ES2423182T3 - Variantes de unión CD44 en las enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar o controlar en un paciente una enfermedad neurodegenerativa, comprendiendo ladetección del nivel de expresión de un ácido nucleico en una muestra biológica del paciente, donde dicho ácidonucleico se compone de una secuencia homóloga de una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, almenos, un 90% de homóloga y al menos 20 nucleótidos en las coordenadas 639-822 de la SEC ID NÚM 1; en lascoordenadas 639-825 de la SEC ID NÚM 3, en las coordenadas 639- 828 de la SEC ID NÚM 5 o en lascoordenadas 639-900 de la SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas, donde un elevado nivel deexpresión de dicho ácido nucleico es indicativo de enfermedad neurodegenerativa y donde dicha muestrabiológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

Description

Variantes de unión CD44 en las enfermedades neurodegenerativas.

DISEÑO ANTERIOR

[0001] CD44 es una glicoproteína transmembrana de Tipo I expresada por casi todas las células del cuerpo humano. CD44 es una molécula de adhesión de la superficie celular que se ha demostrado que está presente en diversos procesos, como la circulación, la migración o el homing celular, las interacciones célula-célula y las interacciones célula-matriz. El extremo N-terminal de CD44 incluye el dominio de unión al ligando extracelular de la molécula. Se sabe que varios ligandos interactúan con CD44. El ácido hialurónico (AH) es el ligando principal de CD44 (Miyake et. al., J Exp Med 1990, 172:69-75, Aruffo et. Al., Cell 1990, 61: 1303-13, Peach et. al., J Cell Biol 1993, 122:257-64), sin embargo, otros componentes adicionales de la matriz extracelular (MEC), como la laminina, el colágeno, la fibronectina y el condroitín sulfato (Jalkanen et. al., J Cell Biol 1992, 116:817-25, Faassen et. al., J Cell Biol 1992, 116:521-31), así como los componentes que no forman parte de la MEC (adresina vascular de la mucosa, serglicina, osteopontina y cadena invariante clase II), E-selectina y L-selectina (Dimitroff et. al., PNAS 2000, 97:13841-6 and Dimitroff et. al., J Cell Biol 2001, 153:1277-86) y agrecano (Fujimoto et. al., Int Immunol 2001, 13:359-66) también pueden interactuar con el receptor de CD44. Se detecta una importante acumulación de CD44 y, a veces, de ácido hialurónico, en áreas con una intensa migración y proliferación celular, como en la cicatrización de heridas, la remodelación tisular, la inflamación (incluyendo la autoinflamación), la morfogénesis y la carciogénesis. El dominio yuxtamembrana de la cola citoplasmática de CD44 se une a los miembros de la familia de ERM (Ezrin, Radixin, Moesin), familia de las moléculas de enlace de actina, proporcionando de este modo una conexión entre la superficie celular de CD44 y el citoesqueleto de actina (Tsukita et. al., J Cell Biol 1994, 126: 391-401), estableciéndose así la base para la motilidad celular dependiente de CD44.

[0002] Dependiendo de la especie, el locus de CD44 contiene aproximadamente 20 exones codificantes. Por ejemplo, el gen humano CD44 incluye un total de 19 exones, mientras que el gen de ratón CD44 incluye 20 exones. Los exones de CD44 se pueden clasificar en exones constantes y exones variables. Los exones constantes, tanto de humano como de ratón, incluyen exones C1-C5 en el extremo 5' terminal y C6-C9 en el extremo 3' terminal y codifican para las llamadas regiones constantes de CD44 (Screaton et. al., PNAS 1992, 89: 12160-4; Tölg et. al., Neucleic Acids Res, 1993 21:1225-9; Screaton et al., J Biol Chem 1993, 268: 12235-8). Los exones variables se encuentran dentro de la molécula e incluyen 9 exones en humanos (exones V2-V10) y 10 exones en ratones (exones V1-V10). Los exones variables codifican para las regiones variables de CD44. La principal especie molecular expresada en células es la forma estándar, hematopoyética, de CD44 (también llamada CD44S o CD44H), que es la forma más corta de CD44 y está codificada por un ARNm (ácido ribonucleico mensajero) compuesto exclusivamente de exones constantes. La retención de diferentes combinaciones de exones variables en el ARNm da como resultado un sinnúmero de variantes de corte y empalme de CD44 (CD44V, analizado en Gunthert, Curr. Top Microbiol Immunol 1993, 184:47-63). Sin embargo, aunque, en teoría, se pueden producir más de 1000 variantes de corte y empalme individuales de esta manera, e incluso en casos en los que se expresan de manera conjunta múltiples variantes de corte y empalme en un tejido o célula, el CD44S es la principal isoforma (por ejemplo, Ni et. al., J. Lab. Clin. Med 2002, 139:59-65; Bell et al., MCB 1998, 18:5930-41). En determinadas circunstancias y condiciones, los patrones de splicing de CD44 son, a menudo, alterados (como por ejemplo en Gunthert et. al., Cell 1991, 65:13-24; Heider et. al., J. Cell Biol 1993, 120:227-33; Wielenga et. al., Cancer Res 1993, 53:4754-6). Se pueden producir transcritos de CD44 con exones adicionales, por ejemplo, se sabe que los exones sin saltar V3, V5, V6 y V7 son expresados por linfocitos activados y variantes metastáticas de las células tumorales (Naor et. al., Crit Rev Clin Lab Sci, 2002, 39:527-79). La variedad de las células de las variantes de corte y empalme de CD44 es el determinante principal para la afinidad de ligamiento (Lesley et. al., J Exp Med 1995 182:431-7, Stamenkovic et. al., Embo J 1991 10:348-8, Van der Voort et. al., Biochem Biophys Res Commun 1995 214: 135-144).

[0003] Se ha estudiado la expresión de algunas variantes de corte y empalme de CD44 en diversas afecciones, como las enfermedades autoinmunes, y se ha propuesto como una diana para el diagnóstico y el tratamiento de tales enfermedades. Los anticuerpos monoclonales (AcM) dirigidos contra diversas regiones variantes de CD44 fueron sugeridas como agentes potenciales para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Reber et. al., describieron los AcM dirigidos contra las variantes específicas de metástasis de la proteína superficial CD44 de un adenocarcinoma pancreático en una rata (Reber et. al., Int J Cancer, 1990, 46:919-27). Los anticuerpos monoclonales anti-CD44, que inhiben la proliferación de células T, también se han presentado para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes (Rothman et. al., J Immonul. 1991 147:2493-9). Los anticuerpos monoclonales específicos para las variantes de CD44 con exón v6, también se descubrieron útiles en el diagnóstico de linfomas (Ristamaki et. al., Blood, 1994, 84:238-43). Además, se ha demostrado que la administración de una proteína, péptido o derivado de CD44 puede ser utilizada para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes (Haynes et. al., Arthritis Rheum, 1991, 34:1434-43). La expresión de CD44 es también una conocida diana para terapias antitumorales y antiinflamatorias. Los experimentos en animales han mostrado que el targeting de CD44 mediante anticuerpos, oligonucleótidos antisentido y otras terapias basadas en estos, reducen notablemente las actividades malignas de varios neoplasmas. Se han desarrollado estrategias de oligonucleótidos antisentido y algunas terapias basadas en estos dirigidos contra la expresión de CD44 como se describe, por ejemplo, en las patentes US 6,150,162 y US 5,990,299.

[0004] Hay diversas pruebas de que CD44 y algunas de sus variantes de corte y empalme están implicadas en trastornos neurológicos producidos de manera autoinmune o por algún agente patógeno como, por ejemplo, la esclerosis múltiple (EM) y la mielopatía crónica, también llamada paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) asociada al virus linfotrópico de células T humanas Tipo I (HTLV-I). Estudios de esfuerzo en ratones con encefalomielitis alérgica experimental (EAE), frecuentemente utilizados como animal modelo de esclerosis múltiple, muestran que el CD44 es inducido in vivo en las células gliales que rodean las lesiones inflamatorias (Haegel et. al., J Cell Biol. 1993, 122:1067-77). Las células mononucleares que expresan la variante de corte y empalme de CD44V10 fueron detectadas en la médula espinal de ratones con EAE (Laman et. al., Mult Scler. 1998, 4:147-53). Los animales vacunados con ADNc de CD44V3-V10 desarrollaron una EAE significativamente menos severa que los animales vacunados con placebo o los vacunados con ADNc de CD44S (Garin et. al., J Neurol Sci. 2007, 258:17-26). Los tratamientos con un anticuerpo contra CD44S in vivo no afectaron a la carga de la enfermedad, mientras que el tratamiento combinado con anticuerpos contra las isoformas que contienen CD44V6, V7 y V10, redujeron considerablemente la carga de la enfermedad (Laman et. al., Mult. Scler. 1998, 4:147-53).

[0005] La mielopatía crónica/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) asociada al virus linfotrópico de células T humanas Tipo I (HTLV-I) está causada por la infección por HTLV-I y se caracteriza por la paraparesia espástica y la alteración urinaria con infiltración perivascular de HTLV-I infectado y CD44+células T activados. Se descubrió que una variante de corte y empalme de CD44 que contiene una conexión directa entre los exones V6 y V10 (CDDV6/V10) se expresaba frecuentemente en las células mononucleares de la sangre periférica en pacientes de HAM/TSP, (Matsouka et. al., J Neuroimmunol. 200, 102:1-7). Estos hallazgos permitieron especular que los linfocitos que contienen V6 y V10 eran capaces de migrar al SNC con facilidad incluso en los estadios iniciales de la enfermedad (Matsouka et al., J Neuroimmunol. 2000, 102:1-7).

[0006] Los trastornos neurodegenerativos “clásicos” [como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)] son enfermedades del adulto gravemente incapacitantes crónicas, progresivas e irreversibles. Además, los trastornos neurodegenerativos no autoinmunes pueden incluir, por ejemplo, enfermedades de neurona motora (ENM), incluyendo sin carácter restrictivo la esclerosis primaria lateral (ELP) y la atrofia muscular espinal (AME). La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por el deterioro mental y cognitivo progresivos, con la consecuente formación de placas amiloides, ovillos neurofibrilares, gliosis y pérdida neuronal. La enfermedad se da tanto en forma genética como esporádica y su curso clínico y sus características patológicas son bastante similares. Se han identificado hasta la fecha tres genes que, cuando mutan, presentan una forma autosómica dominante de la enfermedad de Alzheimer. Estos genes codifican la Proteína Precursora Amiloidea (APP) y dos proteínas estructural y funcionalmente relacionadas con esta, la presenilina-1 (PSES-1) y la presenilina-2 (PSEN-2). Las mutaciones de cualquiera de estas tres proteínas mejoran el procesamiento proteolítico de APP a través de una vía intracelular que genera péptido � amiloide (A�), un péptido de aminoácidos largos 40-42, componente principal de las placas amiloides en la enfermedad de Alzheimer.

[0007] La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad progresiva y letal cuya tasa anual de incidencia es de 1 a 2 casos cada 100000 personas. La ELA se produce cuando las células nerviosas motoras que controlan los movimientos voluntarios se degeneran gradualmente. La pérdida de estas neuronas motoras causa debilitamiento y atrofia muscular, lo que lleva a la parálisis y, finalmente, a la muerte. La etiología de la mayoría de casos de ELA es desconocida, pero el 2% de los casos se debe a mutaciones en el gen que codifica la Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD1). En este último, la SOD1 mutante induce a las neuronas motoras de células no autónomas a matar debido a un incremento desconocido de la toxicidad. La vulnerabilidad selectiva de las neuronas motoras surge, probablemente, de la combinación de varios mecanismos, incluyendo desplegamiento de proteínas, disfunción mitocondrial, estrés oxidativo, defectos del transporte axonal, excitotoxicidad, una señalización insuficiente del factor de crecimiento y la inflamación. El daño en el interior de las neuronas motoras se ve reforzado por el daño provocado por las células no neuronales vecinas a través de una respuesta inflamatoria que acelera la progresión de la enfermedad (Boillee et. al., Neuron. 2006, 52:39-59, Pehar et. al., Neurodegener. Dis. 2005, 2:13946).

[0008] La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa crónica y progresiva causada por la degeneración selectiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta del cerebro. El 80% de las neuronas mueren por causas desconocidas antes de la aparición de síntomas. Estos síntomas incluyen temblor intermitente en las extremidades, falta de equilibrio y dificultad para iniciar el movimiento.

[0009] La esclerosis lateral primaria (ELP) es una enfermedad neuromuscular rara caracterizada por el debilitamiento progresivo de los músculos voluntarios. Como enfermedad neuromotora, la ELP se desarrolla normalmente cuando las células nerviosas, que controlan el movimiento muscular voluntario, se degeneran y mueren, causando debilitamiento en los músculos que controlan. La atrofia muscular espinal (AME) es un término aplicado a varios trastornos que tienen en común el origen genético y el debilitamiento debido a la pérdida de neuronas motoras de la médula espinal y el tronco cerebral.

[0010] A diferencia de las enfermedades neurológicas autoinmunes (tales como la esclerosis múltiple), en las que el sistema inmunitario innato tiene como diana única los constituyentes de las células neuronales normales mediante la infiltración de células-T y linfocitos a través de la barrera sangre-cerebro, en los trastornos neurodegenerativos clásicos las neuronas mueren por una razón desconocida. Se ha sugerido el papel de la interacción neurona-glía y el proceso inflamatorio en las enfermedades neurodegenerativas clásicas. También se ha sugerido que las células macro y microgliales tengan un papel en los procesos degenerativos por fases en la ELA y los respectivos modelos de enfermedades. La activación de células astrogliales y microgliales se produce de manera temprana en la patogénesis de la enfermedad y parece influir en gran medida en la aparición y el progreso de la enfermedad (Di Giorgio et. al., Nat Neurosci- 2007; 10:608-614; Esposito et. al., Exp Neurol. 2007; Kim et al., Exp Mol De. 2006;38:333-47).

[0011] No se ha presentado ninguna prueba clara del papel de las variantes específicas de CD44 en la enfermedad de Alzheimer, en la esclerosis lateral amiotrófica o en la enfermedad de Parkinson. En cultivos primarios de astrocitos de ratón, la expresión superficial y los niveles de ARNm de CD44 podrían ser inducidos mediante la estimulación con cualquier éster de forbol (PMA) o factor de necrosis tumoral alfa más interferón gamma. Los transcritos de C44 producidos contienen exones adicionales, incluyendo el exón v6, así como variantes de mayor tamaño. Sin embargo, se desconoce si la activación se produce in vivo o en los humanos durante el curso de la enfermedad neurodegenerativa (Haegel et. al., J Cell Biol, 1993 122:1067-77). Se investigó la localización de CD44 mediante la inmunohistoquímica en tejido cerebral humano post mórtem de los sujetos y pacientes de control con la enfermedad de Alzheimer. Se descubrió que la materia gris se asocia a algunos astrocitos de morfología protoplásmica y fibrosa. En un cerebro con la enfermedad de Alzheimer, el número de astrocitos positivos de CD44 aumentó radicalmente. CD44 puede ser una molécula de adhesión importante en estos procesos astrocíticos (Akiyama et. al., Brain Res. 1993,632:249-59). Sin embargo, se desconoce si las células que expresan CD44 participan en el progreso de la enfermedad o ayudan a prevenir la neurodegeneración. Ninguna variante de corte y empalme de CD44 fue descrita en estas enfermedades.

RESUMEN

[0012] Las siguientes realizaciones y los aspectos de las mismas se describen e ilustran junto a los sistemas, herramientas y métodos que pretenden ser ejemplarizantes e ilustrativos. En varias realizaciones, uno o más de los problemas anteriormente descritos han sido reducidos o eliminados, mientras otras realizaciones están dirigidas a otras ventajas y mejoras.

[0013] Según una realización de la presente invención, se presenta un método para diagnosticar y controlar una enfermedad neurodegenerativa en un paciente, incluyendo la detección del nivel de expresión de un ácido nucleico en una muestra biológica del paciente en el que dicho ácido nucleico se compone de una secuencia de nucleótidos contiguos a la secuencia homóloga que tiene, al menos, un 90% de homología y, al menos, 20 nucleótidos en lascoordenadas 639-822 de la SEC ID NÚM 1, en las coordenadas 639-825 de la SEC ID NÚM 3, en las coordenadas639-828 de la SEC ID NÚM 5, en las coordenadas 639-900 de la SEC ID NÚM 7 o en cualquier combinación de estas, donde un elevado nivel de expresión de dicho ácido nucleico es indicativo de enfermedad neurodegenerativa y donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

[0014] Según otra realización, dicha enfermedad neurodegenerativa comprende: la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral primaria (ELP) y la atrofia muscular espinal (AME).

