ES2415958T3 - Vacunas de péptidos para cánceres que expresan los polipéptidos MPHOSPH1 ó DEPDC1 - Google Patents
Vacunas de péptidos para cánceres que expresan los polipéptidos MPHOSPH1 ó DEPDC1 Download PDFInfo
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Abstract
Péptido seleccionado de entre (a) o (b) a continuación : (a) péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido se deriva de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2, en la que dicho péptido presenta menos de aproximadamente 15 aminoácidos y se selecciona de entre el grupo que consiste de péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7 ó 8, o (b) el péptido de (a) en el que se han sustituido, delecionado o añadido 1 ó 2 aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 7 ó 8.
Description
Vacunas de péptidos para cánceres que expresan los polipéptidos MPHOSPH1 ó DEPDC1.
Campo técnico
La presente exposición se refiere al campo de las ciencias biológicas, más concretamente al campo de la terapia del cáncer. En particular, la presente exposición se refiere a nuevos péptidos que sirven como vacunas para el cáncer extremadamente efectivas, y a fármacos para tratar y prevenir tumores que contienen dichos péptidos.
Antecedentes de la técnica
Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ reconocen los péptidos derivados de antígenos asociados a tumor (AAT) presentados sobre las moléculas del CMH de clase I y lisan las células tumorales. Desde el descubrimiento de la familia MAGE como primer ejemplo de AAT, se han descubierto muchos otros AAT mediante enfoques inmunológicos (Boon T., Int. J. Cancer 54: 177-80, 1993; Boon T. et al., J. Exp. Med. 183: 725-9, 1996; van der Bruggen P. et al., Science 254: 1643-7, 1991; Brichard V. et al., J. Exp. Med. 178: 489-95, 1993; Kawakami Y. et al., J. Exp. Med. 180: 347-52, 1994). Algunos de ellos ahora se encuentran en desarrollo clínico como dianas inmunoterapéuticas. Entre los AAT descubiertos hasta el momento se incluyen MAGE (van der Bruggen P. et al., Science 254:1643-7, 1991), gp100 (Kawakami Y. et al., J. Exp. Med. 180: 347-52, 1994), SART (Shichijo S. et al., J. Exp. Med. 187:277-88, 1998) y NY-ESO-1 (Chen Y.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1914-8, 1997). Por otra parte, determinados productos génicos que se ha demostrado que se sobreexpresan bastante específicamente en las células tumorales se ha probado que resultan reconocidos como dianas para la inducción de respuestas inmunológicas celulares. Entre dichos productos génicos se incluyen p53 (Umano Y. et al., Br. J. Cancer 84:1052-7, 2001), HER2/neu (Tanaka H. et al., Br. J. Cancer 84:94-9, 2001), CEA (Nukaya I. et al., Int. J. Cancer 80:92-7, 1999) y similares.
A pesar de los significativos avances en la investigación básica y clínica relativa a los AAT (Rosenberg S.A. et al., Nature Med. 4: 321-7, 1998; Mukherji B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8078-82, 1995; Hu X. et al., Cancer Res. 56: 2479-83, 1996), actualmente sólo se dispone de un número muy limitado de AAT candidatos para el tratamiento del cáncer. Los AAT que se expresan abundantemente en las células de cáncer y cuya expresión se restringe a las células de cáncer serían candidatos prometedores a dianas inmunoterapéuticas.
Tanto HLA-A24 como HLA-A0201 son alelos HLA comunes en las poblaciones japonesa y caucásica (Date Y. et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo A. et al., J. Immunol. 155:4307-12, 1995; Kubo R.T. et al., J. Immunol. 152:3913-24, 1994; Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference, Oxford University Press, Oxford, 1065, 1992; Williams F. et al., Tissue Antigen 49:129-33, 1997). De esta manera, los péptidos antigénicos de los cánceres presentados por dichos alelos HLA podrían resultar particularmente útiles en el tratamiento del cáncer en pacientes japoneses y caucásicos. Además, es conocido que la inducción de LTC de baja afinidad in vitro habitualmente resulta de la exposición a concentraciones elevadas de péptido, generando un nivel elevado de complejos específicos de péptido/CMH sobre células presentadoras de antígeno (CPA), las cuales pueden activar eficazmente estos LCT (Alexander-Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93: 4102-7, 1996).
Los recientes avances en las tecnologías de micromatrices de ADNc han permitido construir perfiles completos de expresión génica de células malignas en comparación con las células normales (Okabe H. et al., Cancer Res. 61:2129-37, 2001; Lin Y.M. et al., Oncogene 21:4120-8, 2002; Hasegawa S. et al., Cancer Res. 62:7012-7, 2002). Este enfoque ha permitido comprender la compleja naturaleza de las células de cáncer y los mecanismos de carcinogénesis y ha facilitado la identificación de genes cuya expresión se encuentra desregulada en los tumores (Bienz M. et al., Cell 103:311-20, 2000). Entre los transcritos identificados como regulados positivamente en el cáncer, recientemente se han descubierto MPHOSPH1 (fosfoproteína 1 de etapa M, nº de acceso de GenBank NM_016195, SEC ID nº 1 y nº 2) y DEPDC1 (dominio DEP que contiene 1; nº de acceso de GenBank BM683578). Ver los documentos WO nº 2004/031413, nº 2006/085684 y nº 2007/013.665, el contenido completo de los cuales se incorpora como referencia en la presente memoria. DEPDC1 ha sido descrito en el contexto de dos variantes transcripcionales diferentes: DEPDC1 V1 (SEC ID nº 3, nº 4) y DEPDC1 V2 (SEC ID nº 5, nº 6). Se ha demostrado que estos genes se encuentran específicamente regulados positivamente en las células tumorales de los diversos tejidos de cáncer de los casos analizados (ver posteriormente); sin embargo, los análisis de transferencia northern demuestran que estos productos génicos no se encuentran en los órganos vitales normales (ver la solicitud de patente PCT nº JP2006/302684). En la medida en que los péptidos inmunogénicos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1 puedan encontrar utilidad en la eliminación de células tumorales que expresan dichos antígenos, estos genes resultan de interés particular para los presentes inventores.
Debido a que los fármacos citotóxicos, tales como M-VAC, con frecuencia provocan reacciones adversas severas, resulta evidente que la selección cuidadosa de nuevas moléculas diana basándose en mecanismo de acción bien caracterizados resulta importante en el desarrollo de fármacos anticáncer efectivos con un riesgo minimizado de efectos secundarios negativos. Con este objetivo, los inventores previamente llevaron a cabo un análisis del perfil de expresión de diversos cánceres y tejido humano normal, y descubrieron múltiples genes que se sobreexpresan específicamente en el cáncer (Lin Y.M. et al., Oncogene 21:4120-8, 13 de junio de 2002; Kitahara O. et al., Cancer Res. 61:3544-9, 1 de mayo de 2001; Suzuki C. et al., Cancer Res. 63:7038-41, 1 de nov. de 2003; Ashida S. et al., Cancer Res. 64:5963-72, 1 de sept. de 2004; Ochi K. et al., Int. J. Oncol. 2004 Mar;24(3):647-55.; Kaneta Y, et al., Int J Oncol. 23:681-91, sept. de 2003; Obama K., Hepatology 41:1339-48, junio de 2005; Kato T. et al., Cancer Res. 65:5638-46, 1 de julio de 2005; Kitahara O. et al., Neoplasia 4:293-303, jul-ag. de 2002; Saito-Hisaminato A. et al., DNA Res. 9: 35-45, 2002). De ellos, MPHOSPH1 (nº interno C2093) y DEPDC1 (nº interno B5860N) fueron identificados como genes sobreexpresados en diversos cánceres. En particular, se identificó MPHOSPH1 como sobreexpresado en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal y tumor de tejido blando. De manera similar, se identificó DEPDC1 como sobreexpresado en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, SCL y tumor de tejido blando.
MPHOSPH1 fue identificado anteriormente como una de las proteínas fosforilada específicamente en la transición G2/M y caracterizado como una proteína relacionada con quinesina dirigida al extremo (+) (Abaza A. et al., J. Biol. Chem. 278: 27844-52, 2003). Más particularmente, se ha documentado previamente que MPHOSPH1 es un motor molecular dirigido al extremo (+) que desempeña una función crucial en la citoquinesis y se acumula en la zona intermedia del huso entre la anafase y la telofase en las células HeLa (Abaza A. et al., J. Biol. Chem. 278: 27844-52, 2003; Kamimoto T. et al., J. Biol. Chem. 276: 37520-8, 2001). El ADNc de MPHOSPH1 codifica una proteína de
1.780 aminoácidos que está compuesta de tres dominios: un dominio motor NH2-quinasina, un dominio central de hélice superenrollada-tallo y un dominio de cola C-globular. Conjuntamente, estos datos sugieren que MPHOSPH1 es una proteína relacionada con quinesina de tipo NH2.
Respecto a DEPDC1, sigue sin conocerse exactamente cuál es su función. El dominio DEP contenido en esta proteína también se encuentran en Dishevelled, Egl-10 y Pleckstrin. El dominio DEP en dishevelled de Drosophila desempeña un papel esencial en el rescate de defectos de polaridad plana e induce la señalización de JNK; sin embargo, todavía no se ha aclarado cuál es su función en el ser humano. Sin embargo, tal como se da a conocer en la solicitud de patente PCT nº JP2006/302684, los ARNip de DEPDC1 pueden suprimir el crecimiento de las células de cáncer. Estos resultados demuestran que DEPDC1 desempeña un papel importante en el crecimiento de la mayoría de las células de cáncer.
Descripción resumida de la invención
La invención se refiere a las realizaciones según se define en las reivindicaciones.
Tal como se ha indicado anteriormente, se ha identificado que MPHOSPH1 (fosfoproteína 1 de la etapa M) y DEPDC1 (dominio DEP que contiene 1) se encuentran regulados positivamente en diversos cánceres. Más particularmente, los genes han sido identificados utilizando el perfil de expresión génica con una micromatriz de ADNc para todo el genoma. Tal como se ha comentado anteriormente, se ha demostrado que la expresión de MPHOSPH1 y DEPDC1 se encuentra específicamente regulada positivamente en diversas células tumorales, incluyendo el cáncer de pulmón y el cáncer de vejiga. Tal como se describe en la Tabla 1, se ha demostrado que la expresión de MPHOSPH1 se encuentra válidamente elevada en 30 de 31 cánceres de vejiga, 8 de 36 cánceres de mama, 18 de 18 cánceres cervicales, 5 de 17 carcinomas colangiocelulares, 25 de 31 LMC, 6 de 11 cánceres colorrectales, 6 de 14 cánceres gástricos, 5 de 5 CPCNP, 7 de 7 linfomas, 6 de 10 osteosarcomas, 7 de 22 cánceres de próstata, 10 de 18 carcinomas renales y 15 de 21 tumores de tejido blando. Simultáneamente, se ha demostrado que la expresión de DEPDC1 se encuentra válidamente elevada en 23 de 25 cánceres de vejiga, 6 de 13 cánceres de mama, 12 de 12 cánceres cervicales, 6 de 6 carcinomas colangiocelulares, 3 de 4 LCM, 2 de 4 cánceres colorrectales, 6 de 6 CPCNP, 7 de 7 linfomas, 10 de 14 osteosarcomas, 11 de 24 cánceres de próstata, 14 de 14 CPCP y 22 de 31 tumores de tejido blando, tal como se indica en la Tabla 1.
La presente exposición se basa, por lo menos en parte, en la identificación de péptidos epítopo específicos de los productos génicos de estos genes (MPHOSPH1 y DEPDC1) que presentan la capacidad de inducir linfocitos T citotóxicos (LTC) específicos de las moléculas correspondientes. Tal como se comenta en detalle posteriormente, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de donantes sanos fueron estimuladas con péptidos candidatos de unión a HLA-A*2402 y HLA-A*0201 derivados de MPHOSPH1 ó DEPDC1. A continuación, se establecieron clones y/o líneas de LTC con citotoxicidad específica para las células diana positivas para HLA-A24 ó HLA-A2 pulsadas con cada uno de los péptidos candidatos. Estos resultados demuestran que estos péptidos son péptidos epítopos restringidos a HLAA24 ó HLA-A2 que pueden inducir respuestas inmunológicas potentes y específicas contra células que expresan MPHOSPH1 ó DEPDC1.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo el cáncer. Dichos métodos implican la etapa de administrar en un sujeto que lo necesita, un polipéptido MPHOSPH1 y/o DEPDC1 de la invención. La administración de dicho péptido o péptidos resulta en la inducción de inmunidad antitumoral. De esta manera, la presente invención proporciona métodos para inducir inmunidad antitumoral en un sujeto, implicando dichos métodos la etapa de administrar en el sujeto un polipéptido MPHOSPH1 y/o DEPDC1, así como composiciones farmacéuticas para tratar o prevenir una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cáncer, que incluyen los polipéptidos MPHOSPH1 y/o DEPDC1. Entre los cánceres ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
Es decir, la presente invención incluye las realizaciones siguientes, y cualesquiera combinaciones de las mismas.
[1] Un péptido aislado que presenta inducibilidad de células T citotóxicas, en la que dicho péptido se deriva de la secuencia SEC ID nº 2, nº 4 ó nº 6.
[2] Un péptido aislado de menos de aproximadamente 15 aminoácidos seleccionados de entre el grupo que consiste de péptidos que comprende las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 7, nº 8 y nº 12, o un péptido aislado que presenta inducibilidad de células T citotóxicas, en la que dichos péptidos comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 7, nº 8 y nº 12, en la que 1, 2 ó varios aminoácidos han sido sustituidos, delecionados o añadidos.
[3] El péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas de [2], en el que el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano.
[4] El péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas de [2], en el que el aminoácido C-terminal es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.
[5] Un péptido aislado de menos de aproximadamente 15 aminoácidos seleccionados de entre el grupo que consiste de péptidos que comprende las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 9, nº 10, nº 11, nº 192, nº 195, nº 197, nº 209, nº 225, nº 226, nº 228, nº 230, nº 240, nº 241, nº 243, nº 244, nº 253, nº 254 y nº 255 ó un péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas, en la que dichos péptidos comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 9, nº 10, nº 11, nº 192, nº 195, nº 197, nº 209, nº 225, nº 226, nº 228, nº 230, nº 240, nº 241, nº 243, nº 244, nº 253, nº 254 y nº 255, en las que 1, 2 ó varios aminoácidos han sido sustituidos, delecionados o añadidos .
[6] El péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas de [5], en el que el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal es leucina o metionina.
[7] El péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas de [5], en el que el aminoácido C-terminal es valina
o leucina.
[8] Un vector en el que el ADN codifica péptidos de cualquiera de entre [1] y [7].
[9] Una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad asociada a la sobreexpresión de los genes de SEC ID nº 1, nº 3 y/o nº 5, comprendiendo dicha composición uno o más péptidos de cualquiera de entre [1] y [7].
[10] La composición farmacéutica de [9], en la que la enfermedad es cáncer.
[11] La composición farmacéutica de [10], en la que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
[12] Un exosoma que presenta sobre su superficie un complejo que comprende un péptido cualquiera de entre [1] y
[7] y un antígeno HLA.
[13] El exosoma de [12], en el que el antígeno HLA es HLA-A24.
[14] El exosoma de [13], en el que el antígeno HLA es HLA-A2402.
[15] El exosoma de [12], en el que el antígeno HLA es HLA-A2.
[16] El exosoma de [13], en el que el antígeno HLA es HLA-A0201.
[17] Un método de inducción de células presentadoras de antígeno que presenta una elevada inducibilidad de las células T citotóxicas, que comprende la etapa de poner en contacto una célula presentadora de antígeno con un péptido cualquiera de entre [1] y [7].
[18] Un método de inducción de células T citotóxicas mediante la puesta en contacto de una célula T con un péptido cualquiera de entre [1] y [7].
[19] Un método de inducción de células presentadoras de antígeno que presentan una elevada inducibilidad de las células T citotóxicas, que comprende la etapa de poner en contacto una célula presentadora de antígeno con un péptido cualquiera de entre [1] y [7].
[20] Una célula T citotóxica aislada, que se induce mediante la puesta en contacto de una célula T con un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó que se transduce con los ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos subunidades de RCT de unión a un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el contexto de HLA-A24 ó HLA-A2.
[21] Una célula presentadora de antígeno, que comprende un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido cualquiera de entre [1] y [7] .
[22] La célula presentadora de antígeno de [21], inducida mediante el método de [17].
[23] Una vacuna para inhibir la proliferación de células que expresan genes de SEC ID nº 1, nº 3 y/o nº 5, comprendiendo la vacuna un péptido cualquiera de entre [1] y [7] como ingrediente activo.
[24] La vacuna de [23], en la que la célula es una célula de càncer .
[25] La composición farmacéutica de [24], en la que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando .
[26] La vacuna de [23], formulada para la administración en un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A24 ó HLA-A2 .
[27] Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a la sobreexpresión de los genes de SEC ID nº 1, nº 3 y/o nº 5 en un sujeto, que comprende administrar en dicho sujeto una vacuna que comprende uno o más péptidos cualesquiera de entre [1] y [7], un fragmento inmunológicamente activo de los mismos, o un polinucleótido codificante de dicho péptido o fragmento inmunológicamente activo. [28] El método de [27], en el que la enfermedad es cáncer.
[29] El método de [28], en el que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
Alternativamente, la presente invención se refiere además a un método de inducción de células T citotóxicas, que comprende la etapa de poner en contacto una célula T con la célula presentadora de antígeno producida mediante el método de [19].
