ES2433471T3

ES2433471T3 - Enzimas de ramificación del almidón

Info

Publication number: ES2433471T3
Application number: ES01907236T
Authority: ES
Inventors: Matthew Morell; Sadequr Rahman; Ahmed Regina
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Limagrain Cereales Ingredients SA
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Limagrain Cereales Ingredients SA
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2021-02-21
Also published as: US20110010807A1; AUPQ574200A0; NZ520904A; AU2001235237B2; JP2003523773A; EP1263961B1; AU3523701A; US20050164178A1; CA2400710A1; EP1263961A4; WO2001062934A1; CA2400710C; US7667114B2; EP1263961A1

Abstract

Una planta de trigo que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo delcromosoma 2 que codifica BEIIb, en combinación con uno o más alelos que han perdido su función de un gen quecodifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI.

Description

Enzimas de ramificación del almidón

Esta invención se refiere a trigo con contenido en alelos que han perdido su función de la enzima de ramificación IIb del almidón de trigo. Las plantas de trigo producen grano y harina con nuevas propiedades para aplicaciones alimentarias e industriales, por ejemplo grano de trigo que contiene almidón con elevado contenido en amilosa o bajo contenido en amilopectina.

Antecedentes de la invención

En los vegetales, dos clases de genes codifican enzimas de ramificación del almidón, conocidas respectivamente como BEI y BEII. En los cereales monocotiledóneos existe una fuerte evidencia que demuestra que la clase BEII contiene dos tipos independientes de genes conocidos en el maíz como BEIIa y BEIIb (Gao et al., 1996; Fisher et al., 1996). En cebada se han reseñado dos tipos de genes, y se ha demostrado que se expresan de modo diferencial (Sun et al., 1998). También se ha descrito una clase adicional de enzima de ramificación (50 / 51 kD) de cebada (Sun et al., 1996).

En plantas dicotiledóneas, la pérdida de la actividad de BEII ya sea a través de mutación (Bhattacharyya et al., 1990) o de tecnologías de supresión de genes da origen a almidones que contienen altos niveles en amilosa (Safford, 1998, Jobling 1999).

En plantas monocotiledóneas, mutaciones que dan origen a contenidos elevados en amilosa son conocidos en el maíz, arroz y cebada. Ni en el arroz (Mizuno et al., 1993) ni en la cebada (Schondelmaier et al., 1992) los conocidos fenotipos con elevado contenido en amilosa han sido asociados con las mutaciones de BEIIa o BEIIb, respectivamente. Sin embargo, en el maíz se ha establecido firmemente que el fenotipo con elevado contenido en amilosa está asociado con una sub-regulación del gen BEIIb (Boyer et al., 1980; Boyer y Preiss, 1981, Fisher et al, 1996).

El impacto de la sub-regulación de BEI ha sido investigado a través de la inhibición antisentido en tubérculos de patata; se ha encontrado que la sub-regulación altera las propiedades del almidón, pero no sus características estructurales brutas tales como el contenido en amilosa (Filpse et al., 1996). En el trigo, la sub-regulación antisentido de la actividad de BEI tiene efectos, pequeños pero importantes, sobre la estructura del almidón (Baga et al, 1999). El gen de la enzima de ramificación I procedente de maíz ha sido clonado (Kim et al., 1998), pero se desconocen mutantes que afecten a la actividad de la enzima de ramificación I en el maíz.

No se han reseñado mutaciones que reduzcan específicamente la actividad de BEIIa y ninguno de los experimentos de la supresión de genes en plantas ha tenido éxito en reducir la actividad de BEIIa, a pesar de que se conoce que la mutación du1 en el maíz reduce la expresión tanto de BEIIa como de almidón sintasa III. Sin embargo, ahora se sabe que la mutación du1 es debida a la mutación del gen estructural para la almidón sintasa III (Gao 1998, Cao 1999).

En la solicitud de patente previa de la presente solicitante Nº PCT/AU98/00743 (WO99/14314), los autores de la misma han descrito la estructura de un gen BEII procedente de trigo, gen que los autores de la presente invención han designado subsiguientemente como gen BEIIa.

En la presente solicitud, los autores de la misma describen el aislamiento de un segundo gen BEII procedente de trigo, que han designado como gen BEIIb, y discuten los usos a los que se puede aplicar esta secuencia génica. Los autores de la invención han encontrado, sorprendentemente, que en trigo el nivel de expresión de las diversas enzimas de ramificación es muy diferente al de maíz y cebada. En esta memoria descriptiva, los autores de la invención demuestran que BEIIb en trigo es expresado a bajos niveles en la fracción soluble del endospermo de trigo, y que se encuentra predominantemente dentro del gránulo de almidón. Esto indica que existen importantes diferencias en la regulación de la expresión génica en trigo en comparación con otros cereales, sugiriendo que la manipulación de la relación de amilosa a amilopectina en trigo implicará la manipulación de más de solo el gen BEIIb.

Los autores de la invención han encontrado, sorprendentemente, que las estructuras génicas de BEIIa y BEIIb están altamente conservadas con respecto al tamaño y la posición del exón, permitiéndoles preparar diagnósticos basados en ADN que pueden distinguir no sólo las clases de genes BEIIa y BEIIb, sino también las formas de estos genes codificados en los genomas A, B y D de trigo, y que pueden identificar las proteínas BEIIb expresadas

por los genomas A, B y D de trigo, proporcionando una herramienta esencial para la exploración del germoplasma de trigo para alelos que han perdido su función de la enzima de ramificación IIa de trigo.

Sumario de la invención

La invención proporciona una planta de trigo que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del cromosoma 2 que codifica BEIIb, en combinación con uno o más alelos que han perdido su función de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI. La planta de trigo puede comprender alelos que han perdido su función de más de un gen que codifica BEIIb y un alelo que ha perdido su función de un gen que codifica BEIIa. La planta de trigo puede comprender un gen que codifica BEIIa expresado en la orientación sentido o anti-sentido. El más de un gen que codifica BEIIb puede incluir un gen que corresponde a un ADNc con una secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

La invención proporciona también un grano de trigo que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del cromosoma 2 que codifica BEIIb, en combinación con uno o más alelos que han perdido su función de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI, en donde el grano es grano entero o grano en parte. El grano de trigo puede comprender alelos que han perdido su función de más de un gen que codifica BEIIb y un alelo que ha perdido su función de un gen que codifica BEIIa. El más de un gen que codifica BEIIb puede incluir un gen que corresponde a un ADNc con una secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

La invención proporciona también harina de trigo que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del cromosoma 2 que codifica BEIIb, en combinación con uno o más alelos que han perdido su función de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI. La harina de trigo puede comprender alelos que han perdido su función de más de un gen que codifica BEIIb y un alelo que ha perdido su función de un gen que codifica BEIIa. El más de un gen que codifica BEIIb puede incluir un gen que corresponde a un ADNc con una secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

La invención proporciona también un método para identificar una planta de trigo de acuerdo con la invención, comprendiendo el método el uso de cebadores para la amplificación específica para el gen, para explorar una población de plantas de trigo para identificar una planta de trigo que tenga alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del cromosoma 2 que codifica BEIIb y uno o más alelos que han perdido su función de un gen que codifica una proteína seleccionada de BEIIa, GBSS, SSII y BEI.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de ramificación IIb del almidón de trigo (BEIIb) tiene la secuencia representada en la Figura 8 (SEQ ID NO: 5), la Figura 9 (SEQ ID NO: 6) o SEQ ID NO:

10. También puede comprender moléculas de ácido nucleico capaces de hibridarse a estas secuencias bajo al menos condiciones de hibridación de baja rigurosidad, o una molécula de ácido nucleico con una identidad de la secuencia de al menos el 70% a al menos una de estas secuencias. Métodos para evaluar la capacidad de hibridación y el % de identidad de la secuencia son bien conocidos en la técnica. Incluso más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es capaz de hibridarse a ellas bajo condiciones de elevada rigurosidad, o al menos una identidad de la secuencia de 80%, lo más preferiblemente de al menos 90%. Se prefiere una molécula de ácido nucleico que tenga una identidad de la secuencia de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% con una o más de estas secuencias.

La invención puede hacer uso de una construcción genética que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica BEIIb de trigo, un fragmento biológicamente activo del mismo o un fragmento del mismo que codifica un fragmento biológicamente activo de BEIIb de trigo, operativamente enlazado a una o más secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de facilitar la expresión de BEIIb en una planta de trigo. La construcción puede ser un plásmido o un vector, preferiblemente uno adecuado para uso en la transformación de una planta. Un vector adecuado de este tipo es una bacteria del género Agrobacterium, preferiblemente Agrobacterium tumefaciens. Se conocen métodos para transformar plantas de cereales utilizando Agrobacterium tumefaciens: véase, por ejemplo, la patente australiana Nº 667939 de Japan Tobacco Inc.; la patente australiana Nº 687863 de Japan Tobacco Inc.; la solicitud de patente internacional Nº PCT/US97/10621 de Monsanto Company; y Tingay et al (1997).

La invención puede hacer uso de una construcción genética para fijar como objetivo un gen deseado al endospermo de una planta de trigo, y/o para modular el tiempo de expresión de un gen deseado en el endospermo de una planta de trigo, que comprende un promotor de BEIIb, operativamente enlazado a una secuencia de ácidos

nucleicos que codifica una proteína deseada y, opcionalmente, también operativamente enlazado a una o más secuencias diana adicionales y/o una o más secuencias 3’ no traducidas.

