ES2418454T3 - Ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Corynebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y el vector que comprende el casete, célula huésped que comprende el vector y procedimiento de expresión de un gen utilizando la célula - Google Patents

Ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Corynebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y el vector que comprende el casete, célula huésped que comprende el vector y procedimiento de expresión de un gen utilizando la célula Download PDF

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Abstract

Un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC. ID Nº: 4.

Description

Ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Corynebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y el vector que comprende el casete, célula huésped que comprende el vector y procedimiento de expresión de un gen utilizando la célula.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Corynebacterium, a un casete de expresión que incluye el mismo, a un vector que incluye el casete de expresión, a una célula huésped que incluye el vector y un procedimiento de expresión de un gen utilizando la célula huésped.
Técnica anterior
Las bacterias corineformes son microorganismos que se utilizan para producir varios materiales químicos usados en muchas aplicaciones, tales como piensos para animales, medicinas y alimentos, que incluyen L-lisina, L-treonina, y diversos ácidos nucleicos. A través de modificación por ingeniería genética y metabólica puede desarrollarse una cepa de bacterias corineformes que muestre una alta productividad. Para obtener dicha cepa de bacterias corineformes que muestren alta productividad, es necesario que, en la bacteria corineforme, se exprese un gen relacionado con diversas rutas metabólicas. Para esta finalidad, ha de desarrollarse un promotor adecuado.
Generalmente, en las bacterias corineformes, se expresa un gen bajo un promotor intrínsecamente incluido en el mismo. (Véase, por ejemplo, Journal of Bacteriology, 181(19), 6188-6191, 1999). Sin embargo, no se conoce la estructura de una secuencia promotora que exprese un gen en bacterias corineformes, aunque se conocen las estructuras de otros microorganismos industriales, tales como E. coli y Bacillus subtilis. Por tanto, se ha sugerido el siguiente procedimiento para producir promotores que permitan la expresión de un gen en bacterias corineformes. Primero se elimina una región promotora de un gen que es resistente a un antibiótico, tal como cloranfenicol. Por otro lado, se escinde un ADN cromosómico separado de las bacterias corineformes utilizando una enzima de restricción adecuada, y el fragmento resultante se introduce en el gen al que se le ha eliminado la región promotora. Después, el gen obtenido se usa para transformar las bacterias corineformes para producir una nueva cepa transformada y se mide la resistencia al antibiótico de la cepa transformada: (véase Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996). En particular, se ha desarrollado un número muy pequeño de promotores, un ácido nucleico que se sabe que produce el microorganismo, para utilizarse en Corynebacterium ammoniagenes. Por ejemplo, en E. coli, se utiliza un promotor que tiene una actividad aproximadamente un 10 % mayor que la de un promotor tac (véase Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003). Sin embargo, cuando se usa en una expresión de genes masiva, un promotor de este tipo muestra una eficacia baja. La Patente de Estados Unidos Nº 5.593.781 desvela un promotor de ADN que se separa de una cepa de Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) y tiene una actividad mayor que la de un promotor tac. Sin embargo, dicho promotor de ADN que se separa del género Brevibacterium puede que no sea funcional en otras bacterias. Por tanto se necesita desarrollar una secuencia promotora que se derive de Corynebacterium ammoniagenes disponible comercialmente, y que tenga una alta actividad en otras bacterias.
Por consiguiente, los autores de la presente invención buscaban una secuencia promotora fuerte en Corynebacterium ammoniagenes y encontraron que un promotor, de acuerdo con la presente invención, puede expresar genes con alta actividad en Corynebacterium ammoniagenes.
Descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra los resultados del ensayo de electroforesis bidimensional de una muestra extraída de una bacteria Corynebacterium ammoniagenes, en el que los resultados del ensayo se tiñeron con plata y se desarrollaron para su identificación; La FIG. 2 Ilustra un procedimiento de producción de un vector de selección de p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención; y La FIG. 3 ilustra un procedimiento de producción de un vector recombinante que incluye la secuencia promotora pcj1 a pcj7 a partir de un vector de selección p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Problema técnico
La presente invención proporciona un promotor que tiene alta actividad en Corynebacterium.