Estos y otros objetivos y características de la invención se pondrán más de manifiesto tras la lectura de la descripción detallada siguiente conjuntamente con las figuras y ejemplos adjuntos. Sin embargo, debe entenderse que tanto la descripción resumida anteriormente proporcionada y la descripción detallada siguiente son de realizaciones preferentes, y que no es limitativa de la exposición u otras realizaciones alternativas de la exposición.
Breve descripción de los dibujos
[fig. 1] La figura 1A ilustra los resultados de un ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de péptidos epítopos que, a su vez, demuestran que MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7) es un potente productor de IFN-γ. Los LTC para aquellos péptidos derivados de MPHOSPH1 se generaron según los protocolos descritos en la sección de "Materiales y métodos" de los ejemplos, posteriormente. Se muestran los LTC resultantes que presentan una actividad de LTC específica detectable. En particular, las células en el pocillo número 4 estimuladas con MPHOSPH1-A24-9-278 mostraron una producción potente de IFN-γ para reconocer células diana pulsadas con péptido, en comparación con el control. La figura 1B ilustra los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de clones de LTC tras la dilución limitante (clon de LTC MPHOSPH1-A24-9-278). Se expandieron las células en el pocillo positivo y se llevó a cabo dilución limitante. Tal como demuestran los resultados ilustrados, se determinaron cuáles eran los clones de LTC con actividades de LTC específicas más altas contra la diana pulsada con péptido en comparación con las actividades contra la diana sin pulso de péptido.
[fig. 2] La figura 2A ilustra los resultados de un ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de citotoxicidad de péptidos epítopos que, a su vez, demuestran que MPHOSPH1-A24-10-278 (SEC ID nº 8) es un potente productor de IFN-γ. Los LTC para aquellos péptidos derivados de MPHOSPH1 se generaron según los protocolos descritos en la sección de "Materiales y métodos" de los ejemplos, posteriormente. Se muestran los LTC resultantes que presentan una actividad de LTC específica detectable. En particular, las células en el pocillo número 8 estimuladas con MPHOSPH1-A24-10-278 mostraron una producción potente de IFN-γ en comparación con el control. La figura 2B ilustra los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de clones de LTC tras la dilución limitante (clon de LTC MPHOSPH1-A24-10-278). Se expandieron las células en el pocillo positivo y se llevó a cabo dilución limitante. Tal como demuestran los resultados ilustrados, se determinaron cuáles eran los clones de LTC con actividades de LTC específicas más altas contra la diana pulsada con MPHOSPH1-A24-10-278 en comparación con las actividades contra la diana sin pulso de péptido.
[fig. 3] La figura 3A ilustra el establecimiento de los clones de LTC estimulados con MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7). Este clon de LTC demostró una elevada actividad específica de LTC contra las células diana (A24LCL) pulsadas con MPHOSPH1-A24-9-278, pero no mostró actividad de LTC significativa contra las mismas células diana (A24LCL) pulsadas sin péptidos. La figura 3B ilustra el establecimiento de los clones de LTC estimulados con MPHOSPH1-A24-10-278 (SEC ID nº 8). Este clon de LTC demostró una elevada actividad específica de LTC contra las células diana (A24LCL) pulsadas con MPHOSPH1-A24-10-278, pero no mostró actividad de LTC significativa contra las mismas células diana (A24LCL) pulsadas sin péptidos. R significa Respondedor: clon de LTC. S significa Estimulador: A24-LCL pulsado con péptido (1x104/pocillo).
[fig. 4] La figura 4 ilustra la expresión de MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7) sobre la superficie de las células diana con HLA-A24. La actividad específica de LTC contra COS7 transfectadas tanto con el gen MPHOSPH1 de longitud completa como con la molécula HLA-A*2402 se sometió a ensayo utilizando como células efectoras el clon de LTC inducido por MPHOSPH1-A24-9-278. A modo de control se prepararon células COS7 transfectadas con MPHOSPH1 de longitud completa pero no con HLA-A*2402 y COS7 transfectadas con HLA-A*2402 pero no con MPHOSPH1 de longitud completa. El clon de LTC demostró una elevada actividad específica de LTC contra las COS7 transfectadas tanto con MPHOSPH1 como con HLA-A24. Sin embargo, no mostró actividad específica significativa de LTC contra COS7 transfectadas con MPHOSPH1 ni con HLA-A24. R significa Respondedor: clon de LTC. S significa Estimulador: COS7 transfectante (1x104/pocillo).
[fig. 5] La figura 5 ilustra la actividad de LTC contra las líneas celulares de cáncer de vejiga que expresan endógenamente MPHOSPH1. El clon de LTC establecido que había sido inducido con MPHOSPH1-A24-9-278 reconocía las células tumorales que expresaban endógenamente MPHOSPH1. Las células HT1376, RT-4 y J82 expresaban MPHOSPH1 endógenamente, respectivamente. El clon LTC mostró producción de IFN-γ contra HT 1376 que presentaban el genotipo HLA-A*2402, pero no mostraron respuesta contra RT-4 y J82, que no presentan el genotipo HLA-A*2402.
[fig. 6] La figura 6 ilustra el análisis de inmunogenicidad in vivo utilizando el péptido MPHOSPH1-A24-9-278. Se inyectó por vía subcutánea péptido conjugado con IFA en ratones BALB/c los días 0 y 7. El día 14, se recolectaron esplenocitos de los ratones vacunados y se utilizaron como células respondedoras, mientras que se utilizaron 1x104 células RLmalel pulsadas con péptido MPHOSPH1-A24-9-278 como células estimuladoras en ensayo ELISPOT de
Ani5)
Para cada ratón se indican los recuentos de unidades formadoras de puntos (SFC); cinco ratones (Ani1 γ.IFN
Para cada ratón se indican los recuentos de unidades formadoras de puntos (SFC); cinco ratones (Ani1 γ.IFN
se vacunaron con péptido epítopo y tres ratones (nega1~nega3) recibieron una inyección de emulsión IFA de tratamiento simulado a modo de control negativo.
[fig. 7] La figura 7 ilustra los resultados de un ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de péptidos epítopos que, a su vez, demuestran que MPHOSPH1-A2-9-282 (SEC ID nº 9), MPHOSPH1-A2-9-638 (SEC ID nº 10) y MPHOSPH1-A (SEC ID nº 11) presentan una potente actividad de producción de IFN-γ. Los LTC para aquellos péptidos derivados de MPHOSPH1 se generaron según los protocolos descritos en la sección de "Materiales y métodos" de los ejemplos, posteriormente. Se muestran los LTC resultantes que presentan una actividad de LTC específica detectable. En particular, la figura 7A demuestra que las células en los pocillos nº 1 y nº 5 estimuladas con MPHOSPH1-A24-9-282 mostraron una producción potente de IFN-γ suficiente para reconocer las células diana pulsadas con péptido, en comparación con el control. La figura 7B demuestra que las células en el pocillo nº 8 estimuladas con MPHOSPH1-A24-9-638 mostraron una producción potente de IFN-γ suficiente para reconocer células diana pulsadas con péptido, en comparación con el control. La figura 7C demuestra que las células en el pocillo nº 4 estimuladas con MPHOSPH1-A mostraron una producción potente de IFN-γ suficiente para reconocer las células diana pulsadas con péptido, en comparación con el control.
[fig. 8] La figura 8 ilustra el establecimiento de los clones de LTC estimulados con MPHOSPH1-A24-9-282 (SEC ID nº 9), MPHOSPH1-A02-9-638 (SEC ID nº 10) y MPHOSPH1-AU (SEC ID nº 11). Se expandieron las células en el pocillo positivo y, tal como demuestran los resultados ilustrados, se establecieron las líneas de LTC que presentaban actividades específicas de LTC más altas contra la diana pulsada con MPHOSPH1-A02-9-282 (A), la diana pulsada con MPHOSPH1-A02-9-638 (B) o la diana pulsada con MPHOSPH1-A (C) en comparación con las actividades contra la diana sin péptido pulsado. R significa Respondedor: líneas de LTC. S significa Estimulador: T2 pulsado con péptido (1x104/pocillo).
[fig. 9] La figura 9A ilustra los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de clones de LTC tras la dilución limitante (clon de LTC MPHOSPH1-A2-9-282). Se expandieron las células en el pocillo positivo y se llevó a cabo dilución limitante. Tal como demuestran los resultados ilustrados, se establecieron los clones de LTC con actividades específicas de LTC más altas contra la diana pulsada con MPHOSPH1-A2-9-282 (SEC ID nº 9) en comparación con las actividades contra la diana sin pulsado de péptido. La figura 9B ilustra el establecimiento de clones de LTC estimulados con MPHOSPH1-A02-9-282. El clon de LTC demostró una elevada actividad específica de LTC contra las células diana (T2) pulsadas con MPHOSPH1-A2-9-282, pero no presentaba una actividad de LTC significativa contra las mismas células diana (T2) sin pulsado de péptido. R significa Respondedor: clon de LTC. S significa Estimulador: T2 pulsado con péptido (1x104/pocillo).
[fig. 10] La figura 10A ilustra los resultados de un ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de péptidos epítopos que, a su vez, demuestran que DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID nº 12) es un potente productor de IFN-γ. Los LTC para aquellos péptidos derivados de DEPDC1 se generaron según los protocolos descritos en la sección de "Materiales y métodos" de los ejemplos, posteriormente. Se muestran los LTC resultantes que presentan una actividad de LTC específica detectable. En particular, las células en el pocillo número 10 estimuladas con DEPDC1-A24-9-294 mostraron una producción potente de IFN-γ para reconocer células diana pulsadas con péptido, en comparación con el control. La figura 10B ilustra los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de clones de LTC tras la dilución limitante (clon de LTC DEPDC1-A24-9-294). Se expandieron las células en el pocillo positivo y se llevó a cabo dilución limitante. Tal como demuestran los resultados ilustrados, se determinaron cuáles eran los clones de LTC con actividades de LTC específicas más altas contra la diana pulsada con DEPDC1-A24-9-294 en comparación con las actividades contra la diana sin pulso de péptido.
[fig. 11] La figura 11 ilustra el establecimiento de los clones de LTC estimulados con DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID nº 12). Este clon de LTC demostró una elevada actividad específica de LTC contra las células diana (A24LCL) pulsadas con DEPDC1-A24-9-294, pero no mostró actividad de LTC significativa contra las mismas células diana (A24LCL) pulsadas sin péptidos. R significa Respondedor: clon de LTC DEPDC-A24-9-294. S significa Estimulador: A24-LCL pulsado con péptido (1x104/pocillo).
[fig. 12] La figura 12 ilustra la expresión de DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID nº 12) sobre la superficie de las células diana con HLA-A24. La actividad específica de LTC contra COS7 transfectadas tanto con el gen DEPDC1 de longitud completa como con la molécula HLA-A*2402 se sometió a ensayo utilizando como células efectoras el clon de LTC inducido por DEPDC1-A24-9-294. A modo de controles se prepararon células COS7 transfectadas con DEPDC1 de longitud completa pero no con HLA-A*2402 y COS7 transfectadas con HLA-A*2402 pero no con DEPDC1 de longitud completa. El clon de LTC establecido demostró una elevada actividad específica de LTC contra las COS7 transfectadas tanto con DEPDC1 como con HLA-A24. Sin embargo, no mostró actividad específica significativa de LTC contra COS7 transfectadas con DEPDC1 ni con HLA-A24. R significa Respondedor: Clon de LTC DEPA24-9-294. S significa Estimulador: COS7 transfectante (1x104/pocillo) . [fig. 13] La figura 13 ilustra la actividad de LTC contra líneas celulares de cáncer de vejiga que expresan endógenamente DEPDC1. El clon de LTC establecido que había sido inducido con péptido DEPDC1-A24-9-294 reconoce células tumorales que expresan endógenamente DEPDC1. Las células HT1376, RT-4 y J82 expresaban DEPDC1 endógenamente, respectivamente. El clon de LTC mostró producción de IFN-γ contra HT1376 que presentaba el genotipo HLA-A*2402, pero no mostró respuesta contra RT-4 y J82, que no presentan el genotipo HLA-A*2402.
[fig. 14] La figura 14 ilustra el análisis de inmunogenicidad in vivo utilizando el péptido DEPDC1-A24-9-294. Se inyectó por vía subcutánea péptido conjugado con IFA en ratones BALB/c los días 0 y 7. El día 14, se recolectaron esplenocitos de ratones vacunados y se utilizaron como células respondedoras y se utilizaron 1x104 células RLmale1 pulsadas con péptido DEPDC1-A24-9-294 como células estimuladoras para el ensayo ELISPOT de IFN-γ.
Ani5) se
Para cada ratón se realizaron recuentos de unidades formadoras de puntos (SFC); cinco ratones (Ani1
Para cada ratón se realizaron recuentos de unidades formadoras de puntos (SFC); cinco ratones (Ani1
vacunaron con péptido epítopo y dos ratones (nega1 y nega2) recibieron una inyección de emulsión IFA de tratamiento simulado a modo de control negativo.
[fig. 15] La figura 15 ilustra una potente producción de IFN-γ de DEPDC1-A02-10-644,-10-575,-10-506,-10-765,-10395, -10-224, -9-297, -10-296 y -10-302 mediante ensayo ELISPOT de IFN-γ para el cribado de péptidos epítopos.
Las LTC de los péptidos derivados de DEPDC1 se generaron de la manera descrita en "Materiales y métodos". Las células en los pocillos nº 4 y nº 7 estimuladas con DEPDC1-A02-10-644, nº 2 con DEPDC1-A02-10-575, nº 7 con DEPDC1-A02-10-506, nº 1 con DEPDC1-A02-10-765 y nº 1 con DEPDC1-A02-10-395, nº 1 y nº 2 con DEPDC1A02-10-224, nº 4 con DEPDC1-A02-9-297, nº 3 y nº 4 con DEPDC1-A02-10-296 y nº 2, nº 3, nº 5 y nº 7 con DEPDC1-A02-10-302 mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control.
[fig. 16] La figura 16 ilustra la producción de IFN-γ de la línea de LTC generada con el péptido DEPDC1-A02-10-296. Las líneas de LTC establecidas que se indujeron con el péptido DEPDC1-A02-10-296 presentaban una potente actividad de producción de IFN-γ. Se demostró una potente producción de IFN-γ contra las células diana pulsadas con péptido, pero no se demostró contra las células diana sin pulsado de péptido. Las células diana utilizadas fueron células T2, que expresaban la molécula HLA-A2 en la superficie celular.
[fig. 17] La figura 17 ilustra la actividad de LTC contra dianas que expresan endógenamente la molécula DEPDC1 y HLA-A2. Se demuestra en el panel superior que la línea de LTC establecida que se había generado con el péptido DEPDC1-A02-10-296 presentaba actividad de producción de IFN-γ contra las células diana que expresaban endógenamente DEPDC1V2 y HLA-A2. Se muestra en el panel inferior el caso de la utilización de péptido DEPDC1A02-10-296. A modo de control negativo se prepararon las células diana que expresaban únicamente DEPDC1V2 y que expresaban únicamente HLA-A2 con tratamiento de pulso de péptido DEPDC1V1-9-674 ó DEP-9-462. Las células diana se prepararon a partir de HEK293 transfectante que expresaba establemente HLA-A2 ó simuladas. [fig. 18] La figura 18 ilustra la expresión de antígeno en el Caso 2. En el Caso 2, se expresaron fuertemente tanto MPHOSPH1 como DEPDC1. Por lo tanto, se utilizaron para las vacunaciones dos tipos de péptidos epítopos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1.
[fig. 19] La figura 19 ilustra la evaluación clínica de recurrencia local de cáncer de vejiga en el Caso 2. El caso 2 se evaluó como enfermedad estable (EE) según los criterios RECIST.
[fig. 20] La figura 20 ilustra la expresión de antígenos en el Caso 3. En el Caso 3, se expresaba fuertemente DEPDC1. Por lo tanto, se utilizó para las vacunas el péptido epítopo derivado de DEPDC1 únicamente.
[fig. 21] La figura 21 ilustra la evaluación clínica del lóbulo derecho del pulmón metastásico en el Caso 3. Se redujo la tasa de progresión tras la vacunación. Especialmente se redujo el tamaño del tumor tras los terceros cursos de tratamiento.
[fig. 22] La figura 22 ilustra la evaluación clínica del lóbulo izquierdo del pulmón metastásico en el Caso 3. Se redujo la tasa de progresión tras la vacunación. Especialmente se redujo el tamaño del tumor tras los terceros cursos de tratamiento.
[fig. 23] La figura 23 ilustra el efecto antitumoral en el Caso 3. Se redujo la tasa de progresión del tumor metastásico tras la vacunación.
[fig. 24] La figura 24 ilustra la respuesta específica de TCL en el Caso 3. Se manifestó una fuerte respuesta específica de TCL tras la vacunación.
[fig. 25] La figura 25 ilustra la expresión de antígeno en el Caso 4. En el Caso 4, se expresaron tanto MPHOSPH1 como DEPDC1. Por lo tanto, se utilizaron para las vacunaciones dos tipos de péptidos epítopos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1.
[fig. 26] La figura 26 ilustra la evaluación clínica de recurrencia local de cáncer de vejiga en el Caso 4. El tamaño del tumor se redujo en 20% según los criterios RECIST tras el primer curso de vacunación.
Descripción detallada de la invención
Los términos "un", "una" y "el" o "la" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a "por lo menos uno", a menos que se indique específicamente lo contrario.
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención.
