ES2415890T3 - Procedimiento de preparación de proteínas triméricas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de preparación de una proteína trimérica que comprende cultivar una célula huésped transformada otransfectada con un vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende: (i) un dominio ZymoZipper (ZZ) en el que el dominio ZymoZipper (ZZ) comprende una secuencia de repetición dehéptada viral; (ii) una proteína heteróloga; y (iii) una secuencia de adaptador, en el que el adaptador comprende una secuencia seleccionada del grupoconstituido por la SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 37 y SEC ID Nº: 38.

Description

Procedimiento de preparación de proteínas triméricas.

La presente memoria descriptiva describe polipéptidos capaces de formar multímeros, particularmente trímeros y la fabricación y uso de tales polipéptidos.

A. Bobinas en espiral

Un componente básico de la estructura cuaternaria de los presentes polipéptidos multimerizantes es la bobina en espiral (revisado en Müller y col., (2000) Meth. Enzymol. 328: 261-283). Las bobinas en espiral son dominios de proteína que toman la forma de haces similares a sogas suavemente retorcidas. Los haces contienen dos a cinco hélices en orientación paralela o antiparalela. La característica esencial de las secuencias de bobina en espiral es un repetición de siete residuos, o héptada (abcdefg)n con la primera (a) y cuarta (d) posiciones comúnmente ocupadas por aminoácidos hidrófobos. Los restantes aminoácidos de la estructura de bobina en espiral son generalmente polares, excluyéndose normalmente la prolina debido a su efecto perturbador sobre la arquitectura helicoidal.

Esta repetición de héptada característica (también conocida como una repetición 3,4 hidrófoba) es lo que forma la estructura del dominio de la bobina en espiral, barriendo cada residuo aproximadamente 100º. Esto hace que los siete residuos de la repetición de héptada no alcancen dos giros completos de 20º. El retraso forma un ligera tira hidrófoba hacia la izquierda de residuos que transcurren hacia abajo en una hélice y la bobina en espiral se forma cuando se asocian estas tiras hidrófobas. Las desviaciones de la separación 3,4 regular de residuos apolares cambia el ángulo de la tira hidrófoba con respecto al eje de la hélice, alterando el ángulo de cruce de las hélices y desestabilizando la estructura cuaternaria. Un ejemplo de un medio común de representar en diagrama las repeticiones de héptada de bobina en espiral se ilustra en la Figura 1.

Los dímeros y trímeros paralelos son las estructuras de bobina en espiral observadas más comunes. Las características que distinguen dímeros de trímeros de formaciones de oligomerización de mayor orden son relativamente bien entendidas. Los residuos centrales de la repetición de héptada (residuos a y d) determinan en gran medida el estado de oligomerización, mientras que los residuos en el borde de la hélice (e y g) desempeñan funciones secundarias. Los trímeros son la organización por defecto para una distribución al azar de residuos centrales, ya que otros estados de oligomerización no pueden tolerar aminoácidos �-ramificados (Ile, Val y Thr) en la posición d para dímeros o la posición a para tetrámeros. A diferencia, los trímeros generalmente permiten la presencia de aminoácidos �-ramificados y otros hidrófobos en las posiciones centrales.

Se han usado fusiones de bobinas en espiral para lograr diversos fines experimentales. Un uso común es la sustitución de dominios de oligomerización naturales con una secuencia heteróloga para alterar el estado de oligomerización, estabilidad y/o avidez. Los monómeros de baja afinidad que no se asocian naturalmente pueden oligomerizarse con el fin de unirse efectivamente a otras dianas multiméricas. Adicionalmente, la fusión de dominios de oligomerización puede usarse para imitar el estado activado de la proteína nativa, que es difícil de lograr con la producción de proteínas recombinantes (véase, por ejemplo, Pullen y col. (1999) Biochem. 94:6032). Este enfoque ha sido particularmente eficaz cuando solo se producen dominios específicos tales como la porción extracelular (citoplásmica) o intracelular de una proteína de interés. Comúnmente, las bobinas en espiral se fusionan genéticamente a la proteína de interés mediante un adaptador flexible que proporcionará acceso para la fusión a un gran espacio tridimensional. Se usan fusiones directas para fines experimentales que requieren más moléculas rígidas, tales como aquellas usadas para la cristalización.

Se han desarrollado varios sistemas modelo de bobina en espiral basándose en la información estructural de grandes proteínas estructural tales como miosina y tropomiosina (TM43, Lau y col. J Biol Chem; 259: 13253-13261), un grupo de proteínas conocido como colectinas (Hoppe y col. (1994) Protein Sci; 3:1143-1158), o de la región de dimerización de proteínas reguladoras de ADN tales como la proteína del activador transcripcional de levadura GCN4-p1 (Landschulz y col. (1988) Science; 240:1759-1764). Esta última estructura se denomina frecuentemente una “cremallera de leucina” o LZ. Se han preparado sistemas modelo derivados de TM43, específicamente en los que una leucina por héptada se ha cambiado a fenilalanina. Esta estructura se conoce como una “cremallera de fenilalanina” o FZ (Thomas y col. Prog Colloid Polymer Sci; 99: 24-30). Un tercer tipo de derivado muy conocido de LZ es la cremallera de isoleucina (IZ) (Harbury y col. (1994) Nature 371:80-83).

Un concepto importante de bobinas en espiral modelo es la capacidad para producirse en el huésped de expresión. La falta de enlaces disulfuro en las estructuras de bobina en espiral ayuda en su producción en sistemas de expresión heterólogos. Sin embargo, las secuencias diseñadas de novo tienden a ser sensibles a la proteólisis. Aunque se expresan eficazmente, la falta relativa de eficacia con respecto a secuencias naturales refleja las lagunas en el presente conocimiento sobre todas las variables que participan en la interacción de proteínas (Arndt y col. (2002) Structure 10: 1235-1248). Adicionalmente, el uso de secuencias modelo es problemático cuando el fin de la proteína de fusión producida es una proteína biológicamente funcional.

B. Repeticiones de héptada virales

Muchos virus producen una forma fusogénica de glicoproteínas de la envoltura viral. Entre los géneros o familias virales que presentan este tipo de proteínas de fusión están Orthomyxovirus (por ejemplo, virus de la gripe), Filovirus (virus delÉbola), Betaretrovirus (virus Mason-Pfizer del mono (VMMP)), Gammaretrovirus (virus de la leucemia murina de Friend (FRMLV); virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV)), Deltaretrovirus (virus de la leucemia de linfocitos T humana tipo 1 (HTLV-1)) y Lentivirus (virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y de la inmunodeficiencia simia (VIS)) (revisado en Cheynet y col. (2005) J Virol; 79; 5585-5593). En estos virus, la subunidad de transmembrana se produce como una proteína de fusión, codificada por el gen env. Este producto génico se escinde en dos proteínas, la proteína de la superficie que participa en el reconocimiento de receptores y la subunidad de transmembrana que ancla el complejo env entero a la membrana y participa en la entrada del virus por la fusión de membranas. Estas proteínas se caracterizan por la presencia de repeticiones de héptada dentro de la región TM que forman fuertes interacciones entre oligómeros de la proteína mediante la formación de una estructura de bobina en espiral con tres subunidades (Li y col. (1996) J Virol; 70: 1266-1270; Tucker y col. (1991) Virol; 185:710-720).

Se han determinado estructuras cristalinas de varias proteínas TM: MoMLV (Fass y col. (1996) Nat Struc Biol; 3:465-469); VIH-1 (Chan y col. (1997) Cell; 89: 263-273); HTLV-1 (Kobe y col. (1999) PNAS; 93:4319-4324). También se encontraron estructuras similares en el virus de la gripe (Wilson y col. (1981) Nature; 289: 366-373) y el virus del Ébola (Malashkevich y col. (1999) PNAS; 96:2662-2667) y se ha supuesto que esta estructura refleja un mecanismo común para el proceso de fusión y entrada viral (Chambers y col. J Gen Virol; 71: 3075-3080). Otros virus que incluyen repeticiones de héptada dentro de su genoma son Cornavirus (cornavirus asociado al síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV)) (Bosch y col. J Virol 77: 8801-8811); virus del herpes (virus del herpes simple 1 (VHS-1) (Gianni y col. (2005) J Virol 79:7042-7049) y citomegalovirus humano (CMV)) (Lopper y col. J Virol (2004) 78: 8333-8341); y Paramyxovirus (virus del sarampión) (Buckland y col. (1992) J Gen Virol 73:1703-1707).

La homología de secuencias en la región TM también ha permitido la identificación de retrovirus endógenos en bases de datos de secuencias. Se han realizado estas búsquedas y han identificado satisfactoriamente retrovirus endógenos en muchos genomas de organismos, que incluyen ser humano, rata y ratón. Un ejemplo muy conocido de una familia de retrovirus endógenos humanos (RVEH) es RVEH-W. Se ha mostrado que un sitio de esta familia, ERVWE1, codifica un marco de lectura abierto de env de longitud completa y produce una proteína también conocida como sincitina (Cheynet y col. (2005) J Virol; 79:5585-5593). Al igual que la proteína viral, esta proteína se produce y escinde en dos subunidades separadas, una subunidad de superficie gp50 y una subunidad transmembrana gp24. La subunidad gp24 incluye repeticiones de héptada y las subunidades se encuentran asociadas como homotrímeros. De forma interesante, esta proteína se produce naturalmente en la placenta y puede participar en interacciones célula-célula tales como la fusión de la placenta con la pared uterina.

Sigue existiendo la necesidad en la técnica de adaptar las secuencias de trimerización naturales a su uso en la producción de proteínas de fusión recombinantes biológicamente activas. Por consiguiente, la presente solicitud describe el cribado, descubrimiento y desarrollo de secuencias genéticas naturales apropiadas para la trimerización en la técnica de las proteínas recombinantes.

El documento WO 2004/033486 describe la producción de proteínas de fusión homotriméricas.

Chambers y col., J. General Virology, vol. 71(Parte 12), diciembre de 1990, páginas 3075-3080, informa de que las secuencias de repetición de héptada están localizadas adyacentes a regiones hidrófobas en varios tipos de glicoproteínas de fusión de virus.

Delwart y col., AIDS Research and Human Retroviruses, vol. 6(6) junio de 1990, páginas 703-706, informa de que las glicoproteínas de la envoltura retroviral contienen una repetición similar a cremallera de leucina.

Shugars y col., J. Virology, vol. 70(5) 1996, páginas 2982-2991, describen la caracterización biofísica de proteínas recombinantes que expresan el dominio similar a cremallera de leucina de la proteína transmembrana del VIH tipo 1 pg41.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de una proteína trimérica que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende un dominio ZymoZipper (ZZ) como se define en las reivindicaciones y una proteína heteróloga. En una realización, la proteína heteróloga es una proteína de la membrana, la porción de la proteína heteróloga que está incluida en la proteína de fusión es el dominio extracelular de esa proteína, y la proteína de fusión resultante es soluble. En otra realización de la presente invención, el dominio ZZ se deriva de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína de la envuelta del virus u otro gen que contiene repetición de héptada de un genoma de virus. En una realización, la proteína de la envuelta del virus es del virus Mason-Pfizer del mono (VMMP).

La proteína de fusión comprende una secuencia de adaptador como se define en las reivindicaciones. Una realización adicional es en la que el dominio ZZ se deriva de la subunidad transmembrana (TM) de un retrovirus endógeno, tal como un retrovirus endógeno de rata (RVER) o un retrovirus endógeno humano (RVEH) que incluye, pero no se limita a, ERVWE1.

