ES2412237T3 - Métodos para tratar lesiones por reperfusión - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende flagelina para su uso como medicamento para tratar un tejido de un mamíferofrente a los efectos de la reperfusión.

Description

Métodos para tratar lesiones por reperfusión
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de polipéptidos relacionados con flagelina para tratar tejidos frente a los efectos de la reperfusión.
Antecedentes de la invención
Los tejidos privados de sangre y oxígeno sufren necrosis isquémica o infarto con posibles daños orgánicos irreversibles. Una vez que se restablece el flujo de sangre y oxígeno en el órgano o el tejido (reperfusión), el órgano no vuelve inmediatamente al estado preisquémico normal. La reperfusión del flujo coronario es necesaria para reanimar el tejido u órgano isquémico o hipóxico. Una reperfusión en el momento adecuado facilita el salvamento de las células y disminuye la morbididad y la mortalidad. La reperfusión de una zona isquémica puede dar lugar a una disfunción paradójica, incluida una marcada disfunción de las células endoteliales, que tiene como resultado vasoconstricción, activación de plaquetas y leucocitos, incremento de la producción de oxidantes e incremento de la extravasación de fluidos y proteínas.
Durante las últimas dos décadas se ha sido testigo de varias intervenciones farmacológicas diseñadas para limitar la lesión por reperfusión. Por desgracia, el éxito de algunos agentes se ha limitado a modelos experimentales de isquemia y reperfusión. La falta de un beneficio clínico consistente puede estar relacionada con varios factores, incluidos un mal diseño de los ensayos clínicos, estudios farmacocinéticos/farmacodinámicos inadecuados y la complejidad del modelo humano in vivo.
Existe una necesidad en la técnica de distinguir estrategias terapéuticas para isquemia frente a reperfusión y es posible que sea necesaria una combinación de agentes para provocar el máximo beneficio clínico.
Sumario de la invención
En el presente documento se divulga un método de tratar un tejido de un mamífero frente a los efectos de la reperfusión, que puede comprender administrar a un mamífero que lo necesite una composición que comprende flagelina. La composición se puede administrar en combinación con un antioxidante, que se puede seleccionar del grupo que consiste en amifostina y vitamina E.
La reperfusión se puede deber a una lesión, que puede ser isquemia o hipoxia. La isquemia se puede seleccionar del grupo que consiste en taquicardia, infarto, hipotensión, embolia, tromboembolia (coágulos sanguíneos), drepanocitosis, presión localizada en las extremidades del cuerpo y tumores. La hipoxia se puede seleccionar del grupo que consiste en hipoxia hipoxémica (intoxicación por monóxido de carbono; apnea del sueño, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, parada respiratoria; derivaciones), hipoxia anémica (contenido bajo en O2), hipoxia hipoxémica e hipoxia histotóxica. La presión localizada puede deberse a un torniquete.
La composición puede administrarse antes de, junto con o después de la entrada de oxígeno El tejido se puede seleccionar del grupo que consiste en el tubo digestivo, los pulmones, los riñones, el hígado, el aparato cardiovascular, el endotelio de los vasos sanguíneos, el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico, los músculos, el hueso y los folículos pilosos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 demuestra el nivel de creatinina en suero de ratones más de 5 días después de la administración intravenosa de flagelina a concentraciones de 0,01 μg, 0,5 μg, 1,0 μg o bien 5,0 μg/cuerpo.
La figura 2 demuestra el efecto de la flagelina administrada a ratones antes de la imposición de isquemia renal y la medición de la supervivencia y la creatinina tras la reperfusión de los riñones isquémicos. El panel A muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados previamente con flagelina a concentraciones de 0,01 μg, 0,5 μg, 1,0 μg o 5,0 μg/cuerpo o PBS como control. El panel B muestra el nivel de creatinina en el mismo grupo de ratones previamente tratados y control.
La figura 3 demuestra la histopatología de las células renales isquémicas 24 horas después de la reperfusión previamente tratadas con PBS o con flagelina a concentraciones de 0,01 μg, 0,5 μg, 1,0 μg o 5,0 μg/cuerpo. La columna de Simulado indica células renales aisladas de ratones a los que no se indujo isquemia renal.
La figura 4 demuestra la histopatología de células renales 7 días después de la reperfusión. En el primer panel, el
porta de histopatología muestra células renales aisladas de ratón previamente tratado con PBS antes de la isquemia renal y seguida de reperfusión de los riñones isquémicos. En el primer panel, el porta de histopatología muestra células renales aisladas de ratón previamente tratado con PBS antes de la isquemia renal y seguida de reperfusión de los riñones isquémicos. En el segundo panel, el porta de histopatología muestra células renales aisladas de ratón previamente tratado con flagelina a una concentración de 0,5 μg /cuerpo pero a los que no se ha inducido isquemia renal. En el tercer panel se demuestra un porta de histopatología que muestra células renales aisladas de un ratón previamente tratado con flagelina a una concentración de 0,5 μg /cuerpo y al que se ha inducido isquemia renal, y seguido de reperfusión de los riñones isquémicos.
La figura 5 demuestra la evaluación de la infiltración de leucocitos 9 horas y 24 horas después de la reperfusión en células renales isquémicas aisladas de ratones previamente tratados con PBS o con flagelina a 0,5 μg /cuerpo. En la figura 5a se muestran células de tejido renal teñidas inmunohistoquímicamente para determinar los niveles de infiltración con neutrófilos 9 horas y 24 horas después de la reperfusión en células renales tratadas isquémicas y no isquémicas de ratones previamente tratadas con PBS o flagelina a 0,5 μg /cuerpo. La figura 5b es el número de neutrófilos, macrófagos, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ infiltrados en células de tejido renal aisladas de ratones previamente tratados con PBS o flagelina a una concentración de 0,5 μg /cuerpo. Figura 5c
La figura 6 demuestra un papel crítico de la flagelina para evitar que las quimiocinas CXCL1/KC y CXCL2/KC dirijan la infiltración de leucocitos a tejidos renales isquémicos. La figura 6b demuestra niveles de ARNm de las proteínas de fase aguda IL-1b e IL-6 pero no del TNFa también disminuidos en riñones isquémicos a las 9 horas de la reperfusión en animales previamente acondicionados con flagelina.
La figura 7 demuestra la supervivencia y los niveles de creatinina en grupos de ratones C57BL/6 sometidos a 45 minutos de oclusión bilateral de pedículo renal y a los que se había administrado 0,5 μg de flagelina a varios tiempos tras la retirada de las pinzas renales.
La figura 8 demuestra que la administración de 0,5 μg de flagelina en los 30 minutos posteriores a la reperfusión de riñones isquémicos de ratones C57BL/6 silvestres reconstituidos con médula ósea silvestre disminuía los niveles de ARNm de CXCL1 y CXCL2. En receptores MyD88-/- reconstituidos con médula ósea MyD88-/- o silvestre, se indujo poco o nada de ARNm de CXCL1 y CXCL2 durante la reperfusión de riñones isquémicos y la administración de flagelina durante la reperfusión de estos riñones no disminuyó los niveles de ARNm de estas quimiocinas. Por el contrario, los receptores silvestres de médula ósea de donantes MyD88-/- expresaron niveles elevados de ARNm de CXCL1 y CXCL2 y estos niveles se redujeron mediante la administración de flagelina durante la reperfusión de los riñones isquémicos.
La figura 9 demuestra secciones renales de ratones C57BL/6 y BALB/c silvestres teñidos con el anticuerpo anti-TLR5. La figura 9b demuestra que los niveles de expresión del ARNm de TLR5 eran bajos en los riñones antes de la inducción de isquemia renal/reperfusión pero aumentaban rápidamente durante la reperfusión de riñones isquémicos.
La figura 10 muestra la estructura del dominio de la flagelina bacteriana. El trazo de la estructura de Ca, la distribución del núcleo hidrófobo y la información estructural de F41. Hay cuatro núcleos hidrófobos distintos que definen los dominios D1, D2a, D2b y D3. Todos los átomos de la cadena lateral hidrófoba se muestran con la estructura de Ca. Los átomos de la cadena lateral están codificados por colores: Ala, amarillo; Leu, Ile o Val, naranja; Phe y Tyr, morado (átomos de carbono) y rojo (átomos de oxígeno). c, Posición y región de varias características estructurales en la secuencia de aminoácidos de la flagelina. Se muestran, de arriba a abajo: el fragmento F41 en azul; tres pliegues de b-folio en marrón; la distribución de la estructura secundaria con una alfahélice en amarillo, la estructura beta en verde y los giros beta en morado; la marca cada 50 residuos en azul; los dominios D0, D1, D2 y D3; la región de contacto de la subunidad axial dentro del protoelemento en azul cian; la secuencia de aminoácidos bien conservada en rojo y la región variable en violeta; las mutaciones puntuales en F41 que producen los elementos de diferentes superhélices. Las letras en la parte inferior indican la morfología de los elementos mutantes: L (D107E, R124A, R124S, G426A), lineal de tipo L; R (A449V), lineal de tipo R; C (D313Y, A414V, A427V, N433D), curly33.
La figura 11 muestra un esquema de los dominios de flagelina de Salmonella, sus fragmentos y su interacción con TLR5. Las barras oscuras indican regiones del gen de la flagelina usadas para construir fragmentos que comprenden A, B, C, A' y B'.