La identificación de nuevos AAT, particularmente aquellos que inducen respuestas inmunológicas antitumorales potentes y específicas, justifica un desarrollo posterior de la aplicación clínica de la estrategia de vacunación con péptidos en diversos tipos de cáncer (Boon T. et al., J. Exp. Med. 183: 725-9, 1996; van der Bruggen P. et al., Science 254: 1643-7, 1991; Brichard V. et al., J. Exp. Med. 178: 489-95, 1993; Kawakami Y. et al., J. Exp. Med. 180: 347-52, 1994), Shichijo S. et al., J. Exp. Med. 187:277-88, 1998; Chen Y.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-8, 1997; Harris C.C., J. Natl. Cancer Inst. 88: 1442-55, 1996; Butterfield L.H. et al., Cancer Res. 59:3134-42, 1999; Vissers J.L. et al., Cancer Res. 59: 5554-9, 1999; van der Burg S.H. et al., J. Immunol. 156:3308-14, 1996; Tanaka F. et al., Cancer Res. 57:4465-8, 1997; Fujie T. et al., Int. J. Cancer 80:169-72, 1999; Kikuchi M. et al., Int. J. Cancer 81: 459-66, 1999; Oiso M. et al., Int. J. Cancer 81:387-94, 1999). Tal como se ha indicado anteriormente, MPHOSPH1 (fosfoproteína 1 de la etapa M; nº de acceso de GenBank NM_016195; SEC ID nº 1 y nº 2) y DEPDC1 (dominio DEP que contiene 1; nº de acceso de GenBank BM683578), más particularmente sus dos variantes DEPDC1V1 (SEC ID nº 3 y nº 4) y DEPDC1V2 (SEC ID nº 5 y nº 6) se identificaron previamente utilizando tecnologías de micromatrices de ADNc como sobreexpresados en diversos cánceres. MPHOSPH1 fue identificado anteriormente como una de las proteínas fosforilada específicamente en la transición G2/M y caracterizado como una proteína relacionada con quinesina dirigida al extremo (+) (Abaza A. et al., J. Biol. Chem. 278: 27844-52, 2003). Más particularmente, se ha documentado previamente que MPHOSPH1 es un motor molecular dirigido al extremo (+) que desempeña una función crucial en la citoquinesis y se acumula en la zona intermedia del huso entre la anafase y la telofase en las células HeLa (Abaza A. et al., J. Biol. Chem. 278: 27844-52, 2003; Kamimoto T. et al., J. Biol. Chem. 276: 37520-8). El ADN de MPHOSPH1 codifica una proteína de 1.780 aminoácidos que está compuesta de tres dominios: un dominio motor NH2-quinasina, un dominio central de hélice superenrollada-tallo y un dominio de cola C-globular. Conjuntamente, estos datos sugieren que MPHOSPH1 es una proteína relacionada con quinesina de tipo NH2.
La función de la proteína DEPDC1 sigue sin estar clara. El dominio DEP contenido en esta proteína también se encuentra en Dishevelled, Egl-10 y Pleckstrin. En particular, el dominio DEP en Dishevelled de Drosophila desempeña un papel esencial en el rescate de defectos de polaridad plana e induce la señalización de JNK; sin embargo, todavía no se ha aclarado cuál es su función en el ser humano. Sin embargo, tal como se da a conocer en la solicitud de patente PCT nº JP2006/302684, DEPDC1 (referencia interna nº B5860N) presenta dos variantes transcripcionales diferentes de 12 y 11 exones, correspondientes a DEPDC1 V1 y V2, respectivamente. Se observaron variaciones alternativas en el exón 8 de V1 y se encontró que los demás exones eran comunes a ambas variantes. La variante V2 no presenta el exón 8 de V1, pero genera el mismo codón de parada dentro del último exón. Las secuencias de ADNc de longitud completa de las variantes B5860NV1 y B5860NV2 consisten de 5.318 y
4.466 nucleótidos, respectivamente. Los marcos de lectura abierta (MLA) de dichas variantes se inician dentro de cada exón 1. Finalmente, los transcritos de V1 y V2 codifican 811 y 527 aminoácidos, respectivamente. Los ARNip suprimieron el crecimiento de las células de cáncer. Estos resultados demuestran que DEPDC1 desempeña un papel importante en el crecimiento de la mayoría de células de cáncer.
Tal como se da a conocer en la solicitud de patente PCT nº JP2006/302684, MPHOSPH1 y DEPDC1 se encuentran sobreexpresados en el cáncer de vejiga pero muestran una expresión mínima en los tejidos normales. Además, se encontró que estos genes presentaban una función significativa relacionada con la proliferación celular.
En la presente invención, se demuestra que los péptidos derivados de MPHOSPH1 ó de DEPDC1 son epítopos de AAT restringidos por HLA-A24 y HLA-A2, un alelo de HLA observado comúnmente en las poblaciones japonesas y caucásicas. Específicamente, utilizando sus afinidades de unión a HLA-A24 y a HLA-A2, se identificaron los candidatos a péptidos de unión a HLA-A24 y a HLA-A2 derivados de MPHOSPH1 ó de DEPDC1. Tras la estimulación in vitro de las células T por parte de las células dendríticas (CD) cargadas con dichos péptidos, se establecieron con éxito LTC utilizando MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID nº 7)), MPHOSPH1-A24-10278 (IYNEYIYDLF (SEC ID nº 8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID nº 9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEC ID nº 10)), MPHOSPH1-A (TMSSSKLSNV (SEC ID nº 11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)), DEPDC1-A02-10-644 (SLMIHTFSRC (SEC ID nº 240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPASSMLT (SEC ID nº 241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID nº 243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID nº 244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID nº 249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV (SEC ID nº 253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID nº 226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID nº 254)). DEPDC1-A02-10-301 (NILGLLQPHL (SEC ID nº 255)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEC ID nº 192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEC ID nº 195)), DEPDC 1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEC ID nº 197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEC ID nº 209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID nº 225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDHHQEIL (SEC ID nº 228)) y DEPDC1-A2-10-302 (ILVVCGYITV (SEC ID nº 230)). Estas LTC demostraron una potente actividad citotóxica contra las células A24LCL y T2 pulsadas con péptido. Además, los clones de TLC derivados de estas células también demostraron una citotoxicidad específica contra células positivas para HLAA24 ó HLA-A2 que expresaban MPHOSPH1 ó DEPDC1, respectivamente. Sin embargo, dichos clones de TLC no expresaban actividad citotóxica contra células que presentaban expresión de únicamente uno de los péptidos, incluyendo HLA-A24, HLA-A2, MPHOSPH1 y DEPDC-1. Conjuntamente, estos resultados sugieren la utilidad de MPHOSPH-1 y DEPDC1 como AAT de células de cáncer y que MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID nº 7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYT1EYIYDLF (SEC ID nº 8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID nº 9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEC ID nº 10)), MPHOSPH1-A (TMSSSKLSNV (SEC ID nº 11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)), DEPDC1-A02-10-644 (SLMIHTFSRC (SEC ID nº 240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPASSMLT(SEC ID nº 241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID nº 243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID nº 244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID nº 249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV(SEC ID nº 253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID nº 226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID nº 254)), DEPDC1-A02-10-301 (NILGLLQPHL (SEC ID nº 255)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEC ID nº 192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEC ID nº 195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEC ID nº 197)), DEPDC1A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEC ID nº 209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID nº 225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDHHQEIL (SEC ID nº 228)) y DEPDC1-A2-10-302 (ILWCGYITV (SEC ID nº 230)) son péptidos epítopos de cada AAT restringido por HLA-A24 ó HLA-A2. Debido a que estos antígenos se sobreexpresan en la mayoría de cánceres y se asocian a la proliferación de células tumorales, resultan útiles como dianas inmunoterapéuticas contra cánceres. Entre los cánceres ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente exposición proporciona además métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC-1, por ejemplo cánceres, en un sujeto, incluyendo dichos métodos las etapas de administrar en un sujeto que lo necesita, un péptido inmunogénico de menos de aproximadamente 40 aminoácidos, con frecuencia de menos de aproximadamente 20 aminoácidos, habitualmente de menos de aproximadamente 15 aminoácidos y que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255. Alternativamente, el péptido inmunogénico puede estar compuesto de una secuencia SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255, en la que 1, 2 ó varios (por ejemplo hasta 5) aminoácidos han sido sustituidos, delecionados o añadidos, con la condición de que el péptido variante resultante conserve la actividad inmunogénica (es decir, la capacidad de inducir LTC específicas de células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres). El número de residuos que debe sustituirse, delecionarse o añadirse es generalmente de 5 aminoácidos o menos, preferentemente de 4 aminoácidos o menos, más preferentemente de 3 aminoácidos o menos, todavía más preferentemente de uno o dos aminoácidos. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
Es conocido que los péptidos variantes (es decir, péptidos que presentan una secuencia de aminoácidos modificados mediante sustitución, deleción o adición de uno, dos o varios residuos aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos original) conservan la actividad biológica original (Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-6, 1984; Zoller M.J. y Smith M., Nucleic Acids Res. 10:6487-500, 1982; Dalbadie-McFarland G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-13, 1982). En el contexto de la presente exposición, resulta preferible que la modificación de aminoácidos resulte en la conservación de las propiedades de la cadena lateral de aminoácidos original (un proceso conocido como sustitución conservadora de aminoácidos). Entre los ejemplos de propiedades de las cadenas laterales de aminoácidos se incluyen los aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), los aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) y las cadenas laterales que presentan los grupos o características funcionales siguientes en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P), una cadena lateral que contiene grupo hidroxilo (S, T, Y), una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M), un ácido carboxílico y una cadena lateral que contiene amida (D, N, E, Q), una cadena lateral que contiene base (R, K, H) y una cadena lateral que contiene un aromático (H, F, Y, W). Las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de los aminoácidos.
En realizaciones preferentes, el péptido inmunogénico es un nonapéptido (9-mero) o un decapéptido (10-mero).
La expresión invención proporciona además un método para inducir inmunidad antitumoral frente a una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, en un sujeto, incluyendo dicho método las etapas de administrar en un sujeto que lo necesita, un péptido inmunogénico de la presente invención, es decir, uno que presente la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255 ó una variante de las mismas (es decir, que incluye 1, 2 ó varias sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos). Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
En el contexto de la presente exposición, el sujeto preferentemente es un mamífero. Entre los mamíferos ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca.
En la presente exposición, el péptido puede administrarse en un sujeto mediante un protocolo in vivo o ex vivo. Además, la presente exposición proporciona además la utilización de un nonapéptido o decapéptido seleccionado de entre péptidos que presentan la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 y 255 (y variantes de las mismas) para preparar una composición inmunogénica para el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
Análisis de homología de MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYD (SEC ID nº 7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEYIYDLF (SEC ID nº 8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID nº 9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEC ID nº 10)), MPHOSPH1-A (TMSSSKLSNV (SEC ID nº 11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)), DEPDC1-A02-9-589 (LLQPHLERV (SEC ID nº 192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEC ID nº 195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEC ID nº 197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEC ID nº 209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID nº 225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDHHQEIL (SEC ID nº 228)), DEPDC1-A2-10-302 (ILVVCGYITV (SEC ID nº 230)) DEPDC1-A02-10-644 (SLMIhTFSRC (SEC ID nº 240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPASSMLT(SEC ID nº 241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID nº 243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID nº 244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID nº 249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV (SEC ID nº 253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID nº 226)), DEPDC1-A02-10-296(YELFVNILGL (SEC ID nº 254)) y DEPDC1-A02-10-301(NIL-GLLQPHL (SEC ID nº 255)) demuestran que no presentan homología significativa con los péptidos derivados de cualesquiera productos génicos humanos conocidos. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la posibilidad de respuestas inmunológicas desconocidas o no deseables con la inmunoterapia contra estas moléculas se reduce significativamente.
Con respecto a los antígenos HLA, los datos presentados en la presente memoria demuestran que los usos de los antígenos de tipo A-24 ó de tipo A-2 (que se considera que se expresan a nivel elevado entre los japoneses) son favorables a la obtención de resultados efectivos. Los usos de subtipos tales como A-2402 y A-0201 resultan todavía más preferibles. Típicamente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga previamente, lo que permite, a su vez, seleccionar los péptidos apropiados, que presentan niveles elevados de afinidad de unión para el antígeno del paciente, o que presentan inducibilidad de células T citotóxicas (CTC) mediante presentación de antígeno. Además, con el fin de obtener péptidos con elevada afinidad de unión e inducibilidad de CTC, puede llevarse a cabo la sustitución, deleción o adición de 1, 2 ó varios aminoácidos basándose en la secuencia de aminoácidos del péptido parcial MPHOSPH1 y DEPDC1 natural. En la presente memoria, el término "varios" se refiere a 5 ó menos, más preferentemente 3 ó menos. Además, adicionalmente a los péptidos que se expresan naturalmente, debido a que la regularidad de las secuencias de péptidos expresados mediante la unión a antígenos HLA ya es conocida (Kubo R.T. et al., J. Immunol. 152:3913-24, 1994; Rammensee
H.G. et al., Immunogenetics 41:178-228, 1995; Kondo A. et al., J. Immunol. 155:4307-12, 1995), pueden llevarse a cabo modificaciones basadas en dicha regularidad respecto a los péptidos inmunogénicos de la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse favorablemente péptidos que presentan una afinidad de unión a HLA-24 elevada, en la que el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal ha sido sustituido por fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano. De manera similar, también pueden utilizarse favorablemente péptidos cuyo aminoácido C-terminal se ha sustituido por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina. Por otra parte, pueden utilizarse favorablemente los péptidos que presentan una afinidad de unión a HLA-A2 elevada en los que el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal ha sido sustituido por leucina o metionina, y los péptidos cuyo aminoácido C-terminal ha sido sustituido por valina o leucina. Además, pueden añadirse 1 a 2 aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal del péptido.
Sin embargo, en el caso de que la secuencia del péptido sea idéntica a una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína endógena o exógena que presenta una función diferente, pueden inducirse efectos secundarios, tales como trastornos autoinmunológicos o síntomas alérgicos contra sustancias específicas. Por lo tanto, resulta preferible evitar la situación en la que la secuencia inmunogénica se corresponde con la secuencia de aminoácidos de una proteína conocida. Esta situación puede evitarse llevando a cabo una búsqueda de homología utilizando las bases de datos disponibles. En el caso de que las búsquedas de homología confirmen que los péptidos en los que no existen 1, 2 ó varios aminoácidos diferentes en la naturaleza, puede evitarse el riesgo de que las modificaciones de la secuencia de aminoácidos anteriormente indicada incremente, por ejemplo, la afinidad de unión para los antígenos HLA y/o incremente la inducibilidad de los LTC.
Aunque los péptidos que presentan una afinidad de unión elevada para los antígenos HLA tal como se ha indicado anteriormente se espera que resulten altamente efectivos como vacunas del cáncer, los péptidos candidatos, que se seleccionan según la presencia de alta afinidad de unión como indicador, deben examinarse para la presencia real de inducibilidad de los LTC. La inducibilidad de los LTC puede confirmarse rutinariamente mediante la inducción de células presentadoras de antígeno que portan antígenos del CMH humano (por ejemplo linfocitos B, macrófagos y células dendríticas), o más específicamente células dendríticas derivadas de leucocitos mononucleares sanguíneos periféricos y, tras la estimulación con el péptido de interés, la mezcla con células CD8-positivas y la medición de la actividad citotóxica contra las células diana. Como sistema de reacción, pueden utilizarse animales transgénicos producidos para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo los descritos en BenMohamed L. et al., Hum. Immunol. 61(8):764-79, 2000; artículos y libros relacionados, Linkout.). Por ejemplo, las células diana pueden marcarse radioactivamente con 51Cr y similares, y la actividad citotóxica puede calcularse a partir de la radioactividad liberada de las células diana. Alternativamente, puede examinarse a partir de la medición del IFN-γ producido y liberado por las LTC en presencia de células presentadoras de antígeno que portan péptidos inmovilizados y visualizar la zona de inhibición en el medio utilizando anticuerpos monoclonales anti-IFN-γ.
Como resultado del examen de la inducibilidad de los LTC de los péptidos tal como se ha indicado anteriormente, se descubrió que aquellos péptidos que presentaban una afinidad de unión elevada para un antígeno HLA no presentaban necesariamente una inducibilidad elevada. Sin embargo, los nonapéptidos o decapéptidos seleccionados de entre el grupo de péptidos que presentan las secuencias de aminoácidos indicadas por IYNEYIYDL (SEC ID nº 7), IYNEYIYDLF (SEC ID nº 8), YIYDLFVPV (SEC ID nº 9), RLAIFKDLV (SEC ID nº 10). TMSSSKLSNV (SEC ID nº 11), EYYELFVNI (SEC ID nº 12), LLQPHLERV (SEC ID nº 192), LLMRMISRM (SEC ID nº 195). LLTFEYYEL (SEC ID nº 197), RLCKSTIEL (SEC ID nº 209), CVLCCAEEV (SEC ID nº 225), FLMDHHQEIL (SEC ID nº 228), ILVVCGYITV (SEC ID nº 230) DEPDCI-A02-10-644 (SLMIHTFSRC (SEC ID nº 240)), DEPDC1A02-10-575 (SLLPASSMLT (SEC ID nº 241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID nº 243)), DEPDC1A0210-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID nº 244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID nº 249), DEPDC1-A02-10-224(NMANTSKRGV (SEC ID nº 253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID nº 226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID nº 254)) y DEPDC1-A02-10-301 (NILGLLQPHL (SEC ID nº 255)) mostraron una inducibilidad de LTC particularmente elevada.
