ES2429113T3 - Tira de prueba para líquidos y procedimiento para la misma - Google Patents

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Abstract

Una tira de prueba (1) para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende una capade electrodos (19) y un sustrato (1) con al menos un canal (11) sobre el mismo, en que el canal (11) incluye unaprimera región (111), una segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas sucesivamente y en que laprimera región (111) se usa para la introducción de una muestra líquida en la misma y en que la tira de prueba (1)tiene una capa de fibra (1110) dispuesta en el fondo de la primera región (111) y una capa de nitrocelulosa (1120,1130) dispuesta en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113), en que la tira de prueba (1)comprende además un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la capa de fibra(1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado en la primerao en la segunda región (111, 112); una peroxidasa (1113); un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segundaregión (112), en la capa de nitrocelulosa (1120), para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, enque el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentesepítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un reactivo de sustrato (1132) localizado en la tercera región(113), integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) y que comprende una sacárido-oxidasa (1133), en que el primeranticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113), cuando esta se localiza en la primera región (111), pueden conjugarseentre sí o en que, cuando la peroxidasa se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112), el primeranticuerpo (1111) puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) puede conjugarse conuna molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma uncomplejo de biotina y avidina.

Description

Tira de prueba para líquidos y procedimiento para la misma.
5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. Campo técnico
[0001] La presente invención se refiere a tiras de prueba para líquidos y, más especialmente, a una tira de 10 prueba para líquidos para el ensayo cuantitativo de líquidos biológicos.
2. Descripción de la técnica relacionada
[0002] Los ensayos bioquímicos cuantitativos tradicionales utilizan habitualmente una enzima específica para
15 reaccionar con un analito específico y detectar entonces el cambio en las propiedades químicas o eléctricas de los reactantes o los productos de la reacción. Por ejemplo, es convencional determinar la concentración de glucosa en un líquido biológico mediante detección de la variación de la tensión o de la corriente eléctrica causada por el peróxido de hidrógeno producido en la reacción de la glucosa en el líquido biológico con la glucosa-oxidasa inmovilizada sobre electrodos de oxígeno disuelto. Después se calcula la concentración del peróxido de hidrógeno, a
20 lo que sigue la determinación de la concentración de glucosa en el líquido biológico, ya que la concentración de la glucosa-oxidasa es conocida. Dado que se requiere una cantidad relativamente pequeña de peróxido de hidrógeno para causar cambios en la tensión o la corriente eléctrica, los ensayos electroquímicos, como el ensayo descrito anteriormente, son ventajosos porque el volumen necesario de líquido biológico es asimismo relativamente pequeño y la detección es rápida. Sin embargo, un ensayo tal requiere enzimas específicas para producir peróxido para su
25 detección y, por lo tanto, solo es aplicable al análisis cuantitativo de moléculas pequeñas como glucosa, colesterol, urea, creatinina, etc.
[0003] Otra estrategia conocida es utilizar una capacidad única que tienen las moléculas inmunológicas, ya que pueden reconocer y también unirse a las moléculas biológicas de manera específica. Por ejemplo, el 30 enzimoinmunoanálisis de adsorción tradicional (ELISA), que se realiza típicamente en una placa de 96 pocillos, se caracteriza porque determina la concentración de un analito (es decir, un antígeno) por la intensidad de una señal detectada que resulta de la reacción entre el analito, las moléculas inmunológicas correspondientes, las enzimas y los reactivos correspondientes. Sin embargo, habitualmente los usuarios necesitan llevar a cabo un tedioso lavado en cada etapa del ensayo para eliminar las moléculas sin unir y las moléculas de unión inespecífica, para evitar que
35 el ensayo falle o que se produzcan falsos positivos.
[0004] Con el progreso de la tecnología, en la actualidad los ensayos analíticos inmunológicos se llevan a cabo con tiras de prueba para líquidos que cuentan con canales microfluídicos para simplificar o incluso omitir las complicadas y repetidas tareas de lavado requeridas tradicionalmente después de cada etapa de reacción del 40 ensayo. Sin embargo, en las tiras de prueba para líquidos conocidas es desventajosa la necesidad de añadir manualmente a la tira de prueba para líquidos los reactivos o los sustratos requeridos para las reacciones. Los reactivos o los sustratos requeridos para las tiras convencionales tienden a degradarse a temperatura ambiente o a la luz después de un almacenamiento prolongado, lo que resulta en errores en el ensayo. Por consiguiente, tales reactivos necesitan almacenarse en condiciones específicas, como refrigeración o a prueba de luz. En
45 consecuencia, sin embargo, las tiras de prueba para líquidos convencionales son desventajosas en cuanto a uso y almacenamiento.