La presente invención también proporciona un casete de expresión que incluye el promotor y un vector que incluye el casete de expresión.
La presente invención también proporciona una célula huésped que incluye el vector.
La presente invención también proporciona un procedimiento para expresar un gen utilizando la célula huésped.
Solución Técnica
La presente invención proporciona un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC. ID Nº: 4.
El promotor de acuerdo con la presente invención es un ácido nucleico aislado y tiene actividad promotora. En el presente documento, el término “promotor” se refiere a una región de ADN a la que se une una ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen. La expresión “promotor tac” se refiere a un promotor obtenido por la fusión de una secuencia obtenida de la región- 35 de un promotor operón de triptófano de E. coli y una secuencia obtenida de la región -10 de un promotor operón de lactosa de E. coli. Se sabe que el promotor tac tiene una alta actividad promotora. Un promotor que tenga al menos un ácido nucleico seleccionado de las SEC. ID Nos 1, 4, 5, 6 y 7 tiene mayor actividad en las bacterias del género Corynebacterium que el promotor tac. En particular, un promotor que tenga al menos un ácido nucleico seleccionado de las SEC. ID Nos 1 y 4 tiene una actividad 10 veces más alta que la del promotor tac en bacterias del género Corynebacterium.
El promotor de acuerdo con una realización de la presente invención tiene actividad promotora en bacterias del género Escherichia, además de en bacterias del género Corynebacterium.
La célula en la que el promotor de la presente invención puede funcionar puede ser cualquiera de las bacterias del género Corynebacterium. Como ejemplos de bacterias del género Corynebacterium se incluyen Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KC-CM-10330) y ATCC 6871, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 y ATCC 13060, y similares. Sin embargo, las bacterias del género Corynebacterium no están limitadas a éstas. Como ejemplos de bacterias del género Escherichia, en los que puede funcionar un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención, se incluyen E. coli.
La secuencia del promotor de acuerdo con una realización de la presente invención puede cambiarla fácilmente un experto habitual en la técnica a través de un proceso de mutagénesis conocido, tal como evolución directa y mutagénesis dirigida. Por consiguiente, está dentro del ámbito de la presente invención un ácido nucleico que tenga, por ejemplo, una homología del 70 % o más, preferentemente una homología del 80 % o más y más preferentemente una homología del 90 % o más, con la secuencia del promotor aislado que incluye al menos un ácido nucleico seleccionado de la SEC. ID Nº: 4, y que puede actuar como un promotor en bacterias del género Corynebacterium.
La presente invención también proporciona un casete de expresión que incluye el promotor que está unido operativamente a una secuencia codificante. La secuencia codificante puede ser, por ejemplo, todo el gen o una secuencia codificante que codifique una región predeterminada del gen. En el presente documento, la expresión “unido operativamente” indica que la secuencia codificante está funcionalmente conectada al promotor de tal forma que la secuencia promotora puede iniciar o mediar la transcripción de la secuencia codificante. El casete de acuerdo con una realización de la presente invención puede incluir adicionalmente secuencias de control 5’ y 3’ unidas operativamente a la secuencia promotora. La secuencia codificante puede ser un gen asociado a un producto metabólico, tal como IMP, GMP, L-lisina y L-treonina.
La presente invención también proporciona un vector que incluye el casete de expresión de acuerdo con una realización de la presente invención. En el presente documento, el vector no está limitado, y puede ser cualquier vector conocido en la técnica. Como ejemplos del vector de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se incluyen el vector CR2.1-TOPO (producido de Invitrogen Inc, USA) y pECCG117 (KFCC-10673). Sin embargo, el vector no se limita a estos. Como ejemplos del vector que incluye el casete de expresión de acuerdo con una realización de la presente invención se incluyen p117-cj1-gfp, p117-cj2-gfp, p117-cj3-gfp, p117-cj4-gfp, p117-cj5-gfp, p117-cj6-gfp y p117-cj7-gfp.