Todavía otra realización de la presente invención es un procedimiento como se define en las reivindicaciones de preparación de una proteína hetero-trimérica soluble cultivando una primera célula huésped transformada o transfectada con un primer vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende un primer dominio ZZ y una primera proteína heteróloga; cultivando una segunda célula huésped transformada o transfectada con un segundo vector de expresión que codifica un segundo dominio ZZ y una segunda proteína heteróloga, y cultivando una tercera célula huésped transformada o transfectada con un tercer vector de expresión que codifica un tercer dominio ZZ y una tercera proteína heteróloga. En esta realización, los tres dominios ZZ forman preferencialmente un hetero-trímero. Este cultivo puede producirse en la misma célula huésped. Los dominios ZZ pueden ser iguales o diferentes. La proteína de fusión comprende además una secuencia de adaptador. En una realización particular, las dos proteínas heterólogas usadas para formar la proteína hetero-trimérica son los dominios solubles de APRIL (un ligando de proliferación de linfocitos) y BLyS (estimulante de linfocitos B). La presente memoria descriptiva describe secuencias de ADN, vectores de expresión y células huésped transformadas usadas en el presente procedimiento y proteínas de fusión producidas por el presente procedimiento.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica tras la lectura de los detalles de la invención como se describen más completamente más adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1. es una representación gráfica de la estructura de proteínas de bobina en espiral y la interacción entre residuos dentro de la bobina y los residuos entre bobinas.

La FIG. 2. representa en gráfica los resultados de las pruebas de estimulación de linfocitos B para construcciones de ZZ-APRIL representativas a diversas concentraciones. BLyS es un control positivo.

La FIG. 3. representa en gráfica los resultados del ensayo de proliferación de linfocitos B para construcciones de ZZ12-APRIL representativas con diversos adaptadores. BLyS es un control positivo.

La FIG. 4. representa en gráfica los resultados del bioensayo de TACI-Jurkat para construcciones de ZZ12-APRIL representativas con diversos adaptadores. BLyS es un control positivo.

La FIG. 5. representa en gráfica los resultados del ensayo de proliferación de linfocitos B para la construcción de ZZ12-6 APRIL y varios APRIL comercialmente disponibles. BLyS es un control positivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una proteína trimérica cultivando una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende un dominio ZymoZipper (ZZ) como se define en las reivindicaciones, una proteína heteróloga y una secuencia de adaptador como se define en las reivindicaciones. La invención se basa en el hallazgo de que secuencias de trimerización derivadas de la subunidad transmembrana TM de ciertos virus producen proteínas de fusión altamente bioactivas. Esta observación permitió el desarrollo de un procedimiento de producción de proteínas de fusión que puede usarse para producir proteínas homo- o hetero-triméricas que retienen su actividad biológica.

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es solo con el fin de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención solo se limitará por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los procedimientos y materiales preferidos.

Debe observarse que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Así, por ejemplo, referencia a “un polimorfismo” incluye una pluralidad de tales polimorfismos, referencia a “una molécula de ácido nucleico” incluye una pluralidad de tales moléculas de ácidos nucleicos, y referencia a “el procedimiento” incluye referencia a uno o más procedimientos, etapas de procedimiento y equivalentes de los mismos conocidos para aquellos expertos en la materia, etc.

Las publicaciones tratadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder tal publicación en virtud de invención previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.

Definiciones

En la presente memoria descriptiva, el término “proteína de fusión” se usa en el presente documento para describir una proteína cuyas secuencias se derivan de al menos dos fuentes de genes diferentes. Las secuencias se manipulan genéticamente para transcribirse y traducirse en una proteína que comprende secuencias de al menos dos genes diferentes. Para la presente invención, una fuente de genes es una secuencia de repetición de héptada viral (conocida como el dominio ZymoZipper o ZZ) y la fuente o fuentes de genes adicionales son uno o más genes heterólogos. La proteína de fusión también comprende una secuencia de adaptador que generalmente se localizará entre el dominio ZZ y la secuencia de la proteína heteróloga, como se define en las reivindicaciones.

El término “heterólogo” se usa para describir un polinucleótido o proteína que no es codificado o expresado de modo natural con la secuencia de repetición de héptada viral del dominio ZZ dentro del genoma vírico. Si el dominio ZZ se deriva de un retrovirus endógeno humano, cualquier fuente de genes fuera de las proteínas que se cree que están codificadas por secuencias derivas de virus se considera heteróloga. Una proteína heteróloga puede ser una proteína de longitud completa o un dominio particular de una proteína. Las proteínas heterólogas de la presente invención engloban tanto proteínas unidas a la membrana como proteínas solubles y dominios de las mismas.

Los términos “polinucleótido” y “molécula de ácido nucleico” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término “polinucleótido” incluye moléculas monocatenarias, bicatenarias y de tres hélices. “Oligonucleótido” generalmente se refiere a polinucleótidos de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 nucleótidos de ADN monocatenario o bicatenario. Sin embargo, para los fines de esta divulgación, no hay límite superior para longitud de un oligonucleótido. Los oligonucleótidos también se conocen como oligómeros u oligos y pueden aislarse de genes, o sintetizarse químicamente mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Lo siguiente son realizaciones no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Una molécula de ácido nucleico también puede comprender moléculas de ácidos nucleicos modificadas tales como moléculas de ácidos nucleicos metiladas y análogos de moléculas de ácidos nucleicos. En la técnica se conocen análogos de purinas y pirimidinas. Los ácidos nucleicos pueden producirse naturalmente, por ejemplo, ADN o ARN, o pueden ser análogos sintéticos, como se conoce en la técnica. Tales análogos pueden ser preferidos para su uso como sondas debido a la superior estabilidad bajo condiciones de ensayo. Se ha mostrado que las modificaciones en la estructura nativa, que incluyen alteraciones en el esqueleto, azúcares o bases heterocíclicas, aumentan la estabilidad intracelular y afinidad de unión. Entre los cambios útiles en la química del esqueleto están fosforotioatos; fosforoditioatos, en los que ambos oxígenos de no unión por puente están sustituidos con azufre; fosforamiditos; alquilfosfotriésteres y boranofosfatos. Los derivados de fosfato aquiral incluyen 3'-O'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-O-fosforotioato, 3'-CH2-5'-O-fosfonato y 3'-NH-5'-Ofosforoamidato. Los ácidos nucleicos peptídicos sustituyen el esqueleto del fosfodiéster de ribosa entero con un enlace peptídico.

También se usan modificaciones de azúcar para potenciar la estabilidad y afinidad. Puede usarse el a-anómero de desoxirribosa, en el que la base está invertida con respecto al 1-anómero natural. El 2'-OH del azúcar ribosa puede alterarse para formar azúcares 2'-O-metilo o 2'-O-alilo, que proporcionan resistencia a la degradación sin comprender la afinidad.

La modificación de las bases heterocíclicas debe mantener el apropiado apareamiento de bases. Algunas sustituciones útiles incluyen desoxitimidina por desoxiuridina; desoxicitidina por 5-metil-2'-desoxicitidina y 5-bromo-2'-desoxicitidina. Se ha mostrado que la desoxitimidina y desoxicitidina aumentan la afinidad y actividad biológica cuando se sustituyen por 5propinil-2'-desoxiuridina y 5-propinil-2'-desoxicitidina, respectivamente.

Los términos “polipéptido” y “proteína”, usados indistintamente en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos químicamente o bioquímicamente modificados o derivatizados, y polipéptidos que tienen esqueletos de péptido modificados. El término incluye proteínas de fusión que incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias conductoras heterólogas y homólogas, con o sin residuos de metionina en el extremo N; proteínas inmunológicamente elegidas como diana; y similares.

Un polinucleótido “sustancialmente aislado” o “aislado” es uno que está sustancialmente libre de las secuencias con las que está asociado en la naturaleza. Por sustancialmente libre se indica al menos el 50 %, preferentemente al menos el 70 %, más preferentemente al menos el 80 %, e incluso más preferentemente al menos el 90 % libre de los materiales con los que está asociado en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, un polinucleótido “aislado” también se refiere a polinucleótidos recombinantes que, en virtud del origen o manipulación: (1) no están asociados a todo o una parte de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza, (2) están ligados a un polinucleótido distinto de con el que está ligado en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza.

Las reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de diferente “rigurosidad”. Condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989). Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 ºC, 37 ºC, 50 ºC y 68 ºC; concentraciones de tampón de 10×SSC, 6xSSC, 1×SSC, 0,1×SSC (en las que SSC es NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otros sistemas tampón; concentraciones de formamida del 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2 ó 15 minutos; y disoluciones de lavado de 6×SSC, 1×SSC, 0,1×SSC, o agua desionizada. Ejemplos de condiciones rigurosas son hibridación y lavado a 50 ºC o superior y en 0,1×SSC (NaCl 9 mM / citrato de sodio 0,9 mM).

“Tm” es la temperatura en grados Celsius a la que el 50 % de un dúplex de polinucleótido constituido por hebras complementarias unidas por hidrógeno en dirección antiparalela por apareamiento de bases de Watson-Crick se disocia en sus hebras individuales en condiciones del experimento. Tm puede predecirse según una fórmula convencional, tal como:

en la que [X+] es la concentración de catión (normalmente ión sodio, Na+) en moles/l; ( % de G/C) es el número de residuos G y C como porcentaje de residuos totales en el dúplex; ( % de F) es el porcentaje de formamida en disolución (peso/vol); y L es el número de nucleótidos en cada hebra del dúplex.

Condiciones rigurosas para tanto hibridación de ADN/ADN como de ADN/ARN son como se describen por Sambrook y col. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, incorporados en el presente documento por referencia. Por ejemplo, véase la página 7.52 de Sambrook y col.

El término “célula huésped” incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de cualquier vector recombinante o polinucleótido aislado de la invención. Células huésped incluyen progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula parental original debido a mutación y/o cambio natural, accidental o intencionado. Una célula huésped incluye células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula huésped que comprende un vector recombinante de la invención es un “célula huésped recombinante”.

El término “secuencia señal secretora” indica una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un “péptido secretor”) que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor por una ruta de una célula en la que se sintetiza. El polipéptido mayor se escinde comúnmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito por la ruta secretora.

El término “marca de afinidad” se usa en el presente documento para indicar un segmento de polipéptido que puede unirse a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para el que está disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico puede usarse como marca de afinidad. Las marcas de afinidad incluyen un tracto de poli-histidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson y col., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), marca de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), sustancia P, péptido Flag™ (Hopp y col., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de unión a estreptavidina, u otro epítope antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford y col., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Están disponibles ADN que codifican marcas de afinidad de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Los términos “extremo amino” (extremo N) y “extremo carboxilo” (extremo C) se usan en el presente documento para indicar posiciones dentro de polipéptidos. Si el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una secuencia

o porción particular de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia posicionada en el extremo carboxilo con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido se localiza proximal al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

Como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento”, “tratar” y similares se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma, y/o pueden ser terapéuticos en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. “Tratamiento”, como se usa en el presente 5 documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye:

(a) prevenir que la enfermedad se produzca en un sujeto que puede tener predisposición a la enfermedad, pero que todavía no ha sido diagnosticado con que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, causando regresión de la enfermedad.

Los términos “individuo”, “sujeto” y “paciente”, usados indistintamente en el presente documento, se refieren a un

10 mamífero que incluye, pero no se limita a, murinos, simios, seres humanos, animales de granja mamíferos, animales para deportes mamíferos, y mascotas mamíferas.

El dominio ZymoZipper (ZZ)

La presente invención es un procedimiento de producción de una proteína trimérica que comprende una proteína de fusión como se define en las reivindicaciones que comprende un dominio ZZ y un dominio de proteína heterólogo. Los 15 dominios ZZ se derivan de repeticiones de héptada virales como se encuentran en la subunidad TM de muchas especies de virus. Géneros o familias de virus representativas que tienen dominios TM apropiados u otros genes virales que incluyen repeticiones de héptada incluyen, pero no se limitan, a Orthomyxovirus, Filovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Lentivirus, Cornavirus y Paramyxovirus. Un Betaretrovirus particular contemplado para la presente invención es el virus Mason-Pfizer del mono (VMMP). Otros virus particulares contemplados para la presente 20 invención incluyen, pero no se limitan a, virus de la gripe, virus del Ébola, FRMLV, MoMLV, HTLV-1, VIH-1 y VIS. Las secuencias están seleccionadas por su capacidad esperada para formar estructura de proteínas de bobina en espiral, ya que esta estructura es importante para la capacidad para formar formas de proteínas multiméricas. Particularmente deseado para la presente invención es la capacidad de las proteínas de bobina en espiral para producir estructuras de proteína trimérica. La selección de secuencias apropiadas puede implicar el uso de software de comparación de

25 secuencias, tal como el programa BLAST disponible del Centro nacional para información biotecnológica, como se describe más adelante en el Ejemplo 1.