El ácido nucleico que codifica la proteína deseada puede estar en la orientación sentido o en la orientación antisentido. Alternativamente, puede ser una construcción dúplex que comprende una parte de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína deseada, tanto en las orientaciones sentido como anti-sentido, operativamente enlazada por una secuencia de espaciador. Se contempla que cualquier proteína deseada que sea codificada por un gen que sea capaz de ser expresado en el endospermo de una planta de trigo es adecuada para uso en la invención. Preferiblemente, la proteína deseada es una enzima de la vía biosintética del almidón. Por ejemplo, se pueden utilizar las secuencias anti-sentido de GBSS, enzima de des-ramificación del almidón, SBE II, glutenina de bajo peso molecular o proteína I de suavidad de grano. Secuencias preferidas para uso en la orientación sentido incluyen las de isoamilasa bacteriana, glicógeno sintasa bacteriana o glutenina Bx17 de elevado peso molecular de trigo.

Un polipéptido BEIIb de trigo puede comprender una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico definida anteriormente o puede ser un polipéptido que tenga al menos una identidad de la secuencia de aminoácidos del 70%, más preferiblemente del 80%, incluso más preferiblemente del 90%, y que tenga la actividad biológica de BEIIb.

El polipéptido se puede diseñar sobre la base de secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de ácidos nucleicos, o se puede generar mediante la expresión de la molécula de ácido nucleico BEIIb de trigo en un sistema heterólogo. Sistemas heterólogos adecuados son muy bien conocidos en la técnica y la persona experta será fácilmente capaz de seleccionar un sistema adecuado para el propósito particular deseado.

La invención puede hacer uso de un anticuerpo dirigido contra el polipéptido BEII de trigo. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, y también comprender fragmentos de anticuerpo biológicamente activos tales como Fab, (Fab)2 y ScFv. Métodos para la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos son muy bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos se pueden utilizar para la identificación y separación de proteínas BEIIb de trigo, por ejemplo mediante electroforesis de afinidad. Esto facilita grandemente la identificación y combinación de formas alteradas de BEIIb a través del análisis del germoplasma y ayuda grandemente al cultivo de plantas. Los anticuerpos son adecuados para uso en un sistema de separación basado en afinidad, preferiblemente utilizando métodos que superen la interferencia por parte de amilasas. Métodos adecuados son conocidos en la técnica.

La invención puede hacer uso de una célula vegetal de trigo transformada por una construcción genética arriba descrita, o una planta de trigo derivada de una célula de este tipo. Adicionalmente, una célula vegetal de trigo transformada puede comprender también uno o más alelos que han perdido su función para un gen seleccionado del grupo que consiste en GBSS, BEIIa y SSII.

Es posible modificar las características del almidón producido por una planta de trigo disminuyendo el nivel de expresión de BEIIb en la planta, por ejemplo introduciendo una secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido dirigida a una molécula de ácido nucleico que codifica BEIIb en una planta hospedadora.

Tal como es bien conocido en la técnica, se pueden utilizar secuencias anti-sentido para suprimir la expresión de la proteína a la que la secuencia anti-sentido es complementaria. Otros métodos de suprimir la expresión de genes son conocidos en la técnica, por ejemplo la co-supresión, formación de un dúplex de ARN o recombinación homóloga. Resultaría evidente para la persona experta en la técnica que se pueden elegir secuencias sentido y anti-sentido dependiendo de la planta hospedadora, con el fin de efectuar una diversidad de diferentes modificaciones de las características del almidón producido por la planta.

Preferiblemente, la ramificación del componente amilopectina del almidón es modificada por este proceso. Más preferiblemente, se produce una planta con un elevado contenido en amilosa.

Es posible identificar un alelo que ha perdido su función que codifica una enzima de la vía biosintética del almidón de trigo, sometiendo ADN procedente de una planta de trigo de la que se sospecha posee un alelo de este tipo a un ensayo de identificación genética o de amplificación de ADN, el cual utiliza al menos una sonda de ADN que comprende una o más moléculas de ácidos nucleicos. La molécula de ácido nucleico puede ser un ADN genómico

o un ADNc, y puede comprender la secuencia codificadora de longitud completa o un fragmento de la misma. Se puede utilizar cualquier método adecuado para la identificación de secuencias de BEIIb que incluyen, pero no se

limitan a PCR, amplificación por el círculo rodante, RFLP y AFLP. Este tipo de métodos son bien conocidos en la técnica y se puede utilizar cualquier técnica adecuada.

La invención proporciona una planta de trigo que comprende uno o más alelos que han perdido su función de BEIIb, en combinación con uno o más de otros alelos que han perdido su función, seleccionados del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI. Opcionalmente, la planta de trigo puede comprender también un gen BEIIa o BEIIb expresado en la orientación sentido o la orientación anti-sentido. Los alelos que han perdido su función para BEIIb, GBSS, SSII y BEI se pueden identificar utilizando métodos descritos en el documento PCT/AU98/00743 (WO 99/14314).

Se entenderá claramente que la invención comprende también productos producidos a partir de plantas de trigo de acuerdo con la invención, que incluyen, pero no se limitan a grano entero, parte de grano, harina o almidón.

Debido a la muy estrecha relación entre Aegilops tauschii, antiguamente conocido como Triticum tauschii, y trigo, tal como se comenta en el documento WO 99/14314, los resultado obtenidos con A. tauschii se pueden aplicar directamente a trigo con, en todo caso, una pequeña modificación. Una modificación de este tipo, según se pueda requerir, representa una experimentación de ensayo y error rutinaria. Se pueden utilizar secuencias de estos genes como sondas para identificar alelos en trigo que han perdido su función o alterados, que luego se pueden utilizar en programas de cultivo de plantas para proporcionar modificaciones de las características del almidón. Las secuencias BEIIb se pueden utilizar en estrategias de ingeniería genética o para introducir un gen deseado en una planta de trigo hospedadora, o para proporcionar secuencias anti-sentido para la supresión de la expresión del gen BEIIb en una planta hospedadora, con el fin de modificar las características de almidón producido por la planta de trigo.

Métodos para la transformación de plantas monocotiledóneas tales como trigo, maíz, cebada y arroz, y para la regeneración de plantas a partir de protoplastos o embriones de plantas inmaduros, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Lazzeri et al, 1991; Jahne et al, 1991 y Wan y Lemaux, 1994 para cebada; Wirtzens et al, 1997; Tingay et al, 1997; solicitud de patente canadiense Nº 2092588 por Nehra; solicitud de patente australiana Nº 61781/84 por National Research Council of Canada, y patentes australianas Nº 667939 y Nº 687863 por Japan Tobacco Co.

Las secuencias de ADP glucosa pirofosforilasa de cebada (solicitud de patente australiana Nº 65392/94), enzima de des-ramificación del almidón y su promotor procedente de arroz (publicación de patente japonesa Nº Kokai 6261787 y publicación de patente japonesa Nº Kokai 5317057) y la enzima de des-ramificación del almidón procedente de espinaca y patata (solicitud de patente australiana Nº 44333/96) son todas conocidas.

Breve Descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra la secuencia del ADNc de la enzima de ramificación SBE9 que codifica SBE IIa, clonada a partir de un banco de ADNc del cultivar de trigo Rosella (SEQ ID NO: 1). La Figura 2 muestra la secuencia del gen BEIIa de la enzima de ramificación (SEQ ID NO: 2) contenida dentro del clon F2 lambda aislado de un banco de ADN genómico de Aegilops tauschii. La Figura 3 muestra los resultados de la hibridación de ADN de Aegilops tauschii con sondas derivadas de secuencias de tipo wSBEII-DA1. A. Hibridación con una sonda procedente de SBE9 que consiste en los exones 5

9. B. Hibridación con el fragmento F2.2 (que consiste en los exones 4-9 y los intrones 4-8 y parte de los intrones 3 y 9). Las enzimas utilizadas para la digestión eran: 1. Bam HI, 2. Dra I, 3. EcoR I, 4. EcoR V. Se indican marcadores del tamaño molecular. La Figura 4 muestra la alineación de las secuencias de fragmentos del Intrón 5 procedentes de los genomas A, B y D de trigo. La Figura 5 muestra el análisis por PCR de clones genómicos de A. tauschii utilizando secuencias del Intrón V. La Figura 6 muestra la alineación de un fragmento de PCR de 262 pb amplificado a partir de trigo hexaploide utilizando los cebadores sr913F y WBE2E6R, y una región procedente del gen wSBE II-DB1 de la enzima de ramificación IIb del trigo. La Figura 7 muestra la alineación de ADNc de la enzima de ramificación IIb de la cebada, ADNc de la enzima de ramificación IIb del trigo y secuencias SBE9 con la secuencia del gen de la enzima de ramificación IIb del trigo (A. tauschii). La Figura 8 muestra la secuencia genómica parcial de un gen de la enzima de ramificación IIb procedente de A. tauschii (SEQ ID NO: 5). La Figura 9 muestra la secuencia de un ADNc para el gen de la enzima de ramificación IIb procedente de trigo hexaploide (SEQ ID NO: 6).

