ES2420957T3 - Tratamiento con MAPC de lesiones y enfermedades cerebrales - Google Patents

Abstract

Células para uso en el tratamiento de una lesión cerebral en un individuo propenso a sufrir, que estásufriendo o que ha sufrido una lesión cerebral en donde las células no son células madre embrionarias, célulasgerminales embrionarias, o células germinales en donde las células expresan oct-3/4 y telomerasa y son alogénicaso xenogénicas al individuo y pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de al menos dos de loslinajes embrionarios endodérmico, ectodérmico y mesodérmico y se administran por una ruta eficaz y en unacantidad eficaz para tratar dicha lesión cerebral, en donde dicho individuo no se trata con una terapiainmunosupresora combinada al tratamiento con dichas células.

Description

Tratamiento con MAPC de lesiones y enfermedades cerebrales.

5 Campo de la Invención

El campo de la invención es el tratamiento de lesiones, trastornos, disfunciones, y enfermedades cerebrales utilizando células progenitoras adultas multipotentes ("MAPCs"), en particular el tratamiento de lesiones cerebrales hipóxicas e isquémicas, con inclusión de Lesión e Ictus Cerebral Hipóxico-Isquémico.

Antecedentes de la Invención

Las lesiones cerebrales, con inclusión de las enfermedades cerebrales, son un problema sanitario importante tanto en los Estados Unidos como en todo el mundo. Muchas lesiones cerebrales se originan por hipoxia, con inclusión de

15 hipoxias focales, causadas a menudo por estenosis o bloqueo en el suministro de sangre al cerebro, e hipoxias difusas, causadas generalmente por constricciones en el suministro de aire de un individuo. Las hipoxias focales pueden conducir, por ejemplo, a infartos e ictus corticales. Las hipoxias difusas pueden conducir a lesión cerebral hipóxico-isquémica ("lesión HI"). Los infartos e ictus corticales, así como la lesión HI, son problemas sanitarios importantes.

La lesión HI y sus consecuencias concomitantes afectan a un número importante de nacidos vivos cada año. La medida de la incidencia y los efectos de la lesión cerebral isquémica e hipóxica en los niños es compleja; pero el número de pacientes afectados es grande por cualquier estimación. La lesión HI tiene una incidencia tan alta como 1 en 4000 nacidos vivos. Véase Nelson et al., Lancet Neurol. 3:150-158 (2004. La mayoría de estos niños pequeños

25 sobreviven con déficits considerables cognitivos y motores. Véase Barker, Ann Med. 31: Suppl. 1:3-6 (1999). La encefalopatía neonatal debida a todas las causas ocurre en 1 a 6 de cada 1000 nacidos. Véase, por ejemplo, el sitio de internet del American College of Obstetricians y Gynecologists: www.acog.org. El riesgo de asfixia neonatal intrapartum se estima de 2,5% de todos los nacidos vivos. Véase Heinonen et al., BJOG 109:261-264 (2002). De este gran número de niños, un número menor sufren encefalopatía HI lo bastante importante para producir lesión cerebral con discapacidad motora y cognitiva asociada. La parálisis cerebral, o discapacidad motora crónica no progresiva, afecta a entre el 1 y el 2 por 1000 de los individuos en los Estados Unidos. Aproximadamente 6% de estos pacientes han adquirido su discapacidad por lesiones de nacimiento relacionadas con la lesión HI. Véase, por ejemplo, el sitio NINDS en la red en www.ninds.nih.gov.

35 El resultado clínico global actual de niños a término con lesión HI es malo. De todos los recién nacidos a término que sufren una lesión HI, el 10% mueren y el 30% quedan deteriorados neurológicamente con carácter permanente. Véase Volpe, NEUROLOGY OF THE NEWBORN, 4ª edición, W.B. Sanders, Philadelphia (2001). Las estadísticas generadas por el grupo de control de la prueba de hipotermia en Fase I recién publicada, Randomized Controlled Trial of Hypothermia for Hypoxic-Ischemic Encephalopathy in Term Infants, encontraron niveles de mortalidad mayores aún: 37% de los recién nacidos incluidos murieron y el 25% quedaron deteriorados neurológicamente. Véase Shankaran et al., NEngl J Med. 353:1574-1584 (2005).

Aparte de los cuidados de ayuda, la terapia para la lesión HI es limitada. Se ha comunicado que la hipotermia de cuerpo entero es segura y beneficiosa en una prueba clínica multicentro de Fase I en el tratamiento de la HI

45 neonatal. Sin embargo, la utilidad de la terapia parece limitarse a un corto periodo después del nacimiento. Véase Shankaran (2005) citado anteriormente.

La falta de terapia, el número de individuos afectados, unido a los costes necesarios para facilitar atención y rehabilitación durante toda la vida, indican que la lesión HI representa una necesidad médica actual, importante y no satisfecha. Gran parte de esto mismo es aplicable a una diversidad de otras afecciones caracterizadas por deterioro del tejido cerebral, particularmente el tejido cerebral cortical, tal como el resultante de hipoxia, infarto, y otras lesiones y/o agresiones, tales como, por ejemplo lesiones que producen isquemia y/o necrosis, tales como isquemia y/o necrosis que dan como resultado y/o están asociadas con lesión cerebral HI, accidente cerebral, y/o ictus. Por tanto, hay necesidad de métodos mejorados para el tratamiento de estas lesiones, patologías, y enfermedades

55 afines análogas.

El uso de células madre ha atraído cierto interés para este propósito, y se han registrado algunas observaciones estimulantes en esta área. Una diversidad de células madre han sido aisladas y caracterizadas en los últimos años.Éstas abarcan desde las de potencial de diferenciación muy restringido y capacidad limitada para crecer en cultivo hasta aquéllas con potencial de diferenciación aparentemente no restringido y capacidad ilimitada para crecer en cultivo. Las primeras han sido generalmente las más fáciles de producir y pueden obtenerse de una diversidad de tejidos adultos. Las últimas han tenido que derivarse de células germinales y embriones, y se conocen como células madre embrionarias ("ES"), células germinales embrionarias ("EG"), y células germinales. La célula madre embrionaria ("ES") tiene capacidad de auto-renovación ilimitada y puede diferenciarse en todos los tipos de tejido. 65 Las células ES se derivan de la masa celular interna del blastocisto. Las células germinales embrionarias ("EG") se derivan de células germinales primordiales de un embrión después de la implantación. Las células madre derivadas

de tejido adulto han sido de valor limitado debido a que son inmunógenas, tienen potencial de diferenciación limitado, y tienen una capacidad limitada para propagarse en cultivo. Las células ES, EG, y germinales no adolecen de estas desventajas, pero tienen una propensión acusada a formar teratomas en hospedadores alogénicos, suscitando una preocupación lógica en cuanto a su uso en tratamientos médicos. Por esta razón, existe pesimismo

5 acerca de su utilidad en aplicaciones clínicas, a pesar de su potencial de diferenciación ventajosamente amplio. Las células madre derivadas de embriones están sujetas también a controversias éticas que pueden impedir su uso para tratamiento de enfermedades.

Ciertos esfuerzos para encontrar una alternativa a las células ES, EG, y células germinales han concentrado su atención en células derivadas de tejido adulto. Si bien se han identificado células madre adultas en la mayoría de los tejidos de mamífero, su potencial de diferenciación es restringido y considerablemente más estrecho que el de las células ES, EG, y germinales. De hecho muchas de tales células pueden dar lugar solamente a uno o un pequeño número de tipos de células diferenciados, y muchas otras están restringidas a un solo linaje embrionario. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas pueden diferenciarse únicamente para formar células del linaje

15 hematopoyético, las células madre neurales se diferencian únicamente en células de origen neuroectodérmico, y las células madre mesenquimáticas ("MSCs") se limitan a células de origen mesenquimático (tipos de células mesodérmicas). De acuerdo con ello, estos tipos de células madre están limitados inherentemente en su aplicabilidad terapéutica.

De acuerdo con lo anterior, se ha registrado una necesidad de células madre que puedan utilizarse para el tratamiento de infartos corticales, lesión HI, y otras enfermedades que tienen la capacidad de auto-renovación y diferenciación de las células ES, EG y germinales pero no son inmunógenas; no forman teratomas cuando se aplican a un hospedador por aloinjerto o xenoinjerto; no plantean otros problemas de seguridad asociados con las células ES, EG y germinales; retienen las otras ventajas de las células ES, EG y germinales; son fáciles de aislar de

25 fuentes fácilmente disponibles, tales como placenta, cordón umbilical, sangre del cordón umbilical, sangre normal, y médula ósea; pueden almacenarse en condiciones seguras durante periodos prolongados; se pueden obtener fácilmente y sin riesgo de voluntarios, donantes o pacientes, y otras personas que presten su consentimiento; y no implican las dificultades técnicas y logísticas involucradas en la obtención y el trabajo con las células ES, EG y germinales.

Un tipo de célula, denominado en esta memoria células progenitoras adultas multipotentes ("MAPCs"), ha sido aislado y caracterizado (véase, por ejemplo, la Patente US Núm. 7.015.037). (Se ha hecho referencia también a las "MAPCs" como "MASCs"). Estas células proporcionan muchas de las ventajas de las células ES, EG y germinales, sin muchos de sus inconvenientes. Por ejemplo, las MAPCs son susceptibles de cultivo indefinido sin pérdida de su

35 potencial de diferenciación. Las mismas admiten injerto y diferenciación eficientes a largo plazo a lo largo de linajes de desarrollo múltiples en ratones NOD-SCID y lo hacen sin evidencia de formación de teratomas (observados a menudo con las células ES, EG y germinales) (Reyes, M. y C.M. Verfaillie Ann Ny Acad Sci. 938: 231-5 (2001)).

Sumario de la Invención

Por tanto, en algunas de sus realizaciones la invención proporciona células para uso en el tratamiento de una lesión cerebral en un individuo propenso a sufrir, que está sufriendo o que ha sufrido una lesión cerebral, en donde las células (i) no son células madre embrionarias, no son células germinales embrionarias, y no son células germinales;

(ii) pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de al menos dos de los linajes embrionarios

45 endodérmico, ectodérmico y mesodérmico; y se administran por una ruta eficaz y en una cantidad eficaz para tratar dicha lesión cerebral, con o sin tratamiento inmunosupresor combinado.

En algunas realizaciones la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad es una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad del cerebro. En algunas realizaciones, se trata de una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad en y/o de la córtex cerebral. En algunas realizaciones se trata de una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad en y/o del hipocampo. En algunas realizaciones se trata de una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad en y/o del córtex cerebral (al que se hace referencia también como la región cortical del cerebro).

En algunas realizaciones, en relación con todos y cada una de los casos anteriores, entre otras, la lesión, disfunción,

55 trastorno, y/o enfermedad es una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad asociado(a) con y/o causado(a) por falta de oxígeno. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad está causada por hipoxia. En algunas realizaciones a este respecto la hipoxia es focal. En algunas realizaciones a este respecto, la hipoxia es difusa. En algunas realizaciones a este respecto, la enfermedad es lesión cerebral hipóxicoisquémica.

En algunas realizaciones, también en relación con lo anterior, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad es una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad asociado(a) con y/o causado por un suministro insuficiente de sangre. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad está causada por una estenosis o bloqueo arterial o venoso, con inclusión, pero sin carácter limitante, de un bloqueo causado por un 65 trombo o un émbolo. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad está asociado(a) con y/o causado por un infarto y/o isquemia. En algunas realizaciones a este respecto la lesión,

disfunción, trastorno, y/o enfermedad está asociado(a) con y/o causado por necrosis. En algunas realizaciones a este respecto, el infarto es un infarto cortical. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad es un ictus cerebral.

5 En algunas realizaciones de la invención, las células (MAPCs) se utilizan solas. En algunas realizaciones, las células se utilizan junto con otros agentes terapéuticos como modalidad terapéutica primaria. En algunas realizaciones, las células se utilizan como el agente terapéutico único. En algunas realizaciones, las células se utilizan junto con uno o más agentes terapéuticos distintos. En algunas realizaciones, las células se utilizan solas o con uno o más agentes terapéuticos distintos en una o más modalidades terapéuticas primarias. En algunas realizaciones, las células se utilizan solas o con uno o más agentes terapéuticos distintos en una o más modalidades terapéuticas combinadas. En algunas realizaciones, las células se utilizan solas o con uno o más agentes terapéuticos distintos en una o más modalidades terapéuticas primarias y en una o más modalidades terapéuticas combinadas.

La materia que constituye el objeto de la invención en algunos aspectos y realizaciones se expone adicionalmente

15 con carácter ilustrativo en los párrafos numerados que siguen. Los párrafos son ilustrativos de la invención, y puede obtenerse una comprensión completa de la invención únicamente por lectura de la totalidad de la presente exposición, con inclusión de todo el texto, todas las figuras, el resumen proporcionado con esta memoria y la interpretación de la materia que constituye el objeto descrita ilustrativamente en ellos desde el punto de vista y con el conocimiento y la experiencia de una persona experta en las técnicas pertinentes a ello y a las que se refiere la invención.

La expresión "según lo que antecede o lo que sigue" citada en cualquiera de los párrafos numerados dados significa la materia objeto de dicho párrafo individualmente en cada posible combinación con la materia que constituye el objeto de uno cualquiera o más de otros párrafos numerados. A este respecto, los párrafos soportan explícitamente

25 las reivindicaciones para la totalidad de dichas combinaciones de la materia que constituye el objeto expuesta en ellos. En ciertos casos, en los que la materia objeto de un párrafo numerado está excluida de la combinación con la materia objeto de un párrafo numerado diferente, la exclusión se indica por la frase "según lo que antecede o lo que sigue excepto el o los números", en donde el o los números identifican el o los párrafos excluidos.

1. Células para uso en el tratamiento de una lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o trastorno cerebral y/o enfermedad cerebral en un individuo, que comprenden: administrar a un individuo propenso a sufrir, que está sufriendo, o que ha sufrido una lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o trastorno cerebral y/o enfermedad cerebral por una ruta eficaz y en una cantidad eficaz para tratar dicha lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o trastorno cerebral y/o enfermedad cerebral, células (MAPCs) que: no son células madre embrionarias, células

35 germinales embrionarias, o células germinales, y pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmico, ectodérmico, y mesodérmico.

2.

Células según lo que antecede o lo que sigue, excepto 60-65, en donde dicho individuo no está tratado con una terapia inmunosupresora de modo combinado al tratamiento con dichas células.

3.

Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde la lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o trastorno cerebral, y/o enfermedad cerebral está causada por hipoxia.

4. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde la lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o

45 trastorno cerebral, y/o enfermedad cerebral está causada por una oclusión o un bloqueo del suministro de sangre al cerebro.

5.

Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde la lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o trastorno cerebral, y/o enfermedad cerebral es un infarto.

6.

Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde la lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o trastorno cerebral, y/o enfermedad cerebral es un infarto cortical.

7. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde la lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o 55 trastorno cerebral, y/o enfermedad cerebral es un ictus.

8.

Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde la lesión cerebral y/o disfunción cerebral, y/o trastorno cerebral, y/o enfermedad cerebral es lesión cerebral hipóxico-isquémica.

Las células no pueden ser inmunógenas en dicho individuo.

9.

Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de los linajes embrionarios endodérmico, ectodérmico, y mesodérmico.

65 10. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células expresan telomerasa.

11. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células son positivas para oct-3/4.

12. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células han sufrido al menos 10 a 40 duplicaciones celulares en cultivo antes de su administración al individuo.