Tal como se ha indicado anteriormente, la presente exposición proporciona péptidos que presentan inducibilidad de células T citotóxicas, es decir aquellos que presentan la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255, o una variante de las mismas (es decir, aquéllas en las que 1, 2 ó varios aminoácidos han sido sustituidos, delecionados o añadidos). Resulta preferible que las secuencias de aminoácidos compuestas de 9 ó 10 aminoácidos indicadas en SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255 ó una variante de las mismas no coincida con una secuencia de aminoácidos asociada a otra proteína endógena. En particular, la sustitución de un aminoácido por leucina o metionina en el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal, la sustitución de un aminoácido por valina o leucina en el aminoácido C-terminal y la adición de 1 a 2 aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal son ejemplos de variantes preferentes. El experto en la materia reconocerá que, además de sustituciones y adiciones de aminoácidos, también pueden utilizarse fragmentos inmunológicamente activos en los métodos de la invención. Los métodos para determinar los fragmentos activos son bien conocidos de la técnica. Los clones de LTC obtenidos mediante la estimulación por dichos péptidos modificados pueden reconocer los péptidos originales y provocar daños en las células que expresan los péptidos originales.
Los péptidos de la presente invención pueden prepararse utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos pueden prepararse sintéticamente, utilizando tecnología de ADN recombinante o la síntesis química. Los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse individualmente o en forma de polipéptidos más largos que comprenden dos o más péptidos. Los péptidos de la presente invención preferentemente han sido aislados, es decir, se encuentran sustancialmente libres de otras proteínas naturales de la célula huésped y fragmentos de las mismas.
Los péptidos de la presente invención pueden contener modificaciones, tales como glucosilaciones, oxidaciones de cadenas laterales o fosforilaciones, con la condición de que las modificaciones no destruyan la actividad biológica de los péptidos indicados en la presente memoria, es decir, la capacidad de unirse a un antígeno HLA e inducir los LTC. Entre otras modificaciones se incluyen la incorporación de D-aminoácidos u otros miméticos de aminoácidos que pueden utilizarse, por ejemplo, para incrementar la vida media en suero de los péptidos.
Los péptidos de la presente invención pueden prepararse en forma de una combinación, que incluye dos o más péptidos de la invención, para la utilización como vacuna para una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, tal como una vacuna inductora de LTC in vivo. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando. Los péptidos pueden encontrarse en un cóctel o pueden conjugarse entre sí utilizando técnicas estándares. Por ejemplo, los péptidos pueden expresarse en forma de una única secuencia polipeptídica. Los péptidos en la combinación pueden ser iguales o diferentes. Mediante la administración de los péptidos de la presente invención, los péptidos se presentan a una densidad elevada sobre los antígenos HLA de las células presentadoras de antígeno, las cuales, a su vez, inducen los LTC que reaccionan específicamente con el complejo formado entre el péptido expresado y el antígeno HLA. Alternativamente, las células presentadoras de antígeno, las cuales presentan inmovilizados sobre su superficie celular los péptidos de la presente invención, obtenidas mediante extracción de células dendríticas de los sujetos, pueden ser estimuladas con los péptidos de la presente invención. La nueva administración de estas células en los sujetos respectivos induce los LTC y, como resultado, puede incrementarse la agresividad hacia las células diana.
Más específicamente, la presente invención proporciona fármacos para tratar y/o prevenir la proliferación, metástasis y similares de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, que incluyen uno o más de los péptidos de la presente invención. Los péptidos dados a conocer resultan particularmente útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
Los péptidos dados a conocer pueden administrarse en un sujeto directamente, en forma de una composición farmacéutica que ha sido formulada mediante métodos de formulación convencionales. En estos casos, la adición a los péptidos de la presente invención de portadores, excipientes y similares que se utilizan habitualmente para los fármacos puede incluirse según resulte apropiado, sin limitaciones particulares. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención puede utilizarse para el tratamiento y prevención de una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
Las composiciones inmunogénicas para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, que comprenden como ingrediente activo uno o más péptidos de la presente invención, pueden incluir además un adyuvante, de manera que puede establecerse eficazmente la inmunidad celular. Alternativamente, pueden administrarse con otros ingredientes activos, tales como agentes anticáncer. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando. Entre las formulaciones adecuadas se incluyen gránulos. Se describen adyuvantes adecuados en la literatura (Johnson A.G., Clin. Microbiol. Rev. 7:277-89, 1994). Entre los adyuvantes ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y alúmina. Además, pueden utilizarse convenientemente formulaciones de liposomas, formulaciones granulares en las que el fármaco se encuentra unido a perlas de unos cuantos micrómetros de diámetro y formulaciones en las que se une un lípido al péptido. El método de administración puede ser oral, o la inyección intradérmica, subcutánea o intravenosa, o similar, y puede incluir la administración sistémica o la administración local en un área próxima al tumor diana. La dosis del péptido o péptidos de la presente invención puede ajustarse apropiadamente según la enfermedad que debe tratarse, la edad y peso del paciente, el método de administración, y similares. Aunque la dosis habitualmente es de 0,001 mg a 1.000 mg, preferentemente de 0,01 mg a 100 mg, más preferentemente de 0,1 mg a 10 mg, preferentemente administrada una vez en unos cuantos días a unos cuantos meses, el experto en la materia podrá seleccionar fácilmente la dosis y método de administración apropiados, ya que la selección y optimización de dichos parámetros se encuentra perfectamente dentro de los conocimientos del experto rutinario en la materia.
La presente invención proporciona además vesículas intracelulares denominadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de la presente invención y antígenos HLA sobre su superficie. Los exosomas pueden prepararse, por ejemplo, mediante la utilización de los métodos descritos en detalle en la traducción japonesa publicada de las publicaciones internacionales nº Hei 11-510507 y nº 2000-512161, y preferentemente se preparan utilizando células presentadoras de antígenos obtenidas de sujetos que son dianas de tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención pueden inocularse como vacunas del cáncer, de manera similar a los péptidos de la presente invención.
El tipo de antígenos HLA utilizados debe coincidir con el del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población japonesa, HLA-A24 ó HLA-A2, particularmente HLA-A2402 ó HLA-A0201, con frecuencia resulta apropiado.
En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna de la presente invención incluyen un componente que sensibiliza los linfocitos T citotóxicos. Los lípidos han sido identificados como agentes capaces de sensibilizar los LTC in vivo frente a los antígenos víricos. Por ejemplo, pueden unirse residuos de ácido palmítico a los grupos εamino y α-amino de un residuo de lisina y después unirse a un péptido inmunogénico de la invención. El péptido lipidado seguidamente puede administrarse directamente, en una micela o partícula, incorporado en un liposoma, o emulsionado en un adyuvante. A título de ejemplo alternativo de un lípido sensibilizador de respuestas de LTC, pueden utilizarse lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS) para sensibilizar los LTC cuando se encuentran unidos covalentemente a un péptido apropiado (ver, por ejemplo, Deres
K. et al., Nature 342:561-4, 1989).
Las composiciones inmunogénicas de la presente invención también pueden incluir ácidos nucleicos codificantes de uno o más de los péptidos inmunogénicos dados a conocer en la presente memoria. Ver, por ejemplo, Wolff J.A. et al., Science 247:1465-8, 1990; patentes US nº 5.580.859, nº 5.589.466, nº 5.804.566, nº 5.739.118, nº 5.736.524, nº
5.679.647 y documento WO nº 98/04720. Entre los ejemplos de tecnologías de administración basadas en ADN se incluyen el "ADN desnudo" la administración facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada por péptidos), los complejos lipídicos catiónicos y la administración mediada por partículas ("pistolas génicas") o mediada por presión (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.922.687).
Los péptidos inmunogénicos dados a conocer también pueden ser expresados por vectores víricos o bacterianos. Entre los ejemplos de vectores de expresión adecuados se incluyen huéspedes víricos atenuados, tales como el virus Vaccinia o el de la viruela aviar. Este enfoque implica la utilización del virus Vaccinia, por ejemplo como vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. Tras la introducción en un huésped, el virus Vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico y de esta manera induce una respuesta inmunológica. Los vectores Vaccinia y los métodos que resultan útiles en los protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, la patente US nº 4.722.848. Otro vector adecuado es BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover C.K. et al., Nature 351:456-60, 1991. Se conoce de la técnica una amplia diversidad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización, por ejemplo vectores adenovíricos o adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores Salmonella typhi, vectores de toxina del ántrax destoxificada y similares. Ver, por ejemplo, Shata M.T. et al., Mol. Med. Today 6:66-71, 2000; Shedlock D.J. y Weiner D.B. et al., J. Leukoc. Biol. 68:793-806, 2000, y Hipp J.D. et al., In vivo 14:571-85, 2000.
La presente invención proporciona además métodos de inducción de células presentadoras de antígeno utilizando uno o más péptidos de la presente invención. Las células presentadoras de antígenos pueden inducirse mediante la inducción de células dendríticas procedentes de monocitos de sangre periférica seguido de su puesta en contacto (estimulación) con uno o más péptidos dados a conocer in vitro, ex vivo o in vivo. Al administrar péptidos de la presente invención en los sujetos, las células presentadoras de antígenos que presentan los péptidos de la presente invención inmovilizados en ellas resultan inducidas en el cuerpo del sujeto. Alternativamente, tras inmovilizar los péptidos de la presente invención en las células presentadoras de antígenos, las células pueden administrarse en el sujeto en forma de una vacuna. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir las etapas de:
a : recolectar las células presentadoras de antígenos de un sujeto y
b: poner en contacto las células presentadoras de antígenos de la etapa a. con un péptido de la presente invención
Las células presentadoras de antígenos obtenidas en la etapa b. pueden administrarse en el sujeto en forma de una vacuna.
La presente invención proporciona además un método para inducir las células presentadoras de antígeno que presentan un nivel elevado de inducibilidad de células T citotóxicas, en el que el método incluye la etapa de transferir genes compuestos de uno o más polinucleótidos codificantes de uno o más péptidos de la presente invención a las células presentadoras de antígenos in vitro. Los genes introducidos pueden encontrarse en forma de ADN o ARN. Para el método de la introducción, sin limitaciones particulares, pueden utilizarse convenientemente diversos métodos llevados a cabo convencionalmente en este campo, tales como la lipofección, la electroporación y el método del fosfato cálcico. Más específicamente, la transfección puede llevarse a cabo tal como se describe en Reeves M.E. et al., Cancer Res. 56:5672-7, 1996; Butterfield L.H. et al., J. Immunol. 161:5607-13, 1998; Boczkowski
D. et al., J. Exp. Med. 184:465-72, 1996; traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº 2000509281. Mediante la transferencia del gen al interior de las células presentadoras de antígenos, el gen es transcrito y traducido en la célula y seguidamente la proteína obtenida es procesada por el CMH de clase I ó de clase II y sigue una ruta de presentación para presentar péptidos parciales.
La presente invención proporciona además métodos de inducción de LTC utilizando uno o más péptidos de la presente invención. Al administrar los péptidos de la presente invención en un sujeto, los LTC son inducidos en el cuerpo del sujeto y de esta manera se incrementa la potencia del sistema inmunológico con diana en las células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo células de cáncer en los tejidos tumorales. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando. Alternativamente, los péptidos de la presente invención pueden utilizarse en el contexto de un método terapéutico ex vivo, en el que células presentadoras de antígeno derivadas del sujeto y células positivas para CD8 ó leucocitos mononucleares de sangre periférica se ponen en contacto (se estimulan) con uno o más péptidos de la presente invención in vitro y, tras inducir los LTC, se devuelven las células al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas de:
a : recolectar las células presentadoras de antígenos de un sujeto, b: poner en contacto las células presentadoras de antígenos de la etapa a. con un péptido de la presente invención ,
c: mezclar las células presentadoras de antígenos de la etapa b. con células T CD8+ y cocultivarlas de manera que se induzca las células T citotóxicas, y
d: recolectar las células T CD8+ del cocultivo de la etapa c.
Las células T CD8+ que presentan actividad citotóxica obtenidas en la etapa d. pueden administrarse en el sujeto en forma de una vacuna.
La presente invención proporciona además métodos para producir células T citotóxicas activadas utilizando los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas siguientes:
a : recolectar células T de un sujeto, y
b: poner en contacto las células T con los péptidos siguientes:
- (1)
- un péptido aislado de menos de aproximadamente 15 aminoácidos seleccionado de entre el grupo que consiste de péptidos que presentan las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 y 255.
- (2)
- Un péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dichos péptidos presentan una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 y 255, en el que 1, 2 ó varios aminoácidos han sido sustituidos, delecionados o añadidos.
La presente invención proporciona además un método para producir células presentadoras de antígenos (CPA) que presentan inducibilidad de células T activadas, utilizando los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, el método puede incluir la etapa de poner en contacto células presentadoras de antígenos con los péptidos para producir células presentadoras de antígenos que presentan el péptido y antígeno HLA sobre la superficie. En el contexto de la presente invención, las "células T citotóxicas activadas" inducen la producción de IFN-γ, la liberación de IFN-γ y la muerte de las células tumorales.
La presente invención proporciona además células T citotóxicas aisladas que se han inducido utilizando los péptidos de la presente invención. Las células T citotóxicas, inducidas mediante estimulación con una célula presentadora de antígeno que presenta uno o más péptidos de la presente invención, preferentemente se derivan de sujetos que son la diana de tratamiento y/o prevención y pueden administrarse solas o en combinación con otros fármacos, incluyendo uno o más péptidos de la presente invención o exosomas que presentan actividad antitumoral. Las células T citotóxicas obtenidas actúan específicamente contra células diana que presentan los péptidos de la presente invención o preferentemente el mismo péptido o péptidos utilizados para la inducción. Las células diana pueden ser células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1 endógenamente, o células que han sido transfectadas con genes MPHOSPH1 y/o DEPDC1. Las células que presentan los péptidos de la presente invención sobre la superficie celular, debido a la estimulación con estos péptidos, también pueden convertirse en dianas de un ataque.
La presente invención proporciona además células presentadoras de antígenos que presentan complejos formados entre antígenos HLA y uno o más péptidos de la presente invención. Las células presentadoras de antígenos, obtenidas mediante contacto con los péptidos de la presente invención o con los nucleótidos codificantes de dichos péptidos, preferentemente se derivan de sujetos que son la diana de tratamiento y/o prevención y pueden administrarse en forma de vacunas, solos o en combinación con otros fármacos, incluyendo los péptidos, exosomas
o células T citotóxicas de la presente invención.
La presente invención proporciona además una composición que comprende ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos que son capaces de formar una subunidad de un receptor de células T (RCT) y métodos de utilización de los mismos. Las subunidades de RCT presentan la capacidad de formar RCT que proporcionan especificidad a las células T para las células tumorales que presentan MPHOSPH1 ó DEPDC1. Mediante la utilización del método conocido de la técnica, pueden identificarse los ácidos nucleicos de cadena α y cadena β de los LTC inducidos con uno o más péptidos de la presente invención (documento WO nº 2007/0322 y Morgan et al., J. Immunol. 171:3288, 2003). Los RTC derivados preferentemente se unen a células diana que expresan el péptido MPHOSPH1 ó DEPDC1 con alta avidez, y opcionalmente median en la eliminación eficiente de células diana que presentan el péptido MPHOSPH1 ó DEPDC1 in vivo e in vitro.
Los ácidos nucleicos codificantes de las subunidades de RCT pueden incorporarse en vectores adecuados, por ejemplo en vectores retrovíricos. Estos vectores son bien conocidos de la técnica. Los ácidos nucleicos o los vectores que los comprenden útilmente pueden transferirse al interior de una célula T, la cual preferentemente procede de un paciente. Ventajosamente, la invención proporciona una composición de venta al público que permite la rápida modificación de las propias células T de un paciente (o las de otro mamífero) para producir rápida y fácilmente células T modificadas que presentan excelentes propiedades de eliminación de las células de cáncer.
Además, la presente invención proporciona LTC que se preparan mediante transducción con los ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos de subunidades de RCT de unión al péptido MPHOSPH1 ó DEPDC1, por ejemplo SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255 en el contexto de HLA-A24 ó HLA-A2. Los LTC transducidos son capaces de reconocer las células de cáncer in vivo y expandirse mediante un método de cultivo in vitro bien conocido (por ejemplo Kawakami et al., J. Immunol. 142:3452-3461, 1989). Las células T de la presente invención pueden utilizarse para formar una composición inmunogénica útil en el tratamiento o prevención del cáncer en un paciente que necesita terapia o protección (documento WO nº 2006/031221).
En el contexto de la presente invención, el término "vacuna" (también denominada composición inmunogénica) se refiere a una sustancia que induce inmunidad antitumoral o que suprime cánceres tras la inoculación en animales. Según la presente invención, se sugiere que los polipéptidos que presentan la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, 8 ó 12 son péptidos epítopos restringidos a HLA-A24 y los de SEC ID nº 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255, péptidos epítopos restringidos a HLA-A2, que pueden inducir una respuesta inmunológica potente y específica contra células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo células de cáncer que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando. De esta manera, la presente invención comprende además un método de inducción de inmunidad antitumoral utilizando polipéptidos que presentan la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 ó 255 ó una variante de las mismas (es decir, incluyendo 1, 2 ó varias sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos). En general, la inmunidad antitumoral incluye respuestas inmunológicas tales como las siguientes:
- -
- una inducción de linfocitos citotóxicos contra tumores que contienen células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1,
- -
- una inducción de anticuerpos que reconocen tumores que contienen células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, y
- -
- una inducción de la producción de citoquinas antitumorales.
Por lo tanto, en el caso de que un determinado péptido induzca cualquiera de dichas respuestas inmunológicas al ser inoculado en un animal, se considera que el péptido presenta un efecto inductor de inmunidad antitumoral. La inducción de la inmunidad antitumoral por parte de un péptido puede detectarse mediante la observación in vivo o in vitro de la respuesta del sistema inmunológico en el huésped contra el péptido.