[0005] Además, las tiras de prueba para líquidos convencionales con canales o con canales microfluídicos presentan otros problemas. Aunque un canal o canal microfluídico tal está rodeado de un material no absorbente y
50 normalmente la viscosidad de la muestra líquida para analizar es alta porque la muestra se compone principalmente de proteínas o carbohidratos, siempre hay una parte de la muestra líquida que tiende a adherirse a la superficie del canal y no participa en la reacción. Un escenario tal, si se produce, no solamente causa desventajosamente la pérdida de muestra líquida para analizar, sino que también tiene un efecto adverso en la precisión de los ensayos cuantitativos.
55 [0006] Adicionalmente, la tira de prueba para líquidos convencional puede facilitar el flujo de la muestra líquida por los canales microfluídicos, de modo que la muestra líquida sea suministrada al área de reacción por la fuerza capilar ejercida por las estructuras de tales canales.
[0007] Otra estrategia alternativa para suministrar la muestra líquida supone la aplicación de una fuerza impulsora, como presurización, en el momento en que la muestra líquida se introduce en el canal, de modo que la muestra líquida sea impulsada al área de reacción a través del canal. Sin embargo, las dos estrategias mencionadas anteriormente tienden a causar la producción de burbujas de aire después de haber introducido la muestra líquida en
5 el canal. Estas burbujas, ya sean grandes o pequeñas, bloquearán el canal y darán lugar a resultados imprecisos en el análisis.
[0008] El documento US 6.218.134 B1 describe un dispositivo de prueba y un procedimiento para uso del mismo. El dispositivo de prueba incluye una matriz, moléculas de anticuerpo inmovilizadas en la matriz y un 10 generador de una sustancia señal, dispuesto en la matriz de manera móvil. Cuando se suministra una sustancia para su análisis, dicha sustancia se acopla con las moléculas de anticuerpo y los generadores de la sustancia señal se mueven hacia dicha sustancia para acoplarse con ella. Una sustancia relacionada con la generación de una sustancia señal alcanza a los generadores de la sustancia señal con el fin de formar una sustancia señal que, en función de la distancia a un electrodo, se mueve hacia dicho electrodo hasta alcanzarlo y proporciona una señal 15 proporcional a la cantidad de la sustancia de ensayo. Sin embargo, este dispositivo de prueba tiene la desventaja de que se requiere mucho tiempo hasta que el generador de la sustancia señal alcanza la sustancia de ensayo y existe el riesgo de que también alcance el electrodo una sustancia señal formada por la reacción de la sustancia relacionada con la generación de la sustancia señal con un generador de sustancia señal acoplado a la sustancia de ensayo, lo que conduciría a un resultado de detección erróneo. Por lo tanto, a partir de este estado de la técnica, el
20 objetivo es proporcionar una tira de prueba que permita una detección acelerada y al mismo tiempo garantice un resultado de detección fiable.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
25 [0009] El objetivo mencionado anteriormente se consigue mediante la tira de prueba de acuerdo con la reivindicación 1 y el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5. Algunas mejoras ventajosas se consiguen mediante las reivindicaciones subordinadas correspondientes.
[0010] Para solucionar las deficiencias mencionadas anteriormente, la presente invención desvela una tira de
30 prueba para líquidos para el ensayo cuantitativo de muestras líquidas. La tira de prueba para líquidos comprende un sustrato con al menos un canal en el mismo. El canal tiene una primera región para recibir una muestra líquida, una segunda región y una tercera región. Estas regiones están dispuestas sucesivamente. La primera región se usa para la introducción de la muestra líquida en la misma. Además, la tira de prueba tiene una capa de fibra dispuesta en el fondo de la primera región y una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de cada una de las regiones segunda y
35 tercera. Adicionalmente, el canal contiene un primer anticuerpo, un sacárido, una peroxidasa, un segundo anticuerpo y un reactivo de sustrato. El primer anticuerpo se localiza en la primera región y está integrado en la capa de fibra para el reconocimiento de un analito en la muestra líquida. El sacárido y la peroxidasa se localizan en la primera o en la segunda región. El segundo anticuerpo está inmovilizado en la segunda región, en la capa de nitrocelulosa, para el reconocimiento del mismo analito que el primer anticuerpo. Sin embargo, el segundo anticuerpo y el primer
40 anticuerpo están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito. El reactivo de sustrato se localiza en la tercera región y está integrado en la capa de nitrocelulosa. El reactivo de sustrato comprende una sacárido-oxidasa. Al introducir la muestra líquida en el canal, el primer anticuerpo, el sacárido y la peroxidasa fluirán junto con la muestra líquida. El primer anticuerpo y la peroxidasa, cuando esta se localiza en la primera región, pueden conjugarse entre sí. Alternativamente, cuando la peroxidasa se localiza en la primera o en la segunda región, el
45 primer anticuerpo puede conjugarse con biotina, mientras que la peroxidasa puede conjugarse con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina. El analito y una cantidad parcial de la peroxidasa y el primer anticuerpo se unirán conjuntamente al segundo anticuerpo y, de este modo, quedarán retenidos en la segunda región. El sacárido y la otra parte del primer anticuerpo y la peroxidasa fluirán hasta la tercera región junto con la muestra líquida. El sacárido será oxidado por la
50 sacárido-oxidasa para producir peróxido de hidrógeno (H2O2). Después, el peróxido de hidrógeno reaccionará con la peroxidasa en la tercera región para generar una señal eléctrica.