Otra posible fuente de secuencias del dominio ZZ son subunidades TM de retrovirus endógenos. Éstos incluyen secuencias de retrovirus de rata, ratón o humanos endógenos (RVEH). Más allá de comprender las repeticiones de héptada virales que son características de la estructura de bobina en espiral, se ha encontrado que las proteínas de RVEH

30 se expresan en tejidos humanos. Por ejemplo, la familia de RVEH-W incluye un sitio, ERVWE1, que produce una proteína conocida como sincitina. La ventaja de trabajar con tales secuencias como dominios ZZ es la antigenicidad reducida esperada que tendría una secuencia endógena cuando se introdujera en un sujeto humano.

El trabajar con otros tipos de secuencias de cremallera, por ejemplos, la cremallera de leucina, ha mostrado que un número limitado de sustituciones de aminoácidos conservativas (incluso en el residuo d) puede tolerarse frecuentemente

35 en secuencias de cremallera sin la pérdida de la capacidad de las moléculas para multimerizarse (Landschulz y col., (1989), arriba). Así, cambios conservativos de la secuencia viral nativa por el dominio ZZ se contemplan dentro del alcance de la invención. La Tabla 1 muestra los cambios conservativos que se espera que sean tolerados por la estructura de cremallera.

Tabla 1

Sustituciones de aminoácidos conservativas

Básicos: arginina

lisina

histidina

Ácidos: ácido glutámico

ácido aspártico

Polares: glutamina

asparagina

Hidrófobos: leucina

isoleucina (continuación)

Sustituciones de aminoácidos conservativas

valina

metionina

Aromáticos: fenilalanina

triptófano

tirosina

Pequeños: glicina

alanina

serina

treonina

metionina

Si más de un proteína de fusión está siendo usada para producir proteínas hetero-multiméricas, por ejemplo, heterotrímeros, el dominio ZZ que se usa puede ser el mismo dominio para ambas proteínas de fusión o dominios ZZ 5 diferentes, en tanto que los dominios tengan la capacidad para asociarse entre sí y formar proteínas multiméricas.

El dominio ZZ puede estar dispuesto en cualquiera del extremo N o C de la proteína heteróloga de interés, basándose en consideraciones de función (es decir, si la proteína heteróloga es una proteína de la membrana tipo I o tipo II) y facilidad de construcción de la construcción.

Proteínas heterólogas -- Proteínas de interés

10 Una proteína heteróloga de interés se selecciona principalmente basándose en un deseo de producir una versión multimérica, particularmente trimérica, de la proteína. Además, usando solo un dominio soluble de la proteína heteróloga, puede producirse en forma soluble una proteína transmembrana. De particular interés con la presente invención es la producción de proteínas biológicamente activas de interés. Una familia de proteínas que usa comúnmente trímeros para la actividad es la familia del factor de necrosis tumoral (TNF). Miembros de esta familia incluyen dos ligandos, APRIL y BLyS.

15 Se ha preparado APRIL humano soluble en células de mamífero en varias formas: con una marca Flag (Hahne y col. (1998) J Exp Med; 188:1185-1190), como una proteína de fusión con el dominio de TNF soluble ACRP30 (Rennert y col. (2000) J Exp Med; 192, 1677-1684) o fosfatasa alcalina secretada (Marsters y col. (2000) Curr Biol; 10: 785-788). Se han publicado dos residuos del extremo amino 105 y 110 para la preparación de la forma soluble de APRIL, y ambas formas incluyen el motivo de unión a heparina (residuos 109-114) (Ingold y col. (2005) J Exp Med; 201:1375-1383; Hendriks y col.

20 (2005) Cell Death Differ; 12: 637-648).

A pesar del hecho de que la estructura cristalina de APRIL murino muestre una estructura homotrimérica (y se ha mostrado que APRIL humano soluble fusionado con el epítope Flag también forma un homotrímero (datos sin publicar)), parece que APRIL requiere un componente de fusión trimérico con el fin de formar una molécula soluble activa (Rennert y col., arriba). Así, esta proteína se seleccionó como proteína heteróloga representativa a expresar usando el procedimiento

25 de proteínas de fusión heterólogas de ZZ y producción y ensayos biológicos de su función se describen más adelante en los Ejemplos 1-4. Otra posible proteína que puede producirse usando el procedimiento de proteínas de fusión de ZZ es BLyS. Usando construcciones de proteínas de fusión de ZZ para ambos ligandos de TNF pueden producirse heterotrímeros de APRIL y BLyS.

Secuencias de adaptador, secuencias de marcas de afinidad y péptidos señal

30 Una proteína de interés puede ligarse directamente a otra proteína para formar una proteína de fusión; alternativamente, las proteínas pueden separarse una distancia suficiente para garantizar que las proteínas formen la estructura secundaria y terciaria apropiada necesaria para la actividad biológica. Secuencias de adaptador adecuadas adoptarán una conformación extendida flexible y no presentarán una propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que pudiera interaccionar con los dominios de función de las proteínas de fusión, y tendrán un mínimo carácter hidrófobo o

35 cargado que también pudiera interferir con la función de dominios de fusión. Deben construirse secuencias de adaptador teniendo en cuenta la repetición de héptada viral, ya que puede no actuarse en el mejor interés de la producción de una proteína biológicamente activa para estrechar fuertemente el extremo N o C de la secuencia heteróloga. Este asunto se examina experimentalmente en el Ejemplo 4, más adelante. Más allá de estas consideraciones, la longitud de la secuencia de adaptador puede variar sin afectar significativamente la actividad biológica de la proteína de fusión. Las secuencias de adaptador pueden usarse entre todos y cada uno de los componentes de la proteína de fusión (o construcción de expresión), que incluye marcas de afinidad y péptidos señal.

Otro componente de la proteína de fusión puede ser una marca de afinidad. Tales marcas no alteran la actividad biológica de proteínas de fusión, son altamente antigénicas y proporcionan un epítope que puede unirse reversiblemente por una molécula de unión específica, tal como un anticuerpo monoclonal, permitiendo la rápida detección y purificación de una proteína de fusión expresada. Las marcas de afinidad también pueden transmitir resistencia a la degradación intracelular si las proteínas se producen en bacterias, como E. coli. Una marca de afinidad a modo de ejemplo es la marca FLAG (SEC ID Nº: 58). Procedimientos de producción de proteínas de fusión usando esta marca de afinidad para la purificación se describen en la patente de EE.UU. nº 5.011.912.

Todavía otro componente de la proteína de fusión puede ser una secuencia señal o secuencia conductora. Estas secuencias se usan generalmente para permitir la secreción de la proteína de fusión de la célula huésped durante la expresión y también se conocen como una secuencia conductora, secuencia prepro o secuencia pre. La secuencia señal secretora puede ser la de la proteína heteróloga que se produce, si tiene una secuencia tal, o puede derivarse de otro proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizarse de novo. La secuencia señal secretora está operativamente ligada a la secuencia de ADN de la proteína de fusión, es decir, la dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se posicionan para dirigir el polipéptido recientemente sintetizado a la ruta secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras están comúnmente posicionadas 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal pueden estar posicionadas en cualquier parte en la secuencia de ADN de interés (véase, por ejemplo, Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743; Holland y col., patente de EE.UU. nº 5.143.830). Un ejemplo de una secuencia conductora adecuada para la presente invención es un conductor optimizado del gen de activador de plasminógeno tisular humano (tPA) (SEC ID Nº: 39 y 40).

Preparación de polinucleótidos que codifican proteínas de fusión heterólogas de ZZ

Las composiciones de ácido nucleico descritas en el presente documento se usan en la preparación de toda o una parte de las proteínas de fusión heterólogas de ZZ, como se ha descrito anteriormente. Los polinucleótidos objeto (incluyendo ADNc o el gen de longitud completa) pueden usarse para expresar un producto génico parcial o completo. Las construcciones que comprenden los polinucleótidos objeto pueden generarse sintéticamente. Alternativamente, el ensamblaje de una sola etapa de un gen y el plásmido entero de grandes números de oligodesoxirribonucleótidos se describe por, por ejemplo, Stemmer y col., Gens (Ámsterdam) (1995) 164(1):49-53. En este procedimiento se describe la PCR de ensamblaje (la síntesis de secuencias de ADN largas a partir de grandes números de oligodesoxirribonucleótidos (oligos)). El procedimiento se deriva de barajado de ADN (Stemmer, Nature (1994) 370:389-391) y no se basa en ADN ligasa, pero en su lugar se basa en ADN polimerasa para construir fragmentos de ADN cada vez más largos durante el procedimiento de ensamblaje. Construcciones de polinucleótidos apropiadas se purifican usando técnicas de ADN recombinante convencionales como se describen en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., y bajo reglamentaciones actuales descritas en el Departamento de Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos (HHS), Pautas del Instituto Nacional de Salud (NIH) para la investigación de ADN recombinante.

Moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de polinucleótidos proporcionada en el presente documento se propagan disponiendo la molécula en un vector. Se usan vectores virales y no virales, incluyendo plásmidos. La elección del plásmido dependerá del tipo de célula en la que se desea la propagación y el fin de propagación. Ciertos vectores son útiles para amplificar y preparar grandes cantidades de la secuencia de ADN deseada. Otros vectores son adecuados para la expresión en células en cultivo. Todavía otros vectores son adecuados para la transferencia y expresión en células en un animal o persona completa. La elección del vector apropiado está perfectamente dentro de la habilidad de la técnica. Muchos de tales vectores están disponibles comercialmente. El polinucleótido de longitud parcial o completa se inserta en un vector normalmente por medio de unión de ADN ligasa a un sitio de enzima de restricción escindido en el vector. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos deseada puede insertarse por recombinación homóloga in vivo. Normalmente, esto se lleva a cabo uniendo regiones de homología con el vector sobre los flancos de la secuencia de nucleótidos deseada. Las regiones de homología se añaden por ligación de oligonucleótidos, o por reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores que comprenden, por ejemplo, tanto la región de homología como una parte de la secuencia de nucleótidos deseada.

Para la expresión puede emplearse un casete o sistema de expresión. El producto génico codificado por un polinucleótido de la invención se expresa en cualquier sistema de expresión conveniente que incluye, por ejemplo, sistemas bacterianos, de levadura, de insecto, anfibios y de mamífero. Vectores y células huésped adecuados se describen en la patente de EE.UU. nº 5.654.173. En el vector de expresión, un polinucleótido que codifica el polipéptido BLyS polimórfico se liga a una secuencia reguladora según convenga para obtener las propiedades de expresión deseadas. Éstas pueden incluir promotores (unidos tanto en el extremo 5' de la hebra codificante como en el extremo 3' de la hebra no codificante), potenciadores, terminadores, operadores, represores e inductores. Los promotores pueden regularse o ser constitutivos. En algunas situaciones puede desearse usar promotores condicionalmente activos tales como promotores específicos de tejido o específicos del estadio de desarrollo. Éstos se ligan a la secuencia de nucleótidos deseada usando las técnicas descritas anteriormente para el enlace a vectores. Puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica. En otras palabras, el vector de expresión proporcionará una región de iniciación transcripcional y traduccional, que puede ser inducible o constitutiva, estando la región codificante operativamente ligada bajo el control transcripcional de la región de iniciación de la transcripción, y una región de terminación transcripcional y traduccional. Estas regiones de control pueden ser nativas para el ADN que codifica la proteína de fusión heteróloga de ZZ, o pueden derivarse de fuentes exógenas.

Los vectores de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas. Puede estar presente un marcador de selección operativo en el huésped de expresión. Los vectores de expresión pueden usarse para la producción de proteínas de fusión, proporcionando el péptido de fusión exógeno funcionalidad adicional, es decir, elevada síntesis de proteínas, estabilidad, reactividad con antisueros definidos, un marcador de enzimas, por ejemplo, galactosidasa, etc.

Pueden prepararse casetes de expresión que comprenden una región de iniciación de la transcripción, el gen o fragmento del mismo, y una región de terminación de la transcripción. Es de particular interés el uso de secuencias que permiten la expresión de epítopes o dominios funcionales, normalmente de al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud, más normalmente de al menos aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, a aproximadamente 25 aminoácidos, y hasta el marco de lectura abierto completo del gen. Después de la introducción del ADN, las células que contienen la construcción pueden seleccionarse por medio de un marcador de selección, expandirse las células y luego usarse para la expresión.