La figura 12 representa derivados de flagelina. La estructura del dominio y los límites aproximados (coordenadas de aminoácidos) de derivados de flagelina seleccionados (enumerados a la derecha). La flagelina FliC de Salmonella dublin está codificada en 505 aminoácidos (aa).
La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos para las siguientes variantes de flagelina: AA' (SEQ ID Nº 7-8). AB' (SEQ ID Nº: 9-10), BA' (SEQ ID Nº 11-12), BB' (SEQ ID Nº 13-14), CA' (SEQ ID Nº 15-16), CB' (SEQ ID Nº 17-18), A (SEQ ID Nº 19-20), B (SEQ ID Nº 21-22), C (SEQ ID Nº 23-24), GST-A' (SEQ ID Nº 25-26),
GST-B' (SEQ ID Nº 27-28), AA'n1-170 (SEQ ID Nº 29-30), AA'n1-163 (SEQ ID Nº 33-34), AA'n54-170 (SEQ ID Nº 31-32), AA'n54-163 (SEQ ID Nº 335-36), AB'n1-170 (SEQ ID Nº 37-38), AB'n1-163 (SEQ ID Nº 39-40), AA'n1-129 (SEQ ID Nº 41-42), AA'n54-129 (SEQ ID Nº 43-44), AB'n1-129 (SEQ ID Nº 45-46), AB'n54-129 (SEQ ID Nº 47-48), AA'n1-100 (SEQ ID Nº 49-50), AB'n1-100 (SEQ ID Nº 51-52), AA'n1-70 (SEQ ID Nº 53-54) y AB'n1-70 (SEQ ID Nº 55-56). La secuencia líder pRSETb se muestra en cursiva (la líder incluye Met, que también es el aminoácido 1 de FliC). El dominio constante en N-terminal está subrayado. La secuencia de aminoácidos enlazadora está en negrita. El dominio constante en C-terminal está subrayado. GST, si está presente, está subrayado.
La figura 14A muestra la histología del músculo de la pata trasera de los ratones 14 días después de la reperfusión tras 3 horas de isquemia caliente usando una tinción de hematoxilina/eosina, en la que se había administrado al ratón 0,5 μg de CBLB502 en los 15 minutos posteriores a la reperfusión. La figura 14B muestra la histología del músculo de la pata trasera de los ratones 14 días después de la reperfusión tras 3 horas de isquemia caliente usando una tinción de hematoxilina/eosina, en la que se había administrado al ratón vehículo (PBS) en los 15 minutos posteriores a la reperfusión. La figura 14C muestra la proporción húmedo/seco de edema tisular en la extremidad de los ratones a los que se ha administrado CBLB502 o PBS en los 15 minutos posteriores a la reperfusión tras 3 horas de isquemia. La proporción del edema también se midió en la extremidad de los ratones a los que se ha administrado CBLB501 o PBS, pero dejó 3 horas de isquemia. La figura 15 muestra la proporción húmedo/seco de fugas vasculares usando pigmento azul por gramo de peso de la extremidad de los ratones a los que se ha administrado CBLB502 o PBS en los 15 minutos posteriores a la reperfusión tras 3 horas de isquemia. La proporción de las fugas vasculares también se midió en la extremidad de los ratones a los que se ha administrado CBLB501 o PBS, pero dejó 3 horas de isquemia.
La figura 15 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de los extremos amino (figura 15A) y carboxi (figura 15B) conservados de 21 especies de bacterias. Los 13 aminoácidos conservados importantes para la actividad de TLR5 se muestran en sombreado. Las secuencias de aminoácidos se identifican por sus números de acceso de TrEMBL (primera letra = Q) o Swiss-Prot (primera letra = P).
Descripción detallada
Los inventores han realizado el sorprendente descubrimiento de que la flagelina protege frente a los efectos de la reperfusión. La ausencia o reducción de oxígeno y nutrientes de la sangre crea una condición en la que el restablecimiento de la circulación da como resultado inflamación y daño oxidativo a través de la inducción de estrés oxidativo en lugar del restablecimiento de la función normal. El flujo sanguíneo restablecido reintroduce oxígeno en las células que daña las proteínas celulares, el ADN y la membrana plasmática. Los daños producidos en la membrana celular pueden, a su vez, producir la liberación de más radicales libres. Dichas especies reactivas también participan en la señalización rédox para inducir apoptosis de las células del tejido isquémico. Además, la respuesta inflamatoria daña también el tejido. Los glóbulos blancos transportados a la zona por la sangre recién devuelta liberan una serie de factores inflamatorios, como interleucinas, así como radicales libres en respuesta al daño tisular. Los leucocitos también pueden acumularse en capilares pequeños, obstruyéndolos y conduciendo a más isquemia. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la flagelina puede proporcionar protección frente a los efectos de la reperfusión reduciendo el estrés oxidativo e inflamatorio en el tejido y, de este modo, evitando la apoptosis y permitiendo una recuperación más rápida del tejido a un estado normal. Esta naturaleza protectora de la flagelina puede usarse al inicio de la reperfusión o usarse para prevenir más daños producidos por la reperfusión. La invención que se describe más adelante se refiere, en parte, a la administración de flagelina para tratar un tejido de mamífero frente a los efectos de la reperfusión. 1. Definiciones.
La terminología usada en el presente documento es para el propósito de describir solo realizaciones particulares y no se desea que sea limitante. Como se usa en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “uno”, “una” y “el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Para citar los intervalos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio incluido con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además del 6 y el 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.
“Administrar” puede significar una dosificación de un agente que induce actividad NF-κB, que quiere decir una o varias dosis del agente.
“Análogo” puede significar, en el contexto de un péptido o polipéptido, un péptido o polipéptido que comprende uno o más aminoácidos no comunes u otras variaciones estructurales con respecto al conjunto convencional de aminoácidos.
“Anticuerpo” puede significar un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, o fragmentos, fragmentos o derivados de los mismos, incluidos Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo
monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo purificado por afinidad o mezclas de los mismos, que exhibe suficiente especificidad de unión a un epítopo deseado o a una secuencia derivada del mismo. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede derivatizarse mediante la unión de uno o más restos químicos, peptídicos o polipeptídicos conocidos en la técnica. El anticuerpo puede conjugarse con un resto químico.
“Apoptosis” puede significar una forma de muerte celular que incluye la contracción progresiva del volumen celular con la conservación de la integridad de los orgánulos citoplásmicos; condensación de la cromatina (es decir, condensación nuclear), como se puede ver mediante microscopia óptica o electrónica; y/o escisión del ADN en fragmentos de tamaño de nucleosoma, determinado mediante ensayos de sedimentación centrifugada. La muerte celular se produce cuando se pierde la integridad de la membrana de la célula (p. ej., formación de vesículas en la membrana) de modo que las células fagocíticas engullen los fragmentos de la célula intacta ("cuerpos apoptóticos").
Un “péptido” o “polipéptido” puede significar una secuencia de aminoácidos unidos y puede ser natural, sintética o una modificación o combinación de natural y sintética.
“Tratar”, “tratamiento” o “para tratar” pueden significar, cada uno, aliviar, suprimir, reprimir, eliminar, prevenir o ralentizar la aparición de síntomas, signos clínicos o patología subyacente de una afección o trastorno de un modo temporal o permanente. Prevenir la enfermedad implica administrar a un animal una composición de la presente invención antes del inicio de la enfermedad. Suprimir la enfermedad implica administrar a un animal una composición de la presente invención después de la inducción de la enfermedad pero antes de su presentación clínica. Reprimir la enfermedad implica administrar a un animal una composición de la presente invención después de la presentación clínica de la enfermedad.
TRATAMIENTO DE LOS EFECTOS DE LA REPERFUSIÓN
En el presente documento se divulga un método de tratar los efectos de la reperfusión administrando a un mamífero que lo necesite una composición que comprende flagelina. La reperfusión puede deberse a una lesión.
La reperfusión puede dañar un componente del cuerpo cuando la irrigación sanguínea vuelve al componente corporal tras la lesión. Los efectos de la reperfusión pueden ser más dañinos para el componente corporal que la propia lesión. Existen varios mecanismos y mediadores de la reperfusión, entre ellos los radicales libres de oxígeno, la sobrecarga de calcio intracelular y la disfunción endotelial. Cuando se introducen cantidades excesivas de especies reactivas de oxígeno en un componente corporal previamente dañado, sufren una reducción secuencial que conduce a la formación de radicales libres de oxígeno. Los radicales oxidantes potentes, como el anión superóxido, el radical hidroxilo y el peroxinitrito se pueden producir en los primeros minutos de restablecimiento del flujo en el componente corporal y pueden desempeñar un papel crucial en el desarrollo de la lesión por reperfusión. Los radicales libres de oxígeno se pueden generar también a partir de fuentes distintas a la reducción del oxígeno molecular. Estas fuentes incluyen enzimas, como la xantina oxidasa, la citocromo oxidasa y la ciclooxigenasa, y la oxidación de las catecolaminas.