La presente invención también proporciona una célula huésped que incluye el vector de acuerdo con una realización de la presente invención. La célula huésped puede ser una bacteria del género Corynebacterium o una bacteria del género Escherichia, pero no se limita a estas. Por ejemplo, la célula huésped puede ser Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) o E. coli.
La presente invención también proporciona un procedimiento para expresar un gen exógeno cultivando la célula huésped. Según la célula huésped seleccionada, esta se cultiva en uno de los diversos medios de cultivo conocidos y en diversas condiciones de cultivo conocidas.
Efectos ventajosos
Un gen que está unido operativamente a un promotor de acuerdo con la presente invención se expresa eficazmente en E. coli y en Corynebacterium ammoniagenes. El promotor es adecuado para el desarrollo de una cepa utilizando bacterias del género Corynebacterium.
Un casete de expresión que incluye el promotor de acuerdo con la presente invención y un vector que incluye el casete de expresión de acuerdo con la presente invención son adecuados y expresan eficazmente un gen exógeno en E. coli y en Corynebacterium ammoniagenes.
Una célula huésped de acuerdo con la presente invención puede expresar eficazmente un gen exógeno.
Utilizando un procedimiento para expresar un gen de acuerdo con la presente invención, se puede expresar eficazmente un gen exógeno.
Mejor modo
La presente invención se describirá con más detalle en referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solamente con fines ilustrativos, y no tienen la intención de limitar el ámbito de la presente invención.
Ejemplos
Se prepararon extractos bacterianos a partir de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) a diversas fases de cultivo. Se realizó electroforesis bidimensional e los extractos bacterianos para encontrar en ellos proteínas sobreexpresadas, que después se escindieron para analizar secuencias peptídicas. Las secuencias peptídicas obtenidas se utilizaron para identificar los genes de las proteínas sobreexpresadas. Después, se aislaron las regiones promotoras, y se produjeron los vectores utilizando las regiones promotoras. A continuación, se midieron las actividades del promotor en Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) y E. coli.
Ejemplo 1: Cultivo de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) y selección de la proteína de sobreexpresión de acuerdo con las fases de cultivo.
(1)
Cultivo de las bacterias
Se cultivaron bacterias Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) en un medio que tenía azúcar de melaza de partida (mezcla que contenía glucosa al 50 % y fructosa al 50 %). En ese momento, se midió la concentración celular. Las muestras de las bacterias Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) se recogieron en una fase estacionaria temprana y en fases estacionarias. Se centrifugaron las muestras y se extrajo la solución superior resultante. El sedimento celular obtenido se sometió a lisis en un tampón disgregante para producir aproximadamente 100 !m de un extracto bacteriano.
(2)
Ensayo de electroforesis bidimensional
El extracto bacteriano obtenido en la sección (1) se diluyó utilizando urea 6 M, tiourea 2 M, CHAPS al 4 %, y DDT al 0,4 %, para obtener una mezcla con un volumen total de 350 !l. A continuación, se añadieron a la misma 7 !l de un tampón IPG y 3 !l de bromofenol azul (BPB) al 1 %. La solución resultante se cargó en una bandeja de rehidratación utilizando una tira de gel Immobiline Drystrip con gradiente de pH. La muestra en la bandeja de rehidratación se cubrió con 2 ml de un líquido cobertor para impedir la evaporación de la muestra y la cristalización de la urea, y después se rehidrató a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas.
La tira de gel rehidratada se sometió a isoelectroenfoque a 20 ºC a 0-100 V durante 1 hora, a 300 V durante 1 hora, a 600 V durante 1 hora y a 8000 V durante un tiempo predeterminado, que se ajustó para llegar a un enfoque de 4397 kVh (pH 4-7: 43 kVh, pH 4,5-5,5, pH 5,5-6.7: 97 kVh) utilizando un dispositivo de isoelectroenfoque (Multiphor II: producido por Amersham Bioscience, USA.).