Por ejemplo, un método para detectar la inducción de linfocitos T citotóxicos es bien conocido. Una sustancia foránea que entra en el cuerpo vivo es presentada a las células T y a las células B por la acción de las células presentadoras de antígenos (CPA). Las células T que responden al antígeno presentado por las CPA de una manera específica de antígeno se diferencian en células T citotóxicas (también denominadas linfocitos T citotóxicos
o LTC) debido a la estimulación por el antígeno y seguidamente proliferan; este proceso se denomina en la presente memoria "activación" de las células T. Por lo tanto, la inducción de LTC por un determinado péptido puede evaluarse mediante la presentación del péptido a una célula T por parte de una CPA y la detección de la inducción de los LTC Además, las CPA presentan el efecto de activar las células T CD4+, las células T CD8+, los macrófagos, los eosinófilos y las células NK. Debido a que las células T CD4+ también resultan importantes en la inmunidad antitumoral, la acción inductora de inmunidad antitumoral del péptido puede evaluarse utilizando como indicador el efecto de activación de estas células.
Un método para evaluar la acción inductora de los LTC utilizando células dendríticas (CD) como CPA es bien conocido de la técnica. Las CD son un tipo representativo de CPA que presenta la acción inductora de LTC más potente de entre las APC. En dicho método, el polipéptido de ensayo se pone en contacto inicialmente con las CD y después estas CD se ponen en contacto con células T. La detección de las células T que presentan efectos citotóxicos contra las células de interés tras el contacto con las CD demuestra que el polipéptido de ensayo presenta una actividad de inducción de las células T citotóxicas. La actividad de los LTC contra los tumores puede detectarse, por ejemplo, utilizando como indicador la lisis de células tumorales marcadas con 51Cr. Alternativamente, es bien conocida la evaluación del grado de daño de las células tumorales utilizando la actividad de incorporación de 3Htimidina o la liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa) como indicador. Además, también puede examinarse a partir de la medición del IFN-γ producido y liberado por las LTC en presencia de células presentadoras de antígeno que portan péptidos inmovilizados mediante visualización utilizando anticuerpos monoclonales anti-IFN-γ, tal como un ensayo ELISPOT.
Aparte de las CD, también pueden utilizarse células mononucleares sanguíneas periféricas (CMSP) como las CPA. La inducción de los LTC se informa que resulta incrementada mediante el cultivo de CMSP en presencia de GM-LCE e IL-4. De manera similar, se ha demostrado que los LTC resultan inducidos mediante el cultivo de CMSP en presencia de hemocianina de lapa californiana (HLC) e IL-7.
Los polipéptidos de ensayo que se confirmó que presentaban actividad inductora de LTC mediante dichos métodos eran polipéptidos que presentaban un efecto de activación de CD y la consecuente actividad de inducción de LTC. Por lo tanto, los péptidos que inducen LTC contra las células tumorales resultan útiles como vacunas contra enfermedades asociadas a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Además, las CPA que han adquirido la capacidad de inducir LTC contra una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, mediante el contacto con los polipéptidos resultan útiles como vacunas contra la enfermedad. Además, los LTC que han adquirido citotoxicidad debido a la presentación de los antígenos polipéptidos por parte de las CPA también pueden utilizarse como vacunas contra una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. Dichos métodos terapéuticos para una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, utilizando inmunidad antitumoral debido a las CPA y los LTC, se denominan inmunoterapia celular. Entre los cánceres contemplados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
Generalmente, al utilizar un polipéptido para la inmunoterapia celular, la eficiencia de la inducción de los LTC puede incrementarse combinando una pluralidad de polipéptidos que presentan diferentes estructuras y poniéndolos en contacto con las CD. Por lo tanto, al estimular las CD con fragmentos de proteínas, resulta ventajoso utilizar una mezcla de múltiples tipos de fragmento.
La inducción de inmunidad antitumoral por un polipéptido puede confirmarse adicionalmente observando la inducción de la producción de anticuerpos contra los tumores. Por ejemplo, al inducir anticuerpos contra un polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el polipéptido, y al suprimir el crecimiento, proliferación y/o metástasis de las células tumorales por dichos anticuerpos, se determina que el polipéptido induce inmunidad antitumoral.
La inmunidad antitumoral puede inducirse mediante la administración de una vacuna de la presente invención, y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y prevención de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. La terapia o prevención de la aparición de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, puede incluir la inhibición del crecimiento de células que expresan MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo células de cáncer, la involución de dichas células y la supresión de la aparición de estas células, por ejemplo células de cáncer. La reducción de la mortalidad de los individuos que presentan una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejepmlo cánceres, la reducción de los marcadores de la enfermedad en la sangre, el alivio de los síntomas detectables que acompañan a la enfermedad y similares también se encuentran incluidos en la terapia o prevención de la enfermedad, por ejemplo cáncer. Dichos efectos terapéuticos y preventivos preferentemente son estadísticamente significativos, por ejemplo se observan a un nivel de significancia del 5% o menos, en donde el efecto terapéutico o preventivo de una vacuna contra una enfermedad asociada a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, se compara con un control en el que no se ha administrado vacuna. Por ejemplo, puede utilizarse la prueba t de Student, la prueba U de Mann-Whitney o la ANOVA para determinar la significancia estadística.
En el aspecto de que la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres, los compuestos o composiciones terapéuticas pueden administrarse profiláctica o terapéuticamente en sujetos que sufren o que presentan el riesgo de sufrir (o son susceptibles de sufrir) el desarrollo de la enfermedad. Dichos sujetos pueden identificarse utilizando métodos clínicos estándares. En el contexto de la presente invención, la administración profiláctica se produce antes de la manifestación de síntomas clínicos manifiestos de la enfermedad, de manera que se previene o alternativamente se retrasa el avance de una enfermedad o trastorno. En el contexto del campo médico, el término "prevenir" comprende cualquier actividad que reduce la carga de mortalidad o morbilidad de la enfermedad. La prevención puede producirse a los niveles de prevención primaria, secundaria y terciaria. Mientras que la prevención primaria evita el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundario y terciario de prevención comprenden actividades destinadas a prevenir el avance de una enfermedad y la aparición de síntomas, así como a reducir el impacto negativo de una enfermedad ya establecida mediante la restitución de función y la reducción de las complicaciones relacionadas con la enfermedad.
En el contexto del tratamiento del cáncer, el término "eficaz" se refiere a un tratamiento que conduce a una reducción del tamaño, prevalencia o potencial metastásico del cáncer en un sujeto. Al aplicar un tratamiento profilácticamente, el término "eficaz" se refiere a que el tratamiento retrasa o previene la aparición de cáncer o alivia un síntoma clínico del cáncer. La evaluación de cáncer puede llevarse a cabo utilizando protocolos clínicos estándares. Además, la eficacia de un tratamiento puede determinarse en asociación con cualquier método conocido de diagnóstico o tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el cáncer puede diagnosticarse histopatológicamente o mediante la identificación de anomalías sintomáticas.
El péptido anteriormente indicado, que presenta actividad inmunológico, o un polinucleótido o vector codificante de dicho péptido, puede combinarse con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un compuesto que incrementa la respuesta inmunológica contra el péptido al administrarlo conjuntamente (o sucesivamente) con el péptido que presenta actividad inmunológica. Entre los ejemplos de adyuvantes adecuados se incluyen la toxina del cólera, la toxina de Salmonella, alúmina y similares, aunque sin limitación a los mismos. Además, una vacuna de la presente invención puede combinarse apropiadamente con un portador farmacéuticamente aceptable. Son ejemplos de dichos portadores, agua esteriliza, solución salina fisiológica, tampón fosfato, líquido de cultivo y similares. Además, la vacuna puede contener, según resulte necesario, estabilizadores, suspensiones, conservantes, surfactantes y similares. La vacuna se administra sistémicamente o localmente. La administración de la vacuna puede llevarse a cabo mediante una única administración o reforzarse mediante múltiples administraciones.
Al utilizar CPA o LTC como la vacuna de la presente invención, una enfermedad asociada a la sobreexpresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cáncer, puede tratarse o prevenirse, por ejemplo mediante el método ex vivo. Más específicamente, se recolectan CMSP del sujeto que recibe tratamiento o prevención, y se ponen en contacto ex vivo con un péptido de la presente invención. Tras la inducción de las CPA o los LTC, las células pueden ser administradas en el sujeto. Las CPA también pueden inducirse mediante la introducción de un vector codificante del péptido en las CMSP ex vivo. Las CPA o los LTC inducidos in vitro pueden clonarse previamente a la administración. Mediante la clonación y cultivo de las células que presentan una actividad elevada de producción de daños en las células diana, puede llevarse a cabo más efectivamente la inmunoterapia celular. Además, las CPA y los LTC aislados de esta manera pueden utilizarse para la inmunoterapia celular no sólo contra individuos de los que se han derivado las células, sino también contra tipos similares de enfermedades en otros individuos.
En los ejemplos siguientes se describen aspectos de la presente invención, los cuales se presentan únicamente a título ilustrativo de la presente invención y para ayudar al experto ordinario en la preparación y utilización de los mismos. Los ejemplos no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la exposición.
Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se encuentra ejemplificada, aunque no limitada, mediante los Ejemplos siguientes. Sin embargo, los materiales, métodos y similares indicados en la presente memoria únicamente ilustran aspectos de la invención y en modo alguno pretenden limitar el alcance de la misma. De esta manera, los materiales, métodos y otros similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria pueden utilizarse en la práctica o ensayo de la presente invención.
EJEMPLO 1
MATERIALES Y MÉTODOS
Líneas celulares
Se obtuvieron de la ATCC células A24LCL (HLA-A24/24), líneas celulares linfoblastoides B humanas, células T2 y células COS7.
Selección de péptidos candidatos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1
Se predijeron los péptidos 9-meros y 10-meros derivados de MPHOSPH1 ó DEPDC1 que se unen a HLA-A*2402 y a HLA-A*0201 utilizando el software de predicción de unión "BIMAS" (bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_com-boform) (Parker K.C. et al., J. Immunol. 152(1):163-75, 1994; Kuzushima K. et al., Blood 98(6):1872-81, 2001). Estos péptidos fueron sintetizados por Sigma (Sapporo, Japón) siguiendo el método de síntesis en fase sólida estándar y se purificaron mediante HPLC de fase inversa. Se determinaron la pureza (>90%) y la identidad de los péptidos mediante HPLC analítica y análisis de espectrometría de masas, respectivamente. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 20 mg/ml y se almacenaron a -80ºC.
Inducción in vitro de LTC
Se utilizaron células dendríticas (CD) derivadas de monocitos como células presentadoras de antígenos (CPA) para inducir respuestas de LTC contra péptidos presentados sobre HLA. Se generaron CD in vitro tal como se ha descrito (Nukaya I. et al., Int. J. Cancer 80:92-7, 1999; Tsai V. et al., J. Immunol. 158:1796-802, 1997). Brevemente, se separaron células mononucleares sanguíneas periféricas (CMSP) de un voluntario normal (HLA-A*2402 y/o HLAA*0201) en solución de Ficoll-Paque (Pharmacia) se separaron mediante adherencia a un matraz de plástico de cultivo de tejidos (Becton Dickinson) para enriquecerlas en la fracción de monocitos. Se cultivo la población enriquecida en monocitos en presencia de 1.000 U/ml de GM-LCE (Genzyme) y 1.000 U/ml de IL4 (Genzyme) y AIM-V (Invitrogen) que contenía suero autólogo (SA) inactivado por calor al 2%. Tras 7 días de cultivo, las CD generadas con citoquinas se pulsaron con 20 μg/ml de los péptidos sintetizados, en presencia de 3 μg/ml de β2microglobulina durante 4 h a 20ºC en AIM-V. Estas CD pulsadas con péptido seguidamente se inactivaron con MMC (30 μg/ml durante 30 min) y se mezclaron en una proporción 1:0 con células T CD8+ autólogas, obtenidas mediante selección positiva con Dynabeads M-450 CD8 (Dynal) y DETACHa BEADTM (Dynal). Estos cultivos se prepararon en placas de 48 pocillos (Corning); cada pocillo contenía 1,5x104 CD pulsadas con péptido, 3x105 células T CD8+ y 10 ng/ml de IL-7 (Genzyme) en 0,5 ml de AIM-V/SA al 2%. Tres días después, estos cultivos se suplementaron con IL-2 (CHIRON) hasta una concentración final de 20 IU/ml. Los días 7 y 14, las células T se reestimularon nuevamente con las CD autólogas pulsadas con péptido. Las CD se prepararon cada vez mediante el mismo método que el descrito anteriormente. Se sometieron a ensayo los LTC frente a células A24LCL pulsadas con péptido o células T2 tras la tercera ronda de estimulación con péptido el día 21.
Procedimiento de expansión de LTC
Las LTC se expandieron en cultivo utilizando un método similar al descrito por Riddell S.R. et al. (Walter E.A. et al.,
N. Engl. J. Med. 333:1038-44, 1995; Riddel S.R. et al., Nature Med. 2:216-23, 1996). Se resuspendió un total de 5x104 LTC en 25 ml de AIM-V/SA al 5% con 2 tipos de línea celular linfoblastoide B humana, inactivadas con MMC, en presencia de 40 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después de iniciar los cultivos, se añadieron 120 IU/ml de IL-2 a los cultivos. Los cultivos se alimentaron con AIM-V fresco/SA al 5% que contenía 30 IU/ml de IL-2 los días 5, 8 y 11.
Establecimiento de clones de LTC
Las diluciones se prepararon para presentar 0,3, 1 y 3 LTC/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (Nalge Nunc International). Los LTC se cultivaron con 7x104 células/pocillo de 2 tipos de línea celular linfoblastoide B humana, 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3 y 125 U/ml de IL-2 en total de 150 μl/pocillo de AIM-V que contenía SA al 5%. Se añadieron 50 μl/pocillo de IL-2 al medio 10 días después, de manera que IL-2 alcanzase 125 U/ml en la concentración final. Se sometió a ensayo la actividad de los LTC el día 14, y los clones de LTC se expandieron utilizando el mismo método que anteriormente.
Actividad específica de LTC
Con el fin de examinar la actividad específica de LTC, se llevó a cabo un ensayo ELISPOT de IFN-γ y un ELISA de IFN-γ. Brevemente, se prepararon células A24-LCL ó T2 pulsadas con péptido (1x104/pocillo) como células estimuladoras. Las células cultivadas en 40 pocillos o los clones de LTC tras la dilución limitante se utilizaron como células respondedoras. Se llevaron a cabo ensayos ELISPOT y ELISA de IFN-γ siguiendo el procedimiento del fabricante.
Cultivo celular y transfección
Se establecieron B-LCL HLA-A24 (A24LCL) transformadas con virus de Epstein-Barr. Se obtuvieron Jiyoye, EB-3, COS7, HT1376, RT-4 y J82 de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se mantuvieron A24LCL, Jiyoye y EB-3 en RPMI1640 que contenía suero de feto bovino al 10% (GEMINI Bioproducts) y solución de antibiótico al 1% (Sigma). Las células COS7, HT1376, RT-4 y J82 se mantuvieron en medio apropiado con antibiótico. Las transfecciones de COS7 y HEK se llevaron a cabo utilizando FUGENE6 (Roche). Se estableció un clon de células HEK-A2 estable expresante de la molécula HLA-A*0201, mediante transfección del plásmido pcDNA6.2-HLA-A2 y se
aisló mediante el método de dilución limitante en presencia de 5 μg/ml de blasticidina S.
Inmunogenicidad de los péptidos epítopos en ratones BALB/c
Para la inducción de los LTC específicos de péptido, se administró la inmunización utilizando 100 ml de mezcla de vacuna, que contenía 50 μl (100 μg) de péptido restringido por HLA-A24 y 50 μl de IFA en cada ratón. La vacuna se inyectó subcutáneamente en el flanco derecho para la primera inmunización el día 0 y en el flanco izquierdo para la segunda, el día 7. El día 14, los esplenocitos de los ratones vacunados, sin ninguna estimulación in vitro, se utilizaron como células respondedoras y las células RLmale1 pulsadas o no con péptidos se utilizaron como las células estimuladoras para el ensayo ELISPOT de IFN-γ.
Expresión incrementada de MPHOSPH1 y DEPDC1 en cánceres
Los datos globales de perfilado de expresión génica obtenidos de diversos cánceres utilizando micromatrices de
10 ADNc revelaron que la expresión de MPHOSPH1 (nº de acceso de GenBank NM_016195, SEC ID nº 1) y DEPDC1 (nº de acceso de GenBank BM683578), el cual presentaba dos variantes: DEPDC1 V1 (SEC ID nº 3) y DEPDC1 V2 (SEC ID nº 5), se encontraba incrementado. La expresión de MPHOSPH1 se encontraba válidamente elevada en 30 de 31 cánceres de vejiga, 8 de 36 cánceres de mama, 18 de 18 cánceres cervicales, 5 de 17 carcinomas colangiocelulares, 25 de 31 LMC, 6 de 11 cánceres colorrectales, 6 de 14 cánceres gástricos, 5 de 5 CPCNP, 7 de 7
15 linfomas, 6 de 10 osteosarcomas, 7 de 22 cánceres de próstata, 10 de 18 carcinomas renales y 15 de 21 tumores de tejido blando, en comparación con el tejido normal correspondiente. La expresión de DEPDC1 se encontraba válidamente elevada en 23 de 25 cánceres de vejiga, 6 de 13 cánceres de mama, 12 de 12 cánceres cervicales, 6 de 6 carcinomas colangiocelulares, 3 de 4 LCM, 2 de 4 cánceres colorrectales, 6 de 6 CPCNP, 7 de 7 linfomas, 10 de 14 osteosarcomas, 11 de 24 cánceres de próstata, 14 de 14 CPCP y 22 de 31 tumores de tejido blando, en
20 comparación con el tejido normal correspondiente (Tabla 1).
