ES2430368T3

ES2430368T3 - Partículas de tipo virus VHB/VHC

Info

Publication number: ES2430368T3
Application number: ES04078119T
Authority: ES
Inventors: Mark Selby; Edward Glazer; Michael Houghton
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2020-11-22
Also published as: EP1233783B9; WO2001038358A3; ATE290399T1; JP4647870B2; EP1233783A2; CA2392527A1; JP2003514576A; DE60018601T4; CA2392527C; DE60018601D1; AU1928201A; WO2001038358A9; WO2001038358A2; DE60018601T2; EP1233783B1

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: un dominio S sustancialmente completo de HBsAg capaz de causar laformación de partículas de tipo virus; y un polipéptido que comprende (a) residuos de aminoácidos 192 a 330 de unapoliproteína VHC-1; o (b) los residuos correspondientes de la proteína E1 de otro aislado de VHC.

Description

Partículas de tipo virus VHB/VHC

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENICÓN

La invención se refiere al área de vacunas recombinantes. Particularmente se refiere al campo de antígenos quiméricos y partículas de tipo virus para su uso en vacunas, especialmente vacunas de recombinación para virus de la hepatitis B (VHB) y virus de la hepatitis C (VHC).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El virus de la hepatitis C (VHC) infecta aproximadamente al 1% de la población mundial y causa serios problemas de salud. Más del 75% de los individuos gravemente infectados progresa finalmente a un estado portador crónico que puede dar como resultado cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular. Una fracción muy pequeña de pacientes crónicamente infectados supera VHC de manera natural y resuelven la hepatitis crónica. Véase Alter et al. (1992) N. Eng. J. Med. 327:1899-1905; Resnick y Koff (1993) Arch. Intem. Med. 153:1672-1677; Seeff (1995) Gastrointest. Dis. 6:20-27; Tong et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1463-1466. Inmunización contra glicoproteínas E2 de algunos flavivirus (véase, por ejemplo, Konishi et al., (1992) Virology 188: 714-720), incluyendo VHC (Ishii et al., (1998) Hepatology 28: 1117-1120), pueden proteger contra infección. Sin embargo, los intentos para expresar glicoproteínas E1 y E2 de VHC recombinante se han frustrado por el hecho de que estas proteínas no se secretan de la célula huésped sino que se conservan dentro del retículo endoplasmático (Dubuisson et al., (1994)

J. Virology 68: 6147-6160).

Una técnica para hacer vacunas para VHC y otros virus que se ha intentando es preparar antígenos quiméricos consistentes en fusiones de antígenos de superficie de virus de hepatitis B (HBsAG) con un antígeno heterólogo, por ejemplo, una parte de una proteína VHC. Véase, por ejemplo, Inchauspe et al. (1998) Dev. Stand. 92: 162-168; Nakano et al. (1997) J. Virol. (1997) 71: 7101-7109; e Inchauspe et al. (1997) Vaccine 15. 853-856. El uso de HBsAG es atractivo para la producción de composiciones inmunogénicas tales como vacunas porque HBsAg es altamente inmunogénico y se secreta de células cultivadas en forma de partículas de tipo virus (Patente de Estados Unidos 5.098.704). Los intentos por introducir partes pequeñas de proteínas virales en HBsAG han tenido éxito en la producción de partículas de tipo virus (véase por ejemplo, Delpeyroux et al. (1990) J. Virology 64: 6090-6100), que insertó un segmento de 11 aminoácidos de proteína cápside de virus polio en HBsAg). Sin embargo, en un estudio solamente dos de seis proteínas de fusión que contenían HBsAg combinadas con diferentes dominios hidrofílicos de VCH E2 se secretaron en el medio de cultivo como partículas de tipo virus (Lee et al. (1996) J. Med. Virol. 50: 145151), posiblemente porque los insertos E2 fueron demasiado grandes o hidrofílicos. El sitio de inserción de epítopos heterólogos en HBsAg puede ser un factor importante. Un estudio que insertó un epítopo de nucleocápside de VHB (HBcAg) en varias posiciones en HBsAg encontró que la inserción en un sitio interno en HBsAg dio como resultado una proteína quimérica que fue inmunogénica para HBcAg, mientras que la inserción en la C-terminal fue débilmente inmunogénica (Schodel et al. (1992) J. Virology 66: 106-114). La inserción en la N-terminal previno el acceso a la superficie del epítopo HBcAg en las partículas resultantes y fue no inmunogénico (Id.). Aparentemente, el contexto molecular en el que un epítopo está presente es importante en la determinación de inmunogenicidad, probablemente debido a las alteraciones sutiles de la estructura secundaria y terciaria de la proteína. Este principio se ilustra más en Eckhart et al. ((1996) J. Gen. Virol. 77: 2001-2008), quien introdujo un epítopo conservado de seis aminoácidos de proteína VIH-1 gp41 en influenza hemaglutinina y obtuvo anticuerpos neutralizadores, pero no pudo generar anticuerpos neutralizadores cuando el mismo epítopo se insertó en HBsAg. Los epítopos aislados más pequeños tienen más posibilidades de ser sensibles a tales efectos que las partes más grandes de una proteína inmunogénica.

Actualmente no hay un método disponible para expresar glicoproteínas E1 y E2 enteras de VHC en partículas de tipo virus para su uso en la inmunización. Los métodos disponibles limitan a proteínas basadas en HBsAg a la inserción de solamente dominios aislados pequeños de E2, que pueden o no pueden tener una estructura inmunogénica nativa. De este modo, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y materiales que puedan usarse para expresar antígenos de VHC en una forma inmunogénica en partículas de tipo virus.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención en su sentido más amplio es como las reivindicaciones adjuntas la caracterizan.

Es un objeto de la invención proporcionar antígenos quiméricos de VHB/VHC como se relata en las reivindicaciones para su uso en composiciones inmunogénicas. También se describen partículas de tipo virus que comprenden antígenos quiméricos de VHB/VHC, métodos y materiales para producir tales partículas de tipo virus y vacunas de combinación de VHB/VHC.

Una realización de la invención proporciona un antígeno quimérico que comprende un HBsAg antígeno de superficie de virus de la hepatitis B que está unido a un polipéptido inmunogénico de VHC, como se relata en las reivindicaciones. HBsAg comprende un dominio S sustancialmente completo.

Otra realización más de la invención proporciona proteínas de fusión como se relata en las reivindicaciones que comprenden un dominio S sustancialmente completo de HBsAg y un polipéptido. En una proteína de fusión, el polipéptido comprende (a) residuos de aminoácido 192 a 330 de una poliproteína VHC-1, o (b) los residuos correspondientes de la proteína E1 de otro VHC aislado.

En otra proteína de fusión, el polipéptido comprende a) residuos de aminoácido 384 a 661 de una poliproteína VHC-1, o (b) los residuos correspondientes de la proteína E2 de otro aislado de VHC.

Otra realización más de la invención proporciona moléculas de ácido nucleico como se relata en las reivindicaciones, que codifican proteínas de fusión que comprende un dominio S sustancialmente completo de HBsAg y un polipéptido. En una proteína de fusión, el polipéptido comprende (a) residuos de aminoácido 192 a 330 de una poliproteína VHC-1, o (b) los residuos correspondientes de la proteína E1 de otro aislado de VHC. En otra proteína de fusión, el polipéptido comprende a) residuos de aminoácido 384 a 661 de una poliproteína VHC-1, o (b) los residuos correspondientes de la proteína E2 de otro aislado de VHC. Estas moléculas de ácido nucleico se emplean como componentes de composiciones inmunogénicas, que son realizaciones adicionales.

Otra realización de la invención proporciona vectores como se relatan en las reivindicaciones que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión. Las proteínas de fusión comprenden un dominio S sustancialmente completo de HBsAg y un polipéptido que comprende un fragmento inmunogénico de una poliproteína VHC-1.

Se describe un método para producir partículas de tipo virus. Se cultiva una célula en un medio de cultivo, a través del cual la célula expresa partículas de tipo virus que comprenden un primer HBsAg y un antígeno quimérico. El antígeno quimérico comprende un segundo HBsAg que está unido a un polipéptido inmunogénico VHC. El primer y segundo HBsAg comprende cada uno un dominio S sustancialmente completo. Las partículas de tipo virus se aíslan después del medio de cultivo.

Además se describe un método para producir una línea celular que expresa partículas de tipo virus. Se transfecta una célula con un vector que expresa partículas de tipo virus que comprenden un primer HBsAg y un antígeno quimérico. El antígeno quimérico comprende un segundo HBsAg que está unido a un polipéptido inmunogénico VHC. El primer y segundo HBsAg comprende cada uno un dominio S sustancialmente completo. La célula se cultiva para producir una línea celular que expresa partículas de tipo virus.

Además se describen líneas celulares que expresan partículas de tipo virus. En una línea celular, las partículas de tipo virus comprenden un primer HBsAg y un antígeno quimérico. El antígeno quimérico comprende un segundo HBsAg que está unido a un polipéptido inmunogénico VHC. El primer y segundo HBsAg comprende cada uno un dominio S sustancialmente completo. En otro tipo de línea celular, las partículas de tipo virus comprenden un primer HBsAg y un primer y segundo antígeno quimérico. El primer antígeno quimérico comprende un segundo HBsAg que está unido a un primer polipéptido inmunogénico que comprende una glicoproteína E1 de VHC o un fragmento de la misma, y el segundo antígeno quimérico comprende un tercer HBsAg que está unido a un segundo polipéptido inmunogénico que comprende una glicoproteína E2 de VHC o un fragmento de la misma. El primer, segundo y tercer HBsAg comprende cada uno un dominio S sustancialmente completo.

La invención proporciona de este modo la técnica con métodos y materiales nuevos para la producción de vacunas de combinación de VHC/VHB.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1A y 1B-1F muestran el vector de expresión pCMVII (Fig. 1A) y su secuencia nucleótida (Figs. 1B1F; SEQ ID NO: 1).

Las Figuras 2A y 2B-2I muestran el vector de expresión pCMVII-pS2-sAg (Fig. 2A) y su secuencia nucleótida (Figs. 2B-2I y SEQ ID NO: 2; la secuencia codificadora preS2 comienza en la posición nucleótida 1988 y finaliza en la base nucleótida 2152, y la secuencia codificadora SAg comienza en la base 2153 y finaliza en 2830). La secuencia de aminoácido del polipéptido codificado preS2-S también se muestra en las Figs. 2B-2I y en la SEQ ID NO: 3.

Las Figuras 3A y 3B-3I muestran el vector de expresión pCMVII opti 330 E1/SAg (Fig. 3A) y su secuencia nucleótida (Figs. 3B-3I y SEQ ID NO: 4; la secuencia codificadora 330 E1 comienza en la posición nucleótida 1992 y finaliza en la base nucleótida 2483 y la secuencia codificadora SAg comienza en la base 2484). La secuencia de aminoácido del polipéptido de antígeno quimérico codificado también se muestra en las Figs. 3B-3I y en la SEQ ID NO: 5.

Las Figuras 4A y 4B-4H muestran el vector de expresión pCMV-II-E2661-sAg (Fig. 4A) y su secuencia nucleótida (Figs. 4B-4H y SEQ ID NO: 6; la secuencia codificadora 661 E2 comienza en la posición nucleótida 1997 y finaliza en la base nucleótida 2900, y la secuencia codificadora sAg comienza en la base 2907). La secuencia de aminoácido del polipéptido de antígeno quimérico codificado también se muestra en las Figs. 4B-4H y en la SEQ ID NO: 7.

