ES2428513T3 - Composición biofungicida para el control de hongos fitopatógenos - Google Patents

Abstract

Composición biofungicida proveniente de un cultivo biológicamente puro de un aislado bacteriano chileno obtenido de piel de uvas correspondiente a

Description

Composición biofungicida para el control de hongos fitopatógenos

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a bacterias fungitóxicas, específicamente la cepa silvestre Serratia plymuthica CCGG2742 y las moléculas fungitóxicas que secreta, como agentes de control biológico de hongos fitopatógenos, particularmente del hongo Botrytis cinerea causante de la pudrición gris pre- y postcosecha de frutos. Tanto en pre- como postcosecha se puede usar la bacteria como organismo vivo, ya que se trata de un microorganismo silvestre, saprófito y que no presenta patogenicidad para animales ni vegetales. También se puede usar un concentrado de las moléculas secretadas o preparaciones de las moléculas fungitóxicas puras en forma individual.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención corresponde a la provisión de una cepa bacteriana silvestre, caracterizada como Serratia plymuthica CCGG2742 y su uso como biofungicida. Dicha cepa bacteriana ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, España. El número de orden atribuído por la autoridad internacional de depósito es CECT 7404 (ver documento adjunto). Esta bacteria silvestre, autóctona chilena, fue aislada de piel de uvas y tiene la capacidad de matar a distintos aislados y cepas silvestres del hongo fitopatógeno B. cinerea. La capacidad fungicida de la bacteria está dada por la secreción de moléculas fungitóxicas que interaccionan con el hongo destruyéndolo y como consecuencia de ello inhibiendo la germinación de conidios y la proliferación del micelio fúngico.

Muchos de los biofungicidas de uso actual son potencialmente patógenos para el humano y las plantas. En contraposición a ello, Serratia plymuthica CCGG2742 no es patógena ni tóxica para plantas ni frutos y se ha reportado que tampoco sería patógena de animales ni de humanos. Experimentos realizados en el laboratorio revelan que su inoculación en hojas de plantas de poroto y de vides, no produce alteración visible en estos hospedadores después de 7 días de incubación a 20°C en placas que contenían sólo agar-agar al 1,5% (p/v) para mantener la humedad en niveles adecuados. Del mismo modo, cuando se adicionan altos inóculos de la cepa (2 x 1010 ufc (unidad formadora de colonia)/baya) a bayas de uva intactas o con heridas, no se aprecia efecto alguno después de 7 días de incubación en las mismas condiciones descritas anteriormente.

Otro problema de los biofungicidas bacterianos actuales es su baja supervivencia en la superficie de plantas y frutos que se desean proteger del ataque de hongos fitopatógenos. Experimentos realizados en el laboratorio demuestran que la cepa CCGG2742 inoculada en uvas, en dosis de 106-108 ufc/cm2 alcanza niveles en la superficie de la piel del fruto de 103-105 ufc/cm2 y si las bayas del fruto poseen heridas, la población bacteriana aumenta a 105-107 ufc/cm2 a las 24 horas postinoculación a 20°C, manteniéndose estos niveles durante 5-7 días cuando el fruto se almacena a 4°C, protegiéndolo de la infección por B. cinerea.

El agente biológico de la invención corresponde a una bacteria silvestre, aislada del campo, que generalmente está en la piel de uvas y ha sido individualizado por técnicas bioquímicas, microbiológicas, microscopía electrónica y secuenciación del rADN 16S. La S. plymuthica CCGG2742 es una cepa autóctona chilena y corresponde a un organismo saprófito, no patógeno de plantas ni de animales, siendo por lo tanto, adecuado el uso de células vivas como biofungicida contra B. cinerea.

En forma adicional, la presente invención se refiere a composiciones que contengan dicha cepa o a extractos conteniendo la misma, capaces de proteger a las plantas y sus frutos durante los períodos de pre y postcosecha, del ataque por microorganismos fitopatógenos.

La presente invención incluye también a cualquier mutante derivada de la cepa silvestre que posea esencialmente las mismas características.

De igual manera, la invención se refiere al procedimiento para la obtención de dicha cepa bacteriana o sus derivados y a las aplicaciones de la misma en la protección de las plantas, y en especial de los frutos.