Predicción de los péptidos de unión a HLA-A24 y a HLA-A2 derivados de MPHOSPH1 ó DEPDC1
La Tabla 2 indica los péptidos de unión de HLA-A*2402 para MPHOSPH1 en orden de afinidad de unión. La Tabla 2A indica los péptidos 9-meros derivados de MPHOSPH1 y la Tabla 2B indica los péptidos 10-meros derivados de MPHOSPH1. La Tabla 3 indica los péptidos de unión de HLA-A*0201 para MPHOSPH1 en orden de afinidad de unión. La Tabla 3A indica los péptidos 9-meros derivados de MPHOSPH1 y la Tabla 3B indica los péptidos 10-meros derivados de MPHOSPH1. La Tabla 4 indica los péptidos de unión de HLA-A*2402 para DEPDC1 V1 y V2 en orden de afinidad de unión. La Tabla 4A indica los péptidos 9-meros derivados de DEPDC1 V1 y V2 y la Tabla 4B indica los péptidos 10-meros derivados de DEPDC1 V1. La Tabla 5 indica los péptidos de unión de HLA-A*0201 para DEPDC1 V1 y V2; la Tabla 5A indica los péptidos 9-meros derivados de DEPDC1 V1 y V2, y la Tabla 5B indica los péptidos 10-meros derivados de DEPDC1 V1 y V2.
[Tabla 2A]
Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de MPHOSPH1
- Posición
- Secuencia de SEC Puntuación Inicio = Secuencia de SEC Puntuación
- inicial
- aminoácidos ID nº de unión Posición aminoácidos ID nº de unión
- 278
- IYNEYTYDL 7 360 179 LFDSLQERL 29 24
- 1244
- DYADLKEKL 13 316,8 268 KFSVWVSFF 30 20
- 1319
- QYERACKDL 14 300 575 KLLDLIEDL 31 17,28
- 459
- CYLAYDETL 15 300 1577 RFPKPELEI 32 16,5
- 462
- AYDETLNVL 16 288 1414 KYNADRKKW 33 16,5
- 1054
- GYKDENNRL 17 288 1230 RTQNLKADL 34 14,4
- 236
- LYGSLTNSL 18 288 1421 KWLEEKMML 35 14,4
- 1446
- KYAEDRERF 19 240 1617 KSNEMEEDL 36 14,4
- 899
- NYDIAIAEL 20 220 1555 KIEDGSVVL 37 14,4
- 1118
- CYKAKIKEL 21 220 1456 KQQNEMEIL 38 12
- 57
- DYLQVCLRI 22 105 389 KTQNEGERL 39 12
- 676
- KFNQIKAEL 23 92,4 1371 KWKEKCNDL 40 11,52
- 14
- SYVFSADPI 24 75 1122 KIKELETIL 41 11,52
- 326
- AYRLLKLGI 25 60 850 FLLTIENEL 42 11,088
- 255
- DYEQANLNM 26 37,5 763 SSLIINNKL 43 11,088
- 29
- NFDGIKLDL 27 28 1400 KLINLQDEL 44 10,56
- 286
- LFVPVSSKF 28 27,72 133 IMQPVKDLL 45 10,08
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de MPHOSPH1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" indicada en Materiales y métodos.
[Tabla 2B]
Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de MPHOSPH1
Posición Secuencia de SEC Puntuación Posición Secuencia de SEC Unión inicial aminoácidos ID nº de unión inicial aminoácidos ID nº
1414 KYNADRKKWL 46 600 1274 KLLRIKINEL 56 15,84 278 IYNEYIYDLF 8 252 1332 KIIEDMRMTL 57 14,4 1446 KYAEDRERFF 47 240 1299 RTIQQLKEQL 58 14,4 611 QYWAQREADF 48 100 1134 KVECSHSAKL 59 13,2 1740 LYTSEISSPI 49 70 859 KNEKEEKAEL 60 13,2 293 KFQKRKMLRL 50 60 586 KLINEKKEKL 61 13,2 849 AFLLTIENEL 51 55,44 943 KLMHTKIDEL 62 13,2 1667 TYSLRSQASI 52 50 838 RVLQENNEGL 63 12 1695 DFLQHSPSIL 53 30 369 RVIRVSELSL 64 12 174 RTLNVLFDSL 54 17,28 1159 RNLKEFQEHL 65 12 870 KOIVHFQQEL 55 15,84 281 EYIYDLFVPV 66 10,8
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de MPHOSPH1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" indicada en Materiales y métodos.
[Tabla 3A]
Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de MPHOSPH1 Posición Secuencia de SEC Puntuación Posición Secuencia de SEC Puntuación inicial aminoácidos ID nº de unión inicial aminoácidos ID nº de unión
575 KLLDLIEDL 31 1278,29 1184 KLKEEITQL 93 24,677 282 YIYDLFVPV 9 1096,62 888 TLSKEVQQI 94 23,995 298 KMLRLSQDV 67 650,504 280 NEYIYDLFV 95 23,802 218 ALLRQIKEV 68 591,888 552 LLDEDLDKT 96 23,415
850 FLLTIENEL 42 363,588 461 LAYDETLNV 97 21,546 1108 ALSELTQGV 69 285,163 980 NLPNTQLDL 98 21,362 331 KLGIKHOSV 70 243,432 409 TLGKCINVL 99 20,145 1689 TLQKFGDFL 71 218,772 175 TLNVLFDSL 100 19,888 1251 KLTDAKKQI 72 149,711 923 KLSNEIETA 101 19,596 638 RLAIFKDLV 10 129,506 1389 KEHENNTDV 102 19,407 1467 QLTEKDSDL 73 87,586 987 DLLGNDYLV 103 19,301 1195 NLQDMKHLL 74 87,586 920 KIMKLSNEI 104 18,577 270 SVWVSFFEI 75 83,497 1703 ILQSKAKKI 105 17,736 129 FQGCIMQPV 76 74,608 512 ILNVKRATI 106 17,736 839 VLQENNEGL 77 72,959 1124 KELETILET 107 17,695 1094 TLDVQIQHV 78 63,988 453 IVNISQCYL 108 17,477 1019 AIWEECKEI 79 48,816 771 UCNETVEV 109 16,258 1696 FLQHSPSIL 80 40,289 623 TLLQEREIL 110 15,879 528 DLMEDEDLV 81 38,775 560 TLEENKAFI 111 15,057 406 SLLTLGKCI 82 38,601 1415 YNADRKKWL 112 14,465 1400 KLTNLQDEL 44 36,637 307 KGYSFIKDL 113 13,65 170 GILPRTLNV 83 35,385 133 IMQPVKDLL 45 12,852 171 ILPRTLNVL 84 34,246 1594 KMAVKHPGC 114 12,558 786 KICSERKRV 85 33,472 365 SEMSRVIRV 115 11,509 880 SLSEKKNLT 86 30,553 1191 QLTNNLQDM 116 11,426 944 LMHTKIDEL 87 29,559 871 QIVHFQQEL 117 11,162 1422 WLEEKMMU 88 28,963 245 NISEFEESI 118 10,951 466 TLNVLKFSA 89 28,814 484 TLNSSQEKL 119 10,468 1539 KLQTEPLST 90 26,082 764 SLIINNKLI 120 10,433 132 CIMQPVKDL 91 24,997 587 UNEKKEKL 121 10,032 1260 KQVQKEVSV 92 24,681
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de MPHOSPH1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" indicada en Materiales y métodos.
[Tabla 3B
Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de MPHOSPH1 Posición Secuencia de SEC Puntuación Posición Secuencia de SEC Unión inicial aminoácidos ID nº de unión inicial aminoácidos ID nº
1274 KLLRIKINEL 56 626,279 1318 QQYERACKDL 140 28,417 551 KLLDEDLDKT 122 445,913 452 MIVNISQCYL 141 27,464 460 YLAYDETLNV 123 319,939 923 KLSNEIETAT 142 26,082 943 KLMHTKIDEL 62 311,777 1257 KQIKQVQKEV 143 24,681 262 NMANSIKFSV 124 291,346 980 NLPNTQLDLL 144 24,075 178 VLFDSLQERL 125 269,948 985 QLDLLGNDYL 145 23,029 770 KLICNETVEV 126 243,432 1427 MMLITQAKEA 146 22,569 34 KLDLSHEFSL 127 173,463 1523 QIMDIKPKRI 147 21,762 407 LLTLGKCINV 128 118,238 1484 QLVAALEIQL 148 21,362 1714 TMSSSKLSNV 11 115,534 466 TLNVLKFSAI 149 19,822 1353 QVLEAKLEEV 129 104,046 511 KILNVKRATI 150 18,577 880 SLSEKKNLTL 130 87,586 1340 TLEEQEQTQV 151 18,25 235 TLYGSLTNSL 131 68,36 372 RVSELSLCDL 152 17,627 1019 AIWEECKEIV 132 65,381 1561 VVLDSCEVST 153 16,816 552 LLDEDLDKTL 133 59,558 309 YSFIKDLQWI 154 14,663 1093 VTLDVQIQHV 134 57,298 353 SIFTVKILQI 155 12,208 559 KTLEENKAFI 135 42,314 1094 TLDVQIQHVV 156 11,407 1332 KIIEDMRMTL 57 42,151 1688 GTLQKFGDFL 157 11,242 152 GLTNSGKTYT 136 40,986 311 FIKDLQWIQV 158 10,732 830 NIAEIEDIRV 137 39,21 1079 TLIQQLKEEL 159 10,468 586 KLINEKKEKL 61 36,637 1128 TILETQKVEC 160 10,363 182 SLQERLYTKM 138 30,553 1487 AALEIQLKAL 161 10,352 1043 QQIEKLQAEV 139 28,912 170 GILPRTLNVL 162 10,249 870 KQIVHFQQEL 55 28,807
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de MPHOSPH1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" descrita en Materiales y métodos.
[Tabla 4A]
Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de DEPDC1
Posición Secuencia de SEC Puntuación Posición Secuencia de SEC Puntuación inicial aminoácidos ID nº de unión inicial aminoácidos ID nº de unión
295 YYELFVNIL 163 360 505 KQLCRSQSL 167 14,4 294 EYYELFVNI 12 86,4 275 VFRTIADYF 168 14 282 YFLDLPEPL 164 43,2 36 HFKKYGNCF 169 12 118 RYPELRKNN 165 21,8 307 GYITVSDRS 170 10,5 338 SFKSTECLL 166 20 298 LFVNILGLL 171 42
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de DEPDC1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" indicada en Materiales y métodos.
[Tabla 4B]
- Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*2402 derivados de DEPDC1
- Posición inicial
- Secuencia de aminoácidos SEC ID nº Puntuación de unión Posición inicial Secuencia de aminoácidos SEC ID nº Puntuación de unión
- 294
- EYYELFVNIL 172 288 275 VFRTIADYFL 182 20
- 281
- DYFLDLPEPL 173 240 113 KTLPRRYPEL 183 15,84
- 118
- RYPELRKNNI 174 216 277 RTIADYFLDL 184 14,4
- 770
- EYPLIYQKRF 175 150 270 GFERDVFRTI 185 12,6
- 267
- TYVGFERDVF 176 150 146 RTPKRHGLHL 186 12
- 523
- SYINTPVAEI 177 82,5 505 KQLCRSQSLL 187 12
- 282
- YFLDLPEPLL 178 36 340 KSTECLLLSL 188 11,52
- 191
- RYVILIYLQT 179 21 295 YYELFVNILV 189 10,5
- 338
- SFKSTECLLL 180 20 129 NFSKDKDSIF 190 10
- 103
- LFRFPATSPL 181 20
- La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de DEPDC1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" indicada en Materiales y métodos.
[Tabla 5A]
Péptidos 9-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de DEPDC1
- Posición
- Secuencia de SEC Puntuación Posición Secuencia de SEC Puntuación
- inicial
- aminoácidos ID nº de unión inicial aminoácidos ID nº de unión
- 674
- FLMDHHOEI 191 728,022 563 RLCKSTIEL 209 21,382
- 589
- LLQPHLERV 192 133,255 506 QLCRSQSLL 210 21,362
- 575
- SLLPASSML 193 79,041 193 VILIYLQTI 211 20,753
- 246
- WVLSAMKCL 194 73,172 297 ELFVNILVV 212 18,201
- 619
- LLMRMISRM 195 71,872 235 ILQNKSDDL 213 17,795
- 581
- SMLTGTOSL 196 57,085 616 KLQLLMRMI 214 16,797
- 290
- LLTFEYYEL 197 54,474 623 MISRMSQNV 215 16,258
- 220
- YIMYNMANT 198 40,111 72 TIQLLRKFL 216 16,155
- 283
- FLDLPEPLL 199 39,307 421 CSLEGIVDV 217 15,841
- 787
- ALFGDKPTI 200 38,601 303 LVVCGYITV 218 15,519
- 582
- MLTGTQSLL 201 36,316 524 YINTPVAEI 219 15,177
- 773
- LIYQKRFPT 202 32,33 194 ILIYLQTIL 220 14,89
- 114
- TLPRRYPEL 203 32,044 239 KSDDLPHWV 221 14,333
- 505
- KQLCRSQSL 167 28,049 576 LLPASSMLT 222 12,668
- 765
- KQFQKEYPL 204 28,049 646 MIHTFSRCV 223 12,356
- 395
- IMGGSCHNL 205 26,228 645 LMIHTFSRC 224 11,589
- 296
- YELFVNILV 206 23,018 653 CVLCCAEEV 225 11,034
- 278
- TIADYFLDL 207 22,882 297 ELFVNILGL 226 13,635
- 601
- ALQLCCLLL 208 21,362
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de DEPDC1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" indicada en Materiales y métodos.
10 [Tabla 5B]
Péptidos 10-meros de unión a HLA-A*0201 derivados de DEPDC1
- Posición
- Secuencia de SEC Puntuación Posición Secuencia de SEC Unión
- inicial
- aminoácidos ID nº de unión inicial aminoácidos ID nº
- 666
- LLAGRLVSFL 227 459,398 575 SLLPASSMLT 241 27,572
- 24
- 674
- FLMDHHQEIL 228 299,484 296 YELFVNILVV 242 21,706
- 588
- SLLQPHLERV 229 290,025 506 QLCRSQSLLL 243 21,362
- 302
- ILVVCGYITV 230 177,358 765 KQFQKEYPLI 244 20,547
- 291
- LTFEYYELFV 231 137,017 682 ILQVPSYLQT 245 19,003
- 201
- ILGVPSLEEV 232 133,255 269 VGFERDVFRT 246 16,735
- 195
- LIYLQTILGV 233 119,657 381 QLVNLRNRRV 247 13,91
- 688
- YLQTAVEKHL 234 98,267 283 FLDLPEPLLT 248 13,712
- 645
- LMIHTFSRCV 235 64,9 395 IMGGSCHNLI 249 12,809
- 581
- SMLTGTQSLL 236 57,085 403 LIGLSNMHDL 250 11,485
- 622
- RMISRMSQNV 237 50,232 773 LIYQKRFPTT 251 10,591
- 618
- QLLMRMISRM 238 42,278 488 TLTVQDQEEL 252 10,468
- 654
- VLCCAEEVDL 239 36,316 224 NMANTSKRGV 253 10,046
- 644
- SLMIHTFSRC 240 34,925 296 YELFVNILGL 254 16,26
- 505
- KQLCRSQSLL 187 28,049 301 NILGLLQPHL 255 10,868
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N-terminal de DEPDC1. La puntuación de unión se deriva de "BIMAS" indicada en Materiales y métodos.
Estimulación de las células T utilizando los péptidos predichos a partir de MPHOSPH1 restringido a HLA-A*2402
Los LTC para aquellos péptidos derivados de MPHOSPH1 (SEC ID nº 2) se generaron según los protocolos indicados en la sección "Materiales y métodos", anteriormente. Los LTC resultantes que presentaban actividad de LTC específica detectable, según evaluación mediante ensayo ELISPOT de IFN-γ, se muestran en las figuras 1A y 2A. En la figura 1A, las células en el pocillo número 4 estimuladas con MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. En la figura 2A, las células en el pocillo número 8 estimuladas con MPHOSPH1-A24-10-278 (SEC ID nº 8) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. A continuación, se expandieron las células en el pocillo positivo y se llevó a cabo dilución limitante. Tal como se muestra en la figura 1B (MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7)) y en la figura 2B (MPHOSPH1-A24-10-278 (SEC ID nº 8)), se determinaron cuáles eran los clones de LTC que presentaban actividades de LTC específica más altas contra la diana pulsada con péptido en comparación con las actividades contra la diana sin pulsado con péptido.
Los clones de LTC estimulados con MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID nº 7)) (figura 3A) y con MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEYIYDLF (SEC ID nº 8)) (figura 3B) demostraron una potente actividad de LTC específica contra la diana pulsada con péptido, sin mostrar ninguna actividad de LTC específica significativa contra dianas no pulsadas con ningún péptido. Esto sugiere que el clon de LTC presenta citotoxicidad específica de péptido.
Actividad de LTC específica contra células diana que expresan MPHOSPH1
Los clones de LTC establecidos que se habían cultivado contra dichos péptidos se examinaron para su capacidad de reconocer las células diana que expresaban endógenamente MPHOSPH1 y HLA-A*2402. Se sometió a ensayo la actividad de LTC contra las COS7 transfectadas tanto con el gen MPHOSPH1 de longitud completa como con la molécula HLA-A*2402, que es un modelo específico para las células diana que expresan endógenamente MPHOSPH1 y HLA-A*2402, utilizando como células efectoras el clon de LTC inducido por MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7). A modo de controles se prepararon COS7 transfectadas con MPHOSPH1 de longitud completa pero no con HLA-A*2402 y COS7 transfectadas con HLA-A*2402 pero no con MPHOSPH1 de longitud completa. El clon de LTC que presentaba la actividad específica de LTC contra COS7 más alta fue el transfectado con MPHOSPH1 y con HLA-A24. Sin embargo, no mostró actividad específica significativa de LTC contra COS7 que no habían sido transfectadas con MPHOSPH1 ni con HLA-A24 (figura 4).