La Figura 10 muestra la alineación de la secuencia de genes de la enzima de ramificación. Las secuencias de ADNc utilizadas para este análisis eran SBE9 (SEQ ID NO: 1; Figura 1), ADNc de BEIIb de trigo (SEQ ID NO: 6; Figura 9), Y11282, una secuencia de la enzima de ramificación del trigo (Nair et al. 1997), BEIIa de cebada (Sun et al. 1998), BEIIb de cebada (Sun et al. 1998), BEIII de arroz (Mizuno et al. 1993), BEIV de arroz (Genbank Nº de acceso E14723), BEIIa de maíz (Gao et al. 1997) y BEIIb de maíz (Gao et al. 1997). El N-terminal observado de trigo (Morell et al., 1997; Y11282) se muestra en negrillas. La Figura 11 muestra el dendrograma de secuencias de BE. Las secuencias analizadas eran para Y11282 de trigo (Nair et al., 1997), SBE 9 (SEQ ID NO: 1; Figura 1), BEIIb de trigo (Figura 9), IIa y IIb de cebada (Sun et al. 1998), IIa de maíz (Gao et al. 1997), IIb de maíz (Fisher et al. 1993), III de arroz (Mizuno et al. 1993), IV de arroz (Genbank acceso E14723), BEI de patata (Khoshnoodi et al. 1997), BE II de patata (Cangiano et al 1993), BEI y BEII de guisante (Burton et al. 1995), BE de E. coli (Baecker et al. 1986) y bacillus (Kiel et al 1992). Obsérvese que las secuencias BE I de guisante y BE II de guisante se corresponden con BE II y BE I de maíz, respectivamente, debido a diferencias en convenios de nomenclatura. La Figura 12 muestra la comparación de la estructura de exones/intrones para los genes BEIIa y BEIIb. (1) gen de la enzima de ramificación IIa del trigo, wSBE II DA1 (2) gen BEIIb del extendedor de amilosa de maíz (3) gen de la enzima de ramificación parcial IIb del trigo, wSBE II DB1 (4) gen de la enzima de ramificación parcial IIb de la cebada. La Figura 13 muestra los resultados del análisis de la expresión de ARNm para los genes BEIIa y BEIIb en trigo. Panel (A): hibridación de la sonda SBE9 a las pistas 1 a 3 e hibridación de la sonda de ADNc de BEIIb de trigo a las pistas 4 a 6. Panel (B): carga de ARNm para cada una de las pistas. Las pistas 1 y 4 contienen ARNm de hojas; las pistas 2 y 5 contienen ARNm de flósculo pre-antesis; las pistas 3 y 6 contienen ARNm procedente del endospermo de trigo recogido 15 días después de la antesis. La Figura 14 muestra los resultados del análisis de la enzima de ramificación IIa del endospermo de trigo mediante electroforesis de afinidad. Muestras: las pistas 1, 4 y 7 contenían 20 μg de proteína soluble del endospermo, las pistas 2, 5 y 8 contenían 30 μg de proteína soluble del endospermo y las pistas 3 y 6 contenían 10 μg de proteína soluble del endospermo. La Figura 15 muestra los resultados del análisis por electroforesis en gel no desnaturalizante de enzimas de ramificación en la fracción soluble del endospermo de trigo. Las muestran eran: pista 1, R6 pre-inmune, 1:100; pista 2, R6 pre-inmune, 1:3000; pista 3, R6, 1:100; pista 4, R6, 1:1000; pista 5, R6, 1:3000; pista 6, 3KLH, 1:2000; pista 7, 3KLH, 1:5000; pista 8, R7 pre-inmune, 1:1000; pista 9, R7 pre-inmune 1:5000, pista 10, R7, 1:1000; pista 11, R7, 1:3000; pista 12, R7, 1:5000. La Figura 16 muestra los resultados de la separación por electroforesis de afinidad de formas de la enzima IIa a partir de diverso germoplasma de trigo utilizando las condiciones de gel descritas en la Figura 11 (Panel C). Panel

A. Pista 1, Durati, T. durum; Pista 2 A. tauschii, Nº de acceso 24242; Pista 3, A. tauschii, Nº de acceso 24095; Pista 4, A. tauschii, Nº de acceso 24092; Pista 5, Hartog, Triticum. aestivum; Pista 6, Rosella, T. aestivum; Pista 7, Corrigin, T. aestivum; Pista 8, Bodallin, T. aestivum; Pista 9, Beulah, T. aestivum; Pista 10 Bindawarra, T. aestivum; Pista 11, Barley (Hordeum vulgare). Panel B. Pista 1: Afghanistan 006, Triticum durum; Pista 2, Persia 20, T. aestivum; Pista 3, Afghanistan 8, T. aestivum; Pista 4, Kashmir 4, T. aestivum; Pista 5, Gandum Sockhak, T. aestivum; Pista 6, Warbler, T. aestivum; Pista 7, Bayles, T. aestivum; Pista 8, Kometa; Pista 9, Kashmir 14, T. aestivum; Pista 10, Rosella, T. aestivum; Pista 11, Kashmir 8, T. aestivum; Pista 12, Beijing 10, T. aestivum; Pista 13, Savannah, T. aestivum; Pista 14, Afghanistan 55-623, T. aestivum; Pista 15, Karizik, T. aestivum; Pista 16, Indore E98, T. durum; Pista 17, Iraq 17, T. durum; Pista 18, Seri 82, T. aestivum; Pista 19, Indore 19, T. aestivum. La Figura 17 muestra los resultados de la separación bidimensional de los componentes de la banda de 88 kD del gránulo de almidón de trigo. La banda de 88 kDa del gránulo de almidón de trigo se sometió a electroforesis en la primera dimensión a través de un gel de SDS-PAGE. Las pistas se escindieron, se re-naturalizaron y se colocaron sobre la parte superior de un gel PAGE no desnaturalizante y se sometieron a electroforesis en una segunda dimensión. Dos pistas se colocaron en la parte superior de cada uno de los geles PAGE no desnaturalizantes. (A) Tinción de proteínas con reactivo azul Coomassie (B) Inmunotransferencia de geles con anticuerpos 3KLH o R6, según se indica en la figura. La Figura 18 es una representación diagramática de los genes BEII procedentes de diversas especies, que muestran la estructura de los exones/intrones. Los rectángulos en negro representan exones. La Figura 19 muestra los resultados de amplificación por PCR del gen SBE IIb procedente de líneas nulisómicas CS, utilizando los cebadores ARA 12F y ARA 10R. La Figura 20 muestra los resultados de la amplificación por PCR del gen SBE IIb utilizando los cebadores ARA 6F y ARA 8R procedentes de Triticum spp. Pistas: 1) T. monococcum, 2) T. durum, 3) T. urartu, 4) T. tauschii, 5) CSDT2DS, 6) CSDT2BL-9, 7) CSDT2AS y 8) CS. La Figura 21 muestra la alineación de la región exón-1 – intron 1 – exón 2 del gen SBE IIb procedente de los genomas A, B y D. * indica que las secuencias no podían ser específicamente asignadas al genoma A o B. La Figura 22 muestra la alineación de las secuencias BEIIb procedentes de cada uno de los genomas. La Figura 23 muestra los resultados de la amplificación por PCR del gen SBE IIb, que se llevó a cabo utilizando los cebadores ARA 19F y ARA 15R, después de la digestión por restricción utilizando Rsa1. Pistas 1) CS, 2) T.

monococcum, 3) T. tauschii, 4) CSDT2BL-9, que es la parte que falta del brazo largo del cromosoma 2B y 6) CSDT2AS, que es la parte que falta del brazo largo del cromosoma 2A. La Figura 24 muestra los resultados de la amplificación por PCR de la región del intrón 3 de SBE IIb procedente de líneas de trigo, utilizando los cebadores ARA 19F y ARA 23R, seguido de digestión con Rsa 1. La pista 12 es el mutante que ha perdido la función para el genoma D. La Figura 25 es una representación esquemática que muestra el desarrollo de la construcción SBE IIa. A) vector Biogemma, pDV03000; B) pBluescript que porta el ADNc de longitud completa de SBE IIa; C) construcción de SBE IIa en pDV03000; D) construcción IIa sentido y E) construcción IIa anti-sentido. La Figura 26 es una representación esquemática del desarrollo de la construcción SBE IIb. A) vector Biogemma, pDV03000; B) pGEM-T que porta un fragmento de 1046 pb de SBE IIb; C) construcción SBE IIb en pDV03000; D) construcción IIb sentido y E) construcción IIb anti-sentido. La Figura 27 es una representación esquemática de una construcción dúplex de SBE II. A) secuencia SBE insertada entre el promotor y el terminador en su forma lineal; B) formación dúplex de ARNm dentro de la planta transgénica.

Ejemplo 1 Aislamiento de genes de BEII a partir de un banco genómico de A. tauschii y su caracterización mediante PCR

Material vegetal

Aegilops tauschii, CPI 110799, se utilizó para la construcción del banco genómico. Previamente, este acceso ha demostrado ser lo más parecido al donante del genoma ancestral D de trigo, sobre la base de la conservación del orden de marcadores genéticos (Lagudah et al. 1991). Para la construcción de diferentes bancos de ADNc se utilizaron los cultivares de Triticum aestivum Rosella, Wyuna y Chinese Spring.

ADNc y bancos genómicos

La construcción del ADNc y de los bancos genómicos utilizados en este ejemplo era como se describe en Rahman et al., (1997, 1999) y en Li et al. (1999). Las condiciones para la exploración del banco eran la hibridación a 25% de formamida, 5XSSC, SDS al 0,1%, 10X Denhardts, 100 μg/ml de ADN del esperma de salmón a 42ºC durante 16 h, seguido de lavado a 2XSSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 3X1h.

Exploración de un banco de ADNc de trigo

La exploración de un banco de ADNc del cultivar de trigo Rosella, preparado a partir del endospermo (fase media de desarrollo) con el clon SBE I de maíz (Baba et al., 1991) a una baja rigurosidad de hibridación condujo al aislamiento de dos clases de placas positivas. Una clase se hibridaba fuertemente a la sonda y codificaba SBE I de trigo (Rahman et al., 1997, 1999). La segunda clase era débilmente hibridante. El clon con el inserto más largo procedente de esta segunda clase se denominó SBE 9, y su secuencia demostró una mayor identidad con secuencias de tipo SBE II que con SBE I. A esto se designó SBE IIa. La secuencia de SBE 9 (SEQ ID NO: 1) se recoge en la Figura 1.

Exploración del banco genómico de A. tauschii

Un banco genómico construido a partir de A. tauschii se exploró mediante hibridación de ADN con SBE9, y se purificaron cuatro clones purificados. Estos se designaron F1 a F4. La secuencia desde las posiciones 537 a 890 de SBE9 se amplificó mediante PCR y se utilizó para explorar de nuevo el banco de A. tauschii. A clones aislados a partir de esta exploración se les alude como G1 y G2 y H1 a H8.