La reperfusión también es un potente estímulo de la activación y acumulación de neutrófilos, que a su vez sirven como potentes estímulos para la producción de especies reactivas de oxígeno. Específicamente, los principales productos del estallido respiratorio de los neutrófilos son potentes agentes oxidantes, incluidos peróxido de hidrógeno, radicales de oxígeno libres e hipoclorito. Los neutrófilos son el tipo de fagocito más abundante, que normalmente representa del 50 al 60 % de los leucocitos totales en circulación y suelen ser las primeras células en llegar al lugar en el que se ha producido el daño del componente corporal. Los radicales libres derivados de oxígeno producen daños reaccionando con ácidos grasos poliinsaturados, lo que tiene como resultado la formación de peróxidos e hidroxiperóxidos de lípidos que dañan el componente corporal y alteran la función de los sistemas enzimáticos unidos a la membrana. Los radicales libres estimulan la liberación endotelial del factor de activación de plaquetas y de quimiocinas, como el factor activador de neutrófilos, el ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C) y el ligando 1 de quimiocinas (motivo C-XC) que atrae a más neutrófilos y amplifica la producción de radicales oxidantes y el grado de la lesión por reperfusión. Las especies reactivas de oxígeno también inactivan al óxido nítrico, lo que exagera la lesión endotelial y la disfunción de las células del tejido. Además de un incremento de la producción, también se produce una deficiencia relativa de las enzimas antioxidantes endógenas, lo que a su vez exagera la disfunción cardíaca mediada por radicales libres.
La reperfusión puede además dar como resultado una marcada disfunción de las células endoteliales. La disfunción endotelial facilita la expresión de un fenotipo protrombótico caracterizado por activación de plaquetas y neutrófilos, importantes mediadores de la reperfusión. Una vez que los neutrófilos entran en contacto con el endotelio alterado, se activan y, en una serie de etapas bien definidas (rodadura, adherencia firme y transmigración), migran hacia zonas de tejido dañado a través de las uniones de las células endoteliales como parte de la respuesta inmunitaria innata.
Los cambios en la homeostasis del calcio intracelular desempeñan un importante papel en el desarrollo de la reperfusión. La reperfusión puede estar asociada con un incremento del calcio intracelular; este efecto puede estar relacionado con un incremento de la entrada del calcio sarcolémico a través de canales de calcio de tipo L o puede
ser secundario a las alteraciones del ciclo del calcio en el retículo sarcoplásmico. Además de la sobrecarga de calcio intracelular, en la reperfusión participan alteraciones de la sensibilidad de los miofilamentos al calcio. Se ha sugerido que la activación de las proteasas dependientes de calcio (calpaína I) con la resultante proteólisis de las miofibrillas destaca la lesión por reperfusión, como la proteólisis de troponina.
La reperfusión de las células del tejido sometidas a una lesión produce alteración del metabolismo celular, lo que a su vez puede contribuir a un retraso de la recuperación funcional. Por ejemplo, una lesión puede inducir el metabolismo anaeróbico en la célula, con una producción neta de lactato. La liberación de lactato persiste durante la reperfusión, lo que sugiere un retraso de la recuperación del metabolismo aeróbico normal. Asimismo, la actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH) mitocondrial puede estar inhibida hasta en un 40 % tras una lesión y puede permanecer deprimida hasta 30 minutos después de la reperfusión.
Cada uno de estos acontecimientos durante la reperfusión puede conducir a estrés de las células del tejido a y la muerte celular programada (apoptosis) y la necrosis de las células del tejido. La apoptosis normalmente realiza la función de “limpiar” los tejidos de células heridas y dañadas genéticamente, mientras que las citocinas sirven para movilizar el sistema de defensa del organismo contra los patógenos. No obstante, en condiciones de lesión grave ambos mecanismos de respuesta al estrés pueden, por sí solos, actuar como causas de muerte.
a. Flagelina
La flagelina puede ser un polipéptido relacionado con la flagelina. La flagelina puede proceder de cualquier fuente, incluyendo una variedad de especies de bacterias grampositivas y gramnegativas. La flagelina puede tener la secuencia de aminoácidos de una de las 23 flagelinas de especies bacterianas que se representan en la figura 7 de la publicación de patente de EE. UU. n. º 2003/0044429. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de la flagelina indicados en la figura 7 de la publicación de patente de EE. UU. n. º 2003/0044429 están disponibles para el público en fuentes entre las que se incluyen la base de datos Genbank del NCBI.
La flagelina puede ser el principal componente de los flagelos bacterianos. La flagelina puede estar compuesta por tres dominios (figura 10). El dominio 1 (D1) y el dominio 2 (D1) pueden ser discontinuos y pueden formarse cuando los residuos del extremo amino y el extremo carboxi se yuxtaponen mediante la formación de una estructura en horquilla. Los extremos amino y carboxi que comprenden los dominios D1 y D2 puede estar muy conservados, mientras que el dominio hipervariable central (D3) puede ser altamente variable. Estudios con una proteína recombinante que contienen D1 y D2 en amino y D1 y D2 en carboxilo separados por una bisagra de Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2) indican que D1 y D2 pueden ser bioactivos cuando se acoplan con un elemento ECH. Esta quimera, pero no la bisagra sola, puede inducir la degradación de IkBa, la activación de NF-kB y la producción de NO y de IL-8 en dos líneas de células epiteliales intestinales. El dominio D3 no conservado puede estar en la superficie del filamento flagelar y puede contener los principales epítopos antigénicos. La potente actividad proinflamatoria de la flagelina puede residir en las regiones altamente conservadas N y CD1 y D2.
La flagelina puede inducir actividad de NF-kB uniéndose al receptor tipo Toll 5 (TLR5). La familia de TLR puede estar compuesta por al menos 10 miembros y es esencial en la defensa inmunitaria innata contra los patógenos. El sistema inmunitario innato puede reconocer patrones moleculares asociados con los patógenos (PAMP) que están conservados en los patógenos microbianos. El TLR puede reconocer una estructura conservada que es particular de la flagelina bacteriana. La estructura conservada puede estar compuesta por un gran grupo de residuos que son algo permisivos con la variación del contenido de aminoácidos. Smith et al., Nat Immunol. 4:1247-53 (2003) han identificado 13 aminoácidos conservados en la flagelina que son parte de la estructura conservada reconocida por el TLR5. Los 13 aminoácidos conservados de la flagelina que pueden ser importantes para la actividad de TLR5 se muestran en la figura 11.
La flagelina puede proceder de una especie de Salmonella, un ejemplo representativo de la cual es S. dublin (codificada por el Número de acceso de GenBank M84972) (SEQ ID Nº 1). El polipéptido relacionado con la flagelina puede ser un fragmento, variante, análogo, homólogo o derivado de la SEQ ID Nº 1, o una combinación de los mismos, que se une a TLR5 e induce actividad mediada por TLR5, tal como la activación de la actividad de NF-kB. Un fragmento, variante, análogo, homólogo o derivado de la flagelina se puede obtener mediante el diseño racional basado en la estructura del dominio de la flagelina y en la estructura conservada reconocida por el TLR5.
La flagelina puede comprender al menos 10, 11, 12 o 13 de los 13 aminoácidos conservados mostrados en la figura 11 (posiciones 89, 90, 91, 95, 98, 101, 115, 422, 423, 426, 431, 436 y 452). La flagelina puede tener al menos un 3099 % de identidad con los aminoácidos 1 174 y 418 505 de SEQ ID Nº 1. La figura 26 enumera el porcentaje de identidad del extremo amino y el extremo carboxi de la flagelina con actividad conocida estimuladora de TLR-5, en comparación con la SEQ ID Nº 1. 1.
La flagelina puede ser un polipéptido de flagelina de cualquier especie bacteriana grampositiva o gramnegativa que incluye, entre otros, los polipéptidos de flagelina divulgados en la publicación de patente de EE. UU. 2003/000044429, y los péptidos de flagelina correspondientes a los números de acceso enumerados en los resultados del BLAST mostrados en la figura 25 de la publicación de patente de EE. UU. 2003/000044429, o
variantes de los mismos.
La flagelina puede estimular la actividad de TLR5. Se han construido numerosos mutantes por deleción de la flagelina que conservan al menos alguna actividad estimulante de TLR5. La flagelina puede ser un mutante por deleción divulgado en los Ejemplos del presente documento y puede comprender una secuencia traducida del número de acceso de GenBank D13689 sin los aminoácidos 185-306 o 44-492 o del número de acceso de GenBank M84973 sin los aminoácidos 179-415, o una variante de los mismos.
La flagelina puede comprender transposones insertados y cambios en el dominio D3 variable. El dominio D3 puede sustituirse en parte, o completamente, por un polipéptido bisagra o enlazador que permite que los dominios D1 y D2 se plieguen de forma adecuada de un modo tal que la variante estimule la actividad de TLR5. Los elementos bisagra variantes pueden encontrarse en la proteína MukB de E.coli y pueden tener una secuencia como la indicada en las SEQSEQ ID Nº 3 y 4, o una variante de las mismas.
Se pueden usar otros agentes para dirigirlos a los receptores TLR5. Estos agentes pueden ser agonistas de TLR5 y estimular la actividad de TLR5.
b. Lesión
Los efectos de la reperfusión pueden deberse a una lesión en el componente corporal. La lesión se puede deber a isquemia, hipoxia, un infarto o una embolia. El tratamiento de la lesión puede conducir a reperfusión y el daño adicional en el componente corporal.