Además, la presente invención proporciona una formulación para controlar las enfermedades fúngicas de plantas utilizando la cepa pura Serratia plymuthica CCGG2742. El uso de esta bacteria constituye una alternativa natural para los fungicidas químicos sintéticos, lo que garantiza un medio ambiente más seguro para lograr el control o eliminar las enfermedades producidas por hongos fitopatógenos.

Por último, la presente invención proporciona una composición que contiene a dicha cepa en forma y cantidad adecuada para su actividad biológica. La mezcla contiene agentes no tóxicos que permiten la adherencia de la bacteria al vegetal sobre el cual se inocula, nutrientes vegetales y preservantes en cantidades inocuas, pudiendo encontrarse como suspensión líquida o polvo obtenido por liofilización.

Antecedentes de la Invención

Las enfermedades causadas por hongos fitopatógenos se consideran como las más nocivas y de mayor propagación a nivel mundial. En la actualidad el control de estas enfermedades está basado fundamentalmente en el uso de fungicidas químicos que a pesar de su alta toxicidad, tanto para el vegetal como para las personas que los manipulan y/o realizan trabajos en campos fumigados, y a su escasa biodegradabilidad, se siguen usando masivamente debido a su relativamente eficiente actividad contra las enfermedades fúngicas, sumado a la falta de alternativas eficaces y ambientalmente más seguras.

Botrytis cinerea es un hongo fitopatógeno que infecta a un gran número de especies vegetales de gran importancia económica incluyendo árboles frutales, plantas ornamentales y hortalizas. Este hongo produce una enfermedad conocida como pudrición gris generando un grave problema pre y postcosecha en frutillas, frambuesas, manzanas, peras, castañas, kiwi y uvas entre otras. En la vid este hongo produce la pudrición del racimo, enfermedad que se considera actualmente como una de las más serias a nivel de producción de frutas de exportación en Chile, ya que es capaz de provocar grandes pérdidas no sólo a nivel de campo sino que también durante su almacenamiento y traslado (van Kan J. A. 2006. Licensed to kill: the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen, Trends Plant Sci. 11, 247-253; Elad, Y., Williamson, B., Tudzynski, P. and Delen, N. eds. 2007. Botrytis: Biology, Pathology and Control. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers).

El control actual de este importante hongo fitopatogénico se realiza mayoritariamente con fungicidas químicos, sin embargo, en los últimos años se han descrito algunos microorganismos con actividad antifúngica contra B. cinerea. Uno de los ejemplos más promisorios es el Serenade®, cuyo principio activo es la bacteria Bacillus subtillis QST 713, descubierta en muestras de suelo de un huerto por la empresa AgraQuest Inc. en Davis, California. Este biofungicida está registrado en varios países, incluyendo Chile, tiene baja toxicidad y se está utilizando comercialmente en Estados Unidos para el control de enfermedades como oídio (Uncinula necator), pudrición gris por Botrytis cinerea y pudrición ácida en vides.

En la patente US 5.869.038 se describen aislados bacterianos de las especies Pseudomonas fluorescens, Serratia liquefaciens, Serratia plymuthica, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis y Bacillus polymyxa que son efectivos para inhibir el crecimiento de Botrytis cinerea y Alternaria brassicicola, hongos causantes de enfermedades postcosecha en coles. La bacteria Serratia plymuthica descrita en dicha patente, corresponde a la cepa CL43, distinta de la cepa del presente invento y conviene usarla mezclada con las bacterias anteriormente mencionadas para inhibir el crecimiento fúngico con una eficiencia adecuada. En cambio, la cepa CCGG2742 como cultivo puro, inhibe eficientemente a B. cinerea y no es necesario mezclarla con otras bacterias para usarla como biofungicida.

En la patente US 6.004.774 se divulga a una cepa de Bacillus subtilis para inhibir el crecimiento de hongos y bacterias patógenas de plantas y se describen métodos para tratar o proteger a las plantas de infecciones por hongos y bacterias.

La patente US 6.077.506 se refiere a una novedosa cepa de Bacillus thuringiensis que exhibe una amplia actividad antifúngica y antibacteriana. Además, se divulga el uso de la cepa bacillus thuringiensis o el antibiótico producido por la cepa para el control de un amplio rango de bacterias y hongos patógenos de plantas.