(1) Número de genes tipo BEII en trigo

La secuencia de un gen de la enzima de ramificación, designado F2, de Aegilops tauschii se describió en el documento WO99/14314 y se proporciona en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). Una sonda generada a parir de F2, designada F2.2, contenía las secuencias desde los pb 2704 a 4456 de SEQ ID NO: 2 y contenía los exones 4-9, los intrones 4-8 y parte de los intrones 3 y 9. La hibridación de ADN de A. tauschii (cortado con cuatro enzimas de restricción diferentes) con F2.2 reveló sólo una banda fuertemente hibridante y varias bandas muy débiles (Figura 3, panel B), consistentes con la presencia de un solo gen de tipo BEII en el genoma de A. tauschii. El clon de ADNc, SBE9 (SEQ ID NO: 1) tiene una identidad > 95% con las regiones del exón del gen de la enzima de ramificación F2. Una región de SBE9 desde los nucleótidos 537 a 890, incluidos los exones 5 a 9, se utilizó como una sonda de hibridación, y proporcionó un modelo mucho más complejo (Figura 3, panel A), indicando

fuertemente que existe más de un tipo de gen BEII en el genoma de A. tauschii.

Ejemplo 2: Análisis por PCR del intrón 5 de BEIIa

Se diseñaron cebadores de PCR, sr913F (5’ ATC ACT TAC CGA GAA TGG G 3’, SEQ ID NO: 3) y WBE2E6R (5’ CTG CAT TTG GAT TTC AAT TG 3’, SEQ ID NO:4) para la reasociación al exón 5 y al exón 6, respectivamente del gen F2 de trigo con el fin de amplificar la región del intrón (intrón 5) entre estos exones. El análisis de los productos de las reacciones PCR utilizando estos cebadores demuestra que los cebadores amplifican fragmentos de 228 pb a partir del genoma A de trigo, de 226 pb a partir del genoma D y de 217 pb a partir del genoma B. Estos fragmentos demostraron ser amplificados desde el cromosoma 2A, 2D y 2B de trigo, respectivamente, mediante análisis de líneas de trigo nulisómicas/tetrasómicas manipuladas en los cromosomas. Además de estos fragmentos, se amplificó un fragmento de 262 pb, y este fragmento (designado el fragmento Universal de 262 pb) no era polimórfico entre las líneas manipuladas en los cromosomas sometidas a ensayo. El fragmento Universal de 262 pb y las regiones A, B y D procedentes del gen F2 se clonaron y secuenciaron, y la comparación de las secuencias se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 3: Clasificación de los genes G1-G2 y H1-H10

El análisis por PCR utilizando cebadores de PCR sr913F (5’ ATC ACT TAC CGA GAA TGG G 3’) y WBE2E6R (5’ CTG CAT TTG GAT TTC AAT TG 3’) demostraron que los clones H1 a H10 lambda proporcionaban un fragmento de aproximadamente 200 pb y que los clones G1 y G2 proporcionaban un fragmento de aproximadamente 260 pb (Figura 5). La secuenciación parcial de G1 y G2 demostró que las partes de la secuencia analizadas tenían una identidad del 80% con los exones 4 y 5 de wSBE II-DA1, pero el intrón situado entremedias contenía una secuencia que no mostraba homología con secuencia alguna contenida dentro de F2.

Sin embargo, los clones G1 y G2 procedentes de A. tauschii mostraban una identidad del 92,7% con la secuencia del fragmento universal de 262 pb amplificado y clonado a partir de trigo hexaploide, y en la Figura 6 se muestra una alineación de estas secuencias. La Figura 7 muestra alineación de una región correspondiente a la región de 537 a 890 pb del clon SBE9 procedente de los ADNcs para el ADNc de BEII b de cebada (Sun el al., 1995, Sun et al., 1998), SBE9, BEIIb de trigo con la secuencia procedente del clon G1. La secuenciación ulterior de G1 condujo al aislamiento de una secuencia, mostrada en la Figura 8 (SEQ ID NO: 5) que mostraba una elevada identidad con la secuencia reseñada por Sun et al (1998) para el extremo 5’ de ADNc de IIb de cebada y la secuencia parcial para el gen relacionado. Por lo tanto, G1 y G2 contienen un gen que es distinto de F2 y que tiene una elevada homología con BEIIb de cebada. Los autores de la invención han designado a este gen wSBE II-DB1.

Ejemplo 4: Aislamiento de un ADNc de BEIIb de trigo y un fragmento genómico adicional

Se construyó un banco de ADNc de cebada utilizando 5 μg de ARNm poliA+ (se agruparon 1,67 μg de ARNm poliA+ procedentes de 10, 12 y 15 tejidos de endospermo de DPA). El ADNc se sintetizó utilizando el sistema de síntesis de ADNc comercializado por Life Technology, excepto que se utilizó el cebador NotI-(dT)18 (Pharmacia Biotech) para sintetizar la primera hebra de ADNc. A la reacción se añadió Pfu polimerasa después de la síntesis de la segunda hebra para alinear los extremos de ADNcs. Luego se añadió a los ADNcs adaptador SalI-XhoI (Stratagene). Los ADNcs se ligaron a los brazos SalI-NotI de λZipLox (Life Technology) después de la digestión de ADNcs con NotI, seguido de fraccionamiento por tamaños (columna SizeSep 400 spun de Pharmacia Biotech). Toda la reacción de ligamiento (5 μl) se empaquetó utilizando el extracto de empaquetamiento Gigapack III Gold (Stratagene). El título del banco se sometió a ensayo transfectando la cepa Y1090 (ZL) o la cepa LE392 de E. coli.

Se utilizaron cebadores 1 y 2 (Sun et al. 1998), para la amplificación por PCR de un fragmento procedente de un banco de ADNc de cebada (Ali et al., 2000) utilizando las condiciones descritas en Sun et al. (1998). La identidad de este fragmento se confirmó mediante el análisis de la secuencia, y el fragmento se utilizó como una sonda para aislar un ADNc mediante hibridación a partir de un banco de ADNc construido a partir de Chinese Spring (Li et al. 1999).

Este ADNc se designó wBEIIb, y su secuencia se muestra en la Figura 9. (SEQ ID NO: 6). Esta sonda se utilizó también para volver a sondear el banco genómico procedente de A. tauschii al que se ha aludido anteriormente, y a partir de esta exploración se recuperó un clon designado G5. El análisis demostró que la secuencia de ADNc de wBEIIb mostraba una identidad de 98,5%, y que la secuencia de G5 mostraba una identidad del 100% con secuencias ya recuperadas a partir de G1 y G2. Por lo tanto, G5 representaba el mismo gen wSBE II-DB1, y el ADNc de wBEIIb es un producto del gen ortólogo en trigo hexaploide.

Ejemplo 5: Relaciones entre secuencias de BEII

Las secuencias de aminoácidos deducidas para enzimas de ramificación procedentes de diversos cereales se analizaron utilizando el programa PILEUP de la colección GCG de programas (Devereux 1984), y en la Figura 10 se muestra una alineación de estas secuencias. El análisis PILEUP utilizaba una penalización de 12 para la inserción de un hueco y de 0,1 para extender el hueco por residuo. Las secuencias de ADNc utilizadas para este análisis eran SBE9 (SEQ ID NO: 1; Figura 1), ADNc de BEIIb de trigo (SEQ ID NO: 6; Figura 9), Y11282, una secuencia de la enzima de ramificación del trigo (Nair et al. 1997), BEIIa de cebada (Sun et al. 1998), BEIIb de cebada (Sun et al. 1998), BEIII de arroz (Mizuno et al. 1993), BEIV de arroz (Genbank Nº de acceso E14723), BEIIa de maíz (Gao et al. 1997) y BEIIb de maíz (Fischer et al., 1993). El N-terminal observado de trigo (Morell et al., 1997; Y11282) se muestra en negrillas.

Las relaciones entre secuencias de la enzima de ramificación se ilustran en la Figura 11 utilizando un dendograma generado por el programa PILEUP. Las secuencias analizadas eran para Y11282 de trigo (Nair et al., 1997), SBE9 (Figura 1), BEIIb de trigo (Figura 9), IIa y IIb de cebada (Sun et al. 1998), BEI de maíz (Kim et al., 1998), IIa de maíz (Gao et al. 1997), IIb de maíz (Fisher et al. 1993), BEII de Arabidopsis (U22428, Fisher et al., 1996), BEII de Arabidopsis (U18817, Fisher et al., 1996), I de arroz (Kawasaki et al., 1993), III de arroz (Mizuno et al. 1993), IV de arroz (Genbank acceso E14723), BEI de patata (Khoshnoodi et al. 1997), BE II de patata (Cangiano et al. 1993), BEI y BEII de guisante (Burton et al. 1995), BE de E. coli (Baecker et al. 1986) y bacillus (Kiel et al 1992). Obsérvese que las secuencias BE I de guisante y BE II de guisante corresponden a BE II y BE I de maíz, respectivamente, debido a diferencias en los convenios de la nomenclatura.

Sobre la base de esta comparación, el gen de la enzima de ramificación contenido en el clon F2 se clasificó como un gen de tipo BEIIa y se designó wSBE II-DA1.

Ejemplo 6: Estructura de los genes wSBE II-DA1 y wSBE II-DB1

La Figura 12 muestra una comparación de las estructuras de los exones/intrones de los genes wSBE II-DA1 y wSBE II-DB1 de trigo. La estructura del gen wSBE II-DB1 se muestra a partir del comienzo del ADNc de BEIIb de trigo hasta el exón 5. Los resultados de la hibridación sugieren que las regiones en el extremo 3’ del ADNc de BEIIb de trigo no están contenidas dentro de ninguno de los clones G1, G2 y G5. Esto no es sorprendente, dado que el gen SBE IIb de maíz se extiende a lo largo de 16,5 kb y requería el aislamiento de dos clones genómicos (Kim et al 1998). Las posiciones de los límites de los intrones/exones para los cinco primeros intrones de los genes BEIIa y BEIIb de trigo están conservadas, tal como se muestra en la Tabla 1. Los tamaños de primeros cinco intrones en wSBE II-DB1 varían considerablemente de tamaño a partir de los primeros cinco intrones en wSBE II-DA1.