[0015] Según otra realización, dicho nivel de expresión es detectado determinando el nivel de expresión de un ácido ribonucleico (ARN) codificado por dicho ácido nucleico y que, preferiblemente, comprende además el aislamiento del ARN de la muestra biológica antes de la detección de dicho nivel de ARN expresado por dicho ácido nucleico; o, preferiblemente, en el que dicho nivel de expresión de ARN sea detectado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR), Northern Blot, PCR en tiempo real o cualquier combinación de estos; o, preferiblemente, en el que dicho nivel de expresión de ARN sea detectado mediante la hibridación de un oligonucleótido, incluso más preferiblemente en el que dicho oligonucleótido esté compuesto de ácido desoxirribonucleico (ADN), ARN, ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc), ADN genómico, oligonucleótidos sintéticos o cualquier combinación de estos.

[0016] Según otra realización llevada a cabo durante la presente invención, se presenta un método para diagnosticar y controlar enfermedades neurodegenerativas en un paciente, incluyendo la detección de la expresión de un polipéptido en una muestra biológica de un paciente, en el que dicho polipéptido es seleccionado del grupo formado por una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y, al menos, 10aminoácidos en las coordenadas 214 a 274 de la SEC ID NÚM 2, en las coordenadas 214-275 de la SEC IN NÚM 4,en las coordenadas 214-276 de la SEC ID NÚM 6, en las coordenadas 214-300 de la SEC ID NÚM 8 o cualquier combinación de estas; en la que un nivel de expresión elevado de dicho polipéptido es indicativo en enfermedades neurodegenerativas, en el que dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

[0017] Según otra realización, dicha enfermedad neurodegenerativa comprende: la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral primaria (ELP) y la atrofia muscular espinal (AME) o cualquier combinación de estas.

[0018] Según otra realización, dicha detección comprende la detección de inmunocomplejos de dicho polipéptido y un anticuerpo adaptado para unirse específicamente a dicho polipéptido, en el que, preferiblemente, dicha detección de inmunocomplejos comprende: Western Blot, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o cualquier combinación de estos; o, preferiblemente, en el que dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o cualquier combinación de estos.

[0019] Según otra realización llevada a cabo durante la presente invención, se ha presentado el uso de un reactivo capaz de modular la expresión del ácido ribonucleico (ARN), codificado por un ácido nucleico, mediante uno o más ARNs pequeños de interferencia (siRNA) para la preparación de una composición para el tratamiento o la prevención de enfermedades neurodegenerativas. Dicho siRNA comprende una primera secuencia polinucleótida hibridizada a una segunda secuencia polinucleótida complementaria a la primera, que es un tramo contiguo de, al menos, 15 nucleótidos de una secuencia nucleótida contigua que tiene, al menos, un 90% de homología y, almenos, 20 nucleótidos en las coordenadas 639-822 de la SEC ID NÚM 1, en las coordenadas 639-825 de la SEC INNÚM 3, en las coordenadas 639-828 de la SEC ID NÚM 5, en las coordenadas 639-900 de la SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas. Este ácido nucleico se selecciona del grupo formado por una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y, al menos, 20 nucleótidos de las secuencias:SEC ID NÚM 1, SEC ID NÚM 3, SEC ID NÚM 5, SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas.

[0020] Según otra realización llevada a cabo durante la presente invención, se ha presentado el uso de un reactivo capaz de modular la expresión y/o la actividad de un polipéptido para la preparación de un compuesto para el tratamiento o la prevención de enfermedades neurodegenerativas. Esta secuencia polipeptídica es seleccionada del grupo formado por una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y, al menos,10 aminoácidos en las coordenadas 214 a 274 de la SEC ID NÚM 2, en las coordenadas 214-275 de la SEC INNÚM 4, en las coordenadas 214-276 de la SEC ID NÚM 6, en las coordenadas 214-300 de la SEC ID NÚM 8 o cualquier combinación de estas. Dicho reactivo incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o cualquier combinación de estos adaptada para unirse específicamente a dicho polipéptido.

[0021] Según otra realización, se ha presentado el uso de un polinucleótido compuesto de una secuencia denucleótidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología en las coordenadas 639-825 de la SEC ID NÚM 3, en las coordenadas 639-696 de la SEC IN NÚM 3 o en las coordenadas 769-825 de la SEC ID NÚM 3 para el diagnóstico o el control de enfermedades neurodegenerativas.

[0022] Según otra realización se ha presentado el uso de un péptido compuesto de una secuencia de aminoácidoscontiguos que tiene, al menos, un 90% de homología en las coordenadas aminoácidas 214-275 de la SEC ID NÚM4, en las coordenadas 214-232 de la SEC ID NÚM 4 o en las coordenadas 257-275 de la SEC ID NÚM 4 para el diagnóstico y el control de enfermedades neurodegenerativas.

[0023] Según otra realización, se ha presentado el uso de un polinucleótido compuesto de una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología en las coordenadas nucleótidas 639-828 de laSEC ID NÚM 5, en las coordenadas 639-696 de la SEC ID NÚM 5 o en las coordenadas 772-828 de la SEC ID NÚM 5 para el diagnóstico y el control de enfermedades neurodegenerativas.

[0024] Según otra realización se ha presentado el uso de un péptido compuesto de una secuencia aminoácida contigua que tiene, al menos, un 90% de homología en las coordenadas aminoácidas 214-276 de la SEC ID Nº:6, en las coordenadas 214-232 de la SEC ID Nº:6 o en las coordenadas 258-276 de la SEC ID Nº6 para el diagnóstico y el control de enfermedades neurodegenerativas.

[0025] Según una realización llevada a cabo durante la presente invención, se presenta un kit para su utilización en un método de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas in vivo. Dicho kit contiene al menos un reactivo capaz de detectar la expresión de un ácido nucleico en una muestra biológica, en la que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y, al menos, 20nucleótidos en las coordenadas 639-822 de la SEC ID NÚM 1, en las coordenadas 639-828 de la SEC ID NÚM 5, enlas coordenadas 639-900 de la SEC ID NÚM 7 o en cualquier combinación de estas. Dicho reactivo comprende un oligonucleótido capaz de hibridizarse con dicho ácido nucleico o con una molécula de ácido ribonucleico (ARN) codificada por dicho ácido nucleico. Preferiblemente, dicho oligonucleótido se compone de ADN, ARN, ADNc, ADN genómico, oligonucleótidos sintéticos o cualquier combinación de estas. Dicha muestra biológica se compone de una célula, un tejido, un fluido corporal o cualquier combinación de estos.

[0026] Según otra realización, dicha enfermedad neurodegenerativa comprende: la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral primaria (ELP) y la atrofia muscular espinal (AME) o cualquier combinación de estas.

[0027] Según una realización llevada a cabo durante la presente invención, se presenta un kit para su utilización en un método de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas in vivo. Dicho kit contiene al menos un reactivo capaz de detectar la expresión de un polipéptido en una muestra biológica, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y, al menos, 10 aminoácidos enlas coordenadas 214-274 de la SEC ID NÚM 2, en las coordenadas 214-275 de la SEC ID NÚM 4, en lascoordenadas 214-276 de la SEC ID NÚM 6, en las coordenadas 214-300 de la SEC ID NÚM 8 o en cualquier combinación de estas. Dicho reactivo comprende un anticuerpo adaptado para interactuar específicamente con dicho polipéptido y para formar inmunocomplejos detectables. Preferiblemente, dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o una combinación de estos. Dicha muestra biológica se compone de una célula, un tejido, un fluido corporal o cualquier combinación de estos.

[0028] Según otra realización, dicha enfermedad neurodegenerativa comprende: la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral primaria (ELP) y la atrofia muscular espinal (AME) o cualquier combinación de estas en la que dicha muestra biológica se compone de una célula, un tejido, un fluido corporal o cualquier combinación de estos. [0029] Además de las realizaciones y los aspectos ejemplarizantes descritos anteriormente, serán evidentes otros aspectos y realizaciones por referencia a las figuras y por el estudio de las siguientes descripciones detalladas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0030] Se describen a continuación ejemplos ilustrativos de realizaciones referentes a las figuras adjuntas. En las figuras, las estructuras idénticas y los elementos o partes que aparecen en más de una figura tienen, generalmente, el mismo número en todas las figuras en que aparecen. Las dimensiones de los componentes y las funciones que se muestran en las figuras son, generalmente, elegidos por su conveniencia y claridad de presentación y no se muestran necesariamente a escala. Las figuras son enumeradas a continuación:

La Fig. 1 ilustra de manera esquemática la estructura genómica de CD44;

La Fig. 2 ilustra de manera esquemática las secuencias nucleótidas y proteicas del exón variante 3' y las uniones de splicing de exones variantes 3' con los exones constantes 5' y 6';

La Fig. 3 ilustra de manera esquemática las secuencias nucleótidas y proteicas del exón variante 6' y las uniones de splicing de exones variantes 6' con los exones constantes 5' y 6';

La Fig. 4 ilustra de manera esquemática las secuencias nucleótidas y proteicas del exón variante 7' y las uniones de splicing de exones variantes 7' con los exones constantes 5' y 6';

La Fig. 5 ilustra de manera esquemática las secuencias nucleótidas y proteicas del exón variante 10' y las uniones de splicing de exones variantes 10' con los exones constantes 5' y 6'M

La Fig. 6 muestra la tinción inmunohistoquímica de una sección del hipocampo de un paciente con la enfermedad de Alzheimer con anticuerpos CD44V6;

La Fig. 7 muestra el efecto del siRNA en la expresión del ARNm en diversas variantes de CD44, y

La Fig. 8 muestra el efecto de SME en la expresión del ARNm en diversas variantes de CD44.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0031] En la siguiente descripción se detallan varios aspectos de la invención. Se explicarán más adelante las configuraciones específicas y los detalles para proporcionar la comprensión minuciosa de la invención. Sin embargo, también se puede observar que, para alguien experto en la disciplina, la invención puede llevarse a cabo sin los detalles específicos aquí presentados. Además, las ya conocidas características pueden omitirse o simplificarse para no complicar la invención.

[0032] Se pueden presentar variantes de corte y empalme de CD44 cuya expresión se incrementa en muestras biológicas obtenidas de pacientes que han sido diagnosticados con las enfermedades neurodegenerativas clásicas, tales como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Alzheimer (EA). Se pueden, además, presentar polipéptidos de CD44, polinucleótidos que codifican al mismo y anticuerpos y oligonucleótidos dirigidos contra estos, que puede ser utilizados para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

[0033] Los siguientes términos se han utilizado de manera minuciosa en la descripción y deberían entenderse según varias realizaciones como sigue:

[0034] El término “gen CD44” aquí utilizado se refiere a la secuencia genética y/o a la esctructura genética del CD44, que se ilustra esquemáticamente en la Fig. 1A.

[0035] La expresión “secuencias de ácido nucleico de las variantes de corte y empalme de CD44” aquí utilizada se refiere indistintamente a las “secuencias codificantes de las variantes de CD44”, “variantes de CD44” o “transcrito de variantes de corte y empalme de CD44” pueden referirse a una o más de las variantes de corte y empalme de CD44, que se describen a continuación.

[0036] La expresión “secuencia codificante de ácido nucleico de la variante de corte y empalme 3' de CD44” aquí utilizada se refiere indistintamente a la “secuencia codificante de la variante de corte y empalme 3' de CD44”, “CD44V3”, “transcrito de CD44V3”, “secuencia codificante de CD44V3” o “variante de corte y empalme 3' de CD44” y pueden referirse a las moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia mostrada en la SEC ID NÚM 1, moléculas de ácido nucleico que tienen, al menos un 90% de identidad (véase a continuación) para dicha secuencia y fragmentos (véase a continuación) de las moléculas anteriores de al menos 20 nucleótidos largos. Esta molécula comprende secuencias codificantes para una variante de corte y empalme alternativa y natural del transcrito de CD44 conocido y originario. El CD44V3, representado esquemáticamente en la Fig. 1B, incluye al menos el exón constante 5', el exón variante 3' y el exón constante 6' y, más preferiblemente, incluye los exones constantes 1'-5', 6'9' así como los exones variables 3' del gen CD44. La Fig. 2A enumera la secuencia nucleótida del exón variante 3'. La Fig. 2B enumera la secuencia nucleótida de los enlaces de unión entre el exón variante 3' y el exón constante 6'.

[0037] La expresión “secuencia codificante de ácido nucleico de la variante de corte y empalme 6' de CD44” aquí utilizada se refiere indistintamente a la “secuencia codificante de la variante de corte y empalme 6' de CD44”, “CD44V6”, “transcrito de CD44V6”, “secuencia codificante de CD44V6” o “variante de corte y empalme 6' de CD44” y pueden referirse a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia mostrada en la SEC ID NÚM 3, moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 90% de identidad (véase a continuación) para dicha secuencia y fragmentos (véase a continuación) de las moléculas anteriores de al menos 20 nucleótidos largos. Esta molécula comprende secuencias codificantes para una variante de corte y empalme alternativa y diferente del transcrito de CD44 conocido y originario. El CD44V6, representado esquemáticamente en la Fig. 1C, incluye al menos el exón constante 5', el exón variable 6' y el exón constante 6' y, más preferiblemente, incluye los exones constantes 1'-5', 6'9' así como los exones variables 6' del gen CD44. La Fig. 3A enumera la secuencia nucleótida del exón variable 6'. La Fig. 3B enumera la secuencia nucleótida de los enlaces de unión entre el exón constante 5' y el exón constante 6'. La Fig. 3C enumera la secuencia nucleótida de los enlaces de unión entre el exón variable 6' y el exón constante 6'.

[0038] La expresión “secuencia codificante de ácido nucleico de la variante de corte y empalme 7' de CD44” aquí utilizada se refiere indistintamente a la “secuencia codificante de la variante de corte y empalme 7' de CD44”, “CD44V7”, “transcrito CD44V7”, “secuencia codificante de CD44V7” o “variante de corte y empalme 7' de CD44” pueden referirse a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia mostrada en la SEC ID NÚM 5, moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 90% de identidad (véase a continuación) para dicha secuencia y fragmentos (véase a continuación) de las moléculas anteriores de al menos 20 nucleótidos largos. Esta molécula comprende secuencias codificantes para una variante de corte y empalme alternativa, diferente y natural del transcrito de CD44 conocido y originario. El CD44V7, representado esquemáticamente en la Fig. 1D, incluye al menos el exón constante 5', el exón variable 7' y el exón constante 6' y, más preferiblemente, incluye los exones constantes 1'-5', 6'-9' así como los exones variables 7' del gen CD44. La Fig. 4A enumera la secuencia nucleótida del exón variable 7'. La Fig. 4B enumera la secuencia nucleótida de los enlaces de unión entre el exón constante 5' y el exón constante 7'. La Fig. 4C enumera la secuencia nucleótida de los enlaces de unión entre el exón variable 7' y el exón constante 6'.

[0039] La expresión “secuencia codificante de ácido nucleico de la variante de corte y empalme 10' de CD44” aquí utilizada se refiere indistintamente a la “secuencia codificante de la variante de corte y empalme 10' de CD44”, “CD44V10”, “transcrito CD44V10”, “secuencia codificante de CD44V10” o “variante de corte y empalme 10' de CD44” pueden referirse a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia mostrada en la SEC ID NÚM 7, moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 90% de identidad (véase a continuación) para dicha secuencia y fragmentos (véase a continuación) de las moléculas anteriores de al menos 20 nucleótidos largos. Esta molécula comprende secuencias codificantes para una variante de corte y empalme alternativa y natural del transcrito de CD44 conocido y originario. El CD44V10, representado esquemáticamente en la Fig. 1E, incluye al menos el exón constante 5', el exón variable 10' y el exón constante 6' y, más preferiblemente, incluye los exones constantes 1'-5', 6'-9' así como los exones variables 10' del gen CD44. La Fig. 5A enumera la secuencia nucleótida del exón variable 10'. La Fig. 5B enumera la secuencia nucleótida de los enlaces de unión entre el exón constante 5' y el exón constante 10'. La Fig. 5C enumera la secuencia nucleótida de los enlaces de unión entre el exón variable 10' y el exón constante 6'.