En la publicación WO 00/57706 se describe un cultivo biológico sustancialmente puro de una cepa bacteriana de Pantoea agglomerans, y su uso como antagonista para el control biológico de los hongos responsables de la podredumbre de la fruta. La efectividad de dicho antagonista resulta ser muy elevada y es comparable a los fungicidas sintéticos más utilizados. El antagonista resulta ser efectivo para combatir la pudrición causada por Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum y Rhizopus stolonifer.

En la publicación WO 02/072795 se divulga un grupo de bacterias antagonistas para la protección de plantas contra hongos y bacterias fitopatógenas. Las bacterias aisladas son de las especies Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Serratia plymuthica y Bacillus subtilis. En este caso, la cepa Serratia plymuthica VKPM B-7957 también es distinta de la cepa del presente invento, ya que cuando se usa un cultivo puro de esta bacteria, su eficiencia contra hongos fitopatógenos es muy baja y debe usarse en mezclas con otras bacterias que poseen actividad fungicida para potenciar su efecto.

En la publicación WO 03/000051 se divulga un cultivo biológicamente puro, de un microorganismo, Bacillus licheniformis, cepa SB3086 para su uso como un biofungicida.

La aplicación de organismos vivos como agentes de control biológico presenta algunas limitaciones tales como estrecho rango de efectividad contra patógenos de plantas e inestabilidad en el tiempo, lo que se traduce en corta permanencia del organismo vivo en el medio ambiente y por lo tanto, muy baja eficiencia de acción como biopesticida. Muchas de las cepas bacterianas utilizadas se mueren en algunas semanas al someterlas a las condiciones de almacenamiento estándares o dentro de horas en las condiciones típicas a que se enfrentan en el campo, con temperaturas relativamente altas y los efectos nocivos de la luz UV sobre el microorganismo en crecimiento activo. De cierta utilidad han resultado los intentos de cultivar dichos microorganismos en el mismo sitio donde deberían aplicarse. Sin embargo, se presentan serios problemas de contaminación de los cultivos y la necesidad de aplicar tardíamente en el día el agente de biocontrol para evitar los efectos de la luz UV y la temperatura, complicando el sistema y encareciendo el proceso.

Pruebas Bioquímicas

Producción de indol (IND) -Triptófano desaminasa (TDA) -Reacción de Voges- Proskauer (VP) + DNasa + Catalasa + Utilización de malonato (MAL) -

Es por estos motivos que hasta el momento no se ha logrado diseñar un método de control biológico eficaz y amigable con el medio ambiente, que permita inhibir el daño a las plantas originado por enfermedades fúngicas, lo que constituye un gran desafío para los científicos y una gran necesidad para la industria agrícola, para disminuir el uso de los fungicidas químicos sintéticos que son de uso masivo en la actualidad.

Es, por lo tanto, objeto de la presente invención, proporcionar un agente biológico eficaz, seguro para el medioambiente, con actividad biofungicida, para el control de enfermedades de plantas producidas por hongos y microorganismos fitopatógenos, particularmente B. cinerea.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es una microfotografía electrónica de barrido de células de Serratia plymuthica CCGG2742. La barra en

el extremo izquierdo inferior representa 1 !m. La Figura 2 corresponde a una microfotografía de Serratia plymuthica CCGG2742. Tinción negativa con fosfotungstato de potasio al 1%.

La figura 3 es una microfotografía de secciones ultrafinas de Serratia plymuthica CCGG2742.

La figura 4 corresponde a un gráfico que muestra el crecimiento de Serratia plymuthica CCGG2742 a distintas temperaturas. La figura 5 corresponde a un gráfico que muestra el crecimiento de Serratia plymuthica CCGG2742 en medios de

cultivos tamponados a distintos valores de pH. La Figura 6 muestra el efecto de la bacteria biofungicida sobre micelio de Botrytis cinerea. La figura 7 muestra la secuencia nucleotídica parcial del rADN 16S de S. plymuthica CCGG2742. La figura 8 muestra el efecto de la bacteria como agente biocontrolador en frutas incubadas a 20°C. La figura 9 muestra el efecto de la bacteria como agente biocontrolador en frutas incubadas a 4°C. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La cepa CCGG2742 corresponde a la especie Serratia plymuthica. Su caracterización mediante las pruebas microbiológicas y bioquímicas es la que se presenta en las Tablas 1, 2 y 3. Produce colonias incoloras/blancas sin pigmentación en agar Luria Bertani (LB) y en agar suplementado con extracto de malta (20 g/L).

