central, por ejemplo promoviendo el crecimiento axonico en un area lesionada.

El termino quot;vectorquot; hace referencia a un vehiculo que puede transportar las moleculas de acido nucleico. Las moleculas de acido nucleico que codifican el polipeptido condroitinasa se unen covalentemente al acido nucleico del vector. El vector puede ser un plasmido, un fago mono o bicatenario, un vector viral con ARN o ADN mono-o bicatenario, o un cromosoma artificial, tal como BAC, PAC, YAC, o MAC.

Condroitinasa segun se utiliza en la presente memoria incluye, pero no se limita a, condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC, condroitinasa B, Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4, y PH2O.

La condroitinasa puede obtenerse a partir de un microorganismo que expresa naturalmente una condroitinasa, por ejemplo, pero no limitado a, E. coli, Proteus vulgaris o a partir de la expresion de una proteina recombinante en una celula anfitriona. La celula anfitriona puede ser una celula procariotica (tal como E. coli) o una celula eucariotica (tal como una levadura, una celula de mamifero o una celula de insecto).

En una realizacion de la invencion, se expreso en exceso E.coli una condroitinasa ABCI recombinante de Proteus vulgaris. La secuencia primaria de esta proteina se muestra a continuacion:

en donde los residuos en negrita y subrayados indican residuos que no se corresponden con los de las secuencias de GeneBank y los residuos en cursiva indican una secuencia peptidica que se informo que se habia escindio de la enzima procesada (Khandke, Patente de los Estados Unidos. Num. US 5.578.480).

En otra realizacion, se puede producir una condroitinasa recombinante a partir de la secuencia de aminoacidos de la enzima procesada que tiene la secuencia:

La expresion de un gen de condroitinasa recombinante puede ser producido por ligacion de un acido nucleico que codifica una proteina condroitinasa, o una porcion de la misma, a un vector adecuado para la expresion en celulas procarioticas, celulas eucarioticas, o ambas. Los procedimientos para la ligacion son bien conocidos por los expertos normales en la tecnica. Los vectores de expresion para la produccion de formas recombinantes de los polipeptidos de condroitinasa sujeto incluyen plasmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados para la expresion de un polipeptido de condroitinasa incluyen plasmidos de los tipos: plasmidos derivados de pBR322, plasmidos derivados de pEMBL, plasmidos derivados de pEX, plasmidos derivados de pBTac y plasmidos derivados de pUC para la expresion en celulas procariotas, tales como E. coli.

Existen diversos vectores para la expresion de proteinas recombinantes en levadura. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 y YRP17 son vehiculos de clonacion y de expresion utiles en la introduccion de constructos geneticos en S. cerevisiae (Vease, por ejemplo, Broach et al. (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expresion, ed. M. Inouye Academic Press, pag. 83). Estos vectores pueden replicarse en E. coli debido a la presencia del origen de replicacion de pBR322, y en S. cerevisiae debido al determinante de replicacion del plasmido de 2 micras de levadura. Ademas, se pueden utilizar marcadores de resistencia a farmacos tales como ampicilina.

Opcionalmente, se produce un polipeptido de condroitinasa de recombinantemente utilizando un vector de expresion generado mediante subclonacion de la secuencia codificante de una de las proteinas condroitinasa representadas en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 2.

Los vectores de expresion en mamiferos pueden contener secuencias procarioticas, para facilitar la propagacion del vector en bacterias, y una o mas unidades de transcripcion eucarioticas que son expresadas en celulas eucarioticas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, PTK2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresion de mamiferos adecuados para la transfeccion de celulas eucarioticas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plasmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicacion y la seleccion de resistencia a farmacos en celulas tanto procarioticas como eucarioticas. Alternativamente, se pueden utilizar derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1), o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresion transitoria de proteinas en celulas eucarioticas. Los diversos metodos empleados en la preparacion de los plasmidos y la transformacion de los organismos anfitriones son bien conocidos en la tecnica. Para otros sistemas de expresion adecuados tanto para celulas procarioticas como eucarioticas, asi como procedimientos recombinantes generales, vease Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., Ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Capitulos 16 y 17.

En algunos casos, puede ser deseable expresar el polipeptido de condroitinasa recombinante mediante el uso de un sistema de expresion en insectos tal como el sistema de expresion de baculovirus. Los ejemplos de tales sistemas de expresion de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1), y vectores derivados de pBlueBac (tales como �-gal que contiene pBlueBac III).

Los vectores de expresion enumerados en la presente memoria se proporcionan a modo de ejemplo unicamente y representan los vectores bien conocidos disponibles para los expertos normales en la tecnica que pueden ser utiles para expresar las moleculas de acido nucleico. El experto con un conocimiento practico normal en la tecnica seria consciente de otros vectores adecuados para el mantenimiento de la propagacion o la expresion de las moleculas de acido nucleico descritas en la presente memoria. Estos se encuentran por ejemplo en Sambrook, J., Fritsh, E.F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.

Cuando es deseable expresar solo una porcion de una proteina condroitinasa, tal como una forma que carece de una porcion del extremo N-terminal, es decir, un mutante por truncamiento que carece del peptido senal, puede ser necesario anadir un codon de inicio (ATG, que codifica el aminoacido metionina) al fragmento de oligonucleotido que contiene la secuencia deseada que se va a expresar. Es bien sabido en la tecnica que una metionina en la posicion N-terminal puede ser escindida enzimaticamente mediante el uso de la enzima metionina aminopeptidasa (MAP). La MAP ha sido clonada de E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169:751-757) y Salmonella typhimurium y se ha demostrado su actividad in vitro en proteinas recombinantes (Miller et al. (1987) PNAS 84:2718-1722). Por lo tanto, la eliminacion de una metionina N-terminal, si se desea, se puede lograr ya sea in vivo mediante la expresion de polipeptidos derivados de condroitinasa en un anfitrion que produce MAP (por ejemplo, E. coli o CM89 o S. cerevisiae), ya sea in vitro mediante el uso de MAP purificada.

Los vectores de expresion contienen regiones reguladoras que actuan en cis actuando que estan conectadas operablemente en el vector al acido nucleico de condroitinasa de manera que se permita la transcripcion de las moleculas de acido nucleico en una celula anfitriona.

Las celulas anfitriona recombinantes se preparan introduciendo las constructos de vectores en las celulas mediante mecanismos facilmente asequibles para los expertos normales en la tecnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por lipidos cationicos, electroporacion, transduccion, infeccion, lipofeccion, y otros mecanismos tales como los que se encuentran en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual �a ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.).

Como es conocido en la tecnica, los polipeptidos de condroitinasa se pueden producir mediante tecnicas biologicas convencionales o mediante sintesis quimica. Por ejemplo, una celula anfitriona transfectada con un vector de acido nucleico que dirige la expresion de una secuencia de nucleotidos que codifica los polipeptidos sujeto se puede cultivar en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresion del peptido. El polipeptido de condroitinasa se puede secretar y aislar de una mezcla de celulas y medio que contiene el polipeptido de condroitinasa recombinante. Se describen en la presente memoria metodos de purificacion en los que la condroitinasa se aisla en una forma pura que es mas estable y activa, que en los metodos utilizados actualmente.

Alternativamente, el peptido puede ser retenido citoplasmicamente retirando la secuencia del peptido senal del gen de la condroitinasa recombinante y las celulas cosechadas, lisadas y la proteina aislada mediante los metodos de purificacion descritos en la presente memoria.

Segun se describe en la presente memoria, un procedimiento de purificacion de condroitinasa comprende las siguientes etapas: 1) extraer la enzima de una celula, 2) separar el extracto celular bruto utilizando cromatografia de intercambio cationico, 3) separar adicionalmente el extracto mediante cromatografia de filtracion en gel, y 4) eliminar las endotoxinas a traves de una membrana de intercambio anionico para producir una condroitinasa purificada, que exhibe una elevada actividad con respecto a la condroitinasa purificada mediante los metodos convencionales.

Extraccion de condroitinasa a partir de las celulas puede ser mas eficaz mediante el uso de una disolucion tampon a la cual se anade un tensioactivo. Un tensioactivo es un agente activo de superficie que tiene tendencias solubilizadoras y que contiene grupos de polaridad opuesta. Estos agentes se pueden utilizar para alterar la integridad de una celula. Por lo tanto, un agente tensioactivo se puede utilizar para extraer una enzima de una celula. Se puede utilizar cualquier tensioactivo que promueva la extraccion de condroitinas de una celula, preferiblemente, el tensioactivo es un tensioactivo no ionico.

Los tensioactivos no ionicos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, polioxietilenalquileter, polioxietilen-pt-octilfenileteres, polisorbato, y similares. Los tensioactivos de tipo Emulgen, los tensioactivos de tipo Liponox, los tensioactivos de tipo Brij, y similares, se proporcionan como ejemplos especificos de polioxietilenalquileteres. Los tensioactivos disponibles comercialmente entre estos son Emulgen 120, Emulgen 109P, Liponox DCH, Brij 35, 78, 76, 96, 56, 58, 98, Nikkol BL-9EX, BL-21, BL-25, y similares. Como ejemplos especificos de polioxietilen-p-toctilfenileteres se proporcionan tensioactivos de tipo Triton, tensioactivos de tipo Nonidet P40, tensioactivos de tipo Igepal/CA, Polytergent G, tensioactivos de tipo Neutronyx, tensioactivos de tipo Conco, y similares. Entre estos tipos de tensioactivos, Triton X-100, X-45, X-114, X-102, X-165, X-305, X-405, Nonidet P-40, Igepal CA-630, Neutronyx 605, Conco NIX-100, y similares estan disponibles comercialmente. Los tensioactivos de tipo Tween, los tensioactivos de tipo Emasol, los tensioactivos de tipo Sorbester, los tensioactivos de tipo Crill, y similares, se dan como ejemplos especificos de los polisorbatos. Se prefieren los derivados de poli(oxi-1,2-etanodiil) de mono-9octadecanoato de sorbitan, asequible comercialmente como Tween 80.

De los tensioactivos anteriores, se prefieren los tensioactivos Triton X, incluyendo, pero no limitados a, Triton X-114. Generalmente, el detergente, tal como, pero no limitado a, Triton X, se puede anadir a la muestra de celulas a extraer. En una realizacion de la invencion, la concentracion del detergente puede variar de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 10% (v/v), preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 3% (v/v), o mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 2%.