[0011] Por lo tanto, un objetivo primordial de la presente invención es proporcionar una tira de prueba para líquidos que contenga en su mayor parte los reactivos y materiales requeridos para la reacción, sin etapas
55 complicadas.
[0012] Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una tira de prueba para líquidos en la que, en su mayor parte, los reactivos y materiales requeridos para la reacción contenidos en la misma estén en forma seca, de modo que la tira de prueba para líquidos pueda almacenarse durante un periodo relativamente prolongado antes de
su uso y se eviten los errores de ensayo debidos a la degradación de los reactivos.
[0013] Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una tira de prueba para líquidos que sea compatible con la tecnología de detección electroquímica existente y sea ventajosa para la detección rápida con alta 5 especificidad y alta sensibilidad.
[0014] La presente invención desvela también un procedimiento de detección para analizar una muestra líquida. El procedimiento de detección comprende las etapas siguientes. (1) Proporcionar una muestra líquida que contiene un analito. (2) Proporcionar un sustrato. El sustrato tiene al menos un canal que comprende al menos una 10 primera región para recibir la muestra, una segunda región y una tercera región. Estas tres regiones están dispuestas sucesivamente. La tira de prueba para líquidos tiene además una capa de fibra dispuesta en el fondo de la primera región y una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de cada una de las regiones segunda y tercera. El sustrato comprende además un primer anticuerpo, un sacárido, una peroxidasa, un segundo anticuerpo y un reactivo de sustrato. El primer anticuerpo se localiza en la primera región y está integrado en la capa de fibra para el 15 reconocimiento del analito en la muestra líquida. El sacárido y la peroxidasa pueden localizarse en la primera o en la segunda región. El segundo anticuerpo está inmovilizado en la segunda región, en la capa de nitrocelulosa, para el reconocimiento del analito en la muestra líquida. El segundo anticuerpo y el primer anticuerpo están configurados para reconocer diferentes epítopos de un analito idéntico en la muestra líquida. El reactivo de sustrato se localiza en la tercera región y está integrado en la capa de nitrocelulosa y comprende una sacárido-oxidasa. El primer 20 anticuerpo y la peroxidasa, cuando esta se localiza en la primera región, pueden conjugarse entre sí. Alternativamente, el primer anticuerpo puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa puede conjugarse con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina. (3) Introducir la muestra líquida en la primera región del canal para permitir que el primer anticuerpo, el sacárido y la peroxidasa fluyan junto con la muestra líquida. El primer anticuerpo 25 y la peroxidasa, cuando esta se localiza en la primera región, pueden conjugarse entre sí. Alternativamente, el primer anticuerpo puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa puede conjugarse con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina. (4) La unión del analito al primer anticuerpo, al segundo anticuerpo y a una cantidad parcial de la peroxidasa, de modo que queden retenidos en la segunda región. El sacárido, el primer anticuerpo sin
30 unir y la peroxidasa sin unir fluirán a la tercera región junto con la muestra líquida, de modo que el sacárido será oxidado por la sacárido-oxidasa para producir peróxido de hidrógeno (H2O2). El peróxido de hidrógeno generado reaccionará con la peroxidasa que llegue a la tercera región para generar una señal eléctrica. Y (5) detectar la señal eléctrica generada.
35 [0015] Por consiguiente, otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de detección para un ensayo cuantitativo que use una tira de prueba para líquidos que contenga en su mayor parte los reactivos y materiales requeridos para la reacción, de modo que el resultado del ensayo pueda obtenerse directamente mediante la detección de la señal de la reacción, sin complicadas etapas de reacción.
40 [0016] Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de detección para un ensayo cuantitativo que use una tira de prueba para líquidos en la que, en su mayor parte, los reactivos y materiales requeridos para la reacción contenidos en esta estén almacenados en forma seca, de modo que la tira de prueba para líquidos pueda almacenarse durante un periodo relativamente prolongado antes de su uso y se eviten los errores de ensayo debidos a la degradación de los reactivos.
45 [0017] Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de detección que sea compatible con la tecnología de detección electroquímica existente y sea ventajoso para la detección rápida con alta especificidad y alta sensibilidad.