Tabla 1. Características morfológicas y fisiológicas de Serratia plymuthica CCGG2742.

Forma

Bacilo

Tinción Gram

Negativa

Motilidad

+

Producción de pigmentos

-

Crecimiento a 4°C

+

Tabla 2. Pruebas bioquímicas para la caracterización Serratia plymuthica CCGG2742. Entre paréntesis se indica el nombre con que es conocida la prueba, y a continuación se indica si la prueba es positiva (+) o negativa (-).

Ornitina decarboxilasa (ODC) -Lipasa (LIP) -Hidrólisis de la esculina (ESC) + Hidrólisis de la gelatina (GEL) + Producción de H2S (H2S) -Reducción de NO3 (NO3) +

Utilización de citrato (CIT)

+

Utilización de sorbitol (SBL)

+

Utilización de tioles alifáticos (TET)

+

Ureasa (URE)

-

Oxidasa

-

Arginina dehidrolasa (ADH)

-

Lisina decarboxilasa (LDC)

-

Producción de N2 (N2)

-

�- Glucoronidasa (GUR)

-

Galactosidasa (ONPG)

+

�-Xilosidasa (B-Xil)

-

�-Glucosidasa

+

N-Acetil-�-D- glucosaminidasa (NAG)

+

Pirronilodil aminopeptidasa (PYR)

-

Tabla 3. Fermentación de hidratos de carbono por Serratia plymuthica CCGG2742. Se indican las reacciones positivas (+) y negativas (-), además la abreviatura utilizada para cada prueba se indica entre paréntesis.

Fermentación de Polioles

Fermentación de H. de Carbono

Adonitol (ADON) Manitol (MAN) Inositol (INO) Sorbitol (SOR) Glicerol (GLY) Eritritol (ERY) Xilitol (XLT) D-Arabitol (DARL) L-Arabitol (LARL)

-+ -+ + ---- L-Sorbosa (SBE) Dulcitol (DUL) Inulina (INU) Metil-a-D-manopiranosida (MDM) Metil-a-D-glucopiranosida (MDG) Arbutina (ARB) Salicina (SAL) D-Celobiosa (CEL) D-Maltosa (MAL) D-Lactosa (LAC) D-Trehalosa (TRE) D-Melezitosa (MLZ) D-Rafinosa (RAF) Almidón (AMD) Glicógeno (GLYG) Gentibiosa (GEN) -+ + + -+ + + + + + + -+ -+

Fermentación de H. de Carbono

L-Ramnosa (RHA) D-Sacarosa (SAC) D-Melibiosa (MEL) Amigdalina (AMY) L-Arabinosa (DARA) D-Arabinosa (LARA)

-+ + + + -

D-Ribosa (RIB) D-Xilosa (DXYL) L-Xilosa (LXYL) Metil-�-D-xilopiranosida (MDX) D-Galactosa (GAL) D-Fructosa (FRU) D-Glucosa (GLU) D-Mamnosa (MNE)

+ + --+ + + + D-Turanosa (TUR) D-Lixosa (LYX) D-Tagatosa (TAG) D-Fucosa (DFUC) L-Fucosa (LFUC) Gluconato potásico (GNT) 2-Gluconato potásico (2KG) 5-Gluconato potásico (5KG) --+ -----

Además, se determinó la susceptibilidad de la cepa bacteriana a distintos antibióticos, resultados que se

muestran resumidos en la Tabla 4, donde se indica el antibiótico probado, su concentración y se clasifican según la

familia química a la que pertenece.

Tabla 4. Susceptibilidad de Serratia plymuthica CCGG2742 a distintos antibióticos. Se indica la sensibilidad (S)

o resistencia (R) frente a cada uno de los antibióticos.