(1)
Isquemia
La isquemia puede ser una falta absoluta o relativa de irrigación sanguínea en un componente corporal. La falta relativa puede ser una discordancia, aunque pequeña, entre la sangre suministrada (liberación de oxígeno) a un componente corporal y la sangre que necesita un componente corporal para su adecuada oxigenación. La isquemia puede ser también un flujo adecuado de sangre a una parte del cuerpo debido a una constricción o bloqueo de los vasos sanguíneos que lo irrigan y puede afectar a cualquier componente corporal del organismo. Una insuficiente irrigación sanguínea hace que los componentes corporales estén hipóxicos o, si no se le suministra nada de oxígeno, anóxicos. Esto puede causar necrosis. El mecanismo de la isquemia puede variar considerablemente. Por ejemplo, la isquemia en cualquier componente corporal puede deberse a taquicardia (latidos anormalmente rápidos), ateroesclerosis (placa cargada de lípidos que obstruye la luz de las arterias), hipotensión (baja presión arterial en el choque séptico, insuficiencia cardíaca), tromboembolias (coágulos sanguíneos), compresión externa de los vasos sanguíneos (tumor), embolias (cuerpos extraños en la circulación, por ejemplo, embolia del líquido amniótico), drepanocitosis (hemoglobina de forma anormal), infartos, fuerzas g inducidas que restringen el flujo sanguíneo y dirigen a la fuerza a la sangre a las extremidades del cuerpo, frío extremo localizado por congelación, hielo, tratamiento de compresión con frío inadecuado y cualquier otra fuerza que restrinja el flujo de sangre a las extremidades, como un torniquete. Puede ser necesario aplicar fuerzas para restringir el flujo de sangre a las extremidades debido a laceraciones graves, incisiones, punciones como cuchilladas, lesiones por aplastamiento debidas a traumatismos contusos, y traumatismos balísticos debidos a heridas por disparo de bala o metralla. La isquemia puede ser una característica de las cardiopatías, colitis isquémica, ataques isquémicos transitorios, accidentes cerebrovasculares, lesión renal aguda, rotura de malformaciones arteriovenosas y enfermedad oclusiva de las arterias periféricas.
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Hipoxia
La hipoxia es una privación del suministro adecuado de oxígeno. La hipoxia puede ser una afección patológica en la que el cuerpo en su totalidad (hipoxia generalizada) o una región del cuerpo (hipoxia tisular) quedan privados del suministro adecuado de oxígeno. Una variación de los niveles de oxígeno arterial puede deberse a una discordancia entre el suministro y la demanda de oxígeno por parte de los componentes corporales. Una privación completa del suministro de oxígeno se denomina anoxia. La hipoxia puede ser hipoxia hipoxémica, hipoxia anémica, hipoxia hipoxémica, hipoxia histotóxica, hipoxia citotóxica e hipoxia isquémica.
La hipoxia hipoxémica puede ser un suministro inadecuado de oxígeno al cuerpo en su totalidad a causa de una presión parcial de oxígeno baja en la sangre arterial. La hipoxia hipoxémica puede deberse a una presión parcial de oxígeno atmosférico baja, tal como ocurre a grande altitudes, a sustitución de oxígeno en la mezcla para respiración de una atmósfera modificada como en el alcantarillado, la sustitución del oxígeno de forma intencionada como ocurre en el uso recreativo de óxido nitroso, una disminución de la saturación de oxígeno de la sangre debido a apnea del sueño, o hipoapnea, ventilación pulmonar inadecuada como en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o parada respiratoria, derivaciones anatómicas o mecánicas en la circulación pulmonar o una derivación de derecha a izquierda en el corazón y los pulmones. Las derivaciones pueden producir colapso de los alveolos que todavía están perfundidos o un bloqueo de la ventilación a una zona de los pulmones. Las derivaciones pueden hacer que sangre que estaba destinada al sistema pulmonar no se ventile y evitar el intercambio gaseoso porque los vasos de Tebesio se vacían en el ventrículo izquierdo y la circulación bronquial, que suministra oxígeno a los
bronquios.
En la hipoxia anémica, el contenido total de oxígeno se reduce pero la presión arterial de oxígeno es normal. La hipoxia hipoxémica puede ser cuando la sangre no libera oxígeno en los componentes corporales objetivo. La hipoxia hipoxémica puede deberse a intoxicación por monóxido de carbono, que inhibe la capacidad de la hemoglobina para liberar el oxígeno unido a ella, o metahemoglobinemia, una hemoglobina anormal que se acumula en la sangre.
La hipoxia histotóxica puede deberse a la incapacidad de usar de forma eficaz el oxígeno debido a la inactivación de las enzimas de la fosforilación oxidativa.
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Infarto
El infarto es un tipo de afección patológica que puede producir isquemia. El infarto puede ser un área macroscópica de tejido necrótico causado por la pérdida de un suministro inadecuado de sangre debido a una oclusión. El infarto puede ser un infarto blanco compuesto por plaquetas y que causa necrosis en tejidos orgánicos, como el corazón, el bazo y los riñones. El infarto puede ser un infarto rojo compuesto por glóbulos rojos y hebras de fibrina en los tejidos orgánicos de los pulmones. La enfermedad asociada con infarto puede incluir infarto de miocardio, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular (ictus), insuficiencia renal aguda, enfermedad oclusiva de las arterias periféricas (siendo un ejemplo la gangrena), síndrome de antifosfolípidos, sepsis, artritis de células gigantes, hernia y vólvulos.
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Embolia
La embolia es un tipo de condición patológica que puede producir isquemia. La embolia puede producirse por un objeto que migra de una parte del cuerpo y causa una oclusión o bloqueo de un vaso sanguíneo en otra parte del cuerpo. Una embolia puede ser tromboembolia, embolia grasa, embolia aérea, embolia séptica, embolia tisular, embolia por cuerpo extraño, embolia de líquido amniótico. La tromboembolia puede ser un coágulo que se desprende completa o parcialmente del lugar de la trombosis. La embolia grasa puede ser tejidos grasos endógenos que se escapan a la circulación sanguínea. La fractura de los huesos es un ejemplo de fuga de tejido graso a los vasos y arterias rotas. La embolia aérea puede ser una rotura de los alveolos y el aire inhalado pasa a los vasos sanguíneos. La punción de la vena subclavia o el tratamiento intravenoso son ejemplos de fuga de aire a los vasos sanguíneos. Una embolia gaseosa pueden ser gases, como nitrógeno y helio, que son insolubles y forman pequeñas burbujas en la sangre.
c. Componente corporal
La presente invención se refiere al tratamiento de un componente corporal en un mamífero. El componente corporal puede ser un órgano, un tejido o una célula. El componente corporal puede ser del abdomen, la fosa cotiloidea, el tejido adiposo, la corteza suprarrenal, la glándula suprarrenal, la médula suprarrenal, los macrófagos alveolares, el amnios, la aorta, arterias, ascitis, líquido ascítico, ganglios linfáticos de la axila, vejiga urinaria, sangre, huesos, médula ósea, intestino, cerebro, mama, bronquios, cartílago, tronco caudal inferior, cerebelo, cuello uterino, vellosidades coriónicas, colon, conjuntiva, tejido conjuntivo, córnea, dermis, ganglio de la raíz posterior, duodeno, mucosa lingual displásica, óvulos, embrión, endocrino, endometrio, endotelio, epidermis, epitelio, eritropoyético, ojos, fibroblastos, aletas, feto, pie, prepucio, ganglio de Gasser, estroma gingival, gónadas, ganglios linfáticos de la ingle, corazón, húmero, íleon, intestino, ileocecal, íleon, islotes de Langerhans, riñón, larvas, larvario, laringe, hígado, pulmón, pulmón (bronquioalveolar), linfa, ganglios linfáticos, tejido linfático, linfoide, órganos linfoides, mamario, ganglios alveolares mamarios, glándula mamaria, mesonefros, mesotelio, labios menores en desarrollo, boca, músculo, nasal, tabique nasal, sistema nervioso, neuronal, unión gastroesofágica, esófago, oral, ovario, mesénquima palatal, páncreas, ovárico con papiloma, pene, sangre periférica, peritoneo, faringe, hipófisis, placenta, derrame pleural, líquido pleural, próstata, ovárico en desarrollo, recto, retina, ganglios linfáticos axiales derechos, conducto salival, sialaden, músculo esquelético, piel, intestino delgado, intestino grueso, tejidos blandos, bazo, esternón, estómago, cola, testículo, testículos, muslo, timo, tiroides, glándulas tiroideas, lengua, amígdalas, tráquea, tronco, cornete nasal, cordón umbilical, ombligo, útero, vagina, vísceras, vulva, tubo digestivo, pulmones, riñones, hígado, aparato cardiovascular, endotelio de los vasos sanguíneos, sistema nervioso central y periférico, músculos, huesos, folículos pilosos y saco vitelino.