Las proteínas de fusión heterólogas de ZZ pueden expresarse en procariotas o eucariotas según formas convencionales que dependen del fin de la expresión. Para la producción a gran escala de la proteína, un organismo unicelular, tal como

E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, células de insecto en combinación con vectores de baculovirus, o células de un organismo superior tal como vertebrados, particularmente mamíferos, por ejemplo, células COS 7, HEK 293, CHO, ovocitos de Xenopus, etc., puede usarse como las células huésped de expresión. En algunas situaciones se desea expresar una molécula de ácido nucleico BLyS polimórfica en células eucariotas, beneficiándose la proteína BLyS polimórfica del plegamiento nativo y las modificaciones post-traduccionales. También pueden sintetizarse péptidos pequeños en el laboratorio. Los polipéptidos que son subconjuntos de la secuencia de BLyS completa pueden usarse para identificar e investigar partes de la proteína importantes para la función.

Sistemas de expresión específicos de interés incluyen sistemas de expresión derivados de células bacterianas, levadura, de insecto y células de mamífero. Sistemas representativos de cada una de estas categorías se proporcionan más adelante:

Bacterias. Sistemas de expresión en bacterias incluyen aquellos descritos en Chang y col., Nature (1978) 275:615; Goeddel y col., Nature (1979) 281:544; Goeddel y col., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057; documento EP 0 036.776; patente de EE.UU. nº 4.551.433; DeBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:21-25; y Siebenlist y col., Cell (1980) 20:269.

Levadura. Sistemas de expresión en levadura incluyen aquellos descritos en Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929; Ito y col., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtz y col., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142; Kunze y col., J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459; Roggenkamp y col., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302; Das y col., J. Bacteriol. (1984) 158:1165; De Louvencourt y col., J. Bacteriol. (1983) 154:737; Van den Berg y col., Bio/Technology (1990)8:135; Kunze y col., J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Cregg y col., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376; patentes de EE.UU. nº 4.837.148 y 4.929.555; Beach y Nurse, Nature (1981) 300:706; Davidow y col., Curr. Genet. (1985) 10:380; Gaillardin y col., Curr. Genet. (1985) 10:49; Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284289; Tilburn y col., Gene (1983) 26:205-221; Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:1470-1474; Kelly y Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479; documentos EP 0 244.234; y WO 91/00357.

Células de insecto. La expresión de genes heterólogos en insectos se lleva a cabo como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.745.051; Friesen y col., “The Regulation of Baculovirus Gene Expression”, en: The Molecular Biology of Baculoviruses (1986) (W. Doerfler, ed.); documentos EP 0 127.839; EP 0 155.476; y Vlak y col., J. Gen. Virol. (1988) 69:765-776; Miller y col., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177; Carbonell y col., Gene (1988) 73:409; Maeda y col., Nature (1985) 315:592-594; Lebacq-Verheyden y col., Mol. Cell. Biol. (1988) 8:3129; Smith y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:8844; Miyajima y col., Gene (1987) 58:273; y Martin y col., DNA (1988) 7:99. Numerosas cepas y variantes baculovirales y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes se describen en Luckow y col., Bio/Technology (1988) 6:47-55, Miller y col., Generic Engineering (1986) 8:277-279, y Maeda y col., Nature (1985) 315:592-594.

Células de mamífero. La expresión en mamífero se lleva a cabo como se describe en Dijkema y col., EMBO J. (1985) 4:761, Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:6777, Boshart y col., Cell (1985) 41:521 y patente de EE.UU. nº 4.399.216. Otras características de la expresión en mamífero se facilitan como se describe en Ham y Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44, Barnes y Sato, Anal. Biochem. (1980) 102:255, patentes de EE.UU. nº 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, documentos WO 90/103430, WO 87/00195 y patente de EE.UU. nº RE 30.985.

Si cualquiera de las células huésped anteriores, u otras células huésped u organismos apropiados, se usan para replicar y/o expresar polinucleótidos o ácidos nucleicos, el ácido nucleico replicado resultante, ARN, proteína expresada o polipéptido se describe en el presente documento como un producto de la célula huésped u organismo. El producto se recupera por cualquier medio apropiado conocido en la técnica.

Una vez se identifica el gen correspondiente a un polinucleótido seleccionado, su expresión puede regularse en la célula para la que el gen es nativo. Por ejemplo, un gen endógeno de una célula puede regularse por una secuencia reguladora exógena insertada en el genoma de la célula en la localización suficiente para al menos potenciar la expresión del gen en la célula. La secuencia reguladora puede diseñarse para integrarse en el genoma mediante recombinación homóloga, como se desvela en las patentes de EE.UU. nº 5.641.670 y 5.733.761, o puede diseñarse para integrarse en el genoma mediante recombinación no homóloga, como se describe en el documento WO 99/15650.

Vectores y células huésped que comprenden polinucleótidos

La memoria descriptiva describe vectores recombinantes y células huésped que comprenden polinucleótidos. En general, los vectores recombinantes y las células huésped se aíslan; sin embargo, una célula huésped que comprende un polinucleótido puede ser parte de un animal genéticamente modificado.

Vectores recombinantes. La presente memoria descriptiva describe vectores recombinantes (“construcciones”) que comprenden un polinucleótido. Los vectores recombinantes incluyen vectores usados para la propagación de un polinucleótido, y vectores de expresión. Vectores útiles para la introducción del polinucleótido incluyen plásmidos y vectores virales, por ejemplo, vectores basados en retrovirus, vectores de adenovirus, etc., que se mantienen transitoriamente o establemente en células de mamífero. Puede emplearse una amplia variedad de vectores para la transfección y/o integración del gen en el genoma de las células. Alternativamente puede emplearse micro-inyección, fusión o similares para la introducción de genes en una célula huésped adecuada.

Los vectores de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes localizados próximos a la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas. Puede estar presente un marcador de selección operativo en la expresión huésped. Los vectores de expresión pueden usarse para la producción de proteínas de fusión, proporcionando al péptido de fusión exógeno funcionalidad adicional, es decir, elevada síntesis de proteínas, estabilidad, reactividad con antisueros definidos, un marcador de enzimas, por ejemplo, galactosidasa, etc.

Pueden prepararse casetes de expresión que comprenden una región de iniciación de la transcripción, el gen o fragmento del mismo, y una región de terminación de la transcripción. Es de particular interés el uso de secuencias que permiten la expresión de epítopes o dominios funcionales, normalmente de al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud, más normalmente de al menos aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, de al menos aproximadamente 25 aminoácidos, de al menos aproximadamente 45 aminoácidos, y hasta el marco de lectura abierto completo del gen. Después de la introducción del ADN, las células que contienen la construcción pueden seleccionarse por medio de un marcador de selección, expandirse las células y luego usarse para la expresión.

Los casetes de expresión pueden introducirse en una variedad de vectores, por ejemplo, plásmido, BAC, YAC, bacteriófago tal como lambda, P1, M13, etc., virus de animal o planta y similares, caracterizándose normalmente los vectores por la capacidad para proporcionar selección de células que comprenden los vectores de expresión. Los vectores pueden proporcionar mantenimiento extracromosómico, particularmente como plásmidos o virus, o integración en el cromosoma huésped. Si se desea mantenimiento extracromosómico, se proporciona una secuencia de origen para la replicación del plásmido, que puede tener bajo o alto número de copias. Está disponible una amplia variedad de marcadores para la selección, particularmente aquellos que protegen contra toxinas, más particularmente contra antibióticos. El marcador particular que se elige está seleccionado según la naturaleza del huésped, pudiendo emplearse en algunos casos complementación con huéspedes auxotróficos. La introducción de la construcción de ADN puede usar cualquier procedimiento conveniente, por ejemplo, conjugación, transformación bacteriana, ADN precipitado con calcio, electroporación, fusión, transfección, infección con vectores virales, biolística, etc.

Células genéticamente modificadas. La presente memoria descriptiva describe células huésped, que pueden ser células huésped aisladas, que comprenden moléculas de ácidos nucleicos de BLyS polimórficas de la invención. Células huésped adecuadas incluyen procariotas tales como E. coli, B. subtilis, eucariotas, que incluyen células de insecto en combinación con vectores de baculovirus, células de levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae, o células de un organismo superior tal como vertebrados, que incluyen anfibios (por ejemplo, ovocitos de Xenopus laevis), y mamíferos, particularmente seres humanos, por ejemplo, células COS, células CHO, células HEK293 y similares, pueden usarse como células huésped. Las células huésped pueden usarse para los fines de propagar una molécula de ácido nucleico de BLyS polimórfica, para la producción de un polipéptido de BLyS polimórfico o procedimientos basados en células para identificar agentes que modulan un nivel de ARNm y/o proteína de BLyS y/o actividad biológica en una célula.

Pueden modificarse células y líneas celulares primarias o clonadas por la introducción de vectores que comprenden un ADN que codifica el (los) polimorfismo(s) de la proteína heteróloga de fusión de ZZ. La molécula de ácido nucleico de BLyS polimórfica aislada puede comprender una o más secuencias de variante, por ejemplo, un haplotipo de combinaciones que se producen comúnmente. Puede proporcionarse un panel de dos o más líneas celulares genéticamente modificadas, comprendiendo cada línea celular un polimorfismo de BLyS, para ensayos de sustrato y/o de expresión. El panel puede comprender además células genéticamente modificadas con otras secuencias genéticas, que incluyen polimorfismos, particularmente otras secuencias de interés para cribado farmacogenético, por ejemplo, otros genes/mutaciones de genes asociados a obesidad, varios de los cuales se conocen en la técnica.

Animales transgénicos. Los ácidos nucleicos objeto pueden usarse para generar animales no humanos genéticamente modificados o modificaciones de genes específicos de sitio en líneas celulares. El término “transgénico” pretende englobar animales genéticamente modificados que tienen la adición de ADN que codifica la proteína de fusión heteróloga de ZZ o que tiene un ADN exógeno que codifica la proteína de fusión heteróloga de ZZ que se transmite establemente en las células huésped. Los animales transgénicos pueden prepararse mediante recombinación homóloga. Alternativamente, una construcción de ácidos nucleicos se integra aleatoriamente en el genoma. Vectores para la integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YAC y similares. De interés son mamíferos transgénicos, por ejemplo vacas, cerdos, cabras, caballos, etc., y particularmente roedores, por ejemplo, ratas, ratones, etc.

Las construcciones de ADN para la recombinación homóloga comprenderán al menos una parte del ADN que codifica la proteína de fusión heteróloga de ZZ e incluirán regiones de homología para el sitio diana. Convenientemente están incluidos marcadores para selección positiva y negativa. Los procedimientos para generar células que tienen modificaciones de genes elegidas como diana mediante recombinación homóloga son conocidos en la técnica. Para diversas técnicas para transfectar células de mamífero, véase Known y col. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537.

Para células madre embrionarias (ES) puede emplearse una línea de células ES, o pueden obtenerse células ES recientes a partir de un huésped, por ejemplo ratón, rata, cobaya, etc. Tales células se cultivan sobre una capa alimentadora de fibroblastos apropiada o se cultivan en presencia de factor inhibidor de leucemia (LIF). Cuando las células ES se han transformado, pueden usarse para producir animales transgénicos. Después de la transformación, las células se siembran sobre una capa alimentadora en un medio apropiado. Pueden detectarse células que contienen la construcción empleando un medio selectivo. Después de un tiempo suficiente para que las colonias crezcan, se recogen y se analizan para la aparición de recombinación homóloga. Aquellas colonias que muestran recombinación homóloga pueden entonces usarse para la manipulación de embriones e inyección de blastocistos. Los blastocistos se obtienen de hembras superovuladas de 4 a 6 semanas de edad. Las células ES se tripsinan, y las células modificadas se inyectan en el blastocele del blastocisto. Después de la inyección, los blastocistos se devuelven a cada trompa uterina de hembras seusopreñadas. Entonces se deja que las hembras lleguen a término y las camadas resultantes se criban para células mutantes que tienen la construcción. La progenie quimérica puede detectarse fácilmente proporcionando un fenotipo diferente del blastocisto y las células ES. Los animales quiméricos se criban para la presencia de ADN que codifica la proteína de fusión heteróloga de ZZ y los machos y hembras que tienen la modificación se aparean para producir progenie homocigótica. Los animales transgénicos pueden ser cualquier mamífero no humano, tal como animales de laboratorio, animales domésticos, etc. Los animales transgénicos pueden usarse para determinar el efecto de un fármaco candidato en un entorno in vivo.