Fluoroquinolonas

Macrólidos

Ciprofloxacino 5 1g

S Eritromicina 15 1g R

Cefalosporinas

Aminoglicósidos

Ceftriaxona 30 1g

S Gentamicina 10 1g S

Cefoperazona 75 1g

S Amikacina 30 1g S

Ceftazidima 30 1g

S

Cefotaxima 30 1g

S Nitrofuranos

Cefazolina 30 1g

R

Cefadroxilo 30 1g

R Nitrofurantoína 300 1g R

Cefuroxima 30 1g

R

Cefalotina 30 1g

R Fenicoles

Cloranfenicol 30 1g

S

Penicilinas

Penicilina 10 U

R Glicopéptidos

Oxacilina 1 1g

R

Ampicilina 10 1g

R Vancomicina 30 1g R

Carbenicilina 100 1g

S

Polipéptidos

Amino-penicilinas

Bacitracina 10 U R

Amoxicilina 25 1g

R

Aminocumarinas

Monobactámicos

Novobiocina 5 1g R

Aztreonam 30 1g

S

Otros

Lincosamidas

Sulfatrimetropim 25 1g

S

Clindamicina 2 1g

R

Tetraciclina 30 1g

R

Sulbactam-Ampicilina 10/10 1g

R

A nivel de microscopia óptica, los cultivos están constituidos por bacilos Gram negativos móviles, mientras que a nivel de microscopía electrónica de barrido, se observa claramente la morfología bacilar con un tamaño celular en el rango de 0,7-1,5 !m de largo por 0,6-0,8 !m de ancho (Fig. 1). Los análisis al microscopio electrónico de barrido no permitieron detectar la presencia de apéndices bacterianos. Sin embargo, usando la técnica de tinción negativa y cortes ultrafinos de la bacteria fue posible detectar, al microscopio electrónico de transmisión, la presencia de flagelos perítricos (figuras 2 y 3), lo que concuerda perfectamente con las pruebas de movilidad.

Se determinó el rango de temperatura óptimo para el crecimiento de la cepa bacteriana, el cual va desde 4°C hasta 37°C, no existiendo crecimiento sobre la temperatura indicada. La representación visual de este resultado se puede observar en la figura 4, donde se grafica el crecimiento de la bacteria, medido por DO600nm, a las 12 horas de incubación en cada condición. El rango de temperatura de crecimiento es bastante amplio, dato experimental muy importante ya que se puede usar como biofungicida en período de precosecha de los frutos donde las temperaturas del campo pueden variar desde temperaturas muy bajas en invierno hasta temperaturas bastante altas en verano. Además, durante postcosecha generalmente el fruto se almacena en frío y algunos hongos fitopatógenos como B. cinerea se desarrollan a bajas temperaturas y en esas condiciones de almacenamiento la fruta se pudre. Por ello es de vital importancia que la bacteria sea capaz de crecer a bajas temperaturas para ampliar el rango de este parámetro y poder usarla como un biofungicida de postcosecha.

Adicionalmente, la bacteria es capaz de crecer en un amplio rango de pH (fig. 5), lo que también es una cualidad positiva y le proporciona mayor versatilidad al momento de usarla como biofungicida. Para la determinación del efecto del pH sobre el crecimiento bacteriano, se realizaron curvas de crecimiento en medios de cultivo ajustados a distintos valores de pH. En la Figura 5 se muestra el crecimiento, a las 12 horas de incubación, de la cepa bacteriana frente a distintas concentraciones de protones presentes en el medio. Se encontró que el rango de pH para el crecimiento óptimo de la bacteria está entre 4 y 9 unidades de pH, ambos valores inclusives.

El efecto antagónico de S. plymuthica CCGG2742 contra B. cinerea, se muestra en la figura 6. En (A) y (B) se observan los halos de inhibición producidos por las moléculas fungitóxicas secretadas por la bacteria, las que difunden en el agar impidiendo el crecimiento del hongo. En (A) se utilizaron sensidiscos sin principios activos como controles negativos.