La Figura 5 muestra los resultados de centrifugación con gradiente de densidad de sacarosa de partículas de tipo virus HBsAg recombinantes purificadas. El experimento se describe en el Ejemplo 1.

Las Figuras 6A y 6B ilustran la expresión de proteína de fusión VHCE2- HBsAg en células COS7. Las cantidades crecientes de plásmido codificador de sAg se expresaron junto con plásmido de fusión VHCE2-sAg. El experimento se describe en el Ejemplo 2. El anticuerpo de captura fue MAb sAg, y el anticuerpo detector fue MAb E2 (Fig. 6A) o MAb sAg (Fig. 6B).

Las Figuras 7A y 7B muestran el perfil de sedimentación de partículas de tipo virus expresadas de células COS7 transfectadas temporalmente con diferentes proporciones de proteína de fusión sAg:E2-sAg. El experimento se describe en el Ejemplo 2. El anticuerpo de captura fue MAb sAg, y el anticuerpo detector fue MAb E2 (Fig. 7A) o MAb sAg (Fig. 7B).

Las Figuras 8A y 8B demuestran la expresión de proteína de fusión VHCE1- HBsAg en células COS7. Las cantidades crecientes de plásmido codificador de sAg se expresaron junto con plásmido de fusión VHCE1-sAg. El experimento se describe en el Ejemplo 3. El anticuerpo de captura fue MAb sAg, y el anticuerpo detector fue MAb E2 (Fig. 8A) o MAb sAg (Fig. 8B).

Las Figuras 9A y 9B muestran el perfil de sedimentación de partículas de tipo virus expresadas de células COS7 transfectadas temporalmente con una proporción 5:1 de proteína de fusión sAg:E1-sAg. El experimento se describe en el Ejemplo 3. El anticuerpo de captura fue MAb sAg, y el anticuerpo detector fue MAb E1 (Fig. 9A) o MAb sAg (Fig. 9B).

Las Figuras 10A y 10B muestran la co-expresión y secreción de proteínas de fusión E1-sAg y E2-sAg en células COS7. Las cantidades crecientes de plásmido codificador de sAg se expresaron junto con cantidades contantes de plásmidos de fusión E1-sAg y E2-sAg. El experimento se describe en el Ejemplo 4. En la Figura 10A, se emplearon anticuerpos detectores para E1 y E2, demostrando la secreción en el medio de ambos polipéptidos derivados de E1 y E2. En la Fig. 10B, el anticuerpo detector fue MAb sAg.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A continuación hay un resumen de técnicas y procedimientos estándares que pueden emplearse con el fin de realizar la invención. Este resumen no es una limitación sobre la invención, sino que más bien da ejemplo que pueden usarse, pero que no son necesarios.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la destreza de la técnica. Tales técnicas se explican de manera completa en la bibliografía, por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y ii (D.N. Glover et al., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); serie The Methods en Enzymology (Academic Press, Inc.), especialmente volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vector for Mammalian Cells (J.H. Miller y M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer y Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres).

Debe señalarse que, como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “uno”, “una”, “el”, “la” incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a “un antígeno” incluye una mezcla de dos o más antígenos, y similar.

Las abreviaturas estándares para nucleótidos y aminoácidos se usan en esta especificación. Por ejemplo, las siguientes abreviaturas de aminoácidos se usan a lo largo del texto:

Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D) Cisteína: Cis (C) Glutamina: Gln (Q) Ácido glutámico: Glu (E) Glicina: Gli (G) Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I) Leucenina: Leu (L) Lisina: Lis (K) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Fe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Tr (T) Triptófano: Trf (W) Tirosina: Tir (Y) Valina: Val (V) I. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y pretenden definirse como se indica más abajo.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan en el presente documento intercambiablemente y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a una longitud mínima del producto. De este modo, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares están incluidos dentro de la definición. La definición abarca tanto proteínas de longitud completa como fragmentos de las mismas. Los términos también incluyen modificaciones de post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para fines de la presente invención, un “polipéptido” se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras en naturaleza), con la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como a través de mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debido a amplificación PCR.

Un polipéptido VHC es un polipéptido, como se ha definido anteriormente, derivado de poliproteína VHC. VHC codifica una glicoproteína sencilla que tiene más de 3000 residuos de aminoácido (Choo et al. Science (1989) 244:359-362; Choo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 1711-1715). La poliproteína se procesa co- y post-translacionalmente en proteínas estructurales y no estructurales (NS).

En particular, el genoma VHC codifica varias proteínas. El orden y nomenclatura de los productos de segmentación de la poliproteína VHC es el siguiente. NH2-C-E1-E2-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. La segmentación inicial de la poliproteína se cataliza mediante proteasas huéspedes que liberan tres proteínas estructurales, la proteína nucleocápside N-terminal (llamada “Núcleo”) y dos glicoproteínas estructurales, “E1” (también conocida como E) y “E2” (también conocida como E2/NS1), así como proteínas no estructurales (NS) que contienen las enzimas virales. Las regiones NS se llaman NS2, NS3, NS4 y NS5. NS2 es una proteína de membrana integral con actividad proteolítica. NS2, bien sola o en combinación con NS3, parte el enlace de escisión NS2-NS3 que a su vez genera NS3 N-terminal y libera una poliproteína grande que incluye actividades de serina proteasa y helicasa ARN. La proteasa NS3 sirve para procesar el resto de la glicoproteína. La finalización de la maduración de poliproteína se inicia mediante segmentación autocatalítica en la unión NS3-NS4a, catalizada por la serina proteasa NS3. Las siguientes segmentaciones mediadas por NS3 de la poliproteína VHC parecen incluir el reconocimiento de uniones de segmentación de poliproteína por una molécula NS3 de otro polipéptido. En estas reacciones, NS3 libera un co-factor NS3 (NS4a), dos proteínas con función desconocida (NS4b y NS5a), y una polimerasa ARN dependiente de ARN (NS5b). Cualquiera de estas proteínas, así como fragmentos inmunogénicos de las mismas, encontrará uso con los antígenos quiméricos sujetos.

El polipéptido para su uso en los antígenos quiméricos no necesita derivarse físicamente de VHC, sino que puede producirse sintéticamente o recombinantemente. Además, el polipéptido puede derivarse de cualquiera de las varias cepas de VHC, tal como cepas 1, 2, 3 o 4 de VHC (descrito con más detalla más abajo). Un número de regiones conservadas y variables son conocidas entre estas cepas y, en general, las secuencias de aminoácido de epítopos derivadas de estas regiones tendrán un grado alto de homología secuencial, por ejemplo, homología secuencial de aminoácido superior al 30%, preferentemente superior al 40%, preferentemente superior al 50%, preferentemente superior al 75%, más preferentemente superior a aproximadamente 80%-85%, preferentemente superior a aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente 95%-98% de identidad secuencial, o más, cuando las dos secuencias se alinean. De este modo, por ejemplo, el término polipéptido “E2” se refiere a la proteína nativa E2 de cualquiera de las varias cepas de VHC, así como análogos de E2, muteínas y fragmentos inmunogénicos, como se define con más detalle más abajo.

El término “análogo” y “muteína” se refieren a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia, o fragmentos de tales derivados, que mantienen la actividad deseada, tal como actividad inmunológica como se describe en el presente documento. En general, el término “análogo” se refiere a compuestos que tienen una secuencia y estructura de polipéptido nativo con una o más adiciones, sustituciones (generalmente conservadoras en naturaleza) y/o eliminaciones de aminoácidos, en relación con la molécula nativa, siempre y cuando las modificaciones no destruyan la actividad inmunogénica. El término “muteína” se refiere a péptidos que tienen una o más especies miméticas de péptidos (“peptoides”), tales como aquellos descritos en la Publicación Internacional Número WO 91/04282. Preferentemente, el análogo o muteína tiene al menos la misma inmunoactividad que la molécula nativa. Los métodos para hacer análogos o muteínas de polipéptidos son conocidos en la técnica y se describen con más detalle más abajo.

Los análogos particularmente preferentes incluyen sustituciones que son conservadoras en naturaleza, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias. (1) ácidos – aspartato y glutamato; (2) básicos – lisina, arginina, histidina; (3) no polares – alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados – glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución conservadora similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tenga un mayor efecto sobre la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones de aminoácido conservadoras o no conservadoras, o incluso hasta aproximadamente 15-25 sustituciones de aminoácido conservadoras o no conservadoras, o cualquier número entero entre 5-25, siempre y cuando la función deseada de la molécula permanezca intacta. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente regiones de la molécula de interés que pueden tolerar cambio por referencia a gráficos de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle, bien conocidos en la técnica.

Por “fragmento” se pretende un polipéptido consistente solamente en una parte de la secuencia y estructura de polipéptido de longitud completa intacto. El fragmento puede incluir una eliminación de C-terminal y/o eliminación de N-terminal del polipéptido nativo. Un “fragmento inmunogénico” de una proteína VHC particular generalmente incluirá al menos aproximadamente 5-10 residuos contiguos de aminoácido de la molécula de longitud completa, preferentemente al menos aproximadamente 15-25 residuos contiguos de aminoácido de la molécula de longitud completa, y más preferentemente al menos aproximadamente 20-50 o más residuos contiguos de aminoácido de la molécula de longitud completa, que definen un epítopo, o cualquier número entero entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, siempre y cuando el fragmento en cuestión mantenga la habilidad para obtener una respuesta inmune como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, fragmentos inmunogénicos preferentes incluyen, aunque no se limitan a fragmentos de VHC Núcleo que comprenden, por ejemplo, aminoácidos 10-45, 10-53, 67-88, 81-130, 86-100, 120-130, 121-135 y 121-170 de la poliproteína, enumerados en relación con la secuencia VHC-1 presentada en Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 2451, así como los epítopos definidos derivados de la región c33c de la poliproteína VHC, así como cualquiera de los otros varios epítopos identificados del VHC núcleo, regiones E1, E2, NS3 y NS4. Véase, por ejemplo, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-38; Chien et al. Publicación Internacional Nº WO 93/00365; Chien,

D.Y. Publicación Internacional Nº WO 94/01778; y Patente de Estados Unidos Nº 6.150.087. Los fragmentos representativos de los polipéptidos E1 y E2 incluyen variantes C-terminalmente truncadas de estas moléculas, tales como polipéptidos E1 que terminan en, por ejemplo, aminoácidos 369 e inferiores, como por ejemplo, polipéptidos E1 que terminan en aminoácidos 351, 352, 353 y etcétera, y polipéptidos E2, que terminan en aproximadamente aminoácidos 730, tales como polipéptidos E2 que terminan por ejemplo en aminoácidos 716, 717, 718 y etcétera. Estas moléculas se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.121.020.

“Determinante antigénico” se refiere al sitio sobre un antígeno o hapteno con el que una molécula específica de anticuerpo o un receptor específico de superficie celular se enlaza.