Producción de proteínas hetero-triméricas usando construcciones de ZZ

La presente invención es un procedimiento de preparación de una proteína hetero-trimérica soluble como se define en las reivindicaciones, cultivando una primera célula huésped transformada o transfectada con un primer vector de expresión que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio ZZ y una primera proteína heteróloga, cultivando una segunda célula huésped transformada o transfectada con un segundo vector de expresión que codifica un segundo dominio ZZ y una segunda proteína heteróloga, y cultivando una tercera célula huésped transformada o transfectada con un tercer vector de expresión que codifica un tercer dominio ZZ y una tercera proteína heteróloga. Con el fin de producir una proteína biológicamente funcional, los tres dominios ZZ forman preferencialmente un hetero-trímero. El cultivo también puede producirse en la misma célula huésped, si puede mantenerse la producción eficiente, y las proteínas hetero-triméricas se aíslan entonces del medio. Idealmente, las tres proteínas heterólogas se marcan diferencialmente con diversas secuencias de marca (es decir, marca de His, marca FLAG y marca de Glu-Glu) para permitir el análisis de la composición o purificación de las moléculas resultantes. Alternativamente, los tres componentes pueden producirse por separado y combinarse en relaciones intencionadas para producir las moléculas hetero-triméricas deseadas. Los dominios ZZ usados en la preparación de estas moléculas hetero-triméricas pueden ser iguales o diferentes. La(s) proteína(s) de fusión comprende(n) además una secuencia de adaptador. En una realización particular, las dos proteínas heterólogas usadas para formar la proteína hetero-trimérica son los dominios solubles de APRIL (un ligando de proliferación de linfocitos) y BLyS (estimulante de linfocitos B).

Actividad biológica de las proteínas de fusión heterólogas de ZZ

La actividad biológica de las proteínas de fusión heterólogas de ZZ recombinantes está mediada por la unión de la proteína de fusión recombinante a una molécula afín, tal como un receptor. Una molécula afín se define como una molécula que une la proteína de fusión recombinante en una interacción no covalente basándose en la conformación apropiada de la proteína de fusión recombinante y la molécula afín. Por ejemplo, para una proteína de fusión recombinante que comprende una región extracelular de un receptor, la molécula afín comprende un ligando que une la región extracelular del receptor. En cambio, para una proteína de fusión soluble recombinante que comprende un ligando, la molécula afín comprende un receptor (o proteína de unión) que se une al ligando.

La unión de una proteína de fusión recombinante con una molécula afín es un marcador para actividad biológica. Tal actividad de unión puede determinarse, por ejemplo, por competición para unirse al dominio de unión de la molécula afín (es decir, ensayos de unión competitiva). Una configuración de un ensayo de unión competitiva para una proteína de fusión recombinante que comprende un ligando usa un receptor soluble radiomarcado y células intactas que expresan una forma nativa del ligando. Similarmente, un ensayo competitivo para una proteína de fusión recombinante que comprende un receptor usa un ligando soluble radiomarcado y células intactas que expresan una forma nativa del receptor. Un ensayo tal se describe en el Ejemplo 5. En lugar de células intactas que expresan una forma nativa de la molécula afín, podría sustituirse la molécula afín purificada unida a una fase sólida. Los ensayos de unión competitiva pueden realizarse usando metodología convencional. Pueden obtenerse resultados cualitativos o semi-cuantitativos por ensayos de unión en placa autorradiográfica competitivos, o citometría de flujo activada por fluorescencia, o pueden usarse representaciones de Scatchard para generar resultados cuantitativos.

La actividad biológica también puede medirse usando bioensayos que se conocen en la técnica, tal como un ensayo de proliferación celular. Bioensayos a modo de ejemplo se describen en los Ejemplos 5 y 6 en el presente documento. El tipo de ensayo de proliferación celular usado dependerá de la proteína de fusión soluble recombinante. Un bioensayo para una proteína de fusión soluble recombinante que en su forma nativa actúa sobre linfocitos T usará linfocitos T purificados obtenidos mediante procedimientos que se conocen en la técnica. Tales bioensayos incluyen ensayos de co-estimulación en los que los linfocitos T purificados se incuban en presencia de la proteína de fusión soluble recombinante y un nivel inferior al óptimo de un mitógeno tal como Con A o PHA. Similarmente, se usarán linfocitos B purificados para una proteína de fusión soluble recombinante que en su forma nativa actúa sobre linfocitos B. También pueden seleccionarse otros tipos de células basándose en el tipo de célula sobre el que actúa la forma nativa de la proteína de fusión soluble recombinante. La proliferación se determina midiendo la incorporación de una sustancia radiomarcada, tal como 3Htimidina, según procedimientos convencionales.

Todavía otro ensayo tipo para determinar la actividad biológica es la inducción de secreción de moléculas secundarias. Por ejemplo, ciertas proteínas inducen la secreción de citocinas por linfocitos T. Los linfocitos T se purifican y se estimulan con una proteína de fusión soluble recombinante en las condiciones requeridas para inducir la secreción de citocinas (por ejemplo, en presencia de un co-mitógeno). La inducción de la secreción de citocinas se determina por bioensayo, midiendo la proliferación de una línea celular dependiente de citocina. Similarmente, la inducción de la secreción de inmunoglobulinas se determina midiendo la cantidad de inmunoglobulina secretada por linfocitos B purificados estimulados con una proteína de fusión soluble recombinante que actúa sobre los linfocitos B en su forma nativa, usando un ensayo cuantitativo (o semi-cuantitativo) tal como un inmunoensayo enzimático.

Procedimientos de tratamiento

Para uso farmacéutico, las proteínas de fusión descritas en el presente documento se formulan para administración parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, según procedimientos convencionales. La administración intravenosa será mediante inyección en bolo o infusión durante un periodo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína de fusión heteróloga de ZZ en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina, solución salina tamponada, 5 % de dextrosa en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamiento, albúmina para prevenir la pérdida de proteína sobre las superficies del vial, etc. Los procedimientos de formulación son muy conocidos en la técnica y se desvelan, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, que se incorpora en el presente documento por referencia. Las dosis terapéuticas estarán generalmente en el intervalo de 0,1 a 100 μg/kg de peso de paciente por día, preferentemente 0,5-20 μg/kg por día, siendo la dosis exacta determinada por el profesional clínico según patrones aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad de la afección que va a tratarse, rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del experto habitual en la técnica. Las proteínas pueden administrarse para tratamiento agudo, durante una semana o menos frecuentemente, durante un periodo de uno a tres días, o pueden usarse en tratamiento crónico, durante varios meses o años. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína de fusión heteróloga de ZZ es una cantidad suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en los síntomas característicos de la falta de función de proteína heteróloga. Alternativamente, si la proteína de fusión heteróloga de ZZ es para actuar de antagonista, una cantidad terapéuticamente eficaz es la que produce un cambio clínicamente significativo en síntomas característicos de una sobreabundancia de la función de proteína heteróloga.

5 Eliminación enzimática del dominio ZZ

Dependiendo del uso previsto de la proteína de fusión heteróloga de ZZ, puede ser ventajoso eliminar el dominio ZZ después de la producción de la proteína, pero antes del uso final de la proteína. La eliminación de este dominio puede llevarse a cabo usando proteasas muy conocidas para un experto habitual. La secuencia diana específica para la escisión por diversas proteasas es muy conocida, y tales secuencias pueden estar presentes en la propia secuencia de 10 ZymoZipper naturalmente o por ingeniería genética. Preferentemente, con el fin de evitar cambios en la función multimerizante del dominio ZZ, la secuencia diana puede encontrarse o manipularse en otra porción de la proteína de fusión, tal como la región de adaptador. Algunas enzimas apropiadas para este procedimiento de eliminación incluyen, pero no se limitan a tripsina, Lys C, Lys N, Arg C, Asp N, Glu C (condiciones de bicarbonato o fosfato), quimiotripsina, pepsina (a diversos intervalos de pH), proteinasa K y papaína. También pueden usarse combinaciones de estas enzimas,

15 si fuera necesario, para optimizar la eliminación del dominio ZZ de la proteína de fusión final producida.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan de manera que se provea a aquellos expertos habituales en la técnica de una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden representar que los experimentos más adelante son todos

20 o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero debe contarse con algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio en peso, temperatura es en grados Celsius, y presión es atmosférica o próxima a atmosférica.

EJEMPLO 1: SELECCIÓN DE SECUENCIAS DE ZZ CANDIDATAS

25 Se obtuvo una serie de secuencias de env retrovirales por la Herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales (BLAST; Centro nacional para información biotecnológica (NCBI)) usando la subunidad TM de la envuelta de la leucemia murina de Moloney como secuencia de búsqueda. Este programa encuentra regiones de similitud local entre secuencias y calcula la significancia estadística de las coincidencias. BLAST puede usarse para deducir la función y relación evolucionaria entre secuencias, además de ayudar a identificar miembros de familias de genes. Las secuencias

30 resultantes se dispusieron en un árbol genómico y se seleccionaron seis secuencias de diferentes agrupaciones dentro del conjunto para maximizar la diversidad de las secuencias de héptadas ensayadas. Se eligieron las secuencias de repetición de héptada mostradas en la Tabla 2 y se usaron para preparar proteínas de fusión con una proteína candidata.

Tabla 2 (continuación)

Componente de la héptada

fg abcdefg abcdefg abcdefg abcdefg abcde

ZZ03 (SEC ID Nº: 27)

KE LREVEKS IENLNKK MEDGFLD VLQNRRG -----

ZZ07 (SEC ID Nº: 28)

DD LREVEKS ISNLEKS LTSLSEV VLQNRRG LDLLF

ZZ09 SEC ID Nº: 29)

DD LGALEKS VSALEKS LTSLSEV VLQNRRG LDLLF

ZZ10 (SEC ID Nº: 30)

AD VQRLQQG VDDLSDS LSSLAEV VLQNRRG LDLLF

Componente de la héptada

fg abcdefg abcdefg abcdefg abcdefg abcde

ZZ11 (SEC ID Nº: 31)

NG FRKMSQT MLTIQKQ IDSLAAV VLQNRRG LDVLT

ZZ12 (SEC ID Nº: 32)

SD VQAISSTI QDLQDQ VDSLAEV VLQNRRG LDLLT

Debido a las dificultades en la producción de APRIL biológicamente activo, esta proteína se seleccionó para producir una proteína de fusión. Las proteínas se manipularon para incluir un péptido señal, un marca Flag, la secuencia de ZZ, un adaptador y los aminoácidos 110-250 de APRIL.

5 EJEMPLO 2: CONSTRUCCIÓN DE VECTORES DE EXPRESIÓN DE ZZ

Cebadores para cada una de las construcciones de ZZ se organizaron del siguiente modo: dos mitades, delantera (D) y trasera (T), cada mitad compuesta por dos cebadores, 5' y 3'. Las mitades D y F se ensamblaron a partir de sus cebadores de 5' y 3' respectivos por PCR como se describe más adelante y se desvela en la Tabla 3, luego se ensamblaron alícuotas de D y T para cada ZZ en cada secuencia de ZZ completa por PCR de solapamiento con los 10 cebadores zc49141 y zc49142. Las condiciones de PCR fueron del siguiente modo: 1 ciclo, 94 ºC, 2 minutos; 35 ciclos, 94 ºC, 30 segundos, seguido de 55 ºC, 30 segundos, seguido de 72 ºC, 30 segundos; 1 ciclo, 72 ºC, 5 minutos. El diez por ciento de cada una de las mezclas de reacción de PCR se ejecutaron sobre un 1,8 % de gel de agarosa para análisis. La porción restante de los fragmentos de PCR se precipitó mediante la adición de 10 μl de acetato de Na 3 M y 250 μl de etanol, se centrifugó a 13.000 x g durante 30 minutos, el sedimento se aclaró una vez con 70 % de etanol y se dejó secar

15 al aire. Los sedimentos se resuspendieron en 10 μl de agua destilada.