Además de la caracterización microbiológica y bioquímica de la bacteria, se procedió a su caracterización molecular mediante la obtención de la secuencia nucleotídica del rADN 16S y su análisis bioinformático. En la figura 7 se muestra la secuencia nucleotídica parcial del rADN 16S de S. plymuthica CCGG2742 (994 nucleótidos). El alineamiento de esta secuencia con secuencias existentes en bases de datos utilizando Blast, da como resultado lo siguiente:

Tabla 5. Resultados del alineamiento del rADN 16S de Serratia plymuthica CCGG2742 en BlastN. Se indican los valores de los parámetros calculados por el programa informático.

Código de Acceso

Descripción Puntuación máxima Puntuación total Cobertura de la pregunta Valor E Identidad máxima

DQ365586

Secuencia parcial del gen del RNA ribosomal 16S de Serratia plymuthica cepa GS10 1118 1118 65% 0.0 97%

Por lo tanto, las pruebas microbiológicas, bioquímicas, de microscopía electrónica y de secuenciación del rADN 16S, confirman que se trata de una nueva cepa de Serratia plymuthica, aislada de piel de uvas recolectada en Chile y que llamamos CCGG2742.

Parte Experimental

Procedimiento para propagación de la nueva cepa de Serratia plymuthica.CCGG2742.

La propagación de la bacteria se puede realizar tanto en medios de cultivo líquidos como sólidos. Los siguientes medios de cultivo que se describen a continuación, son adecuados para el rápido crecimiento de las células bacterianas y para favorecer la secreción de las moléculas fungitóxicas:

i) Extracto de malta 20 g/L

ii) Medio LB (Luria Bertani). Este medio contiene extracto de levaduras (5g/L), triptona (10 g/L) y NaCl (10 g/L). Se debe ajustar el pH a 7,5.

En cualquiera de estos medios de cultivo después de adicionar el inóculo bacteriano, la incubación se realiza a 20°C por un tiempo mínimo de 12 horas. Para los medios sólidos se adiciona agar-agar 15 g/L.

Determinación de efectos dañinos o patogénicos sobre plantas y frutos.

De acuerdo a los resultados experimentales obtenidos, S. plymuthica CCGG2742, no presenta efectos patogénicos sobre hojas de plantas (poroto y vid) ni frutos (uvas).

El procedimiento experimental fue el siguiente: 10 μL del cultivo bacteriano crecido en LB en distintas diluciones (desde aproximadamente 1 x 106 cfu/mL hasta 2 x 1012 cfu/mL) se inocularon como una gota sobre la piel de la uva intacta (sin daño). También sobre otra baya de uva, se inoculó el mismo volumen (10 μL) de las mismas diluciones del cultivo, pero a través de un pinchazo atravesando la piel del fruto (inyección de las bacterias). La observación de las bayas de uva a los 7 días post-inoculación, no reveló ningún tipo de alteración externa ni interna del fruto inoculado con las bacterias vivas. Estos experimentos se realizaron en triplicado con bayas de uva blanca y rosada. Como control se inocularon bayas en las mismas condiciones descritas anteriormente, pero en lugar de inocularlas con bacterias se les adicionó 10 μL de medio de cultivo LB estéril. Durante todo el período de incubación a 20°C, las frutas fueron mantenidas en placas de vidrio con agar al 1,5% para mantener la humedad.

Determinación de las condiciones de temperatura y pH para el crecimiento óptimo de S. plymuthica CCGG2742

La determinación del rango de temperatura de crecimiento de la cepa bacteriana se realizó en medio extracto de malta (ME; Extracto de malta 20 g/L, Peptona 1 g/L), a las siguientes temperaturas: 4, 10, 20, 25, 30, 35, 37 y 40 °C (fig. 4). Se tomó 1 mL de inóculo bacteriano desde un cultivo crecido durante 16 h, con una densidad óptica a 600 nm (DO600nm) de 0,8, y se inoculó en un matraz Nefelo que contenía 50 mL de ME, y se mantuvo con agitación constante (200 rpm). Se registró la DO600nm en el tiempo, 0-12 h con mediciones cada 1 h, además se midió a 24, 48 y 72 h, en cada una de las temperaturas en que se realizó el ensayo. La DO600nm se midió en un espectrofotómetro (Spectronic 20, Bausch & Lomb). La determinación del rango de pH en que tiene crecimiento la cepa bacteriana se realizó a 30°C, utilizando la misma metodología que la utilizada para la determinación del rango de temperatura, pero para la preparación del medio de cultivo ME se utilizó una solución amortiguadora en vez de agua destilada. Para pH 3, 4, 5 y 7 se utilizó amortiguador fosfato-citrato, para pH 9 amortiguador Tris-HCl y para pH 10 se utilizó amortiguador glicina-NaOH (fig. 5) (Gomori G. 1955. Preparation of buffers for use in enzyme studies. In: Methods in Enzymology. Colowick S., Kaplan N., Eds. 1:138-146). El resultado de la medición del crecimiento a las 12 h se utilizó para construir una representación gráfica del rango de temperatura y pH en que existe crecimiento bacteriano. Cada una de las curvas de crecimiento se realizó en triplicado.