Segun se describe en la presente memoria, el proceso de extraccion tambien puede implicar sonicacion. La sonicacion implica el uso de ondas de sonido para desorganizar las celulas fragiles (que se han vuelto fragiles, por ejemplo, por la exposicion a un tensioactivo, tal como Triton X). Esto da como resultado la dispersion y desorganizacion de las celulas de tal manera que la integridad de la celula se destruye adicionalmente, provocando de este modo la liberacion de los componentes intracelulares. La sonicacion puede implicar una o ambas de una exposicion pulsada o continua a las ondas de sonido. Por ejemplo, para someter a sonicacion las celulas, se puede utilizar una sonda pequena (micro). El aparato de ultrasonidos se puede ajustar a pulsos (no continuo). En otra realizacion, el aparato de ultrasonidos se puede ajustar a continuo. Opcionalmente, la etapa de sonicacion puede utilizar una combinacion de sonicacion pulsada y continua. Opcionalmente, la suspension celular se puede someter a sonicacion con 10 rafagas cortas de 10 segundos seguidas de intervalos de 30 segundos para la refrigeracion. La suspension celular se puede mantener sobre hielo durante la sonicacion para evitar el sobrecalentamiento de los constituyentes de la muestra. Despues de la sonicacion los restos de celulas se pueden eliminar por centrifugacion. Se pueden emplear otros metodos de sonicacion, como determinan facilmente los expertos en la tecnica, dependiendo del tipo de celula que se este desorganizando.

Opcionalmente, la extraccion de la enzima tambien puede implicar la homogeneizacion en un Polytron. Este proceso triturara mecanicamente las celulas tratadas con tensioactivo, desorganizando de ese modo la integridad celular, y liberando los componentes celulares a una disolucion para su purificacion adicional. Generalmente, la muestra se mantiene sobre hielo para evitar o limitar cualquier calentamiento de la muestra. La muestra se puede homogeneizar durante aproximadamente 30 segundos, o hasta que se hayan dispersado a los grupos de celulas. Los metodos para la realizacion de homogeneizacion con Polytron son bien conocidos en la tecnica.

La condroitinasa se puede capturar del extracto celular utilizando cromatografia de intercambio ionico. En la cromatografia de intercambio ionico, las sustancias cargadas se separan utilizando los materiales de la columna que portan una carga opuesta. Se diferencian dos tipos de intercambiadores: alcalinos (de carga positiva) y acidos (de carga negativa). Los tipos de intercambiadores de iones se pueden dividir ademas en debilmente alcalinos o acidos

o fuertemente alcalinos o acidos. Con los materiales fuertemente alcalinos o acidos todos los grupos funcionales estan presentes generalmente en forma ionizada. Por ejemplo, los grupos amino cuaternario (R3N+) estan cargados positivamente, mientras que los grupos acido sulfonico (SO3-) estan cargados negativamente. Tambien existen tipos debilmente alcalinos y tipos debilmente acidos de columnas de intercambio ionico. Los tipos debilmente alcalinos son generalmente grupos funcionales amino secundarios y terciarios; los tipos debilmente acidos son generalmente grupos funcionales carboxilo.

Muchas proteinas se pueden separar en forma de polianiones (pH gt; pI) o en forma de policationes (pH lt; pI). Los grupos de intercambio ionico mas comunes incluyen, pero no se limitan a, dimetillamoniometilo (anion), dietilaminoetilo (anion), dimetilaminoetilo (anion), carboxi (cation), carboxialquilo (cation), sulfoisobutilo (cation), sulfoalquilo (cation), sulfopropilo (cation) y sulfoetilo (cation).

Para capturar la enzima del extracto celular, el extracto obtenido se puede someter a cromatografia de intercambio cationico. Mediante el uso de una resina de intercambio cationico se produce un condroitinasa con aumento de la actividad y la pureza en comparacion con el producto lisado bruto. Se pueden utilizar resinas de intercambio cationico debiles o fuertes, por ejemplo, pero no limitadas a, resinas de intercambio cationico que tienen un grupo carboxialquilo y un grupo sulfoalquilo o sulfopropilo, respectivamente. Otras resinas de intercambio cationico son bien conocidas en la tecnica (vease mas arriba).

Por lo tanto, la enzima puede ser capturada del extracto celular mediante la carga de la muestra en la cromatografia de intercambio cationico, el lavado el intercambiador cationico, en el que los componentes celulares que no sean condroitinasa se lavan mediante el aumento de la fuerza ionica y/o mediante cambios de pH, es decir, bajo condiciones de cromatografia de intercambio cationico; y la elucion de la muestra de condroitinasa mediante un aumento adicional de la fuerza ionica y/o mediante un cambio de pH.

Los tampones utilizados en la cromatografia de intercambio cationico incluyen, pero no se limitan a los enumerados en la Tabla 1.

Tabla 1. Tampones de la cromatografia de intercambio cationico

Molecula

pKa dpKa/grado C. Contraion

Acido maleico

2,00 sodio

Acido malonico

2,88 sodio

acido citrico

3,13 -0,0024 sodio

acido lactico

3,81 sodio

acido formico

3,75 0,0002 sodio o litio

acido butanodioico

4,21 -0,0018 sodio

acido acetico

4,76 0,0002 sodio o litio

acido malonico

5,68 sodio o litio

fosfato

7,20 -0,0028 sodio

HEPES

7,55 -0,0140 sodio o litio

BICINE

8,35 -0,0180 sodio

La eliminacion de los agregados y los contaminantes de bajo peso molecular y las impurezas se puede llevar a cabo a traves de diversos metodos de filtracion, incluyendo, por ejemplo, filtracion en gel o cromatografia de exclusion por 5 tamano. Los ejemplos asequibles comercialmente de filtracion en gel son Sephadex y Sephacryl.

La cromatografia de filtracion en gel es una separacion basada en el tamano. Tambien se denomina exclusion molecular o cromatografia de penetracion en gel. En la cromatografia de filtracion en gel, la fase estacionaria consiste en cuentas porosas con una gama bien definida de tamanos de poro. Se dice que la fase estacionaria para la filtracion en gel tiene un intervalo de fraccionamiento, lo que significa que las moleculas dentro de ese intervalo de

10 peso molecular se pueden separar.

Por lo tanto, las proteinas que son lo suficientemente pequenas pueden caber dentro de los poros de las cuentas y se dice que estan incluidas. Estas proteinas pequenas tienen acceso a la fase movil en el interior de las cuentas, asi como a la fase movil entre las cuentas y eluyen en ultimo lugar en la separacion de filtracion en gel. Las proteinas que son demasiado grandes para caber dentro de cualquiera de los poros se dice que estan excluidas. Estas tienen

15 acceso solamente a la fase movil entre las cuentas y, por lo tanto, eluyen primero. Las proteinas de tamano intermedio estan parcialmente incluidas -lo que significa que pueden caber dentro de algunos pero no de todos los poros en las cuentas. Estas proteinas eluiran despues entre las proteinas grandes (quot;excluidasquot;) y las pequenas (quot;totalmente incluidasquot;).

Otro contaminante que puede estar presente en la preparacion del producto lisado celular es la endotoxina. La

20 endotoxina es un contaminante toxico comun en los sistemas biologicos. Es importante eliminar suficientemente la endotoxina que es un componente de la pared celular de las bacterias. La endotoxina es un lipopolisacarido de la pared celular de la mayoria de las bacterias gram-negativas, tales como E.coli. Se sabe que la endotoxina incluida en las proteinas ocasiona sintomas de fiebre alta, choque por endotoxinas, e inflamacion, incluso en una cantidad muy pequena. Puesto que los extractos bacterianos pueden estar altamente contaminados con endotoxina, las

25 realizaciones de la invencion pueden incluir una etapa de eliminacion de endotoxina en un procedimiento de purificacion. Se pueden emplear diversos metodos para la eliminacion de la endotoxina, tales como, pero no limitados a, cromatografia de intercambio cationico, cromatografia de intercambio anionico, cromatografia de afinidad, ultrafiltracion, y separacion de fases utilizando un tensioactivo.

Opcionalmente, la endotoxina se elimina utilizando una columna de intercambio anionico. Los ejemplos de la

30 cromatografia de intercambio anionico incluyen, pero no se limitan a, membrana Q, una amina cuaternaria; y resina de dietilaminoetano (DEAE). Los tampones utilizados en la cromatografia de intercambio anionico incluyen, pero no se limitan a los que se ilustran en la Tabla 2.

Tabla 2. Tampones de la cromatografia de intercambio anionico

Molecula

pKa dpKa/grado C. Contraion

N-metilpiperazina

4,75 -0,015 cloruro

piperazina

5,68 -0,015 cloruro o formiato

L-histidina

5,96 cloruro

bis-tris

6,46 -0,017 cloruro

bis-tris propano

6,80 cloruro

trietanolamina

7,76 -0,020 cloruro o acetato

Tris

8,06 -0,028 cloruro

N-metil-dietanolamina

8,52 -0,028 cloruro

dietanolamina

8,88 -0,025 cloruro

1,3-diaminopropano

8,64 -0,031 cloruro

etanolamina

9,50 -0,029 cloruro

piperazina

9,73 -0,026 cloruro

1,3-diaminopropano

10,47 -0,026 cloruro

piperidina

11,12 -0,031 cloruro

fosfato

12,33 -0,026 cloruro

El reparto puede ocurrir en diferentes etapas del procedimiento, preferiblemente durante la purificacion antes de la filtracion en gel. La filtracion a traves de membranas Q es otra alternativa para la etapa de limpieza de endotoxina. 5 En una realizacion, se puede emplear la filtracion en membrana Q utilizando un pH de pH 5,5 en acetato de Na 20 mM y NaCl 100 mM. De acuerdo con K.C. Hou y R. Zaniewski, Biotech. Appl. Biochem. 12, 315-324, 1990, se espera que estas condiciones de pH y sal eliminen endotoxina en el intervalo de aproximadamente 70 a 85%. En una realizacion, un procedimiento de filtracion Q en un modo de recoleccion de flujo continuo produce mas de aproximadamente 95% de condroitinasa. La filtracion en membrana Q se puede realizar en varios momentos

10 durante el procedimiento, incluyendo, por ejemplo, al final de la purificacion despues de la filtracion en gel.

De este modo, la eliminacion de la endotoxina de la condroitinasa de la muestra puede incluir la carga de la muestra en la cromatografia de intercambio anionico, el lavado del intercambiador anionico, en el que las impurezas se lavan mediante el aumento de la fuerza ionica y/o mediante los cambios de pH, es decir, en condiciones de cromatografia de intercambio anionico; y la elucion de la muestra de condroitinasa mediante un aumento adicional de la fuerza

15 ionica y/o mediante un cambio de pH.

La dialisis es uno de los metodos mas comunmente utilizados para la transferencia de una muestra biologica, por lo general a base de proteinas, de un medio a otro. Con frecuencia es necesario eliminar las sales o cambiar el tampon despues de una etapa en la purificacion para que la siguiente etapa funcione eficazmente. Esto se puede conseguir mediante dialisis en donde la disolucion de proteina se mantiene en una membrana semi-permeable y se coloca en 20 el tampon de modo que las moleculas pequenas, p. ej., sales, puedan pasar libremente a traves de la membrana, mientras que las moleculas grandes, por ejemplo proteinas, son retenidas. Opcionalmente, se utiliza una etapa de dialisis para purificar adicionalmente la condroitinasa. Se puede utilizar un tampon volatil, tal como bicarbonato de amonio, pH 8,0 para la etapa de dialisis. Tambien se pueden utilizar otros tampones. La eleccion del tampon seleccionado debe ser apropiada para la proteina que se esta sometiendo a dialisis. Tales tampones son bien

conocidos en la tecnica (por ejemplo, pero no limitados a, tampones basados en Tris, tampones de fosfato, etc.). El tampon utilizado para la dialisis puede ser cualquier tampon que sea capaz de mantener el pH apropiado en el cual estabilizar la proteina que esta siendo aislada.