50 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0018] La invención, así como un modo de uso preferido, otros objetivos y ventajas de la misma se entenderán mejor con referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones ilustrativas al leerla conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:
55 la figura 1A es una vista en perspectiva de una tira de prueba para líquidos de acuerdo con una primera realización de la presente invención;
la figura 1B es un dibujo esquemático que muestra la distribución de los materiales de reacción en un canal de la tira de prueba para líquidos de la figura 1;
las figuras 1C a 1E son dibujos esquemáticos que muestran la variación de la distribución de los materiales de reacción en el canal de la tira de prueba para líquidos de la figura 1;
5 las figuras 1F a 1H son dibujos esquemáticos que muestran una variación alternativa de la distribución de los materiales de reacción en el canal de la tira de prueba para líquidos de la figura 1;
la figura 1I es una vista en perspectiva seccionada de la tira de prueba para líquidos de la figura 1; y
10 la figura 2 es un organigrama de un procedimiento de detección de acuerdo con una segunda realización de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
15 [0019] Aunque la presente invención propone una tira de prueba para líquidos y un procedimiento de detección mediante el uso de la misma, los principios físicos y químicos de la biología implementada en los mismos son conocidos por los expertos en la técnica y no necesitan ser discutidos en más detalle en este documento. Mientras tanto, los dibujos adjuntos a los que se hace referencia en la descripción siguiente se proporcionan con
20 fines ilustrativos y no necesitan hacerse a escala.
[0020] Para una vista en perspectiva de una tira de prueba para líquidos de acuerdo con una primera realización de la invención se hará referencia a la figura 1A. La tira de prueba para fluidos 1 comprende un sustrato 10 y una capa de electrodos 19 y el sustrato 10 tiene un canal 11 dispuesto sobre el mismo. El canal 11 tiene una
25 primera región 111, una segunda región 112 y una tercera región 113. Estas regiones están dispuestas sucesivamente. La primera región 111 es para introducir una muestra líquida en la misma.
[0021] La figura 1B es un dibujo esquemático que muestra la distribución de los materiales de reacción en el canal 11 de la tira de prueba para líquidos 1. La primera región 111 contiene un primer anticuerpo 1111, un sacárido
30 1112 y una peroxidasa 1113. La segunda región 112 contiene un segundo anticuerpo 1121 inmovilizado en la misma. En particular, el primer anticuerpo 1111 y el segundo anticuerpo 1121 están configurados para reconocer diferentes epítopos de un idéntico analito 1101 en la muestra líquida. Por lo tanto, el primer anticuerpo 1111 y el segundo anticuerpo 1121 podrían ser anticuerpos monoclonales (mAb) o anticuerpos policlonales (pAb), siempre que el primer anticuerpo 1111 y el segundo anticuerpo 1121 no compitan entre sí por el mismo antígeno y por tanto
35 interfieran con el reconocimiento del antígeno. Adicionalmente, el primer anticuerpo 1111 así como el segundo anticuerpo 1121, pueden ser un anticuerpo completo, un fragmento de unión a antígenos (fragmento Fab) o estar en la forma de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). Un reactivo de sustrato 1132 que comprende una sacárido-oxidasa 1133 se localiza en la tercera región 113. La peroxidasa 1113 puede ser una HRP (peroxidasa de rábano), una AP (ascorbato-peroxidasa) o una peroxidasa de hidrógeno. De acuerdo con un aspecto de la presente
40 invención, el sacárido 1112 es preferentemente glucosa, mientras que la sacárido-oxidasa 1133 es glucosa-oxidasa.
[0022] Con referencia a las figuras 1C a 1E, las figuras son dibujos esquemáticos que muestran la variación de la distribución de los materiales de reacción en el canal 11 de la tira de prueba para líquidos 1 en las diferentes etapas de la reacción. En la figura 1C, después de que la muestra líquida que contiene el analito 1101 se introduce
45 en el canal 11, el primer anticuerpo 1111 reconoce el analito 1101 y se une a él. Dado que el primer anticuerpo 1111, el sacárido 1112 y la peroxidasa 1113 no están inmovilizados en la primera región 111, el primer anticuerpo 1111, el analito 1101 unido al primer anticuerpo 1111, la peroxidasa 1113 y el sacárido 1112 fluirán junto con la muestra líquida hacia la segunda región 112.
50 [0023] Con referencia ahora a la figura 1D, después de que la muestra líquida llega a la segunda región 112, el segundo anticuerpo 1121 se une al analito 1101 y de este modo se forma un complejo que comprende el primer anticuerpo 1111, el analito 1101 y el segundo anticuerpo 1121. El segundo anticuerpo está inmovilizado en la segunda región 112. Por consiguiente, el primer anticuerpo 1111 unido al analito 1101, el analito 1101 unido al segundo anticuerpo 1121 y la peroxidasa 1113 conjugada con el primer anticuerpo 1111 quedarán retenidos en la
55 segunda región 112. Sin embargo, el sacárido 1112 que fluye junto con la muestra líquida a la segunda región 112 sigue fluyendo hacia la tercera región 113 junto con la muestra líquida y junto con el primer anticuerpo 1111 sin unir, así como con la peroxidasa 1113 conjugada con el primer anticuerpo 1111 sin unir.