El término “epítopo” como el usado en el presente documento se refiere a una secuencia de al menos 3 a 5, preferentemente aproximadamente de 5 a 10 o 15, y no más de aproximadamente 1.000 aminoácidos (o cualquier número entero entre ellos), que define una secuencia que por sí misma o como parte de una secuencia más grande, estimulará el sistema inmune de un huésped para crear una respuesta inmune específica del antígeno celular cuando el antígeno esté presente, o una respuesta de anticuerpo humoral. Un epítopo para su uso en la invención sujeto no está limitado a un polipéptido que tiene la secuencia exacta de la parte de la proteína matriz de la cual se deriva. De hecho, los genomas virales están en un estado de flujo constante y contienen varios dominios variables que muestran grados relativamente altos de variabilidad entre aislados. De este modo, el término “epítopo” abarca secuencias idénticas a la secuencia nativa, así como modificaciones a la secuencia nativa, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras en naturaleza).

Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítope pueden identificarse usando un número de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Métodos en Bilogía Molecular, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a partes de la molécula de la proteína, y reaccionando los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos se mantienen unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. Similarmente, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente al determinar la conformación espacial de aminoácidos tales como, por ejemplo, cristalografía con rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de proteínas pueden también identificarse usando gráficos estándares de antigenicidad e hidropatía, tales como aquellos calculados usando, por ejemplo el programa de software Omiga versión 1.0 disponible en Oxford Molecular Group. Este programa de ordenador emplea el método Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78. 3824-3828 para determinar perfiles de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 para gráficos de hidropatía.

Como se usa en el presente documento, el término “epítopo conformacional” se refiere a una proteína de longitud completa, o un análogo o muteína de la misma, que tiene características estructurales nativas para la secuencia de aminoácido que codifica el epítopo dentro de la proteína natural de longitud completa. Las características estructurales nativas incluyen, aunque no se limitan a, glicosilación y estructura tridimensional.

Preferentemente, un epítopo conformacional se produce recombinantemente y se expresa en una forma celular que es extraíble bajo condiciones que preservan sus características estructurales deseadas, por ejemplo, sin la desnaturalización del epítopo. Tales células incluyen bacterias, levadura, células de insectos y mamíferos. La expresión y aislamiento de epítopos conformacionales recombinantes de la poliproteína VHC se describen, por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales Números WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734.

Como se usa en el presente documento, el término “epítopo célula T” se refiere a una característica de una estructura de péptido que es capaz de inducir inmunidad de la célula T hacia la estructura de péptido o un hapteno asociado. Los epítopos de célula T generalmente comprenden determinantes lineales de péptido que asumen conformaciones extendidas dentro de la partición del enlace peptídico de moléculas MHC, (Unanue et al., Science (1987) 236: 551-557). La conversión de polipéptidos a determinantes lineales de péptido asociados con MHC clase II (generalmente entre 5-14 aminoácidos en longitud) se llama “procesamiento de antígeno” que lo realizan las células presentadoras de antígeno (CPAs). Más particularmente, un epítope de célula T se define por características locales de estructura corta de péptido, tales como propiedades primarias de aminoácido que incluyen carga y hidrofobicidad, y ciertos tipos de estructura secundaria, tales como helicidad, que no depende del pliegue del polipéptido completo. Además, se cree que los péptidos cortos capaces de que las células T ayudantes los reconozcan son generalmente estructuras anfipáticas que comprenden un lado hidrofóbico (para su interacción con la molécula MCH) y un lado hidrofílico (para su interacción con el receptor de célula T). (Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitope, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc., ed. G. C. Woodrow et al. (1990) páginas 109-116) y además que las estructuras anfipáticas tienen una configuración a-helicoidal (véase, por ejemplo, Spouge et al., J. Immunol. (1987)

138: 204-212; Berkower et al., J. Immunol. (1986) 136: 2498-2503).

Por consiguiente, los segmentos de proteínas que incluyen epítopos de célula T pueden predecirse fácilmente usando numerosos programas de ordenador. (Véase, por ejemplo, Margalis et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Ind. Ed. G. C. Woodrow et al. (1990) páginas 109-116). Tales programas generalmente comparan la secuencia de aminoácido de un péptido con una secuencia conocida que induzca una respuesta de célula T, y busca patrones de aminoácido que se cree que se necesitan para un epítopo de célula T.

Una “respuesta inmunológica” a un polipéptido o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular a moléculas presentes en la composición de interés. Para fines de la presente invención, una “respuesta inmune humoral” se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras que una “respuesta inmune celular” es la mediada por linfocitos T y/o otros glóbulos blancos. Un aspecto importante de inmunidad celular incluye una respuesta específica de antígeno por célula T citolíticas (“CTLs”). CTLs tienen especificidad para antígenos de péptido que están presentes en asociación con proteínas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y se expresan sobre superficies de células. CTSs ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto de inmunidad celular incluye una respuesta específica de antígeno por las células T ayudantes. Las células T ayudantes actúan para ayudar a estimular la función, y enfocar la actividad de células efectoras no específicas contra las células que muestran antígenos de péptido en asociación con moléculas MHC sobre su superficie. Una “respuesta inmune celular” también se refiere a la producción de citoquinas, quimioquinas y otras moléculas del tipo producidas por células T activadas y/o otros glóbulos blancos, incluyendo aquellos derivados de células T CD4+ y CD8+.

Una composición, tal como una composición inmunogénica, o vacuna que obtiene una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar un sujeto vertebrado mediante la presentación de antígeno en asociación con moléculas MHC en la superficie celular. La respuesta inmune mediada por la célula se dirige a, o cerca de, células que presentan antígeno en su superficie. Además, pueden generarse linfocitos T específicos de antígeno para permitir la protección futra de un huésped inmunizado.

La habilidad de un antígeno o composición particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por una célula puede determinarse mediante un número de ensayos, tales como mediante ensayos de linfoprofileración (activación de linfocitos), ensayos de células tóxicas CTL, o mediante ensayo de linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24-2369-2376; y los ejemplos más abajo.

De este modo, una respuesta inmunológica como la usada en el presente documento puede ser aquella que estimula la producción de CTLs, y/o la producción o activación de células T ayudantes. El antígeno de interés también puede obtener una respuesta inmune mediada por un anticuerpo. Por consiguiente, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos por células B; y/o la activación de céulas T supresoras y/o células T yo dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos presentes en la composición o vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar infectividad, y/o mediar citotoxicidad celular complemento de anticuerpos o dependiente de anticuerpos (CCDA) para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Tales respuestas pueden determinarse usando inmunoensayos estándares y ensayos de neutralización, bien conocidos en la técnica.

Un polipéptido o composición “inmunogénica” es aquella que obtiene una respuesta inmunológica como se ha definido anteriormente.

Una proteína “recombinante” es una proteína que conserva la actividad deseada y que se ha preparado mediante técnicas de ADN recombinante como se describe en el presente documento. En general, el gen de interés se clona y después se expresa en organismos transformados, como se describe con más detalle más abajo. El organismo huésped expresa el gen externo para producir la proteína bajo condiciones de expresión.

Por “aislado” se entiende, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y diferenciada del organismo entero con el que la molécula se encuentra por naturaleza o está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término “aislado” con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico desprovista, toda o en parte, de secuencias normalmente asociadas con ella por naturaleza; o una secuencia, como la que existe por naturaleza, pero que tiene secuencias homólogas en asociación con la misma; o una molécula desasociada del cromosoma.

“Homología” se refiere a la identidad porcentual entre dos polinucleótidos o dos fracciones de polipéptido. Dos secuencias de ADN o de polipéptidos son “sustancialmente homólogas” entre sí cuando las secuencias muestran al menos aproximadamente 50%, preferentemente al menos aproximadamente 75%, más preferentemente al menos aproximadamente 80%-85%, preferentemente al menos aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente 95%-98% de identidad secuencial sobre una longitud definida de las moléculas. Como se usa en el presente documento, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con la secuencia especificada de ADN o polipéptido.

En general, “identidad” se refiere a una correspondencia exacta nucleótido con nucleótido o aminoácido con aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, respectivamente. La identidad porcentual puede determinarse mediante una comparación directa de la información secuencial entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo entre la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Pueden usarse programas de ordenador fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tales como ALIGN, Dayhoff, M. O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Supl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC., que adapta el algoritmo local de homología de Smith y Waterman Advances en Appl. Math. 2: 482-489, 1982 para análisis de péptidos. Los programas para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos están disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas pueden utilizarse fácilmente con los parámetros estándares recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido anteriormente. Por ejemplo, la identidad porcentual de una secuencia particular de nucleótido con una secuencia de referencia puede determinarse usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman usando una tabla estándar de puntuaciones y una penalización en la puntuación de alineamiento de seis posiciones de nucleótido.

Otro método para establecer identidad porcentual en el contexto de la presente invención es usar el paquete MPSRCH de programas con derechos de autor de la Universidad de Edimburgo, desarrollados por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuidos por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Desde este grupo de paquetes puede emplearse el algoritmo Smith-Waterman donde los parámetros estándares se usan para la tabla de puntuaciones (por ejemplo, penalización en la puntuación de alineamiento abierto de 12, penalización en la puntuación de alineamiento de extensión de uno, y una puntuación de alineamiento de seis). A partir de los datos generados el valor “Coincidencia” refleja la “identidad secuencial”. Otros programas adecuados para calcular la identidad porcentual o similitud entre secuencias se conocen de manera general en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros estándares. Por ejemplo, BLASTN Y BLASTP pueden usarse usando los siguientes parámetros estándares; código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = dos; límite = 60;esperanza = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS traslaciones + Swiss protein+ Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, la homología puede determinarse mediante hibridización de polinucleótidos bajo condiciones que forman duplicaciones estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa(s) específica(s) de única hebra, y determinación de tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, condiciones rigurosas, como se define para este sistema particular. La definición de condiciones apropiadas de hibridación está dentro de la destreza de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Una “secuencia codificadora” o una secuencia que “codifica” un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) o se traslada (en el caso de mARN) a un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio en la terminal 5’ (amino) y un codón de parada de translación en la terminal 3’ (carboxi). Una secuencia de terminación de transcripción puede estar situada en 3’ con la secuencia codificadora.

“Operablemente unido” se refiere a una disposición de elementos donde los componentes así descritos están configurados para que realicen su función deseada. De este modo, un promotor dado operablemente unido a una secuencia codificadora es capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificadora cuando los factores apropiados de transcripción, etc., están presentes. El promotor no necesita estar contiguo a la secuencia codificadora, siempre y cuando funcione para dirigir la expresión de la misma. De este modo, por ejemplo, secuencia interventoras no trasladadas ya transcritas pueden estar presentes entre la secuencia promotora y la secuencia codificadora, como lo pueden estar intrones transcritos, y la secuencia promotora puede todavía considerase “operablemente unida” con la secuencia codificadora.

“Recombinante” como se usa en el presente documento para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, cADN, viral, semi-sintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con todo o una parte del polinucleótido con el que se asocia por naturaleza. El término “recombinante” como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y después se expresa en organismos transformados, como se describe con más detalle más abajo. El organismo huésped expresa el gen externo para producir la proteína bajo condiciones de expresión.

Un “elemento de control” se refiere a una secuencia de polinucleótido que ayuda en la expresión de una secuencia codificadora a la que está unida. El término incluye promotores, secuencias de terminación de transcripción, dominios reguladores corriente arriba, señales de poliadenilación, regiones no trasladadas, que incluyen 5’-UTR y 3’-UTR y cuando sea apropiado, secuencias líderes y potenciadores, que colectivamente proporcionan la transcripción y traslación de una secuencia codificadora en una célula huésped.