5 Las células pueden ser células de mamífero con inclusión de células humanas, de caballo, vaca, cabra, oveja, cerdo, rata, o ratón.

Las células pueden derivarse de células aisladas de cualquier tejido placentario, tejido del cordón umbilical, sangre del cordón umbilical, médula ósea, sangre normal, tejido esplénico, tejido del timo, tejido de la médula espinal, tejido adiposo, y tejido hepático.

13. Células según cualquiera de lo anterior o lo que sigue, en donde dichas células se derivan de células

aisladas de una cualquiera o más de médula ósea o sangre. 15

14. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células son alogénicas para el individuo.

15. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células son xenogénicas para el individuo.

El individuo puede ser un mamífero.

El individuo puede ser un animal mascota mamífero, un animal mamífero de ganado, un animal mamífero de investigación, o un primate no humano. 25 El individuo puede ser un humano.

16. Células según algo de lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células se administran al individuo en una o más dosis que comprenden 105 a 108 de dichas células por kilogramo de la masa del individuo.

Las células pueden administrarse al individuo en una o más dosis que comprenden 104 a 108 con inclusión de 105 a 107 de dichas células por kilogramo de la masa del individuo.

17. Células según lo anterior o lo que sigue, en donde dichas células se administran al individuo en una o

35 más dosis que comprenden 106 a 5 x 107 de dichas células por kilogramo de la masa del individuo. Las células se pueden administrar al individuo en una o más dosis que comprenden 2 x 107 a 4 x 107 de dichas células por kilogramo de la masa del individuo.

Además de dichas células, se pueden administrar a dicho individuo uno o más factores. Además de dichas células, se pueden administrar a dicho individuo uno o más factores de crecimiento, factores de diferenciación, factores de señalización, y/o factores que aumentan el retorno. 45 Pueden administrarse a dicho individuo una o más citoquinas. Las células se pueden administrar a un individuo en combinación con otro tratamiento que se administre antes, al mismo tiempo o después de la administración de dichas células.

18. Células según lo anterior o lo siguiente, en donde se administran adicionalmente a dicho individuo uno o más agentes antibióticos.

19. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde se administran adicionalmente a dicho

individuo uno o más agentes antifúngicos. 55

20. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde se administran adicionalmente a dicho individuo uno o más agentes antivirales.

Se puede administrar a dicho individuo cualquier combinación de dos o más de agentes antibióticos y/o agentes antifúngicos y/o agentes antivirales.

Las células se pueden administrar en una formulación que comprende uno o más agentes farmacéuticamente activos distintos.

65 Las células se pueden administrar en una formulación que comprende uno o más agentes antibióticos.

Las células se pueden administrar en una formulación que comprende uno o más agentes antifúngicos.

Las células se pueden administrar en una formulación que comprende uno o más agentes antivirales.

5 21. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células se administran al individuo por ruta parenteral.

Las células se pueden administrar al individuo por una cualquiera o más de las rutas parenterales siguientes: inyección intravenosa, intraarterial, intracardiaca, intraespinal, intratecal, intraósea, intraarticular, intrasinovial, 10 intracutánea, intradérmica, subcutánea, e intramuscular.

Las células se pueden administrar al individuo mediante una aguja hipodérmica por medio de una jeringuilla o se pueden administrar al individuo a través de un catéter.

15 Las células se pueden administrar por implantación quirúrgica.

Las células se pueden administrar al individuo por implantación utilizando un procedimiento artroscópico.

22. Células según lo que antecede o lo que sigue, en donde dichas células se administran al individuo por 20 inyección estereotáxica.

Las células se pueden administrar al individuo en o sobre un soporte.

Las células se pueden administrar al individuo en forma encapsulada.

25 Las células se pueden formular adecuadamente para administración por una cualquiera o más de las rutas siguientes: oral, rectal, epicutánea, ocular, nasal, y pulmonar.

Las células se pueden administrar al individuo en una sola dosis. 30 Las células se pueden administrar al individuo en una serie de dos o más dosis sucesivas.

Las células se pueden administrar en una sola dosis, en dos dosis, o en más de dos dosis, en donde las dosis son iguales o diferentes, y las mismas se administran con intervalos iguales o desiguales entre ellas.

35 Las células se pueden administrar a lo largo de un periodo más corto que va desde menos de un día a una semana, una semana a un mes, un mes a un año, un año a dos años, o más largo de dos años.

23. Células según lo que antecede o lo que sigue, excepto 2, en donde además de tratamiento con dichas 40 células, el individuo ha sido, será, o está siendo tratado con uno o más agentes inmunosupresores.

24. Células según lo que antecede o lo que sigue, excepto 2, en donde además de tratamiento con dichas células, el individuo ha sido, será, o está siendo tratado con uno o más de un corticosteroide, ciclosporina A, un agente inmunosupresor análogo a ciclosporina, ciclofosfamida, globulina antitimocitos, azatioprina, rapamicina, FK

45 506, y un agente inmunosupresor de tipo macrólido distinto de FK-506, y un agente anticuerpo monoclonal inmunosupresor (es decir, un inmunosupresor que es un anticuerpo monoclonal inmunosupresor o un es un agente que comprende un anticuerpo monoclonal, en su totalidad o en una o más partes, tal como una proteína quimérica que comprende un sitio de fijación Fc o Ag de un anticuerpo monoclonal.

50 Las células se pueden administrar en una formulación que comprende uno o más agentes inmunosupresores distintos.

Las células se pueden administrar en una formulación que comprende uno o más de un corticosteroide, ciclosporina A, un agente inmunosupresor análogo a ciclosporina, ciclofosfamida, globulina antitimocitos, azatioprina, rapamicina, 55 FK-506, y un agente inmunosupresor de tipo macrólido distinto de FK-506, y un agente anticuerpo monoclonal inmunosupresor.

Las células se pueden administrar en una formulación que comprende uno o más de un corticosteroide, ciclosporina A, azatioprina, ciclofosfamida, rapamicina, FK-506, y un agente anticuerpo monoclonal inmunosupresor. 60 Descripciones Breves de las Figuras

La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra el protocolo experimental general utilizado en algunos de los ejemplos que se describen en esta memoria, como se indica en el Ejemplo 1. 65

La Figura 2 es una serie de gráficos que muestran que los trasplantes de MAPC singénicos y alogénicos promueven la recuperación de la conducta en ratas HI neonatales, como se describe en el Ejemplo 2. Los tests de conducta para las funciones motoras y neurológicas se condujeron los días 7 y 14 en animales que recibieron trasplantes de MAPC singénicos y alogénicos. Los animales exhibían inicialmente una tendencia hacia menos déficits de conducta

5 el día 7 después del trasplante, y exhibían luego anormalidades motoras significativamente reducidas el día 14 después del trasplante, comparados con los controles. Los asteriscos indican la significación estadística para p < 0,05 frente a los controles negativos (infusión de vehículo).

La Figura 3 es un gráfico que muestra que los injertos de MAPC reducen la pérdida de células neuronales CA3 en animales con lesión HI, como se describe en el Ejemplo 3. El gráfico muestra células viables observadas por análisis histológico de secciones del hipocampo. Los animales se sacrificaron el día 14 después de trasplante de MAPCs. Se prepararon secciones de cerebro, se tiñeron con NissI y se examinaron respecto a viabilidad neuronal en los hipocampos de animales tratados con MAPC y con vehículo. Se contaron las células viables por campo en los campos del hipocampo lesionados y los campos contralaterales no lesionados de cada sección, y se compararon

15 estos recuentos. Los recuentos de las células de hipocampo no lesionadas se tomaron como 100%. Los datos demuestran una protección estadísticamente significativa de las neuronas en la región CA3 después del trasplante MAPC (el valor ANOVA F es 35,33, df = 2, 19 y p < 0,0001; el valor Fisher posthoc es p < 0,0001).

La Figura 4 es una serie de gráficos que muestra que los trasplantes de MAPC xenogénicas promueven la recuperación de la conducta en ratas adultas después de ictus isquémico inducido quirúrgicamente, como se describe en el Ejemplo 7. Los tests conductuales para las funciones motoras y neurológicas se condujeron los días 14 y 21 después de la inducción del ictus (días 7 y 14 después de trasplante intracraneal). Los animales recibieron 100.000, 200.000, y 400.000 células MAPC xenogénicas o PBS como control de vehículo solo. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre el grupo de control y el grupo experimental MAPC (medidas repetidas de

25 ANOVA, p < 0,0001; test t posthoc de Fisher PLSD, p's < 0,0001).

La Figura 5 es un gráfico que muestra que los trasplantes xenogénicas y alogénicos de MAPC promueven una recuperación locomotora sostenida y estadísticamente significativa después de ictus isquémico, en las ratas. Se condujeron tests conductuales para las funciones locomotoras el día 14, y cada 14 días después durante 56 días, como se describe en el Ejemplo 10. Los asteriscos indican la significación estadística para p < 0,0001 frente a controles negativos (MAPCs irradiadas no viables).

La Figura 6 es un gráfico que muestra que los trasplantes xenogénicas y alogénicos de MAPC promueven recuperación neurológica sostenida y estadísticamente significativa después de ictus isquémico en las ratas. Se

35 condujeron tests conductuales para las funciones neurológicas el día 14 y cada 14 días después durante 56 días, como se describe en el Ejemplo 10. Los asteriscos indican la significación estadística para p < 0,0001 frente a los controles negativos (MAPCs irradiadas no viables).

La Figura 7 es un gráfico que muestra una mejora dependiente de la dosis en la función locomotora después de administración de MAPCs xenogénicas a ratas con ictus isquémico, como se describe en el Ejemplo 12. Se condujeron tests conductuales para las funciones locomotoras en el día 14 y cada 14 días después durante 56 días. Los asteriscos indican la significación estadística para p < 0,01 frente a los controles negativos (MAPCs irradiadas no viables).

45 La Figura 8 es un gráfico que muestra las mejoras dependientes de la dosis en las funciones neurológicas de ratas con ictus isquémico tratadas con MAPCs xenogénicas, como se describe en el Ejemplo 12. Se condujeron tests de Bederson para las funciones neurológicas el día 14 y cada 14 días después durante 56 días. Los asteriscos indican la significación estadística para p < 0,01 frente a controles negativos (MAPCs irradiadas no viables).

La Figura 9 es un gráfico que muestra las mejoras dependientes de la dosis en las funciones locomotoras de ratas con ictus isquémico tratadas con MAPCs xenogénicas, como se describe en el Ejemplo 14. Se condujo un EBST para medir la función locomotora una semana después de infusión IV y luego una vez a la semana cada semana hasta la semana 8 para demostrar la eficacia de larga duración. El Retardo 1 indica el grupo que recibe las células un día después de la inducción de la lesión isquémica. El Retardo 2 es el grupo que recibe las células dos días

55 después de la lesión, y el Retardo 7 el grupo que recibe las células 7 días después de la lesión isquémica. Los asteriscos indican la significación estadística para p < 0,001 frente a controles negativos (MAPCs irradiadas no viables suministradas el día 7 después del ictus).

La Figura 10 es un gráfico que muestra las mejoras dependientes de la dosis en la función neurológica de ratas con ictus isquémico tratadas con MAPCs xenogénicas, como se describe en el Ejemplo 14. Se condujeron tests de Bederson para medir la función neurológica una semana después de la infusión IV y luego una vez por semana cada semana hasta la semana 8 para demostrar la eficacia de larga duración. El Retardo 1 denota el grupo que recibió las células un día después de la inducción de la lesión isquémica, el Retardo 2 denota el grupo que recibió las células dos días después de la lesión isquémica. El Retardo 7 denota el grupo que recibió las células 7 días después de la

65 lesión isquémica. Los asteriscos indican significación estadística para p < 0,001 frente a los controles negativos (MAPCs irradiadas no viables suministradas el día 7 después del ictus). 7

La Figura 11 es un gráfico y fotografías que muestran que la pérdida de células neuronales endógenas en las ratas con ictus isquémico se reduce a lo largo del tiempo por infusión IV de MAPCs, como se describe en el Ejemplo 16. Los animales se sacrificaron el día 56 después de la iniciación de la infusión de MAPC. Se prepararon secciones de

5 cerebro y se tiñeron con NissI respecto a viabilidad neuronal. La viabilidad se determinó en la totalidad de los animales injertados y se comparó la viabilidad neuronal en los animales que recibieron MAPCs en tiempos diferentes después de la lesión. Se contaron las células viables por campo para cada sitio de lesión, y para un sitio no lesionado en el campo contralateral en la misma sección, y se compararon los resultados. El recuento para el sitio contralateral no lesionado se ajustó a 100%. Los datos, representados en el gráfico en la Figura 11, muestran una protección estadísticamente significativa de las neuronas en la región penumbral después del trasplante de MAPC. Los asteriscos indican significación estadística para p < 0,05 frente a otros grupos. Los insertos encima del gráfico muestran secciones transversales representativas de los sitios lesionados.

Glosario

15 Generalmente, los términos y expresiones se utilizan en esta memoria según sus significados establecidos en la técnica. Sin embargo, para evitar posibles ambigüedades, se describen a continuación los significados de ciertos términos y frases utilizados en esta memoria.

"Un" o "uno" significa uno o más; al menos uno.

"Combinado(s)" significa juntos, junto con, además de, en conjunción con, etcétera.

"Infarto cerebral", "infartación cerebral" se refieren a una afección isquémica del cerebro causada por una

25 obstrucción en el flujo de sangre a o a través del cerebro. Los infartos cerebrales conducen típicamente a necrosis del tejido que ha estado privado de oxígeno por pérdida de flujo sanguíneo debida a la obstrucción. Los infartos cerebrales dan a menudo como resultado déficits neurológicos focales persistentes.

"Accidente cerebrovascular" significa lo mismo que ictus.

"Isquemia cerebral" se refiere a la afección que ocurre cuando el flujo sanguíneo al cerebro desciende por debajo del mínimo requerido para mantener la función neurológica normal. La isquemia cerebral está causada a menudo por estenosis de arteria carótida, estenosis de arteria basilar, estenosis de arteria vertebral, y enfermedad cerebral oclusiva. La misma puede estar causada también por la enfermedad de Moyamoya y la arteritis de Takayasu.

35 "Co-administración" puede incluir administración concurrente o secuencial de dos o más agentes.

"Cortical" se refiere a la porción exterior de un órgano o una parte de un órgano o análogos. Por ejemplo se hace referencia la porción exterior del cerebro como el córtex cerebral. El córtex cerebral humano tiene un espesor de 2-4 mm (0,08-0,16 pulgadas) y juega un papel fundamental en muchas funciones cerebrales complejas. La superficie del córtex cerebral humano está plegada, y más de dos terceras partes de la superficie cortical se encuentra en el canal de los pliegues, denominados "surcos". La parte más antigua filogenéticamente del córtex cerebral se conoce como el hipocampo. La porción evolucionada más recientemente se denomina neo-córtex.

45 "Infarto cortical" hace referencia a un infarto asociado con una pérdida de suministro de sangre al córtex del cerebro; típicamente un infarto asociado con pérdida de suministro de sangre al cerebro. Infarto cortical tiene prácticamente el mismo significado que infarto cerebral.

Las "citoquinas" se refieren a factores celulares que inducen o mejoran el movimiento celular, tal como el retorno de las MAPCs u otras células madre, células progenitoras, o células diferenciadas. Las citoquinas pueden estimular también la división de dichas células.