[0040] La expresión “producto de variantes de corte y empalme de CD44” aquí utilizada se refiere indistintamente a los “productos variantes de CD44”, “proteínas variantes de CD44” o “péptidos variantes de CD44” y puede relacionarse a uno o más de los productos de las variantes de corte y empalme que se describen a continuación.

[0041] El término “producto de CD44V3” aquí utilizado se refiere indistintamente a la “proteína de CD44V3” o “péptido de CD44V3” y es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificados por la secuencia codificante de CD44V3. Se entiende por “polipéptido” un péptido o proteína, así como los péptidos o proteínas que han modificado químicamente aminoácidos (véase a continuación) como los glicopéptidos o glicoproteínas. Lasecuencia aminoácida del producto CD44V3 se muestra en la SEC ID NÚM 2. La secuencia aminoácida de la regiónC5-V3-C6 de CD44V3 corresponde a las coordenadas 214-274 en la SEC ID NÚM 2. La Fig.2A enumera la secuencia aminoácida de la secuencia del exón variable 3'. La Fig. 2B muestra la secuencia de los enlaces de unión entre el exón variable 3' y el exón constante 6'. “Producto CD44V3” también incluye homólogos (véase a continuación) de dicha secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos han sido añadidos, eliminados, sustituidos (véase a continuación) o modificados químicamente (véase a continuacuón), así como los fragmentos (véase a continuación) de esta secuencia con al menos 6 aminoácidos.

[0042] El término “producto de CD44V6” aquí utilizado se refiere indistintamente a la “proteína de CD44V6” o “péptido de CD44V6” y es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificados por la secuencia codificante de CD44V6. Se entiende por “polipéptido” un péptido o proteína, así como los péptidos o proteínas que han modificado químicamente aminoácidos (véase a continuación) como los glicopéptidos o glicoproteínas. Lasecuencia aminoácida del producto CD44V6 se muestra en la SEC ID NÚM 4. La secuencia aminoácida de la regiónC5-V6-C6 de CD44V6 corresponde a las coordenadas 214-275 en la SEC ID NÚM 4. La Fig.3A enumera la secuencia aminoácida de la secuencia del exón variable 6'. La Fig. 3B muestra la secuencia de los enlaces de unión entre el exón variable 6' y el exón constante 5'. La Fig. 3C muestra la secuencia aminoácida de los enlaces de unión entre el exón variable 6' y el exón constante 6'. “Producto CD44V6” también incluye homólogos (véase a continuación) de dicha secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos han sido añadidos, eliminados, sustituidos (véase a continuación) o modificados químicamente (véase a continuación), así como los fragmentos (véase a continuación) de esta secuencia con al menos 6 aminoácidos.

[0043] El término “producto de CD44V7” aquí utilizado se refiere indistintamente a la “proteína de CD44V7” o “péptido de CD44V7” y es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificados por la secuencia codificante de CD44V7. Se entiende por “polipéptido” un péptido o proteína, así como los péptidos o proteínas que han modificado químicamente aminoácidos (véase a continuación) como los glicopéptidos o glicoproteínas. Lasecuencia aminoácida del producto CD44V7 se muestra en la SEC ID NÚM 6. La secuencia aminoácida de la región C5-V7-C6 de CD44V7 corresponde a las coordenadas 214-276 en la SEC ID NÚM 6. La Fig.4A muestra la secuencia aminoácida de la secuencia del exón variable 7'. La Fig. 4B muestra la secuencia de los enlaces de unión entre el exón variable 7' y el exón constante 5'. La Fig. 4C muestra la secuencia aminoácida de los enlaces de unión entre el exón variable 7' y el exón constante 6'. “Producto CD44V7” también incluye homólogos (véase a continuación) de dicha secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos han sido añadidos, eliminados, sustituidos (véase a continuación) o modificados químicamente (véase a continuación), así como los fragmentos (véase a continuación) de esta secuencia con al menos 6 aminoácidos.

[0044] El término “producto de CD44V10” aquí utilizado se refiere indistintamente a la “proteína de CD44V10” o “péptido de CD44V10” y es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificados por la secuencia codificante de CD44V10. Se entiende por “polipéptido” un péptido o proteína, así como los péptidos o proteínas que han modificado químicamente aminoácidos (véase a continuación) como los glicopéptidos o glicoproteínas. Lasecuencia aminoácida del producto CD44V10 se muestra en la SEC ID NÚM 8. La secuencia aminoácida de laregión C5-V10-C6 de CD44V10 corresponde a las coordenadas 214-300 en la SEC ID NÚM 8. La Fig.5A enumera la secuencia aminoácida de la secuencia del exón variable 10'. La Fig. 5B muestra la secuencia de los enlaces de unión entre el exón variable 10' y el exón constante 5'. La Fig. 3C muestra la secuencia aminoácida de los enlaces de unión entre el exón variable 10' y el exón constante 6'. “Producto CD44V10” también incluye homólogos (véase a continuación) de dicha secuencia aminoácida en la que uno o más aminoácidos han sido añadidos, eliminados, sustituidos (véase a continuación) o modificados químicamente (véase a continuación), así como los fragmentos (véase a continuación) de esta secuencia con al menos 6 aminoácidos.

[0045] El homólogo está relacionado con los polipéptidos que tienen una secuencia aminoácida que es, al menos, idéntica al 90% a la secuencia de una de las SEC ID NÚM 2, SEC ID NÚM 4, SEC ID NÚM 6, SEC ID NÚM 8 o, al menos, idéntica al 90% a un fragmento de, al menos, 6 aminoácidos de cualquiera de las secuencias de SEC ID NÚM 2, SEC ID NÚM 4, SEC ID NÚM 6, SEC ID NÚM 8. La variación en la secuencia aminoácida entre el homólogo y la secuencia de una de las SEC ID NÚM 2, SEC ID NÚM 4, SEC ID NÚM 6, SEC ID NÚM 8 o un fragmento de estas, resultante de la adición, eliminación, sustitución o modificación química de uno o más aminoácidos de algunade estas secuencias: SEC ID NÚM 2, SEC ID NÚM 4, SEC ID NÚM 6, SEC ID NÚM 8, en las que el homólogo contiene una sustitución, preferiblemente una conservativa.

[0046] “Molécula de ácido nucleico”, “ácido nucleico” o “polinucleótido” se refiere a un polímero de doble capa o simple compuesto de nucleótidos de ADN (ácido desoxirribonucleico), nucleótidos de ARN (ácido ribonucleico) o una combinación de ambos tipos, y puede incluir nucleótidos naturales, químicamente modificados y sintéticos.

[0047] “Secuencia de aminoácidos” se refiere a una secuencia compuesta de uno de los 20 aminoácidos naturales, aminoácidos que han sido químicamente modificados (véase a continuación) o aminoácidos sintéticos.

[0048] “Sustitución conservativa” se refiere a la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de la misma clase, en la que la clase es definida por las propiedades fisicoquímicas comunes de la cadena aminoácida y las elevadas frecuencias de sustitución de las proteínas homólogas encontradas en la naturaleza, como se determina, por ejemplo, por una matriz de intercambio de frecuencia estándar Dayhoff o una matriz BLOSUM. Seis clases generales de cadenas aminoácidas han sido categorizadas e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, THR, Pro, Ala, Gly), Clase III (Asn, Asp, Gin, Glu), Clase IV (His, Arg, Lys), Clase V (He, Leu, Val, Met) y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitución de un Asp por otro residuo de Clase III como un Asn, Gin o Glu es una sustitución conservativa.

[0049] “Sustitución no conservativa” se refiere a la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de otra clase, por ejemplo, la sustitución de un Ala, un residuo de Clase II, por un residuo de Clase III como un Asp, Asn, Glu o Gin.

[0050] “Químicamente modificado” se refiere a un producto (proteína) en el que al menos uno de sus aminoácidos residuales es modificado bien por procesos naturales, como procesamiento u otras modificaciones posttraduccionales, o por técnicas de modificación química ya conocidas en la disciplina. Entre las numerosas modificaciones conocidas, los ejemplos típicos, aunque no exclusivos, incluyen: acetilación, acilación, amidación, APD-ribosilación, adición de glúcidos, adición de glucosaminoglucanos, formación de anclaje a GPI, unión covalente de un lípido o un derivado de este, metilación, miristilación, peguilación, prenilación, fosforilación, ubiquitinación o cualquier proceso similar.

[0051] “Alineación óptima” se define como la alineación que da el porcentaje de puntuación más elevado. Dicha alineación puede llevarse a cabo utilizando una variedad de programas de análisis de secuencias disponibles en el mercado, como el programa de alineación local LALIGN, que utiliza parámetros de organización por defecto.

[0052] “Que tiene, al menos, un 90% de identidad” con respecto a dos grupos de secuencias de aminoácidos o ácido nucleico, se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias son alineadas de manera correcta. De este modo, la secuencia con, al menos, un 90% de identidad significa que al menos el 90% de los aminoácidos en dos o más secuencias polipeptídicas alineadas de manera correcta son idénticos. Sin embargo, esta definición excluye expresamente las secuencias que son 100% idénticas a la secuencia original de ácido nucleico o la secuencia original proteica de la que la variante fue variada.

[0053] “Secuencia de molécula de ácido nucleico aislado con una variante de ácido nucleico” y “molécula polinucleótida aislada” se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia codificante de la variante. La molécula de ácido nucleico aislado puede incluir sin carácter restrictivo la secuencia codificante de la variante como una inserción independiente y puede incluir la secuencia codificante de la variante fusionada a otra secuencia codificante, codificando juntas una proteína de fusión en la que la secuencia codificante de la variante en la secuencia codificante dominante (por ejemplo, la secuencia codificante adicional puede codificar un péptido señal), la secuencia codificante de la variante puede estar combinada con secuencias no codificantes, como intrones

o elementos de control, como un promotor, elementos de terminación o regiones no traducidas de 5' y/o 3', efectivos para la expresión de la secuencia codificante en un receptor adecuado, o puede ser un vector en el que la secuencia codificante de proteína variante es heteróloga.

[0054] “Vector de expresión” se refiere a los vectores que tienen la habilidad de incorporar y expresar fragmentos heterólogos de ADN en una célula exterior. Numerosos vectores de expresión de procariotas y eucariotas son ya conocidos y/o disponibles en el mercado. La selección de vectores de expresión apropiados forma parte de los expertos en la disciplina.

[0055] “Oligonucleótido” se refiere a un oligómero o polímero simple o de doble capa de ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de estos. Este término incluye oligonucleótidos compuesto de bases, azúcares y enlaces covalentes internucleósidos naturales (por ejemplo, la espina dorsal), así como oligonucleótidos con porciones no naturales que funcionan de manera similar a sus respectivas porciones naturales.

[0056] “Eliminación” se refiere al cambio en la secuencia nucleótida o aminoácida en la que uno o más residuos de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, están ausentes cuando se comparan con la secuencia natural.

[0057] “Inserción” o “adición” se refiere al cambio de una secuencia nucleótida o aminoácida que ha resultado de la adición de uno o más residuos nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, cuando se comparan con la secuencia natural.

[0058] “Sustitución” se refiere al remplazo de uno o más nucleótidos o aminoácidos por diferentes nucleótidos o aminoácidos respectivamente, cuando se comparan con la secuencia natural. En relación con las secuencias aminoácidas, la sustitución puede ser conservativa o no conservativa.

[0059] “Anticuerpo” se refiere a los anticuerpos de cualquiera de las clases de anticuerpo IgG, IgM, IgD, IgA e IgE. La definición incluye los anticuerpos policlonales y monoclonales. Este término se refiere a anticuerpos completos o a fragmentos de anticuerpos que contienen áreas de unión a antígenos de los anticuerpos de producto de antivariante, por ejemplo scFv, Fab, F(ab')2, otros anticuerpos sin porción Fc, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, otros fragmentos que contienen solo la variante, que contienen áreas de unión a antígenos de los anticuerpos y similares, que retienen sustancialmente las características de la unión de antígenos del anticuerpo completo del que se derivan.

[0060] “Agonista” se refiere a una molécula que mimetiza el efecto del producto de la variante de CD44 o ha mejorado su actividad comparado con el producto de la variante de CD44, o, a veces, incluso incrementa o prolonga la duración de la actividad biológica del producto de la variante, cuando se compara al inducido por el producto de la variante en sí mismo. El mecanismo puede ser mediante cualquier mecanismo conocido para prolongar la actividad de moléculas biológicas como la unión a los receptores, la prolongación de la vida de las moléculas, el incremento de la actividad de las moléculas en su diana, el incremento de la afinidad de moléculas a su receptor, la inhibición, degradación o proteolisis de las moléculas y demás. Los agonistas pueden ser polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos o derivados de estos, o cualquier otra molécula que puede modular positivamente la actividad del producto de la variante.

[0061] “Antagonista” se refiere a una molécula que inhibe o acorta la duración de la actividad biológica del producto de la variante de CD44. Este puede ser obtenido por cualquier mecanismo conocido para desactivar o inhibir moléculas biológicas como el bloqueo del receptor, el bloqueo de un sitio activo, la competición en un sitio de unión, el aumento de la degradación y similares. Los antagonistas pueden ser polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos o derivados de estos, o cualquier otra molécula que pueda modular negativamente la actividad del producto de la variante de CD44.

[0062] “Muestra biológica”. La muestra biológica usada en diversas realizaciones y ejemplos puede ser cualquier muestra apropiada procedente del cuerpo humano. La muestra puede incluir muestras de fluidos como sangre entera, monocitos de sangre periférica o leucocitos. Las muestras pueden incluir diversas células y tejidos. La muestra puede incluir secciones de tejido fijadas y/o incrustadas. Las muestras pueden ser extraídas recientemente

o congeladas. Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos vivos o muertos y se pueden obtener de cualquier organismo como, por ejemplo, humanos, ratas y ratones.

[0063] “Tratar una enfermedad” se refiere a la administración de una composición que incluye al menos un reactivo/sustancia efectiva para mejorar los síntomas asociados a una enfermedad, para reducir la severidad o curar la enfermedad o para prevenir que se produzca dicha enfermedad.

[0064] El término “modular” aquí utilizado está dirigido a afectar (cambiar) la expresión y/o actividad de un ácido nucleico y/o un polipéptido. El término modulación puede referirse al incremento y/o la atenuación (regulación a la baja) de la expresión y/o actividad del ácido nucleico y/o el polipéptido.

[0065] “Detección”, “Diagnóstico” se refiere a los métodos de detección de una enfermedad, síntoma, trastorno, condición patológica o normal; de clasificación de una enfermedad, síntoma, trastorno o condición patológica; de determinación de la severidad de una enfermedad, síntoma, trastorno o condición patológica; de control de una enfermedad, síntoma, trastorno o progresión de la condición patológica y de pronóstico de un resultado y/o las perspectivas de recuperación de estas.

[0066] “Sonda” es una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia codificante de la variante o una secuenta complementaria de esta, que se utiliza para detectar la presencia de otras secuencias similares en una muestra. La detección se lleva a cabo mediante la identificación de complejos de hibridación entre la sonda y la secuencia de ensayo. La sonda, en algunas realizaciones, puede estar unida a un soporte sólido o a un marcador. La sonda será, por lo general, monocatenaria y de entre 10 y 100 nucleótidos. Las propiedades particulares de una sonda dependerán de la utilización particular y no es necesario ser experto en la disciplina para determinarlas.

[0067] “Par de cebadores” es un grupo de dos moléculas de ácido nucleico (primers), cada una de las cuales puede servir para cebar la polimerización dirigida por molde mediante una polimerasa o transcriptasa, cuyos cebadores hibridan la capa opuesta de una secuencia de ácido nucleico de doble capa (template) de tal manera que para dirigir la polimerización (y amplificación) de la secuencia nucleótida de doble capa de la secuencia nucleótida localizada entre las regiones de hibridación cebadora. Este par de cebadores puede ser utilizado en la ya conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El diseño de los pares de cebadores es bien conocido en la disciplina y dependerá de la secuencia particular para la que sea amplificada. En general, los cebadores son simples, entre 10 y 40 bases de longitud, e hibrida regiones de la secuencia molde localizada entre 50 y 2000 bases aparte.