Un “promotor” como se usa en el presente documento es una región reguladora de ADN capaz de enlazarse con una polimerasa de ARN en una célula huésped e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora operablemente unida a la misma corriente abajo (dirección 3’). Para fines de la presente invención, una secuencia promotora incluye el mínimo número de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción de un gen de interés en niveles detectables por encima de los antecedentes. Dentro de la secuencia promotora está un sitio de iniciación de transcripción, así como dominios de enlace de proteína (secuencias de consenso) responsables de enlace de polimerasa de ARN. Los promotores eucarióticos a menudo, pero no siempre, contendrán cajas “TATA” o “CAT”.

Una secuencia de control “dirige la transcripción” de una secuencia codificadora en una célula cuando la polimerasa de ARN se enlaza con la secuencia promotora y transcribe la secuencia codificadora en mARN, que después se traslada al polipéptido codificado por la secuencia codificadora.

El “casete de expresión” o “construcción de expresión” se refiere a un montaje que es capaz de dirigir la expresión de la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. El casete de expresión incluye elementos de control, como se ha descrito anteriormente, tales como un promotor que está operablemente unido (para dirigir la transcripción de) a la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés, y a menudo incluye una secuencia de poliadenilación también. En ciertas realizaciones de la invención, el casete de expresión descrito en el presente documento puede estar contenido dentro de una construcción de plásmido. Además de los componentes del casete de expresión, la construcción de plásmido también puede incluir uno o más marcadores detectables, una señal que permita que la construcción de plásmido exista como ADN de una única hebra (por ejemplo, un origen M13 de réplica), al menos un sitio de múltiples clonaciones, y un origen “mamífero” de réplica (por ejemplo, un origen SV40 o adenovirus de réplica).

“Transformación” como se usa en el presente documento, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método usado para su inserción: por ejemplo, transformación mediante absorción directa, transfección, infección y similares. Para métodos particulares de transfección, véanse más detalles más abajo. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, un episoma, o alternativamente, puede integrase en el genoma huésped.

Una “célula huésped” es una célula que se ha transformado, o es capaz de transformación, mediante una secuencia exógena de ADN.

Por “inmunización de ácido nucleico” se entiende la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos seleccionados en una célula huésped, para la expresión in vivo del antígeno o antígenos. La molécula de ácido nucleico puede introducirse directamente en el sujeto recipiente sujeto, tal como mediante inyección, inhalación, administración oral, intranasal y mucosa, o similares, o puede introducirse ex vivo, en células que se han retirado del huésped. En el último caso, las células transformadas se vuelven a introducir en el sujeto donde puede realizarse una respuesta inmune contra el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, “tratamiento” se refiere a cualquiera de (i) la prevención de infección o reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la reducción o eliminación de síntomas, y(iii) la eliminación completa o sustancial del patógeno en cuestión. El tratamiento puede efectuarse profilácticamente (antes de la infección) o terapéuticamente (después de la infección).

Por “sujeto vertebrado” se entiende cualquier miembro de los cordados subfilos, incluyendo, aunque sin limitación, humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cerdos de guinea; aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de juego tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y similares. El término no denota una edad particular. De este modo, se pretende incluir tanto individuos adultos como recién nacidos. La invención descrita en el presente documento pretende usarse en cualquiera de las especies anteriores vertebradas, ya que los sistemas inmunes de todos estos vertebrados funcionan similarmente.

II. Modos de Realizar la Invención

Antes de describir la presente invención con detalle, se entenderá que esta invención no se limita a formulaciones particulares o parámetros de procesos ya que tales, por supuesto, pueden variar.

Aunque en la práctica de la presente invención puede usarse un número de composiciones y métodos similares

o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento, los materiales y métodos preferentes se describen en el presente documento.

Como se ha señalado anteriormente, los antígenos quiméricos que combinan HBsAg con partes de proteínas de VHC mejoran la presentación al sistema inmune de proteínas de VHC débilmente inmunogénicas debido a la fuerte antigenicidad de HBsAg. Las partículas de tipo virus típicamente contienen una envoltura de membrana en la que se incrustan una o más proteínas virales de envoltura. Las partículas de tipo virus se secretan por una célula infectada con un virus o una célula transfectada con una molécula de ácido nucleico que codifica una o más proteínas virales.

Las partículas de tipo virus son una forma especialmente ventajosa de presentación de antígenos. Las partículas de tipo virus que contienen quimeras HBsAg combinan la naturaleza altamente antigénica del propio HBsAg con la presentación deseable de otros antígenos en la superficie de una preparación particulada.

La presente invención proporciona métodos y materiales que permiten la producción de antígenos VHB/VHC quiméricos en forma de partículas de tipo virus para la producción de composiciones inmunogénicas, tales como vacunas. Al utilizar co-expresión de HBsAg junto con antígenos quiméricos, ahora es posible incluir grandes segmentos de glicoproteínas de envoltura VHC fusionadas con HBsAg en forma de partículas de tipo virus. Tales partículas son especialmente muy adecuadas para su uso en composiciones inmunogénicas.

La estrategia para preparar partículas de tipo virus VHB/VHC depende en primer lugar de la producción de uno

o más antígenos quiméricos para mostrarse en las partículas. Tales antígenos quiméricos son proteínas de fusión que comprenden un dominio S sustancialmente completo de un polipéptido HBsAg (llamado “sAg” en el presente documento) y un polipéptido inmunogénico VHC o un fragmento del mismo. Un dominio S de HBsAg, o cualquier otro polipéptido de la invención, es “sustancialmente completo” si contiene la secuencia nativa del polipéptido con o sin eliminaciones menores de uno o más pocos aminoácidos de las regiones de N-terminal o C-terminal o dentro del polipéptido. Por ejemplo, el dominio S de HBsAg puede truncarse por unos pocos aminoácidos, esto es, hasta aproximadamente 3, 5, 7 o 10 aminoácidos, sin afectar en gran medida a su antigenicidad o habilidad para causar la formación de partículas de tipo virus. Las secuencias enlazadoras de cualquier longitud deseada, preferentemente no más de unos pocos aminoácidos, pueden añadirse entre los polipéptidos unidos para formar la proteína de fusión. Bien el dominio preS2 (anteriormente llamado pres) o los dominios preS2 y preS12 de HBsAg pueden también incluirse en el terminal amino del polipéptido HBsAg si se desea.

Valenzuela, et al. (1982) Nature 298: 347-350 describe el gen para HBsAg. Véase, también, Valenzuel, et al. (1979) Nature 280: 815-819. Las proteínas derivadas de la superficie de VHB, tal como el antígeno de superficie, sAg, así como las secuencias de pre-superficie, preS1 y preS2, y cualquier combinación de estas secuencias, pueden formar espontáneamente partículas tras la expresión en una célula huésped adecuada, tal como después de la expresión en células de mamífero, insecto, levadura o células Xenopus. De este modo, como se ha explicado anteriormente, las partículas de tipo virus VHB/VHC pueden incluir polipéptidos que forman partículas de sAg, preS1 y/o preS21, así como polipéptidos que forman partículas de cualquier combinación de las anteriores, tales como sAg/preS1, sAg/preS2 y sAg/preS1/preS2. Véase, por ejemplo, “Vacunas VHB – del laboratorio a la autorización: estudio de un caso” en Mackett, M. y Williamson. J. D., Human Vaccines and Vaccination, páginas 159-176, para una exposición de estructura de VHB; y Patenes de Estados Unidos Números 4.722.84., 5.098.704, 5.324.513, 5.965.140, Beames et al., J. Virol. (1995) 69: 6933-6938, Birnbaum et al., J. Virol. (1990) 64: 3319-3330, Zhou et al.,

J. Virol. (1991) 65: 5457-5464, para descripciones de la producción recombinante de varias partículas VHB.

VHC tiene un genoma que contiene un único marca de lectura abierto de aproximadamente 9,5 kb, que se trascribe a una poliproteína. La poliproteína VHC se parte para formar al menos diez productos distintos, que son NH2-Núcleo-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Las proteínas E1 y E2 de VHC se glicosilan posttransacionalmente. La secuencia de longitud completa de la poliproteína se desvela en la Publicación Europea Nº

388.232 y la Patente de Estados Unidos Nº 6.150.087. Además, las secuencias para los productos anteriores de poliproteínas VHC, y los polipéptidos inmunogénicos derivados de los mismos, son conocidos (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.350.671). Por ejemplo, se ha descrito un número de polipéptidos generales y específicos, derivados de la poliproteína VHC. Véase, por ejemplo, Houghton et al., Publicaciones Europeas Números 318.216 y 388.232; Choo et al., Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al., Science (1989) 244: 362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381-388; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19929 89: 10011-10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., Publicación Internacional Nº WO 93/00365; Chien, D.Y, Publicación Internacional Nº WO 94/01778. Estas publicaciones proporcionan antecedentes amplios sobre VHC en general, así como la fabricación y usos de reagentes inmunológicos de polipéptido VHC.

Cualquier polipéptido E1 o E2 de VHC deseado como se relata en las reivindicaciones puede utilizarse como parte del antígeno quimérico. La glicoproteína E1 corresponde a residuos aminoácidos 192 a 383, y E2 se extiende aproximadamente desde el aminoácido 384 al aminoácido 746 en la mayoría de las cepas de VHC. Véase Choo et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455. Un fragmento de la glicoproteína E1 o E2 que se utiliza en el antígeno quimérico debería comprender preferentemente un epítopo, dominio u otra unidad estructural que sea inmunogénica.

Una glicoproteína E1 o E2 o fragmento de la misma para su uso en un antígeno quimérico, preferentemente conservará o se parecerá a su conformación nativa. Si una conformación sustancialmente nativa se conserva para el polipéptido VHC en la proteína de fusión que contiene HBsAg, entonces los anticuerpos generados para el polipéptido VHC reconocerán y se enlazarán con el polipéptido correspondiente en VHC.

Otros polipéptidos de VHC también pueden usarse en los antígenos quiméricos de la invención. Por ejemplo, los polipéptidos de VHC derivados de la región Núcleo, tales como polipéptidos derivados de la región encontrada entre los aminoácidos 1-191; aminoácidos 10-53; aminoácidos 10-45; aminoácidos 67-88; aminoácidos 86-100; 81130; aminoácidos 121-135: aminoácidos 120-130; aminoácidos 121-170; y cualquiera de los epítopos Núcleo identificados en, por ejemplo, Houghton et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.350.671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa (1992) 89: 1011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., Publicación Internacional Nº WO 93/00365; Chien, D.Y, Publicación Internacional Nº WO 94/01778; y Patente de Estados Unidos Nº 6.150.087, encontrarán uso con las moléculas quiméricas sujeto.

Además, los polipéptidos derivados de las regiones no estructurales de los virus también encontrarán uso en el presente documento. La región NS3/4a de la glicoproteína de VHC se ha descrito y la secuencia de aminoácido y la estructura global de la proteína se desvelan en Yao et al. Structure (Noviembre 1999) 7: 1353-1363. Véase, también, Dasmahapatra et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.843.752. Como se ha explicado anteriormente, tanto la secuencia nativa como los análogos inmunogénicos pueden usarse en las formulaciones sujeto. Dasmahapatra et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.843.752 y Zhang et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.990.276, ambas describen análogos de NS3/4a y métodos de hacer lo mismo.