Cuando el isoelectroenfoque se completó, las tiras de gel respectivas se equilibraron en una solución a un pH de 8,8 que contenía Tris-HCl 20 mM, urea 6 M, SDS al 2 %, glicerol al 20 %, acrilamida al 2,5 % y TBP 5 mM durante 15 minutos. Las respectivas tiras equilibradas se cargaron en un gel bidimensional (con un gradiente de concentración del 9 %-16 %) y después se sellaron con una solución SDS que contenía agarosa al 0,5 % que tenía bajo punto de cocción y BPB al 0,001 %. La electroforesis se realizó a 100 V durante aproximadamente 19 horas.
Después de completarse la electroforesis, el gel se inmovilizó en una solución de metanol al 45 % y una solución de ácido acético al 5 %. El ácido acético se lavó durante una hora utilizando agua destilada. El gel se sensibilizó con tiosulfato sódico al 0,02 % durante 2 minutos y se lavó con agua destilada. Después, el gel reaccionó con nitrato de plata al 0,1 % durante 20 minutos y se lavó con agua destilada. El producto de reacción se desarrolló con una solución que contenía carbonato sódico al 2 % (p/v) y formaldehído al 0,04 % (v/v). Cuando apareció una mancha con la intensidad deseada, se detuvo la reacción utilizando ácido acético al 1 %. El gel se lavó con agua destilada y se conservó a 4 ºC en una bolsa de plástico hermética.
Cuando se usó la tinción coomassie, después de que se completara la electroforesis, el gel se fijó utilizando una solución de metanol al 30 % y una solución de ácido acético al 10 % durante una hora, se lavó con agua destilada, y se tiñó con coomassie coloidal brillante G-250 durante 24 horas, y después se blanqueó con una solución de metanol al 10 % y una solución de ácido acético al 7 % durante 4 horas.
(3) Preparación de una muestra peptídica utilizada para espectrometría de masas basada en manchas
El péptido se separó de las manchas utilizando una versión modificada de un procedimiento conocido (Shevchenko y col. Anal. Chem., 68(5), 850-8, 1996).
Primero, se escindió una mancha proteica del gel preparado en la Sección (2), se blanqueó en 120 !l de una solución mixta de ferricianida potásica 30 mM y tiosulfato sódico 100 mM a una relación 1:1, y se lavó con agua destilada y después con 120 !l de acetonitrilo al 50 % / bicarbonato amónico 25 mM (pH 7,8) durante 10 minutos. El producto resultante reaccionó con 50 !l de acetonitrilo al 100 % hasta que aparecía un color blanco durante aproximadamente 5 minutos y luego se secó al vacío.
Se añadieron 10 !l de tripsina apta para electroforesis bidimensional (0,02 !g/!l) a las manchas secas y después se pusieron a reaccionar en hielo durante 45 minutos. Después, se añadió un tampón de bicarbonato amónico 50 mM (pH 7,8) al producto de reacción y se dejó reaccionar a 37 ºC durante 12-14 horas. El producto resultante se trató tres veces con ondas ultrasónicas durante 10 min en 10 !l de TFA al 0,5 % y acetonitrilo al 50 % para extraer el péptido.
(4) Espectrometría de masas
El péptido extraído como se describe anteriormente se ensayó con HPLC-MS/MS. La HPLC-MS/MS se realizó con el sistema HPLC de la serie 1100 (producido por Agilient Inc., USA) y un dispositivo de espectrometría de masas de trampa iónica LCQ DECA Finnigan (producido por ThermoQuest, USA) en los que se instaló una fuente ionizada por nanopulverización. La HPLC se realizó con una columna de fase inversa C18 con microsonda, ácido fórmico al 0,1 % (disolvente A) y una solución (solución B) de acetonitrilo al 90 % (v/v) y un 0,1 % de ácido fórmico que se suministraron en un grado lineal (caudal=1 !l/min) para aislar el péptido.