[0068] “Unión de corte y empalme”, referida indistintamente a “enlace de unión” se refiere al proceso de combinación (interacción) entre una molécula de ácido nucleico simple y una molécula de ácido nucleico complementaria dentro de una molécula. Esta es la región en la que un exón se conecta a sus exones flanqueantes, en la secuencia del transcrito procesado.

[0069] “Hibridización” o “hibridización de ácido nucleico” se refiere al proceso de combinación (interacción) entre una molécula de ácido nucleico monocatenaria y una molécula de ácido nucleico complementaria dentro de una molécula.

[0070] Se hace referencia ahora a la Figura 1, que ilustra esquemáticamente la estructura genética humana de CD44. La Figura 1A ilustra la estructura del gen humano CD44, que se compone de 9 exones variables (cuadrados rellenos, marcados V2-10) y exones constantes (cuadrados vacíos, marcados como C1-5 y C6-10). La Figura 1B ilustra esquemáticamente la estructura del transcrito de la variante de CD44 CD44V3, que incluye, además de exones constantes, el exón variable 3'. La Figura 1C ilustra esquemáticamente la estructura del transcrito de la variante de CD44 CD44V6, que incluye, además de exones constantes, el exón variable 6'. La Figura 1D ilustra esquemáticamente la estructura del transcrito de la variante de CD44 CD44V7, que incluye, además de exones constantes, el exón variable 7'. La Figura 1E ilustra esquemáticamente la estructura del transcrito de la variante de CD44 CD44V10, que incluye, además de exones constantes, el exón variable 10'.

[0071] Las muestras de ARN pueden extraerse de muestras biológicas de sujetos diagnosticados con una enfermedad neurodegenerativa (pacientes) o de animales modelo, como, por ejemplo, ratones transgénicos, que son utilizados como modelo en enfermedades neurodegenerativas. El ARN extraído puede incluir ARN total o ARNm. El ARN extraído puede ser transcrito inverso y usado en una reacción de amplificación PCR. La reacción de amplificación PCR puede además incluir cebadores cuya secuencia nucleótida puede derivar de regiones con diferentes exones variables de un gen CD44, regiones dentro varios exones constantes de un gen CD44, regiones que abarcan secuencia nucleótidas de regiones de unión de enlaces de exones constantes y variables o una combinación de estos. Los productos de PCR resultantes pueden ser, a continuación, analizados y sus secuencias determinadas. De este modo, varios transcritos de CD44 pueden ser identificados y pueden incluir, entre otros, nuevos transcritos de variantes de corte y empalme de CD44 que no han sido anteriormente descritos en la disciplina.

[0072] Además, las muestras de ARN pueden extraerse muestras de muestras biológicas de sujetos diagnosticados con una enfermedad neurodegenerativa (pacientes), así como de sujetos coincidentes en edad y sexo que no fueron diagnosticados con una enfermedad neurodegenerativa (control normal). El extracto de ARN puede incluir ARN total o ARNm. El extracto de ARN puede ser transcrito de forma inversa y usado en una reacción de amplificación mediante RCP. La reacción de amplificación mediante RCP puede incluir además, cebadores cuya secuencia de nucleótidos puede derivarse de regiones de los distintos exones variables de un gen CD44, regiones de distintos exones constantes de un gen CD44, regiones que abarcan la secuencia de nucleótidos de las regiones de corte y empalme que se unen los exones constantes y variables y cualquier combinación de estos. A continuación se pueden analizar los productos resultantes de la RCP, obtenidos de las muestras biológicas de los pacientes y los sujetos de control normal, determinando su secuencia. Los productos de la RCP pueden incluir transcritos de CD44, que a su vez pueden incluir, entre otros, transcritos de variantes de corte y empalme que no han sido descritas previamente en la disciplina. Por otra parte, el nivel de expresión de los distintos productos de RCP, que representan distintos transcritos de variantes de CD44, pueden ser comparadas entre las muestras obtenidas de los pacientes y las muestras obtenidas a partir de los controles normales. Se puede determinar el nivel de expresión de los distintos transcritos de variantes de CD44 y la comparación del nivel de expresión entre las diferentes muestras mediante diversos métodos conocidos en la disciplina, tales como, por ejemplo, de manera semicuantitativa mediante la transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR), RCP en tiempo real y similares. Por ejemplo, tal comparación puede indicar la expresión exclusiva de variante (s) de corte y empalme específica (s) en muestras obtenidas de pacientes en comparación a las muestras obtenidas de los controles normales. Por ejemplo, tal comparación puede indicar un nivel elevado de expresión (regulación al alza/supra regulación) en muestras obtenidas de pacientes en comparación a las muestras obtenidas de los controles normales. Por ejemplo, tal comparación puede indicar una disminución en el nivel de expresión (regulación a la baja) de la(s) variante(s) de corte y empalme específica(s) en muestras obtenidas de pacientes en comparación a las muestras obtenidas de los controles normales. Por ejemplo, tal comparación puede indicar que no se observa ningún cambio en el nivel de expresión de la(s) variante(s) de corte y empalme específica(s) en muestras obtenidas de pacientes en comparación a las muestras obtenidas de los controles normales. Por ejemplo, tal comparación puede indicar expresión exclusiva de la(s) variante(s) de corte y empalme específica(s) en las muestras obtenidas de los controles normales en comparación a las muestras obtenidas de los pacientes.

[0073] El ARN total se puede extraer de muestras de hipocampo post mórtem de sujetos diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer (pacientes con EA), así como sujetos coincidentes en edad y sexo que no fueron diagnosticados con la enfermedad (control normal). El ARN se transcribe de forma inversa y es usado en una reacción de amplificación mediante RCP, véase a continuación en el Ejemplo 1. La RCP incluye, además, cebadores cuya secuencia de nucleótidos puede derivar de regiones de los diversos exones variables de un gen CD44, de regiones de los distintos exones constantes de un gen CD44, de regiones que abarcan la secuencia de nucleótidos de las regiones de corte y empalme que unen los exones constantes y variables y cualquier combinación de estos. Se muestran a continuación ejemplos de secuencias de cebadores en el Ejemplo 1. El análisis de los productos resultantes de la RCP obtenidos de este modo indica distintas variantes de corte y empalme de CD44, cuya expresión es aumentada en las muestras obtenidas de pacientes en comparación a las muestras obtenidas de los controles normales. En particular, se identificaron así varias variantes de corte y empalme de CD44, que contenían un exón variable sin saltar flanqueado por los exones constantes de CD44, y mostraba un aumento significativo en la expresión de los pacientes con EA en comparación a los controles normales. Las variantes de corte y empalme de CD44, identificadas de este modo incluyen CD44V3, CD44V6, CD44V7, y CD44V10. Los experimentos de RCP en tiempo real, véase a continuación el Ejemplo 2, muestran que las variantes de corte y empalme CD44V3, CD44V6 y CD44V10 presentan un aumento aproximado de la expresión de 7,17; 7,02 y 18,15 en pacientes con EA en comparación al control normal, respectivamente. Además, la isoforma CD44S de CD44 mostró un aumento aproximado de la expresión de 4,95 en pacientes con EA en comparación con el control normal.

[0074] Se puede extraer ARN total de ratones transgénicos que expresan APP751, y pueden usarse como modelo para patologías de tipo EA, véase a continuación el Ejemplo 3. Se aísla el ARN de los tejidos del hipocampo de la hembra de ratón transgénico que expresa APP751 y de la camada no transgénica a partir de los 7,o 7,5 meses. El ARN se transcribe de forma inversa y se utiliza en una reacción de amplificación mediante RCP, tal y como se detalla a continuación en el Ejemplo 3. Los resultados mostraron un incremento de 7,2 en la expresión de ARNm que codifica un transcrito con la unión V7-C10 de los ratones transgénicos que expresan APP751 en comparación con con el control de ratones no transgénicos. En idénticas condiciones, los niveles de expresión de CD44S mostraron un incremento del 16%. El aumento de la expresión de CD44V7 en ratones transgénicos que expresan APP751 (como se demuestra en el Ejemplo 3), junto con el descubrimiento de CD44V7 en el cerebro de pacientes con EA (como se demuestra en el Ejemplo 1), indican la implicación de CD44V7 en la patología de la EA, por ejemplo, la acumulación posterior de A , cuya acumulación en la región específica del cerebro es una de los características de la EA.

[0075] Como se muestra esquemáticamente en la Figura 1B, el transcrito de la variante de corte y empalme de CD44V3 incluye al menos el exón constante 5', el exón variable 3' y el exón constante 6'. Más preferiblemente, el transcrito de la variante de corte y empalme de CD44V3 incluye los exones constantes 1'-5', el exón variable 3' y los exones constantes 6'-9'. Una búsqueda utilizando Blast en bases de datos públicas de secuencias humanas expresadas, usando parámetros por defecto y la secuencia de nucleótidos de CD44V3 tuvo como resultado un único EST (número de registro DA283531) sin identidad conocida para cualquier ARNm. Una búsqueda similar mediante Blast, usando la secuencia de nucleótidos de la región C5-V3-C6 de CD44V3 (coordenadas 639-822 en la SEC IDNÚM 1 tal y como se ilustra en las Fig. 2A-C) dio lugar a resultados similares.

[0076] Como se muestra esquemáticamente en la Figura 1C, el transcrito de la variante de corte y empalme CD44V6 incluye al menos un exón constante 5', un exón variable 6' y un exón constante 6'. Más preferiblemente, el transcrito de la variante de corte y empalme de CD44V3 incluye los exones constantes 1'-5', el exón variable 6' y los exones constantes 6'-9'. Una búsqueda utilizando Blast en bases de datos públicas de secuencias humanas expresadas, usando parámetros por defecto y la secuencia de nucleótidos de CD44V6, no dio lugar a ningún EST similar o secuencias de ARNm. Una búsqueda similar mediante Blast usando la secuencia de nucleótidos de laregión C5-V6-C6 de CD44V6 (coordenadas 639-825 en la SEC ID NÚM 3 tal y como se ilustra en las Fig. 3A-C) han demostrado que no se encontraron ni ARNm ni EST para contener una combinación de la secuencia de nucleótidos tanto de C5V6 como de V6C6 en la misma molécula. Por lo tanto, CD44V6 es una nueva variante de corte y empalme del gen CD44 que no ha sido descrita previamente. Guriec et al. En (Breast Cancer Res Treat. 1997 44:261-8) menciona el V6 solo, pero únicamente comprobó la región de V6-C6 y no otras regiones conectadas a V6.

[0077] Como se describe esquemáticamente en la Figura 1D, el transcrito de la variante de corte y empalme CD44V7 incluye al menos un exón constante 5', un exón variable 7' y un exón constante 6'. Más preferiblemente, el transcrito de la variante de corte y empalme de CD44V7 incluye exones constantes 1'-5', un exón variable 7' y los exones constantes 6'-9'. La secuencia de nucleótidos de la región C5-V7-C6 de CD44V7 corresponde a lascoordenadas 639-828 en la SEC ID NÚM 5. En una búsqueda utilizando Blast en bases de datos públicas de secuencias humanas expresadas usando parámetros por defecto y la secuencia de nucleótidos de CD44V7, no se obtuvo ningún EST similar o secuencias de ARNm, es decir; no se encontró un ARNm con enlaces C5V7 y V7C6 en la misma molécula.

[0078] Como se muestra esquemáticamente en la Figura 1E, el transcrito de la variante de corte y empalme de CD44V10 incluye al menos un exón constante 5', un exón variable 10' y un exón constante 6'. Más preferiblemente, el transcrito de la variante de corte y empalme de CD44V10 incluye los exones constantes 1'-5', el exón variable 10' y los exones constantes 6'-9'. Una búsqueda utilizando Blast en bases de datos públicas de secuencias humanas expresadas, usando parámetros por defecto y la secuencia de nucleótidos de CD44V10 se obtuvieron un ARNm (EF581837) y dos EST (CD641177 y AW995521). Una búsqueda similar mediante Blast usando la secuencia denucleótidos de la región C5-V10-C6 de CD44V10 (coordenadas 639-900 en la SEC ID NÚM 7 tal y como se ilustra en las Figura 5A-C), dio lugar a resultados similares.

[0079] Como se detalla a continuación en el Ejemplo 4, el ARN total se puede extraer a partir de muestras post mórtem de la médula espinal y de la corteza motora de sujetos diagnosticados con ELA (pacientes de ELA), así como de sujetos que no fueron diagnosticados con la enfermedad (control normal). El ARN se transcribe de forma inversa y es usado en una reacción de amplificación mediante RCP. La RCP incluye, además, cebadores cuya secuencia de nucleótidos puede derivar de regiones de los diversos exones variables de un gen CD44, de regiones de los distintos exones constantes de un gen CD44, de regiones que abarcan la secuencia de nucleótidos de las regiones de corte y empalme que unen los exones constantes y variables y cualquier combinación de estos. El análisis de los productos resultantes de la RCP obtenidos de este modo indica distintas variantes de corte y empalme de CD44, cuya expresión aumentó en las muestras obtenidas de pacientes en comparación con las muestras obtenidas de los controles normales. En particular, se identificaron así diversas variantes de corte y empalme de CD44 que contenían un exón variable sin saltar flanqueado por los exones constantes de CD44, mostrando un incremento significativo en la expresión de los pacientes con EA en comparación con los controles normales. Las variantes de corte y empalme de CD44 identificadas de este modo, incluyen CD44V3, CD44V6, y CD44V10.

[0080] Los transcritos de las variantes de CD44 identificadas de este modo, tales como, por ejemplo, CD44V3, CD44V6, CD44V7 y CD44V10 y sus respectivos productos proteicos pueden estar implicados en los procesos inflamatorios que mediados por células gliales residentes (microglía o astrocitos) o por la infiltración de células inflamatorias como los linfocitos T, que pueden ser bien protectores, bien perjudiciales y que son estimulados a lo largo del curso de las enfermedades en algunos exones sin saltar. La selección de las variantes de corte y empalme parece ser específica de especies y enfermedades.

[0081] Los péptidos derivados de las secuencias de diversas proteínas de la variante CD44 se puede preparar mediante varios procesos como, por ejemplo, síntesis química y/o métodos recombinantes y pueden ser usados como antígenos para la producción de anticuerpos específicos dirigidos contra esos péptidos. Los anticuerpos preparados de este modo pueden incluir anticuerpos policlonales y monoclonales y pueden reconocer expresamente las diversas proteínas de la variante de CD44. La preparación y purificación de los anticuerpos se puede realizar mediante cualquier método conocido en la disciplina. Los anticuerpos que reconocen y se unen expresamente a las diversas proteínas de la variante de CD44 muestran una afinidad al menos 2 veces mayor que si se compara con la unión a otras variantes de CD44 conocidas en la disciplina, que no se describen en ninguna de las realizaciones descritas en este documento. Se puede evaluar la especificidad de la unión mediante diversos métodos bien conocidos en la disciplina, como los ensayos de unión, ensayos biológicos y cualquier combinación de estos.

