ES2426717T3 - Variantes de fitasa de Hafnia - Google Patents

Abstract

Método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradascon respecto a la estabilidad térmica según se determina a 75° C, midiendo la actividad con respecto a la actividadmáxima, con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución,inserción o deleción y no más de 30 modificaciones en una o varias de las posiciones: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76,77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325,346, 363, 369, 396 y 403, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 deSEQ ID N.º:2. El método comprende a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera por la cual el ADN o el gen codificanpara dicha sustitución, inserción y/o deleción, b) conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de lafitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresiónrecombinante, c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado, d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y e) recuperación de la fitasa.

Description

Variantes de fitasa de Hafnia

5 Referencia para el listado de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en soporte informático.

Campo de la invención

10 [0002] La presente invención se refiere a una fitasa que tiene al menos 90% de identidad con una fitasa derivada de Hafnla alvei, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en el listado de secuencias anexo como SEQ ID N.º: 2 y comprende al menos una modificación tal y como se define en las reivindicaciones anexas 1 a 10 en comparación con esta fitasa (es decir, es una variante de la misma). La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas,

15 constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden los polinucleótidos al igual que métodos de su producción, al igual que su uso, por ejemplo, en alimento para animales y aditivos de alimento para animales.

Antecedentes de la invención

20 Estado de la técnica

[0003] Las fitasas son enzimas bien conocidas, como lo son las ventajas de añadirlas a productos alimenticios para animales, incluidos seres humanos. Las fitasas se han aislado de muchas fuentes, incluidas varias cepas fúngicas y 25 bacterianas.

[0004] Un objeto de la presente invención es proporcionar polipéptidos alternativos con actividad de fitasa (fitasas) y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos. Las variantes de fitasa de la invención exhiben propiedades modificadas

o alteradas preferiblemente mejoradas en comparación con la fitasa progenitora. Ejemplos no limitativos de tales

30 propiedades son: estabilidad (tal como estabilidad del ácido, estabilidad térmica, estabilidad de vapor, estabilidad de granulación y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina), perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, rendimiento en alimento para animales (tal como una liberación y/o degradación mejoradas de fitato), susceptibilidad para glicación y/o modelo de glicosilación.

35 [0005] Se conocen varias estructuras tridimensionales de fitasas del tipo fosfato de ácido de histidina (HAP). (por ejemplo, Lim et al. Nature struct. biol. 7, 108-113 (2000). Estas fitasas están estructuralmente relacionadas, pero hay diferencias bastante grandes en las secuencias de aminoácidos.

[0006] PCT/EP2008/053561 divulga la secuencia de aminoácidos de la fitasa HAP de tipo salvaje de Hafnia alvei DSM

40 19197 (es decir, SEQ ID N.º:2 en la presente), como SEQ ID N.º:10 en PCT/EP2008/053561. La estructura tridimensional de la fitasa HAP de tipo salvaje de Hafnia alvei DSM 19197 también es descrita en PCT/EP2008/053561. La estructura se corresponde correctamente con las estructuras conocidas.

[0007] Es un objeto de la invención proporcionar fitasas de propiedades modificadas, preferiblemente, mejoradas en 45 comparación con la fitasa progenitora o de referencia de las cuales éstas fueron derivadas.

Resumen del listado de secuencias

[0008] En el listado de secuencias, SEQ ID N.º:1 y 2 proporcionan ADN y secuencias de aminoácidos para la fitasa de 50 Hafnia alvei DSMZ 19197.

Resumen de ejemplos

[0009] En la especificación se proporcionan los siguientes ejemplos:

55 Ejemplo 1: preparación de variantes y determinación de actividad Ejemplo 2: actividad específica Ejemplo 3: estabilidad de temperatura Ejemplo 4: termoestabilidad

Ejemplo 5: perfil de temperatura

Ejemplo 6: perfil de pH

Ejemplo 7: estabilidad de vapor

Ejemplo 8: actividad residual de glicación

Ejemplo 9: pruebas de estabilidad de granulación

Ejemplo 10: rendimiento en el alimento para animales en un modelo in vitro para pollo para consumo

Ejemplo 11: rendimiento en una prueba de cerdo in vivo Resumen de la invención

[0010] La presente invención se refiere a un método para producir una variante de la fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica según se determina a 75° C, por actividad de medición con respecto a la actividad máxima, con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, caracterizada por el hecho de que dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción y no más de 30 modificaciones en unas o varias de las posiciones: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403, caracterizada por el hecho de que las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2. El método comprende a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera que por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción, b) la conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante, c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado, d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y e) recuperación de la fitasa.

[0011] El método de la invención específicamente se refiere a la producción de una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora en la cual las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones: 8L,C,M,Y; 32Q,I,L; 33C,N; 41T,Q; 54C,G; 66C; 72A; 76R,V,N; 77K,G,W,Q; 78G,R,K,Q,S,T; 93P,E,N; 95P,A; 101C; 109D,G; 111R,K,S; 131R,Q; 139C, R; 143C,V; 148R; 150C; 152A,G,T,I; 163P,K; 176C,Q,R; 179C,L,W; 187E; 201C,G,V; 207N,L,Q,R; 234L,R,C,V,E; 239R,K; 242S; 259C; 293R,K,N; 294L; 325C,K; 346S,T; 363C,R,K,V; 369S,D; 370C; 396D,E,K y 403N.

[0012] La invención así también se refiere a un método para producir una fitasa que tiene al menos 90 % de identidad con los residuos de aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2 y que comprenden al menos una modificación en al menos una posición seleccionada entre las siguientes: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403 y al menos otra modificación en al menos una posición seleccionada entre las siguientes: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403, con la condición de que la fitasa no sea la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2.

[0013] La invención también se refiere a un método para producir una fitasa que tiene al menos 90 % de identidad con los residuos de aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2 y donde las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones: 8L,C,M,Y; 32Q,I,L; 33C,N; 41T,Q; 54C,G; 66C; 72A; 76R,V,N; 77K,G,W,Q; 78G,R,K,Q,S,T; 93P,E,N; 95P,A; 101 C; 109D,G; 111R,K,S; 131R,Q; 139C,R; 143C,V; 148R; 150C; 152A,G,T,1; 163P,K; 176C,Q,R; 179C,L,W; 187E; 201 C,G,V; 207N,L,Q, R; 234L,R,C,V,E; 239R,K; 242S; 259C; 293R,K,N; 294L; 325C,K; 346S,T; 363C,R,K,V; 369S,D; 370C; 396D,E,K y 403N.

[0014] Las variantes de fitasa producidas por la invención muestran propiedades modificadas o preferiblemente alteradas con respecto a la estabilidad térmica, caracterizadas por el hecho de que dicha estabilidad térmica según se determina a 75° C, por medición de la actividad con respecto a la actividad máxima, es superior a la estabilidad térmica de la fitasa de SEQ ID N.º:2.

[0015] La invención además se refiere a una variante de fitasa con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2 y con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica, caracterizadas por el hecho de que dicha estabilidad térmica según se determina a 75° C, por medición de la actividad con respecto a la actividad máxima, es superior a la estabilidad térmica de la fitasa de SEQ ID N.º:2 y producid por un método como se ha indicado anteriormente con la condición de que la fitasa no sea la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2.

[0016] La invención también se refiere a ADN que codifica estas fitasas, constructos de ADN, vectores de expresión y huéspedes recombinantes que comprenden estos, métodos de su producción, al igual que el uso de los mismos, por ejemplo, en el alimento para animales y aditivos de pienso alimento animales.

Descripción detallada de la invención

[0017] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia progenitora, con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica según se determina a 75° C, por actividad de medición con respecto a la actividad máxima, con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, caracterizada por el hecho de que dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción y no más de 30 modificaciones en una o varias de las posiciones: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403, caracterizada por el hecho de que las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2. El método comprende a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera que por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción, b) la conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante, c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado, d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y e) recuperación de la fitasa.

[0018] El porcentaje de identidad se determina como se describe en la sección "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad".

[0019] Los números de posición se refieren a la numeración de posición de la SEQ ID N.º:2, como se describe en la sección "Numeración de posición." Las posiciones correspondientes a estos números de posición SEQ ID N.º:2 en otras fitasas se determinan como se describe en la sección "Identificación de los números de posición correspondientes."

[0020] La fitasa de la invención es una variante de la fitasa de la SEQ ID N.º:2, a saber, no es idéntica a la SEQ ID N.º:2, puesto que comprende al menos una modificación en comparación con la SEQ ID N.º:2.

[0021] En una forma de realización particular, la fitasa de la invención comprende al menos una de las siguientes modificaciones: 8L,C,M,Y; 32Q,I,L; 33C,N; 41T,Q; 54C,G; 66C; 72A; 76R,V,N; 77K,G,W,Q; 78G,R,K,Q,S,T; 93P,E,N; 95P,A; 101C; 109D,G; 111R,K,S; 131R,Q; 139C,R; 143C,V; 148R; 150C; 152A,G,T,I; 163P,K; 176C,Q,R; 179C,L,W; 187E; 201C, G,V; 207N,L,Q,R; 234L,R,C,V,E; 239R,K; 242S; 259C; 293R,K,N; 294L; 325C,K; 346S,T; 363C,R,K,V; 369S,D; 370C; 396D,E,K y 403N.

[0022] La nomenclatura usada en este documento para las modificaciones se describe en detalle en la sección "Modificacones, tales como sustituciones, deleciones, inserciones".

[0023] La invención también comprende una variante de fitasa con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2 y con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica, caracterizada por el hecho de que dicha estabilidad térmica según se determinaa 75° C, por actividad de medición con respecto a la actividad máxima, es superior a la estabilidad térmica de la fitasa de SEQ ID N.º:2 y producida según el método indicado arriba con la condición de que la fitasa no sea la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2.

[0024] Preferiblemente la fitasa de la invención que muestra termoestabilidad mejorada comprende al menos una de las siguientes modificaciones: 8C, 33C 35C, 36C, 54C, 63C, 66C, 101C, 139C, 143C, 201C, 150C, 172C, 176C, 177C, 178C, 179C, 224C, 228C, 236C, 259C, 325C, 326C, 331C, 343C, 358C, 363C, 368C, 370C, 374C. Específicamente esta comprende conjuntos de modificaciones seleccionadas entres las siguientes: 8C/343C, 139C/201C, 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C, 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 8C/343C en combinación con 139C/201C, 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 139C/201C en combinación con 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 179C/33C en combinación con 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 178C/33C en combinación con 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 172C/35C en combinación con 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 177C/36C en combinación con 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C,

66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 176C/36C en combinación con 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 143C/201C en combinación con 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 5 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 54C/101C en combinación con 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 63C/368C en combinación con 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 66C/370C en combinación con 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 10 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 224C/236C en combinación con 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 150C/259C en combinación con 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 331 C/326C en combinación con 358C/325C, 228C/363C o 368C/374C. La invención también comprende tales combinaciones como 358C/325C en combinación con 228C/363C o 368C/374C. La invención

15 también comprende tales combinaciones como 228C/363C en combinación con 368C/374C.

[0025] En otras formas de realización para mejorar la termoestabilidad, la fitasa comprende una modificación seleccionada entre las siguientes: 93P y 95P.

20 [0026] La fitasa también puede comprender una modificación seleccionada entre las siguientes: 8L, 32Q, 41T, 54G, 77K, 78G, 93E, 109D, 176Q, 207N, 363R y 369S.

[0027] La fitasa también puede comprender una modificación seleccionada entre las siguientes: 78R,K, 93E, 111R,K, 239R, 293R,K y 363R,K.

25 [0028] La fitasa también puede comprender una modificación seleccionada entre las siguientes: 76R, 131 R, 139R, 148R, 176R, 179L, 187E, 207L y 234R,.

[0029] En formas de realización preferidas adicionales, la fitasa comprende las siguientes combinaciones de 30 modificaciones: 54C/55E/101 C, 33C/178E/179C y 33C/175S/176Q/178E/179C

[0030] La fitasa de la invención puede ser una variante de cualquier fitasa variante o de tipo salvaje.

[0031] Específicamente para la fitasa de SEQ ID N.º:2, se incluyen las siguientes modificaciones específicas:

35 V130L/M137L/V146I/I201V/ M260L/I266V/E54C/A101C/K207Q, D33C/E54C/A101C/Y179C E54C/A101C/K139C/I201C/K207Q, E54C/A101C/K139C/I201C,

40 S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/G186S/I201C/K207Q/G346S, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/ R289W/H363R, T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H 363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/ H363R,

45 E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R, E54C/D92Y/A101C/K139C/I201 C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H36 3R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R,

50 Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/Q162R/Q181L/I201 C/A217G/K234V/P34 8R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R, D92Y/E100W/K139C/D173N/P175S/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,

55 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/V208T/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R,

60 Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R, y Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R. La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 3-11.

5 [0032] La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos indicada más arriba, vectores de expresión recombinantes que comprenden los constructos de ácidos nucleicos y células huésped recombinantes que comprenden los constructos de ácidos nucleicos y/o los vectores de expresión anteriores.

10 [0033] La invención también se refiere a composiciones que comprenden al menos una fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 3-11 y

(a)

al menos una vitamina fitosoluble;

(b)

al menos una vitamina soluble en agua y/o

(c)

y/o al menos un oligoelemento.

15 [0034] La invención también se refiere a tales composiciones que además comprenden al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o beta-glucanasa. Tales composiciones pueden ser aditivos de alimento para animales.

20 [0035] La invención también se refiere a un método para producir un producto de fermentación, que comprende (a) fermentación usando un microorganismo fermentador de un material que contiene carbohidrato en presencia de una fitasa de cualquiera de reivindicaciones 3-11 y (b) producción del producto de fermentación o coproducto de fermentación del carbohidrato fermentado que contiene material.

25 [0036] Dicho producto de fermentación puede ser etanol, cerveza, vino, o granos de destilería desecados (DDG por sus siglas en inglés).

Estrategia para preparar variantes

30 [0037] La estructura de la fitasa de H. alvei DSM 19197 (aminoácidos 1 a 413 de SEQ ID N.º:2) se describe en PCT/EP2008/053561.

[0038] La estructura fue sometida a simulaciones de dinámica molecular (DM) y cálculos electroestáticos. Las posiciones para puentes disulfuro putativos y prolinas fueron también identificadas, así como otras posiciones de 35 importancia potencial en lo que respecta a las diversas propiedades enzimáticas deseables. Finalmente, los sitios de glicosilación putativa (tramos de NXT o NXS) fueron identificados.

[0039] Todas estas sugerencias fueron evaluadas dentro del marco de la estructura modelada y los resultados de la simulación, para la propiedad de termoestabilidad con énfasis particular al final de temperatura alta.

40 [0040] Las variantes de fitasa correspondientes fueron preparadas a través de métodos conocidos en la técnica y evaluadas como se describe en la parte experimental.

Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad

45 [0041] En el presente contexto, una fitasa es un polipéptido con actividad de fitasa, es decir, una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (mioinositol hexakisfosfato) a (1) mioinositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico.

50 [0042] En el presente contexto el término sustrato de fitasa abarca, por ejemplo, ácido fítico y cualquier fitato (sal de ácido fítico), así como los fosfatos listados en el punto (2) más arriba.

[0043] El sitio web de ENZYME en internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativa a la nomenclatura de enzimas. Está basado principalmente en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la

55 Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la cual se ha proporcionado un número EC (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Véase también el manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBBM, 1992).

[0044] Según el sitio web de ENZYME, se conocen tres diferentes tipos de fitasas: una fitasa denominada 3-fitasa 60 (nombre alternativo 1-fitasa; una mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8), una fitasa denominada 4-fitasa (nombre alternativo 6-fitasa, nombre basado en el sistema de numeración 1L y no en la numeración 1D, EC 3.1.3.26) y

una fitasa denominada 5-fitasa (EC 3.1.3.72). Para los fines de la presente invención, los tres tipos se incluyen en la definición de fitasa.

[0045] En particular, las fitasas de la invención pertenecen a la familia de fosfatasas ácidas histidina (HAP), que incluye la fosfatasa ácida de pH 2, 5 de Escherichia coli (gen appA) así como fitasas fúngicas tales como fitasas A y B de Aspergillus awamorii (EC: 3.1.3.8) (gen phyA y phyB). Las fosfatasas ácidas histidina comparten dos regiones de similitud de secuencia, cada una centrada alrededor de un residuo de histidina conservada. Estas dos histidinas parecen estar implicadas en el mecanismo catalítico de las enzimas. La primera histidina está localizada en la sección N-terminal y forma una histidina de fósforo intermedia mientras la segunda está localizada en la sección C-terminal y posiblemente actúa como donante de protón.

[0046] En particular, las fitasas de la invención tienen un motivo de sitio activo conservado, a saber, R-H-G-X-R-X-P, caracterizado por el hecho de que X designa cualquier aminoácido (véanse los aminoácidos 18 a 24 de la SEQ ID N.º: 2).

[0047] Para los fines de la presente invención, la actividad de fitasa se determina en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgánico por min. bajo las siguientes condiciones: pH 5, 5; temperatura 37°C; sustrato: fitato de sodio (C6 H6 O24 P6 Na12 ) en una concentración de 0, 0050 mol/l. Ensayos de

fitasa adecuados son los ensayos FYT y FTU descritos en el Ejemplo 1 de WO 00/20569. FTU es para determinar la actividad de fitasa en el alimento para animales y premezclas. La actividad de fitasa también puede ser determinada usando los ensayos del Ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de la fosfatasa” o "Determinación de la actividad de la fitasa").