COMPOSICIÓN
La presente invención también se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de flagelina. La composición puede ser una composición farmacéutica que se puede producir usando métodos bien conocidos en la técnica. La composición puede también comprender un coagente. Como se ha descrito anteriormente, la composición se puede administrar a un mamífero para tratar los efectos de la reperfusión.
a. Administración
La administración de las composiciones usando el método descrito en el presente documento puede ser administración oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosa, tópica, mediante inhalación, bucal o combinaciones de las mismas. La administración parenteral incluye, entre otras, administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal e intraarticular. Para uso veterinario, la composición se puede administrar como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración que es más adecuada para un animal concreto. Las composiciones se pueden administrar a un paciente humano, perro, gato, animal grande o ave.
La composición puede administrarse de forma simultánea o metronómicamente con otros tratamientos. El término “simultáneo” o “de forma simultánea” como se usa en el presente documento, significa que la composición y otro tratamiento se pueden administrar separados 48 horas, preferentemente 24 horas, más preferentemente 12 horas, todavía más preferentemente 6 horas y lo más preferentemente 3 horas o menos uno de otro. El término “metronómicamente”, como se usa en el presente documento, significa la administración de la composición en momentos diferentes uno de otro y a una determinada frecuencia relativa para repetir la administración.
La composición se puede administrar en cualquier momento antes de la reperfusión, incluyendo 120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102 h, 100 h, 98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84 h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h, 60 h, 58 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50h, 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 55 min., 50 min., 45 min., 40 min., 35 min., 30 min., 25. min., 20 min., 15 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min., 6 min., 5 min., 4 min., 3 min, 2 min, y 1 min antes de la reperfusión. La composición se puede administrar en cualquier momento antes de la lesión, incluyendo 120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102 h, 100 h, 98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84 h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h, 60 h, 58 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50h, 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 55 min., 50 min., 45 min., 40 min., 35 min., 30 min., 25. min., 20 min., 15 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min., 6 min., 5 min., 4 min., 3 min, 2 min, y 1 min antes de la lesión.
La composición se puede administrar en cualquier momento después de la reperfusión, incluyendo aproximadamente 1min, 2 min., 3 min., 4 min., 5 min., 6 min., 7 min., 8 min., 9 min., 10 min., 15 min., 20 min., 25 min., 30 min., 35 min., 40 min., 45 min., 50 min., 55 min., 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h, 48 h, 50 h, 52 h, 54 h, 56 h, 58 h, 60 h, 62 h, 64 h, 66 h, 68 h, 70 h, 72 h, 74 h, 76 h, 78 h, 80 h, 82 h, 84 h, 86 h, 88 h, 90 h, 92 h, 94 h, 96 h, 98 h, 100 h, 102 h, 104 h, 106 h, 108 h, 110 h, 112 h, 114 h, 116 h, 118 h y 120 h después de la reperfusión.
b. Formulación
El método puede comprender administrar una composición para tratar los efectos de la reperfusión. Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden estar en forma de comprimidos o pastillas formulados de forma convencional. Por ejemplo, los comprimidos y cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales, incluyendo, entre otros, agentes aglutinantes, cargas, lubricantes, disgregantes y agentes humectantes. Los agentes aglutinantes incluyen, entre otros, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, goma tragacanto, mucílago de almidón y polivinilpirrolidona. Las cargas incluyen, entre otros, lactosa, azúcar, celulosa microcristalina, almidón de maíz, fosfato cálcico y sorbitol. Los lubricantes incluyen, entre otros, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol y sílice. Los disgregantes incluyen, entre otros, almidón de patata y glicolato de almidón sódico. Los agentes humectantes incluyen, entre otros, laurilsulfato sódico. Los comprimidos se pueden recubrir de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden ser también formulaciones líquidas incluyendo, entre otras, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes y elixires. Las composiciones también se pueden formular como un producto seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de usar. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos, incluyendo, entre otros, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Los agentes de suspensión incluyen, entre otros, jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio y grasas comestibles hidrogenadas. Los agentes emulsionantes incluyen, entre otros, lecitina, monooelato de sorbitán y goma arábiga. Vehículos no acuosos incluyen, entre otros, aceites comestibles, aceite de almendras, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilenglicol y alcohol etílico. Entre los ejemplos de conservantes se incluyen p-hidroxibenzoato de metilo o de propilo y ácido sórbico.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento también se pueden formular como supositorios que pueden contener bases de supositorio incluyendo, entre otros, manteca de cacao o glicéridos. Las composiciones proporcionadas en el presente documento también se pueden formular para inhalación, que puede estar en una forma, incluyendo, entre otros, una solución, suspensión o emulsión que se puede administrar como un polvo seco o en forma de un aerosol usando un propulsor, tal como diclorodifluorometano o triclorofluorometano. Las composiciones proporcionadas en el presente documento también se pueden formular como formulaciones transdérmicas, que comprenden vehículos acuosos o no acuosos, incluyendo, entre otros, cremas, pomadas,
lociones, pastas, vendajes medicados, parches o membranas.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento también se pueden formular para administración parenteral incluyendo, entre otros, mediante inyección o en infusión continua. Las formulaciones para inyectables pueden estar en forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, incluyendo, entre otros, agentes de suspensión, estabilizantes y dispersantes. La composición también se puede proporcionar en forma de un polvo para reconstituir con un vehículo adecuado, incluyendo, entre otros, agua apirógena estéril.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento también se pueden formular como preparación depot, que se puede administrar mediante implantación o mediante inyección intramuscular. Las composiciones se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (como emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo), resinas de intercambio iónico, o en forma de derivados escasamente solubles (como, por ejemplo, en forma de una sal escasamente soluble).
c. Dosificación
El método puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición a un paciente que lo necesite. La cantidad terapéuticamente eficaz requerida para uso en tratamiento varía con la naturaleza de la afección que se está tratando, la duración de tiempo deseada para incrementar las células madre hematopoyéticas en la circulación sanguínea y la edad/estado del paciente. En general, no obstante, las dosis usadas para el tratamiento de seres humanos adultos normalmente están en el intervalo de 0,001 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg al día. La dosis puede ser de aproximadamente 1 μg/kg a aproximadamente 100 μg/kg al día. La dosis deseada se puede administrar de forma conveniente en una única dosis o en dosis múltiples administradas a intervalos adecuados, por ejemplo como dos, tres, cuatro o más subdosis al día. Puede desearse o requerirse múltiples dosis.
La dosis puede ser cualquier dosis, incluyendo, entre otros, aproximadamente 0,1 μg/kg, 0,2 μg/kg, 0,3 μg/kg, 0,4 μg/kg, 0,5 μg/kg, 0,6 μg/kg, 0,7 μg/kg, 0,8 μg/kg, 0,9 μg/kg, 1 μg/kg, 25 μg/kg, 50 μg/kg, 75 μg/kg, 100 μg/kg, 125 μg/kg, 150 μg/kg, 175 μg/kg, 200 μg/kg, 225 μg/kg, 250 μg/kg, 275 μg/kg, 300 μg/kg, 325 μg/kg, 350 μg/kg, 375 μg/kg, 400 μg/kg, 425 μg/kg, 450 μg/kg, 475 μg/kg, 500 μg/kg, 525 μg/kg, 550 μg/kg, 575 μg/kg, 600 μg/kg, 625 μg/kg, 650 μg/kg, 675 μg/kg, 700 μg/kg, 725 μg/kg, 750 μg/kg, 775 μg/kg, 800 μg/kg, 825 μg/kg, 850 μg/kg, 875 μg/kg, 900 μg/kg, 925 μg/kg, 950 μg/kg, 975 μg/kg o 1 mg/kg.
COAGENTE
La flagelina o la composición se puede coadministrar con un coagente. El coagente puede ser cualquier compuesto que ralentice o prevenga los efectos de la reperfusión. El coagente puede ser un antioxidante. El antioxidante puede ser capaz de ralentizar y prevenir la oxidación de otras moléculas, células, tejidos u órganos. El antioxidante puede ser vitamina E, ácido ascórbico, glutatión, ácido lipoico, ácido úrico, carotenos tales como β-caroteno y retinol, vitamina E y coenzima Q, tioles tales como cisteína, cisteamina, glutatión y bilirrubina, amifostina y flavanoides.
El coagente puede ser un inhibidor del antiporte sodio-hidrógeno. La lesión y la reperfusión pueden dar lugar a una acidosis intracelular marcada. Se puede usa un inhibidor del antiporte sodio-hidrógeno para reducir la salida de protones y prevenir los incrementos de Ca2+. Un inhibidor de sodio-hidrógeno puede ser cariporide.
El coagente puede ser insulina. La insulina se puede usar para estimular la actividad de PDH y prevenir la inhibición de la actividad de PDH tras la reperfusión.
El coagente puede ser adenosina. La adenosina se puede usar para abrir los canales de KATP mitocondrial.