La detección del péptido se realizó 3 veces utilizando ionización por nanopulverización (NSI) (voltaje del pulverizador: 1,8 kV; temperatura capilar: 200 ºC, voltaje capilar: 34 V, compensación de lente tubular: 40 V; y multiplicador de electrones: -60 V). Las mediciones se obtuvieron en modo centroide. Después de obtener toda la exploración MS de 400-2000 Da, se estableció un valor de umbral de 1x105 recuentos y los iones más fuertes se separaron a través de un espectro “zoom scan” de alta resolución. Después se realizó MS/MS por disociación inducida por colisión (CID). La secuencia de un espectro CID que no estaba codificada se identificó utilizando un programa informático TurboQuest (producido por Thermo Finnigan Inc., USA). Los resultados de una búsqueda SEQUEST se identificaron a través de correlación cruzada y �Cn (correlación delta normalizada).
La secuencia de aminoácidos del péptido se confirmó e identificó utilizando LC MS/MS Q-start Pulsar (producido por Applied Biosystems Inc, USA).
Como resultado, se encontraron 50 proteínas, y se seleccionaron siete proteínas sobreexpresadas de las 50 proteínas. La FIG. 1 muestra los resultados del ensayo de electroforesis bidimensional de una muestra extraída de Corynebacterium ammoniagenes, en la que los resultados del ensayo se tiñeron con plata y se desarrollaron para su identificación. En la FIG. 1, se identificaron siete manchas sobreexpresadas denominadas CJ1 a CJ7. Las funciones de estas siete proteínas sobreexpresadas se indican en la Tabla 1. Las funciones de estas proteínas se identificaron comparando la secuencia del péptido con una secuencia de aminoácidos contenida en la base de datos del banco de genes del NCBI.
Tabla 1
Nombre de la mancha
Proteína Nº de registro del Banco de Genes
Proteína de choque térmico hsp60
AE008903.1
5-carboximetil-2-hidroxi muconato semialdehído deshidrogenasa
NC-006461.1
Homoprotocateculato 2,3-dioxigenasa
NC-005835.1
Factor de extensión temporal de traducción EF-Tu
YP-145957
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
AAA69094
Cisteína sintetasa
AAV89445
Manganeso superóxido dismutasa
NP-940564
Se supuso una secuencia génica de las siete proteínas sobreexpresadas y se analizó para seleccionar una región promotora. Como resultado, se supuso que los oligonucleótidos de las SEC. ID Nos: 1 a 7 separados de la secuencia génica correspondiente a las proteínas denominadas CJ1 a CJ7 tenían actividad promotora.
Ejemplo 2: Fabricación de un vector recombinante p117-cj1-7-gfp que contiene una secuencia promotora y confirmación de la actividad promotora en Corynebacterium ammoniagenes
(1) Amplificación de la secuencia promotora del genoma de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 Se separaron 500 !g de ADN cromosómico de 25 ml de un cultivo de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
incubado durante un día, utilizando un procedimiento sugerido por Eikmann y col. (Gene, 102, 93-98, 1991). El ADN cromosómico separado se utilizó como un molde. Las PCR se realizaron utilizando grupos cebadores (SEC. ID Nos: 10 y 11, 12 y 13, 14 y 15, 16 y 17, 18 y 19, 20 y 21, y 22 y 23) para amplificar los promotores de CJ1 a CJ7 durante 30 segundos a 94 ºC, a 55 ºC, y a 72 ºC, repitiéndolo 30 veces, respectivamente. Como resultado, se amplificaron las secuencias promotoras respectivas pcj1 a pcj7.