[0048] En particular, las fitasas pueden estar aisladas. El término "aislada" como se utiliza en este caso se refiere a un polipéptido que es al menos un 20% puro, preferiblemente al menos un 40% puro, más preferiblemente al menos un 60% puro, incluso aún más preferiblemente al menos un 80% puro, de la forma más preferible al menos un 90% puro, e incluso aún más preferible al menos un 95% puro, según lo determinado por SDS-PAGE. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptido esté esencialmente liberada de otro material de polipéptido con el cual está originalmente asociada. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación tradicional.

[0049] La relación entre dos secuencias de aminoácidos es descrita por el parámetro "identidad". Para fines de la presente invención, la alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineación global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización por abertura de espacio es 10 y la penalización por extensión de espacio es 0,5.

[0050] El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención") y la secuencia de aminoácidos a la que se hace referencia en las reivindicaciones (SEQ ID N.º:2) se calcula como el número de coincidencias exactas en una alineación de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención, " o la longitud de la SEQ ID N.º:2, la que sea más corta. El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

[0051] Una coincidencia exacta ocurre cuando la "secuencia de la invención" y la SEQ ID N.º:2 tienen residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de la superposición (en el ejemplo de alineación más abajo esto está representado con "I" ). La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos en la secuencia (por ejemplo, la longitud de los aminoácidos 1-413 de la SEQ ID N.º:2 es 413).

[0052] Para obtener una explicación más detallada, se hace referencia a WO 2007/112739 en la página 7, línea 24 a página 8, línea 5.

[0053] En formas de realización particulares de la fitasa de la invención, el grado de identidad con SEQ ID N.º:2 es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99%. En otras formas de realización particulares adicionales, el grado de identidad es al menos 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o al menos 99,9%.

[0054] También, la fitasa de la invención no tiene más que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o no más de 10 modificaciones en comparación con SEQ ID N.º:2 no más de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o no más de 20 modificaciones en comparación con SEQ ID N.º:2 no más de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o no más de 30 modificaciones en comparación con SEQ ID N.º:2.

Numeración de posición

[0055] La nomenclatura usada en este documento para definir las posiciones de aminoácidos se basa en la secuencia de aminoácidos de la fitasa derivada de Hafnia alvei DSM 19197, cuya secuencia madura se da en el listado de 5 secuencia como la SEQ ID N.º:2 (aminoácidos 1-413 de la SEQ ID N.º:2). Por consiguiente, en el presente contexto, la base para numerar posiciones es SEQ ID N.º:2 comenzando con S1 y finalizado con P413.

[0056] Cuando en este documento se usa el término parte (o secuencia) "madura", se refiere a la parte del polipéptido que es segregada por una célula que contiene, como parte de su equipamiento genético, un polinucleótido que codifica 10 el polipéptido. En otras palabras, la parte madura del polipéptido se refiere a la parte del polipéptido que permanece después de que la parte de péptido señal, así como una parte de propéptido, si la hay, ha sido escindida. La parte de péptido señal puede ser predicha por programas conocidos en la técnica (por ejemplo, SignalP). La SEQ ID N.º:2 es la parte madura prevista. Generalmente, el primer aminoácido de la parte madura de una enzima se puede determinar mediante la secuenciación N-terminal de la enzima purificada. Cualquier diferencia entre la parte de péptido señal y la

15 parte madura debe entonces deberse a la presencia de un propéptido.

Modificaciones, tal como sustituciones, deleciones, inserciones

[0057] Una variante de fitasa puede comprender varios tipos de modificaciones en relación a un molde (es decir, una

20 fitasa de referencia o progenitora, o una secuencia de aminoácidos comparativa tal como la SEQ ID N.º:2): un aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido; un aminoácido puede ser eliminado; un aminoácido puede ser insertado entre dos residuos; al igual que cualquier combinación de cualquier número de modificaciones de este tipo. En el presente contexto, el término "inserción" tiene como objetivo abarcar también las extensiones N- y/o C-terminal.

25 [0058] La nomenclatura general usada en este documento para una única modificación es la siguiente: XDcY, donde "X" e "Y" designan independientemente un código de aminoácido de una sola letra, o un "*" (deleción de un aminoácido), "D" designa un número y "c" designa un contador alfabético (a, b, c, etcétera) , que únicamente está presente en inserciones. Se hace referencia a la Tabla 1 a continuación que describe ejemplos puramente hipotéticos de la aplicación de esta nomenclatura para varios tipos de alteraciones.

30 Tabla 1 Ejemplos de nomenclatura

Tipo

Descripción Ejemplo

Sustitución

X=Aminoácido en molde D=Posición en el molde c vacío Y=Amino ácido en la variante G80A

Inserción

X="*" D=Posición en el molde antes de la inserción c="a" para primera inserción a esta posición, "b" para siguiente, etc. *80aT *80bY *85aS

Deleción

X=Aminoácido en molde D=Posición en el molde c vacío Y="*" V81*

Extensión N-terminal

Inserciones en la posición "0". *0aA *0bT *0cG

Extensión C-terminal

Inserciones después aminoácido N-terminal del *275aS *275bT

[0059] Como se explica más arriba, el número de posición ("D") se cuenta a partir del primer residuo de aminoácido de la SEQ ID N.º:2.

[0060] Las diferentes alteraciones en la misma secuencia se separan por "/" (barra), por ejemplo, la designación"1*/2*/3*" significa que los aminoácidos en el número de posición 1, 2 y 3 se eliminan todos y la designación "104A/105F" significa que el aminoácido en el número de posición 104 se sustituye por A y el aminoácido en el número de posición 105 se sustituye por F.

[0061] Las alteraciones alternativas se separan por ", " (coma) , por ejemplo, la designación "119R, K" significa que el aminoácido en la posición 119 se sustituye por R o K.

[0062] Las comas usadas en este documento en otras varias enumeraciones de posibilidades significan lo que estas normalmente hacen gramaticalmente, a saber, frecuentemente y/o. Por ejemplo, la primera coma en el listado "53V, Q, 121 D y/o 167Q" denota una alternativa (V o Q), mientras que las dos comas siguientes deberían ser interpretadas como opciones y/o: 53 V o 53Q y/o 121 D y/o 167Q.

[0063] En el presente contexto, "por lo menos uno" (por ejemplo, modificación) significa uno o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones; o 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28 o 30 modificaciones. Las variantes de fitasa de la invención, no obstante, todavía deben ser por lo menos un 74% idénticas a la SEQ ID N.º:2, siendo determinado este porcentaje como se ha descrito anteriormente.

[0064] Una sustitución o extensión sin ninguna indicación de con qué sustituir o extender se refiere a la inserción de cualquier aminoácido natural, o no natural, excepto el que ocupa esta posición en el molde.

Identificación de los números de posición correspondientes

[0065] Como se ha explicado anteriormente, la fitasa madura de Hafnia alvei DSM 19197 (SEQ ID N.º:2) se usa como el estándar para la numeración de posición y, de ese modo, también para la nomenclatura.

[0066] Para otra fitasa, en particular una variante de fitasa de la invención, la posición correspondiente a la posición D en la SEQ ID N.º:2 se encuentra alineando las dos secuencias como se ha especificado anteriormente en la sección titulada "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad". A partir de la alineación, la posición en la secuencia de la invención correspondiente a la posición D de la SEQ ID N.º:2 se puede identificar claramente y sin ambigüedad (las dos posiciones en la parte superior de cada una en la alineación).

[0067] A continuación, se incluyen algunos ejemplos adicionales, puramente hipotéticos, que se derivan de la anterior Tabla 1 que incluye en la tercera columna varias alineaciones de dos secuencias:

[0068] Nótese la tercera celda en la primera fila de la Tabla 1: la secuencia superior es el molde, la inferior es la variante. El número de posición 80 se refiere al residuo de aminoácido G en el molde. El aminoácido A ocupa la posición correspondiente en la variante. Por consiguiente, esta sustitución es designada G80A.

[0069] Nótese ahora la tercera celda en la segunda fila de la Tabla 1: la secuencia superior es otra vez el molde y la inferior, la variante. El número de posición 80 se refiere de nuevo al residuo de aminoácido G en el molde. La variante tiene dos inserciones, a saber, TY, después de G80 y antes de V81 en el molde. Mientras que la T y la Y, por supuesto, tendrían su propio número de posición "real" en la secuencia de aminoácidos variante, para los fines presentes siempre se hace referencia a los números de posición de molde y por consiguiente, se dice que la T y la Y están en el número de posición 80a y 80b, respectivamente.

[0070] Finalmente, nótese la tercera celda en la última fila de la Tabla 1: el número de posición 275 se refiere al último aminoácido del molde. Se dice que una extensión C-terminal de ST está en el número de posición 275a y 275b, respectivamente, aunque, nuevamente, por supuesto tienen su propio número de posición "real" en la secuencia de aminoácidos variante.

Propiedades modificadas, referencia o fitasa progenitora

[0071] Las fitasas de la invención tiene propiedades modificadas o, preferiblemente, mejoradas. Los términos "alterado”, modificado" y "mejorado" implican una comparación con otra fitasa. Ejemplos de otras fitasas de referencia,

10 progenitoras o comparativas son: SEQ ID N.º:2 y/o otras fitasas con una identidad de secuencia con SEQ ID N.º:2 superior a 90, 95 o 98%.

[0072] Ejemplos no limitativos de propiedades que son modificadas, preferiblemente mejoradas, son los siguientes: termoestabilidad, estabilidad de vapor, estabilidad de granulación, perfil de pH, actividad específica, rendimiento en el

15 alimento para animales, sensibilidad de proteasa y/o modelo de glicosilación. La fitasa de la invención tiene una estabilidad térmica mejorada.

Rendimiento térmico

20 Estabilidad de temperatura

[0073] La estabilidad de temperatura se puede determinar como se describe en el ejemplo 3 determinando la actividad residual tras la incubación durante 30 minutos a temperaturas de 70° C a 80° C.

25 Termoestabilidad

[0074] La termoestabilidad se puede determinar como se describe en el Ejemplo 4, es decir, usando mediciones de calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) para determinar la temperatura de desnaturalización, Td, de la proteína de fitasa purificada. La Td es indicativa de la termoestabilidad de la proteína: cuanto más alta sea la

30 Td, más alta será la termoestabilidad. Por consiguiente, en una forma de realización preferida, la fitasa de la invención tiene una Td que es superior a la Td de una fitasa de referencia, donde la Td se determina en las muestras de fitasa purificada (preferiblemente con una pureza de al menos 90% o 95%, determinado por SDS-PAGE).

Estabilidad térmica

35 [0075] La estabilidad térmica se puede determinar como se describe en el ejemplo 5 determinando el perfil de temperatura/actividad de las fitasas variantes.

Estabilidad de vapor

40 [0076] La estabilidad de vapor se puede determinar como se describe en el ejemplo 7 determinando la actividad residual de las moléculas de fitasa después tratamiento de vapor a 85°C o 90°C durante un tiempo breve.

Estabilidad de granulación,

45 [0077] Estabilidad de granulación se puede determinar como se describe en el ejemplo 9 usando granulado enzimático premezclado con alimento para animales. Esta premezcla se mezcla con alimento para animales. Del mezclador la alimento para animales se acondiciona con vapor a 95° C. Después de la preparación, el alimento para animales se prensa en gránulos y se determina la actividad residual.

50 [0078] Preferiblemente las propiedades térmicas tales como estabilidad térmica, estabilidad de temperatura, termoestabilidad, estabilidad de vapor y/o estabilidad de granulación según se proporcionan por la actividad residual, la Td u otro parámetro de la fitasa de la invención es superior al valor correspondiente, como la actividad residual o Td, de la fitasa de SEQ ID N.º:2, más preferiblemente al menos 101% del mismo, o al menos 102%, 103%, 104%, 105%,

55 106%, 107%, 108%, 109% o al menos 110% del mismo. Incluso más preferiblemente, el valor del parámetro, tal como actividad residual o Td, de la fitasa de la invención es al menos 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180% o al menos 190% del valor para la fitasa de SEQ ID N.º:2.

[0079] La fitasa de la invención preferiblemente tiene una temperatura de fusión, Tm (o una temperatura de desnaturalización, Td), como se determina usando calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) como se describe en los Ejemplos (es decir. en 20 mM de acetato sódico, pH 4,0), de al menos 50° C. Aún más, la Tm es al menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62,5. 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99 o al menos 100° C. Las mediciones de DSC también se pueden realizar como se describe en los Ejemplos.

[0080] La estructura descrita en ePCT/EP2008/053561 fue usada para identificar posiciones que se seleccionan para modificación. La estructura fue también comparada con otras estructuras de fitasa HAP conocidas para el mismo fin.

[0081] Usando simulaciones de Dinámica Molecular para analizar movilidades a altas temperaturas, se identificó que las siguientes posiciones para modificación proporcionan propiedades térmicas mejoradas: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 37, 38, 39, 40, 41, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 91, 108, 109, 110, 111, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 131, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 144, 145, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 163, 175, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190, 193, 194, 196, 198, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 285. 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 319, 320, 322, 324, 343, 344, 345, 346, 347, 364, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372, 373, 375, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 396, 397, 400, 403, 404, 408, 409, 412 y 413.

[0082] Concretamente se propone que las modificaciones en algunas de estas posiciones son seleccionadas de las siguientes: 8L,C,M,Y, 9K,P,S, 26R,Q,H, 27A, 28A, 29P,R,K,A, 30P,L, 32Q,I,L, 33C,N, 37D,R,K, 38A, 41T,Q, 69E,L, 70E, 72A, 74S, 75A, 76R,V,N, 77K,G,W,Q, 78G,R,K,Q,S,T, 79L, 81E, 82S, 83G, 109D,G, 111R,K,S, 117A,Q, 118A,N,E,P,T, 119D,K,E, 120G,L,I, M, 121A,S,T,G,K, 122A,S,T,K, 131R,Q, 132T,V, 134V, 138N,V, 139C,R, 140P, 144R, 148R, 150C, 151D, 152A,G,T,I, 160G, 163P,K, 175N,S 178C,E 179C,L,W, 181L, 185R,K, 186S,T, 187E, 190N, 193R, 198E, 201C,G,V, 202A,K, 203Y, 206G,T,A, 207N,L,Q,R, 234L,R,C,V,E, 235P, 236C, 239R,K, 242S, 243P, 244P, 285D, 286T, 287P, 288P, 289W, 293R,K,N, 294L, 319L, 320N, 343C, 344K, 346S,T, 347R, 365K, 366T, 369S,D, 370C, 382S,T, 383N, 396D,E,K 403N y 411S.

[0083] Sobre la base de las comparaciones con otras fitasas conocidas, se identificó que las siguientes posiciones son capaces de proporcionar propiedades térmicas mejoradas, tales como termoestabilidad: 12, 16, 48, 49, 54, 55, 77, 93, 100, 103, 128, 130, 136, 137, 173, 176, 195, 209, 211, 215, 219, 221, 227, 228, 248, 251, 258, 260, 261, 310, 313, 314, 316, 318, 335, 354, 356, 360, 362, 363, 374, 376, 378 y 411.

[0084] De las comparaciones concretamente se indica que las sustituciones deberían ser elegidas entre las siguientes 12S, 16V, 48W, 49L, 54G, 55E, 77K, 93E, 100W, 103A, 128N, 130L, 1360,137L, 173N, 1760,195L, 209S, 211T, 215S, 219M, 221T, 2270, 2280,248T, 251S, 258Y, 260L, 261Q, 310L, 313L, 314G, 316A, 318E, 335E, 354L, 356F, 360Q, 362M, 363R, 374P, 376E, 378K y 411S.

[0085] En relación con variantes producidas de la fitasa de SEQ ID N.º:2 las modificaciones deberían ser elegidas de las siguientes: K12S, L16V y48W, I49L, E54G, H55E, D77K, Q93E, L103A, H128N, V130L, S136Q, M137L, D173N, K1760, M195L, A209S, E211T, G215S, T219M, A221T, E227Q, H228Q, S248T, K251S, D258Y, M260L, S261Q, I310L, I313L, S314G, M316A, G318E, A335E, M354L y356F, A360Q, L362M, H363R, A374P, S376E, R378K y/o Q411S.

[0086] En formas de realización particulares, caracterizadas por el hecho de que los puentes disulfuro se crean en la molécula, se prevé una termoestabilidad mejorada de las siguientes variantes de una fitasa con al menos 76% identidad para residuos de aminoácidos 2-413 de SEQ ID N.º:2: 8C/343C, 139C/201C, 179C/33C, 178C/33C, 172C/35C, 177C/36C, 176C/36C, 143C/201C, 54C/101C, 63C/368C, 66C/370C, 224C/236C, 150C/259C, 331C/326C, 358C/325C, 228C/363C y 368C/374C.

[0087] De forma similar, una termoestabilidad mejorada es también prevista de la sustitución de residuos de prolina por los residuos existentes en posiciones seleccionadas. Este se prevé de las siguientes variantes de fitasa: 29P.30P, 93P, 95P, 140P, 163P, 235P, 243P, 244P, 284P, 287P, 288P, 316P y 360P. Específicamente para modificaciones en la SEQ ID N.º:2, las siguientes modificaciones deberían mejorar la termoestabilidad: Q29P, T30P, Q93P, K95P, S140P, A163P, V235P, E243P, Q244P, S284P, T287P, S288P, M316P y A360P.

[0088] También, la optimización de residuos cargados es capaz de mejorar las propiedades térmicas, como la termoestabilidad. La optimización se refiere a las interacciones de carga de carga en la superficie de la molécula de fitasa.

[0089] A continuación, se presentan tres grupos de sustituciones para modificar las fitasas progenitora o de referencia con al menos 90% de identidad con los residuos de aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2 con residuos como se indica.

Los residuos cuya carga puede ser invertida, los residuos cambiados a una carga negativa y los residuos para ser cambiados a una carga positiva son:

Inversión de carga

5 D111 R,K, K251 D,E y D293R,K.

Cambio a negativo

Q69E, Q70E, T81E, Q93E, N119D, Q230E, Q245E, P348D,E, L395E y S396D,E.