Además, antígenos de fusión de múltiples epítopos (llamados “AFMEs”), como se describe en la Publicación Internacional Nº WO 97/44469, pueden usarse en las quimeras sujetos. Tales AFMEs incluyen múltiples epítopos derivados de dos o más de las varias regiones virales. Los epítopos son preferentemente de más de una cepa de VHC, proporcionando de este modo la habilidad añadida de proteger contra múltiples cepas de VHC en una única vacuna.

Además, los polipéptidos para su uso en las quimeras sujetos pueden derivarse de la región NS3 de la poliproteína de VHC. Un número de tales polipéptidos son conocidos, incluyendo, aunque sin limitar a polipéptidos derivados de regiones c33c y c100, así como proteínas de fusión que comprenden un epítopo NS3, tal como c25. Estos y otros polipéptidos NS3 son útiles en la presente composición y son conocidos en la técnica y descritos en, Houghton et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.350.671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa (1992) 89: 101110015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., Publicación Internacional Nº WO 93/00365; Chien, D.Y, Publicación Internacional Nº WO 94/01778; y Patente de Estados Unidos Nº 6.150.087.

Es realmente aparente que una multitud de polipéptidos VHC pueden usarse en las moléculas quiméricas sujeto o pueden co-administrase con ellas, con el fin de proporcionar una respuesta inmune contra el antígeno de VHC en cuestión.

Como se ha explicado anteriormente, los antígenos de VHC pueden usarse en su totalidad o fragmentos inmunogénicos de los mismos, así como variantes inmunogénicas, pueden combinarse con un polipéptidos HBsAg para formar el antígeno quimérico mediante fusión de las secuencias del gen que codifican las secuencias deseadas de polipéptidos, en un marco de lectura apropiado, usando técnicas estándares disponibles en la técnica. De este modo, los polipéptidos de VHB y VHC descritos para su uso en la invención pueden modificarse mediante eliminaciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos conservadores, siempre y cuando se conserve una conformación sustancialmente nativa para el epítopo de VHC que se pretende usar como un inmunógeno. Preferentemente, el polipéptido de VHC o fragmento de polipéptido se elige para que, cuando se exprese en una proteína de fusión con HbsAg, conserve sustancialmente la conformación nativa de la parte correspondiente de la proteína VHC de la que se deriva, esto es, la conformación aproximada que existe en un virión maduro de VHC.

Debería señalarse que por conveniencia, las varias regiones de VHC se definen con respecto al número de aminoácidos en relación con la poliproteína codificada por el genoma de VHC-1a, como se describe en Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451, con la designación de metionina iniciadora en la posición 1. Sin embargo, los polipéptidos para su uso con la presente invención no se limitan a aquellos derivados de la secuencia VHC-1a. Cualquier cepa o aislado de VHC puede servir como la base para proporcionar secuencias antigénicas para uso con la invención. En este aspecto, las regiones correspondientes en otro aislado de VHC pueden determinarse fácilmente alineando secuencias de los dos aislados de una manera que ponga a las secuencias en la máxima alineación.

Varias cepas y aislados de VHC son conocidos en la técnica, que difieren entre sí en cambios en la secuencia de nucleótido y aminoácido. Por ejemplo, aislado J1de VHC se describe en Kubo et al. (1989) Japan. Nucl. Acids. Res. 17: 10367-10372; Takeuchi et al. (1990) Gene 91. 287-291; Takeuchi et al. (1990) J. Gen. Virol. 71: 3027-3033; y Takeuchi et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18: 4626. Las secuencia completas codificadoras de dos aislados independientes, VHC-J y BK se describen en Kato et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 87: 9524-9528 y Takamizawa et al., 81991) J. Virol. 65: 1105-1113, respectivamente. Aislados VHC-1 se describen en Choo et al (1990) Brit. Med. Bull 46: 423-441; Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455 y Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711-1715. Aislados HC-J1 y HC-J4 de VHC se describen en Okamoto et al. (1991) Japan J. Exp. Med. 60: 167-177. Aislados HCT 18~, HCT 23, Th, HCT 27, EC1 y EC10 de VHC se describen en Weiner et al. (1991) Virol. 180: 842-848, Aislados Pt-1 de VHC, VHC-K1 y VHC-K2 se describen en Enomoto et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 1021-1025. Aislados A, C, D y E de VHC se describen en Tsukiyama-Kohara et al. (1991) Virus Genes 5: 243-254.

Las secuencias codificadoras para polipéptidos VHC que ocurren de manera natural para su uso en las moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención pueden obtenerse a partir de cualquiera de las cepas de VHC anteriormente citadas o de aislados recién descubiertos aislados de tejidos o fluido de pacientes infectados. En la elección de polipéptidos de VHC o sus fragmentos de diferentes cepas de VHC para su uso en un antígeno quimérico de la invención, es preferente que las secuencias de nucleótido o de aminoácido estén alineadas para que haya la máxima superposición entre cepas. Esto puede conseguirse, por ejemplo, compensando las inserciones o eliminaciones de aminoácidos para que se obtenga la mayor superposición posible entre cepas antes de seleccionar una secuencia para su incorporación en el antígeno quimérico. Si una secuencia desvelada en el presente documento se selecciona de otra cepa de VHC, entonces preferentemente se seleccionará la secuencia correspondiente, esto es, la secuencia que se alinea para ser idéntica en el máximo número posible de residuos con la secuencia desvelada. Las secuencias modificadas que no ocurren en la naturaleza también pueden usarse. Una “molécula de ácido nucleico” de acuerdo con la invención puede ser cualquier ácido nucleico tal como ADN o ARN, bien con una única o doble hebra, o cualquier análogo o derivado químico del mismo que codifique una proteína de fusión de la invención o parte de la misma o cualquier HbsAg o parte del mismo.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden clonarse en vectores de expresión y transformarse en, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, planta, insecto o mamífero para que los antígenos quiméricos y las partículas de tipo virus de la invención puedan expresarse en y aislarse del cultivo celular. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar contenidas dentro de un plásmido, tal como pBR322, pUC, ColE1, o plásmidos relacionados tales como pCMV6a (véase Patente de Estados Unidos 5.688.688) o plásmidos derivados de los mismos. Las molécula de ácido nucleico pueden también estar contenidas dentro de un vector viral, tal como cualquier vector derivado de adenovirus, virus Sindbis, virus del simio 40, citomegalovirus, y retrovirus tales como virus del sarcoma murino, virus del tumor mamario del ratón, virus de la leucemia murina de Moloney y virus del sarcoma de Rous. Los vectores bacterianos, tales como Salmonella ssp., Yersinia enterocolitica, Shigella spp., Vibrio cholerae, cepa Mycobacterium BCG, y Listeria monocytogenes también pueden usase. Los microcromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, cósmidos, y replicones también pueden usase.

Cualquier vector de expresión adecuado puede construirse o utilizarse para expresar cualquier forma de HbsAg

: o cualquier antígeno quimérico de la invención. Un vector preferente es pCMVII, un vector de clonación basado en pUC19 diseñado para su expresión en células mamíferas. pCMVII comprende los siguiente elementos: potenciador/promotor CMV IE humano, intrón A CMV humano, un líder activador tisular plasminógeno humano (tPA),

: o terminador poliA de hormona del crecimiento bovina (BGHt), un origen ColE1 de réplica, y un gen de resistencia a la ampicilina Amp R (Figs. 1A y 1B-1F, SEQ ID No:1). pCMVII-pS1-sAg puede usarse para la expresión de preS2-HbsAg (Figs. 2A y 2B-2I, SEQ ID Ns: 2 y 3). En pCMVII-pS2-sAg, las secuencias codificadores para los dominios preS2 y S de HbsAg se han insertado en pCMVII entre intrón A CMV y BGHt; este vector también puede modificarse añadiendo las secuencias codificadoras para el dominio preS1 o retirando el dominio preS2. Los antígenos

quiméricos que contienen HbsAg junto con epítopos de proteínas VHC pueden construirse similares a pCMVII opti 330 E1/sAg (Figs. 3A y 3B-3I, SEQ ID NOS: 4 y 5) o pCMVII-E2661-sAg (Figs. 4 A y 4B-4F, SEQ ID NOS: 6 y 7). Estos vectores se proporcionan a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los vectores pCMVII aislados y purificados que contienen una inserción que codifica HbsAg o un antígeno quimérico pueden disolverse en tampón de suero salino estéril 0,9% o cualquier otro tampón adecuado antes de su uso.

La expresión de antígenos quiméricos para su uso como inmunógenos requiere la transfección de célula eucarióticas con un vector de expresión. Puede usarse cualquier línea celular eucariótica, por ejemplo, células CHO

o células COS. Una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno quimérico puede incorporarse en cualquier vector adecuado para transfección, por ejemplo un vector plásmido o un vector viral. Si se usa un vector viral, preferentemente producirá partículas virales defectuosas, no infecciosas para que el riesgo de contaminación con virus infeccioso en una preparación de vacuna se minimice.

La transfección puede realizarse mediante cualquier método conocido y puede dar como resultado una transfección temporal o transfección estable. La transfección estable es preferente para establecer una línea celular que produzca partículas de tipo virus de VHB/VHC. Los métodos para obtener transfección estable son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, selección de transfectantes espontáneamente estables, transfección con genes inmortales (véase, por ejemplo, Katakura et al., Methods Cell Biol. (1998) 57: 69-91), y selección de genes que proporcionan resistencia a antibióticos tales como higromicina B y neomicina. Un método preferente para células CHO incluye la selección de células transfectadas con dihidrofolato reductasa seguida de amplificación del transgen usando metotrexato (véase Wurn et al., Ann, N. Y. Acad. Sci. (1996) 782-70-78).

La co-expresión de antígenos quiméricos con HBsAg da como resultado la formación y secreción de partículas de tipo virus. La secreción óptima de partículas de tipo virus requiere una cantidad suficiente de expresión de HBsAg en relación con la expresión de antígeno quimérico, y cantidades mayores de expresión HBsAg generalmente mejoran la eficiencia de secreción de antígeno quimérico. La secreción de antígeno quimérico como partículas de tipo virus pueden optimizarse variando la proporción de las secuencias codificadoras para HBsAg con las secuencias codificadoras para el antígeno quimérico. Generalmente, la secreción útil de partículas de tipo virus se obtendrá en una proporción de secuencias codificadoras de HBsAg con secuencias codificadoras de antígeno quimérico de aproximadamente: 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 7:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 o 100:1. Las proporciones inferiores a 1:1 proporcionan una menor producción de partículas de tipo virus que contienen antígeno quimérico, mientras que las proporciones altas superiores a 100:1 diluyen el antígeno quimérico y finalmente limitarán la utilidad de las partículas debido a la dilución del antígeno quimérico con HBsAg.