TRATAMIENTO DE COMBINACIÓN
El método se puede usar en combinación con los otros métodos para tratar la lesión. Los otros métodos pueden ser tratamientos de infarto de miocardio (ataque cardíaco), embolia pulmonar, accidente cerebrovascular (ictus), enfermedad oclusiva de las arterias periféricas (siendo un ejemplo gangrena), síndrome antifosfolípidos, sepsis, arteritis de células gigantes, vólvulos, cánceres de tumores sólidos, enfermedad de descompresión, drepanocitosis, punción de la vena subclavia, fracturas óseas, enfermedad de altitudes altas, uso recreativo de óxido nitroso, apnea del sueño, hipoapnea, derivaciones, anemia, intoxicación por monóxido de carbono, metahemoglobinemia, tromboembolia, embolia grasa, embolia gaseosa, embolia séptica, embolia tisular, embolia por cuerpo extraño, embolia de fluido amniótico, fuerzas g inducidas y presión externa para prevenir el flujo sanguíneo debido a cortes graves, castración o sarna. El método también se puede usar en combinación con métodos de tratar las lesiones por reperfusión, como administración de dosis bajas de anhídrido sulfhídrico (H2S), glisodeno o glialina de trigo, o efectuar hipotermia terapéutica o pinzamiento cruzado aórtico.
La presente invención tiene muchos aspectos que se ilustran mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Protección dependiente de la dosis de flagelina sobre la función renal [la flagelina puede ser un agonista de TLR5]
A dosis concretas, la flagelina no afecta a la función renal. Este efecto se demostró midiendo los niveles de creatinina en suero de ratones tras la administración sistémica de diferentes dosis de flagelina. Se inyectó en ratones C57BL/6 0,01 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, o 5,0 μg de flagelina y se controlaron los niveles de creatinina en suero (mg/dl) a diario como se muestra en la figura 1. La administración de 5 μg de flagelina tuvo como resultado un incremento de las concentraciones en suero que fue evidente en las 24 horas posteriores a la administración. Tras 24 horas adicionales (48 horas en total), los niveles de creatinina alcanzaron el máximo y después disminuyeron a niveles basales en 72 horas desde la administración y después comenzaron a aumentar lentamente hasta niveles bajos de nuevo (figura 1). Por el contrario, la administración de 1 μg de flagelina también indujo una elevación de los niveles de creatinina sérica, pero esto solo se detectó como un único pico tras 48 horas y después disminuyeron a los niveles basales a las 72 horas de la administración. La administración de 0,5 μg y 0,1 μg no indujo ningún incremento mensurable de los niveles de creatinina en suero a lo largo del periodo del estudio.
Ejemplo 2
Efecto dependiente de la dosis de flagelina sobre la función renal
A dosis concretas, la flagelina puede proteger el tejido renal de un mamífero de los efectos de la isquemia renal aguda. Este efecto se demostró administrando flagelina rada a ratones antes de la imposición de isquemia renal y midiendo la supervivencia tras la reperfusión de riñones isquémicos. Específicamente, 30 minutos antes de realizar 45 minutos de oclusión del pedículo renal bilateral, grupos de ratones C57BL/6 recibieron varias dosis de flagelina (0,01 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, o 5,0 μg por cuerpo) en 400 μl de PBS o PBS solo (400 μl) mediante administración intravenosa. Se recogieron datos de supervivencia de los ratones, los niveles de creatinina en suero y la histopatología.
a. Supervivencia
En los ratones se realizó oclusión del pedículo renal bilateral como se ha detallado previamente (REFERENCIAS). Se administró a los ratones 20 U (unidades/ml) de heparina sódica mediante administración intraperitoneal 20 minutos antes de la cirugía. Se anestesió a los ratones con fenobarbital y se leas mantuvo calientes con una bombilla de luz de 60 W hasta la cirugía. En condiciones de asepsia se abrió la cavidad abdominal con una incisión medial y se ocluyó el pedículo renal bilateral de modo no traumático con una pinza microvascular (World Precision Instruments, Sarasota, FL) y la herida se cerró temporalmente con una sutura de seda de 4-0. Se colocó a los ratones sobre una almohadilla térmica bajo una bombilla de 60 vatios y se introdujo en la cavidad abdominal una punta sensora de Traceable™ Certificate Memory Monitoring Thermometer (Fisher Scientific) para garantizar la temperatura a 32 ºC durante la imposición de la isquemia renal. Se sometió a los riñones a isquemia durante 45 minutos. Tras la retirada de la pinza, la reperfusión renal inmediata y completa se confirmó visualmente y se cerró la cavidad peritoneal. Los ratones operados de forma simulada fueron tratados de un modo idéntico para el pinzamiento bilateral del pedículo renal.
En el grupo control al que se administró PBS sin flagelina, el 80 % de los animales murió en 5 días tras la reperfusión de los riñones isquémicos (véase la figura 2a). A todos los animales a los que se administró 5 μg de flagelina antes de la imposición de la isquemia renal caducó en 5 días tras la reperfusión. Por el contrario, a todos los animales a los que se administró 1 o 0,5 μg de flagelina antes de la isquemia renal sobrevivieron más de 45 días tras la reperfusión. Asimismo se observó que el efecto protector de la flagelina en la isquemia renal aguda era dependiente de la dosis en cuanto a que los animales que recibieron 0,1 o 0,01μg no estaban protegidos contra la lesión.
b. Medición de la función renal
También se midieron los niveles de creatinina en suero para determinar el efecto protector de la flagelina sobre la función renal. Se anestesió a los ratones operados de forma simulada y sometidos a lesión I/R bilateral con isofluorano y se les extrajo sangre del plexo postorbital usando un tubo microcapilar recubierto con heparina a intervalos de 24 horas. El suero se almacenó a -80 ºC hasta la medición. Los niveles de creatinina sérica usando el kit de creatinina (Sigma Diagnostics, Inc., St. Louis, MO). El efecto protector de la flagelina se reflejó por los niveles bajos de creatinina en suero determinado a las 24 de la reperfusión en animales que recibieron 1,25 o 0,5 μg de flagelina 30 minutos antes de la imposición de la isquemia (véase la figura 2b). Los animales a los que se ha administrado dosis bajas no protectoras de flagelina (0,1 a 0.01μg) tenían niveles más altos de creatinina que bajaron justo por debajo de los observados en el grupo control que recibieron PBS 30 minutos antes de la oclusión del pedículo bilateral.
c. Estudios histológicos del tejido renal
Los niveles elevados de creatinina sérica, una indicación de la disfunción renal inducida por la imposición de isquemia-lesión por reperfusión fueron avalados por la histopatología de los riñones isquémicos 24 horas después de la reperfusión (véase la figura 3). Para inmunohistoquímica, los riñones recuperados se cortaron por la mitad, se incluyeron en compuesto OCT (Sakura Finetek U.S.A., Torrence, CA) e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. Se cortaron secciones coronales (7 mm), se montaron sobre portaobjetos, se secaron durante 1 horas y después se fijaron en acetona durante 10 minutos. Los portaobjetos se sumergieron en PBS durante 10 minutos en peróxido de hidrógeno al 3 %/metanol durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar la actividad de peroxidasa endógena. La actividad de biotina endógena se bloqueó con el sistema Biotin Blocking System (DAKO, Carpentaria, CA). Después de tratar con suero normal de rata (1:100), a las secciones se añadieron AcMo Gr-1 antiratón (RB6.8C5) diluido a 1:100 en PBS con 1 % de seroalbúmina bovina (BSA) para detectar neutrófilos o diluciones a 1:50 de AcMo CD4 anti-ratón de rata (GK1.5) para detectar linfocitos T CD4+, AcMo CD8a anti-ratón de rata (53-6.7) para detectar los linfocitos T CD8+ o el AcMo de anti-macrófagos de rata (F4/80) (SEROTEC, Raleigh, NC). Los portaobjetos control se incubaron con IgG de rata. Tras 1 hora, los portaobjetos se lavaron 3X con PBS y se incubaron durante 20 minutos con antisuero anti-IgG de rata de conejo (Sigma Aldrich) diluido a 1:100 en PBS/1 % de BSA. Tras 3 lavados en PBS, los portaobjetos se incubaron con estreptavidina-peroxidasa de rábano (DAKO) durante 20 minutos. A los portaobjetos se aplicó la solución sustrato DAB (3,3'-diaminobencidina)cromágeno (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) durante 0,5-3 minutos. Después de enjuagar con dH2O, se sometió a los portaobjetos a contratinción con hematoxilina, se lavaron con dH2O, se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron mediante microscopia óptica. Las imágenes se capturaron usando Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Para teñir el TLR5 se aplicó 1 mg de AcMo anti-TLR5 (ABR-Affinity BioReagents, Inc., Golden, CO) a los portaobjetos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después de lavar se aplicó anticuerpo IgG antiratón de cabra biotinilado diluido a 1:100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de aplicar la solución DAB, los portaobjetos se lavaron con agua corriente, se sumergieron durante 3 segundos en hematoxilina y después se lavaron. Los portaobjetos se deshidrataron con concentraciones crecientes de etanol al 50 % y después se sumergieron en citrasolve dos veces durante 10 minutos cada uno. Los portaobjetos se lavaron con agua corriente, se taparon con cubreobjetos y se observaron al microscopio óptico.