(2)
Fabricación del vector de selección
En primer lugar, las PCR se realizaron utilizando, como molde, un vector pGFuv (producido por Clontech Inc, USA) y utilizando, como cebadores, las SEC ID Nos: 8 y 9 a 94 ºC durante 30 segundos, a 55 ºC durante 30 segundos, y a 72 ºC durante un minuto, respectivamente. La PCR se realizó 30 veces a cada temperatura. Como resultado, se amplificó un gen de proteína fluorescente verde (GFP, green fluorescent protein) que no incluía la región promotora. Después, el gen GFP obtenido que no incluía la región promotora se clonó en vectores pCR2.1-TOPO (producidos por Invitrogen, USA), que después se escindieron por pstl y EcoRI y se introdujeron en los sitios pstl y EcoRI de pECCG117 (KFCC-1 0673/KFCC-1 0674), que es un vector lanzadera y que puede expresarse en E. coli y en bacterias corineformes. El vector resultante se utilizó como un vector de selección (p117-gfp) para separar el promotor. La FIG. 2 ilustra un procedimiento para producir el vector de selección de p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención.
(3)
Introducción de la secuencia promotora en un vector de selección e identificación de la actividad promotora en Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
El vector de selección obtenido en la Sección (2), se escindió con una enzima de restricción de Kpnl/EcoRV y después se ligó a las secuencias promotoras de pcj1 a pcj7 que la misma enzima de restricción había escindido para producir vectores recombinantes de p117-cj1-7-gfp en los que los oligonucleótidos de pcj1 a pcj7, que se han separado de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 y a los que se había supuesto actividad promotora, se ligaron al GFP. La FIG. 3 ilustra un procedimiento para producir un vector recombinante que incluye las SEC. ID Nos: pcj1 a pcj7 del vector de selección p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención.
El vector recombinante obtenido se introdujo en Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) preparada para la transformación a través de un procedimiento introducido por van der Rest y col. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545,1999). Con la cepa transformada resultante se hizo un frotis en un medio CM (peptona al 1 %, caldo al 1 %, cloruro sódico al 0,25 %, extracto de levadura al 1 %, 100 mg/ml de adenina, 100 mg/ml de guanina, agar al 2 % (pH 7,2)) que contenía 10 !g/ml de kanamicina y se cultivó a 32 ºC durante 3 días. Se seleccionó una cepa viable de las colonias que mostraron crecimiento. Después, se irradió luz ultravioleta en la cepa seleccionada y se seleccionaron las cepas que irradiaban fluorescencia.
La selección de las cepas que irradiaban fluorescencia indica que los promotores de pcj1 a pcj7 muestran actividad promotora en una bacteria corineforme.
Al mismo tiempo, la actividad promotora se midió cuantitativamente. El vector recombinante de p117-cj1-7-gfp se introdujo en Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) y se cultivó de la misma manera descrita anteriormente. El cultivo se centrifugó para obtener el sedimento bacteriano. Después, el sedimento bacteriano se suspendió en un tampón de extracción de proteínas (EDTA 1 mM de PBS, glicerol al 3 %, solución tritón-X-100 al 1 %, pH 7,5) y se sometió a lisis por ultrasonidos. El lisado se centrifugó y se separó la solución superior resultante que contenía un extracto bacteriano. La cantidad de proteína contenida en el extracto bacteriano se midió mediante un procedimiento del ensayo de Bradford. Posteriormente se irradió una luz de 488 nm en el extracto bacteriano en la misma cantidad que el extracto bacteriano descrito anteriormente utilizando un procedimiento introducido por Laure Gory y col. (FEMS Microbiology Letters 194, 127-133, 2001) y la luz emitida se midió utilizando un espectrofotómetro LS-50B (Perkin-Elmer) para encontrar el grado de expresión del gen GFP y se encontró que tenía una longitud de onda de 511 nm.
Los resultados se muestran en la Tabla 2. Como se muestra en esta Tabla, el promotor de acuerdo con una realización de la presente invención dirige una expresión eficaz de un gen GFP. Más particularmente, los promotores de pcj1 y pcj4 mostraron la eficacia más elevada en comparación con los otros promotores.