Estas PCR produjeron una serie de productos (228-246 pb) constituidos por cada secuencia de ZZ (ZZ3, ZZ7, ZZ9, ZZ10, ZZ11, ZZ12) con 40 pb de secuencia flanqueante en cualquier extremo para promover la recombinación homóloga en el sitio apropiado en el extremo amino de APRIL. Éstas se insertaron en un vector de expresión constituido por pZMP21 con APRIL [res nº 110-250], el conductor de tPA optimizado, y una secuencia que confiere propiedades trimerizantes. El vector

20 p2MP21 es un vector de expresión de mamífero descrito en la publicación de patente nº US2003/023414 A1 y depositado en la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (designado ATCC nº PTA-5266). El vector APRIL se linealizó en un único sitio Bgl II en el sitio previsto de recombinación y la secuencia trimerizante se sustituyó por secuencias de ZZ usando recombinación homóloga en Saccharomyces cerevisiae.

La recombinación se realizó del siguiente modo: 100 μl de células de levadura competentes (S. cerevisiae) se combinaron

25 con 10 μl de la mezcla de producto de PCR y el vector linealizado se transfirió luego a una cubera de electroporación de 0,2 cm. Las mezclas de levadura/ADN se electropulsaron a 0,75 kV (5 kV/cm), o ohm ios, 25 μF. A cada cubeta se añadieron 600 μl de sorbitol 1,2 M y la levadura se sembró en dos alícuotas de 300 μl sobre dos placas URA-D y se incubaron a 30 ºC. Esto se hizo para cada secuencia de ZZ y con vector linealizado solo. Después de aproximadamente 48 horas, las colonas se evaluaron contra el control de vector solo y los transformantes de levadura URA+ de placas

30 positivas correspondientes a cada secuencia de ZZ se resuspendieron en 1 ml de H2O y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células de levadura. El sedimento de células se resuspendió en 1 ml de tampón Qiagen P1. Se añadieron quinientos microlitros de cada mezcla a un tubo Eppendorf que contenía 300 μl de perlas de vidrio lavadas con ácido, se removieron con vórtex dos o tres veces durante intervalos de 1 minuto, seguido de una centrifugación de 15 segundos en una centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Se transfirieron trescientos microlitros de lisado de levadura a

35 un tubo fresco, y a partir de ese momento se siguió el procedimiento del fabricante para Qiagen miniprep. El eluato de las columnas QiaPrep se precipitó mediante la adición de 0,1 volúmenes de NaAc 3 M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto y el sedimento de ADN se resuspendió en 10 μl de H2O.

La transformación de células de E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) se hizo con 0,5-2 μl de preparación de ADN de levadura y 40 μl de células DH10B. Las células se electropulsaron a 1,7 kV, 25 μF y 400 ohmios. Tras la

40 electroporación, 1 ml de SOC (2 % de Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5 % de extracto de levadura (Difco), NaCl 10 mM, KCI 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM) se sembró en alícuotas de 250 μl sobre cuatro placas LB AMP (caldo LB (Lennox), 1,8 % de Bacto Agar (Difco), 100 mg/l de ampicilina). Cada construcción completada se sometió a análisis de secuencias y la construcción que contenía la secuencia correcta se seleccionó para ampliación por el kit QIAGEN Plasmid Mega.

Tabla 3: Secuencias de cebadores

oligo

nombre Secuencia

zc49141

5' todo

zc49142

3' todo

zc49317

ZZ3 F5'

zc49363

ZZ3 F3'

zc49244

ZZ3 B5'

zc49310

ZZ3 B3'

zc49169

ZZ7 F5'

zc49170

ZZ7 F3'

zc49171

ZZ7 B5'

zc49172

ZZ7 B3'

zc49223

ZZ9 F5'

zc49224

ZZ9 F3'

zc49225

ZZ9 B5'

zc49226

ZZ9 B3'

zc49227

ZZ10 F5'

zc49228

ZZ10 F3'

(continuación)

oligo

nombre Secuencia

zc49229

ZZ10 B5'

zc49230

ZZ10 B3'

zc49231

ZZ11 F5'

zc49232

ZZ11 F3'

zc49233

ZZ11 B5'

zc49234

ZZ11 B3'

zc49235

ZZ12 F5'

zc49236

ZZ12 F3'

zc49237

ZZ12 B5'

zc49238

ZZ12 B3'

EJEMPLO 3: EXPRESIÓN DEL PANEL DE ZZ-APRIL EN CÉLULAS 293F Y CHO Y PURIFICACIÓN

5 Expresión transitoria en células 293F

Las construcciones de ZZ-APRIL se expresaron primero transitoriamente en células 293F, así la proteína podría producirse para probar la actividad biológica. La expresión transitoria se logró usando un procedimiento de alta resolución que alcanza los siguientes parámetros de reactivo: relación de lípido/ADN de 1,33 mg/mg; ADN por transfección de 1500 μg; volumen de transfección total de 1500 ml; lípido por transfección de 2000 μl; número de transfecciones de 15;

10 OpitMEM por transfección de 40 ml.

El protocolo de transfección fue el siguiente: 1000 ml de células 293F se sembraron en un matraz de centrífuga de 3 l a 435 cm3/ml durante 72 h antes de la transfección. Las células se cultivaron en una estufa de incubación de cabina telefónica a 37 ºC, 6 % de CO2, a 95 rpm. Las células se diluyeron entonces a 136 cm3/ml en 1500 ml inmediatamente antes de la transfección. El complejo de ADN/lípido se preparó diluyendo 2 ml de lipofectamina 2000 en 20 ml de

15 OptiMEM (Invitrogen (Gibco), Carlsbad, CA). A continuación, 1,5 mg de ADN de la construcción de ZZ se diluyeron en 20 ml de OptiMEM. Estas dos disoluciones se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se combinan y se incuban durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, invirtiendo ocasionalmente. La mezcla de ADN/lípido se añade entonces al matriz de la centrífuga. Las células transfectadas se incuban en una estufa de incubación de cabina telefónica a 37 ºC, 6 % de CO2, a 75 rpm. El sobrenadante se recoge 96 horas después de la transfección.

Expresión en células CHO

1,5 mg de las construcciones de ZZ se digirieron cada una usando diversas enzimas de restricción a 37 ºC durante tres horas y luego se precipitaron con IPA y se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El sobrenadante se separó por decantación del sedimento, y el sedimento se lavó con 1 ml de 70 % de etanol y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo se centrifugó en una microcentrífuga durante 10 minutos a 14.000 rpm y el sobrenadante se separó por decantación del sedimento. El sedimento se resuspendió entonces en 750 μl de medio PF-CHO en un entorno estéril, se dejó incubar a 60 ºC durante 30 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Células 5E6 APFDXB11 se centrifugaron en un tubo cónico de 15 ml para cada construcción de ZZ y se resuspendieron usando la disolución de medio de ADN. Las mezclas de ADN/célula se dispusieron en una cubeta de ranura de 0,4 cm y se sometieron a electroporación usando los siguientes parámetros: 950 μF, alta capacitancia, y 300 V. Entonces se sacó el contenido de las cubetas y se diluyó a 25 ml con medio PF-CHO y se dispuso en un matraz con agitación de 125 ml. El matraz se dispuso en una estufa de incubación sobre un agitador a 37 ºC, 6 % de CO2 y agitación a 120 rpm.

Las líneas celulares se sometieron a selección con nutriente, seguido de amplificación en metrotrexato 500 nM (MTX). La expresión se confirmó por transferencia Western, y la línea celular se amplió y siguió la purificación de proteínas.

Esquema de purificación para ZZ-APRIL-NF

Todos los procedimientos se realizaron a 4 ºC, a menos que se indique lo contrario. Los medios acondicionados producidos a partir de tanto la expresión transitoria de células 293F como la expresión de células CHO se cargaron directamente sobre una columna de hidroxiapatita 80 uM BIO-RAD Macro-Prep Ceramic. La columna se lavó con PO4 0,2 M, pH 6,8 y se eluyó con un gradiente de 10 VC de PO4 0,2 M, pH 6,8 a PO4 0,4 M, pH 6,8. La etapa de elución se realizó a temperatura ambiente.

Se realizaron geles NuPAGE (teñidos con Coomassie), Western y RP-HPLC para analizar la elución. Las fracciones de interés se reunieron y se purificaron adicionalmente sobre una columna de afinidad anti-FLAG M2 (Kodak). Para algunas proteínas de fusión, esta etapa se realiza mejor usando una columna de cationes. La columna se equilibró y se lavó con PBS, pH 7,3. La columna se eluyó entonces con PO4 10 mM, citrato 40 mM, AmSO4 100 mM, pH 3,0. Las fracciones se neutralizaron con Tris 2 M, pH 8,0.

El conjunto anti-FLAG (o conjunto de la columna de cationes) se concentró usando un dispositivo centrífugo Amicon Ultra, MWCO 30.000, y se cargó sobre una Superdex 200 equilibrada (GE Healthcare). El tampón usado fue PO4 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,8.

Las fracciones se reunieron basándose en los resultados de los geles NuPAGE (teñidos con Coomassie), Western y RP-HPLC.

Se realizaron Western y geles NuPAGE teñidos con Coomassie sobre el conjunto para confirmar la pureza y el contenido. Para análisis adicional, la proteína se sometió a AAA, secuenciación del extremo N y SEC-MALS, confirmando la identidad de la proteína como ZZ-APRIL del extremo N.

Las secuencias de ADN para ZZ7-APRIL, ZZ9-APRIL, ZZ10-APRIL, ZZ11-APRIL y ZZ12-APRIL son SEC ID Nº: 43, 46, 49, 52 y 55, respectivamente. Las secuencias de proteína para ZZ3-APRIL, ZZ7-APRIL, ZZ9-APRIL, ZZ10-APRIL, ZZ11-APRIL y ZZ12-APRIL son SEC ID Nº: 41, 44, 47, 50, 53 y 56, respectivamente. Las secuencias de ADN consenso para ZZ3-APRIL, ZZ7-APRIL, ZZ9-APRIL, ZZ10-APRIL, ZZ11-APRIL y ZZ12-APRIL son SEC ID Nº: 42, 45, 48, 51, 54 y 57, respectivamente.

EJEMPLO 4: ENSAYO DE PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS B USANDO BLYS

Un vial que contiene 1 x 108 células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aferesadas congeladas se descongeló rápidamente en baño de agua a 37 ºC y se resuspendieron en 25 ml de medio de linfocitos B (medio RPMI-1640, 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor, 5 % de L-glutamina, 5 % de pen/estrep) en un tubo de 50 ml. Las células se probaron para viabilidad usando azul de tripano (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Los linfocitos B CD19+ se aislaron entonces por selección positiva usando microperlas recubiertas de anti-CD 19 (Miltenyi Biotech). Las células recubiertas se aislaron entonces sobre una columna MACS LS (Miltenyi Biotech). Los linfocitos B se resuspendieron a una concentración final de 1,6 x 106 células/ml en medio de linfocitos B y se sembraron a 100 μl/pocillo en una placa de fondo en U de 96 pocillos (Falcon, VWR, Seattle, WA).

Diversas ZZ-APRIL solubles como se han preparado en el Ejemplo 3 o BLyS se añadieron a las células en diluciones de 3 veces de 1000 ng/ml a 0 ng/ml. El volumen final fue 200 μl/pocillo.

Las células se incubaron entonces a 37 ºC en una estufa de incubación humidificada durante 72 horas. Dieciséis horas antes de la recogida se añadió 1 μCi de 3H-timidina a todos los pocillos. Las células se recogieron en una placa de filtro de 96 pocillos (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) en la que se recogieron usando un colector de células (Packard) y se recogieron según instrucciones del fabricante. Las placas se secaron a 55 ºC durante 20-30 minutos y el fondo de los pocillos se tapó con un sellante de placas opaco. A cada pocillo se añadieron 0,25 ml de fluido de centelleo (Microscint-O,

5 Packard) y la placa se leyó usando un contador de centelleo de microplacas TopCount (Packard).

Los resultados del ensayo de proliferación se informan en la Figura 3.