10 Cambio a positivo Q9R, Q29R,K, H37R,K, L59R,K, N78R,K, H115R,K, I185R,K, N239R y H363R,K.

Perfil de temperatura/Estabilidad de temperatura

15 [0090] Si una fitasa de la invención tiene o no un perfil de temperatura modificada en comparación con una fitasa de referencia, se puede determinar como se describe en el Ejemplo 5. Por consiguiente, una fitasa de la invención tiene un perfil de temperatura modificada en comparación con una fitasa de referencia, caracterizado por el hecho de que el perfil de temperatura se determina como actividad de fitasa como una función de temperatura en el fitato de sodio a pH 5,5 en el intervalo de temperatura de 20-90° C (en pasos de 10° C). Un tampón preferido es en un tampón de 0,25 M de

20 Na-acetato pH 5,5. La actividad a cada temperatura es indicada preferiblemente como actividad relativa (en %) normalizada al valor a temperatura óptima. La temperatura óptima es la temperatura dentro de las temperaturas evaluadas (es decir, aquellas con saltos de 10° C) donde la actividad es máxima.

Perfil de pH

25 [0091] Si una fitasa de la invención tiene o no un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia se puede determinar como se describe en los Ejemplos. Por consiguiente, una fitasa de la invención tiene un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia, caracterizada por el hecho de que el perfil de pH se determina como actividad de fitasa como una función de pH en fitato de sodio a 37° C en el intervalo pH de 2, 0 a 7, 5 (en pasos

30 de unidad de pH de 0,5). Un tampón preferido es un cóctel de 50 mM de glicina, 50 mM de ácido acético y 50 mM de Bis-Tris. La actividad en cada pH es indicada preferiblemente como actividad relativa (en %) normalizada al valor de pH óptimo.

[0092] Un ejemplo de un perfil de pH alterado es donde la curva del pH (actividad relativa como función de pH) se

35 desplaza hacia un pH más alto, o más bajo. Las sustituciones preferidas que proporcionan un cambio de 0,5 unidades de pH a un pH más alto en comparación con la fitasa de referencia de la SEQ ID N.º:2. No obstante, para ciertos fines, puede ser preferible proporcionar un cambio de 0,5 unidades de pH hacia un pH inferior en comparación con la fitasa de referencia de SEQ ID N.º2.

40 [0093] Otro ejemplo de un perfil de pH alterado es donde el pH óptimo es cambiado, en dirección hacia arriba o hacia abajo.

[0094] En particular, la fitasa de la invención puede tener un perfil de pH alterado en comparación con una fitasa de referencia. Más en particular, el perfil de pH está modificado en el intervalo de pH de 3,5-5,5. Todavía más en particular, 45 la actividad a pH 4,0; 4,5; 5, 0 y/o 5,5 está a un nivel de al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,

o al menos un 95% de la actividad al pH óptimo (pH 3,5).

Actividad específica

50 [0095] La fitasa de la invención puede tener una actividad específica mejorada en relación a una fitasa de referencia. Más en particular, la actividad específica de una fitasa es al menos un 105%, en relación a la actividad específica de una fitasa de referencia determinada por el mismo procedimiento. En otras formas de realización particulares adicionales, la actividad específica relativa es al menos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 o incluso un 400%, todavía en relación a la actividad específica de la fitasa de referencia

55 como se determina mediante el mismo procedimiento.

[0096] En la alternativa, el término actividad específica alta se refiere a una actividad específica de al menos 200 FYT/mg de proteína enzimática (PE). En particular, la actividad específica es al menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700,

60 2800, 2900 o 3000 FYT/mg de PE.

[0097] La actividad específica se mide en muestras altamente purificadas (un gel de poliacrilamida SDS debería mostrar la presencia de un único componente). La concentración de proteína enzimática se puede determinar por análisis de aminoácido y la actividad de fitasa en las unidades de FYT se puede determinar como se describe en el Ejemplo 1. La actividad específica es una característica de la variante de fitasa específica en cuestión y se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína enzimática de variante de fitasa. Véanse el Ejemplos para obtener más detalles.

[0098] Una actividad específica modificada se espera de las siguientes variantes de la fitasa de la SEQ ID N.º:2, en la que, en orden de preferencia, el bucle entre los residuos 115 y 127 (HQQNTQQADPL) que da al sitio activo es sustituido por un bucle seleccionado de, por ejemplo, HQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTSSPDPL, HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPL.

Rendimiento en el alimento para animales

[0099] Una fitasa de la invención puede tener un rendimiento mejorado en el alimento para animales en comparación con una fitasa de referencia. El rendimiento en el alimento para animales se puede determinar por el modelo in vitro de los Ejemplos. Por consiguiente, la fitasa de la invención tiene un rendimiento mejorado en el alimento para animales, donde el rendimiento se determina en un modelo in vitro, preparando muestras de alimento para animales compuestas por un 30% de harina de soja y 70% de harina de maíz con CaCl2 añadido a una concentración de 5 g de calcio por kg de alimento para animales; preincubándolos a 40° C y pH 3,0 durante 30 minutos seguidos de adición de pepsina (3000 U/g de alimento para animales) y fitasa; incubando las muestras a 40° C y pH 3,0 durante 60 minutos seguidos de pH 4,0 durante 30 minutos; parando las reacciones; extrayendo ácido fítico y inositol fosfatos mediante adición de HCl a una concentración final de 0,5 M e incubación a 40° C durante 2 horas, seguido de un ciclo de congelacióndescongelación y 1 hora de incubación a 40° C; separando ácido fítico y inositol fosfatos mediante cromatografía iónica de alto rendimiento; determinando la cantidad de fósforo de fitato residual (IP6-P) ; calculando la diferencia en IP6-P residual entre la fitasa tratada y una muestra en blanco de una fitasa no tratada (esta diferencia es IP6-P degradado) ; y expresando el IP6-P degradado de la fitasa de la invención relativo al IP6-P degradado de la fitasa de referencia.

[0100] La fitasa de la invención y la fitasa de referencia son, por supuesto, dosificadas en la misma cantidad, preferiblemente en base a unidades de actividad de fitasa (FYT). Una dosificación preferida es 125 FYT/kg de alimento para animales. Otra dosificación preferida es 250 FYT/kg de alimento para animales. Las fitasas se pueden dosificar en la forma de fitasas purificadas, o en la forma de sobrenadantes de fermentación. Las fitasas purificadas tienen preferiblemente una pureza de al menos un 95%, como se determina mediante SDS-PAGE.

[0101] Preferiblemente, el valor de IP6-P degradado de la fitasa purificada de interés, en relación al valor IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es al menos 101%, o al menos 102%, 103%, 104%,105%, 110%, 115%, o al menos 120%. Aún más, el valor IP6-P degradado de la fitasa purificada de interés, en relación al valor IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es al menos 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, o al menos 200%. Preferiblemente, el valor IP6-P degradado de la fitasa de la invención, en relación al valor degradado IP6- P de la fitasa de la SEQ ID N.º:2, es al menos un 105%, 110%, 113%, 115%, 120%, 125%, o al menos un 130%.

[0102] El rendimiento relativo de una fitasa de interés también se puede calcular como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de referencia.

[0103] Aún más, el rendimiento relativo de una fitasa de interés puede también ser calculado como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de interés, relativo a la cantidad de fósforo liberado por la fitasa de referencia.

[0104] Aún más, el rendimiento relativo de una fitasa de interés es al menos 105%, preferiblemente al menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o al menos 200%.

Reducción en la glicación

[0105] La glicación no enzimática es un proceso postranslacional espontáneo en el cual los azúcares reductores se enlazan de manera covalente a grupos amino libres en proteínas principalmente en residuos de lisina (K). Para reducir la glicación dando como resultado una reducción de actividad de la fitasa, la actividad se mejora por substitución de determinados residuos de aminoácido, tal como Lys.

[0106] Por lo tanto, se propone hacer una o varias de las siguientes modificaciones en la fitasa de SEQ ID N.º2: K12R,Q, K26R,Q, K45P, K76R,Q, K97R,Q, K131R,Q, K139R,Q, K148R,Q, K176R,Q, K187E, K207L, K234R,Q, K251R,Q, K268R,Q, K299R,Q, K347R,Q, S261A, T308A, T25A, T28A, T30L, T219L, T120L, N202A, N206A, N270R,Q, N312A, N119D, Q256A, Q29A, Q121A, Q122A, Q117A, Q118A y48W y Y179L. Modificaciones específicamente preferidas con respecto a esta mejora en la eficiencia son las modificaciones K26Q y K26R.

Sensibilidad de proteasa reducida

5 [0107] En particular, una fitasa de interés puede tener una sensibilidad de proteasa reducida. Más en particular, tiene un sensibilidad reducida hacia el pepsina y la tripsina de las proteasas, lo que significa una tendencia reducida para volverse dividida por estas proteasas.

10 [0108] Las posiciones a ser modificadas en este aspecto se indican en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Posiciones de modificar sensibilidad de proteasa

Pepsina

Pepsina

Tripsina

F8

W42 R22

L46

Y48 K26

L73

L74 K45

L112

F174 K76

L126

W237 K131

L157

L323 R160

L188

L379 K176

W321

K187

L368

K234

L370

L395

[0109] Para reducir la sensibilidad hacia la pepsina, el residuo de aminoácido debería ser modificado a un aminoácido 15 diferente de F, L, W o Y. En el caso de la tripsina, debe ser modificado a un residuo de aminoácido diferente de R o K.

Modelo de glicosilación

[0110] La glicosilación es un fenómeno que solo se observa cuando las proteínas se expresan en eucariotas tales como

20 hongos y plantas transgénicas, pero no en procariotas tales como bacterias. Hay varios tipos de glicosilación, pero en el presente contexto el más pertinente es la N-glicosilación, es decir, la glicosilación ligada a asparagina donde los azúcares se unen a una proteína, empezando por una molécula de N-acetiglucosamina unida a asparaginas. Se ha descubierto que la N-glicosilación solo tiene lugar en asparaginas que en la secuencia son parte de los siguientes tripéptidos: N-X-T o N-X-S, donde X designa cualquier aminoácido.

25 [0111] Se ha observado que la termoestabilidad se puede mejorar para fitasas expresadas en hongos alterando los sitios de glicosilación potencial.

[0112] Ejemplos de fitasas son las fitasas bacterianas, por ejemplo, fitasas gram-negativas, tales como E.coli y fitasas 30 de Citrobacter y Hafnia y variantes de las mismas, incluidas las fitasas de la presente invención. Ejemplos de huéspedes de expresión fúngica son Pichia, Saccharomyces y especies de Aspergillus.

[0113] En particular, se espera un modelo de glicosilación modificada de las siguientes fitasas de interés:

35 Eliminación de un sitio de glicosilación Nuevos sitios de glicosilación: NXX

Número res.

Tipo res. Cambiar a

285

Asn Asp

Número res.

Tipo res. Cambiar a

121

Gln Ser,Thr

186

Gly Ser,Thr

249

Leu Ser,Thr

331

Pro Ser,Thr

346

Gly Ser,Thr

355

Val Ser,Thr

382

Pro Ser,Thr

Creación de nuevos sitios de glicosilación del tipo XXT

Número res.

Tipo res. Cambiar a

33

Asp Asn

48

Tyr Asn

93

Gln Asn

96

Arg Asn

118

Gln Asn

320

Thr Asn

Creación de nuevos sitios de glicosilación del tipo XXS

Número res.

Tipo res. Cambiar a

138

Asp Asn

162

Gln Asn

175

Pro Asn

190

Asp Asn

246

Trp Asn

293

Asp Asn

383

Gly Asn

394

Pro Asn

401

Leu Asn

403

Ser Asn

Estabilidad del vapor

[0114] La termoestabilidad es un parámetro importante, pero asociada a esta la estabilidad del vapor también es 10 importante. En este aspecto, se hace referencia al Ejemplo 8 más abajo.

Variantes hipoalergénicas [0115] Las fitasas de la presente invención son (también) variantes hipoalergénicas, diseñadas para recurrir a una 15 respuesta inmunológica reducida cuando es expuesta a animales, incluido el hombre. El término respuesta 15

inmunológica debe ser entendido como cualquier reacción del sistema inmunológico de un animal expuesto a la variante de fitasa. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Las variantes hipoalergénicas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la variante de fitasa se puede conjugar con partes de protección de fracciones poliméricas o epítopos de la variante de fitasa implicados en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar acoplamiento químico in vitro del polímero a la variante de fitasa, por ejemplo, como se describe en WO 96/17929 , WO 98/30682 , WO 98/35026 y/o WO 99/00489. La conjugación puede además o alternativamente a estos implicar un acoplamiento in vivo de polímeros a la variante de fitasa. Tal conjugación se puede conseguir por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de fitasa, insertando secuencias de consenso que codifican sitios de glicosilación adicional en la variante de fitasa y expresando la variante de fitasa en un huésped capaz de glicosilar la variante de fitasa, véase, por ejemplo, WO 00/26354. Otro modo de proporcionar variantes hipoalergénicas es la ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifican la variante de fitasa para provocar que las variantes de fitasa se autooligomericen, logrando que los monómeros de variante de fitasa puedan proteger los epítopos de otros monómeros de variante de fitasa y así reducir la antigenicidad de los oligómeros. Tales productos y su preparación se describen, por ejemplo, en WO 96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica se pueden identificar por varios métodos tales como el método de visualización de fago descrito en WO 00/26230 y WO 01/83559, o el enfoque aleatorio descrito en EP 561907. Una vez que un epítopo ha sido identificado, su secuencia de aminoácidos se puede alterar para producir propiedades inmunológicas alteradas de la variante de fitasa mediante conocidas técnicas de manipulación de genes tales como mutagénesis de sitio dirigido (véanse, por ejemplo, WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede realizarse con proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja al epítopo.

Secuencias de ácidos nucleicos y constructos

[0116] La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácido nucléico que codifica una variante de fitasa de la invención.

[0117] El término "secuencia de ácido nucleico aislada" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, al menos aproximadamente un 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% puro, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60% puro, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% puro y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 90% puro como se determina por electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada se puede obtener por procedimientos de clonación estándar usados en ingeniería genética para desplazar la secuencia de ácidos nucleicos de su ubicación natural a un sitio diferente donde esta será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde múltiples copias o clones de la secuencia de ácidos nucleicos serán duplicadas. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.

[0118] Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar introduciendo al menos una mutación en una secuencia codificante de fitasa de molde o una subsecuencia de la misma, donde la secuencia mutante de ácidos nucleicos codifica una fitasa variante. La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede realizar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por mutagénesis de sitio dirigido, por mutagénesis aleatoria, o por mutagénesis dopada, adicionada, o aleatoria localizada.

[0119] La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente ya sea como mutagénesis localizada o aleatoria en una región específica en al menos tres partes del gen traduciendo a la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión o en el gen entero. Cuando la mutagénesis se realiza por el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido a las posiciones que deben ser cambiadas. El dopaje o el adicionado se puede realizar de modo que se eviten codones para aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado se puede incorporar al ADN que codifica la enzima de fitasa mediante cualquier técnica, usando, por ejemplo, PCR, LCR o cualquier polimerasa y ligasa de ADN según se estime apropiado.

[0120] Preferiblemente, el dopado se realiza usando un "dopado aleatorio constante", en el que el porcentaje de tipo salvaje y mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopaje puede ser dirigido hacia una preferencia para la introducción de determinados nucleótidos y así una preferencia para la introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje se puede realizar, por ejemplo, para permitir la introducción de un 90% de tipo

salvaje y un 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se basa en limitaciones genéticas así como estructurales de proteínas.

[0121] La mutagénesis aleatoria puede ser localizada de manera ventajosa en una parte de la fitasa progenitora en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando determinadas regiones de la enzima han sido identificadas por ser de especial importancia para una propiedad dada de la enzima.

[0122] Los métodos alternativos para suministrar variantes de la invención incluyen transposición de genes, por ejemplo, como se describe en WO 95/22625 o en WO 96/00343 y el proceso de derivación de consenso como se describe en EP 897985.

Constructos de ácidos nucleicos

[0123] Un constructo de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención enlazada de manera operativa a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Se entiende que la expresión incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluido, de modo enunciativo, pero no limitativo, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

[0124] El término "constructo de ácidos nucleicos" según se utiliza en este documento se refiere a una molécula de ácido nucleico, mono- o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de un modo tal que si no fuera así no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

[0125] El término "control de secuencias" está definido en este documento para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, de modo enunciativo, pero limitativo, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de transcripción. En un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlaces con la intención de introducir sitios de restricción específicos facilitando ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

[0126] El término "enlazado de manera operativa" denota en este documento una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada en relación a la secuencia codificante de la secuencia polinucleótida de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

[0127] Cuando se usa aquí el término "secuencia codificante" (SC) significa una secuencia de nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante son generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que inicia normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser una secuencia ADN, ADNc, o secuencia de nucleótidos recombinante.

Vector de expresión

[0128] El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluido, de modo enunciativo, pero no limitativo, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

[0129] El término "vector de expresión" se define en la presente como una molécula lineal o circular de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención y que está operativamente enlazado a nucleótidos adicionales que propician su expresión.

[0130] Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante de fitasa de la invención puede ser expresada usando un vector de expresión que incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0131] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de fitasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y la elección de vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la cual ha de ser introducida.

El vector puede ser uno que, cuando está introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se duplica junto con el/los cromosoma/s) en el cual ha sido integrado.