Bioensayos de inhibición del crecimiento del micelio

Las cepas de B. cinerea Bc149 y Bc55L utilizadas en los bioensayos pertenecen a la colección del Laboratorio de Virología de Hongos-USACH, y fueron aisladas desde uvas. Dichas cepas se mantuvieron en agar papa-dextrosa (PDA; Oxoid) hasta la realización de los bioensayos.

Los bioensayos de observación de la inhibición del crecimiento del micelio se realizaron en agar extracto de malta (MEA; extracto de malta 20 g/L; peptona 1 g/L; agar 15 g/L) suplementado con glicerol al 2%. Se tomó un trozo de micelio de 7 mm de diámetro de B. cinerea Bc149 y se sembró en el centro de la placa Petri. La bacteria se inoculó en un extremo (fig. 6A) o en cuatro puntos distantes a 4 cm del centro de la placa (fig. 6B). El inóculo contenía aproximadamente 1 x 106 ufc de la cepa bacteriana. Se observó el crecimiento durante 7 días a 20°C. Como control se realizó el mismo experimento, pero sin la inoculación de la cepa bacteriana. Estos ensayos se realizaron en triplicado.

Efecto biofungicida de la cepa de Serratia plymuthica.

Se inocularon hojas de plantas de poroto y hojas de vides con 105-108 ufc/mL. Se incubaron a 20°C durante 12 horas y luego se aplicó el hongo fitopatógeno asperjando sobre el vegetal suspensiones concentradas de conidios (104106 conidios). Se incubaron durante 4-8 días y se determinó el grado de infección o daño producido en el vegetal,

comparándolo con un control al cual no se le adicionaron esporas del hongo fitopatógeno y a hojas no inoculadas con la bacteria. El experimento se realizó en triplicado. Se observó una adecuada y eficaz protección cuando la bacteria se aplicó preventivamente. También fue efectiva cuando se aplicó simultáneamente con el patógeno 0, 12 horas, o 24 horas después de aplicar el patógeno sobre el vegetal.

Para evaluar el efecto de la bacteria como biocontrolador al encontrarse directamente sobre frutas, se utilizaron racimos de uva de la variedad. Thompson Seedless, cosechadas en la localidad de Colina, Región Metropolitana, Santiago, Chile, que no recibieron tratamiento post-cosecha y que tenían una masa entre 500-620 g. De acuerdo a las condiciones experimentales detalladas en la Tabla 6, los racimos utilizados en las condiciones experimentales 1 y 2 se inocularon directamente. Los racimos de uva utilizados en las condiciones experimentales 3 a 9 y en el control, se lavaron una vez con una solución al 0,5% de hipoclorito de sodio, luego tres veces con H2O destilada estéril y se dejaron secar en un ambiente estéril. Luego, cada racimo fue puesto en una caja plástica, y se aplicó el tratamiento respectivo según la condición experimental.

Tabla 6. Tratamientos aplicados en racimos de uva en cada condición experimental. Se detallan las ufc totales de S. plymuthica CCGG2742 o conidios totales de B. cinerea Bc55L presentes sobre el racimo de uva, según cada condición experimental.