Tabla 1

Estructuras de Exones/intrones de Genes de la Enzima de ramificación de Cereales

Exones Intrones

wSBEII-BEIIb WSBEII-BEIIb de wSBEII-BEIIb WSBEII-BEIIb de

DA1 de de DB1 de cebada DA1 de de DB1 de cebada

trigo maíz trigo trigo maíz trigo

1 123a 112a 198a 121a 1 327 106 148 105 2 98 146 146 152 2 276 244 663 2064 3 242 155 230 230 3 401 1086 465 388

154 99 99 99 99 4 169 76 74 74 5 43 43 43 43b 5 152 196 181 6 60 60 60 6 335 499 442 7 81 81 81 7 83 81 79 8 117 117 117 8 288 567 178

209 81 84 84 9 629 775 10 122 122 10 175 751 11 120 120 11 974 4020 12 130 130 12 88 86 13 111 111 13 201 148

25 14 129 129 14 579 3051 15 104 104 15 841 872 16 145 145 16 1019 457 17 148 148 17 135 144 18 105 101 18 176 226

30 19 74 78 19 201 266 20 156 156 20 377 448 21 75 75 21 89 96 22 384 84

35 a La numeración del exón 1 comienza desde ATG del codón del inicio de la traducción b Secuencia parcial para el exón o intrón

Ejemplo 7: Análisis de expresión al nivel de ARNm

40 ARN procedente del endospermo en diferentes fases de desarrollo se obtuvo de trigo desarrollado en invernadero, según se describe en Li et al. (1999). El ARN se extrajo por el método de Higgins et al. (1976), se separó en geles de formamida desnaturalizantes y se transfirió sobre papel Hybond N+, esencialmente según se describe en Maniatis et al. (1992). Las sondas se prepararon a partir de los términos 3’ extremos de SBE9 (bases 2450 a 2640

45 de SEQ ID NO: 1) y ADNc de wBEIIb (bases 2700 a 2890 de SEQ ID NO: 6) mediante PCR utilizando el siguiente esquema: 94ºC, 2 min, 1 ciclo, 94ºC, 30 s, 55ºC, 30 s, 72ºC, 30 s, 36 ciclos, 72ºC 5 min, 1 ciclo, 25ºC, 1 min, 1 ciclo. Las sondas procedían de la región 3’ no traducida y eran específicas para las secuencias de tipo wSBE II-DA1 o wSBE II-DB1. Una especie de ARN de aproximadamente 2,9 kb se hibridó a cada una de las sondas (Figura 13, Panel B). Sin embargo, la intensidad de hibridación determinada por densitometría y normalizada para

50 diferencias en la carga de ARN, indicó que el ARN que se hibridaba al gen wSBE II-DB1 estaba presente a una concentración 2,5 a 3 veces menor que el ARN que se hibridaba al gen wSBE II-DA1.

Ejemplo 8: El análisis de las enzimas de ramificación mediante electroforesis por afinidad demuestra que sólo BEIIa es predominante en la fracción soluble

55 En Morell et al., (1997), los autores de la invención reseñaron que sólo una forma sencilla de enzima de ramificación II podía ser identificada en la fracción soluble del endospermo en desarrollo de trigo. Sin embargo, esto se realizó sobre la base de una cromatografía de intercambio de aniones, y siguió siendo posible que existieran múltiples formas, incluso a pesar de que no se podrían separar por esta técnica. Matsumoto ha

60 desarrollado un método de electroforesis por afinidad para medir la interacción de enzimas de ramificación con

sustratos de polisacáridos (Matsumoto et al., 1990), y los autores de la invención han desarrollado adicionalmente esta técnica, específicamente para permitir la separación de las formas de la enzima de ramificación IIa codificadas por cada uno de los tres genomas de trigo. La Figura 14 muestra una inmunotransferencia de un experimento de electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, en que la matriz del gel contenía la dextrina β-límite de amilopectina de maíz sola (Figura 14, pistas 1 y 2), mostrando la separación de tres formas de la enzima de ramificación IIa. La resolución está ligeramente reforzada por la adición del inhibidor de α-amilasa acarbosa (Figura 14, pistas 3, 4 y 5) y está sustancialmente reforzada por la adición de α-ciclodextrina (Figura 14, pistas 6, 7 y 8).

Se preparó un gel no desnaturalizante que contenía un gel concentrador compuesto por tampón Tris-HCl 0,125 M (pH 6,8), acrilamida al 6%, persulfato de amonio al 0,06% y TEMED al 0,1%. El gel separador estaba compuesto por tres paneles. La mezcla de geles no desnaturalizantes básica contenía tampón Tris-HCl 0,34 M (pH 8,8), CHAPS (0,05%), glicerol (10,3%), acrilamida (6,2%), persulfato de amonio al 0,06%, TEMED al 0,1% y la dextrina β-límite de la amlopectina de maíz (al 0,155%). El Panel A (pistas 1 y 2) contenía sólo los reactivos de gel no desnaturalizante básicos. El Panel B (pistas 3, 4 y 5) contenía los reactivos de gel no desnaturalizante básicos y acarbosa 0,066 mM. El Panel C (pistas 6, 7 y 8) contenía los reactivos de gel no desnaturalizante básicos y αciclodextrina 0,067 mM.

Después de la electroforesis a 100 V durante 16 horas a 4ºC, las proteínas en el gel separador se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con Morell et al (1997) y se hicieron inmunorreaccionar con una dilución al 1:5000 de anticuerpos 3KLH (desarrollados contra el péptido sintético AASPGKVLVPDESDDLGC (SEQ ID NO: 7) acoplado a la hemocianina de lapa boca de llave a través del reactivo heterobifuncional éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida).

El uso de una dextrina β-límite proporciona una separación superior, ya que evita la interferencia con la separación por parte de β-amilasas endógenas en el tejido del endospermo de trigo, y el uso de α-ciclodextrina en el ensayo potencia adicionalmente la separación. Sin desear limitar la invención por cualquier mecanismo propuesto, los autores de la misma piensan que este refuerzo puede resultar de la inhibición de α-amilasas de endospermo de trigo endógeno.

El análisis demuestra que están presentes tres proteínas de la enzima de ramificación II, y que cada una de estas proteínas reacciona de forma cruzada con anticuerpos contra un oligopéptido sintético diseñado a partir de la región N-terminal de proteína BEIIa en una región que no comparte homología con la proteína BEIIb de trigo.

La fracción soluble del endospermo de trigo se hizo reaccionar con diversos anticuerpos desarrollados contra péptidos, diseñados sobre la base de las secuencias del ADNc de BEIIa de trigo (véase la Figura 12) o de BEIIb de trigo. La Figura 15 muestra que sólo 3KLH, desarrollados contra el extremo N de BEIIa, reaccionaban de forma cruzada con proteínas (marcadas mediante flechas) en la fracción soluble que muestra un desplazamiento específico en la movilidad en presencia de la dextrina β-límite de amilopectina y α-ciclodextrina. Los geles se prepararon según se describe en la Figura 14, excepto que el gel utilizado en el Panel A contenía la mezcla de geles no desnaturalizantes sin la dextrina β-límite de amilopectina de maíz. El Panel B contenía la mezcla de geles no desnaturalizantes más α-ciclodextrina. Se preparó un extracto del endospermo de trigo en desarrollo utilizando 3 volúmenes de tampón de extracción por g de tejido y por cada gel se aplicaron 140 μl de muestra. Después de la electroforesis a 100 V durante 16 horas a 4ºC, las proteínas en el gel separador se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con Morell et al (1997) la cual se cortó en tiras de 1 cm. Los anticuerpos preparados eran 3KLH (véase la Figura 11), R6 (desarrollado en conejo contra el péptido sintético AGGPSGEVMIGC (SEQ ID NO: 8) acoplado a la hemocianina de la lapa boca de llave a través del reactivo heterobifuncional éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida); suero pre-inmune procedente del conejo R6; R7 (desarrollado en conejo contra el péptido sintético GGTPPSIDGPVQDSDGC (SEQ ID NO: 9) acoplado a la hemocianina de la lapa de boca de llave a través del reactivo heterobifuncional éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) y suero pre-inmune procedente del conejo R7.

Al igual que en la Figura 14, la proteína BEIIa se separa en tres formas (indicadas por flechas en la Figura 15, Panel B), mediante electroforesis de afinidad en presencia de dextrina β-límite. En cebada (Sun et al., 1997) y maíz (Bayer y Preiss, 1981) las dos enzimas de ramificación IIa y IIb están presentes en la fracción soluble. En algunos experimentos subsiguientes, los autores de la invención han detectado niveles bajos de BE IIb en la fracción soluble.

La separación de las formas de BEIIa codificadas por cada uno de los genomas de trigo se demuestra en la Figura

16. En el Panel (A) A. tauschii diploide (pistas 2, 3 y 4) y la línea de cebada (pista 11) proporciona una banda

sencilla. Sin embargo, las líneas tetraploides de T. durum (Panel A pista 1, Panel B pistas 1, 16 y 17) y líneas hexaploides de T. aestivum (Panel A pistas 5-10, Panel B pistas 2-15, 18-19) dan al menos 2 bandas. Algunas líneas hexaploides (Panel A, pistas 7 y 9, Panel B pistas 2-6, pistas 8-9, pista 13) proporcionan 2 bandas, indicando que carecen de función para un genoma o que los productos de dos genomas migran con una movilidad idéntica en el sistema de gel.

El uso del sistema de separación como medio para la exploración de genomas de trigo con alelos alterados o que han perdido su función de la enzima de ramificación IIa se demuestra por la Figura 14 (Panel B), en que se demuestra que diferentes líneas tienen diferentes números y movilidades de proteínas de la enzima de ramificación IIa.