[0132] La variante de fitasa puede también ser coexpresada junto con al menos otra enzima de interés de alimento para animales, tal como una fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, amilasa y/o beta-glucanasa. Las enzimas se pueden coexpresar desde distintos vectores, desde un vector, o usando una mezcla de ambas técnicas. Cuando se usan vectores diferentes, los vectores pueden tener marcadores seleccionables diferentes y orígenes diferentes de replicación. Cuando se usa solo un vector, los genes se pueden expresar a partir de uno o más promotores. Si se clona bajo la regulación de un promotor (di- o multicistrónico), el orden en que los genes son clonados puede afectar los niveles de expresión de las proteínas. La variante de fitasa puede también ser expresada como una proteína de fusión, es decir, que el gen que codifica la variante de fitasa ha sido fusionado en el marco del gen que codifica otra proteína. Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.

Células huésped

[0133] El término "célula huésped", según se utiliza en este documento, incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción y similares con un constructo de ácidos nucleicos que comprendan un polinucleótido de la presente invención.

[0134] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que es usado ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal que se duplica como se describió anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

[0135] La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.

[0136] Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas incluidas, entre otras, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis; o una célula Streptomyces cell, epor ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. Coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es un Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o célula de Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico.

[0137] La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada mediante transformación de protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115 ), usando células competentes (véase, por ejemplo young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 , o Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 ), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Tome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278 ).

[0138] La célula huésped puede también ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta o de hongos.

[0139] En un aspecto preferido, la célula huésped es una célula de hongos.. “Hongos" según se utiliza en la presente incluye la phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Cigomicota (como es definido por Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby’s Dictionar y of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB Internacional, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como también la Oomycota (como se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra).

[0140] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. “Levadura" como se utiliza en este documento incluye levadura de ascoesporogenous (Endomicetales), levadura de basidiosporogenous y levadura perteneciente a los hongos imperfectos (Blastomicetes). Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Serie de simposio n°. 9, 1980).

[0141] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

[0142] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula Kluyveromices lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

[0143] En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según es definido por Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están generalmente caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0144] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

[0145] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides,o Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una cepa de célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0146] Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular en un modo conocido per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de las células huéspedes Aspergillus y Trichoderma están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474 . Los métodos adecuados para la transformación de especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, gen 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology

153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920 .

Métodos de producción

[0147] La presente invención también se refiere a métodos para producir una fitasa de la presente invención que comprende (a) cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la fitasa; y (b) recuperación la fitasa.

[0148] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de los polipéptidos usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación y fermentación a gran o pequeña escala (incluidas fermentaciones continuas de lote, lote alimentado o en estado sólido) en el laboratorio o fermentadores industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan al polipéptido ser expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Hay disponibles medios adecuados de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es

secretado en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, se puede recuperar de lisatos celulares.

[0149] El polipéptido resultante puede ser recuperado usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluidos, entre otros, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

[0150] Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluidos, entre otros cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico, cromatoenfoque y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J. C. Janson y Lars Riden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Composiciones y usos

[0151] En todavía otros aspectos, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención, al igual que métodos de uso de estas.

[0152] Las composiciones del polipéptido se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden ser en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición del polipéptido puede estar en forma de granulados o microgranulados. El polipéptido que ha de incluirse en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0153] La fitasa de la invención se puede usar para la degradación, en cualquier contexto industrial, de, por ejemplo, fitato, ácido fítico y/o el mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos de mioinositol. Es bien conocido que las fracciones de fosfato de estos compuestos quelan cationes divalentes y trivalentes tales como iones metálicos, es decir, los iones nutricionalmente esenciales de calcio, hierro, zinc y magnesio así como el magnesio de oligoelementos, cobre y molibdeno. Además, el ácido fítico también une hasta cierto punto proteínas por interacción electrostática.

[0154] Por consiguiente, los usos preferidos de los polipéptidos de la invención son preparaciones de alimento para animales (incluida la alimentación humana) o en aditivos para preparaciones de este tipo.

[0155] En una realización particular, el polipéptido de la invención se puede usar para mejorar el valor nutricional de alimento para animales. Ejemplos no limitativos de mejora del valor nutricional del alimento para animales (incluida la alimentación humana) son: mejorar la digestibilidad del alimento para animales; estimular el crecimiento del animal; mejorar la utilización del alimento para animales; mejorar la biodisponibilidad de proteínas; aumentar el nivel de fosfato digerible; mejorar la liberación y/o degradación de fitato; mejorar la biodisponibilidad de oligoelementos; mejorar la biodisponibilidad de macrominerales; eliminar o reducir la necesidad de añadir fosfato suplementario, oligoelementos y/o macrominerales y/o mejorar la calidad de la cáscara del huevo. El valor nutricional del alimento es, por lo tanto, más elevado y el índice de crecimiento y/o aumento de peso y/o conversión alimenticia (es decir, el peso del alimento ingerido en relación al aumento de peso) del animal se pueden mejorar.

[0156] Además, el polipéptido de la invención se puede usar para reducir el nivel de fitato de abono.

[0157] Las variantes de fitasa de la invención también pueden usarse en un método para la producción de un producto de fermentación, que comprende (a) fermentación usando un microorganismo fermentador de un material que contiene carbohidrato en presencia de una fitasa de la invención y (b) producción del producto de fermentación o coproducto de fermentación del carbohidrato fermentado que contiene material.

[0158] Cuando se usa para este fin, el producto de fermentación es preferiblemente etanol, cerveza, vino o granos de destilería desecados (DDG por sus siglas en inglés).

Animales, alimento para animales y aditivos de alimento para animales

[0159] El término animal incluye todos los animales, seres humanos incluidos. Ejemplos de animales son rumiantes y no rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como oveja, cabra y ganado, por ejemplo, ganado vacuno y vacas lecheras. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo, el cerdo o el puerco (incluidos, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas) ; aves de corral tales como pavos, patos y pollos (incluidos, entre otros, pollos de engorde, gallinas ponedoras); peces (incluidos, entre otros, salmón, trucha, tilapia, siluro y carpa) y crustáceos (incluidos, entre otros, gamba y langostino).

[0160] El término alimento o composición alimentaria significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada para la ingesta por parte de un animal o destinada a ese fin.

[0161] En el uso según la invención, el polipéptido se puede suministrar al animal antes o después de la dieta o 5 simultáneamente con esta. Se prefiere esto último.

[0162] En una forma de realización particular, el polipéptido, en la forma en la que se añade al alimento, o cuando se incluye en un aditivo alimenticio, es sustancialmente puro. En una forma de realización particular está bien definido. El término "bien definido" significa que la preparación de fitasa es al menos un 50% pura como se determina mediante

10 cromatografía de exclusión por tamaño (véase el Ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares, la preparación de fitasa es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos un 95% pura como se determina mediante este método.

[0163] Una preparación de polipéptido sustancialmente pura y/o bien definida es ventajosa. . Por ejemplo, es mucho

15 más fácil dosificar correctamente un polipéptido al alimento que está esencialmente libre de interferir o contaminar otros polipéptidos. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes y la capacidad de optimizar la dosificación basada en el efecto deseado.

[0164] No obstante, para uso en el alimento para animales, el polipéptido de fitasa de la invención no necesita ser tan 20 puro; puede, por ejemplo, incluir otros polipéptidos, en cuyo caso se podría denominar una preparación de fitasa.

[0165] La preparación de fitasa puede ser (a) añadida directamente al alimento (o usarse directamente en un proceso de tratamiento de proteínas) o (b) se puede usar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos alimenticios o premezclas que se añaden posteriormente al alimento (o usarse en un proceso de tratamiento).

25 El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación del polipéptido original, si se usa según los puntos (a) o (b) anteriores.

[0166] Las preparaciones de polipéptido con purezas de este orden de magnitud se encuentran en partículas obtenibles usando métodos recombinantes de producción, mientras que no se obtienen tan fácilmente y también están sujetas a

30 una variación de lote a lote mucho más elevada cuando el polipéptido se produce por métodos de fermentación tradicional.

[0167] Tal preparación del polipéptido puede, por supuesto, mezclarse con otros polipéptidos.

35 [0168] El polipéptido se puede añadir al alimento en cualquier forma ya sea como un polipéptido relativamente puro o en la mezcla con otros componentes destinados a añadirse al alimento para animales, es decir, en forma de aditivos alimenticios, tales como las denominadas premezclas para alimento para animales.

[0169] En otro aspecto la presente invención se refiere a composiciones para su uso en el alimento para animales, tales 40 como alimentos para animales y aditivos para alimentos para animales, por ejemplo, premezclas.

[0170] Además del polipéptido de la invención, los aditivos para alimentos para animales de la invención contienen al menos una vitamina fitosoluble y/o al menos una vitamina soluble en agua y/o al menos un oligoelemento. El aditivo alimentario puede también contener al menos un macromineral.

45 [0171] Además, los ingredientes de aditivos de alimento opcionales son agentes colorantes, por ejemplo, carotenoides tales como betacaroteno, astaxantina y luteína; compuestos de aroma; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; especias generadoras de oxígeno reactivo y/o por lo menos otro polipéptido seleccionado de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); fosfatasa (EC 3.1.3.1; EC 3.1.3.2; EC 3.1.3.39) ; xilanasa (EC 3.2.1.8) ; galactanasa

50 (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tales como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

[0172] En una forma de realización particular, estos otros polipéptidos están bien definidos (como se ha definido más 55 arriba para preparaciones de fitasa).

[0173] La fitasa de la invención puede también ser combinada con otras fitasas, por ejemplo, fitasas de ascomiceto tales como fitasas de Aspergillus, por ejemplo, derivadas de Aspergillus ficuum, Aspergillus niger o Aspergillus awamori; o fitasas de basidiomiceto, por ejemplo, derivadas de Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Trametes pubescens, o

60 Paxillus involutus; o derivados, fragmentos o variantes de los mismos que tienen actividad de fitasa.

[0174] Así, en formas de realización preferidas del uso en el alimento para animales de la invención y en formas de realización preferidas del aditivo para alimentación animal y el alimento para animales de la invención, la fitasa de la invención se combina con tales fitasas.

5 [0175] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (PAMs) son CAP18, Leucocino A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina y Ovispirina tales como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas y Estatinas, incluidos los compuestos y los polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, al igual que variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

10 [0176] Ejemplos de polipéptidos antifungicidas (PAFs) son el Aspergillus giganteus y los péptidos Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se ha descrito en WO 94/01459 y WO 02/090384

[0177] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como 15 ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linoleico.

[0178] Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son sustancias químicas tales como perborato, persulfato

o percarbonato; y polipéptidos tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

20 [0179] Por lo general, las vitaminas grasas e hidrosolubles, así como los oligoelementos forman parte de una premezcla destinada a la adición al alimento, mientras que los macrominerales se añaden al alimento normalmente por separado. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con un polipéptido de la invención, es un aditivo para alimentación animal de la invención.

25 [0180] En una forma de realización particular, el aditivo para alimentación animal de la invención está destinado a ser incluido (o prescrito como que debe ser incluido) en dietas o alimento para animales a niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente 0,05 a 5,0%; o 0,2 a 1,0% (% significa g de aditivos por 100 g de alimento). Esto es así en particular para premezclas.

30 [0181] Lo siguiente son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

[0182] Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E y vitamina K, por ejemplo, vitamina K3.

35 [0183] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo, pantotenato Ca-D.

[0184] Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre yodo, selenio y cobalto.

40 [0185] Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

[0186] Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) están listados en la tabla A de WO 01/58275. Requisito nutritivo significa que estos componentes deberían proporcionarse en la dieta en las concentraciones indicadas.

45 [0187] En la alternativa, el aditivo para alimentación animal de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres o cuatro y así sucesivamente hasta todos los trece o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en

50 una cantidad tal para proporcionar una concentración en alimento en el intervalo indicado en la columna cuatro, o en la columna cinco, o en la columna seis de la Tabla A.

[0188] La presente invención también se refiere a composiciones de alimento para animales. Las composiciones de alimento para animales o dietas tienen un contenido relativamente alto de proteína. Las dietas publicación WO

55 01/58275, columnas 2-3. Las dietas de peces se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además tales dietas de peces tienen normalmente un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.

[0189] La publicación WO 01/58275 corresponde a la publicación US 09/779334.

60 [0190] Una composición de alimento para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg y comprende además al menos un polipéptido como se reivindica en este documento.

[0191] Además, o en la alternativa (al contenido bruto de proteína indicado anteriormente), la composición alimentaria para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0192] En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína y/o lisina está dentro de uno cualquiera de los intervalos 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).

[0193] La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicada por un factor 6,25, es decir, proteína cruda (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, OfficialMethods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[0194] La energía metabolizable puede ser calculada basándose en la publicación del NRC sobre los requisitos de nutrientes en los cerdos, novena edición revisada 1988, Subcomisión para porcinos, Comité de nutrición animal, Consejo de agricultura, Cconsejo nacional de investigación. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6 y la Tabla europea de valores energéticos de los alimentos para las aves, Centro Spelderholt para la investigación de aves y extensión, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

[0195] El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas completas para animales se calcula basándose en tablas de alimentos tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. . ISBN 90-72839-13-7.

[0196] En una forma de realización particular, la composición de alimento para animales de la invención contiene al menos una proteína. La proteína puede ser una proteína animal, tales como harina de carne y huesos y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal. El término proteínas vegetales según se utiliza en este documento se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluya al menos una proteína derivada u originada a partir de un vegetal, incluidas proteínas modificadas y derivados de proteína. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es de al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o un 60% (p/p).

[0197] Las proteínas vegetales pueden ser derivadas de fuentes de proteína vegetal, tales como legumbres y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

[0198] En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo, semilla de soja, altramuz, guisante o alubia.

[0199] En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinua.

[0200] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son la semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón y repollo.

[0201] La semilla de soja es una fuente de proteína vegetal preferida.

[0202] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son los cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (mazorca), arroz, triticale y sorgo.

[0203] En todavía más formas de realización particulares, la composición de alimento para animales de la invención contiene un 0-80% de maíz; y/o un 0-80% de sorgo; y/o un 0-70% de trigo; y/o un 0-70% de cebada; y/o un 0-30% de avena; y/o un 0-40% de harina de soja; y/o un 0-25% de harina de pescado; y/o un 0-25% de harina de carne y hueso; y/o un 0-20% de lactosuero.

[0204] Las dietas para animales pueden, por ejemplo, producirse como pienso en harina (no granulado) o pienso en gránulos o pienso extruido. Típicamente, se mezclan los materiales alimenticios triturados y se agregan cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales según las especificaciones para las especies en cuestión. Los polipéptidos se pueden agregar como formulaciones de polipéptido sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación de polipéptido sólida se agrega típicamente antes o durante la etapa de mezclado; y una preparación de polipéptido líquida se agrega típicamente después de la etapa de granulación. El polipéptido se puede también incorporar en forma de aditivo alimentario o premezcla.

[0205] La concentración de polipéptidos final en la dieta está en el intervalo de 0,01-200 mg de proteína de polipéptido por kg de dieta, por ejemplo, en el intervalo de 5-30 mg de proteína de polipéptido por kg de dieta animal.

[0206] La fitasa de la invención debería por supuesto añadirse en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutricional del alimento. Actualmente se contempla que el polipéptido se administra en una o más de las cantidades siguientes (intervalos de dosificación): 0.01-200; 0.01-100; 0.5-100; 1-50; 5-100; 10- 100; 0.05-50; o 0.10-10 - siendo todos estos intervalos en mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg de alimento (ppm).

[0207] Para determinar los mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg de alimento, la fitasa se purifica a partir de la composición alimentaria y la actividad específica de la fitasa purificada se determina usando un ensayo pertinente. . La actividad de fitasa de la composición alimentaria como tal se determina también usando el mismo ensayo y basándose en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína de fitasa por kg de alimento.

[0208] Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína de polipéptido de fitasa en aditivos alimenticios. Por supuesto, si hay una muestra disponible de la fitasa usada para la preparación del aditivo para alimentación animal o el alimento, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar la fitasa de la composición alimentaria o el aditivo).

EJEMPLOS

[0209] Los productos químicos usados fueron productos comerciales de al menos grado reactivo.

Ejemplo 1: preparación de variantes y determinación de actividad

Preparación de variantes de fitasa

Expresión de variantes de fitasa en Aspergillus oryzae

[0210] Los constructos que comprenden los genes de la variante de fitasa de Hafnia en los ejemplos fueron usados para construir vectores de expresión para Aspergillus. Los vectores de expresión de Aspergillus consisten en un cassette de expresión basado en el promotor II de amilasa neutral de Aspergillus niger fusionada a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglicosidasa de Aspergillus niger (Tamg). También presente en el plásmido está el marcador selectivo de Aspergillus amdS de Aspergillus nidulans que permite crecimiento en la acetamida como fuente de nitrógeno única. Los plásmidos de expresión para variantes de fitasa fueron transformados en Aspergillus como se describe en Lassen et al. (2001), Applied and Environmental Micorbiology, 67, 4701-4707 . Para cada uno de los constructos, se aislaron 10-20 cepas y se purificaron y cultivaron en matraces de agitación.

Purificación de variantes de fitasa de Hafnia alvei

[0211] El sobrenadante de fermentación con la variante de fitasa fue filtrado a través de un filtro superior de botellas PES rápido con un corte de 0,22 Im. La solución resultante fue diluida con agua al volumen doble y el pH se ajstó a 4,5 con ácido acético. Ocasionalmente, la solución se volvió un poco nublada y esto se quitó por filtración a través de un filtro superior de botellas PES rápido con un corte de 0.22 Im.

[0212] Después del pretratamiento, la variante de fitasa fue purificada por cromatografía en S sefarosa, aproximadamente 30 ml en una columna XK26, usando como tampón A 50mM de acetato sódico pH 4,5 y como tampón B 50mM de acetato sódico + 1M de NaCl pH 4,5. Llas fracciones de la columna fueron analizadas en cuanto a la actividad usando un ensayo de fosfatasa (véase más abajo) y se agruparon las fracciones con actividad.