[0082] Los péptidos derivados de las secuencias de diferentes productos de variantes de CD44 identificados en este documento, tales como el producto CD44V3, el producto CD44V6, el producto CD44V7, el producto CD44S y el producto CD44V10, se pueden sintetizar químicamente mediante síntesis en fase sólida (Merrifield, J. 1964, Biochemistry, 3:1385-90) y utilizarse para la producción de anticuerpos que pueden reconocer expresamente variantes de CD44. Los anticuerpos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos policlonales y/o anticuerpos monoclonales. Preferiblemente los péptidos derivados de las secuencias de los diversos productos de las variantes de CD44 se obtienen de las regiones que corresponden a las uniones entre los exones variables y los exones constantes. Un péptido derivado de la proteína CD44V3 puede incluir, por ejemplo, la región de unión que corresponde a una secuencia de aminoácidos que enlaza los exones C5 y V3 (Aminoácidos 214-233 en la SEC ID NÚM 2 y Figura 2B). Por ejemplo, un péptido derivado de la proteína CD44V3 puede incluir la región de unión correspondiente a la secuencia de aminoácidos que enlaza los exones V3 y C6 (Aminoácidos 256-275 en la SEC IDNÚM 2 tal y como se muestra en la Figura 2C). Un péptido derivado de la proteína CD44V6 puede incluir, por ejemplo, la región de unión correspondiente a la secuencia de aminoácidos que enlaza los exones C5 y V6(Aminoácidos 214-233 en la SEC ID NÚM 4 y Figura 3B). Por ejemplo, un péptido derivado de la proteína CD44V6 puede incluir la región de unión correspondiente a la secuencia de aminoácidos que enlaza los exones V6 y C6(Aminoácidos 257-276 en la SEC ID NÚM 4 tal y como se muestra en la Figura 3C). Un péptido derivado de la proteína CD44V10 puede incluir, por ejemplo, la región de unión correspondiente a la secuencia de aminoácidos queenlaza los exones C5 y V10 (Aminoácidos 214-233 en la SEC ID NÚM 8 y Figura 5B). Los esplenocitos de ratones inmunizados con dichos péptidos se pueden fusionar con células de mieloma, y los hibridomas que producen ACs monoclonales específicos se pueden seleccionar probando la capacidad de los sobrenadantes de estas células para unirse a las líneas celulares Namalwa del linfoma de Burkitt, transfectadas de forma estable con construcciones recombinantes que codifican variantes de CD44 pero no a las células de control de los CD44 transfectados o no transfectados.

[0083] Los reactivos, como los anticuerpos específicos, pueden reaccionar expresamente en contra y reconocer diferentes variantes de corte y empalme de CD44, que pueden utilizarse en el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas. El análisis de la expresión de las diferentes variantes de corte y empalme de CD44 puede llevarse a cabo en varias muestras biológicas obtenidas de individuos sometidos a prueba. Dichas muestras pueden incluir, por ejemplo, muestras de plasma, muestras de tejido y similares. El análisis puede incluir diversos métodos bien conocidos utilizados para determinar la expresión de la proteína en una muestra, como el Western Blot, el Ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), el Radioinmunoensayo (RIA) y similares. La presencia y/o el nivel de expresión de las variantes de CD44 se puede comparar a un control conocido y previamente calibrado, y la diferencia en la expresión entre los individuos estudiados y los de control pueden indicar tant la existencia de una enfermedad como el nivel de progresión de la misma.

[0084] Se puede realizar el análisis inmunohistoquímico de tejido del hipocampo del cerebrol de los pacientes de EA, véase a continuación el Ejemplo 5. Los anticuerpos específicos contra CD44S, CD44V3, CD44V6 o CD44V10 para la tinción inmunohistoquímica del tejido cerebral de pacientes con EA. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica demuestran localizaciones celulares y subcelulares diferenciales de las distintas isoformas de CD44. Considerando que el CD44S se encuentra principalmente en los astrocitos y en las placas seniles, la tinción del CD44V6 y CD44V10 se encuentra en las neuronas de las zonas paranucleares que se superponen a la región autofluorescente de la lipofuscina, como se detalla en el Ejemplo 5. La tinción de CD44V3 se encuentra tanto en los astrocitos como en las zonas neuronales paranucleares. La lipofuscina es un complejo de proteína lisosómica oxidada y residuos de degradación de lípidos acumulados en las neuronas envejecidas. Los resultados muestran que en contraste con CD44S, las variantes de CD44, expresadas en las neuronas, pueden tener un papel directo en el proceso patofisiológico que puede conducir a la muerte las células neuronales. Por ejemplo, las variantes de CD44 pueden tener una nueva función en el proceso intracelular de A de la proteína precursora de APP en las neuronas. Por ejemplo, las variantes de CD44 como el CD44V3, CD44V6, CD44V7 y CD44V10 pueden estar involucradas en la autofagia, la principal vía implicada en la degradación de las proteínas y orgánulos de larga vida, en la remodelación celular y en la supervivencia en situación de inanición. La autofagia está implicada en la degradación intracelular propensa a la agregación de alfa-sinucleína (Ravikumar Nat. Genr. 2004, 36:585-95) y huntingtina (Shibata J. Biol. Chem. 2006, 281: 14474-85). Las vacuolas autofágicas han sido previamente identificadas en las neuritas distróficas en cerebros con EA y pueden ser una zona para la producción de A (Yu et at J. Cell Biol. 2005, 171: 87-98). Se ha demostrado recientemente que la autofagia tiene un papel preventivo importante en la acumulación de A�, en la deposición extracelular de A� y en la degeneración de neuronas en los ratones modelo con EA (Pickford et. al., J Clin Invest. 2008, 118: 2190-99). Si hacemos referencia a las Figuras 6A y 6B, éstas muestran una tinción típica de la sección del hipocampo de pacientes de EA con anticuerpos CD44V6 y CD44V10, respectivamente. Como se muestra en la Figura 6A, diversas células neuronales como, por ejemplo, las células neuronales 2A-F se pueden identificar dentro de la sección hipocampal (4). Tal y como se ejemplifica, las células se pueden teñir mediante la célula 2F, una neurona típica teñida positivamente. La parte inferior derecha de la Figura 6A (panel 6) muestra una vista aumentada de un ejemplar de célula teñida positivamente (8), donde el núcleo de la célula (10) no está teñido, mientras que los compartimentos paranucleares y de citoplasma (12), se tiñeron positivamente con un anticuerpo CD44V6, que es el producto de CD44V6 expresado en estos compartimentos celulares. Como se muestra en la Figura 6B, diversas células neuronales como, por ejemplo, las células neuronales 12A-F se pueden identificar en de la sección hipocampal (14). Tal y como se ejemplifica, las células se pueden teñir mediante la célula 12F, una neurona típica teñida positivamente. La parte inferior derecha de la Figura 6B (panel 16), muestra una vista ampliada de un ejemplar de célula teñido positivamente (18), donde el núcleo de la célula (20) no está teñido, mientras que los compartimentos paranucleares y de citoplasma (22), se tiñeron positivamente con un anticuerpo CD44V10, que es el producto de CD44V10 expresado en estos compartimentos celulares. En conjunto, los resultados de tinción muestran una fuerte tinción en el citoplasma neuronal, así que este es el compartimento neuronal en el cual se expresan los productos de las variantes de CD44.

[0085] Se puede proporcionar por lo tanto, un método cualitativo para diagnosticar la presencia y/o el nivel de progresión de una enfermedad neurodegenerativa, como por ejemplo, EA y ELA. Este método puede incluir el uso de reactivos que pueden reaccionar específicamente en contra y reconocer las diferentes variantes de corte y empalme de CD44, como las proteínas CD44V3, CD44V6, CD44V10 o una combinación de estas. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o policlonales que reconocen de forma individual las diferentes variantes de CD44. La presencia de las variantes de CD44, como la proteína CD44V3, la proteína CD44V6 y/o la proteína CD44V10 se puede probar en una muestra biológica obtenida de un sujeto estudiado, como por ejemplo, un tejido, una muestra de fluido, una célula y similares. La presencia de las variantes de corte y empalme de CD44, como la proteína CD44V3, la proteína CD44V6 y/o la proteína CD44V10 se puede probar mediante técnicas de inmunohistoquímica y/o análisis de Western blot realizados en secciones y/o extractos de proteínas obtenidos a partir de las muestras biológicas. Como se ha demostrado anteriormente, la expresión detectada (presencia) de las diferentes variantes de corte y empalme de CD44, tales como las proteínas CD44V3, CD44V6, CD44V10 o una combinación de estas, puede indicar la presencia de una enfermedad neurodegenerativa en el sujeto evaluado. Por otra parte, el método se describe en este documento como un método cualitativo que también puede utilizarse como método cuantitativo. En el método cuantitativo, el nivel de expresión de la proteína CD44V3, la proteína CD44V6, la proteína CD44V10 o cualquier combinación de estas en el sujeto evaluado, se compara con un nivel de calibrado conocido de la expresión en dichas proteínas. Se deduce el estado de progresión de la enfermedad neurodegenerativa por la cuantificación del nivel de expresión de las variantes de corte y empalme de CD44, tales como las proteínas CD44V3, CD44V6 y CD44V10.

[0086] Los reactivos, como los anticuerpos específicos, pueden reaccionar expresamente en contra y reconocer diferentes variantes de corte y empalme de CD44, que pueden utilizarse en el diagnóstico de las enfermedades neurodegenerativas, por su aparición o progresión. Por lo tanto, se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa en un paciente necesitado, incluyendo la administración a un paciente que necesite una cantidad eficaz de un reactivo, como un anticuerpo específico dirigido contra una variante de corte y empalme de CD44, como las proteínas CD44V3, CD44V6, CD44V10 o una combinación de estas. El reactivo, como anticuerpo específico, puede regular a la baja la actividad o la expresión de las variantes de corte y empalme de CD44, tratando de este modo, la enfermedad neurodegenerativa.

[0087] Se pueden proporcionar moléculas oligonucleótidas que pueden utilizarse para la identificación, caracterización, detección y cuantificación de la expresión de las variantes de corte y empalme de CD44V3, CD44V6, CD44V7 y CD44V10 en diversas muestras biológicas. Las moléculas oligonucleótidas pueden incluir ácidos nucleicos de ADN o ARN como, por ejemplo, sondas de oligonucleótidos, cebadores de oligonucleótidos o cualquier combinación de estos, cuya secuencia nucleótida puede hibridar al menos a una región de la secuencianucleótida de los transcritos de CD44V3 (SEC ID NÚM 1) y/o CD44V6 (SEC ID NÚM 3) y/o CD44V7 (SEC ID NÚM5) y/o CD44V10 (SEC ID NÚM 7). Por ejemplo, las moléculas de oligonucleótidos pueden incluir una sonda de ácido nucleico. Una sonda de ácido nucleico adecuada puede incluir unos 100 o 200 nucleótidos y dicha sonda puede utilizarse para identificar y cuantificar la expresión de las variantes de corte y empalme de CD44 en diversos sistemas biológicos. El uso de la sonda para la identificación y la cuantificación de la expresión de la variante de corte y empalme de CD44 puede lograrse mediante varios métodos basados la hibridación específica de la sonda con las variantes de corte y empalme de CD44. Tales métodos pueden incluir, por ejemplo, el análisis de Northern blot y la hibridación in situ de ARN. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico también pueden incluir pares de cebadores. Los pares de cebadores son dos moléculas oligonucleótidas cortas (como por ejemplo, en la longitud de 10 a 30 nucleótidos) que pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de las diversas variantes de corte y empalme de CD44 (transcritos de corte y empalme de CD44) con el método bien conocido en la disciplina de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). En este método, las moléculas de ARN extraídas de una muestra biológica se transcriben de forma inversa a ADN mediante una enzima transcriptasa inversa. La molécula de ADN resultante se utiliza entonces, como molde en una reacción de RCP junto a los pares de cebadores específicos, cuya secuencia es idéntica o complementaria a, al menos, parte de la región de las variantes individuales de corte y empalme de CD44. Si una variante específica de corte y empalme de CD44 se expresa (significa que su ARNm se encuentra en una muestra biológica) en la reacción de amplificación, se observa un producto de la RCP y se puede cuantificar su nivel. Para cada una de las diversas variantes de corte y empalme de CD44 anteriormente descritas, al menos un par de cebadores específicos pueden ser diseñados y preparados. La secuencia de los pares de cebadores, puede derivar preferiblemente de las regiones de secuencia única de cada variantes de corte y empalme. Las regiones de secuencia única de cada variante se encuentran más preferiblemente en las proximidades de las regiones de unión de enlaces de exones constantes y exones variables (unión de corte y empalme). Las secuencias de pares de cebadores específicos ejemplares pueden utilizarse para tal fin, véanse a continuación los ejemplos 1 y 3.

[0088] Los oligonucleótidos, como las sondas específicas y los pares de cebadores, como aquellos que se muestran en los ejemplos 1 y 3 citados a continuación, pueden reconocer específicamente diversas variantes de corte y empalme de CD44 y, por tanto, pueden utilizarse para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas. El análisis de la expresión de las diferentes variantes de corte y empalme de CD44 puede realizarse en diversas muestras biológicas obtenidas de individuos sometidos a prueba. Dichas muestras pueden incluir, por ejemplo, muestras de plasma, muestras de tejidos y similares. El análisis de las muestras puede utilizarse para determinar la presencia, la existencia, y el nivel de expresión de las diversas variantes de CD44. El análisis puede incluir diversos métodos bien conocidos utilizados para determinar la expresión del transcrito en una muestra, como el RT-PCR, PCR en tiempo real, la Nothern blot, hibridación in situ y similares. La presencia y/o el nivel de la expresión de los transcritos de las variantes de CD44 se puede comparar con un control conocido previamente calibrado y la diferencia en la expresión entre los individuos estudiados y los de control pueden indicar la existencia de una enfermedad, así como el nivel de progresión de la enfermedad. Por ejemplo, como se detalla anteriormente y en los ejemplos 1 y 2, los niveles de expresión de los diferentes transcritos de CD44, como por ejemplo, CD44S, CD44V3, CD44V6 y/o CD44V10 son significativamente elevados en el cerebro de pacientes con EA en comparación con los cerebros de control. Por ejemplo, la expresión del transcrito de CD44V3 y CD44V6 aumenta unas 7 veces en pacientes con EA en comparación con el control. Por ejemplo, la expresión de CD44V10 aumenta unas 18 veces en pacientes con EA en comparación con el control.

[0089] Se presenta, además, un método para diagnosticar o controlar una enfermedad neurodegenerativa (como ELA, EA, EP) en un paciente que incluye la detección del nivel de expresión de un ácido nucleico en una muestrabiológica del paciente, en el que dicho ácido nucleico contiene: SEC ID NÚM 1, SEC ID NÚM 3, SEC ID NÚM 5, SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas. La muestra biológica puede incluir una célula, un tejido, un fluido biológico o cualquier combinación de estos. El nivel de expresión puede detectarse mediante la determinación de los niveles de expresión del ARN codificado por el ácido nucleico, que se separa de la muestra biológica. La detección de los niveles de expresión de ARN puede incluir diversos métodos como por ejemplo, RCP, RT-PCR, Northern blot, PCR en tiempo real, similares o cualquier combinación de estos que pueda utilizarse para la detección de la hibridación del ARN a un oligonucleótido, como por ejemplo, ADN, ARN, ADNc, ADN genómico, oligonucleótidos sintéticos y similares o cualquier combinación de estos. Por ejemplo, el método de diagnóstico puede incluir la detección del nivel de expresión de un polipéptido en una muestra biológica del paciente, en el que dicho polipéptido se puede seleccionar de un grupo que incluya: SEC ID NÚM 2, SEC ID NÚM 4, SEC ID NÚM 6, SEC ID NÚM 8 o cualquier combinación de estas. La detección del nivel de expresión del polipéptido puede incluir la detección de inmunocomplejos del polipéptido y un anticuerpo adaptado para unirse específicamente al polipéptido, por métodos sin carácter restrictivo, tales como: Western blot, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), similares o cualquier combinación de estos. Por ejemplo, un método cualitativo para diagnosticar la presencia y/o el nivel de progresión de una enfermedad neurodegenerativa, como por ejemplo, las enfermedades EA, ELA y Parkinson pueden incluir el uso de oligonucleótidos que reconocen los diferentes transcritos de las variantes de corte y empalme de CD44 como, por ejemplo, el transcrito de CD44S, el transcrito de CD44V3, el transcrito de CD44V6, el transcrito de CD44V7, el transcrito de CD44V10 o cualquier combinación de estos. Los oligonucleótidos pueden incluir, por ejemplo, oligonucleótidos sintéticos como por ejemplo, pares de cebadores, tales como los enumerados en los ejemplos 1 y 3. La presencia de los transcritos de las variantes de CD44 como por ejemplo, el transcrito de CD44V3, el transcrito de CD44V6, el transcrito de CD44V7, el transcrito de CD44S y/o el transcrito de CD44V10 pueden comprobarse en una muestra biológica obtenida de un sujeto a prueba. La presencia de los transcritos de las variantes de CD44 como, por ejemplo, el transcrito de CD44V3, el transcrito de CD44V6, el transcrito de CD44V7, el transcrito de CD44V10 o cualquier combinación de estos puede comprobarse, por ejemplo, mediante el análisis de RT-PCR, el análisis de RCP en tiempo real y similares, realizados en los extractos de ARN obtenidos de muestras biológicas. La expresión detectada (presencia) de los diferentes transcritos de las variantes de corte y empalme de CD44 como, por ejemplo, el transcrito de CD44V3, el transcrito de CD44V6, el transcrito de CD44V10, el transcrito de CD44S, el transcrito de CD44V7 o cualquier combinación de estos, puede indicar la presencia de una enfermedad neurodegenerativa en sujetos sometidos a prueba. Por otra parte, el método descrito en este documento como método cualitativo también puede utilizarse como método cuantitativo. En el método cuantitativo, el nivel de expresión del transcrito de CD44V3, el transcrito de CD44V6, el transcrito de CD44V6, el transcrito de CD44V10, el transcrito de CD44S o cualquier combinación de estos en el sujeto sometido a prueba, puede determinarse, por ejemplo, mediante los métodos RT-PCR o RCP en tiempo real, y se compara con un nivel de expresión conocido y calibrado de estos transcritos. Por cuantificación del nivel de la expresión de los transcritos de la variante de corte y empalme de CD44, como el transcrito CD44V3 y/o el transcrito de CD44V6, y/o el transcrito de CD44V10 y/o el transcrito de CD44S, se puede deducir el estado de progresión de la enfermedad neurodegenerativa.