Ejemplo 9 : Presencia de dos clases de proteínas en el gránulo de almidón a 88 kDa y su unión diferencial a anticuerpos

El gránulo de almidón de trigo contiene un cierto número de proteínas que han sido analizadas mediante SDS-PAGE (Rahman et al., 1995, Denyer et al., 1995, Takaoka et al, Li et al., 1999a, Li et al, 1999b) y electroforesis en gel bidimensional (Yamamori y Endo, 1996). Se han identificado las siguientes bandas: 60 kDa, GBSS; 75 kDa, SSI; 100 kDa, 108 kDa y 115 kDa, SSII). También se observa una banda de 88 kDa, y ha demostrado estar asociada con la actividad de la enzima de ramificación (Denyer et al., 1995) y reaccionar con anticuerpos contra BEII de maíz (Rahman et al., 1995). Se demostró que esta banda de la proteína contenía al menos dos componentes de proteínas.

Este análisis ha sido extendido mediante purificación y análisis de las proteínas del gránulo individuales. Las proteínas del gránulo se aislaron a partir de 4,7 g de gránulos de almidón de trigo mediante ebullición en 24 ml de tampón SDS (tampón Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, SDS al 10% y 2-mercaptoetanol al 6,25%) según se describe por Rahman et al., (1995). El almidón granular residual se separó por centrifugación y las proteínas de los gránulos se separaron aplicando el sobrenadante a un gel de SDS-PAGE al 9% preparado en un aparato Prep Cell de Biorad Modelo 491. El gel de SDS contenía un gel concentrador compuesto por tampón Tris-HCl 0,125 M (pH 6,8), SDS al 0,25%, acrilamida al 6%, persulfato de amonio al 0,06% y TEMED al 0,1% y un gel separador que contenía tampón Tris-HCl 0,34 M (pH 8,8), SDS al 0,25%, acrilamida (9%), persulfato de amonio al 0,06% y TEMED al 0,1%. Las muestras se sometieron a electroforesis a una corriente constante de 60 mAmp durante 16 horas, y fracciones de las reacciones (5 ml) se recogieron mediante una bomba que funcionaba a razón de 0,5 ml/min. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y fracciones que contenían una banda de 88 kDa se precipitaron mediante la adición de 3 volúmenes de acetona. El precipitado procedente de cada una las fracciones de 5 ml se recogió mediante centrifugación, la muestra se disolvió en tampón SDS y se sometió a electroforesis a través de un gel de SDS-PAGE al 8% estándar. La pista se escindió del gel y re-naturalizó en Tris 0,04 M durante 2 horas. Para generar una separación bidimensional, el gel se extendió luego a través de la parte superior de un segundo gel PAGE no desnaturalizante y se sometió a electroforesis. Las proteínas se identificaron mediante tinción con azul Coomasie (una mezcla 50:50 de disoluciones azul Coomassie R-250 y azul Coomassie G250 al 2,5%).

La Figura 17, Panel (A) demuestra que eran visibles dos proteínas después de la tinción, y estas se designaron 88 kD (U) y 88 kD (L), según se indica por las flechas. La inmunotransferencia del gel bidimensional con anticuerpos del péptido contra el N-terminal de BEIIa (3KLH) y contra el extremo N de la secuencia de ADNc de BEIIb de trigo (R6; véanse las Figuras 12 y 13. Detalles de los anticuerpos se recogen en el Ejemplo 8) indicaron una unión preferencial del anticuerpo R6 a 88 kD (U) y una unión preferencial de 3KLH a 88 kD (L) (Figura 17, Panel B), proporcionando una asignación provisional de estas proteínas como BEIIb y BEIIa, respectivamente.

Las proteínas se analizaron adicionalmente mediante digestión con tripsina, y los péptidos liberados se identificaron mediante análisis MALDI-TOF en la Australian Proteome Analysis Facility, Macquarie University, Sydney. Los resultados de este análisis, mostrados en la Tabla 2, demostraron que 88 kD (U) era el producto del gen BEIIb de trigo y que, mientras que la asignación de 88 kD (L) no era concluyente, los resultados eran consistentes con que la proteína era una proteína de ramificación codificada por SBE9 o el ADNc de BEIIb de trigo.

Tabla 2

(a) Comparación de 88 kD (U) y la proteína predicha codificada por el ADNc de BEIIb de trigo Emparejamientos: 6 Puntuación MOWSE: 4,97e+001 Cobertura: 8,85% Péptidos de emparejamiento:

PM Delta Comienzo Final Secuencia

755,4766 -0,13 320 325 (K) RPKSLR (I) 1337,7092 0,01 453 463 (R) VFNYGNKEVIR (F) 1337,6728 -0,03 703 713 (R) RFDLGDAEFLR (Y) 1508,7623 -0,12 785 799 (K) VVLDSDAGLFGGFGR (I)

15 1589,6933 -0,08 731 743 (K) YGFMTSDHQYVSR (K) 1692,7049 -0,17 184 198 (R) SDIDEHEGGMDVFSR (G) 1706,8740 -0,04 340 353 (K) INTYANFRDEVLPR (I)

(b) Comparación de 88 kD (L) y las proteínas predichas codificadas por el ADNc de BEIIb y ADNc de SBE9

20 de trigo Emparejamientos al ADNc de BEIIb de trigo Emparejamientos: 8 Puntuación MOWSE: 1,32e+003 Probabilidad: 2,053+003

25 Cobertura: 11,72% Péptidos de emparejamiento:

PM Delta Comienzo Final Secuencia

30 819,4603 11,23 464 470 (R)FLLSNAR (W) 1210,5090 -105,27 444 452 (R) GHHWMWDSR (V) 1337,7092 10,53 453 463 (R) VFNYGNKEVIR (F) 1337,6728 -16,68 703 713 (R) RFDLGDAEFLR (Y) 1508,7623 -44,33 785 799 (K) VVLDSDAGLFGGFGR (I)

35 1573,7446 -16,81 326 339 (R) IYETHVGMSSPEPK (I) 1589,6933 -23,46 731 743 (K) YGFMTSDHQYVSR (K) 1692,7049 -95,07 184 198 (R) SDIDEHEGGMDVFSR (G) 1706,8740 -15,57 340 353 (K) INTYANFRDEVLPR (I)

40 Emparejamientos a SBE9 de trigo Emparejamientos: 6 Puntuación MOWSE: 1,04e+001 Cobertura: 8,63% Péptidos de emparejamiento:

PM Delta Comienzo Final Secuencia

819,4603 11,23 451 457 (R)FLLSNAR (W)

1210,5090 -105,27 431 439 (R) GHHWMWDSR (V)

50 1508,7875 -27.64 145 156 (K) IYEIDPTLKDFR (S) 1573,7446 -16,81 313 326 (R) IYESHIGMSSPEPK (I) 1599,7641 -9,93 171 185 (R) AAIDQHEGGLEAFSR (G) 1692,8583 -4,45 327 340 (K) INSYANFRDEVLPR (I)

Ejemplo 10 : Secuenciación del gen SBE IIb

Se obtuvo una secuencia genómica parcial del gen SBEIIb utilizando el clon G5 descrito en el Ejemplo 4. Hasta

60 ahora se habían obtenido aproximadamente 8,4 kb de la secuencia. Esto incluía aproximadamente 500 pb aguas 13

arriba del codón de iniciación, que comprendía presumiblemente la región de promotor, y los exones 1 a 14 completos. Esta secuencia parcial se recoge en SEQ ID NO: 10. A partir de las secuencias de los genes BEII de maíz y Arabidopsis correspondientes, los autores de la invención esperaban que el gen contuviera 22 exones. Una comparación entre las estructuras de los exones/intrones de diversos genes BEII y el gen BEIIb de trigo se muestra en la Figura 18, y los tamaños de los exones en diversos genes SBEII se comparan en la Tabla 3. En esta Tabla “Arab” representa Arabidopsis.

Tabla 3

Tamaños de exones en diversos genes SBE IIb

Exones nº: Arab21 Arab22 BEIIa de trigo BEIIb de maíz BEII de cebada BEIIb de trigo

1: 42 124 279 212 121 148

2: 253 120 98 146 152 146

3: 236 182 243 155 230 230

4: 99 99 99 99 99 99

5: 43 43 43 43 43 43

6: 60 60 60 60 60

7: 81 81 81 81 81

8: 117 117 117 117 117

9: 84 84 84 84 84

10: 122 122 122 122 122

11: 120 120 120 120 120

12: 130 130 130 130 130

13: 111 111 111 111 111

14: 129 129 129 129 129

15: 104 104 104 104

16: 145 145 145 145

17: 148 148 148

18: 101 101 101

19: 78 78 78

20: 156 156 156

21: 75 75 75

22: 90 384 304

17: 558

18: 164

Ejemplo 11: Desarrollo de Conjuntos de Cebadores de PCR para la Discriminación de los Genes 15 BEIIb precedentes de cada uno de los genomas

10 Utilizando una sonda específica para el extremo 3’ de SBE IIb, se han aislado ahora tres clones designados G7, G8 y G9, respectivamente, a partir del banco genómico de T. tauschii, y están sometiéndose a análisis de la secuencia para proporcionar la región 3’ del gen.

Un cierto número de conjuntos de cebadores, diseñados sobre la base de comparaciones entre genes SBE IIa y SBE IIb, se sometieron a ensayo en ADN genómico de trigo. Las secuencias de estos cebadores eran como sigue:

20 ARA 12F: 5’ CCG TCC TAC ATG ACA CCT GGC CG 3’ SEQ ID NO:11 ARA 10R: 5’ CCG CCG GAT CGA GGA GCC GAC GG 3’ SEQ ID NO:12 ARA 6F: 5’ GGC GGC GGC GAC GGG ATG GCT GC 3’ SEQ ID NO:13 ARA 8R: 5’ CGC CGT CAG GGA TCA TCA CCT CC 3’ SEQ ID NO:14 ARA 19F: 5’ CAC CCA TTG TAA TTG GGT ACA CTG 3’ SEQ ID NO:15

25 ARA 15R 5’ TCC ATG CCT CCT TCG TGT TCA TCA 3’ SEQ ID NO:16 ARA 23R 5’ CTG CGC ATA AAT CCA AAC TTC TCG 3’ SEQ ID NO:17

La fijación como objetivo de la región del promotor de SBE IIb utilizando los cebadores ARA 12F y ARA 13R resultó en la amplificación específica de sólo el gen del genoma D. El análisis aneuploide utilizando este par de

30 cebadores demostró que el SEB IIb estaba situado en el brazo largo del cromosoma 2 en trigo, tal como se ilustra en la Figura 19.