El uso de los niveles de creatinina sérica como indicación de la disfunción renal inducida por la imposición de isquemia-lesión por reperfusión fue avalado por la histopatología de los riñones isquémicos 24 horas después de la reperfusión (véase la figura 3). Los animales del grupo control a los que se administró PBS 30 minutos antes de la imposición de isquemia renal tenían necrosis tubular con formación de cilindros evidente a las 24 horas de la reperfusión. Consistente con la inducción de disfunción renal mediante la administración de 5 μg de flagelina, había pruebas de patología renal 30 minutos después de la administración de 5 μg de flagelina sin imponer isquemia y su aumento de gravedad tras la imposición de la isquemia renal y la reperfusión con hemorragia manifiesta, trombosis y formación de cilindros. Por el contrario, los animales que reciben 0,5 μg de flagelina antes de la imposición de isquemia tenían niveles bajos de infiltración leucocitaria 24 horas después de la reperfusión, pero la arquitectura renal parecía relativamente normal. La dosis baja no protectora, 0,1 μg de flagelina, no reacató la patología renal inducida por isquemia/lesión por reperfusión. Cuando los riñones de los animales supervivientes se examinaron a los 7 días de la reperfusión se produjeron marcadas disminuciones en la necrosis tubular e infiltración leucocitaria, además de la ausencia de trombosis y formación de cilindros en los animales a los que se administró 0,5 μg de flagelina antes de la imposición de isquemia renal. (Véase la figura 4).
d. Infiltración de neutrófilos en tejido renal dañado
Dado que la infiltración y la activación de neutrófilos es un factor contribuyente principal de la lesión tisular tras la isquemia-reperfusión renal, se recuperaron los riñones isquémicos 9 y 24 horas después de la reperfusión de los animales tratados con PBS solo o con 0,5 μg de flagelina antes de la imposición de isquemia y los niveles de infiltración de neutrófilos se evaluaron mediante tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido preparadas.
Para determinar directamente el número de neutrófilos, macrófagos, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ en riñones isquémicos durante la reperfusión, se cortaron piezas de un cuarto del riñón recuperado y se pesaron. Los riñones se incubaron en medio de cultivo RPMI 1640 con 2 % de suero bovino fetal durante 1 hora y después se forzaron a través de un colador de 70 mm usando un émbolo de una jeringa. Se recogieron las células y los eritrocitos se lisaron usando tampón de lisis ACK (GIBCO, Grand Island, NY). Tras 2 lavados, se contaron las células viables usando exclusión con azul tripán. Todos los alícuotas de las células se incubaron previamente con el anticuerpo del receptor anti-CD16/CD32 Fc (BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 5 minutos para bloquear la unión inespecífica del anticuerpo y después se incubaron las muestras con AcMo anti-CD45 conjugado con FITC así como anticuerpo conjugado con PE para detectar macrófagos (F4/80) o linfocitos T CD8+ (53-6.7) y anticuerpo conjugado con APC para detectar neutrófilos (RB6.8C5) o linfocitos T CD4+ (GK1.5) (todos los anticuerpos son de BD Pharmingen) durante 30 minutos a 4 ºC. Las células se analizaron usando citometría de flujo en dos colores en un FACSCalibur
(BD Biosciences, San Jose, CA). Se usaron los canales de dispersión hacia delante y de FL1 (CD45+) para encerrar los leucocitos en el tejido renal, seguido de análisis de las poblaciones de leucocitos específicas. Para cada muestra se acumularon 200.00 acontecimientos. Los datos se analizaron usando el software CellQuest (BD Biosciences). El número total de cada población de leucocitos se calculó mediante: (el número total de leucocitos contados) x (% de la población de leucocitos contados en las células CD45+)/100. Los datos se indican como el número de cada población de leucocitos / g de tejido renal de animales operados de forma simulada y operados de I/R.
Se observaron marcadas disminuciones de la infiltración de neutrófilos 9 y 24 horas después de la reperfusión cuando se administró a los animales 0,5 μg de flagelina (véase la figura 5a). La cuantificación directa de la infiltración de leucocitos en los riñones isquémicos indicó que ,5 μg de flagelina reducían la infiltración de neutrófilos casi a los niveles observados en los animales control operados de forma simulada (véase la figura 5b). Se observaron disminuciones del número linfocitos T CD4 y CD8 y de macrófagos en riñones isquémicos 24 horas después de la reperfusión y la administración de 0,5 μg de flagelina 30 minutos antes de la isquemia disminuyó más el número de linfocitos T CD4 y CD8.
Ejemplo 3
La condición de flagelina disminuye la expresión de citocinas proinflamatorias durante la reperfusión de riñones isquémicos
Este ejemplo demuestra el papel crucial de la flagelina que evita que las quimiocinas CXCL1/KC y CXCL2/KC se dirijan la infiltración de los leucocitos a los tejidos renales isquémicos. En estudios previos se ha indicado que los niveles máximos de los quimioatrayentes de neutrófilos CXCL1/KC y CXCL2/KC en riñones isquémicos se produce a las 9 horas de la reperfusión [REFERENCIA].
Para comenzar a investigar los mecanismos subyacentes a la disminución de la infiltración de leucocitos en riñones isquémicos cuando se acondicionó a los animales con 0,5 ug de flagelina, se extrajeron los riñones 9 y 24 horas después de la reperfusión y se determinaron los niveles de ARNm y de proteínas de los quimioatrayentes de neutrófilos y macrófagos (figura 6). Se cortaron piezas de un cuarto de los riñones recogidos y se congelaron en nitrógeno líquido. El ARN tisular total se extrajo usando el kit RNeasyTM Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) y se realizó transcripción inversa usando el kit High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se efectuó una PCR en tiempo real en un sistema Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) con cebadores de ensayo KC/CXCL1, MIP-2/CXCL2 y MCP-1/CCL2 usados como control (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Las muestras de riñones almacenados en nitrógeno líquido se disolvieron en 500 ml de PBS con EDTA 0,01M y un cóctel de inhibidor de la proteinasa (10 mg/ml de fluoruro de fenilmetlsulfonilo, 2 mg/ml de aprotinina, 2 mg/ml de leupeptina, 100 mg/ml de Pefabloc SC y 100 mg7ml de quimiostatina) y, después, se añadió 1 ml de 1,5 % de Triton X-100 en PBS. Tras incubar con agitación durante 1 hora a 4 ºC, se centrifugaron las muestras, se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas totales usando el kit BCATM Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL). Se midieron las concentraciones de KC/CXCL1, MIP-2/CXCL2 y MCP-1/CCL2 mediante ELISA de tipo sándwich usando los kits Quantikine M Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN). Para determinar la activación de los neutrófilos durante la reperfusión de riñones isquémicos, la concentración de mieloperoxidasa (MPO) se midió usando el kit de ensayo Mouse MPO ELISA (Cell Sciences, Canton, MA). Los resultados se indican como la concentración de las proteínas de ensayo por mg de proteína de tejido total ± DE.
El preacondicionamiento con dosis protectoras de flagelina (1,25 o 0,5 ug) tuvo como resultado disminuciones significativas de la expresión de ARNm y los niveles de proteínas de los quimioatrayentes de neutrófilos CXCL1 y CXCL2 a las 9 horas de la reperfusión. La expresión de ARNm de CCL2 o los niveles de proteínas fueron bajos a las 9 y 24 horas de la reperfusión y no vieron influenciados adicionalmente por el preacondicionamiento con flagelina. Además, los niveles de ARNm de las proteínas de fase aguda IL-1b e IL-6 pero no de TNFa también disminuyeron en riñones isquémicos a las 9 horas de la reperfusión en animales preacondicionados con flagelina (figura 6b).
Ejemplo 4
Efecto protector de la flagelina cuando se administra durante la reperfusión de riñones isquémicos
Este ejemplo demuestra que la flagelina proporciona un efecto protector a los riñones isquémicos agudos tratados cuando se administra después del inicio de a reperfusión. Como se ha descrito anteriormente, en los ratones se efectuó oclusión del pedículo renal bilateral y se midieron los niveles de creatinina en suero para determinar el efecto protector de la flagelina sobre la función renal tras el inicio de la reperfusión.
Específicamente, los grupos de ratones C57BL/6 fueron sometidos a 45 minutos de oclusión bilateral de pedículo renal y se administró 0,5 μg de flagelina a varios tiempos tras la retirada de las pinzas renales (véase la figura 7). La administración de flagelina 30 minutos antes o en los 30 minutos posteriores a la retirada de las pinzas rescató la viabilidad de todos los ratones sometidos a la lesión isquémica. La administración de flagelina 1 hora después y en
momentos posteriores tras el inicio de la reperfusión no rescató a ninguno de los ratones de la lesión. El efecto protector de administrar la flagelina 30 minutos antes de retirar las pinzas o en los 30 minutos posteriores a la retirada de las pinzas se reflejó en los bajos niveles de creatinina en suero monitorizados 24 horas después de la reperfusión de los riñones isquémicos (figura 7b).
Ejemplo 5
El efecto protector de la flagelina requiere señalización de TLR5 sobre las células del parénquima renal
Este ejemplo demuestra la fuente diana del efecto protector del tratamiento con flagelina durante la reperfusión de tejido. Como se trata en los Ejemplos 1-4, se realizaron estudios de reperfusión con riñones isquémicos.