Este ensayo también se usó para comparar la función biológica de una construcción de ZZ-APRIL con diversos APRIL comercialmente disponibles (Alexis APRIL y R&D APRIL). Como puede apreciarse en la Figura 5, ZZ-APRIL imitó mejor el control positivo de BLyS que cualquiera de las fuentes comercialmente disponibles.

10 EJEMPLO 5: BIOENSAYO DE CÉLULAS JURKAT TRANSFECTADAS CON TACI

El bioensayo in vitro de TACI usa una línea de células Jurkat (linfocito de linfocitos T agudo humano, KZ142, clon nº 24) que se ha transfectado con dos plásmidos. Primero, la línea celular se transfectó con un plásmido que contenía un gen indicador de luciferasa bajo el control del promotor NF-K�AP -1 y un gen de resistencia a neomicina. Se eligió un clon apropiado después de la selección con G418. Esta línea celular se transfectó entonces con un plásmido que contenía el

15 ADNc de TACI de longitud completa bajo el control del promotor del CMV (TACI/pZP7P) y un gen resistente a puromicina. Los clones se seleccionaron con puromicina y luego se eligió una línea celular apropiada para el ensayo evaluando la expresión de TACI por citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales para TACI.

El ensayo se basa en registrar la lectura de la expresión génica de luciferasa que es desencadenada por la unión del ligando de prueba (ZZ-APRIL) a TACI de la superficie celular producido a partir del ADNC de TACI.

20 Las células de Jurkat transfectadas se propagaron en medio RPMI 1640 sin rojo de fenol (Rosewell Park Memorial Institute, Buffalo, NY) con 10 % de SBF añadido. Se añadió puromicina a 2 μg/ml como reactivo selectivo para la transfección. También se añadieron piruvato de sodio y L-glutamina a los medios al 1 % de volumen.

Se usaron el sustrato del sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo (Promega, Madison, WI #E2510) y tampón de ensayo según instrucciones del fabricante.

25 El ensayo se realizó resuspendiendo células de Jurkat transfectadas en medio a 1,6 x 106 célula/ml. Las células se siembran sobre una placa de ensayo blanca con 50 μl por pocillo. Las muestras de ZZ-APRIL se llevaron a dilución apropiada y se dispusieron en una placa de 96 pocillos. Se añadieron diluciones a las células, a 50 μl por pocillo. La placa se incluyó 4 h en una estufa de incubación a 37 ºC. Durante la incubación, el tampón Steady-GLO y el sustrato se equilibraron a temperatura ambiente. Después de la incubación de 4 h, la placa se dejó enfriar a temperatura ambiente

30 durante 5 minutos. Se mezclaron tampón de ensayo y sustrato juntos y se añadieron a 100 μl por pocillo. Las placas se agitaron con vórtex a ajuste bajo durante 1 minuto para la mezcla, luego se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La placa se leyó luego en un luminómetro con integración de 5 segundos.

Los resultados del bioensayo de células de Jurkat se informan en la Figura 2.

EJEMPLO 6: OPTIMIZACIÓN DE SECUENCIAS DE ADAPTADOR PARA ZZ12

35 Basándose en los resultados del ensayo de proliferación de linfocitos B y el bioensayo de células de Jurkat, la construcción de ZZ12 se seleccionó para optimización usando secuencias de adaptador. Se probaron diversas longitudes de adaptador en combinación con la construcción de ZZ12 para actividad biológica óptima usando los bioensayos descritos en los Ejemplos 4 y 5. La Tabla 4 desvela las secuencias de adaptador probadas. Los resultados del ensayo de proliferación de linfocitos B sobre construcciones de ZZ12-APRIL optimizadas para adaptador seleccionadas se informan

40 en la Figura 3. Los resultados del bioensayo de TACI-Jurkat de estas mismas construcciones se informan en la Figura 4.

Tabla 4 (continuación)

abcde

fgabcd

ZZ12.1 (SEC ID Nº: 33)

LDLLT GDL --APRIL[110-250]

ZZ12.2 (SEC ID Nº: 34)

LDLLT GSGDL --APRIL[110-250]

abcde

fgabcd

ZZ12.3 (SEC ID Nº: 35)

LDLLT L --APRIL[110-250]

ZZ12.4 (SEC ID Nº: 36)

LDLLT GD --APRIL[110-250]

ZZ12.5 (SEC ID Nº: 37)

LDLLT GERSL --APRIL[110-250]

ZZ12.6 (SEC ID Nº: 38)

LDLLT RSGGGS --APRIL[110-250]

EJEMPLO 7: ELIMINACIÓN ENZIMÁTICA DEL DOMINIO DE CREMALLERA

Con el fin de verificar que la presencia del dominio de cremallera del extremo amino no altera las propiedades funcionales

5 y biológicas de APRIL, se usó tripsina para eliminar enzimáticamente el dominio ZZ12.6 de la proteína de fusión de ZymoZipper 12.6-April marcada con Flag en el extremo N (NF-ZZ12-6-APRIL). El homotrímero de APRIL es inesperadamente resistente a la escisión con tripsina. Adicionalmente, dos sitios de escisión con tripsina estrechamente separados están localizados en la unión entre el dominio de cremallera y el dominio de APRIL. Estos sitios son accesibles a tripsina y APRIL sin que la cremallera ZZ12.6 pueda obtenerse fácilmente usando el siguiente procedimiento:

10 Aproximadamente 24 mg de NF-ZZ12.6-APRIL a 1,2 mg/ml en NaPO4 50 mM, NaCl 250 mM, EDTA 2 mM a pH 7,2 se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC en presencia de una relación de masa 1:100 de tripsina (grado de secuenciación, porcina, Promega). La reacción se inactivó con la adición de 5 ml de 2,5 mg/ml de inhibidor de tripsina AEBSF (Roche) en una disolución de PBS similar.

APRIL escindido sin el dominio ZZ12.6 se separó de especies sin reaccionar usando cromatografía en heparina. La

15 disolución de reacción se diluyó a NaCl 150 mM usando 17 ml de agua fría. La disolución diluida se cargó sobre una columna AF-Heparin 650-M de 3,4 ml (Toso Bioscience). El flujo continuo recogido se analizó por cromatografía en columna de heparina analítica y SDS-PAGE para confirmar que todas las especies moleculares que contenían APRIL se unieron a la columna de heparina preparativa. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de NaPO4 50 mM, NaCl 150 mM, 1 mg/ml de AEBSF a pH 7,0 y luego se eluyó usando un gradiente de 10 volúmenes de columna de NaCl 150

20 mM a NaCl 1 M en NaPO4 50 mM a pH 7,0, que contenía 1 mg/ml de AEBSF, seguido de una etapa de elución con NaCl 2 M. La elución de la proteína de la columna se monitorizó usando la absorbancia de la disolución a 280 nm (A280nm). Adicionalmente, fracciones que incluían las muestras de carga y de flujo continuo se analizaron por SDS-PAGE. Se eluyeron dos picos, el primero correspondiente a NF-ZZ12.6-APRIL intacto, mientras que el segundo pico de elución posterior se correspondió con APRIL sin el dominio ZZ12.6. La proteína en el segundo pico (conjunto de eluato de

25 heparina) se procesó adicionalmente.

El conjunto de eluato de heparina que contenía APRIL sin el dominio ZZ12.6 se concentró a un volumen de < 3 ml usando una membrana de centrífuga Ultracel de 10 kD de MWCO (Millipore) y se purificó adicionalmente usando cromatografía de exclusión por tamaño sobre una columna Superdex 200 16/60 (GE Healthcare) con una elución isocrática usando NaPO4 50 mM a pH 7,2, NaCl 250 mM. Las fracciones de eluato se analizaron por SDS-PAGE. Se observó una pequeña

30 cantidad de material agregado en la traza de A280 nm. Este material agregado no se incluyó en el eluato reunido (conjunto de eluato de Superdex 200).

El conjunto de eluato de Superdex 200 se purificó adicionalmente usando 1 m de resina de afinidad (resina de agarosa anti-FLAG M2: Sigma) con una incubación durante la noche a 4 ºC. La resina de afinidad une el extremo amino de la marca de epítope FLAG (NF) a ZZ12.6 en la molécula de NF-ZZ12.6-APRIL, y se usó para eliminar cualquier NF-ZZ12.6

35 APRIL sin escindir contaminante restante. APRIL sin el dominio ZZ-12.6 se separó de la resina de afinidad usando una unidad de filtración de 0,22om (Millipore), se concentró a aproximadamente 1 mg/ml basándose en cálculos estimados de la concentración de heparina analítica usando una membrana centrífuga de 5 kD de MWCO (Millipore), se tomaron alícuotas y se guardó a -80 ºC.

APRIL sin el dominio ZZ12.6 se caracterizó usando cromatografía de exclusión por tamaño analítica con detección por 40 dispersión de la luz de ángulo múltiple y demostró la forma trimérica esperada. La secuenciación del extremo amino verificó la escisión en dos de los posibles sitios de tripsina: R83 y K90, en una relación de aproximadamente 2:1. La afinidad de APRIL por Atacicept (TACI-Ig) como se mide usando un instrumento Biacore fue la misma para ambas formas moleculares de APRIL (con y sin ZZ12.6). Adicionalmente, ambas formas de APRIL mostraron actividad comparable en el bioensayo de TACI-Jurkat definido.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Moore, Margaret D. Fox, Brian A.

<120> POLIPÉPTIDOS TRIMERIZANTES

<130> 05-19PC

<150> 60/715.883

<151> 09/09/2005

<160> 58

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 1 agccaggaaa tccatgccga gttgagacgc ttccgtagag attataagga cgatgacgat 60

<210> 2

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 2 ggtggcgtta atgggaacca ggtgcaggac agagtgctgc ttcttctgtt tcagatctcc 60

<210> 3

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 3 gattataagg acgatgacga taagggcgga ggtggctcaa aggagtttaa caac 54

<210> 4

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 4 catcttcttg ttcaggttct cgatgcggcg ctccaggttg ttaaactcct ttgagcc 57

<210> 5

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 5 gagaacctga acaagaagat ggaggacggt tttctggacg tgtggaccta c 51

<210> 6

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 6 cttcttctgt ttcagatctc cctcggcgtt gtaggtccac acgtccagaa a 51

<210> 7

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 7 gattataagg acgatgacga taagggcgga ggtggctcag atgatctgcg cgaggtg

<210> 8

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 8

ggtcagggac ttctccagat tggagatgga cttctccacc tcgcgcagat catctga

57

<210> 9

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 9

aatctggaga agtccctgac ctccctgtcc gaggtggtgc tccagaaccg ccgcggc

57

<210> 10

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 10

cttcttctgt ttcagatctc cgaacagcag gtccaggccg cggcggttct ggagcac

57

<210> 11

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 11

gattataagg acgatgacga taagggcgga ggtggctcag atgatctggg cgccctg

57

<210> 12

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 12

ggtcagggac ttctccaggg cggacacgga tttttccagg gcgcccagat catctga

57

<210> 13

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 13

gccctggaga agtccctgac ctccctttcc gaggtcgtcc tgcagaaccg ccgcggc

57

<210> 14

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 14

cttcttctgt ttcagatctc caaaaagaag gtcaaggccg cggcggttct gcaggac

57

<210> 15

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 15

gattataagg acgatgacga taagggcgga ggtggctcag ccgacgtcca gcgcctc

57

<210> 16

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 16

ggaaagggag tcggaaagat catcgacgcc ctgctggagg cgctggacgt cggc

54

<210> 17

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 17

gatctttccg actccctttc ctccctcgcc gaggtggtgc tgcagaatcg ccgcggc

57

<210> 18

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 18

cttcttctgt ttcagatctc cgaaaagaag atcaaggccg cggcgattct gcagcac

57

<210> 19

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 19

gattataagg acgatgacga taagggcgga ggtggctcaa atggctttcg caagatg

57

<210> 20

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 20

atcgatctgt ttctggatcg taagcatggt ctgggacatc ttgcgaaagc catttga

57

<210> 21

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 21

acgatccaga aacagatcga ttcccttgcc gccgtggtgc ttcagaatcg ccgcggc

57

<210> 22

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 22

cttcttctgt ttcagatctc ccgtgaggac gtcgaggccg cggcgattct gaagcac

57

<210> 23

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 23

gattataagg acgatgacga taagggcgga ggtggctcat ccgacgtcca ggcgatc

57

<210> 24

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 24

gtcgacctgg tcctgaaggt cctggatggt ggaggagatc gcctggacgt cggatga

57

<210> 25

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 25

gaccttcagg accaggtcga ctccctggcg gaggtggtgc tgcagaatcg ccgcggc

57

<210> 26

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 26

cttcttctgt ttcagatctc ccgtaagaag gtcaaggccg cggcgattct gcagcac

57

<210> 27

10

<211> 30

<212> PRT

<213> gripe A

<400> 27

15 <210> 28

<211> 35

<212> PRT

<213> Virus de la leucemia murina de Moloney

<400> 28

<210> 29

<211> 35

<212> PRT

<213> Mus musculus 25 <400> 29

<210> 30

<211> 35

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

<210> 31

<211> 35

<212> PRT

<213> Rat norvegicus

<400> 31

10 <210> 32

<211> 35

<212> PRT

<213> Virus Mason-Pfizer del mono

<400> 32

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20 <220>

<223> Héptada final más adaptador

<400> 33

<210> 34 25 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Héptada final más adaptador