"Deletéreo" significa, como se utiliza en esta memoria, nocivo. A modo de ilustración, "respuesta inmune deletérea" significa, como se utiliza en esta memoria, una respuesta inmune nociva, tal como aquéllas que faltan o son

55 demasiado débiles, aquéllas que son demasiado fuertes y/o aquéllas que están dirigidas erróneamente. Asimismo, entre las respuestas deletéreas inmunes se encuentran respuestas inmunes que interfieren con el tratamiento médico, incluyendo respuestas inmunes que son normales por lo demás. Ejemplos incluyen respuestas inmunes implicadas en el rechazo de trasplantes e injertos, y la respuesta de células inmunocompetentes en trasplantes e injertos que causan la enfermedad de rechazo inverso.

Los "factores de diferenciación" se refieren a factores celulares, tales como factores de crecimiento, que inducen compromiso de linaje.

"Disfunción" significa, como se utiliza en esta memoria, un trastorno, enfermedad, o efecto deletéreo de un proceso

65 que por lo demás es normal. A modo de ilustración, los infartos corticales y la falta de oxígeno (hipoxia) pueden causar disfunciones tales como o que conducen a una lesión isquémica. Otras disfunciones incluyen también, por ejemplo, respuestas inmunes implicadas en el rechazo de trasplantes e injertos, y la respuesta de células inmunocompetentes en los trasplantes e injertos que causan la enfermedad de rechazo inverso, que generalmente tienen que tratarse luego con regímenes inmunosupresores.

5 "Células EC" se refiere a células de carcinoma embrionario.

"Cantidad eficaz", "dosis eficaz" y términos análogos significan generalmente una cantidad que proporciona el efecto local o sistémico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para producir un resultado clínico beneficioso o deseado. La cantidad eficaz puede proporcionarse de una vez en una sola administración o en cantidades fraccionadas que proporcionan la cantidad eficaz en varias administraciones. Por ejemplo, una cantidad eficaz de MAPCs podría administrarse en una o más administraciones y podría incluir cualquier cantidad preseleccionada de células. La determinación precisa de lo que podría considerarse como una cantidad eficaz puede estar basada en factores individuales para cada individuo, con inclusión de su volumen, edad, lesión, y/o enfermedad o lesión a tratar, y el tiempo transcurrido desde que se produjo la lesión o comenzó la enfermedad. Un

15 experto en la técnica podrá determinar la cantidad eficaz para un individuo dado basándose en estas consideraciones que son rutinarias en la técnica. Así, por ejemplo, el profesional experto en esta técnica, tal como un médico, basándose en las propiedades conocidas de las MAPCs que se describen en esta memoria y en la técnica, junto con una consideración de los factores que anteceden, podrá determinar la cantidad eficaz de MAPCs para un individuo dado. Como se utiliza en esta memoria, "dosis eficaz" significa lo mismo que "cantidad eficaz".

En general, el término eficaz en este contexto significa suficiente para alcanzar un resultado deseable, que puede ser un mejor pronóstico y/o un estado mejorado del paciente en algún sentido. Dicho término se refiere a menudo a la mejora o curación de una lesión, disfunción, trastorno, o enfermedad. En el caso de lesión cerebral, disfunción, trastorno, o enfermedad, por ejemplo, una dosis eficaz puede ser una que consiga un resultado neurológico

25 deseado, que puede incluir disminución del deterioro celular con respecto al que podría ocurrir en ausencia de tratamiento con la cantidad "eficaz", detención total de deterioro celular ulterior, y/o inversión del deterioro celular. "Eficaz" en este contexto puede definirse también por un resultado clínico tal como una pérdida ulterior nula en la función neurológica y/o mejora en la función neurológica. Las mejoras en la función neurológica a este respecto pueden juzgarse por cualquiera de una diversidad de tests y medidas utilizados para este propósito por el personal de atención sanitaria.

Lo que antecede es aplicable más o menos igualmente a las dosis y cantidades eficaces en relación con otras lesiones, disfunciones, trastornos, y/o enfermedades.

35 "Células EG" se refiere a células germinales embrionarias.

"Injerto" se refiere al proceso de contacto e incorporación de células en un tejido existente de interés in vivo.

"Población enriquecida" significa un aumento relativo en los números de MAPCs con relación a otras células o constituyentes en una población inicial, tal como un aumento en los números de MAPCs con relación a uno o más tipos de células distintas de MAPC en cultivo, tal como cultivo primario, o in vivo.

"Células ES" se refiere a células madre embrionarias.

45 "Expansión" se refiere a la propagación de una célula o células sin diferenciación.

"GVHD" se refiere a la enfermedad de rechazo inverso, que significa procesos que ocurren fundamentalmente en un hospedador inmunodeficiente cuando es reconocido como extraño por las células inmunocompetentes de un injerto.

"HVG" se refiere a la respuesta del hospedador frente al injerto, lo que significa procesos que ocurren cuando un hospedador rechaza un injerto. Típicamente, la HVG se desencadena cuando un injerto es reconocido como extraño (no propio) por las células inmunocompetentes del hospedador.

"Hipoxia" se refiere a falta de oxígeno. En un contexto neurológico, el término se refiere a una disminución del

55 suministro de oxígeno al cerebro, que puede ocurrir a pesar de un suministro adecuado de sangre. La hipoxia puede surgir por ahogamiento, estrangulación, sofocación, traumatismo craneal, envenenamiento por monóxido de carbono, parada cardiaca, y como complicación de anestesia general, así como por la oclusión o bloqueo del flujo sanguíneo. La hipoxia cerebral conduce a una cascada de eventos que dan como resultado el deterioro celular y la muerte celular. La hipoxia/isquemia cerebral puede estar causada por un amplio espectro de enfermedades que afectan al sistema de bombeo cardiovascular o al sistema respiratorio. La hipoxia/isquemia cerebral se clasifica en cuatro tipos: isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global, hipoxia cerebral difusa, e infarto cerebral.

La isquemia cerebral focal (FCI) está causada por un coágulo de sangre en el cerebro que reduce el flujo sanguíneo en el área afectada. La gravedad de la FCI varía, y a menudo causa lesión irreversible de neuronas sensitivas. La 65 isquemia cerebral global (GCI) está causada por fibrilación ventricular o asístole cardiaca que termina el flujo sanguíneo al cerebro. La recuperación de una GCI que dura más de 5 a 10 minutos es problemática. Una GCI más

larga es generalmente fatal. La hipoxia cerebral difusa (DCH) está causada por oxigenación deficiente de la sangre y típicamente da como resultado hipoxemia leve a moderada. La DCH pura causa disfunción cerebral pero no da como resultado deterioro cerebral irreversible. Puede estar causada por enfermedad pulmonar, mal de altura, o anemia severa. El infarto cerebral (CI) es resultado de una oclusión vascular focal en un área del cerebro que causa

5 necrosis.

"Infarto" o "infartación" se refiere a un área de necrosis en un tejido como resultado de isquemia (una obstrucción en el flujo sanguíneo) causada usualmente por un trombo o émbolo. Dicho término se refiere también a una obstrucción en el flujo sanguíneo, que da como resultado isquemia, causado usualmente por un trombo o émbolo.

"Inmunosupresión" se refiere a prevención, represión y/o inversión de una respuesta inmune en un individuo, tal como por ejemplo una respuesta inmune a un antígeno extraño, tal como células o tejidos alogénicos o xenogénicas. En algunos casos, por ejemplo, se requiere tratamiento inmunosupresor para suprimir una respuesta inmune de un individuo que podría ser adversa para un resultado clínico deseado del tratamiento del individuo con un trasplante de

15 células o de un órgano.

"Isquemia" se refiere a una restricción en el suministro de sangre, típicamente a causa de oclusión de un vaso, que da como resultado disfunción o deterioro del tejido al que suministra oxígeno el vaso ocluido. La isquemia se refiere también a un flujo inadecuado de sangre a una parte de un cuerpo causado por constricción o bloqueo de los vasos sanguíneos. La isquemia en el tejido cerebral inicia una cascada (a la que se hace referencia como la cascada isquémica) que da como resultado la liberación de enzimas proteolíticas, especies químicas de oxígeno reactivas, y otras sustancias que pueden deteriorar y finalmente destruir el tejido cerebral.

"Aislado" se refiere a una célula o células que no están asociadas con uno o más células o uno o más componentes 25 celulares que están asociados con la célula o células in vivo o en cultivo primario.

"MAPC" es un acrónimo para "célula progenitora adulta multipotente". El término se refiere a una célula no-ES, no-EG y no-germinal que puede dar lugar a linajes de células de más de una capa germinal, tal como la totalidad de las tres capas germinales (a saber, endodermo, mesodermo, y ectodermo). Las MAPCs tienen también actividad de telomerasa. Las mismas pueden ser positivas para oct-3/4 (v.g., oct-3A humano). Las mismas pueden expresar también uno o más de rex-1, rox-1, sox-2, SSEA-4, y/o nanog. El término "adulto" en las MAPC no es restrictivo. El mismo denota únicamente que estas células no son células ES, EG, o germinales. Típicamente, como se utiliza en esta memoria, MAPC es singular y MAPCs es plural. Se ha hecho referencia también a las MAPCs como células madre adultas multipotentes (MASCs). Véase, por ejemplo, la Patente U.S. Núm. 7.015.037 en cuanto a los métodos

35 expuestos en dicho documento para el aislamiento y crecimiento de MAPCs/MASCs, métodos que son simplemente ejemplarizantes e ilustrativos y no son en absoluto limitantes de tales métodos útiles de acuerdo con la invención.

"MASC," véase MAPC.

"MNC" se refiere a células mononucleares.

"Modalidad" significa un tipo, enfoque, vía, o método, tal como una modalidad terapéutica; es decir, un tipo de terapia.

45 "MSC" es un acrónimo para células madre mesenquimatosas.

"Multipotente", con respecto a las MAPCs, se refiere a la capacidad para dar lugar a linajes de células de más de una capa germinal, tal como la totalidad de las tres capas germinales primitivas (a saber, endodermo, mesodermo, y ectodermo) después de diferenciación.

"Persistencia" se refiere a la capacidad de las células para resistir el rechazo y mantenerse y/o aumentar en número a lo largo del tiempo (v.g., días, semanas, meses o años) in vivo.

"Cultivo primario" se refiere a la población de células obtenidas directamente de un explante de material procedente

55 de un organismo, antes de subcultivo. Típicamente, los cultivos primarios se establecen por (a) aislamiento de tejido de un organismo; (b) disección y/o disgregación del tejido, y (c) permisión de que las células del tejido comiencen a crecer, sea suspendidas en el medio o, más típicamente, fijadas a una superficie de la vasija de cultivo. Los objetivos primarios no implican, y preceden al sub-cultivo de las células del explante, por ejemplo por subdivisión y dilución de las células y re-siembra de las mismas en medios nuevos y/o vasijas de cultivo nuevas. Típicamente, un cultivo primario de células fijadas se obtiene dejando que las células migren a partir de un fragmento de tejido adhiriéndose a un sustrato adecuado o por disgregación del tejido mecánica o enzimáticamente a fin de producir una suspensión de células, algunas de las cuales se fijan luego al sustrato.

"Progenitor", como se utiliza en las células progenitoras adultas multipotentes (MAPCs) indica que estas células 65 pueden dar lugar a otras células tales como células ulteriores diferenciadas. El término no es limitante y no limita estas células a un linaje particular. 10

"Auto-renovación" se refiere a la capacidad para producir células madre hijas repetidas que tienen un potencial de diferenciación que es idéntico al de aquéllas de las que proceden. Un término similar utilizado en este contexto es "proliferación".

5 "Ictus" es una lesión neurológica aguda. En el 80% de los casos está causado (haciendo referencia al mismo como ictus isquémico) por una disrupción del suministro de sangre al cerebro que afecta (un infarto), y típicamente interrumpe, la perfusión sanguínea del cerebro. La interrupción puede ser resultado de una disrupción en el flujo de sangre arterial, pero puede ser también resultado de una disrupción en el flujo venoso. La parte del cerebro en la

10 que se altera la perfusión no recibe oxígeno adecuado, causando deterioro celular y muerte. El resultado es un ictus.

Los ictus pueden dar como resultado deterioro neurológico transitorio, deterioro permanente o muerte. El deterioro puede ser focal o generalizado. El ictus isquémico se clasifica comúnmente como ictus trombótico, ictus embolico, hipoperfusión sistémica (ictus Watershed o ictus en la Zona de Borde), o trombosis venosa. El ictus trombótico está

15 causado por un estrechamiento de una arteria por un trombo, implicando usualmente una placa ateroesclerótica. El ictus embólico es resultado de un bloqueo arterial por un émbolo, muy frecuentemente un coágulo de sangre.

Un "individuo" es un vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo un humano. Los mamíferos incluyen, pero sin carácter limitante, humanos, animales de granja, animales utilizados en deportes, y mascotas. Individuos que 20 precisan tratamiento por los métodos de la presente invención incluyen aquéllos que sufren un trastorno, disfunción

o enfermedad, tal como un infarto cortical y/o una lesión cerebral isquémica hipóxica, o un efecto secundario de los mismos, o un tratamiento de los mismos, que pueden beneficiarse de la administración de MAPCs como tratamiento primario o tratamiento combinado.

25 "Trasplantar", como se utiliza en esta memoria, significa introducir en un individuo células, tejidos, u órganos. El trasplante puede derivarse del mismo individuo, de un cultivo, o de una fuente extraña al individuo.

"Tratar", "terapia" y "tratamiento", y términos análogos, se refieren a la gestión y cuidado de un paciente, particularmente en lo que respecta a combatir un trastorno o enfermedad, que incluye, pero sin carácter limitante,

30 prevención, mejora, inhibición, y/o curación de una deficiencia, disfunción, trastorno, o enfermedad, u otro proceso que dé como resultado un efecto deletéreo, tal como, por ejemplo, combate, prevención, mejora, inhibición y/o curación de una lesión, disfunción, trastorno, o enfermedad. Véase también eficaz, cantidad eficaz, y dosis eficaz.

"Terapia" es sinónimo de tratamiento. 35 Descripción de la Invención

Como se describe en esta memoria, de acuerdo con ciertos aspectos y realizaciones de la invención, las MAPCs pueden utilizarse para tratar lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad del cerebro, tal como, pero sin carácter 40 limitante, infartos corticales y lesión cerebral isquémica hipóxica con y sin tratamientos inmunosupresores combinados.

Diversas realizaciones de la invención proporcionan MAPCs para uso en la evitación, prevención, combate, mejora, alivio, disminución, minimización, eliminación, y/o curación o análogos de una lesión, disfunción, trastorno, y/o

45 enfermedad del cerebro. En algunas realizaciones, puede tratarse de una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad en y/o del córtex del cerebro (a lo que se hace referencia también como la región cortical del cerebro). En algunas realizaciones se trata de una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad en y/o del cerebro. En algunas realizaciones se trata de una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad en y/o del córtex cerebral. En algunas realizaciones se trata de una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad en y/o del hipocampo.

50 En algunas realizaciones en relación con todos y cada uno de los párrafos anteriores, entre otras cosas, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad es una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad asociada con y/o causada por falta de oxígeno. En realizaciones a este respecto la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad está causada por hipoxia. En algunas realizaciones a este respecto la hipoxia es focal. En algunas realizaciones a este respecto la

55 hipoxia es difusa. En algunas realizaciones a este respecto la enfermedad es lesión cerebral isquémica hipóxica.