Para el almacenamiento y la distribucion de la condroitinasa purificada, el procedimiento de purificacion de la condroitinasa puede incluir ademas la etapa de secado. La etapa de secado puede implicar secado por calor convencional o, mas preferiblemente, liofilizacion o secado por congelacion.

Se puede proporcionar adicionalmente un metodo de seguimiento de los rendimientos y perfiles de pureza enzimaticos mediante HPLC de fase inversa. Esto se puede realizar despues de cualquiera o de todas las etapas en el procedimiento de purificacion.

El rendimiento final de enzima puede ser de hasta aproximadamente 50 mg de condroitinasa a partir de 1L de celulas cultivadas. El rendimiento final de enzima puede estar en el intervalo de aproximadamente 75 a 85 mg/1 L de celulas.

La condroitinasa purificada se puede caracterizar por una o mas de las siguientes propiedades: la actividad de la enzima, el pI, la especificidad de sustrato, la velocidad de catalisis de sustrato, el efecto inhibidor de las sales de metales divalentes, el pH optimo del tampon de almacenamiento, los efectos de las diferentes condiciones de estres, el tampon y la fuerza ionica optimos, la estabilizacion de la enzima en diversos excipientes, y el efecto de la concentracion de la enzima en la estabilidad termica.

Se utilizo una condroitinasa ABCI como ejemplo de una condroitinasa que se puede purificar y formular. La condroitinasa ABCI liofilizada purificada se reconstituyo y se analizo para determinar su actividad que se comparo con las actividades de las enzimas condroitinasa ABCI disponibles de otras fuentes. La actividad de la enzima condroitinasa ABCI fue una preparacion de enzima relativamente alta. La actividad de la condroitinasa ABCI purificada es de aproximadamente 160 U/mg. El pI de la condroitinasa ABCI purificada es de aproximadamente 7,8 a aproximadamente 8,0. La afinidad de la condroitinasa ABCI purificada es similar para la condroitina A, la condroitina B, y la condroitina C. La velocidad de catalisis de un sustrato para la condroitinasa ABCI purificada es mayor para la condroitina A que para la condroitina C, que es mayor que la velocidad de catalisis de la condroitina B.

Las sales de metales divalentes pueden inhibir una actividad de condroitinasa. Por ejemplo, la condroitinasa ABCI purificada puede ser inhibida por Zn, Ni y Co. El Ca y el Mg parecen ser menos inhibidores. El pH del tampon de almacenamiento no afecta a la actividad de la condroitinasa purificada. En realizaciones preferidas, el tampon de almacenamiento tiene un pH 7,4, pH fisiologico.

Si bien la condroitinasa generalmente puede verse afectada por varias condiciones adversas, la condroitinasa purificada no parece verse afectada por congelacion y descongelacion repetidas.

Varias realizaciones proporcionan una formulacion estable de la enzima tanto para el almacenamiento como para la administracion. En general, la condroitinasa de tales formulaciones estables exhibe al menos aproximadamente 50% de actividad en aproximadamente 24 horas, preferiblemente al menos aproximadamente 75% de actividad, mas preferiblemente al menos aproximadamente 85% de actividad. En otro aspecto de la invencion, las formulaciones proporcionan consecuentemente actividad condroitinasa estable.

En la invencion, la condroitinasa se formula en un tampon de fosfato de sodio con una concentracion en el intervalo de aproximadamente 750 mM a aproximadamente 1 M. Una realizacion preferida es fosfato de sodio aproximadamente 750 mM. En una realizacion adicional, la condroitinasa se puede formular en un tampon de fosfato de sodio que comprende ademas acetato de sodio. El acetato de sodio puede estar presente en el intervalo de 25 mm a aproximadamente 75 mM. En una realizacion preferida, la concentracion de acetato de sodio es aproximadamente 50 mM. En una realizacion, una formulacion preferida para la administracion es una condroitinasa en un tampon con un pH de 7,4. Otras realizaciones de formulaciones para el almacenamiento y la administracion se proporcionan en los ejemplos descritos.

En otra realizacion, se proporciona una formulacion que comprende condroitinasa purificada y un tampon que comprende un aumento de la fuerza ionica. Las realizaciones en las que una formulacion comprende un aumento de la concentracion ionica pueden aumentar la estabilidad de una formulacion de enzima. Por ejemplo, una realizacion preferida proporciona una formulacion con aproximadamente NaCl 1 M en fosfato de sodio. La concentracion de fosfato de sodio puede ser de aproximadamente 50 mM. En una realizacion preferida, la concentracion de almacenamiento de condroitinasa es inferior a aproximadamente 0,4 mg/ml.

En otra realizacion, se proporciona una formulacion que comprende una condroitinasa B con una condroitinasa ABC purificada.

Opcionalmente, se proporciona una purificacion de condroitinasa AC que comprende las siguientes etapas: 1) extraccion de la enzima a partir de una celula, 2) separar el extracto de celulas bruto utilizando cromatografia de intercambio cationico, 3) separar adicionalmente el extracto mediante cromatografia de filtracion en gel, y 4) eliminar la endotoxina a traves de una membrana de intercambio anionico para producir una condroitinasa AC purificada.

Opcionalmente, una condroitinasa AC purificada se somete a dialisis en un tampon volatil, se liofiliza y se almacena a -80quot;C. El Ejemplo 12 describe un metodo de purificacion de una condroitinasa AC.

En una realizacion, se proporciona tampon de estabilizacion (para a aproximadamente 37quot;C) fosfato de sodio aproximadamente 0,75 M, pH 7,4, acetato de sodio 50 mM. En otra realizacion el almacenamiento de condroitinasa es en forma liofilizada.

La actividad condroitinasa se puede estabilizar mediante la adicion de excipientes o mediante liofilizacion. Los estabilizadores incluyen carbohidratos, aminoacidos, acidos grasos y tensioactivos y son conocidos por los expertos en la tecnica. Los ejemplos incluyen carbohidratos tales como sacarosa, lactosa, manitol, y dextrano, proteinas tales como albumina y protamina, aminoacidos tales como arginina, glicina, y treonina, tensioactivos tales como TWEEN� y PLURONIC�, sales tales como cloruro de calcio y fosfato de sodio, y lipidos tales como acidos grasos, fosfolipidos y sales biliares.

Los estabilizadores se anaden generalmente a la proteina a una proporcion de 1:10 a 4:1, carbohidrato a proteina, aminoacidos a proteina, estabilizador de proteina a proteina, y sales a proteina; 1:1000 a 1:20, tensioactivo a proteina; y 1:20 a 4:1, lipidos a proteina. Otros estabilizadores incluyen concentraciones elevadas de sulfato de amonio, acetato de sodio o sulfato de sodio, basandose en estudios comparativos con actividad heparinasa. Los agentes estabilizantes, preferiblemente el sulfato de amonio u otra sal similar, se anaden a la enzima a una proporcion de 0,1 a 4,0 mg de sulfato de amonio/UI enzima.

La condroitinasa se puede administrar topicamente, localmente o sistemicamente. La administracion topica o local es preferible para un mayor control de la aplicacion. Las condroitinasas, singularmente o combinadas, se pueden mezclar con un vehiculo farmaceutico apropiado antes de su administracion. Los ejemplos de los vehiculos y aditivos farmaceuticos generalmente utilizados son diluyentes, aglutinantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes disgregantes, agentes tamponadores, acidos grasos isotonizantes, agentes isotonizantes, conservantes, anestesicos, agentes tensioactivos convencionales y similares, y son conocidos por los expertos en la tecnica. Especificamente los vehiculos farmaceuticos que se pueden utilizar son dextrano, sacarosa, lactosa, maltosa, xilosa, trehalosa, manitol, xilitol, sorbitol, inositol, albumina de suero, gelatina, creatinina, polietilenglicol, tensioactivos no ionicos (p. ej., esteres de acidos grasos de polioxietilensorbitan, aceite de ricino endurecido con polioxietileno, esteres de acidos grasos de sacarosa, polioxietilenpolioxipropilenglicol) y compuestos similares. Los vehiculos farmaceuticos tambien pueden ser utilizados combinados, por ejemplo polietilenglicol y/o sacarosa, o esteres de acidos grasos de polioxietilensorbitan, es particularmente preferido el monooleato de polioxietilensorbitan (20 O.E.).

Se puede llevar a cabo un regimen de tratamiento por medio de la administracion, sola o combinada de condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC, condroitinasa B, HYAL1, Hyal2, Hyal3, Hyal4, y PH2O a las lesiones de la zona lesionada del SNC. El modo de administracion, el momento de administracion y la dosificacion se llevan a cabo de manera que la recuperacion funcional del deterioro del sistema nervioso central se vea reforzada por la promocion del crecimiento de las neuritas. Los tratamientos de la presente descripcion liberan una cantidad eficaz de condroitinasa ABCI purificada como se ha descrito anteriormente, sola o combinada con condroitinasa ABCII, condroitinasa AC, condroitinasa B, Hyal 1, Hyal 2, Hyal 3, Hyal 4, y PH2O al sitio de la lesion .

La cantidad eficaz de condroitinasa puede administrarse en una sola dosis, dos dosis o una pluralidad de dosis. Aunque se debe entender que la dosis se puede administrar en cualquier momento, en un ejemplo, la dosis se administra a las 12 horas de la lesion, o tan pronto como sea posible. En otro ejemplo, la dosis se administra a un mamifero herido en una, dos o una pluralidad de dosis; tales dosis dependerian de la gravedad de la lesion y la cantidad de CSPG presente en la cicatrizacion glial. Cuando se administra una pluralidad de dosis, esta se puede liberar diariamente, semanalmente o quincenalmente. La liberacion de las dosis puede ser por medio de un cateter o una jeringa. Alternativamente, el tratamiento se puede administrar durante la cirugia para permitir la aplicacion directa a la cicatriz glial.

Como ejemplo de una formulacion purificada de una condroitinasa, se purifico y se caracterizo una ABCI recombinante (cABCI) como se ha descrito anteriormente utilizando los siguientes parametros: la estabilidad de la temperatura, las caracteristicas de la enzima, la susceptibilidad a diversas condiciones de estres, los productos de degradacion; los efectos de diferentes excipientes sobre la estabilidad de la enzima.

Los siguientes metodos se utilizan para ilustrar las diversas realizaciones de la presente invencion. Los metodos son metodos ilustrativos y no se pretende que limiten la invencion.