[0024] Con referencia ahora a la figura 1E, el sacárido 1112, el primer anticuerpo 1111 sin unir y la peroxidasa 1113 conjugada con el primer anticuerpo 1111 sin unir fluyen ahora a la tercera región 113. Entonces, el sacárido 1112 reacciona con la sacárido-oxidasa 1113 integrada en la tercera región 113, con lo que se produce peróxido de hidrógeno (H2O2). El peróxido de hidrógeno resultante reacciona con la peroxidasa 1113 que llega a la tercera región 113, de modo que se genera una señal eléctrica que es emitida por los electrodos y circuitos en la capa de
5 electrodos 19 y después se detecta por un instrumento externo.
[0025] En consecuencia, mediante la detección de la intensidad de la señal eléctrica generada se determina la concentración de la enzima implicada en la reacción. En otras palabras, mediante la detección de la intensidad de la señal eléctrica generada, puede determinarse la cantidad de peroxidasa 1113 que llega a la tercera región 113 y 10 está implicada en la reacción. Además, la peroxidasa 1113 se incluye en una cantidad constante en la tira de prueba para líquidos 1 durante la fabricación, por lo que es fácil determinar la cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112 mediante una simple sustracción ([cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112] = [cantidad total de peroxidasa 1113] - [cantidad de peroxidasa 1113 que fluye a la tercera región 113]). Dado que la cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112 varía directamente con la concentración del
15 analito 1101 en la muestra líquida, es posible calcular la concentración del analito 1101 en la muestra líquida por medio de la cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112, con lo que se consigue un ensayo cuantitativo.
[0026] Antes de la reacción, el primer anticuerpo 1111 y la peroxidasa 1113 se conjugan directamente entre sí
20 según se representa en la figura 1B. Alternativamente, el primer anticuerpo 1111 puede conjugarse con biotina, mientras que la peroxidasa 1113 se conjuga con avidina. La biotina y la avidina se unen fuertemente para formar un complejo AB. De este modo, cuando el primer anticuerpo 1111 queda retenido en la segunda región 112, también hace que una parte de la peroxidasa 1113 permanezca junto con este en la segunda región 112. La avidina puede sustituirse también por estreptavidina o neutravidina.
25 [0027] Las figuras 1F a 1H son dibujos esquemáticos que muestran otros diversos modos de distribución de los materiales de reacción en el canal 11 de la tira de prueba para líquidos 1 antes de la reacción. De acuerdo con el concepto de la presente invención, en la tira de prueba para líquidos 1 de la presente invención, en lugar de disponer a la vez el sacárido 1112 y la peroxidasa 1113 en la primera región 111, los dos pueden localizarse
30 alternativamente en la segunda región 112.
[0028] Con referencia a la figura 1F, se muestra que el primer anticuerpo 1111 y la peroxidasa 1113 se localizan en la primera región 111, mientras que el sacárido 1112 está depositado en la segunda región 112. En este modo, el primer anticuerpo 1111 y la peroxidasa 1113 pueden conjugarse directamente entre sí según se describe 35 previamente o están unidos respectivamente a biotina y avidina y forman un complejo AB en la reacción. La distribución de los otros materiales de reacción, como el segundo anticuerpo 1121, el reactivo de sustrato 1132 y la sacárido-oxidasa 1133, es de la manera que se muestra en la figura 1B. En tal configuración, después de que la muestra líquida fluye a través de la segunda región 112, el sacárido 1112 también se transportará a la tercera región 113 para permitir la reacción siguiente representada en las figuras 1C a 1E. Por lo tanto, la distribución de los
40 materiales de reacción en las diferentes etapas de la reacción es según se representa en las figuras 1C a 1E y se omite en esta descripción.
[0029] Otro modo de distribución de los materiales de reacción es según se representa en la figura 1G. El primer anticuerpo 1111 se localiza en la primera región 111, mientras que tanto la peroxidasa 1113 como el sacárido 45 1112 se localizan en la segunda región 112. Otro modo más de distribución de los materiales de reacción es según se representa en la figura 1H. El primer anticuerpo 1111 y el sacárido 1112 se localizan en la primera región 111, mientras que la peroxidasa 1113 se localiza en la segunda región 112. La distribución de los otros materiales de reacción en los dos modos descritos anteriormente es de la misma manera que se muestra en la figura 1B y la distribución de los materiales de reacción en las diferentes etapas de la reacción es según se representa en las
50 figuras 1C a 1E, por lo que se omite una repetición de la descripción en este documento.