[0090] Se pueden utilizar varios métodos, reactivos y técnicas conocidas en la disciplina para afectar el nivel de expresión de los diferentes transcritos de las variantes de CD44, CD44V3, CD44V6 y/o CD44V10. Por ejemplo, estas técnicas pueden incluir, entre otros, el uso de moléculas de ácido nucleico (normalmente en forma de oligonucleótidos), teniendo, al menos en parte, una secuencia complementaria a la de los transcritos de las variantes de CD44, CD44V3, CD44V6 y/o CD44V10. Dichas moléculas pueden incluir, por ejemplo, ARN pequeño de interferencia (siRNA), oligonucleótidos antisentido y similares. Por ejemplo, los siRNAs conocidos en la disciplina pueden incluir la secuencia nucleótida corta (unos 21-23 nucleótidos), que tiene una estructura de pares de bases caracterizada por dos salientes de nucleótidos 3´ (Tuschl and Borkhardt, Molecular Intervent. 2002, 2(3): 158-67). La introducción de siRNAs en células animales puede dar como resultado el silenciamiento potente, duradero y posttrancripcional de genes específicos, para el que el siRNA es dirigido en contra. (Caplen et. al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2001, 98:9742-7; Elbashir et al., Genes Dev. 2001, 15:188-200; Elbashir et. al.; EMBO J. 2001, 20: 687788). Los métodos y las composiciones para el uso de siRNA se describen, por ejemplo, en la patente U.S. Pat. Nº.

6.506.559. Los métodos para producir siRNA de una longitud de 21-23 nucleótidos mediante un sistema in vitro y el uso de siRNA para interferir con el ARNm de un gen en una célula u organismo, se describen, por ejemplo, en la patente WO0175164. El siRNA también puede realizarse in vivo en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión estable. Por ejemplo, se describe (Brummelkamp et. al., 2002, Science 296:550-3) un sistema vectorial llamado pSUPER, encargado de dirigir la síntesis de ARN pequeño de interferencia (siRNAs) en células de mamíferos. Como se detalla en el Ejemplo 6, (y Tabla 5), las secuencias específicas de siRNA, dirigidas contra los diferentes transcritos de las variantes de CD44, tales como CD44V3, y/o CD44 V6 y/o CD44V10 y/o CD44s se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos anteriormente mencionados. Se puede administrar siRNA por cualquiera de los métodos conocidos en la disciplina (tal y como se describe por ejemplo en Meade et. al., Adv Drug Deliv. Rev, 2007). Se puede dirigir siRNA contra distintas regiones de la secuencia de ARNm de diversos transcritos de variantes de CD44 para asegurar el silenciamiento de la expresión de CD44V3, CD44V6, CD44V10, CD44S y cualquier combinación de estos. Como se detalla en el Ejemplo 6 y se muestra en la Figura 7, los niveles de expresión de ARN de las distintas variantes de CD44 se pueden atenuar mediante el uso de moléculas específicas de siRNA. Como se detalla en el Ejemplo 6, se diseñaron tres moléculas de siRNA contra cada una de las variantes CD44S, CD44V3 y CD44V10. Se introdujeron las moléculas de siRNA en células y se detectaron los niveles de expresión de ARNm y la proteína de CD44 mediante RT-PCR. Si hacemos referencia a la Figura 7, se muestra el efecto de diversas moléculas de siRNA en la expresión ARN de los diferentes transcritos. El panel I de la Figura 7, ilustra un pictograma en gel de agarosa que muestra los niveles de expresión del transcrito de CD44V3 en diferentes condiciones experimentales (“RT” Reacción en transcriptasa inversa; ”NT” Células no transfectadas; “NR” siRNA no relevante; moléculas de CD44V3 siRNA #1-#3-siRNA con las respectivas secuencias enumeradas en la Tabla 6). Como se muestra en la Figura 7, panel I, la expresión de los niveles de CD44V3 en la presencia de al menos dos de los siRNA se reduce de manera significativa, mientras los controles de gel de actina y de CD44V6, no se muestran afectados. En el panel II de la Figura 7, se ilustra un pictograma en gel de agarosa que muestra los niveles de expresión de un transcrito de CD44V6 en diferentes condiciones experimentales (“RT” Reacción en transcriptasa inversa; “NT” Células no transfectadas; “NR” siRNA no pertinente; moléculas de CD44V3 siRNA #1-#3- siRNA con las respectivas secuencias enumeradas en la tabla 6). Como se muestra en la Figura 7, panel II, la expresión de los niveles de CD44V6 en presencia de al menos dos de los siRNA se reducen de manera significativa en mientras los controles de gel de actina y de CD44S, no se muestran afectados. En el panel III de la Figura 7, se ilustra un pictograma en gel de agarosa que muestra los niveles de expresión de un transcrito CD44V10 en diferentes condiciones experimentales (“RT” Reacción en transcriptasa inversa; “NT” Células no transfectadas; “NR” siRNA no pertinente; moléculas de CD44V3 siRNA #1-#3- siRNA con las respectivas secuencias enumeradas en la tabla 6). Como se muestra en la Figura 7, panel III, la expresión de los niveles de CD44V10 en presencia de al menos dos de los siRNA se reducen de manera significativa en mientras la expresión de los niveles de ARNm en los controles de gel de actina y de CD44S, no se muestran afectados. El análisis de cuantificación presentado en la Tabla 7 del Ejemplo 6 muestra que las moléculas son capaces de reducir de manera significativa la expresión del ARNm de las diversas variantes de CD44.

[0091] La técnica de antisentido se utiliza generalmente para atenuar y/o inhibir la expresión de una diana (puede incluir moléculas de ARN o ADN como, por ejemplo, la molécula de ARNm) y puede implicar interacciones de ARNARN, ARN-ADN, triple hélice, ribozimas y efecto mediado RNasa H. Las moléculas de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido) son por lo general una sóla cadena de molécula de ácido nucleico que, tras la hibridación con bases complementarias en una molécula de ARN o ADN (la diana), puede atenuar y/o inhibir la expresión de la diana que puede incluir, por ejemplo, un gen específico, una molécula de ARNm y similares. Las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden prepararse de forma sintética o codificada por un gen recombinante para la expresión en la célula. De entre algunos de los ejemplos de oligonucleótidos sintéticos pueden incluir oligonucleótidos que contienen fosforotioatos, fosfotriésteres, metilfosfonatos, alquilo de cadena corta, enlaces de inter-azúcar cicloalquilo, o enlaces inter-azúcar heteroatómico de cadena corta o de inter-azúcar heterocíclico. Pueden también utilizarse enlaces de nitrógeno o grupos que contienen nitrógeno para preparar imitadores de oligonucleótidos. Se incluyen también fosforamidato y compuestos oligoméricos de fosforotioamidato, donde los oligonucleótidos tienen esqueletos de morfolina. Se puede usar un esqueleto de ácido nucleico peptídico (PNA), en el que el esqueleto de fosfodiéster del oligonucleótido se puede reemplazar por un esqueleto de poliamida, estando unidas las bases directa o indirectamente con átomos de nitrógeno aza del esqueleto de poliamida. Otros oligonucléicos sintéticos pueden contener restos de azúcar sustitutos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, O(CH2)NH2 o O(CH2)NH3 donde n en las posiciones de 1 a 10; alquilo inferior C1 a C10 , sustituto alquilo inferior, alcarilo o aralquilo; CI; Br; CN; CF3 ; O--;S--, o N-alquil; O--;S--; o N-alquenil; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2;; N2; NH2; heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalcalamino, polialquilamino, sustituto sililo, un resto fluorescente, grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes con propiedades similares. Los oligonucleótidos pueden también tener imitadores de azúcares tales como ciclobutilo u otros carbocíclicos en lugar del grupo pentofuranosilo. Se pueden preparar moléculas antisentido como, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido dirigidos contra los diversos transcritos de las variantes de CD44, tales como CD44V3, y/o CD44V6, y/o CD44V10. Los oligonucleótidos antisentido pueden dirigirse contra diversas regiones de la secuencia del ARNm de los diferentes transcritos de las variantes de CD44 para garantizar el éxito de atenuación/silenciamiento de la expresión de CD44V3, CD44V6, CD44V10 y cualquier combinación de estos. El uso de oligonucleótidos antisentido se realiza en condiciones celulares favorables incluyendo una óptima temperatura y condiciones de tampón como, por ejemplo, las descritas en Du L. et. al., PNAS, 2007, 104: 6007-12; Hua et. al., PloS Biol. 2007, 5:e73).

[0092] Los oligonucleótidos dirigidos contra las diferentes regiones de las secuencias de los transcritos de las variantes de CD44, tales como, CD44V3, CD44V6, CD44V7, CD44S y/o CD44V10, que están diseñados para atenuar (regulación a la baja) la expresión de estos transcritos, pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Como se ha descrito anteriormente y en el Ejemplo 6, los oligonucleótidos pueden incluir, por ejemplo, moléculas de siRNA. Se presenta por lo tanto, un método de tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas en un paciente incluyendo la administración de una composición que comprende un reactivo capaz de atenuar la expresión de ARN codificado por un ácido nucleico, donde se selecciona el ácidonucleico de un grupo consistente en: SEC ID NÚM 1, SEC ID NÚM 3, SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas. El reactivo puede incluir, por ejemplo, uno o varios polinucleótidos capaces de hibridarse con dicho ácido nucleico. Uno o varios polinucleótidos pueden incluir ADN, ARN, siRNA o cualquier combinación de estos. Por ejemplo, el reactivo puede incluir uno o varios SME como, por ejemplo, un modulador vía MAP quinasas (MAPK/ERK), un modulador de PKC y similares. Por ejemplo, el método puede incluir la introducción de ácido nucleico antisentido y/o una molécula de siRNA dirigida hacia el ARN (ARNm) de las diversas variantes de CD44, tales como, CD44V3, CD44V6, CD44V7 y/o CD44V10 en un paciente, en una célula del paciente o en un organismo con enfermedad neurodegenerativa, manteniendo la célula o el organismo introducido con el oligonucleótido en condiciones que favorezcan la interacción de los oligonucleótidos con el ARNm diana de las diferentes variantes de corte y empalme de CD44, y verificando la regulación a la baja de la expresión de las distintas variantes de corte y empalme de CD44, CD44V3, CD44V6, CD44V7, CD44V10, CD44S o cualquier combinación de estas, tratando de este modo la enfermedad neurodegenerativa.

[0093] Pueden identificarse entidades moleculares pequeñas (SME) que pueden afectar (modular) la actividad y/o la expresión de las distintas variantes de corte y empalme de CD44. Las entidades moleculares pequeñas pueden incluir cualquier molécula o sustancia para que pueda interactuar con las variantes de corte y empalme de CD44 y perturbar la interacción de la variante de CD44 con sus ligandos fisiológicamente relevantes. Por ejemplo, se puede desarrollar SME in silico, utilizando el hardware y software apropiados conocidos en la disciplina para identificar sustancias. Se puede desarrollar SME, por ejemplo, mediante la exploración in vivo e in vitro de bibliotecas químicas para las entidades moleculares capaces de interactuar con las variantes de corte y empalme de CD44. Por ejemplo, la unión de las variantes de corte y empalme de CD44, tales como CD44V3, CD44V6 y/o CD44V10 con el ligando fisiológico del ácido hialurónico y sus derivados se puede evaluar por la presencia o ausencia de SME. Del mismo modo, la interacción de CD44V3, CD44V6, y/o CD44V10 se puede probar por la presencia o ausencia de SME dudosas. SME identificadas de este modo pueden usarse para afectar (modular) la actividad y/o la expresión de las diversas variantes de corte y empalme de CD44. Por ejemplo, las SME pueden ser utilizadas como antagonistas de las variantes de corte y empalme de CD44. Por ejemplo, las SME pueden ser utilizadas como agonistas de las variantes de corte y empalme de CD44. Por ejemplo, las SME pueden incluir cualquier molécula o sustancia que pueda afectar (modular) directa o indirectamente la expresión de las distintas variantes de CD44. Por ejemplo, las SME pueden incluir un inhibidor y/o activador que puede disminuir (atenuar) directa o indirectamente y/o aumentar el nivel de la expresión de las diferentes variantes de CD44.

[0094] Por ejemplo, se ha demostrado que la vía MAP quinasa (MAPK/ERK) puede estar implicada en la regulación del splicing alternativo de CD44 (Weg-Remers et. al., EMBO J. 2001, 20: 4194-203). La implicación de la vía MAPK en el splicing alternativo de CD44 en células de origen neuronal se detalla en el Ejemplo 7 y se muestra en la Figura 8. Los cultivos celulares en 34 células madre neuronales de ratón, que se derivan de la fusión de neuronas motoras de la médula espinal embrionaria y de células de neuroblastoma, fueron cultivados y bien se dejaron sin tratar o bien se trataron con un inhibidor de MEK U0126. Los niveles de expresión de ARNm de las variantes de CD44 se detectaron mediante RT-PCR. Como se muestra en la Figura 8, la modulación (por inhibición) de la vía MAP quinasa por U0126, causa una reducción significativa de exones en la variante de corte y empalme de CD44. Como se muestra en la Figura 8, panel A, los niveles de ARNm de CD44S no cambian en presencia del inhibidor (“+” calle derecha) si se compara con los niveles de expresión de CD44V3, en ausencia del inhibidor (“-” calle central). Como se muestra en la Figura 8, panel B, los niveles de ARNm de CD44V3 se reducen en presencia del inhibidor (“+” calle derecha) si se compara con los niveles de expresión de CD44V3, en ausencia del inhibidor (“-” calle central). Como se muestra en la Figura 8, panel C, los niveles de ARNm de CD44V7 se reducen en presencia del inhibidor (“+” calle derecha) si se compara con los niveles de expresión de CD44V7, en ausencia del inhibidor (“-” calle central). Como se muestra en la Figura 8, panel D, los niveles de ARNm de CD44V5 se reducen en presencia del inhibidor (“+” calle derecha) si se compara con los niveles de expresión de CD44V5, en ausencia del inhibidor (`“” calle central). Como se muestra en la Figura 8, panel E, los niveles de ARNm de CD44V10 se reducen en presencia del inhibidor (“+” calle derecha) si se compara con los niveles de expresión de CD44V10, en ausencia del inhibidor (“-” calle central). Además, como se muestra en la Figura 8, el panel F es un control, lo que demuestra la falta de efecto del inhibidor U0126 en la expresión del gen de control, actina. También, la posición de la calle izquierda de los paneles A-F es un control negativo realizado en ausencia de la enzima RT (“-RT”). Por lo tanto, las moléculas pequeñas, que son conocidas para modular la vía MARK/ERK, pueden utilizarse además para la modulación de splicing alternativo de CD44 en células neuronales.