Analisis de la actividad. La actividad enzimatica de cABCI se analizo de acuerdo con una version modificada de Hamai et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (14) :9123-9130. Se incubaron 125 �l de la mezcla de reaccion que contenia Tris 40 mM, pH 8,0, acetato de Na 40 mM, caseina al 0,002% a aproximadamente 37quot;C durante al menos 3 min. Despues de la incubacion, se anadieron 1 mg/ml (concentracion final) de sulfato de condroitina C y 0,05-0.5 �g de enzima cABCI, la mezcla se sometio a vortice suavemente y despues se verifico la velocidad de formacion de producto por medio de absorcion a aproximadamente 232 nm durante aproximadamente 45-90 segundos. Los calculos de las concentraciones de sustrato y producto estan basadas en el PM de los residuos hexuronato equivalentes a 521 y un coeficiente de extincion molar (�232) para hexuronato-6-sulfato insaturado a 232 nm de 5500.

Cuando se utilizaron condroitina A y B como sustratos en el analisis, los calculos para los productos de hexuronato4-sulfato insaturado se realizaron con un PM equivalente a 503 y un �232 de 5100. Las tasas de actividad iniciales se calcularon en nmoles de disacarido/min mediante el ajuste de los datos recogidos en una funcion lineal. La actividad especifica de la enzima se expreso en U/mg, donde unidad (U) se define como �moles de producto formado en 1 min. El intervalo lineal para medir la velocidad de degradacion de condroitina fue amplio como se muestra en la Figura 1.

Estimacion del coeficiente de extincion. Se determino el coeficiente de extincion para diferentes lotes de cABCI. Dos lotes diferentes de condroitinasa ABCI purificada se reconstituyeron en acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, NaCl 100 mM. Algunas muestras contenian sacarosa 0,3 M en el tampon de reconstitucion. Se tomaron para cada muestra la absorcion a 280 nm y las concentraciones de proteina utilizando mediciones de analisis de proteinas de Lowry modificado. La estimacion del coeficiente de extincion para cABCI se presenta a continuacion en la Tabla 3.

Tabla 3. Coeficiente de extincion

Muestra cABCI

A280 Concentracion, mg/ml �280 0,1%

Lote 5c-4quot;C

0,928 0,68 1,36

Lote 5c-4quot;C sacarosa

0,53 0,4 1,32

Lote 5c-Tambiente

0,672 0,342 1,96

Lote 5c-Tambiente sacarosa

0,46 0,25 1,84

Lote 5d

1,81 0,98 1,84

Promedio

1,66

La estimacion del coeficiente de extincion para la disolucion de cABCI al 0,1% se obtuvo dividiendo A280 por la concentracion (mg/ml). El coeficiente de extincion promedio (1,66) se utilizo en experimentos posteriores para las mediciones de la concentracion de cABCI.

Caracterizacion mediante cromatografia de exclusion por tamano (SEC). Se utilizo la SEC analitica para caracterizar la agregacion y la conformacion de la condroitinasa ABCI. La SEC analitica se realizo utilizando columnas Shodex KW-803, que tiene un rango de separacion de alrededor de 50.000 a 150.000 Daltons (Da) y Shodex KW-804, que tiene un rango de separacion de alrededor de 100.000 a 600.000 Daltons (Da). El tampon para la fase movil fue fosfato de sodio 100 mM, NaCl 50 mM, betaina al 0,5%, pH 7,3. El analisis se realizo a una velocidad de flujo de 1 ml/min a temperaturas ambiente (aproximadamente 22quot;C).

Analisis de Proteina. Para determinar la concentracion de proteina se utilizaron un analisis de proteina de Lowry modificado (BioRad) y BCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

SDS-PAGE. Las proteinas se separaron en minigel performado para SDS-PAGE con un gradiente de 4-20% (BioRad) y la electroforesis se llevo a cabo a 200 V en un aparato para minigel (BioRad). Los geles se tineron con Coomassie o tincion de plata.

IEF-PAGE. La IEF-PAGE se llevo a cabo para determinar el valor de pI para condroitinasa ABCI en un intervalo de pH de 3-10 utilizando geles Novex IEF (Invitrogen) y se ejecuto de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un aparato de gel Novex. Los geles se tineron con Azul de Coomassie Coloidal.

Transferencia Western. Las proteinas se separaron sobre SDS-PAGE y despues se sometieron a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa mediante el metodo de transferencia de tanque (BioRad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampon de transferencia contenia Tris 25 mM y glicina 192 mM a pH 8,3, SDS al 1%.

Analisis Oxyblot. La deteccion de los grupos carbonilo que se introducen en las cadenas laterales de las proteinas mediante un mecanismo especifico de sitio fue proporcionada por el kit de Deteccion de la Oxidacion de Proteina OxyBlot de Chemicon Internacional. Especificamente, los grupos carbonilo en las cadenas laterales de las proteinas fueron derivatizados por 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) a 2,4-dinitrofenilhidrozona (DNP-hidrozona). Las muestras se transfirieron despues a nitrocelulosa. La membrana se expuso a continuacion a un anticuerpo primario especifico de DNP. Despues de la incubacion con el anticuerpo primario, la membrana se incubo con un anticuerpo secundario conjugado con HRP. La presencia del complejo de anticuerpo se detecto mediante quimioluminiscencia.

Analisis HPLC de intercambio cationico. Los productos de oxidacion de cABCI se analizaron utilizando una columna de Intercambio Cationico WCX-10 Dionex ProPac unida a un sistema Thermo Finnigan Chromatographic que consiste en un detector Surveyor PDA, bomba y muestreador automatico. La enzima se hizo eluir con un gradiente de NaCl en tampon de Fosfato de Na 10 mM, pH 6,0. La longitud de onda del detector se ajusto a 215 nm.

Cromatografia de exclusion por tamano. La cromatografia de exclusion por tamano analitica se llevo a cabo a traves de una columna KW-803 (Showdex Inc.), que tiene un rango de separacion de aproximadamente 50 a 150.000, y una columna de KW-804, que tiene un rango de separacion de alrededor de 100.000-600.000, utilizando HPLC (ESA Inc.) provista de dispersion de luz (Wyatt Technology) y detector UV (Waters Co.). Se utilizo Fosfato de Na 100 mM, pH 7,4 como fase movil.

Estudios de Estres de cABCI. La enzima cABCI liofilizada se reconstituyo en un tampon de eleccion. Se dejo que la enzima se reconstituyera o bien sobre hielo o bien a aproximadamente 4quot;C durante varias horas y el material insoluble, si lo hubiera, se elimino mediante centrifugacion a 14.000 g. Despues alicuotas de 100 �l se sometieron a diferentes condiciones de estres, incluyendo pero no limitadas a, temperatura, vortice continuo, congelaciondescongelacion, luz UV, presencia de peroxido de hidrogeno. Las muestras sometidas a luz UV se mantuvieron en hielo durante la exposicion para minimizar cualquier efecto de calentamiento sobre la enzima. El vortice se realizo a aproximadamente 4quot;C. La oxidacion por medio de peroxido de hidrogeno se sometio a ensayo mediante la incubacion de las muestras con diferentes concentraciones de peroxido de hidrogeno durante la noche a 4quot;C. Los ciclos de congelacion-descongelacion se ejecutaron sobre hielo seco. Las muestras de post-tratamiento se analizaron para determinar la concentracion de proteina por medio de lecturas a A280, actividad enzimatica mediante espectrofotometria y adicionalmente se evaluaron mediante SDS-PAGE reductora y no reductora, IEF-PAGE desnaturalizada, SEC y HPLC de intercambio cationico.

Estudios de formulacion para cABCI. Puesto que la cABCI puede ser susceptible de inactivacion por calor, tambien se utilizo la incubacion a aproximadamente 37quot;C como un factor de estres en los estudios de formulacion. Las muestras de cABCI reconstituidas se incubaron durante la noche o mas tiempo en un bano de agua a 37quot;C con diferentes aditivos y componentes del tampon. Despues de la incubacion, las muestras se analizaron para determinar la actividad de la enzima.

Ejemplo 1

La condroitinasa ABCI recombinante se expreso en exceso en E.coli y se purifico de acuerdo con las siguientes etapas:

(i)extraccion de la enzima con Triton X-114/PBS y sonicacion del sedimento de celulas bacterianas;

(ii)cromatografia de intercambio cationico SP en tampon de acetato de sodio a pH 5,5;

(iii)cromatografia de filtracion en gel Sephacryl S200 en tampon de acetato de sodio a pH 5,5;

(iv)filtracion a traves de membrana de intercambio anionico Q para la eliminacion de endotoxina y ADN; y

(v) dialisis en un tampon volatil (bicarbonato de amonio a pH 8,0). Opcionalmente, esta etapa puede estar seguida de liofilizacion, o de cualquier otro metodo de concentracion y eliminacion de tampon (por ejemplo, filtracion en condiciones esteriles seguido de suspension en una formulacion apropiada).

Se expreso en exceso una condroitinasa ABCI recombinante en E. coli. Una gran parte de la enzima se libero en disolucion con detergente no ionico y sonicacion. Una SDS-PAGE, visualizada con tincion de plata, del extracto soluble en detergente y fracciones de sedimento insolubles en detergente de las celulas bacterianas que expresan en exceso ABCI revelo una unica banda grande que corre entre marcadores de tamano de aproximadamente 75 kDa y 100 kDa.

La cromatografia de intercambio cationico se utilizo como una etapa de captura en purificaciones adicionales. La cromatografia CEX SP a pH aproximadamente 5,5 en tampon de acetato fue eficaz para la captura de la condroitinasa ABCI del extracto de celulas bacterianas. Se encontro que la enzima se habia unido cuantitativamente y eluia de la columna SP con una pureza y una rendimiento relativamente altos cuando se utilizaba detergente Triton X-114, concentracion final en el intervalo de aproximadamente 0,2-1%, en el tampon de extraccion. El analisis mediante SDS-PAGE de las fracciones inicio, flujo continuo y de elucion de la condroitinasa ABCI (25%B) de la columna SP para el extracto con Triton X-114 revelo que la condroitinasa ABCI habia eluido. Un extracto que contenia Triton X-100 parecio alterar las caracteristicas de carga de la condroitinasa ABCI dando como resultado una captura escasa, unos rendimientos de elucion pobres y una baja pureza en la etapa.

La eliminacion de endotoxina se logro mediante dos metodos, especificamente reparto en Triton X-114 y filtracion en membrana de intercambio anionico Q.

El analisis mediante SDS-PAGE de las fracciones condroitinasa ABCI durante etapa de eliminacion de endotoxina utilizando el metodo de reparto con Triton X-114 detecto una unica banda grande en ausencia de cualquiera de las bandas de fondo.

La filtracion a traves de membranas Q se empleo para la etapa de eliminacion de endotoxina. Este metodo se sometio a ensayo a aproximadamente pH 5,5. Se encontro que el acetato de Na 20 mM, pH 5,5, NaCl 100 mM era un tampon eficaz para la union de la endotoxina a las membranas Q (de acuerdo con K.C. Hou y R. Zaniewski, Biotech. Appl. Biochem. 12, 315-324, 1990, se espera que estas condiciones de pH y sal eliminen aproximadamente 75% de endotoxina) y para reducir al minimo las perdidas cABCI durante esta etapa. Se recogio mas de 95% de la cABCI en un modo de flujo continuo. Esta etapa se llevo a cabo despues de filtracion en gel al final de la purificacion, tal como se describe a continuacion.