[0213] Finalmente, la solución con la variante de fitasa purificada fue concentrada usando un dispositivo de filtración Amicon ultra-15 con una membrana de corte de 30 kDa.

[0214] El peso molecular, como se estima a partir de SDS-PAGE, fue aproximadamente de 45 kDa y la pureza fue > 95%.

Determinación de actividad de fosfatasa [0215] 75 microlitros de solución enzimática con fitasa se dispensan en un pocillo de placa de microtitulación, por ejemplo, NUNC 269620 y se añaden 75 microlitros de sustrato (para preparar el sustrato, se disuelven dos comprimidos

de 5 mg de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, Cat.No. N-9389) en 10 ml 0,1 M de tampón de Na-acetato, pH 5,5). La placa se sella e se incuba 15 min., se agita a 750 r.p.m. a 37° C. Después del tiempo de incubación se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo de parada es 0,1 M de tetraborato de sodio en agua) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. Una unidad de fosfatasa se define como la actividad enzimática que libera 1 micromol de fosfato/min bajo las condiciones de reacción dadas (tampón ciego sustraído). Se determina que la absorbancia de 1 p-nitrofenol de micromol es 56 AU (AU= unidades de absorbancia) bajo condiciones de ensayo.

Determinación de actividad de fitasa

[0216] 75 microlitos de solución enzimática con fitasa, diluidos apropiadamente (por ejemplo, en 0 25 M de acetato sódico, 0,005% (p/v) Tween-20. pH 5,5) , se dispensan en un pocillo de placa de microtitulación, por ejemplo, NUNC 269620 y se añaden 75 microlitros de sustrato (preparados disolviendo 100 mg de fitato de sodio de arroz (Aldrich Cat.No. 274321) en 10 ml 0,25 M de tampón de acetato de sodio, pH 5,5). La placa se sella y se incuba 15 min. agitada a 750 r.p.m. a 37° C. Después de la incubación, se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo deparada se prepara mezclando 10 ml de solución de molibdato (10% (p/v) de hepta-molibdato de amonio en 0,25% (p/v) de solución de amoníaco); 10 ml de vanadato de amonio (0,24% producto comercial de Bie&Berntsen, Cat.No. LAB17650) y 21,7 % (p/v) de ácido nítrico) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. . La actividad de fitasa se expresa en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 microml de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las condiciones anteriores. Un valor absoluto para la actividad de fitasa medida se obtiene por referencia a una curva estándar preparada a partir de diluciones apropiadas de fosfato inorgánico o por referencia a una curva estándar hecha de diluciones de una preparación de enzima de fitasa con actividad conocida (tal preparación enzimática estándar con una actividad conocida está disponible a petición de Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd).

Ejemplo 2: actividad específica

[0217] La actividad específica de una variante de fitasa se determina en muestras altamente purificadas dializadas contra 250 mM de acetato sódico, pH 5,5. La pureza se controla previamente en un gel de poliacrilamida SDS que muestra la presencia de solo un componente.

[0218] La concentración de proteína se determina mediante el análisis de aminoácidos de la siguiente manera: una alícuota de la muestra es hidrolizada en 6N HCl, 0,1 % de fenol durante 16 h a 110° C en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes son cuantificados usando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A accionado según las instrucciones del fabricante. A partir de las cantidades de los aminoácidos se puede calcular la masa -y por lo tanto también la concentración- de proteína en la alícuota hidrolizada.

[0219] La actividad de fitasa se determina en las unidades de FYT como se describe en el Ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fitasa") y la actividad específica se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades de FYT por mg de proteína enzimática de variante de fitasa.

Ejemplo 3: estabilidad de temperatura

Cepas y plásmidos

[0220] Se utilizó E.coli DH12S (disponible de Gibco BRL) para el rescate de plásmido de levadura.

[0221] pJHP000 es un vector transportador de S. cerevisiae y E.coli bajo el control de promotor TPI, construido a partir de pJC039 descrito en WO 01/92502, en el cual se ha insertado el gen de fitasa de Hafnia alvei.

[0222] Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, leu2-D2, his 4-539 se utilizó para la expresión de variantes de fistasa. Está descrito en J. Biol. Chem. 272 (15), págs 9720-9727, 1997.

Medios y sustratos

[0223] 10X Solución Basal: 66,8 g/l base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCOI, 100 g/l succinato, 60 g/l NaOH. [0224] Glucosa SC: 100 ml/l 20% glucosa (es decir, una concentración final de 2% = 2 g/100ml), 4 ml/l 5% treonina, 10 ml/l 1% triptófano, 25 ml/l 20% casamino ácidos, 100 ml/l 10 X solución basal. La solución es esterilizada usando un filtro de un tamaño de poro de 0,20μm. Agar y H2 O (aprox. 761 ml) se someten juntos a autoclave y la solución de glucosa SC separadamente esterilizada se añade a la solución de agar.

[0225] YPD: 20 g/l bacto peptona, 10 g/l extracto de levadura, 100 ml/l 20% glucosa 5 [0226] Solución de PEG/LiAc: 50ml 40% PEG4000, 1ml 5M acetato de litio

Manipulaciones de ADN

10 [0227] A menos que se declare de otra manera, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando métodos estándares de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995 ; Harwood, C. R. and Cutting, S. M. (eds.).

15 Transformación de levadura

[0228] La transformación de levadura se realizó por el método de acetato de litio. Mezclar 0,5 microL de vector (digerido por endonucleasas de restricción) y 1 microL de fragmentos de la PCR. Descongelar células competentes YNG318 en hielo. Mezclar 100μl de las células, la mezcla de ADN y 10μl de ADN portador (Clontech) en tubos de polipropileno de 20 12ml (Falcon 2059). Añadir 0,6 ml de solución de PEG/LiAc y mezclar suavemente. Incubar durante 30 min. a 30º C y 200 r.p.m. Incubar durante 30 min. a 42º C (choque térmico). Transferir a un tubo Eppendorf y centrifugar durante 5 seg. Eliminar el sobrenadante y redisolver en 3ml de YPD. Incubar la suspensión celular durante 45 min. a 200 r.p.m. a 30 º

C. Verter la suspensión en placas de glucosa SC e incubar a 30º C durante 3 días para formar colonias. El ADN total de

la levadura es extraído por medio del método de Robzik y Kassir descrito en Nucleic acidsr esearch vol. 20, No14 (1992) 25 3790.

Secuenciación del ADN

[0229] Una transformación de E. coli para la secuenciación de ADN fue obtenida por electroporación (BIO-RAD Gene

30 Pulser). Los plásmidos de ADN fueron preparados por medio de un método alcalino (Clonación molecular, Cold SpringHarbor) o con el Qiagen® Plasmid Kit. Los fragmentos de ADN fueron recuperados del gel de agarosa por medio del kit de extracción en gel Qiagen. Se realizó la PCR con el PTC-200 DNA Engine. Se usó el ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer para determinar todas las secuencias de ADN.

35 Construcción de vector de expresión de fitasa

[0230] El gen de fitasa de Hafnia fue amplificado con los pares de cebadores (HafPhyF y HafPHyR). Los fragmentos de la PCR resultantes fueron introducidos en S. cerevisiae YNG318 con el vector pJC039 digerido con enzimas de restricción para eliminar la parte madura de gen de cutinasa de Humicola insolens.

40 HafPhyF (34mer) CTCCTGAACTTGTTGCCCGGTCGGATACAGCCCC HafPhyR (39mer) ATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAGGGGAGCTGACATG

45 [0231] Se recuperó el plásmido, que se denomina pJHP000 de los transformantes de levadura en las placas de glucosa SC y se determinó la secuencia interna para confirmar el gen de fitasa.

Construcción de librería de levadura y variantes dirigidas

50 [0232] Librería en levadura y variantes dirigidas se construyeron por el método SOE PCR (empalme por extensión por superposición, véase "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University Press, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido de recombinación in vivo de levadura.

55 Cebadores generales para amplificación y secuenciación

[0233] Los cebadores siguientes se utilizan para hacer fragmentos de ADN que contienen cualquier fragmento mutado por el método SOE junto con cebadores degenerados (AM34 + cebador inverso y AM35 cebador directo) o solo para amplificar un gen de fitasa entero (AM34 + AM35).

AM34

TAGGAGTTTAGTGAACTTGC

AM35

TTCGAGCGTCCCAAAACC

Sistema de reacción PCR:

Condiciones:

48,5 micro L

H2O 1 94°C 2 min.

2 perlas

puRe Taq Ready-To-Go PCR 2 94°C 30 seg.

Perlas (Amersham bioscineces)

3 55°C 30 seg.

0,5 micro L X 2100 pmol/micro L cebadores

4 72°C 90 seg

0,5 micro L

Modelo ADN 2-4 25 ciclos

5

72°C 10 min.

5 [0234] Los fragmentos de ADN fueron recuperados del gel de agarosa por medio del kit de extracción en gel Qiagen. Los fragmentos purificados resultantes fueron mezclados con la asimilación del vector. La solución mezclada fue introducida en Saccharomyces cerevisiae para construir bibliotecas o o variantes dirigidas por recombinación in vivo.

Selección de bibliotecas (el ensayo de membrana primaria)

10 [0235] Las bibliotecas de levadura fueron cultivadas en la placa de glucosa SC con una membrana de acetato de celulosa (superior) y membrana Biodyne C (de Pall gelman) (inferior) a 30º C al menos durante 3 días. Las membranas Biodyne C fueron transferidas a placas preincubadas con 20mM de tampón de acetato, pH 4,0 e incubadas durante 1-2 horas a una temperatura determinada (50° C en el caso de WT como esqueleto).

15 [0236] Luego, las membranas fueron quitadas y mojadas en la solución de sustrato fresco (10 ml 20mM tampón acetato, pH 4,0, 0,01 g, alfa naftil fosfato (Sigma); 0,02g, Fast Garnet GBC (Sigma). Los clones de levadura correspondientes a las posiciones de color rojo desarrollados en las membranas Biodyne C fueron aislados de membranas de acetato de celulosa.

20 Selección de bibliotecas (la selección de actividad relativa secundaria)

[0237] Los clones de levadura en las membranas de acetato de celulosa fueron inoculados a una placa de mitrotitulación de 96 pocillos y cultivados a 28° C durante 3 días. La sctividad de fitasa se midió a 37 °C y a la 25 temperatura más alta (60, 62, 64, 66° C etc.) para determinar la actividad relativa a una temperatura determinada. Luego, los clones con actividad relativa más alta fueron seleccionados y la secuencia fue confirmada.

Estándar, control de nivel y muestras se pipetan en un MTP o tubo de 8 bandas.

10 Il

Se añade sustrato precalentado (50° C).

200Il

El tubo de 8 bandas o MTP se coloca en un incubador MTP a 37, 60 y 64° C (o superior).

30 min.

Quitar 35Il, añadirlo en 100Il de reactivo complejo de parada y mezclar 5-20 s.

35 + 100 Il

La muestra espera antes de la medición.

5-30 min.

Se mmide OD a

750 nm

Sustrato, 2,0 mM de solución de fitato de sodio (cada vez) Ejemplo de preparación de 100 ml: [0238]

Fitato de sodio

0,1 M tampón acetato, pH 4,0

Reactivo complejante Ejemplo de preparación de 200 ml:

[0239] FeSO4.7H2O Solución de heptamolibdato de amonio

Reactivo complejo de parada

0,1847 g hasta 100 ml

14,64 g hasta 200 ml

Ejemplo de preparación de 600 ml de reactivo complejo de parada [0240] 0,5 M H2SO4 200 ml 15 Reactivo complejante 400 ml [0241] Solución de heptamolibdato de amonio

Ejemplo de preparación de 1000 ml: 20

[0242]

(NH4)6Mo7O24.4H2O

10,0 g Ácido sulfúrico 32 ml Agua desmineralizada hasta 1000 ml

[0243] Los resultados se proporcionan a continuación. La columna que indica la actividad relativa proporciona la primera

25 la actividad relativa de la variante y luego la actividad relativa de la fitasa de referencia usada en la determinación. La referencia es el tipo salvaje o variantes n.º 62, 69, 84, 104, 105,113 y/o 138. Las variantes fueron usadas típicamente como referencia cuando la actividad residual del tipo salvaje era muy baja.

Resultados

30 [0244]

Variante n.º

Modificaciones (sustituciones, inserciones o deleciones) Actividad relativa (variante de control/referencia)

005

A132V/Q162R 11 % a 72°C (WT2%)

007

Y179W 12% a 72°C (WT2%)

008

A132V/Q181L 15% a 72°C (WT2%)

011

A132V/E211R 10% a 72°C (WT2%)

012

A132V/D83G 11 % a 72°C (WT3%)

013

A132V/A217G 50% a 72°C (WT2%)

014

A132V/A217S 47% a 72°C (WT2%)

015

A221G 11 % a 72°C (WT2%)

016

R32I 46% a 72°C (WT26%)

017

R32L 38% a 72°C (WT26%)

020

D77G 46% a 72°C (WT26%)

021

D77W 40% a 72°C (WT26%)

023

T95A 44% a 72°C (WT26%)

024

E100W/H363R 42% a 72°C (WT26%)

025

D111S 69% a 72°C (WT26%)

027

D138V/Y48H 48% a 72°C (WT39%)

028-1

K234C 50% a 72°C (WT39%)

028-2

K234V 50% a 72°C (WT39%)

029

K251S 46% a 72°C (WT39%)

030

H363V 40% a 72°C (WT39%)

031

H363R 53% a 72°C (WT39%)

046-1

A132V/A217G 42% a 70°C (WT13%)

046-2

A132V/Q162R/Q181L/A217G 42% a 70°C (WT13%)

047

D293R 30% a 70°C (WT13%)

048

Q93E 22% a 70°C (WT13%)

050-1

P348R/H363R 30% a 70°C (WT13%)

050-2

P348S 30% a 70°C (WT13%)

051

Q69L 20% a 70°C (WT13%)

052

Q245E 19% a 70°C (WT13%)

053

Q9S/D92Y 42% a 70°C (WT13%)

054-2

D92Y/H115L 28% a 70°C (WT13%)

054-re1,2

D92Y/H115M 32% a 70°C (WT17%)

057

N78Q 56% a 70°C (WT28%)

058

K76V 57% a 70°C (WT28%)

061-1

G325K 47% a 70°C (WT28%)

062

E100W/A217G/H363R(reference) 63% a 72°C (WT17%)

063

A217G/K251S 40% a 72°C (WT17%)

064

E100W/A217G/K251S 38% a 72°C (WT17%)

065

E100W/K251S 26% a 72°C (WT17%)

066

A217G 29% a 72°C (WT10%)

067

E100W/I555V/A217G 45% a 72°C (WT9%)

068

Q9S/E100W/R160G/A217G/H363R 45% a 72°C (WT9%)

069

D92Y/E100W/A217G/H363R(reference) 79% a 72°C (WT9%)

070

E100W/H115M/A217G/H363R 41% a 72°C (WT9%)

071

E100W/A217G/P348R/H363R 63% a 72°C (WT9%)

072

Q9S/A89A/D92Y/H115M/A217G/H363R 67% a 72°C (WT9%)

073

A132T 21% a 72°C (WT16%)

Referencia=variante no. 62

075

N78Q/E100W/A217G/H363R 47% a 72°C (62 40%)

076

K76V/N78Q/E100W/A217G/H363R 47% a 72°C (62 40%)

077

D83G/E100W/A217G/H363R 39% a 72°C (62 40%)

078

E100W/Y179W/A217G/H363R 48% a 72°C (62 40%)

079

E100W/A217G/K234V/K251 E/I286T/H363R 60% a 72°C (62 40%)

081

E100W/A217G/K234V/P348R/H363R 50% a 72°C (62 35%)

082

Q9S/R18K/A89A/D92Y/H115M/A217G/K234V/ H363R 61% a 72°C (62 35%)

082v2-1

Q9S/D92Y/H115M/A217G/K234V/H363R 61 % a 72°C (62 35%)

083

Q9S/N78Q/D92Y/L112S/H115M/K234V/P348R/ H363R 39% a 72°C (62 35%)

084

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ Q181L/A217G/K234V/P348R(reference) 64% a 72°C (62 35%)

Referencia=WT y/o variante n.º 69

085

Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C/ A217G/H363R 82% a 72°C (69 74% WT 14%)

086

E54C/N78S/D92Y/A101C/H143C/L199C/A217G/ H363R 74% a 72°C (wt 49% 69 80%)

088

E54C/A101C/M168V/A217G/H363R 33% a 72°C (62 36% 69 73%)

089-1

P82S/D92Y/E100W/H143C/I201C/A217G/H363R 65% a 72°C (62 36% 69 73%)

089-2

P82S/D92Y/E100W/H143C/I201C/A217G/H363R 65% a 72°C (62 36% 69 73%)

090

Q9S/N78Q//D92Y/L112S/H115M/A217G/K234V/ P348R/H363R 65% a 72°C (62 36% 69 73%)

091

D92Y/A217G/K234V/H363R 81% a 72°C (62 36% 69 73%)

092-1

Y64S/D92Y/E100W/Y179W/A217G/H363R 80% a 72°C (69 74% WT 14%)

092-2

D92Y/A217G/H363R 80% a 72°C (69 74% WT 14%)

094

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/H143C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R 54% a 74°C (wt 9% 69 45%)

095

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R 75% a 74°C (wt 9% 69 45%)

097

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ Y179W/Q181L/A217G/K234V/P348R 76% a 74°C (wt 9% 69 45%)

100

D33C/D92Y/E100W/Y179C/A217G/H363R/ 49% a 72°C (69 79%)

103-1

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ 103% a 72°C (69 88%)