Una estrategia para transfectar células huéspedes con los vectores de la invención, bien para producción in vitro de las partículas de tipo virus o para la inmunización de un organismo huésped usando una vacuna de ácido nucleico, es proporcionar dos o más vectores separados, uno que codifique HBsAg y uno o más que codifiquen un antígeno quimérico. Otra estrategia es incluir HBsAg y uno o más antígenos quiméricos en una única construcción. Por ejemplo, un vector de expresión que tiene un único marco de lectura abierto podría tener una secuencia codificadora de HBsAg bajo control de un promotor, seguido de secuencias codificadoras de uno o más antígenos quiméricos, cada uno precedido por un sitio de entrada ribosomal interna (IRES, véase, por ejemplo, Martinez-Salas (1999) Curr. Op. Biotechnol. 10: 458-464). De este modo, la invención abarca el uso de un único polipéptido inmunogénico o múltiples polipéptidos inmunogénicos distintos en una única partícula de tipo virus. Opcionalmente, la expresión de polipéptidos inmunogénicos puede regularse incluyendo secuencias promotoras y/o potenciadoras en el vector de expresión que responde a los activadores producidos en las células transfectadas.

Las células que se han transfectado con vectores plásmidos o virales que expresan antígenos quiméricos de VHB/VHC junto con HBsAg pueden analizarse para determinar si cada antígeno se está expresando y secretando en forma de partículas de tipo virus. Puede usarse un ensayo inmunológico estándar para detectar antígenos de VHB y VHC, incluyendo, por ejemplo, ensayos quimioluminiscentes (véase, por ejemplo, ensayos Magic Lite en los Ejemplos 1-4; Woodhead, J. S. y Weeks, 1. (1989) J. Biolumin. Chemilumin. 4: 611-14), ELISA, y radioinmunoensayos. Donde se produce un antígeno mediante células transfectadas en cultivo, la cantidad de secreción del antígeno al medio de cultivo puede determinarse comparando la cantidad de antígeno en el medio de cultivo con el resto de cantidad en las células lisadas. La presencia de partículas de tipo virus puede confirmarse mediante la sedimentación de tales partículas del medio de cultivo a un gradiente de densidad, por ejemplo, un gradiente de densidad de sacarosa (véase Ejemplos 1-3).

Mientras la expresión en una línea celular mamífera es preferente, también pueden emplearse otros sistemas para expresar partículas de tipo virus de la invención. Por ejemplo, puede usarse cultivo de células de levadura (véase Patente de Estados Unidos 5.098.7047), en la que las partículas de tipo virus puede cosecharse afectando a las células usando agitación con gotas de cristal u otro método adecuados.

En general, las proteínas de la invención sujeto se agregarán de manera natural para formar partículas en el huésped de la expresión. Las partículas pueden envolverse con una capa de membrana de lípido, que puede o no incluir proteínas de membrana codificadas por el virus. Alternativamente, las partículas pueden no incluir la membrana de lípido o la membrana puede estar presente inicialmente o puede retirarse, en su totalidad o en parte.

Patentes de Estados Unidos Números 4.722.840 y 5.965.140, describen partículas híbridas comprendidas por un fragmento formador de partícula de una proteína estructural de un virus, tal como fragmento formador de partícula de antígeno de superficie (HBsAg) de virus de la hepatitis B (VHB), fusionado con un polipéptido heterólogo.

Las partículas de tipo virus de VHB/VHC pueden purificase después de cosecharse de un medio de cultivo o suspensión celular y antes de usarse en una composición inmunogénica. Puede usarse cualquier método que sea conocido para separar las partículas de tipo virus o los virus de proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, membranas, células intactas y similares circundantes. Especialmente preferentes son los métodos de cromatografía de afinidad; por ejemplo, puede usarse un anticuerpo monoclonal inmovilizado específicos para HBsAg. Métodos adecuados adicionales son cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, y sedimentación con gradiente de densidad. Los métodos para partículas de tipo virus quiméricas aisladas se describen en, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Números 4.722.840 y 5.965.140.

Cualquier composición de la invención, tal como una proteína de fusión, o molécula de ácido nucleico, puede usarse como una “composición inmunogénica”. Una composición inmunogénica preferentemente genera una respuesta inmune, como la definida anteriormente, tal como una respuesta de anticuerpo o célula T, en un mamífero al que se administra. Una composición inmunogénica de la invención puede ser, aunque no se limita a, una vacuna o una vacuna de combinación, por ejemplo, una composición inmunogénica que produzca una respuesta inmune a más de un inmunógeno. Además, las proteínas quiméricas de la invención pueden formularse en “composiciones antigénicas”, por ejemplo, composiciones que incluyan epítopos a los que se enlaza una molécula específica de anticuerpo o un receptor específica de superficie celular.

Las composiciones inmunogénicas y antigénicas que contienen partículas de tipo virus de VHB/VHC o una molécula de ácido nucleico que codifica proteínas que forman partículas de tipo virus pueden administrarse a un mamífero, tal como un ratón, conejo, babuino, chimpancé o humano, para obtener anticuerpos anti-VHC in vivo. La inyección de una composición inmunogénica de la invención preferentemente da como resultado la síntesis de partículas de tipo virus en el huésped. Por lo tanto, las composiciones que comprenden ácidos nucleicos deberían incluir secuencias codificadoras de HBsAg y antígenos quiméricos tales como proteínas de fusión HBsAg-E1 y/o HBsAg-E2, así como fusiones con otros polipéptidos VHC. La proporción peso:peso de ácidos nucleicos que codifican HBsAg con ácidos nucleicos que codifican antígenos quiméricos es preferentemente 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 50:1 o 100:1 y da como resultado la formación de partículas de tipo virus en las células del huésped y su secreción dentro del huésped. Más preferentemente, la proporción se encuentra en el rango de 5:1 a 20:1.

Las partículas de tipo virus o molécula de ácido nucleico de una composición antigénica o inmunogénica pueden combinarse con adyuvantes, molécula inmunoestimulantes, o transportadores, incluyendo, aunque sin limitar a, MF59 (descrito más abajo), micropartículas poli(dl-láctido-co-glicólido) (PLG, véase, por ejemplo, Delgado et al. (1999) Vaccine 17: 2927-2938), toxinas LT, complejos inmunes estimulantes (ISCOMS, véase, por ejemplo, Mowat et al. (1999) Immunol. Lett. 65: 133-140), y QS21 (véase Singh y O’Hagan (1999) Nat. Biotechnol. 17: 1075-1081).

Por ejemplo, los adyuvantes preferente para mejorar la efectividad de las composición incluyen, aunque no se limitan a: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones con emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes específicos inmunoestimulantes tales como péptidos muramil (véase más abajo) o componentes de pared celular bacteriana), tales como por ejemplo

(a) MF59 (Publicación PCT Nº WO 90/14837), que contiene 5% Escualeno, 0,5% Tween 80 y 0,5% Span 85 (opcionalmente contiene varias cantidades de MTP-PE (véase más abajo), aunque no se requiere) formulada en partículas de submicrón usando un microfluidizador tal como microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene 10% Escualeno, 0,4% Tween 80, 5% polímero en bloque plurónico L121, y tr-MDP (véase más abajo) bien microfluidizado en una emulsión de submicrones o trabajado con vórtice para generar una emulsión de tamaño mayor de partícula, y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2% Escualeno, 0,2% Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo consistente en monofosforilípido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (3) adyuvantes de saponina, tales como Sitmulon™ (Cambridge Bioscience, Worcesterj, MA) pueden usarse o partículas generadas de las mismas tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes); (4) Adyuvante de Freund Completo (AFC) y Adyuvante de Freund Incompleto (AFI); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factores estimulantes de colonia de macrófago (M-CSF), factores de necrosis tumoral (TNF), etc; (6) mutantes detoxificados de una toxina bacteriana ribosilante ADP tal como una toxina de cólera (TC), una toxina de pertussi (TP), o una toxina lábil al calor de E. coli (TL), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PTK9/G129; véase, por ejemplo, WO 93/13302 y WO 92/19265; (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la efectividad de la composición; y (8) micropartículas con macromoléculas adsorbidas, como se describe en la Solicitud de Patente co-pendiente de Estados Unidos Nº de Serie 09/285.855 (presentada el 2 de abril, 1999) y la Solicitud de Patente Internacional Nº de Serie PCT/US99/17308 (presentada el 29 de julio, 1999). Alum y MF59 son preferentes.

Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos muramil incluyen, aunque no se limitan a, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (tr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no MDP), N-acetilmuramil-Lalanil-D-isoglutamina-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi-etilamina (MTP-PE), etc.

Una composición inmunogénica puede también comprender un transportador farmacéuticamente aceptable. Los transportadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para aquellos en la técnica. Tales transportadores incluyen, aunque no se limitan a, macromoléculas grandes lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, y partículas inactivas de virus. Los liposomas, tales como aquellos descritos en U.S 5.422.120, WO 95/13796, WO 91/14445 o EP 524.968 B1, así como micropartículas de poli(dl-láctido-co-glicólido) (PLG, véase, por ejemplo, Delgado et al. (1999) Vaccine 17: 2927-2938), también pueden usarse como un transportador para una composición de la invención.

Sales farmacéuticamente aceptables también pueden usarse en composiciones de la invención, por ejemplo, sales minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos o benzoatos.

Las composiciones de la invención contienen generalmente excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agua, suero salino, glicerol y etanol, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, o agentes que amortiguan el pH.

Las moléculas quiméricas de la presente invención pueden usarse para inmunización de ácido nucleico, para generar una respuesta inmune apropiada, tal como para activar células T específicas de VHC, usando protocolos estándares de administración de genes. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para empaquetar y administrar moléculas de ácido nucleico de la invención, incluyendo moléculas de ácido nucleico en una composición inmunogénica. Los métodos para la administración de genes son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Números 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466. Por ejemplo, las secuencias codificadoras pueden empaquetarse en un vector viral, combinado con excipientes lípidos y peptoides, formulaciones PLG, o partículas de oro. Preferentemente, una composición inmunogénica se administración como ADN desnudo o ARN desnudo. El polipéptido expresado se presenta preferentemente al sistema inmune del huésped con modificaciones, estructura y conformación post-traslacional.

Por ejemplo, las construcciones pueden empaquetarse en liposomas antes de su administración a las células. La encapsulación lípida se consigue generalmente usando liposomas que son capaces de enlazarse de manera estable o atrapar y conservar ácido nucleico. La proporción de ADN condensado con preparación lípida puede variar pero generalmente será aproximadamente 1:1 (ADN mg:lípido micromoles), o más de lípido. Para un análisis del uso de liposomas como transportadores para la administración de ácidos nucleicos, véase, Hug y Sleight, Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1097: 1-17; Straubinger et al, en Methods of Enzymology (1983), Vol. 101, páginas 512-527.

Las preparaciones liposomales para su uso con la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (con carga positiva), aniónicas (con carga negativa) y neutrales, con liposomas catiónicos particularmente preferentes. Los liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo, liposomas N[1-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,Ntrietilamonio (DOTMA) están disponibles bajo la marca Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Véase, también, Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7416). Otros lípidos disponibles en el mercado incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Otros liposomas catiónicos pueden prepararse a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194-4198; Publicación PCT Nº WO 90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas DOTAP (1,2-bis(oleoyloxi)-3-(trimetilamonio)propano). Los varios complejos liposomasácido nucleico se preparan usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger et al., en METHODS OF IMMULOGY (1983), Vol. 102, páginas 512-527; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194-4198; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394:383 ; Wilson et al., Cell (1979) 17:77); Deamer y Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976) 443:629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76:836; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), 76:3348); Enoch y ATrittmatter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:145); Fraley et al. J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka y Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. US (1978) 75:145; y Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215:166.