La filtracion en gel se utilizo como una etapa de refinado para la condroitinasa ABCI. Los ejemplos de la filtracion en gel que se pueden utilizar incluyen Sephacryl S200 y Sephacryl S300. Se sometieron a ensayo Sephacryl S200 y Sephacryl S300 para determinar su eficacia en la separacion de los agregados y los contaminantes de bajo peso molecular. Se sometieron a ensayo dos tampones de elucion diferentes (Tampon 1: Tris 20 mM a pH 8,0, NaCl 200 mM, betaina 0al ,5% y Tampon 2: acetato de sodio 20 mM a pH 5,5, NaCl 100 mM) para cada gel y se encontro que funcionaban igual de bien. La condroitinasa ABCI se hizo eluir con los tiempos de retencion esperados sin una perdida sustancial en la muestra.

La Figura 2 representa la purificacion de condroitinasa ABCI mediante en gel. La Figura 2A es un perfil de cromatografia para columna 26/60 de Sephacryl S300. La Figura 2B es un analisis de SDS-PAGE de la fraccion de elucion de condroitinasa ABCI de una columna 26/60 de Sephacryl S300 en Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM, betaina al 0,5%. La Figura 2C es un analisis de SDS-PAGE de la fraccion de elucion de condroitinasa ABCI de una columna 26/60 de Sephacryl S200 en acetato de Na 20 mM, pH 5,5, NaCl 100 mM.

Para la liofilizacion, la enzima purificada se sometio a dialisis en tampon volatil de NH4CO3 0,1 M, a pH aproximadamente 8,0.

Se llevo a cabo una SDS-PAGE en gradiente (4-20%), en condiciones reductoras, de muestras de la columna de captura de intercambio cationico (extracto de partida, flujo continuo, lavado y conjunto de elucion de SP) y de las etapas de filtracion en gel (conjunto de elucion de S200) . El gel se tino con azul de Coomassie. El analisis en gel mostro que las etapas de purificacion eliminaron relativamente todos los restos celulares y contaminantes, proporcionando una muestra de enzima relativamente pura.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la actividad enzimatica de la condroitinasa ABCI recombinante purificada del Ejemplo 1 en comparacion con la enzima nativa. La actividad enzimatica de la condroitinasa ABCI se analizo como se describe en otra parte en la presente memoria. La condroitinasa ABCI recombinante del Ejemplo 1 tiene la misma o mayor actividad especifica que la enzima nativa, y una actividad mucho mas alta que la condroitinasa ABCI expresada de manera recombinante como se muestra a continuacion en la Tabla 4.

Tabla 4. Actividad enzimatica

Fuente de Enzima

Actividad Especifica, U/mg

Condroitinasa ABCI nativo (Seikagaku)

120

Condroitinasa recombinante (Glyko)

24

Condroitinasa ABCI recombinante (Acorda)

160

La caracterizacion mediante SEC se llevo a cabo tanto para la condroitinasa ABCI recombinante del Ejemplo 1 como para la condroitinasa ABCI nativa descrita anteriormente. Los perfiles de elucion de la condroitinasa ABCI recombinante y la condroitinasa ABCI nativa fueron los mismos. La condroitinasa ABCI recombinante tuvo el tiempo de retencion y el peso molecular esperados para una condroitinasa ABCI.

Determinacion del punto isoelectrico de la condroitinasa ABCI recombinante. Se utilizo IEF-PAGE, como se describe en otra parte en la presente memoria, para determinar el valor de pI para la condroitinasa ABCI recombinante del Ejemplo 1. La proteina recombinante del Ejemplo 1 mostro 3 formas isomericas con un pI de aproximadamente 7,88,0 para la isoforma principal. Este valor fue mayor de lo esperado para una enzima nativa.

Ejemplo 3

Se sometieron a ensayo condroitinasa ABCI, AC, y B en una serie de sustratos y en medula espinal de ratas para

5 determinar su especificidad y su actividad utilizando un metodo mejorado de HPLC de intercambio anionico. Este metodo detecta los disacaridos productos de escision de CSPG (Ldi-4DS y Ldi-6DS) con un limite de cuantificacion de 25 ng.

Las mediciones de los productos de escision disacaridos liberados revelaron concentraciones de enzimas, combinaciones de enzimas, y caracteristicas del sustrato en medula espinal de ratas optimas. La actividad catalitica

10 de la condroitinasa ABCI y la condroitinasa AC aumento sinergicamente con la adicion de condroitinasa B. Las digestiones ex vivo de medula espinal de rata proporcionan Ldi-4DS y Ldi-6DS en una proporcion de aproximadamente 95:5. Los estudios de evolucion en el tiempo revelaron que la formacion maxima del producto tenia lugar en el plazo de 6 horas incluso aunque las enzimas fueran activas durante mucho mas tiempo. La inhibicion del producto se descarto como causa de esta observacion.

15 Ejemplo 4

El siguiente ejemplo ilustra la especificidad de sustrato de la cABCI recombinante purificada. La cABCI (lote 7b) se reconstituyo en fosfato de sodio 0,1 M, y NaCH3COO 50 mM a pH 7,4. Las tasas de formacion de producto se midieron a diferentes concentraciones para las condroitinas A, B, y C. Los datos se representaron graficamente y, cuando fue apropiado, se ajustaron directamente a la ecuacion de Michaelis-Menten para el calculo de los valores 20 de Km y Vmax. Las curvas para las condroitinas A, B y C mostraron saturacion a altas concentraciones de sustrato lo que es tipico para la cinetica de Michaelis-Menten. Se midieron los siguientes parametros cineticos de cABCI (Figuras 1 y 3, Tablas 3-5): Km = 0,033 mg/ml y Vmax = 283 U/mg para la condroitina A, Km = 0,021 mg/ml y Vmax = 74 U/mg para la condroitina B, Km = 0,025 mg/ml y Vmax = 188 U/mg para la condroitina C. Teniendo en cuenta los niveles de impurezas que estan presentes en cada sustrato (aproximadamente 70%, para la condroitina A,

25 aproximadamente 85% para la condroitina B y aproximadamente 90% para la condroitina C), parece que la cABCI tiene una afinidad similar para todas las condroitinas, pero las digiere a diferentes tasas especificas (condroitina A gt; condroitina C gt; condroitina B). La Tabla 5 proporciona los datos en bruto para las curvas de dependencia de la concentracion de la condroitina A, B y C.

Tabla 5. Actividad Las tasas medias especificas (U/mg) se representaron graficamente como una funcion de la concentracion de sustrato (mg/ml) y los datos se ajustaron directamente en la ecuacion de Michaelis-Menten para la determinacion de los parametros cineticos de cABCI. La Figura 3 muestra las curvas de Michaelis-Menten para cABCI y sus sustratos:

Sustrato, mg/ml

Tasas medidas, nmol/min Actividad media, U/mg

Condroitina A (pureza de 70%) 0,032

5,03; 5,54; 6,8 127,9

0,048

6,85; 7,39; 7,15 157,6

0,08

9,50; 8,25; 10,38 207,2

0,12

11,34; 9,78; 11,41 239,6

0,16

11,65; 12,24; 9,19 243,6

0,24

8,97; 14,65; 10,46; 12,44 257,0

0,32

10,95; 10,45; 10,98 238,4

0,48

11,81; 11,48; 11,34 255,1

Condroitina B (pureza de 85%) 0,04

9,85; 10,49 47,1

0,06

12,97; 10,67 54,7

0,08

12,46; 12,88 58,7

Sustrato, mg/ml

Tasas medidas, nmol/min Actividad media, U/mg

0,16

14,47; 14,50 67,0

0,20

14,58; 12,72 63,2

0,40

15,20; 15,31 70,6

0,60

15,21; 13,98; 16,03 69,8

0,80

16,10; 14,97 71,9

Condroitina C (pureza de 90%)

0,03

5,26; 3,91; 4,26 91,6

0,053

6,57; 6,41; 6,23 131,2

0,107

8,00; 8,55; 8,46 170,7

0,160

7,49; 7,98; 7,66 158,0

0,267

8,84; 8,49; 7,46 169,3

0,400

8,23; 9,23; 7,58 171,1

0,533

9,65; 8,33; 8,18 178,7

5 condroitina A, B y C.

Ejemplo 5

Se midio la inhibicion de la enzima condroitinasa ABCI purificada en presencia de diversas sales de metales divalentes (1 mM). Se analizo la actividad cABCI despues realizar adiciones de metales. La capacidad de inhibicion de los metales sometido a ensayo parece estar en el orden siguiente: Zn gt;gt; Ni gt;gt; Co gt; Ca gt; Mg. En particular, los

10 iones de calcio y magnesio parecen tener algunos efectos inhibidores medibles sobre cABCI. La Tabla 6 proporciona la inhibicion por metal de la cABCI recombinante.

Tabla 6. Inhibicion por metal

Sales metalicas, 1 mM

Tasas medidas, nmol/min Actividad retenida, U/mg Actividad retenida %

Ninguno

12,6; 13,9; 14,7 127 100

CoCl2

6,5; 6,6 61 48

NiSO4

1,8; 1,9 17 14

ZnCl2

0,23; 0,29 2,4 2

CaCl2

7,6; 9,2 78 61

Sales metalicas, 1 mM

Tasas medidas, nmol/min Actividad retenida, U/mg Actividad retenida %

MgCl2

9,1; 9,2 85 67

FeCl2

interfirio en un analisis ND ND

Cu(CH3COO)2

interfirio en un analisis ND ND

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra el efecto que tiene el pH del tampon de almacenamiento sobre la estabilidad de la cABCI recombinante purificada. La cABCI liofilizada se reconstituyo en tampon de acetato de Na 20 mM, pH 5,5, NaCl 100 5 mM a 2,0 mg/ml de concentracion (utilizando un analisis de proteina BCA). Se lograron diferentes condiciones de pH mediante la dilucion de la muestra reconstituida a razones de aproximadamente 1:2 con tampones de Bis-Tris propano 50 mM con diversas condiciones de pH. La concentracion de cABCI de las muestras finales fue de aproximadamente 1 mg/ml. Las muestras se almacenaron a aproximadamente 4quot;C y su actividad se midio a las 24 horas, 48 horas y 72 horas. Tabla 7 proporciona los datos de actividad medidos para las muestras de cABCI

10 recombinante almacenadas bajo diferentes condiciones de pH.