En algunas realizaciones adicionales en relación con esto mismo, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad es una lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad asociada con y/o causada por un suministro insuficiente de sangre. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad está causada por una 60 estenosis o bloqueo arterial o venoso, incluyendo, pero sin carácter limitante, un bloqueo causado por un trombo o un émbolo. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad está asociada con y/o causada por un infarto y/o isquemia. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o enfermedad está asociada con y/o causada por necrosis. En algunas realizaciones a este respecto, el infarto es un infarto cortical. En algunas realizaciones a este respecto, la lesión, disfunción, trastorno, y/o

65 enfermedad es un ictus.

Las realizaciones proporcionan MAPCs para uso a este respecto con tratamiento y/o terapia inmunosupresora combinados. Algunas realizaciones proporcionan MAPCs para uso a este respecto sin tratamiento inmunosupresor combinado.

5 En algunas de sus realizaciones, por consiguiente, la invención proporciona células que: (i) no son células madre embrionarias, no son células germinales embrionarias, y no son células germinales; (ii) pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmico, ectodérmico, y mesodérmico; y (iii) son eficaces para tratamiento de una lesión y/o disfunción y/o trastorno y/o enfermedad cerebral.

10 En algunas realizaciones, la lesión y/o disfunción y/o trastorno cerebral está causada por y/o asociada con una falta de oxígeno. En algunas realizaciones, aquélla está causada por o asociada con hipoxia. En algunas realizaciones, la misma está causada por o asociada con estenosis o bloqueo del suministro de sangre. En algunas realizaciones, la misma es o está asociada con infarto y/o isquemia. En algunas realizaciones se trata de un ictus. En algunas realizaciones se trata de una lesión cerebral isquémica hipóxica. En algunas realizaciones, la misma es o está

15 asociada con un infarto cortical.

En algunas realizaciones de la invención, las células se utilizan a este respecto solas o junto con otros agentes y modalidades terapéuticos como modalidades terapéuticas primarias. En algunas realizaciones de la invención, las células se utilizan como el agente terapéutico único o junto con otros agentes terapéuticos. En algunas realizaciones

20 de la invención, las células se utilizan, solas o con otros agentes o modalidades terapéuticas, tanto en una o más modalidades terapéuticas primarias como en una o más modalidades terapéuticas combinadas.

MAPCs

25 Las células de acuerdo con la invención se describen con mayor detalle en esta memoria y se hace referencia aquí generalmente a las mismas como "células progenitoras adultas multipotentes" y por el acrónimo "MAPC" (utilizándose en muchos casos "MAPCs" para el plural). Debe tenerse en cuenta que estas células no son células ES, EG, ni células germinales, y que tienen capacidad para diferenciarse en tipos de células de al menos dos de los tres linajes de la capa germinal primitiva (ectodermo, mesodermo, y endodermo), v.g., en células de los tres linajes

30 primitivos.

Las MAPCs pueden formar las células siguientes, por ejemplo, entre otras, células mesodérmicas esplácnicas, células musculares, células óseas, células cartilaginosas, células endocrinas, células exocrinas, células endoteliales, células formadoras de pelo, células formadoras de dientes, células mesodérmicas viscerales, células 35 hematopoyéticas, células estomáticas, células del estroma medular, células neuronales, células neuroectodérmicas, células epiteliales, células oculares, células pancreáticas, y células semejantes a los hepatocitos, así como células de los mismos linajes, entre muchas otras. Por ejemplo, entre las células formadas por MAPCs se encuentran osteoblastos, condroblastos, adipocitos, células de la musculatura esquelética, miocitos esqueléticos, células epiteliales biliares, células pancreáticas acinares, células mesangiales, células de la musculatura lisa, células

40 musculares cardiacas, cardiomiocitos, osteocitos, células vasculares formadoras de tubos, oligodendrocitos, neuronas, con inclusión de neuronas serotonérgicas, GABAérgicas, neuronas dopaminérgicas, células gliales, células de la microglía, células epiteliales pancreáticas, células epiteliales del intestino, células epiteliales hepáticas, células epiteliales de la piel, células epiteliales de riñón, células epiteliales renales, células de los islotes pancreáticos, fibroblastos, hepatocitos, y otras células de los mismos linajes que las anteriores, entre muchas otras.

45 Las MAPCs tienen actividad de telomerasa necesaria para auto-renovación y para evitar la senescencia replicativa. Generalmente las mismas expresan también oct-3/4. Oct-3/4 (oct-3A en los humanos) es por lo demás específico para las células ES, EG y germinales. Se considera que el mismo es un marcador de células no diferenciadas que tienen capacidades de diferenciación amplias. Se cree también generalmente que oct-3/4 desempeña cierto papel

50 en el mantenimiento de una célula en un estado no diferenciado. Oct-3/4 (oct-3 en humanos) es un factor de transcripción expresado en el embrión antes de la gastrulación, el embrión en la etapa de escisión inicial, las células de la masa celular interna del blastocisto, y las células del carcinoma embrionario ("EC"), Nichols, J. et al. (1998) Cell 95:379-91), y se regula en sentido decreciente cuando se induce la diferenciación celular. El gen oct-4 (oct-3 en humanos) se transcribe en al menos dos variantes de la remodelación en humanos, oct-3A y oct-3B. La variante de

55 remodelación oct-3B se encuentra en muchas células diferenciadas, en tanto que se ha comunicado que la variante de remodelación oct-3A (designada también anteriormente oct-3/4) es específica para las células madre embrionarias no diferenciadas. Véase Shimozaki et al. (2003) Development 130: 2505-12. La expresión de oct-3/4 juega un papel importante en la determinación de las etapas iniciales en la embriogénesis y la diferenciación. Oct3/4, en combinación con rox-1, causa activación de la transcripción de la proteína de dedos de Zn rex-1, que se

60 requiere también para el mantenimiento de las células ES en un estado indiferenciado (Rosfjord, E. y Rizzino, A. (1997) Biochem Biophys Res Commun 203: 1795-802; Ben-Shushan, E. et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 1866-78).

Las MAPCs pueden expresar también otros marcadores. Entre éstos se encuentran prex-1, rox-1, y sox-2. Rex-1 está controlado por oct-3/4, que activa la expresión aguas abajo de rex-1. Rox-1 y sox-2 se expresan en células no

65 ES.

En algunas realizaciones de la invención, se utilizan MAPCs junto con uno o más otros agentes y/o modalidades terapéuticas como la modalidad terapéutica primaria. En algunas realizaciones de la invención, las células se utilizan como modalidad terapéutica combinada, es decir, como una combinación con otra modalidad terapéutica primaria. En algunas realizaciones, las células se utilizan como el único agente activo de una modalidad terapéutica

5 combinada. En otras, las células se utilizan como una modalidad terapéutica combinada junto con uno o más agentes o modalidades terapéuticas adicionales. En algunas realizaciones, las células se utilizan a la vez como agentes y/o modalidades terapéuticos primarios y como agentes terapéuticos combinados. En ambos aspectos, las células pueden utilizarse solas en la modalidad primaria y/o en la modalidad combinada. Las mismas pueden utilizarse también junto con otros agentes o modalidades terapéuticos, en la modalidad primaria o en la modalidad combinada, o en ambas.

Como se ha expuesto anteriormente, un tratamiento primario, tal como un agente terapéutico, terapia, y/o modalidad terapéutica, está direccionado(a) (es decir, está propuesto para actuar sobre) la disfunción primaria, tal como una enfermedad, que va a tratarse. Un tratamiento combinado, tal como una terapia y/o una modalidad terapéutica,

15 puede administrarse en combinación con un tratamiento primario, tal como un agente terapéutico, terapia, y/o modalidad terapéutica, para actuar sobre la disfunción primaria, tal como una enfermedad, y complementar el efecto del tratamiento primario, aumentando con ello la eficacia global del régimen de tratamiento. Un tratamiento combinado, tal como un agente, terapia, y/o modalidad terapéutica, puede administrarse también para actuar sobre las complicaciones y/o efectos secundarios de una disfunción primaria, tal como una enfermedad, y/o los causados por un tratamiento, tal como un agente terapéutico, terapia, y/o modalidad terapéutica. En relación con cualquiera de estos usos, pueden utilizarse uno, dos, tres o más tratamientos primarios junto con uno, dos, tres, o más tratamientos combinados.

En algunas realizaciones, las MAPCs se administran a un individuo antes de la aparición de una disfunción, tal como

25 una enfermedad y/o efecto secundario. En algunas realizaciones, las células se administran mientras se está desarrollando la disfunción. En algunas realizaciones, las células se administran después que se ha establecido la disfunción. Las MAPCs pueden administrarse en cualquier momento a lo largo del desarrollo, la persistencia, y/o la propagación de la disfunción o después que la misma entra en recesión.

Como se ha expuesto anteriormente, las realizaciones de la invención proporcionan células para uso en terapia primaria o combinada. En ciertas realizaciones de la invención, las células se administran a un individuo alogénico. En algunas realizaciones, aquéllas son autólogas para el individuo. En algunas realizaciones, aquéllas son singénicas para el individuo. En algunas realizaciones las células son xenogénicas para un individuo. Sean alogénicas, autólogas, singénicas o xenogénicas, en diversas realizaciones de la invención las MAPCs son sólo

35 débilmente inmunógenas o son no-inmunógenas para el individuo. En algunas realizaciones las MAPCs tienen una inmunogenicidad suficientemente baja o son no-inmunógenas y están suficientemente exentas de respuestas inmunes deletéreas en general, que cuando se administran a individuos alogénicos, aquéllas pueden utilizarse como células donantes "universales" sin tipificación ni coincidencia con el tejido. De acuerdo con diversas realizaciones de la invención, las MAPCs pueden almacenarse y mantenerse también en bancos de células, y por consiguiente pueden mantenerse disponibles para uso en caso necesario.

Adicionalmente, a este respecto, las MAPCs en diversas realizaciones pueden administrarse sin tratamiento inmunosupresor combinado.

45 En todos estos aspectos y otros, las realizaciones de la invención proporcionan MAPCs de mamíferos, incluyendo en una realización humanos, y en otras realizaciones primates no humanos, ratas y ratones, así como perros, cerdos, cabras, ovejas, caballos, y vacas. Las MAPCs preparadas a partir de mamíferos como se ha descrito arriba pueden utilizarse en la totalidad de los métodos y otros aspectos de la invención descritos en esta memoria.

Las MAPCs de acuerdo con diversas realizaciones de la invención pueden aislarse de una diversidad de compartimientos y tejidos de tales mamíferos en los cuales se encuentran las mismas, con inclusión pero sin carácter limitante, de médula ósea, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, sangre normal, bazo, hígado, músculo, cerebro, tejido adiposo, placenta y otros expuestos más adelante. En algunas realizaciones, las MAPCs se cultivan antes de su utilización.

55 En algunas realizaciones, las MAPCs se modifican genéticamente, a fin de mejorar sus propiedades inmunomoduladoras. En algunas realizaciones, se producen MAPCs modificadas genéticamente por cultivo in vitro. En algunas realizaciones, las MAPCs modificadas genéticamente se producen a partir de un organismo transgénico.

Mecanismos de Acción de las MAPCs

Sin quedar limitados por uno o más mecanismos explicativos de las propiedades, actividades, y efectos de las MAPCs, es digno de mención que dichas células pueden ejercer efectos beneficiosos, tales como efectos de tratamiento con MAPCs, por una diversidad de modalidades. Por ejemplo, las MAPCs pueden tener efectos 65 beneficiosos directos. Tales efectos directos pueden ser fundamentalmente una cuestión de contacto directo entre las MAPCs y las células de un hospedador. El contacto puede ser con miembros estructurales de las células o con

constituyentes en su entorno inmediato. Tales mecanismos directos pueden implicar contacto directo, difusión, absorción, u otros procesos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las actividades y efectos directos de las MAPCs pueden estar limitados espacialmente, por ejemplo a un área de deposición local o a un compartimiento corporal al que se accede por inyección.

5 Las MAPCs pueden también "retornar" en respuesta a señales de "retorno", tales como las liberadas en sitios de lesión o enfermedad. Dado que el retorno está mediado a menudo por señales cuya función natural es reclutar células a los sitios en los que se precisan reparaciones, la conducta de retorno puede ser una herramienta poderosa para la concentración de MAPCs en dianas terapéuticas. Este efecto puede ser estimulado por factores específicos, como se expone más adelante.

Las MAPCs pueden modular también efectos beneficiosos, como de tratamientos con MAPCs, por su respuesta a determinados factores. Esto puede ocurrir adicional o alternativamente a la modulación directa. Tales factores pueden incluir factores de retorno, mitógenos, y otros factores de estimulación. Los mismos pueden incluir también

15 factores de diferenciación, y factores que desencadenan procesos celulares particulares. Entre los últimos se encuentran factores que causan la secreción por las células de otros factores específicos, tales como aquéllos que están involucrados en el reclutamiento de células, tales como células madre (con inclusión de MAPCs), a un sitio de lesión o enfermedad.

Las MAPCs pueden, además de lo que antecede o alternativamente a ello, secretar factores que actúan sobre células endógenas, tales como células madre o células progenitoras. Los factores pueden actuar sobre otras células para generar, aumentar, disminuir, o suprimir sus actividades. Las MAPCs pueden secretar factores que actúan sobre las células madre, progenitoras, o diferenciadas haciendo que dichas células se dividan y/o se diferencien. Las MAPCs que retornan a un sitio en el que se precisa reparación pueden secretar factores tróficos que atraen otras

25 células al sitio. De este modo, las MAPCs pueden atraer células madre, progenitoras, o diferenciadas a un sitio en el que son necesarias. Las MAPCs pueden secretar también factores que causan la división o diferenciación de tales células.

La secreción de tales factores, con inclusión de factores tróficos, puede contribuir a la eficacia de las MAPCs en, por ejemplo, la limitación de un deterioro inflamatorio, la limitación de la permeabilidad vascular, la mejora de la supervivencia celular, y la generación y/o aumento del retorno de células reparadoras a sitios de deterioro. Tales factores pueden afectar también directamente a la proliferación de las células T. Dichos factores pueden afectar también a las células dendríticas, por disminución de sus actividades fagocíticas y de presentación de antígeno, que pueden afectar también a la actividad de las células T.

35 Por estos y otros mecanismos, las MAPCs pueden proporcionar efectos beneficiosos en el tratamiento de una diversidad de lesiones, disfunciones, trastornos, y enfermedades.

Administración de las MAPC

Preparaciones de MAPC

Las MAPCs se pueden preparar a partir de una diversidad de tejidos, tales como células de la médula ósea, como se expone con mayor detalle en otro lugar de esta memoria.

45 En muchas realizaciones, la pureza de las MAPCs para administración a un individuo es aproximadamente 100%. En otras realizaciones, la misma es 95% a 100%. En algunas realizaciones, aquélla es 85% a 95%. Particularmente en el caso de mixturas con otras células, el porcentaje de MAPCs puede ser 2%-5%, 3%-7%, 5%-10%, 7%-15%, 10%-15%, 10%-20%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 60%-70%, 70%80%, 80%-90%, o 90%-95%.

El número de MAPCs en un volumen dado se puede determinar por procedimientos e instrumentación bien conocidos y rutinarios, utilizando la presencia y/o ausencia de ciertos marcadores, con inclusión de los descritos en esta memoria, tales como telomerasa, y, en caso deseable, la capacidad para diferenciarse en células de más de

55 uno de los tres linajes primitivos descritos en esta memoria. El porcentaje de MAPCs en un volumen dado de una mixtura de células se puede determinar por recuento de células (tales como las células en una parte alícuota de una muestra) y determinación del número de células que son MAPCs utilizando los procedimientos mencionados anteriormente para identificación de MAPCs. Las células pueden contarse con facilidad manualmente o utilizando un contador de células automático. Las MAPCs se pueden determinar, tales como MAPCs en un volumen dado, por tinción específica, por ejemplo con reactivos de fijación específicos, a menudo anticuerpos conjugados con un marcador fluorescente, seguido por examen y recuento visual o por instrumentación automática de identificación y recuento, por ejemplo por medio de un instrumento FACS (clasificador de células activado por fluorescencia).