[0030] Con referencia ahora a la figura 1I, corresponde a una vista de sección de la tira de prueba para líquidos 1 tomada a lo largo de la línea A-A en la figura 1A. De acuerdo con la figura 1I, se proporciona una capa de fibra 1110 en el fondo de la primera región 111 y el primer anticuerpo (numerado como 1111 en la figura 1B) se 55 dispone en la capa de fibra 1110, de modo que después de haber introducido la muestra líquida en la primera región 111, el primer anticuerpo (numerado como 1111 en la figura 1B) es transportado por la muestra líquida a la segunda región 112. Se proporcionan una segunda capa de nitrocelulosa 1120 y una tercera capa de nitrocelulosa 1130, respectivamente, en el fondo de la segunda región 112 y de la tercera región 113. El segundo anticuerpo (numerado como 1121 en la figura 1B) está inmovilizado en la segunda capa de nitrocelulosa 1120 y el reactivo de sustrato
1132 integrado en la tercera capa de nitrocelulosa 1130.
[0031] La segunda capa de nitrocelulosa 1120 y la tercera capa de nitrocelulosa 1130 podrían ser membranas de nitrocelulosa laminadas en el fondo de la segunda región 112 y de la tercera región 113, respectivamente.
5 [0032] Otra estrategia preferida para disponer las capas de nitrocelulosa en el fondo de la segunda región 112 y de la tercera región 113 es el vaciado de una disolución de nitrocelulosa en el fondo de la segunda región 112 y de la tercera región 113, seguido de un proceso de secado (secado al aire o liofilización). Por consiguiente, tanto la segunda capa de nitrocelulosa 1120 como la tercera capa de nitrocelulosa 1130 formadas por este procedimiento
10 tienen una conformación de matriz hueca. El canal 11 con las capas de nitrocelulosa preparadas por el procedimiento de vaciado de acuerdo con la presente invención es diferente del canal microfluídico tradicional. Además, con el fin de reducir la fuerza capilar, cada una de las regiones segunda 112 y tercera 113 tiene preferentemente una anchura no inferior a 0,3 mm. El sustrato 10 está hecho preferentemente de un material biocompatible. Para optimizar el resultado del procedimiento de vaciado, el canal 11 tiene preferentemente una
15 rugosidad superficial (Ra) en el intervalo de 3 µm a 50 µm. La capa de nitrocelulosa 1120 comprende preferentemente un espesor medio igual al de la capa de nitrocelulosa 1130. Además, el canal 11 puede comprender adicionalmente una cuarta región (no se muestra) con una capa de nitrocelulosa formada en el fondo de la misma que también tiene una conformación de matriz hueca para acomodar el exceso de muestra líquida.
20 [0033] Para preparar la disolución de nitrocelulosa se mezcla polvo de nitrocelulosa con un disolvente que contiene ésteres y cetonas. La razón volumétrica entre el polvo de nitrocelulosa y el disolvente que contiene ésteres y cetonas es preferentemente de 1:9. Además, cuando la capa de nitrocelulosa 1120 se forma por el procedimiento de vaciado según se describe anteriormente, el segundo anticuerpo 1121 se dispone en la conformación de matriz hueca de la capa de nitrocelulosa 1120 por inyección de una disolución de reacción que contiene el segundo
25 anticuerpo 1121 en la capa de nitrocelulosa 1120, seguida de un proceso de secado y, por lo tanto, el segundo anticuerpo 1121 permanece en la segunda capa de nitrocelulosa 1120 en forma de polvo.
[0034] Además de la estrategia anteriormente mencionada, en la que el segundo anticuerpo 1121 se dispone después de haberse secado las capas de nitrocelulosa, una estrategia alternativa consiste en mezclar previamente
30 la disolución que contiene el segundo anticuerpo 1121 con la disolución de nitrocelulosa y después vaciar la disolución mixta en el fondo de la segunda región 112, a lo que sigue un proceso de secado. De este modo se forma la segunda capa de nitrocelulosa 1120 en el fondo de la segunda región 112 mientras que el segundo anticuerpo 1121 permanece en la matriz de conformación hueca y se seca en forma de polvo.
35 [0035] Para proporcionar la tercera capa de nitrocelulosa 1130 con el reactivo de sustrato 1132 pueden implementarse estrategias similares a la empleada para proporcionar la segunda capa de nitrocelulosa 1120 con el segundo anticuerpo 1121. La tercera capa de nitrocelulosa 1130 puede preformarse y después añadirle el reactivo de sustrato 1132 o el reactivo de sustrato 1132 puede mezclarse con la disolución de nitrocelulosa para después aplicar la disolución mixta sobre el fondo de la tercera región 113 y, de este modo, formar la tercera capa de
40 nitrocelulosa 1130 con el reactivo de sustrato 1132. Los detalles similares se omiten en esta descripción.