Tabla 7. Actividades medidas

PH Almacenamiento

Tasas de inicio, nmol/min Cambio despues de 24 horas a 4quot;C, nmol/min Cambio despues de 48 horas a 4quot;C, nmol/min Cambio despues de 72 horas a 4quot;C, nmol/min Tasas promedio, nmol/min

4

1,63; 2,47 5,47; 5,28 5,16; 5,00 4,84; 5,59 4,4

5

2,55; 3,13 5,92; 4,09 4,00; 3,70 4,89; 4,59 4,1

6

3,93; 4,04 4,46; 3,74 2,64; 2,78 4,90; 4,67 3,9

7

4,15; 5,55 4,41,4,57 4,97; 5,09 4,91; 4,51 4,8

8

4,43; 3,49 3,62; 4,21 4,29; 4,04 4,24; 4,80 4,1

9

4,47; 3,65 4,53; 4,27 5,09; 4,49 5,05; 4,10 4,5

No se observaron diferencias significativas entre las muestras almacenadas a diferentes condiciones de pH. Se prefiere el pH 7,4 para que este dentro del intervalo de pH fisiologico.

15 Ejemplo 7

La cABCI recombinante se sometio a diferentes condiciones de estres. Los datos de actividad y concentracion de proteina para las muestras cABCI recombinante despues de diversos tratamientos de estres se presentan en la Tabla 8.

Tabla 8. Actividad despues de condiciones de estres Las muestras tratadas con estres tambien se analizaron mediante SEC con un detector de dispersion de luz. Los perfiles de dispersion de luz de SEC de las muestras de cABCI no tratadas (control) y tratadas con estres se muestran en las Figuras 4A-4E.

Num. Muestra

Tratamiento Puntos de Tratamiento Concentracion, mg/ml Tasas medidas, nmol/min Actividad, U/mg

Control

4quot;C 0,976 31,7, 30,0 126,4

1

Congelacion 1 ciclo 0,952 30,1, 29,2 124,6

2

Congelacion 2 ciclo 0,952 22,8, 27,8 108,6

Num. Muestra

Tratamiento Puntos de Tratamiento Concentracion, mg/ml Tasas medidas, nmol/min Actividad, U/mg

3

Congelacion 3 ciclo 0,932 27,3; 25,8 114

4

H2O2 0,5 mM 0,952 24,3; 22,7 98,8

5

H2O2 5 mM 0,964 4,3; 6,1 21,3

6

H2O2 20 mM 0,982 1,1; 1,4 5,15

7

Vortice 5 min 0,765 18,4; 17,9 94,8

8

Vortice 20 min 0,432 13,0; 12,3 117

9

Vortice 60 min 0,066 0,7; 0,8 46

10

UV 40 min 0,976 0,1; 0,3 0,8

11

UV 1 hora 0,976 0,1; 0,1 0,36

12

UV 2 horas 0,976 0,1; 0,1 0,33

13

37quot;C 1 hora 0,922 18,9; 16,0 75,5

14

37quot;C 4 horas 0,934 15,8; 17,0 70,1

15

37quot;C 20 horas 0,801 14,6; 8,8 58,3

5 La cABCI recombinante, a aproximadamente 1 mg/ml, no parecio ser afectada por 3 ciclos de congelacion y descongelacion. La enzima precipito y se inactivo en una manera dependiente del tiempo cuando se utilizo vortice como factor de estres. La exposicion a peroxido de hidrogeno dio como resultado la perdida de la actividad de una manera dependiente de la concentracion con cambios notables en sus perfiles de isoforma sobre IEF-PAGE. La exposicion a la luz UV tuvo un efecto negativo sobre la actividad de cABCI. La enzima no parecia ser estable a 37quot;C

10 y su perdida de actividad parecia ser dependiente del tiempo. Las muestras inactivadas termicamente tuvieron una disminucion de la concentracion de proteina y mostraron cambios similares en el perfil de isoforma, pero en menor grado, con respecto a los observados para las muestras tratadas con peroxido de hidrogeno.

Se desarrollo un metodo de HPLC de intercambio cationico debil (CEX) con el fin de cuantificar los productos de oxidacion de cABCI. Por lo tanto, se llevo a cabo otro estudio estres con el fin de identificar y correlacionar la 15 presencia de productos de oxidacion con la perdida de actividad enzimatica. Algunos tratamientos de estres se repitieron en condiciones mas suaves que las utilizadas en el estudio anterior (exposicion a UV). Las muestras de cABCI reconstituidas (0,6 mg/ml) se expusieron a 2 diferentes fuentes de luz UV (exposicion de larga distancia y de corta distancia) durante aproximadamente 0,5, 1, 3 y 5 minutos e inactivacion termica (aproximadamente 37quot;C) en tampon acetato de Na 20 mM, pH 5,5, NaCl 100 mM. Las muestras se analizaron para determinar la actividad y

20 mediante IEF-PAGE, SDS-PAGE, oxyblot y CEX-HPLC. Los resultados se describen a continuacion.

Despues del tratamiento de oxidacion, aparecio un pico adicional en CEX-HPLC y se supuso que era la condroitinasa oxidada de la Figura 5. Este pico se incremento con el aumento en el tiempo de exposicion a UV. Las areas totales bajo la curva en los cromatogramas de RP-HPLC se mantuvieron casi iguales.

La Figura 5 muestra un analisis CEX-HPLC debil de las muestras de cABCI tratadas con UV. Se muestran los

25 cromatogramas de cABCI antes (Figura 5A) y despues de 0,5 (Figura 5B), 3 (Figura 5C) y 5 minutos (Figura 5D) de exposicion a UV cercano (fuente de luz portatil).

La Tabla 9 proporciona los datos de actividad de cABCI para las muestras no tratadas (control) y tratadas con estres. Tabla 9. Actividad para las muestras tratadas con estres y de control.

Muestras

Tasas, nmol/min, Actividad, U/mg,

Control

49,3; 40,9; 40,9 146,7

Luz UV de larga distancia

0,5 min

53,5; 37,9; 46,3 46,304 45,87 154,0

1min

34,0; 44,6; 44,0 137,1

3min

37,62; 39,3; 32,4 122,2

5 minutos

20,4; 29,2; 23,9 82,04

Luz ultravioleta de corta distancia

0,5 min

41,0; 36,0; 35,2 125,5

1min

16,3; 19,8; 19,2 61,9

3min

8,6; 9,3; 7,8 28,7

5 minutos

1 dia a 37quot;C

13,3; 18,0; 14,1 50,9

Tabla 10. Actividad despues de la exposicion UV

Despues de la exposicion a UV y calor, las muestras de cABCI se analizaron para determinar la actividad por medio del analisis espectrofotometrico descrito anteriormente. Parece que hay una correlacion entre la disminucion relativa en el area del pico de cABCI no oxidada con la disminucion relativa de la actividad (U/mg). La Tabla 10, mostrada a continuacion, es la correlacion de la disminucion de la cABCI no oxidada con la actividad despues de la exposicion a luz ultravioleta de corta distancia y de larga distancia.

Tiempo, minutos

Area del pico area del pico de control % De area inicial % De actividad inicial

0

19239 2739975 100,0 100,0

Luz UV de corta distancia

0,5

93587 2429091 88,7 85,6

1

171634 1225441 44,7 42,1

3

180745 292674 10,7 19,7

5

181961 216126 7,9 6,4

Tiempo, minutos

Area del pico area del pico de control % De area inicial % De actividad inicial

Luz UV de larga distancia

0,5

31900 2770293 101,1 105,0

1,0

28732 2670994 97,5 93,6

3,0

68466 2410100 88,0 83,3

5,0

89149 1877997 68,5 55,8

Las Figuras 6-8 muestran la correlacion de la presencia del producto oxidado de cABCI con la reduccion de la actividad de la enzima. Tambien se observo cierta relacion entre la aparicion del producto oxidado y la actividad enzimatica para las muestras inactivadas termicamente. Las muestras de cABCI fueron expuestas a calor y se

5 analizaron para determinar su actividad mediante espectrofotometria y para determinar el producto oxidado mediante CEX-HPLC como se ha descrito anteriormente.

La Tabla 11 muestra los datos de las mediciones de la actividad de cABCI despues de la incubacion a 37quot;C durante 0 a 24 horas. Se reconstituyo un vial de cABCI del lote 7b en acetato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 100 mM. Las muestras se incubaron a 37quot;C durante 1, 2, 4, 6 y 24 horas. Se determino la concentracion de la muestra de control

10 (antes de cualquiera de las incubaciones). La A280 de la muestra fue 0,88, y se calculo que la concentracion era igual a aproximadamente 0,53 mg/mL.

Tabla 11. Actividad despues de la incubacion

Muestras

Tasas medidas, nmol/min �� Actividad, U/mg

Control, 4quot;C �

34,4; 26,7 181,85

1 hr

26,6; 27,5 161,17

2 hr

22,0; 26,7; 21,3 138,87

4 hr

21,0; 21,5 126,56

6 hr

19,9; 11,6; 17,9; 9,6 87,79

24 hr

4,7; 4,7 27,91

Tabla 12. Correlacion de los datos de actividad de cABCI con el perfil de HPLC de cABCI durante la inactivacion 15 termica.

Tabla 12. Actividad despues de la inactivacion termica

Tiempo

Area del pico Area del pico de control % De area inicial % De actividad inicial

Inicial

49607 3342595 100 100,0

1 hr

60633 2926126 87,5 84,7

2 hr

77000 2728818 81,6 72,8

4 hr

88621 2068080 61,9 66,6

Tiempo

Area del pico Area del pico de control % De area inicial % De actividad inicial

6 hr

134161 1375960 41,2 45,9

25 hr

311574 336266 10,1 14,7

Despues de la determinacion de la actividad y del analisis mediante CEX-HPLC debil, tambien se analizaron las muestras inactivadas termicamente y con UV mediante SDS-PAGE, IEF-PAGE y Oxyblot.

El estudio de incubacion a 37quot;C se repitio para otras condiciones de tampon: Fosfato de Na 0,1 M, pH 7,4, Acetato 5 de Na 50 mM y Fosfato de Na 0,75 M, Acetato de Na 50 mM, como se describe en el Ejemplo 8.

Ejemplo 8

En el siguiente estudio, se utilizaron diferentes tampones para determinar la estabilidad de la enzima. La cABCI recombinante se reconstituyo en Acetato de Na 50 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM y se diluyo 1:3 con disoluciones 0,2 M de acetato de sodio, fosfato de sodio, Tris y HEPES. Despues de una incubacion durante la noche a 37quot;C en los

10 diferentes tampones se determino la actividad de cABCI. Los datos se presentan en la Tabla 13.

Tabla 13. Actividad basada en el sistema tampon

Sistema tampon

Tasas medida, nmol/min Actividad, U/mg

Acetato, pH 6,5 despues de incubacion a 4quot;C

31,7; 30,0 126,4

Acetato, pH 6,5 despues de incubacion a 37quot;C

16,4; 20,8 82,4

Tris, pH 8,1 despues de incubacion a 37quot;C

15,5; 18,9 76,1

Fosfato de Na, pH 7,4 despues de incubacion a 37quot;C

28,4; 28,0 124,8

HEPES, pH 6,8 despues de incubacion a 37quot;C

24,2; 26,9 113

Este estudio revelo que el tampon de fosfato proporciono la mayor proteccion para cABCI contra la inactivacion termica.