El tratamiento de los trastornos o enfermedades o análogos con MAPCs puede realizarse con MAPCs no

65 diferenciadas. El tratamiento puede realizarse también con MAPCs que han sido tratadas de tal manera que están asignadas a un camino de diferenciación. El tratamiento puede implicar también MAPCs que se han tratado para diferenciarse en una célula madre menos potente con potencial de diferenciación limitado. El mismo puede implicar también MAPCs que se han tratado para diferenciarse en un tipo de célula diferenciada terminalmente. El tipo o mixtura óptimos de MAPCs vendrá determinado por las circunstancias particulares de su utilización, y será una cuestión de diseño rutinario para los expertos en la técnica determinar un tipo o combinación eficaz de MAPCs a

5 este respecto.

Formulaciones

La elección de la formulación para administrar MAPCs para una aplicación dada dependerá de una diversidad de factores. Prominentes entre éstos serán la especie del individuo, la naturaleza del trastorno, la disfunción o la enfermedad que se esté tratando y su estado y distribución en el individuo, la naturaleza de otras terapias y agentes que estén siendo administrados, la vía óptima para administración de las MAPCs, la supervivencia de las MAPCs por dicha vía, el régimen de dosificación, y otros factores que serán evidentes para los expertos en la técnica. En particular, por ejemplo, la elección de portadores adecuados y otros aditivos dependerá de la ruta exacta de

15 administración y de la naturaleza de la forma de dosificación particular.

La supervivencia de las células puede ser un determinante importante de la eficacia de las terapias de utilización de MAPCs. Esto es cierto tanto para terapias primarias como para terapias combinadas. Otro problema se presenta cuando los sitios diana son inhóspitos para la siembra de células y el crecimiento de las mismas. Esto puede incluir el acceso al sitio y/o injerto de las MAPCs terapéuticas en el mismo. En algunas realizaciones, la invención comprende el uso de medidas para aumentar la supervivencia celular y/o resolver problemas planteados por barreras para la siembra y/o el crecimiento.

Ejemplos de composiciones que comprenden MAPCs incluyen preparaciones líquidas, con inclusión de soluciones,

25 suspensiones, y preparaciones para administración intramuscular o intravenosa (v.g., administración inyectable), tales como suspensiones o emulsiones estériles. Tales composiciones pueden comprender una mixtura de MAPCs con un vehículo, diluyente, o excipiente adecuado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa, o análogos. Las composiciones pueden estar también liofilizadas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, aditivos gelificantes o mejoradores de la viscosidad, conservantes, agentes saborizantes, colorantes, y análogos, dependiendo de la ruta de administración y la preparación deseada. Textos estándar, tales como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", edición 17ª, 1985, pueden consultarse para preparar preparaciones adecuadas, sin experimentación excesiva.

35 Las composiciones de la invención se proporcionan convenientemente a menudo como preparaciones líquidas, v.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, o composiciones acuosas isotónicas viscosas, que pueden estar tamponadas a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas, y composiciones sólidas. Adicionalmente, las composiciones líquidas son más fáciles de administrar, especialmente por inyección. Por otra parte, las composiciones viscosas pueden formularse dentro de intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar periodos de contacto más largos con tejidos específicos.

A menudo se incluirán diversos aditivos para mejorar la estabilidad, esterilidad, e isotonicidad de las composiciones, tales como conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y tampones, entre otros. La prevención

45 de la acción de los microorganismos puede ser asegurada por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y análogos. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio, y análogos. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse por el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio, y gelatina. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención cualquier vehículo, diluyente, o aditivo utilizado tendría que ser compatible con las células.

Las soluciones, suspensiones, y geles MAPS contienen a menudo una mayor cantidad de agua (preferiblemente agua purificada, esterilizada) además de las células. Pueden estar presentes también cantidades menores de otros ingredientes tales como ajustadores del pH (v.g., una base tal como NaOH), emulsionantes o agentes dispersantes,

55 agentes tampón, conservantes, agentes humectantes y agentes de preparación de gelatinas (v.g., metilcelulosa).

A menudo las composiciones serán isotónicas, es decir, tendrán la misma presión osmótica que la sangre y el fluido lacrimal cuando se preparan adecuadamente para administración.

La isotonicidad deseada de las composiciones de esta invención puede lograrse utilizando cloruro de sodio, u otros agentes farmacéuticamente aceptables tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato de sodio, propilenglicol, u otros solutos inorgánicos u orgánicos. El cloruro de sodio es particularmente preferido para tampones que contengan iones sodio.

65 La viscosidad de las composiciones, en caso deseado, puede mantenerse al nivel seleccionado utilizando un agente espesante farmacéuticamente aceptable. Se prefiere la metilcelulosa debido a que está fácil y económicamente disponible y es fácil de manipular. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma de xantano, carboximetilcelulosa, hidroxipropil-celulosa, carbomer, y análogos. La concentración preferida del espesante dependerá del agente seleccionado. El punto importante consiste en utilizar una cantidad que consiga la viscosidad seleccionada. Las composiciones viscosas se preparan normalmente a partir de soluciones por la adición de tales

5 agentes espesantes.

Un conservante o estabilizador de las células farmacéuticamente aceptable puede emplearse para aumentar la vida de las composiciones MAPC. Si se incluyen tales conservantes, está dentro del alcance del profesional experto seleccionar composiciones que no afecten a la viabilidad o eficacia de las MAPCs.

Los expertos en la técnica reconocerán que los componentes de las composiciones deben ser químicamente inertes. Esto no presentará problema alguno para los expertos en principios químicos y farmacéuticos. Los problemas pueden evitarse fácilmente acudiendo a textos estándar o por experimentación simple (sin implicar experimentación excesiva) utilizando la información proporcionada por la descripción, los documentos citados en esta memoria y

15 generalmente disponibles en la técnica.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles por incorporación de las células utilizadas en la práctica de la presente invención en la cantidad requerida del disolvente apropiado con diversas cantidades de los otros ingredientes, en caso deseado.

Se prefieren también soluciones para inyección, con inclusión de inyección e infusión esterotáxica, tal como infusión

IV.

En algunas realizaciones, las MAPCs se formulan en una forma inyectable de dosificación unitaria, tal como una

25 solución, suspensión, o emulsión. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección de MAPCs son típicamente soluciones y dispersiones acuosas estériles. Los vehículos para formulaciones inyectables pueden ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, y análogos), y mixturas adecuadas de los mismos.

El profesional experto puede determinar fácilmente la cantidad de células y aditivos, vehículos, y/o portadores opcionales en las proporciones a administrar en los métodos de la invención. Típicamente, cualesquiera aditivos (además de las células) están presentes en una cantidad de 0,001 a 50% en peso en solución, tal como en solución salina tamponada con fosfato. El ingrediente activo está presente en el orden de microgramos a miligramos, tal

35 como aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 5% en peso, con preferencia aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1% en peso, de modo más preferible aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,05% en peso o aproximadamente 0,001 a aproximadamente 20% en peso, con preferencia aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10% en peso, y de modo muy preferible aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5% en peso.

Para cualquier composición a administrar a un animal o humano, y para cualquier método particular de administración, se prefiere determinar por tanto: toxicidad determinando por ejemplo la dosis letal (LD) y LD50 en un modelo animal adecuado, v.g. roedor tal como ratón o rata; así como la dosificación de la o las composiciones, concentración de componentes en ellas, y la elección del momento de administración de la o las composiciones, que provocan una respuesta adecuada. Tales determinaciones no requieren experimentación excesiva partiendo del

45 conocimiento del profesional experto, de esta descripción, y de los documentos citados aquí. Asimismo, el tiempo para las administraciones secuenciales puede averiguarse sin experimentación excesiva.

En algunas realizaciones las MAPCs se encapsulan para su administración, particularmente en los casos en que la encapsulación mejora la eficacia de la terapia, o proporciona ventajas en la manipulación y/o la vida útil. La encapsulación en algunas realizaciones en las que la misma aumenta la eficacia de la inmunosupresión mediada por las MAPC puede, como resultado, reducir también la necesidad de terapia con fármacos inmunosupresores.

Asimismo, la encapsulación en algunas realizaciones proporciona una barrera para el sistema inmunitario de un individuo que puede reducir adicionalmente una respuesta inmune del individuo a las MAPCs (que generalmente no

55 son inmunógenas o son sólo débilmente inmunógenas en trasplantes alogénicos), reduciendo con ello cualquier rechazo de injerto o inflamación que pudiera ocurrir después de la administración de las células.

En una diversidad de realizaciones en las que las MAPCs se administran en mezcla con células de otro tipo, que son más típicamente inmunógenas en un escenario alogénico o xenogénico, la encapsulación puede reducir o eliminar las respuestas inmunes adversas del hospedador a las células distintas de MAPC y/o GVHD que podría ocurrir en un hospedador inmunodeficiente si las células incorporadas son inmunocompetentes y reconocen el hospedador como extraño.

Las MAPCs pueden encapsularse en membranas, y/o en cápsulas, antes de la implantación. Se contempla que

65 pueden emplearse cualquiera de los muchos métodos de encapsulación celular disponibles. En algunas realizaciones, las células están encapsuladas individualmente. En algunas realizaciones, muchas células están encapsuladas en la misma membrana. En algunas realizaciones en las que las células deben retirarse después de la implantación, una estructura de tamaño relativamente grande que encapsule muchas células, por ejemplo dentro de una sola membrana, puede proporcionar un medio conveniente para la retirada.

5 Puede utilizarse una gran diversidad de materiales en diversas realizaciones para microencapsulación de MAPCs. Tales materiales incluyen, por ejemplo, cápsulas de polímero, microcápsulas de alginato-poli-L-lisina-alginato, cápsulas de bario-poli-L-lisina-alginato, cápsulas de alginato de bario, fibras huecas de poliacrilonitrilo/poli(cloruro de vinilo) (PAN/PVC), y fibras huecas de polietersulfona (PES).

Los métodos para microencapsulación de células que pueden utilizarse para administración de MAPCs son conocidos para quienes poseen una experiencia en la técnica y se describen, por ejemplo, en Chang, P., et al., 1999; Matthew, H.W., et al., 1991; Yanagi, K., et al., 1989; Cai Z.H., et al., 1988; Chang, T.M., 1992 y en la Patente

U.S. Núm. 5.639.275 (que, por ejemplo, describe una cápsula biocompatible para mantenimiento a largo plazo de células que expresan de manera estable moléculas biológicamente activas). Métodos adicionales de encapsulación

15 se citan en la Publicación de Patente Europea Núm. 301.777 y las Patentes U.S. Núms. 4.353.888; 4.744.933; 4.749.620; 4.814.274; 5.084.350; 5.089.272; 5.578.442; 5.639.275; y 5.676.943.

Ciertas realizaciones incorporan MAPCs en un polímero, tal como un biopolímero o polímero sintético. Ejemplos de biopolímeros incluyen, pero sin carácter limitante, fibronectina, fibrina, fibrinógeno, trombina, colágeno, y proteoglicanos. Otros factores, tales como las citoquinas expuestas anteriormente, pueden incorporarse también en el polímero. En otras realizaciones de la invención, las MAPCs pueden estar incorporadas en los intersticios de un gel tridimensional. Típicamente, un polímero o gel grande se implantará por vía quirúrgica. Un polímero o gel que puede formularse en partículas o fibras suficientemente pequeñas se pueden administrar por otras rutas comunes no quirúrgicas más cómodas.

25 Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar de muchas formas que incluyen tabletas, cápsulas de gelatina dura o blanda, soluciones acuosas, suspensiones, y liposomas y otras formulaciones de liberación lenta, tales como geles polímeros conformados. Las composiciones farmacéuticas orales líquidas pueden encontrarse en forma de, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes, o elixires acuosos o aceitosos, o se pueden presentar como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su utilización. Tales composiciones farmacéuticas líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles) o conservantes. Una forma de dosificación oral puede formularse de tal manera que las células se liberen en el intestino después de pasar a través del estómago. Tales formulaciones se describen en la Patente U.S.

35 Núm. 6.306.434 y en las referencias contenidas en ella.

Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal se pueden preparar como supositorios de dosis unitaria. Vehículos adecuados incluyen solución salina y otros materiales utilizados comúnmente en la técnica.

Para administración por inhalación, las células pueden suministrarse convenientemente mediante un insuflador, nebulizador, o un envase presurizado u otro medio cómodo de suministro de un spray de aerosol. Los envases presurizados pueden comprender un propelente adecuado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida.

45 Alternativamente, para administración por inhalación o insuflación, un medio puede tomar la forma de una composición de polvo seco, por ejemplo, una mixtura en polvo de un modulador y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición de polvo puede presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos o, v.g., en envases de gelatina o envases burbuja, desde los cuales puede administrarse el polvo con ayuda de un inhalador o insuflador. Para administración intra-nasal, las células pueden administrarse en forma de un spray líquido, tal como por un atomizador en botella de plástico.

Otros Ingredientes Activos

55 Las MAPCs se pueden administrar con otros agentes farmacéuticamente activos. En algunas realizaciones, uno o más de tales agentes se formulan junto con las MAPCs para administración. En algunas realizaciones, las MAPCs y los uno o más agentes se encuentran en formulaciones separadas. En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden las MAPCs y/o los uno o más agentes se formulan con relación a uso combinado de unos con otros.

Las MAPCs se pueden administrar en una formulación que comprende agentes inmunosupresores, tal como cualquier combinación de cualquier número de un corticosteroide, ciclosporina A, un agente inmunosupresor semejante a ciclosporina, ciclofosfamida, globulina antitimocitos, azatioprina, FK-506, y un agente inmunosupresor de tipo macrólido distinto de FK-506 y rapamicina. En ciertas realizaciones, tales agentes en sí incluyen un corticosteroide, ciclosporina A, azatioprina, ciclofosfamida, rapamicina, y/o FK-506. Agentes inmunosupresores de

65 acuerdo con lo que antecede pueden ser los únicos agentes adicionales de este tipo o pueden combinarse con otros agentes, tales como otros agentes indicados en esta memoria. Otros agentes inmunosupresores incluyen Tacrolimus, Micofenolato de mofetilo, y Sirolimus.

Tales agentes incluyen también agentes antibióticos, agentes antifúngicos, y agentes antivirales, para citar sólo un 5 pequeño número de otras sustancias y composiciones farmacológicamente activas que pueden utilizarse de acuerdo con realizaciones de la invención.

Antibióticos o compuestos anti-micóticos típicos incluyen, pero sin carácter limitante, penicilina, estreptomicina, anfotericina, ampicilina, gentamicina, kanamicina, ácido mico-fenólico, ácido nalidíxico, neomicina, nistatina, paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetraciclina, tilosina, zeocina, y cefalosporinas, aminoglicosidos, y equinocandinas.

Aditivos adicionales de este tipo se refieren al hecho de que las MAPCs, al igual que otras células madre, después de administración a un individuo pueden "regresar" a un ambiente favorable para su crecimiento y funcionamiento.