[0095] Los reactivos descritos anteriormente en este documento, que están diseñados para modular (por regulación a la baja (atenuación) y/o por aumento) la expresión y/o actividad de las diversas variantes de corte y empalme de CD44 destinadas al tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa de un paciente como, por ejemplo, las moléculas siRNA, pueden proporcionarse al paciente tal y como están o pueden ser parte de una composición farmacéutica donde se mezcla con un portador y excipientes farmaceúticamente aceptables. Las moléculas de siRNA se pueden introducir, además, por ejemplo, en una célula, en un tejido y similares del paciente. Los reactivos y/o las composiciones farmacéuticas que los contienen se pueden proporcionar por cualquier vía de administración conocida. Los reactivos pueden también presentarse en un envase o en un dispositivo dispensador, como un kit. Además, los reactivos pueden también administrarse en combinación con otros ingredientes activos.

[0096] Los reactivos descritos anteriormente en este documento, que están diseñados para detectar y cuantificar la expresión y los productos de las diversas variantes de corte y empalme de CD44, pueden proporcionarse en forma de kit. Por ejemplo, el kit puede incluir un kit para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa. El kit puede incluir al menos un reactivo capaz de detectar la expresión de un ácido nucleico en una muestra biológica,donde el ácido nucleico puede incluir la SEC ID NÚM 1, SEC ID NÚM 3, SEC ID NÚM 5, SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas. El reactivo puede incluir, por ejemplo, un oligonucleico capaz de hibridar con el ácido nucleico

o con una molécula de ARN codificada por el ácido nucleico. Por ejemplo, el kit puede incluir al menos un reactivo capaz de detectar la expresión de un polipéptido en una muestra biológica, donde el polipéptido puede incluir lasSEC ID NÚM 2, SEC ID NÚM 4, SEC ID NÚM 6, SEC ID NÚM 8 o cualquier combinación de estas. El reactivo puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo adaptado para interactuar de manera específica con el polipéptido y para formar inmunocomplejos detectables con el polipéptido.

[0097] Se pueden preparar constructos recombinantes como, por ejemplo, vectores de expresión, que pueden incluir secuencias de codificación de las diversas variantes de corte y empalme de CD44, como las secuencias de codificación de CD44V3, CD44V6, CD44V7 o CD44V10. Los constructos pueden incluir un vector como un vector plásmido o viral, en el que se inserta con una orientación inversa o directa la secuencia de nucleótidos de las variantes de corte y empalme de CD44. Además, el constructo puede incluir secuencias reguladoras como un promotor. Los constructos pueden además incluir secuencias de codificación adicionales de proteínas diversas no relacionadas y/o péptidos que pueden insertarse en un marco antes o después de las secuencias de nucleótidos de las variantes de corte y empalme de CD44. Las secuencias de nucleótidos de las variantes de corte y empalme de CD44 introducidas en un vector pueden incluir la secuencia codificadora íntegra o solo una secuencia parcial del transcrito de la variante de corte y empalme de CD44. La selección de los vectores y la construcción de los constructos recombinantes pueden realizarse por cualquiera de los métodos conocidos en la disciplina. Se pueden utilizar constructos recombinantes, por ejemplo, para obtener la expresión de las distintas variantes de corte y empalme de CD44, tales como CD44V3, CD44V6 o CD44V7 y/o CD44V10 en diversos sistemas biológicos con fines experimentales, de diagnóstico y/o terapéuticos. [0098] Mientras que se ha discutido anteriormente un número de realizaciones y aspectos ejemplarizantes, los expertos en la materia reconocerán ciertas modificaciones, permutaciones, adiciones y subcombinaciones de los mismos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 – La expresión de CD44V3, CD44V6 y CD44V10 en el hipocampo de pacientes con EA y control normal.

[0099] Se extrajo ARN total de muestras congeladas del hipocampo aisladas post mórtem de pacientes con EA y controles normales. (Kit de ARN EZ, Beit Haemek). A continuación, se utiliza el ARN en un análisis de RT-PCR semicuantitativo. En primer lugar, se sometió el ARN a la reacción en trascriptasa inversa (RT). La transcripción inversa se realizó con 5U de transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen). Las mezclas de reacción se incubaron durante 1 h a 42 ºC. Los pasos de la RCP se realizaron en un incubador controlado por un microprocesador usando 1μl de las reacciones de RT en un volumen de reacción de 20μl, conteniendo 200μM de dNTPs, 1,25 U de ADN polimerasa Thermoprime Plus (ABgene) y 0,5 mM de cebadores:

V3_F: 5´-TGACCACACAAAACAGAACCA-3´ C6_R: 5´-CCCATGTGAGTGTCCATCTG-3´ C5_F: 5´-GAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC-3´ V6_R: 5´-GGGTAGCTGTTTCTTCCGTTG-3´ C5V10_F: 5´-GACAGAATCCCTGCTACCAATAGG-3´ V10C6_R: 5´-GGAATGTGTCTTGGTCTCCTGAT-3´

[0100] Se llevaron a cabo 42 ciclos para ampliaciones, cada uno consistente en 1 min a 94 ºC, 1 min a 55 ºC y 1 min a 72 ºC. Además, se incluyeron cebadores para actina en la reacción de la RCP para la normalización de los resultados. Se purificaron los productos de ampliación a partir del gel de agarosa (QlAquick gel extraction Kit, Qiagen) y se secuenció uno de los cebadores utilizados en la reacción de la PCR. La secuencia de los datos se analizó utilizando BlatsN ejecutado en secuencias de referencia de bases de datos humanas y genómica (RefSeq NCBI).

[0101] Los resultados de la RT-PCR semicuantitativa se resumen en la Tabla 1. La columna de la izquierda de la Tabla 1 indica la cantidad de los exones variables y de los enlaces de unión a los exones constantes validados por secuenciación. El nivel de expresión de los diferentes productos de la RCP se determinó por la intensidad de banda relativa observada en el gel de agarosa. El nivel de expresión relativa se indica mediante el número de signos + (1, 2 y 3), representando expresiones débiles, moderadas o fuertes, respectivamente. 0 para la observación de ninguna banda (es decir, sin expresión) y ND para una reacción sin ejecutar.

Tabla 1:

Exones variables

Pacientes con EA Pacientes normales

Paciente Núm

1 2 3 4 5 11 12 13 14 15

V2

0 0 ++ ++ 0 0 0 0 0 0

V2-V3

0 0 0 ++ ++ 0 0 0 0 0

V3-C6

++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ 0

C5-V3

++ ++ ++ ++ ++ 0 0 0 + +

C5-V4

0 0 0 ++ ++ 0 0 0 0 0

C5-V4-V5

0 + + + 0 + + 0 + 0

V6-V7

+ 0 0 ++ 0 0 0 0 0 0

V6-C6/C5-V6

++ ++ ++ ++ ++ + 0 0 + 0

C5-V7

0 0 0 ++ 0 0 0 0 0 0

V7-V8-C6

0 0 0 ++ + 0 0 +++ 0 0

V6-V7-V8

0 0 0 ++ 0 0 0 0 0 0

C5-V6-V10-C6

0 0 0 ++ 0 ++ 0 0 0 0

V8-C6

++ 0 0 ++ 0 0 0 ++ + 0

V8-V9-C6

0 0 0 + 0 0 0 0 ++ 0

V8-V9-V10-C6

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C5-V10-C6

+++ ++ ++ ++ ++ + + + + +

Ejemplo 2 - Expresión de CD44s, CD44V3, CD44V6 y CD44V10 en cerebros con EA comparados con los controles normales mediante RCP en tiempo real.

[0102] Se extrajo ARN total a partir de muestras congeladas del hipocampo aisladas post mórtem de pacientes con EA (n= 10) y controles normales (n= 10) usando el kit de ARN EZ (Beit Haemek). Se determinó la concentración de ARN total usando el espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). 1,5 μg de ARN de cada muestra se transcribe de forma inversa utilizando Bioscript transcriptasa inversa (Bioline), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las mezclas de reacción se incubaron durante 1 h a 42 ºC. El reactivo Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) se emplea para la Q-PCR con 500 nM de cebadores. Se lleva a cabo una curva estándar (en seis concentraciones de grupos de ADNc por duplicado) en cada par de cebadores para confirmar la linealidad de la reacción de la Q-PCR y transformar los valores experimentales de la Ct con los valores relativos de expresión. El programa de ciclo de la RCP en tiempo real es de la siguiente manera: 50 ºC, 2 min, 95 ºC, 2 min, luego 40 ciclos de 95 ºC durante 15 seg y 60 ºC durante 34 seg. Todas las reacciones de la Q-PCR se ejecutan en el Sistema de RCP en Tiempo Real Applied Biosystems (ABI). [0103] Los datos indican el aumento significativo de la expresión de CD44S, CD44V3, CD44V6 y CD44V10 en pacientes con EA si se comparan con los controles normales semejantes en edad y sexo.

Tabla 2: expresión relativa de las variantes CD44S y CD44 como ratio GAPDH en pacientes con EA y controles normales.

Variables:

EA Normal EA/Ratio normal Valor P (t-test)

CD44S

2,33 0,47 4,95 0,035

V3

1,22 0,2 7,17 0,008

V6

3,65 0,52 7,02 0,002

V10

8,35 0,46 18,15 0,007

[0104] Para caracterizar la expresión de la variante CD44V7 en una patología similar a EA, los ratones que expresan APP751 humana, contiene mutaciones London (V717I) y Swedish (K670M/N671L), (ambas mutaciones se encontraron asociadas con la familia de EA) y se usan bajo la regulación del promotor Thy-1 murino. Los ratones que expresan APP751 desarrollan placas amiloides en el neocórtex y en el hipocampo a los 4 o 6 meses, mostrando un déficit de memoria a partir de los 6 meses. Se aíslan tejidos del hipocampo de hembras y camadas de ratones transgénicos que expresan APP751 desde los 7,o 7,5 meses. Se extrae el ARN usando RNA-EZ (Beit Haemek). Se transcriben de forma inversa las cantidades iguales en ADNc utilizando 5U de transcriptasa inversa SuperScript II (invitrogen). Las mezclas de reacción se incuban durante 1 h a 42 ºC. El paso de las CRPs semicuantitativas se preforman en un incubador controlado por un microprocesador con 1 μl de volumen de la reacción de RT de 20 μl, conteniendo 200 μM de dNTPs, 1,25U de ADN polimerasa Thermoprime plus (Larova) y 0,5 μM de oligonucleótido de la siguiente lista:

C3F: 5´-TCTGTGCAGCAAACAACACA C6R: 5´-CCCATGTGAGTGTCCATCTG V7F: 5´-TGTTTCCTGGACAGATTTCTTCG Actina F: 5´-CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG Actina R: 5´ CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT

[0105] El programa de ciclo de paso para la RCP incluye la desnaturalización a 94 ºC durante 30 segundos, la hibridación a 58 ºC durante 30 segundos y la extensión a 72 ºC durante 30 segundos para 42 ciclos (para CD44V7), 32 ciclos (para la amplificación de CD44S) o 25 ciclos (para �-Actina, usada como gen de referencia). Las intensidades de banda de los productos de la PCR se ejecutan en el de agarosa y se cuantifican usando el software de TotalLab. Se observó un incremento de 7,2 veces en la expresión de ARNm que contiene un transcrito de una unión de V7C10 en ratones que expresan APP751 si se compara con ratones no transgénicos. Se observó un aumento del 16% en CD44S en condiciones similares.

Ejemplo 4 – Expresión de CD44V3, CD44V6 y CD44V10 en la columna vertebral y en la corteza motora en pacientes con ELA y control normal

[0106] Se obtuvieron tejidos del Human Brain and Spinal Fluid Ressource Centre (CA, USA). Se extrajo el ARN de la columna vertebral y de la corteza motora de pacientes con ELA así como de sujetos coincidentes en edad y sexo de los controles normales. El ARN se utiliza en una reacción RT-PCR semicuantitativa como se detalla en el Ejemplo

1. Los resultados de la RT-PCR realizados en muestras de ARN obtenidas de la corteza motora y la columna vertebral de pacientes con ELA y control normal se presentan en la Tabla 3. En la columna de la izquierda de la Tabla 3 se indica la identidad de los exones variables y los enlaces de unión a los exones constantes validados por secuenciación. El nivel de expresión de los diferentes productos de la RCP se determinó por la intensidad de banda relativa observada en el gel de agarosa. El nivel de la expresión relativa se indica mediante el número de signos + (1, 2 y 3), representando expresiones débiles, moderadas o fuertes, respectivamente. 0 para la observación de ninguna banda (es decir, sin expresión) y ND para una reacción sin ejecutar.

Tabla 3:

Corteza motora

Exones variables

Pacientes de ELA Controles normales

Paciente núm

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD44S

++ ++ +++ ++ ++ + ++ ++ 0

V3-C6

0 + 0 0 0 0 0 + 0

V6-C6

0 + 0 0 0 0 0 + 0

C5-V10

C5-V10-C6

Columna vertebral

Exones variables

Pacientes de ELA Controles normales

Paciente núm

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD44S

++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++

C5-V3

0 +++ ++ ++ +++ 0 ++ ++ ++

V3-C6

+ +++ +++ +++ +++ 0 0 +++ +

C5-V3-C6

0 + ++ ++ + 0 0 + +

V5-C6

0 +++ 0 0 0 0 0 0 0

C5-V6

0 ++ +++ +++ +++ 0 0 0 +++

V6-C6

0 ++ +++ +++ +++ 0 0 0 +++

C5-V6-C6

0 +++ + +++ +++ 0 0 0 ++

V7-V8-V9-V10

0 0 ++ ++ +++ 0 0 0 0

V6-V7-V8-V9-V10

0 0 + ++ ++ 0 0 0 0

C5-V10

0 ++ + ++ +++ 0 0 0 0

C5-V10-C6

+ +++ +++ +++ +++ + + + +

Ejemplo 5 – Análisis inmunocitoquímico en las variantes de corte y empalme de CD44 en cerebros de pacientes con EA [0107] Se prepararon secciones de 8 μm a partir de tejidos del hipocampo fijados en formalina fija y embebidos en parafina (Banco cerebral de Holanda). Los anticuerpos primarios se utilizan en contra de CD44 (HCAM, clon de rata IM7, Santa Cruz), CD44V3 (monoclonal de ratón vff-327, ABcam), CD44V6 (policlonal de conejo, Chemicon) y CD44V10 (policlonal de conejo, Chemicon). Los anticuerpos secundarios se utilizan en contra de las especies relevantes conjugadas con peroxidasa de rábano, complejo Envisión® (Dako), sustrato: diaminobenzidina (DAB). Los controles negativos son sueros de control de isotipos emparejados para los anticuerpos policlonales de conejo en un conejo no inmune al suero con la misma concentración de proteína que el anticuerpo primario y para los anticuerpos de ratón en un control múltiple de isotipos (Dako). Para el anticuerpo de rata fue un control de isotipos emparejados con la misma concentración de proteína que en el anticuerpo primario. La Tabla 4 resume los resultados de la tinción inmunohistoquímica.

[0108] La tinción inmunohistoquímica revela diferenciales celulares y localizaciones subcelulares. Considerando que los CD44S se encuentran principalmente en los astrocitos y en las placas seniles, la tinción de las variantes de CD44 se encuentra en las neuronas de las regiones paranucleares intracitoplasmáticas.

Tabla 4: Localización celular de las proteínas variables de CD44S

Antígeno

Áreas evaluadas Localización celular

CD44S

Formación del hipocampo* 1. Placas, tinción en paleocorteza adyacente al hipocampo. Están presentes áreas discretas con fibras fuertemente inmunorreactivas que se asemejan a las placas seniles. Se tiñen unas cuantas somas neuronales en placas, rara vez en otros lugares. 2. La materia blanca está difusamente teñida con tinción típica perivascular para astrocitos.

CD44V3

Formación del hipocampo 1. Neuronas: intracitoplasmática- solapamientos en la región de lipofuscina 2. Astrocitos, mayoritariamente materia blanca

CD44V6

Formación del hipocampo 1. Neuronas: intracitoplasmática- solapamientos en la región de lipofuscina 2. Tinción de materia blanca (astrocito)

CD4410

Formación del hipocampo Neuronas: intracitoplasmática- solapamientos en la región de lipofuscina

* Incluye la formación del hipocampo y estructuras adyacentes como el subículo y la corteza entorrinal.