El ADN también puede administrarse en composiciones de cocleato lípido similares a aquellas descritas por Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta. (1975) 395:483-491. Véase, también, Patentes de Estados Unidos Números 4.663.161 y 4.871.488.

Se han desarrollado un número de sistemas con base viral para transferencia de gen a células mamíferas. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para sistemas de administración de genes, tales como virus de sarcoma murino, virus del tumor mamario del ratón, virus de la leucemia murina de Moloney y virus del sarcoma de Rous. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la técnica. El virus recombinante puede después aislarse y administrarse a células del sujeto bien in vivo o ex vivo. Se han descrito un número de sistemas retrovirales. (Patente de Estados Unidos Nº 5.219.740); Miller y Rosman, BioTechniques (1989) 7: 980-990; Miller, A.D., Human Gene Therapy (19909) 1: 5-14; Scarpa et al., Virology (1991) 180: 849-852; Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 8033-8037; y BorisLawrie y Termin, Cur. Opin. Genet. Develop. (1993) 3: 102-109. En resumen, los vehículos de administración de gen retroviral de la presente invención pueden construirse fácilmente a partir de una amplia variedad de retrovirus, incluyendo por ejemplo, retrovirus de tipo B, C y D así como spumavirus y lentivirus tales como VIF, VIH, VIH-1, VIH2 y VIS (véase RNA Tumor Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Tales retrovirus pueden obtenerse fácilmente de depositarios o colecciones, tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo (“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209), o aislados de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.

También se han descrito un número de vectores de adenovirus, tales como vectores de adenovirus Tipo 2 y Tipo 5. A diferencia de los retrovirus que se integran en el genoma huésped, los adenovirus persisten extracromosomalmente minimizando así los riesgos asociados con la mutagénesis insercional (Haj-Ahmad y Graham, J. Virol. (1986) 57: 267-274; Bett et al., J. Virol. (1993) 67: 5911-5921; Mittereder et al., Human Gene Therapy (1994) 5: 717-729; Seth et al., J. Virol. (1994) 68: 933-940; Barr et al., Gene Therapy (1994) 1: 51-58; Berkner, K. L. BioTechniques (198) 6: 616-629; y Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4: 461-476).

Los vectores conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 6566-6869 y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103, también pueden usarse para administración de genes.

Los miembros del genero Alphavirus, tales como aunque sin limitar los vectores derivados de los virus Sindbis y del bosque Semliki, VEE, también encontrarán uso como vectores virales para administrar el gen de interés. Para una descripción de vectores derivados el virus Sindbis útiles para la práctica de métodos instantáneos, véase, Dubensky et al., J. Virol. (1996) 70: 508-519; y Publicaciones Internacionales Números WO 95/07995 y WO 96/17072.

Pueden usarse otros vectores, incluyendo aunque sin limitar virus del simio 40, citomegalovirus. Pueden usarse vectores bacterianos, tales como Salmonella ssp. Yersinia enterocolitica, Shigella sppl, Vibrio cholerae, cepa BCG de Mycobacterium, y Listeria monocytogenes. También pueden usarse minimicrosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, cósmidos (plásmidos en los que se han insertado sitios fagos lambda cos) y replicones (elementos genéticos que son capaces de réplica bajo su propio control en una célula).

Las construcciones quiméricas también pueden estar encapsuladas, adsorbidas en, o asociadas con transportadores particulados. Tales transportadores presentan múltiples copias de una molécula seleccionada para el sistema inmune y promueven el atrapamiento y retención de moléculas en nodos linfáticos locales. Las partículas pueden estar fagocitadas por macrófagos y pueden mejorar la presentación de antígenos a través de la liberación de citoquinas. Ejemplos de transportadores particulados incluyen aquellos derivados de polímeros de polimetilmetacrilato, así como micropartículas derivadas de poli(láctidos) y poli(láctido-co-glicólidos), conocidos como PLG. Véase, por ejemplo, Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362-368; y McGee et al., J. Microencap. (1996).

Puede usarse una amplia variedad de otros métodos para administrar las construcciones a las células. Tales métodos incluyen transfección mediada con DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada con polilisina o poliornitina, o precipitación usando otras sales inorgánicas insolubles, tales como fosfato de estroncio, silicatos de aluminio incluyendo bentonita y caolín, óxido crómico, silicato de magnesio, talco, y similares. Otros métodos útiles de transfección incluyen electroporación, sonoporación, fusión de protoplastos, liposomas, administración de peptoides, o microinyección. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, para una exposición de técnicas para transformar células de interés; y Felgner, P. L. Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5: 163-187 para un análisis de sistemas de administración útiles para la transferencia de genes. Un método particularmente efectivo de administración de ADN usando electroporación se describe en la Publicación Internacional Nº WO/0045823.

Además, los sistemas de administración biolística que emplean transportadores particulados tales como oro y tungsteno, son útiles para administrar las construcciones de la presente invención. Las partículas se cubren con la construcción que se administran y se aceleran a alta velocidad, generalmente bajo una atmósfera reducida, usando una descarga de polvos con pistola de una pistola génica. Para una descripción de tales técnicas y aparatos útiles por lo tanto, véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050; 5.036.006; 5.100.792; 5.179.022;

5.371.015 y 5.478.744.

Las construcciones quiméricas pueden administrarse directamente al sujeto vertebrado o, alternativamente, administrarse ex vivo, a células derivadas del sujeto y las células reimplantadas en el sujeto. Por ejemplo, las construcciones pueden administrarse como ADN de plásmido, por ejemplo, contenidas en un plásmido, tal como pBR322, pUC o ColE1.

Una composición quimérica de la invención se administra de una manera compatible con la composición particular usada y en una cantidad que es efectiva para obtener un título de anticuerpos de polipéptido anti-VHC, tal como título de anticuerpo anti-E2 o anti-E1. La administración puede ser mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo inyección intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, incluyendo inyección que usa una pistola balística biológica (“pistola génica”). También pueden usarse electroporación o iontoforesis. La administración también puede ser intranasal u oral. Para administración oral de una composición inmunogénica, preferentemente se incluye un transportador de proteínas. Una composición inmunogénica, incluyendo composiciones que comprenden ADN o ARN desnudo, preferentemente se inyecta intramuscularmente a un mamífero grande, tal como un babuino, chimpancé o humano, en una dosis de 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 o 10 mg/kg. Una composición que comprende partículas de tipo virus se inyecta preferentemente intramuscularmente a un mamífero grande, tal como un humano, en una dosis de 0,01, 0,05, 0,75, 1,0, 2,0, 2,5, 5 o 10 mg proteína/kg de peso corporal.

La administración directa de las composiciones se logrará generalmente mediante inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente o se administran al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden también administrarse a una lesión. Otros medios de administración incluyen administración oral, intranasal o pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (véase, por ejemplo, WO 98/20734), aguja, pistolas génicas o hipopulverizadores. La dosificación del tratamiento puede ser un régimen de dosis simple o un régimen de dosis múltiple.

Los métodos para administración ex vivo y reimplantación de céulas transformadas a un sujeto son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en WO 93/14778. Ejemplos de células útiles en aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, células madre, particularmente células hematopoyéticas, linfáticas, macrófagos, dendríticas o tumorales. Generalmente, la administración de ácidos nucleicos para aplicaciones ex vivo e in vivo puede lograrse mediante los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polipreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de polinucleótido (o polinucleótidos) en liposomas y microinyección directa de ADN en los núcleos, todos ellos bien conocidos en la técnica.

Las composiciones inmunogénicas que comprenden partículas de tipo virus de VHB/VHC o ácidos nucleicos que codifican y expresan tales partículas de tipo virus pueden administrarse a un mamífero que no esté infectado con VHC o pueden administrase a un mamífero infectado con VHC. Las dosis particulares de partículas de tipo virus

o ácidos nucleicos dependerán de un número de factores incluyendo, aunque sin limitar a, la especie, edad y condición general del mamífero al que se administra la composición y el modo de administración de la composición. Una cantidad efectiva de la composición de la invención puede determinarse fácilmente usando experimentación rutinaria. Los modelos in vivo son bien conocidos y pueden emplearse para identificar dosis apropiadas. Si se desea, también pueden emplearse moléculas co-estimulantes o adyuvantes antes, después o junto con las composiciones inmunogénicas. Las composiciones inmunogénicas pueden administrase más de una vez, como sea requerido para una inmunización efectiva. La administración de composiciones inmunogénicas que contienen partículas de tipo virus puede realizarse antes o después de la administración de composiciones inmunogénicas que contienen ácidos nucleicos, de tal manera que una forma (proteína o ácido nucleico) proporcione una inmunización primaria y la otra forma estimule la respuesta inmune.

III. Experimental

Más abajo hay ejemplos de realizaciones específicas para realizar la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente para fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Aquellos expertos en la técnica apreciarán fácilmente que la invención puede practicarse en una variedad de maneras dado el contenido de esta divulgación.

Se han hecho esfuerzos para asegurar precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero deben permitirse, por supuesto, algún error y desviación experimental.

EJEMPLO 1

Detección de Partículas de Tipo Virus VHB Usando Sedimentación con Gradiente de Densidad de Sacarosa

Se obtuvieron partículas de HBsAg recombinantes purificadas en forma de una vacuna de hepatitis B de Chiron Corp. Clinical Department. Doscientos cincuenta μl de una suspensión de 37 g/mL en 0,03 M citrato, 0,26 M NaCl, 0,005% polisorbato 80 se cargaron en un gradiente de sacarosa 5-30% (peso-vol) y se centrifugaron 4 horas a

40.000 rpm en un rotor Beckman SW41. Se extrajeron diez fracciones y se analizaron para HBsAg mediante el Ensayo Magic Lite. Los resultados se muestran en la Fig. 5.

Ensayo Magic Lite

Este describe un ensayo de inmunoquimioluminiscencia altamente sensible usado para detectar antígenos de VHB y VHC. Cien μL de muestra se añadieron a un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm. Se añadieron cien μL (30 g) de un anticuerpo de “captura” a la muestra. El anticuerpo de captura se enlazó covalentemente con partículas paramagnéticas mediante glutaraldehído entrelazando una mezcla de 6:1 partículas paramagnéticas:anticuerpo. Los tubos se agitaron creando vórtices y se incubaron a 37 ºC en un baño de agua durante 20 minutos. Después, los tubos se colocaron sobre un estante magnético donde pueden agregarse las partículas paramagnéticas (PMP). Esto permitió el lavado y la decantación. Después del tercer lavado, se añadieron 100 μL de un anticuerpo “detector”, que se enlazó covalentemente con dimetilacridinio y el tubo se agitó creando vórtices. Los tubos se incubaron de nuevo a 37 ºC durante 20 minutos y después se colocaron sobre un estante magnético para lavado y decantación. Después del tercer lavado, los tubos se colocaron en un quimioluminómetro Ciba Corning Magic Lite para medir el analito unido. Los resultados se expresaron en unidades arbitrarias de intensidad de luz (unidades relativas de luz, URL).