Los cebadores ARA6F y ARA8R que amplifican la región exón 1-intrón 1-exon 2 de SBE IIb, podían distinguir el genoma D de los genomas A y B, tal como se muestra en la Figura 20. El análisis de la secuencia de esta región indicó que los genes procedentes de los genomas A y B carecían por completo del intrón 1. Esto se ilustra en la Figura 21.

Ejemplo 12: Identificación de SBE IIb en los Genomas A, B y D

El análisis de la secuencia de la región del intrón 3 de SBE IIb, amplificada mediante PCR utilizando los cebadores ARA 19F y ARA 15R, seguido de la digestión utilizando la enzima de restricción Rsa1, reveló un polimorfismo significativo entre los tres genomas. Este polimorfismo, ilustrado en la alineación de las secuencias recogida en la Figura 22, se utilizó para desarrollar los marcadores específicos del genoma que pueden distinguir entre los genomas A, B y D.

La amplificación por PCR del gen SBE IIb se llevó a cabo utilizando los cebadores ARA 19F y ARA 15R, seguido de la digestión por restricción utilizando Rsa1. Los resultados del análisis por PCR, mostrados en la Figura 23, indican que estos cebadores pueden distinguir entre los tres genomas.

La exploración de aproximadamente 600 líneas de trigo utilizando el par de cebadores específicos para el genoma, ARA 19F y ARA 23R, que amplifica la misma región que ARA 19F y ARA 15R, identificaron un mutante que ha perdido su función del genoma de trigo. La amplificación se realizó según se describe para la Figura 23, y los resultados se muestran en la Figura 24.

Ejemplo 13: Construcciones para la Expresión de genes BEII

La tecnología de ADN recombinante se puede utilizar para inhibir o suprimir la expresión de uno cualquiera o de ambos de BE IIa y BE IIb. Se utilizan tres enfoques generales utilizando la transformación de las células vegetales diana con uno de los siguientes tipos de construcción:

a) Construcciones “antisentido” de SBE IIa y SBE IIb, en las que la secuencia de ácidos nucleicos deseada está insertada en la construcción en la dirección opuesta al gen funcional. b) Construcciones “sentido” de SBE IIa y SEB IIb, en las que el ácido nucleico deseado está insertado en la misma dirección que el gen funcional; esto utiliza fenómenos de co-supresión para inhibir la expresión del gen diana; c) Construcciones dúplex de SBE IIa y SBE IIb, en las que el ácido nucleico deseado tanto en las orientaciones sentido como antisentido está co-localizado en la construcción en cualquier lado de un bucle “espaciador” formado por una secuencia de intrón.

En los tres casos, el ácido nucleico deseado está operativamente enlazado a una secuencia de promotor en la construcción.

Construcciones sentido y anti-sentido se han utilizado ampliamente para modular la expresión de genes en vegetales. Más recientemente, se ha demostrado que el suministro de ARNs con un potencial para formar dúplex es una estrategia particularmente eficaz para generar el silenciamiento del gen post-transcripcional en plantas transgénicas (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000).

La transformación de las células de trigo diana o células de otras plantas, utilizando estas construcciones se efectúa utilizando métodos conocidos en la técnica tales como transformación con Agrobacterium tumefaciens. Una vez que se obtienen plantas transgénicas, éstas se evalúan en cuanto a los efectos de los transgenes sobre la expresión de BE IIa y BE IIb. Por ejemplo, tanto en maíz como en patata, se ha demostrado que el cruzamiento de mutaciones BE II o transgenes BE II en fondos deficientes en BE I aumenta grandemente el contenido en amilosa. Líneas que han perdido su función de BE I de trigo, identificadas utilizando los métodos descritos en el documento WO99/14314, proporcionan una fuente rápida de material genético deficiente en BE I en la que se pueden cruzar componentes transgénicos BE IIa y BE IIb con el fin de extender adicionalmente la gama de almidones que se puede producir.

Construcciones sentido, anti-sentido y dúplex de SBE IIa y SBE IIb se generaron en el vector pDV03000 (Biogemma Ltd, Reino Unido) que porta el promotor de gluten de elevado peso molecular (pHMWG – siglas en inglés) y el terminador de Nopalina sintasa (Nos). Estas construcciones están representadas esquemáticamente en las Figuras 25, 26 y 27. Los vectores de Biogemma están basados en el plásmido pBR322 bien conocido, y comprenden un cierto número de sitios de restricción tal como se ilustra en las Figuras 25 y 26, para la incorporación de secuencias de ADN deseadas. Todo el ADN deseado, más las secuencias de promotor y terminador a las que se alude anteriormente, pueden entonces escindirse en forma de un fragmento Xho y clonarse en un vector adecuado tal como Agrobacterium tumefaciens. Los expertos en la técnica serán conocedores de

5 otros vectores adecuados que podrían utilizarse.

Construcciones de SBE IIa

Una construcción sentido de SBE IIa se preparó insertando un fragmento de 2143 pb de la secuencia codificadora

10 de SBE IIa en la orientación sentido en el sitio EcoR1/Sma1 de pDV03000. Se preparó una construcción antisentido de SBE IIa insertando 1913 pb de la secuencia codificadora de SBE IIa en la orientación anti-sentido en el sitio EcoR1/BamH1 de pDV03000. Esto se ilustra también en la Figura 25.

Construcciones de SBE IIb

15 Una construcción sentido de SBE IIb se generó insertando un fragmento de 1008 pb de la secuencia codificadora de SBE IIb en la orientación sentido en el sitio EcoR1/Sma1 de pDV03000. Se preparó una construcción antisentido de SBE IIb insertando una secuencia de 955 pb de la región codificadora de SBE IIa en el sitio BamH1/Pst1 de pDV03000 en la orientación antisentido. Esto se ilustra en la Figura 26.

Construcciones dúplex

En la Figura 27 se recoge un modelo esquemático de una construcción dúplex. La construcción dúplex se preparó utilizando el siguiente protocolo, en el que todas las etapas de amplificación se realizaron utilizando la PCR bajo 25 condiciones convencionales.

Dúplex de SBE IIa

1) Una secuencia de 468 pb de SBE IIa, que incluye la totalidad de los exones 1 y 2 y parte del exón 3,

30 con sitios de restricción EcoR1 y Kpn1 en cualquier lado, se amplificó para obtener un primer fragmento (fragmento 1); 2) un segundo fragmento, de 512 pb de longitud, que consiste en parte de los exones 3 y 4, y la totalidad del intrón 3 de SBE IIa, con sitios Kpn1 y Sac1 en cualquier lado, se amplificó para proporcionar el fragmento 2;

35 3) un fragmento de 528 pb, que consiste en los exones completos 1, 2 y 3 de SBE IIa, con sitios BamH1 y Sacl en cualquier lado, se amplificó para proporcionar el fragmento 3; 4) los fragmentos 1, 2 y 3 se ligaron de modo que la secuencia del fragmento 3 se ligó al fragmento 2 en la orientación antisentido con respecto al fragmento 1.

40 Dúplex de SBE IIb

1) Una secuencia de 471 pb, que incluye la totalidad de los exones 1 y 2 y parte del exón 3 de SBE IIb, se amplificó con sitios de restricción EcoR1 y Kpn1 en cualquier lado, para generar el fragmento 1; 2) un fragmento de 589 pb, que consiste en parte de los exones 3 y 4, y la totalidad del intrón 3 de SBE

45 IIb, con sitios Kpn1 y Sac1 en cualquier lado, se amplificó para proporcionar el fragmento 2; 3) un fragmento de 528 pb, que consiste en los exones completos 1, 2 y 3, con sitios BamH1 y Sacl en cualquier lado, se amplificó para proporcionar el fragmento 3; 4) los fragmentos 1, 2 y 3 se ligaron de modo que el fragmento 3 estaba en la orientación antisentido con respecto al fragmento 1 cuando se ligó al fragmento 2.