Ejemplo 6 – Experimentos desmontables del siRNA de la expresión de CD44 en células humanas

[0109] Varias moléculas de siRNA dirigidas contra las diversas variantes de CD44 se diseñaron utilizando parámetros bien establecidos y sus secuencias se enumeran a continuación en la Tabla 5. Las células HeLa ( 15x104 células cultivadas en placas de 6 pocillos el día anterior) se transfectaron con los diferentes siRNA (IDT), en una concentración final de 10nM usando Lipofectamine ARNi Max (Invitrogen) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Como control negativo, se dejan células transfectadas (NT) o se transfectan a siRNA no relevante (NR) marcado con TYE 563 en su extremo final 5´, la secuencia de las cuales no tiene ninguna homología significativa de cualquier ARNm humano conocido. Las células transfectadas con siRNA de CD44V6 se privaron de suero durante 24 h tras la transfección y de la renovación del mismo durante 8 h más [como se describe, por ejemplo, en Cheng et. al., Genes Dev. (2006) 20:1715-20]. Como control positivo, para esta variante, la secuencia de siRNA utilizada por Cheng et. al., se utiliza como referencia (siRNA Nº2). [0110] Se aísla el ARN total a partir de las células HeLa 48 h después de la transfección utilizando ARN-EZ (Beit Haemek) y cantidades iguales de ARN total se transcribieron de forma inversa en ADNc utilizando 5U de transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). Las mezclas de reacción se incuban durante 1 h a 42 ºC. El paso de la RCP semicuantitativa se preforma en un incubador controlado por microprocesador con 1 μl de volumen de reacción de RT de 20 μl, conteniendo 200 μM de dNTPs, 1,25U ADN polimerasa Thermoprime plus (Larova) y 0,5 μM de oligonucleótido de la siguiente lista:

C3F: 5´-TCTGTGCAGCAAACAACACA C6R: 5´-CCCATGTGAGTGTCCATCTG V3R: 5´-AGCCTGCTGAGATGGTATTTGA V6R: 5´-GGGTAGCTGTTTCTTCCGTTG V10R: 5´-TCTTCCACCTGTGACATCATTC Actina F: 5´-CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG Actina R: 5´ CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT

[0111] El programa de ciclo de paso para la PCR incluye la desnaturalización a 94 ºC durante 30 seg, la hibridación a 58 ºC durante 30 seg y la extensión a 72 ºC durante 30 seg para 42 ciclos (amplificación de V3, V6 y V10), 32 ciclos (para la amplificación de CD44S) o 25 ciclos (para �-Actina, usada como gen de referencia). Para más cuantificación de los datos, las intensidades de las bandas se cuantificaron usando software de TotalLab. Se presentan los resultados de la cuantificación en la Tabla 6, mostrando los ratios entre las variantes de CD44 y �-Actina (gen de control), normalizado a las células sin transfectar (NT). [0112] Un reducción significativa (>80%) en el nivel de expresión del ARNm de CD44S, CD44V3, CD44V6 y CD44V10 se observó como resultado de la co-expresión de al menos un nuevo siRNA dirigido contra cada una de las isoformas de CD44.

Tabla 5: Secuencias de siRNA (dirección 5´ a 3´) dirigidas contra diversas variantes de CD44. Todos los nucleótidos en las secuencias de siRNA son ribonucleótidos excepto para los nucleótidos seguidos de la letra d, que son desoxirribonucleótidos

Variante de CD44

# Sentido Antisentido

1

AGAUGAAAGAGACAGACACCUCAdGdT ACUGAGGUGUCUGUCUCUUUCAUCUUC

CD44V3

2 CUGGAUCAGGCAUUGAUGAUGAUdGdA UCAUCAUCAUCAAUGCCUGAUCCAGAA

3

GCAUUGAUGAUGAUGAAGAUU UCUUCAUCAUCAUCAAUGC

1

ACAACGGAAGAAACAGCUACCCAGA UCUGGGUAGCUGUUUCUUCCGUUGUAC

CD44V6

2 GCAACUCCUAGUAGUACAAdTdT UUGUACUACUAGGAGUUGCdTdT

3

ACAGATGGCATGAGGGATAUU UAUCCCUCAUGCCAUCUGUUU

1

GCAGGACCUUCAUCCCAGUGACCdTdC GAGGUCACUGGGAUGAAGGUCCUGCUU

CD44V10

2 CUACUUUACUGGAAGGUUA UAACCUUCCAGUAAAGUAGUU

3

GUUGGAGAUUCCAACUCUAUU UAGAGUUGGAAUCUCCAACAG

NR

CUUCCUCUCUUUCUCUCCCUUGUdGdA UCACAAGGGAGAGAAAGAGAGGAAGGA

Tabla 6: Análisis de cuantificación del efecto de siRNA en diversas variantes de CD44

NT

NR Núm 1 Núm 2 Núm 3

CD44V3/Actina

1 1 0,05 0,16 1,47

CD44V6/Actina

1 1,4 0 0 1,1

CD44V10/Actina

1 1,2 1,61 0 0

Ejemplo 7 – Modulación del splicing alternativo de CD44 mediante una vía quinasa MAPK/ERK en células de origen neuronal

[0113] Para probar la implicación de la vía ERK en el splicing alternativo de CD44 en células de origen neuronal, se utilizan 34 células madre neuronales de ratón que se derivan de la fusión de neuronas motoras de la médula espinal embrionaria y de células de neuroblastoma. Cultivos celulares de 34 células madre neuronales (15x104 células cultivadas en placas de 6 pocillos el día anterior) se dejaron sin tratar o se trataron con 10 μM de inhibidor MEK U0126 (Sigma) durante 6 horas. El ARN total se aisló de las células utilizando el kit de ARN-EZ (Beit Haemek) y las cantidades iguales de ARN se transcribieron de forma inversa en ADNc usando 5U de transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen). Se incubaron las mezclas de reacción durante 1 h a 42 ºC. Los pasos de la PCR semicuantitativa se preforman en un incubador controlado por microprocesador usando 1 μl de volumen de reacción de RT de 20 μl, conteniendo 200 μl de dNTPs, 1,25U de ADN polimerasa Thermoprime plus (ABgene) y 0,5 μM de cebador, de los siguientes:

C5F: 5´-GAGCACCCCAGAAAGCTACATT-3 C7R: 5´-CCAGAAGTTGTGGTCACTCCAC-3 V3R: 5´-ATCATCAATGCCTGATCCAGA-3 V5F: 5´-CCACAGCCTCCTTTCAATAACC-3 V7F: 5´-TGTTTCCTGGACAGATTTCTTCG-3 V10F: 5´-TCTGGGTATTGAAAGGTGTAGCC-3 Actina F: 5´-CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3 Actina R: 5´ CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3

[0114] El programa de ciclo de paso para la PCR incluye la desnaturalización a 94 ºC durante 30 seg, la hibridación a 58 ºC durante 30 seg y la extensión a 72 ºC durante 30 seg para 42 ciclos (amplificación de V3, V6 y V10), 32 ciclos (para la amplificación de CD44S). La PCR de control de actina se preforma para la normalización de los resultados. Como puede verse en la Figura 8, paneles B-E, la inhibición de la vía ERK por U0126 (calle derecha, ”=”), lleva a una reducción significativa del splicing de exones de la variante de CD44.

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LISTA DE SECUENCIAS

[0116]

<110> Pinner Elhanan, Laudon Moshe, Zisapel Nava

<120> Variantes de corte y empalme de CD44 en enfermedades neurodegenerativas

<130> P-9919-PC

<150> US 60/929, 706

<151> 2007-07-10

<160> NUMERO DE LA SEC ID NÚM 8

<210> SEC ID NÚM 1

<211> LONGITUD: 1212

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 1

<210> SEC ID NÚM 2

<211> LONGITUD: 403

<212> TIPO: PRT

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 2

<210> SEC ID NÚM 3

<211> LONGITUD: 1215

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 3

<210> SEC ID NÚM 4

<211> LONGITUD: 404

<212> TIPO: PRT

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 4

<210> SEC ID NÚM 5

<211> LONGITUD: 1218

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 5 <210> SEC ID NÚM 6

<211> LONGITUD: 405

<212> TIPO: PRT

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 6

<210> SEC ID NÚM 7

<211> LONGITUD: 1290

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 7

<210> SEC ID NÚM 8

<211> LONGITUD: 429

<212> TIPO: PRT

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA 8

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para diagnosticar o controlar en un paciente una enfermedad neurodegenerativa, comprendiendo la detección del nivel de expresión de un ácido nucleico en una muestra biológica del paciente, donde dicho ácido nucleico se compone de una secuencia homóloga de una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, almenos, un 90% de homóloga y al menos 20 nucleótidos en las coordenadas 639-822 de la SEC ID NÚM 1; en lascoordenadas 639-825 de la SEC ID NÚM 3, en las coordenadas 639- 828 de la SEC ID NÚM 5 o en las coordenadas 639-900 de la SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas, donde un elevado nivel de expresión de dicho ácido nucleico es indicativo de enfermedad neurodegenerativa y donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

2. 2.

   Un método, según la reivindicación 1, en que dicha enfermedad neurodegenerativa comprende: Esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), Esclerosis lateral primaria (ELP), Atrofia muscular espinal (AME) o cualquier combinación de estas.

3. 3.

   Un método según la reivindicación 1, en que dicho nivel de expresión se detecta mediante la determinación del nivel de expresión de un ácido ribonucleico (ARN) codificada por dicho ácido, comprendiendo además, preferiblemente, el aislamiento del ARN de la muestra biológica antes de la detección de dicho nivel de ARN expresado por dicho ácido nucleico; o preferiblemente en que dicho nivel de expresión del ARN se detecta por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por PCR en transcriptasa inversa (RT-PCR), Nothern blot, PCR en tiempo real o cualquier combinación de estos, o preferiblemente en el que dicho nivel de expresión de ARN se detecta por hibridación a un oligonucleótido, aún más preferiblemente en el que dicho oligonucleótido comprende ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido desoxirribonucleico complementario al ARN (ADNc), ADN genómico, oligonucleótido sintético o cualquier combinación de estos.

4. 4.

   Un método para diagnosticar y controlar en un paciente la enfermedad neurodegenerativa, comprendiendo la detección de la expresión de un polipéptido en una muestra biológica del paciente, en que dicho polipéptido se selecciona de un grupo consistente en una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% dehomología y, al menos, 10 aminoácidos en las coordenadas 214-274 de la SEC ID NÚM 2; en las coordenadas214-275 de la SEC ID NÚM 4, en las coordenadas 214- 276 de la SEC ID NÚM 6 o en las coordenadas 214-300 de la SEC ID NÚM 8 o cualquier combinación de estas, donde un elevado nivel de expresión de dicho polipéptido es indicativo de enfermedad neurodegenerativa y donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

5. 5.

   Un método según la reivindicación 4, en que dicha enfermedad neurodegenerativa comprende:

   Esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), Esclerosis lateral primaria (ELP), Atrofia muscular espinal (AME) o cualquier combinación de estas.

6. 6.

   Un método según la reivindicación 4 en que dicha detección comprende la detección de inmunocomplejos de dicho polipéptido y un anticuerpo adaptado para unirse específicamente a dicho polipéptido, preferiblemente en la que dicha detección de inmunocomplejos comprende: Western blot, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), o cualquier combinación de estos, o, preferiblemente en el que dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o cualquier combinación de estos.

7. 7.

   El uso de un reactivo capaz de modular la expresión del ácido ribonucleiclo uboniclaico (ARN) codificado por un ácido nucleico por uno o más ARN pequeños de interferencia (siRNA) para la preparación de una composición para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa, en el que dicho siRNA comprende una secuencia híbrida de un primer polinucleótido con una secuencia de un segundo polinucleótido complementaria a dicha primera secuencia de polinucleótidos y en la que dicha primera secuencia de polinucleótidos es un tramo contiguo que tiene, al menos, 15 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, al menos, un90% de homología y, al menos, 20 nucleótidos en las coordenadas 639-822 de la SEC ID NÚM 1; ; en lascoordenadas 639-825 de la SEC ID NÚM 3, en las coordenadas 639-828 de la SEC ID NÚM 5 o en lascoordenadas 639-900 de la SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas, donde dicho ácido nucleico se selecciona del grupo consistente en una secuencia de nucleótidos contigua que tiene, al menos, un 90% dehomología y, al menos, 20 nucleótidos de: SEC ID NÚM1, SEC ID NÚM 3, SEC ID NÚM 5, SEC ID NÚM 7 o cualquier combinación de estas.

8. 8.

   El uso de un reactivo capaz de modular la expresión y/o la actividad de un polipéptido para la preparación de una composición para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa, donde la secuencia de dicho polipéptido se selecciona de un grupo consistente en una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y, al menos, 10 aminoácidos en las coordenadas 214-274 de la SEC ID NÚM 2; en lascoordenadas 214-275 de la SEC ID NÚM 4, en las coordenadas 214- 276 de la SEC ID NÚM 6 o en lascoordenadas 214-300 de la SEC ID NÚM 8 o cualquier combinación de estas, en el que dicho reactivo

   comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o cualquier combinación de estos adaptados para unirse específicamente a dicho polipéptido.

9. 9.

   El uso de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología para las coordenadas nucleótidas 639-825 de la SEC ID NÚM 3, 639-696 de la SEC ID NÚM 3 o769-825 de la SEC ID NÚM 3 para el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad neurodegenerativa en una muestra biológica, donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

10. 10 . El uso de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% dehomología para las coordenadas aminoácidas 214-275 de la SEC ID NÚM 4, 214-232 de la SEC ID NÚM 4, o 257-275 de la SEC ID NÚM 4 para el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad neurodegenerativa en una muestra biológica, donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

11. 11.

    El uso de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, al menos, un90% de homología para las coordenadas nucleótidas 639-828 de la SEC ID NÚM 5, 639-696 de la SEC ID NÚM5 o 772-828 de la SEC ID NÚM 5 para el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad neurodegenerativa en una muestra biológica, donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

12. 12.

    El uso de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% dehomología para las coordenadas aminoácidas 214-276 de la SEC ID NÚM 6, 214-232 de la SEC ID NÚM 6, 258276 de la SEC ID NÚM 6 para el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad neurodegenerativa en una muestra biológica, donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

13. 13.

    El uso de un Kit en el método de diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, dicho kit comprende al menos un reactivo capaz de detectar la expresión de un ácido nucleico en una muestra biológica, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y,al menos, 20 nucleótidos en las coordenadas 639-822 de la SEC ID NÚM 1; en las coordenadas 639-825 de la SEC ID NÚM 3, en las coordenadas 639-828 de la SEC ID NÚM 5 o en las coordenadas 639-900 de la SEC IDNÚM 7 o cualquier combinación de estas, en el que al menos uno de dichos reactivos comprende un oligonucleótido capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico o con una molécula de ácido ribonucleico (ARN) codificada por dicho ácido nucleico, preferiblemente donde dicho ácido oligonucleótido comprende ADN, ARN, ADNc, ADN genómico, oligonucleótidos sintéticos o cualquier combinación de estos y donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

14. 14.

    El uso de un kit de la reivindicación 13, en la que dicha enfermedad neurodegenerativa comprende: Esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), Esclerosis lateral primaria (ELP), Atrofia muscular espinal (AME) o cualquier combinación de estas.

15. 15.

    El uso de un Kit en un método de diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, dicho kit comprende al menos un reactivo capaz de detectar la expresión de un polipéptido en una muestra biológica, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene, al menos, un 90% de homología y, almenos, 10 aminoácidos en las coordenadas 214-274 de la SEC ID NÚM 2; en las coordenadas 214-275 de la SEC ID NÚM 4, en las coordenadas 214- 276 de la SEC ID NÚM 6 o en las coordenadas 214-300 de la SEC IDNÚM 8 o cualquier combinación de estas, en el que, al menos, un reactivo comprende un anticuerpo adaptado para interactuar específicamente con dicho polipéptido y para formar inmunocomplejos detectables, en el que dicho anticuerpo comprende preferiblemente un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o cualquier combinación de estos y donde dicha muestra biológica es una muestra de hipocampo, columna vertebral, corteza motora y líquido cefalorraquídeo.

16. 16.

    El uso de un kit de la reivindicación 15, en la que dicha enfermedad neurodegenerativa comprende: Esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), Esclerosis lateral primaria (ELP), Atrofia muscular espinal (AME) o cualquier combinación de estas.