15 Dicho "retorno" concentra a menudo las células en sitios en los que son necesarias éstas, tales como sitios del trastorno, la disfunción, o la enfermedad inmune. Se conocen cierto número de sustancias que estimulan el retorno.Tales sustancias incluyen factores de crecimiento y agentes de señalización tróficos, tales como citoquinas. Éstas pueden utilizarse para promover el retorno de las MAPCs a sitios de tratamiento direccionados terapéuticamente, y se pueden administrar a un individuo antes del tratamiento con MAPCs, junto con las MAPCs, o se administran después de las MAPCs.

Ciertas citoquinas, por ejemplo, alteran o afectan a la migración de las MAPCs o sus homólogos diferenciados a sitios que precisan terapia, tales como sitios inmunodeficientes. Citoquinas que pueden utilizarse a este respecto incluyen, pero sin carácter limitante, factor-1 de grado de células estromáticas (SDF-1), factor de células madre

25 (SCF), angiopoyetina-1, factor de crecimiento derivado de placenta (PIGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), citoquinas que estimulan la expresión de moléculas de adhesión endoteliales tales como ICAMs y VCAMs, y citoquinas que generan o facilitan el retorno.

Las mismas se pueden administrar a un individuo como pretratamiento, junto con MAPCs, o después que se han administrado las MAPCs, para promover el retorno a sitios deseados y conseguir un efecto terapéutico mejorado, sea por mejora del retorno o por otros mecanismos. Tales factores pueden combinarse con MAPCs en una formulación adecuada para que los mismos se administren juntos. Alternativamente, tales factores se pueden formular y administrar por separado.

35 El orden de administración, así como las formulaciones, dosis, frecuencia de dosificación, y rutas de administración de los factores (tales como las citoquinas expuestas anteriormente) y MAPCs variará generalmente con el trastorno

o enfermedad de que se trate, su gravedad, el individuo, otras terapias que estén siendo administradas, la fase del trastorno o enfermedad, y factores de pronóstico, entre otros. Regímenes generales que han sido establecidos para otros tratamientos proporcionan un marco para la determinación de la dosificación apropiada en la terapia directa ocombinada mediada por las MAPC. Éstos, junto con la información adicional que se proporciona en esta memoria, permitirán al profesional experto determinar los procedimientos de administración apropiados de acuerdo con realizaciones de la invención, sin experimentación excesiva.

En algunas realizaciones, las células se formulan adecuadamente para tratamiento de lesión cerebral, con inclusión

45 de las lesiones y/o disfunciones y/o trastornos y/o enfermedades cerebrales expuestas en esta memoria. En algunas realizaciones, las formulaciones son eficaces para administración parenteral. En algunas realizaciones, las formulaciones son eficaces para infusión I.V. En algunas realizaciones, las formulaciones son eficaces para inyección estereotáxica.

Rutas

Las MAPCs se pueden administrar a un individuo por cualquiera de una diversidad de rutas conocidas por los expertos en la técnica que pueden utilizarse para administrar células a un individuo.

55 En diversas realizaciones, las MAPCs se administran a un individuo por cualquier ruta para suministro eficaz de terapéutica celular. En algunas realizaciones, las células se administran por inyección, con inclusión de inyección local y/o sistémica. En algunas realizaciones, las células se administran dentro y/o en proximidad al sitio de la disfunción para cuyo tratamiento están asignadas éstas. En algunas realizaciones, las células se administran por inyección en una localización que no se encuentra en proximidad al sitio de la disfunción. En algunas realizaciones, las células se administran por inyección sistémica, tal como inyección intravenosa.

Las MAPCs pueden estar destinadas a la administración por ruta parenteral. Las rutas parenterales de administración útiles en diversas realizaciones de la invención incluyen, entre otras, administración por inyección intravenosa, intraarterial, intracardiaca, intraespinal, intratecal, intraósea, intraarticular, intrasinovial, intracutánea, 65 intradérmica, subcutánea, y/o intramuscular. En algunas realizaciones, se utiliza inyección intravenosa, intraarterial,

intracutánea, intradérmica, subcutánea, y/o intramuscular. En algunas realizaciones se utilizan inyección intravenosa, intraarterial, intracutánea, subcutánea, y/o intramuscular.

En diversas realizaciones de la invención, las MAPCs se administran por inyección sistémica. La inyección

5 sistémica, tal como inyección intravenosa, ofrece una de las rutas más simples y menos invasivas para administración de MAPCs. En algunos casos, estas rutas pueden requerir dosis altas de MAPC para eficacia y/o retorno óptimos de las MAPCs a los sitios diana. En una diversidad de realizaciones, las MAPCs se pueden administrar por inyecciones direccionadas y/o localizadas a fin de asegurar el efecto óptimo en los sitios diana.

10 Las MAPCs se pueden administrar al individuo por medio de una aguja hipodérmica mediante una jeringuilla en algunas realizaciones de la invención. En diversas realizaciones, las MAPCs se administran al individuo a través de un catéter. En una diversidad de realizaciones, las MAPCs se administran por implantación quirúrgica. Adicionalmente, a este respecto, en diversas realizaciones de la invención las MAPCs se administran al individuo por implantación utilizando un procedimiento artroscópico. En algunas realizaciones, las MAPCs se administran al

15 individuo por inyección estereotáxica. En algunas realizaciones, las MAPCs se administran al individuo en o sobre un soporte sólido, tal como un polímero o gel. En diversas realizaciones, las MAPCs se administran al individuo en forma encapsulada.

En realizaciones adicionales de la invención, las MAPCs están formuladas convenientemente para suministro oral, 20 rectal, epicutáneo, ocular, nasal, y/o pulmonar y se administran de acuerdo con ello.

En algunas realizaciones, se utiliza administración parenteral para tratamiento de la lesión cerebral, con inclusión de las lesiones y/o disfunciones y/o trastornos y/o enfermedades cerebrales expuestas en esta memoria. En algunas realizaciones, se utiliza infusión IV. En algunas realizaciones se utiliza inyección estereotáxica.

25 Dosificación

Las composiciones se pueden administrar en dosis y por métodos bien conocidos por los expertos en las técnicas médicas y veterinarias teniendo en consideración factores tales como la edad, el sexo, el peso, y el estado del

30 paciente particular, así como la formulación que va a administrarse (v.g. sólida frente a líquida). Las dosis para humanos u otros mamíferos pueden ser determinadas sin experimentación excesiva por el profesional experto, a partir de esta exposición, los documentos citados en ella, y el conocimiento de la técnica.

La dosis de MAPCs apropiada para utilización de acuerdo con diversas realizaciones de la invención dependerá de

35 numerosos factores. La misma puede variar considerablemente por diversas circunstancias. Los parámetros que determinarán las dosis óptimas de MAPCs a administrar para terapia primaria y combinada incluirán generalmente algunos o todos de los siguientes: la enfermedad que se esté tratando y su fase; la especie del individuo, su salud, sexo, edad, peso y tasa de metabolismo; la inmunocompetencia del individuo; otras terapias que se estén administrando; y posibles complicaciones esperadas por la historia o el genotipo del individuo. Los parámetros

40 pueden incluir también: si las MAPCs son singénicas, autólogas, alogénicas, o xenogénicas; su potencia (actividad específica); el sitio y/o la distribución que debe(n) fijarse como diana para que las MAPCs sean eficaces; y características análogas del sitio tales como la accesibilidad para las MAPCs y/o el injerto de MAPCs. Parámetros adicionales incluyen la administración conjunta con MAPCs de otros factores (tales como factores de crecimiento y citoquinas). La dosis óptima en una situación dada tendrá en consideración también la vía en la que se formulan las

45 células, la vía de administración de las mismas, y el grado en que se localizarán las células en los sitios diana después de la administración. Finalmente, la determinación de la dosis óptima proporcionará necesariamente una dosis eficaz que no sea inferior al umbral de beneficio máximo ni superior al umbral en el que los efectos deletéreos asociados con la dosis de MAPCs sobrepasen las desventajas de la dosis aumentada.

50 La dosis óptima de MAPCs para algunas realizaciones estará comprendida en el intervalo de las dosis utilizadas para trasplante autólogo de células mononucleares de la médula ósea. La misma puede estimarse por extrapolación a partir de estudios con animales teniendo en cuenta las diferencias en el volumen (masa) y factores metabólicos, y a partir de los requerimientos de dosificación establecidos para otras terapias con células, tales como las terapias de trasplante.

55 En algunas realizaciones, las dosis óptimas varían desde 104 a 109 células MAPC/kg de masa del receptor por administración. En algunas realizaciones, las dosis óptimas por administración estarán comprendidas entre 105 y 108 células MAPC/kg. En algunas realizaciones, la dosis óptima por administración será 5 x 105 a 5 x 107 células MAPC/kg. En algunas realizaciones, las dosis óptimas por administración serán cualesquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

60 o 9 x 106 hasta cualesquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 x 107.

A modo de referencia, algunas de las dosis medias-altas anteriores son análogas a las dosis de células nucleadas utilizadas en trasplante autólogo de células mononucleares de la médula ósea. Algunas de las dosis medias-bajas son análogas al número de células CD34+/kg utilizadas en trasplante autólogo de células mononucleares de la

65 médula ósea.

Debe apreciarse que una dosis simple puede suministrarse de una vez, fraccionadamente, o continuamente a lo largo de un periodo de tiempo. La dosis completa puede suministrarse también a un solo punto o extenderse fraccionadamente a lo largo de varias localizaciones.

5 En diversas realizaciones, las MAPCs se pueden administrar en una dosis inicial, y mantenerse después por administración ulterior de MAPCs. Las MAPCs se pueden administrar por un método inicialmente, y administrarse después por el mismo método o por uno o más métodos diferentes. Los niveles de MAPC del individuo pueden mantenerse por la administración continuada de las células. Diversas realizaciones administran las MAPCs sea inicialmente o para mantener su nivel en el individuo o con ambos objetos, por inyección intravenosa. En una diversidad de realizaciones, se utilizan otras formas de administración, dependiendo del estado del paciente y otros factores, expuestos en otro lugar de esta memoria.

Debe indicarse que los individuos humanos se tratan generalmente durante más tiempo que los animales experimentales; no obstante, el tratamiento tiene por regla general una duración proporcional a la duración del 15 proceso de la enfermedad y la eficacia del tratamiento. Los expertos en la técnica tendrán en cuenta esto en la utilización de los resultados de otros procedimientos llevados a cabo en humanos y/o en animales, tales como ratas, ratones, primates no humanos, y análogos, a fin de determinar las dosis apropiadas para humanos. Tales determinaciones, basadas en estas consideraciones y teniendo en cuenta las directrices proporcionadas por la presente exposición y la técnica anterior permitirán al profesional experto realizar esto sin experimentación excesiva.

Regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis ulteriores o para administraciones secuenciales pueden ser todos ellos iguales, o pueden ser variables. Los regímenes apropiados pueden ser determinados por el profesional experto, a partir de esta exposición, los documentos citados en ella, y el conocimiento de la técnica.

25 La dosis, frecuencia, y duración del tratamiento dependerán de muchos factores, que incluyen la naturaleza de la enfermedad, el individuo, y otras terapias que puedan ser administradas. De acuerdo con ello, pueden utilizarse una gran diversidad de regímenes para administrar las MAPCs.

En algunas realizaciones, las MAPCs se administran a un individuo en una sola dosis. En otras, se administran las MAPCs a un individuo en una serie de dos o más dosis sucesivas. En algunas otras realizaciones en las que se administran las MAPCs en una sola dosis, en dos dosis, y/o en más de dos dosis, las dosis pueden ser iguales o diferentes, y las mismas se administran con intervalos iguales o desiguales entre ellas.

Las MAPCs se pueden administrar en muchas frecuencias a lo largo de una amplia gama de tiempos, por ejemplo

35 hasta que se alcanza un efecto terapéutico deseado. En algunas realizaciones, las MAPCs se administran a lo largo de un periodo de menos de un día. En otra realización, se administran las mismas a lo largo de dos, tres, cuatro, cinco, o seis días. En algunas realizaciones, las MAPCs se administran una o más veces por semana, a lo largo de un periodo de semanas. En otras realizaciones, aquéllas se administran a lo largo un periodo de semanas durante uno hasta varios meses. En algunas realizaciones, aquéllas se pueden administrar a lo largo de un periodo de meses. En otras, aquéllas se pueden administrar a lo largo de un periodo de uno o más años. Generalmente, las duraciones de tratamiento serán proporcionales a la duración del proceso de la enfermedad, la eficacia de las terapias que se estén aplicando, y el estado y la respuesta del individuo que se esté tratando.

En algunas realizaciones, las MAPCs se administran una vez, dos veces, tres veces, o más de tres veces hasta que

45 se alcanza un efecto terapéutico deseado o hasta que ya no parezca probable que la administración proporcione un beneficio para el individuo. En algunas realizaciones, las MAPCs se administran continuamente durante cierto periodo de tiempo, por ejemplo por goteo intravenoso. La administración de las MAPCs puede realizarse durante un periodo de tiempo corto, durante días, durante semanas, durante meses, durante años, o durante periodos de tiempo más largos.

En algunas realizaciones, se administra un bolus simple para tratar lesiones cerebrales, con inclusión de las lesiones y/o disfunciones y/o trastornos y/o enfermedades cerebrales expuestas en esta memoria. En algunas realizaciones se administran dos o más administraciones de un bolus simple por separado en el tiempo durante uno o más días. En algunas realizaciones, cada dosis se administra por infusiones I.V. a lo largo de cualquier periodo de tiempo

55 desde varios minutos a varias horas. En algunas realizaciones, se administrará una sola dosis de células por inyección estereotáxica. En algunas realizaciones, se administran dos o más dosis a la misma o diferentes áreas del cerebro por inyección estereotáxica. En las realizaciones que implican bolus, IV, e inyección estereotáxica para tratamiento de una lesión cerebral a este respecto, la dosis de células por administración es de 104 a 109 células MAPC/kg de masa del receptor por administración. En algunas realizaciones, la dosis es de 105 a 108 células MAPC /kg. En algunas realizaciones, la dosis es de 5 x 105 a 5 x 107 células MAPC/kg. En algunas realizaciones la dosis es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 x 106 hasta cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 x 107.

MAPC's como se Describen en la Patente U.S. Núm. 7.015.037

65 Las MAPCs humanas se describen en la técnica. Los métodos de aislamiento de MAPC para humanos y ratones son conocidos en la técnica. Así pues, actualmente es posible que un experto en la técnica obtenga aspirados de médula ósea, biopsias cerebrales o hepáticas, y otros órganos, y aísle las células utilizando métodos de selección positiva y/o negativa disponibles para los expertos en la técnica, basándose en los genes que se expresan (o no se expresan) en estas células (v.g., por ensayos funcionales o morfológicos tales como los descritos en las solicitudes citadas anteriormente). Métodos ilustrativos se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. Núm. 7.015.037.

5 Aislamiento y Crecimiento de MAPC's como se describe en la Patente U.S. Núm. 7.015.037

Los métodos de aislamiento de las MAPC son conocidos en la técnica a partir de, por ejemplo, humanos, ratas, ratones, perros y cerdos. Métodos ilustrativos se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. Núm. 7.015.037 y PCT/US02/04652 (publicado como WO 02/064748), y estos métodos, junto con una caracterización de las MAPCs expuestas en esta memoria, a modo de ilustración y exclusivamente como ejemplo no limitante.