Variante n.º

Modificaciones (sustituciones, inserciones o deleciones) Actividad relativa (variante de control/referencia)

Y179W/A217G/K234V/P348R/H363R

103-3

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/ Y179W/A217G/K234V/S261 F/P348R/H363R 99% a 72°C (69 88%)

Referencia=variante 69 y/o variante 84

101

D92Y/E100W/A217G/H363R/+ 116-123(HQQNTQQA 21% a 76°C (69 39%, 84 55%)

>TQADTSSP)

102

Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C/ A217G/N298S/H363R +116-123(HQQNTQQA>TQADTSSP) 29% a 76°C (69 39%, 84 55%)

104

Q9S/N78Q/A69A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ G151 D/Q162R/Y179W/Q181L/I201 C/A217G/ K234V/P348R(reference) 55% a 74°C (69 57% 84 65%)

105

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R (reference) 77% a 74°C (69 57% 84 65%)

Referencia=variante 104 y variante 69

106

E54C/D92Y/A101C/M168V/A217G/H363R 22% a 74°C (104 70% 69 54%)

107

Q9S/N78Q/A132V/K139C/Q162R/Y179W/I201C/ A217G/K234L/P348R/H363R 34% a 74°C (104 70% 69 54%)

Referencia=variante 105

108

D92Y/E100W/H143C/A144R/I201C/A217G/ N247D/H363R 37% a 80°C (105 36%)

109

D92Y/E100W/H116S/K139C/1201C/A217G/ N247D/H363R 43% a 78°C (105 36%)

110

D92Y/E100W/H128R/K139C/H143V/I201C/ A217G/N247D/H363R 44% a 78°C (105 36%)

111

D92Y/E100W/K139C/I201C/N206G/A217G/ N247D/H363R 45% a 78°C (105 36%)

112

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ H363R 51% a 78°C (105 36%)

113

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ Q256D/H363R 98% a 78°C (105 36%)

114

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ H363R 49% a 78°C (105 36%)

115

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ N344K/H363R 32% a 78°C (105 36%)

117

D92Y/E100W/K139C/A144S/K176E/I201C/ A217G/K234V/N247D/H363R 38% a 80C (105 34%)

118

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/H363R/E54C/H55E/A101C 32% a 80C (105 34%)

123

D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 27% a 80C (105 15%)

124

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/ A217G/K234V/N247D/H363R 17% a 80C (105 15%)

125

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/S284C/H363R 20% a 80C (10515%)

126

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/T287W/H363R 20% a 80C (105 15%)

Referencia=variante 104 y variante 69

127

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289M/H363R 18% a 80C (105 15%)

128

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/R289W/H363R 17% a 80C (10515%)

Variante n.º

Modificaciones (sustituciones, inserciones o deleciones) Actividad relativa (variante de control/referencia)

129

N78Q/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 103% a 80C (105 34%)

130

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/P348R/H363R 99% a 80C (105 34%)

131

D92Y/E100W/K139C/Q162R/Q181L/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 76% a 80C (105 34%)

132

D92Y/E100W/A113G/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 34% a 80C (105 34%)

133

D92Y/E100W/T120GorA*/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247D/H363R/L395LorV 41% a 80C (105 34%)

135

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/S284M/H363R 24% a 80C (105 34%)

137

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/H363R/A366S 31 % a 80C (105 34%)

138

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247W/Q256D/H363R 89% a 80C (10514%)

140

D92Y/E100W/H128R/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247E/Q256D/H363R 49% a 80C (10514%)

141

D92Y/E100W/K139C/Q141S/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 24% a 80C (105 14%)

142

D92Y/E100W/K139C/A144S/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R 18% a 80C (10514%)

144

P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/K139C/ 1201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 71 % a 80C (105 30%)

145

D92Y/E100W/K139C/D173N/P175S/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 27% a 80C (105 30%)

147

D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/I294T/H363R 90% a 80C (105 26%)

Referencia=variante 113

143

D33N/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 29% a 80C (113 62%)

148

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q1256D/H363R 74% a 80C (113 80%)

150

D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 67% a 82C (113 33%)

151

D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R 29% a 82C (113 33%)

152

D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/L199S/ 1201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 38% a 80C (113 80%)

153

Y48H/D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/ I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 38% a 80C (113 54%)

Referencia=variante 113

154

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R 91% a 80C (113 73%)

155

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/1201C/ A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 88% a 80C (113 80%)

156

D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/I201C/ 41% a 82C (113 33%)

A217G/K234V/N247W/Q256D/R289W/H363R

157

Y48H/D92/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247W/Q1256D/R289W/H363R 79% a 80C (113 80%)

158

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247W/Q256D/H363R 95% a 80C (113 80%)

159

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/ 20% a 80C (113 57%)

Variante n.º

Modificaciones (sustituciones, inserciones o deleciones) Actividad relativa (variante de control/referencia)

A217G/K234V/N247D/R289W/H363R

160

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 92% a 80C (113 80%)

161

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/ 1201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 55% a 80C (113 80%)

162

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/ K234V/N247W/R289W/H363R 56% a 80C (113 80%)

163

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247W/R289W/H363R 66% a 80C (113 80%)

Reference=variant 138

164

Y48H/E54C/D92Y/E100W/A101C/K139C/T152A/ 1201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R 94% a 80C (138 78%)

165

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 65% a 80C (138 78%)

166

T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R 15% a 80C (138 78%)

167

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R 61 % a 80C (138 78%)

Referencia=wt

168

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/ Q256D/H363R 69% a 80C (w 7%)

169

E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/I201C/A217G/H363R 33% a 80C (w 7%)

170

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/V208T/ A217G/H363R 32% a 80C (w 7%)

171

E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/I201C/V208T/A217G/H363R 36% a 80C (w 7%)

172

Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/ A101C/K139C/T152A/I201C/V208T/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R 48% a 80C (w 7%)

173

E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/I201C/V208T/A217G/K234V/N239S/N247D/ Q256D/H363R 50% a 80C (w 7%)

Ejemplo 4. Termoestabilidad

[0245] Una alícuota de la muestra de proteína de fitasa Hafnia alvei (purificada como se describe en el ejemplo 1) fue bien desalada y cambiado de búfer en 20 mM de Na-acetato, pH 4,0 usando una columna preempaquetada PD-10 dializada contra 2 x 500 ml 20 mM de Na-acetato, pH 4,0 a 4° C en un paso de 2-3h seguido por un paso durante toda la noche. La muestra fue 0.45 Im filtrada y diluida con tampón para aprox. 2 unidades A280. El tampón de diálisis fue usado como referencia en la calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las muestras fueron desgasificadas usando succión de vacío y agitación por aprox. 10 minutos.

[0246] Se realizó una calorimetría por análisis diferencial fue en un calorímetro VP-DSC de MicroCal a una tasa de

5 barrido constante de 1,5 °C/min de 20-90 °C. La manipulación de datos fue realizada usando el software Origin de MicroCal (versión 4.10) y la temperatura de desnaturalización, Td (también llamada la temperatura de fusión, Tm) se define como la temperatura en el ápice del valor máximo en el termograma.

[0247] Los resultados de la calorimetría por análisis diferencial para variantes de fitasa Hafnia alvei se resumen en la 10 tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Termoestabilidad comparativa de fitasas Hafnia alvei

Variante

1.º calorimetría Td (°C)

A150C/L259C

62,4

Q162N/R96N

63,8

L16V/I1310L/I313L/M319L/M354L

64,3

V87I/L103A/L112I/A113T/I114V

67,4

E66C/L370C

67,2

H363R

68,3

Q162N/G186S

67,5

E54C/A101C

68,0

V130L/M137L/V146I/I120V/M260L/I266V

67,8

wt

69

K45P

70,9

K139C/I201C

70,8

E54C/A101C/K139C/I201C

72,6

D92Y/E100W/A217G/H363R

75,1

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132/ K139C/Q162/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R

75,5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R

77,7

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R

78,0

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R

78,9

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R

79,8

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R

80,0

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/1201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R

80,2

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R

81,7

Y48H/D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256/H363R

82,7

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

83,1

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

84,2

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/G186S/I201C/K207Q/G346S

71,9

Ejemplo 5. Perfil de temperatura

[0248] El perfil de temperatura (actividad de fitasa como una función de temperatura) fue determinado para fitasa Hafnia alvei y las variantes en el intervalo de temperatura de 20-90°C esencialmente como se describe anteriormente ("Determinación de la actividad de fitasa"). Sin embargo, las reacciones enzimáticas (100 microlitros de solución enzimática con fitasa + 100 microlitros de sustrato) fueron realizadas en tubos PCR en vez de en placas de 5 microtitulación. Después de un periodo de reacción de 15 minutos a temperatura deseada los tubos fueron enfriados a 20° C durante 20 segundos y 150 microlitros de la mezcla reactiva fueron transferidos a una placa de microtitulación. 75 microlitros de reactivo de parada fueron añadidos y la absorbancia a 405 nm fue medida en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. Los resultados se resumen en la Tabla 4 de abajo. Los números dados para cada temperatura son actividad relativa (en %) normalizados al valor en condiciones óptimas. 10

Tabla 4: Perfiles de temperatura relativa en estabilidad del orden de 75°C

Variante de fitasa

Temperatura (°C)

20

30 40 50 60 65 70 75 80 85 90

*wt

18 29 50 75 100 94 93 24 12 7 5

*K131Q

21 34 53 77 94 99 100 26 16 10 6

Q162N/D138N

17 28 44 66 88 100 95 26 14 9 7

1294L

18 30 46 64 90 100 90 26 14 11 11

G72A

17 29 45 67 83 100 78 26 13 11 8

H143C/I201C

10 22 37 62 85 100 91 26 5 5 4

Q162R

18 30 49 73 91 100 95 26 15 11 9

I49L

17 29 45 65 90 100 94 26 13 9 11

*E66C/L370C

15 27 43 66 100 88 99 27 12 6 5

T369S

18 28 47 64 92 100 95 27 15 11 9

I201V

16 27 41 59 78 100 82 27 13 11 8

K148R

19 35 51 71 98 97 100 27 11 7 6

A163K

14 27 38 63 79 100 93 27 12 9 6

S1QS

15 26 40 62 87 93 100 27 9 4 2

F8M

15 27 38 67 96 100 91 27 10 5 5

F8Y

16 27 44 69 96 100 93 27 10 6 6

T242S

18 30 48 66 91 100 93 27 12 11 10

K176R

17 33 43 66 100 96 96 28 8 5 3

S403N

14 32 42 67 84 100 96 28 14 10 8

S1P

17 27 44 60 87 100 92 28 13 11 8

E41Q

16 28 44 63 87 100 99 28 13 9 9

*K131L

18 30 50 72 85 95 100 29 15 8 4

*K207R

18 30 48 70 88 93 100 29 15 8 5

*K207Q

23 37 58 81 92 97 100 29 18 10 7

G346S

16 28 47 65 95 100 92 29 10 6 4

T308A

9 17 33 56 80 99 100 29 12 9 6

S396K

19 31 44 69 86 100 87 30 14 12 10

L401N

14 33 43 68 86 100 87 30 13 10 7

I201G

16 28 43 62 81 100 87 30 14 11 8

P348R

18 30 43 62 81 100 91 31 14 11 8

E100W

18 29 40 61 79 100 85 31 13 10 7

K187E

16 28 39 66 90 100 92 31 10 -6 4

N239R

19 30 48 66 89 100 96 32 12 11 10

A304V

15 24 42 58 86 100 98 32 14 11 8

S396D

16 28 41 60 81 100 87 32 13 10 8

T152G

16 28 42 66 85 100 95 32 14 10 9

K12R

18 29 42 64 82 100 98 33 14 12 8

1303L

17 27 40 62 86 100 88 33 13 11 10

Q162N

16 27 42 62 89 90 100 34 10 7 3

S192A

17 26 43 59 88 100 94 35 13 9 9

T369D

18 29 43 66 86 100 90 35 14 12 11

V130L/M137L/V146I/I201V/ M260L/I266V

13 25 43 67 89 98 100 35 14 10 6

Q109G

17 33 44 68 94 100 94 36 11 6

N239K

19 31 47 70 92 100 94 38 14 12 11

K234V

17 29 42 63 79 100 94 39 15 11 8

K234E

17 27 43 61 86 100 92 40 15 11 7

H363R

18 28 42 66 90 100 90 41 11 6 5

S261A

13 24 39 62 83 98 100 41 14 10 7

A217G

14 32 41 65 84 100 90 43 15 11 7

E54C/A101C/K207Q

21 33 48 68 89 100 95 55 13 10 6

K45P

19 29 43 68 86 100 93 59 18 11 10

E54C/A101C

16 27 42 64 85 100 88 64 9 7 4

D33C/E54C/A101C/Y179C

16 31 45 67 94 100 82 74 9 6 3

E54C/A101C/K139C/I201C/ K207Q

18 30 41 62 85 80 100 84 36 9 10

D92Y/E100W/A217G/H363R

6 13 27 50 89 85 100 84 32 10 5

E54C/A101C/K139C/I201C

15 28 40 59 86 78 100 86 47 8 9

K139C/I201C

18 25 37 56 91 91 100 87 15 7 4

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/ K139C/Q162N/G186S/I201C/ K207Q/ G346S

26 37 49 67 80 100 92 90 18 13 10

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/K207Q/ V208T/A217G/K234V/N247D R289W/ H363R

10 20 39 63 85 81 100 92 58 11 6

T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/ D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201C/A217G/K234V/

5 9 28 50 77 80 100 93 13 5 1

N247D/R289W/H363R

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/V208T/ A217G/K234V/N247D/ R289W/ H363R

5 13 26 53 76 83 100 95 75 11 4

E54C/D92Y/A101C/K139C/ I201C/A217G/H363R

10 15 28 52 81 93 100 96 83 10 1

E54C/D92Y/A101C/K139C/ I201C/A217G/K234V/N247D/ Q256D/ H363R

9 16 33 58 81 84 100 96 79 18 6

D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/ K234V/N247D/ H363R

6 13 27 49 85 84 100 98 71 13 6

P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247D/Q256D/ H363R

6 15 30 51 81 82 100 98 76 20 5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/

8 11 25 44 78 88 100 99 68 10 2

1201C/A217G/K234V/N247D/ R289W/ H363R

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/ A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/ K234V/P348R

8 16 32 54 85 86 100 100 81 14 6

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ 1201C/A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R

3 12 24 46 77 89 85 100 75 14 1

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ T152I/I201C/A217G/K234V/ N247D/ H363R

4 12 24 45 76 92 87 100 66 14 4

D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/ H363R

9 16 22 47 70 81 89 100 78 24 6

D92Y/E100W/K139C/D173N/ P175S/I201C/A217G/K234V/ N247D/ Q256D/H363R

6 16 37 52 81 89 88 100 37 9 3

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ I201C/ V208T/A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R

9 15 22 47 76 91 90 100 68 18 6

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R

9 16 26 57 78 89 90 100 80 21 7

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ 1201C/A217G/K234V/N247W/ Q256D/ H363R

9 12 19 46 68 76 85 100 77 29 4

Y48H/D92Y/E100W/K139C/ T152A/I201C/A217G/K234V/ N247W/Q256D/H363R

8 12 20 46 66 78 80 100 81 33 4

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/A217G/

4 8 21 44 80 91 88 100 81 17 3

K234V/ N247D/R289W/ H363R

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/1201C/A217G/K234V/ N247W/ R289W/H363R

7 13 22 48 76 87 84 100 82 24 6

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201C/A217G/K234V/ N247W/R289W/H363R

5 11 20 46 77 89 79 100 81 27 4

Tabla 5: Estabilidad térmica a 75º C, actividad relativa a la actividad máxima

Mutación

Actividad relativa

wt

24

K131Q

26

Q162N/D138N

26

I294L

26

G72A

26

H143C/I201C

26

Q162R

26

I49L

26

E66C/L370C

27

T369S

27

I201V

27

K148R

27

A163K

27

S1QS

27

F8M

27

F8Y

27

T242S

27

K176R

28

S403N

28

S1P

28

E41Q

28

K131L

29

K207R

29

K207Q

29

G346S

29

T308A

29

S396K

30

L401N

30

I201G

30

P348R

31

E100W

31

K187E

31

N239R

32

A304V

32

S396D

32

T152G

32

K12R

33

1303L

33

Q162N

34

S192A

35

T369D

35

V130L/M137L/V146I/I201V/ M260L/I266V

35

Q109G

36

N239K

38

K234V

39

K234E

40

H363R

41

S261A

41

A217G

43

E54C/A101C/K207Q

55

K45P

59

E54C/A101C

64

D33C/E54C/A101C/Y179C

74

E54C/A101C/K139C/I201C/ K207Q

84

D92Y/E100W/A217G/H363R

84

E54C/A101C/K139C/I201C

86

K139C/I201C

87

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/ K139C/Q162N/G186S/I201C/K207Q/G346S

90

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201 C/K207QN208T/A217G/ K234V/N247D R289W/H363R

92

T35A/Y48H/E54C/P75N/ K76N/ D77Q/N78T/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201 C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R

93

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/ T152A/I201CN208T/ A217G/ K234V/N247D/ R289W/ H363R

95

E54C/D92Y/A101C/K139C/ I201C/ A217G/H363R

96

E54C/D92Y/A101C/Kl39C/ I201C/A217G/K234V/N247D/ Q256D/ H363R

96

D92Y/E100W/K139C/I201C/ A217G/ K234V/N247D/ H363R

98

P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/ E100W/K139C/I201C/ A217G/K234V/N247D/ Q256D/H363R

98

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/ R289W/ H363R

99

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/ A132V/K139C/ Q162R/Q181 L/I201C/A217G/ K234V/ P348R

100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/1201 C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R

100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152VI201C/A217G/K234V/N247D/H363R

100

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/ H363R

100

D92Y/E100W/K139C/D173N/ P175S/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/ H363R

100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/1201C/V208T/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R

100

Y48H/E54C/D92Y/A101 C/K139C/I201 C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R

100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/1201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

100

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

100

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/ H363R

100

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R

100

Y48H/E54C/D92Y/A101C/ K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247W/R289W/H363R

100

Ejemplo 6. Perfil de pH

[0249] El perfil de pH se determinó a 37°C en el intervalo de pH de 2,0 a 7,5 (en pasos de 0,05 unidades de pH) como se describe eanteriormente en la sección"Determinación de la actividad de fitasa" , exceptuando que se usó un cóctel de tampón (50 mM de glicina, 50 mM de ácido acético y 50 mM de bis-tris en vez del tampón de 0,25 M de acetato sódico pH 5,5. Los resultados se resumen en la Tabla 1 de abajo. Los valores dados para cada pH en el intervalo de 2, 0-7, 5 son la actividad relativa en % normalizada al valor óptimo.