[0036] Además de la primera realización descrita anteriormente, la presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento de detección para el ensayo de muestras líquidas como segunda realización. La tira de prueba para líquidos implementada en la segunda realización es sustancialmente la misma que en la primera
45 realización, por lo que los detalles similares de la tira de prueba para líquidos se omitirán y todos los números de referencia para indicar los componentes de la tira de prueba para fluidos se referirán a las figuras 1B a 1H.
[0037] La figura 2 es un organigrama del procedimiento de detección de acuerdo con la segunda realización de la presente invención. Las etapas del procedimiento de detección de la presente invención se describen según se
50 indica a continuación.
[0038] Etapa 21: proporcionar una muestra líquida que contiene un analito 1101 (mostrado en la figura 1B).
[0039] Etapa 22: proporcionar un sustrato 10 con al menos un canal 11 que incluye una primera región 111,
55 una segunda región 112 y una tercera región 113. Estas tres regiones están dispuestas sucesivamente. La primera región 111 permite la introducción de una muestra líquida en la misma y tiene un primer anticuerpo 1111. La segunda región 112 tiene un segundo anticuerpo 1121 inmovilizado en la misma. El primer anticuerpo 1111 y el segundo anticuerpo 1121 están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito 1101 en la muestra líquida. Por lo tanto, el primer anticuerpo 1111 y el segundo anticuerpo 1121 pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales, siempre que el primer anticuerpo 1111 y el segundo anticuerpo 1121 no compitan entre sí por el mismo antígeno y de este modo interfieran con el reconocimiento del antígeno. Un reactivo de sustrato 1132 que comprende una sacárido-oxidasa 1133 se localiza en la tercera región 113. La peroxidasa 1113 puede ser una HRP (peroxidasa de rábano), una AP (arcorbato-peroxidasa) o una peroxidasa de hidrógeno. El sacárido 1112 es
5 preferentemente glucosa, mientras que la sacárido-oxidasa 1133 es glucosa-oxidasa. Además, el sacárido 1112 y la peroxidasa 1113 se distribuyen en el canal 11 de la manera descrita en la primera realización (con referencia a las figuras 1B, 1F, 1G y 1H).
[0040] Etapa 23: introducir la muestra líquida en la primera región 111 del canal 11, de modo que la muestra
10 líquida fluya a lo largo del canal 11 a través de la primera región 111, la segunda región 112 y la tercera región 113, sucesivamente, y de este modo haga fluir consigo al primer anticuerpo 1111, al sacárido 1112 y a la peroxidasa 1113 en el canal 11.
[0041] Etapa 24: después de su introducción, el analito 1101 fluirá a la segunda región 112 junto con la
15 muestra líquida. De este modo, el segundo anticuerpo 1121 se unirá al analito 1101 y, por lo tanto, se formará un complejo de unión que comprende el primer anticuerpo 1111, el analito 1101 y el segundo anticuerpo 1121. El segundo anticuerpo 1121 está inmovilizado en la segunda región 112. Por consiguiente, el primer anticuerpo 1111 unido al analito 1101, el analito 1101 unido al segundo anticuerpo 1121 y la peroxidasa 1113 conjugada con el primer anticuerpo 1111 quedarán retenidos en la segunda región 112. La muestra líquida transporta continuamente
20 el sacárido 1112, el primer anticuerpo 1111 sin unir y la peroxidasa 1113 sin unir a la tercera región 113. En la tercera región 113, el sacárido 1112 es catalizado por la sacárido-oxidasa 1133 para producir peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno reacciona entonces con la peroxidasa 1113 que llega a la tercera región 113, de modo que se genera una señal eléctrica que es emitida por los electrodos y circuitos de la capa de electrodos 19 del sustrato y detectada por un instrumento externo.
25 [0042] Etapa 25: detectar la señal eléctrica generada en la etapa 24. En consecuencia, mediante la detección de la intensidad de la señal eléctrica generada se determina la concentración de la enzima implicada en la reacción. En otras palabras, mediante la detección de la intensidad de la señal eléctrica generada, puede determinarse la cantidad de peroxidasa 1113 que llega a la tercera región 113 y está implicada en la reacción. Además, la
30 peroxidasa 1113 se incluye en una cantidad constante en la tira de prueba para líquidos 1 durante la fabricación, por lo que es fácil determinar la cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112 mediante una simple sustracción ([cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112] = [cantidad total de peroxidasa 1113] [cantidad de peroxidasa 1113 que fluye a la tercera región 113]). Dado que la cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112 varía directamente con la concentración del analito 1101 en la muestra líquida, es posible
35 calcular la concentración del analito 1101 en la muestra líquida por medio de la cantidad de peroxidasa 1113 retenida en la segunda región 112, con lo que se consigue un ensayo cuantitativo.