Anticuerpos

Chiron Diagnostics (Walpole, MA) proporcionó anti-sAg y se dirigió contra serotipos AYW y ADW. Se obtuvo MAb 5E5/E7 de ratones usando aminoácidos HeLa E1/E2 1-967 como un inmunógeno y reconoce el epítopo E2 384-655. También se obtuvo MAb 3D5/C3 de ratones inmunizados con aminoácidos HeLa E1/E2 1-967 y reconoce el epítopo E1 211-217.

EJEMPLO 2

Expresión de Partículas de Tipo Virus de VHB/VHC que Contienen Antígeno Quimérico HBsAg-E2-661 en Células COS7

Se prepararon cinco μg de pCMV-II-E2661-sAg (Fig. 4A) y cantidades crecientes de pCMV-II-pS2-sAg (Fig. 2A). La expresión de pCMV-II-pS2-sAg dio como resultado una mezcla de aproximadamente 5-20% preS2-Spolipéptido, con el resto siendo S-polipéptido. Las proporciones de sAg con plásmidos E2661-sAg usados fueron 0:1, 1:1, 5:1 y 10:1 sobre una base de ADN μg. La cantidad total de ADN en cada tubo se normalizó a 55 μg mediante la adición de pCMV-km-Bgal. Esta mezcla se transfectó a células COS7 usando el reagente de transfección LT1 de Panvera, como se describe más abajo. A las 48 horas de la post-transfección, los medios y lisados solubles (obtenidos al incubar monocapas celulares en PBS con 0,1% NP40 y centrifugando para extraer los restos insolubles) se extrajeron y analizaron mediante el Ensayo Magic Lite, con captura mediante anti-sAG seguida de detección con un conjugado anti-E2 MAb (5E5/H7, véase Ejemplo 1) (Fig. 6A) o MAb sAg (Fig. 6B). Tanto E2 como sAg se secretaron cada vez más al medio a medida que la proporción de sAg:E2661-sAg aumentó, con una secreción óptima en proporciones en el rango de 5:1 a 10:1.

Con el fin de caracterizar las partículas de tipo virus, se cargó 1 mL de medio de cultivo de cada condición en 5-30% de gradiente de sacarosa. Las muestras se centrifugaron 4 horas a 40.000 rpm usando un rotor Beckman SW41. Once fracciones se extrajeron y analizaron para E2 (Fig. 7A) o sAg (Fig. 7B) mediante el Ensayo Magic Lite. Tanto E2 como sAg se observaron en la cantidad más alta en la fracción 4, que es la misma posición de gradiente para la distribución pico de partículas de tipo virus que contienen HBsAg (Fig. 5).

Protocolo de Transfección

Las células se sembraron en placas de 6 pozos el día anterior a la transfección para conseguir confluencia 5060% en el momento de la transfección. Se añadieron Opti-mem (100 μL) y reagente de transfección LT-1 (12 μL) a un tubo de polipropileno estéril y se incubaron a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después se añadieron tres μg de ADN al tubo, que se incubó otros cinco minutos a temperatura ambiente. Durante este periodo de incubación, las células se lavaron con Opti-mem (2 mLs por pozo). Se añadieron dos mLS de Opti-mem a cada pozo, seguido de 100 μL de la mezcla Opti-mem/LT-1/ADN. Las células se incubaron después durante cuatro hora a 37 ºC, seguido de aspiración y adición de medio de cultivo (1,5 mL/pozo de DMEM + 10% FBS). A las 48 horas de la post-transfección, el medio se cosechó y loas monocapas celulares se solubilizaron usando PBS que contenía 0,1% NP-40. Tanto el medio cosechado como las células solubilizadas se centrifugaron para extraer los restos.

EJEMPLO 3

Expresión de Partículas de Tipo Virus de VHB/VHC que Contienen Antígeno Quimérico HBsAg-E1-330 en Células COS7

Se prepararon mezclas de pCMV-II-optiE1330 (2,5 μg ADN) y varias cantidades de pCMV-II-pS2-sAg para proporcionar proporciones de plásmido sAg con plásmido E1-sAg de 0:1 (control), 1:1, 5:1, 10:1 y 20:1. La expresión de pCMV-II-pS2-sAg dio como resultado una mezcla de aproximadamente 5-20% preS2-S-polipéptido, con el resto siendo S-polipéptido. La cantidad total de ADN en cada tubo se normalizó a 52,5 μg mediante la adición de pCMVkm-�gal. Las mezclas se transfectaron a células COS7 usando el reagente de transfección LT1 de Panvera. A las 48 horas de la post-transfección, los medios y lisados solubles se recuperaron y analizaron mediante el Ensayo Magic Lite. La captura fue con anti-sAG seguida de detección con un conjugado anti-E1 MAb (eD5/C3) (Fig. 8A) o MAb sAg (Fig. 8B). Tanto E1 como sAg se secretaron cada vez más al medio a medida que la proporción de sAg:E1-330-sAg aumentó, con una secreción óptima en proporciones en el rango de 5:1 a 20:1.

Con el fin de caracterizar las partículas de tipo virus, se cargó 1 mL de medio de cultivo de cada condición en 5-30% de gradiente de sacarosa. Las muestras se centrifugaron 4 horas a 40.000 rpm usando un rotor Beckman SW41. Once fracciones se extrajeron y analizaron para E1 (Fig. 9A) o sAg (Fig. 9B) mediante el Ensayo Magic Lite. Tanto E1 como sAg se observaron en la cantidad más alta en las fracciones 4-6, que es similar a la posición de gradiente para la distribución pico de partículas de tipo virus que contienen HBsAg (Fig. 5).

EJEMPLO 4

Expresión de Partículas de Tipo Virus de VHB/VHC que Contienen Antígenos Quiméricos HBsAg-E2-661 y HBsAgE1-330 en Células COS7

Una mezcla de pCMVII opti 330 E1-sAg y pCMV-II-E2661-sAg (0,5 μg de ADN de cada plásmido) se combinó con cantidades crecientes de pCMV-II-pS2-sAg. La cantidad total de ADN en cada tubo se normalizó a 26 μg mediante la adición de pCMV-km-�gal. La mezcla se transfectó a células COS7 usando el reagente de transfección LT1 de Panvera. A las 48 horas de la post-transfección, los medios y lisados solubles se recuperaron y analizaron mediante el Ensayo Magic Lite, con captura mediante anti-sAG seguida de detección con un conjugado anti-E2 o anti-E1 MAb (Fig. 10A) o un conjugado anti-sAg (Fig. 10B).

EJEMPLO 5

Uso de Partículas de Tipo Virus de VHB/VHC para Generar una Respuesta Inmune

Con el fin de evaluar la habilidad de las partículas de tipo virus de VHB/VHC sujeto para generar una respuesta inmune in vivo, se hizo el siguiente experimento. A cuatro grupos de 10 ratones (Grupo 2 tenía 9 ratones) se les administró ADN que codifica VHC E2661 y pCMV-II, en una proporción de 5 veces pCMV-II para E2661 (Grupo 1); pCMV-II- E2661-sAg (Fig. 4A) y pCMV-II, en una proporción de 5 veces pCMV-II para pCMV-II-E2661-sAg (Grupo 2); pCMV-II-E2661-sAg y pCMV-II-pS2-sAg (Fig. 2A) en una proporción de 5 veces pCMV-II-pS2-sAg para pCMV-IIE2661-sAg (Grupo 3); y pCMV-II y pCMV-II-pS2 –sAg, en una proporción de 5 veces pCMV-II-pS2 –sAg para pCMV-II (Grupo 4).

Todos fueron inmunizados dos veces con 90 μg (45 μg/pata) por inmunización, el día 0 y el día 21, y se recogió sangre. Los títulos de anticuerpo se evaluaron con ELISA usando una molécula E2715 E2 truncada, que se había expresado en células CHO, usando el Ensayo Magic Lite descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Grupo #: Tratamiento GM +/- SE

1: E2661 + 5x vector 1300 +/- 85

2: E2661-sAg + 5x vector 1547 +/- 690

3: E2661-sAg + 5x pS2sAg 4175 +/- 603

4: Vector + 5x pS2sAg 0

Se realizó un segundo experimento, de nuevo usando 10 animales por grupo, excepto el Grupo 5, que teína 5 ratones. Los grupos y resultados se muestran en la Tabla 2. El protocolo de tratamiento y la determinación de anticuerpos fueron como se ha descrito anteriormente.

Grupo #: Tratamiento GM +/- SE

1: E2661 + 5x vector 724 +/- 96

2: E2661 + 5x pS2sAg 222 +/- 90

3: E2661-sAg + 5x vector 1018 +/- 305

4: E2661-sAg + 5x pS2sAg 1290 +/- 292

5: Simulado 0

Como puede verse, los títulos para E2 en los ratones inmunizados con E2661 se redujeron en presencia de 5x sAg. Esto puede haber resultado de la competición por la descentración al retículo endoplasmático. Los títulos E2 fueron más altos cuando E2 se fusionó con sAg. La adición de sAg en lugar del vector dio como resultado un cambio pequeño en el título. Mientras esta diferencia es pequeña, la comparación con el control con sAG está garantizada. Ya que el exceso de sAg provocó una reducción en títulos E2 en el antígeno no fusionado, en el contexto de la fusión hubo una compensación aparente. Esto presumiblemente refleja la habilidad de sAg para impulsar la secreción de la fusión.

De este modo, se desvelan las partículas quiméricas de tipo virus de VHB/VHC, así como métodos para hacer y usar las mismas.

LISTADO SECUENCIAL

<120> PARTÍCULA TIPO VIRUS VHB/VHC

<210> 1

<211> 4276

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: plásmido pCMVII

<210> 2

<211> 5128

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: plásmido pCMVII-pS2-SAg

<210> 3

<211> 281

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: plásmido pCMVII-pS2-SAg

<210> 4

<211> 5459

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: pCMVII opti 330 E1/SAg

<210> 5

<211> 390

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: pCMVII opti 330 E1/SAg

<210> 6

<211> 5882

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: plásmido pCMV-II-E2661-sAg

<210> 6

<211> 5882

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: plásmido pCMV-II-E2661-sAg

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una proteína de fusión que comprende: un dominio S sustancialmente completo de HBsAg capaz de causar la formación de partículas de tipo virus; y un polipéptido que comprende (a) residuos de aminoácidos 192 a 330 de una poliproteína VHC-1; o (b) los residuos correspondientes de la proteína E1 de otro aislado de VHC.
2.

La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde el dominio S sustancialmente completo está covalentemente unido en su terminal amino al polipéptido.
3.

La proteína de fusión de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 5.
4.

Una proteína de fusión que comprende: un dominio S sustancialmente completo de HBsAg capaz de causar la formación de partículas de tipo virus; y un polipéptido que comprende (a) residuos de aminoácidos 384 a 661 de una poliproteína VHC-1; o (b) los residuos correspondientes de la proteína E2 de otro aislado de VHC.
5.

La proteína de fusión de la reivindicación 4, donde el dominio S sustancialmente completo está covalentemente unido en su terminal amino al polipéptido.
6.

La proteína de fusión de la reivindicación 4 que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 7.
7.

Una molécula de ácido nucleico que codificad una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
8.

La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 que comprende nucleótidos 1992 a 3161 de la SEQ ID NO: 4.
9.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
10.

La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9 que comprende nucleótidos 1992 a 3584 de la SEQ ID NO:
6.
11.

Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, 8, 9 ó 10.
12.

Una composición inmunogénica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, 8, 9 ó 10.