<400> 34

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Héptada final más adaptador

<400> 35

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Héptada final más adaptador

<400> 36

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Héptada final más adaptador

<400> 37

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Héptada final más adaptador

<400> 38

<210> 39

<211> 105 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> conductor de tPA optimizado

<220> 10 <221> CDS

<222> (1)...(105)

<400> 39

<210> 40 15 <211> 35

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia conductora de tPA optimizada 20 <400> 40

<210> 41

<211> 222

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ3-APRIL

<400> 41

<210> 42 5 <211> 666

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Consenso de ZZ3-APRIL 10 <220>

<221> misc_feature

<222> 9, 18, 21, 24, 33, 36, 39, 42, 48, 51, 54, 60, 63, 66, 69, 84, 90, 93, 96, 102, 105, 123, 129, 132, 144, 165, 171, 177, 183, 192, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 243, 264, 267,

270, 276, 279, 282, 291, 294, 297, 309, 315, 318, 324, 336 15 <223> n = A,T,C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 366, 372, 378, 381,

384, 396, 399, 402, 408, 411, 417, 423, 426, 438, 441, 447, 453, 459, 462, 465, 468, 474, 480, 483, 492, 495, 501, 20 510, 513, 519, 522, 528, 534, 537, 546, 555, 558, 561, 564

<223> n = A,T,C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> 573, 582, 591, 594, 597, 606, 609, 612, 615, 618, 624, 630, 633, 636, 642, 645, 651, 654, 660, 666

<223> n = A,T,C o G

<400> 42

<210> 43

<211> 684

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> ZZ7-APRIL

<220>

<221> CDS

<222> (1) ... (684) 15 <400> 43

<210> 44

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ7-APRIL

<400> 44

5 <210> 45

<211> 672

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Consenso de ZZ7-APRIL

<220>

<221> misc_feature

<222> 9, 18, 21, 24, 33, 36, 39, 42, 48,-51, 54, 60, 63, 66, 69,

84, 90, 93, 96, 102, 105, 132, 135, 138, 141, 144, 153, 156, 162, 171, 177, 183, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 213, 15 216, 219, 228, 231, 234, 237, 243, 246, 252, 258, 279, 282

<223> n = A,T,C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> 285, 291, 294, 297, 306, 309, 312, 324, 330, 333, 342, 345,

20 348, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 372, 378, 384, 387, 390, 402, 405, 408, 414, 417, 423, 429, 432, 444, 447, 453, 459, 465, 468, 471, 474, 480, 486, 489, 498, 501, 507, 516

<223> n = A,T,C o G <220>

<221> misc_feature

<222> 519, 525, 528, 534, 540, 543, 552, 561, 564, 567, 570, 579, 588, 597, 600, 603, 612, 615, 618, 621, 624, 630, 636, 639, 642, 648, 651, 657, 660, 666, 672

<223> n = A,T,C o G

<400> 45

<210> 46

<211> 684 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ9-APRIL

<220> 15 <221> CDS

<222> (1)...(684)

<400> 46

<210> 47

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ9-APRIL

<400> 47

<210> 48

<211> 681

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Consenso de ZZ9-APRIL

<220>

<221> misc_feature 10 <222> 9, 18, 21, 24, 33, 36, 39, 42, 48, 51, 54, 60, 63, 66, 69,

84, 90, 93, 96, 102, 105, 132, 135, 138, 141, 144, 153, 156, 159, 162, 171, 174, 177, 180, 183, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 213, 216, 219, 228, 231, 234, 237, 243, 246, 252

<223> n = A,T,C o G

<220> 15 <221> misc_feature

<222> 258, 279, 282, 285, 291, 294, 297, 306, 309, 312, 324, 330,

333, 339, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 381, 387, 393, 396, 399, 411, 414, 417, 423, 426, 432, 438, 441, 453, 456, 462, 468, 474, 477, 480, 483, 489, 495, 498

<223> n = A,T,C o G 20 <220>

<221> misc_feature

<222> 507, 510, 516, 525, 528, 534, 537, 543, 549, 552, 561, 570, 573, 576, 579, 588, 597, 606, 609, 612, 621, 624, 627, 630, 633, 639, 645, 648, 651, 657, 660, 666, 669, 675, 681

<223> n = A,T,C o G

<400> 48

<210> 49

<211> 684 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ10-APRIL

<220> 10 <221> CDS

<222> (1)...(684)

<400> 49

<210> 50

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ10-APRIL

<400> 50

<210> 51

<211> 681

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Consenso de ZZ10-APRIL

<220>

<221> misc_feature 10 <222> 9, 18, 21, 24, 33, 36, 39, 42, 48, 51, 54, 60, 63, 66, 69,

84, 90, 93, 96, 102, 105, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 153, 159, 162, 171, 174, 183, 186, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 213, 216, 219, 228, 231, 234, 237, 243, 246, 252, 258

<223> n = A,T,C o G

<220> 15 <221> misc_feature

<222> 279, 282, 285, 291, 294, 297, 306, 309, 312, 324, 330, 333,

339, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 381, 387, 393, 396, 399, 411, 414, 417, 423, 426, 432, 438, 441, 453, 456, 462, 468, 474, 477, 480, 483, 489, 495, 498, 507

<223>

n = A,T,C o G 20 <220>

<221> misc_feature

<222> 510, 516, 525, 528, 534, 537, 543, 549, 552, 561, 570, 573, 576, 579, 588, 597, 606, 609, 612, 621, 624, 627, 630, 633, 639, 645, 648, 651, 657, 660, 666, 669, 675, 681

<223>

n = A,T,C o G 25 <400> 51

<210> 52

<211> 684 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ11-APRIL

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(684)

<400> 52

<210> 53

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ11-APRIL

<400> 53

5 <210> 54

<211> 681

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Consenso de ZZ11-APRIL

<220>

<221> misc_feature

<222> 9, 18, 21, 24, 33, 36, 39, 42, 48, 51, 54, 60, 63, 66, 69,

84, 90, 93, 96, 102, 105, 132, 135, 138, 141, 144, 150, 156, 165, 171, 177, 180, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 15 228, 231, 234, 237, 243, 246, 249, 252, 258, 279, 282, 285

<223> n = A,T,C o G

<220>

<221> misc_feature

<222> 291, 294, 297, 306, 309, 312, 324, 330, 333, 339, 351, 354,

20 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 381, 387, 393, 396, 399, 411, 414, 417, 423, 426, 432, 438, 441, 453, 456, 462, 468, 474, 477, 480, 483, 489, 495, 498, 507, 510, 516, 525

<223> n = A,T,C o G <220>

<221> misc_feature

<222> 528, 534, 537, 543, 549, 552, 561, 570, 573, 576, 579, 588, 597, 606, 609, 612, 621, 624, 627, 630, 633, 639, 645, 648, 651, 657, 660, 666, 669, 675, 681

<223> n = A,T,C o G

<400> 54

<210> 55

<211> 684 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ12-APRIL

<220> 15 <221> CDS

<222> (1)...(684)

<400> 55

<210> 56

<211> 227

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ZZ12-APRIL

<400> 56

<210> 57

<211> 681

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Consenso de ZZ12-APRIL

<220>

<221> misc_feature 10 <222> 9, 18, 21, 24, 33, 36, 39, 42, 48, 51, 54, 60, 63, 66, 69,

84, 90, 93, 96, 102, 105, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 153, 159, 165, 168, 171, 183, 195, 201, 204, 207, 213, 216, 219, 228, 231, 234, 237, 243, 246, 249, 252, 258, 279, 282

<223> n = A,T,C o G

<220> 15 <221> misc_feature

<222> 285, 291, 294, 297, 306, 309, 312, 324, 330, 333, 339, 351,

354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 381, 387, 393, 396, 399, 411, 414, 417, 423, 426, 432, 438, 441, 453, 456, 462, 468, 474, 477, 480, 483, 489, 495, 498, 507, 510, 516

<223> n = A,T,C o G 20 <220>

<221> misc_feature

<222> 525, 528, 534, 537, 543, 549, 552, 561, 570, 573, 576, 579, 588, 597, 606, 609, 612, 621, 624, 627, 630, 633, 639, 645, 648, 651, 657, 660, 666, 669, 675, 681

<223> n = A,T,C o G

<400> 57

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Marca FLAG

<400> 58

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de preparación de una proteína trimérica que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende:

   (i)

   un dominio ZymoZipper (ZZ) en el que el dominio ZymoZipper (ZZ) comprende una secuencia de repetición de héptada viral;

   (ii)

   una proteína heteróloga; y

   (iii) una secuencia de adaptador, en el que el adaptador comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 37 y SEC ID Nº: 38.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína heteróloga comprende el dominio extracelular de dicha proteína.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha proteína de fusión es soluble.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio ZZ se deriva de la subunidad transmembrana (TM) de un virus clasificado dentro del género o de la familia seleccionados del grupo constituido por Orthomyxovirus, Filovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Lentivirus, Cornavirus y Paramyxovirus, preferentemente en el que el virus es gripe A o un Betaretrovirus tal como el virus Mason-Pfizer del mono (VMMP).

5. 5.

   El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio ZZ comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32.

6. 6.

   El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el adaptador comprende la SEC ID Nº: 35 y el dominio ZZ comprende SEC ID Nº: 32.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho dominio ZZ se deriva de la subunidad transmembrana (TM) de un retrovirus endógeno humano (RVEH), preferentemente en el que dicho RVEH es ERVWE1.

8. 8.

   El procedimiento de cualquier reivindicación anterior que comprende además eliminar el dominio ZZ de la proteína trimérica usando digestión con proteasa, preferentemente en el que dicha proteasa es tripsina.

9. 9.

   Un procedimiento de preparación de una proteína hetero-trimérica soluble:

   cultivando una primera célula huésped transformada o transfectada con un primer vector de expresión que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio ZZ y una primera proteína heteróloga,

   cultivando una segunda célula huésped transformada o transfectada con un segundo vector de expresión que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un segundo dominio ZZ y una segunda proteína heteróloga, y

   cultivando una tercera célula huésped transformada o transfectada con un tercer vector de expresión que codifica una tercera proteína de fusión que comprende un tercer dominio ZZ y una tercera proteína heteróloga;

   en el que dicha primera, segunda y tercera proteínas de fusión comprenden además una secuencia de adaptador, en el que el adaptador comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 37 y SEC ID Nº: 38;

   en el que el primer, segundo y tercer dominios ZZ comprenden una secuencia de repetición de héptada viral y en el que el primer, segundo y tercer dominios ZZ forman preferencialmente un hetero-trímero;

   y combinando la primera, segunda y tercera proteínas de fusión en condiciones que promuevan un hetero-trímero.

10. 10.

    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha primera y segunda células huésped son la misma célula.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha primera y segunda proteínas heterólogas son las mismas.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha primera y segunda proteínas heterólogas son el dominio extracelular de BLyS y dicha tercera proteína heteróloga es el dominio extracelular de APRIL.

13. 13.

    El procedimiento de la reivindicación 9 que comprende además eliminar el dominio ZZ de la proteína hetero-trimérica usando digestión con proteasa, preferentemente en el que dicha proteasa es tripsina.