Tabla 2
Promotor
pcj1 pcj2 pcj3 pcj4 pcj5 pcj6 pcj7
12309
437 479 11790 1363 5651 2493
Ejemplo 3: Comparación de la actividades del promotor tac y de un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención en Corynebacterium ammoniagenes
En este experimento, se compararon las actividades de un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención y un promotor tac que se utiliza convencionalmente en Corynebacterium ammoniagenes.
(1) Fabricación de un vector que contiene la secuencia del promotor tac y el gen GFP combinados
En primer lugar, la PCR se realizó utilizando, como molde, un vector pKK223-2 (producido por Pharmacia Biotech, USA) y utilizando, como cebadores, las SEC. ID Nos: 24 y 25 de la misma manera que en el Ejemplo 1 para amplificar la secuencia del promotor tac. El producto amplificado se clonó en un vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, USA). Posteriormente, para obtener un vector de expresión recombinante (p117-tac-gfp), la secuencia del promotor tac obtenida se escindió con las enzimas de restricción kpnl y EcoRV y se ligó a p117-gfp que las mismas enzimas de restricción habían escindido.
El vector recombinante se utilizó para transformar Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 de la misma manera que en el Ejemplo 1, y se midió la actividad del gen GFP. Se comparó la actividad del gen GFP debida al promotor tac con la actividad del gen GFP debida al promotor seleccionado de acuerdo con el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Promotor
pcj1 pcj2 pcj3 pcj4 pcj5 pcj6 pcj7 Ptac
1140 %
40 % 44 % 1092 % 126 % 523 % 231 % 100 %
Como se muestra en la Tabla 3, se encontró que un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención expresaba eficazmente un gen GFP. Además, cuando en Corynebacterium ammoniagenes la actividad de los promotores de acuerdo con una realización de la presente invención se comparaba con la actividad del promotor tac en Corynebacterium ammoniagenes, los promotores pcj1, pcj4, pcj5, pcj6 y pcj7 mostraban mayores intensidades que el promotor tac. En particular, los promotores de pcj1 y pcj4 mostraron 10 veces la actividad del promotor tac.
Ejemplo 4: Confirmación de la actividad del promotor de acuerdo con la presente invención en E. coli
Se confirmó que el promotor de acuerdo con una realización de la presente invención mostraba actividad en E. coli además de en bacterias corineformes. La E. coli se transformó con el vector de expresión recombinante utilizado en los Ejemplos 1 y 2.
Se determinó si el promotor de acuerdo con una realización de la presente invención permitía la expresión eficaz del gen GFP en E. coli, midiendo la actividad del gen GFP de la misma manera que en el Ejemplo 1. Un vector de referencia fue un vector recombinante p117-tac-gfp que contenía un promotor tac. La tabla 4 muestra la actividad promotora de los promotores de acuerdo con realizaciones de la presente invención en E. coli.
Tabla 4
Promotor
pcj1 pcj2 pcj3 pcj4 pcj5 pcj6 pcj7 ptac
296 %
15 % 20 % 17 % 19 % 24 % 24 % 100 %
Como se muestra en la Tabla 4, se encontró que, en E. coli, el promotor de acuerdo con una realización de la presente invención expresaba eficazmente el gen GFP. Mas particularmente, el promotor pcj1 muestra una alta actividad tanto en bacterias corineformes como en E. coli.
Ejemplo 5: Efectos del IPTG sobre la actividad del promotor de acuerdo con la presente invención
Se sabe que un promotor tac es un promotor representativo en el que, en E. coli, la expresión génica es inducible por IPTG (isopropil-tio-1-D-galactósido). En otras palabras, en E. coli, la cantidad de un gen expresado por el promotor tac varía de acuerdo con la presencia o ausencia de IPTG.
En este experimento, se midieron los efectos de IPTG sobre la expresión de un gen GFP por un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención. Con esta finalidad, un vector recombinante, que contenía el promotor pcj1 que tiene una actividad más alta que los otros promotores de p117-cj1-gfp, se introdujo en E. coli y Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) de la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2, y se midió de esta manera la cantidad de gen GFP expresado. La referencia fue un vector recombinante de p117-tac-gfp que contenía un promotor tac.