Estos resultados demuestran claramente que MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº se expresaba naturalmente en la superficie de las células diana con la molécula HLA-A24 y que reconocía los LTC.
Actividad de LTC contra líneas celulares de cáncer de vejiga que expresan endógenamente MPHOSPH1
El clon de LTC establecido que se había cultivado contra el péptido MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7) se examinó para su capacidad de reconocer las células tumorales que expresaban endógenamente MPHOSPH1. Se sometió a ensayo la actividad de LCT contra las células HT1376, que expresan endógenamente MPHOSPH1 y HLA-A24, utilizando el clon de LTC inducido por MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7) a modo de células efectoras. Se utilizaron células J82 y RT-4 como células diana que expresan endógenamente MPHOSPH1 pero que no expresan HLA-A24. El clon de LTC establecido mostraba una producción elevada de IFN-γ contra las células HT1376 que expresaban tanto MPHOSPH1 como HLA-A24. Por otra parte, las LTC no mostraban actividad de LTC significativa contra las células J82 y RT-4 que expresaban MPHOSPH1 pero no HLA-A24 (figura 5). Estos resultados demuestran claramente que el péptido MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7) es procesado naturalmente enviándolo a la superficie de las células tumorales con la molécula HLA-A24 y que es reconocido por los LTC.
Inducción in vivo de LTC con el péptido MPHOSPH1-A24-9-278 en ratones BALB/c
Es conocido que la molécula H-2Kd, una molécula del CMH de clase I de ratón, presenta un motivo de anclaje peptídico similar para la molécula HLA-A24 y que reacciona cruzadamente de manera parcial con el péptido restringido por HLA-A24. A continuación, los presentes inventores examinaron si el péptido MPHOSPH1-A24-9-278 induce los LTC in vivo mediante vacunación con este péptido utilizando ratones BALB/c (H-2Kd). Se inyectó por vía subcutánea péptido conjugado con IFA en ratones BALB/c los días 0 y 7. El día 14, se recolectaron esplenocitos y se utilizaron como las células respondedoras para el ensayo ELISPOT. Los esplenocitos de todos los ratones en los que se había inyectado péptido (Anil~5) mostraron una producción potente de IFN-γ en comparación con los ratones de control, los cuales recibieron inyecciones de solo IFA (negal~3) (figura 6). Estos datos indican que el péptido MPHOSPH1-A24-9-278 podría inducir una respuesta de LTC incluso in vivo.
Estimulación de las células T utilizando los péptidos predichos a partir de MPHOSPH1 restringido por HLA-A*0201
Los LTC resultantes que presentaban una actividad de LTC específica detectable, según evaluación mediante ensayo ELISPOT de IFN-γ, se muestran en la figura 7. Tal como se muestra en al figura 7A, las células en los pocillos nº 1 y nº 5, estimuladas con MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID nº 9)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Tal como se muestra en la figura 7B, las células en el pocillo número 8 estimuladas con MPHOSPH1-A2-9-638 (SEC ID nº 10)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Tal como se muestra en la figura 7C, las células en el pocillo número 4 estimuladas con MPHOSPH1-A (TMSSSKLSNV (SEC ID nº 11)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control.
Tal como se muestra en las figuras 8A (MPHOSPH1-A24-9-282 (SEC ID nº 9), 8B (MPHOSPH1-A2-9-638 (SEC ID nº 10) y 8C (MPHOSPH1-A (SEC ID nº 9)), se expandieron estas células en el pocillo positivo, y se determinaron cuáles eran las líneas de LTC que presentaban actividades de LTC específicas más altas contra la diana pulsada con péptido en comparación con las actividades contra la diana sin pulsado de péptido.
Los clones de LTC estimulados con MPHOSPH1-A24-9-282 (YIYDLFVPV (SEC ID nº 9)) (figuras 9A y 9B) demostraron una potente actividad de LTC específica contra la diana pulsada con péptido, sin mostrar ninguna actividad de LTC específica significativa contra dianas no pulsadas con ningún péptido.
Estimulación de las células T utilizando los péptidos predichos a partir de DEPDC1 restringido por HLA-A*2402
Las LTC de los péptidos derivados de DEPDC1 se generaron según el protocolo descrito en la sección de "Materiales y métodos", anteriormente. Los LTC resultantes que presentaban una actividad de LTC específica detectable, según evaluación mediante ensayo ELISPOT de IFN-γ, se muestran en la figura 10. Tal como se muestra en al figura 10A, las células en los pocillos nº 10 estimuladas con DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. A continuación, se expandieron las células en el pocillo positivo y se llevó a cabo dilución limitante. Tal como se muestra en la figura 10B (DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID nº 12)), se determinaron cuáles eran los clones de LTC que presentaban actividades de LTC específica más altas contra la diana pulsada con péptido en comparación con las actividades contra la diana sin pulsado con péptido. Los clones de LTC estimulados con DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)) (figura 11) demostraron una potente actividad de LTC específica contra la diana pulsada con péptido, sin mostrar ninguna actividad de LTC específica significativa contra dianas no pulsadas con ningún péptido. Los resultados sugieren que el clon de LTC presenta citotoxicidad específica de péptido.
Actividad de LTC específica contra células diana que expresan DEPDC1 y HLA-A*2402
Los clones de LTC establecidos que se habían cultivado contra dichos péptidos se examinaron para su capacidad de reconocer las células diana que expresaban endógenamente DEPDC1 y HLA-A*2402. Se sometió a ensayo la actividad de LTC contra las COS7 transfectadas tanto con el gen DEPDC1 de longitud completa como con la molécula HLA-A*2402, que es un modelo específico para las células diana que expresan endógenamente DEPDC1 y HLA-A*2402, utilizando como células efectoras el clon de LTC inducido por DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)). A modo de controles se prepararon COS7 transfectadas con DEPDC1 de longitud completa pero no con HLA-A*2402 y COS7 transfectadas con HLA-A*2402 pero no con DEPDC1 de longitud completa. El clon de LTC demostró una elevada actividad específica de LTC contra las COS7 transfectadas tanto con DEPDC1 como con HLA-A24. Sin embargo, no mostró actividad específica significativa de LTC contra COS7 que no habían sido transfectadas con DEPDC1 ni con HLA-A24 (figura 12).
Estos resultados demuestran claramente que DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)) se expresaba naturalmente en la superficie de las células diana con la molécula HLA-A24 y que reconocía los LTC.
Actividad de LTC contra líneas celulares de cáncer de vejiga que expresan endógenamente DEPDC1
El clon de LTC establecido que se había cultivado contra el péptido DEPDC1-A24-9-294 se examinó para su capacidad de reconocer las células tumorales que expresaban endógenamente DEPDC1. Se sometió a ensayo la actividad de LCT contra las células HT1376, que expresan endógenamente DEPDC1 y HLA-A24, utilizando el clon de LTC inducido por DEPDC1-A24-9-294 a modo de células efectoras. Se utilizaron células J82 y RT-4 como células diana que expresan endógenamente DEPDC1 pero que no expresan HLA-A24. El clon de LTC establecido mostraba una producción elevada de IFN-γ contra las células HT1376 que expresaban tanto DEPDC1 como HLA-A24. Por otra parte, las LTC no mostraban actividad de LTC significativa contra las células J82 y RT-4 que expresaban DEPDC1 pero no HLA-A24 (figura 13). Se demuestra claramente que DEPDC1-A24-9-294 es procesado naturalmente enviándolo a la superficie de las células tumorales con la molécula HLA-A24 y que es reconocido por los LTC.
Inducción in vivo de LTC con el péptido DEPDC1-A24-9-294 en ratones BALB/c
Es conocido que la molécula H-2Kd, una molécula del CMH de clase I de ratón, presenta un motivo de anclaje peptídico similar para la molécula HLA-A24 y que reacciona cruzadamente de manera parcial con el péptido restringido por HLA-A24. A continuación, los presentes inventores examinaron si el péptido DEPDC1-A24-9-294 inducía los LTC in vivo mediante vacunación con este péptido utilizando ratones BALB/c (H-2Kd). Se inyectó por vía subcutánea péptido conjugado con IFA en ratones BALB/c los días 0 y 7. El día 14, se recolectaron esplenocitos y se utilizaron como las células respondedoras para el ensayo ELISPOT. Los esplenocitos de todos los ratones en los que se había inyectado péptido (Anil~5) mostraron una producción potente de IFN-γ en comparación con los ratones de control, los cuales recibieron inyecciones de solo IFA (negal~2) (figura 14). Estos datos indican que el péptido DEPDC1-A24-9-294 podría inducir una respuesta de LTC incluso in vivo.
Estimulación de las células T utilizando los péptidos predichos a partir de DEPDC1 restringido por HLA-A*0201
Los LTC resultantes que presentaban una actividad de LTC específica detectable según cribado mediante ensayo ELISPOT de IFN-γ, se muestran en la figura 15 y en la Tabla 6. Las células en los pocillos nº 4 y nº 7, estimuladas con DEPDC1-A02-10-644 (SLMIHTFSRC (SEC ID nº 240)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 2 estimuladas con DEPDC1-A02-10-575 (SLLPASSMLT (SEC ID nº 241)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 7 estimuladas con DEPDC1-A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEC ID nº 243)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 1 estimuladas con DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEC ID nº 244)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 1 estimuladas con DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEC ID nº 249)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en los pocillos nº 1 y nº 2 estimuladas con DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV (SEC ID nº 253)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 4 estimuladas con DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEC ID nº 226)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en los pocillos nº 3 y nº 4 estimuladas con DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID nº 254)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en los pocillos nº 2, nº 3, nº 5 y nº 7 estimuladas con DEPDC1-A02-10-301 (NILGLLQPHL (SEC ID nº 255)) mostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 6 estimuladas con DEPDC1-A02-9-598 (LLQPHLERV (SEC ID nº 192)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 6 estimuladas con DEPDC1-A02-9-619 (LLMRMISRM (SEC ID nº 195)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 2 estimuladas con DEPDC1-A02-9-290 (LLTFEYYEL (SEC ID nº 197)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 5 estimuladas con DEPDC1-A02-9-563 (RLCKSTIEL (SEC ID nº 209)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en los pocillos nº 1 y nº 3 estimuladas con DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID nº 225)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en el pocillo número 1 estimuladas con DEPDC1-A02-10-674 (FLMDHNQEIL (SEC ID nº 228)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control. Las células en los pocillos nº 2 y nº 6 estimuladas con DEPDC1-A02-10-302 (ILVVCGYITV (SEC ID nº 230)) demostraron una potente producción de IFN-γ en comparación con el control.
Los clones de LTC estimulados con DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID nº 254)) y DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID nº 225)) (figura 16) mostraron una potente actividad de LTC específica contra la diana pulsada con péptido, sin mostrar ninguna actividad de LTC específica significativa contra dianas no pulsadas con ningún péptido. Esto sugiere que el clon de LTC presenta citotoxicidad específica de péptido.
[Tabla 6] Péptidos candidatos de DEPDC1 restringido por HLA-A*0201 nombre de péptido SEC ID nº Pocillo nº
DEPDC1-A02-9-589 192 6 DEPDC1-A02-9-619 195 6 DEPDC1-A02-9-290 197 2 DEPDC1-A02-9-563 209 5 DEPDC1-A02-9-653 225 1 DEPDC1-A02-9-653 225 3 DEPDC1-A02-10-674 228 1 DEPDC1-A02-10-302 230 2 DEPDC1-A02-10-302 230 6
Actividad de LTC específica contra células diana que expresan DEPDC1 y HLA-A*0201
Las líneas de LTC establecidas que se habían cultivado contra DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID nº 254)) y DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID nº 225) se examinaron para su capacidad de reconocer las células diana que expresaban endógenamente DEPDC1 y HLA-A2. Inicialmente, los presentes inventores establecieron que la línea celular HEK293, que expresa constitutivamente HLA-A*0201 (HEK-A2), determina eficientemente la respuesta de LTC específica. Se sometió a ensayo la actividad de LTC específica contra las células HEK-A2 transfectadas con el gen DEPDC1 de longitud completa, que es un modelo específico de células diana que expresan DEPDC1 y HLA-A2, utilizando las líneas de LTC establecidas que se habían cultivado contra DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEC ID nº 254)) y DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEC ID nº 225) a modo de células efectoras. Para los controles negativos se prepararon HEK-A2 transfectadas con vector de expresión simulada y HEK-A2 no pulsadas con el péptido correspondiente derivado de DEPDC1. Las líneas de LTC establecidas mostraron actividad de LTC específica contra HEK-A2 transfectadas con DEPDC1. Por otra parte, las líneas de LTC no mostraron actividad de LTC específica significativa contra HEK-A2 transfectadas con vector de expresión simulada y que habían sido pulsadas con péptido DEPDC1-A02-9-674 ó DEPDC1-A02-9-462 (figura 17). Se demuestra claramente que los péptidos DEPDC1-A02-10-296 y DEPDC-A02-9-653 son procesados naturalmente enviándolos a la superficie de las células diana con la molécula HLA-A2 y que son reconocidos por los LTC.
Análisis de homología de los péptidos antigénicos
Los LTC establecidos contra los péptidos de la presente invención demostraron una potente actividad de LTC. Esto sugiere que las secuencias de MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7), MPHOSPH1-A24-10-278 (SEC ID nº 8), MPHOSPH1-A2-9-282 (SEC ID nº 9), MPHOSPH1-A2-9-638 (SEC ID nº 10), MPHOSPH1-A (SEC ID nº 11), DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID nº 12), DEPDC1-A2-9-589 (SEC ID nº 192), DEPDC1-A2-9-619 (SEC ID nº 195), DEPDC1-A2-9-290 (SEC ID nº 197), DEPDC1-A2-9-563 (SEC ID nº 209), DEPDC1-A2-9-653 (SEC ID nº 225), DEPDC1-A2-10-674 (SEC ID nº 228), DEPDC1-A2-10-302 (SEC ID nº 230) DEPDC1-A02-10-644 (SEC ID nº 240), DEPDC1-A02-10-575 (SEC ID nº 241), DEPDC1-A02-10-506 (SEC ID nº 243), DEPDC1-A02-10-765 (SEC ID nº 244), DEPDC1-A02-10-395 (SEC ID nº 249), DEPDC1-A02-10-224 (SEC ID nº 253), DEPDC1-A02-9-297 (SEC ID nº 226), DEPDC1-A02-10-296 (SEC ID nº 254) y DEPDC1-A02-10-301 (SEC ID nº 255) son homólogas de los péptidos derivados de otras moléculas, que es conocido que sensibilizan el sistema inmunológico humano. Para excluir esta posibilidad, se llevó a cabo un análisis de homología con las secuencias peptídicas como secuencias problema utilizando el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). No se descubrió homología de secuencias significativa.
Estos resultados sugieren que las secuencias de MPHOSPH1-A24-9-278 (SEC ID nº 7), MPHOSPH1-A24-10-278 (SEC ID nº 8), MPHOSPH1-A2-9-282 (SEC ID nº 9), MPHOSPH1-A2-9-638 (SEC ID nº 10), MPHOSPH1-A2-101714 (SEC ID nº 11), DEPDC1-A24-9-294 (SEC ID nº 12), DEPDC1-A2-9-598 (SEC ID nº 192), DEPDC1-A2-9-619 (SEC ID nº 195), DEPDC1-A2-9-290 (SEC ID nº 197), DEPDC1-A2-9-563 (SEC ID nº 209), DEPDC1-A2-9-653 (SEC ID nº 225), DEPDC1-A2-10-674 (SEC ID nº 228), DEPDC1-A2-10-302 (SEC ID nº 230) DEPDC1-A02-10-644 (SEC ID nº 240), DEPDC1-A02-10-575 (SEC ID nº 241), DEPDC1-A02-10-506 (SEC ID nº 243), DEPDC1-A02-10-765 (SEC ID nº 244), DEPDC1-A02-10-395 (SEC ID nº 249), DEPDC1-A02-10-224 (SEC ID nº 253), DEPDC1-A02-9-297 (SEC ID nº 226), DEPDC1-A02-10-296 (SEC ID nº 254) Y DEPDC1-A02-10-301 (SEC ID nº 255) son únicas y de esta manera presentan un riesgo reducido de inducir una respuesta inmunológica no deseada contra cualquier molécula no relacionada.
COMENTARIO potentes y específicas, justifica un desarrollo posterior de la aplicación clínica de las estrategias de vacunación con péptidos en diversos tipos de cáncer (Boon T. et al., J. Exp. Med. 183: 725-9, 1996; van der Bruggen P. et al., Science 254: 1643-7, 1991; Brichard V. et al., J. Exp. Med. 178: 489-95, 1993; Kawakami Y. et al., J. Exp. Med. 180: 347-52, 1994), Shichijo S. et al., J. Exp. Med. 187:277-88, 1998; Chen Y.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-8, 1997; Harris C.C., J. Natl. Cancer Inst. 88:1442-5, 1996; Butterfield L.H. et al., Cancer Res 59:3134-42, 1999; Vissers J.L. et al., Cancer Res 59: 5554-9, 1999; van der Burg S.H. et al., J. Immunol. 156:3308-14, 1996; Tanaka F. et al., Cancer Res. 57:4465-8, 1997; Fujie T. et al., Int. J. Cancer 80:169-72, 1999; Kikuchi M. et al., Int. J. Cancer 81:459-66, 1999; Oiso M. et al., Int. J. Cancer 81:387-94, 1999).