Las MAPCs se aislaron inicialmente de médula ósea, y se establecieron subsiguientemente a partir de otros tejidos, con inclusión de cerebro y músculo (Jiang, Y. et al., 2002). Las MAPCs pueden aislarse de gran número de fuentes,

15 con inclusión, pero sin carácter limitante, de médula ósea, placenta, cordón umbilical y sangre del cordón, músculos, cerebro, hígado, médula espinal, sangre, tejido adiposo y piel. Por ejemplo, pueden derivarse MAPCs de aspirados de médula ósea, que se pueden obtener por medios estándar disponibles para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Muschler, G.F. et al., 1997; Batinic, D., et al., 1990).

Fenotipo de las MAPC Humanas en las Condiciones Expuestas en la Patente U.S. Núm. 7.015.037

El análisis inmunofenotípico por FACS de MAPCs humanas obtenidas después de 22-25 duplicaciones celulares indicó que las células no expresan CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD50, CD62E y -P, HLA-DR, muc18, STRO-1, cKit, Tie/Tek; y expresan niveles bajos de CD44, HLA-clase I, y microglobulina �2, pero expresan CD10, CD13,

25 CD49b, CD49e, CDw90, y Flkl (N > 10).

Una vez que las células se sometieron a > 40 duplicaciones en cultivos se sembraron de nuevo a aproximadamente 2 x 103/cm2, el fenotipo se volvió más homogéneo, y ninguna célula expresaba HLA de clase-I o CD44 (n = 6). Cuando las células habían crecido hasta un valor superior a la confluencia, expresaban niveles altos de Muc18, CD44, HLA clase I, y microglobulina �2, lo que es similar al fenotipo descrito para MSC (N = 8) (Pittenger, 1999).

La inmunohistoquímica demostró que las MAPCs humanas que habían crecido hasta aproximadamente 2 x 103/cm2 de densidad de siembra expresaban EGF-R, TGF-R1 y -2, BMP-R1A, PDGF-R1a y -B, y que una pequeña subpoblación (entre 1 y 10%) de las MAPCs se teñían con anticuerpos anti-SSEA4 (Kannagi, R, 1983).

35 Utilizando redes de cDNA Clontech, se determinó el perfil génico expresado por las MAPCs humanas cultivadas a densidades de siembra de aproximadamente 2 x 103 células/cm2 para 22 y 26 duplicaciones celulares.

A. Las MAPCs no expresaban CD31, CD36, CD62E, CD62P, CD44-H, cKit, Tie, receptores para IL1, IL3, IL6, IL11, G CSF, GM-CSF, Epo, Flt3-L, o CNTF, y niveles bajos de HLA-clase-I, CD44-E y Muc-18 mRNA.

B. Las MAPCs expresaban mRNA para las citoquinas BMP1, BMP5, VEGF, HGF, KGF, MCP1; los receptores de citoquinas Flk1, EGF-R, PDGF-R1a, gp130, LIF-R, activin-R1 y -R2, TGFR-2, BMP-R1A; los receptores de adhesión CD49c, CD49d, CD29; y CD10.

C. Las MAPCs expresaban mRNA para hTRT y TRF-1; el factor de transcripción del dominio POU oct-4, sox-2 (requerido con oct-4 para mantener el estado indiferenciado de ES/EC, Uwanogho D., 1995), sox 11 (desarrollo neural), sox 9 (condrogénesis) (Lefebvre V., 1998); factores de transcripción de homeodominios: Hox-a4 y -a5 (especificación del esqueleto cervical y torácico; organogénesis del tracto respiratorio) (Packer AI, 2000), Hox-a9 (mielopoyesis (Lawrence H, 1997), Dlx4 (especificación de las estructuras del prosencéfalo y periféricas de la cabeza) (Akimenko MA, 1994), MSX1 (mesodermo embrionario, corazón y musculatura adultos, condro-y osteogénesis) (Foerst-Potts L. 1997), PDX1 (páncreas) (Offield MF, 1996).

D. Se confirmó la presencia de oct-4, LIF-R, y hTRT mRNA por RT-PCR. 55

E. Adicionalmente, la RT-PCR demostró que mRNA de rex-1 y mRNA de rox-1 se expresaban en MAPCs.

Oct-4, rex-1 y rox-1 se expresaban en MAPCs derivadas de médula humana y murina y de hígado y cerebro murino. Las MAPCs humanas expresaban LIF-R y se teñían positivamente con SSEA-4. Por último, se encontró que los niveles de mRNA de oct-4, LIF-R, rex-1 y rox-1 aumentaban en las MAPCs cultivadas más allá de 30 duplicaciones celulares, lo cual daba como resultado células más homogéneas fenotípicamente. En contraste, las MAPCs cultivadas a esta densidad pierden la expresión de estos marcadores. Esto se asoció con la senescencia antes de 40 duplicaciones celulares y la pérdida de diferenciación a células distintas de condroblastos, osteoblastos, y adipocitos. Así pues, la presencia de oct-4, combinado con rex-1, rox-1, y sox-2, estaba correlacionada con la

65 presencia de las células más primitivas en los cultivos MAPCs.

Los métodos para cultivar MAPCs son bien conocidos en la técnica. (Véase por ejemplo, la Patente U.S. Núm. 7.015.037). La densidad para cultivo de MAPCs puede variar desde aproximadamente 100 células/cm2 o aproximadamente 150 células/cm2 hasta aproximadamente 10.000 células/cm2, incluyendo aproximadamente 200 células/cm2 hasta aproximadamente 1500 células/cm2 y hasta aproximadamente 2000 células/cm2. La densidad

5 puede variar entre las especies. Adicionalmente, la densidad óptima puede variar dependiendo de las condiciones de cultivo y la fuente de las células. Está dentro de la experiencia del profesional ordinario la determinación de la densidad óptima para una serie dada de condiciones y células de cultivo.

Asimismo, concentraciones de oxígeno atmosférico eficaces inferiores a aproximadamente 10%, con inclusión de aproximadamente 3 a 5%, pueden utilizarse en cualquier momento durante el aislamiento, el crecimiento, y la diferenciación de MAPCs en cultivo.

La presente invención se describe adicionalmente por los ejemplos ilustrativos y no limitantes siguientes.

15 Ejemplos

EJEMPLO 1: Lesión Hipóxico-Isquémica con MAPCs en las Ratas y Tratamiento con MAPCs e Inmunosupresión

Crías de rata Sprague Dawley (SD) de 7 días (n = 7 por grupo de test) se sometieron a lesión HI por el método de ligación unilateral de la carótida seguido por 8% de hipoxia, como ha sido descrito por Rice et al., Ann Neurol. 9: 131-141 (1961), que se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad, particularmente en lo que respecta a este método. Siete días después de la lesión, los animales se sometieron a trasplante estereotáxico en la región del hipocampo con MAPCs criopreservadas (descongeladas inmediatamente antes del trasplante) derivadas de ratas SD (singénicas, marcadas con GFP, 200.000 células por animal) o ratas Fisher (alogénicas, marcadas con

25 gal, 200.000 células por animal). Todos los animales se trataron con inmunosupresión diaria (CSA, 1 mg/kg, i.p.) a lo largo del periodo de supervivencia. Los días 7 y 14 posteriores al trasplante, se realizaron el Test de Balanceo del Cuerpo Levantado (EBST) y el Test Rotarod para revelar las funciones motoras y neurológicas generales y coordinadas como se describe en Borlongan et al., J Neurosci., 15: 5372-5378 (1995). Los animales se sometieron a eutanasia para análisis inmunohistoquímico de las MAPCs injertadas después de la realización del test el día 14. Un diagrama de flujo del experimento se representa en la Figura 1. No se observó mortalidad alguna en los animales que recibieron trasplantes de MAPC durante el curso del estudio.

EJEMPLO 2A: Evaluación de la Habilidad Locomotora a los 7 y 14 Días Después de Inyección de MAPC en Ratas con Lesión HI.

35 Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 1. El día 7 después del trasplante, los animales con lesión HI trasplantados con MAPC exhibían cierta tendencia a menor asimetría motora como se determinó por el EBST (64-65% frente a 75%) y mayor tiempo invertido en el Rotarod (14,1-16,5 frente a 18 segundos) comparados con los animales lesionados infundidos con vehículo. El día 14 después del trasplante, los animales trasplantados con MAPC exhibían una asimetría motora significativamente reducida (66-70% frente a 87%) y mayor tiempo invertido en el Rotarod (27,3-28,3 frente a 21 segundos) que los animales de control que recibieron la infusión de vehículo. Las MAPCs singénicas y alogénicas trasplantadas en animales lesionados no diferían estadísticamente en sus mejoras conductuales en ambos periodos de test. Los resultados se representan gráficamente en la Figura 2. Los resultados muestran los efectos terapéuticos de las MAPCs inyectadas en el modelo de la lesión HI de la rata por medidas

45 tanto locomotoras como neurológicas.

EJEMPLO 2B: Análisis Histológico del Injerto de MAPC el Día 14 Después de la Inyección con MAPC en los Cerebros de Ratas HI.

Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 1. La MAPCs injertadas se detectaron en los cerebros de los animales con lesión HI después del sacrificio el día 14 posterior al trasplante por examen histológico. Los injertos singénicos positivos a GFP se detectaron en su mayoría en el sitio de trasplante CA3del hipocampo y la región CA2 adyacente, que se marcaban concurrentemente con DAPI. Los injertos alogénicos, detectados por tinción con anti-gal y marcación conjunta con DAPI, exhibían un patrón similar de supervivencia del injerto en los cerebros con lesión

55 HI. La supervivencia del injerto era 0,96% a los 14 días (el valor F de ANOVA es 24,27, df = 2, 19 y p < 0,0001; el valor Fisher posthoc es p < 0,0001). Los resultados muestran que los injertos de MAPCs tanto alogénicas como singénicas se injertan en el sitio de inyección y persisten hasta al menos dos semanas después de la inyección intracerebral directa en los animales en el modelo de la lesión HI de la rata.

EJEMPLO 3: Las MAPC Injertadas Protegen las Neuronas Endógenas

Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 1. El análisis histológico se llevó a cabo en gran parte como se describe en el Ejemplo 2B, pero secciones cerebrales alternativas se tiñeron con NissI a fin de determinar el nivel de viabilidad neuronal endógena. Se registraba una disminución significativa en la muerte de neuronas 65 endógenas en los animales que se inyectaron con MAPCs singénicas o alogénicas, comparados con los animales inyectados con vehículo de control. Los resultados se representan gráficamente en la Figura 3. Los resultados

muestran que la administración de MAPC protege las neuronas endógenas contra la lesión isquémica hipóxica, dando como resultado una viabilidad neuronal incrementada.

EJEMPLO 4: Co-Localización de las MAPCs Injertadas y Neuronas Representadas por Análisis de Marcadores

5 Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 1. Secciones cerebrales generadas a partir de las ratas tratadas con MAPC se tiñeron conjuntamente para los marcadores de MAPC arriba descritos (GFP para MAPCs singénicas o -gal para MAPCs alogénicas) y concurrentemente para MAP2, un marcador bien caracterizado para neuronas. Se encontró un pequeño número de células que expresaban tanto el marcador MAPC respectivo como el marcador neuronal, tanto en los animales injertados singénicos como en los alogénicos, lo que indicaba que algunas MAPCs se han diferenciado en neuronas; aunque es también posible que algunas células de doble tinción sean el resultado raro de la fusión de una células MAPC injertada con una célula neuronal endógena. Los resultados muestran la diferenciación neuronal fenotípica precoz de MAPCs el día 14 después de la administración a los animales en el modelo de la lesión HI de la rata.

15 EJEMPLO 5: Las MAPCs son Terapéuticamente Beneficiosas en el Modelo de la Lesión HI en la Rata Neonatal Sin Inmunosupresión Cuando se Administran por Inyección Estereotáxica o por Infusión I.V.

Crías de rata Sprague-Dawley (SD) de 7 días (n = 7 por grupo de test) se sometieron a lesión HI por ligación unilateral de la carótida seguida por 8% de hipoxia, como se describe en el Ejemplo 1 anterior y en la referencia citada en dicho lugar. Siete días después de la lesión HI, los animales se sometieron a trasplante estereotáxico en la región del hipocampo con MAPCs criopreservadas (descongeladas inmediatamente anteriores del trasplante) derivadas de ratas Fisher (alogénicas, marcadas con �-gal, 200.000 células por animal). Los tests conductuales se condujeron en los días 7 y 14 después del trasplante utilizando el test EBST y el test Rotarod para revelar las

25 funciones motoras y neurológicas generales y coordinadas. Llegado el día 14, los animales tratados con MAPC exhibían una mejora estadísticamente significativa tanto en los grupos intracraneales como en los suministrados por IV en ambos tests EBST y Rotarod, comparados con el grupo de control, que recibió PBS solamente (p < 0,05 para ambos tests).

EJEMPLO 6: Tratamiento del Ictus con MAPCs Xenogénicas (Humanas) en el Modelo de Ictus en Roedores con Oclusión de la MCA

Veintiocho ratas SD adultas se sometieron a cirugía de oclusión de la arteria cerebral media (MCA) para inducir un ictus quirúrgico en los animales. Siete días después de la inducción del ictus, los animales se separaron en cuatro

35 grupos de 7 animales cada uno. Cada grupo recibió administración intracerebral directa de una de las siguientes: (1) inyección de 3 1l de PBS (control), (2) inyección de 3 1l de PBS que contenía 100.000 MAPCs humanas, (3) inyección de 3 1l de PBS que contenía 200.000 MAPCs humanas, y (4) inyección de 3 1l de PBS que contenía

400.000 MAPCs humanas. Los animales se testaron como se describe en los ejemplos siguientes y se sacrificaron el día 21.

EJEMPLO 7: Beneficio Terapéutico de la Administración de MAPC en el Modelo del Ictus Demostrado por Test Locomotor y Neurológico

Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 6. Al cabo de 7 y 14 días después del trasplante de

45 células, cada animal se sometió a un test EBST y Bederson para determinar la función locomotora y neurológica, como se ha descrito arriba. Se observó una mejora estadísticamente significativa en la balanceo sesgado en el EBST en los animales que recibieron 200.000 ó 400.000 células comparados con el control el día 7 después del trasplante. A los 14 días, los tres grupos de animales que recibieron inyecciones de MAPC humanas exhibían una mejora significativa comparados con el grupo de control. Los resultados se representan en los gráficos superior e inferior en el lado izquierdo de la Figura 4.

Concurrentemente pero por separado del EBST, cada RATA se sometió al panel Bederson de CUATRO tareas para valorar la función neurológica a los 14 y 21 días después del ictus por oclusión de la MCA. Los cuatro tests se puntúan desde 0 (déficit neurológico no observable) a 3 (déficit neurológico severo) para cada uno de los cuatro

55 tests. Las cuatro puntuaciones se promedian luego para proporcionar una medida global de la función neurológica. A los 7 días después del trasplante de MAPC, los animales que recibieron 200.000 ó 400.000 células exhibían una mejora estadísticamente significativa en la función neurológica comparados con los animales de control. A los 14 días, los tres grupos que recibieron inyecciones de MAPC humanas demostraron mejora significativa comparados con el grupo de control. Los resultados se representan en los gráficos superior e inferior en el lado derecho de la Figura 4.

Los resultados muestran una mejora estadísticamente significativa, dependiente de la dosis, de los animales a partir del primer punto de test (7 días después de la inyección) tanto en el test locomotor como en el neurológico de los animales tratados con 200.000 ó 400.000 MAPCs. (Los animales tratados con 100.000 MAPCs no presentaban

65 mejora estadísticamente significativa con respecto a los animales tratados sólo con el vehículo de control.) Los resultados demuestran que la administración de MAPCs xenogénicas por inyección intracerebral directa al cerebro con ictus de la rata proporciona una mejora estadísticamente significativa en ambos tests de beneficio locomotor y neurológico cuando se comparan con los animales tratados sólo con vehículo al menos tan pronto como una semana después de la inyección y que persiste durante al menos tanto como dos semanas después de la inyección.