Tabla 6: Perfiles de pH relativos a 37º C

Mutación/pH

2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5

K26P

72 89 100 96 81 67 55 37 21 8 1 3

K26Q

40 69 91 100 98 95 84 59 35 12 -1 1

K26R

48 66 85 100 99 98 87 64 40 14 2 -1

D92Y/E100W/ A217G/H363R

63 78 94 100 95 76 46 20 7 1 -1 9

Q9S/N78Q/A89A/ D92Y/H115M/ A132V/K139C/ Q162R/Q181L/ 1201C/A217G/ K234V/P348R

50 68 90 100 99 79 42 17 3 0 0 5

T35C/L172C

39 65 87 100 99 94 73 51 30 10 1 1

D92Y/E100W/ A217G/H363R

63 78 94 100 95 76 46 20 7 1 -1 9

Q9S/N78Q/A89A/D9 2Y/H115M/A132V/ K139C/Q162R/Q181 L/ I201C/ A217G/ K234V/P348R

50 68 90 100 99 79 42 17 3 0 0 5

H143C/I201C

49 71 89 100 93 90 77 55 33 12 2 0

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/K139C/ I201C/A217G/ K234V/N247D/

42 65 89 100 98 85 53 21 7 1 0 -1

R289W/ H363R

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/K139C/ T152A/I201C/ A217G/K234V/N247 W/R289W/H363R

47 62 89 100 97 85 52 18 6 0 0 0

T35A/Y48H/E54C P75N/K76N/D77Q/ N78T/D92Y/A101C/ K139C/T152A I201C/A217G/ K234V/N247D/ R289W/H363R

41 74 88 100 96 78 49 17 5 0 -1 -2

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/ K139C/ T152A/ I201C/ A217G/ K234V/ N247D/R289W/ H363R

39 70 87 100 94 82 52 21 7 2 1 -1

E54C/D92Y/A101C/ K139C/ I201C/ A217G/H363R

40 65 87 100 99 88 57 23 7 1 0 -1

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/ K139C/ T152A/I201C/ V208T/ A217G/

40 70 84 100 98 90 65 29 11 3 1 -1

K234V/N247D/ R289W/H363R

K131P

50 64 83 95 100 99 95 83 65 36 5 3

K131Q

51 67 82 98 100 99 95 80 69 39 7 -2

K207R

38 51 71 85 100 97 95 81 50 27 3 3

D33C/Y179C

40 53 72 86 100 92 83 65 38 18 2 5

G325C/T358C

40 54 78 93 100 100 90 68 41 16 0 -3

H228C/H363C

36 53 75 92 100 97 88 67 38 16 2 -1

A150C/L259C

36 57 78 95 100 97 89 64 42 16 3 -2

D92Y/E100W/ K139C/I201C/ A217G/N247D/ H363R

58 73 90 99 100 84 49 20 6 1 -1 3

D92Y/E100W/ K139C/I201C/ A217G/K234V/ N247D/ H363R

58 73 90 99 100 84 49 20 6 1 -1 3

T308A

39 58 79 99 100 94 85 76 55 36 4 -3

E54C/A101C

42 55 77 98 100 90 85 63 0 15 2 1

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/T152I/ I201C/A217G K234V/ N247D/ H363R

54 68 84 98 100 93 54 20 5 0 0 -6

K131Q Q

51 67 82 98 100 99 95 80 9 39 7 -2

I49L

40 62 83 97 100 94 80 58 37 14 2 -1

Y48H/E54C/D92Y /A101C/ K139C/ I201C/A217G/ K234V/ N247W/ R289W/H363R

42 62 87 96 100 81 50 22 6 0 0 -1

Q162N

40 66 75 96 100 93 91 73 47 22 6 1

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/201C/ A217G/K234V/ N247D/R289W/ H363R

46 69 86 95 100 79 55 23 9 2 0 0

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/T152A/ 1201 C/A217G/ K234V/ N247W/ Q256D/H363R

41 59 75 94 100 95 66 24 6 1 0 -1

E66C/L370C

33 58 80 94 100 100 87 66 41 14 2 0

E41Q

44 62 78 93 100 97 86 68 41 17 3 0

Q109G

37 57 77 92 100 100 96 73 48 23 41 0

A163K

47 63 75 92 100 99 89 67 41 13 3 0

Y48H/D92Y/E100W/ K139C/I201C/ A217G/K234V/ N247D/Q256D/ H363R

50 55 72 91 100 91 57 19 4 -1 -1 -1

A304V

53 60 82 91 100 95 88 68 45 19 3 3

E54C/D92Y/A101C/

35 48 68 90 100 94 64 22 6 0 -1 -1

K139C/I201C/ A217G/K234V/ N247D/ Q256D/ H363R

P75N/K76N/D77Q/ N78T/ D92Y/ E100W/K139C/ I201C/A217G/ K234V/N247D/ Q256D/H363R

42 55 71 88 100 95 62 23 6 0 0 0

D92Y/E100W/ K139C/I201 C/ A217G/K234V/ N247W/Q256D/ H363R

37 51 65 89 100 97 69 20 2 -3 -5 -4

Y48H/D92Y/T98S/ E100W/ K139C/ T152A/I201C/ A217G/K234V/ N247W/Q256D/ H363R

39 50 69 89 100 99 73 28 8 0 -1 -1

K234E

44 53 75 88 100 99 95 71 47 19 3 1

D92Y/E100W/

44 54 70 87 100 93 62 22 5 1 0 -1

K139C/D173N/ P175S/I201C/ A217G/ K234V/ N247D/ Q256D/ H363R

K207R

38 51 71 85 100 97 95 81 50 27 3 3

D33C/E54C/A101C/ Y179C

37 59 74 84 100 88 82 65 41 21 5 2

Q162N/D138N

39 58 81 95 100 100 91 71 47 21 4 3

Q162R

38 58 78 88 100 100 96 72 48 22 3 0

N285D

45 61 81 96 100 100 97 71 39 18 2 7

E66C/L370C

33 80 94 100 100 87 66 41 14 2 0

46

58 56 79 92 100 100 94 72 47 22 3 2 -1

T369S S192A

46 58 81 90 100 100 93 62 42 15 2 0

Y48H/E54C/D92Y/ A101C/K139C/ T152A/I201C/ K207Q/V208T/ A217G/K234V/ N247D/ R289W/ H363R

36 63 83 96 100 100 85 61 36 14 2 -1

Tipo salvaje

41 57 77 93 99 100 94 75 48 20 3 0

K131L

45 59 75 93 98 100 96 84 71 44 13 -1

D33C/P178C

37 61 77 90 94 100 88 66 43 15 1 1

F63C/L368C

29 55 78 92 98 100 83 65 38 14 2 -1

S1QS

45 56 80 86 99 100 83 63 45 14 3 0

1303L

40 59 75 89 98 100 91 73 45 18 2 0

F8Y

44 59 78 93 98 100 88 64 37 14 3 -4

1201V

36 53 73 91 98 100 88 68 40 13 -1 -2

Y48H/D92Y/E100W/

46 60 76 88 98 100 74 35 10 1 0 1

K139C/I201C/ V208T/A217G/ K234V/ N247D/ Q256D/H363R

K176R

38 58 76 90 97 100 94 72 45 18 0 -4

S1P

46 56 80 90 97 100 84 64 40 15 2 -2

T242S

38 58 73 85 97 100 97 73 48 22 2 -1

S396D

41 54 76 87 97 100 93 71 47 19 4 0

F8M

48 57 71 90 96 100 82 70 40 14 5 1

N239R

32 46 69 93 96 100 98 74 50 24 1 2

N239K

38 52 70 91 96 100 95 73 48 20 3 0

S396K

37 51 72 87 96 100 96 73 46 21 3 -1

K139C/I201C

34 48 69 84 96 100 94 72 45 17 1 -2

K148R P348R

35 57 70 90 95 100 92 75 47 15 1 -1

38

54 73 91 95 100 98 72 48 25 3 1

I201G

36 52 73 93 95 100 89 68 41 14 -1 -5

V130UM137U V146I/I201V/ M260L/I266V

32 53 69 88 95 100 89 71 52 26 8 2

T152G

30 50 67 84 94 100 95 73 47 19 2 0

L401N

30 50 63 87 94 100 100 72 50 23 2 1

I294L

37 53 78 83 93 100 94 73 46 20 2 -1

G346S

34 55 71 86 93 100 90 69 43 18 2 -5

H363R

29 50 67 87 92 100 96 77 49 22 2 0

T369D G72A

35 54 68 82 92 100 90 72 51 18 3 0

35

47 67 85 90 100 80 61 37 14 -1 -2

E54C/A101C/ K139C/I201C

37 49 75 87 90 100 89 66 50 23 6 0

S261A

30 46 69 83 90 100 84 67 43 19 -1 -3

K187E

34 57 72 88 89 100 92 70 44 21 1 -1

E54C/A101C/ K139C/1201C/ K207Q

28 48 65 79 89 100 98 85 71 47 18 1

A217G

39 54 73 85 88 100 85 59 39 -1 -1

K207L

41 52 69 84 92 98 100 92 69 41 11 1

K207Q

38 49 69 83 95 95 100 92 65 45 10 5

S403N

33 51 72 85 99 99 100 77 49 22 1 -1

K45P

34 60 72 90 91 98 100 75 48 23 2 0

E100W

29 44 69 78 93 98 100 84 57 28 3 0

S1QGPS/K26H/ E54C/A101C/ K139C/Q162N/ G186S/I201C/ K207Q/ G346S

38 54 69 83 92 98 100 88 64 29 2 -1

K234V

35 54 65 94 93 96 100 74 44 26 3 1

E54C/A101C/K207Q

34 52 70 85 96 96 100 92 76 47 14 1

K207Q

38 49 69 83 95 95 100 92 65 45 10 5

[0251] 20 IL de cada muestra de enzima purificada se dispensa en un único pocillo de un a placa de 96 pocillos de

Ejemplo 7: Estabilidad del vapor

Método 1

5 [0250] La actividad residual de las moléculas de fitasa después del tratamiento de vapor fue evaluada usando el siguiente ensayo:

10 Corning® (1 x 8 Stripwell™) (Corning, Lowell, MA, EE. UU.) y posteriormente es evaporada a sequedad en un centrifugador de vacío (Genevac EZ-1 Plus, Genevac Ltd, Suffolk, Reino Unido). La incubación de vapor se realiza en un contenedor styropor cerrado con las dimensiones internas 27 x 18 x 20 cm. Las muestras, en bandas abiertas, se colocan aproximadamente 10 cm sobre el fondo del contenedor en una cremallera metálica, para no estar en contacto con el agua.

15 [0252] Un litro de agua hierviendo se vierte en el contenedor, la tapa se cierra y la temperatura del vapor producido es monitoreada usando un termómetro montado en la tapa del contenedor. La incubación procede durante 60 segundos desde el momento que el agua se vierte en el contenedor. Durante este periodo, la temperatura aumenta a aproximadamente 85° C. Inmediatamente después de la incubación, las muestras son enfriadas en hielo, resuspendidas

5 y evaluadas respecto a la actividad de la fitasa usando ensayo de fosfato de p-nitrofenilo colorimétrico (pNPP) (Sigma, Broendby, DK). Cada muestra enzimática es en comparación con una muestra similar que ha sido tratada con vapor para calcular la actividad residual.

[0253] Los resultados se presentan en tablas 7 y 8 más abajo.

10 Tabla 7: Estabilidad al vapor determinada por el método 1

Variante

Actividad residual [%]

Experimento 1

Wt 12

E66C/L370C

23

D33C/E54C/A101C/Y179C

22

Experimento 2

Wt 14

G346S

25

Q109G

22

H143C/I201C

16

Experimento 3

Wt 10

Q162N (realizado dos veces)

31;35

Experimento 4

Wt 20

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R

88

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R

62

D92Y/E100W/K139C/1201C/A217G/N247D/H363R

51

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/ Q256D/H363R

54

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/ A217G/K234V/N247D/H363R

45

Y48H/D92Y/T98S/E100W/K139C/T152A/ I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

86

E54C/D92Y/A101C/K139C/1201C/A217G/ K234V/N247D/Q256D/H363R

91

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/ A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

88

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/ I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R

90

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ V208T/A217G/K234VM247D/R289W/H363R

95

T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/ D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/ N247D/R289W/H363R

81

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/ K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R

95

Experimento 5

Wt 25,9

D92Y/E100W/A217G/H363R

39,5

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R

57,5

Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/ Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R

68,5

Método 2 [0254] En estos experimentos, se usó una configuración modificada por la cual el vapor es provisto desde un generador de vapor y conducido a la caja. Las muestras colocadas en una placa se insertan en la caja a través de un cajón cuando se ha alcanzado la temperatura. Tras la inserción de las muestras, la temperatura cae 4° C. La incubación se realiza durante 30 segundos mientras la temperatura permanece aproximadamente constante a 90° C. Luego la placa es rápidamente quitada de la caja y las muestras son colocadas en el hielo. Las muestras se analizan como en el método 1.Tabla 8: Estabilidad al vapor determinada por el método 2

Variante

Actividad residual [%]

Experimento 1

Wt 15

V130L/M137L/V1461/I201V/M260L/I266V

27

Experimento 2

Wt 6

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/ G186S/I201C/K207Q/G346S

29

Experimento 3

Wt 4

S261A

12

T308A

9

Experimento 4

wt 8

L401N

14

S403N

9

T308A

11

Experimento 5

wt 4

E54C/A101C

9

Experimento 6

wt 6

T152G

10

Experimento 7

wt 5

S1P

10

F8M

14

Experimento 8

wt 3

K139C/I201C

13

Experimento 9

wt 5

S1QS

9

A217G

9

Ejemplo 8: actividad residual de glicación

10 Inactivación por glicación

[0255] El efecto de glicación fue investigado por incubación de variantes de fitasa purificada con glucosa. Para este 0,5mg/ml de enzima en 0,1 M HEPES pH 7,5 se mezcló con 1 M de glucosa y se incubó a 50° C durante 5 h. La

15 actividad de fosfatasa fue medida antes y después de la incubación y los resultados se indicaron más abajo en la tabla 9 Tabla 9: Modifiación de glicación

mutación

Actividad residual

Wt

18%

K26Q 55%

K26R 47%

[0256] Los resultados mostrados arriba indican que la enzima de tipo salvaje es fuertemente inhibida por glicación (18% de actividad residual). Las variantes en la posición K26 son claramente mucho mejores en este aspecto siendo menos afectadas.

5 Ejemplo 9: pruebas de estabilidad de granulación

Mediciones de estabilidad de granulación

[0257] Aproximadamente 50 g de granulado enzimático fue premezclado con 10 kg de alimento durante 10 minutos en

10 un mezclador horizontal pequeño. Esta premezcla fue mezclada con 90 kg de alimento durante 10 minutos en un mezclador horizontal más grande. Del mezclador, el alimento fue llevado al acondicionador (un mezclador de cascada con inyección de vapor) a razón de aproximadamente 300 kg/hora. El acondicionador calentó el alimento a 95 °C (medido a la salida) por vapor de inyección. El periodo de permanencia en el acondicionador fue 30 segundos. Del acondicionador, el alimento fuellevado a una prensa Simon Heesen equipada con boquilla horizontal de 3,0x35 mm y se

15 prensó a gránulos con una longitud de alrededor de 15 mm. Después de la prensa, los gránulos fueron colocados en un refrigerador de aire y enfriados durante 15 minutos.

Formulación del alimento

20 [0258]

74,0% maíz molido 5,0% aceite de soja 20,7% sémola de soja tostada

25 0,3% premezcla de minerales y vitaminas Solivit Mikro 106 12% contenido de agua

Prueba 1

30 [0259] Un polvo consistente en:

1,5 Kg celulosa fibrosa, Arbocel BC200 0,75 Kg ligante de carbohidrato, Avedex W80 11,552 kg sulfato de sodio finamente molido

35 se granula en un mezclador Lödige FM 50 con un líquido de granulación que consiste en:

0.75 Kg ligante de carbohidrato, Avedex W80 2,49 kg peso concentrado de Phytase Hafnia 0,45 kg agua

40 [0260] La granulación se realiza en una manera como se describe en la patente estadounidense n.º 4,106,991, Ejemplo

1. El granulado obtenido se seca en un lecho fluido a un contenido de agua debajo de 1% y tamizado para obtener un producto con elrango de partícula 250 Im a 850 Im. Finalmente, el producto se reviste con 10% de aceite de palma y 22% de carbonato de calcio de una manera descrita en la estadounidense n.º 4,106,991, Ejemplo 22.