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5
Célula huésped
Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 E. coli
Inducción
Inducción con IPTG Sin inducción Inducción con IPTG Sin inducción
Promotor
ptac pcj1 ptac pcj1 ptac pcj1 ptac
Intensidad de fluorescencia
2089 5530 1959 5048 6480 7165 2314
Como se muestra en la tabla 5, un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención expresa más eficazmente un gen GFP en E. coli y en Corynebacterium ammoniagenes que un promotor tac, independientemente de la presencia de IPTG.
Los promotores de pCJ1, pCJ2, pCJ3, pCJ4, pCJ5, pCJ6 y pCJ7 obtenidos en los Ejemplos descritos anteriormente
5 se insertaron en pECCG117. Los vectores obtenidos se utilizaron para transformar E. coli DH5. Los transformantes resultantes se depositaron en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), que es una organización internacional de depósito según el Tratado de Budapest, el 11 de junio de 2004 (números de depósito: KCCM10611, KCCM-10612, KCCM-10613, KCCM-10614, KCCM-10615, KCCM-10616 y KCCM-10617).
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<130> PN05941
<160> 24
20 <170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 301
<212> ADN 25 <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
<400> 1
<210> 2
<211> 285
<212> ADN
<213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 35
<400> 2
40 <210> 3
<211> 291
<212> ADN
<213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
<400> 3
5 <210> 4
<211> 312
<212> ADN
<213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
10 <400> 4
<210> 5 15 <211> 249
<212> ADN
<213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
<400> 5 20
<210> 6
<211> 332
<212> ADN
<213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
<400> 6 <210> 7
<211> 318
<212> ADN
<213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
<400> 7 <210> 11
15
<210> 8 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> cebador
20
<400> 8 acgcgatatc atgagtaaag gagaagatct t 31
25
<210> 9 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> cebador <400> 9 aaaactgcag ttatttgtag agctcatcca t 31
35
<210> 10 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
40
<220> <223> cebador
<400> 10 cggggtacca ccgcgggctt attccattac at
32
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 11 acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc
<210> 12
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 12 cggggtacca attccaccag acgttgttta gta
<210> 13
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 13 acgcgatatc tgtgcactcc ttgttcttcg tg
<210> 14
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 14 cggggtaccg ctgcctacat ctggacttct gac
<210> 15
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 15 acgcgatatc gatgactcct agtgaggtta a
<210> 16
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 16 cggggtacca ctgggagggt aggggtcac
<210> 17
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 17 acgcgatatc tgtatgtcct cctggacttc 30
<210> 18
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 18 cggggtacct cggacatata cggatttacc tg 32
<210> 19
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 19 acgcgatatc gttgtctcct aaaaagttgg g 31
<210> 20
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 20 cggggtaccg gcttcatcgt cgtct 25
<210> 21
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 21 acgcgatatc atggcctcct cttaatagac 30
<210> 22
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 22 cggggtacca gaaacatccc agcgctacta ata 33
<210> 23 <211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5 <220>
<223> cebador
<400> 23 acgcgatatc agtgtttcct ttcgttggg 29 10
<210> 24
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15
<220>
<223> cebador
<400> 24 20 cggggyaccc ggagcttatc gactgcacg 29

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC. ID Nº: 4.
  2. 2.
    Un casete de expresión que comprende el promotor de la reivindicación 1 y que está unido operativamente a una secuencia codificante.
    5 3. Un vector que comprende el casete de expresión de la reivindicación 2.
  3. 4.
    Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 3.
  4. 5.
    La célula huésped de la reivindicación 4 que es una célula bacteriana que pertenece al género Corynebacterium o al género Escherichia.
  5. 6. Un procedimiento de expresión de un gen exógeno que comprende cultivar la célula huésped de las 10 reivindicaciones 4 o 5.
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