5 EJEMPLO 8: Injerto de MAPC en los Cerebros del Modelo de Ictus HI en la Rata

Se trataron ratas como se describe en el Ejemplo 6 anterior. Después del último test conductual el día 14 posterior al trasplante de MAPC, los animales se sacrificaron y se extrajeron los cerebros. Secciones semidelgadas de tejido incrustado en parafina se tiñeron con DAPI para visualizar todos los núcleos celulares y los anticuerpos policlonales 10 de ratón anti-HuNu (núcleos humanos), seguidos por anticuerpos monoclonales anti-ratón de cabra conjugados con FITC para teñir las MAPCs humanas injertadas. Se encontraron MAPCs en el córtex (CTX), la zona sub-ventricular (SVZ), y el cuerpo estriado (STR). Los resultados indican que las MAPCs humanas sobreviven y se injertan después de inyección intracerebral en las ratas que exhibían beneficios terapéuticos significativos de la administración de MAPC. La distribución de las células indica que las MAPCs migran a regiones secundarias del cerebro y 15 permanecen injertadas en ellas así como en el sitio primario, en el que se inyectaron las células. El mismo patrón de supervivencia y migración se observó para inyecciones de 100.000 y 200.000 MAPCs. No se registraba inmunorreactividad detectable alguna de HuNu en los cerebros de los animales de control con ictus que fueron inyectados solamente con el vehículo. Los porcentajes de supervivencia del injerto eran 0,55%, 0,7%, y 0,51% a los 14 días después del ictus para dosis de trasplante de 100.000, 200.000, y 400.000 MAPC, respectivamente. Los

20 resultados muestran claramente que las MAPCs sobreviven y se mantienen injertadas en los cerebros del modelo de ictus no sólo en el sitio de inyección, sino que aquéllas migran también a y se injertan en sitios secundarios alejados del sitio de inyección. En suma, hasta al menos dos semanas después de la inyección intracerebral directa, las MAPCs humanas xenogénicas están presentes en el sitio de lesión e inyección (el cuerpo estriado), y en sitios secundarios en los cerebros inyectados, con inclusión del córtex y la zona sub-ventricular.

25 EJEMPLO 9: Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de Rata con MAPCs Alogénicas (Rata). Con MAPCs (Humanas) Xenogénicas. Ambos Con y Sin Tratamiento Inmunosupresor Concurrente

Se sometieron 35 ratas SD a cirugía de ligación de la arteria cerebral media (MCA) para inducir un ictus quirúrgico

30 en los animales. Siete días después de la inducción del ictus, los animales se separaron en 5 grupos de 7 animales cada uno. Cada grupo recibió administración intracerebral directa de una de las siguientes: (1) inyección de 3 1l de PBS que contenían 400.000 MAPCs de rata sin inmunosupresora alguna; (2) inyección de 3 1l de PBS que contenían 400.000 MAPCs de rata con tratamiento inmunosupresor (CSA, 1 mg/kg, i.p.); (3) inyección de 3 1l de PBS que contenían 400.000 MAPCs humanas sin inmunosupresor alguna; (4) inyección de 3 1l de PBS que

35 contenían 400.000 MAPCs humanas con tratamiento inmunosupresor (CSA, 1 mg/kg, i.p.), y (5) inyección de 3 1l de PBS que contenían 400.000 MAPCs humanas irradiadas no viables con tratamiento inmunosupresor (CSA, 1 mg/kg, i.p.).

EJEMPLO 10: Conducta y Evaluación Neurológica del Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de

40 Rata con MAPCs Alogénicas (Rata), Con MAPCs Xenogénicas (Humanas), Ambos Con y Sin Tratamiento Inmunosupresor Concurrente

Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 9. A los 14 días después del trasplante de las células, y cada 14 días después de ello durante 8 semanas, cada animal se sometió a un test EBST y Bederson para 45 determinar la función locomotora y neurológica. La administración de MAPCs xenogénicas y alogénicas dio en ambos casos como resultado mejoras estadísticamente significativas y sostenidas en ambas evaluaciones EBST y Bederson, con y sin tratamiento inmunosupresor. Los resultados muestran que las MAPCs trasplantadas 7 días después de la lesión isquémica proporcionan beneficios terapéuticos estadísticamente significativos de larga duración (8 semanas) en la conducta y las funciones neurológicas. Los resultados indican adicionalmente que no se

50 requiere inmunosupresión para los efectos terapéuticos demostrados. Los resultados se representan gráficamente en la Figuras 5 y 6.

EJEMPLO 11: Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de Rata con MAPCs Xenogénicas (Humanas) Suministradas por Inyección o por Infusión I.V., Con y Sin Inmunosupresión

55 Cuarenta y dos ratas SD se sometieron a cirugía de ligación de la arteria cerebral media (MCA) para inducir un ictus isquémico en los animales. Siete días después de la inyección del ictus, los animales se separaron en 6 grupos de 7 animales cada uno. Cada grupo recibió administración intravenosa de una de las siguientes: (1) 400.000 MAPCs humanas con tratamiento inmunosupresor (CSA, 1 mg/kg, i.p.); (2) 400.000 MAPCs humanas sin inmunosupresión

60 alguna; (3) 1.000.000 MAPCs humanas con tratamiento inmunosupresor (CSA, 1 mg/kg, i.p.); (4) 1.000.000 MAPCs humanas sin tratamiento inmunosupresor alguno; (5) 1.000.000 MAPCs humanas irradiadas no viables con tratamiento inmunosupresor (CSA, 1 mg/kg, i.p.), y (6) 1.000.000 MAPCs humanas irradiadas no viables sin tratamiento inmunosupresor alguno.

EJEMPLO 12: Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de Rata con MAPCs Xenogénicas (Humanas) Suministradas por Inyección o por Infusión I.V., Con y Sin Inmunosupresión - Conducta y Evaluaciones Neurológicas

5 Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 11. A los 14 días después del trasplante, y cada 14 días después de ello durante 8 semanas, se evaluó la función locomotora y neurológica de cada animal por los tests EBST y Bederson, respectivamente.

Los animales se sacrificaron después del test el día 56 posterior al trasplante.

Los resultados muestran un efecto terapéutico significativo dependiente de la dosis sobre la función locomotora. Los animales infundidos con 1.000.000 MAPCs viables exhibían mejora significativa con respecto al grupo de control correspondiente tratado con MAPCs irradiadas. Se obtuvo el mismo resultado con y sin inmunosupresión. No se registró mejora significativa alguna en los animales infundidos con 400.000 MAPCs viables con respecto al grupo de

15 control correspondiente tratado con MAPCs irradiadas. Se obtuvo el mismo resultado con y sin inmunosupresión.

Los resultados muestran también un efecto significativo dependiente de la dosis sobre la función neurológica. Los animales tratados tanto con 400.000 como con 1.000.000 MAPCs viables exhibían mejoras significativas con respecto a los grupos correspondientes tratados con MAPCs irradiadas. Se observó tendencia hacia una menor recuperación a lo largo de 56 días del experimento en los animales tratados con 400.000 células pero no en los tratados con 1.000.000 células. Se obtuvieron los mismos resultados con y sin inmunosupresión.

En suma, los animales tratados con 1.000.000 MAPCs viables exhibían una mejora estadísticamente significativa y sostenida tanto en el funcionamiento locomotor como en el neurológico a lo largo de todo el transcurso de 8

25 semanas del experimento. Además, el efecto terapéutico no requiere inmunosupresión. Los resultados eran los mismos son y sin CSA.

Los resultados se representan gráficamente en las Figuras 7 y 8.

EJEMPLO 13: Efecto de la Elección del Momento del Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de Rata con MAPCs Xenogénicas (Humanas) Suministradas por Infusión I.V.

Se sometieron 28 ratas SD a cirugía de ligación de la arteria cerebral media (MCA) para inducir un ictus quirúrgico en los animales. Los animales se separaron en 4 grupos de 7 animales cada uno. Cada grupo recibió 1.000.000

35 MAPCs xenogénicas (humanas) por infusión intravenosa, sin inmunosupresión. Todos los grupos se trataron del mismo modo excepto que las MAPCs se administraron en diferentes momentos después de la inducción del ictus. Las MAPCs se administraron a los grupos el número siguiente de días después de la inducción: (1) un día, (2) dos días, y (3) siete días. Adicionalmente, el grupo (4) recibió 1.000.000 MAPCs irradiadas no viables el día 7 después de la inducción.

No se observó mortalidad alguna en los animales que recibieron MAPCs durante el estudio.

EJEMPLO 14: Efecto de la Elección del Momento Sobre el Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de Rata con MAPCs Xenogénicas (Humanas) Suministradas por Infusión I.V. - Función Locomotora y Neurológica

45 Se trataron los animales como se describe en el Ejemplo 12. A los 7 días después del trasplante de las células, y cada 7 días después de ello durante 8 semanas, se evaluaron las funciones locomotora y neurológica en cada animal por los tests EBST y Bederson, respectivamente.

Los resultados para los 3 grupos de animales tratados con MAPCs viables exhiben una mejora estadísticamente significativa y sostenida en ambas funciones locomotora y neurológica comparados con el grupo de control tratado con MAPCs irradiadas (grupo 4). No se registraba diferencia estadística alguna entre los resultados para la función locomotora obtenidos para los 3 grupos tratados con MAPCs viables. Lo mismo ocurría para los 3 grupos en cuanto a la función neurológica.

55 Los resultados demuestran que las MAPCs proporcionan un beneficio terapéutico tanto en la función locomotora como en la neurológica cuando se administran por IV del primero al séptimo día después de lesión cerebral isquémica.

Los resultados se representan gráficamente en las Figuras 9 y 10.

EJEMPLO 15: Efecto de la Elección del Momento Sobre el Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de Rata con MAPCs Xenogénicas (Humanas) Suministradas por Infusión I.V. - Injerto

65 Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 12. Los animales se sacrificaron después de los tests conductuales finales el día 56 para cada grupo. Se extirparon los cerebros de los animales sacrificados. Se prepararon secciones semidelgadas de tejido incrustado en parafina a partir de los cerebros. Las secciones se tiñeron con DAPI para visualizar todos los núcleos celulares y con anticuerpos policlonales de ratón anti-HuNu (núcleos humanos), seguido por anticuerpos monoclonales anti-ratón de cabra conjugados con FITC para teñir MAPCs humanas injertadas. Se contaron tanto las células teñidas con DAPI como las teñidas con FITC. El número

5 total de células injertadas se determinó a partir del número de células teñidas con FITC. El porcentaje de MAPCs inyectadas que se injertaba se calculó a partir de la ratio del número total de células injertadas al número total de células infundidas en cada animal.

Los resultados muestran un número algo menor de células injertadas en los primeros momentos de la administración

10 después de la lesión. Los animales administrados con MAPCs un día después de la lesión promediaban 0,75% de injerto. Los administrados con MAPCs dos días después de la lesión promediaban 1,1% de células injertadas. Los animales administrados con MAPCs siete días después de la lesión promediaban 1,27% de células viables injertadas. La tendencia no es estadísticamente significativa; sin embargo sugiere que el entorno inflamatorio de la lesión isquémica inmediatamente después de un ictus puede ser menos favorable para el injerto y la supervivencia a

15 largo plazo de las MAPCs que el entorno presente sólo unos cuantos días más tarde.

EJEMPLO 16: Efecto de la Elección del Momento Sobre el Tratamiento del Ictus Isquémico en un Modelo Quirúrgico de Rata con MAPCs Xenogénicas (Humanas) Suministradas por Infusión I.V. - Protección Neuronal

20 Los animales se trataron como se describe en el Ejemplo 12. Se prepararon secciones de cerebro como se describe en el Ejemplo 14. Se tiñeron secciones alternativas (a las utilizadas en el Ejemplo 14) con NissI para determinar la viabilidad neuronal endógena. Los resultados muestran una disminución estadísticamente significativa en la muerte neuronal endógena por la administración de MAPC. El efecto protector de las MAPCs sobre la viabilidad neuronal endógena aumenta a medida que disminuye el tiempo entre la inducción del ictus y la administración de las MAPC.

25 Había más neuronas viables en los animales que recibieron las MAPCs un día después de la inducción del ictus que en los que recibieron las MAPCs el día 2 después de la inducción del ictus, y la diferencia era estadísticamente significativa. Análogamente, había más neuronas viables en los animales que recibieron MAPCs el día 2 después de la inducción del ictus que los que recibieron MAPCs el día 7 después del ictus, y esta diferencia era también estadísticamente significativa. Los resultados indican que cuanto más pronto se administran las MAPCs después de

30 un evento isquémico, tanto mayor es el efecto protector para la viabilidad neuronal endógena.

Los resultados se presentan gráficamente en la Figura 11.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Células para uso en el tratamiento de una lesión cerebral en un individuo propenso a sufrir, que está

   sufriendo o que ha sufrido una lesión cerebral en donde las células no son células madre embrionarias, células 5 germinales embrionarias, o células germinales en donde las células expresan oct-3/4 y telomerasa y son alogénicas

   o xenogénicas al individuo y pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmico, ectodérmico y mesodérmico y se administran por una ruta eficaz y en una cantidad eficaz para tratar dicha lesión cerebral, en donde dicho individuo no se trata con una terapia inmunosupresora combinada al tratamiento con dichas células.
2. 2. El uso de células en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una lesión cerebral en un individuo propenso a sufrir, que está sufriendo o que ha sufrido una lesión cerebral, en donde las células no son células madre embrionarias, células germinales embrionarias, o células germinales en donde las células expresan oct-3/4 y telomerasa y son alogénicas o xenogénicas al individuo y pueden diferenciarse en al menos un tipo de

   15 célula de cada uno de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmico, ectodérmico, y mesodérmico y se administran por una ruta eficaz en una cantidad eficaz para tratar dicha lesión cerebral, en donde dicho individuo no se trata con una terapia inmunosupresora en combinación con el tratamiento con dichas células.
3. 3. Células para uso o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la lesión cerebral está 20 causada por hipoxia y/o por una oclusión o un bloqueo del suministro de sangre.
4. 4. Células para uso o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la lesión cerebral es lesión cerebral isquémica hipóxica, infarto cortical y/o ictus.

   25 5. Células para uso o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas células pueden diferenciarse en al menos un tipo de célula de cada uno de los linajes embrionarios endodérmico, ectodérmico, y mesodérmico.
5. 6. Células para uso o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas

   30 células se administran a dicho individuo en una o más dosis que comprenden 105 a 108 de dichas células por kilogramo de la masa del individuo con inclusión de una o más dosis que comprenden 106 a 5 x 107 de dichas células por kilogramo de la masa del individuo.
6. 7. Células para uso o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde se

   35 administra adicionalmente a dicho individuo cualquier combinación de uno o más de los siguientes: un agente antibiótico, un agente antifúngico, y/o un agente antiviral.
7. 8. Células para uso o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dichas

   células se administran en una formulación que comprende uno o más agentes farmacéuticamente activos 40 adicionales.
8. 9. Células para uso o el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha formulación comprende adicionalmente cualquier combinación de uno o más de: un agente antibiótico, un agente antifúngico, y/o un agente antiviral.
9. 10. Células para uso o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dichas células se administran al individuo por una ruta parenteral, por infusión intravenosa y/o por inyección estereotáxica.