Prueba 2

[0261] Un polvo consistente en:

50 1,6 kg de celulosa firbosa, Arbocel BC200

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 12,027 kg desulfato de sodio finamente molido

se granula en un mezclador Lödige FM 50 con un líquido de granulación que consiste en: 55

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80

3.5 kg de concentrado de variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R 0,02 kg de agua

[0262] La granulación, el secado yel cernido se realizan como se indicó anteriormente. Finalmente, el producto se 5 reviste con 9% de aceite de palma y 22% carbonato de calcio en una manera como se indicó anteriomente.

Prueba 3

[0263] Un polvo consistente en: 10 1,6 kg de celulosa firbosa, Arbocel BC200

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 12,013 kg desulfato de sodio finamente molido

15 se granula en un mezclador Lödige FM 50 con un líquido de granulación que consiste en:

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80

3.2 kg concentrado de variante 2 de fitasa 0,30 kg de agua 20

[0264] La granulación, el secado y el cernido se realizan como se indicó anteriormente. Finalmente, el producto se reviste con 9,8% de aceite de palma y 22% carbonato de calcio en una manera como se indicó anteriomente.

Prueba 4

[0265] Un polvo consistente en:

1,6 kg de celulosa firbosa, Arbocel BC200

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 30 12,225 kg desulfato de sodio finamente molido

se granula en un mezclador Lödige FM 50 con un líquido de granulación que consiste en:

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 35 3,50 kg de concentrado de variante E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R

[0266] La granulación, el secado y el cernido se realizan como se indicó anteriormente. Finalmente, el producto se reviste con 9,0% de aceite de palma y 22% carbonato de calcio en una manera como se indicó anteriomente.

40 Prueba 5

[0267] Un polvo consistente en:

1,6 kg de celulosa firbosa, Arbocel BC200

45 0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 12,225 kg desulfato de sodio finamente molido

se granula en un mezclador Lödige FM 50 con un líquido de granulación que consiste en:

50 0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 3,50 kg de concentrado de variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R

[0268] La granulación, el secado y el cernido se realizan como se indicó anteriormente. Finalmente, el producto se reviste con 9,0% de aceite de palma y 22% carbonato de calcio en una manera como se indicó anteriomente.

Prueba 6

[0269] Un polvo consistente en: 1,6 kg de celulosa firbosa, Arbocel BC200

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 12,435 kg desulfato de sodio finamente molido

5 se granula en un mezclador Lödige FM 50 con un líquido de granulación que consiste en:

0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 3,50 kg de concentrado de variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

10 0,30 kg de agua

[0270] La granulación, el secado y el cernido se realizan como se indicó anteriormente. Finalmente, el producto se reviste con 9,7% de aceite de palma y 22% carbonato de calcio en una manera como se indicó anteriomente:

15 Prueba 7

[0271] Un polvo consistente en:

1,6 kg de celulosa firbosa, Arbocel BC200

20 0.80 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 12,193 kg desulfato de sodio finamente molido

se granula en un mezclador Lödige FM 50 con un líquido de granulación que consiste en:

25 0,64 kg de ligante de carbohidrato, Avedex W80 3,50 kg concentrado de variante 5 de fitasa 0,16 kg de agua

[0272] La granulación, el secado y el cernido se realizan como se indicó anteriormente. Finalmente, el producto se

30 reviste con 8,3% de aceite de palma y 22% carbonato de calcio en una manera como se indicó anteriomente. [0273] Las muestras producidas en la prueba 1 a la prueba 7 fueron evaluadas en una prueba de granulación a 95° C, salida del acondicionador. El contenido de fitasa fue medido usando método analítico EB-SM 0559.02 versión 01 (disponible de Novozymes por pedido) antes de la granulación y en los gránulos de alimento después de la granulación. Se encontraron las siguientes actividades residuales de la fitasa:

35 Tabla 10: Estabilidad de granulación

Prueba Actividad residual de fitasa [%] Variante

1 13 Wt

2 26

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R

3 20 D92Y E100W K139C I201C A217G K234V N247D H363R

4 30 E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R

5 26 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R

6 28 Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R

7 43 Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/1201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R

[0274] La conclusión es que las variantes tienen mejor estabilidad de granulación en comparación con la prueba de referencia 1.

40 Ejemplo 10: Rendimiento en el alimento para animales en un modelo in vitro

[0275] El rendimiento en el alimento para animales de una variante de fitasa de la invención es comparada, en un modelo in vitro,con el rendimiento de una proteína de referencia tales como SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y/o SEQ ID NO:6. El modelo in vitro simula condiciones gastrointestinales en un animal monogástrico y correlaciona

45 bien con resultados obtenidos en los ensayos in vivo en animales. La versión usada en este ejemplo simula el buche y estómago de un pollo de engorde. La comparación se realiza de la siguiente manera:

[0276] La actividad de fitasa en la muestra variante se determina como se describe en el Ejemplo 1 bajo "Determinación de la actividad de fitasa".

[0277] Gránulos de alimentación de una prueba de alimento para pollos de engorde- y con maíz, harina de soja y aceite

5 de soja como constituyentes principales- se preincuban a 40° C y pH 4,6 durante 5 minutos seguidos por la adición de dosificaciones adecuadas de las fitasas (se usan dosificaciones idénticas para todas las fitasas que deben evaluarse para permitir comparación), por ejemplo entre 125 y 1000 unidades de fitasa FTU/kg alimentación, o tampón en las muestras de control. Después de 5 minutos de incubación, se añade pepsina (3000 U/g alimento) en una solución de HCl y de esta manera el pH se reduce a 3. Las muestras luego son incubadas a 40° C durante otros 5 minutos.

10 [0278] Las reacciones se detienen y el ácido fítico y los inositol fosfatos se extraen mediante adición de HCl a una concentración final de 0, 5 M e incubación a 40° C durante 2 horas, seguido de un ciclo de congelación-descongelación y 1 hora de incubación a 40°C.

15 [0279] El ácido fítico y los inositol fosfatos se separan por cromatografía iónica de alto rendimiento como es descrito por Chen et al. en el Journal of Chromatography A (2003) vol. 1018, págs. 41-52 y cuantificado como se describe por Skoglund et al. en J. Agric. Food Chem. (1997), vol. 45, pp. 431-436 .

[0280] La degradación de fitato luego se calcula como la diferencia en el fósforo ligado al inositol fosfato (IP6-P) entre la

20 fitasa tratada y las muestras no tratadas. El rendimiento relativo de la variante se calcula como el porcentaje de degradación de filaro por la fitasa de tipo salvaje.

[0281] La degradación relativa de las variantes de fitasa (Ttabla 11) muestra que las variantes son todas capaces de degradadar inositol-6-fosfato en el sistema in vitro aplicado. Candidatos determinados tuvieron mejor rendimiento que el

25 tipo salvaje (por ejemplo, variante: D92Y/E100W/A217G/H363R, variant: Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/0256D/H363R, variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R) mientras que otras no fueron tan eficaces in vitro como el tipo salvaje (por ejemplo, variante: K207Q).

Tabla 11. Degradación in vitro de IP6-P de una dieta a base de semilla de soja/maíz. La degradación de fitato de la 30 variante se calcula como el porcentaje de degradación de fitato por la fitasa de tipo salvaje.

Degradación de fitato de la variante como porcentaje de degradación de fitato por el tipo salvaje (dos números representan datos de dos ensayos diferentes)

Dosificación de fitasa (FYT/kg de alimento)

Variante de fitasa

D92Y/E100W/A217G/H363R

125 181

Como se indica arriba

250 199

D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R

125 74; 101

Como se indica arriba

250 71; 137

Como se indica arriba

500 72

Como se indica arriba

1000 76

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R

125 252; 543

Como se indica arriba

250 219; 347

Como se indica arriba

500 184; 215

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R

125 237; 297

Como se indica arriba

250 160; 246

Como se indica arriba

500 148;197

K207Q

250 57

E54C/A101C

250 119

G346S

250 79

Q162N

250 180

S1QS

255 68*

S1P

277 70*

F8M

246 74*

F8Y

229 71*

K139C/I201C

250 105

S1QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/G186S/I201C/K207Q/G346S

250 90

* Para estos datos el peso fue evaluado a 250 FTU/kg

Ejemplo 11: rendimiento en una prueba de cerdo in vivo

[0282] Evaluación comparativa de los efectos de cantidades valoradas de dos variantes de fitasa Hafnla alveii en la digestibilidad fecal y excreción de fósforo y calcio en cerdos en crecimiento.

[0283] Se utilizaron sesenta y cuatro cerdos blanco grande Landrace cerdos con un peso corporal inicial de 43,55 ± 4,35 kg.

[0284] Los animales fueron alojados en jaulas de corral de piso en una cámara del medio ambiente controlado. Cada corral tenía un suelo con cables soldados revestidos de plástico y estaba equipado con dos pezoneras de agua y cuatro alimentadores individualizados de acero inoxidable. La temperatura ambiente fue 21-22° C y el porcentaje de humedad fue 50 %.

[0285] Los cerdos fueron alimentados con una dieta básica formulada paraa proporcionar fósforo (P) exclusivamente de origen vegetal durante un periodo adaptativo de 14 días. Después de se periodo, fueron asignados en 16 grupos iguales de 4 animales cada uno.

[0286] Fueron alimentados durante 12 días con la dieta básica o esta dieta suplementada con 1000, 2000 U/kg y 4000 U/kg de fitasa Hafnia alveii de tipo salvaje, con 500,1000 y 2000 U/kg de la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R o con 500,1000 y 2000 U/kg de la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V / N247D/H363R.

[0287] Un marcador indigerible (óxido de cromo) se añadió a una concentración de 0,4 % a todas las dietas permitiendo el cálculo del digestibilidad de P y calcio (Ca). El alimento fue distribuido ad libitum en la forma de trituración, bajo control de consumo de alimentación de corral y los animales tenían libre acceso al agua potable. El digestibilidad de Ca no era corregida para la ingesta de Ca con la agua potable.

[0288] Las concentraciones de P Fecal, Ca y Cr fueron medidas al 12.º día del segundo periodo. Las heces fueron muestreadas individualmente, en aproximadamente la misma cantidad al mismo tiempo del día, durante el último 3 días antes de esa fecha. De ese modo, para cada tratamiento dietético y para cada criterio, se han realizadp un total de 12 determinaciones individuales. Todos minerales fueron determinados según los métodos estándares de Association of Official Analytical Chemists (1990) usando un espectómetro Vista-MPX ICP-OES. La digestibilidad aparente (% de la toma) de los minerales fue calculada para el periodo mencionado de 3 días.

[0289] Lac concentración media de P fecal de los animales suplementados con enzima fue muy significativamente inferior a la observada para los animales que ingirieron la dieta de control (a).

[0290] La digestibilidad P dependió de la dosis mejoró muy significativamente con las cinco fitasas en todos grupos suplementados (b). La máxima digestibilidad P fue observada en el la dieta suplementada con 4000 U/kg de Hafnia alvei de tipo salvaje y en el grupo JHP113 con 2000 U/kg.

[0291] La excreción fecal de P fue signficativaamente reducida en todos los animales suplementados con fitasa y para todos los niveles de inclusión evaluada (c).

[0292] El P aparente absorbido fue superior al 2,25 g/kg recomendado para los cerdos en crecimiento en el grupo de 4000 U/kg de Hafnia alvei de tipo salvaje y muy cerca de éste con JHP113 y "C. braakii" de tipo salvaje con 2000 U/kg y 4000 U/kg respectivamente (d).

[0293] Las equivalencias P, consideradas como P suplementario digerido comparativamente con el control no suplementado, fueron altamente signficantivamene superiores al control en las cinco dietas suplementadas con fitasas (e).

5 [0294] La digestibilidadde Ca fue mejorada la excreción fecal de Ca fue reducida con todos enzimas evaluadas y en todo la niveles de inclusión (f).

[0295] El máximo de eficiencia en estos parámetros fue observado con Hafnia alvei de tipo salvaje al nivel de inclusión 10 de 4000 U/kg, mientras que la variante Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C / A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R tuvo el mejor rendimiento al comparar la eficacia con las suplementaciones de 1000 U/kg y 2000 U/kg.

[0296] Los resultados se presentan en la siguiente tabla 12 Tabla 12: Niveles residuales de de parámetros para digestibilidad

Dosis (U/kg)

0

500 1000 2000

(a) concentración fecal de fósforo (mg/g DM)

Peso

14,3 11,5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R

13,7 12,6 11,5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R

14,5 13,9 11,0

Control

18,3

(b) digestibilidad fecal aparente de fósforo (%)

Peso

47,3 50,1

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R

44,1 55,3 58,0

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R

43,1 48,6 51,4

Control

27,9

(c) excreción de fósforo (mg/g DM)

Peso

2,06 1,93

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R

2,14 1,74 1,61

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R

2,16 1,97 1,81

Control

2,80

(d) absorción de fósforo (mg/g)

Peso

1,85 1,94

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R

1,69 2,16 2,22

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R

1,63 1,86 1,91

Control

1,09

(e) equvalencias de fósforo (mg/g)

Wt

0,77 0,86

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R

0,61 1,07 1,14

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R

0,56 0,78 0,83

Control

0,00

(f) Digestibilidad aparente de calcio (%)

Peso

58,9 55,2

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/ N247D/Q256D/H363R

54,1 63,1 63,5

Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/ K234V/N247D/H363R

53,2 55,3 57,9

Control

51,0

LISTADO DE SECUENCIAS

5

[0297] <110> Novozymes A/S

<120> Hafnia phytase

10

<130> 11422.204-WO

<160> 2

15 20

<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1338 <212> DNA <213> Hafnia alvei <220> <221> CDS <222> (1)..(1338)

25

<220> <221> sig_peptide <222> (1)..(99)

30

<220> <221> mat_peptide <222> (100)..(1338)

<400> 1

<210> 2

<211> 446

<212> PRT

<213> Hafnia alvei

<400> 2

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica según se determina a 75° C, midiendo la actividad con respecto a la actividad máxima, con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción y no más de 30 modificaciones en una o varias de las posiciones: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2. El método comprende

   a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción, b) conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante, c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado, d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y e) recuperación de la fitasa.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, donde las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones: 8L,C,M,Y; 32Q,I,L; 33C,N; 41T,Q; 54C,G; 66C; 72A; 76R,V,N; 77K,G,W,Q; 78G,R,K,Q,S,T; 93P,E,N; 95P,A; 101C; 109D,G; 111R, K,S; 131R,Q; 139C,R; 143C,V; 148R; 150C; 152A,G,T,I; 163P,K; 176C,Q,R; 179C,L,W; 187E; 201C,G,V; 207N,L,Q,R; 234L,R,C,V,E; 239R,K; 242S; 259C; 293R,K,N; 294L; 325C,K; 346S,T; 363C,R,K,V; 369S,D; 370C; 396D,E,K y 403N.

3. 3.

   Variante de fitasa con al menos 90% de identidad con SEQ ID N.º:2 y con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica donde dicha estabilidad térmica según se determiina a 75º C, midiendo la actividad con respecto a la actividad máxima, es superior a la estabilidad térmica de la fitasa de SEQ ID N.1º:2 y producida según la reivindicación 1 o 2 con la condición de que la fitasa no es la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2

4. 4.

   Fitasa según la reivindicación 3, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: 8C; 33C; 54C; 66C; 101C; 139C; 143C; 201C; 150C; 176C; 179C; 259C; 325C; 363C y 370C.

5. 5.

   Fitasa según la reivindicación 4, que comprende al menos un conjuntos de modificaciones seleccionado de las siguientes: 139C/201C; 33C/179C; 35C/172C; 36C/177C; 36C/176C; 143C/201C; 54C/101C; 66C/370C y 150C/259C.

6. 6.

   Fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: 93P y 5P.

7. 7.

   Fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 3-6 que es una variante de la fitasa de SEQ ID N.º:2.

8. 8.

   Fitasa según la reivindicación 7, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: F8C; D33C; E54C; E66C; A101C; K139C; H143C; I201C; A150C; K176C; Y179C; L259C; G325C; H363C; y L370C.

9. 9.

   Fitasa según la reivindicación 8, que comprende al menos un consunto de modificaciones seleccionadas de las siguientes: K139C/I201C; Y179C/D33C; L172C/T35C; S177C/P36C; K176C/P36C; H143C/I201C; E54C/A101C; E66C/L370C y A150C/L259C.

10. 10.

    Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: Q93P y K95P.

11. 11.

    Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 7-10 con las modificaciones: V130L/M137L/V146I/I201V/M260L/I266V/E54C/A101C/K207Q, D33C/E54C/A101C/Y179C E54C/A101C/K139C/I201C/K207Q, E54C/A101C/K139C/I201C, S 1 QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/G186S/I1201C/K207Q/G346S, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H3 63R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I1201C/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R,

    E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R, E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,

    5 Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R,

    10 D92Y/E100W/K139C/D173N/P175S/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/V208T/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R,

    15 Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R y Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R.
12. 12. Secuencia de ácidos nucleicos aislados que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fitasa 20 según cualquiera de las reivindicaciones 3-11.
13. 13. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 12 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado.

14. 14.

    Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 13.

15. 15.

    Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 13 y/o el

    vector de expresión según la reivindicación 14. 30
16. 16. Composición que comprende al menos una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-11 y

    (a)

    al menos una vitamina fitosoluble;

    (b)

    al menos una vitamina soluble en agua y/o

    (c) y/o al menos un oligoelemento. 35
17. 17. Composición según la reivindicación 16 que comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o betaglucanasa.

    40 18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 16-17 que es un aditivo de pienso.
18. 19. Método para producir un producto de fermentación, que comprende (a) fermentación usando un microorganismo fermentador de un material que contiene carbohidrato en presencia de una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-11 y (b) producción del producto de fermentación o coproducto de fermentación del material que

    45 contiene carbohidrato fermentado.
19. 20. Método según la reivindicación 19, carecterizado por el hecho de que el producto de fermentación es etanol, cerveza, vino, o granos secos de destilería (DDG).