15 Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra el efecto de diversos estabilizadores de proteina (tampones) y excipientes sobre su capacidad para estabilizar la cABCI. Los resultados de esta evaluacion de diferentes estabilizadores de proteinas y condiciones de tampon para la formulacion de tampon para cABCI se enumeran en la Tabla 14.

Tabla 14. Actividad basada en estabilizadores de proteina y tampones

Tratamiento

Tasas de inicio, nmol/min Actividad de inicio, U/mg Tasas 72 horas, 37quot;C, nmol/min Actividad 72 horas, 37quot;C, U/mg Actividad retenida %

Control: Fosfato de Na 100 mM pH 7,4, Acetato de Na 50 mM, NaCl 50 mM

8,6; 9,8 91,6 2,6; 2,4 5,3 5,8

NaCl 500 mM

7,9; 10,0 89,5 14,2; 12,3 17,7 19,7

Fosfato de Na 750 mM

11,3; 12,2 117,9 11,3; 11,8 106,0 90,0

Hidroquinona 0,1 mM

10,3; 10,2 102,9 0,03; 0,09 0 0

Tratamiento

Tasas de inicio, nmol/min Actividad de inicio, U/mg Tasas 72 horas, 37quot;C, nmol/min Actividad 72 horas, 37quot;C, U/mg Actividad retenida %

Manitol al 1%

11,6; 9,2 104,5 4,6; 6,1 7,6 7,2

Sacarosa 0,3 M

10,5; 8,9 87,3 13,0; 13,7 13,3 15,3

Glicerol al 10%

9,6; 10,2 98,8 3,6; 3,1 3,5 3,6

Arginina 100 mM

10,2; 11,6 109,2 0,06; 0,12 2,5 2,3

Trehalosa 0,3 M

8,7; 8,7 87,1 0,8; 0,8 1,2 1,4

Fosfato de Na 50 mM

3,0; 3,0 51,4 0,2; 0,3 3,3 6,4

Fosfato de Na 50 mM Polietilimida al 0,01%

4,5; 4,3 68,3 2,2; 3,0 11,3 16,5

� Mostrados son ejemplos de dos pruebas

La Tabla 15 proporciona una evaluacion de EDTA como aditivo para la formulacion de tampon para cABCI. Tabla 15. Actividad despues de la administracion de EDTA

Tratamiento

Tasas de inicio, nmol/min Actividad de inicio, U/mg Tasas 36 a hrs, 37quot;C, nmol/min Actividad a 36 horas, 37quot;C, U/mg Actividad retenida %

Fosfato de Na 50 mM

5,9; 6,1 83,3 23,9; 26,0 53,1 63,7

Fosfato de Na 50 mM, EDTA 1 mM

6,0; 4,8 75,0 18,0; 21,1 65,2 86,9

Fosfato de Na 750 mM

12,0; 10,8 158,2 5,9; 6,2 151,1 95,5

Fosfato de Na 750 mM EDTA 1 mM

11,3; 8,2 135,8 5,9; 6,0 149,5 110,1

5 Ninguno de los excipientes o tampones, excepto el fosfato de sodio 750 mM, fue eficaz contra la inactivacion termica de cABCI. El NaCl 500 mM tambien mostro una cierta mejora en la estabilidad termica de cABCI. Los resultados sugirieron que la fuerza ionica podria desempenar un papel en la proteccion de cABCI frente a la inactivacion termica.

Ejemplo 10

10 Este ejemplo demuestra los efectos que diferentes sales y diferentes concentraciones de sal tienen sobre la estabilidad de cABCI usando cloruro de sodio en el tampon de formulacion para cABCI. Se reconstituyo cABC recombinante en Fosfato de Na 50 mM, pH 7,4 a aproximadamente 2 mg/ml. Se tomo una lectura de la actividad inicial para determinar el nivel basico de actividad. La condroitinasa (1 mg/ml) se diluyo en cloruro de sodio (NaCl) en Fosfato de Na 50 mM, pH 7,4 a concentraciones que oscilaban de 0 a 1 M. Las muestras se dejaron incubando a

15 37quot;C durante 48 horas. Despues de dos dias, las muestras se analizaron para determinar su actividad. Los datos se presentan a continuacion en la Tabla 16-18 y en las Figuras 10 y 11. La Tabla 16 demuestra que la estabilidad termica de cABCI depende de la fuerza ionica del NaCl en presencia de tampon de Fosfato de Na 50 mM.

Tabla 16. Estabilidad termica y fuerza ionica

NaCl, mM

Tasas medidas, nmol/min Actividad a 48 horas, 37quot;C, U/mg Actividad retenida, %

0

0,33; 0,33 3,3 5,1

10

0,11; 0,27 2,0 3,0

100

0,79; 0,92 8,5 13,2

250

0,83; 0,84 8,4 12,9

500

1,30; 1,76 15,3 23,7

1000

1,80; 1,67 17,4 26,9

La Figura 10 es una representacion grafica de los datos que se muestran en la Tabla 16. La Tabla 17 demuestra que los efectos de la concentracion de tampon sobre la estabilidad termica de cABCI son dependientes de la concentracion del tampon en presencia de NaCl 100 mM y Acetato de Na 50 mM.

Tabla 17. Estabilidad termica y tampon

Tampon de fosfato, mM

Tasas, nmol/min Actividad a 96 horas, 37quot;C, U/mg Actividad Retenida %

50

0,10; 0,07 0,83 0,8

100

4,4; 4,6 9,0 8,8

250

18,6; 20,8 43,9 43,0

500

16,4; 15,3 69 67,6

750

24,6; 20,8 103,3 101,4

1000

16,9; 19,9 92,2 90,5

La Figura 12 es una representacion grafica de los datos presentados en la Tabla 17. Los datos demostraron que el aumento de la fuerza ionica parece mejorar la estabilidad termica de cABCI. El Fosfato de Na 750 mM tambien

10 proporciona proteccion para cABCI.

El siguiente conjunto de experimentos se realizo con el fin de optimizar las condiciones de fuerza ionica, mientras que se mantenia la concentracion de sal lo mas baja posible en la formulacion final. La estabilidad termica de la cABCI se determino en una disolucion de fosfato de sodio y sulfato de sodio. El sulfato de sodio es conocido por sus efectos estabilizadores de proteinas. Las concentraciones de ambas sales se variaron y se midieron las tasas

15 cataliticas de cABCI despues de incubaciones a 37quot;C durante 19 hrs, 48 hrs, 120 hrs, y 192 hrs.

La Tabla 18 representa la optimizacion de las concentraciones de fosfato de sodio y sulfato de sodio para la formulacion tampon para cABCI. La cABCI se reconstituyo en Na2HPO4 0,1 M, Acetato de Na 50 mM, pH 7,4. Todas las muestras tuvieron concentraciones de cABCI de 0,37 mg/ml, y la misma concentracion de acetato (50 mM), el mismo pH (7,4) pero diferentes concentraciones de fosfato y sulfato. Las muestras se mantuvieron en un bano de

20 agua a 37quot;C durante los tiempos indicados (19 hrs, 48 hrs, 120 hrs y 192 hrs).

Tabla 18. Formulaciones de fosfato de sodio y sulfato de sodio

Muestra

Tasa despues de 19 horas, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasa despues de 48 horas, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasa despues de 120 horas, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasa despues de 192 horas, nmol/min (Actividad, U/mg)

Control, 4quot;C 0,37 mg/ml

33,701 35,646 40,353 (197,66) N/A N/A N/A

Na2HPO4 0,05 M

Num. 1

0,185 0,2766 (1,25) N/A N/A N/A

Num. 2 Na2SO4 0,15 M

0,984 0,777 (4,8) N/A N/A N/A

Num. 3 Na2SO4 0,22 M

1,3588 1,3924 (7,44) N/A N/A N/A

Num. 4 Na2SO4 0,3 M

1,9721 1,8339 (10,29) N/A N/A N/A

Na2HPO4 0,1 M

Num. 5

1,1044 0,9543 (5,56) N/A N/A N/A

Num. 6 Na2SO4 0,15 M

1,6853 1,4162 (8,38) N/A N/A N/A

Num. 7 Na2SO4 0,22 M

2,7917 2,5572 (14,46) N/A N/A N/A

Num. 8 Na2SO4 0,3 M

3,3989 3,8001 (19,46) N/A N/A N/A

Na2HPO4 0,1 M

N/A N/A N/A

Num. 9

3,9975 3,2614 (19,62) N/A N/A N/A

Num. 10 Na2SO4 0,15 M

7,7154 5,48 (35,66) N/A N/A N/A

Muestra

Tasa despues de 19 horas, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasa despues de 48 horas, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasa despues de 120 horas, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasa despues de 192 horas, nmol/min (Actividad, U/mg)

Num. 11 Na2SO4 0,22 M

5,1651 4,9371 (27,3) N/A N/A N/A

Num. 12 Na2SO4 0,3 M

8,4036 8,6568 (46,1) 2,64 3,24 (15,89) 0,06 0,23 0,1 0,02 (0,27) precip. N/A

Na2HPO4 0,4 M

Num. 13

11,995 14,978 (72,9) 8,08 9,74 9,97 (50,07) 1,15 1,05 1,41 (0,45) precip. N/A

Num. 14 Na2SO4 0,15 M

20,921 17,78 (104,6) 17,2 15,5 (88,38) 5,29 5,25 (14,2) precip. N/A

Num. 15 Na2SO4 0,22 M

20,066 22,769 (115,77) 14,5 19,0 15,26 11,72 (81,7) 7,48 9,75 (23,3) precip. N/A

Num. 16 Na2SO4 0,3 M

18,07 16,462 (93,32) 16,4 18,1 12,8 19,0 (90,0) 13,4 12,4 8,2 (30,5) precip. N/A

Na2HPO4 0,75 M

Num. 17 cABCI

30,481 27,388 28,128 (154,95) 22,3 28,7 30,9 26,1 (145,9) 20,3 7,0 9,1 13,8 (90,45) precip. 13,234 13,749 (73)

Los datos para las muestras de 19 horas se resumen en la Tabla 19 como el porcentaje de actividad restante.

Tabla 19. Actividad por ciento despues de 19 horas

Na2HPO4 Na2SO4

0,05 M 0,1 M 0,2 M 0,4 M 0,75 M

0

0,6 2,8 9,9 37,0 78,7

0,15 M

2,4 4,3 18,1 53,1 NA

0,22 M

3,8 7,4 13,9 58,8 NA

0,3 M

5,2 9,9 23,4 47,4 NA

Aunque el sulfato de sodio parece mejorar la estabilidad de cABCI, la proteccion del fosfato parece ser mas pronunciada. El tampon de fosfato de sodio 0,75 M se selecciono para las formulaciones de cABCI para su uso a 5 37quot;C. Este tampon no se selecciono para las formulaciones que podian ser almacenadas a temperaturas mas bajas debido a su propension a precipitar.