Las tecnologías de micromatrices de ADNc pueden generar perfiles completos de expresión génica de las células malignas (Lin Y.M. et al., Oncogene 21:4120-8, 13 de junio de 2002; Kitahara O. et al., Cancer Res. 61:3544-9, 1 de mayo de 2001; Suzuki C. et al., Cancer Res. 63:7038-41, 1 de nov. de 2003; Ashida S. et al., Cancer Res. 64:596372, 1 de sept. de 2004; Ochi K. et al., Int. J. Oncol. 647-55, marzo de 2004; Kaneta Y. et al., Int. J. Oncol. 23:68191, sept. de 2003; Obama K., Hepatology 41:1339-48, junio de 2005; Kato T. et al., Cancer Res. 65:5638-46, 1 de julio de 2005; Kitahara O. et al., Neoplasia 4:293-303, jul-ag. de 2002; Saito-Hisaminato A. et al., DNA Res. 9: 3545, 2002) y encontrar utilidad en la identificación de AAT potenciales. Entre los transcritos que se encuentran regulados positivamente en diversos cánceres, se han identificado dos nuevos genes humanos, denominados MPHOSPH1 y DEPDC1, respectivamente, utilizando dichas tecnologías.
Tal como se ha demostrado anteriormente, MPHOSPH1 y DEPDC1 se encuentran sobreexpresados en diversos cánceres mientras que muestran una expresión mínima en tejidos normales. Además, se ha demostrado que dichos genes presentan una función significativa relacionada con la proliferación celular (ver la solicitud de patente PCT nº JP2006/302684). De esta manera, los péptidos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1 pueden servir como epítopos AAT que, a su vez, pueden utilizarse para inducir respuestas inmunológicas significativas y específicas contra las células de cáncer.
De esta manera, debido a que MPHOSPH1 y DEPDC1 son AAT nuevos, las vacunas que utilicen estos péptidos epítopos encontrarán utilidad como inmunoterapéuticos contra diversos carcinomas u otras enfermedades que expresan dichas moléculas.
EJEMPLO 2
MATERIALES Y MÉTODOS
Péptidos y adyuvante
Los péptidos sintetizados de grado BPF se obtuvieron de Neo Multi Peptide System (MPS) (San Diego, CA). Como adyuvante se utilizó adyuvante incompleto de Freund (IFA) (MONTANIDE *ISA51). Se emulsionó 1 mg del péptido apropiado con 1 mg de IFA.
Expresión de antígenos
Los presentes inventores llevaron a cabo un análisis inmunohistoquímico. Las células tumorales o tejidos tumorales de cánceres de vejiga obtenidos de cirugía o biopsia se tiñeron con cada uno de los anticuerpos policlonales específicos de MPHOSPH1 y de DEPDC1 El protocolo de tinción fue el establecido en el Human Genome Center, Institute for Medical Science, The University of Tokyo, tal como se ha descrito anteriormente (Kanehira M. et al., Cancer Res. 67(7):3276-3285, 2007; Kanehira M. et al., Oncogene, 23 de abril de 2007 [publ. elec. previa a la impresa]. Se sometió a ensayo la expresión de HLA-A*2402 en el SRL (Tachikawa, Japón).
Pacientes incluidos
Los criterios de inclusión fueron los siguientes:
- 1.
- Pacientes con cáncer de vejiga recurrente no operable sometido previamente a quimioterapia estándar que resultó fallida.
- 2.
- Pacientes con estado funcional 0 ó 1 según los criterios japoneses.
- 3.
- Pacientes de entre 20 y 80 años de edad.
- 4.
- Pacientes con tumor primario o metástasis que puede reconocerse mediante inspección de imágenes (TC/RMI) antes del tratamiento, con independencia de la guía RECIST
- 5.
- Pacientes en los que han transcurrido más de 4 semanas desde el tratamiento anterior (cirugía, quimioterapia, radioterapia, termoterapia, otra inmunoterapia, etc.).
- 6.
- Pacientes con pronóstico esperado de más de 3 meses.
- 7.
- Pacientes con función de la médula ósea (glóbulos blancos (GB)>2.000, 15.000 menos que, placa más de 50.000), función hepática (GOT<150, GTP<150, T-bil<3,0), función renal (Cr<3,0).
- 8.
- Pacientes con HLA-A*2402.
- 9.
- Tumor del paciente con expresión de MPHOSPH1 y/o DEPDC1. Los criterios de exclusión fueron los siguientes:
- 1.
- Pacientes en estado de gestación.
- 2.
- Pacientes lactantes.
- 3.
- Pacientes con deseo de gestación.
- 4.
- Pacientes con infección no controlable.
- 5.
- Pacientes con necesidad de seguimiento médico durante el periodo de ensayo clínico; administración sistémica de esteroides; administración sistémica de inmunosupresor
- 6.
- Pacientes que el médico o investigador principal considera que no deben incluirse en el ensayo.
Protocolo
Los pacientes incluidos con cáncer de vejiga con HLA-A*2402 cuyos tumores expresaban fosfoproteína 1 de etapa M (MPHOSPH1) y/o dominio DEP que contiene 1 (DEPDC1) se inmunizaron con el péptido epítopo restringido por HLA-A*2402, MPHOSPH1-9-278 (IYNEYIYDL (SEC ID nº 7)) y/o DEPDC1-9-294 (EYYELFVNI (SEC ID nº 12)). Cada péptido se combinó con 1 ml de adyuvante incompleto de Freund (IFA, MONTANIDE *ISA51) y se inyectó subcutáneamente en una lesión axilar o inguinal una vez a la semana. Cuatro veces una inyección se define como un curso, y tras 1 curso para la evaluación inmunológica y clínica se extrajo sangre y se llevó a cabo TC/RMI.
Evaluación de la seguridad
La evaluación de los efectos adversos se llevó a cabo según los criterios comunes de toxicidad del National Cancer Institute, versión 3 (NCI-CTC ver. 3).
Evaluación inmunológica
Éste es un criterio de evaluación secundario en el presente estudio y los presentes inventores confirmaron si se había producido respuesta de LTC específica de péptido o no. Se midió una respuesta de LTC específica de la manera siguiente: se recolectaron células mononucleares sanguíneas periféricas y se estimularon nuevamente con los péptidos apropiados. Se sometió a ensayo la respuesta de TCL el día 14º mediante ensayo ELISPOT de IFN-γ.
Evaluación de los efectos antitumorales
La evaluación de la respuesta clínica se llevó a cabo según los criterios RECIST.
RESULTADOS
La Tabla 7 muestra el resumen del presente ensayo clínico. No se produjeron efectos adversos graves, excepto exantema de grado 2 en el Caso 3. Se observó una respuesta menor (Caso 3) y una respuesta mixta (Caso 4). La expresión de MPHOSPH1 se produjo en 4 de 5 casos, mientras que DEPDC1 se expresó en 5 de 5 casos, respectivamente.
Caso 2
En el Caso 2, se incluyó en el presente ensayo clínico una mujer de 72 años de edad con cáncer de vejiga muy avanzado tras el fracaso de la quimioterapia estándar. En la figura 18, la expresión de antígenos del tumor reveló que se expresaban fuertemente tanto MPHOSPH1 como DEPDC1. Por lo tanto, se utilizaron para las vacunaciones dos tipos de péptidos epítopos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1. En el Caso 2 se produjo recurrencia local del cáncer de vejiga. Se evaluó como enfermedad estable (EE) según los criterios RECIST (figura 19).
Caso 3
En el Caso 3, se incluyó en el presente ensayo clínico un hombre de 49 años de edad con cáncer de vejiga muy avanzado tras el fracaso de la quimioterapia estándar. Sólo se expresaba fuertemente DEPDC1 (figura 20). Por lo tanto, se utilizó para las vacunas el péptido epítopo derivado de DEPDC1 únicamente. El Caso 3 presentaba múltiples metástasis pulmonares del cáncer de vejiga. En los lóbulos derecho (figura 21) e izquierdo (figura 22) de las metástasis pulmonares, se redujo la tasa de progresión tras la vacunación. Especialmente se redujo el tamaño del tumor tras los terceros cursos de tratamiento. La figura 23 muestra el efecto antitumoral según los criterios RECIST. Se clarificó que la tasa de progresión del tumor metastásico se reducía tras la vacunación. Indicaba una respuesta menor obtenida mediante la vacunación con el péptido epítopo derivado de DEPDC1. Para la evaluación inmunológica del Caso 3, se midió la respuesta de LTC específica antes y después de la vacunación. Se mostró una respuesta específica de LTC fuerte tras la vacunación (figura 24). Indicaba claramente que los LTC inducidos por el péptido epítopo derivado de DEPDC1 podrían mostrar un efecto antitumoral.
Caso 4
En el Caso 4, se incluyó en el presente ensayo clínico un hombre de 74 años de edad con cáncer de vejiga muy avanzado tras el fracaso de la quimioterapia estándar. De este tumor se expresaban MPHOSPH1 y DEPDC1 (figura 25). Por lo tanto, se utilizaron para las vacunaciones dos tipos de péptidos epítopos derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1. En el Caso 4 se produjo recurrencia local del cáncer de vejiga. Tras 1 curso de vacunación, el tamaño del tumor se redujo en 20% según los criterios RECIST (figura 26). Sin embargo, aparecieron nuevas lesiones metastásicas en pulmones. La respuesta obtenida fue mixta con la vacunación con dos tipos de péptidos epítopos, derivados de MPHOSPH1 y DEPDC1.
COMENTARIO
A continuación se describe la fundamentación del presente ensayo clínico:
- 1.
- debido a que MPHOSPH1 y DEPDC1 no se expresan en los tejidos normales excepto en los testículos, ambos antígenos son altamente específicos de tumor.
- 2.
- Estos péptidos se considera que presentan una fuerte inmunogenicidad, ya que se establecen respuestas de LTC potentes y específicas con estos péptidos epítopos.
- 3.
- El 60% de la población japonesa presenta HLA-A*2402.
- 4.
- Estos péptidos presentan suficiente estabilidad química para la aplicación a un ensayo clínico.
El propósito del presente estudio era obtener información clínica sobre la toxicidad, respuesta inmunológica y actividad antitumoral.
Los efectos adversos previamente informados en ensayos clínicos de vacunas con péptidos son síntomas similares a la gripe, tales como fiebre, cefalea y malestar. En casos raros, se ha informado de reacciones en la piel con ampollas, consideradas una reactividad cruzada en el sitio de la inyección. En el presente estudio no se produjeron efectos adversos severos, excepto exantema de grado 2 en el Caso 3. Este paciente presentaba una historia clínica de exantema durante la quimioterapia. Ello indica que este efecto adverso no se originaba en la vacunación y por lo tanto el presente protocolo podría considerarse seguro.
Se llevó a cabo un análisis inmunológico mediante inducción de una respuesta específica de LTC tras la vacunación. En el Caso 1, no se obtuvo respuesta de LTC específica tras la vacunación (datos no mostrados). En el Caso 3, se obtuvo claramente una respuesta de LTC específica contra el péptido derivado de DEPDC1 tras el 1º y 2º curso de vacunación. En el Caso 3 se obtuvo un efecto antitumoral mediante la vacunación. Demostró claramente que este péptido derivado de DEPDC1 presentaba un efecto antitumoral contra el cáncer de vejiga mediante inducción de una respuesta específica de LTC.
En el Caso 4, tras sólo el primer curso de vacunación se obtuvo un claro efecto antitumoral contra la recurrencia local del cáncer de vejiga. Estos datos apoyan fuertemente que estos péptidos epítopos presentan efectos antitumorales contra el cáncer de vejiga.
En conclusión, se clarificó que la presente terapia de epítopos es segura y que además muestra fuertes efectos antitumorales sin efectos adversos severos. Aplicabilidad industrial La presente invención identifica nuevos AAT, particularmente que inducen potentes respuestas inmunológicas
antitumorales específicas. Dichos AAT justifican un desarrollo adicional de las vacunas de péptidos contra enfermedades asociadas a MPHOSPH1 y/o DEPDC1, por ejemplo cánceres. LISTADO DE SECUENCIAS
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<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 204 <210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 205
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 206
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 207
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 208 <210> 209
<211> 9
<212> PRT
5 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
10 <400> 209
<210> 210
<211> 9 15 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 210
<210> 211 25 <211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 30 <223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 211
- 35
- <210> 212
- <211> 9
- <212> PRT
- <213> Artificial
- 40
- <220>
- <223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
- <400> 212
- 45
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 213
<210> 214
<211> 9
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 214
<210> 215 25 <211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 215
35 <210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 216
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 217
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 218
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 219
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 220
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 221 <210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 222
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 223
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 224
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 225 <210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 226
<210> 227
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 227
<210> 228
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 228
<210> 229
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 229 <210> 231
- <210> 230
- <211> 10
- <212> PRT
- <213> Artificial
- 5
- <220>
- <223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
- <400> 230
- 10
<211> 10
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
20 <400> 231
<210> 232 25 <211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 30 <223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 232
35 <210> 233
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<212> PRT
<213> Artificial
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 233
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 234
<210> 235
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 235
<210> 236
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 236
<210> 237
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 237
<210> 238
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 238 <210> 239
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 239
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 240
<210> 241
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 241
<210> 242
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 242 <210> 243
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 243
<210> 244
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 244
<210> 245
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 245
<210> 246
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 246
<210> 247
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 247
<210> 248
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 248
<210> 249
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 250
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 251 <210> 252
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 252
<210> 253
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 253
<210> 254
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 254
<210> 255
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia peptídica sintetizada artificialmente
<400> 255
Claims (24)
- REIVINDICACIONES1. Péptido seleccionado de entre (a) o (b) a continuación :
- (a)
- péptido que presenta inducibilidad de células T citotóxicas, en el que dicho péptido se deriva de la secuencia de aminoácidos
SEC ID nº 2, en la que dicho péptido presenta menos de aproximadamente 15 aminoácidos y se selecciona de entre el grupo que consiste de péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7 ó 8, o- (b)
- el péptido de (a) en el que se han sustituido, delecionado o añadido 1 ó 2 aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 7 ó 8.
- 2. Péptido según la reivindicación 1(b), en el que el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 7 y 8 presenta por lo menos una sustitución en la secuencia SEC ID nº 7 ó 8 seleccionada de entre el grupo que consiste de:
- (a)
- el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano, y
- (b)
- el aminoácido C-terminal es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.
- 3. Péptido según la reivindicación 1 seleccionado de entre (a) o (b) a continuación:
- (a)
- un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7 ó 8, o
- (b)
- un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7 ó 8 en la que se han sustituido, delecionado o añadido 1 ó 2 aminoácidos.
- 4. Péptido según la reivindicación 3(b), en el que el péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 7 y 8 presenta por lo menos una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste de:
- (a)
- el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano, y
- (b)
- el aminoácido C-terminal es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.
-
- 5.
- Vector que comprende ADN codificante del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
-
- 6.
- Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de los genes de SEC ID nº 1, comprendiendo dicha composición uno o más péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
-
- 7.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para la utilización en el tratamiento o prevención del cáncer.
-
- 8.
- Vacuna para la utilización en la inhibición de la proliferación de células que expresan genes de SEC ID nº 1, que comprenden un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a modo de ingrediente activo.
-
- 9.
- Vacuna según la reivindicación 8, formulada para la administración en un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A24.
-
- 10.
- Vacuna según la reivindicación 8 ó 9, en la que las células son células de cáncer.
-
- 11.
- Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la utilización en el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto.
-
- 12.
- Utilización del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la preparación de una vacuna destinada al tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto.
-
- 13.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 7, vacuna según la reivindicación 10, péptido para la utilización según la reivindicación 11 ó utilización según la reivindicación 12, en la que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, LMC, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, CPCNP, linfoma, osteosarcoma, cáncer de próstata, carcinoma renal, CPCP y tumor de tejido blando.
-
- 14.
- Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la utilización en la inducción de células
presentadoras de antígenos que presentan una elevada inducibilidad de células T citotóxicas mediante el contacto de una célula presentadora de antígenos con dicho péptido. -
- 15.
- Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la utilización en la inducción de células T citotóxicas mediante la puesta en contacto de una célula T con dicho péptido.
-
- 16.
- Polinucleótido codificante del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la utilización en la inducción de células presentadoras de antígenos que presentan una elevada inducibilidad de células T citotóxicas, mediante la transferencia del gen que comprende un polinucleótido codificante de dicho péptido a una célula presentadora de antígenos.
-
- 17.
- Método in vitro de inducción de células presentadoras de antígeno que presentan una elevada inducibilidad de las células T citotóxicas, que comprende la etapa de poner en contacto una célula presentadora de antígenos con el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
-
- 18.
- Método in vitro de inducción de células presentadoras de antígenos que presentan una elevada inducibilidad de las células T citotóxicas, comprendiendo dicho método la etapa de transferir un polinucleótido codificante del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a una célula presentadora de antígenos.
-
- 19.
- Célula T citotóxica inducida mediante la puesta en contacto de una célula T con un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó mediante la transducción con los ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos de subunidades de receptores de células T de unión a dicho péptido.
-
- 20.
- Célula presentadora de antígenos, que comprende un complejo de un antígeno HLA y un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
-
- 21.
- Célula presentadora de antígenos según la reivindicación 20, el péptido producido según la reivindicación 14 ó el polinucleótido según la reivindicación 16.
-
- 22.
- Exosoma que presenta sobre su superficie un complejo que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un antígeno HLA.
-
- 23.
- Exosoma según la reivindicación 22 ó la célula presentadora de antígenos según la reivindicación 20 ó 21, en el que el antígeno HLA es HLA-A24.
-
- 24.
- Exosoma o célula presentadora de antígenos según la reivindicación 23, en el que el antígeno HLA es HLA-A2402.
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