50 Los puntos de inicio y final de las secuencias utilizadas para producer las construcciones eran como sigue:

a) Construcción sentido de SBE IIa Inicio: 461 pb de ADNc de Sbe 9 (SBE IIa) 55 Final: 2603 pb de ADNc de Sbe 9 (SBE IIa)

b) Construcción anti-sentido de SBE IIa Inicio: 691 pb de ADNc de Sbe 9 (SBE IIa) Final: 2603 pb de ADNc de Sbe 9 (SBE IIa)

60 Este fragmento se ligó en la orientación anti-sentido.

c) Construcción sentido de SBE IIb Inicio: 85 pb de ADNc de SBE IIb Final: 1085 pb de ADNc de SBE IIb

d) Construcción anti-sentido de SBE IIb Inicio: 153 pb de ADNc de SBE IIb Final: 1085 pb de ADNc de SBE IIb Este fragmento se ligó en la orientación anti-sentido.

e) Construcción dúplex de SBE IIa

i) Fragmento 1 Exón 1 completo: 1151 pb – 1336 pb de secuencia genómica de SBE IIa Exón 2 completo: 1664 pb – 1761 pb de secuencia genómica de SBE IIa Exón 3 parcial: 2038 pb – 2219 pb de secuencia genómica de SBE IIa Este fragmento tenía un sitio EcoR1 (GAATTC) introducido al inicio de la secuencia del exón 1 y un sitio Kpn1 (GGTACC) introducido al final de la secuencia del exón 3 parcial.

ii) Fragmento 2 Exón 3 parcial: 2220 pb – 2279 pb de secuencia genómica de SBE IIa Intrón 3 completo: 2280 pb – 2680 pb de secuencia genómica de SBE IIa Exón 4 parcial: 2681 pb – 2731 pb de secuencia genómica de SBE IIa Este fragmento tenía un sitio Kpn1 (GGTACC) introducido al inicio de la secuencia del exón 3 parcial y un sitio Sac1 (GAGCTC) introducido al final de la secuencia del exón 4 parcial.

iii) Fragmento 3 Exón 1 completo: 1151 pb – 1336 pb de secuencia genómica de SBE IIa Exón 2 completo: 1664 pb – 1761 pb de secuencia genómica de SBE IIa Exón 3 completo: 2038 pb – 2279 pb de secuencia genómica de SBE IIa Este fragmento tenía un sitio BamH1 (GGATCC) introducido al inicio de la secuencia del exón 1 completo y un sitio Sac1 (GAGCTC) introducido al final de la secuencia del exón 3 completo.

f) Construcción dúplex de SBE IIb

i) Fragmento 1 Exón 1 completo: 489 pb – 640 pb de secuencia genómica de SBE IIb Exón 2 completo: 789 pb – 934 pb de secuencia genómica de SBE IIb Exón 3 parcial: 1598 pb – 1770 pb de secuencia genómica de SBE IIb Este fragmento tenía un sitio EcoR1 (GAATTC) introducido al inicio de la secuencia del exón 1 y un sitio Kpn1 (GGTACC) introducido al final de la secuencia del exón 3 parcial.

ii) Fragmento 2 Exón 3 parcial: 1771 pb – 1827 pb de secuencia genómica de SBE IIb Intrón 3 completo: 1828 pb – 2292 pb de secuencia genómica de SBE IIb Exón 4 parcial: 2293 pb – 2359 pb de secuencia genómica de SBE IIb Este fragmento tenía un sitio Kpn1 (GGTACC) introducido al inicio de la secuencia del exón 3 parcial y un sitio Sac1 (GAGCTC) introducido al final de la secuencia del exón 4 parcial.

iii) Fragmento 3 Exón 1 completo: 489 pb – 640 pb de secuencia genómica de SBE IIb Exón 2 completo: 789 pb – 934 pb de secuencia genómica de SBE IIb Exón 3 completo: 1598 pb – 1827 pb de secuencia genómica de SBE IIb Este fragmento tenía un sitio BamH1 (GGATCC) introducido al inicio de la secuencia del exón 1 completo y un sitio Sac1 (GAGCTC) introducido al final de la secuencia del exón 3 completo.

Los dúplex de SBE IIa y SBE IIb, así formados, se insertaron respectivamente en el sitio EcoR1/BamH1 de pDV03000.

Muestras de clones G5 y G9 del fago λ han sido depositadas en el Australian Government Analytical Laboratories, actuando como Autoridad de Depósito Internacional bajo el Tratado de Budapest el 20 de febrero de 2001, bajo los números de acceso NM01119255 y NM01/19256, respectivamente.

Resultará evidente para la persona experta en la técnica que, mientras que la invención ha sido descrita con cierto 5 detalle para los fines de claridad y comprensión, se pueden realizar diversas modificaciones y alteraciones a las realizaciones y métodos descritos en esta memoria.

Las referencias citadas en esta memoria se listan en las siguientes páginas.

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20 Sathish, P., C. X. Sun, A. Deiber, C. Jansson, y C. X. Sun. Cloning and anti-sense RNA constructs of a starch branching enzyme gene from barley endosperm. Mathis, P. 313-316. 1995. Photosynthesis: from light to biosphere. Volume V. Proceedings of the Xth International Photosynthesis Congress, Montpellier, France, 20-25 de agosto 1995.

25 Schondelmaier, J., A. Jacobi, G. Fischbeck, y A. Jahoor. 1992. Genetical Studies on the mode of inheritance and localization of the amol (High Amylose) gene in barley. Plant Breeding 109: 274-280.

Smith, N.A., Singh S.P., Wang M.B., Stoutjesdijk P.A., Green A.G., Waterhouse P.M. (2000) Nature 407, 319-420.

30 Sun, C. X., P. Sathish, B. Ek, A. Deiber, C. Jansson, y C. X. Sun. 1996. Demonstration of in vitro starch branching enzyme activity for a 51/50-kDa polypeptide isolated from developing barley (Hordeum vulgare) caryopses. Physiologia. Plantarum. 96: 474-483.

Sun, C. X., P. Sathish, S. Ahlandsberg, A. Dieber, C. Jansson, y C. X. Sun. 1997. Identification of four 35 starchbranching enzymes in barley endosperm: partial purification of forms I, IIa and IIb. New Phytologist. 137: 215-222.

Sun, C. X., P. Sathish, S. Ahlandsberg, C. Jansson, y C. X. Sun. 1998. The two genes encoding starch-branching enzymes IIa and IIb are differentially expressed in barley. Plant Physiology. 118: 37-49.

40 Takaoka, M., S. Watanabe, H. Sassa, M. Yamamori, T. Nakamura, T. Sasakuma, y H. Hirano. 1997. Structural characterization of high molecular weight starch granule-bound proteins in wheat (Triticum aestivum L). J. Agric. Food Chem. 45: 2929-2934.

45 Tingay, S., McElroy, D., Kalla, R., Fieg, S., Wang.M, Thornton, S. y Brettel, R. 1997, The Plant Journal, 11, 13691376.

Wan Y., y Lemaux, P.G. 1994, Plant Physiology. 104, 37-48.

50 Wirtzens, B, Brettel RIS, Murray F., McElroy D, Li Z, Dennis ES. (1998) Comparison of three selectable marker genes for transformation of wheat by microprojectile bombardment. Aust. J. Plant. Physiol. 25, 39-44.

Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M.B. (1998). Virus resistance and gene silencing can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 13959-13964.

55 Yamamori, M. y T. R. Endo. 1996. Variation of starch granule proteins and chromosome mapping of their coding genes in common wheat. Theor Appl Genet 93: 275-281.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CSIRO Goodman Fielder Limited Groupe Limagrain Pacific Pty Limited 5 <120> Enzimas de Ramificación del Almidón

<130> FP14112

<140> PQ5742 10 <141>

<150> PQ5742

<151> 15 <160> 17

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

20 <211> 2726 <212< ADN

<213> Triticum sp.

<400> 1 25

5: <210> <211> <212< <213> 2 11475 ADN Triticum sp.

<400>: 2

5: <210> <211> <212< <213> 3 19 ADN Triticum sp.

<400>: 3

10

<210>: 4

<211>: 20

<212<: ADN

<213>: Triticum sp.

15

<400>: 4

20 <210> 5

<211> 3962

<212< <213>: ADN Triticum sp.

5: <400>
5

5: <210> <211> <212< <213> 6 2968 ADN Triticum sp.

<400>: 6

5: <210> <211> <212< <213> 7 18 PRT Triticum sp.

<400>: 7

5: <210> <211> <212< <213> 8 12 PRT Triticum sp.

<400>: 8

15: <210> <211> <212< <213> 9 17 PRT Triticum sp.

<400>: 9

20

<210>: 10

<211>: 8381

<212<: ADN

<213>: Triticum sp.

25

<400>: 10

5: <210> <211> <212< <213> 11 26 ADN Triticum sp.

<400>: 11

15: <210> <211> <212< <213> 12 27 ADN Triticum sp.

<400>: 12

20 <210> 13

<211> 26

<212< <213>: ADN Triticum sp.

5: <400> 13

10: <210> <211> <212< <213> 14 27 ADN Triticum sp.

<400>: 14

20: <210> <211> <212< <213> 15 27 ADN Triticum sp.

<400>: 15

25

<210>: 16

<211>: 28

<212<: ADN

<213>: Triticum sp.

30

<400>: 16

35: <210> <211> <212< <213> 17 28 ADN Triticum sp.

40: <400> 17

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una planta de trigo que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del cromosoma 2 que codifica BEIIb, en combinación con uno o más alelos que han perdido su función de un gen que 5 codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI.
2.- Una planta de trigo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen que codifica BEIIb y un alelo que ha perdido su función de un gen que codifica BEIIa.

10 3.- Una planta de trigo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende, además, un gen que codifica BEIIa expresada en la orientación sentido o anti-sentido.
4.- Una planta de trigo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho más de un gen que codifica BEIIb incluye un gen que corresponde a un ADNc que tiene una secuencia de nucleótidos según se recoge

15 en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
5.- Grano de trigo, que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del cromosoma 2 que codifica BEIIb, en combinación con uno o más alelos que han perdido su función de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI, en donde el grano es grano

20 entero o grano en parte.
6.- Grano de trigo de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen que codifica BEIIb y un alelo que ha perdido su función de un gen que codifica BEIIa.

25 7.- Grano de trigo de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde dicho más de un gen que codifica BEIIb incluye un gen que corresponde a un ADNc que tiene una secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
8.-Harina de trigo, que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del

30 cromosoma 2 que codifica BEIIb, en combinación con uno o más alelos que han perdido su función de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en BEIIa, GBSS, SSII y BEI.
9.- Harina de trigo de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende alelos que han perdido su función de más de un gen que codifica BEIIb y un alelo que ha perdido su función de un gen que codifica BEIIa.

35 10.-Harina de trigo de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde dicho más de un gen que codifica BEIIb incluye un gen que corresponde a un ADNc que tiene una secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

40 11.- Un método para identificar una planta de trigo de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el método el uso de cebadores de la amplificación específicos para genes para explorar una población de plantas de trigo para identificar una planta de trigo que tenga alelos que han perdido su función de más de un gen en un brazo largo del cromosoma 2 que codifica BEIIb, y uno o más alelos que han perdido su función de un gen que codifica una proteína seleccionada de BEIIa, GBSS, SSII y BEI.