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra el efecto de la concentracion de la enzima sobre su estabilidad termica. Las muestras se suspendieron en fosfato 0,75 M de pH 7,4, acetato de Na 50 mM. Para determinar el intervalo de funcionamiento de

10 las concentraciones de cABCI, se midio la estabilidad termica de cABCI a diferentes concentraciones de enzima. Se observo que la cABCI a bajas concentraciones era tan estable como la cABCI a altas concentraciones (vease la Tabla 20). Tambien se encontro que la cABCI a altas concentraciones tiende a precipitar despues de una exposicion prolongada a 37quot;C. Para evitar este problema, por ejemplo, las concentraciones de cABCI pueden mantenerse por debajo de - 0,4 mg/ml como se muestra en la Tabla 20.

15 Tabla 20. Estabilidad a 37quot;C de las muestras de cABCI a diferentes concentraciones de enzima en tampon Fosfato de Na 0,75 M.

cABCI, mg/ml

Tasas de partida, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasas a 19 horas a 37quot;C, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasas a 48 horas a 37quot;C, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasas a 120 horas a 37quot;C, nmol/min (Actividad, U/mg) Tasas a 192 horas a 37quot;C, nmol/min (Actividad, U/mg)

0,75

NA 26,3; 16,1; 21,9 (115,9) 21,8; 19,6; 27,1 (101,5) precipita 2,7; 2,5 (14)

0,35

33,7; 35,6; 40,3 (197,66) 30,5; 27,3; 28,1 (155,0) 22,3; 28,7; 30,9, (145,9) precipita 13,2; 13,7 (73)

0,18

NA 24,3; 24,3; 26,0 (134,36) 29,1; 26,6; 21,1 (138,4) 14,6; 20,6; 24,4 (107,4) 14,7; 15,3 (81)

0,09

NA 20,7; 21,9; 22,2 (116,79) 23,7; 21,4; 20,3 (117,8) 20,4; 18,0 (103,8) 11,0; 12,9 (65)

La SDS-PAGE y el analisis de transferencia Western de la cABCI recombinante revelaron una fragmentacion parcial de la cABCI despues de un almacenamiento prolongado a 4quot;C. La observacion de que los productos de degradacion 20 son los mismos tanto para las proteinas recombinantes como nativas sugiere que la fragmentacion observada puede ser debida a una propiedad intrinseca de la cABCI.

El extremo amino terminal de los productos de degradacion se secuencio. Estos resultados revelaron que la mayoria de los productos de degradacion eran una mezcla de fragmentos de proteinas. Banda Num. 1: ATSNPAF (SEC ID NO: 3); Banda Num. 2: ATSNPAF principal (SEC ID NO: 4); NLNTSGD minoritaria (SEC ID NO: 5); Banda Num. 3: 25 ASNPAFD (SEC ID NO: 6) mas una mezcla de secuencias; Banda Num. 4: X1X2NX3VX4-X5 (SEQ ID NO: 7) mezcla en la que X1 puede ser A o N; X2 puede ser T o P; X3 puede ser T o E; X4 puede ser A o G y X5 puede ser F o E; Banda Num. 5: X1X2NX3X4X5 (SEQ ID NO: 8) mezcla en la que X1 puede ser A o N; X2 puede ser T o Y; X3 puede ser T o P; X4 puede ser A o E, X5 puede ser A o G; Banda Num. 6: MQVNERD principal (SEQ ID NO: 9); GPRGAGT

minoritaria (SEQ ID NO: 10); Banda Num. 7: no se identifico ninguna secuencia; Banda Num. 8: ATSNPAF (SEC ID NO: 11 ).

Ejemplo 12

Este ejemplo muestra los resultados de un metodo de purificacion para la purificacion de condroitinasa AC.

Las celulas que expresaban condroitinasa AC se extrajeron usando un sonicador de punta cuadrada a una velocidad maxima de aproximadamente 9. La sonicacion se realizo durante aproximadamente 30 segundos. Esto estuvo seguido inmediatamente por aproximadamente 10 segundos sin sonicacion. Estas etapas de encendido/apagado se realizaron para un total de aproximadamente 10 ciclos. Cada sedimento se sometio a sonicacion por separado y a continuacion se agruparon. Las extracciones se sacudieron durante la noche a 4quot;C.

Despues de la extraccion celular de la condroitinasa AC, la muestra sometida a sonicacion se analizo mediante SDS-PAGE para analizar la solubilidad de la proteina condroitinasa AC. La enzima se detecto principalmente en el sobrenadante, lo que implica que la proteina es soluble. La purificacion se continuo utilizando una columna de intercambio cationico para capturar la enzima.

Todo el extracto celular se cargo en una columna SP de 20 ml. El extracto se cargo en la columna a aproximadamente 0,5 ml/min. La columna SP se adjunto a AKTA Explorer para visualizar el lavado y los picos de elucion. La columna se lavo y se hizo eluir la condroitinasa AC. Las fracciones de la columna se analizaron despues en SDS-PAGE para verificar la pureza y el analisis del gel revelo que la condroitinasa AC eluia desde NaCl aproximadamente 245 mM a NaCl aproximadamente 370 mM. El analisis de SDS-PAGE revelo que las fracciones eluidas contenian condroitinasa AC relativamente pura y estas se reunieron dando como resultado un volumen total de 190 ml. Los 190 ml de las fracciones reunidas se concentraron utilizando una membrana MWCO de 10.000 (Millipore) hasta un volumen total de 105 ml con una absorbancia (A280) de 1,47. A continuacion, la muestra concentrada se purifico adicionalmente usando una columna de filtracion en gel.

Las muestras de la etapa de intercambio cationico se cargaron en una columna de filtracion de gel S200. Las muestras se eluyeron utilizando acetato de sodio 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,5. La primera ronda de purificacion a traves de la columna de filtracion en gel se analizo mediante SDS-PAGE para comprobar la pureza. Las fracciones que revelaron una condroitinasa AC relativamente pura se reunieron. Despues de la quinta ronda de purificacion a traves de la columna las muestras de las fracciones se verificaron nuevamente mediante SDS-PAGE para determinar la pureza. Las fracciones que revelaron una condroitinasa AC relativamente pura procedente de las siete rondas se reunieron hasta un volumen total de 250 ml con una absorcion (A280) de 0,431. Los 250 ml se concentraron hasta un volumen total de 83 ml con absorcion (A280) de 1,40.

La eliminacion de la endotoxina de la muestra de condroitinasa AC se logro mediante purificacion adicional de la muestra aislada de la etapa de filtracion en gel. Las muestras se centrifugaron a traves de una membrana de intercambio anionico Q (como se describe en otra parte de la presente memoria) y condroitinasa AC se recogio en un modo de flujo continuo. Este metodo se sometio a ensayo a pH aproximadamente 5,5. Se encontro que el acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, NaCl 100 mM era un tampon eficaz para la union de la endotoxina a las membranas Q, se espera que estas condiciones de pH y sal eliminen aproximadamente 75% de endotoxina. La absorcion resultante (A280) fue de 1,37. El producto final se analizo mediante SDS-PAGE para determinar la pureza. Los resultados revelaron una condroitinasa AC pura con un peso molecularde aproximadamente 50 a 75 kDa.

La condroitinasa AC purificada se sometio a dialisis en un tampon volatil de bicarbonato de amonio 0,1 M, pH 8,0 durante la noche y se dividio en alicuotas en pequenas muestras (aproximadamente 1,0 ml), se liofilizo y se almaceno a -80quot;C. La Figura 12 muestra la SDS-PAGE de la condroitinasa AC purificada final.

Aunque la presente invencion se ha descrito en detalle considerable con referencia a ciertas realizaciones preferidas de la misma, son posibles otras versiones.

LISTA DE SECUENCIAS

lt;110gt; ACORDA THERAPEUTICS, INC. CAGGIANO, Anthony O. GRUSKIN, Elliott A. SHEPTOVITSKY, Yelena

KASPERBAUER, Sarah 5

lt;120gt; Formulaciones de condroitinasa purificada y metodos para emplear la misma

lt;130gt; 127304.02702

10 lt;140gt; aun sin asignar

lt;141gt;

lt;150gt; 60/572.030

lt;151gt; 15

lt;150gt; 60/621.82

lt;151gt;

lt;160gt; 11 20

lt;170gt; PatentIn version 3.2

lt;210gt; 1

lt;213gt; Proteus vulgaris

lt;400gt; 1

lt;210gt; 2

lt;211gt; 841

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Proteus vulgaris

lt;400gt; 2

lt;210gt; 3

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;400gt; 3

lt;210gt; 4

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;400gt; 4

lt;210gt; 5

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;400gt; 5

lt;210gt; 6

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;400gt; 6

lt;210gt; 7

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1) .. (1)

lt;223gt; Xaa puede ser A o N

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (2) .. (2)

lt;223gt; Xaa puede ser T o P

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (4) .. (4)

lt;223gt; Xaa puede ser T o E

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (6)..(6)

lt;223gt; Xaa puede ser A o G

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (7)..(7)

lt;223gt; Xaa puede ser F o E

lt;400gt; 7

lt;210gt; 8

lt;211gt; 6

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (1) .. (1)

lt;223gt; Xaa puede ser A o N

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (2)..(2)

lt;223gt; Xaa puede ser T o Y

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (4)..(4)

lt;223gt; Xaa puede ser T o P

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (5)..(5)

lt;223gt; Xaa puede ser A o E

lt;220gt;

lt;221gt; caracteristica miscelanea

lt;222gt; (6) .. (6)

lt;223gt; Xaa puede ser A o G

lt;400gt; 8

lt;210gt; 9

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;400gt; 9

lt;210gt; 10

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;400gt; 10

lt;210gt; 11

lt;211gt; 7

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; fragmento de proteina

lt;400gt; 11

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una formulacion que comprende una condroitinasa en un tampon de fosfato de sodio a una concentracion de aproximadamente 750 a 1000 mM.

2. 2.

   La formulacion de la reivindicacion 1, en donde la concentracion de tampon de fosfato de sodio es de 750 a 1000 mM.

3. 3. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la condroitinasa esta purificada.

4. 4.

   La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la condroitinasa conserva al menos de 45 a 55% de la actividad aproximadamente a las 24 horas.

5. 5.

   La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la condroitinasa se selecciona del grupo que consiste en condroitinasa ABC I, condroitinasa ABC II, condroitinasa AC, condroitinasa B, Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4, y PH20.

6. 6.

   La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la condroitinasa es condroitinasa ABCI.

7. 7.

   La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la condroitinasa es condroitinasa AC.

8. 8.

   La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende adicionalmente acetato de sodio.

9. 9.

   La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dicha formulacion esta a un pH de 7,4.

10. 10.

    La formulacion de la reivindicacion 6, en donde la condroitinasa ABC I tiene una secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 2.

11. 11.

    La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la concentracion de tampon de fosfato de sodio es de aproximadamente 750 mM.

12. 12.

    La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la concentracion de tampon de fosfato de sodio es de aproximadamente 1.000 mM.