Se generaron quimeras reconstituidas de médula ósea inducida con radiación entre ratones C57BL/6 y B6.MyD88-/silvestres. Se generaron quimeras reconstituidas de médula ósea inducida con radiación cortando las puntas de los fémures y tibias de ratones C57BL/6 y B6.MyD88-/- silvestres y lavándolos con medio RPMI 1640 para recoger las células de médula ósea. Primero, los ratones receptores de la médula ósea recibieron irradiación g a 1.100 radianes y 3 horas después recibieron 20 X 106 células de médula ósea por vía intravenosa. Los receptores de CD90.1 irradiado recibieron médula ósea de donantes de CD90.1 congénitos o al contrario. Los receptores reconstituidos recibieron antibióticos (0,2 mg/ml de sulfametoxazol y 0,4 mg/ml de trimetroprima) en el agua de bebida del día 1 al 7 como profilaxis. Se permitió a los receptores que se recuperaran durante 8-12 semanas y el quimerismo completo se confirmó mediante tinción de las células de sangre periférica con 90.2 conjugado con FITC y 90.1 conjugado con PE.
La figura 8 muestra que la administración de 0,5 μg de flagelina en los 30 minutos posteriores a la reperfusión de riñones isquémicos de ratones C57BL/6 silvestres reconstituidos con médula ósea silvestre disminuía los niveles de ARNm de CXCL1 y CXCL2. En receptores MyD88-/- reconstituidos con médula ósea MyD88-/- o silvestre, se indujo poco o nada de ARNm de CXCL1 y CXCL2 durante la reperfusión de riñones isquémicos y la administración de flagelina durante la reperfusión de estos riñones no disminuyó los niveles de ARNm de estas quimiocinas. Por el contrario, los receptores silvestres de médula ósea de donantes MyD88-/- expresaron niveles elevados de ARNm de CXCL1 y CXCL2 y estos niveles se redujeron mediante la administración de flagelina durante la reperfusión de los riñones isquémicos. Esto demuestra que la diana de la flagelina era las células del parénquima renal y no los leucocitos.
Para investigar esto adicionalmente, las secciones renales de ratones C57BL/6 y BALB/c silvestres se tiñeron con anticuerpo anti-TLR5 (figura 9a). Las células que se teñían positivamente eran, principalmente, células de la vasculatura y la tinción no era evidente en las células tubulares renales ni en los glomérulos. Las secciones renales de ratones Moth Eaten que tienen un defecto genético en la expresión de TLR5 no se teñían con el anticuerpo anti-TLR5. Los niveles de expresión del ARNm de TLR5 eran bajos en los riñones antes de la inducción de isquemia renal/reperfusión pero aumentaban rápidamente durante la reperfusión de riñones isquémicos (figura 9b).
Ejemplo 6
Efecto protector de la flagelina en un modelo de isquemia de las patas traseras
Los posibles efectos protectores de CBLB502 en un modelo de isquemia de las patas traseras de ratón se investigaron en una simulación de una lesión isquémica inducida con un torniquete. Estos estudios se originaron de estudios indicativos de que CBLB502 administrado a ratones sometidos a oclusión bilateral del pedículo renal atenuaba la lesión isquémica y la disfunción renal, incluida la disminución de la producción de quimioatrayentes de neutrófilos en respuesta a la reperfusión, disminuía la infiltración de neutrófilos en el riñón isquémico y atenúa las elevaciones de los niveles de creatinina sérica y pérdida de viabilidad. El protector se pudo administrar antes de la imposición de la oclusión del pedículo renal o, de forma más importante para el uso clínico, hasta 30 minutos después de la reperfusión del riñón isquémico.
La lesión inducida por torniquete se modeló atando una tira de caucho ancha sobre la pata trasera izquierda de los ratones durante 2-4 horas. Después del tiempo de isquemia se soltó la tira de caucho y se retiró. Los animales se recuperaron de la anestesia pero exhibieron incapacidad para usar la pata isquémica, que arrastraban durante periodos de hasta 9 días. La lesión isquémica también incluyó edema de la pata que era claramente visible y que se cuantificó mediante mediciones del peso húmedo-seco y comparación con la pata trasera contralateral no isquémica e inducción de niveles altos de citocinas proinflamatorias, incluyendo quimioatrayentes de neutrófilos e intensa infiltración por neutrófilos de la pata isquémica. Además, la inyección de pigmento de azul de Evan indicó cantidades considerables de fuga vascular en la pata isquémica (datos no mostrados).
Para estudiar los efectos protectores de CBLB502, se sometió de nuevo a los ratones a una lesión inducida mediante un torniquete atando una tira de caucho ancha sobre la pata trasera izquierda durante 3 horas. Después del tiempo de isquemia se soltó la tira de caucho y se retiró. Quince minutos después de la retirada de la tira de caucho y del inicio de la reperfusión se administró por vía intramuscular en la pata isquémica izquierda 0,5 μg de
CBLB502 o vehículo (PBS). Los ratones a los que se administró el CBLB502 tuvieron una recuperación más rápida del uso de la pata y, a los 14 días de la reperfusión tenían una fuerza de agarre mensurable para la pata isquémica de 10 GF. Por el contrario, los ratones a los que se administró solo PBS 15 minutos después de la reperfusión no alcanzaron esta fuerza hasta el día 21. Además, las extremidades que recibieron CBLB502 casi no presentaban edema 25 horas después de la reperfusión como evidencia la proporción del peso húmedo/seco de 2,5 frente a 3,4 para la pata isquémica de los ratones a los que solo se administró vehículo en la reperfusión (véase la figura 14C). Con respecto a la fuga vascular, los ratones a los que se administró CBLB501 tenían 7,4 μg de pigmento azul de Evan por gramo de peso de tejido de la pata frente a 13,1 μg para los ratones a los que se administró vehículo, P< 0,001 (véase la figura 14D). Por último, las patas tratadas con CBLB502 en la reperfusión presentaban disminuciones significativas de los quimioatrayentes de neutrófilos y macrófagos sCXCL2, CCL2, en los tejidos y de mieloperoxidasa (P< 0,05 para cada ensayo) [¿TENEMOS NÚMEROS CUANTIFICADOS?] Se realizó una tinción con hematoxilina/eosina en el músculo de la pata trasera el día 14 después de la reperfusión, tras 3 horas de isquemia en ratones tratados con CBLB502 (figura 14A) o vehículo (figura 14B).
La inyección de CBLB502 en los 30 minutos después de la reperfusión también dio lugar a disminuciones de la producción de quimioatrayentes de neutrófilos y de la infiltración de neutrófilos en la pata isquémica, disminuciones visibles en el edema y recuperación acelerada (día 4-6) del uso de las patas isquémicas. La exploración histológica también indicó mayor espesor del haz de fibras musculares en las patas isquémicas de los animales tratados con el protector (datos no mostrados).
Estos resultados se investigarán adicionalmente mediante medición cuantitativa de la inflamación y la disfunción de las patas en animales sometidos a isquemia en las patas traseras con frente a sin administración del protector CBLB502. Esto incluirá cuantificación de otras citocinas proinflamatorias, cuantificación directa de infiltración de neutrófilos, cuantificación del espesor del haz de fibras musculares y apoptosis de las fibras musculares y la magnitud y duración del edema.
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<212> PRT
<213> Salmonella dublin
<400> 34
<210> 35
<211> 792
<212> ADN
<213> Salmonella dublin
<400> 35
<210>
36 10 <211> 263
<212> PRT
<213> Salmonella dublin
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<211> 807
<212> ADN
<213> Salmonella dublin
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38 10 <211> 268
<212> PRT
<213> Salmonella dublin
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<212> ADN
<213> Salmonella dublin
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40 10 <211> 261
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<213> Salmonella dublin
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42 10 <211> 282
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> PRT 10 <213> Salmonella dublin
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<212> PRT
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<212> ADN
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<400> 55
<210> 56
<211> 168 10 <212> PRT
<213> Salmonella dublin
<400> 56

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición que comprende flagelina para su uso como medicamento para tratar un tejido de un mamífero frente a los efectos de la reperfusión.
  2. 2.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la reperfusión puede deberse a una lesión.
  3. 3.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la lesión es isquemia o hipoxia.
  4. 4.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la isquemia se selecciona del grupo que consiste en taquicardia, infarto, insuficiencia renal aguda, ictus, hipotensión, embolia, tromboembolia (coágulos sanguíneos), drepanocitosis, presión localizada en las extremidades del cuerpo y tumores.
  5. 5.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la hipoxia se selecciona del grupo que consiste en hipoxia hipoxémica (intoxicación por monóxido de carbono; apnea del sueño, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, parada respiratoria; derivaciones), hipoxia anémica (contenido bajo en O2), hipoxia hipoxémica e hipoxia histotóxica.
  6. 6.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la lesión se selecciona del grupo que consiste en infarto de miocardio, ictus e insuficiencia renal aguda.
  7. 7.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la presión localizada se debe a un torniquete.
  8. 8.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición se administra antes de, junto con, o después de la entrada de oxígeno.
  9. 9.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el tejido se selecciona del grupo que consiste en: tubo digestivo, pulmón, riñón, hígado, aparato cardiovascular, endotelio de los vasos sanguíneos, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, músculo, hueso y folículo piloso.
  10. 10.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición se administra en combinación con un antioxidante.
  11. 11.
    La composición que comprende flagelina para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el antioxidante se selecciona del grupo que consiste en amifostina y vitamina E.
  12. 12.
    Una composición que comprende un agonista del receptor tipo Toll 5 (TLR5) para su uso ****como medicamento para tratar un tejido de un mamífero frente a los efectos de la reperfusión.
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