Condición experimental

Suspensión o medio inoculado, 0 h (5 mL) Suspensión o medio inoculado, 24 h* (5 mL)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Control

5 x 108 ufc 5 x 104 conidios 5 x 106 ufc 5 x 108 ufc 5 x 104 conidios 5 x 104 conidios 5 x 104 conidios 5 x 106 ufc 5 x 108 ufc H2O estéril 5 x 104 conidios H2O estéril H2O estéril H2O estéril H2O estéril 5 x 106 ufc 5 x 108 ufc 5 x 104 conidios 5 x 104 conidios H2O estéril

*Corresponde al tratamiento inoculado 24 h después del tratamiento inoculado a las 0 h.

Este experimento se realizó a dos temperaturas, 20°C (fig. 8), donde se observó el desarrollo del patógeno durante 15 días y 4°C (fig. 9), donde se observó el desarrollo del fitopatógeno durante 40 días. Se realizó en triplicado cada condición experimental. En ambas condiciones de temperatura, la cepa CCGG2742 protege eficazmente al fruto contra la infección por B. cinerea. Esta es otra diferencia importante con la cepa CL43 descrita en la patente US 5.869.038. La eficiencia antifúngica de la cepa CL43 disminuye notablemente cuando los experimentos se realizan a 4°C.

Tanto las aplicaciones de las esporas como las de las células bacterianas se deben realizar usando un solvente oleoso que permita la adherencia de conidios y bacterias al vegetal. Se deben resuspender en solución acuosa conteniendo 0,5% de Pelgel (Liphatech, Milwaukee, WI) como componente adhesivo. El Pelgel es una mezcla de carboximetilcelulosa con goma arábica. Además de proporcionar características adhesivas a los conidios y bacterias, permite su adherencia a la superficie vegetal y sirve como nutriente

Almacenamiento y mantención del biofungicida bacteriano

La cepa CCGG2742 puede mantenerse indefinidamente en el laboratorio usando las técnicas de bacteriología general. La conservación a corto plazo (1-3 meses) se obtiene sembrando la bacteria en tubos con agar nutritivo tendido, manteniéndolos en el refrigerador a 4°C. Para la mantención de la bacteria por un plazo de 6 meses a 1 año, es necesario congelar a -80°C suspensiones concentradas de la bacteria en glicerol al 30-50% (v/v). Finalmente, si se desea mantener la bacteria almacenada por tiempos más prolongados, es necesario recurrir a la técnica de liofilización. Los cultivos de esta bacteria son perfectamente liofilizables y los liófilos se pueden mantener en forma muy estable por al menos 1 año a temperatura ambiente.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Cepa de la especie bacteriana Serratia plymuthica, donde es la cepa CCGG2742, con el número de orden 7404 atribuido por la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, España.

   5 2. Composición biofungicida, que comprende la cepa de acuerdo a la reivindicación 1 y un vehículo aceptable para prácticas agrícolas.
2. 3. Composición biofungicida de acuerdo a las reivindicación 2, que posee una supervivencia en el rango de 103105 ufc (unidad formadora de colonia)/cm2 cuando la cepa es inoculada en uvas en dosis de 106-108 ufc/cm2.
3. 4. Composición biofungicida de acuerdo a la reivindicación 2, que crece en un rango de temperatura de 4°C a 10 40°C.

4. 5.

   Composición biofungicida de acuerdo a la reivindicación 2, que crece en un rango de pH de 3 a 10.

5. 6.

   Uso de la composición biofungicida de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que sirve para el control de infecciones fúngicas producidas por hongos fitopatógenos en plantas o frutas.

6. 7.

   Uso de acuerdo a la reivindicación 6, que dicho hongo fitopatógeno pertenece al género Botrytis.

   15 8. Uso de acuerdo a la reivindicación 7, donde una dosis efectiva de la cepa CCGG2742 en el rango de 105108 ufc /mL sirve para el control de Botrytis cinerea.
7. 9. Uso de acuerdo a la reivindicaciones 6 a 8, que sirve para proteger fruta en estado de precosecha, postcosecha, durante su período de almacenamiento, traslado y conservación.
8. 10. Método para prevenir la podredumbre de frutos, donde la fruta es asperjada con una composición biofungicida 20 de acuerdo a la reivindicación 2.
9. 11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, donde la composición biofungicida es aplicada mediante aspersión de cultivos líquidos o polvo liofilizado estándar suspendido en soluciones acuosas.