[0043] De acuerdo con el procedimiento de detección de la presente invención, la configuración preferida del primer anticuerpo 1111 y la peroxidasa 1113, la selección del primer anticuerpo 1111 y la peroxidasa 1113, las
40 categorías preferidas del primer anticuerpo 1111, el segundo anticuerpo 1112 y la peroxidasa 1113, las estructuras preferidas del canal 11, la configuración y el procedimiento de preparación de las capas de nitrocelulosa, la composición y la razón preferida de la disolución de nitrocelulosa y la composición y los procedimientos de preparación de los materiales de reacción son similares a los descritos en la primera realización y los detalles de los mismos se omiten en este documento.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una tira de prueba (1) para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende una capa de electrodos (19) y un sustrato (1) con al menos un canal (11) sobre el mismo, en que el canal (11) incluye una 5 primera región (111), una segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas sucesivamente y en que la primera región (111) se usa para la introducción de una muestra líquida en la misma y en que la tira de prueba (1) tiene una capa de fibra (1110) dispuesta en el fondo de la primera región (111) y una capa de nitrocelulosa (1120, 1130) dispuesta en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113), en que la tira de prueba (1) comprende además un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la capa de fibra
    10 (1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado en la primera
    o en la segunda región (111, 112); una peroxidasa (1113); un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segunda región (112), en la capa de nitrocelulosa (1120), para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, en que el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un reactivo de sustrato (1132) localizado en la tercera región 15 (113), integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) y que comprende una sacárido-oxidasa (1133), en que el primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113), cuando esta se localiza en la primera región (111), pueden conjugarse entre sí o en que, cuando la peroxidasa se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112), el primer anticuerpo (1111) puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) puede conjugarse con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un
    20 complejo de biotina y avidina.
  2. 2. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que la capa de nitrocelulosa (1120, 1130) comprende una conformación de matriz hueca y se prepara por vaciado de una disolución de nitrocelulosa en el fondo de la segunda y la tercera región (112, 113), seguido de un proceso de secado.
  3. 3. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que cada una de las regiones segunda (112) y tercera
    (113) tiene una anchura de al menos a 0,3 mm.
  4. 4. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que el canal (11) comprende además una cuarta región
    30 con una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de la misma para acomodar el exceso de muestra líquida, en que dicha nitrocelulosa comprende una matriz hueca.
  5. 5. Un procedimiento para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende las etapas de:
    35 proporcionar (21) una muestra líquida que contiene una analito (1101);
    proporcionar (22) una tira de prueba (1) que incluye una capa de electrodos (19) y un sustrato (10) con al menos un canal (11) que incluye una primera región (111), una segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas 40 sucesivamente, en que la primera región (111) permite la introducción de una muestra líquida en la misma y en que la tira de prueba tiene una capa de fibra (1110) dispuesta en el fondo de la primera región (111) y una capa de nitrocelulosa (1120, 1130) dispuesta en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113); en que la tira de prueba (1) comprende: un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la capa de fibra (1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado 45 en la primera o en la segunda región (111, 112); una peroxidasa (1113); un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segunda región (112), en la capa de nitrocelulosa (1120), para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, en que el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un reactivo de sustrato (1132) localizado en la tercera región (113), integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) y que comprende una sacárido-oxidasa (1133),
    50 en que el primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113), cuando esta se localiza en la primera región (111), pueden conjugarse entre sí o en que, cuando la peroxidasa se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112), el primer anticuerpo (1111) puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) se conjuga con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina;
    55 introducir (23) la muestra líquida en la primera región (111) del canal (11) para hacer que el primer anticuerpo (1111), el sacárido (1112) y la peroxidasa (1113), si la peroxidasa está localizada en la primera región (111), fluyan conjuntamente con la muestra líquida; permitir (24) que el analito (1101) y una parte del primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) se unan al segundo anticuerpo (1121), de modo que queden retenidos en la segunda región (112); permitir que el sacárido (1112) y la otra parte del primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) fluyan a la tercera región (113) junto con la muestra líquida, de modo que el sacárido (1112) que llega a la tercera región es catalizado por la sacárido-oxidasa
    5 (1133) para producir peróxido de hidrógeno; permitir que la peroxidasa (1113) que llega a la tercera región (113) reaccione con el peróxido de hidrógeno, de modo que se genere una señal eléctrica; y
    detectar (25) la señal eléctrica generada.
    10 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en que la capa de nitrocelulosa (1120, 1130) se prepara por vaciado de una disolución de nitrocelulosa en el fondo de la segunda y la tercera región (112, 113), seguido de un proceso de secado.
  6. 7. El procedimiento de la reivindicación 5, en que cada una de las regiones segunda (112) y tercera (113) 15 tiene una anchura no inferior a 0,3 mm.
  7. 8. El procedimiento de la reivindicación 5, en que el canal (11) comprende además una cuarta región con una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de la misma para acomodar el exceso de muestra líquida, en que dicha nitrocelulosa comprende una matriz hueca.
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